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CO~IPOSITION IM~IUNO~IODULATRICE UTILE EN PARTICULIER POUR LE
TKAITEMFNT DEIS INFECTIONS PROVOQII~ES PAR VIH.
La presente invention se rapporte à une nouvelle composition S immunomodulatrice contenant des principes actifs d'un extrait végétal pouvant etre obtenu par e.Ytraction à partir des feuilles d'une plante de la famille des Buxacées, et m~ du genre Bu~us. L'invention concerne egalement un médicament contenant cette composition, utile en particulier comme immunomodulateur et pour le traitement des affections I() pro~oquées par le virus de l'immunodéficience humaine (Vl~
Le s~ndrome d'immunodéficience acquise (SIDA) se développe à la suite de l'infection d'ull indi~idu par le VIH; le Vlll reconnait le récepteur CD~ exprimé a la surface des Iymphocytes T~. Une période asymptomatique pou~ ant durer plusieurs années peut suivre la contamination initiale. Le 1~ déclenchement du SIDA est entrainé par l'activation des cellules et la multiplication du virus qui se propage a d'autres Iymphocytes. Ia phase clinique de la maladie se traduit par la survenue d'affectlons opportunistes ~t la modification de ~dl.illl~ S sanguins, commc la chute du taux de CD~
ou l'augmentation de l'antigénémie p2cl.
~() L'eYtrême variabilité du Vl~} rend tres difficile la mise au point d'un traitement efficace.
La demande de brevet FR ~ 6~8 835 a proposé l'utilisation d'un e~trait préparé à partir du bois, de la raclne et de l'écorce de la racine de ~uYus sempervirens, essentiellement constitué d'alcaloïdes stéroïdiques, ~5 pour le tr~itement du SIDA.
De manière inattendue, la Demanderesse a maintenant trouvé qu'un e~;tr~it végetal obtenu à panir de plantes de 1~ famille des Buxacées, dont les alcaloïdes ont été pratiquement éliminés, possede une activité
immunomodulatrice. C~est pourquoi la présente illvention a pour objet une O composition immunomodulatrice contenant des principes actifs d'un eYtrait végétal, caractérisée en ce que l'extrait végétal peut être obtenu par la mise en oeuvre des opérations successi~ es suivantes:
a) les feuilles d'une plante de la famille des Bu.~acées sont soumises à une étape d'extraction par un mélange eau/solvanl organique, puis les 3~ solvants sont éliminés pour obtenir un extrait brut solide, .. ..... .. . .... .... ... . . _ . _ . _ . _ _ wo~s/23606 218~ /r~ 7 b~ l'e~ it brut est remis en suspension dans un mélange hydroalcoolique puis introduit dans une colonne de résine non ionique ma--ul,o~.n~c, qui est éluée par un mélange hydroalcoolique, de racon à récupérer un extrait essentiellement dépour~u de sucres, S c) les solvants de l'extrait obtenu à l'issu de l'étape ~) sont éliminés et le residu est remis en solution dans de l'eau, d) la solution ~queuse obtenue à l'issue de l'érape c~ est introduite dans une colonne de résine .S~h~n~e--ce de catiolls Faiblement acide, qui est éluée par de l'eau, 10 e) les solvants sont éliminés de Itéluat obtenu a l'issue de l'étape d) et le résidu solide est remis en solution a~ueuse à pH acide, f) la solution aqueuse est introduite dans une coionne de résine érh~n~2~c~ de cations fortement acide, qui est éluée par de l'eau, de facon à recupérer un extrait végétal essentiellement dépourvu d'alcaloides.
Ia préparation s'effectue de préférence sur des feuilies sèches, broSées, d~Lalds~e~.. de toute trace de bois ou de racine, les feuilles sont é~elltuellement réduites en poudre avant d'être soumises à l'extraction.
L'extraction à l'étape a~ peut avantageusement etre effectuée par 20 un mélange hydroaicoolique, par exemp~e par un mélange éthanol~eau, dans des rapports compris entre 99~1 et ~5~35, de manière préférée entre 90~10 et 75~5. Un mélange éthanol~eau dans un rapport de 80~2û est particulièrement approprié.
Seion l'un des modes de mise en oeuvre de l'invention, I'extraction de l'étape a) peut étre effectuée à température ambiallte, c'est-à-dire comprise entre environ 18 C et 30 C, de l'ordre de 20 à 26 C. L'etape d'extraction comprend de préférence plusieurs extractions repétées, chaque période d'extraction pouvant durer plusieurs semaines. Après chaque période d'extraction, le mélange est filtré pour séparer le solide de O la solution. Le solide est ensuite réextrait dans ies conditions décrites préc~ n-m~nt Les solutions pro~!enant des extractions successives sont ensuite réunies, filtrées pour eliminer toute particule solide puis évaporées soit sous pression réduite à une température ne dépassallt pas ~0 C, soit Iyophilisee.
W095t23606 2 ~ ~ 4 ~ g 9 r-llr~ 47 Par exemple, 4 I;g de feuilles sont mis en suspension avec 5 litres d'un mélange d'éthanol absolu (4 litres) et d'eau ( 1 litre) dans un récipient fermé et soumis à une agitation mécanique pendant trois semaines. L'extract~on s'effectue à t~ dlUI~: ambiante. Le mélange est 5 filtré. La solution éthanolique est conser~ée. Le résidu solide est mélangé à
5 litres du meme mélange éthanol-eau 80/20 (volume/volume).
L'opération precédente est ainsi renou~elée deux fois.
Les solutions éthanoliques sont réunies et traitées pour obtenir l'extrait brut solide.
Selon un autre mode de mise en oeuvre de l'invention, I'extraction de l'étape a) est effectuée à chaud. Elle est effectuée de préférence plusieurs fois, pendant p~usieurs heures, au moyen d'un solvant organique et d'eau au reflu.x.
Par exemple, I'extraction est erfectuée en placant les feuilles 1~ broyées (100 g) en ~ .IsiL~l dans le melange éthanol (400 ml) et eau ~100 ml), dans un ballon surmonté d'un réfrigérant. La suspension est chauffée jusqu'à l'ébullition qui est maintenue pendant 9 heures. La suspension est ensuite refroidie, filtrée et le résidu solide est repris dans les memes conditions que celles décrites ci-dessus. L'opération est 20 rcnouvelée en tout trois fois.
Les solutions provenant des extractions successives sont ensuite réunies et traitées comme pour l'extraction effectuée à froid, afin d~obtenir un extrait brut solide.
L'eYtrait brut solide est remis en suspension pour subir plusieurs 25 etapes de fractionnement par chromatographie d'adsorption et de partition. Le rllélange hydroalcoolique scrvant à préparer cette suspension est de préférence constitué par un mélange éthanol/eau, dans Ics proportions indiquées pour le mélange utilisé à l'étape a).
Le passage sur la colonne de résine macroporeuse de l'étape b) 30 permet d'éliminer essentiellement les sels et les sucres présents dans l'e.~trait brut solide de départ.
W0 9~5/23tiC6 ~ /r~,S.'~ 47 ~18~99 Par exemple, une coloIme de 3 cm de diarllètre et de 50 cm de hauteur est remplie par une s~-~r~n~ n de DUOLITE S 861 (Rohm & Haas) dans un mélange d'éthanol et d'eau 80/Z0 (volume~volume). 5g d'extra~t en solution dans 10 cm3 d'eau distillee sont deposés au sommet de la coionne. On fait passer à travers la colonne, pour l'élution, 1 litre du meme mélange éthanol-eau. La solution recueillie est évaporée sous pression réduite ou Iyophilisée.
L'extrait dépour~u de sucre ainsi obtenu, est de préférence trituré
dans de l'eau distillée, pour séparer une fraction insoluble. I.'extrait obtenu à l'issue de l'étape b, débarassé de la fraction insoluble et remis en solution aqueuse, est séparé par passage sur une colonne de résine Prh~n~el-c~ d~ions, faiblement acide, ce qui COnSlitue l'étape d) ci-dessus.
Par exemple, dans une colonne, de mémes dimensions que celle décrite à l'étape précédente, on place en suspension dans de l'eau distiLiée 1~ ulle résine échangeuse de cations faiblement acide, par exe~npie une résine Amberlite IRC 50 (Rohm & Haas). L'extrait, débarrassé de la fraction insoluble, est mis en solution dans de l'eau distillee ( 10 cm31 et dépose sur la colonne. L'elution est effectuée au moyen d'un litre d'eau distillee. La nouvelle solution obtenue est évaporée sous pression reduite à une l-.~.,ué.dlull: ne dépassant pas ~0 C, ou Iyophilisée.
On obtient un résidu solide qul est remis en solution aqueuse à pH
acide puis fractionné par passage sur une colonne de résille échangeuse cationique fortement acide, possédant de préférence des ~roupes fonctionnels sulfonate ~étape n ).
Par exemple, une résine Amberlite IR 120 (Roh~l et Haas) sous forme ionique Nai ~st placée en suspension dans l'eau distill~e dans une colonne de mèmes dimensions qu'à l'étape précédente. I.'extrait est solubilisé dans 10 cm3 d'eau distillée et le pll de cette solutioll est ajusté àpl-I = 2. Cette solution est déposée sur la colonne et l'élution s'effectue par un litre d'eau distillée. La nouvelle solution obtenue est evaporée sous presslon réduite à une ltlll~CldlUI~: ne dépassant pas 40~ C, ou Iyophilisée.
Wo 9s~23606 2 1 8 4 ~ 9 9 ~ ~ l/r~ I ~ -Lj7 On obtient un extrait qui, à l'issue des étapes e) et f) est essentiellem~nt débarrassé des alcaloïdes présents dans le produit de départ.
L'extrait végétal selon l'invention peut etre obtenu par la mise en oeuvre des étapes du procéde défini ci-dessus, à partir de plantes de la famille des Buxacées appartenant au genre Buxus, et en particulier à
partir de Buxus sempervirens.
En ~ dl~hie basse pressioll sur colonne Zorba.~ OL)S SB~
(250 x 4,6 mm) (colonne de silice, ~ ialisée par Dupont de Nemours) 10 éluée par un mé}ange eau + 19~o d'acide trifluoroacét~que, avec un débit de I mlfmin, la composition présente, à 255 nm, le spectre .~I.a~l~Li: sur la figure 1, ~c~ ;LIIt 6 pics majeurs.
Ces pics sortent aux temps suivants: - 0,07 min - entre 3,72 et 4,87 min 1~ - 8,75 min - 1 1 , 1 7 min - 1~,29 min - 28,70 min La composition selon l'invention, en chromatographie sur appareil Waters 990, sur colonne ~ypersil BDS C18~g (100 mm x 1,6 mm), éluée par de l'acétate d'ammonium, pH 5,9 (10 min) puis par un gradient jusqu'à
acétonitrile-eau 70% (70 min), présente, à 75~ nm, le spectre representé
sur la figure 2. i--La colonne ~persil BDS C18 est une colollne de silice greffée par ~5 des chaînes carbonées possédant 18 atomes de carbone, commercialisée par Millipore.
Le spectre a éte enregistré sur un chromatographe liquide haut~
pression Waters 990, le spectre a été enregistré à 254 nm, la colonne utilisée est une Hypersil BDS C18, support de 3 microns (dimensions de la colonne 100mm x 4,6mm). I'échantillo~l a été prép~ré par mise en solution de 30,5 mg de SPV 30 dans 750 micro litres d'eau distillée. Cette solution a été ~lltrée sur un micro~iltre de type Millex GV13. 10 microlitres ont été
injectés dans l'appareil. L'élution a ét~ programmée en ~radient de la manière sui~ante: pendant 10 mn avec une solution d'acétate 3~ d'ammonium 0,1 Molaire (pll 5,9), puis en 20 mn passage de cette première solution à un mélange final acétonitrile-eau à 70% (par enrirhiccPmrnt en acétonitrile).
,,, _ ,,, , . ,,, .. , . . . .... .. , , .... . . , , .. , ... .. . .. . , .. , _ _ WO 9~123~0~ rl . ~7 ~18~99 La figure 3 le~,és~ le spectre à 254 nm de la phase aqueuse obtenue après une extraction chloroforme.~eau de la composition selon l'inventioll, et Filtration sur Millex GV13, par chromatographie sur une colonne Hypersi~ BDS C18, dans des conditions Identiques à celles de la S cf)mr~-sjti( tn tota~e.
La figure 4 représente Ic spectre chromatographique de la phasc chloroformique obtenue après une extraction chloroforine~eau de la composition selon l'invention et fi~tration sur Millex GV13, sur une colonne Hypersil BDS C18 dans des conditions identiques à ce~les suivies ~0 pour la composition totale.
La figure S représente le spectre UV des trois principaux produits trouvés dans la phase chloroformi4ue.
I.a composition selon l'invelltion présente une acti~ieé
immumJ.~Ioduldllice sur les cellules immuno~ lltes humaines.
La composition selon l'invention stimule la production basale d'lL-1~, de T~'F~ et de (:I~I-CSF par les cellules mononuclées du sang périphérique, de manière dose-dépendante.
Cependant, I'activation de la production induite par d'autles activateurs est inhibée par ies compositions selon l'in~entio~ us4u'à 90~6 20 pour le Ghl-CSF ct à environ 30% pour le TN~
L'extrait selon l'invention est sans action sur la production d'lL-6.
La composition est également sans actio~l sur la production basale d'lL-2. I.orsque la production d'lk7 est stimulée par des activateurs comms~
la ph~to-h~maglutinine, ou le PMA, I'addition d'ulle composition selon 7S l'ill~ention entraine une inhibition de cette production.
Les ~olllpu~ JIls selon l'invention renforcent l'eftet inhibiteur de la ciclosporine sur la production d'}l.-2.
Les compositions selon l'invention ont une action antagoniste de l'illhibition de ia prolifération cellulaire Induite par la ciclosporine.
3() C'est pourquoi la présente illvention a égalemel~t pour obiet un médicament, caractérisé en ce qu'il contient une composition contenanf les principes actifs de l'extrait végétai pou~ant etre obtenu par les étapes a~ à f) décrites ci-dessus.
Plus particulièrement, I'in~-ention concerne l'utilisation d'une telle 35 composition poLr la preparation d'un médicament utile comme immunom~-d~ tf~t~r wo gsl23606 2 1 8 4 6 9 9 r l/rl~7 b. 47 De manière générale les compositions selon l'invention ont une activité immunostimulante sur les cellules quiescentes tll~ , GM-CSF), immunosu~",~ e sur les cellules activées (IL-2, G~I-CSF), agoniste de la ciclosporine A dans l'inhibition de 1~ synthèse d'lL-2, antagoniste de 5 la ciclosp~rine A dans l'inhibition de la prolifér~tion.
Les médicaments selon l'invention pourront donc ètre avantageusement utilisés lors de transplantation d'organes, dans le traitement des maladies dul~ .,ulles ainsi que dans le traitement de l'infection à Vlll.
L'invention a égalemellt pour objet l'utilisation d'une composition selon l'invention po~ir la préparatioIl d'un médicament utile pour le traitement des infections virales, en particulier provoquées par les retrovirus comme le VIH.
L'administration de telles compositions selon l'invention à des sujets infectés par le VIH est bien tolérée et entraine une remontée du taux de CD~.
L'invention conceme également un procédé de stimulation in vitro des Iymphocytes, caractérisé en ce qu'on introduit dans une culture l)mphocytaire ulle composition selon l'invention.
Les exemples qui suivent sont destinés à illustrer l'invention sal~s aucunement en limiter la portée.
Exemple l: Préparation d'un extrait végétal selon l'invention (SPV 30) -wo ~ s / 23606 ~ 8 ~ 6 ~ 9 P ~ llr ~ 47 I
CO ~ IPOSITION IM ~ IUNO ~ IODULATOR USEFUL PARTICULARLY FOR
TKAITEMFNT DEIS HIV-PROVIDED INFECTIONS.
The present invention relates to a new composition S immunomodulator containing active ingredients from a plant extract obtainable by e.Ytraction from the leaves of a plant of the Buxaceae family, and m ~ of the genus Bu ~ us. The invention relates to also a medicament containing this composition, useful in particular as an immunomodulator and for the treatment of ailments I () pro ~ oquées by the human immunodeficiency virus (Vl ~
The acquired immunodeficiency syndrome (AIDS) develops when as a result of HIV infection; the Vlll recognizes the receiver CD ~ expressed on the surface of T ~ lymphocytes. An asymptomatic period may last several years may follow initial contamination. The 1 ~ triggering of AIDS is caused by the activation of cells and multiplication of the virus which spreads to other lymphocytes. The phase clinical disease results in the occurrence of opportunistic affections ~ t the modification of ~ dl.illl ~ S blood, as the drop in CD levels ~
or increased p2cl antigenemia.
~ () The extreme variability of Vl ~} makes it very difficult to develop a effective treatment.
Patent application FR ~ 6 ~ 8,835 proposed the use of a e ~ trait prepared from wood, root and bark from the root of ~ uYus sempervirens, essentially consisting of steroidal alkaloids, ~ 5 for the treatment of AIDS.
Unexpectedly, the Applicant has now found that a e ~; tr ~ it vegetal obtained from plants of 1 ~ Buxaceae family, of which alkaloids have been virtually eliminated, has activity immunomodulatory. This is why the present invention relates to a O immunomodulatory composition containing active principles of a Plant extract, characterized in that the plant extract can be obtained by implementing the following successive operations:
a) the leaves of a plant of the family Bu. ~ acées are subjected to a extraction step with an organic water / solvanl mixture, then 3 ~ solvents are removed to obtain a solid crude extract, .. ..... ... .... .... .... . _. _. _. _ _ wo ~ s / 23606 218 ~ / r ~ 7 b ~ the raw e ~ it is resuspended in a hydroalcoholic mixture then introduced into a column of non-ionic resin ma - ul, o ~ .n ~ c, which is eluted by a hydroalcoholic mixture, of racon to recover a extract essentially devoid of sugars, S c) the solvents of the extract obtained at the end of step ~) are removed and the residue is redissolved in water, d) the solution ~ queuse obtained at the end of the c ~ crape is introduced into a column of resin .S ~ h ~ n ~ e - this of weakly acidic catiolls, which is eluted by water, E) the solvents are removed from the gelatin obtained at the end of step d) and the solid residue is redissolved in a ~ uous solution at acid pH, f) the aqueous solution is introduced into a resin region erh ~ n ~ 2 ~ c ~ of strongly acidic cations, which are eluted by water, way to recover a plant extract essentially lacking of alkaloids.
Ia preparation is preferably carried out on dry leaves, embroidered, d ~ Lalds ~ e ~ .. from any trace of wood or root, the leaves are é ~ elltuelles pulverized before being subjected to extraction.
The extraction in step a ~ can advantageously be carried out by 20 a hydroaicoolic mixture, for example by an ethanol ~ water mixture, in ratios between 99 ~ 1 and ~ 5 ~ 35, preferably between 90 ~ 10 and 75 ~ 5. An ethanol ~ water mixture in a ratio of 80 ~ 2û is particularly suitable.
According to one of the modes of implementation of the invention, the extraction of step a) can be carried out at room temperature, that is to say between approximately 18 C and 30 C, of the order of 20 to 26 C. The stage preferably comprises several repeated extractions, each extraction period can last several weeks. After each extraction period, the mixture is filtered to separate the solid from O the solution. The solid is then re-extracted under the conditions described prev ~ nm ~ nt The solutions pro ~! enant successive extractions are then combined, filtered to remove any solid particles and then evaporated either under reduced pressure at a temperature does not exceed ~ 0 C, or Iyophilized.
W095t23606 2 ~ ~ 4 ~ g 9 r-llr ~ 47 For example, 4 I; g of leaves are suspended with 5 liters a mixture of absolute ethanol (4 liters) and water (1 liter) in a container closed and mechanically stirred for three weeks. The extract ~ is carried out at t ~ dlUI ~: ambient. The mixture is 5 filtered. The ethanolic solution is stored. The solid residue is mixed with 5 liters of the same 80/20 ethanol-water mixture (volume / volume).
The previous operation is thus renewed ~ elée twice.
The ethanolic solutions are combined and treated to obtain solid crude extract.
According to another embodiment of the invention, the extraction of step a) is carried out hot. It is preferably done several times, for several hours, using a solvent organic and reflux water x.
For example, the extraction is made by placing the leaves 1 ~ crushed (100 g) in ~ .IsiL ~ l in the ethanol (400 ml) and water mixture ~ 100 ml), in a flask surmounted by a condenser. The suspension is heated until boiling which is maintained for 9 hours. The suspension is then cooled, filtered and the solid residue is taken up in the same conditions as those described above. The operation is 20 rcovered altogether three times.
The solutions from successive extractions are then combined and processed as for cold extraction, so to obtain a solid crude extract.
The solid raw extract is resuspended to undergo several 25 stages of fractionation by adsorption chromatography and partition. The hydroalcoholic mixture to prepare this suspension is preferably constituted by an ethanol / water mixture, in Ics proportions indicated for the mixture used in step a).
Passing over the column of macroporous resin from step b) 30 essentially eliminates the salts and sugars present in e. ~ solid gross starting line.
W0 9 ~ 5 / 23tiC6 ~ /r~,S.'~ 47 ~ 18 ~ 99 For example, a color of 3 cm in diameter and 50 cm in height is filled with a s ~ - ~ r ~ n ~ n of DUOLITE S 861 (Rohm & Haas) in a mixture of ethanol and water 80 / Z0 (volume ~ volume). 5g extra dissolved in 10 cm3 of distilled water are deposited at the top of the coion. We pass through the column, for the elution, 1 liter of the same ethanol-water mixture. The collected solution is evaporated under pressure reduced or freeze-dried.
The extract of ~ u sugar thus obtained is preferably triturated in distilled water, to separate an insoluble fraction. I. extract obtained at the end of stage b, rid of the insoluble fraction and put back in aqueous solution, is separated by passage over a column of resin Prh ~ n ~ el-c ~ d ~ ions, weakly acid, which COnSlitue step d) above.
For example, in a column, of the same dimensions as that described in the previous step, placed in suspension in distilled water 1 ~ ulle weakly acidic cation exchange resin, e.g. ~ npie one Amberlite IRC 50 resin (Rohm & Haas). The extract, freed from the fraction insoluble, is dissolved in distilled water (10 cm31 and deposited on the column. The elution is carried out by means of a liter of distilled water. The new solution obtained is evaporated under pressure reduced to a l-. ~., ué.dlull: not exceeding ~ 0 C, or freeze-dried.
A solid residue is obtained which is returned to an aqueous solution at pH
acid then fractionated by passage over a column of exchange mesh strongly acidic cationic, preferably having ~ roups functional sulfonate ~ step n).
For example, an Amberlite IR 120 resin (Roh ~ l and Haas) under Nai ~ st ionic form suspended in distilled water in a column of same dimensions as in the previous step. I. the extract is solubilized in 10 cm3 of distilled water and the pll of this solutioll is adjusted to pl-I = 2. This solution is deposited on the column and the elution is carried out by one liter of distilled water. The new solution obtained is evaporated under presslon reduced to a ltlll ~ CldlUI ~: not exceeding 40 ~ C, or freeze-dried.
Wo 9s ~ 23606 2 1 8 4 ~ 9 9 ~ ~ l / r ~ I ~ -Lj7 An extract is obtained which, at the end of steps e) and f) is essentially ~ rid of alkaloids present in the product of departure.
The plant extract according to the invention can be obtained by placing work of the stages of the process defined above, from plants of the Buxaceae family belonging to the genus Buxus, and in particular to from Buxus sempervirens.
In ~ dl ~ hie low pressioll on Zorba column. ~ OL) S SB ~
(250 x 4.6 mm) (silica column, ~ ialized by Dupont de Nemours) 10 eluted by a mé} angel water + 19 ~ o of trifluoroacét acid ~ that, with a flow of I mlfmin, the composition has, at 255 nm, the spectrum. ~ Ia ~ l ~ Li: on the Figure 1, ~ c ~; LIIt 6 major peaks.
These peaks come out at the following times: - 0.07 min - between 3.72 and 4.87 min 1 ~ - 8.75 min - 1 1, 1 7 min - 1 ~, 29 min - 28.70 min The composition according to the invention, in apparatus chromatography Waters 990, on a column ~ ypersil BDS C18 ~ g (100 mm x 1.6 mm), eluted with ammonium acetate, pH 5.9 (10 min) then by a gradient to acetonitrile-water 70% (70 min), presents, at 75 ~ nm, the spectrum represented in Figure 2. i--The BDS C18 parsley column is a silica column grafted with ~ 5 carbon chains having 18 carbon atoms, marketed by Millipore.
The spectrum was recorded on a high liquid chromatograph ~
Waters 990 pressure, the spectrum was recorded at 254 nm, the column used is a Hypersil BDS C18, support of 3 microns (dimensions of the column 100mm x 4.6mm). I'échantillo ~ la summer prep ~ re by solution 30.5 mg of SPV 30 in 750 micro liters of distilled water. This solution has been ~ lltrée on a micro ~ ilter type Millex GV13. 10 microliters were injected into the device. The elution was ~ programmed in ~ radiate from the sui ~ ante way: for 10 min with an acetate solution 3 ~ 0.1 Molar ammonium (pll 5.9), then in 20 minutes passage of this first solution to a final acetonitrile-water mixture at 70% (by enrirhiccPmrnt in acetonitrile).
,,, _ ,,,,. ,,, ..,. . . .... ..,, ..... . ,, .., ... ... ... , .., _ _ WO 9 ~ 123 ~ 0 ~ rl. ~ 7 ~ 18 ~ 99 Figure 3 the ~, és ~ the spectrum at 254 nm of the aqueous phase obtained after chloroform extraction. ~ water of the composition according to inventioll, and Filtration on Millex GV13, by chromatography on a Hypersi ~ BDS C18 column, under conditions identical to those of the S cf) mr ~ -sjti (tn tota ~ e.
FIG. 4 represents the chromatographic spectrum of the phasc chloroform obtained after chloroforin ~ water extraction composition according to the invention and fi ~ tration on Millex GV13, on a Hypersil BDS C18 column under conditions identical to that followed ~ 0 for the total composition.
Figure S shows the UV spectrum of the three main products found in the chloroform phase.
Ia composition according to the invelltion has an acti ~ ieé
immumJ. ~ Ioduldllice on human immuno ~ cells.
The composition according to the invention stimulates the basal production of IL-1 ~, T ~ 'F ~ and (: I ~ I-CSF by mononuclear blood cells peripheral, in a dose-dependent manner.
However, the activation of production induced by others activators is inhibited by ies compositions according to in ~ entio ~ us4u'à 90 ~ 6 20 for Ghl-CSF ct about 30% for TN ~
The extract according to the invention has no action on the production of IL-6.
The composition is also without actio ~ l on the basal production of IL-2. I. when the production of lk7 is stimulated by activators comms ~
ph ~ to-h ~ maglutinin, or PMA, the addition of a composition according to 7S the ill ~ ention causes an inhibition of this production.
The ~ olllpu ~ JIls according to the invention strengthen the inhibitory effect of ciclosporin on the production of} l.-2.
The compositions according to the invention have an antagonistic action of inhibition of cell proliferation induced by cyclosporine.
3 () This is why the present invention also has ~ t for obiet a medicament, characterized in that it contains a composition containing the active ingredients of the vegetable extract for being obtained by the steps a ~ to f) described above.
More particularly, the in ~ -ention relates to the use of such a 35 composition for the preparation of a drug useful as immunom ~ -d ~ tf ~ t ~ r wo gsl23606 2 1 8 4 6 9 9 rl / rl ~ 7 b. 47 In general, the compositions according to the invention have a immunostimulatory activity on tll ~, GM- quiescent cells CSF), immunosu ~ ", ~ e on activated cells (IL-2, G ~ I-CSF), agonist of cyclosporine A in the inhibition of 1 ~ synthesis of IL-2, antagonist of 5 ciclosp ~ rine A in the inhibition of proliferation ~ tion.
The drugs according to the invention can therefore be advantageously used during organ transplantation, in the treatment of diseases of ulc., ulles as well as in the treatment of Vlll infection.
The invention also relates to the use of a composition according to the invention for the preparation of a medicament useful for treatment of viral infections, especially caused by retrovirus like HIV.
The administration of such compositions according to the invention to people infected with HIV is well tolerated and causes an increase in the rate of CD ~.
The invention also relates to a method of in vitro stimulation.
Lymphocytes, characterized in that introduced into a culture l) mphocytaire ulle composition according to the invention.
The following examples are intended to illustrate the invention sal ~ s in no way limit its scope.
Example 1: Preparation of a plant extract according to the invention (SPV 30)
2~
A partir de 4 kg de feuilles de Buxus semper~irens, traites durant 3 fois 3 semaines par 3 fois un mélange éthanol/eau (80:70), on récupère 350 g d'extrait brut. Le fractionnement est eFfectue sur 6g d'extrait brut à
l'aide d'une colonne de 3 cm de diamètre et de 50 cm de hauteur.
Première colonne:
EiiminatioIl des sels et des sucres par une résine D~lOLlrE S 861 qui est introduite dans la colonne en s~ dans un mélange EtOH~H~O
w09s/23c06 ~i8~699 r~llr~ 7 (80:20), jusqu'a une hauteur de 45 cm. 6 g d'e~trait brut, solubilisés dans 1-S cm3 d'EtOll~112O (80:20), sont déposés. On élue par un litre de solution EtOH/H2O (80:20) et on évapore les sol~!ants. La fraction afnsi obtenue est solubilisée d~uls 4-5 cm3 cd'eau (une partie reste non soluble, elle est 5 éliminée du mifieu) et acidifiée par HCI IN jusqu'à pl~ ~ 4.
l)eu~i~-nP colonne:
La résine utilisée ici est l'Amberlite CG 50, échangeuse d ions, faiblement acide. Elle est introduite dans la même colonne que 10 préc~rl~-mmrnt en su~ siol~ dans l'eau jusqu'à Ulle hauteur de 45 cm. La fraction acidifiée résultant de la première colonne est déposée et OM élue par un litre d'eau. On é~apore ensuite le so~ant. Cette dernière fraction est alors déposee sur une troisième colonne.
Troisième colonne:
Echangeuse d'iQns fortement acide, cette Amberlite IR 120 (plus) forme Na~ est introduite comme précédemment en suspension dans l'eau jusqu'à une hauteur de 45 cm. La fraction résultant de ~a deuAième colonne est déposée dans 4-5cc d'eau et on élue par 11 d'eau. Ia fraction SPV -30 recupérée est évaporée et on isole 3,5 g.
La régénération des différentes colonnes s'effectue de la faSon sui~ante:
DUOLITE: Sl de NaOH à 49& Rinçage jusqu'à ph=7 AMB~RIIT~ CG ~0: 2,51 de HCI lN. Rincdge jusqu'a ph=7 AMBERI lTl~ IR 120: 2,51 de NaCl saturée. Rincage.
Exemple 2 ~ tude de la cytotoxicité du SPV30 L'effet toxfque de la fraction SPV30 sur les cellules CEi~r-SS n(~n illfectées est apprécié par la réaction colorimetrique (~1~).
Cette réaction est basée sur la capacité des cellules ~ antes à
réduire le 3-(4,5 diméthylthiazol-2-yl)-2,5 diphenyl-tétrazolium bromide eIl formazan après 5 jours d'incubation en présence de différentes concentrations de la fraction SPV30.
WO 951t3606 21~ ~ G !~ 9 . ~/rlv i~ 17 La c~totoxicité de SPV30 (SPV30. 1 ) a également été mesurée par comptage en microscopie optique, en comparant l'exclusion du bleu tr~pan par les cellules incubées en absence et en présence des concentrations croissantes (de 50 llg~'ml à 10 mg/ml) de la fraction, pendant 24, 48 et 120 heures.
L'absence de cytotoxicité de SPV30 a été demontrée d-dns plusieurs e.~périences, en ~JIIIpdli~ Ia mortalité des cel~ules incubées en absence et en présence des concentrations croissantes, 50 ~Ig~ml à 10 mg/ml, de la fraction. I,'e.xclusion du b~eu tr~pan a été estimée à 24, à 48 et 120 heures d'incubation, par comptage en microscopie optique. Jusqu'à 5 mg/ml la ~iabilité des cellules incubées en présence de SPV30 était la meme que celle des cellules contrBles. Après 48 h d'incubation en presence de 10 mg~ml de SPV30, 70% de cellules sont restées vi~antes par rapport aux cellules controles.
~ ~
Exemple 3: Evaluaeion de l'activité aDti-VII1-1 de la fraction 1~. Activité anti-rétrovirale de SPV30 ~() La multiplication du Vl~l-l (souche LAI) dans les cellules CEM-SS est ~aluée, ~pres 5 jours de culture, par dosage de 1~ réverse transc}iptase (R1~).
L'acti~ité de la RT traduit la présence de virus, relargué dans le surnageant de culture.
~5 La fraction SPV30 est ajoutée après l'adsorption du virus dans le milieu de culture.
Activité aDti-VlH-1 dc la fraction S.P.V. 30 sur les autres lignées cellulaires ~) Activité anti-VIII mesurée:
1- par inhibition de ECY (Effet cytopathogène):
estimation de la viabilité cellulaire (~Idll~r~lllld~iOn du MTT en formazellan) wo s~/~36~ 218 ~ 6 9 9 r~ "
~o 2- par inhibition de la Reverse. Transcriptase à J5 infectés par le VIE-I (souche Lav-1-bru) ou non inFectés pour déterminer la cytotoxicité du produit.
Emcacité testée sur dirr~ lignées: le SPV 30 est actif sur les 5 lignées:
à une ~u~ ion de 10-3 mg~ml CEM-SS à une col1centration de 10-~ mg~ml PBMC à une concentration de 10 3 mg/ml Absence de cytoto~;icité jusqu'a des concentrdtions > lmg/ml, ce 4ui perrnet de penser que l'irldex de sélectivité est important.
Z) Activité aatirétrovirale sur des cellules fibroblastiques de 15 souris (I~LluYilu~ murin de Friend F-MuLV~
Après 4 iours de culture de cellules fibroblastiques: recherche de protéine d'enveloppe ~irale (gp70) à difFérentes concentrations de SPV 30 (mise en évidence des foyers de cellules infectées) et calcul du %
Z0 illhibition de la réplication ~irale~cellules non traitées mais infectées:
1,6 ~ug/l 39% inhibition 22 fo~ers lOûO ,'lg~l 78% inhibition 8 foyers 5000 ug/l 100% inhibition 0 foyers 2 ~
From 4 kg of Buxus semper ~ irens leaves, treated for 3 times 3 weeks by 3 times an ethanol / water mixture (80:70), we recover 350 g of crude extract. The fractionation is carried out on 6g of crude extract to using a column 3 cm in diameter and 50 cm in height.
First column:
Elimination of salts and sugars by a resin D ~ lOLlrE S 861 which is introduced into the column at s ~ in an EtOH ~ H ~ O mixture w09s / 23c06 ~ i8 ~ 699 r ~ llr ~ 7 (80:20), up to a height of 45 cm. 6 g of raw milk, dissolved in 1-S cm3 of EtOll ~ 112O (80:20), are deposited. Eluted with one liter of solution EtOH / H2O (80:20) and the solids are evaporated. The resulting afnsi fraction is solubilized with ~ 4-5 cm3 of water (part remains insoluble, it is 5 removed from the medium) and acidified with HCI IN to pl ~ ~ 4.
l) eu ~ i ~ -nP column:
The resin used here is Amberlite CG 50, ion exchange, weakly acidic. It is entered in the same column as 10 prev ~ rl ~ -mmrnt en su ~ siol ~ in water to Ulle height of 45 cm. The acidified fraction resulting from the first column is deposited and OM elected per liter of water. Then é ~ apore the so ~ ant. This last fraction is then placed on a third column.
Third column:
Highly acidic iQns exchanger, this Amberlite IR 120 (more) Na ~ form is introduced as previously suspended in water up to a height of 45 cm. The fraction resulting from ~ a second column is deposited in 4-5cc of water and eluted with 11 of water. Ia fraction SPV -30 recovered is evaporated and 3.5 g are isolated.
The regeneration of the different columns is done in the same way next:
DUOLITE: Sl NaOH at 49 & Rinse until ph = 7 AMB ~ RIIT ~ CG ~ 0: 2.51 HCI lN. Rinsing up to ph = 7 AMBERI lTl ~ IR 120: 2.51 of saturated NaCl. Rinsing.
EXAMPLE 2 Study of the Cytotoxicity of SPV30 The Toxic Effect of the SPV30 Fraction on CEi ~ r-SS n Cells (~ n infected is appreciated by the colorimetric reaction (~ 1 ~).
This reaction is based on the ability of ~ ante cells to reduce 3- (4,5 dimethylthiazol-2-yl) -2,5 diphenyl-tetrazolium bromide eIt formazan after 5 days of incubation in the presence of different concentrations of the SPV30 fraction.
WO 951t3606 21 ~ ~ G! ~ 9. ~ / rlv i ~ 17 The totoxicity of SPV30 (SPV30.1) was also measured by counting in light microscopy, comparing the exclusion of blue tr ~ pan by cells incubated in the absence and in the presence of increasing concentrations (from 50 μg ~ ml to 10 mg / ml) of the fraction, for 24, 48 and 120 hours.
The absence of cytotoxicity of SPV30 has been demonstrated in several e. ~ experiences, in ~ JIIIpdli ~ the mortality of cel ~ ules incubated in absence and in the presence of increasing concentrations, 50 ~ Ig ~ ml to 10 mg / ml, of the fraction. I, 'e.xclusion of b ~ eu tr ~ pan was estimated at 24, 48 and 120 hours incubation, by counting in optical microscopy. Up to 5 mg / ml la ~ reliability of cells incubated in the presence of SPV30 was the same as that of controlled cells. After 48 h of incubation in the presence of 10 mg ~ ml of SPV30, 70% of cells remained alive compared to control cells.
~ ~
Example 3: Evaluation of the activity aDti-VII1-1 of the fraction 1 ~. SPV30 anti-retroviral activity ~ () The multiplication of Vl ~ ll (LAI strain) in CEM-SS cells is ~ aluted, ~ almost 5 days of culture, by dosing of 1 ~ transc} iptase reverse (R1 ~).
The activity of RT reflects the presence of viruses, released in the culture supernatant.
~ 5 The SPV30 fraction is added after the adsorption of the virus in the culture centre.
ADti-VlH-1 activity with the SPV 30 fraction on the others cell lines ~) Anti-VIII activity measured:
1- by inhibition of ECY (Cytopathogenic effect):
estimation of cell viability (~ Idll ~ r ~ lllld ~ iOn from MTT in formazellan) wo s ~ / ~ 36 ~ 218 ~ 6 9 9 r ~ "
~ o 2- by inhibition of Reverse. Transcriptase on D5 infected with VIE-I (Lav-1-bru strain) or not Infected to determine the cytotoxicity of the product.
Emcacity tested on dirr ~ lines: SPV 30 is active on 5 lines:
at a ~ u ~ ion of 10-3 mg ~ ml CEM-SS at a col1centration of 10- ~ mg ~ ml PBMC at a concentration of 10 3 mg / ml Absence of cytoto ~; icity up to concentrations> lmg / ml, this 4ui think that the selectivity irldex is important.
Z) Aatiretroviral activity on fibroblastic cells of 15 mice (I ~ LluYilu ~ murine from Friend F-MuLV ~
After 4 days of fibroblastic cell culture: search for envelope protein ~ iral (gp70) at different concentrations of SPV 30 (highlighting outbreaks of infected cells) and calculating the%
Z0 inhibition of replication ~ iral ~ untreated but infected cells:
1.6 ~ ug / l 39% inhibition 22 fo ~ ers lOûO, 'lg ~ l 78% inhibition 8 foci 5000 ug / l 100% inhibition 0 outbreaks
3) Evaluation de l'activité anti-VII~-I des composés sur les cellules CEM-SS
Principe 3() La multiplication du Vl~-l (souche LAI) dans les cellules CElv~-SS
(infectées avec 20 TCiD50) est é~ aluee, après 5 jours de culture, par dosage de la r~verse transcriptase (RT) dont l'activité traduit la présence de virus relargué dans le surnageant de culture. Les composês testes sont ajoutés après l'adsorption du virus dans le milieu de culture. On compare l'activité
35 de l'AZT et de l'eYtrait SP~'30 selon l'invention.
wo ss/23co6 2 1 8 ~ 6 ~ 9 . ~ l/r~S~ - 17 L'eFfet toxique des composés sur les cellules CEM-SS non infectées est apprécié par la reactiol colorimétrique (MTT basée sur la capacité des cellules vi~antes a réduire le 3-(4,5 diméth~lthiazol-2-yl)-2,5 diphényl-tétrazolium bromide en formazan après 5 jours d incubation en présence S de différentes coll~c~ d~ions en composé.
Les résultats sont présentés sur la figure 6.
Les courbes font d~paldl~
- d'une part les resultats du test MTT exprimés en D0 - et d'autre par les valeurs (en cpm) de l'activité enzyma~ique ~n en présence du composé testé aux differentes concentrations indiquées. 3) Evaluation of the anti-VII ~ -I activity of the compounds on the CEM-SS cells Principle 3 () The multiplication of Vl ~ -l (LAI strain) in CElv ~ -SS cells (infected with 20 TCiD50) is e ~ alue, after 5 days of culture, by assay r ~ verse transcriptase (RT) whose activity reflects the presence of viruses released into the culture supernatant. Test compounds are added after adsorption of the virus in the culture medium. We compare the activity 35 of AZT and eYtrait SP ~ '30 according to the invention.
wo ss / 23co6 2 1 8 ~ 6 ~ 9. ~ l / r ~ S ~ - 17 The toxic effect of compounds on uninfected CEM-SS cells is appreciated by the colorimetric reactiol (MTT based on the capacity of vi ~ antes cells to reduce 3- (4,5 dimeth ~ lthiazol-2-yl) -2,5 diphenyl-tetrazolium bromide to formazan after 5 days of incubation in the presence S of different coll ~ c ~ d ~ ions in compound.
The results are shown in Figure 6.
The curves make d ~ paldl ~
- on the one hand the results of the MTT test expressed in D0 - and the other by the values (in cpm) of the enzymatic activity ~ n in the presence of the compound tested at the different concentrations indicated.
4) Evaluation de l'activité anti VIH- I de différents composés sur les cellules MT4 15 Principe La multiplication du VIH-I (souche HTLV 111~) dans les cellules MT4 (cellules T4 transformées par le HTLV-1) est suivie par l'effet c~topathogène induit parle virus. Les cellules sont infectées avec une dose de Vl~l-1 produisant, après 5 jours de culture, une diminution de 90% de 20 nombre de cellules vivantes. Les cornposés testés sont ajoutés après l'adsorptio!l du virus dans le milieu de culture à différentes concentrations.
La viabilité des cellules est mesurée par 1~ réaction colorimétrique (~TT) basée sur la capacité des cellules vi~ antes à réduire le 3-(4,5 25 diméthylthiazol-2-yl)-2,5 dip~len~l-tétrazolium bromide en formazan, propriété due aux déshydrogénases mitochondriales. La quantité de formazan produite (D0 à 5~0 nm) est proportionnelle au nombre de cellules vis.antes.
Le pourcentage de protection (~) des cellules infectées par le 30 traitcment avec les composés est calculé en appliquant la formule proposée par Pauwels et col.
1~0540 des ~ellules infectées traitées (T~ -1)05~o des cellules infectées To (S2) D0s40 des ~ellules non infectées (S1) - D0s40 des ce~lules infcctécs Temoin (S2) wossl23~/)6 21~16~g r~l,r ~ 47 L'ef~et toxique des composés sur les celiules hlT~ non infectées est mesuré par la même réaction col~ t~ ue.
La ~o~f~ dtion c~totoxique 509~ (CC 50) est la concentration de composé provociuant une diminution de moitié de la DOs40 par rapport à 4) Evaluation of the anti-HIV-I activity of different compounds on MT4 cells 15 Principle The multiplication of HIV-I (strain HTLV 111 ~) in MT4 cells (T4 cells transformed by HTLV-1) is followed by the effect c ~ topathogen induced by virus. The cells are infected with a dose of Vl ~ l-1 producing, after 5 days of culture, a 90% decrease in 20 number of living cells. The tested components are added after adsorption of the virus in the culture medium at different concentrations.
Cell viability is measured by 1 ~ colorimetric reaction (~ TT) based on the ability of living cells to reduce 3- (4,5 25 dimethylthiazol-2-yl) -2.5 dip ~ len ~ l-tetrazolium bromide in formazan, property due to mitochondrial dehydrogenases. The quantity of formazan produced (D0 at 5 ~ 0 nm) is proportional to the number of cells vis.antes.
The percentage of protection (~) of cells infected with the 30 treatment with compounds is calculated by applying the formula proposed by Pauwels et al.
1 ~ 0540 of ~ infected infected cells (T ~ -1) 05 ~ o of infected cells To (S2) D0s40 of ~ uninfected cells (S1) - D0s40 of these ~ infected cells Witness (S2) wossl23 ~ /) 6 21 ~ 16 ~ gr ~ l, r ~ 47 The toxic and toxic effect of the compounds on non-infected hlT ~ cells is measured by the same reaction col ~ t ~ ue.
The ~ o ~ f ~ dtion c ~ totoxique 509 ~ (CC 50) is the concentration of compound causing a halving of OD40 compared to
5 celle des cellules témoins.
S~il y a lieu, ]a co~ tldtion du composé conferant une protection de 50% (IC = 50 = ~ CtlllldtiOn inhibant la réplication virale de 50 96) est calculée.
10 Résultats La feullle de résultat represente, pour chaque produit, - d'une part le plan de la plaque de culture (96 puits) avec les résultats du test MTT (e,Yprimés en DO) des cellules infectées et non infectees, en présence et en absence du composé, - et d'autre part, exprimées sur le graphique, la protection (~) et la toxicité (I) du compose en fonction de sa concentration.
Exemple 4: Effets i~l...~ . o~ f~rS in vitro du SPV 30 :O MATE~RIEL ET METHODES
Réactifs La so}utlon stocl; de la fractioli SPV30 a cté préparée par dissolution de la fraction désséchée dans un milieu aqueux ~milieu de culture, PBS ou ~5 NaCI 0,9%) à la ~ .tll~ldtion de 100 mg~ml, filtrée sur membrane 0,~5 !lm puis sur membrane 0,~ llm et conservée à 4~ C darls un tube stérile. Dans ces conditions, elle mairLtient ses propriétés biologiques pendallt au moins deux mois. Le(s) principe(s) actif(s) de SPV30 est (sont) dialysable(s) (membrane de dialyse avec cut off de poids moléculajre egal à 10 ICDa).
WO ~2360G 2 ~ 8 ~ 6 9 ~ r~ l lr l~ ' . 17 Un dewiième lot de la fraction preparé par le LCBO, désigné SPV30 l, a également été testé; utilisés dans les mernes conditions, SPV30 et SPV30.1 ont manifesté les memes propriétés biologiques. Les autres réactifs ont été
préparés et stockés comme suit: P~A, solution dans EtOH absolu 1 mg/ml, 5 -20 C; ciclosporine A, solution dans EilOH absolu 1 mg~ml, -20 C; PHA, solution dans PBS 1 mg~ml, -20~ C; anticorps monoclonal CD3, solution dans PBS 1 mg/ml, -20 C; LPS, solution dans PBS 10 mg/ml, 4 C. Le milieu de culture RPMI 16~0 a été supplémenté avec 10% (mesure de la prolifération cellulaire) ou 5% (mesures de la s~nthèse des cytokines) du 10 sérum de veau foetal (SVF) inactivé par la chalcur (30 min à 56~ C), le glutarnate de sodium 2 mM, la pénicilline 100 Ul/ml et la streptomycine 100 Ul/ml.
Ccllules et conditions de culture l~ Les cellules mononucléées du sang periphérique de donneurs sains ont été obtenues par cel1trifugation sur milieu de scparation des l-mphocytes (soit le sang total mélangé à du NaCI 0,9% (2:1), soit les poches de ~buff'~ coat" mélangées à du NaCI 0,9%, resuspelldues dans le milieu de culture complet à la denslté de 106 cellules/ml, ensemencées dans des 20 plaques de culture de 2~ ou 48 puits (mesures de la synthèse des cytokines, 10f} cellules/puits) ou 96 puits (mesures de la prolifératioll cellulaire et de ~a cytotoxicité, 105 cellules~puits) et laissées a 37 C (humidité 5%~ en absence de tout effecteur pendant 14 à 18 I~curcs. Lcs cellules ont ensuite cté incubées avec le SPV30 (SPV30 l) à différentes concentrations testées en absence, ou en présence, des concentrations optimales ou suboptimales d'activateurs. Les cellules des lignées humaines T (Jurl;at) et monocytaire (TIIP-I) ont été maintenues en culture continue dans le m-~me milieu (5%
SVF) et utilisées à la même densité et dans les memes conditions.
V/O!J5123hO6 2l8~ . r~llr~ c--47 Mesure de la synthèse des cytokines: 11.-lfs~ , IL-6, GM-CS~
IL-2 .
Les effets sur la production des cyto};ines ont éte testes pour des concentrations de SPV30 de 2 ng~ml à 4 mg/ml. Au terme de l'in~l~h lti--n, 5 les plaques de culture contenant les dirférelltes conditions e.~périmentales ont été rapidement congelées et décongelees. Les quantités de cytokines produites par les cellules mononucléées ont été déterminees en utilisant des imnll~n~o~es specifiques et 4uantitatifs (FLISA); les p~rOI,.,~
de ces tests ainsi que les détails techniques précis de mesure ont été
10 publies. Il a eté vérifié que la présence de SPV30 n'interferait pas avec la qualltification des cytol;ines par ELiSA.
Determination de la prolifération cellulaire Les effets sur la prolifération cellulaire ont été testés pou~ des 15 concentrations de SPV30 de ~ ng~ml à 4 mg~ml. La prolifération Iymphocytairc, basale et induite par des mitogènes, a été quantifiée enmesurant l'incorporation de la thymidine tritiée par les cellules en culture, selon les tecitniques déjà décrites.
7(1 RESULTATS
Production de 1'11.-1~
La fraction SPV30 en absence de tout autre efFecteur stimule de manière dose-dépendante la production de l'IL-1~ par les cellules 25 mol1onuclées du sang périphérique. L'augment~tion de la production de l'IL-1~ par rapport à la production basale est détectable à partir de 50-100 llg/ml de SP~30, après 24 heures d'incubation. L'IL-1,~ stimulée par le SPV30 à 2 mg~ml atteint les concentrations 2 à 3 fois superieures (15-20 llg/ml) à celles induites, dans la même e?~périence, par les concelltratio~ls 3Q optin1ales ~1-10 ng/ml) de LPS; cependant, le plateau de production de 1'11.-1,~ n'est pas obser~é dans ces conditions. 1~ production de l'IL-1~3 par les cellules stimulées par les LPS (1 ng/ml) ou pal- le Pl~,IA (10 ngfml) plus le CD3 (1 ,~g~ml) l1'est pas modifiée de manière sigllificative par la présence de SP~/30.
W0~5/23606 218~9~ r~l~rl~s~ 7 Production de l'IL-6 La présence de la fraction SPV30 dans le milieu de cul~ure des cellules mononucléées du sang périphérique n'exerce aucun effet sur la 5 production de 1'IL-6, bas~le ou stimulée.
Production du TNFQ
En absence d'autres effecteurs, la fraction SPV30 stimule la production de TNF par les cellules mononucléées du sang périphérique de manière dose ~ f n~nte (détectable à partir de 50-100 ~g/ml de Sl'V30) et modeste ~de l'ordre de 0,1 ng~ml pour la concentration de SPV30 de 2 mg/ml). La production de TNFtl induite par les concentrations optimales de P~IA (10 ng/ml) plus CD3 (1 llg/ml), de l'ordre de 5-10 ng/ml à 24 h et de 50 ng/ml à 48 h, est légèrement inhibée par le SPV30 (inhibition maximale 1~ de 20 à 30% par la présence de SPV30 a 1 mg/ml, demi-effet à 750 llg/ml de Production du GM-CSF
La fraction SPV30 en absence de tout autre effecteur induit de ~0 m;mière dose-dépendante, détectable à partir de 50-100 ~Ig/ml de SPV30, la production de Gh~-CSF par les cellules mononucléées du sang périphérique.
A 2~ h, en présence de 2 mg/ml de SPV30, le taux de Gl~f-CSF atteint 0,2 ng/ml (quatre fois la production basale), comp,lrable à celui induit par les LPS. Le SPV30 inhibe de manière significative la rroduction de GM-CSF
7S induite par l'incubation avec Ph~A (10 ng/ml) plus C1~3 ~ g/ml) ainsi qu'avec PMA (10 ng/ml) plus PHA lo ,Lg/ml). La production de GM-CSF
induite par ces activateurs est de l'ordre de 10 ng/ml à 48 heures.
Ltinhibition ma~dmale atteint 90% en présence d~ SPV30 à 4 mg/ml, le demi-effet est à 1 mg/ml. L'effet inhibiteur de: SPV30 est aboli après la ~0 dialyse de la solution stocl~ contre du PBS.
w09s/u~(i6 ~1g,~i~9~- r~l~rh~s.: 17 Production d'lL-2 Mis en présence des ceLLules mononllrléé~ du sang périphéri4ue, le SPV30 n'exerce aucun ef~et sur la production babale d'lk2. La s~nthèse d'lk2 induite par différents activateurs, tels la P~A ~ g/ml~, le P~IA (10 S ng~ml) plus le CD3 ( 1 I,lg~ml~, ie PMA ( 10 ng~ml) plus la PHA ( 1 llg~ml), est inhibee de manière spectaculaire, dose dépendante, par le SPV30. I.'effet inhibiteur de la syntbèse d'lL-2 est détectable à 200-300 ~Lg/ml de SPV30, le demi-effet est obser~!e à 750-1000 llg~ml, et ~ hibition ma~imaLe de 80-~0% est atteinte à 4 mg~ml. Ia fract;oll diaLysai~le de SPV30 rend compte de ces propriétes. Pour observer l'effet inhibiteur optim~l, le SPV30 doit etre ajouté dans le milieu de culture ~h~ulldllL~Ilent avec l'activateur ou peu apres, u~e à deu~ heures; l'inhibition de la production d'll-2 est observable, mais suboptimale, quand les cellules ont été préincubées 2 heures avec le SPV30 seul ou 4 heures avec l'activateur seul. L'effet du SPi~'30 est détectable dès le début de la production d'll.-2 elle-Même; puis i'effet ~Uppl~.~b~.~ll augmente régulièrement pour atteindre 50Yo et 75%
d'inhibition ~SPV30 à I mg~ml et à 2 mg/ml, respectivement1 après 24 h d~incuhation et ~5% et 85% d'inhibition après ~8 h.
2~ Action agonistc du SPV30 ct dc la ciclosporin~ A sur la p}oduction d'lL-2 En accord avec les données publiées, I'effet inhibiteur de la ciclosporine A sur la syntl1èse d'lk2 a été détectable à 10-20 nM, le demi-effet a été observé à 50 nM et l'inhibition de 80% a été atteinte à 100 IlM. L~
présence de la fraction SPV30 a déplacé la courbe dose-réponse de l'inhibition de production d'lL-2 par la CsA vers la bas et lègèrement à
gauche, indiquant leur action au moins additive . ainsi à 300 ~lg/ml de SPV30, I'inhibition de la producti~n d'lL-2 a eté observable à 5-10 nM de CsA; en présence de 1250 ~Lg/ml de SPV30, I'inhibition a été de 60% pour I
nM de CsA, de 80% pour 50 nM de CsA et de 92% pour 100 nM de CsA.
4~99 WO 95123G06 2 1 8 r~llr~ - ~7 Il existe un probable effet de potrnti~ ,3iion de l'action suppressive de la ciclosporine A par la fractioil SP\/30; en présence de 50 n~l de CsA, la courbe dose-réponse de l'inhibition de la production d'll-2 par le SPV30 est plate, montrant 85% d'inhibition pour toutes les concentrations testées ~0,01 à 2,5 mg/ml) de SPV30 -Prolifération cellulaire La prolifération de cellules mononucléées du sang périphérique induite par la PHA (I ~Lg~ml) est inhibée dc manière dose-dépendante par le SPV30 pour des concentrations de 0,7 à 2 mg/ml; à l mg~ml de SPV30, concentration demi-inhibitrice de la s~nthèse d'll.-2, la prolifération a été
inhibée de 30% et à 2 mg/ml l'inhibition de la prolif~ration a été de 75%.
Cepcndant, une amplification par le SPV30 de la proliferation cellulaire induite par la PHA a été obser~ée pour des concentrations 4UI n'exercent 1~ pas d'effet detectable sur la productiol1 d'lL-2; 30% d'augmentation d'incorporation de th~midine tritiée à 50 ,~g~ml de SPV30, 15%
d'augmentation a 200 ~lg/ml. rl faut souligller que l'influence de SPV30 sur l~ proiifération cellulairc a été obser~!ée uniquement à 48 heurcs de culture; la mesure de l'incorporation de thymidinc tritiée à des temps plus 2() tardifs (72 h ou 96 h) n'a montré aucun effet de SPV30 sur la prolifératioll, bas~le ou induite par l t PHA.
Action antagoniste du SPV30 ct dc la ciclosporine A sur la prolifération cellulaire ~S En accord avec les données publiées, I'effet suppresseur sur la prolifération Iymphocytaire induite par les mitogènes a été observé pour les memes concentrations de ciclosporine A, que son effet inhibiteur de la production d'll.-2. La fraction SPV30 e~erce un effet antagoniste de I'~ction de la CsA sur la prolifération. La présence de SPV30 à 0,3 mg/ml a ~0 illduit une amplification de la prolifération stimulée par la PilA en présence des doses non inhibitrices de la CsA (60% d'augmentatioll a 1 ni~l WO9~/23606 ~1 8~638 P~,l/rlh ~r 17 'I ' ' 1~
de CsA, 30% à 10 nM de Csa~, à lO0 nm de CsA en présence de 0,3 mg~ml de SYV30 à la proliférat;on reste à son niveau maYimal stimulé par la Pl-IA. Le même effet est observe en présence de SPV30 à 1,2 mg~ml qui a proYoqué
une translation analogue de la courbe dose-répo~lse de l'inhibition de la 5 prolifération par la CsA vers le haut. L'eflet antagolliste de l'actior suppressive de la prolifération par la CsA n'a pas été ohser~é en présence de SFV30 à 2,5 mg~rnl.
F:xemple 5: Essai clinique: SPV vs PIACEBO
Essai pilote phase 1/11 rarldomisée en douhlc aveugle - But: Efficacité et de la tolerance du S.P.V. patients V.l.!l asymptomatiques - A~is favorable du C.C.P.P.R.B: avril 92 - Criteres inclusion: CD~ entre 2S0 et 500 / mm3.
patient V.l/ll asymptomatiquc (stade 11 CDC) - Critères d'exclusion: prise d'antiviraux ~AZ1'-DDI~
- Critères prindpal de ~ugement: évolution du nom~re de CD~
- Critères secondaires:
~() Evaluation de la tolérance du S.P.V-l'~ si~,., dans la maladie Autres marqueurs prédictifs de l'infection V.l.}~
(Agp~ 7microglobulinémie, néoptérine, IgA) [,es résu~tats sont présentés sur la figure 7. Ctn observe une augmentation significative du tau.x de CD~ dans le groupe traité par SPV30.
25 11 n'existe pas de différence significati~e des effets secondaires entre les deux groupes. 5 that of the control cells.
If applicable,] a co ~ tldtion of the compound conferring protection 50% (CI = 50 = ~ CtlllldtiOn inhibiting viral replication of 50 96) is calculated.
10 results The result sheet represents, for each product, - on the one hand, the plan of the culture plate (96 wells) with the MTT test results (e, Y expressed as DO) of infected cells and not infected, in the presence and absence of the compound, - and on the other hand, expressed on the graph, the protection (~) and the toxicity (I) of the compound as a function of its concentration.
Example 4: Effects i ~ l ... ~. o ~ f ~ rS in vitro of SPV 30 : O MATE ~ RIEL AND METHODS
Reagents The so} utlon stocl; SPV30 fractioli was prepared by dissolution of the fraction dried in an aqueous medium ~ culture medium, PBS or ~ 5 NaCI 0.9%) at ~ .tll ~ ldtion of 100 mg ~ ml, filtered on membrane 0, ~ 5! Lm then on membrane 0, ~ llm and stored at 4 ~ C darls a sterile tube. In under these conditions, it maintains its biological properties at least two months. The active principle (s) of SPV30 is (are) dialyzable (dialysis membrane with cut off of molecular weight equal to 10 ICDa).
WO ~ 2360G 2 ~ 8 ~ 6 9 ~ r ~ l l l l '. 17 A second batch of the fraction prepared by the LCBO, designated SPV30 l, has also been tested; used in the same conditions, SPV30 and SPV30.1 have shown the same biological properties. The other reagents have been prepared and stored as follows: P ~ A, solution in absolute EtOH 1 mg / ml, 5-20 C; ciclosporin A, solution in EilOH absolute 1 mg ~ ml, -20 C; PHA, solution in PBS 1 mg ~ ml, -20 ~ C; CD3 monoclonal antibody, solution in PBS 1 mg / ml, -20 C; LPS, solution in PBS 10 mg / ml, 4 C. The medium culture culture 16 ~ 0 was supplemented with 10% (measurement of cell proliferation) or 5% (measurements of cytokine synthesis) 10 fetal calf serum (SVF) inactivated by chalcur (30 min at 56 ~ C), 2 mM sodium glutarnate, penicillin 100 IU / ml and streptomycin 100 IU / ml.
Cells and culture conditions l ~ Peripheral blood mononuclear cells from healthy donors were obtained by cel1trifugation on medium of separation of l-mphocytes (either whole blood mixed with 0.9% NaCl (2: 1), or bags of ~ buff '~ coat "mixed with 0.9% NaCI, resuspelled in the middle of complete culture at a density of 106 cells / ml, seeded in 20 culture plates of 2 ~ or 48 wells (measurements of the synthesis of cytokines, 10f} cells / well) or 96 wells (measurements of cell proliferation and ~ has cytotoxicity, 105 cells ~ well) and left at 37 C (humidity 5% ~ in absence of any effector for 14 to 18 I ~ curcs. The cells then incubated with SPV30 (SPV30 l) at different concentrations tested in absence, or presence, of optimal or suboptimal concentrations activators. Cells from human T (Jurl; at) and monocytic lines (TIIP-I) were maintained in continuous culture in the same medium (5%
SVF) and used at the same density and under the same conditions.
V / O! J5123hO6 2l8 ~. r ~ llr ~ c - 47 Measurement of cytokine synthesis: 11.-lfs ~, IL-6, GM-CS ~
IL-2.
The effects on the production of cyto} ines have been tested for SPV30 concentrations from 2 ng ~ ml to 4 mg / ml. At the end of in ~ l ~ h lti - n, 5 the culture plates containing the dirferelltes conditions e. ~ Perimentales were quickly frozen and thawed. Amounts of cytokines produced by mononuclear cells have been determined using imnll ~ n ~ o ~ es specific and 4uantitatives (FLISA); the p ~ rOI,., ~
of these tests as well as the precise technical details of measurement were 10 published. It has been verified that the presence of SPV30 will not interfere with the qualltification of cytol; ines by ELiSA.
Determination of cell proliferation The effects on cell proliferation have been tested for 15 concentrations of SPV30 from ~ ng ~ ml to 4 mg ~ ml. Proliferation Basal mitogen-induced lymphocyte was quantified by measuring the incorporation of thymidine tritiated by cells into culture, according to the techniques already described.
7 (1 RESULTS
Production of 1'11.-1 ~
The SPV30 fraction in the absence of any other efFector stimulates dose-dependent manner the production of IL-1 ~ by cells 25 mol1onucleated peripheral blood. The increase in the production of IL-1 ~ compared to basal production is detectable from 50-100 llg / ml of SP ~ 30, after 24 hours of incubation. IL-1, ~ stimulated by SPV30 at 2 mg ~ ml reaches concentrations 2 to 3 times higher (15-20 llg / ml) to those induced, in the same e? ~ experience, by the concelltratio ~ ls 3Q optin1ales ~ 1-10 ng / ml) of LPS; however, the production plateau of 1'11.-1, ~ is not observed ~ é in these conditions. 1 ~ production of IL-1 ~ 3 by cells stimulated by LPS (1 ng / ml) or pal ~ Pl ~, IA (10 ngfml) more CD3 (1, ~ g ~ ml) l1 is not significantly changed by presence of SP ~ / 30.
W0 ~ 5/23606 218 ~ 9 ~ r ~ l ~ rl ~ s ~ 7 IL-6 production The presence of the SPV30 fraction in the middle of the cul ~ ure des peripheral blood mononuclear cells has no effect on the 5 production of IL-6, low ~ le or stimulated.
TNFQ production In the absence of other effectors, the SPV30 fraction stimulates production of TNF by peripheral blood mononuclear cells dose ~ fn ~ nte (detectable from 50-100 ~ g / ml Sl'V30) and modest ~ of the order of 0.1 ng ~ ml for the concentration of SPV30 of 2 mg / ml). TNFtl production induced by optimal concentrations of P ~ IA (10 ng / ml) plus CD3 (1 llg / ml), of the order of 5-10 ng / ml at 24 h and of 50 ng / ml at 48 h, is slightly inhibited by SPV30 (maximum inhibition 1 ~ from 20 to 30% by the presence of SPV30 at 1 mg / ml, half-effect at 750 llg / ml of GM-CSF production The SPV30 fraction in the absence of any other effector induced by ~ 0 m; dose-dependent medium, detectable from 50-100 ~ Ig / ml of SPV30, the production of Gh ~ -CSF by peripheral blood mononuclear cells.
At 2 ~ h, in the presence of 2 mg / ml of SPV30, the level of Gl ~ f-CSF reaches 0.2 ng / ml (four times the basal production), comp, lrable to that induced by LPS. SPV30 significantly inhibits the production of GM-CSF
7S induced by incubation with Ph ~ A (10 ng / ml) plus C1 ~ 3 ~ g / ml) as well than with PMA (10 ng / ml) plus PHA lo, Lg / ml). GM-CSF production induced by these activators is of the order of 10 ng / ml at 48 hours.
The inhibition ma ~ dale reaches 90% in the presence of ~ SPV30 at 4 mg / ml, the half-effect is 1 mg / ml. The inhibitory effect of: SPV30 is abolished after ~ 0 dialysis of the stocl solution ~ against PBS.
w09s / u ~ (i6 ~ 1g, ~ i ~ 9 ~ - r ~ l ~ rh ~ s .: 17 IL-2 production When placed in the presence of mononllllated cells of peripheral blood, the SPV30 has no effect whatsoever on the babal production of lk2. The Summary of lk2 induced by different activators, such as P ~ A ~ g / ml ~, P ~ IA (10 S ng ~ ml) plus CD3 (1 I, lg ~ ml ~, ie PMA (10 ng ~ ml) plus PHA (1 llg ~ ml), is dramatically inhibited, dose dependent, by SPV30. I. effect IL-2 syntbesis inhibitor is detectable at 200-300 ~ Lg / ml of SPV30, the half effect is observed ~! e at 750-1000 llg ~ ml, and ~ hibition ma ~ imaLe of 80-~ 0% is reached at 4 mg ~ ml. The fract; oll diaLysai ~ le of SPV30 reports on these properties. To observe the optimal inhibitory effect, the SPV30 must be added to the culture medium ~ h ~ ulldllL ~ Ilent with the activator or little after, u ~ e at two ~ hours; inhibiting the production of ll-2 is observable, but suboptimal, when cells have been preincubated 2 hours with the SPV30 alone or 4 hours with the activator alone. The effect of SPi ~ '30 is detectable from the start of the production of ll.-2 itself; then the effect ~ Uppl ~. ~ b ~. ~ It increases regularly to reach 50Yo and 75%
inhibition ~ SPV30 at I mg ~ ml and 2 mg / ml, respectively 1 after 24 h of ~ incuhation and ~ 5% and 85% inhibition after ~ 8 h.
2 ~ Agonistic action of SPV30 and ciclosporin ~ A on the production of IL-2 In accordance with the published data, the inhibitory effect of ciclosporin A on the syntl1esis of lk2 was detectable at 10-20 nM, half effect was observed at 50 nM and 80% inhibition was reached at 100 IlM. L ~
presence of the SPV30 fraction shifted the dose-response curve from inhibition of production of IL-2 by CsA downwards and slightly to left, indicating their action at least additive. thus at 300 ~ lg / ml of SPV30, the inhibition of the production of IL-2 was observable at 5-10 nM from That's it; in the presence of 1250 ~ Lg / ml of SPV30, the inhibition was 60% for I
nM of CsA, 80% for 50 nM of CsA and 92% for 100 nM of CsA.
4 ~ 99 WO 95123G06 2 1 8 r ~ llr ~ - ~ 7 There is a probable potrnti ~ effect, 3iion of the suppressive action of the ciclosporin A by fractioil SP \ / 30; in the presence of 50 n ~ l of CsA, the dose-response curve of SPV30 inhibition of III-2 production flat, showing 85% inhibition for all concentrations tested ~ 0.01 to 2.5 mg / ml) of SPV30 -Cell proliferation Proliferation of peripheral blood mononuclear cells PHA-induced (I ~ Lg ~ ml) is inhibited in a dose-dependent manner by SPV30 for concentrations of 0.7 to 2 mg / ml; at 1 mg ~ ml of SPV30, half-inhibitory concentration of the s-nthèse d'll.-2, proliferation was inhibited by 30% and at 2 mg / ml the inhibition of proliferation was 75%.
However, an amplification by SPV30 of cell proliferation induced by PHA has been observed for 4UI concentrations do not exert 1 ~ no detectable effect on the productiol1 of IL-2; 30% increase incorporation of th ~ midine tritiated at 50, ~ g ~ ml of SPV30, 15%
increase to 200 ~ lg / ml. rl it should be stressed that the influence of SPV30 on Cellular proiiferation was observed only 48 hours before culture; measuring the incorporation of tritiated thymidinc at longer times 2 () late (72 h or 96 h) showed no effect of SPV30 on proliferation, low ~ le or induced by lt PHA.
Antagonistic action of SPV30 and ciclosporin A on the cell proliferation ~ S In accordance with the published data, the suppressing effect on Mitogen-induced lymphocyte proliferation has been observed for the same concentrations of ciclosporin A as its inhibitory effect on ll.-2 production. The SPV30 fraction has an antagonistic effect of I ~ ction of CsA on proliferation. The presence of SPV30 at 0.3 mg / ml has ~ 0 induces an amplification of proliferation stimulated by PilA in presence of non-inhibitory doses of CsA (60% increase at 1 ni ~ l WO9 ~ / 23606 ~ 1 8 ~ 638 P ~, l / rlh ~ r 17 'I' 1 ~
of CsA, 30% at 10 nM of Csa ~, at 10 nm of CsA in the presence of 0.3 mg ~ ml of SYV30 proliferates; we remain at its maYimal level stimulated by Pl-IA. The same effect is observed in the presence of SPV30 at 1.2 mg ~ ml which caused a similar translation of the dose-response curve ~ lse of the inhibition of 5 proliferation by CsA upwards. The actior antagollist effect suppressing proliferation by CsA was not ohser ~ ed in the presence from SFV30 to 2.5 mg ~ rnl.
F: example 5: Clinical trial: SPV vs PIACEBO
Pilot test phase 1/11 rarldomized in double blind - Goal: Efficacy and tolerance of SPV Vl! L asymptomatic patients - A ~ is favorable of the CCPPRB: April 92 - Inclusion criteria: CD ~ between 2S0 and 500 / mm3.
asymptomatic Vl / ll patient (stage 11 CDC) - Exclusion criteria: taking antivirals ~ AZ1'-DDI ~
- Main criteria of change: evolution of the name ~ re of CD ~
- Secondary criteria:
~ () Assessment of the tolerance of SPV-l ~ if ~,., In the disease Other predictors of Vl} infection ~
(Agp ~ 7microglobulinemia, neopterin, IgA) [, es resu ~ tats are presented on figure 7. Ctn observes a significant increase in CD ~ tau.x in the group treated with SPV30.
25 There is no significant difference in side effects between two groups.