CA2261855C

CA2261855C - Surfaces hyperbactericides

Info

Publication number: CA2261855C
Application number: CA002261855A
Authority: CA
Inventors: Francis Rondelez; Pascal Bezou; Othman Bouloussa
Original assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Institut Curie
Current assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Institut Curie
Priority date: 1996-07-31
Filing date: 1997-07-25
Publication date: 2005-12-27
Anticipated expiration: 2017-07-25
Also published as: FR2751882B1; EP1019097A1; DE69715686D1; CA2261855A1; EP1019097B1; WO1998004296A1; JP2000517352A; FR2751882A1; CN1228711A; US6316015B1; ATE224206T1

Abstract

L'invention concerne une surface douée de propriétés antibiotiques ou antiseptiques, constituée d'un substrat solide modifié par fixation covalence d'un ou plusieurs espaceurs, caractérisée en ce qu'une ou plusieurs molécules antibiotiques, bactéricides, virucides ou fongicides sont liées de façon covalente à l'extrémité réactive dudit ou desdits espaceurs.

Description

WO 98104296 PGT/FR9'7101403 La présente invention porte sur le procédé de fabrication de surfaces à propriétés antibiotiques, bactéricides, fongicides ou virucides permanentes, sur les surfaces susceptibles d'être obtenues par !e procédé
de fabrication et sur leur utilisation dans les domaines médical, cosmétique, alimentaire, de l'hygiène, ou des fluides industriels.
Dans l'ensemble du présent texte, les termes molécules ou substances antibiotiques, cytotoxiques, bactéricides doivent être compris ~, ' i0 comme incluant non seulement la propriété bactéricide stricto sensu, mais égaiement virucide, fongicide ou de manière générale toute substance bio-active cytotoxique pour toute cellule vivante dont l'élimination est recherchée.
If existe déjà des surfaces bactéricides notamment à usage médical, par exemple des gants ou encore des tissus. Des mélanges non covalents entre des surfaces et des substances bactéricides ont été
décrits ; i! peut s'agir notamment de gants incorporant entre deux couches de latex un milieu liquide contenant un agent pharmacologique efficace (brevet français n° 8711753') ; il peut également s'agir d'une émulsion de micro-goutelettes stabilisée par un copolymère bloc (brevet français N° 9315561 du 23 décembre 1993).
Des implants médicaux ou des cathéters ont également été
recouverts avec un antibiotique ou des mélanges d'antibiotiques ; la liaison avec ie support est de type ionique et l'antibiotique est simplement adsorbé
sur le substrat (WO 9317746). .
le brevet EP 348462 décrit des lentilles de contact constituées d'un polymère acrylique dont la surface est modifiée par greffage de molécules organiques ayant les propriétés souhaitées (résistance UV, résistance, cytotoxicité sélective etc...). Cette molécule WO 98/04296 PCT/F'R97/01403

2 comprend un groupe silane réactif vis-à-vis des groupes carboxyliques des chaînes polymères acryliques. La surface modifiée de ces lentilles comprend une multicouche du groupe chimique sélectionné d'épaisseur variable : 50 à 100 ä dans certains cas (tableau 1, colonne 4), 2 000 à
6 000 A dans d'autres cas quand la lentille est modifiée pour lui conférer des propriétés particulières.
Le dépôt de molécules organiques sur des substrats de verre ou de silice par greffage d'une couche monomoléculaire a été décrit dans Appl. Phys. Lett., 62, 2256 (1993), Sciences et Avenir, 567, 87 (1994) et La Recherche, 275 (26), 460 (1995) ; ces surfaces ainsi modifiées trouvaient leur application dans les domaines de surfaces autolubrifiantes, d'isolants électriques ultraminces, de vitres non salissables.
L'intérêt de surfaces antibiotiques apparaît en particulier pour lutter contre le dévéloppement des infections nosocomiales en milieu hospitalier ; il serait en effet intéressant de pouvoir disposer de matériaux dont la surface serait cytotoxique et qui inhiberait le développement des bactéries qui viendraient en contact avec ces mëmes matériaux. On peut envisager ici les instruments chirurgicaux, les cathéters, mais aussi la vaisselle, les portes et fenêtres, tes revétements de murs, la céramique 2o etc.... Par ailleurs, l'apparition de souches bactériennes devenues résistantes aux doses normales d'antibiotiques nécessite l'utilisation de produits cytotoxiques à des concentrations de plus en plus élevées. II faut donc que le nombre de molécules antibiotiques par unité de surface soit le plus grand possible.
La présente invention est relative à une surface douée de propriétés antibiotiques, antiseptiques, virucides, ou encore fongicides constituée d'un substrat solide minéral ou organique, dont la surface a été
recouverte par des moyens chimiques appropriés d'une couche monomoléculaire, homogène et dense, de molécules ayant ces propriétés WO 98/04296 PCT/FIt97/01403

3 bio-actives. Lesdites molécules sont fixées par des liaisons covalentes sur le substrat, ce qui confère à la couche active un caractère permanent et irréversible.
Le substrat modifié selon l'invention est caractérisé par le fait que les molécules antibiotiques sont fixées sur la surface par des liaisons covalentes par l'intermédiaire d'un ou plusieurs « espaceurs ».
Ces molécules espaceurs sont généralement des chaînes alkyles, composées d'une série de 2 à 18 atomes de carbone, et de deux groupes fonctionnels en extrémités permettant une liaison covalente to irréversible avec un site de surface du substrat solide d'une part, et la molécule bio-active, d'autre part.
L'espaceur selon l'invention répondra de préférence à la formule A1-(CHZ)n-AZ dans laquelle - A~ est X-OH, CO-Z, ou Y3-Si, avec X un halogène, Z = H, OH ou CI; e Y = X ou un groupe alkoxy de 1 à 3 atomes de carbone ;
- le nombre n de groupes méthylène formant la chaîne alkyle est compris entre 2 et 24 ;
- A2 est choisi parmi ies résidus CH3, CH=CH2, OH, halogéné ou CO-Z, avec Z = H, OH ou CI.
2o Dans la formule ci-dessus, n est de préférence compris entre 5 et 18. En effet, un espaceur trop court risquerait d'avoir une rigidité trop importante alors que s'il était trop long, il y aurait des risques de repliement de la chaîne aliphatique sur elle-même, ce qui conduirait à une moins bonne efficacité du couplage avec l'antibiotique.
Les substrats à modifier sont soit des surfaces minérales, en particulier à base de silice (sable, billes de verre, laine de verre) soit des substrats organiques, selon l'utilisation que l'on souhaite en faire dans des domaines aussi différents que ceux cités ci-dessus. Parmi les substrats organiques, on peut citer, sans être limitatif, le polyéthylène, le chlorure de polyvinyle (PVC), les polyacryiates, les polyméthacrylates, le polypropylène,

4 les polyamides, les polyuréthanes, l'acrylonitrile- butadiène-styrene (ABS), les polyesters saturés ou insaturés tel le polyéthylène téréphtalate (PET), les polycarbonates, les polyacrylamides, le Téflon~ (PTFE), les polysiloxanes, les polysaccharides ou tout polymère ou copolymère susceptible d'être greffé avec un espaceur comprenant deux extrémités réactives. Le substrat peut également être un métal ou son oxyde tel l'aluminium (AI), l'étain (Sn) ou l'indium (In).
Parmi les substrats utilisés, notamment les substrats organiques, certains possèdent des fonctions naturellement réactives, soit to dans leurs chaînes latérales tel le PVC (CI), le polyacrylate (-COOH), le polyamide (-CO-NH2) ou le polyhydrométhylsiloxane (Si-H), soit dans leur chaîne principale tel le polyuréthane (-NH-CO-O-), le polycarbonate(-O-CO-O-), les polyesters (-CO-O-).
Pour d'autres, au contraire, leurs fonctions réactives doivent être générées in situ par les méthodes standard d'activation comme l'oxydation chimique ou le traitement par un plasma, selon les techniques décrites dans L. Penn et al. (Polymers for Advanced Technologies (1994)

5 : 809-817) ; c'est le cas par exemple pour le polyéthylène et de nombreux autres polymères ou copolymères 2o En dehors des polymères cités, tout polymère ayant des groupements réactifs dans leur squelette, ou à leur surface, ou des groupements susceptibles d'être transformés en fonction réactive, sont des bons candidats comme substrat des surfaces de !'invention. La surface sera bien entendu choisie en fonction de !'utilisation antibiotique ou cytotoxique que l'on souhaite développer.
Les formes des surfaces varient également en fonction de l'utilisation que l'on souhaite en faire.
Dans les domaines biologiques ou médicaux, les surfaces planes ou pseudo-planes peuvent être des bouteilles, des poches, des t

6 PCT/FR97101403 flacons ou autres contenants, cela peut être des surfaces tubulaires, telles des cathéters, des seringues, des aiguilles, etc..., ou encore des microfibres pleines ou creuses ; à titre d'exempte d'utilisation de fibres creuses, on peut citer des cartouches de dialyse rénale ou des systèmes à fibres creuses 5 pour la culture de cellules animales.
Les surfacES sphériques peuvent être des bittes ou microbilles et avoir tout diamètre approprié à l'utilisation que l'on souhaite en faire, notamment entre quelques microns et quelques millimètres. A titre d'exemples d'utilisation de billes, on peut citer les bacs à sable pour les to enfants, les abrasifs contenus dans les pâtes dentifrices, les systèmes de purification d'eau par contact avec des particules de grande surface spécifique et permettant de décontaminer une solution par simple agitation et sans risque de relargage d'antibiotiques dans le milieu.
Dans le domaine de fa décontamination des fluides industriels (fluides de coupe pour les machines-outils, etc...), les surfaces peuvent être des fibres pleines assemblées en une cartouche filtrante.
Les antibiotiques utilisables à la réalisation des surfaces de l'invention sont nécessairement des antibiotiques qui agissent préférentiellement au niveau de la paroi cellulaire ; les antibiotiques agissant au niveau de la transcription ou de la traduction sont moins intéressants dans ie cas présent, dans la mesure où la fixation covalente ne permet pas à l'antibiotique de pénétrer dans la bactérie dans les mêmes conditions que lorsqu'il est en solution.
Ces antibiotiques peuvent notamment être ceux comportant un noyau (i-lactame telles les pénicillines, les céphatosporines, les monobactames, les thiénamycines, les inhibiteurs des (3-lactamases, les inhibiteurs de la synthèse des peptidoglycanes, des polypeptides basiques tels que la bacitracine ou fa novobiocine.

Les bactéricides à base d'ammonium quaternaire de même que les fongicides choisis notamment parmi - la famille des imidazoles, comme la nystatine et l'amphotéricine B ;
- les fongicides aliphatiques comme l'undécylénate de zinc, de calcium ou de sodium ;
- la famille des carbamates, des dithiocarbamates et des iodocarbamates comme le 3-iodo 2-butyl carbamate ;
- des dérivés organomercuriels comme le silicate de methoxy-t0 ethyl-mercure ;
- la famille des fongicides hétérocycliques comme les triazines ou le 1,3,5 hexafiydrotriazine ;
- les dérivés de l'isothiazoline, du pyridine ethione, les alcools aminés, etc...
peuvent également entrer dans la constitution des surfaces actives de l'invention.
Le bactéricide ou l'antibiotique peut nécessiter une modification chimique préalable afin de ie rendre greffable sur une surface, par exemple une surface de verre. Pour cela, les groupes réactifs des 2o antibiotiques seront utilisés, comme par exemple la fonction amine naturellement présente dans la structure chimique de certains antibiotiques comportant un noyau ~-lactame comme l'acide aminopénicillanique.
Sur le substrat modifié de l'invention, les molécules antibiotiques forment une couche monomoléculaire d'épaisseur inférieure à
4 nm.
La couche peut ëtre homogène ou hétérogène dans sa composition afin d'optimiser fes propriétés antibiotiques, fongicides ou virucides et le cas échéant d'élargir le spectre d'action antibiotique de la surface ainsi modifiée ; l'hétérogénéité peut être à un niveau moléculaire ou n r

7 à un niveau macroscopique : par exemple, des microbilles, homogènes individuellement et porteuses de molécules de nature différente peuvent être mélangées.
L'homme du métier saura, en fonction du spectre antibiotique qu'il souhaite conférer à la surface de l'invention, s'il doit greffer un seul antibiotique et lequel, ou un mélange de plusieurs antibiotiques et dans quelles proportions. Dans le deuxième cas, on peut utiliser, soit un seul type d'espaceur et les antibiotiques choisis réagissent avec la même extrémité réactive de l'espaceur, soit plusieurs types d'espaceurs, chacun 1o d'entre eux étant susceptible de réagir avec un antibiotique particulier.
II est également possible de mélanger des molécules de spécificités bio-actives différentes.
La couche monomoléculaire formée par les molécules bio-actives est très dense et les molécules sont au contact direct les unes des autres, formant un empilement bi-dimensionnel compact.
Les surfaces de l'invention ont une densité de sites actifs d'antibiotiques par unité de surface qui peut atteindre 5.10'4 molécules d'antibiotiques par centimètre carré. Cette densitP ~nnm n+
concentration locale très importante d'environ 1 mole par litre ou 400 g/l, 2o soit plus de dix mille fois supérieure aux concentrations usuelles en solution volumique, ce qui rend l'efficacité cytotoxique de cette surface extrêmement élevée et le risque de développement de souches résistantes devient quasiment nul.
Si on le souhaite, et pour des applications particulières, il est possible de diminuer la densité de molécules bio-actives présentes à la surface du matériau en introduisant une concentration variable d'espaceurs passifs, c'est-à-dire incapables de former une liaison covalence avec une molécule bio-active. La densité d'antibiotiques peut ainsi être ajustée facilement, par exemple entre 10" et 5.10'4 molécules / cm2.

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8 Les risques de relargage accidentel de molécules cytotoxiques dans le milieu extérieur, et à partir de la surface, sont inexistants. La couche monomoféculaire est greffée de façon irréversible sur le substrat solide. Les molécules bio-actives ne peuvent donc se détacher du substrat sur lequel elles ont été fixées. Les liaisons covalentes avec le substrat et entre les molécules elles-mëmes à l'intérieur de la couche monomoléculaire sont extrémement fortes et ne peuvent être détruites que par des traitements chimiques ou photochimiques très particuliers (irradiation ultra-violette vers 210 nm en présence d'ozone, lo rayonnements ionisants, etc...). De plus, mémo si la couche complète venait à se détacher, les risques biologiques resteraient limités : Si on dissout 1 cm2 de la couche greffée dans un volume liquide de 1 ml, par exemple du sang, la concentration d'antibiotiques serait au maximum de 1 umole/litre, ou encore 0,4 mgllitre. II y a donc un effet de dilution considérable. Par rapport à la concentration locale présente à la surface du matériau cytotoxique, le rapport de dilution est de 106. Une concentration de 1 ~molellitre ne présente aucun danger pour l'organisme.
Les matériaux à propriétés cytotoxiques décrites dans cette invention sont donc utilisables pour des applications sous-cutanée, intramusculaire ou intravasculaire.
La couche monomoléculaire résiste à des nettoyages prolongés par des solvants aqueux ou organiques, ainsi qu'à des températures de l'ordre de 120° C.
La couche monomoiéculaire est permanente dans le temps et ne nécessite pas de conditions de stockage et de conservation particulières.
La présente invention porte également sur un procédé de fixation covaiente de molécules à caractère bactéricide ou antibiotique sur des surfaces organiques et minérales par l'intermédiaire de molécules de

9 type espaceurs répondant à la formule ci-dessus. Ce procédé diffère en fonction de la nature exacte du support et de l'antibiotique à greffer.
Dans le cas où la surface est en verre ou en silice, ce procédé
de préparation des surfaces a déjà été décrit dans le cas particulier où les molécules greffées sont des trichloroalkylsilanes ou des trialkoxyalkylsilanes ne comportant pas en extrémité libre de groupe fonctionnel permettant une liaison covalente avec une molécule antibiotique (Nature, 360, 719 (1992)). Une description détaillée du mode de dépôt d'une couche monomolécuiaire de chaînes hydrocarbonées sur des t0 surfaces de silice hydratée via un groupe trichlorosilane peut être trouvée dans plusieurs articles récents (JB Brzoska et al, (1994) Langmuir 4367- 4373 ; D. L. Allara et al (1995), Langmuir 11 : 2357, 2360).
Le procédé décrit dans ces articles a été modifié de façon significative pour permettre la fixation des molécules bio-actives.
Le procédé de préparation des surfaces comprend donc - un nettoyage préalable de ladite surface, le but du nettoyage étant d'éliminer toute particule ou molécule qui serait susceptible d'empêcher la fixation de l'espaceur sur les groupements réactifs de la surface, - le cas échéant, une activation chimique de la surface solide afin de générer des groupes réactifs, - un dépôt d'une couche d'accrochage possédant une fonction réactive en position terminale externe, - un greffage chimique de l'antibiotique ou du bactéricide sur le groupement réactif de la surface ainsi modifiée.

Quand les surfaces sont des surfaces minérales, le nettoyage est effectué
- soit par immersion dans une solution d'eau oxygénée (H202) à 15 % que l'on décompose en ajoutant quelques gouttes de FeCl3, suivie 5 d'une deuxième immersion dans une solution d'H2S04 à 50 % ;
- soit par immersion dans un bain d'eau oxygénée 15 % et de soude (12 g/l).
La réactivité de ces surfaces peut être augmentée en les plongeant quelques secondes dans une solution de HF entre 3 et 10 %.
1o Les surfaces ainsi traitées sont ensuite rincées abondamment à l'eau distillée et séchées à l'étuve à 80°C pendant 10 à 15 min.
Dans le cas de surtaces de type organique, il peut être nécessaire selon la nature du support de générer des groupements réactifs a) si le substrat est du PVC, la surface est préalablement activée par le traitement suivant mise en contact avec une solution aqueuse d'azide de sodium à 10'z mol/l pendant 24 h, à 20-45°C ;
rinçage à l' eau ;
. mise en contact avec une solution aqueuse de NaBH4 à

10-2 mol/l pendant 24 heures, à 20-45°C.
c) lorsque le substrat est du polyéthylène téréphtalate (PET), la surface est préalablement activée par mise en contact de la surtace avec une solution de 1 à 5 % de 3-aminopropyltriethoxysilane dans du toluène pendant 24 heures sous argon.
De manière générale, que le substrat soit naturellement réactif ou modifié pour le rendre réactif, le procédé de l'invention consiste à faire réagir les groupes réactifs à la surface du substrat solide avec des molécules « e~paceur » comportant une tête greffable sur le support, une 3o chaîne alkyle comportant 2 à 18 groupes méthyle et une fonction terminale i

11 externe qui servira à greffer la molécule bio-active. Par exemple, on peut utiliser le chlorure de 11-(trichlorosilyl)undécènoyl (TCSUC). Le support préalablement nettoyé, et éventuellement activé, est immergé dans une solution contenant les molécules « espaceur » (environ 10-3 M). On laisse la réaction se faire pendant 24 heures à température ambiante.
Les molécules bio-actives utilisées peuvent étre soit des ammoniums quaternaires, comme le bromure du 2-hydroxyéthyl-diméthyldodécylammonium (HEDMDA), soit des antibiotiques, comme, par exempte !e 6-aminopenicillanate de triéthylammonium (APATEA), soit des fongicides.
De manière générale, ces molécules doivent posséder un groupe fonctionnel permettant la formation d'une liaison covalente avec les molécules « espaceur » déposées sur le substrat.
La réaction se fait en plongeant le support solide modifié avec les molécules « espaceur » dans une solution diluée contenant l'antibiotique (environ 10-3 M). La réaction dure 24 heures à température ambiante.
La présente invention porte également sur l'utilisation des surfaces de l'invention décrite ci-dessus, et susceptibles d'être obtenues 2o par le procédé décrit ci-dessus et illustré dans les exemples ci-dessous.
L'utilisation des surfaces de l'invention à des fins de décontamination peut intéresser de nombreux domaines industriels tels la santé, l'hygiène et l'agro-alimentaire. A titre d'exemple, on peut citer - l'utilisation d'une surface à la fabrication de contenants à
usage médical tels des bouteilles, des poches, des tubages, notamment ceux à usage unique ;
- l'utilisation d'une surtace à la fabrication de dispositifs médicaux pour le traitement des organes ex vivo ou in vivo, tels des cartouches de dialyse rénale ;

u

12 - l'utilisation d'une surface à la fabrication de matériels ou materiaux pour la dentisterie ou le nettoyage des dents ;
- l'utilisation d'une surface à la fabrication de prothèses osseuses ou vasculaires ;
- l'utilisation des surfaces à la décontamination des fluides domestiques, et en particulier l'eau et les boissons d'usage courant (jus de fruits, lait, vins, etc...), ou autres fluides alimentaires.
- l'utilisation des surfaces à la décontamination des effluents et fluides industriels, par exemple les fluides de coupe, lubrifiants, les fluides to pé#roliers tels le gazole, l'essence, le kérozène.
Les exemples ci-après, sans aucun caractère limitatif, sont destinés à illustrer les modalités de préparation des surfaces selon l'invention et leurs propriétés bactéricides, selon le support utilisé, l'antibiotique greffé, et la nature des bactéries que l'on cherche à détruire.
PARTIE EXPERIMENTALE
Toutes les surfaces ont été caractérisées par infrarouge (IR), photospectroscopie (XPS), ellipsométrie et mesure de l'angle de contact par la méthode de la goutte sessile décrite par C. Allain et al., Journal of Colloïd and Interface Science, 107, 5 (1985).
2o I. Préparation des réactifs A titre d'exemple, un silane portant un groupement terminal vinylique, un silane portant un groupement terminal chlorure d'acide, un antibiotique pénicillanique et deux bactéricides ont été utilisés. La préparation des trois derniers composés est décrite ci-dessous.
I.a. chlorure de 11-(trichlorosilyl)undécènoyl (TCSUC) On introduit dans une ampoule 5 ml (50 mole) de trichlorosilane, 3,6 ml (17 mole) de chlorure d'undécénoyle et 220 mg d'AIBN (2.2'-azo-bis-isobutyronitrile) préalablement recristallisé. Après dégazage, on scelle l'ampoule sous vide et on la chauffe à 80 °C
pendant

13 36 heures. Le produit de la réaction est distillé sous vide (Td = 128 °C sous 0,2 mmHg). Rendement : 50 %.
I.b. 6-aminopenicillanate de triéthylammonium (APATEA) On met en suspension 2 g (10 mole) d'acide 6-aminopénicillanique (6-APA) dans 60 ml d'un mélange EtOHlH20,(5/1 v/v) et on ajoute 1,4 ml (10 mole) de triéthylamine (TEA). Après solubilisation totale, le solvant est évaporé et le produit séché sous vide, Rendement 100 %.
I.c. Bromure du 2-hydroxyéthyl-diméthyldodécylammonium lo {HEDMDA) On dissout 10 g (47 mole) de N,N diméthyldodécyiamine et g (80 mole) de 2-bromoéthanol dans 60 ml d'acétone. On agite le mélange à reflux pendant 6 heures. Après refroidissement, le HEDMDA
précipite. Ce précipité est filtré, lavé à l'éther et séché sous vide.
Rendement : 81 %.
Le bromure du 5-bromopentyl-diméthyldodécylammonium (BPDMDA) est préparé selon ie méme procédé en utilisant du 1,5-dibromopentane au üeu du 2-bromoéthanol.
II. Préparation des surfaces minérales II-a. Nettoyage des surfaces Deux modes de nettoyage ont été utilisés:
1. Les surfaces sont plongées pendant 30 à 60 min dans une solution d'H202 à 15 %, que l'on décompose en ajoutant quelques gouttes de FeCl3. Elles sont ensuite trempées 5 min dans une solution d'H2S04 à
50%, rincées abondamment à l'eau distillée et séchées à l'étuve à 80°C
pendant 10-15 min.

14 2. Les surfaces sont plongées dans une solution d'H202 à

15 %. On ajoute prudemment de la soude en poudre (12 gll) et l'ensemble est agité pendant 1 h. Après rinçage à l'eau, les surfaces sont séchées à
l'étuve à 80°C pendant 10-15 min.
II-b. Dépot de la couche d'accrochage à terminaison chlorure d'acide ou vinylique La technique utilisée a été décrite par J.B. Brzoska et al, (1994) Langmuir 1Q 4367.
On prépare une solution de TCSUC (10-3 mol/I) dans un 1o mélange Hexane/CHZCI2 (70130 v/v) que l'on refroidit à 0°C sous argon. Les surfaces sont mises en contact avec cette solution pendant 1 h 30. Elles sont ensuite rincées pendant 5 min dans une cuve à ultrasons contenant du chloroforme. Finalement elle sont séchées sous un flux d'azote.
II-c. Modification éventuelle de la couche d'accrochage pour obtenir des fonctions carboxyliques (-COOH) On plonge les surfaces silanisées dans une solution aqueuse de Na2C03 à 5% pendant 2 x 24H. Après neutralisation comme précédemment, les surfaces sont rincées à l'eau distillée puis séchées sous azote.
2o II-d. Greffage de la molécule bio-active - Sun'ace fonctionnalisée avec des groupements carboxyliques (-COOH) On prépare une solution de CHC13 ou CH2C12 contenant : 10 -Z mol/L
d'APATEA et 10-2 mol/l de TEA. Après dissolution, on ajoute 10-2 mol/I de dicyclohexylcarbodümide et 2.10-3 mol/l de N,N diméthyiaminopyridine. Les surfaces sont plongées dans cette solution et le mélange est agité pendant 24 h. Les surfaces ainsi traitées sont rincées au chloroforme et séchées.
r - Surface fonctionnalisée avec des groupements chlorure d'acide (-COCI) Les surtaces sont plongées dans une solution de CHCl3 contenant 10-2 molli de HEDMDA et 10-2 mol/I de TEA. Après agitation 5 {24h), les surfaces sont rincées au chloroforme et séchées.
III. Préparation des scrfaces organic~i, Tous les matériaux organiques utilisés peuvent être nettoyés par immersion dans une solution éthanolique soumise à agitation ultrasonore pendant 5 min.
1o ill-a. Polychlorure de vinyle (PVC) Dans le cas du polychlorure de vinyle, il est nécessaire d'activer la surface en transformant les groupements chlorure en groupements amine.
Pour ce faire, le PVC est plongé dans une solution aqueuse 15 d'azoture de sodium à 10-2 mol/l. Après agitation pendant 24 h à
40°C, le PVC est lavé à l'eau. II est ensuite plongé dans une solution aqueuse de NaBH4 à 10-2 mol/I pendant 24h, à 40°C.
Le greffage de l'antibiotique peut-être effectué de deux façons:
1 ) Après rinçage à l'eau, le PVC est plongé dans une solution aqueuse de glutaraldéhyde à 5% v/v. L'ensemble est agité pendant 20 h, du NaBH4 (l0-2 M) est ajouté et l'agitation est poursuivie pendant 4 h, puis le PVC est rincé à l'eau Le PVC est ensuite plongé dans une solution aqueuse de 2-bromoéthylamine (10-2 M) et de soude {10-2 M). L'ensemble est agité
pendant 20 h, du NaBH4 (10-2 M) est ajouté et l'agitation est poursuivie pendant 4 h.

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16 Après rincage à l'eau, ie PVC est plongé dans une solution méthanolleau (75/25 v/v) contenant de la N,N-diméthyldodécylamine (10'2 M). L'ensemble est agité pendant 24 h, puis le PVC est rincé à l'eau et séché.
2} Après rincage à l'eau; le PVC est plongé dans une solution aqueuse de BPDMDA (10'2 M). L'ensemble est agité pendant 24 h à 40°C, puis le PVC est rincé à l'eau et séché.
Cette seconde méthode permet de conserver l'intégralité du PVC (caractéristique physique et composition chimique) lors du traitement d'un objet fini.
1o III-b PET (polyéthylène téréphtalate) Comme dans le cas du PVC, il est nécessaire d'activer la surface du PET en incorporant dans les chaînes de polymères des molécules d'aminoalkylsilanes. Pour ce faire, la méthode décrite par L.N.
Bui et al (1993), Analyst, _1~8 : 463 a été utilisée.
Le PET est plongé dans une solution à 2 % v/v de 3-aminopropyltriéthoxysilane dans du toluène pendant 24 h sous argon.
Après rinçage au chloroforme et au toluène, le PET activé est soit immergé
dans une solution de chlorure de sébacoyle à 3 % v/v dans du toluène contenant quelques gouttes de pyridine, soit dans une solution aqueuse de 2o glutaraldéhyde à 5% v/v, et l'ensemble est agité pendant 24 h sous argon.
Le PET est ensuite rincé au toluène (dans le cas du chlorure d'acide) ou à
l'eau (dans le cas de l'aldéhyde), puis à i'éthanol. Cette procédure permet de fixer les molécules espaceur à la surface du PET.
La transformation éventuelle des fonctions terminales chlorure d'acide des molécules espaceurs en groupements carboxyliques est effectuée comme pour les surfaces minérales.
n . r

17 Le greffage de l'antibiotique ou du bactéricide est ensuite effectué selon le même procédé que pour les surfaces minérales.
TESTS BACTÉRIOLOGIQUES
I. Protocole On commence par préparer une solution de milieu nutritif contenant une souche de staphylocoques blancs (staphylococcus epidermidis) (SB) à une concentration de l'ordre de 105-106 bactéries/ml.
Les surfaces sont testées en situation quasi-statique en les immergeant dans la solution de SB (sans agitation),. Le temps d'incubation 1o est généralement de 24 h et la température de 37,5°C.
Différents types de surtace ont été utilisés:
- Poudre (particules sphériques de diamètre inférieur au mm), - Billes (particules sphériques de diamètre supérieur au mm), - Tubes, films minces ou plaques épaisses, 1 s - Fibres.
II. Résultats La concentration en bactéries dans la solution après incubation avec les surfaces traitées est déterminée par mesure de la densité optique à 600 nm, numération sur boîte de Pétri et/ou comptage au 20 laser.
Les résultats obtenus pour différents matériaux sont rassemblés dans les tableaux ci-dessous.
T représente la température d'incubation en °C.
t représente le temps d'incubation en heures de la solution 2s [SB)o représente le nombre de bactéries par ml dans ta solution à l'instant initial, t = 0.

m

18 [SB]t représente le nombre de bactéries par ml dans la solution après incubation pendant le temps t.
II-1. Sable (99 % silice Si02}
Type Antibiotique T (C) t [SB]o [SB]t N
(h) Poudre sans 37,5 24 106 250.106 A1 (diamtre APATEA 37,5 24 106 40. 106 A2 :

200~m) HEDMDA 37,5 24 106 <100 A3 II-2. Verre (boro silicate contenant 60 % de silice}
Type AntibiotiqueT (C) t (h) [SB]o [SB], N

Billes sans 37,5 24 106 350.106 84 (diamtre APATEA 37,5 24 106 230. B5 : 106 2 mm) HEDMDA B6 Fibres sans 37,5 48 2.104 250.106 B7 (diamtre APATEA gg :

30~m) HEDMDA 37,5 48 2.104 40.106 B9 Tube sans g10

19 I I-3. PVC
Type AntibiotiqueT (C) t (h) [SBjo [Sgj~ N

Poudre sans 37,5 24 105 8.10' D1 BPDMDA 37,5 24 105 <100 D3 Broy sans 105 6.10' D4 (diamtre APATEA D5 :

3 mm) BPDMDA 105 <100 D6 Tube sans 37,5 24 105 7.108 D10 BPDMDA 37,5 24 105 <20 D12 II-5. PET
Type Antibiotique T (C) t (h) [SBjo [SB]t N

Poudre sans 37,5 24 104 4.10' E1 HEDMDA 37,5 24 104 102 E3 Fibres sans E4 Film sans E10 (paisseur APATEA E11 0,35 mm) HEDMDA E12 III. Analyse des résultats L'examen des différents tableaux met en évidence un effet bactéricide ou bactériostatique très net dans le cas des surfaces traitées.
La concentration finale de bactéries dans une solution mise en contact avec 5 des antibiotiques greffés est généralement nulle ou non mesurable dans les conditions utilisées alors que la concentration finale mesurée en l'absence d'antibiotiques devient 1000 fois supérieure à la concentration initiale, toutes conditions étant égales par ailleurs.
Cet effet est présent pour tous les types de surtaces et tous to les matériaux étudiés.
On observe que l'effet est d'autant plus important que la surface spécifique est grande (grand nombre de sites antibiotiques ou bactéricides) (comparer, par exemple, les cas A2 et B5).
L'efficacité bactéricide des surfaces traitées semble 15 exceptionnellement élevée. Dans un volume de 1 ml dans lequel on immerge une surface traitée de 2 cm2, on observe que toutes les bactéries sont détruites en 24 heures alors qu'un nombre équivalent de molécules bactéricides mises directement en solution est inefficace. Le calcul montre d'ailleurs que la concentration atteinte dans ce cas (< 1 pglml) est inférieure 2o à la CMB de l'antibiotique.
Les valeurs de CMB mesurées pour ces antibiotiques en solution sont de 64 Ng/ml et de 4 Ng/ml respectivement pour APATEA et HEDMDA (ou BPDMDA).
Les avantages des surfaces de l'invention sont, en résumé, les suivants - le greffage chimique rend le traitement bactéricide de surtace permanent et irréversible ;
T~ ' I

- l'éventualité d'un relargage accidentel des molécules organiques utilisées dans le milieu environnant est pratiquement nulle du fait des liaisons covalentes avec le substrat ;
- la couche de molécules organiques étant d'épaisseur monomoléculaire, une quantité très faible de produit actif suffit pour recouvrir totalement tes surfaces que l'on désire traiter ;
- la concentration loça(e en molécules bio-actives est très importante, typiquement dix mille fois plus élevée que les doses usuelles en solution, ce qui confère une efficacité bactériologique exceptionnelle aux surfaces traitées ;
- l'interaction entre la surface traitée et les bactéries à détruire est basée sur des principes-l physico-chimiques très généraux plutôt que sur des interactions spécifiques. Un même revêtement est donc actif sur plusieurs classes de bactéries et levures ;
- les molécules utilisées ne sont pas des antibiotiques et ne posent donc pas de problème d'écologie microbienne ;
il est possible de déposer des "cocktails" de molécules antibactériennes sur une même surface de façon à élargir le spectre d'action ;
- il n'y a pas "consommation", et donc pas épuisement des produits 2o antibactériens déposés au cours du temps ;
- la localisation des agents antibactériens sur les surfaces empêche la formation de biofilms et le développement de colonies bactériennes ;
- les objets traités sont auto-stériles et ne demandent pas de conditions de stockage particulières ;
- le traitement de surface est extrêmement résistant. Les matériaux traités peuvent être lavés avec tous les solvants habituels, être chauffés à des températures élevées (120° C), ou encore être stérilisés à l'oxyde d'ethylène. Une stérilisation ou une décontamination de type classique est donc possible ;

- les traitements chimiques choisis ne modifient les polymères traités que sur des épaisseurs atomiques ; ni les propriétés structurales des polymères, ni leur aspect extérieur ne sont affectés ;
- les objets traités peuvent avoir des formes et des dimensions quelconques. Dans le cas de tubes creux, la section interne aussi bien, que la section externe peuvent être recouvertes en une seule et même étape.
De même, les surfaces n'ont pas besoin d'être planes ou lisses.
n T

Claims

REVENDICATIONS

1. Surface douée de propriétés antibiotiques ou antiseptiques à haute densité, constituée d'un substrat solide modifié par fixation covalente d'un ou plusieurs espaceurs, caractérisée en ce qu'une ou plusieurs molécules antibiotiques, bactéricides, virucides ou fongicides sont liées de façon covalente à l'extrémité réactive dudit ou desdits espaceurs, lui-même étant de formule (CH2)n-A2 dans laquelle - A1 est X, OH, CO-Z, ou Y3-Si avec X un halogène, Z=H, OH ou Cl; Y = X
ou un groupe alkoxy de 1 à 3 atomes de carbone;
- n est compris entre 2 et 24;
- A2 est choisi parmi les résidus CH3, CH=CH2, OH, halogéné ou CO-Z, avec Z = H, OH ou Cl.

2. Surface selon la revendication 1 caractérisée en ce que n est compris entre 5 et 18.

3. Surface selon l'une des revendications 1 à 2 caractérisée en ce que l'antibiotique est susceptible d'agir au niveau des parois bactériennes.

4. Surface selon la revendication 3 caractérisée en ce que l'antibiotique comporte un noyau .beta.-lactame.

5. Surface selon la revendication 4 caractérisée en ce que l'antibiotique est choisi parmi les penicillines, les céphalosporines, les monobactames, les thiénamycines, les inhibiteurs des .beta.-lactamases, les inhibiteurs de la synthèse des peptidoglycanes, les polypeptides basiques telles la bacitracine et la novobiocine.

6. Surface selon l'une des revendications 1 à 2 caractérisées en ce que le bactéricide est un ammonium quaternaire.

7. Surface selon l'une quelconque des revendications 1 à 6 caractérisée en ce que le substrat est un support minéral.

8. Surface selon la revendication 7 caractérisée en ce que le support minéral est en verre ou en fibre de verre.

9. Surface selon l'une quelconque des revendications 1 à 6 caractérisée en ce que le substrat est un oxyde de métal.

10. Surface selon la revendication 9 caractérisée en ce que le substrat est choisi parmi Al2O3, SnO2 et InO3.

11. Surface selon l'une quelconque des revendications 1 à 6 caractérisée en ce que le substrat est un plastique organique.

12. Surface selon la revendication 11 caractérisée en ce que le plastique organique est choisi parmi un polyéthylène, un chlorure de polyvinyle (PVC), des polyacrylates, des polyméthacrylates, du polypropylène, des polyamides, des polyuréthanes, de l'acrylonitrile-butadiene-styrene (ABS), des polyesters saturés ou insaturés, le polyéthylène téréphtalate (PET), des polycarbonates, des polyacrylamides, le Téflon ® (PTFE), des polysiloxanes, des polysaccharides et tout polymère ou copolymère susceptible d'être greffé avec un espaceur comprenant deux extrémités réactives.

13. Surface selon l'une quelconque des revendications 1 à 12 constituant un contenant d'un produit à usage médical, chirurgical, cosmétique alimentaire ou d'hygiène.

14. Surface selon l'une quelconque des revendications 1 à 12 constituant des particules de diamètre compris entre quelques microns et quelques millimètres.

15. Surface selon la revendication 14 caractérisée en ce que les particules forment du sable.

16. Surface selon l'une quelconque des revendications 1 à 12 caractérisée en ce qu'elle constitue une prothèse à usage médical.

17. Surface selon la revendication 16 caractérisée en ce que la prothèse est une lentille de contact.

18. Surface antibiotique selon l'une quelconque des revendications 1 à 12 caractérisée en ce que la densité de sites actifs d'antibiotiques par unité de surface est comprise entre 10 11 et 5.10 14 molécules d'antibiotiques par cm2.

19. Surface douée de propriétés antibiotiques selon l'une quelconque des revendications 1 à 18 caractérisée en ce qu'un ou plusieurs antibiotiques différents sont greffés sur ladite surface, sur laquelle ils forment une couche monomoléculaire d'épaisseur inférieure à 4nm.

20. Procédé de préparation de surfaces selon l'une quelconque des revendications 1 à 12 comprenant au moins les étapes suivantes:
- un nettoyage de la surface;
- le cas échéant, une activation chimique de la surface afin de générer des groupes réactifs;
- un dépôt d'une couche d'accrochage possédant une fonction réactive en position terminale externe;
- le greffage chimique de l'antibiotique, du bactéricide ou du fongicide sur le groupement réactif de la surface ainsi modifiée.

21. Procédé de préparation de surfaces selon la revendication 20 caractérisé
en ce que quand le substrat est du PVC, il comprend au moins les étapes suivantes:
- le nettoyage de la surface;
- une activation chimique de la surface afin de générer des groupes réactifs par mise en contact avec une solution aqueuse de NaN3, - une mise en contact avec une solution aqueuse de NaBH4.

22. Procédé selon la revendication 20 ou 21 dans lequel les surfaces sont modifiées avec du APATEA, du HEDMDA ou du BPDMDA.

23. Procédé de préparation de surfaces selon la revendication 20 caractérisé
en ce que quand le substrat est du polyéthylène téréphtalate (PET), il comprend au moins les étapes suivantes:

- une activation chimique de la surface par mise en contact avec une solution de 1 à 5% de 3-aminopropyltriethoxysilane dans du toluène pendant 24 heures sous argon, - un greffage chimique de l'antibiotique, du bactéricide ou du fongicide sur le groupement réactif de la surface ainsi modifiée.

24. Procédé selon la revendication 23 dans lequel les surfaces sont modifiées avec du APATEA, du HEDMDA ou du BPDMDA.

25. Utilisation d'une surface selon l'une quelconque des revendications 1 à 19 à la fabrication de contenants à usage médical.

26. Utilisation d'une surface selon la revendication 25 dans laquelle les contenants à usage médical sont choisis parmi bouteilles, poches et tubages à
usage unique ou multiple.

27. Utilisation d'une surface selon l'une quelconque des revendications 1 à 19 à la fabrication de dispositifs médicaux pour le traitement des organes ex vivo ou in vivo, tels des cartouches de dialyse rénale.

28. Utilisation d'une surface selon l'une quelconque des revendications 1 à 19 à la fabrication de matériels ou matériaux pour la dentisterie ou le nettoyage des dents.

29. Utilisation d'une surface selon l'une quelconque des revendications 1 à 19 à la fabrication de prothèses.

30. Utilisation d'une surface selon la revendication 29 dans laquelle les prothèses sont osseuses ou vasculaires.

31. Utilisation d'une surface selon l'une quelconque des revendications 14 et 15 à la préparation de bacs à sable pour les enfants.

32. Utilisation d'une surface selon l'une quelconque des revendications 14 et 15 pour la stérilisation des boissons d'usage courant et autres denrées fluides alimentaires.

33. Utilisation d'une surface selon l'une quelconque des revendications 14 et 15 pour la stérilisation des fluides industriels.