BRPI1106429B1 - Ceftizoxima radiomarcada encapsulada em lipossomas recobertos com alendronato e uso - Google Patents

Abstract

ceftizoxima radiomarcada encapsulada em lipossomas recobertos com alendronato e uso a invenção descreve ceftizoxima radiomarcada encapsulada em lipossomas recobertos com alendronato e o seu uso em diagnóstico de osteomielite. o encapsulamento da ceftizoxima radiomarcada e o revestimento do lipossoma com alendronato possibilita maior direcionamento da mesma para o tecido ósseo, aumentando a concentração do radiotraçador no sítio alvo, consequentemente, melhorando a qualidade das imagens cintilográficas e favorecendo o diagnóstico precoce da doença.

Description

A invenção descreve ceftizoxima radiomarcada encapsulada em lipossomas recobertos com alendronato e o seu uso em diagnóstico de osteomielite. O encapsulamento da ceftizoxima radiomarcada e o revestimento do lipossoma com alendronato possibilita maior direcionamento da mesma para o tecido ósseo, aumentando a concentração do radiotraçador no sítio alvo, consequentemente, melhorando a qualidade das imagens cintilográficas e favorecendo o diagnóstico precoce da doença.

O tecido ósseo é um tipo especializado de tecido conjuntivo dotado de grande dureza, derivada da calcificação de sua matriz extracelular. A composição do osso varia com a idade, localização anatômica e estado nutricional. Em geral, a matriz mineral corresponde a 50 - 70 % do osso adulto, enquanto a matriz orgânica corresponde a 20 - 40 % (Hib, J. Di Fiore histologia, Guanabara Koogan, 2003; Shea, J. E.; Miller, S. C. Skeletal function and structure: Implications for tissue-targeted therapeutics. Advanced Drug Delivery Reviews, v. 57, n. 7, p. 945-957, 2005).

A maior parte da matriz mineral é constituída por hidroxiapatita [Caw (PO4)6(OH)2] que garante a rigidez e força necessárias às funções ósseas. A hidroxiapatita consiste de pequenos cristais de tamanho aproximado a 200 Â e contém muitas impurezas, incluindo carbonato e magnésio. As imperfeições na estrutura permitem a entrada de água, com liberação de íons quando necessários à homeostase (Anada, T.; Takeda, Y.; Honda, Y.; Sakurai, K.; Osamo, S. Synthesis of calcium phosphate-binding liposome for drug delivery. Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters, v.19, p.4148-4150, 2009; Avioli, L.; Krane, S. Metabolic bone disease and clinically related disorders, 3a Ed, Lippincott Willians and Wilkins, 1998).

O desenvolvimento e manutenção do esqueleto requerem que o tecido ósseo seja constantemente absorvido e produzido. Em indivíduos saudáveis, este balanço é bem coordenado, com a massa do osso e a integridade de sua microestrutura mantidas. Entretanto, distúrbios deste equilíbrio são vistos em numerosas doenças ósseas, incluindo osteoporose, doença de Paget, metástases ósseas, artrite reumatóide, osteomielite, entre outras (Rodan, G. A.; Martin, T. J. Therapeutic approaches to bone diseases. Science, v. 289, p. 1508-1514, 2000).

A captação de fármacos na região óssea é ainda limitada devido às características do tecido que é constituído basicamente por hidroxiapatita. Uma estratégia adequada para este problema é a produção de fármacos com alta afinidade pela hidroxiapatita. Os bifosfonatos são uma classe de compostos sintéticos estrutural mente relacionados ao pirofosfato que rapidamente se localizam na superfície óssea após administração endovenosa ou oral, uma vez que a porção P-C-P da sua estrutura possui alta afinidade pela hidroxiapatita. A modificação de drogas ou sistemas com bifosfonatos pode ser um método promissor para a entrega seletiva de fármacos para o tecido ósseo (Hirabayashi, H.; Fujisaki, J. Bone-specific drug delivery systems: approaches via chemical modification of bone-seeking agents. Clinical Pharmacokinetics, v. 43, n. 15, p. 1319-1330, 2003).

Os bifosfonatos são os fármacos mais amplamente utilizados e os mais eficientes agentes antirreabsorção para o tratamento de doenças nas quais há um aumento do número ou atividade dos osteoclastos (Rogers, M. J. From molds and macrophages to mevalonate: a decade of progress in understanding the molecular mode of action of bisphosphonates. Calcified Tissue International, v.75, p. 451-461, 2004).

Os bifosfonatos são análogos sintéticos do pirofosfato, uma substância de ocorrência natural que inibe a mineralização dos ossos (Roelofs, A. J.; Thompson, K. Gordon, S; Rogers, M. J. Molecular mechanisms of action of biphosphonates: current status. Clinical Cancer Research, v. 12, n. 20, p. 6222- 6230, 2006). Nestes fármacos, o átomo de oxigênio central é substituído por um átomo de carbono com dois outros substituintes, sem perda da afinidade pela região óssea (Sweetman, S. C. Martindale: The Complete Drug Reference, 35a Ed., Pharmaceutical Press, 2007). A ligação fósforo-carbono-fósforo confere resistência à hidrólise química e enzimática (Compston, J. E. Fortnightly review: The therapeutic uses of biphosphonates. BMJ, v. 309, n.6959, p.711-715, 1994). Além disto, esta estrutura confere a capacidade de ligação a ions metálicos divalentes, tal como Ca2+’ presentes na hidroxiapatita. Por esta razão, os bifosfonatos são rapidamente eliminados da circulação e se ligam às superfícies minerais do osso em regiões de remodelação óssea ativa, particularmente as áreas sujeitas à reabsorção osteoclástica (Roelofs et al., 2006).

Os bifosfonatos ligados à matriz mineral óssea podem ser liberados no ambiente ácido gerado pelos osteoclastos durante o processo de reabsorção óssea, uma vez que sua capacidade de complexação aos íons cálcio diminui quando há diminuição do pH por protonação dos grupos fosfato, sendo em seguida, endocitados (Rogers, M. J.; Crockett, J. C.; Coxon, F. P.; Mõnkkõnen, J. Biochemical and molecular mechanisms of action. Bone, 2010).

Devido a sua alta afinidade pelo osso, liberação localizada durante a reabsorção osteoclástica e acumulação eficiente nos osteoclastos por endocitose, os bifosfonatos possuem uma alta especificidade por regiões de remodelação óssea (Roelofs et al., 2006). Estes fármacos têm sido, então, estudados como potenciais agentes para vetorização óssea de drogas e agentes de imagem quando conjugados a outros ativos ou estruturas (Anada et al., 2009; Ironside, M. S.; Duer, M. J.; Reid, D. G.; Byard, S. Biphosphonate protonation state, conformations and dynamics on bone mineral probed by solid-state NMR without isotope enrichment, European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics, v. 76, n. 1, p. 120-126, 2010; Salerno, M; Cenni, E.; Fotia, C.; Avnet, S.; Granchi, D.; Castelli, F.; Micieli, D.; Pignatello, R.; Capulli, M.; Rucci, N.; Angelucci, A.; Del Fattore, A.; Teti, A.; Zini, N.; Giunti, A.; Baldini, N. Bone-targeted doxorubicin-loaded nanoparticles as a tool for the treatment of skeletal metastases. Current Cancer Drug Targets, v.10, p. 649-659, 2010).

A osteomielite é uma infecção óssea que acomete a medula óssea e o tecido cortical adjacente, causada mais comumente por bactérias piogênicas e micobactérias sendo a principal complicação após fraturas e tratamentos cirúrgicos ósseos (Fauci, A. S.; Braunwald, E.; Kasper, D. L.; Hauser, S. L.; Longo, D. L.; Jameson, J. L.; Loscalzo, J. Harrison’s principles of internal medicine, 17a Ed., Mc-Graw Hill, 2008; Martin-Comin, J.; Arias, M. I. A.; Farto, J. C. A. Diagnostico de la inflamación y de la infection en Medicina Nuclear, 2005). Os microrganismos atingem o osso por disseminação hematogênica, por continuidade através da disseminação de infecções de tecidos moles adjacentes ou por penetração direta (Tierney, L; McPhee, S; Papadakis, M. Current Medical Diagnosis and Treatment, 45a Ed., Mc-Graw Hill Medical, 2006). O S. aureus é o agente etiológico da osteomielite mais prevalente, sendo responsável por mais de 50 % dos casos, seguido pelos microrganismos do gênero Streptococcus e Escherichia (Cecil, L; Goldman, L; Ausiello, D. Cecil textbook of medicine, 23a Ed., Elsevier, 2008). A persistência da infecção leva a uma infecção polimicrobiana (Martin-Comin et al., 2005).

No Brasil, dados epidemiológicos do Sistema Único de Saúde demonstraram que, em 2010, a doença foi responsável por cerca de 17.000 internações, gerando um gasto de 13 milhões de reais, com uma taxa de mortalidade de cerca de 1,19 mortos para cada 100 doentes (DATASUS, Informações de Saúde / Ministério da Saúde. Disponível em: <http://tabnet.datasus.gov.br>. Acesso em: 27/01/2011).

Existem diferentes sistemas de classificação para descrição da osteomielite (Pineda, C.; Vargas, V.; Rodríguez, A. Imaging of osteomyelitis: current concepts. Infections Disease Clinics of North America, v. 20, p. 789- 825, 2006). No que se refere às fases clínicas da doença, há evidências de que possa ser classificada como aguda e crônica (Cecil; Goldman; Ausiello, 2008; Fauci, 2008; Lew, D.; Waldvogel, F. Current concepts: Osteomyelitis. The New England Journal of Medicine, v. 336, n.14, p. 999-1007, 1997).

A osteomielite aguda é uma infecção supurada que se caracteriza por dilatação vascular, edema, trombose, infiltração de células inflamatórias e formação de abcessos (Boutin, R.; Brosmann, J.; Sartoris, D.; Reilly, D.; Resnick, D. Update on imaging of orthopedic infections. Orthopedic Clinics of North America, v. 29, N.1, p. 41-66, 1998; Calhoun, J.; Manring, M. Adult osteomyelitis, Infectious Disease Clinics of North America, v. 19, p. 765-786, 2005). À medida que o infiltrado inflamatório se dissemina na cavidade intramedular, o aumento da pressão faz com que os patógenos se estendam ao córtex através dos canais de Havers e Volkmann, com subsequente, disseminação ao periósteo e aos tecidos moles adjacentes. Isto pode resultar em elevação do periósteo e abcessos subperiosteais, principalmente em crianças (Boutin et al., 1998; Karmazyn, B. Imaging approach to acute hematogenous osteomyelitis in children: an update. Seminars in Ultrasound, CT and MRI, v. 31, p. 100-106, 2010). A falta de tratamento pode levar à cronificação da doença, risco aumentado de sepse, redução do crescimento ósseo e deformação óssea (Karmazyn, 2010).

A osteomielite crônica sucede uma infecção aguda em até 30% dos casos, acometendo adultos e crianças. Normalmente, a cronificação ocorre duas semanas após a instalação da infecção, sendo caracterizada clinicamente por dor local de baixa intensidade, entretanto, este tipo de infecção pode manter-se assintomático durante um longo período até que a reativação da doença ocorra (El-Manghraby, T.; Moustafa, H.; Pauwels, E. Nuclear medicine methods for evaluation of skeletal infection among other diagnostic modalities. The Quarterly Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging, v. 50, n. 3, p. 167-192, 2006; Reinehr, T.; Bürk, G.; Michel, E.; Andler, W. Chronic osteomyelitis in childhood: is surgery always indicated? Infection, v. 28, n. 5, p. 282-286, 2000). A redução do aporte sanguíneo a determinadas áreas do osso pode provocar o desprendimento de fragmentos de tecido ósseo necrótico (sequestro). As fraturas são a complicação mais comum da osteomielite crônica (El-Manghraby; Moustafa; Pauwels, 2006).

O diagnóstico precoce da osteomielite aguda é extremamente importante para prevenir mortalidade, morbidade e deformações ósseas e para assegurar que o tratamento cirúrgico ou terapêutico adequado seja iniciado antes que a cronificação da doença ocorra (Cheon, J. E.; Chung, H. W.; Hong, S. H.; Lee, K. H.; Yeon, K. M.; Kang, H. S. Sonography of acute osteomyelitis in rabbits with pathologic correlation. Academic Radiology, v. 8(3), p. 243-249, 2001; Raptopoulos V, Doherty PW, Goss TP, King MA, Johnson K, Gantz NM. Acute osteomyelitis: Advantage of white cell scans in early detection. American Journal of Roentgenology, v. 138, p. 1077-1082, 1982; TAS, F.; Oguz, S.; Bulut, O.; Bulut S.; Isik AO. Comparison of the diagnosis of plain radiography ultrasonography and magnetic resonance imaging in early diagnosis of acute osteomyelitis experimentally formed on rabbits. European Journal of Radiology, v. 56, p. 107-112, 2005).

Exames laboratoriais como contagem de leucócitos sanguíneos e velocidade de sedimentação de eritrócitos (VSE) não são capazes de diferenciar inflamação séptica de asséptica. A proteína C reativa sérica (PCR) é elevada nos casos de cirurgia, como colocação de prótese, mas tende a voltar a níveis normais dentro de semanas. A manutenção de valores elevados é sugestiva de infecção. Entretanto, nos casos não relacionados a cirurgias, não se pode determinar a causa do aumento. Outro parâmetro que pode ser avaliado, a determinação dos níveis de procalcitonina, ainda não é bem estabelecido para a osteomielite, apesar de ser importante para o diagnóstico de outras infecções (Trampuz, A.; Zimmerli, W. Diagnosis and treatment of implant-associated septic arthritis and osteomyelitis. Current Infectious Disease Reports, v. 10, p. 394-403, 2008).

Culturas apresentam resultados variáveis, sendo positivas de 20 a 90 % dos casos de osteomielite (Karmazyn, 2010; Restrepo, C.; Giménez, C.; McCarthy, K. Imaging of osteomyelitis and musculoskeletal soft tissue infections: current concepts. Rheumatic Disease Clinics of North America, v. 29, p. 89-109, 2003). O inconveniente do emprego deste método é a necessidade de coleta de material na região acometida, levando à possibilidade da introdução de bactérias provenientes de tecidos moles infeccionados adjacentes ao osso originalmente estéril (Awasthi, V. et al. Imaging experimental osteomyelitis using radiolabeled liposomes. The Journal of Nuclear Medicine, v. 39(6), p. 1089-1094, 1998).

A fim de se evitar o emprego de técnicas invasivas e fornecer mais informações a respeito da extensão e do local exato acometido pela infecção, várias técnicas de imagem têm sido utilizadas para diagnóstico da osteomielite, o que inclui duas modalidades básicas: imagens anatômicas e imagens funcionais (El-Manghraby; Moustafa; Pauwels, 2006).

Imagens anatômicas ou morfológicas incluem radiografia, tomografia computadorizada, ultrassonografia e ressonância magnética. Estas técnicas revelam as alterações estruturais dos tecidos e órgãos que, no caso de infecções, são produzidas pela combinação da presença dos microrganismos e da resposta inflamatória do hospedeiro. Imagens funcionais empregam pequenas quantidades de materiais radioativos (traçadores) que são capturados diretamente por células, tecidos e órgãos ou se ligam a substâncias nativas do organismo e, posteriormente, migram para a região de interesse (Palestro C.J., Love C., Miller T.T., Diagnostic imaging tests and microbial infections. Cellular Microbiology, v.9, n.10, p.2323-2333, 2007). As técnicas funcionais mostram-se capazes de diagnosticar infecção e inflamação nos seus estágios iniciais, uma vez que se baseiam nas alterações fisiológicas destes processos, quando alterações nas estruturas anatômicas podem não ser aparentes (Corstens, F. H. M.; Van Der Meer, J. W. M. Nuclear medicine’s role in infection and inflammation. The Lancet, v. 354, p. 765-770, 1999). Além disto, as imagens funcionais apresentam a vantagem de permitir a imagem de corpo inteiro do paciente de uma só vez, enquanto as técnicas anatômicas fornecem imagens de uma área limitada do corpo a cada exame (Barreto, V. G.; Iglesias, F.; Roca, M.; Tubau, F.; Martin-Comin, J. Labelling of ceftizoxime with 99m-Tc. Revista Espanola de Medicina Nuclear, v. 19, n. 7, p. 478-483, 2000).

Devido à sua capacidade de se ligar à hidroxiapatita óssea, os bifosfonatos radiomarcados com Tecnécio-99m (99mTc), tais como o "mTc- metilenodifosfonato (99mTc-MDP) e "mTc-hidroxirnetanodifosfonato ("mTc- HDP), são os radiofármacos mais amplamente utilizados para identificação de regiões de alta remodelação óssea, podendo ser utilizados para o diagnóstico de osteomielite (Van Der Bruggen, W.; Bleeker-Rovers, C. P.; Boerman, O. C.; Gotthard, M.; Oyen, W. J. G. PET and SPECT in osteomyelitis and prosthetic bone and bone infections: A systematic review. Seminars in Nuclear Medicine, v. 40, p. 3-15, 2010). Embora a sensibilidade desta técnica para diagnóstico de osteomielite seja elevada (acima de 80 %) a especificidade é limitada (inferior a 50 %), já que outras patologias que levam ao aumento da permeabilidade vascular e taxa de metabolismo ósseo, como trauma recente, cirurgia, dispositivos ortopédicos, lesões malignas primárias ou secundárias podem induzir resultado falso positivo (Gotthardt et al., 2010; Van Der Bruggen et al., 2010).

O radiofármaco citrato de 67Ga pode ser utilizado para a identificação de osteomielite uma vez que este radiofármaco é capaz de se ligar à transferrina circulante, devido à sua similaridade ao íon ferro. Em regiões de permeabilidade aumentada, o complexo formado extravasa e o radiofármaco é capaz de se ligar à lactoferrina, liberada pelos leucócitos ativados, assim como aos sideróforos, substâncias capazes de captar ferro liberadas especificamente por bactérias (Martin-Comin et al., 2005). Embora a cintilografia com citrato de 67Ga apresente elevada sensibilidade para infecções agudas e crônicas, bem como para inflamações assépticas, o emprego deste radiofármaco é limitado em virtude de sua baixa especificidade, da necessidade de aguardar entre 18 e 72 horas para a aquisição das imagens e da elevada exposição do paciente à radiação em virtude da longa meia-vida física do radionuclídeo (3 dias) e da alta energia (1MeV) da radiação gama emitida (Boerman, O. C.; Oyen, W. J.; van Bloois, L.; Koenders, E. B.; van der Meer, J. W.; Corstens F. H.; Storm, G. Optimization of technetium-99m-labeled PEG liposomes to image focal infection: effects of particle size and circulation time. Journal of Nuclear Medicine, v.38, p.489-493, 1997; Van Der Bruggen et al., 2010).

Os leucócitos autólogos radiomarcados tornaram-se o método de escolha para diagnóstico da maioria dos casos de infecção óssea, uma vez que apresenta sensibilidade superior a 95 % (El-Manghraby; Moustafa; Pauwels, 2006; Van Der Bruggen et al., 2010). A captação dos leucócitos radiomarcados depende da quimiotaxia, do número e tipo de células marcadas e dos componentes celulares da resposta inflamatória em questão (Love, C.; Palestro, C. Radionuclide imaging of infection. Journal of Nuclear Medicine Technology, v. 32, n. 2, p. 47-57, 2004). Ainda, esta técnica apresenta algumas restrições. No caso da marcação com 111ln-oxiquinolina, destaca-se a baixa disponibilidade desse radioisótopo quando comparado ao "mTc e a necessidade de esperar 24 horas para a realização das imagens. No caso da marcação com "mTc-hexarnetilpropilenoamino oxima (99mTc-HMPAO), a excreção urinária e fecal podem dificultar a visualização das estruturas abdominais (El-Manghraby; Moustafa; Pauwels, 2006). Além disto, independentemente do radioisótopo escolhido, a marcação requer procedimento demorado e laborioso, que inclui a manipulação de sangue potencialmente contaminado e de seus derivados (Palestro; Love; Miller, 2007). Embora leucócitos radiomarcados com 111ln ou "mTc tenham um papel importante no diagnóstico de infecções, incluindo a osteomielite, como a resposta neutrofílica está presente tanto em processos infecciosos quanto em não-infecciosos, esta técnica não é adequada para a distinção destas duas condições. Além disto, com a cronificação, há diminuição da mobilização de leucócitos para a região acometida pela doença, diminuindo sua sensibilidade (Hall A.V., Solanki K.K., Vinjamuri S., Britton K.., Das S.S. Evaluation of the efficacy of "mTc-lnfecton, a novel agent for detecting sites of infection. The Journal of Clinical Pathology, v.51, p.215-219, 1998; Sonmezoglu, K. et al. Usefulness of 99mTc-ciprofloxacin (infection) scan in diagnosis of chronic orthopedic infections: comparative study with 99mTc-HMPAO leukocyte scintigraphy. The Journal of Nuclear Medicine, v. 42(4), p. 567-574, 2001; Benitez A., Roca M., Martin-Comin J., Labeling of antibiotics for infection diagnosis. The Quarterly Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging, v.5O, p.147-152, 2006; Van Der Bruggen et al., 2010).

A técnica de tomografia por emissão de positrons (PET) apresenta maior resolução intrínseca quando comparada às técnicas convencionais de medicina nuclear, o que facilita a localização precisa de sítios de infecção e inflamação (Palestro; Love; Miller, 2007). O 18Fluor-fluorodesoxiglicose (18FDG) é um análogo radiomarcado da glicose, que se acumula em sítios de inflamação e infecção, possivelmente devido à maior expressão de transportadores de glicose (glut-1 e glut-3) no tecido inflamatório. Devido à similaridade com a glicose, no interior das células, o radiofármaco é convertido à fluorodesoxiglicose-6-fosfato, que não pode mais ser metabolizado, se acumulando (Van Der Bruggen et al., 2010). Trata-se, contudo, de um traçador inespecífico, cuja utilização é limitada pela obtenção de falsos positivos em pacientes apresentando tumores e fraturas e pela incapacidade na diferenciação de processos assépticos e sépticos em próteses de articulação (Palestro; Love; Miller, 2007).

A distinção entre inflamações assépticas e sépticas é clinicamente relevante em várias situações no campo das doenças osteoarticulares (Sarda L., Crémieux A.C., Lebellec Y., Meulemans A., Lebtahi R., Hayem G., Génin R., Dalahaye N., Huten D., Le Guludec D. Inability of "mTc-Ciprofloxacin Scintigraphy to discriminate between septic and sterile osteomuscular diseases. The Journal of Nuclear Medicine, v.44, n.6, p.920-926, 2003). Como exemplos, podem-se citar o diagnóstico de artrites séptica ou asséptica, a investigação de falhas em artroplastias, o diagnóstico de infecções espinhais pós-operatórias e o diagnóstico de infecção em próteses de articulação (Pineda; Vargas; Rodríguez, 2006)

Ainda em fase de experimentação, o emprego de antibióticos radiomarcados surgiu como uma idéia promissora para a detecção de lesões infecciosas em virtude de sua ligação específica a componentes de bactérias. A grande vantagem dos antibióticos reside na possibilidade de diferenciar lesões inflamatórias sépticas das estéreis. Além disso, apresentam baixa toxicidade para o homem, uma vez que agem sobre alvos microbiológicos e são administrados numa dose muito inferior à dose terapêutica usual (Pineda; Vargas; Rodríguez, 2006; Wareham, D.; Michael, J.; Das, S. Advances in bacterial specific imaging. Brazilian Archives of Biology and Technology, v. 48, p. 145-152, 2005; Benitez et al., 2006).

A ceftizoxima (OFT) é um antibiótico utilizado como radiotraçador. Trata- se de uma cefalosporina semissintética de 3a geração, que possui amplo espectro contra bactérias Gram positivas e negativas. Este antibiótico liga-se à parede bacteriana, inibindo a formação de peptideoglicanos, comprometendo a formação da parede celular e, consequentemente, provocando a morte da bactéria. A CFT é solúvel em água, sensível à luz e administrada por via parenteral. A excreção da CFT ocorre de forma inalterada na urina por meio de filtração glomerular e secreção tubular. Além disto, a CFT apresenta vários grupos funcionais (amida, amina, sulfeto) que podem atuar como doadores de elétrons, permitindo a ligação a átomos de tecnécio reduzido (Barreto et al., 2000).

Barreto e colaboradores (2000) desenvolveram um método para marcação de CFT com "mTc, apresentando elevado rendimento (aproximadamente 95%) e estabilidade até seis horas após a marcação, sem prejuízo da atividade antibiótica original. Posteriormente, Diniz e colaboradores (2005) desenvolveram um kit liofilizado contendo CFT para uso em medicina nuclear. O kit também apresentou elevado rendimento de marcação (aproximadamente 92%) e a estabilidade do radiofármaco foi mantida até 6 horas após a marcação (Diniz, S. O. F.; Siqueira, C. F.; Nelson, D. L; Martin- Comin, J.; Cardoso, V. N. Technetium-99m ceftizoxime kit preparation. Brazilian Arquives of Biology and Technology, v. 48, p. 89-96, 2005).

Estudos demonstraram que "mTc-CFT apresenta elevada afinidade por bactérias viáveis. Observou-se que a captação do radiofármaco no músculo dos ratos que apresentavam inflamação estéril foi muito inferior quando comparada à captação no abcesso infeccioso. Além disto, em imagens tardias, observou-se que a atividade de "mTc-CFT reduziu no foco inflamatório estéril, mas aumentou no foco infeccioso. Estudos iniciais em pacientes com inflamação / infecção demonstraram sensibilidade, especificidade e exatidão equivalentes a 100, 83 e 94%, respectivamente (Benitez et al., 2006).

Resultados obtidos por Diniz e colaboradores (2008) reiteraram o potencial de aplicação de "mTc-CFT na diferenciação de processos inflamatórios sépticos e assépticos. "mTc-CFT foi injetada em ratos, na tíbia dos quais foram induzidos foco infeccioso com suspensão de S. aureus ou foco inflamatório asséptico com zimosan 5% (p/v). Imagens cintilográficas obtidas entre 4 e 6 horas após a injeção do radiofármaco demonstraram fixação de "mTc-CFT nos focos infecciosos, mas não nos processos inflamatórios assépticos. A razão da quantidade de radioatividade determinada no alvo em relação ao não alvo foi, em média, significativamente maior para focos infecciosos (2,40 + 0,22) quando comparada a do foco inflamatório asséptico (1,50 + 0,05) e grupo controle (1,05 + 0,04), permitindo concluir que "mTc-CFT pode ser usada como agente de diagnóstico diferencial entre estes dois processos (Diniz S.O., Rezende C.M., Serakides R., Ferreira R.L., Ribeiro T.G., Martin-Comin J., Cardoso V.N., Scintigraphic imaging using technetium-99m- labeled ceftizoxime in an experimental model of acute osteomyelitis in rats. Nuclear Medicine Communications, v.29, n.9, p.830-836, 2008).

Determinados fármacos que apresentam resultados satisfatórios em culturas celulares falham em produzir o mesmo efeito no corpo humano por ineficiência para atingir a região desejada, necessitando-se a administração de doses altas, o que leva ao aumento nos efeitos adversos. Esta ineficiência pode estar relacionada à baixa solubilidade e instabilidade da substância nos fluidos corporais, o que leva a baixa biodisponibilidade; à alta ligação às proteínas plasmáticas, que pode impedir a passagem do fármaco através de barreiras como a hemato-encefálica e à inespecifidade do agente, que pode se acumular em vários órgãos. A baixa disponibilidade resulta em tratamento ineficiente e risco aumentado de toxicidade e, até mesmo, morte. Devido a isto, nos últimos anos, interesse em sistemas nanoestruturados carreadores de fármacos tem surgido na área farmacêutica (Rawat, M.; Singh, D.; Saraf, S.; Saraf, S. Nanocarriers: Promising vehicle for bioactive drugs. Biological and Pharmaceutical Bulletin, v.29, n.9, p. 1790-1798, 2006). Os sistemas nanoestruturados são assim chamados por apresentarem diâmetro na escala nanométrica, preferencialmente entre um e 100 nm. Estes sistemas podem conter fármacos e agentes de imagem encapsulados, adsorvidos ou conjugados à sua estrutura. Quando utilizados como carreadores de fármacos ou agentes de diagnóstico, oferecem algumas vantagens, tais como redução do volume de distribuição, alteração na farmacocinética e aumento da disponibilidade do fármaco no alvo com baixa concentração em tecidos sadios, o que podem resultar em maior eficácia e menor toxicidade (Drummond, D. C.; Meyer, O.; Hong, K.; Kirpotin, D. B.; Papahadjopoulos, D. Optimizing liposomes for delivery of chemotherapeutic agents to solid tumors. Pharmacology Reviews, v. 54, n. 4, p. 691-743, 1999; KOO, O.; Rubinstein, I; Onyuksel, H. Role of nanotechnology in targeted drug delivery and imaging: a concise review. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology and Medicine, v. 1, p. 193- 212, 2005).

Em tumores e processos inflamatórios, a permeabilidade vascular, assim como o fluxo sanguíneo encontram-se aumentados, facilitando a captura destes nanossistemas por difusão passiva (Moghimi, S.; Szebeni, J. Stealth liposomes and long circulating nanoparticles: critical issues in pharmacokinetics, opsonization and protein-binding properties. Progress in Lipid Research, v. 42, p. 463-479, 2003). Os nanossistemas podem, ainda, ser utilizados para a entrega do fármaco em alguns tecidos ou processos patológicos por interações específicas. Isto pode ser alcançado por funcionalização da superfície dos carreadores, com substâncias específicas que interajam com receptores superexpressos nas células doentes ou substâncias presentes na região acometida pelo processo patológico ativo (Jolck, R. I.; Feldborg, L. N.; Andersen, S.; Moghimi, S.M.; Andresen, T. L. Engineering liposomes and nanoparticles for biological targeting. Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology. p. 1-30, 2010).

A associação de fármacos já em uso a um sistema transportador, visando direcioná-los para a célula alvo ou tecido alvo e evitar os locais indesejáveis onde este exerce toxicidade, oferece um ganho de tempo na fase de desenvolvimento de um produto porque utiliza um fármaco já caracterizado do ponto de vista farmacológico (Frézard, F. Schettini, D. A.; Rocha, O. G. F.; Damichelli, C. Lipossomas: propriedade físico-químicas e farmacológicas, aplicações na quimioterapia à base de antimônio. Química Nova, v. 28, n. 3, p. 511-518, 2005).

Dentre os diversos sistemas nanoestruturados utilizados para fins de diagnóstico podem-se citar os lipossomas. Lipossomas são sistemas lipídicos dispersos constituídos freqüentemente por fosfolípides, os quais em meio aquoso se organizam espontaneamente em bicamadas formando vesículas esféricas. Considerando que os lipossomas são constituídos por moléculas anfifílicas, os mesmos são capazes de encapsular substâncias hidrofílicas, lipofílicas e anfifílicas. Moléculas hidrofílicas são encapsuladas na sua cavidade interna, onde estão presentes os grupos polares dos fosfolípides. As substâncias lipofílicas são acomodadas na região apolar da bicamada e as anfifílicas ao longo de toda sua extensão, interagindo com a região apoiar e polar. Os lipossomas convencionais, quando administrados por via endovenosa, sofrem adsorção de proteínas séricas (opsoninas), ocasionando sua captura pelas células do sistema fagocitário mononuclear (SFM), sobretudo no fígado, baço e medula óssea. Foi observado que a incorporação, na membrana dos lipossomas, de lipídeos acoplados a polímeros de etilenoglicol (PEGs), altera sua interação com o ambiente, sendo o efeito mais importante o impedimento da captura pelos macrófagos e a prolongação de sua presença na corrente sanguínea. Estes lipossomas, denominados lipossomas de circulação prolongada, permitem uma distribuição do fármaco para outros órgãos além daqueles do SFM (Fontes, A. P. S.; Cesar, E. T.; Beraldo, H. A química Inorgânica na terapia do câncer. Cadernos Temáticos de Química Nova na Escola, n. 6, p. 13-18, 2005.). Concentrações de 5-10 % de fosfatidiletanolamina acoplado a PEG (PE-PEG) de massa molecular 1000- 2000 Da conferem excelente estabilidade às formulações (Ulrich, A. S. Biophysical aspects of using liposomes as delivery vehicles. Bioscience Reports, v. 22, p. 129-150, 2002).

Os lipossomas podem se localizar em órgãos ou tecidos específicos de forma passiva ou ativa. A captação passiva está relacionada a estruturas ou processos anatômicos naturais, que regulam sua distribuição e disposição. Em presença de inflamação, infecção ou tumores, a captação passiva está relacionada à permeabilidade e fluxo sanguíneo aumentados que permitem o extravasamento dos nanossistemas; já a captação ativa é alcançada pela utilização de imunolipossomas ou lipossomas de superfície modificada com ligantes (Forssen, E.; Willis, M. Ligand-targeted liposomes. Advanced Derug Delivery Reviews* v. 29, n. 3, p. 249-271, 1999; Surendiran, A.; Sandhiya, S.; Pradhan, S. C.; Adithan, C. Novel applications of nanotechnology in medicine. Indian Journal of Medical Research, v. 130, p. 689-701, 2008).

Para a produção de lipossomas de superfície modificada, o ligante deve ser específico para a região de interesse, uma vez que a captação deve ser direcionada a um determinado órgão ou tecido. Deve-se, então, procurar ligantes para receptores ou substâncias que sejam superexpressas nas células ou tecidos acometidos pela patologia e que estejam ausentes ou minimamente expressas nos tecidos sadios (Wang, M.; Thanou, M. Targeting nanoparticles to cancer. Pharmacological Research, v. 62, p. 90-99, 2010).

Apesar de serem comuns para lipossomas, os ligantes de superfície podem ser utilizados na maioria dos sistemas coloidais de carreamento de fármacos. Estudos de Salerno e colaboradores (2010) demonstraram a capacidade de nanopartículas poliméricas revestidas por alendronato direcionarem o fármaco doxorrubicina para tratamento de tumores ósseos em modelos experimentais. O direcionamento foi possível, uma vez que em regiões tumorais, assim como inflamatórias e infecciosas, nos ossos há alta taxa de remodelação óssea e, consequentemente, deposição de hidroxiapatita, substância pela qual o alendronato possui alta afinidade (Shea & Miller, 2005).

O emprego de antibióticos radiomarcados para a identificação de infecções tem se mostrado uma área promissora para o diagnóstico de patologias infecciosas, uma vez que apresentam ligação específica a bactérias viáveis. Apesar dos avanços na pesquisa, devido a sua estrutura mineral, o tecido ósseo não permite grande captação dos radiofármacos. O emprego de nanossistemas com alta afinidade pela região óssea como carreadores de antibióticos radiomarcados torna-se uma área de interesse, permitindo um maior acúmulo do radiofármaco na região acometida pela infecção, proporcionando melhor qualidade das imagens cintilográficas e, consequentemente, favorecendo o diagnóstico precoce da doença.

O preparo de lipossomas revestidos com alendronato contendo ceftizoxima radiomarcada com "mTc para direcionamento ósseo torna-se, assim, uma perspectiva interessante no diagnóstico de processos infecciosos. Sabe-se que a precocidade no diagnóstico é de fundamental importância para a conduta terapêutica e eficiência do tratamento. O diagnóstico precoce de infecções ósseas, como a osteomielite, permite a rápida instalação do tratamento, diminuindo o risco de cronificação e fraturas. Assim, a técnica proposta tem aplicação como metodologia auxiliar para o diagnóstico de infecções ósseas, auxiliando na detecção precoce desta doença, o que muitas vezes não é possível com as técnicas convencionais de imagem.

O documento BRPI0604132- Kit para teste com antibiótico radiomarcado- descreve um Kit de radiofármaco empregando um antibiótico, ceftizoxima (CFT), capaz de ser marcado com o isótopo radioativo 99mtecnécio para gerar imagens cintilográficas de focos infecciosos.

A presente tecnologia torna-se vantajosa em relação ao documento supracitado por permitir maior acúmulo da "mTc-CFT nas regiões de infecção óssea, quando comparados ao radiofármaco livre. Isto pode levar a uma diminuição da dose de radiação necessária para a realização dos exames de imagem cintilográfica, com menor exposição do paciente à radiação.

O documento PI0700940-2- Processo de preparação de formulações de lipossomas pH-sensíveis radiomarcados com 99mtecnécio, produto e usos- descreve processo de obtenção de lipossomas pH-sensíveis radiomarcados (99mTc-HMPAO ) e seu uso como agente de imagem citilográfica de focos inflamatórios ou infecciosos.

A tecnologia supracitada não permite a diferenciação entre focos infecciosos e inflamatórios, ao contrário da presente tecnologia, que permite essa diferenciação devido à presença do antibiótico radiomarcado. Além disso, os lipossomas radiomarcados não são direcionados a um sítio específico.

Vários outros documentos descrevem o uso de lipossomas radiomarcados ou contendo drogas radiomarcadas no diagnóstico e tratamento de doenças, mas nenhum está relacionado com a presente tecnologia:

O documento US2011158903- One pot processes of preparing multifunctional lipossome drug for imaging, delivery and targeting in cancer diagnosis and therapy- Descreve um processo para preparar lipossomas multifuncionais em que o lipossoma marcado com um radionuclídeo, carreando uma droga quimioterápica e um ligante alvo, é utilizado no diagnóstico do câncer e em quimioterapia.

O documento US2009/0232731- Cationic liposomal preparations for the treatment of rheumatoid arthritis- refere-se ao uso de preparações lipossomais para o tratamento ou diagnóstico de artrite reumatóide ou desordens relacionadas. Sendo o agente ativo, contido no lipossoma, um antiinflamatório.

O documento WO2011/059262- Uses of apoptotic cell-targeting peptides, label substances and liposomes contining a therapeutic agent for preventing, treating or therapeutically diagnosing apoptosis-related diseases- relata composições para prevenir, tratar ou diagnosticar doenças relacionadas à apoptose compreendendo: peptídeos direcionados às células apoptóticas, substâncias marcadas e lipossomas contendo um agente terapêutico como ingrediente ativo.

Breve Descrição das Figuras

Figura 1 - Imagens cintilográficas de ratos Wistar infectados por S. aureus (visão anterior) após a injeção endovenosa dos Lip-"mTc-CFT (superior) e ALip-"mTc-CFT (inferior). As imagens foram obtidas nos intervalos de tempo de 1, 2, 4, 6 e 8 horas. A seta branca indica o local do foco infeccioso.

Figura 2 - Análise quantitativa das imagens cintilográficas de ratos Wistar acometidos por osteomielite, após injeção endovenosa dos Lip-"mTc-CFT (■) e ALip-"mTc-CFT (•). As relações alvo/não alvo foram calculadas a partir da análise do ROI das imagens. A letra a indica diferença estatisticamente significativa entre o grupo tratado com ALip-"mTc-CFT e Lip-"mTc-CFT para cada intervalo de tempo (p<0,05).

Figura 3 - Análise quantitativa das imagens cintilográficas de ratos Wistar sadios (■), acometidos por osteomielite (A) e por inflamação asséptica (•), após injeção endovenosa dos ALip-"mTc-CFT. As relações alvo/não alvo foram calculadas a partir da análise do ROI das imagens. As letras a, b e c indicam diferença estatisticamente significativa entre os grupos para cada intervalo de tempo.

Figura 4 - Figura 1 - Perfil de concentração dos ALip-"mTc-CFT no fígado, baço e pulmão após a sua administração intravenosa em ratos Wistar acometidos por osteomielite. Os resultados estão expressos como média ± erro padrão.

Figura 5 - Perfil de concentração da "mTc-CFT e dos ALip-"mTc-CFT no rim após a sua administração intravenosa em ratos Wistar acometidos por osteomielite. Os resultados estão expressos como média ± erro padrão. Os resultados não apresentaram diferença estatisticamente significativa.

Figura 6 - Perfil de concentração da "mTc-CFT e dos ALip-"mTc-CFT no sangue após a sua administração intravenosa em ratos Wistar acometidos por osteomielite. Os resultados estão expressos como média ± erro padrão. O asterisco representa diferença estatisticamente significativa entre a "mTc-CFT e os ALip-"mTc-CFT para cada tempo analisado (p < 0.05).

Figura 7- Análise quantitativa dos estudos de biodistribuição em ratos Wistar acometidos por inflamação séptica, após injeção endovenosa de "mTc-CFT ou ALip-"mTc-CFT. As relações alvo/não alvo foram obtidas mediante a determinação da atividade nas tíbias infectada e contralateral. O asterisco indica diferença estatisticamente significativa entre os resultados encontrados para a "mTc-CFT e os ALip-"mTc-CFT em cada intervalo de tempo analisado (p < 0.05).

Descrição detalhada da invenção

A invenção descreve ceftizoxima radiomarcada encapsulada em lipossomas, de circulação prolongada ou não, recobertos com alendronato e o seu uso em diagnóstico de osteomielite

A presente tecnologia poderá ser melhor compreendida, de forma não limitante, a partir dos exemplos que se seguem:

Exemplo 1- Preparo dos lipossomas de circulação prolongada recobertos por alendronato contendo ceftizoxima radiomarcada com "mTc (ALip- 99mTc-CFT)

Foram preparados lipossomas com concentração lipídica na faixa de 10 a 40 mM, preferencialmente 20 mM. Para o preparo dos lipossomas utilizou-se a metodologia descrita por Bangham, 1965, (Bangham, A. D.; Standish, M. M.; Watkins, J. C. Diffusion of univalent ions across the lamellae of swollen phospholipids. Journal of Molecular Biology, v.13, n.1, p. 238-252, 1965). Inicialmente, alíquotas das soluções clorofórmicas de fosfatidilcolina de ovo (EPC), colesterol, estearilamina e diestearoilfosfatidiletanolmaina acoplado ao polietilenoglicol 2000 (DSPE-aPEG2ooo) (concentração lipidica total igual a 20 mM; razão molar 60,8/15,2/19/5, respectivamente) foram transferidas para um balão de fundo redondo para a formação do filme lipídico pela evaporação do clorofórmio em evaporador rotatório sob pressão reduzida. O filme lipídico foi hidratado com solução aquosa de cloreto de sódio (0,9 % p/v). As vesículas multilamelares resultantes foram submetidas à filtração através de membranas de policarbonato de 0,4, 0,2 e 0,1 μm utilizando um extrusor. A formulação foi submetida a 5 ciclos de filtração por membrana. A encapsulação de "mTc-CFT nos lipossomas foi realizada mediante o emprego do método de congelamento e descongelamento, conforme proposto por Ferreira (2010). Foram misturados 1,0 mL de solução aquosa de "mTc-CFT (2,5 mg/mL) e 1,0 mL da dispersão de lipossomas. A mistura foi submetida a três ciclos de congelamento a -196 °C por 5 minutos e descongelamento em banho de água a 37 °C por 5 minutos. Os lipossomas foram purificados por ultracentrifugação a 150.000 g, 4 °C, durante 90 minutos. Após o ciclo de ultracentrifugação, o precipitado foi reconstituído com solução de alendronato de sódio em concentração na faixa de 0,1 a 10 mg/mL, preferencialmente 1,0 mg/mL, em cloreto de sódio 0,9% (p/v), mantendo-se a concentração lipídica de 20 mM. Lipossomas de circulação prolongada não recobertos por alendronato (Lip-"mTc-CFT) foram preparados por metodologia semelhante, sendo que a reconstituição do precipitado foi realizada com uma solução de cloreto de sódio 0,9 % (p/v).

Exemplo 2- Caracterização dos ALip-99rnTc-CFT e Lip-"mTc-CFT

Determinação do diâmetro das vesículas e do índice de polidispersão O diâmetro médio e a distribuição do tamanho das vesículas (índice de polidispersão) dos lipossomas foram determinados por espectroscopia de correlação de fótons, a 25 °C e a um ângulo de 90°, utilizando o equipamento Zetasizer 3000 HSA (Malvern, Inglaterra). As amostras foram diluídas em solução de cloreto de sódio 1 mM e as medidas foram realizadas em triplicata.

O diâmetro médio e índice de polidispersão foram analisados para as formulações antes e após a incorporação da "mTc-CFT, enquanto o potencial zeta foi analisado após o recobrimento por alendronato. Os resultados estão representados na Tabela 1. Tabela 1 - Diâmetro, índice de polidispersão (IP) e potencial zeta dos lipossomas antes e após a encapsulação de "mTc-CFT

Os resultados foram expressos como média ± desvio padrão (n = 3). As letras a e b indicam diferenças estatisticamente significativas entre os lipossomas brancos e aqueles contendo o fármaco, para o diâmetro médio e IP, respectivamente (p< 0.05). O ’ indica diferença estatisticamente significativa entre os valores de potencial zeta (p<0,05).

Houve aumento do diâmetro médio das vesículas e do índice de polidispersão após incorporação "mTc-CFT, em ambas as formulações. O processo de congelamento e descongelamento provoca, respectivamente, a ruptura e a reformação das vesículas, o que permitiu a encapsulação de CFT. Apesar do aumento do tamanho das vesículas, as formulações apresentaram diâmetros na faixa de 100 a 500nM, apresentando em média diâmetro inferior a 200 nm, após a encapsulação, o que é adequado para a administração endovenosa. As vesículas lipossomais de diâmetro médio desta grandeza apresentam uma eficiência de encapsulação razoável, maior tempo de circulação sanguínea, são mais estáveis e têm a habilidade de se extravasarem dos vasos sanguíneos, atingindo a região de interesse (Litzinger, D. C.; Buiting, A. M. J.; Van Rooijen, N.; Huang, L. Effect of liposome size on the circulation time and intraorgan distribution of amphipathic polyethylene glycol)-containing liposomes. Biochimica et Biophysica Acta Biomembranes, v. 1190, p. 99-107, 1994). O índice de polidispersão reflete a distribuição do tamanho das vesículas na dispersão coloidal e pode variar de 0,0 a 1,0 para sistemas mono e polidispersos, respectivamente. As formulações apresentaram valores de IP inferiores a 0,3, o que indica boa homogeneidade dos sistemas que estão monodispersos.

Determinação do potencial zeta

O potencial zeta foi determinado por espalhamento dinâmico da luz associado à análise da mobilidade eletroforética das vesículas a um ângulo de 90° e a temperatura de 25°C. As amostras foram diluídas em solução de cloreto de sódio 1 mM e as medidas foram realizadas em triplicata utilizando o equipamento Zetasizer 3000 HSA (Malvern, Inglaterra).

Houve um decréscimo do valor de potencial zeta das formulações com a incorporação de alendronato. Isto pode ser explicado em função da interação eletrostática entre as cargas positivas na superfície dos lipossomas, geradas pela presença das moléculas de estearilamina e/ou de DSPE-aPEG2ooo, com as cargas negativas dos grupos fosfato do alendronato. Este fato leva à diminuição da carga superficial total do sistema.

Determinação do teor de encapsulação da "mTc-CFT O teor de encapsulação de "mTc-CFT nos lipossomas foi determinado por meio da quantificação da radiação gama no precipitado e no sobrenadante, após a ultracentrifugação. A radioatividade foi medida em um contador de radiação gama Capintec CRC - 15R (Ramsey, EUA). O teor de encapsulação foi calculado através da seguinte equação:

Atividade no precipitado

O teor de encapsulação de "mTc nos lipossomas foi de 39,5 ± 5,3 % (n= 6).

Exemplo 3- Imagens cintilográficas dos AI_ip-"mTc-CFT e Lip-"mTc-CFT

Avaliou-se o efeito da presença de alendronato na superfície dos lipossomas na captação do nanossistema pela região de interesse.

As imagens cintilográficas foram realizadas em modelo animal experimental de osteomielite, de inflamação asséptica obtida mediante a administração de suspensão de zimosan 5,0 % (p/v) e em animais do grupo controle (n = 5). Foram injetados 0,2 mL de ALip-"mTc-CFT ou Lip-"mTc-CFT (atividade de aproximadamente 20 MBq) na veia caudal dos animais, sob anestesia, após 48 h da indução dos focos. Nos intervalos de tempo de 1, 2, 4, 6 e 8 horas após a injeção das formulações, os animais foram novamente anestesiados e colocados em decúbito dorsal sob uma câmara de cintilação equipada com um colimador de baixa energia adequado para "mTc (140 keV). Imagens estáticas planares foram adquiridas durante 10 minutos usando uma matriz de 256 X 256 pixels (Nuclide™ TH 22, Mediso, Hungria). As imagens cintilográficas foram analisadas determinando-se a radioatividade nas regiões de interesse (ROI). As ROI foram delineadas em torno da tíbia esquerda (alvo) e copiadas por imagem espelhar para a região contralateral (não alvo). Os valores de radioatividade (contagem total) obtidos para a região de interesse foram divididos pelos da região contralateral, de modo a se determinar a relação alvo / não alvo.

As imagens cintilográficas obtidas, assim como os valores das relações alvo/não alvo para estes grupos, estão representados nas Figuras 1 e 2, respectivamente. É possível verificar captação preferencial dos ALip-"mTc-CFT no foco de osteomielite em todos os grupos. Observa-se que a presença de alendronato na superfície favorece a captação do radiofármaco, e consequentemente, o seu acúmulo na região óssea.

Quando se compara os resultados adquiridos para os ALip-"mTc-CFT nos dois modelos de inflamação e no animal sadio (Figura 3), é possível perceber uma captação preferencial do radiofármaco na região de interesse do animal portador de osteomielite maior que nos outros dois grupos, indicando que este sistema poderia ser utilizado para distinção de processos inflamatórios sépticos e assépticos. Nos modelos de inflamação asséptica houve também acúmulo do radiofármaco, entretanto, de forma menos intensa que na inflamação séptica.

Estes resultados sugerem que três fatores podem estar atuando no carreamento e acúmulo do radiofármaco na região de interesse. Primeiramente, a região acometida por inflamação (tanto séptica quanto asséptica) possui fluxo sanguíneo e permeabilidade vascular aumentados, o que permite o extravasamento e permanência dos lipossomas devido ao efeito de permeação e retenção (EPR), uma vez que estes sistemas possuem diâmetro inferior aos poros dos vasos. Além disto, a presença do alendronato na superfície favorece a captação na região óssea, uma vez que este fármaco possui alta afinidade pela hidroxiapatita presente na mesma. Estes dois fatores explicam o acúmulo do radiofármaco tanto nas regiões de inflamação séptica quanto asséptica. Entretanto, a liberação de "mTc-CFT e ligação específica do radiofármaco às bactérias permite um maior acúmulo da mesma nas regiões de interesse do modelo de inflamação séptica, levando a relações alvo/não alvo maiores.

Exemplo 4- Estudo de biodistribuição dos ALip-"mTc-CFT no modelo animal experimental de osteomielite

Alíquotas de 0,2 mL de "mTc-CFT ou ALip-"mTc-CFT (aproximadamente 20 MBq) foram injetadas na veia da cauda dos animais, sob anestesia, após 48 horas da inoculação da suspensão de S. aureus (n = 5). Em diferentes intervalos de tempo (1, 2, 4, 6 e 8 horas) após a injeção, os animais foram novamente anestesiados, o sangue foi coletado por punção cardíaca e, então, foram sacrificados por deslocamento cervical. O fígado, o baço, os rins, o pulmão, as tíbias esquerda e direita foram removidos e pesados. A radioatividade presente no sangue e órgãos foi medida em um cintilador de poço automático (Perkin Elmer Wizard 3” 1480, Waltham, EUA), programado para detectar a radiação gama na janela de energia referente ao "mTc. Uma dose padrão contendo a mesma quantidade de radioatividade injetada nos animais foi contada simultaneamente em um tubo separado, para fins de correção do decaimento radioativo. Os resultados foram expressos como % de dose injetada/g de tecido e foram determinados pela seguinte equação:

Foi observada uma intensa captação dos ALip-"mTc-CFT no fígado e baço em todos os tempos (Figura 4). Estes resultados são coerentes com os anteriormente descritos por Ferreira (2010), após a injeção de lipossomas pH- sensíveis de circulação prolongada contendo "mTc-CFT em modelos experimentais de osteomielite. A intensa captação dos lipossomas no fígado e baço se deve à eliminação pelo SFM (Allen, T. M.; Hansen, C. Pharmacokinetics of stealth versus conventional liposomes effect of dose. Biochimica et Biophysica Acta, v.1068, p. 133-141, 1991). A captação na região pulmonar não foi significativa e apresentou redução gradual com o decorrer do tempo.

Tanto para a "mTc-CFT quanto para os ALip-"mTc-CFT, é possível perceber uma intensa e constante captação renal (Figura 5). Este efeito pode ser atribuído à eliminação renal de "mTc-CFT, uma vez que este antibiótico apresenta vida média de aproximadamente 1,5 horas e não sofre metabolização, sendo excretado pelos rins na forma ativa (inalterada) (Lesko, A.B., Sesin, G.P., Cersosimo, R.J. Ceftizoxime stability in iv solutions, DICP: The annals of Pharmacology, v. 23, p. 615-618, 1989).

Como pode ser observado na Figura 6, a disponibilidade de lipossomas no sangue apresentou valores máximos de radioatividade uma hora após a injeção dos ALip-"mTc-CFT. Verificou-se uma tendência para redução gradual da concentração dos lipossomas na circulação sanguínea no decorrer no tempo. A redução da quantidade de lipossomas circulante observada ao longo do tempo é coerente com os resultados anteriormente relatados, uma vez que há significativa captação hepática e esplénica dos lipossomas e uma eliminação renal durante todo o intervalo de tempo avaliado. Em relação à "mTc-CFT livre, é também possível perceber uma gradual redução da concentração sanguínea, coerente com a eliminação renal do radiofármaco.

É possível perceber uma maior concentração dos ALip-"mTc-CFT na corrente sanguínea para todos os tempos analisados. Este efeito pode ser explicado pelo aumento do tempo de circulação do radiofármaco quando encapsulado nos lipossomas de circulação prolongada.

A razão da quantidade de radioatividade encontrada na tíbia esquerda (alvo) e na tíbia direita (não alvo), nos diferentes intervalos de tempo, foi determinada tanto para a "mTc-CFT quanto para os ALip-"mTc-CFT (Figura 7). Para os ALip-"mTc-CFT, foi possível verificar que a relação alvo/não alvo foi próxima a 1,5 para o tempo de uma hora, com aumento estatisticamente significativo para os tempos posteriores, atingindo valores próximos a 2,2 para o tempo de oito horas. Para a "mTc-CFT, verificou-se uma relação alvo/não alvo de 1,4 no tempo de uma hora, com redução gradual até valor próximo a um, no tempo de oito horas. A maior captação dos ALip-"mTc-CFT na tíbia esquerda pode ser explicada pelo aumento do tempo de circulação do radiofámarmaco encapsulado em lipossomas de circulação prolongada e à presença do recobrimento com alendronato, que permitem maior acesso da "mTc-CFT à região de interesse. Ao ser liberada na região acometida pela infecção (tíbia esquerda), a "mTc-CFT pode ser reconhecida pelas bactérias presentes no meio, o que garante a manutenção de seus níveis na região durante todo o tempo de análise, enquanto na tíbia direita há uma diminuição. Para a "mTc-CFT livre, o curto tempo de circulação e a dificuldade de acesso à região óssea impedem um acúmulo significativo na região acometida pela infecção.

Estes dados indicam que os ALip-"mTc-CFT pode ser uma ferramenta interessante para a identificação de focos infecciosos, uma vez que permite maior acúmulo da "mTc-CFT nas regiões de infecção óssea, quando comparado ao radiofármaco livre. Isto pode levar a uma diminuição da dose de radiação necessária para a realização dos exames de imagem cintilográfica, com menor exposição do paciente à radiação.

Claims (6)

1. CEFTIZOXIMA RADIOMARCADA, caracterizada pela ceftizoxima estar radiomarcada com 99mTc e estar encapsulada e/ou adsorvida em lipossomas catiônicos, de circulação prolongada, e revestidos com alendronato.

2. CEFTIZOXIMA RADIOMARCADA, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelos lipossomas serem constituídos por um lípide catiônico e por um ou mais fosfolipídios, selecionados do grupo compreendendo fosfatidilcolina e/ou diestearoilfosfatidiletanolamina acoplado ao polietilenoglicol.

3. CEFTIZOXIMA RADIOMARCADA, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelos lipossomas possuírem uma concentração lipídica total compreendia na faixa de 10 a 40mM.

4. CEFTIZOXIMA RADIOMARCADA, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelos lipossomas formarem vesículas com diâmetro na faixa de 100 a 500 nm.

5. CEFTIZOXIMA RADIOMARCADA, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo revestimento dos lipossomas ocorrer em solução de alendronato em concentração na faixa de 0,1 a 10 mg/ml.

6. USO DA CEFTIZOXIMA RADIOMARCADA, definida na reivindicação 1, caracterizado por ser como marcador para o diagnóstico de osteomielite.

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