wo g~/03826 2 ~ ~ 7 7 ~ 2 PCT~94/00955 .
Préparations d'immuno~lobulines stabilisées et procédé ~our leur Pré~aration La présente invention a trait a des préparations d'immunoglobulines (Ig) humaines ou ~n;mAles, en particulier immunoglobulines polyclonales sanguines. La présente invention a également trait a un procédé de stabilisation des immunoglobulines.
- lO Les immunoglobulines sont largement utilisées dans la prophylaxie et la thérapeutique. Leur mode d'administration par voie intraveineuse nécessite de réduire au mA~;mum leur activité anticomplémentaire qui peut résulter d'une dénaturation des Ig conduisant notamment à la formation d'agrégats et de polymères.
Ainsi, la norme européenne publiée dans Pharmeuropa (3 (4), décembre 1991, 259-268) exige que les solutions d'immunoglobulines pour administration intraveineuse aient des taux d'agrégats et de polymères inférieurs ou égaux à 3 % des protéines totales et une activité anticomplémentaire inférieure ou égale à 1 unité
CH 50 par mg d'Ig. La formation d'agregats n'intervient pas seulement au cours de la préparation des solutions d'immunoglobulines, mais aussi au cours de leur conservation sous forme liquide, notAmm~nt lors de leurs manipulations. En effet, les immunoglobulines ont tendance à se dénaturer aux interfaces liquide/gaz et liquide/solide, ce qui se traduit par une augmentation de l'activité anticomplémentaire par formation d'agrégats solubles ou insolubles.
La demande de brevet francais FR-A-2 301 266 propose un procédé de préparation de gamma-globulines injectables par voie intraveineuse. La mise sous forme pharmaceutique comprend la dissolution des gamma-~167712 _ ~ Q _ Patent abstracts of Japan, 5, n 41 (C-047) 18 mars 1981 divulgue une préparation d'immunoglobulines anti HB à laquelle est ajouté un agent tensioactif dans le but d'assurer la stabilisation lors de la lyophilisation de la préparation. La concentration en tensioactif qui est preconisee est comprise entre 0,1 g/l et 0,5 g/l.
La demande de brevet WO-A-8 911 297 concerne une composition d'anticorps monoclonaux lyophilisés. Il n'y est pas question de l'utilisation d'un quelconque sur~actant.
La demande de brevet DE-A-3 208 523 décrit l'utilisation du PLURONIC TM à une concentration élevée (1 à 3 %) en tant qu'agent précipitant des aggrégats, et non dans un but de protection. Il n'y est pas fait mention des propriétés surfactantes du produit, ni de celles protectrices contre la dénaturation de l'immunoglobuline. Le taux résiduel en PLURONIC TM y reste très élevée.>
globulines dans une solution aqueuse tamponnee et contenant du glycocolle et de l'albumine.
Fn outre, pour empecher ou reduire toute dénaturation de surface (aux interfaces liquide/ai~ ou liquide/solide), cette demande propose d'ajou-er a la preparation pharmaceutioue obtenue un agent tensio-actif non ioniaue. A titre d'agent tensio-actif, cette demande propose les Tweens ou le Pluronic 68. Dans le seul mode de realisation decrit, cette demande preconise l'utillsation de T-~een 80 à une concentration de 0,1 %
c'est-a-dire de 1 g/l. En consequence, la mise sous forme phar~aceutique des gamma-globulines passerait par l'utilisation combinee de glycocolle, d'albumine e_ de tensio-actif non-ionioue a une concentration de l'ordre de 1 g/l.~ ~
p ~ ~ La demande de ~revet européen EP-A 448 075 _ a décrit un procede de preparation d'Ig int_aveineuse avec filtra~ion sur memb-ane, dans leauel on cherc;~e a empêcher la denaturation des Ig lors de la fil.ration a l'aide d'un s~zbilisant tensio-actif, qui peut et-e un tensio-ac~if non ionicue t~l cue le Pluronic. Le taux de stabilisant recommande est compris entre 0,5 et 50 g/l.
Il en résulte oue le produit final contient le tensio-actif à un taux tres eleve.
~.L. Levine et al. (J. of Pa-ente-al Science and Technology, volume 45 (3) mai-juin 1991, pages 160 a 165) rapportent une etude sur les effets protec.eurs des tensio-actifs non ioniques contre la denaturation de sur~ace de solutions d'anticorps monoclonaux fai~lement concentrees dans un tes. d'agitation. Les auteurs rapportent une concentration efficace de l'ordre de 0,1 ~, c'est-a-dire correspondant a 1 g/l. Aucune protection n'est par con~re obtenue avec une concent~ation de 0,1 g/l .
W095/03826 3 ~ ~ 7 ~ ~ ~ PCT/FR94/00955 .
Or il est etabli qu'à ces concentrations élevées, ces agents tensio-actifs présentent des inconvénients sérieux en cas d'injection intraveineuse.
Ainsi, le brevet US-A-4 439 421 recommande de ne pas utiliser les tensio-actifs non ioniques tels que décrits notAmm~nt dans le brevet US-A-4 093 606 correspondant à la demande de brevet français ci-dessus, pour un problème d'innocuité vis-à-vis des cellules sanguines. Cela confirme les observations de J.C. KRANTZ
- 10 et al. (J. Pharmacol Exp. Ther. g3, pages 188 à 195, 1948) sur le pouvoir hémolytique du Tween 20 à la concentration de 1 g/l. Le brevet US précité propose de stabiliser les solutions d'Ig en vue de leur lyophilisation en combinant plusieurs types de stabilisants, macromolécules, protéines et polyols de bas poids moléculaire. Le polyéthylène glycol est préféré en liaison avec de l'albumine humaine et du glucose.
Il est en effet connu que l'albumine agit comme un stabilisant efficace pour les immunoglobulines.
Mais dans le contexte médical actuel, on cherche à éviter autant que faire se peut l'utilisation de substances d'origine humaine ou An;mAle, qui présentent un risque de contA~;nAtion virale.
La demanderesse a maintenant découvert de ~façon surprenante qu'il était possible de préparer des solutions d'immunoglobulines stabilisées sous forme liquide à l'aide d'un tensio-actif non ionique en très faible concentration, tout en se passant des stabilisants habituels tels que l'albumine.
La présente invention a donc pour objet des préparations d'immunoglobulines humaines ou animales, en particulier polyclonales, et notamment IgG polyclonales, qui comprennent, à titre de stabilisant de conservation sous forme liquide, un tensio-actif non ionique en concentration inférieure ou égale à 0,1 g/l et qui sont W095/03~6 4 PCT/FR94/00955 wo g ~ / 03826 2 ~ ~ 7 7 ~ 2 pct ~ 94/00955 .
Immuno ~ lobulin preparations stabilized and process ~ our Pré ~ aration The present invention relates to preparations human immunoglobulins (Ig) or ~ n; male, in especially polyclonal blood immunoglobulins. The The present invention also relates to a method of stabilization of immunoglobulins.
- lO Immunoglobulins are widely used in prophylaxis and therapy. Their fashion intravenous administration requires reduce to mA ~; mum their anticomplementary activity which may result from denaturation of Ig leading to especially the formation of aggregates and polymers.
So the European standard published in Pharmeuropa (3 (4), December 1991, 259-268) requires that immunoglobulin solutions for administration intravenous have levels of aggregates and polymers less than or equal to 3% of total protein and one anticomplementary activity less than or equal to 1 unit CH 50 per mg of Ig. Aggregate formation does not occur not just during the preparation of solutions immunoglobulins, but also during their conservation in liquid form, notAmm ~ nt during their manipulations. Indeed, immunoglobulins have tendency to denature at the liquid / gas interfaces and liquid / solid, which results in an increase of anticomplementary activity by formation of aggregates soluble or insoluble.
French patent application FR-A-2 301 266 offers a process for the preparation of gamma globulins intravenous injection. The formatting pharmaceutical includes dissolving gamma-~ 167,712 _ ~ Q _ Patent abstracts of Japan, 5, n 41 (C-047) March 18, 1981 discloses an anti HB immunoglobulin preparation to which a surfactant is added in order to ensure the stabilization during lyophilization of the preparation. The concentration of surfactant which is recommended is understood between 0.1 g / l and 0.5 g / l.
Patent application WO-A-8,911,297 relates to a composition lyophilized monoclonal antibodies. There is no question the use of any one on ~ actant.
Patent application DE-A-3 208 523 describes the use of the PLURONIC TM at a high concentration (1 to 3%) as as an agent precipitating aggregates, not for the purpose of protection. Properties are not mentioned surfactants of the product, or those that protect against denaturation of immunoglobulin. The residual rate in PLURONIC TM remains very high there.>
globulins in a buffered aqueous solution and containing glycine and albumin.
Fn addition, to prevent or reduce any surface denaturation (at the liquid / ai ~ or interfaces liquid / solid), this request proposes to add to the pharmaceutical preparation obtained a surfactant non-ionic. As a surfactant, this request offers the Tweens or the Pluronic 68. In the single mode of implementation described, this request recommended the use of T- ~ een 80 at a concentration of 0.1%
i.e. 1 g / l. As a result, the formatting phar ~ aceutique of gamma-globulins would pass by the combined use of glycine, albumin and non-ionic surfactant at a concentration of the order 1 g / l. ~ ~
p ~ ~ The request for ~ European revet EP-A 448 075 _ described a process for the preparation of intavinous Ig with filtra ~ ion on memb-ane, dans leauel on cherc; ~ ea prevent the denaturation of Ig during fil.ration a using a surfactant, which can and does non-ionic tensio-ac ~ t ~ l cue the Pluronic. The rate of recommended stabilizer is between 0.5 and 50 g / l.
The result is that the final product contains the tensio-active at a very high rate.
~ .L. Levine et al. (J. of Pa-ente-al Science and Technology, volume 45 (3) May-June 1991, pages 160 to 165) report a study on the protective effects of nonionic surfactants against denaturation of on ~ ace of monoclonal antibody solutions weakly concentrated in a test. of agitation. Authors report an effective concentration of the order of 0.1 ~, that is to say corresponding to 1 g / l. No protection is not con ~ re obtained with a concentration ~ ation of 0.1 g / l.
W095 / 03826 3 ~ ~ 7 ~ ~ ~ PCT / FR94 / 00955 .
However, it is established that at these high concentrations, these surfactants have drawbacks serious in case of intravenous injection.
Thus, US-A-4,439,421 recommends not not use nonionic surfactants such as described notAmm ~ nt in US-A-4,093,606 corresponding to the above French patent application, for a safety problem with cells blood. This confirms the observations of JC KRANTZ
- 10 et al. (J. Pharmacol Exp. Ther. G3, pages 188 to 195, 1948) on the hemolytic power of Tween 20 at the concentration of 1 g / l. The aforementioned US patent proposes stabilize Ig solutions with a view to their lyophilization by combining several types of stabilizers, macromolecules, proteins and low polyols molecular weight. Polyethylene glycol is preferred in binding with human albumin and glucose.
It is indeed known that albumin acts as an effective stabilizer for immunoglobulins.
But in the current medical context, we are looking to avoid as much as possible the use of substances of human origin or An; male, which have a risk of contA ~; viral nAtion.
The plaintiff has now discovered ~
surprising that it was possible to prepare stabilized immunoglobulin solutions in the form liquid using a nonionic surfactant in very low concentration, while doing without stabilizers such as albumin.
The present invention therefore relates to human or animal immunoglobulin preparations, in particularly polyclonal, and in particular polyclonal IgG, which include, as a conservation stabilizer in liquid form, a nonionic surfactant in concentration less than or equal to 0.1 g / l and which are W095 / 03 ~ 6 4 PCT / FR94 / 00955
2~ ~7712 essentiellement dépourvues d'albumine. Par essentiellement dépourvues d'albumine, il faut comprendre qu'aucune trace d'albumine n'est détectée par la méthode de référence Pharmeuropa en électrophorèse sur acétate de cellulose , ce qui correspond à une quantité d'albumine inférieure à 1% des IgG.
De préférence, la concentration en tensio-actif non ionique est comprise entre 0,02 et 0,05 g/l environ et est de préférence de l'ordre de 0,025 g/l.
- lO De préférence, les préparations selon l'invention comprennent entre 30 et 120 g/l d'immunoglobulines.
Le tensio-actif non-ionique est choisi de préférence dans le groupe consistant en monooléate de sorbitanne polyoxyéthylène (20), éther octylphénylique du décaéthylène-glycol, monolaurate de sorbitanne polyoxyéthylène (20), copolymère mixte polyoxyéthylène/polyoxypropylène et polyoxyéthylène et Laurate de polyéthylène glycol 600.
Comme cela est d'usage, les préparations selon l'invention peuvent aussi comprendre un stabilisant de lyophilisation usuel tel que le saccharose, notamment en concentration de l'ordre de 50 à 100 g/l.
Les préparations d'immunoglobulines selon l'invention ont également de préférence les caractéristiques préconisées par les normes en vigueur, tel que pH compris entre 4,0 et 7,4, osmolalité
supérieure à 280 mosmol/kg par l'addition de solutés osmotiquement actifs, tels que des sels minéraux (tel que NaCl) ou des sucres (tel que glucose, saccharose, maltose) ou des sucres-alcools (tels que mannitol, sorbitol) ou des acides aminés (tel que glycocolle).
Les préparations obtenues répondent aux critères de sécurité d'emploi particuliers aux solutions d'Ig pour a~r;n;~tration intraveineuse, à savoir stérilité
bactérienne et fongique, apyrogénicité, taux réduit WO9~/03826 5 Z ~ ~ ~ 712 PCT/FR94/00955 .
d'agrégats et de polymères et activité anticomplémentaire réduite.
Les immunoglobulines présentes dans la - préparation peuvent être obtenues à partir de plasma, de sérum ou de placenta par les méthodes classiques de - fractionnement des protéines, complétées le cas échéant par des traitements spécifiques visant à réduire le taux d'agrégats et de polymères et/ou à réduire l'activité
anticomplementaire de la préparation (par exemple traitement modéré à la pepsine ou à la plasmine, traitement dissociant à pH acide, modification chimique par réduction et/ou alkylation ou précipitation des agrégats et polymères par le PEG).
Les préparations selon l'invention peuvent être des solutions prêtes à l'emploi, donc conservées sous forme liquide, ou être des solutions obtenues extemporanément par dissolution d'un concentré
lyophilisé.
La présente invention a également trait à un procédé de stabilisation des préparations d'immunoglobulines humaines ou animales, polyclonales, dans lequel on ajoute à la préparation un stabilisant de conservation sous forme liquide qui est un tensio-actif non ionique de façon à obtenir une concentration inférieure ou égale à 0,1 g/l dans la préparation finale.
De préférence, le tensio-actif non ionique est ajouté en concentration comprise entre 0,02 et 0,05 g/l environ et de préférence de l'ordre de 0,025 g/l. Le tensio-actif non ionique est choisi parmi ceux indiqués plus haut.
L'agent tensio-actif est avantageusement ajouté juste avant le conditionnement final en flacons, mais il peut également être ajouté à un stade antérieur du procédé
d'extraction et de purification des Ig.
W095l03826 6 PCT/~ 4/00955 L'invention va être maintenant décrite plus en détail à l'aide d'essais réalisés avec des préparations d'immunoglobulines selon l'invention.
On a simulé des conditions sévères de manipulation de flacons d'Ig intraveineuse à l'aide d'un test d'agitation. Des flacons de verre borosilicate de type I de 50 ml sont remplis aseptiquement avec 20 ml d'une solution stérile d'Ig à 50 g/l. Les flacons sont agités à température ambiante de 20-C pendant 1 ou 2 h sur un agitateur de type oscillant/alternatif réglé pour 80 oscillations horizontales par minute.
L'activité anticomplémentaire (AcA) de la solution est mesurée selon le test décrit dans "Pharmeuropa" (supra).
Essai 1 : effet protecteur du Tween 80 Composition de la solution d'Ig intraveineuse :
Ig = 50 g/l Saccharose = 100 g/l NaCl z 1 g/l pH = 4,3 Concentration variable de Tween 80 : de 0 à
100 mg/l Tableau 1 :
Tween 80 (mg/l) 0 10 25 lO0 * AcA avant agitation O,34 0,35 O,35 O,36 * AcA après agitation 2h >1,19 1,19 O,75 0,38 * CH 50/mg Ig Résultat : Une protection nette s'observe dès 25 mg/l. Elle est quasiment totale avec lOO mg/l de tensio-actif.
W095/03826 7 ~ 7 ~ 1~ PCT/FR94/00955 .
Bs~ai 2 : e~fet protecteur de ~riton X loo Idem essai 1, mais avec du Triton X 100 au lieu du Tween 80 comme tensio-actif Ta~leau 2 :
Triton X 100 (mg/l) * AcA avant agitation 0,37 0,36 0,36 0,31 * AcA après agitation 2h 0,50 0,34 0,36 0,19 * CH 50/mg Ig Résultat : Une protection totale est obtenue avec la plus faible concentration essayée, 25 mg/l.
Es~ai 3 : effet protecteur du Tween 80 Idem essai 1, mais avec une agitation de 1 h au lieu de 2h.
Tableau 3 :
Tween 80 (mg/l) * AcA avant agitation 0,41 0,33 * AcA après agitation 1 h 0,70 0,27 * CH 50/mg Ig Résultat : Dans cet essai moins sévère, la concentration de 25 mg/l de Tween suffit à proteger totalement l'Ig.
E~sai 4 : effet Protecteur de l~albumine Idem essai 1, mais utilisation d'albumine humaine au lieu de Tween 80 comme protecteur.
7 ~ 2 Tableau 4 :
Albumine (mg/l) 0 100 1000 10 . 000 * AcA avant agitation 0,34 0,36 0,26 0,29 * AcA après agitation 2h 1,24 0,64 0,27 0,28 .
* CH 50/mg Ig Résultat : L'albumine exerce un effet protecteur - 10 sur l'Ig à partir d'une concentration comprise entre 100 et 1000 mg/l.
Tensio-actifs non ioniques Préférés :
- Tween 80 (ester oléique du sorbitanne polyoxyéthylene fabriqué par Atlas).
- Triton X 100 (éther octyl-phénylique du polyoxyéthylène fabriqué par Rohm et Haas).
- Tween 20 (ester laurique du sorbitanne polyoxyéthylène) - Pluronic F 68 (copolymère de polyoxyéthylène et de polyoxypropylène fabriqué par Ugine Kl~hlm~nn).
- Laurate de polyéthylène glycol 600 (fabrique par Gattefossé).
Le Tween 80 est préféré du fait de son absence de toxicité et de son emploi en formulation pharmaceutique ou alimentaire bien documenté (Voir l'ouvrage "Non Ionic Surfactants" M. Schick éd. Marcel Dekker NY, 1967, 28, 923-970). 2 ~ ~ 7712 essentially free of albumin. By essentially free of albumin, you have to understand no trace of albumin is detected by the method Pharmeuropa benchmark in electrophoresis on acetate cellulose, which corresponds to an amount of albumin less than 1% of IgG.
Preferably, the concentration of surfactant non-ionic is between 0.02 and 0.05 g / l approximately and is preferably of the order of 0.025 g / l.
- 10 Preferably, the preparations according to the invention contain between 30 and 120 g / l of immunoglobulins.
The nonionic surfactant is chosen from preferably in the group consisting of sorbitan polyoxyethylene (20), octylphenyl ether of decaethylene glycol, sorbitan monolaurate polyoxyethylene (20), mixed copolymer polyoxyethylene / polyoxypropylene and polyoxyethylene and Polyethylene glycol 600 laurate.
As is customary, the preparations according to the invention may also include a stabilizer usual lyophilization such as sucrose, especially in concentration of the order of 50 to 100 g / l.
Immunoglobulin preparations according to the invention also preferably have the characteristics recommended by the standards in force, such as pH between 4.0 and 7.4, osmolality greater than 280 mosmol / kg by the addition of solutes osmotically active, such as mineral salts (such as NaCl) or sugars (such as glucose, sucrose, maltose) or sugar alcohols (such as mannitol, sorbitol) or amino acids (such as glycine).
The preparations obtained meet the criteria job security specific to Ig solutions for a ~ r; n; ~ intravenous tration, namely sterility bacterial and fungal, apyrogenicity, reduced rate WO9 ~ / 03826 5 Z ~ ~ ~ 712 PCT / FR94 / 00955 .
of aggregates and polymers and anticomplementary activity scaled down.
The immunoglobulins present in the - preparation can be obtained from plasma, serum or placenta by conventional methods of - protein fractionation, supplemented if necessary by specific treatments aimed at reducing the rate of aggregates and polymers and / or to reduce the activity anticomplementary preparation (for example moderate pepsin or plasmin treatment, dissociative treatment at acid pH, chemical modification by reduction and / or alkylation or precipitation of aggregates and polymers by PEG).
The preparations according to the invention can be ready-to-use solutions, therefore stored under liquid form, or be solutions obtained extemporaneously by dissolving a concentrate freeze-dried.
The present invention also relates to a process for stabilizing preparations polyclonal human or animal immunoglobulins, in which a stabilizer of storage in liquid form which is a surfactant non-ionic so as to obtain a concentration less than or equal to 0.1 g / l in the final preparation.
Preferably, the nonionic surfactant is added in concentration between approximately 0.02 and 0.05 g / l and preferably of the order of 0.025 g / l. The surfactant non-ionic is chosen from those indicated above.
The surfactant is advantageously added just before final packaging in vials, but may also be added at an earlier stage of the process extraction and purification of Ig.
W095l03826 6 PCT / ~ 4/00955 The invention will now be described in more detail.
detail using tests carried out with preparations of immunoglobulins according to the invention.
We simulated severe conditions of manipulation of intravenous Ig vials using a agitation test. Borosilicate glass vials of 50 ml type I are aseptically filled with 20 ml of a sterile Ig solution at 50 g / l. The bottles are stirred at room temperature 20 ° C for 1 or 2 h on an oscillating / alternating type agitator set for 80 horizontal oscillations per minute.
The anticomplementary activity (AcA) of the solution is measured according to the test described in "Pharmeuropa" (supra).
Test 1: protective effect of Tween 80 Composition of the intravenous Ig solution:
Ig = 50 g / l Sucrose = 100 g / l NaCl z 1 g / l pH = 4.3 Variable concentration of Tween 80: from 0 to 100 mg / l Table 1:
Tween 80 (mg / l) 0 10 25 l00 * AcA before shaking O, 34 0.35 O, 35 O, 36 * AcA after shaking 2h> 1.19 1.19 O, 75 0.38 * CH 50 / mg Ig Result: Clear protection is observed from 25 mg / l. It is almost complete with 100 mg / l of surfactant.
active.
W095 / 03826 7 ~ 7 ~ 1 ~ PCT / FR94 / 00955 .
Bs ~ ai 2: protective effect of ~ riton X loo Same as test 1, but with Triton X 100 instead of Tween 80 as surfactant Ta ~ leau 2:
Triton X 100 (mg / l) * AcA before shaking 0.37 0.36 0.36 0.31 * AcA after shaking 2h 0.50 0.34 0.36 0.19 * CH 50 / mg Ig Result: Total protection is obtained with the lowest concentration tested, 25 mg / l.
Es ~ ai 3: protective effect of Tween 80 Same as trial 1, but with 1 hour agitation instead of 2h.
Table 3:
Tween 80 (mg / l) * AcA before shaking 0.41 0.33 * AcA after shaking 1 h 0.70 0.27 * CH 50 / mg Ig Result: In this less severe trial, the 25 mg / l Tween is enough to protect totally the Ig.
E ~ sai 4: Protective effect of albumin Same as trial 1, but use of human albumin instead of Tween 80 as a protector.
7 ~ 2 Table 4:
Albumin (mg / l) 0 100 1000 10. 000 * AcA before shaking 0.34 0.36 0.26 0.29 * AcA after shaking 2h 1.24 0.64 0.27 0.28 .
* CH 50 / mg Ig Result: Albumin has a protective effect - 10 on the Ig from a concentration between 100 and 1000 mg / l.
Preferred nonionic surfactants:
- Tween 80 (oleic ester of polyoxyethylene sorbitan manufactured by Atlas).
- Triton X 100 (octylphenyl ether of polyoxyethylene manufactured by Rohm and Haas).
- Tween 20 (lauric ester of polyoxyethylene sorbitan) - Pluronic F 68 (copolymer of polyoxyethylene and polyoxypropylene manufactured by Ugine Kl ~ hlm ~ nn).
- Polyethylene glycol 600 laurate (manufactured by Gattefossé).
The Tween 80 is preferred because of its lack of toxicity and its use in pharmaceutical formulation or well documented food (See the book "Non Ionic Surfactants "M. Schick ed. Marcel Dekker NY, 1967, 28, 923-970).