BRPI9810844B1 - dispositivo de ensaio para detectar microorganismos em uma amostra líquida, e, processo para conduzir um número de análises mais provável - Google Patents

Abstract

"dispositivo de ensaio para detectar microrganismos em uma amostra líquida, e, processo para conduzir um número de análises mais provável". é descrito um processo para detectar um microorganismo em uma amostra de teste. o processo envolve distribuir microvolumes de 0,01 a 25 microlitros de uma amostra a uma pluralidade de microcompartimentos de um dispositivo de cultura, incubar por um tempo suficiente para permitir pelo menos um ciclo de divisão celular do microorganismo, então detectar a presença ou ausência do microorganismo nos microcompartimentos. são igualmente apresentados dispositivos para realizar estes processos.

Description

"DISPOSITIVO DE ENSAIO PARA DETECTAR MICRORGANISMOS EM UMA AMOSTRA LÍQUIDA, E, PROCESSO PARA CONDUZIR UM NÚMERO DE ANÁLISES MAIS PROVÁVEL".

Este pedido é uma continuação parcial do Pedido n£ 08/838.552, depositado em 9 de abril de 1997.

Esta invenção diz respeito a processos e dispositivos que usam compartimentos de microvolumes para efetuar a rápida e precisa detecção e enumeração de microorganismos. A detecção e enumeração de microorganismos é praticada em numerosos ambientes, incluindo a indústria produtora de alimentos (testes quanto à contaminação de alimentos por microorganismos, tais como o E. coli e o S. aureus), a indústria de cuidados sanitários (testes de amostras de pacientes e outras amostras clínicas quanto à infecção ou contaminação), a indústria de testes ambientais, a indústria farmacêutica e a indústria de cosméticos. A detecção e a enumeração com base no desenvolvimento dos microorganismos é comumente praticada usando-se ou meios nutrientes líquidos [análise do número mais provável (MPN)] ou meios nutrientes semi-sólidos (uso de contagem direta, por exemplo as placas de Petri de agar). A enumeração usando-se no processo de MPN líquido é tipicamente obtida pela colocação de diluições décuplas em série de uma amostra de interesse em conjuntos de réplicas de tubos contendo meios seletivos e indicadores químicos. Os tubos são incubados em temperatura elevada (24 a 48 horas), seguido por exame quanto ao desenvolvimento de organismos, Uma fórmula estatística, com base no número de tubos positivos e negativos para cada conjunto, é usada para estimar o número de organismos presentes na amostra inicial.

Este processo de realizar a análise de MPN tem várias desvantagens. Ele é laborioso por causa das múltiplas etapas de diluições e de pipetagens necessárias para realizar a análise. Além disso, é apenas prático usar conjuntos de replicação de cerca de três a cinco tubos de cada diluição. Como resultado, os 95% de limites de confiança para uma estimativa de MPN quanto à concentração microbiana, são extremamente amplos, Por exemplo, uma estimativa de MPN de três tubos de 20 tem 95% dos limites de confiança variando de 7 a 89.

Contrariamente ao processo descrito acima, uma contagem direta de microorganismos viáveis em uma amostra pode ser obtida dispersando-se a amostra sobre uma área definida usando-se meios nutrientes contendo um agente de gelação. O agente de gelação (agar) evita a difusão dos organismos durante a incubação (24 a 48 horas), produzindo uma colônia na área onde o organismo original foi depositado. Existe, no entanto, um limite para o número de colônias que pode ajustar-se em uma dada área de meios nutrientes, antes da fusão com as colônias da vizinhança, que influi na precisão da contagem. Isto comumente necessita que se realize várias diluições para cada amostra. Além disso, as classes de moléculas de indicadores químicos que podem ser usadas para identificar os tipos individuais de microorganismos presentes, dentro de uma população mista, são limitadas àquelas que produzem um produto que seja insolúvel nos meios gelificados.

Além destas desvantagens, tanto a análise de MPN presentemente usada, quanto os sistemas com base em gel, necessitam de um tempo de incubação relativamente longo, antes que um resultado positivo possa ser detectado. O processo da presente invenção soluciona os problemas associados com os sistemas presentemente usados. Em geral, esta invenção fornece um processo para efetuar detecção e enumeração rápidas e precisas de microorganismos, com base no resultado surpreendente de que o uso de microvolumes substancialmente aumenta a velocidade de detecção. Como aqui usado, o termo “microorganismo” inclui todos os organismos e células viventes microscópicas, incluindo, sem limitação, bactérias, micoplasmas, riquétsias, espiroquetas, leveduras, mofos, protozoários, bem como as formas microscópicas de células eucarióticas, por exemplo células únicas (cultivadas ou derivadas diretamente de um tecido ou órgão), ou pequenos grupos de células. Os microorganismos são detectados e/ou enumerados não apenas quando o total das células é detectado díretamente, mas também quando tais células são detectadas indiretamente, tal como através da detecção ou quantificação de fragmentos celulares, moléculas biológicas derivadas das células, ou subprodutos celulares.

Em um aspecto, a invenção dá destaque a um processo para detectar um microorganismo em uma amostra de teste líquida. O processo envolve as etapas de: distribuir microvolumes da amostra a uma pluralidade de microcompartimentos de um dispositivo de cultura; incubar o dispositivo de cultura por um tempo suficiente para permitir pelo menos um ciclo de divisão celular do microorganismo; e detectar a presença ou ausência do microorganismo nos microcompartimentos.

Como aqui usado, o termo microvolume se refere a um volume entre cerca de 0,01 microlitro e cerca de 25 microlitros^ e o termo “microcompartimento” se refere a um compartimento que tem uma capacidade, ou volume, para manter um microvolume de amostra líquida de teste.

Em modalidades preferidas, o processo ainda inclui a etapa de quantificar os microorganismos na amostra líquida de teste. A quantificação pode incluir as etapas de determinar a MPN na amostra, ou pode envolver a enumeração dos microorganismos em cada microcompartimento do dispositivo de cultura.

Em outras modalidades, os microcompartimentos podem conter um revestimento de meio nutriente, e o meio nutriente pode ainda incluir pelo menos uma substância indicadora. Altemativamente, a amostra líquida de teste pode incluir pelo menos uma substância indicadora. Em qualquer caso, a substância indicadora pode ser qualquer substância indicadora capaz de fornecer um sinal detectável na amostra líquida de teste. Tais indicadores incluem, mas a estes não estão limitados, os indicadores cromogênicos, os indicadores fluorescentes, os indicadores luminescentes e os indicadores eletroquímicos. Para os fins deste pedido, o termo “eletroquímico” significa um indicador químico que mude a resistência ou a condutância da amostra após a reação com um microorganismo.

Em outro aspecto, a invenção apresenta um processo para detectar um microorganismo em uma amostra líquida de teste. Este processo envolve as etapas de: distribuir alíquotas da amostra a uma pluralidade de microcompartimentos de um dispositivo de cultura, em que o dispositivo de cultura contenha uma pluralidade de conjuntos de microcompartimentos, cada conjunto tendo microcompartimentos de tamanho uniforme, e os conjuntos variando em tamanhos de microcompartimentos; incubar o dispositivo de cultura por um tempo suficiente para permitir pelo menos um ciclo de divisão celular do microorganismo; e detectar a presença ou ausência do microorganismo nos microcompartimentos.

Em modalidades preferidas, os microcompartimentos destes processos são de tamanho uniforme e cada compartimento tem um volume de cerca de 0,01 a cerca de 25 microlitros. Mais preferivelmente, cada microcompartimento tem um volume de cerca de 0,1 a cerca de 10 microlitros, e mesmo mais preferivelmente, de cerca de 1 a cerca de 2 microlitros. O dispositivo de cultura preferivelmente contém de 1 a cerca de 100.000 microcompartimentos, mais preferivelmente de cerca de 100 a cerca de 10.000 microcompartimentos, mesmo mais preferível de cerca de 200 a cerca de 5.000 microcompartimentos, e o mais preferível, de cerca de 400 a cerca de 600 microcompartimentos.

Em outro aspecto, a invenção apresenta um dispositivo de ensaio. O dispositivo inclui um substrato tendo nele uma pluralidade de microcompartimentos, cada microcompartimento tendo um topo e um fundo. O substrato pode incluir uma “área divisória” hidrofóbica entre os microcompartimentos. De preferência, os microcompartimentos incluem os reagentes de ensaio, por exemplo os nutrientes, os agentes de gelação ou as substâncias indicadoras, tais como os indicadores cromogênicos, os indicadores fluorescentes, os indicadores luminescentes ou os indicadores eletroquímicos. Para evitar a formação de bolhas de ar quando a amostra líquida for carregada nos reservatórios, alguns dos compartimentos podem ter aberturas tanto nos seus topos quanto nos fundos. As aberturas das superfícies de fundo são ocluídas por um material que é permeável ao ar, mas substancialmente não permeável aos líquidos aquosos.

Em outro aspecto ainda, o dispositivo contém microcompartimentos na forma de microcanais. Os microcanais podem estar contidos em um substrato de camada única ou de múltiplas camadas, tal como uma película. Os dispositivo pode, ou não, ter uma área divisória hidrofóbica entre os microcanais. Os microcanais podem compreender orifícios alongados que são formados no substrato. Em uma modalidade preferida, os microcanais são cobertos por uma película.

Os microcanais microcompartimentos podem incluir tubos capilares. Tubos capilares discretos podem ser formados/ligados entre si para formar um dispositivo. Os microcanais preferivelmente têm sobre eles aplicado pelo menos um reagente de ensaio.

Os microcompartimentos podem ser dispostos em fileiras substancialmente paralelas. Os volumes dos microcompartimentos em cada fileira tipicamente são uniformes. Os microcompartimentos podem, altemativamente, ser dispostos em vários agrupamentos ou amostras para reconhecimento e contagem mais fácil dos sinais positivos.

Os volumes dos microcompartimentos podem variar de cerca de 0,01 a cerca de 25 microlitros, mais preferivelmente de cerca de 0,1 a cerca de 10 microlitros, e o mais preferível de cerca de 1 a cerca de 2 microlitros.

Como aqui descrito, a presente invenção possui várias vantagens. Primeiro, o uso de microvolumes em microcompartimentos permite uma detecção surpreendentemente rápida de um microorganismo em uma amostra líquida de teste. Segundo, esta detecção rápida permite a rápida enumeração ou quantificação dos microorganismos na amostra líquida de teste. A invenção é particularmente útil na análise de MPN de uma amostra líquida de teste quanto a um microorganismo específico, tal como o E. coli ou S. aureus, A invenção permite a análise de MPN a ser conduzida convenientemente em um dispositivo único, ao contrário dos tubos separados, e vantajosamente requer um tempo de incubação substantivamente mais curto para se obter o desenvolvimento detectável dos microorganismos. Terceiro, o uso de microvolumes em compartimentos permite a separação de uma amostra líquida de teste dentro de um número relativamente maior de volumes de teste. Em geral, o uso de microvolumes em microcompartimentos provê um número muitíssimo maior de séries, ou repetições, de um teste sobre a amostra líquida. No caso de análise de MPN, o uso de microvolumes em microcompartimentos provê um número maior de pontos de dados dos quais a MPN pode ser calculada, dessa forma estreitando significativamente os 95% dos limites de confiança para um dado resultado da MPN. Quarto, a separação da amostra em um grande número de volumes de teste permite uma concentração mais elevada de microorganismos a serem enumerados, dessa forma reduzindo ou eliminando as diluições de amostras. Quinto, esta invenção permite a análise da MPN a ser conduzida em um dispositivo único tendo os indicadores e/ou nutrientes diretamente aplicados sobre ele. Sexto, esta invenção permite uma ampla faixa de contagem quando se realiza a análise da MPN. A Figura 1 é uma vista em perspectiva de uma modalidade de um dispositivo de cultura de microcompartimentos. A Figura 2 apresenta uma vista de topo de um dispositivo de cultura de microcompartimentos tendo conjuntos de microcompartimentos variando no volume dos microcompartimentos. A Figura 3 é uma vista lateral de um dispositivo de microcompartimentos tendo os fundos dos microcompartimento abertos ocluídos por material de lâmina não tecida. A Figura 4 é uma apresentação gráfica de cinéticas intensificadas das enzimas a partir do uso de microcompartimentos. A Figura 5 é uma apresentação gráfica de cinéticas intensificadas das enzimas a partir do uso de microcompartimentos. A Figura 6 é uma vista explodida em perspectiva de um dispositivo de microcompartimentos de camada única. A Figura 7 é uma vista em perspectiva de um dispositivo de múltiplas camadas de microcompartimentos tendo microcanais. A Figura 8 é uma vista em seção transversal de um dispositivo de camada única de microcompartimentos tendo microcanais.

Esta invenção diz respeito ao uso de alíquotas de amostras líquidas de microvolumes em microcompartimentos na detecção com base em sinais de microorganismos em amostras líquidas.

Entre os problemas encontrados na técnica, relativos aos testes das amostras líquidas quanto à presença ou à quantidade de um microorganismo, encontram-se os tempos de incubação relativamente longos, a necessidade de se usar vasos separados para as alíquotas em teste, e a necessidade de um volume relativamente grande de amostras para os testes. A presente invenção proporciona uma solução para estes e outros problemas associados com tais testes. A invenção fornece um processo para detectar a presença, a quantidade ou a ausência de um microorganismo em uma amostra líquida, mediante distribuição de microvolumes aos microcompartimentos em um dispositivo de teste. Um “microvolume” como aquele termo é aqui usado, se refere a um volume de menos do que cerca de 25 microlitros, e inclui volumes na faixa de submicrolitros. Os presentes inventores descobriram que o uso de microvolumes na detecção de microorganismos em amostras líquidas resulta em tempos de incubação extraordinariamente mais cursos necessários para produzir nível de desenvolvimento com base em sinal detectável. Tendo em vista que os tempos de incubação mais curtos são altamente desejáveis neste campo, este aspecto da invenção proporciona uma vantagem distinta. Além disso, o uso de um número relativamente grande de compartimentos de microvolumes restringe sígnificativamente os limites de confiança de 95% para o resultado e reduz o número de diluições de amostras para as amostras concentradas.

Além das vantagens acima, o uso de microvolumes nos testes de amostras líquidas pode permitir o uso de amostras de teste substancialmente menores. Amostras de teste de volume muito pequeno são algumas vezes necessárias devido às fontes de amostras de volumes muito pequenos, ou desejáveis para fins tais como a facilidade de manipulação.

Os presentes inventores desenvolveram vários dispositivos novos para o teste de amostras líquidas com base em microvolumes. Exemplos não limitativos destes dispositivos incluem um substrato, tal como películas microestampadas ou prensadas tendo uma pluralidade de microcompartimentos e tendo vários tratamentos superficiais para melhorar o desempenho e a conveniência, e as películas microestampadas ou prensadas tendo uma pluralidade de microcompartimentos de fundo aberto, em que cada abertura do fundo de reservatório é ocluída por um material que é permeável ao ar, mas é substancialmente não permeável aos fluidos aquosos. A configuração de fundo aberto pode ajudar a eliminar o problema potencial ou as bolhas de ar que ficam aprisionadas na amostra nos microcompartimentos.

Quando visualizado em uma vista de topo o microcompartimento pode ter, por exemplo, uma aparência geralmente circular, facetada, quadrada, oval ou alongada. Será observado que os microcompartimentos destes dispositivos podem ter muitas configurações possíveis, tais como a cilíndrica, a cônica, a piramidal, a hemisférica, a tetraédrica, a cúbica, as formas truncadas, e outras, com fundos abertos ou fechados.

Outro exemplo inclui um substrato, tal como uma película plástica contendo microcanais, em que a amostra líquida pode mover-se dentro dos microcanais pela ação capilar. Os microcanais podem ser tubos capilares discretos que sejam formados ou ligados entre si em um substrato. A seção transversal de cada canal pode tomar muitas formas, incluindo as formas circular, triangular, quadrada e retangular, e outras. Em uma modalidade preferida, a seção transversal do da(s) extremidade(s) dos microcanais é menor do que a seção transversal do centro dos microcanais. Nesta configuração, a amostra é menos provável de derramar durante a manipulação dos dispositivos.

Vantajosamente, os dispositivos acima sumarizados permitem os testes de amostras líquidas usando-se alíquotas de microvolumes em um único dispositivo, eliminando a necessidade de vasos separados. A amostra de teste pode ser distribuída entre centenas ou milhares de microcompartimentos discretos, dessa forma aumentando substancialmente o número de pontos de dados em um teste de amostra líquida.

Uma aplicação particularmente útil destes processos e dispositivos é na detecção e enumeração com base no desenvolvimento de microorganismos em amostras líquidas de teste. Tal detecção e enumeração com base no desenvolvimento é muito importante nos testes de alimentos, condições ambientais, clínicos, farmacêuticos, de cosméticos, e de outras amostras, quanto à contaminação por microorganismos. Os processos e dispositivos desta invenção permitem testes de tais amostras eficientes, precisos, convenientes e vantajosos quanto ao custo.

Uma utilização preferida do^ processos e dispositivos desta invenção é na MPN. A quantidade de trabalho é grandemente reduzida porque nenhuma pipetagem em tubos individuais é necessária. Ao invés disso, a amostra líquida é distribuída a microcompartimentos por processos tais como carregar um dispositivo único e dispersar a amostra através dos microcompartimentos. Além disso, menos diluições de amostras é necessária por causa do grande número de microcompartimentos nos dispositivos. O número relativamente grande de microcompartimentos também fornece uma estimativa de concentração microbiana mais precisa. Isto é porque o número correspondentemente maior de pontos de dados provê um intervalo de limite de confiança correspondentemente mais restrito.

Consequentemente, a presente invenção proporciona um processo para detectar um microorganismo em uma amostra líquida de teste. O processo primeiro envolve a distribuição dos microvolumes da amostra deteste a uma pluralidade de microcompartimentos de um dispositivo de cultura. O dispositivo de cultura pode ser qualquer dispositivo que contenha uma pluralidade de microcompartimentos e que possam ser carregados com a amostra líquida de teste. Exemplos não limitativos de tais dispositivos de cultura incluem aqueles aqui descritos.

Os microcompartimentos no dispositivo de cultura preferivelmente são de tamanho uniforme, e cada compartimento tem a capacidade para manter um volume de cerca de 0,01 a cerca de 25 microlitros da amostra líquida. Em uma modalidade preferida, cada microcompartimento tem um volume de cerca de 0,1 a cerca de 10 microlitros. Em outra modalidade preferida, cada microcompartimento tem um volume de cerca de 1 a cerca de 2 microlitros. O dispositivo de cultura de preferência contém cerca de 1 a cerca de 100.000 microcompartimentos, mais preferível de cerca de 100 a cerca de 10.000 microcompartimentos, mesmo mais preferível cerca de 200 a cerca de 5.000 microcompartimentos e o mais preferível de cerca de 400 a cerca de 600 microcompartimentos. O uso de um dispositivo que tenha cerca de 400 a cerca de 600 microcompartimentos é particularmente útil no contexto dos testes de uma amostra líquida quanto à concentração de microorganismos usando-se a MPN. Certas exigências reguladoras podem determinar que um processo de teste deva ser capaz de detectar um microorganismo em amostra de um a cinco milímetros. Um tal tamanho de amostra é padrão na indústria de processamento de alimentos para os testes microbiológicos. Assim, por exemplo, um dispositivo de cultura tendo 500 microcompartimentos, em que cada microcompartimento tenha um volume de cerca de 2 microlitros, deve ser muito útil para testar uma amostra de 1 ml. O tamanho do microcompartimento de 2 microlitros permite rápido desenvolvimento de um sinal detectável de acordo com a invenção, e o uso de cerca de 400 a cerca de 600 microcompartimentos fornece um número suficientemente grande de pontos de dados para melhorar substancialmente o intervalo de confiança para um cálculo de MPN. Além disso, é exeqüível realizar uma contagem manual dos testes de microcompartimentos positivos quanto aos microorganismos de interesse. A amostra líquida de teste pode ser qualquer amostra contendo microorganismo de qualquer fonte. A amostra pode ser distribuída à pluralidade de microcompartimentos diretamente, ou a amostra pode ser diluída antes da distribuição aos microcompartimentos. A determinação quanto à necessidade da diluição da amostra dependerá de uma variedade de fatores, tais como a origem e a idade da amostra, e tal determinação é uma questão de rotina para aqueles de experiência na técnica. A amostra líquida de teste pode incluir meios de crescimento nutrientes seletivos, opcionalmente incluindo um agente de gelação, para i microorganismo de interesse, e/ou substância indicadora que produza um sinal na presença do microorganismo em cultivo. Um agente de gelação é um material absorvente de água que se tome um gel após a adição de água. Se um agente de gelação for usado, o gel preferivelmente encapsulará, ou conterá, o microorganismo em cultivo. Um ou ambos os meios de cultivo nutrientes seletivos e a substância indicadora podem estar presentes nos microcompartimentos, em quantidades suficientes para obter concentrações desejadas quando um microvolume da amostra líquida de teste seja distribuído dentro doso microcompartimentos. O revestimento pode ser obtido, por exemplo, colocando-se ou distribuindo-se uma solução do meio nutriente e/ou da substância indicadora dentro dos microcompartimentos e desidratando-se a solução para produzir um revestimento do meio nutriente e/ou substância indicadora nos microcompartimentos. É conhecida uma ampla variedade de meios de cultivo seletivos para uma ampla variedade de microorganismos de interesse, como o é uma ampla variedade de substâncias indicadoras para uma ampla variedade de microorganismos, e qualquer um destes meios ou substâncias indicadoras podem ser adequados para uso no processo da invenção. Indicadores solúveis podem ser usados na presente invenção, porque a difusão é evitada pelo confinamento dentro dos microcompartimentos. O processo pelo qual a amostra líquida de teste é distribuída à pluralidade de microcompartimentos depende do dispositivo de cultura particular empregado no processo. Se um dispositivo de película contendo os microcompartimentos for usado, a amostra pode simplesmente ser escoada ou pipetada sobre o dispositivo e a amostra dispersa através dos microcompartimentos por exemplo por agitação, com uma lâmina ou outra ferramenta. Se forem usados microcanais, a amostra pode ser distribuída nos microcanais através da ação capilar.

Após a amostra ter sido distribuída aos microcompartimentos do dispositivo de cultura, este é opcionalmente coberto ou selado para fechar os microcompartimentos e então é incubado por um tempo suficiente para permitir pelo menos um ciclo de divisão celular dos microorganismos. Em geral, a incubação do dispositivo de cultura é conduzido em cerca de 25 a 45°C, preferivelmente em cerca de 30 a 37°C. Na prática desta invenção, em que os microcompartimentos são usados, o tempo de incubação variará. Por exemplo, quando da detecção e enumeração da maioria das bactérias, o tempo de incubação tipicamente variará de cerca de 20 minutos a cerca de 24 horas, de modo a produzir um cultivo detectável, tal como revelado pela substância indicadora na amostra líquida de teste incubada. Este tempo de incubação relativamente curto representa um vantagem bem definida sobre os processos de detecção correntemente usados, que tipicamente requerem tempos de incubação de cerca de 24 horas ou mais.

Seguindo-se à incubação do dispositivo de cultura, a presença ou ausência dos microorganismos nos microcompartimentos (e assim na amostra líquida de teste) são detectadas. O modo e a sensibilidade de detecção depende do tipo de substância indicadora usada no processo. Em alguns exemplos, a presença ou ausência do microorganismo podem ser detectadas visualmente, sem o auxílio de substância indicadora da geração do sinal, mediante visualização da turbidez ou da clarificação da amostra em cada microcompartimento. Qualquer substância indicadora que forneça um sinal detectável na amostra líquida de teste pode ser usada, incluindo, mas não se limitando a estes, os indicadores cromogênicos, os indicadores fluorescentes, os indicadores luminescentes, os indicadores eletroquímicos, e outros. A presença ou ausência de um microorganismo em um microcompartimento podem ser visualmente detectadas a olho nu, microscopicamente, ou com o auxílio de outros equipamentos ou processos. Existem numerosas substâncias indicadoras e sistemas de detecção de sinal conhecidos na técnica, para detectar microorganismos, e qualquer uma de tais substâncias ou sistemas pode ser usada de acordo com a presente invenção. A detecção de microorganismos na amostra líquida pode ainda envolver a enumeração de uma contagem de microorganismos na amostra líquida de teste. Em uma modalidade preferida, a enumeração é realizada usando-se a MPN. Uma vez o número de microcompartimentos contendo os microorganismos de interesse seja determinado, um cálculo da MPN pode ser feito usando-se técnicas conhecidas de MPN. Se desejável, o número de microorganismos em um microcompartimento individual pode ser determinado usando-se técnicas conhecidas, por exemplo a intensidade do sinal comparada com um padrão conhecido, ou pela colocação em placas dos conteúdos do microcompartimento. Vantajosamente, o grande número de microcompartimentos usados no processo da invenção, permite intervalos mais restritos para os limites de confiança de 95% em uma análise de MPN de uma amostra líquida de teste.

Por causa do grande número de microcompartimentos em um dispositivo único que os processos e dispositivos da presente invenção proporcionam, é possível usar um dispositivo único na detecção e enumeração de microorganismos múltiplos de interesse, enquanto se preserva as vantagens da invenção. Por exemplo, uma amostra líquida de teste única pode ser analisada quanto à presença de concentração de E. coli e de S. aureus. Uma parte de um dispositivo de cultura pode conter microcompartimentos para a detecção e enumeração de um destes microorganismos, por exemplo pela aplicação a um conjunto de microcompartimentos de um meio seletivo de cultura e uma primeira substância indicadora selecionada para detectar esse microorganismo. Um segundo conjunto de microcompartimentos pode ser revestido com meio seletivo de cultura e uma segunda substância indicadora selecionada para detectar outro microorganismo de interesse. Altemativamente, todos os microcompartimentos de um dispositivo de cultura podem ser revestidos com reagentes de ensaio designados para a detecção simultânea de microorganismos múltiplos. Por exemplo, E. coli deve ser detectado com uma substância indicadora fluorescente, enquanto, ao mesmo tempo, coliformes podem ser detectados com uma substância cromogênica indicadora.

Em outra modalidade, a invenção diz respeito a um processo para detectar um microorganismo em uma amostra líquida de teste. O processo é semelhante ao processo descrito acima, exceto que a etapa de distribuição envolve a distribuição de microvolumes da amostra líquida de teste a uma pluralidade de microcompartimentos do dispositivo de cultura, em que este dispositivo de cultura inclui uma pluralidade de conjuntos de microcompartimentos. Cada conjunto de microcompartimentos possui compartimentos de tamanho uniforme, e o dispositivo tem pelo menos dois conjuntos de microcompartimentos. Por exemplo, o dispositivo de cultura pode incluir uma pluralidade de faixas ou outros agrupamentos, cada um contendo microcompartimentos de um volume particular. Este aspecto permite a distribuição da amostra líquida de teste dentro de diferentes medidas de volumes de testes, incluindo medidas de volume maiores do que as medidas de microvolumes, dentro de um único dispositivo. Em MPN, este aspecto provê uma vantagem significativa em que, para uma amostra altamente concentrada, uma medida de volume apropriada pode ser selecionada e a análise de MPN realizada usando-se uma etapa única de distribuição em um dispositivo único sem a necessidade de diluições em série.

Como estabelecido acima, os processos desta invenção podem ser praticados usando-se qualquer cultura ou dispositivo de teste contendo microcompartimentos, dependendo da modalidade particular que está sendo praticada. Os presentes inventores desenvolveram vários novos dispositivos adequados para uso nos processos desta invenção. O seguinte são exemplos não limitativos de tais dispositivos.

Com referência à Figura 1, um dispositivo 10 pode compreender um substrato 12 tendo uma pluralidade de compartimentos na forma de microcompartimentos 14. O substrato 12 pode ser fabricado de qualquer material em que os microcompartimentos possam ser modelados. O substrato 12 pode ser fabricado, por exemplo, de películas poliméricas ou outros materiais apropriados. Polímeros apropriados incluem, sem limitação, polietileno, polipropileno, poliamidas, fluoropolímeros, policarbonatos, poliésteres, poliuretanos e poliestirenos. Os microcompartimentos 14 podem ser formados por qualquer processo apropriado ao material do substrato 12. Tal processo inclui, sem limitação, estampagem térmica, estampagem por fundição, perfuração a laser e gravação com materiais reativos. Altemativamente, um dispositivo pode ser preparado mediante laminação de uma folha de material padronizado contendo uma pluralidade de pequenas aberturas sobre uma película de apoio, em que um microcompartimento seja formado pela combinação da abertura e da película de apoio. Películas de polietileno ou de polipropileno podem ser, por exemplo, modeladas por pressão ou modeladas por extrusão, e podem incluir vários pigmentos e tensoativos. O dispositivo 10 pode incluir qualquer número desejado de microcompartimentos. Adicionalmente, o dispositivo 10 pode incluir reservatórios relativamente grandes ou outros compartimentos adaptados para manter volumes maiores de liquido para manutenção de um nível de umidade apropriado dentro do dispositivo. Não obstante o número de microcompartimentos possa ser relativamente pequeno (por exemplo de 2 a 50), os tamanhos pequenos dos microcompartimentos permitem números relativamente grandes de microcompartimentos a serem fabricados em um dispositivo único 10. Preferivelmente, o dispositivo tem de cerca de 1 a cerca de 100.000 microcompartimentos, mais preferivelmente de cerca de 100 a 10.000 microcompartimentos, mesmo mais preferível entre cerca de 200 a cerca de 5.000 microcompartimentos, e o mais preferível, de cerca de 400 a cerca de 600 microcompartimentos. O dispositivo 10 pode ter uma população de microcompartimentos uniformemente dimensionados 14, embora os microcompartimentos não necessitem ser de tamanho uniforme. Por exemplo, um dispositivo 16 como apresentado na Figura 2, pode ter conjuntos (por exemplo fileiras) de microcompartimentos em que os volumes sejam constantes dentro de um conjunto, mas variem entre os conjuntos. Como apresentado na Figura 2, os volumes podem variar de forma crescente através de uma série de conjuntos de microcompartimentos, com os microcompartimentos menores 18 contendo volumes de submicrolitros, e os microcompartimentos maiores 20 contendo volumes múltiplos de microlitros.

Como discutido acima, a presença de microcompartimentos em um dispositivo de ensaio permite a separação de uma amostra líquida de teste em um número relativamente grande de microvolumes de teste. A capacidade de separar uma amostra líquida dentro dos microcompartimentos e de realizar a MPN ou outros ensaios sem contaminação cruzada entre os compartimentos, e a vantagem principal dos presentes dispositivos. Vários processos adicionais de fabricação, no entanto, podem ser usados para acentuar ainda a função de separação dos microcompartimentos, como descrito abaixo.

Com referência novamente à Figura 1, a área 13 entre os microcompartimentos 14 (“área divisória”) pode ser fabricada de modo a ser hidrofóbica. Isto serve para evitar que o fluido aquoso faça ligação entre os microcompartimentos 14, dessa forma evitando a contaminação cruzada. A área divisória 13 pode ser tomada hidrofóbica de várias maneiras. Por exemplo, a área divisória sobre uma película de polietileno estampada por extrusão, que havia sido tomada hidrófila pela incorporação de um tensoativo, pode ser tomada hidrofóbica pela transferência de uma camada fina de silicone acrilada ou outro material hidrofóbico para a área divisória.

Com referência à Figura 6, os microcompartimentos podem ser configurados como microcanais 32 em um substrato 34. A forma do microcanal 32 pode variar. O microcanal pode ser de fundo quadrado, conformado em U e em V, ou compreender orifícios alongados.

Preferivelmente, o microcanal 32 é coberto para evitar a evaporação a partir do canal e a contaminação deste. A cobertura 36 pode ser preparada de qualquer material adequado que seja, pelo menos parcialmente, impermeável ao vapor d’água. Por exemplo, a cobertura pode compreender uma película de silicone adesiva sensível à pressão ou uma película quente selável.

Reagentes de ensaio podem ser aplicados dentro do microcanal. Preferivelmente, pelo menos um tal reagente é aplicado dentro de cada microcanal.

Em uma modalidade alternativa preferida como se apresenta na Figura 7, camadas individuais de película com microcanais 32 nelas, podem ser laminadas entre si para formar uma estrutura de múltiplas camadas 38. Esta estrutura tem muitas vantagens, incluindo a de ter um grande número de compartimentos em uma pequena área e a facilidade de ínoculação de um grande número de microcompartimentos. Como apresentado, os canais sombreados 33 representam canais tendo uma indicação positiva para o microorganismo alvo.

Altemativamente, como apresentado na Figura 8, o dispositivo 40 pode compreender uma pluralidade de tubos capilares 42 que sejam ligados ou formados juntos dentro de um substrato, como se apresenta na Figura 7. Os tubos capilares podem ser de extremidades abertas ou podem ser parcialmente fechados em uma extremidade.

Os seguintes exemplos são oferecidos para auxiliar no entendimento da presente invenção, e não são interpretados como limitativos do seu escopo. A menos que de outra forma indicado, todas as partes e percentuais são em peso. EXEMPLO 1 Dispositivos de cultura de película estampada Os dispositivos de cultura de película estampada contendo uma pluralidade de microcompartimentos e capazes de ser usados para a detecção de microorganismos em uma amostra líquida de teste, foram construídos conforme descrito neste exemplo.

Os microcompartimentos podem ser formados em um substrato por vários processos, exemplos dos quais são a estampagem térmica, a estampagem por fundição e a perfuração a laser, e por gravação da superfície com um material reativo. Descrições detalhadas de como produzir os recessos (isto é, os “microcompartimentos”) em películas poliméricas, são fornecidas nas Patentes U.S. 5.192.548,5.219.462,5.344.681 e 5.437.754. As seguintes descrições são representativas de dispositivos específicos de cultura de película estampada usados nos exemplos subsequentes. A. Películas estampadas por pressão contendo uma pluralidade de microcompartimentos Polietileno (Resina 18BOA da Eastman Chemical Company) contendo 10% em peso de Ti02 (50% de TiO2/50% de concentrado de pigmento de Polietileno) e 0,5% em peso de Tensoativo Triton X-35 (Sigma Chemical Company), foi moldado por extrusão dentro de uma película [espessura de 4 mil (101,6 μ)]. A película foi cortada em folhas e empilhada (~20 folhas) sobre ferramenta de liga de magnésio fotolitograficamente gravada, preparada como descrito na Patente U.S. 5.192.548, projetada para formar uma pluralidade de microcompartimentos. As protuberâncias contidas na ferramenta de magnésio gravada dispostas em padrões descritos nos exemplos subsequentes. As folhas de polietileno empilhadas foram estampadas em uma prensa hidráulica aquecida (132°C, permanência de 120 segundos), conforme descrito na Patente U.S.5.219.462. Deixou-se as amostras esfriar, em cujo tempo a ferramenta foi removida para fornecer uma película de camada única contendo a imagem “negativa” da ferramenta. B, Películas estampadas por extrusão contendo uma pluralidade de microcompartimentos Uma folha da ferramenta mestra de magnésio fotolitograficamente gravada foi ligada a um rolo de aço usando-se adesivo de transferência sensível à pressão. A composição de polietileno, pigmento e tensoativo descrita no Exemplo IA foi misturada entre si e a moldada por extrusão sobre o rolo, conforme descrito na Patente U.S. 5.192.548, que fica aqui incorporada por referência. Amostras sem o Triton X-35 também foram preparadas desta maneira. C. Películas estampadas por extrusão com área “divisória” hidrofóbica Películas de polietileno estampadas por extrusão contendo o Tensoativo Triton X-35 foram preparadas de acordo com o Exemplo 1B. A área entre os microcompartimentos (área “divisória”) foi tomada hidrofóbica mediante transferência de uma camada fina de silicone acrilada (FC 711 da Goldschmidt) contendo 4,8% de um agente de reticulação (Darocur 1173), usando-se um aparelho de revestimento rolo-a-rolo (Straub Design Co.). O revestimento hidrofóbico foi curado por exposição da película à radiação ultravioleta sob atmosfera de nitrogênio, usando-se uma lâmpada de UV da Fusion Systems, com um bulbo H fornecendo uma dosagem de 85 milijoules/cm2. Uma solução aquosa contendo indicador vermelho de fenol (para prover contraste) foi espalhada sobre as amostras tratadas e não tratadas. As amostras tratadas com o revestimento hidrofóbico foram observadas que distribuíam o líquido dentro dos microcompartimentos individuais, sem ligação dos fluidos entre eles. D. Películas estampadas por pressão contendo uma pluralidade de microcanais A película de polietileno (Exemplo 1 A) foi cortada em folhas e estas empilhadas [~10 folhas de quatro mil (101,6 μ)] na ferramenta de magnésio projetada para formar uma pluralidade de microcanais paralelos, seguido por estampagem em uma prensa hidráulica aquecida de acordo com o seguinte protocolo: aquecida a 143°C, mantida em 0,7 N/m2 por 1 minuto, pressão reduzida a 2,1 N/m2 e mantida por 15 segundos, esfriada a 29°C, e liberada. A ferramenta foi removida, para fornecer uma película de camada única contendo a imagem “negativa” da ferramenta. Após a estampagem, um material de revestimento de poliéster (PE) contendo um adesivo de silicone sensível à pressão (PSA) (CW14HT, Specialty Tapes, Racine, WI) foi laminado até o topo da película estampada, dessa forma criando uma série de microcanais paralelos cobertos. EXEMPLO 2 Dispositivos de cultura de película estampada com microcompartimentos de fundo perfurado Dispositivos de cultura de película estampada contendo uma pluralidade de microcompartimentos de fundo perfurado, e tendo as aberturas no fundo cobertas com um revestimento de lâmina não tecida, foram construídos como descrito neste exemplo. Os rendimentos de enchimento e as fugas destes dispositivos de cultura foram avaliadas como também descrito neste exemplo. A. Preparação de dispositivos de cultura de película estampada de fundo perfurado Polipropileno [espessura de 18 mil (457,2 μ), Complex Co.] foi estampado como descrito no Exemplo IA, mas com uma ferramenta de estampagem projetada para produzir microcompartimentos tendo camadas de fondo muito finas [espessura < 1 mil (25,4 μ)]. O calor de um maçarico de propano foi então aplicado à superfície de fondo dos microcompartimentos, para gerar um orifício (perfuração). O diâmetro do orifício formado desta maneira é menor do que o diâmetro do fundo do microcompartimento original.

Teste de enchimento e vazamento dos dispositivos de cultura de película estampada de fundo perfurado Para analisar quanto à eficiência de enchimento e fuga, uma amostra de teste (1,5 a 3,0 ml) do diluente Butterfield (Weber Scientific, Hamilton, NJ) contendo vermelho de fenol para auxiliar na inspeção visual, foi aplicada por pipeta sobre uma película estampada de polipropileno tendo uma pluralidade de microcompartimentos, alguns dos quais foram perfurados conforme descrito acima. Cada microcompartimento tinha a configuração de um cone hexagonal truncado invertido, tendo um diâmetro de aproximadamente 1,9 mm na superfície, e de 1,0 mm em sua profundidade, que era de cerca de 1,1 mm. A solução foi distribuída através dos microcompartimentos mediante redemoinho da película estampada manualmente. Foi observado que quase todos os microcompartimentos com fondos perfurados foram enchidos com a solução de teste e não tinham nenhuma bolha de ar aparente. Em comparação, ocasionalmente os microcompartimentos sem fondos perfurados foram observados conterem bolhas de ar aprisionadas. No entanto, quando a superfície de fondo da película estampada foi colocada em contado com uma segunda superfície, a solução de teste foi repelida dos microcompartimentos contendo os fondos abertos. Igualmente, durante o processo de inoculação, foi observado que a solução de teste aplicada a partir de uma pipita em alta velocidade, algumas vezes vazava através dos poucos microcompartimentos localizados diretamente sob a ponta da pipeta.

Preparação de películas estampadas com microcompartimentos de fundo perfurado cobertos com lâminas não tecidas.

Um material em lâmina não tecida adesivo sensível à pressão (PSA) foi aplicado à superfície inferior dos dispositivos de cultura de película de polipropileno estampada tendo uma pluralidade de microcompartimentos de fundo perfurado, de modo a eliminar o vazamento da solução da amostra de teste. A lâmina não tecida foi construída de Kraton 1112 (peso da lâmina = 50 g/m2) e continha um PSA de fibra moldada sobre pressão, como descrito no Pedido de Patente Européia número 94119851.7. A lâmina não tecida de PSA foi facilmente ligada à película mediante pressão e, dessa forma, formou um fundo coberto, mas poroso ao ar, em cada um dos microcompartimentos. Teste de enchimento e de vazamento das películas com microcompartimentos de fundo perfurado cobertos com lâminas não tecidas. O diluente Butterfield contendo vermelho de fenol, como descrito acima, foi inoculado em uma película estampada de polipropileno tendo uma pluralidade de microcompartimentos, alguns dos quais foram perfurados e cobertos no fundo com uma lâmina não tecida. Todos os microcompartimentos perfurados foram enchidos por um redemoinho manual da película, e apenas os microcompartimentos não perfurados aprisionaram ar. Diferentes quantidades da solução de teste (1 a 3 ml) foram aplicadas por pipeta sem nenhum vazamento ter sido observado durante o processo de inoculação. Nenhum fluxo da solução de teste através do fundo poroso coberto dos microcompartimentos foi observado sob um microscópio ótico, e quando a película foi colocada em contato com uma segunda superfície, nenhuma expulsão da solução de teste foi evidente. B. Folhas laminadas com microcompartimentos de fundo aberto com lâminas não tecidas As folhas laminadas contendo uma pluralidade de microcompartimentos de fundo aberto, e tendo as aberturas dos reservatórios de fundo cobertas com um revestimento de lâmina não tecida, foram construídas como descrito neste exemplo. Estas folhas laminadas podem ser cortadas no tamanho e utilizadas nos dispositivos de cultura para a detecção e enumeração dos microorganismos.

Uma película de polietileno contendo uma pluralidade de pequenas aberturas uniformemente espaçadas (Vispore 6607 e Vispore 6582, Tregedar Film Products, Richmond, VA) foi laminada sobre uma lâmina de PSA não tecida para fornecer folhas laminadas contendo uma pluralidade de microcompartimentos com os fundos abertos cobertos com uma lâmina não tecida, As características físicas dos materiais de película de partida acham-se resumidas na Tabela 2B.

As folhas laminadas foram facilmente inoculadas pela adição de um pequeno volume de solução nutriente contendo vermelho de fenol para acentuar a visualização dos microcompartimentos enchidos. As imagens óticas aumentadas das folhas laminadas, mostraram, após a inoculação, enchimento uniforme dos microcompartimentos. Nenhuma bolha de ar ou vazamento foram observados nos microcompartimentos cheios, dessa forma sugerindo que o ar, mas não o liquido, pode fluir facilmente através das aberturas do fundo cobertas com lâminas não tecidas, dos microcompartimentos. EXEMPLO 3 Detecção e enumeração de microorganismos (Processo que utiliza uma pluralidade de microcompartimentos) A possibilidade de utilizar dispositivos de cultura de película estampada contendo uma pluralidade de microcompartimentos para detectar e enumerar E, coli, foi demonstrada neste exemplo.

Uma cultura de caldo durante a noite, de E. coli ATCC 51813 (~109 CFU/ml em meio de Tryptic Soy Broth (TSB) foi diluído em série em meio de Violet Red Bile (VRB) (7,0 g/1 de peptona Bacto, 3,0 g/1 de extrato de levedura, e 1,5 g/1 de sais de bile) contendo 4-metilumbeliferil-P-D-glicuronídeo (0,5 mg/ml) (MUG, Biosynth International, Naperville, IL). As diluições foram preparadas para as concentrações bacterianas aproximadas apresentadas na Tabela 3a. Uma amostra diluída (1 ml) foi aplicada por pipeta sobre um dispositivo de cultura de película estampada de polietileno (Exemplo 1B, carente do Triton X-35) contendo 525 microcompartimentos (cerca de 1,9 μΐ/microcompartimento). Os microcompartimentos foram dispostos em uma disposição hexagonal (cerca de 19 microcompartimentos/cm2) e cada microcompartimento tinha a forma de um cone hexagonal truncado invertido, tendo um diâmetro de aproximadamente 1,9 mm na superfície e 1,00 mm em sua profundidade, que era de cerca de 1,1 mm. Os microcompartimentos foram enchidos conforme descrito na Patente U.S. 5.219.462, canalizando-se a solução de amostra diluída para baixo da película com o fio de uma lâmina de barbear. Uma amostra diluída (1 ml) também foi colocada sobre uma PETRIFILM® série 2000 Rapid Coliform Teste Plate (Placa de Teste Rápido de Coliformes) (3M Company, St. Paul, MN), incubada e interpretada de acordo com as orientação do fabricante. Os dispositivos de cultura em película estampada inoculada foram colocados dentro de placas de Petri, e incubados por 12 horas a 37°C. O número de microcompartimentos que apresentaram fluorescência foram contados para cada amostra. O número mais provável foi calculado usando-se a fórmula MPN = N ln (N/N-X), onde N é o número total de microcompartimentos cheios e X é o número total de microcompartimentos apresentando uma reação positiva. Os resultados são comparados com as contagens das Placas PETRIFILM® série 2000 na Tabela 3a. *TNTC = muito numerosos para contar Os resultados deste exemplo mostram que os microorganismos podem ser facilmente detectados e enumerados usando-se um dispositivo de cultura de película estampada tendo uma pluralidade de microcompartimentos, e que os valores obtidos são comparáveis com aqueles obtidos das Placas de Contagem PETRIFILM® série 2000. Além disso, este processo fornece uma faixa de contagem mais ampla por amostra do que os processos correntemente disponíveis. EXEMPLO 4 Detecção e enumeração de microorganismos (Método que utiliza microcompartimentos de fundo perfurado) A possibilidade de se utilizar dispositivos de cultura de película estampada contendo uma pluralidade de microcompartimentos que tenham sido perfurados e cobertos no fundo com uma lâmina não tecida, para a detecção e enumeração de Serratia marcescans, foi demonstrada neste exemplo.

Uma cultura em caldo, durante a noite, de Serratia marcescans cultivado a 35°C em TSB, foi diluída em série por incrementos décuplos em diluente de Butterfield. As diluições de ΙΟ"4, 10'5 e 10'6 foram usadas para inocular os dispositivos de cultura de película estampada de polipropileno, tendo microcompartimentos de fundo perfurado coberto com lâmina não tecida (Exemplo 2). Cada película foi cortada em círculos de 5,1 cm de diâmetro e colocada em placas de Petri de poliestireno (diâmetro de 5,1 cm x altura de 1,9 cm) para inoculação, cultivo e detecção de bactérias. O disco de película foi elevado do fundo da placa de Petri por um anel espaçador de espuma. Silicone curável foi aplicado ao longo da borda do disco de película para fornecer uma selagem entre o disco de película e a placa. A selagem impediu que as soluções da amostra de teste vazassem através da borda do disco de película durante a inoculação. Cada uma das placas resultantes do dispositivo de cultura continha cerca de 300 microcompartimentos (cerca de 2,00 μΐ/reservatório) e foi tratada por embebição em isopropanol por 2 a 3 minutos, e secada durante a noite em condições ambiente e em um forno a 60°C durante 5 minutos antes do uso.

Uma amostra (0,1 ml) das diluições individuais foi misturada com meio nutriente balanceado de contagem aeróbica (0,9 ml) tendo a composição apresentada na Tabela 4a e contendo 4-metilurabeliferilfosfato (0,1 mg/ml). A amostra de teste resultante (~1 ml) foi aplicada por pipeta sobre uma placa do dispositivo de cultura e a placa foi suavemente agitada para depositar uma porção da amostra dentro de cada um dos microcompartimentos. A placa foi então inclinada para despejar o volume em excesso da amostra dentro de uma almofada absorvente, que foi ligada à borda da placa de poliestireno. Água destilada adicional (cerca de 0,3 ml) foi adicionada à almofada absorvente para molhá-la completamente a fim de fornecer umidade ao reservatório. As placas inoculadas foram invertidas, incubadas durante 24 horas a 35°C, e a quantidade de microcompartimentos fluorescentes (positivos) contada sob excitação da luz ultravioleta (360 nm). O Número Mais Provável (MNP) foi calculado de acordo com o Exemplo 3. O MPN/ml foi calculado multiplicando-se o MPN por 1,66 com base em um volume de amostra de 600 microlitros contido dentro dos 300 microcompartimentos do dispositivo. Os resultados são fornecidos na Tabela 4b.

Os resultados deste exemplo mostram que os microorganismos podem ser facilmente detectados e enumerados usando-se um dispositivo de cultura de película estampada tendo uma pluralidade de microcompartimentos, que tenham sido perfurados e cobertos sobre o fundo com uma lâmina não tecida. As aberturas cobertas com a lâmina no fundo dos microcompartimentos deixavam o ar, mas não o líquido, escapar quando a amostra líquida foi aplicada. O número de bactérias detectadas (microcompartimentos positivos ou MPN) foi correspondentemente reduzido para cada diluição da série.

EXEMPLOS

Detecção e enumeração de microorganismos (Processo utilizando os conjuntos de microcompartimentos A possibilidade de utilizar dispositivos de cultura de película estampada contendo uma pluralidade de microcompartimentos de diferentes tamanhos (“conjuntos”) para detectar e enumerar E. coli, foi demonstrada neste exemplo.

Amostras diluídas de E. coli ATCC 51813 foram preparadas de acordo com o Exemplo 3. Dois dispositivos de cultura de película estampada foram preparados em conformidade com o Exemplo 1B, O primeiro continha uma disposição quadrada de microcompartimentos de 0,8 μΐ (~16 microcompartimentos/cm2), cada microcompartimento na forma de um cone truncado invertido, tendo um diâmetro de aproximadamente 1,2 mm na superfície, e de 0,7 mm em sua profundidade, que era de cerca de 1,0 mm. A segunda película continha uma disposição quadrada de microcompartimentos maiores do que 5 μΐ (~4 microcompartimentos/cm2), cada microcompartimento na forma de uma pirâmide quadrada truncada, tendo uma abertura de 3,7 x 3,7 mm na superfície e de 2,0 x 2,0 mm em sua profundidade, que era de cerca de 1,0 mm. Uma amostra de 250 μΐ de cada diluição foi dividida dentro dos microcompartimentos mediante o uso do procedimento descrito no Exemplo 3. Os dispositivos foram incubados durante a noite a 37°C e o número de microcompartimentos que apresentavam fluorescência foi contado para cada conjunto de películas. Os valores de MPN foram calculados conforme descrito no Exemplo 3. O MPN por milímetro foi calculado pela multiplicação do valor obtido para o inóculo de 250 μΐ, por 4. Os resultados são fornecidos na Tabela 5a e são comparados com as contagens obtidas dos testes padrão com as Placas de Contagem PETRIFILM® Série 2000.

Os resultados deste exemplo mostram que os microorganismos podem ser facilmente detectados e enumerados usando-se um dispositivo de cultura de película estampada tendo uma pluralidade de microcompartimentos de diferentes conjuntos, e que os valores obtidos são comparáveis com aqueles obtidos das Placas de Contagem comercial PETRIFILM® série 2000. Este exemplo ainda demonstra que uma faixa de contagem mais ampla pode ser obtida usando-se um conjunto de “pequenos” microcompartimentos acoplados com um conjunto de “grandes” microcompartimentos. EXEMPLO 6 Detecção e enumeração de microorganismos (Faixa elevada de contagem) Este exemplo demonstra um processo de detecção e de enumeração para uma amostra altamente concentrada (>200.000 CFU/ml).

Os meios nutrientes VRB contendo 1 mg/ml de ácido 5-bromo-4-cloro-3-indoxil-p-D-glicurônico (BCIG, Biosynth International, Naperville, IL) e glicose (1 g/1) foram preparados de acordo com o Exemplo 3. Uma cultura noturna de E. coli ATCC 51813 foi diluída nesta formulação dos meios até uma concentração aproximada de 1.000 CFU/ml.

Uma película contendo aproximadamente 2.330 microcompartimentos por polegada quadrada (361 microcompartimentos por cm2) (0,03 microlitros por microcompartimento) foi preparada de acordo com o Exemplo IA. Cada microcompartimento tinha a conformação de um cone hexagonal truncado invertido, tendo um diâmetro lado a lado de aproximadamente 0,3 mm na superfície, e 0,15 mm em sua profundidade, que era de 0,7 mm. Os microcompartimentos foram enchidos como descrito no Exemplo 3, canalizando-se o inóculo através dos microcompartimentos com o fio de uma lâmina de barbear. Para este exemplo, uma fita adesiva de silicone sensível à pressão (Produto CW-14HT, Specialty Tapes, Racine, WI) foi usada para selar os topos dos microcompartimentos. Este processo forneceu um meio para evitar a evaporação dos pequenos volumes de amostra nos microcompartimentos durante a incubação noturna. A película selada foi incubada a 37° durante a noite (18 horas), depois subseqüentemente removida do incubador e observada sob um microscópio. O número de microcompartimentos positivos (cor azul) foi contado em um campo microscópico representativo contendo 520 microcompartimentos, correspondentes a um volume amostrado de 15,6 microlitros. Dezenove microcompartimentos positivos foram observados no campo, correspondendo a um valor de MPN calculado de 1290 por mililitro. A faixa máxima de contagem para este exemplo (519 positivos para um volume amostrado de 15,6 microlitros) foi de 208.000 CFU/ml. EXEMPLO 7 Detecção e enumeração de microorganismos (Processo utilizando uma pluralidade de microcompartimentos revestidos) Este exemplo demonstra o processo em que nutriente e indicador são incorporados nos microcompartimentos da película antes da inoculação com a amostra de teste. O meio VRB contendo o indicador fluorescente MUG foi preparado como descrito no Exemplo 3. Um excedente desta solução foi aplicado à superfície de uma película com o padrão e a geometria de microcompartimentos descritos no Exemplo 3. A solução foi distribuída nos microcompartimentos por revestimento a faca da solução, através da superfície da película. A película revestida foi então secada em um forno a 52°C. Uma diluição aquosa de Serratia liquefaciens foi preparada de uma cultura noturna em uma concentração aproximada de cerca de 50 CFU/ml. (tampão de Butterfíeld, Fisher Scientific). Uma amostra desta solução (300 μ 1) foi aplicada à película revestida de nutriente usando-se o processo do Exemplo 3, para encher 420 microcompartimentos. A amostra foi incubada durante a noite a 37°C. Trinta e seis microcompartimentos fluorescentes foram observados, correspondendo a um MPN calculado de 39 (130/ml). EXEMPLO 8 Detecção e enumeração de microorganismos (Detecção usando-se o indicador de pH e o nutriente incorporados nos microcompartimentos) Este exemplo demonstra a detecção com base na absorbância, usando-se um indicador que monitora o pH dos meios.

Os meios VRB contendo o vermelho de fenol indicador de pH (1 mg/ml, Sigma Chemical Company) foram preparados como descrito no Exemplo 3. Esta solução foi incorporada nos microcompartimentos de uma película, como descrito no Exemplo 7. Uma diluição aquosa (tampão de Butterfíeld, Fisher Scientific) de Serratia liquefaciens (aproximadamente 50 CFU/ml) foi aplicada à película, como descrito no Exemplo 3, seguido por incubação noturna a 37°C. Dos 420 microcompartimentos que foram enchidos, 21 apresentaram uma cor amarela, correspondendo a um valor de MPN de 21 (70/ml). EXEMPLO 9 Cinética enzimática intensificada empregando-se microcompartimentos (Enzima + Indicador fluorescente) Neste exemplo, o mesmo número de moléculas enzimáticas (2,5 ng) foi colocado em uma pluralidade de microcompartimentos variando em tamanho de 0,1 a 50 μΐ. Cada reservatório continha a mesma concentração de indicador fluorescente (0,25 mM). A produção de fluorescência resultante da hidrólise enzimática do indicador foi medida simultaneamente para cada microcompartimento, usando-se uma câmera CCD. Uma imagem foi armazenada em cada ponto do tempo durante a experiência. Os valores quantitativos da fluorescência para cada microcompartimento foram obtidos carregando-se as imagens armazenadas no software de processamento de imagem e determinando-se a média dos valores da intensidade através de 4 pixéis no centro de cada microcompartimento.

Procedimento Detalhado Uma ferramenta de magnésio fotolitograficamente gravada foi projetada para prover protuberâncias cônicas invertidas de volume crescente, de tal modo que uma película estampada preparada de acordo com o procedimento do Exemplo IA produzisse uma película com microcompartimentos de 0,1,0,5,1,0,3,0,14,20 e 50 μΐ.

Uma solução de enzima fosfatase alcalina (0,1 mg/ml) foi preparada em tampão de glicina (50 mM, pH 10,4) e diluída em série en tampão adicional de glicina, usando-se o seguinte esquema de diluição sequencial (em mililitros): 1:1, 1:4, 1:1, 1:2, 1:1,3, 1:1, 1:0,43, 1:15. Uma alíquota (100 μΐ) de cada diluição foi colocada em microcompartimentos adjacentes de uma placa de microtitulação de 95 microcompartimentos. Um pipetador de múltiplos canais foi usado para simultaneamente adicionar 100 μΐ de indicador de 4-metilumbeliferilfosfato (0,5 mM em tampão de glicina) a cada microcompartimento. Uma alíquota (0,1 μΐ) da primeira diluição foi colocada imediatamente com uma seringa no microcompartimento correspondente a este volume (0,1 μΐ). Isto foi repetido quanto às seis diluições subsequentes correspondentes aos volumes de 0,5,1,3,14,20 e 50 μΐ. Usando-se este procedimento, cada microcompartimento foi enchido com diluente contendo 2,5 ng de enzima em 0,25 mM de indicador. Uma amostra de fundo tendo microcompartimentos contendo apenas indicador, foi também preparada.

Após encher os microcompartimentos, a amostra foi colocada em uma placa de Petri coberta e selada com fita, para evitar a evaporação. A placa foi colocada dentro de um dispositivo de iluminação ultravioleta e formação de imagem (UltraLum Corporation, 365 nm). As imagens da CCD foram armazenadas nos intervalos de tempo apresentados na Figura 4. Os ores da intensidade da fluorescência para cada ponto do tempo foram idos determinando-se a média de 4 pixéis no centro de cada crocompartimento. Os valores finais foram obtidos pela determinação da dia de duas experiências em duplicata. A Figura 4 mostra, (1) dado o mesmo número de moléculas dmáticas em cada reservatório, que as cinéticas da reação são nificativamente intensificadas nos microcompartimentos menores, e (2) 5 o sinal de fluorescência para o sistema de detecção (CCD neste caso) é arçado nos microcompartimentos menores. Para ilustrar este efeito, a orescência de fundo de um microcompartimento contendo apenas .icador (sem enzima) é plotada no gráfico. Em uma base de pixéis, o sinal onsideravelmente mais elevado (saturado quanto a volumes menores) nos ;rocompartimentos menores do que nos microcompartimentos maiores, te-se que, no ponto do tempo de 2 horas, a intensidade de 50 μΐ é de 2,3x ivés do fundo, enquanto o valor de 1 μΐ é de 9,8x mais elevado. Tanto os itos de cinética de reação intensificada quanto o sinal de fluorescência msificado, conduziram à detecção cada vez mais rápida, à medida em que imanho dos microcompartimentos era reduzido. EMPLO 10 tecção intensificada de microorganismos usando-se microcompartimentos ictérias + Indicador fluorescente) Neste exemplo, o mesmo número de bactérias (-5000 CFU) colocado em uma pluralidade de microcompartimentos variando em íanho de 1 a 50 μΐ. Cada microcompartimento continha a mesma icentração de indicador fluorescente (0,25 mM) em um meio nutriente de tivo. A produção da fluorescência resultante da hidrólise enzimática do icador foi medida simultaneamente para cada microcompartimento, ndo-se uma câmera CCD. icedimento Detalhado Películas estampadas de polietileno foram preparadas em conformidade com o Exemplo 9, com microcompartimentos projetados para manter 1, 3, 7,14,20 e 50 μΐ de líquido. Uma cultura de caldo noturna de E. coli ATCC 51813 (~109 CFU/ml em TSB) foi diluída em série em meio VRB contendo 4-metilumbeliferil-P-D-glicuronídeo (0,5 mg/ml) conforme descrito no Exemplo 3. As diluições foram preparadas de tal modo que -5000 CFU estivessem inicialmente presentes em cada reservatório antes da incubação. As películas inoculadas foram colocadas em placas de Petri, seguido por incubação a 37°C. A fluorescência relativa foi medida nos pontos de tempo mostrados na Figura 5 usando-se o sistema CCD de formação de imagem descrito no Exemplo 9. Os tempos calculados para se obter o valor relativo da fluorescência de 80 para cada um dos microcompartimentos são fornecidos na Tabela 10a.

Os resultados desta exemplo, conforme ilustrados pelos valores da Tabela 10a e os dados gráficos da Figura 5, mostram que a fluorescência é observada significativamente mais cedo nos microcompartimentos menores do que nos microcompartimentos maiores, EXEMPLOU

Detecção e enumeração de microorganismos (Processo utilizando uma pluralidade de microcanais) A possibilidade de utilizar dispositivos de cultura de película contendo uma pluralidade de microcanais cobertos para detectar e enumerar bactérias, foi demonstrada na Seção A (Dispositivo de Cultura de Película de Camada Única) e na Seção B (Dispositivo de Cultura de Película de Camada Única Revestido com o Meio) deste exemplo. A construção e a inoculação dos dispositivos de cultura em película contendo “conjuntos” de múltiplos volumes de microcanais cobertos e contendo estruturas de película de múltiplas camadas, são descritas na Seção C e na Seção D, respectivamente, deste exemplo. A. Dispositivo de cultura de película de camada única Película estampada contendo microcanais paralelos sulcados em V, foi preparada como descrito no Exemplo 1D e na Patente U.S. 5.514.120. A película resultante foi coberta com uma película superior de silicone PSA/PE (Exemplo 1D), dessa forma criando uma série de microcanais paralelos cobertos, tendo uma seção transversal triangular com uma base de aproximadamente 0,6 mm e uma altura de aproximadamente 0,75 mm. Uma “área divisória” plana de aproximadamente 0,3 mm, separava cada microcanal e fornecia uma superfície de ligação para a película de cobertura. As películas cobertas foram cortadas em tiras de 2 cm de altura e 5 cm de largura, com cada tira (dispositivo de cultura em película) contendo 50 microcanais paralelos de 2 cm de comprimento. Cada canal tinha um volume de aproximadamente 5 μΐ (volume total amostrado de aproximadamente 250 μΐ). Uma cultura noturna de caldo de E. coli ATCC 51813 foi diluída em série em meio VRB (Exemplo 3), contendo vermelho de fenol (0,5 mg/ml). As diluições foram preparadas para as seguintes concentrações bacterianas aproximadas (CFU/ml): 10.000, 1.000, 100 e 10. Uma borda do dispositivo de cultura de película estampada foi imersa na amostra e o fluido deixado introduzir-se nos microcanais por meio da ação capilar. A borda de topo do dispositivo foi então selada por imersão na parafina fundida para evaporação lenta durante a inoculação. A borda de fundo foi deixada aberta. As amostras foram incubadas durante a noite a 37°C dentro de uma placa de Petri umedecida e, então, observadas quanto às mudanças de cor de vermelho a amarelo. Uma cor amarela ao longo de um canal individual indicava a produção de ácido a partir do cultivo bacteriano (fermentação da glicose) dentro do canal. Nas diluições de 10.000 CFU/ml e 1.000 CFU/ml, as amostras apresentaram uma cor amarela em todos os 50 canais, sugerindo que pelo menos um organismo dividido em cada canal durante o processo de introdução. Na diluição de 100 CFU/ml, 29 canais ficaram amarelos (bactérias presentes) e 21 canais ficaram vermelhos (sem bactéria), o que correspondeu a um MPN calculado de 179 (formula para MPN fornecida no Exemplo 3). Na diluição de 10 CFU/ml, apenas 3 canais foram observados serem amarelos, o que correspondia a um MPN de 12. Nenhuma modificação da cor foi observada nas amostras de controle que foram preparadas sem a adição do E. coli. B. Dispositivo de cultura de película de camada única revestida do meio Uma tira de película estampada (Exemplo 11 A) sem a película de topo de silicone PSA/PE foi imersa em meio VRB contendo vermelho de fenol. Os microcanais conformados em V foram deixados encher-se, após o que a película foi removida do meio nutriente e secada em temperatura ambiente por cerca de 30 minutos. A película de topo de PSA/PE foi aplicada à película estampada para prover um dispositivo de cultura de película revestida pelo meio, que foi então imerso em uma diluição aquosa de E. coli ATCC 51813 (~50 CFU/ml). A solução bacteriana foi introduzida nos microcanais revestidos de meio através da ação capilar. Após incubação noturna a 37°C, o dispositivo de cultura de película estampada foi observado como tendo 10 canais amarelos e 40 canais vermelhos, correspondendo a um valor de MPN de 44.

Este exemplo serve para demonstrar que os nutrientes bacterianos podem ser incorporados nos microcanais de um dispositivo de cultura de película, e que o dispositivo pode, então, ser usado para amostrar diretamente uma solução aquosa de teste. C. Dispositivo de cultura de película de camada única, contendo conjuntos de microcanais.

Um dispositivo de cultura de película estampada de camada única contendo conjuntos de múltiplos volumes de microcanais fechados tendo volumes de 20 μΐ, 2 μΐ e 0,2 μΐ, foi construído como segue. As películas para cada conjunto foram estampadas com ferramentas de diferentes configurações, cobertas com película de topo conforme descrito no Exemplo 11A, e cortadas em tiras de larguras diferentes, para dar os desejados volumes dos microcanais. As dimensões das tiras e os volumes dos microcanais para cada conjunto, são fornecidos na Tabela 11a. O dispositivo final de cultura de película de camada única foi montado pela aderência de duas tiras de cada conjunto de volume (30 microcanais por tira) adjacentes entre si na base de uma placa de Petri quadrada (“Integrid” 100 x 15 mm, Becton Dickenson, Lincoln Park, NJ). As tiras foram ligadas usando-se fita de transferência (Scotch 300LSE Hi Strength Adhesive, 3M Co.) e colocadas a aproximadamente 2 mm de distância. O dispositivo foi inoculado usando-se uma solução contendo um corante para colorir alimentos para propiciar contraste. Uma pipeta de transferência foi usada para colocar a solução de teste na “área interna” entre cada conjunto de tiras. Pela inclinação do dispositivo, o fluido drenou para baixo da “área interna” e encheu os microcanais de extremidade aberta (posicionados perpendicularmente à “área interna”) pela ação capilar. A solução excedente ficou contida por uma tira de toalha de papel colocada na base do dispositivo. Mediante o uso do dispositivo deste exemplo (60 microcanais por conjunto) e a fórmula de MPN delineada no Exemplo 3, as faixas de contagem para cada um dos três conjuntos foram calculadas e são fornecidas na Tabela 11a.

Este exemplo serve para demonstrar que um dispositivo de cultura de película de camada única contendo conjuntos de microcanais, pode o fornecer a base para um teste de enumeração bacteriana que seja tanto altamente sensível quanto cubra uma faixa de contagem muito ampla. D. Dispositivos de cultura de película de múltiplas camadas As estruturas de película de múltiplas camadas foram construídas de modo a aumentar tanto o volume total do líquido amostrado quanto o número de microcanais individuais incluídos no dispositivo de cultura. Duas construções foram preparadas laminando-se, juntas, as películas estampadas de camada única, e são descritas na Tabela 11b. As películas de camada única usadas na construção Dl de múltiplas camadas continham microcanais paralelos com uma seção transversal quadrada com lados de aproximadamente 0,2 mm x 0,2 mm. Cada microcanal foi espaçado aproximadamente de 0,1 mm de distância. As películas de camada única foram cortadas em tiras de 1,5 cm de largura x 1 cm de altura. Uma camada fina de adesivo (RD 1273, 3M Co.) foi aplicada atrás de cada tira, e as tiras foram empilhadas juntas para formar uma estrutura de múltiplas camadas contendo uma pluralidade de microcanais. A construção D2 foi montada usando-se as películas de camada única descritas no Exemplo 1 IA laminadas juntas usando-se uma camada fina de adesivo (Super Strength Adhesive, 3M Co.). A detecção de E. coli ATC 51813 foi demonstrada com o dispositivo D2 de película de múltiplas camadas (Tabela 11b), usando-se diluições em série das bactérias em meio VRB contendo vermelho de fenol (Exemplo 11 A). Uma extremidade do dispositivo foi imersa no meio, dessa forma enchendo cada microcanal por ação capilar. Após incubação durante a noite a 37°C, as mudanças de cor de vermelho a amarelo foram observadas nos microcanais contendo bactérias em cultivo, mediante visualização do dispositivo na margem.

Claims (8)

1. Dispositivo de ensaio para detectar microrganismos em uma amostra líquida compreendendo um substrato tendo uma pluralidade de microcanais de microcompartimentos, ditos microcanais tendo pelo menos um reagente de ensaio revestido no mesmo, em que o dispositivo é adaptado para ser inoculado com a amostra líquida através da ação capilar, caracterizado pelo fato de possuir múltiplas camadas de microcompartimentos.

2. Dispositivo de ensaio para detectar microrganismos, caracterizado pelo fato de compreender uma pluralidade de tubos capilares de microcompartimentos formados juntos, ditos tubos capilares tendo pelo menos um reagente de ensaio revestido no mesmo.

3. Dispositivo de ensaio, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que os diferentes microcompartimentos incluem diferentes reagentes de ensaio revestidos no mesmo.

4. Dispositivo de ensaio, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que dito reagente de ensaio compreende meio nutriente.

5. Dispositivo de ensaio, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de possuir múltiplas fileiras de microcompartimentos.

6. Dispositivo de ensaio, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de possuir uma pluralidade de conjuntos e microcompartimentos, cada conjunto de tamanho uniforme e os conjuntos variando em tamanho do microcompartimento.

7. Processo para conduzir um número de análises mais provável, usando qualquer um dos dispositivos como definidos nas reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de compreender: a) distribuir amostra a uma pluralidade de microcompartimentos de um dispositivo de cultura; b) incubar dito dispositivo de cultura por um tempo suficiente para permitir pelo menos um ciclo de divisão celular de ditos microorganismos; c) detectar a presença ou ausência de ditos microorganismos no microcompartimento; e d) conduzir uma análise mais provável com base no número de compartimentos em que o microorganismo é detectado.

8. Processo, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que a dita etapa de distribuir amostra para dito dispositivo compreende introduzir dito dispositivo em uma amostra líquida em que dita amostra inocula os microcompartimentos através da ação capilar.