CA1341331C - Viral vector and recombinant dna coding for one or more structural protein (ha, f and/or np) of a morbillivirus, infected cell culture, resulting proteins, vaccine and antibodies - Google Patents
Viral vector and recombinant dna coding for one or more structural protein (ha, f and/or np) of a morbillivirus, infected cell culture, resulting proteins, vaccine and antibodies Download PDFInfo
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Abstract
Poxvirus recombinant exprimant une ou des protéines de structure, HA, F et/ou NP, d'un Morbillivirus, vaccin composé de ce Poxvirus ou des protéines du Morbillivirus qu'il synthétise.Recombinant Poxvirus expressing one or more structural proteins, HA, F and / or NP, of a Morbillivirus, a vaccine composed of this Poxvirus or the proteins of the Morbillivirus which it synthesizes.
Description
r t Le virus de la rougeole est responsable d'une maladie humaine très contagieuse caractérisée par des symptômes divers (conjonctivite, toux et éruption cutanée). Le système nerveux central peut également être atteint en donnant lieu soit à une encéphalite soit de manière plus rare une panencéphalite sub-aiguë sclérosante. Les différentes formes de la maladie peu-vent être évitées grâce à la vaccination avec un virus de la rougeole atténué selon des méthodes traditionnelles. Bien que les vaccins actuellement employés donnent pour une large part satisfaction car ils permettent d'abaisser de manière specta-culaire le nombre des cas de rougeole ainsi que le nombre de décès ou complications dûs à ce virus, plusieurs problèmes subsistent qui justifient l'amélioration de la prévention anti-rougeoleuse. Une première difficulté est liée au fait que les vaccins utilisés actuellement sont constitués de virus vi vant atténué, dont l' admi ni strati on pose plus de problèmes que celle d'un vaccin â base d'organismes tués. Les efforts réalisés jusqu'à présent pour mettre au point un vaccin tué
ont tous échoué. Par ailleurs, les vaccins actuellement utili-sés sont relativement sensibles à la chaleur en raison des propriétés physico-chimiques du virus ce qui rend leur emploi difficile dans les pays tropicaux. Or la rougeole est l'une des premières causes de décès chez l'enfant dans de nombreux pays à climat tropical.
Les travaux antérieurs (Norrby, 1985) sur le virus de la rougeole et les analogies que l'on peut établir avec d'au-tres virus appartenant à la même famille donnent à penser que les protéines de surface de la particule virale, à savoir la protéine hémagglutinante (HA) et la protéine de fusion (F), sont suffi santes pour i ndui re une immuni té protectri ce.
Par ailleurs, les relations immunologiques entre les protéines de surface du virus de la rougeole et celles des autres Morbillivirus (5, 1, 4, 8, 9) et les homologies de sé-quences entre les ADN codant pour certaines de ces protéines (10) permettent d'envisager l'utilisation d'antigènes du virus T rt Measles virus causes disease highly contagious human being characterized by various symptoms (conjunctivitis, cough and rash). The nervous system central can also be reached by giving rise to either a encephalitis is more rarely a sub- panencephalitis acute sclerosing. The different forms of the disease can can be prevented by vaccination with a measles attenuated using traditional methods. Although the vaccines currently used give a large part satisfaction because they allow to dramatically lower the number of measles cases and the number of death or complications from this virus, several problems that justify improving prevention Anti-measles. A first difficulty is linked to the fact that currently used vaccines are made up of viruses living attenuated, whose admi ni strati on poses more problems than that of a vaccine based on killed organisms. The efforts done so far to develop a killed vaccine have all failed. In addition, the vaccines currently used are relatively sensitive to heat due to physicochemical properties of the virus which makes their use difficult in tropical countries. But measles is one the leading causes of death in children in many countries with tropical climate.
Previous work (Norrby, 1985) on the virus measles and analogies that can be drawn with other very viruses belonging to the same family suggest that surface proteins of the viral particle, namely the hemagglutinating protein (HA) and fusion protein (F), are sufficient to i ndui re protective immunity.
Furthermore, the immunological relationships between surface proteins of measles virus and those of other Morbilliviruses (5, 1, 4, 8, 9) and seology homologies between DNA coding for some of these proteins (10) allow to consider the use of virus antigens T
2 1341331 de la rougeole pour la vaccination contre la maladie de Carré, la peste bovine et la peste des petits ruminants. I1 est éga-lement possible de prévoir l'utilisation des antigénes de surface provenant de chacun des Morbillivirus en systéme de vaccination homologue ou hétérologue.
D'autre part, plusieurs travaux ont montré que les protéines internes de différents virus sont importantes pour l' i nducti on d' une i mmuni té de type cellulai re. Pour compléter le vaccin contre les Morbillivirus, il peut donc être i mportant d' i ntrodui re, dans le vi rus recombi nant, le géne, codant pour la nucléoprotéine (NP).
C'est pourquoi la présente invention concerne un Poxvirus recombinant caractérisé en ce qu'il comporte, dans une ou plusieurs parties non essentielles de son génome, au moins une séquence d'ADN codant pour tout ou partie d'au moins une protéine de structure d'un Morbillivirus ainsi que les éléments assurant l'expression de cette protéine.
Les Morbi lli vi rus qui peuvent être uti li sés sont choisis parmi le virus de la rougeole, le virus de la maladie de Carré, le vi rus de la peste bovi ne et le vi rus de la peste des petits ruminants.
Parmi les Poxvi rus uti li sables, i 1 faut ci ter plus parti culi érement le vi rus de la vacci ne.
Les protéines de structure plus particuliérement intéressantes sont les protéines de surface, la protéine hémagglutinante (HA), la protéine de fusion (F) et une pro-téi ne i nterne, la nucléoprotéi ne ( NP ) . Les séquences d' ADN
correspondantes peuvent coder pour la protéine de longueur totale ou bien pour des fragments suffisants pour induire des anticorps neutralisant le virus de la rougeole ou les autres Morbi lli vi rus ou une réponse i mmuni tai re de type cellulaire. 2 1341331 measles for distemper vaccination, rinderpest and peste des petits ruminants. I1 is also It is also possible to foresee the use of the antigens of area from each of the Morbilliviruses in the homologous or heterologous vaccination.
On the other hand, several studies have shown that internal proteins of different viruses are important for the i nducti on of a cellular type i munity. To complete the Morbillivirus vaccine, so it can be i important to introduce, in the recombinant vi rus, the gene, coding for nucleoprotein (NP).
This is why the present invention relates to a Recombinant poxvirus characterized in that it comprises, in one or more non-essential parts of its genome, at at least one DNA sequence encoding all or part of at least a structural protein of a Morbillivirus as well as the elements ensuring the expression of this protein.
The Morbi lli vi rus that can be used are chosen from the measles virus, the disease virus de Carré, the bovine plague virus and the plague virus small ruminants.
Among the useful Poxvi rus, i must be mentioned more Particularly the vaccine vaccine.
Structural proteins in particular interesting are the surface proteins, the protein hemagglutinating (HA), fusion protein (F) and a pro-internally, nucleoprotein (NP). DNA sequences correspondents can code for length protein total or for fragments sufficient to induce antibodies that neutralize the measles virus or other Morbi lli vi rus or a type i mmuni tai re response cellular.
3 I1 est évi demment possible de prévoi r la mi se en oeuvre d'une séquence d'ADN codant pour plusieurs protéines ou plusieurs fragments de celles-ci.
Bien que la souche du virus de la rougeole mise en oeuvre dans les exemples du brevet soit une souche particuli-ére, il est possible d'utiliser d'autres souches. En effet, étant donné la conservation importante des épitopes antigéni-ques associés aux protéines HA et F des différentes souches du virus de la rougeole, la méthode décrite pour une souche de virus peut être étendue aux autres souches.
Les éléments d'expression de la protéine sont essen-tiellement des promoteurs, en particulier des promoteurs effi-caces dans la vaccine, ainsi on peut utiliser le promoteur du géne codant pour la protéi ne de 7, 5 Kd de la vacci ne qui sera appelé en abrégé promoteur 7,5 Kd.
L'insertion de l'ADN doit se faire dans une partie non essentielle du génome du virus, c'est-â-dire dans une partie qui n'empêche pas la réplication du Poxvirus.
On effectue par exemple l'intégration dans le géne TK
de la vaccine car, outre le fait qu'il n'est pas essentiel pour le virus, ce géne permet une sélection des virus ayant intégré la séquence en cause.
On peut aussi effectuer l'intégration dans un géne dénommé hr qui n' est nécessai re â la multipli cati on du vi rus que dans certains types cellulaires.
Suivant les cas, les différentes protéines de Morbillivirus peuvent être exprimées simutanément par le même virus recombinant ou par plusieurs virus. Dans le premier cas, les génes correspondants peuvent être intégrés au même site ou â des sites différents, en particulier dans les génes TK et hr. 3 It is obviously possible to plan mid-term work of a DNA sequence coding for several proteins or several fragments of these.
Although the strain of the measles virus work in the examples of the patent either a particular strain It is possible to use other strains. Indeed, given the significant conservation of antigenic epitopes associated with the HA and F proteins of the different strains of the Measles virus, the method described for a strain of virus can be spread to other strains.
The expression elements of the protein are essential.
promoters, particularly effective promoters caces in vaccinia, so you can use the promoter gene coding for the 7.5 Kd protein of the vaccine which will abbreviated as promoter 7.5 Kd.
The insertion of DNA must be done in a part not essential to the genome of the virus, i.e. in a part which does not prevent the replication of the Poxvirus.
We perform for example the integration in the TK gene vaccine because, apart from the fact that it is not essential for the virus, this gene allows a selection of viruses having integrated the sequence in question.
We can also integrate into a gene called hr which is not necessary for the multipli cati on of the virus than in certain cell types.
Depending on the case, the different proteins of Morbilliviruses can be expressed simultaneously by the same recombinant virus or by several viruses. In the first case, the corresponding genes can be integrated into the same site or â different sites, especially in the TK genes and hr.
4 C'est pourquoi la présente invention concerne égale-ment des virus recombinants caractérisés en ce qu'ils compor-tent simultanément dans 2 parties non essentielles de leur génome des séquences d'ADN codant pour différentes protéines de Morbi l li vi rus .
Les Poxvirus recombinants ainsi obtenus, qu'ils soi ent vi vants ou i nacti vés, sont plus parti culi érement uti li sables comme vaccins, notamment contre la rougeole, la maladie de Carré, la peste bovine et la peste des petits ruminants.
Toutefois, il est possible d'utiliser ces Poxvirus de façon i ndi recte pour infecter des cellules de mammi féres, in vitro, afin d'obtenir des protéines de structure de Morbilli-virus, notamment de la rougeole, qui pourraient être utilisées comme agents d' i mmuni sati on et de vacci nati on ou encore â
titre d'éléments de diagnostic selon des procédés connus.
C'est pourquoi l'invention concerne également l'ap-plication des protéines de structure ou de fragments de proté-ines de structure â titre d'agents vaccinants et qui peuvent notamment être obtenues â partir des cultures cellulaires précédentes.
Enfin, l'invention concerne également les antisérums contenant les anticorps dressés contre les poxvirus ou les protéines selon l'invention, pour leur utilisation en sérothérapie.
I1 sera fait référence aux dessins annexés dans lesquels:
la figure 1 est une construction du vecteur permettant le transfert du cADN codant pour la protéine HA
dans le génome du virus de la vaccine, rt _. . ~ , ,.
4a 1 3 4 1 3 3 1 la figure 2 est une construction du vecteur permettant le transfert du cADN codant pour la protéine F dans le génome du virus de la vaccine, la figure 3 illustre les protéines HA et F du virus de la rougeole synthétisées dans des cellules infectées par les recombinants du virus de la vaccine et mises en évidence par immunofluorescence, la figure 4 illustre une immunoprécipitation des protéines HA et F du virus de la rougeole synthétisées dans des cellules infectées par des recombinants du virus de la vaccine, la figure 5 est une construction du vecteur permettant le transfert du cADN codant pour la protéine F et HA dans le génome du virus de la vaccine, la figure 6 illustre une immunoprécipitation des protéines HA et F du virus de la rougeole synthétisées dans des cellules infectées par le recombinant w.TG.HAFM2122 codant pour les deux protéines, la figûre 7 est une construction d'un deuxième vecteur permettant le transfert du cADN codant pour la protéine F et HA dans le génome du virus de la vaccine, la figure 8 est une construction d'un vecteur permettant le transfert du gène codant pour la B-galactosidase d'E. coli à la place du gène hr dans le génome du virus de la vaccine, la figure 9 est une construction d'un vecteur permettant le transfert du gène codant pour la protéine F du virus de la rougeole à la place du gène hr dans le génome du virus de la vaccine, la figure 10 est une construction de deux vecteurs permettant le transfert du gène codant pour la protéine NP du virus de la rougeole dans le génome du virus de la vaccine, la figure 11 illustre la mise en évidence de la protéine NP dans des cellules infectées par le virus W.TG.2139.
~~:', Les figures suivantes illustrent les exemples .
Figure 1 . Construction du vecteur permettant le transfert du cADN codant pour la protéine HA dans le génome du 4 This is why the present invention also relates to Recombinant viruses characterized in that they contain try simultaneously in 2 nonessential parts of their genome DNA sequences encoding different proteins from Morbi l li vi rus.
The recombinant Poxviruses thus obtained, which they either live or inactivated, are more particularly useful sands as vaccines, especially against measles, disease de Carré, rinderpest and peste des petits ruminants.
However, it is possible to use these Poxviruses right way to infect fair mammalian cells, in in vitro, in order to obtain Morbilli structural proteins viruses, including measles, that could be used as i mmuni sati on and vacci nati on agents or even â
as diagnostic elements according to known methods.
This is why the invention also relates to the app-plication of structural proteins or protein fragments ines of structure as vaccinating agents and which can in particular be obtained from cell cultures preceding.
Finally, the invention also relates to the antisera containing antibodies raised against poxviruses or proteins according to the invention, for their use in serum therapy.
Reference will be made to the accompanying drawings in which:
Figure 1 is a construction of the vector allowing the transfer of the cDNA coding for the HA protein in the vaccinia virus genome, rt _. . ~,,.
4a 1 3 4 1 3 3 1 Figure 2 is a construction of the vector allowing the transfer of the cDNA encoding the F protein into the genome of the vaccinia virus, FIG. 3 illustrates the HA and F proteins of the virus measles synthesized in cells infected with vaccinia virus recombinants and demonstrated by immunofluorescence, Figure 4 illustrates immunoprecipitation of measles virus HA and F proteins synthesized in cells infected with recombinant virus vaccinated, Figure 5 is a construction of the vector allowing the transfer of the cDNA encoding the F protein and HA in the genome of the vaccinia virus, FIG. 6 illustrates an immunoprecipitation of measles virus HA and F proteins synthesized in cells infected with the recombinant w.TG.HAFM2122 coding for the two proteins, Fig. 7 is a construction of a second vector allowing the transfer of the cDNA encoding the protein F and HA in the genome of the vaccinia virus, Figure 8 is a construction of a vector allowing the transfer of the gene coding for B-galactosidase of. coli in place of the hr gene in the genome of the vaccinated, Figure 9 is a construction of a vector allowing the transfer of the gene coding for the F protein of measles virus in place of the hr gene in the genome of vaccinia virus, Figure 10 is a construction of two vectors allowing the transfer of the gene coding for the NP protein of measles virus in the genome of the vaccinia virus, Figure 11 illustrates the highlighting of the NP protein in virus infected cells W.TG.2139.
~~ ', 1,341 33 1 The following figures illustrate the examples.
Figure 1 . Construction of the vector allowing the transfer of cDNA encoding the HA protein in the genome of
5 vi rus de la vacci ne .
La séquence rougeole (HA measles) est indiquée par un arc ouvert avec une fléche qui donne le sens de la traduction du géne. Le grand fragment BamHI dans pCD-HA est le vecteur pCD
tandis que dans M13TG2101 et M13TG2106 le grand fragment BamHI
est le vecteur M13TG131. Dans l'étape 3 le plasmide recombi-nant M13TG2107 n'est pas représenté. Dans le plasmide pTG11,69 le petit fragment HindIII correspond â pTGlH, le trait continu au fragment HindIIIJ du virus vaccinal interrompu dans le géne TK et la fléche large correspond au promoteur dè la protéine 7, 5 Kd.
Figure 2 . Construction du vecteur permettant le transfert du cADN codant pour la protéine F dans le génome du virus de la vaccine.
La séquence rougeole (F measles) est indiquée par un arc ouvert avec une fléche qui donne le sens de la traduction. Les autres annotations sont identiques â celles employées dans la fi gure 1.
Figure 3 . Protéines HA et F du virus de la rougeole synthéti-sées dans des cellules infectées par les recombi-nants du virus de la vaccine et mises en évidence par immunofluorescence.
Le panneau A montre l'immunofluorescence membranaire obtenue aprés infection de cellules LTK- avec le recombinant W.TG.HAM2-2 et réaction d'un anticorps monoclonal anti-HA
suivi d'un anticorps anti-souris marqué â la fluorescéine. Le panneau B montre l'immunofluorescence observée aprés infection des cellules LTK- avec le recombinant VV.TG.FM1173 et réaction d'un anticorps monoclonal anti F suivi d'un anticorps anti-souris marqué â la fluorescéine.
,~..,~
Fi gure 4 . Immunopréci pi tati on des protéi nes HA et F du vi rus de la rougeole synthétisées dans des cellules infectées par des recombinants du virus de la vac-ci ne.
Autoradiographie du gel de polyacrylamide sur lequél les pro-téines immunoprécipitées ont été déposées. L'hémaglutinine (HA) est présente dans les cellules infectées avec W.TG.HAM2-2 tandis que la protéine de fusion (FO) et ses produits de clivage F1 et F2 sont présents dans les cellules infectées avec VV.TG.FM1173.
Figure 5 . Construction du vecteur permettant le transfert du cADN codant pour la protéine F et HA dans le génome du virus de la vaccine.
Les annotations sont identiques â celles employées dans les figures 1 et 2.
Fi Bure 6 . Immunopréci pi tati on des protéi nes HA et F du vi rus de la rougeole synthétisées dans des cellules infectées par le recombinant vv.TG.HAFM2122 codant pour les deux protéines.
Autoradiographie du gel de polyacrylamide sur lequel les pro-téines immunoprécipitées ont été déposées. Les extraits de cellules infectées avec W.TG.FM1173 (colonne 1), W.TG.HAM2-2 (colonne 2) et W.TG.HAFM2122 (colonne 3) ont été immunopréci-pitées avec un sérum polyclonal de cobaye. Les protéines HA, F0, F1 et F2 attendues aprês infection avec le recombinant W.TG.HAFM2122 apparaissent distinctement dans la colonne 3.
Figure 7 . Construction d'un deuxiéme vecteur permettant le transfert du cADN codant pour la protéine F et HA
dans le génome du virus de la vaccine.
Les séquences du virus de la rougeole codant pour les pro-téines HA et F sont représentées par des arcs de cercles annotés HA et F. Les génes sont orientés selon le sens donné
par les fléches. Le promoteur P7,5 Kd du virus de la vaccine est schématisé par une fléche épaisse. La région d'ADN com-prise entre les sites HindIII correspond au vecteur bactérien pTGlH. En amont et en aval du vecteur bactérien sont repré-sentés par un arc de cercle simple, la partie gauche et la partie droite respectivement du fragment HindIII J du virus de la vaccine. Le symbole B° indique l'endroit oû un site BgIII a été fusi onné par li gati on à un si te BamHI .
Figure 8 . Construction d'un vecteur permettant le transfert du géne codant pour la S-galactosidase d'E. coli à
la place du géne hr dans le génome du virus de la vacci ne.
La partie correspondant au vecteur bactérien pUC~ est représentée par un arc de cercle au trait unique. Les séquences d'ADN du virus de la vaccine situées de part et d'autre du site BgIII sont représentées par des arcs de cercle ou trait double et correspondent aux régions du génome qui codent pour des protéines de 30 Kd et 50 Kd (à gauche du site BgIII) ou 42 Kd (à droite du site BglII). Le géne codant pour la ~-galactosidase est annoté lac Z et son orientation est donnée par rapport au promoteur P7,5 Kd. Ce dernier est représenté par une fléche épaisse. Le symbole B° indique l'endroit oû un site BglII a été fusionné par ligation à un site BamHI.
Figure 9 . Construction d'un vecteur permettant le transfert du gêne codant pour la protéine F du virus de la rougeole à la place du géne hr dans le génome du virus de la vaccine.
Les annotations sont les mêmes que celles utilisées dans la figure 8. Le symbole E° indique l'endroit du vecteur oû le site EcoRl a été supprimé. La région située entre le site BglII et le site EcoRl du vecteur pTG2147 correspond au seg-ment adaptateur. Le gêne de la rougeole codant pour la pro-téine F est représenté par un arc de cercle en traits doubles et annoté Measles F.
Figure 10 . Construction de deux vecteurs permettant le transfert du géne codant pour la protéine NP du virus de la rougeole dans le génome du virus de la vacci ne.
Dans le plasmide pCD NP, les arcs de cercle au trait simple représentent la partie pCD. Dans les plasmides annotés M13, les régions au trait unique représentent la partie M13TG131.
Les plasmides pTG sont schématisés comme dans les figures précédentes. Les sites ayant été détruits par ligation sont annotés B° pour la fusion d'un site BglII â un site BamHI et Sma 1° pour la fusion d'un site Smal â un site Hpal. ' Figure 11 . Mise en évidence de la protéine NP dans des cellules infectées par le virus VV.TG.2139.
Les lysats de cellules de hamster BHK 21 infectées avec la souche sauvage du virus de la vaccine (piste annotée T) ou avec des isolats du recombinant W.TG.2139 (annotés 1,2 et 3) ont été immunoprécipités avec un sérum polyclonal de cobaye et analysés par électrophorése sur gel de polyacrylamide.
L'autoradiographie du gel révéle la présence d'une protéine NP
(60 Kd) seulement dans les échantillons de cellules infectées avec le vi rus W.TG. 2139.
Exemple 1 Construction d'un vecteur permettant le transfert du cADN codant pour la protéine HA dans le génome du virus de la vaccine.
Le cADN codant pour la protéine HA du virus de la souche Hallé a été isolé et séquencé précédemment (3). Afin de faciliter la manipulation du géne, le cADN HA provenant du plasmide pCD HA a été excisé par les deux sites BamHI qui l'entourent et inséré dans le vecteur M13TG131 (6) pour donner naissance au plasmide M13TG2101. Un site Pstl a été introduit par mutagénése localisée en amont de la partie codante du géne HA portée par le plasmide M13TG2101 â l'aide de l'oligonuclé-otide synthétique suivant .
GGGGGGGGAGGGCTGCAGATCATCCACAATG
Le plasmide muté a été dénommé M13TG2106. Un fragment Pstl-BamHI contenant le géne HA a été excisé du M13TG2106 et inté-gré dans le vecteur M13TG130 (6) préalablement coupé par Pstl-BamHI pour donner naissance au plasmide M13TG2107. La séquence nucléotidique de la région mutée du cADN HA a été vérifiée par la méthode des didéoxynucléotides puis le cADN HA a été excisé
du vecteur M13TG2107 avec les enzymes Pstl-EcoRI et inséré en aval du promoteur 7,5 Kd du vecteur de transfert pTG186POLY
(brevet français 84.06499) préalablement coupé par les enzymes Pstl-EcoRI pour donner naissance au plasmide pTG1169. L'ensem-ble de ces étapes est schématisé dans la figure 1.
Exemple 2 Construction d'un vecteur permettant le transfert du cADN codant pour la protéine F dans le génome du virus de la vaccine.
Le cADN codant pour la protéine F du virus de la souche Hallé a été isolé et séquencé précédemment (2). Afin de faciliter la manipulation du.géne, le cADN codant pour la protéine F a été excisé du vecteur pCD F (2) â l'aide de l'en-zyme BamHI. Ceci donne deux fragments, l'un qui recouvre la partie 5' du géne et l'autre qui recouvre la partie 3' du lo géne. Le fragment 5' a été inséré dans le vecteur M13TG131 préalablement coupé par l'enzyme BamHI pour donner le plasmide M13TG2103-5. La partie 3' a été de même intégrée dans le vec-teur M13TG131 pour donner M13TG2103-3' . Un site Nsil a été
introduit par mutagénése localisée en amont de la partie co-dante du géne F porté par le plasmide M13TG2103-5' â l'aide de l'oligonucléotide synthétique suivant .
Ns i 1 AAGACTCATCCAATGCATATCATGGGTCTCAAG
Le plasmide muté a été dénommé M13TG2109. Un fragment Nsil-BamHI contenant la partie 5' du géne F a été excisé du M13TG2109 et inséré en aval du promoteur 7,5 Kd du vecteur de transfert pTG186POLY préalablement coupé par les, enzymes Pstl-BamHI pour donner naissance au vecteur pTG1172. La partie 3' du gêne F a été excisée de M13TG2103-3' par l'enzyme BamHI et insérée dans l'orientation qui reconstitue le géne naturel dans pTG1172 préalablement coupé par BamHI pour donner le vecteur pTG1173. L'ensemble de ces étapes est schématisé dans la fi Bure 2.
Exemple 3 Construction d'un recombinant du virus de la vaccine contenant le géne HA du virus de la rou-geole et capable d'exprimer la protéine corres-pondante.
Le géne codant pour la protéine HA contenu sur le plasmide pTG1169 a été transféré dans le génome du virus de la vaccine selon un protocole classique précédemment décrit (bre-vet français 84.06499). En bref, des cellules d'embryon de poulet ont été infectées avec le mutant thermosensible du virus de la vaccine ts N7 â raison de 0,1 pfu par cellule et incubées pendant deux heures â 33°C (température permissive pour le mutant). Les cellules ont été ensuite transfectées avec un précipité de phosphate de calcium contenant 1 ~,g d'ADN
de la souche sauvage du virus de la vaccine et 100 ng du plas-mide pTG1169. Aprés une heure d'incubation â température ambi-ante, un milieu de culture frais a été ajouté aux cellules sans enlever le précipité et l'incubation a été poursuivie pendant deux heures â la température de 39,5°C (température non permissive pour le mutant). Au bout de cette période le milieu contenant le précipité a été éliminé et remplacé pen-dant une minute par un milieu de culture contenant 10 ~ de glycerol. Enfin les cellules ont été lavées deux fois avec du PBS puis incubées pendant deux jours â 39,5° dans un milieu de culture normal. Des virus recombinants, thymidine kinase néga-tif ont ensuite été sélectionnés, â partir du virus non ther-mosensible produit dans la transfection précédente. Pour rér aliser cette étape les cellules de poulet infectées et trans-fectées de la maniére décrite ci-dessus ont été lysées par congélation puis sonication et le virus qu'elles contiennent titré sur cellules LTK- en présence de 100 wg/ml de bromodéso-xyuridine et sous une couche d'agarose 1 ~. Des plages de virus TK- ont été reprises et le virus qu'elles contiennent a été amplifié sur des cultures fraîches de cellules d'embryon de poulet. Les stocks de virus ainsi obtenus ont été analysés pour leur aptitude â synthétiser de la protéine HA, soit par une technique d'immunofluorescence, soit par une technique d'immunoprécipitation.
Pour l'immunofluorescence des cellules LTK- ont été
infectées avec le virus recombinant â raison d'environ une pfu par cellule pendant 15 heures. Les cellules infectées ont ensuite été fixées à l'acétone, réhydratées au PBS puis incu-bées pendant une demi-heure avec un anticorps monoclonal de souris dirigé contre la protéine HA du virus de la rougeole et dilué au 1/200e. Aprés lavage au PBS pour éliminer l'anticorps non fixé, les cellules ont été incubées en présence d'anti-corps anti-souris marqué â la fluorescéine et dilué au 1/100e.
Aprés de nouveaux lavages pour éliminer l'anticorps marqué et fixé aspécifiquement, les échantillons sont observés au mi-croscope â fluorescence. La photo de la figure 3 montre que les cellules infectées avec le recombinant isolé ci-dessus présentent une fluorescence caractéristique de cellules infec-tées par le virus de la rougeole tandis que les cellules infectées par du virus de la vaccine sauvage ne présentent pas cette fluorescence. Un des recombinants du virus de la vaccine capable de synthétiser la protéine HA a été choisi et dénommé
VV.TG.HAM2-2. Pour s'assurer qu'il ne contenait pas de conta-mi nati on par un autre vi rus non recombi nant i 1 a été puri fi é
une nouvelle fois par isolement d'une plage infectieuse et amplification sur cellules d'embryon de poulet.
Afin de confirmer la synthése de la protéine HA d'une taille attendue, des cellules BHK21 ont été infectées à raison d'environ 0,1 pfu par cellule pendant 15 heures puis incubées dans un milieu dépourvu de méthionine normale mais contenant de la méthionine radioactive marquée au soufre 35. Aprés qua-tre heures de marquage, les cellules infectées ont été lysées dans du tampon d'immunoprécipitation et la protéine HA immuno-précipitée avec un anticorps polyclonal de cobaye dirigé con-tre les protéines du virus de la rougeole, en présence de la protéine A de Staphylocoque aureus fixée au sépharose. Les protéines immunoprécipitées ont été analysées sur un gel de polyacrylamide en présence de SDS. Le gel séché est soumis â
autoradiographie. Les résultats (figure 4) montrent que le recombi nant du vi rus de la vacci ne VV . TG. HAM2-2 i ndui t la synthése d'une protéine de taille identique à la protéine HA
authentique du virus de la rougeole.
Exemple 4 Construction d'un recombinant du virus de la vaccine contenant le géne codant pour la protéine F du virus de la rougeole.
Le géne codant pour la protéine F porté par le plas-mide pTG1173 a été transféré dans le génome du virus de la vaccine selon le même protocole que celui décrit dans l'exem-ple 3 pour le géne HA. Ai nsi un recombi nant vi ral dénommé
W.TG.FM1173 a été isolé. Afin de confirmer que ce recombinant induit la synthése de la protéine F, des cellules BHK21 ont été infectées avec environ 0,1 ufp par cellule pendant 15 heures pui s i ncubées dans un mi li eu dépourvu de méthi oni ne normale mais contenant de la méthionine radioactive marquée au 355, Aprés quatre heures de marquage, les cellules infectées ont été lysées dans du tampon d'immunoprécipitation et la protéine F immunoprécipitée avec un anticorps polyclonal de cobaye dirigé contre les protéines du virus de la rougeole, en présence de la protéine A de Staphylocoque aureus fixée au sépharose.
Les protéines immunoprécipitées ont été analysées sur gel de polyacrylamide en présence de SDS. Le gel séché est soumis â autoradiographie. Les résultats (figure 4) montrent que le recombinant VV.TG.FM1173 induit la synthése de la pro-téine FO correspondant au produit initial de la traduction du géne F et des produits de clivage protéolytique F1 et F2 qui apparaissent naturellement lors d'une infection par la rougeo-le. Les protéines F0, F1 et F2 ont la taille attendue pour les protéines authentiques du virus de la rougeole. Afin de mon-trer que ces protéines sont associées â la membrane de la cel lule i nfectée comme lors de l' i nfecti on par le vi rus de la rougeole, des cellules LTK- ont été infectées avec le recombi-nant VV.TG.FM1173 â raison d'environ une ufp par cellule pen-dant 15 heures. Les cellules infectées ont ensuite été fixées â l'acétone, réhydratées au PBS puis incubées pendant une demi-heure avec un anticorps monoclonal de souris dirigé con-tre les protéines F du virus de la rougeole et dilué au 1/100e. Aprés lavage au PBS les cellules ont été incubées en présence d'anticorps anti-souris marqués â la fluorescéine et dilué au 1/100e. Aprés de nouveaux lavages pour éliminer l'an-ticorps marqué et fixé aspécifiquement, les échantillons sont observés au microscope â fluorescence. La photo de la figure 3 montre que les cellules infectées avec le recombinant W.TG.FM1173 présentent une fluorescence membranaire caracté-ristique de cellules infectées par le virus de la rougeole tandis que les cellules infectées avec le virus de la vaccine de type sauvage ne présentent aucune fluorescence.
Exemple 5 Vaccination des souris avec le recombinant W.TG.HAM2-2.
Des souris Balb C âgées de 4 â 5 semaines ont été
vaccinées par scarification de la queue avec 4 10~ pfu de virus, soit du recombinant W.TG.HAM2-2, soit du virus W
sauvage. Trois semaines aprés l'inoculation du sang a été
prélevé des animaux et on a mesuré le taux d'anticorps capa-bles d'inhiber l'activité hémagglutinante du virus et capables de neutraliser le virus in vitro. Le tableau 1 montre que la plupart des souris vaccinées avec VV.TG.HAM2-2 présentent aussi bien des anticorps anti-hémagglutinants que des anti-corps neutralisants. Trois semaines aprés la vaccination une inoculation d'épreuve a été administrée aux animaux . chaque souris a reçu 50 ~,1 d'une suspension diluée â 10 $ d'un cer-veau de souris préalablement infectée avec une souche de rou-geole neuroadaptée (11). Les animaux ont été surveillés pen-dant un mois. Le tableau 2 montre que les souris vaccinées avec la souche VV.TG.HAM2-2 sont protégées tandis que les autres animaux succombent â l'inoculation d'épreuve.
Exemple 6 Vaccination des souris avec le recombinant VV. TG. FM117 3.
Des souris Balb C femelles âgées de cinq semaines ont été vaccinées par scarification de la queue avec 4.10 ufp de vi rus, soi t du recombi nant VV . TG. FM117 3, soi t du vi rus W
sauvage. Vingt cinq jours aprês l'inoculation, du sang a été
prélevé des animaux et on a mesuré le taux d'anticorps capa-bles de neutraliser le virus in vitro. Le tableau 3 montre que la plupart des souris vaccinées avec VV.TG.FM1173 présentent des anticorps neutralisants. Le jour du prélévement sanguin les souris ont été inoculées par voie intracérébrale avec une souche virulente neuroadaptée du virus de la rougeole. Chaque souris reçoit 50 wl d'une suspension diluée â 10 $ d'un cer-veau de souris préalablement infectée avec la souche virulente neuroadaptée. Les animaux sont surveillés pendant un mois.
Seules les souris vaccinées avec la souche W.TG.FM1173 sont protégées contre l'inoculation d'épreuve (Tableau 2).
Tableau 1 Immunisation de souris par inoculation du virus recombinant W.TG.HAM2-2.
souris femelles anticorps anticorps anti-hmagglutinine neutralisants 2 g0 160 g 40 40 g 160 160 ' souris mâles 5 g0 640 g 160 160 4p 80 Les titres sont exprimés en réciproque de la dilution la plus élevée du sérum qui donnait une neutralisation compléte de 50 ufp du virus de la rougeole ou une inhibition totale de l'activité hémagglutinante. Les sérums de souris non vaccinées ou vaccinées avec la souche W sauvage donnaient un titre d'anticorps anti-hémagglutinine inférieur â 20 et un titre d'anticorps neutralisants inférieur â 40.
Tableau 2 Protection des souris.
Exprience Exprience vi rus uti li W pas VV
s pour la sauvage VV.TG.HAM2-2 de sauvage VV.TG,FM1173 vacci na- vi rus tion nombre d' ani 12 19 9 3 22 maux i noculs nombre*
de survi- 2 19 1 0 22 vants * Trois semaines aprés la vaccination, les souris ont été
éprouvées avec une souche SSPE de la rougeole adaptée â la souris. Les décés ayant eu lieu dans les trois premiers jours n'ont pas été comptabilisés dans les résultats car ils sont attribués au traumatisme de la voie d'inoculation.
Tableau 3 Immunisation des souris par inoculation du virus recombinant VV.TG.FM1173.
Souris femelles Anticorps neutralisants 8 80 ' Les titres sont exprimés en réciproque de la dilution la plus élevée du sérum qui donnait une neutralisation compléte de 50 ufp du virus de la rougeole. Les sérums de souris non vacci-nées ou vaccinées avec la souche sauvage donnaient un titre d'anticorps neutralisants inférieur â 40.
Exemple 7 Construction d'un recombinant du virus de la vac-cine contenant les génes codant pour la protéine F et pour la protéine HA du virus de la rougeole.
Un plasmide recombinant permettant le transfert si-multané des génes HA et F dans le génome du virus de la vacci-ne a été construit de la maniêre suivante (illustré dans la figure 5) . le promoteur 7,5 Kd a été excisé du vecteur M13TG2119 par digestion partielle avec l'enzyme BgIII et di-gestion compléte avec EcoRI. Le fragment BglII-EcoRI ainsi obtenu a été inséré dans le plasmide pTG1169 préalablement coupé par BamHI et EcoRI. De cette maniére un nouveau plasmide a été isolé et appelé pTG2121.
Dans cette construction, le géne HA est suivi en 3' par le promoteur 7,5 Kd orienté dans le même sens de trans-cription que le gêne HA.
Le plasmide pTG2121 a été ouvert en aval du second promoteur 7,5 Kd avec les enzymes BamHI et EcoRI pour y insé-rer le géne F, excisé du plasmide pTG1173 par les enzymes BglII et EcoRI ; le nouveau plasmide est appelé pTG2122. Ainsi le plasmide pTG2122 correspond au plasmide pTG186POLY dans lequel ont été insérés les génes HA et F, chacun étant placé
sous le contrôle d'un promoteur 7,5 Kd. L'ensemble a été
transféré dans le génome du virus de la vaccine selon le pro-tocole décrit dans l'exemple 3. Un virus recombinant (VV.TG.HAFM2122) capable d'induire la synthése de la protéine HA et de la protéine F a été isolé et caractérisé par immuno-fluorescence et i mmunopréci pi tati on comme décri t dans les exemples 3 et 4 ( voi r fi gure 6 pour l' i mmunopréci pi tati on ) .
Exemple 8 Construction d'un deuxiéme recombinant du virus de la vaccine contenant les génes codant pour la protéine F et pour la protéine HA du virus de la rougeole.
Le recombinant VV.TG.HAFM2122 s'est révélé instable.
En effet, l'analyse de la population virale issue d'un clonage du recombinant a montré que tandis que 100 ~ d'entre eux codent toujours pour la protéine F, seulement 50 ~ codent pour 10 la protéine HA. Un clonage successif du même type en partant toujours d'un clone viral codant pour les deux protéines a' donné des résultats identiques. I1 est probable que la pré-sence du promoteur 7,5 Kd en répétition directe permette la délétion du géne (le géne HA en l'occurence) qui est encadré
15 par la répétition.
Afin de générer un recombinant codant pour les protéines HA et F de maniére stable, les deux promoteurs 7,5 Kd ont été placés en répétition inversée de telle sorte 20 que toute recombinaison donnerait naissance â un génome viral tronqué, non viable. Ceci constitue donc un systéme de sélection contre la délétion du géne HA et assure la stabilité
du virus recombinant.
Les constructions ont été réalisées de la maniére suivante. Dans un premier temps un deuxiéme promoteur 7,5 Kd a été ajouté au plasmide pTG1169. Le promoteur a été excisé de M13TG2119 en coupant celui-ci de maniére partielle par BglII
et de maniére compléte par BamHI. Le fragment d'ADN contenant le promoteur coupé par BglII en amont et par BamHI en aval a été isolé et lié au plasmide pTG1169 préalablement coupé par BamHI et traité â la phosphatase.
~,..~..
Aprés transformation de bactéries E. coli avec le mélange de li gati on, un plasmi de pTG2130 a été i solé dans lequel le deuxiéme promoteur 7,5 Kd est dans le sens de transcription opposé au premier. L'extrémité codant pour la partie N terminale de la protéine F a ensuite été excisée de pTG1173 par les enzymes BglII et BamHI et insérée dans le vecteur pTG2130 préalablement coupé par BamHI et déphospho-rylé. Ceci donne naissance au plasmide pTG2133.
Afin d'ajouter la partie C terminale du géne F il s'est révélé nécessaire de déléter auparavant l'extrémité'poly A qui se trouvait dans le cADN d'origine et avait été transfé-rée au vecteur M13TG2103 3'. Pour ce faire, une mutagénése localisée avec l'oligonucléotide 5' .AATTATCTCCGGCTTAGATCTGGCCGAACAATATCGG
a été effectuée de façon â introduire un site BglII â 246 nucléotides en aval du site BamHI situé dans le géne F. Le phage M13 muté appelé M13TG2143 a servi de source d'un frag-ment BamHI-BglII codant pour la séquence C terminale du géne F. Celui-ci a été inséré dans le plasmide pTG2133 coupé au préalable par BamHI puis déphosphorylé. Le plasmide recombi-nant obtenu nommé pTG3115 comprend le géne HA et F placés en sens opposés l'un par rapport â l'autre, chacun étant controlé
par un promoteur p7,5 Kd également opposés l'un par rapport â
l'autre. L'ensemble des manipulations effectuées pour construire le plasmide pTG3115 est résumé dans la figure 7.
Le transfert des séquences décrites ci-dessus dans le génome du virus de la vaccine a été effectué selon les métho-des décrites auparavant et un virus appelé W.TG.HAFM3115 a été isolé. Ce virus recombinant code pour les protéines HA et F d'aprés les critéres d'immunofluorescence et d' immunoprécipi-tation uti li sés ci-dessus et par ai lieurs i 1 présente un phé-notype (expression des protéines HA et F) stable aprés clonages successifs.
Exemple 9 Construction d'un recombinant du virus de la vacci ne codant pour la protéi ne F du vi rus de la rougeole en remplacement du géne hr Des travaux antérieurs (12) ont montré que le virus de la vacci ne posséde un géne, dénommé géne hr, qui. est nécessaire â la multiplication virale sur certains types cellulai res d' ori gi ne humai ne mai. s n' est pas i ndi spensable sur d'autres types cellulaires (cellules d'embryons de poulet, cellules BHK21 de hamster, cellules L de souris). Ces résul-tats indiquent que le géne hr pourrait être délété et remplacé
par un autre géne.
Le géne qui code pour la protéine F du virus de la rougeole a été intégré â la place du géne hr de la maniére sui vante 1° Intégration du géne de la ~ galactosidase â la place du géne hr dans le génome du virus de la vaccine.
Dans un premier temps un plasmide a été construit dans lequel le géne hr est remplacé par un bloc d'expression comprenant le promoteur p7,5 Kd suivi du géne de la ~-galac-tosidase. L'ADN viral qui se trouve en amont et en aval du géne hr (ce dernier ayant été délété) a été introduit dans le vecteur pUC7 pour donner le pBACl. Le site BglII unique de ce plasmide correspond au site oû était localisê le géne hr.
Le plasmide pBACl a été ouvert par BglII et un fragment BglII-BamHl provenant de pTG1174 et contenant le gêne de la S galactosidase y a été inséré de telle sorte que le sens de la lecture du gêne soit de la gauche vers la droite par rapport au sens conventionnel du génome viral. Le plasmide obtenu, pTG2128 a été ouvert au site BglII unique en amont du gêne de la ~-galactosidase et le promoteur p7,5 Kd contenu sur un fragment d'ADN BglII-BglII provenant de M13TG2119 a été in-tégré dans le sens permettant la transcription du gêne de la S
galactosidase. Le plasmide provenant de cette ligation est appelé pTG2131 ; les étapes de sa construction sont schéma-tisées dans la figure 8.
Des cellules d'embryon de poulet infectées au préalable par le mutant tsN7 du virus de la vaccine ont été
transfectées simultanément par l'ADN de virus de type sauvage et par l'ADN du pTG2131. Les virus non thermosensibles issus de cette expérience ont été étalés sur cellules d'embryons de poulet pour la formation de plages sous une couche de milieu contenant de l'agar â 1 $. Deux jours aprés, on ajoute une deuxiéme couche de milieu contenant de l'agar et 60 mg par ml de X-Gal (5-bromo-4chloro-3indoly-~-D-galactopyranoside).
Cette technique permet de reconnaître les plages bleues con-tenant du virus qui a intégré et qui exprime le gêne de la S-galactosidase.
Parmi les nombreux virus recombinants reconnus de cette maniére, une plage a été isolée et le virus a été
recloné puis amplifié et dénommé W.TG.hrsga1.2131. L'étude de son spectre d'hôte sur plusieurs types cellulaires montre qu'il ne se multiplie pas sur cellules RK13 de lapin ni sur cellules humaines 143B tk-. Ce phénotype correspond â ce que l'on attend pour un virus ayant perdu le gêne hr. Par contre le virus W.TG.hr~ga1.2131 est toujours capable de se multiplier sur cellules humaines HepII.
2° Construction d'un virus de phénotype hr~gal thermosensible Afin de disposer d'un virus qui posséde à la fois un phénotype ts et une substitution du géne hr par le géne de la S-galactosidase on a réalisé une infection mixte de cellules d'embryon de poulet avec le mutant W tsN7 et le virus W.TG.hrsga1.2131. Aprês infection avec 5 ufp par cellule de chaque virus les cellules ont été incubées à 33°C pendant un jour. Les cellules ont ensuite été congelées puis décongelées et le lysat titré sur cellules d'embryon de poulet à 33°C.
Aprés deux jours à 33°C les cellules infectées ont été colo-rées au rouge neutre puis transférées à 39,5°C pendant deux jours supplémentaires. Les plages de virus qui ne se sont pas agrandies pendant les deux derniers jours sont vraisemblable-ment des virus de type ts. Une quarantaine de ceux-ci ont été
repris, amplifiés puis criblés à la fois pour leur caractére ts et pour la capacité de former des plages bleues en présence de X-gal. Cinq recombinants ts~galhr ont été identifiés de cette maniére et l'un d'entre eux appelé W.TG.tssgalhr.l a été recloné et utilisé dans les expériences suivantes.
3° Construction d'un plasmide vecteur destiné à
l'intégration d'un géne quelconque dans le génome du virus de la vaccine en remplacement du géne hr Le géne hr du virus de la vaccine entouré de part et d'autre par ses séquences adjacentes naturelles a été cloné
dans le plasmide bactérien pUC7. Cette construction a été
appelée pBACD2. Dans ce plasmide, le géne hr a été modifié de façon à présenter à ses extrémités un site Xhol et un site BglII.
Le géne hr a été délété en coupant pBACD2 avec XhoI
et BglII puis le promoteur 7,5 Kd entouré par des sites Sali et BglII (provenant de M13TG2119) a été inséré â sa place. Le plasmide obtenu est appelé pTG2141. Dans ce plasmide, le pro-s moteur 7,5 Kd est orienté de la gauche vers la droite, selon la convention adoptée pour le génome du vi rus de la vacci ne.
Le mode d'intégration choisi a pour effet de supprimer le site Xhol en amont du promoteur et de conserver le site BglII en aval.
Le plasmide pTG2141 a ensuite été modifié afin de~
supprimer les sites EcoRl situés aux extrémités de la partie pUC7 . Ai nsi l' ADN plasmi di que de pTG2141 a été di géré par EcoRl en concentration limitante de façon â ne couper le plasmi de qu' une foi s. Le vecteur li néari sé a été i solé pui s traité par le fragment Klenow de l'ADN-polymérase en présence des quatre nucléosides triphosphates puis fermé â la ligase.
Aprés transformation de cellules d'E. coli un plasmide ne contenant plus qu'un site EcoRl a été isolé et celui-ci a subi le même traitement â l'enzyme EcoRl pour donner un nouveau plasmide sans site EcoRl, appelé pTG2141-EcoRl.
Ce dernier a été coupé par BglII pour y insérer un segment d'ADN adaptateur provenant du vecteur Poly II (13) qui est entouré par les sites BglII et BamHl ; cette construction est appelée pTG2147. Le vecteur pTG2147 comprend donc une régi on promoteur ( p7 , 5 Kd ) sui vi e d' une séri e de si tes de restri ction qui peuvent être uti li sés pour ajouter un géne quelconque. Les différentes étapes de la construction de ce vecteur sont schématisées dans la figure 9.
4° Intégration du géne F du virus de la rougeole en remplacement du géne hr dans le génome du virus de la vaccine Le plasmide pTG2147 a été ouvert avec les enzymes BglII et EcoRl pour y intégrer un fragment d'ADN, BglII-EcoRl provenant de pTG1173, codant pour la protéine F du virus de la rougeole. Le plasmide obtenu, pTG2148, a été employé pour substituer le géne de la ~-galactosidase dans le virus VV.TG.hr~ga1.2131 par le géne F du virus de la rougeole.
Pour cela, des cellules d'embryons de poulet ont été
infectées avec le virus W.TG.ts~galhr.l puis transfectées avec le plasmide pTG2148 et de l'ADN purifié du virus VV.TG.hr~ga1.2131 Aprés incubation des cellules pendant 48 heures â 39,5 °C, le virus non thermosensible issu de l'ex-périence a été étalé sur cellules d'embryons de poulet sous un milieu contenant de l'agar â 1 $. Deux jours plus tard du milieu contenant de l'agar et 60 mg par ml de X-gal a été
ajouté et les virus des plages qui n'ont pas donné de couleur bleue ont été repris et amplifiés.
Ces derniers proviennent vraisemblablement de la recombinaison du virus non thermosensible portant le géne de la ~-galactosidase avec le plasmide qui contient le géne F du virus de la rougeole. Un virus recombinant issu de cette ex-périence et appelé W.TG.FM2148 induit en effet la synthése de la protéine F dans les cellules infectées, selon les critéres d'immunofluorescence employés précédemment.
Exemple 10 Construction d'un recombinant du virus de la vaccine contenant les gênes codant pour les protéines HA et F du virus de la rougeole dans deux régi ons di sti nctes du génome, tk et hr.
On a sélectionné de nouveaux virus recombinants portant le géne HA â la place du géne vaccinal Tk et le géne F
â la place du géne vaccinal hr.
Des cellules d'embryons de poulet ont été coinfectées avec le virus W.TG.FM2148 et avec le virus VV.TG.HAM2-2.
Aprés 24 heures d'infection les cellules ont été congelées, décongelées puis le lysat étalé â différentes dilutions sur des cellules Ltk- en présence de 5' bromodésoxyuridine. Cette premiére étape permet de sélectionner les virus recombinants tk- ayant par conséquent conservé le géne HA intégré dans le géne tk.
Des cellules d'embryons de poulet ont été infectées avec les virus issus des plages isolées lors de cette étape.
Aprés deux jours d'incubation les cellules ont été colorées, avec du rouge neutre et les plages présentant un aspect caractéristique du phénotype hr ont été reprises et le virus amplifié par infection de cellules d'embryons de poulet.
L'un des nombreux virus recombinants isolés a été
retenu et appelé VV.TG.HA/tk.F/hr. Ce dernier induit la synthése de la protéine F et de la protéine HA, selon le critére d'immunofluorescence employé auparavant.
Exemple 11 Construction de deux recombinants du virus de la vaccine contenant le géne NP du virus de la rougeole et capables d'exprimer la protéine correspondante.
Une banque de cADN faite â partir de RNA de cellules Vero infectées avec le virus de la rougeole (souche Hallé) a été construite dans le vecteur pCD (2,3). Un cADN codant pour la nucléoprotéine (NP) a été sélectionné par hybridation â
l'aide d'un cADN homologue de celui décrit par Gorecki et Rosenblatt (14). Ce cADN codant pour la nucléoprotéine (NP), cloné dans le vecteur pCDl, donne le plasmide pCDNP.
La détermination de la séquence nucléotidique du géne NP de la souche Hallé met en évidence sa parenté étroite avec la séquence du géne NP d'un autre isolat du virus de la rougeole publiée par Rozenblatt et al. (15). Toutefois, on remarque un G supplémentaire â la position 1489 dans la séquence de Rozenblatt, également détecté par Cattaneo et al.
(16). Cette modification change le cadre de lecture publié
pour les 29 acides aminés â l'extrémité carboxy terminale.
Par ailleurs, la séquence â l'extrémité 5' du géne NP
qui n' a pas été publi ée auparavant a été déterrai née afi n de faciliter la mutagénése localisée décrite plus loin. Le cADN
codant pour la protéine NP (environ 1620 nucléotides) a été
excisé de pCDNP par les enzymes Pstl et Xbal puis inséré dans le vecteur M13TG131 ouvert par les mêmes enzymes pour donner le phage M13TG2124. Le cADN codant pour NP et porté par M13TG2124 a été modi fi é par mutagénése di ri gée â l' ai de de l'oligonucléotide .
CCTTAAAAGTGTGGCCATCTTAGATCTCCCTAATCCTGCTC
pour introduire un site BglII trois nucléotides en amont du premier codon du géne NP. Le géne NP ainsi modifié a été
excisé du phage muté, appelé M13TG2126, â l'aide du site BglII
nouvellement créé et d'un site EcoRl situé en 3' du géne NP.
Le fragment BglII-EcoRl codant pour NP a ensuite été
inséré en aval du promoteur 7,5 Kd porté par le vecteur pTG186 poly (13) préalablement coupé par BamHl et EcoRl ce qui donne le plasmi de pTG2139. L' uti li sati on, du si te Xbal pour les clonages décrits ci-dessus entraine une délétion d'un codon du géne NP et crée un géne de fusion dans lequel les 22 derniers codons proviennent en partie du vecteur M13 utilisé et en parti e du gêne tk du vi rus de la vacci ne.
Afin de réaliser une construction analogue â pTG2139 mais contenant un géne NP complet tout en étant dépourvu de codons d'une autre origine, la partie carboxy terminale du géne NP a été excisée de pCDNP par les enzymes Xbal et Hpal et le fragment obtenu a été inséré dans M13TG2126 coupé par Xbal et Smal pour donner M13TG2142. Puis le cADN complet codant pour NP a été sorti de M13TG2142 par BglII-EcoRl et intégré
dans pTG186po1y coupé par BamHl et EcoRl. Le plasmide issu de ce dernier clonage est appelé pTG3109. Les différentes étapes de la construction des vecteurs pTG2139 et pTG3109 sont schématisées dans la figure 10. , Le géne NP tronqué (plasmide pTG2139) ou complet (plasmide pTG3109) a été transféré dans le génome du virus de la vaccine selon la technique résumée dans l'exemple 3. Deux recombi nants du vi rus de la vacci ne i ssus de ces mani pula-tions ont été nommés respectivement W.TG.NP2139 et VV.TG.NP3109.
Pour vérifier qu'ils codent effectivement pour la protéine NP du virus de la rougeole, des cellules L de souris ont été infectées puis analysées 16 heures aprés par immunofluorescence avec un anticorps monoclonal anti NP. Cette réaction a permis de mettre en évidence la présence de l'antigéne NP aussi bien dans le cytoplasme que dans le noyau des cellules infectées avec les deux virus recombinants tandis que l'infection par la souche sauvage du virus de la vaccine ne donne lieu â aucune fluorescence spécifique.
La synthése de la protéine NP a également été mise en évi dence par la techni que d' i mmunopréci pi tati on sui vi e de l'analyse par électrophorése sur gel de polyacrylamide. Cette méthode a permis de montrer qu'une protéine d'environ 60 Kd, ce qui correspond â la taille attendue pour la protéine NP, est synthétisée dans les cellules infectées par le recombinant VV.TG.2139 (voir figure 11).
La scarification de souris BalbC avec 4.10 ufp du recombinant W.TG.2139 a induit la synthése d'anticorps capables d'immunoprécipiter la protéine NP de cellules infectées par le virus de la rougeole.
Dépôt de souches re~résentat:tves de l'invention Les souches suivantes ont été déposées â la Collec tion Natiovale de cultures de Microorganisures (25 Rue du Dr.
Roux, Pari s ) , le 3 avri 1 1987 5K/pTG1173 sous le n° I-654 5K/pTG1169 sous le n° I-657.
et le 17 jui n 1988 5K/pTG3109 sous le N° I-769.
REFERENCES
1) Appel, M.J.G., Shek, W.R., Shesberadoran, H. & Norrby, E.
Archives of Virology 82, 73-82 (1984).
2) Buckland, R., Gerald, C., Barker, R. & Wild, T.F. J. Gen.
Virol. 68, 1695-1703 (1987).
3) Gerald, C. , Bukland, R. , Barker, R. , Freemon, G. & Wi ld, T.F. J. Gen. Virol. 67 (1986).
4) Hall, W.W., Lamb, R.A. & Choppin, P.W. Virology 100, 433-449 (1980).
5) Imagawa, D.T. Prog. Med. Virol. vol. 10, pp. 160-193 ed.
Karger, Basel/New York (1968). 5 vaccine shots.
Measles sequence (HA measles) is indicated by an arc open with an arrow that gives the meaning of the translation of the uncomfortable. The large BamHI fragment in pCD-HA is the vector pCD
while in M13TG2101 and M13TG2106 the large BamHI fragment is the vector M13TG131. In step 3 the recombinant plasmid nant M13TG2107 is not shown. In the plasmid pTG11.69 the small HindIII fragment corresponds to pTGlH, the solid line to the HindIIIJ fragment of the vaccine virus interrupted in the gene TK and the large arrow corresponds to the promoter of the protein 7.5 Kd.
Figure 2. Construction of the vector allowing the transfer of cDNA encoding the F protein in the genome of vaccinia virus.
Measles sequence (F measles) is indicated by an arc open with an arrow that gives the meaning of the translation. The other annotations are identical to those used in the figure 1.
Figure 3. Synthetic measles virus HA and F proteins located in cells infected with recombinant vaccinia virus nantes and highlighted by immunofluorescence.
Panel A shows the membrane immunofluorescence obtained after infection of LTK- cells with the recombinant W.TG.HAM2-2 and reaction of an anti-HA monoclonal antibody followed by a fluorescein labeled anti-mouse antibody. The panel B shows the immunofluorescence observed after infection LTK- cells with the recombinant VV.TG.FM1173 and reaction an anti F monoclonal antibody followed by an anti fluorescein labeled mouse.
~ .. ~
Figure 4. Immunopreci pi tati on of HA and F proteins from the virus measles synthesized in cells infected with vac- c virus recombinants ci ne.
Autoradiography of the polyacrylamide gel on which they are immunoprecipitated tins have been deposited. The hemagglutinin (HA) is present in cells infected with W.TG.HAM2-2 while the fusion protein (FO) and its F1 and F2 cleavage products are present in cells infected with VV.TG.FM1173.
Figure 5. Construction of the vector allowing the transfer of cDNA encoding the F and HA protein in the genome vaccinia virus.
The annotations are identical to those used in the Figures 1 and 2.
Fi Bure 6. Immunopreci pi tati on of HA and F proteins from the virus measles synthesized in cells infected with the recombinant vv.TG.HAFM2122 encoding for both proteins.
Autoradiography of the polyacrylamide gel on which the pro-immunoprecipitated tins have been deposited. Extracts from cells infected with W.TG.FM1173 (column 1), W.TG.HAM2-2 (column 2) and W.TG.HAFM2122 (column 3) were immunopreci-pites with a polyclonal guinea pig serum. HA proteins, F0, F1 and F2 expected after infection with the recombinant W.TG.HAFM2122 appear distinctly in column 3.
Figure 7. Construction of a second vector allowing the transfer of cDNA encoding the F and HA protein in the genome of the vaccinia virus.
The measles virus sequences encoding the tines HA and F are represented by arcs of circles annotated HA and F. The genes are oriented according to the given direction by the arrows. The vaccinia virus P7.5 Kd promoter is shown diagrammatically by a thick arrow. The DNA region com-taken between HindIII sites corresponds to the bacterial vector pTGlH. Upstream and downstream of the bacterial vector are represented felt by a simple arc, the left part and the right part respectively of the HindIII J fragment of the virus the vaccine. The symbol B ° indicates the place where a BgIII site has was fused by li gati on to a si BamHI.
Figure 8. Construction of a vector allowing the transfer of the gene coding for E-galactosidase. coli to the place of the hr gene in the genome of the virus vaccinated.
The part corresponding to the bacterial vector pUC ~ is represented by an arc of a single line. The vaccinia virus DNA sequences located on either side on the other side of the BgIII site are represented by arcs of a circle or double line and correspond to the regions of the genome which code for proteins of 30 Kd and 50 Kd (on the left of the site BgIII) or 42 Kd (to the right of the BglII site). The gene coding for the ~ -galactosidase is annotated lake Z and its orientation is given with respect to the promoter P7.5 Kd. This last one is represented by a thick arrow. The symbol B ° indicates the location where a BglII site was ligated to a BamHI site.
Figure 9. Construction of a vector allowing the transfer gene coding for the F protein of the measles instead of the hr gene in the genome of vaccinia virus.
The annotations are the same as those used in the figure 8. The symbol E ° indicates the location of the vector where the EcoRl site has been deleted. The region between the site BglII and the EcoRl site of the vector pTG2147 corresponds to the seg-adapter. The embarrassment of measles coding for the pro-téine F is represented by an arc of a circle in double lines and annotated Measles F.
Figure 10. Construction of two vectors allowing the transfer of the gene coding for the NP protein of measles virus in the genome of the measles virus vaccinated.
In the plasmid pCD NP, the arcs of a single line represent the pCD part. In M13 annotated plasmids, the regions with the single line represent the part M13TG131.
The pTG plasmids are shown diagrammatically as in the figures preceding. Sites that have been destroyed by ligation are annotated B ° for the fusion of a BglII site to a BamHI site and Sma 1 ° for the fusion of a Smal site to a Hpal site. ' Figure 11. Demonstration of the NP protein in cells infected with the VV.TG.2139 virus.
BHK 21 hamster cell lysates infected with wild strain of vaccinia virus (annotated track T) or with isolates of the recombinant W.TG.2139 (annotated 1,2 and 3) were immunoprecipitated with a polyclonal guinea pig serum and analyzed by electrophoresis on polyacrylamide gel.
Autoradiography of the gel reveals the presence of an NP protein (60 Kd) only in samples of infected cells with the vi rus W.TG. 2139.
Example 1 Construction of a vector allowing the transfer cDNA encoding the HA protein in the genome vaccinia virus.
The cDNA encoding the HA protein of the Hallé strain was isolated and sequenced previously (3). In order to facilitate manipulation of the gene, the HA cDNA from the plasmid pCD HA was excised by the two BamHI sites which surround it and inserted into the vector M13TG131 (6) to give birth of the plasmid M13TG2101. A Pstl site has been introduced by mutagenesis located upstream of the coding part of the gene HA carried by the plasmid M13TG2101 using the oligonucleotide following synthetic otid.
GGGGGGGGAGGGCTGCAGATCATCCACAATG
The mutated plasmid was named M13TG2106. A Pstl- fragment BamHI containing the HA gene has been excised from M13TG2106 and integrated in the vector M13TG130 (6) previously cut by Pstl-BamHI to give rise to the plasmid M13TG2107. The sequence nucleotide of the mutated region of cDNA HA has been verified by the dideoxynucleotide method and then the HA DNA was excised of the vector M13TG2107 with the enzymes Pstl-EcoRI and inserted in downstream of the 7.5 Kd promoter of the transfer vector pTG186POLY
(French patent 84.06499) previously cut by enzymes Pstl-EcoRI to give rise to the plasmid pTG1169. The ensem-ble of these steps is shown schematically in Figure 1.
Example 2 Construction of a vector allowing the transfer cDNA encoding the F protein in the genome vaccinia virus.
The cDNA encoding the F protein of the Hallé strain was isolated and sequenced previously (2). In order to facilitate manipulation of the gene, the cDNA encoding the protein F was excised from the vector pCD F (2) using the BamHI zyme. This gives two fragments, one covering the part 5 'of the gene and the other covering the part 3' of the lo uncomfortable. The 5 'fragment was inserted into the vector M13TG131 previously cut with the BamHI enzyme to give the plasmid M13TG2103-5. The 3 ′ part was likewise integrated into the vector M13TG131 to give M13TG2103-3 '. An Nsil site has been introduced by mutagenesis located upstream of the co-dante of the F gene carried by the plasmid M13TG2103-5 'using the following synthetic oligonucleotide.
Ns i 1 AAGACTCATCCAATGCATATCATGGGTCTCAAG
The mutated plasmid was named M13TG2109. An Nsil fragment-BamHI containing the 5 'part of the F gene was excised from M13TG2109 and inserted downstream of the 7.5 Kd promoter of the vector transfer pTG186POLY previously cut by the enzymes Pstl-BamHI to give rise to the vector pTG1172. Part 3 ' gene F was excised from M13TG2103-3 'with the enzyme BamHI and inserted in the orientation which reconstructs the natural gene in pTG1172 previously cut by BamHI to give the vector pTG1173. All of these steps are shown schematically in fi Bure 2.
Example 3 Construction of a recombinant virus vaccine containing the HA gene of the rou-jail and able to express the corresponding protein ponding.
The gene coding for the HA protein contained in the plasmid pTG1169 has been transferred to the genome of the vaccine according to a conventional protocol previously described (short-French vet 84.06499). In short, embryo cells from chicken were infected with the heat-sensitive mutant of vaccinia virus ts N7 at 0.1 pfu per cell and incubated for two hours at 33 ° C (permissive temperature for the mutant). The cells were then transfected with a calcium phosphate precipitate containing 1 ~, g of DNA
of the wild strain of vaccinia virus and 100 ng of plas-mide pTG1169. After one hour of incubation at room temperature 1,341 33 1 ante, fresh culture medium was added to the cells without removing the precipitate and the incubation was continued for two hours at a temperature of 39.5 ° C (temperature not permissive for the mutant). At the end of this period the medium containing the precipitate was removed and replaced during for one minute with a culture medium containing 10 ~ of glycerol. Finally the cells were washed twice with PBS then incubated for two days at 39.5 ° in a medium of normal culture. Recombinant viruses, thymidine kinase nega-tif were then selected, from the non-ther-mosensible produced in the previous transfection. To reserve alise this step the infected chicken cells and trans-affected in the manner described above were lysed by freezing then sonication and the virus they contain titrated on LTK- cells in the presence of 100 wg / ml of bromodéso-xyuridine and under a layer of agarose 1 ~. Beaches of TK- viruses have been taken up and the virus they contain has been amplified on fresh embryonic cell cultures of chicken. The virus stocks thus obtained were analyzed for their ability to synthesize HA protein, either by an immunofluorescence technique, either by a technique immunoprecipitation.
For immunofluorescence of LTK- cells were infected with the recombinant virus at a rate of approximately one pfu per cell for 15 hours. The infected cells have then fixed with acetone, rehydrated with PBS and then incubated opened for half an hour with a monoclonal antibody mouse against the HA protein of the measles virus and diluted 1 / 200th. After washing with PBS to remove the antibody not fixed, the cells were incubated in the presence of anti anti-mouse body labeled with fluorescein and diluted 1 / 100th.
After further washes to remove the labeled antibody and fixed specifically, the samples are observed at mid fluorescence croscope. The photo in Figure 3 shows that cells infected with the recombinant isolated above exhibit characteristic fluorescence of infected cells measles virus while the cells infected with wild vaccinia virus do not have this fluorescence. One of the vaccinia virus recombinants able to synthesize the HA protein has been chosen and named VV.TG.HAM2-2. To make sure it didn't contain any mi nati on by another non-recombinant vi i i 1 has been puri fi ed once again by isolating an infectious area and amplification on chicken embryo cells.
In order to confirm the synthesis of the HA protein of a expected size, BHK21 cells were infected at a rate about 0.1 pfu per cell for 15 hours then incubated in a medium devoid of normal methionine but containing radioactive sulfur-labeled methionine 35. After about three hours of labeling, the infected cells were lysed in immunoprecipitation buffer and the HA protein immuno-precipitated with a polyclonal guinea pig antibody directed be the proteins of the measles virus, in the presence of protein A of Staphylococcus aureus attached to sepharose. The immunoprecipitated proteins were analyzed on a gel polyacrylamide in the presence of SDS. The dried gel is subjected to autoradiography. The results (Figure 4) show that the recombinant from the VV vaccine. TG. HAM2-2 i ndui t la synthesizes a protein the same size as the HA protein authentic measles virus.
Example 4 Construction of a recombinant virus vaccinia containing the gene encoding the protein F of the measles virus.
The gene encoding the F protein carried by the plas-mide pTG1173 has been transferred to the genome of the vaccine according to the same protocol as that described in example ple 3 for the HA gene. So a vii recombi nant called W.TG.FM1173 has been isolated. In order to confirm that this recombinant induces the synthesis of protein F, BHK21 cells have 1,341 33 1 been infected with approximately 0.1 pfu per cell for 15 hours then if ncubated in a mi li had devoid of methi oni do normal but containing radioactive methionine labeled with 355, After four hours of labeling, the infected cells were lysed in immunoprecipitation buffer and the protein F immunoprecipitated with a polyclonal antibody to guinea pig against the proteins of the measles virus, in Presence of Staphylococcus aureus protein A attached to sepharose.
The immunoprecipitated proteins were analyzed on polyacrylamide gel in the presence of SDS. The dried gel is subject to autoradiography. The results (Figure 4) show that the recombinant VV.TG.FM1173 induces the synthesis of pro-FO tine corresponding to the initial product of the translation of the gene F and proteolytic cleavage products F1 and F2 which appear naturally in red infection the. Proteins F0, F1 and F2 have the expected size for authentic measles virus proteins. In order to my-trer that these proteins are associated with the membrane of the This cell is infected as during infection by the virus of the measles, LTK- cells were infected with the recombi-nant VV.TG.FM1173 at the rate of approximately one pfu per cell during at 3 p.m. The infected cells were then fixed with acetone, rehydrated with PBS and then incubated for one half hour with mouse monoclonal antibody directed be the F proteins of the measles virus and diluted with 1 / 100th. After washing with PBS, the cells were incubated in presence of anti-mouse antibodies labeled with fluorescein and diluted 1 / 100th. After further washes to remove the an-tibody marked and fixed specifically, the samples are observed under a fluorescence microscope. The photo of figure 3 shows that cells infected with the recombinant W.TG.FM1173 exhibit a characteristic membrane fluorescence of cells infected with the measles virus while cells infected with vaccinia virus wild type show no fluorescence.
1,341 33 1 Example 5 Vaccination of Mice with the Recombinant W.TG.HAM2-2.
4-5 week old Balb C mice were vaccinated by tail scarification with 4 10 ~ pfu virus, either of the recombinant W.TG.HAM2-2, or of the virus W
wild. Three weeks after inoculation of the blood was sampled from animals and the level of capa-to inhibit the hemagglutinating activity of the virus and capable to neutralize the virus in vitro. Table 1 shows that the most mice vaccinated with VV.TG.HAM2-2 have both anti-haemagglutinating antibodies and anti-neutralizing bodies. Three weeks after vaccination one Test inoculation was administered to the animals. each mouse received 50 ~ 1 of a suspension diluted to $ 10 from one mouse calf previously infected with a strain of rou-neuroadapted jail (11). The animals were monitored during for a month. Table 2 shows that the vaccinated mice with the strain VV.TG.HAM2-2 are protected while the other animals succumb to challenge inoculation.
EXAMPLE 6 Vaccination of Mice with the Recombinant VV. TG. FM117 3.
Five-week-old female Balb C mice were been vaccinated by tail scarification with 4.10 pfu of vi rus, it is the recombinant VV. TG. FM117 3, so far from W
wild. Twenty five days after inoculation, blood was sampled from animals and the level of capa-to neutralize the virus in vitro. Table 3 shows that most mice vaccinated with VV.TG.FM1173 have neutralizing antibodies. The day of the blood sample the mice were inoculated intracerebrally with a Viral neuroadapted strain of the measles virus. Each mouse receives 50 wl of a diluted suspension at 10 $ from a cer mouse calf previously infected with the virulent strain neuroadaptée. The animals are monitored for one month.
Only mice vaccinated with the W.TG.FM1173 strain are protected against challenge inoculation (Table 2).
Table 1 Immunization of mice by inoculation of the virus recombinant W.TG.HAM2-2.
female mice antibody antibody anti-hmagglutinin neutralizers 1,320 1,280 2 g0 160 3,160 80 g 40 40 g 160 160 ' male mice 1,160 80 2,160 80 3,160,320 4,160,320 5 g0 640 160,320 160,320 g 160 160 4p 80 Securities are expressed in reciprocal of the most diluted elevated serum which gave complete neutralization of 50 measles virus pfu or total inhibition of hemagglutinating activity. Unvaccinated mouse sera or vaccinated with the wild W strain gave a titer anti-hemagglutinin antibody lower than 20 and a titer neutralizing antibodies less than 40.
Table 2 Protection of mice.
Experience experience vi rus uti li W not VV
s for wild VV.TG.HAM2-2 from wild VV.TG, FM1173 vacci na- vi rus tion number of ani 12 19 9 3 22 ill i noculs number*
lowing * Three weeks after vaccination, the mice were proven with an SSPE strain of measles suitable for mouse. Deaths in the first three days have not been counted in the results because they are attributed to trauma to the inoculation pathway.
Table 3 Immunization of mice by inoculation of the virus recombinant VV.TG.FM1173.
Female mice Neutralizing antibodies 1,160 2,160 4,320 7,160 8 80 ' 19,320 21,160 Securities are expressed in reciprocal of the most diluted elevated serum which gave complete neutralization of 50 measles virus pfu. Unvaccinated mouse sera born or vaccinated with the wild strain gave a title neutralizing antibodies less than 40.
EXAMPLE 7 Construction of a Vacuum Virus Recombinant cine containing the genes coding for the protein F and for the HA protein of the measles virus.
A recombinant plasmid allowing the transfer if-of HA and F genes in the vaccine virus genome was built in the following way (illustrated in the figure 5). the 7.5 Kd promoter was excised from the vector M13TG2119 by partial digestion with the enzyme BgIII and di-complete management with EcoRI. The BglII-EcoRI fragment as well obtained was inserted into the plasmid pTG1169 beforehand cut by BamHI and EcoRI. In this way a new plasmid was isolated and named pTG2121.
In this construction, the HA gene is followed in 3 ' by the promoter 7.5 Kd oriented in the same direction of trans-cription as the HA annoyance.
Plasmid pTG2121 was opened downstream of the second 7.5 Kd promoter with the enzymes BamHI and EcoRI to insert therein gene F, excised from plasmid pTG1173 by enzymes BglII and EcoRI; the new plasmid is called pTG2122. So the plasmid pTG2122 corresponds to the plasmid pTG186POLY in which have been inserted the HA and F genes, each being placed under the control of a 7.5 Kd promoter. The whole was transferred into the genome of the vaccinia virus according to the pro-tocole described in example 3. A recombinant virus (VV.TG.HAFM2122) capable of inducing the synthesis of the protein HA and F protein was isolated and characterized by immuno-fluorescence and i mmunopréci pi tati on as described in the examples 3 and 4 (see fi gure 6 for i mmunopréci pi tati on).
Example 8 Construction of a Second Recombinant Virus vaccine containing the genes encoding for F protein and for HA protein of the measles.
The recombinant VV.TG.HAFM2122 was found to be unstable.
Indeed, the analysis of the viral population resulting from cloning of the recombinant showed that while 100 ~ of them always code for F protein, only 50 ~ code for 10 HA protein. Successive cloning of the same type starting always of a viral clone coding for the two proteins a ' gave identical results. It is likely that the pre-sence of the 7.5 Kd promoter in direct repetition allows the deletion of the gene (the HA gene in this case) which is framed 15 by repetition.
In order to generate a recombinant encoding the stable HA and F proteins, the two promoters 7.5 Kd were placed in reverse repeat so that 20 that any recombination would give rise to a viral genome truncated, not viable. This therefore constitutes a system of selection against deletion of the HA gene and ensures stability recombinant virus.
The constructions were carried out in the manner next. First a second promoter 7.5 Kd was added to plasmid pTG1169. The promoter was excised from M13TG2119 by cutting it partially with BglII
and complemented by BamHI. The DNA fragment containing the promoter cut by BglII upstream and by BamHI downstream has was isolated and linked to the plasmid pTG1169 previously cut by BamHI and phosphatase treated.
~, ~ .. ..
After transformation of E. coli bacteria with mixture of li gati on, a plasmi of pTG2130 was i solved in which the second promoter 7.5 Kd is in the direction of transcription opposite to the first. The end coding for N-terminal part of the F protein was then excised from pTG1173 by the enzymes BglII and BamHI and inserted into the vector pTG2130 previously cut with BamHI and dephospho-Ryle. This gives rise to the plasmid pTG2133.
In order to add the terminal C part of the F gene it has proved necessary to delete the poly end beforehand To who was in the original DNA and had been transferred linked to the vector M13TG2103 3 '. To do this, a mutagenic localized with the oligonucleotide 5 '.AATTATCTCCGGCTTAGATCTGGCCGAACAATATCGG
was performed to introduce a BglII site at 246 nucleotides downstream of the BamHI site located in the F gene.
mutated phage M13 called M13TG2143 served as the source of a frag-BamHI-BglII encoding the terminal C sequence of the gene F. This was inserted into the plasmid pTG2133 cut to beforehand with BamHI then dephosphorylated. The recombinant plasmid nant obtained named pTG3115 includes the HA and F gene placed in opposite directions to each other, each being controlled by a promoter p7.5 Kd also opposite one with respect to â
the other. All the manipulations performed for constructing the plasmid pTG3115 is summarized in FIG. 7.
The transfer of the sequences described above in the genome of the vaccinia virus was carried out according to the methods previously described and a virus called W.TG.HAFM3115 has been isolated. This recombinant virus codes for the HA proteins and F according to the immunofluorescence criteria and immunoprecipitation used above and by links i 1 has a phe-notype (expression of HA and F proteins) stable after successive cloning.
Example 9 Construction of a recombinant virus vaccine coding for protein F of the virus of the measles replacing hr gene Previous work (12) has shown that the virus de la vacci does not have a gene, called hr gene, which. East necessary for viral multiplication on certain types ori gi ne human cells may not. sn 'est pas i ndi spensable on other cell types (chicken embryo cells, hamster BHK21 cells, mouse L cells). These results states indicate hr gene could be deleted and replaced by another gene.
The gene that codes for the F protein of the measles has been integrated instead of the hr gene so next 1 ° Integration of the ~ galactosidase gene into the place of the hr gene in the genome of the vaccinia virus.
First, a plasmid was constructed in which the hr gene is replaced by an expression block including the promoter p7.5 Kd followed by the gene of ~ -galac-tosidase. The viral DNA that is found upstream and downstream of the hr gene (the latter having been deleted) was introduced in the vector pUC7 to give pBACl. The unique BglII site of this plasmid corresponds to the site where the hr gene was located.
The plasmid pBACl was opened by BglII and a BglII-BamHI fragment from pTG1174 and containing the gene of S galactosidase was inserted therein so that the sense of embarrassment reading either from left to right compared to the conventional sense of the viral genome. The plasmid obtained, pTG2128 was opened at the single BglII site upstream of the discomfort of ~ -galactosidase and the p7.5 Kd promoter contained on a BglII-BglII DNA fragment from M13TG2119 was inserted integrated in the direction allowing the transcription of the S gene galactosidase. The plasmid from this ligation is called pTG2131; the stages of its construction are schematically shown in figure 8.
Chicken embryo cells infected with by the vaccinia virus tsN7 mutant were simultaneously transfected with wild-type virus DNA
and by the DNA of pTG2131. Non-heat-sensitive viruses from of this experiment were spread on embryo cells from chicken for beach formation under a layer of medium containing $ 1 agar. Two days later, add a second layer of medium containing agar and 60 mg per ml of X-Gal (5-bromo-4chloro-3indoly- ~ -D-galactopyranoside).
This technique makes it possible to recognize the blue beaches holding the virus which has integrated and which expresses the discomfort of S-galactosidase.
Among the many recognized recombinant viruses of this way a beach was isolated and the virus was recloned then amplified and called W.TG.hrsga1.2131. The study of its host spectrum across multiple cell types shows that it does not multiply on rabbit RK13 cells or on human cells 143B tk-. This phenotype corresponds to what we are waiting for a virus that has lost the hr discomfort. On the other hand the W.TG.hr ~ ga1.2131 virus is still capable of multiply on human HepII cells.
2 ° Construction of a virus of phenotype hr ~ gal thermal In order to have a virus that has both a phenotype ts and a substitution of the hr gene with the S-galactosidase we carried out a mixed infection of cells chicken embryo with W mutant tsN7 and virus W.TG.hrsga1.2131. After infection with 5 pfu per cell each virus the cells were incubated at 33 ° C for one day. The cells were then frozen and then thawed and the titrated lysate on chicken embryo cells at 33 ° C.
After two days at 33 ° C the infected cells were colo-neutral red then transferred to 39.5 ° C for two additional days. The virus ranges that have not enlarged in the last two days are likely-ts type viruses. Forty of these were taken up, amplified then screened at the same time for their character ts and for the capacity to form blue areas in the presence from X-gal. Five ts ~ galhr recombinants have been identified from this way and one of them called W.TG.tssgalhr.la was recloned and used in the following experiments.
3 ° Construction of a vector plasmid intended for the integration of any gene into the genome of the virus the vaccine to replace the hr gene The vaccinia virus hr gene surrounded by hand and else by its natural adjacent sequences has been cloned in the bacterial plasmid pUC7. This construction was called pBACD2. In this plasmid, the hr gene has been modified from so as to present at its ends an Xhol site and a site BglII.
The hr gene was deleted by cutting pBACD2 with XhoI
and BglII then the promoter 7.5 Kd surrounded by Sali sites and BglII (from M13TG2119) was inserted in its place. The plasmid obtained is called pTG2141. In this plasmid, the pro-s 7.5 Kd motor is oriented from left to right, depending on the convention adopted for the vaccine genome.
The mode of integration chosen has the effect of deleting the site Xhol upstream of the promoter and to keep the BglII site in downstream.
The plasmid pTG2141 was then modified in order to ~
delete EcoRl sites located at the ends of the game pUC7. So the plasmi DNA of pTG2141 was managed by EcoRl in limiting concentration so as not to cut the plasmi of that one faith s. The vector li néari sé was i solé pui s treated with the Klenow fragment of DNA polymerase in the presence of the four nucleoside triphosphates and then closed with ligase.
After transformation of E. cells. coli a plasmid does containing more than one EcoRl site has been isolated and this site has undergone the same treatment with the EcoRl enzyme to give a new plasmid without EcoRl site, called pTG2141-EcoRl.
The latter was cut by BglII to insert a adapter DNA segment from the Poly II vector (13) which is surrounded by the BglII and BamHI sites; this construction is called pTG2147. The vector pTG2147 therefore comprises a promoter regi on (p7, 5 Kd) followed by a series of restri ction that can be used to add a gene any. The different stages of the construction of this vector are shown schematically in Figure 9.
4 ° Integration of gene F of the measles virus into replacement of the hr gene in the genome of the vaccinia virus Plasmid pTG2147 was opened with enzymes BglII and EcoRl to integrate a DNA fragment, BglII-EcoRl from pTG1173, encoding the F protein of the measles. The plasmid obtained, pTG2148, was used to substitute the gene for ~ -galactosidase in the virus VV.TG.hr ~ ga1.2131 by gene F of the measles virus.
For this, chicken embryo cells were infected with the W.TG.ts ~ galhr.l virus and then transfected with plasmid pTG2148 and DNA purified from the virus VV.TG.hr ~ ga1.2131 After incubation of the cells for 48 hours at 39.5 ° C, the non-heat-sensitive virus from the former perience was spread on chicken embryo cells under a medium containing $ 1 agar. Two days later from medium containing agar and 60 mg per ml of X-gal was added and beach viruses that did not give color blue were taken over and amplified.
The latter probably come from the recombination of the non-heat-sensitive virus carrying the gene ~ -galactosidase with the plasmid which contains the F gene of measles virus. A recombinant virus from this ex-perience and called W.TG.FM2148 indeed induces the synthesis of protein F in infected cells, according to criteria previously used immunofluorescence tests.
Example 10 Construction of a recombinant virus vaccine containing the genes coding for measles virus HA and F proteins in two di i sti nct regions of the genome, tk and hr.
New recombinant viruses have been selected carrying the HA gene in place of the Tk vaccine gene and the F gene in place of the vaccine gene hr.
Chicken embryo cells have been coinfected with the W.TG.FM2148 virus and with the VV.TG.HAM2-2 virus.
After 24 hours of infection the cells were frozen, thawed then the lysate spread at different dilutions on Ltk- cells in the presence of 5 'bromodeoxyuridine. This first step selects the recombinant viruses tk- having therefore retained the HA gene integrated in the gene tk.
Chicken embryo cells have been infected with viruses from the beaches isolated during this step.
After two days of incubation the cells were stained, with neutral red and areas with an aspect characteristic of the hr phenotype have been taken up and the virus amplified by infection of chicken embryo cells.
One of the many recombinant viruses isolated has been retained and called VV.TG.HA / tk.F / hr. The latter induces synthesizes F protein and HA protein, depending on the previously used immunofluorescence test.
Example 11 Construction of two recombinant virus of the vaccine containing the NP gene for the virus measles and able to express protein corresponding.
A cDNA library made from cell RNA
Vero infected with measles virus (Hallé strain) a was constructed in the vector pCD (2,3). A DNA coding for the nucleoprotein (NP) was selected by hybridization â
using a cDNA homologous to that described by Gorecki and Rosenblatt (14). This cDNA coding for nucleoprotein (NP), cloned into the vector pCDl, gives the plasmid pCDNP.
Determination of the nucleotide sequence of the gene NP of the Hallé strain highlights its close relationship with the NP gene sequence of another HPV isolate measles published by Rozenblatt et al. (15). However, we notice an additional G at position 1489 in the Rozenblatt sequence, also detected by Cattaneo et al.
(16). This modification changes the reading frame published for the 29 amino acids at the carboxy terminus.
Furthermore, the sequence at the 5 'end of the NP gene which has not been previously published was unearthed in order to facilitate the localized mutagenesis described below. CDNA
coding for the NP protein (approximately 1620 nucleotides) has been excised from pCDNP by the enzymes Pstl and Xbal then inserted into the vector M13TG131 opened by the same enzymes to give phage M13TG2124. The cDNA coding for NP and carried by M13TG2124 has been modified by mutagenesis di ri ged with de the oligonucleotide.
CCTTAAAAGTGTGGCCATCTTAGATCTCCCTAATCCTGCTC
to introduce a BglII site three nucleotides upstream of the first codon of the NP gene. The NP gene thus modified has been excised from the mutated phage, called M13TG2126, using the BglII site newly created and an EcoRl site located 3 'from the NP gene.
The BglII-EcoRl fragment coding for NP was then inserted downstream of the 7.5 Kd promoter carried by the vector pTG186 poly (13) previously cut with BamHl and EcoRl which gives the plasmi of pTG2139. The uti li sati on, of the Xbal site for cloning described above results in a deletion of a codon from the NP gene and creates a fusion gene in which the last 22 codons come in part from the vector M13 used and in part of the tk discomfort of the vaccine virus.
1,341 33 1 In order to achieve a construction analogous to pTG2139 but containing a complete NP gene while being devoid of codons from another origin, the terminal carboxy part of gene NP was excised from pCDNP by the enzymes Xbal and Hpal and the fragment obtained was inserted into M13TG2126 cut by Xbal and Smal to give M13TG2142. Then the full cDNA encoding for NP was released from M13TG2142 by BglII-EcoRl and integrated in pTG186po1y cut with BamHI and EcoRI. The plasmid from this latter cloning is called pTG3109. The different steps of the construction of the vectors pTG2139 and pTG3109 are shown schematically in Figure 10., The truncated NP gene (plasmid pTG2139) or complete (plasmid pTG3109) has been transferred to the virus genome the vaccine according to the technique summarized in Example 3. Two recombinants of the vaccine virus i ssus of these mani pula-tions were named respectively W.TG.NP2139 and VV.TG.NP3109.
To verify that they actually code for the NP protein from measles virus, mouse L cells were infected and then analyzed 16 hours later by immunofluorescence with an anti NP monoclonal antibody. This reaction made it possible to highlight the presence of the NP antigen both in the cytoplasm and in the nucleus cells infected with the two recombinant viruses while that infection with the wild strain of vaccinia virus does not give rise to any specific fluorescence.
The synthesis of the NP protein has also been implemented.
evi dence by the i munopreci pi tati on technique followed by analysis by electrophoresis on polyacrylamide gel. This method has shown that a protein of around 60 Kd, which corresponds to the expected size for the NP protein, is synthesized in cells infected with the recombinant VV.TG.2139 (see Figure 11).
Scarification of BalbC mice with 4.10 pfu of recombinant W.TG.2139 induced antibody synthesis capable of immunoprecipitating NP protein from cells infected with the measles virus.
Deposit of re ~ resentat strains: tves of the invention The following strains have been deposited at Collec Natiovale of Microorganisures cultures (25 Rue du Dr.
Roux, Pari s), 3 Apr 1 1987 5K / pTG1173 under n ° I-654 5K / pTG1169 under No. I-657.
and on June 17, 1988 5K / pTG3109 under No. I-769.
REFERENCES
1) Appel, MJG, Shek, WR, Shesberadoran, H. & Norrby, E.
Archives of Virology 82, 73-82 (1984).
2) Buckland, R., Gerald, C., Barker, R. & Wild, TFJ Gen.
Virol. 68, 1695-1703 (1987).
3) Gerald, C., Bukland, R., Barker, R., Freemon, G. & Wi ld, TFJ Gen. Virol. 67 (1986).
4) Hall, WW, Lamb, RA & Choppin, PW Virology 100, 433-449 (1980).
5) Imagawa, DT Prog. Med. Virol. flight. 10, pp. 160-193 ed.
Karger, Basel / New York (1968).
6) Kieny, M.P., Lathe, R. & Lecocq, J.P. Gene 26, 91-99 (1983). 6) Kieny, MP, Lathe, R. & Lecocq, JP Gene 26, 91-99 (1983).
7) Norrby, E. Measles in Virology ed. B.N. Fields et al.
Raven Press, New York, 55, 1305-1321 (1985) 7) Norrby, E. Measles in Virology ed. BN Fields et al.
Raven Press, New York, 55, 1305-1321 (1985)
8) Norrby, E., Sheshberodaran, H., Mc Cullough, K.C., Carpenter, W.C. & Orvell, C. Intervirology 23, 228-232 ( 1985) . 8) Norrby, E., Sheshberodaran, H., Mc Cullough, KC, Carpenter, WC & Orvell, C. Intervirology 23, 228-232 (1985).
9) Orvell, C. & Norrby, E. J. Gen. Virol. 50, 231-245 (1980). 9) Orvell, C. & Norrby, EJ Gen. Virol. 50, 231-245 (1980).
10) Varsanyi, T., Joinvall, H., Orvell, C. and Norrby, E.
Virology 157, 241-244 (1987). 10) Varsanyi, T., Joinvall, H., Orvell, C. and Norrby, E.
Virology 157, 241-244 (1987).
11) Wild, T.F., Giraudon, P., Bernard, A. & Huppert, J. J.
Med. Virol. 4, 103-114 (1979). 11) Wild, TF, Giraudon, P., Bernard, A. & Huppert, JJ
Med. Virol. 4, 103-114 (1979).
12) Gi llard, S. , Spehner, D. , Dri lli en, R. and Ki rn, Proc.
Natl. Acad. Sci - USA, 83, 5573-5577 ( 1986) 12) Gi llard, S., Spehner, D., Dri lli en, R. and Ki rn, Proc.
Natl. Acad. Sci - USA, 83, 5573-5577 (1986)
13) Lathe, R., Vilotte, J.L., Clarck, A.J. Gene 57, 193-201 (1987) 13) Lathe, R., Vilotte, JL, Clarck, AJ Gene 57, 193-201 (1987)
14) Gorecki, M., Rosenblatt. Proc. Natl. Acad. Sci - USA, 77, 3686-3690 (1980) 14) Gorecki, M., Rosenblatt. Proc. Natl. Acad. Sci - USA, 77, 3686-3690 (1980)
15) Rozenblatt, S., Eizenberg, O., Ben-Levy, R., Lavie, V. and Belli ni, W.J. J. Virol. 53, 684-690 (1985) 15) Rozenblatt, S., Eizenberg, O., Ben-Levy, R., Lavie, V. and Belli ni, WJJ Virol. 53, 684-690 (1985)
16) Cattaneo, R. , Schmid, A. , Bi lleter, M.A. , Sheppard, R.D.
and Udem, S.A. J. Virol. 62, 1388-1397 (1988) 16) Cattaneo, R., Schmid, A., Bi lleter, MA, Sheppard, RD
and Udem, SAJ Virol. 62, 1388-1397 (1988)
Claims (8)
9. ADN recombinant correspondent au poxvirus selon l'une des revendications 1 à 8.
10. Cellule de mammifère infectée par le poxvirus selon l'une des revendications 1 à 8.
11. Procédé de préparation de tout ou partie d'une protéine de structure d'un Morbillivirus, caractérisé en ce qu'on cultive des cellules selon la revendication 10 et en ce que l'on récupère ladite protéine de structure.
12. Vaccin caractérisé en ce qu'il contient un Poxvirus selon l'une des revendications 1 à 8 et/ou des protéines de structure de Morbillivirus et la protéine hémagglutinante HA
d'une Morbillivirus seuls ou en combinaison et/ou un Poxvirus recombinant caractérisé en ce qu'il comporte, dans une ou plusieurs parties non essentielles de son génome, au moins une séquence d'ADN codant pour tout ou partie d'au moins une protéine hémagglutinante HA d'un Morbillivirus ainsi que ses éléments assurant l'expression de ladite protéine.
13. Vaccin selon la revendication 12, caractérisé en ce que le Poxvirus est vivant.
14. Vaccin selon la revendication 12, caractérisé en ce que le Poxvirus est inactivé.
15. Vaccin selon l'une des revendications 12 à 14, caractérisé en ce que le Poxvirus est le virus de la vaccine.
16. Vaccin selon la revendication 15, caractérisé en ce que la séquence d'ADN est sous le contrôle d'un promoteur de la vaccine.
17. Vaccin selon la revendication 16, caractérisé en ce que le promoteur de la vaccine est le promoteur 7,5 Kd de la vaccine.
18. Vaccin selon la revendication 17, caractérisé en ce que la ou les séquence(s) d'ADN sont clonées dans le gène TK de la vaccine.
19. Vaccin selon la revendication 17, caractérisé en ce que la ou les séquence(s) d'ADN sont clonées dans le gène hr de la vaccine.
20. Vaccin selon la revendication 17, caractérisé en ce qu'il comporte au moins deux séquences d'ADN codant pour tout ou partie d'une protéine de structure d'un Morbillivirus, ces séquences étant intégrées dans deux régions ou génome choisies parmi les gènes TK et hr.
Les réalisations de l'invention, au sujet desquelles un droit exclusif de propriété ou de privilège est revendiqué, sont définies comme suit: or part of a structural protein of a Morbillivirus, these sequences being integrated into two regions of the genome chosen from the TK and hr genes.
9. Recombinant DNA corresponds to the poxvirus according to one of claims 1 to 8.
10. Mammalian cell infected with poxvirus according to one of claims 1 to 8.
11. Process for the preparation of all or part of a protein structure of a Morbillivirus, characterized in that cultivates cells according to claim 10 and in that said structural protein is recovered.
12. Vaccine characterized in that it contains a Poxvirus according to one of claims 1 to 8 and / or proteins of Morbillivirus structure and the haemagglutinating protein HA
a Morbillivirus alone or in combination and / or a Poxvirus recombinant characterized in that it comprises, in one or several non-essential parts of its genome, at least a DNA sequence encoding all or part of at least one HA hemagglutinating protein of a Morbillivirus and its elements ensuring the expression of said protein.
13. Vaccine according to claim 12, characterized in that the Poxvirus is alive.
14. Vaccine according to claim 12, characterized in that the Poxvirus is inactivated.
15. Vaccine according to one of claims 12 to 14, characterized in that the Poxvirus is the vaccinia virus.
16. Vaccine according to claim 15, characterized in that the DNA sequence is under the control of a promoter of the vaccinated.
17. Vaccine according to claim 16, characterized in that the vaccinia promoter is the 7.5 Kd promoter of the vaccinated.
18. Vaccine according to claim 17, characterized in that the DNA sequence (s) are cloned into the TK gene of the vaccine.
19. Vaccine according to claim 17, characterized in that the DNA sequence (s) are cloned into the hr gene of the vaccine.
20. Vaccine according to claim 17, characterized in that that it contains at least two DNA sequences coding for all or part of a structural protein of a Morbillivirus, these sequences being integrated into two regions or genome chosen from the TK and hr genes.
The realizations of the invention, about which a right exclusive ownership or lien is claimed, are defined as follows:
en ce qu'il s'agit du virus de la vaccine. 3. Poxvirus according to claim 1 or 2, characterized in that it is the vaccinia virus.
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