CA2127178A1 - Nouvelles compositions cosmetiques ou dermatologiques renfermant des ribosomes, preparation des ribosomes, preparation des dites compositions et leur application - Google Patents
Nouvelles compositions cosmetiques ou dermatologiques renfermant des ribosomes, preparation des ribosomes, preparation des dites compositions et leur applicationInfo
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Abstract
PRECIS DE LA DIVULGATION L'invention concerne une composition cosmétique ou dermatologique pour les soins de la peau, caractérisée en ce qu'elle renferme à titre de principe actif associé à un excipient acceptable pour fins cosmétiques ou dermatologiques des ribosomes extraits de cellules végétales, animales ou de micro-organismes. L'invention concerne également l'application de la composition précédemment définie à titre de produit cosmétique. L'invention concerne en outre une méthode de traitement cosmétique et l'utilisation de ribosomes comme facteur de croissance.
Description
2~2~-~78 Nouvelles com~ositions cosmétiques ou dermatoloqiques renfermant des ribosomes, préParation des ribosomes pré~aration desdites comPositions et leur apPlication.
La présente invention concerne de nouvelles compositions cosmétiques ou dermatologiques pour les soins de la peau, caractérisées en ce qu'elles renferment à titre de principe actif associé à un excipient acceptable pour fins cosmé-tiques ou dermatologiques, des ribosomes extraits de cellules lo végétales, animales ou de micro-organismes.
Ces nouvelles compositions sont destinées notamment à
retarder les signes de vieillissement de la peau.
Au fur et à mesure du développement du vieillissement cutané, des modifications interviennent, surtout au niveau 15 épidermique et dermique.
Au sein de l'épiderme, la production de cellules nou-velles ne compense plus la desquamation et l'épiderme s'amin-cit progressivement.
Les glandes sébacées sont ~onctionnellement moins acti- ~ -20 ves et la peau devient alors sèche.
Au niveau du derme, la formation de collagène jeune, responsable de la tonicité cutanée, se ralentit par diminu-tion de l'activité secrétrice des fibroblastes. Des liaisons croisées intermoléculaires au sein des fibres de collagène se 25 multiplient, entraînant une rigidité structurale, une réduc-tion de la capacité d'absorption d'eau, une diminution des apports nutritionnels et d'oxyg~ne.
Ces transformations néfastes provoquent une perte d'élasticité, une déshydratation, une asphyxie et une séche-30 resse cutanée.
Ces phénom~nes conduisent à l'apparition de rides, notamment au niveau du visage où la peau est particulièrement agressée par des facteurs d'origine externe (intempéries, pollution, radiations lumineuses) et par des facteurs d'ori-35 gine interne (maladies, augmentation de l'âge).
De nombreuses préparations cosmétiques destinées ~
combattre le vieillissement de la peau existent déjà sur le marché.
Ces préparations connues renferment des composés très 2~27~ 7~
variés, tels que des extraits biologiques, par exemple des extraits placentaires, du collagène, des mélanges polyvi-taminés, des acides gras essentiels.
On connait également des compositions cosmétiques 5 renfermant du sérum de veau foetal, des extraits d'organes tels que thymus ou rate, des extraits animaux, décrites par exemple dans la demande de brevet francais n- 84 19446 publiée sous le n 23 74 661.
Cependant jamais encore n'a été décrite l'utilisation en ::
10 cosmétologie des propriétés topiques réelles de ribosomes, ni n'ont été utilisés les ribosomes extraits de cellules végé~
tales, animales ou de micro-organismes, pour lutter contre le ::
vieillissement cutané. :~
Les ribosomes sont des organelles sub-cellulaires compo-15 sés d'ARN et de protéines impliqués dans la synthèse des i- .
protéines.
A titre d'illustrations, on peut noter que les ribosomes de E. coli (gram-) sont constitués des fractions : ~ :
70 S (M : 2,7.106 dalton) 20 50 S (M : 1,8.106 dalton) ~ :
30 S (M : 0,9.106 dalton) A leur tour les fractions 50 S et 30 S ont la composition suivante :
50 S : 34 protéines, 2ARN (23 S, 5S) 25 30 S : 21 protéines, lARN (16 S). :~
Il vient d'être démontré et c'est l'objet de la présente invention que ces ribosomes possèdent un remarquable pouvoir -stimulant et régénérant et qu'ils sont doués d'un effet stimulant sur la croissance cellulaire.
Ces différentes propriétés illustrées plus loin dans la partie expérimentale, peuvent être avantageusement mises à
profit en dermatologie et en cosmétologie.
L'un des avantages qu'apportent les compositions de la présente invention sur les compositions connues de l'art 35 antérieur est, par exemple en rempla~ant le sérum de veau foetal par des ribosomes extraits de cellules végétales, animales ou de micro-organismes, d'éviter les risques d'in-fection virale, tels que par exemple les risques d'infection par des prions qui sont de nouveaux agents infectieux apparus 2~271 7~
depuis le milieu des années 1980 et responsables de l'épidé-mie dite des vaches folles ou encéphalite bovine spongiforme.
D'autre part, l'identité des souches ou, en général, des cellules, à partir desquelles on extrait les ribosomes est - -5 facile à vérifier en permanence, ce qui assure une parfaite reproductibilité de l'extrait employé quant à son origine génétique et à sa composition.
La présente invention concerne notamment des composi-tions cosmétiques ou dermatologiques telles que définies ci-10 dessus, caractérisées en ce que les ribosomes sont extraitsde micro-organismes eucaryotes ou procaryotes, de bactéries Gram~ choisies dans le groupe formé par Klebsiella pneumo- -niae, Hafnia, Escherichia coli, Klebsiella ozoenae, Entero-bacter chloacae, Pseudomonas aeruginosa et Proteus ou de 15 bactéries Gram+ telles que par exemple le Bacillus subtilis, Arthrobacter sp., Lactobacillus ou le Staphylococcus tel que Staphylococcus aureus.
Parmi les ribosomes extraits de bactéries gram~ on retient notamment les ribosomes extraits des bactéries gram~
20 choisies dans le groupe formé par Klebsiella pneumoniae, Hafnia ou Escherichia coli.
La presente invention concerne donc plus particulière-ment les compositions telles que définies ci-dessus, caracté-risées en ce que les ribosomes sont extraits de bactéries 25 Gram~ choisies dans le groupe formé par Klebsiella pneu-moniae, Hafnia, Escherichia coli.
Parmi les ribosomes extraits de Klebsiella pneumoniae on peut citer par exemple les ribosomes extraits de la souche de Klebsiella pneumoniae et déposée à l'Institut Pasteur à Paris 30 sous le n- I-163.
Parmi les ribosomes extraits d'Hafnia, on peut citer par exemple les ribosomes extraits de la souche d'Hafnia et déposée à l'Institut Pasteur à Paris sous le n I-868.
Parmi les ribosomes extraits d'Escherichia coli, on peut 35 citer par exemple les ribosomes extraits de la souche d'Escherichia coli, déposée à l'Institut Pasteur à Paris sous le n- I-870 ou de la souche MRE600 du Microbiological Research Establishment, Sa]isbury, England.
21271 7~
Dans les compositions de l'invention, l'extrait de ribosomes peut ê-tre utilisé sous forme pulvérulente ou sous forme de suspension aqueuse.
L'invention concerne notamment des compositions cosméti~
ques ou dermatologiques telles que définies ci-dessus, carac-térisées en ce qu'elles renferment 5.10-5 % à 1 % en poids d'une suspension de ribosomes extraits de micro-organismes ou de cellules d'organisme supérieur : cellules végétales ou animales.
- : :
L'invention concerne plus particulièrement les composi- ~ -tions telleis que définies ci-dessus, caractérisées en ce qu'elles renferment 0,005 % à 0,05 % en poids d'une suspen-sion de ribosomes extraits de cellules végétales, animales et notammen-t de micro-organismes. ~-~
L'invention concerne tout particulièrement les composi- -tions telles que définies ci-dessus, caractérisées en ce qu'elles renferment o,Ol % en poids d'une suspension de ribo-somes extraits de cellules végétales, animales et notamment de micro-organismes.
Les ribosomes peuvent être préparés selon les méthodes usuelles connues de l'homme du métier. ~ ~ -La présente invention s'est également attachée ~ la préparation des ribosomes extraits de cellules végétales, animales et notamment de micro-organismes.
La présente invention concerne donc également les compo-sitions telles que définies ci-dessus, caractérisées en ce que les ribosomes extraits de micro-organismes sont préparés selon les étapes successives suivantes - cul-ture sur un milieu liquide ou solide de la souche de 30 micro-organismes, - récolte après complet développement des micro-organismes, - lyse des micro-organismes, et traitement de ce lysat par centrifugation, précipitation au sulfate d'ammonium, centrifugation, tamisage moléculaire, 35 précipitation au PEG 6000 (c'est à dire polyéthylène glycol d'un poids moléculaire moyen de 6000), centrifugation et dialyse de la solution obtenue.
Les milieux sur lesquels peuvent être cultivées les micro-organismes sont leis milieux liquide ou solide usuels et : .
2 ~L 2 7 1 r bon marché incluant une source de carbone, une source d'azote d'origine naturelle ou inorganique et des sels minéraux, tels qu'ils sont bien connus par l'homme du métier. La littérature donne de nombreux exemples de tels milieux de culture. On 5 peut citer par exemple le chapitre 1.6 "Culture media" du livre "Biochemical Engineering and Biotechnology Handbook", 2nde édition 1991 (Stockton Press).
Les micro-organismes après récolte sont repris dans un tampon tel que par exemple le tampon polymix I :
10 MgC12 5 mM pH = 7,5 CaC12 0,5 mM
Put~escine 8 mM
Spermidine 1 mM
Tricine 20 mM
15 NH4Cl 5 mM
KCl 95 mM
DTT 1 mM
ou encore dans le tampon :
Tris/Hcl 20 mM pH = 7,6 20 NH~Cl 100 mM
Mg(OAc)2 10 mM
on procade alors à la lyse des micro-organismes par exemple par lyse ~ haute pression ou encore par broyage à
l'alumine.
Puis on centrifuge le lysat obtenu à environ 10.000 à
13.000 rpm et précipite les proteines de preference au sul-fate d'ammonium, à la concentration de 210 mg/ml et ajusté à
pH = 7,5. Apr~s une nouvelle centrifugation, puis un tamisage moléculaire et une élution dans le tampon polymix II :
30 MgC12 5 mM pH = 7,5 Ca~l2 0,5 mM
Putrescine 8 mM
Spermidine 1 mM
Tricine 20 mM
35 NH4Cl 150 mM
KCl 95 mM
DTT 1 mM
la fraction contenant les ribosomes est précipitée de préfé-.
2~7:~7~
_ 6 rence par du PEG 6000 à 100 mg/ml.
Après centrifugation, la solution obtenue est dialysee environ une nuit contre un tampon tel que par exemple Tris/Hcl 20 mM
5 NH4Cl 60 mM - ;~
Mg(OAc)2 10 mM pH = 7,6 on obtient ainsi les ribosomes extraits de micro-organismes attendus.
Un tel exemple de preparation des ribosomes est donne 10 ci-après.
on peut noter que le protocole de purification des ribosomes pourrait être arrêté soit ~ l'issue des centrifuga-tions apr~s lyse des cellules des micro-organismes, soit à
l'issue de la centrifugation après l'étape de précipitation 15 des protéines au sulfate d'ammonium.
Jusqu'ici il était connu et usuel d'utiliser en culture cellulaire ln vitro comme ~acteur de croissance cellulaire -~
des composes en mélange tels que du sérum animal, en concen-tration de l'ordre de 10 %, et plus particulièrement le sérum 20 de veau foetal, ou des substituants synthétiques de celui-ci qui sont commercialisés à un prix élevé et dont la composi-tion est tenue secr~te, ex. Ultroser HY (IBF~, NU-SERUM
(Sochibo), et/ou des facteurs individuels tel l~ facteur de croissance épidermique "EGF" (Epidermal Growth Factor~.
Jamais encore, et c'est également l'objet de la présente invention, n'avaient été utilisés des ribosomes comme facteur de croissance cellulaire in vitro, à des concentrations~ en plus, très faibles qui ont eté définies ci-dessus.
La présente invention concerne donc particulièrement 30 l'utilisation en alternative économiquement très avantageuse aux suppléments ci-dessus cités, de ribosomes extraits de micro-organismes comme facteur de croissance de cultures cellulaires in vitro.
De tels ribosomes peuvent être préparés ainsi qu'il est 35 indiqué ci-dessus.
Dans le cadre de la présente invention, on a étudié le ~
pouvoir stimulant des ribosomes selon l'invention par compa- ~ ;
raison avec celui du sérum de veau foetal et du facteur de , ,;~
21 2 71 l ~3 croissance épidermique (EGF~ constituant ici le milieu témoin positi~, dans des cultures de kératinocytes dQ l'épiderme humain.
Un exemple d'une telle étude, qui montre la supériorité
5 du pouvoir stimulant sur la croissance cellulaire des ribo-somes sur les composés connus et couramment utilisés qui sont le sérum de veau foetal et le facteur de croissance épidermi-que EGF est décrit ci-après.
La présente invention concerne donc tout particulière-10 ment l'utilisation de ribosomes extraits de micro-organismes comme ~acteur de croissance de culture de kératinocytes in vitro.
Par ailleurs, en étudiant l'activité des ribosomes de la présente demande, on a constaté que ceux-ci présentaient une 15 remarquable activité inductrice "like" de l'EGF (Epidermal Growth Factor~ facteur de croissance épidermique, sans pré-senter la toxicité de ce dernier. De ce fait les ribosomes peuvent ~tre utilisés pour faciliter la régénération de la peau et de l'épiderme.
Ainsi les propriétés régénératrices cutanées par stimu-lation de la croissance cellulaire des compositions selon l'invention leur confèrent une efficacité dans la lutte contre le vieillissement de la peau.
La dose usuelle, variable selon le produit utilisé, le 25 sujet traité et l'affection en cause, peut etre, par exemple de 50 mcg à 5 mg par jour en applications locales chez l'homme.
L'invention a particulièrement pour objet les composi-tions cosmétiques ou dermatologiques telles que définies ci-30 dessus, caractérisées en ca qu'elles se présentent sous formede préparations liquides ou solides ~ usage topique et notamment les compositions cosmétiques ou dermatologiques -telles que définies ci-dessus caracterisees en ce qu'elles se presentent préférentiellement sous une des formes suivantes :
35 - des gels aqueux, - des gels gras, - des émulsions simples, eau dans huile, - des émulsions simples, huile dans eau, ~ :. ..
2~717~
- des émulsions multiples, par exemple : -- eau dans huile dans eau ou huile dans eau dans huile, - une émulsion triple eau dans huile dans eau, : ~ :
- une émulsion triple huile dans eau dans huile, 5 - une émulsion huile dans eau contenant des cristaux liqui-des, - des émulsions complexes contenant des cristaux liquides formant des bicouches lipidiques entourant des phases ~
grasses, :
10 - des pseudo-émulsions (dispersion d'une phase huileuse ou ~:
d'une émulsion eau dans huile dans une phase aqueuse geli-fiee, sans tensio-actifs traditionnels), - des micro-émulsions huile dans eau ou eau dans huile, - des émulsions contenant deux phases huiles dispersées, 15 différentes et insolubles entre elles, - une pseudo-émulsion ou dispersion d'une phase grasse dis- :~
persée dans une phase aqueuse et stabilisée avec du Labragel (R), du Pemulen (R), de l'Hypan (R~, de la gomme xanthane, de la CMC, de l'hydroxyéthyl cellulose, de l'Amigel (R~, de la 20 Polyvinyl-pyrrolidone, de l'Amercell HM 1500 (R), ou un mélange de deux ou plusieurs de ces gélifiants.
Les compositions selon l'invent:ion peuvent le cas éch8ant contenir des filtres, des écrans aux radiations solaires, des extraits vitaminés, des parfums, des conserva-25 teurs, des anti-oxydants, des colorants.
Les compositions dermatologiques peuvent être, par exemple, solides ou liquides et se présenter sous les formes dermatologiques couramment utilisées, comme par exemple, les crèmes, les gels, les pommades, les lotions, les laits pour 30 la peau, les gouttes, les collyres, les aérosols, les sham-poings ou sous forme de liposomes ; elles sont préparées :
selon les methodes usuelles. Le ou les principes actifs peuvent y être incorporés à des excipients habituPllement ~:
employés dans ces compositions phaxmaceutiques, tels que le ~- b 35 talc, la gomme arabique, le lactose, l'amidon, le stéarate de magnésium, le beurre de cacao, les véhicules aqueux ou non, les corps gras d'origine animale ou végétale, les dérivés paraffiniques, les glycols, les divers agents mouillants, '~ ' ',~ 9 2~2717~ , dispersants ou émulsi~iants, les conservateurs.
Ces compositions selon l'invention peuvent renfermer le cas échéant en plus des ribosomes extraits de microorganis-mes, d'autres composés actifs ayant des propriétés cutanées 5 particulières.
Ainsi, ces compositions selon l'invention peuvent contenir par exemple l'acétate d'oléyle. Ce produit a des propriétés anti-lipasique et prévient directement la formation de comédons et de points noir.
Les compositions ainsi obtenues renferment deux consti-tuants qui par leur action combinée constituent un produit bien adapté aux peaux à tendance acnéique.
Ces compositions selon l'invention peuvent aussi renfermer le cas échéant un composé favorisant la cicatrisa-15 tion des lésions de l'acné, tel que par exemple, un extrait de Centella Asiatica et plus particulièrement un extrait glycolique ou un extrait sec titré de Centella Asiatica.
D'autres substances telles que l'huile d'onagre, les acides amin~s peuvent aussi y ~tre incorporées.
L'invention a donc plus particulièrement pour objet des compositions dermatologiques, caractarisées en ce qu'elles renferment des ribosomes extraits de microorganismes et le ca~ ~ch~ant un ou plusieurs des produits choisis parmi l'acé-tate d'oléyle, l'extrait sec titré de Centella Asiatica, 25 l'huile d'onagre, les acides aminés.
Les compositions cosmétiques se:Lon l'invention peuvent se présenter sous toutes les formes utilisées en cosmétolo- -gie : crème ou gel en pots ou en tubes, lait ou lotion en flacons de verre ou de matière plastique et éventuellement en 30 flacon-doseur, ampoule, aérosol.
L'invention concerne donc des compositions cosmétiques, caractérisées en ce qu'elles se présentent sous forme de crème, gel, lait, lotion, émulsion, savon liquide, pain ; ~
dermatologi~ue, ou shampoing. ; ~`
Pour chaque forme, on a recours à dPs excipients appro-priés. Ces excipients doivent avoir toutes les qualités habituellement demandées. Ils doivent ~tre doués d'une grande affinité pour la peau, être parfaitement bien toléres, -- lo 2~27~ 7~
stables, présenter une consistance adéquate, permettant une utilisation facile et agréable. ~:
A titre d'exemples d'excipients pouvant être utilisés, on peut citer notamment les hydrocarbures, les huiles de : ::
5 silicones, les triglycérides d'acide gras, les triglycérides de synthèse, les cires végétales, animales ou minérales, les acides et les alcools gras, les esters d'acides gras ou d'alcool gras, les amides d'acide gras, la lanoline, les tensio-a~tifs non ioniques, les tensio-actifs anioniques, les 10 polysaccharides gélifiants naturels ou synthétiques, la chitine désacétylée, les dérivés de cellulose, les dérivés de ~ :
guar, la polyols, les polyalkylèneglycols, les charges miné-rales, les pigments organiques ou les laques de colorants organiques ainsi que d'autres excipients connus et couramment 15 utilisés tels que, par exemple, les polymères de type carbo-xyvinylique, les polyéthylèneglycols, le propyl~ne glycol, des dérives stéariques tel que, par exemple, le stearate de glycerol, des alcools tels que, par exemple, les alcools stéaryliques, les alcools cétostéaryliques, l'alcool cétyli-20 que, l'~ther cetylique polyoxyethyléné, des huiles végétalestelles que l'huile d'avocat, l'huile de tournesol, des huiles minérales telles que l'huile de vaseline, la glycerine, des dérivas de la lanoline, du talc, des mouillants, des épais-sissants, des stabilisants, des émulsionnants, des conserva-25 teurs, des par~ums, des colorants.
Enfin des filtres solaires et des ré~lecteurs solairespeuvent être ajoutés à ces compositions cosmétiques pour leur conferer un pouvoir protecteur vis à vis des rayonnements ~.
solaires. Lorsque ces additifs sont insolubles dans les ~ :
30 phases huiles et aqueuses, ils constituent donc une phase supplémentaire. Il seront choisis par exemple parmi les ~ .
produits suivants - les perfluoroéthers comme les FoMsLIN (R) de la Societe - ~.
Montecatini, 35 - les pigments insolubles comme ~
. les oxydes de titane, ~.-. oxyde de titane rutile, . oxyde de titane anatase, ~ ~7~ 7~
--` 11 - ' . oxyde de titane pyrogéné comme le P 25 (R) de Degussa, . oxyde de titane micronisé dans le SUN VEIL (R) d'Ikeda, . oxyde de titane traité en surface par des silicones ou par des acides aminés, ou par de la lécithine, ou par des stéarates métalliques, . oxyde de fer, . oxyde de fer traité en surface par des silicones, ou par des acides aminés, ou par de la lécithine, ou par des stéarates métalliques, . oxyde de zinc, . oxyde ~inc microni~é comme l'UFZ0 (R) de Cosmo Trends Corporation, . mica recouvert d'oxyde de titane.
Les différentes formes cosmetiques mentionnées ci-dessus peuvent ~tre obtenues selon les méthodes usuelles utilisées dans ce domaine.
La présente invention concerne tout particuli~rement les compositions cosmétiques ou dermatologiques telles que défi-20 nies ci-de~sus, caractérisees en ce que leurs excipients sont ; -adaptés à l'application sur le visage, le cou et les mains. ;~
La pr~sente invention concerne égalem~nt l'application ~ -titre de produit cosmétique de compositions caractérisées en ce qu'elles renferment des ribosomes extraits de micro-25 organismes. ~ ~;
La présente invention concerne notamment une méthode de traitement cosmétique de régénération et de lutte contre le ;~
vieillissement de la peau caractérisée en ce que l'on appli-que sur la peau une quantité suffisante d'une composition 30 cosmétique telle que définie ci-dessus.
Les exemples donnés ci-dessous illustrent l'invention sans toutefois la limiter.
EXEMP~ Pr paratio~ de riho30mes La technique utilisée dérive de celle décrite dans l'article référencé comme suit : JELENC P, Rapid purification of highly active ribosomes from Escherichia coli. Anal Biochem 1980 ; 105 : 369-74.
12 2~7~
La souche utilisée est E. coli MRE600 de Microbiological Research Establishment, Salisbury, England, congelée et conservee ~ -20 C.
Les 3 tampons utilisés sont :
5 Tampon pol~mix I :
MgCl2 5 mM pH = 7,5 CaC12 0,5 mM
Putrescine 8 mM
Spermidine 1 mM
10 Tricine 20 mM
NH4Cl 5 mM
KCl 95 mM
DTT 1 mM
15 Tam~on polvmix II :
MgCl2 5 mM pH = 7,5 CaCl2 0,5 mM
Putrescine 8 mM
Spermidine 1 mM
20 Tricine 20 mM .
NH4Cl 150 ~M
KCl 95 mM
DTT 1 mM
25 Tampon TRIS :
TRIS HCl 20 mM pH = 7,6 NH4Cl 60 mM
Ng(OAc)2 10 mM
Toutes les manipulations sont effectuées à 4 C.
30 - 127 g (poids humide) de bactéries E. coli sont décongelées et reprises dans 254 ml de tampon polymix I
- lyse des bactéries par trois passages à haute pression :
V = 490 ml :~
- centrifugation : 30 minutes à 13000 rpm : V = 400 ml 35 - centrifugation : 30 minutes à 13000 rpm : V = 370 ml, -~ :
DO260 = 112480 ~:
- précipitation des protéines par sulfate d'ammonium (210 mg/ml) ; ajustement du pH à 7,5 212~1 ~8 -~ 13 - agitation 30 minutes, V = 395 ml - centrifugation 30 minutes a 13000 rpm, DO260 = 82855 - surnageant déposé sur SEPHACRYL S 200, prééquilibrage et élution par tampon Polymix II
5 - les fractions qui contiennent les ribosomes sont précipi-tées par le PEG 6000 (100 mg/ml) - agitation 30 minutes - centrifugation 15 minutes à 10.000 rpm - dialyse une nuit contre 5 litres de tampon Tris.
Expression des rasult~ts et méthode~ de calcul Une unité A260 (absorption à 260 nm) correspond respec-tiv~ment à 24 pmoles/ml de ribosomes 70S, 69 pmoles/ml de sous unité 30S et 35 pmoles/ml de sous-unité 50S.
On obtient ainsi V = 44 ml, DO260 = 7620 soit une sus-pension contenant 2,4 g de ribosomes 70S qui, si nécessaire, subit une filtration stérilisante et est ensuite répartie en aliquotes, congelés dans l'azote liquide, puis conservés à
-80 C.
EXENPLB 2 : cr~me pour le visage ::
- suspension de ri.bosomes 0,5 g - acétate d'oléyle 2,0 g - alcoyle phosphate de potassium2,0 g 25 - palmitate d'éthyl hexyle 8,0 g - lanoline hydrogénée 5,0 g - triglycérides d'acides gras 4,0 g - stéarate de sorbitan 1,0 q - polymère carboxyvinylique neutralisé 0,4 g 30 - conservateurs 0,4 g - composition aromatique 0,4 g - eau purifiée q.s.p. 100 g ~XÆMPLE 3 : gel pour le visaga 35 - suspension de ribosomes 0,5 g - extrait glycolique Centella Asiatica 5,0 g - propylène glycol 5,0 g - polymère carboxyvinylique neutralise 0,8 g 2~2717~
- conservateurs 0,35 g - composition aro~atique 0,1 g - eau purifiée q.s.p. lOo g 5 EXEMPLE 4 : ~r~me pour le corp8 - suspension de ribosomes 0,2 g - stéarate de glycérol 4,0 g - palmitate de sorbitan 6,0 g - perhydrosqual~ne 5,0 g 10 - diisopropyle-cyclohexane 7,0 g - triglyc~rides d'acides gras9,0 g - glycérine 5,0 g - conservateurs 0,3s g - composition aromatique 1,0 g 15 - eau purifiée q.s.p. 100 g :~.
EXEMPLE S : lotion tonigue pour 1Q visage - suspension de ribosomes 0,05 g ~`
- propylène glycol 5,0 g 20 - conservateurs 0,3 g - composition aromatique 0,1 g - alcool ~thylique 10,0 g - eau purifi~e q.s.p. 100 ml 25 E~EMPLE C : lait solaire ;
- suspension de ribosome~ 0,1 g - filtres solaires 5,0 g - huile de vaseline 10,0 g - cétéaryl octanoate 9,0 g 30 - huile de silicone 2,5 g éther c~tylique P.O.E. 2,0 g - stearate de sorbitan 1,0 g - conservateurs 0,35 g - composition aromatique 0,5 g 35 - eau purifiée q.s.p. 100 ml EX~MPLE 7 : emul~ion multiple on chauffe à 80 C la phase aqueuse suivante~ dite phase 21~717~
aqueuse interne :
- eau déminéralisée 26,52 g - methylparaben 0,1 g - sulfate de magnésium 0,28 g 5 - glycérine 30 B 0,8 g - o-cymen-5-ol 0,04 g On chauffe séparément la phase grasse suivante : .
- glycéryl isostéarate 2 g 10 - huile de ricin hydrogénée polyoxyéthylénée (7 moles) 0,2 g - triglycérides capri~ues (capryli~ues) 8,2 g - propylparaben 0,06 g - ~ :
- huile de silicone volatile 1,6 g :~
On disperse la phase aqueuse dans la phase grasse à 80 C en ;~
agitant vigoureusement 5 minutes. Puis on refroidit lentement jusqu'à 25 C.
On disperse ensuite cette émulsion primaire eau/huile dans la 20 phase aqueuse suivante, dite phase aqueuse externe, en mélan-geant doucement ~ température ambiante :
- eau déminéralisée QS 100 g - lubragel MS (R) 15 g - carbopol 980 (R) 0,03 g 25 - tétrasodium EDTA o,o54 g - méthylparaben 0,216 g - imidazolidinyl urée 0,216 g - hydroxyde de sodium pur 0,125 g - suspension de ribosomes o,5 g EXEMPLE 8 : émulsion à pha~e gémellaires On fait chauffer la phase grasse suivante à 80 C ~. j .
- alcool stéarylique 1,0 g - alcool cétylique 2,0 g 35 - cétéaryl octanoate 4,0 g - polysorbate 60 4,0 g - sorbitan stéarate 4,0 g - caprylic caprique triglycérides3,0 g ~27~7~
- beurre de karité 3,0 g - acétate d'oleyle 2,0 g - huile de silicone 0,5 g - tocophérols 0,05 g On fait chauffer la phase aqueuse suivante à 80 C
- eau déminéralisée QS 100 g :
- polymère carboxy vinylique0,3 g - aonservateur 0,7 g 10 ~ lubragel MS (R) 5 g - hydroxyde de sodium pur 0,3 g On disperse la phase grasse dans la phase aqueuse et on agite vigoureusement pendant 10 minutes. On refroidit ensuite 15 lentement l'émulsion ainsi formée jusqu'à 25 C, on y ajoute :;;
alors sous agitation modérée les ingrédients suivants : ;
- suspension de ribosomes 0,05 g - parfum 0,2 g ~ :~
20 BXEMPLE 9 : emul~ion eau/silicone On chauffe à 60 C la phase grasse suivante :
- eau d~minéralisée 73,12 g - chloruxe de sodium 0,8 g . .
- acide citrique pur 0,01 g 25 - m~thylparaben 0,25 g - propyl~ne glycol 2 g :
- 0-cymen-5-ol 0,1 g On chauffe à 60 C la phase silicone suivante :
30 - stéarate d'isocetyle 3 g - arlacel 83 (R) 0,8 g - huile de ricin hydrogénée 0,3 g - elfacos ST9 (R) 2,0 g - acétate d'oleyle (anti-lipase) 0,15 g 35 - silicone DC 3225 (R) (DOW CORNING) 9,O g - silicone volatile 4,0 g on disperse la phase aqueuse dans la phase silicone sous ~~ 17 ~~ ~1 ~
agitation moyenne pendant 10 minutes. On refroidit ensuite l'émulsion ainsi formée jusqu'à 25'C et on ajoute sous agita-tion ~aible :
- mélange de :
. suspension de ribosomes 1 g -. parfum 0,3 g EXEMPL3 10 : emulisio~ sa~s emulisionnant On chauffe ~ 80 C la phase grasse suivante :
10 - huile de jojoba 4,0 g -- polyisobutène 4,0 g - octyl stéarate 4,0 g - acétate d'oleyle 2,0 g 15 On chauffe à 80'C la phase aqueuse suivante :
- glycérine 30 codex 3,0 g - polymère carboxyvinylique 0,45 g - lubrajel MS (R) 4,0 g - hydroxyde de sodium pur 0,055 g 20 - conservateurs 0,55 g - parfum 0,20 g eau déminéralisée 30,0 g On disperse la phase grasse dans la phase aqueuse sous une 25 tr~s faible agitation et cisaillement élevé pendant 1/2 heure. On refroidit ensuite lentement l'émulsion ainsi formée jusqu'à 45 C, on ajoute alors sous bonne agitatio~ :
- talc 3 g 30 Quand la dispersion du talc est bien terminée, on continue à
refroidir sous agitation lente. Quand la température est de 25 C, on ajoute sous agitation modérée :
- eau deminéralisée 30 g - suspension de ribosomes 0,05 g 35 préalablement mélangés.
Puis on ajoute, sous la meme agitation :
- parfum 0,2 g f~ 2~2~
EXEMPLE 11 :
On prépare une émulsion huile dans eau de la manière suivante :
on chauffe à 80 C les composants de la phase grasse 5 suivante :
- stéarate de glycérol autoémulsionnable 6 g ; ~ ~-(arlacel 165 (R) de la Sté ICI) - alcool cétylique 1 g - stérol de soja éthoxylé 2 g lo (générol 122 E 10 (R) de la Sté Henkel) - mélange d'huile de vaseline et d'alcool ~-de lanoline 3 g (amerchol Llol de la Sté Amerchol (R)) ~-- pétrolatum et alcool de lanoline 1 g 15 (amerchol CAB (R) de la Ste Amerchol) ;~
- huile de carthame 6 g - beurre de karité 3 g - propyl paraben 0,05 g 20 Par ailleurs on prépare la phase aqueuse suivante que l'on porte également à 80 C :
- eau d~minéralisée 60 g - sorbitol à 70 % 3 g - gomme xanthane 0,3 g 25 - méthylparaben o,1 g Quand la gomme xanthane est bien dispersée, on ajoute la phase grasse à la phase aqueuse à 80 C, et on agite vivement pendant 20 minutes. L'émulsion se forme. ~-~
30 Ensuite on réduit l'agitation et on refroidit lentement l'~mulsion jusqu'à 40 C.
On y ajoute alors 2 g d'eau contenant 0,15 g d'imidazolidinyl urée, puis 0,3 g de parfum. A cette température on ajoutera 0,5 g de suspension de ribosomes.
Etude de l'évaluation de l'action "~timulante" et "régénérante" de6 ribosome6 ~elon l'invention ~ur des kérati-noeyteæ d'épiderme humain.
2~27~7,Q
18a La présente étude sera mieux comprise avec référence aux ;
dessins suivants renfermant les Figures 1 et 2 qui repré~
sentent respectivement, l'activité d'une composition de :
l'invention versus la néosynthèse de protéines et tl-n ~ t.~
2 ~ ~ 71 ~ ~3 ,~ 19 Les méthodes in vitro permettent d'évaluer rapidement l'activité de produits de synthèse ou d'origine naturelle :
ceux-ci sont directement mis en contact avec leur cible cosmétique, les cellules du derme ou de l'épiderme.
5 a~ Matériels L'actif cosmétique étudié est constitué par le produit de l'exemple 1 : la suspension de ribosomes. -La leucine ~marquage au 14C de tous les carbones, acti-vité sp~cifique 11,7 GBq/mmole), et la thymidine (marquage au 10 tritium sur le carbone en position 6, activité spécifique 1,07 TBq/mmole) ont été fournis par Amersham.
Tous les réactifs, milieux et additifs de culture ont été fournis par des sociétés commerciales telles que MERCK et GIBCO.
15 MCA = Milieu de culture pour l'attachement des kératinocytes, milieu MEM/199 (75/25 % v/v ; GIBCO) additionné de 50 UI/ml de pénicilline, de 50 ~g/ml de steptomycine, de 10 % de sérum de veau foetal, de 10 ng/ml de to~ine cholérique, de 5 ~g/ml d'insuline bovine, de 0,4 ~g/ml d'hydrocortisone, de 5 ~g/ml 20 de choline et de 8,5 ~g/ml d'inositol. ~ -MCI = Milieu de culture pour l'incubation en présence des composés soit milieu MCA sans EGF ni sérum de veau foetal (SVF).
Milieu utilisé pour le marquage des protéines par la 14C
25 leucine et de l'ADN par la 3H thymidine : milieu MEM sans leucine (BIOPREDIC) additionné de 50 UI/ml de pénicilline, de 50 ~g/ml de streptomycine, de 6,3 10 7 M de leucine radiomar-qu~e (7,4 kBq/ml) et de 3,4 10 8 M de thymidine tritiée (37 kBq/ml).
30 b) Méthode expérimentale L'actif cosmétique a été ~iltré puis rajouté dans le milieu MCI aux concentrations de 0,01 % et de 0,1 % (v/v).
Le prélèvement de peau a été effectué selon les recom-mandations du Comité National d'Ethique sur une femme de 35 73 ans ("post mortem").
Les kératinocytes ont été obtenus par dissociation à la trypsine de l'épiderme.
Les cellules, d'origine mammaire, ont eté utilisées au "~'.. -. ~`S.. . . . . ... .. .: : . . - . ... . . .. .
^ 20 2~2~17~
La présente invention concerne de nouvelles compositions cosmétiques ou dermatologiques pour les soins de la peau, caractérisées en ce qu'elles renferment à titre de principe actif associé à un excipient acceptable pour fins cosmé-tiques ou dermatologiques, des ribosomes extraits de cellules lo végétales, animales ou de micro-organismes.
Ces nouvelles compositions sont destinées notamment à
retarder les signes de vieillissement de la peau.
Au fur et à mesure du développement du vieillissement cutané, des modifications interviennent, surtout au niveau 15 épidermique et dermique.
Au sein de l'épiderme, la production de cellules nou-velles ne compense plus la desquamation et l'épiderme s'amin-cit progressivement.
Les glandes sébacées sont ~onctionnellement moins acti- ~ -20 ves et la peau devient alors sèche.
Au niveau du derme, la formation de collagène jeune, responsable de la tonicité cutanée, se ralentit par diminu-tion de l'activité secrétrice des fibroblastes. Des liaisons croisées intermoléculaires au sein des fibres de collagène se 25 multiplient, entraînant une rigidité structurale, une réduc-tion de la capacité d'absorption d'eau, une diminution des apports nutritionnels et d'oxyg~ne.
Ces transformations néfastes provoquent une perte d'élasticité, une déshydratation, une asphyxie et une séche-30 resse cutanée.
Ces phénom~nes conduisent à l'apparition de rides, notamment au niveau du visage où la peau est particulièrement agressée par des facteurs d'origine externe (intempéries, pollution, radiations lumineuses) et par des facteurs d'ori-35 gine interne (maladies, augmentation de l'âge).
De nombreuses préparations cosmétiques destinées ~
combattre le vieillissement de la peau existent déjà sur le marché.
Ces préparations connues renferment des composés très 2~27~ 7~
variés, tels que des extraits biologiques, par exemple des extraits placentaires, du collagène, des mélanges polyvi-taminés, des acides gras essentiels.
On connait également des compositions cosmétiques 5 renfermant du sérum de veau foetal, des extraits d'organes tels que thymus ou rate, des extraits animaux, décrites par exemple dans la demande de brevet francais n- 84 19446 publiée sous le n 23 74 661.
Cependant jamais encore n'a été décrite l'utilisation en ::
10 cosmétologie des propriétés topiques réelles de ribosomes, ni n'ont été utilisés les ribosomes extraits de cellules végé~
tales, animales ou de micro-organismes, pour lutter contre le ::
vieillissement cutané. :~
Les ribosomes sont des organelles sub-cellulaires compo-15 sés d'ARN et de protéines impliqués dans la synthèse des i- .
protéines.
A titre d'illustrations, on peut noter que les ribosomes de E. coli (gram-) sont constitués des fractions : ~ :
70 S (M : 2,7.106 dalton) 20 50 S (M : 1,8.106 dalton) ~ :
30 S (M : 0,9.106 dalton) A leur tour les fractions 50 S et 30 S ont la composition suivante :
50 S : 34 protéines, 2ARN (23 S, 5S) 25 30 S : 21 protéines, lARN (16 S). :~
Il vient d'être démontré et c'est l'objet de la présente invention que ces ribosomes possèdent un remarquable pouvoir -stimulant et régénérant et qu'ils sont doués d'un effet stimulant sur la croissance cellulaire.
Ces différentes propriétés illustrées plus loin dans la partie expérimentale, peuvent être avantageusement mises à
profit en dermatologie et en cosmétologie.
L'un des avantages qu'apportent les compositions de la présente invention sur les compositions connues de l'art 35 antérieur est, par exemple en rempla~ant le sérum de veau foetal par des ribosomes extraits de cellules végétales, animales ou de micro-organismes, d'éviter les risques d'in-fection virale, tels que par exemple les risques d'infection par des prions qui sont de nouveaux agents infectieux apparus 2~271 7~
depuis le milieu des années 1980 et responsables de l'épidé-mie dite des vaches folles ou encéphalite bovine spongiforme.
D'autre part, l'identité des souches ou, en général, des cellules, à partir desquelles on extrait les ribosomes est - -5 facile à vérifier en permanence, ce qui assure une parfaite reproductibilité de l'extrait employé quant à son origine génétique et à sa composition.
La présente invention concerne notamment des composi-tions cosmétiques ou dermatologiques telles que définies ci-10 dessus, caractérisées en ce que les ribosomes sont extraitsde micro-organismes eucaryotes ou procaryotes, de bactéries Gram~ choisies dans le groupe formé par Klebsiella pneumo- -niae, Hafnia, Escherichia coli, Klebsiella ozoenae, Entero-bacter chloacae, Pseudomonas aeruginosa et Proteus ou de 15 bactéries Gram+ telles que par exemple le Bacillus subtilis, Arthrobacter sp., Lactobacillus ou le Staphylococcus tel que Staphylococcus aureus.
Parmi les ribosomes extraits de bactéries gram~ on retient notamment les ribosomes extraits des bactéries gram~
20 choisies dans le groupe formé par Klebsiella pneumoniae, Hafnia ou Escherichia coli.
La presente invention concerne donc plus particulière-ment les compositions telles que définies ci-dessus, caracté-risées en ce que les ribosomes sont extraits de bactéries 25 Gram~ choisies dans le groupe formé par Klebsiella pneu-moniae, Hafnia, Escherichia coli.
Parmi les ribosomes extraits de Klebsiella pneumoniae on peut citer par exemple les ribosomes extraits de la souche de Klebsiella pneumoniae et déposée à l'Institut Pasteur à Paris 30 sous le n- I-163.
Parmi les ribosomes extraits d'Hafnia, on peut citer par exemple les ribosomes extraits de la souche d'Hafnia et déposée à l'Institut Pasteur à Paris sous le n I-868.
Parmi les ribosomes extraits d'Escherichia coli, on peut 35 citer par exemple les ribosomes extraits de la souche d'Escherichia coli, déposée à l'Institut Pasteur à Paris sous le n- I-870 ou de la souche MRE600 du Microbiological Research Establishment, Sa]isbury, England.
21271 7~
Dans les compositions de l'invention, l'extrait de ribosomes peut ê-tre utilisé sous forme pulvérulente ou sous forme de suspension aqueuse.
L'invention concerne notamment des compositions cosméti~
ques ou dermatologiques telles que définies ci-dessus, carac-térisées en ce qu'elles renferment 5.10-5 % à 1 % en poids d'une suspension de ribosomes extraits de micro-organismes ou de cellules d'organisme supérieur : cellules végétales ou animales.
- : :
L'invention concerne plus particulièrement les composi- ~ -tions telleis que définies ci-dessus, caractérisées en ce qu'elles renferment 0,005 % à 0,05 % en poids d'une suspen-sion de ribosomes extraits de cellules végétales, animales et notammen-t de micro-organismes. ~-~
L'invention concerne tout particulièrement les composi- -tions telles que définies ci-dessus, caractérisées en ce qu'elles renferment o,Ol % en poids d'une suspension de ribo-somes extraits de cellules végétales, animales et notamment de micro-organismes.
Les ribosomes peuvent être préparés selon les méthodes usuelles connues de l'homme du métier. ~ ~ -La présente invention s'est également attachée ~ la préparation des ribosomes extraits de cellules végétales, animales et notamment de micro-organismes.
La présente invention concerne donc également les compo-sitions telles que définies ci-dessus, caractérisées en ce que les ribosomes extraits de micro-organismes sont préparés selon les étapes successives suivantes - cul-ture sur un milieu liquide ou solide de la souche de 30 micro-organismes, - récolte après complet développement des micro-organismes, - lyse des micro-organismes, et traitement de ce lysat par centrifugation, précipitation au sulfate d'ammonium, centrifugation, tamisage moléculaire, 35 précipitation au PEG 6000 (c'est à dire polyéthylène glycol d'un poids moléculaire moyen de 6000), centrifugation et dialyse de la solution obtenue.
Les milieux sur lesquels peuvent être cultivées les micro-organismes sont leis milieux liquide ou solide usuels et : .
2 ~L 2 7 1 r bon marché incluant une source de carbone, une source d'azote d'origine naturelle ou inorganique et des sels minéraux, tels qu'ils sont bien connus par l'homme du métier. La littérature donne de nombreux exemples de tels milieux de culture. On 5 peut citer par exemple le chapitre 1.6 "Culture media" du livre "Biochemical Engineering and Biotechnology Handbook", 2nde édition 1991 (Stockton Press).
Les micro-organismes après récolte sont repris dans un tampon tel que par exemple le tampon polymix I :
10 MgC12 5 mM pH = 7,5 CaC12 0,5 mM
Put~escine 8 mM
Spermidine 1 mM
Tricine 20 mM
15 NH4Cl 5 mM
KCl 95 mM
DTT 1 mM
ou encore dans le tampon :
Tris/Hcl 20 mM pH = 7,6 20 NH~Cl 100 mM
Mg(OAc)2 10 mM
on procade alors à la lyse des micro-organismes par exemple par lyse ~ haute pression ou encore par broyage à
l'alumine.
Puis on centrifuge le lysat obtenu à environ 10.000 à
13.000 rpm et précipite les proteines de preference au sul-fate d'ammonium, à la concentration de 210 mg/ml et ajusté à
pH = 7,5. Apr~s une nouvelle centrifugation, puis un tamisage moléculaire et une élution dans le tampon polymix II :
30 MgC12 5 mM pH = 7,5 Ca~l2 0,5 mM
Putrescine 8 mM
Spermidine 1 mM
Tricine 20 mM
35 NH4Cl 150 mM
KCl 95 mM
DTT 1 mM
la fraction contenant les ribosomes est précipitée de préfé-.
2~7:~7~
_ 6 rence par du PEG 6000 à 100 mg/ml.
Après centrifugation, la solution obtenue est dialysee environ une nuit contre un tampon tel que par exemple Tris/Hcl 20 mM
5 NH4Cl 60 mM - ;~
Mg(OAc)2 10 mM pH = 7,6 on obtient ainsi les ribosomes extraits de micro-organismes attendus.
Un tel exemple de preparation des ribosomes est donne 10 ci-après.
on peut noter que le protocole de purification des ribosomes pourrait être arrêté soit ~ l'issue des centrifuga-tions apr~s lyse des cellules des micro-organismes, soit à
l'issue de la centrifugation après l'étape de précipitation 15 des protéines au sulfate d'ammonium.
Jusqu'ici il était connu et usuel d'utiliser en culture cellulaire ln vitro comme ~acteur de croissance cellulaire -~
des composes en mélange tels que du sérum animal, en concen-tration de l'ordre de 10 %, et plus particulièrement le sérum 20 de veau foetal, ou des substituants synthétiques de celui-ci qui sont commercialisés à un prix élevé et dont la composi-tion est tenue secr~te, ex. Ultroser HY (IBF~, NU-SERUM
(Sochibo), et/ou des facteurs individuels tel l~ facteur de croissance épidermique "EGF" (Epidermal Growth Factor~.
Jamais encore, et c'est également l'objet de la présente invention, n'avaient été utilisés des ribosomes comme facteur de croissance cellulaire in vitro, à des concentrations~ en plus, très faibles qui ont eté définies ci-dessus.
La présente invention concerne donc particulièrement 30 l'utilisation en alternative économiquement très avantageuse aux suppléments ci-dessus cités, de ribosomes extraits de micro-organismes comme facteur de croissance de cultures cellulaires in vitro.
De tels ribosomes peuvent être préparés ainsi qu'il est 35 indiqué ci-dessus.
Dans le cadre de la présente invention, on a étudié le ~
pouvoir stimulant des ribosomes selon l'invention par compa- ~ ;
raison avec celui du sérum de veau foetal et du facteur de , ,;~
21 2 71 l ~3 croissance épidermique (EGF~ constituant ici le milieu témoin positi~, dans des cultures de kératinocytes dQ l'épiderme humain.
Un exemple d'une telle étude, qui montre la supériorité
5 du pouvoir stimulant sur la croissance cellulaire des ribo-somes sur les composés connus et couramment utilisés qui sont le sérum de veau foetal et le facteur de croissance épidermi-que EGF est décrit ci-après.
La présente invention concerne donc tout particulière-10 ment l'utilisation de ribosomes extraits de micro-organismes comme ~acteur de croissance de culture de kératinocytes in vitro.
Par ailleurs, en étudiant l'activité des ribosomes de la présente demande, on a constaté que ceux-ci présentaient une 15 remarquable activité inductrice "like" de l'EGF (Epidermal Growth Factor~ facteur de croissance épidermique, sans pré-senter la toxicité de ce dernier. De ce fait les ribosomes peuvent ~tre utilisés pour faciliter la régénération de la peau et de l'épiderme.
Ainsi les propriétés régénératrices cutanées par stimu-lation de la croissance cellulaire des compositions selon l'invention leur confèrent une efficacité dans la lutte contre le vieillissement de la peau.
La dose usuelle, variable selon le produit utilisé, le 25 sujet traité et l'affection en cause, peut etre, par exemple de 50 mcg à 5 mg par jour en applications locales chez l'homme.
L'invention a particulièrement pour objet les composi-tions cosmétiques ou dermatologiques telles que définies ci-30 dessus, caractérisées en ca qu'elles se présentent sous formede préparations liquides ou solides ~ usage topique et notamment les compositions cosmétiques ou dermatologiques -telles que définies ci-dessus caracterisees en ce qu'elles se presentent préférentiellement sous une des formes suivantes :
35 - des gels aqueux, - des gels gras, - des émulsions simples, eau dans huile, - des émulsions simples, huile dans eau, ~ :. ..
2~717~
- des émulsions multiples, par exemple : -- eau dans huile dans eau ou huile dans eau dans huile, - une émulsion triple eau dans huile dans eau, : ~ :
- une émulsion triple huile dans eau dans huile, 5 - une émulsion huile dans eau contenant des cristaux liqui-des, - des émulsions complexes contenant des cristaux liquides formant des bicouches lipidiques entourant des phases ~
grasses, :
10 - des pseudo-émulsions (dispersion d'une phase huileuse ou ~:
d'une émulsion eau dans huile dans une phase aqueuse geli-fiee, sans tensio-actifs traditionnels), - des micro-émulsions huile dans eau ou eau dans huile, - des émulsions contenant deux phases huiles dispersées, 15 différentes et insolubles entre elles, - une pseudo-émulsion ou dispersion d'une phase grasse dis- :~
persée dans une phase aqueuse et stabilisée avec du Labragel (R), du Pemulen (R), de l'Hypan (R~, de la gomme xanthane, de la CMC, de l'hydroxyéthyl cellulose, de l'Amigel (R~, de la 20 Polyvinyl-pyrrolidone, de l'Amercell HM 1500 (R), ou un mélange de deux ou plusieurs de ces gélifiants.
Les compositions selon l'invent:ion peuvent le cas éch8ant contenir des filtres, des écrans aux radiations solaires, des extraits vitaminés, des parfums, des conserva-25 teurs, des anti-oxydants, des colorants.
Les compositions dermatologiques peuvent être, par exemple, solides ou liquides et se présenter sous les formes dermatologiques couramment utilisées, comme par exemple, les crèmes, les gels, les pommades, les lotions, les laits pour 30 la peau, les gouttes, les collyres, les aérosols, les sham-poings ou sous forme de liposomes ; elles sont préparées :
selon les methodes usuelles. Le ou les principes actifs peuvent y être incorporés à des excipients habituPllement ~:
employés dans ces compositions phaxmaceutiques, tels que le ~- b 35 talc, la gomme arabique, le lactose, l'amidon, le stéarate de magnésium, le beurre de cacao, les véhicules aqueux ou non, les corps gras d'origine animale ou végétale, les dérivés paraffiniques, les glycols, les divers agents mouillants, '~ ' ',~ 9 2~2717~ , dispersants ou émulsi~iants, les conservateurs.
Ces compositions selon l'invention peuvent renfermer le cas échéant en plus des ribosomes extraits de microorganis-mes, d'autres composés actifs ayant des propriétés cutanées 5 particulières.
Ainsi, ces compositions selon l'invention peuvent contenir par exemple l'acétate d'oléyle. Ce produit a des propriétés anti-lipasique et prévient directement la formation de comédons et de points noir.
Les compositions ainsi obtenues renferment deux consti-tuants qui par leur action combinée constituent un produit bien adapté aux peaux à tendance acnéique.
Ces compositions selon l'invention peuvent aussi renfermer le cas échéant un composé favorisant la cicatrisa-15 tion des lésions de l'acné, tel que par exemple, un extrait de Centella Asiatica et plus particulièrement un extrait glycolique ou un extrait sec titré de Centella Asiatica.
D'autres substances telles que l'huile d'onagre, les acides amin~s peuvent aussi y ~tre incorporées.
L'invention a donc plus particulièrement pour objet des compositions dermatologiques, caractarisées en ce qu'elles renferment des ribosomes extraits de microorganismes et le ca~ ~ch~ant un ou plusieurs des produits choisis parmi l'acé-tate d'oléyle, l'extrait sec titré de Centella Asiatica, 25 l'huile d'onagre, les acides aminés.
Les compositions cosmétiques se:Lon l'invention peuvent se présenter sous toutes les formes utilisées en cosmétolo- -gie : crème ou gel en pots ou en tubes, lait ou lotion en flacons de verre ou de matière plastique et éventuellement en 30 flacon-doseur, ampoule, aérosol.
L'invention concerne donc des compositions cosmétiques, caractérisées en ce qu'elles se présentent sous forme de crème, gel, lait, lotion, émulsion, savon liquide, pain ; ~
dermatologi~ue, ou shampoing. ; ~`
Pour chaque forme, on a recours à dPs excipients appro-priés. Ces excipients doivent avoir toutes les qualités habituellement demandées. Ils doivent ~tre doués d'une grande affinité pour la peau, être parfaitement bien toléres, -- lo 2~27~ 7~
stables, présenter une consistance adéquate, permettant une utilisation facile et agréable. ~:
A titre d'exemples d'excipients pouvant être utilisés, on peut citer notamment les hydrocarbures, les huiles de : ::
5 silicones, les triglycérides d'acide gras, les triglycérides de synthèse, les cires végétales, animales ou minérales, les acides et les alcools gras, les esters d'acides gras ou d'alcool gras, les amides d'acide gras, la lanoline, les tensio-a~tifs non ioniques, les tensio-actifs anioniques, les 10 polysaccharides gélifiants naturels ou synthétiques, la chitine désacétylée, les dérivés de cellulose, les dérivés de ~ :
guar, la polyols, les polyalkylèneglycols, les charges miné-rales, les pigments organiques ou les laques de colorants organiques ainsi que d'autres excipients connus et couramment 15 utilisés tels que, par exemple, les polymères de type carbo-xyvinylique, les polyéthylèneglycols, le propyl~ne glycol, des dérives stéariques tel que, par exemple, le stearate de glycerol, des alcools tels que, par exemple, les alcools stéaryliques, les alcools cétostéaryliques, l'alcool cétyli-20 que, l'~ther cetylique polyoxyethyléné, des huiles végétalestelles que l'huile d'avocat, l'huile de tournesol, des huiles minérales telles que l'huile de vaseline, la glycerine, des dérivas de la lanoline, du talc, des mouillants, des épais-sissants, des stabilisants, des émulsionnants, des conserva-25 teurs, des par~ums, des colorants.
Enfin des filtres solaires et des ré~lecteurs solairespeuvent être ajoutés à ces compositions cosmétiques pour leur conferer un pouvoir protecteur vis à vis des rayonnements ~.
solaires. Lorsque ces additifs sont insolubles dans les ~ :
30 phases huiles et aqueuses, ils constituent donc une phase supplémentaire. Il seront choisis par exemple parmi les ~ .
produits suivants - les perfluoroéthers comme les FoMsLIN (R) de la Societe - ~.
Montecatini, 35 - les pigments insolubles comme ~
. les oxydes de titane, ~.-. oxyde de titane rutile, . oxyde de titane anatase, ~ ~7~ 7~
--` 11 - ' . oxyde de titane pyrogéné comme le P 25 (R) de Degussa, . oxyde de titane micronisé dans le SUN VEIL (R) d'Ikeda, . oxyde de titane traité en surface par des silicones ou par des acides aminés, ou par de la lécithine, ou par des stéarates métalliques, . oxyde de fer, . oxyde de fer traité en surface par des silicones, ou par des acides aminés, ou par de la lécithine, ou par des stéarates métalliques, . oxyde de zinc, . oxyde ~inc microni~é comme l'UFZ0 (R) de Cosmo Trends Corporation, . mica recouvert d'oxyde de titane.
Les différentes formes cosmetiques mentionnées ci-dessus peuvent ~tre obtenues selon les méthodes usuelles utilisées dans ce domaine.
La présente invention concerne tout particuli~rement les compositions cosmétiques ou dermatologiques telles que défi-20 nies ci-de~sus, caractérisees en ce que leurs excipients sont ; -adaptés à l'application sur le visage, le cou et les mains. ;~
La pr~sente invention concerne égalem~nt l'application ~ -titre de produit cosmétique de compositions caractérisées en ce qu'elles renferment des ribosomes extraits de micro-25 organismes. ~ ~;
La présente invention concerne notamment une méthode de traitement cosmétique de régénération et de lutte contre le ;~
vieillissement de la peau caractérisée en ce que l'on appli-que sur la peau une quantité suffisante d'une composition 30 cosmétique telle que définie ci-dessus.
Les exemples donnés ci-dessous illustrent l'invention sans toutefois la limiter.
EXEMP~ Pr paratio~ de riho30mes La technique utilisée dérive de celle décrite dans l'article référencé comme suit : JELENC P, Rapid purification of highly active ribosomes from Escherichia coli. Anal Biochem 1980 ; 105 : 369-74.
12 2~7~
La souche utilisée est E. coli MRE600 de Microbiological Research Establishment, Salisbury, England, congelée et conservee ~ -20 C.
Les 3 tampons utilisés sont :
5 Tampon pol~mix I :
MgCl2 5 mM pH = 7,5 CaC12 0,5 mM
Putrescine 8 mM
Spermidine 1 mM
10 Tricine 20 mM
NH4Cl 5 mM
KCl 95 mM
DTT 1 mM
15 Tam~on polvmix II :
MgCl2 5 mM pH = 7,5 CaCl2 0,5 mM
Putrescine 8 mM
Spermidine 1 mM
20 Tricine 20 mM .
NH4Cl 150 ~M
KCl 95 mM
DTT 1 mM
25 Tampon TRIS :
TRIS HCl 20 mM pH = 7,6 NH4Cl 60 mM
Ng(OAc)2 10 mM
Toutes les manipulations sont effectuées à 4 C.
30 - 127 g (poids humide) de bactéries E. coli sont décongelées et reprises dans 254 ml de tampon polymix I
- lyse des bactéries par trois passages à haute pression :
V = 490 ml :~
- centrifugation : 30 minutes à 13000 rpm : V = 400 ml 35 - centrifugation : 30 minutes à 13000 rpm : V = 370 ml, -~ :
DO260 = 112480 ~:
- précipitation des protéines par sulfate d'ammonium (210 mg/ml) ; ajustement du pH à 7,5 212~1 ~8 -~ 13 - agitation 30 minutes, V = 395 ml - centrifugation 30 minutes a 13000 rpm, DO260 = 82855 - surnageant déposé sur SEPHACRYL S 200, prééquilibrage et élution par tampon Polymix II
5 - les fractions qui contiennent les ribosomes sont précipi-tées par le PEG 6000 (100 mg/ml) - agitation 30 minutes - centrifugation 15 minutes à 10.000 rpm - dialyse une nuit contre 5 litres de tampon Tris.
Expression des rasult~ts et méthode~ de calcul Une unité A260 (absorption à 260 nm) correspond respec-tiv~ment à 24 pmoles/ml de ribosomes 70S, 69 pmoles/ml de sous unité 30S et 35 pmoles/ml de sous-unité 50S.
On obtient ainsi V = 44 ml, DO260 = 7620 soit une sus-pension contenant 2,4 g de ribosomes 70S qui, si nécessaire, subit une filtration stérilisante et est ensuite répartie en aliquotes, congelés dans l'azote liquide, puis conservés à
-80 C.
EXENPLB 2 : cr~me pour le visage ::
- suspension de ri.bosomes 0,5 g - acétate d'oléyle 2,0 g - alcoyle phosphate de potassium2,0 g 25 - palmitate d'éthyl hexyle 8,0 g - lanoline hydrogénée 5,0 g - triglycérides d'acides gras 4,0 g - stéarate de sorbitan 1,0 q - polymère carboxyvinylique neutralisé 0,4 g 30 - conservateurs 0,4 g - composition aromatique 0,4 g - eau purifiée q.s.p. 100 g ~XÆMPLE 3 : gel pour le visaga 35 - suspension de ribosomes 0,5 g - extrait glycolique Centella Asiatica 5,0 g - propylène glycol 5,0 g - polymère carboxyvinylique neutralise 0,8 g 2~2717~
- conservateurs 0,35 g - composition aro~atique 0,1 g - eau purifiée q.s.p. lOo g 5 EXEMPLE 4 : ~r~me pour le corp8 - suspension de ribosomes 0,2 g - stéarate de glycérol 4,0 g - palmitate de sorbitan 6,0 g - perhydrosqual~ne 5,0 g 10 - diisopropyle-cyclohexane 7,0 g - triglyc~rides d'acides gras9,0 g - glycérine 5,0 g - conservateurs 0,3s g - composition aromatique 1,0 g 15 - eau purifiée q.s.p. 100 g :~.
EXEMPLE S : lotion tonigue pour 1Q visage - suspension de ribosomes 0,05 g ~`
- propylène glycol 5,0 g 20 - conservateurs 0,3 g - composition aromatique 0,1 g - alcool ~thylique 10,0 g - eau purifi~e q.s.p. 100 ml 25 E~EMPLE C : lait solaire ;
- suspension de ribosome~ 0,1 g - filtres solaires 5,0 g - huile de vaseline 10,0 g - cétéaryl octanoate 9,0 g 30 - huile de silicone 2,5 g éther c~tylique P.O.E. 2,0 g - stearate de sorbitan 1,0 g - conservateurs 0,35 g - composition aromatique 0,5 g 35 - eau purifiée q.s.p. 100 ml EX~MPLE 7 : emul~ion multiple on chauffe à 80 C la phase aqueuse suivante~ dite phase 21~717~
aqueuse interne :
- eau déminéralisée 26,52 g - methylparaben 0,1 g - sulfate de magnésium 0,28 g 5 - glycérine 30 B 0,8 g - o-cymen-5-ol 0,04 g On chauffe séparément la phase grasse suivante : .
- glycéryl isostéarate 2 g 10 - huile de ricin hydrogénée polyoxyéthylénée (7 moles) 0,2 g - triglycérides capri~ues (capryli~ues) 8,2 g - propylparaben 0,06 g - ~ :
- huile de silicone volatile 1,6 g :~
On disperse la phase aqueuse dans la phase grasse à 80 C en ;~
agitant vigoureusement 5 minutes. Puis on refroidit lentement jusqu'à 25 C.
On disperse ensuite cette émulsion primaire eau/huile dans la 20 phase aqueuse suivante, dite phase aqueuse externe, en mélan-geant doucement ~ température ambiante :
- eau déminéralisée QS 100 g - lubragel MS (R) 15 g - carbopol 980 (R) 0,03 g 25 - tétrasodium EDTA o,o54 g - méthylparaben 0,216 g - imidazolidinyl urée 0,216 g - hydroxyde de sodium pur 0,125 g - suspension de ribosomes o,5 g EXEMPLE 8 : émulsion à pha~e gémellaires On fait chauffer la phase grasse suivante à 80 C ~. j .
- alcool stéarylique 1,0 g - alcool cétylique 2,0 g 35 - cétéaryl octanoate 4,0 g - polysorbate 60 4,0 g - sorbitan stéarate 4,0 g - caprylic caprique triglycérides3,0 g ~27~7~
- beurre de karité 3,0 g - acétate d'oleyle 2,0 g - huile de silicone 0,5 g - tocophérols 0,05 g On fait chauffer la phase aqueuse suivante à 80 C
- eau déminéralisée QS 100 g :
- polymère carboxy vinylique0,3 g - aonservateur 0,7 g 10 ~ lubragel MS (R) 5 g - hydroxyde de sodium pur 0,3 g On disperse la phase grasse dans la phase aqueuse et on agite vigoureusement pendant 10 minutes. On refroidit ensuite 15 lentement l'émulsion ainsi formée jusqu'à 25 C, on y ajoute :;;
alors sous agitation modérée les ingrédients suivants : ;
- suspension de ribosomes 0,05 g - parfum 0,2 g ~ :~
20 BXEMPLE 9 : emul~ion eau/silicone On chauffe à 60 C la phase grasse suivante :
- eau d~minéralisée 73,12 g - chloruxe de sodium 0,8 g . .
- acide citrique pur 0,01 g 25 - m~thylparaben 0,25 g - propyl~ne glycol 2 g :
- 0-cymen-5-ol 0,1 g On chauffe à 60 C la phase silicone suivante :
30 - stéarate d'isocetyle 3 g - arlacel 83 (R) 0,8 g - huile de ricin hydrogénée 0,3 g - elfacos ST9 (R) 2,0 g - acétate d'oleyle (anti-lipase) 0,15 g 35 - silicone DC 3225 (R) (DOW CORNING) 9,O g - silicone volatile 4,0 g on disperse la phase aqueuse dans la phase silicone sous ~~ 17 ~~ ~1 ~
agitation moyenne pendant 10 minutes. On refroidit ensuite l'émulsion ainsi formée jusqu'à 25'C et on ajoute sous agita-tion ~aible :
- mélange de :
. suspension de ribosomes 1 g -. parfum 0,3 g EXEMPL3 10 : emulisio~ sa~s emulisionnant On chauffe ~ 80 C la phase grasse suivante :
10 - huile de jojoba 4,0 g -- polyisobutène 4,0 g - octyl stéarate 4,0 g - acétate d'oleyle 2,0 g 15 On chauffe à 80'C la phase aqueuse suivante :
- glycérine 30 codex 3,0 g - polymère carboxyvinylique 0,45 g - lubrajel MS (R) 4,0 g - hydroxyde de sodium pur 0,055 g 20 - conservateurs 0,55 g - parfum 0,20 g eau déminéralisée 30,0 g On disperse la phase grasse dans la phase aqueuse sous une 25 tr~s faible agitation et cisaillement élevé pendant 1/2 heure. On refroidit ensuite lentement l'émulsion ainsi formée jusqu'à 45 C, on ajoute alors sous bonne agitatio~ :
- talc 3 g 30 Quand la dispersion du talc est bien terminée, on continue à
refroidir sous agitation lente. Quand la température est de 25 C, on ajoute sous agitation modérée :
- eau deminéralisée 30 g - suspension de ribosomes 0,05 g 35 préalablement mélangés.
Puis on ajoute, sous la meme agitation :
- parfum 0,2 g f~ 2~2~
EXEMPLE 11 :
On prépare une émulsion huile dans eau de la manière suivante :
on chauffe à 80 C les composants de la phase grasse 5 suivante :
- stéarate de glycérol autoémulsionnable 6 g ; ~ ~-(arlacel 165 (R) de la Sté ICI) - alcool cétylique 1 g - stérol de soja éthoxylé 2 g lo (générol 122 E 10 (R) de la Sté Henkel) - mélange d'huile de vaseline et d'alcool ~-de lanoline 3 g (amerchol Llol de la Sté Amerchol (R)) ~-- pétrolatum et alcool de lanoline 1 g 15 (amerchol CAB (R) de la Ste Amerchol) ;~
- huile de carthame 6 g - beurre de karité 3 g - propyl paraben 0,05 g 20 Par ailleurs on prépare la phase aqueuse suivante que l'on porte également à 80 C :
- eau d~minéralisée 60 g - sorbitol à 70 % 3 g - gomme xanthane 0,3 g 25 - méthylparaben o,1 g Quand la gomme xanthane est bien dispersée, on ajoute la phase grasse à la phase aqueuse à 80 C, et on agite vivement pendant 20 minutes. L'émulsion se forme. ~-~
30 Ensuite on réduit l'agitation et on refroidit lentement l'~mulsion jusqu'à 40 C.
On y ajoute alors 2 g d'eau contenant 0,15 g d'imidazolidinyl urée, puis 0,3 g de parfum. A cette température on ajoutera 0,5 g de suspension de ribosomes.
Etude de l'évaluation de l'action "~timulante" et "régénérante" de6 ribosome6 ~elon l'invention ~ur des kérati-noeyteæ d'épiderme humain.
2~27~7,Q
18a La présente étude sera mieux comprise avec référence aux ;
dessins suivants renfermant les Figures 1 et 2 qui repré~
sentent respectivement, l'activité d'une composition de :
l'invention versus la néosynthèse de protéines et tl-n ~ t.~
2 ~ ~ 71 ~ ~3 ,~ 19 Les méthodes in vitro permettent d'évaluer rapidement l'activité de produits de synthèse ou d'origine naturelle :
ceux-ci sont directement mis en contact avec leur cible cosmétique, les cellules du derme ou de l'épiderme.
5 a~ Matériels L'actif cosmétique étudié est constitué par le produit de l'exemple 1 : la suspension de ribosomes. -La leucine ~marquage au 14C de tous les carbones, acti-vité sp~cifique 11,7 GBq/mmole), et la thymidine (marquage au 10 tritium sur le carbone en position 6, activité spécifique 1,07 TBq/mmole) ont été fournis par Amersham.
Tous les réactifs, milieux et additifs de culture ont été fournis par des sociétés commerciales telles que MERCK et GIBCO.
15 MCA = Milieu de culture pour l'attachement des kératinocytes, milieu MEM/199 (75/25 % v/v ; GIBCO) additionné de 50 UI/ml de pénicilline, de 50 ~g/ml de steptomycine, de 10 % de sérum de veau foetal, de 10 ng/ml de to~ine cholérique, de 5 ~g/ml d'insuline bovine, de 0,4 ~g/ml d'hydrocortisone, de 5 ~g/ml 20 de choline et de 8,5 ~g/ml d'inositol. ~ -MCI = Milieu de culture pour l'incubation en présence des composés soit milieu MCA sans EGF ni sérum de veau foetal (SVF).
Milieu utilisé pour le marquage des protéines par la 14C
25 leucine et de l'ADN par la 3H thymidine : milieu MEM sans leucine (BIOPREDIC) additionné de 50 UI/ml de pénicilline, de 50 ~g/ml de streptomycine, de 6,3 10 7 M de leucine radiomar-qu~e (7,4 kBq/ml) et de 3,4 10 8 M de thymidine tritiée (37 kBq/ml).
30 b) Méthode expérimentale L'actif cosmétique a été ~iltré puis rajouté dans le milieu MCI aux concentrations de 0,01 % et de 0,1 % (v/v).
Le prélèvement de peau a été effectué selon les recom-mandations du Comité National d'Ethique sur une femme de 35 73 ans ("post mortem").
Les kératinocytes ont été obtenus par dissociation à la trypsine de l'épiderme.
Les cellules, d'origine mammaire, ont eté utilisées au "~'.. -. ~`S.. . . . . ... .. .: : . . - . ... . . .. .
^ 20 2~2~17~
3~me passage. Elles ont eté ensemencées dans des plaques de culture ~ 96 puits, à raison de 7 104 cellules par puits dans 0,1 ml de milieu d'attachement (MCA). Elles ont été cultivées pendant 1 jour et utilisées avant confluence.
L'actif cosmétique a été mis en présence des cellules pendant 20 heures. Chaque condition expérimentale a ete réalisée en triplicate. Des cultures témoins ont été effec-tuées en parallèle, en l'absence du produit à l'essai, soit dans le milieu MCI (culture témoin), soit dans le milieu MCA
10 (culture temoin positif).
Pour l'incorporation de leucine et de thymidine radio-marquées, les kératinocytes ont été incubés avec la leucine radiomarquée au 14C et la thymidine tritiée pendant 4 heures.
Les tapis cellulaires ont eté lavés afin d'éliminer les 15 pracurseurs non incorporés puis comptés en scintillation liquide. Les valeurs ont été exprimées en dpm/puits de culture~
c) Xésultats :
Les essais ont été réalisés ~ deux concentrations de 20 l'acti~, 0,01 à 0,1 % (v/v), dans des conditions convention-nelles, c'est-~-dire dans des cultures effectuées sur un support plastique plan.
Lss effets du composé ont été évalués par la mesure de deux paramatres fonctionnels, la néosynthèse des protéines et 25 la néosynthèse d'ADN, après 20 heures d'incubation.
Le milieu d'incubation était dépourvu de sérum de veau foetal (SVF) et de facteur de croissance épidermique (EGF) pour faciliter la mise en évidence d'une stimulation cellu-laire.
L'effet de l'addition de SVF et d'EGF dans le milieu de culture (témoin positif) a été étudié en parallèle.
Néosynth~se des protéines L'acti~ cosmétique augmente significativement ce para-mètre aux deux concentrations étudiées, 0,01 et 0,1 % (v/v).
35 L'effet maximal, + 274 % par rapport aux cultures témoins, est obtenu ~ la plus faible concentration ; il était compa-rable à celui constaté avec le témoin positif (tableau 1, figure 1 ;
21271~ ~
~~ 21 Incorporation de la thymidine dans l'ADN
L'actif cosmétique augmente sign.ificativement ce para~
mètre aux deux concentrations étudiées, 0,01 et 0,1 % (v/v).
L'effet maximal, ~82 % par rapport aux cultures témoins, 5 était obtenu à la plus faible concentration ; il etait simi-laire à celui observé pour le témoin positif (tableau 1, figure 2).
Ces résultats montrent donc que dans les conditions expérimentales retenues, l'actif cosmétique a exercé un effet 10 stimulant significatif vis-~-vis des kératinocytes humains, cette action cytostimulante étant maximale à la plus faible concentration essayée, 0,01 % (v/v).
2 1 ~
TABLEAU 1 :
Incorporation de (14C)-leucine dans les protéines et de (3H)-thymidine dans l'ADN de kératinocytes en culture incubés pendant 20 heures en présence de l'actif cosmétique Actif cosmetique Témoin ParamatreConcentration ~%, v/v) positif O 0,01 0,1 Néosynth~se des 1125 4726 3804 4167 protéines 1107 4391 2743 3721 1396 ~450 3111 3526 120g 4522~ ~2~9~ ~805 ~/~ +/~ ~/~
(100) (374) (266) (315) , ",.~, Néosynthèse 1254 2689 1993 2253 d'ADN 1243 2043 1846 2274 1334 2431~ 1903* 2352~ ' +/~' ~ /_ +/~
148 3~2 79 153 _ (100) (182) (143) (176) ~-~
Les résultats sont exprimés en dpm/puits de culture.
15 En caractères gras : moyenne et écart-type.
Entre ( ) : pourcentage par rapport aux cultures témoins.
* Moyenne des groupes différents du groupe témoin (p < 0,05).
`'' ~, ~
L'actif cosmétique a été mis en présence des cellules pendant 20 heures. Chaque condition expérimentale a ete réalisée en triplicate. Des cultures témoins ont été effec-tuées en parallèle, en l'absence du produit à l'essai, soit dans le milieu MCI (culture témoin), soit dans le milieu MCA
10 (culture temoin positif).
Pour l'incorporation de leucine et de thymidine radio-marquées, les kératinocytes ont été incubés avec la leucine radiomarquée au 14C et la thymidine tritiée pendant 4 heures.
Les tapis cellulaires ont eté lavés afin d'éliminer les 15 pracurseurs non incorporés puis comptés en scintillation liquide. Les valeurs ont été exprimées en dpm/puits de culture~
c) Xésultats :
Les essais ont été réalisés ~ deux concentrations de 20 l'acti~, 0,01 à 0,1 % (v/v), dans des conditions convention-nelles, c'est-~-dire dans des cultures effectuées sur un support plastique plan.
Lss effets du composé ont été évalués par la mesure de deux paramatres fonctionnels, la néosynthèse des protéines et 25 la néosynthèse d'ADN, après 20 heures d'incubation.
Le milieu d'incubation était dépourvu de sérum de veau foetal (SVF) et de facteur de croissance épidermique (EGF) pour faciliter la mise en évidence d'une stimulation cellu-laire.
L'effet de l'addition de SVF et d'EGF dans le milieu de culture (témoin positif) a été étudié en parallèle.
Néosynth~se des protéines L'acti~ cosmétique augmente significativement ce para-mètre aux deux concentrations étudiées, 0,01 et 0,1 % (v/v).
35 L'effet maximal, + 274 % par rapport aux cultures témoins, est obtenu ~ la plus faible concentration ; il était compa-rable à celui constaté avec le témoin positif (tableau 1, figure 1 ;
21271~ ~
~~ 21 Incorporation de la thymidine dans l'ADN
L'actif cosmétique augmente sign.ificativement ce para~
mètre aux deux concentrations étudiées, 0,01 et 0,1 % (v/v).
L'effet maximal, ~82 % par rapport aux cultures témoins, 5 était obtenu à la plus faible concentration ; il etait simi-laire à celui observé pour le témoin positif (tableau 1, figure 2).
Ces résultats montrent donc que dans les conditions expérimentales retenues, l'actif cosmétique a exercé un effet 10 stimulant significatif vis-~-vis des kératinocytes humains, cette action cytostimulante étant maximale à la plus faible concentration essayée, 0,01 % (v/v).
2 1 ~
TABLEAU 1 :
Incorporation de (14C)-leucine dans les protéines et de (3H)-thymidine dans l'ADN de kératinocytes en culture incubés pendant 20 heures en présence de l'actif cosmétique Actif cosmetique Témoin ParamatreConcentration ~%, v/v) positif O 0,01 0,1 Néosynth~se des 1125 4726 3804 4167 protéines 1107 4391 2743 3721 1396 ~450 3111 3526 120g 4522~ ~2~9~ ~805 ~/~ +/~ ~/~
(100) (374) (266) (315) , ",.~, Néosynthèse 1254 2689 1993 2253 d'ADN 1243 2043 1846 2274 1334 2431~ 1903* 2352~ ' +/~' ~ /_ +/~
148 3~2 79 153 _ (100) (182) (143) (176) ~-~
Les résultats sont exprimés en dpm/puits de culture.
15 En caractères gras : moyenne et écart-type.
Entre ( ) : pourcentage par rapport aux cultures témoins.
* Moyenne des groupes différents du groupe témoin (p < 0,05).
`'' ~, ~
Claims (26)
1. Composition cosmétique ou dermatologique pour les soins de la peau, caractérisée en ce qu'elle renferme à titre de principe actif associé à un excipient acceptable pour fins cosmétiques ou dermatologiques, des ribosomes extraits de cellules végétales, animales ou de micro-organismes.
2. Composition telle que définie à la revendication 1, caractérisée en ce que les ribosomes sont extraits de microorganismes eucaryotes ou procaryotes, de bactéries Gram-choisies dans le groupe formé par Klebsiella pneumoniae, Hafnia, Escherichia coli, Klebsiella ozoenae, Enterobacter chloacae, Pseudomonas aeruginosa et Proteus ou de bactéries Gram+.
3. Composition telle que définie à la revendication 1, caractérisée en ce que les ribosomes sont extraits de microorganismes eucaryotes ou procaryotes, de bactéries Gram-choisies dans le groupe formé par Klebsiella pneumoniae, Hafnia, Escherichia coli, Klebsiella ozoenae, Enterobacter chloacae, Pseudomonas aeruginosa et Proteus ou de bactéries Gram+ choisies dans le groupe formé par le Bacillus subtilis, Arthrobacter sp., Lactobacillus et le Staphylococcus.
4. Composition telle que définie à la revendication 3, caractérisée en ce que le Staphylococcus est le Staphylococcus aureus.
5. Composition telle que définie à la revendication 1, caractérisée en ce que les ribosomes sont extraits de bacté-ries Gram- choisies dans le groupe formé par Klebsiella pneumoniae, Hafnia et Escherichia coli.
6. Composition telle que définie à la revendication 1, caractérisée en ce que les ribosomes sont extraits de la souche Klebsiella pneumoniae déposée à l'Institut Pasteur à
Paris sous le numéro I-163.
Paris sous le numéro I-163.
7. Composition telle que définie à la revendication 1, caractérisée en ce que les ribosomes sont extraits de la souche d'Hafnia déposée à l'Institut Pasteur à Paris sous le numéro I-868.
8. Composition telle que définie à la revendication 1, caractérisée en ce que les ribosomes sont extraits de la souche d'Escherichia coli, déposée à l'Institut Pasteur à
Paris sous le numéro I-870 ou de la souche MRE600 du Microbiological Research Establishment, Salisbury, England.
Paris sous le numéro I-870 ou de la souche MRE600 du Microbiological Research Establishment, Salisbury, England.
9. Composition telle que définie à la revendication 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8, caractérisée en ce qu'elle renferme de 5.10-5 % à 1 % en poids d'une suspension de ribosomes extraits de micro-organismes ou cellules d'organisme supérieur.
10. Composition telle que définie à la revendication 9, caractérisée en ce qu'elle renferme de 0,005 % à 0,05 % en poids d'une suspension de ribosomes extraits de micro-organismes.
11. Composition telle que définie à la revendication 10, caractérisée en ce qu'elle renferme 0,01 % en poids d'une suspension de ribosomes extraits de micro-organismes.
12. Composition telle que définie à la revendication 9, caractérisée en ce que les ribosomes extraits de micro-organismes sont préparés selon les étapes successives suivantes :
- culture sur un milieu liquide ou solide de la souche de micro-organismes, - récolte après complet développement des micro-organismes, - lyse des micro-organismes, et traitement de ce lysat par centrifugation, précipitation au sulfate d' ammonium, centrifugation, tamisage moléculaire, précipitation au polyéthyleneglycol d'un poids moléculaire moyen de 6000, centrifugation et dialyse de la solution obtenue.
- culture sur un milieu liquide ou solide de la souche de micro-organismes, - récolte après complet développement des micro-organismes, - lyse des micro-organismes, et traitement de ce lysat par centrifugation, précipitation au sulfate d' ammonium, centrifugation, tamisage moléculaire, précipitation au polyéthyleneglycol d'un poids moléculaire moyen de 6000, centrifugation et dialyse de la solution obtenue.
13. Composition telle que définie à la revendication 10, caractérisée en ce que les ribosomes extraits de micro-organismes sont prépares selon les étapes successives suivantes :
- culture sur un milieu liquide ou solide de la souche de micro-organismes, - récolte après complet développement des micro-organismes, - lyse des micro-organismes, et traitement de ce lysat par centrifugation, précipitation au sulfate d'ammonium, centrifugation, tamisage moléculaire, précipitation au polyéthyleneglycol d'un poids moléculaire moyen de 6000, centrifugation et dialyse de la solution obtenue.
- culture sur un milieu liquide ou solide de la souche de micro-organismes, - récolte après complet développement des micro-organismes, - lyse des micro-organismes, et traitement de ce lysat par centrifugation, précipitation au sulfate d'ammonium, centrifugation, tamisage moléculaire, précipitation au polyéthyleneglycol d'un poids moléculaire moyen de 6000, centrifugation et dialyse de la solution obtenue.
14. Composition telle que définie à la revendication 11, caractérisée en ce que les ribosomes extraits de micro-organismes sont préparés selon les étapes successives suivantes :
- culture sur un milieu liquide ou solide de la souche de micro-organismes, - récolte après complet développement des micro-organismes, - lyse des micro-organismes, et traitement de ce lysat par centrifugation, précipitation au sulfate d'ammonium, centrifugation, tamisage moléculaire, précipitation au polyéthyleneglycol d'un poids moléculaire moyen de 6000, centrifugation et dialyse de la solution obtenue.
- culture sur un milieu liquide ou solide de la souche de micro-organismes, - récolte après complet développement des micro-organismes, - lyse des micro-organismes, et traitement de ce lysat par centrifugation, précipitation au sulfate d'ammonium, centrifugation, tamisage moléculaire, précipitation au polyéthyleneglycol d'un poids moléculaire moyen de 6000, centrifugation et dialyse de la solution obtenue.
15. Composition telle que définie à la revendication 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 11, 12, 13 ou 14, caractérisée en ce que l'excipient est tel qu'il permette la présentation de la composition sous la forme d'un préparation liquide ou-solide usage topique.
16. Composition telle que définie à la revendication 9, caractérisée en ce que l'excipient est tel qu'il permette la présentation de la composition sous la forme d'un préparation liquide ou solide à usage topique.
17. Composition dermatologique telle que définie à la revendication 15, caractérisée en ce qu'elle renferme des ribosomes extraits de microorganismes.
18. Composition dermatologique telle que définie à la revendication 17, caractérisée en ce qu'elle renferme en outre un ou plusieurs des produits choisis dans le groupe formé par l'acétate d'oléyle, l'extrait sec titré de Centella Asatiaca, l'huile d'onagre et les acides aminés.
19. Composition cosmétique telle que définie à la revendica-tion 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 11, 12, 13, 14 ou 16, carac-térisée en ce que l'excipient est tel qu'il permet la préparation d'une composition sous forme d'une crème, gel, lait, lotion, émulsion, savon liquide, pain dermatologique ou shampoing.
20. Composition cosmétique ou dermatologique telle que définie à la revendication 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 11, 12, 13, 14 ou 16, caractérisée en ce que l'excipient est adapté à permettre la préparation d'une composition pour application sur le visage, le cou et les mains.
21. Application à titre de produit cosmétique d'une composi-tion caractérisée en ce qu'elle renferme à titre de principe actif associé à un excipient acceptable pour fins cosmétiques, des ribosomes extraits de micro-organismes.
22. Méthode pour le traitement cosmétique de régénération et de lutte contre le vieillissement de la peau caractérisée en ce que l'on applique sur la peau une quantité suffisante d'une composition cosmétique ou dermatologique telle que définie à la revendication 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 11, 12, 13, 14 ou 16.
23. Méthode pour le traitement cosmétique de régénération et de lutte contre le vieillissement de la peau caractérisée en ce que l'on applique sur la peau une quantité suffisante d'une composition cosmétique ou dermatologique telle que définie à la revendication 9.
24. Méthode pour le traitement cosmétique de régénération et de lutte contre le vieillissement de la peau caractérisée en ce que l'on applique sur la peau une quantité suffisante d'une composition cosmétique ou dermatologique telle que définie à la revendication 15.
25. Utilisation de ribosomes extraits de micro-organismes ou cellules d'organisme supérieur, comme facteur de croissance cellulaire in vitro.
26. Utilisation de ribosomes extraits de micro-organismes comme facteur de croissance de culture de kératinocytes in vitro.
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