BRPI1103781A2 - composiÇÕes farmacÊuticas com aÇço leishmanicida e processos para produÇço dos mesmos - Google Patents

Abstract

COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS COM AÇçO LEISHMANICIDA E PROCESSOS PARA PRODUÇçO DOS MESMOS. A presente invenção compreende processos para produção de compostos com ação antiparasitária. Mais especificamente, substâncias com ação inibitória ou tóxica frente a diferentes espécies de protozoários do gênero Leishmania, incluindo L. brazillensis e L. infantum. Propõe-se a produção destas substâncias a partir do cultivo de micélios e subsequentes processos de extração e purificação. Diversas espécies de fungos podem ser empregadas, preferencialmente dentre os macromicetos, mais especificamente a espécie Perenniporia martiusli. O cultivo micelial pode ser realizado utilizando substratos líquidos ou sólidos de baixo custo e ampla disponibilidade, preferencialmente em biorreatores com controle de temperatura, agitação e aeração. Os processos de recuperação, extração e purificação podem incluir etapas de filtração, centrifugação, concentração, extração com solventes orgânicos, técnicas cromatográficas e secagem. Os produtos assim obtidos podem ser utilizados na formulação de fármacos destinados à prevenção ou ao tratamento de Ieishmanioses em humanos e outros animais.

Description

composiqOes farmac£uticas com Xqao leishmanicida ε PROCESSOS PARA PRODUQAO DOS MESMOS

Campo da Invencao:

A presente invengao relaciona-se de Ioirma geral aos campos da biotecnologia, bioprocessos industrials, bioquimica, parasitologia, microbiologia, patologia, medicina e doengas infecciosas. Especificamente, trata sobre metodos e composigees para tratar, inibir ou prevenir as infei^des causadas por protozoarios,. principalmente do genero Leishmania. Mais especificamente, trata sobre processos de fabrica^ao do material que e utilizado nos referidos metodos e composi^oes. Estes processos incluem etapas de cuItivo micelial em biorreatores e recuperapao das substancias Ieishmanicidas produzidas.

Historico da Invencao

Leishmaniose

Doengas infecciosas sao aquelas que podem ser transmitidas, direta ou indiretamente, de uma pessoa para outra. Sao causadas por microrganismos patogenicos, como bacterias, virus, parasitas ou fungos.

Apesar do atual sucesso alcan^ado no controle de algumas doengas transmissiveis, algumas apresentam quadra de persistencia. Nesse grupo, estao as Ieishmanioses (visceral e tegumentar), para as quais, alem da manutengiao de elevadas prevalencias, constata-se expansao na area de ocorrencia, em geral associada as modificagoes ambientais provocadas pelo homem (LAINSON, R.; SHAW, J.J. Evolution, classification and geographical distribution. In: PETERS, W.; KILLICK-KENDRICK, R. (Eds.), The Leishmaniasis in Biology and Medicine 1, Academic Press, London, 1-120, 1987).

As Ieishmanioses sao doen?as parasitarias causadas por diferentes especies de protozoarios flagelados do genero Leishmania, pertencentes a ordem Kinetoplastida e familia Trypanosomatidae. O parasita se desenvolve em um organism。vivo e se multiplica por fissao binaria. Essencialmente sao consideradas zoonoses, mas tornam-se antropozoonoses quando ha ingresso do homem no ciclo de transmissao do parasito (ASHFORD, R.W. The Leishmaniases as emerging and reemerging zoonoses. International Journal for Parasitology 30: 1269-1281, 2000). O ciclo celular de Leishmania tem duas fases distintas: amastigota e promastigota. A fase amastigota, com formato arredondado e sem flagelos, parasita ο citoplasma de macr0fagos infectados de hospedeiros vertebrados. A transmissao habitual acontece por meio de insetos de varias especies de flebotomineos (vetor), que adquirem ο parasito ao picar animais infectados (reservatorios). O parasito diferencia-se e e transmitido ao homem ou a outros mamiferos sob a forma promastigota, de formato alongado e flagelado.

A manifestagao da doenga ocasioria ο surgimento de Iesoes cutaneas ou ο comprometimento de orgaos. Sua gravidade e ditada especialmente pela condigao do sistema imune do individuo infectado. Neste processo, a especie envolvida de Leishmania tambem tem papel fundamental. Conforme a interapao, uma grave desregulagao fisiologica ocorre nos tecidos em que ha presenga de formas amastigotas do parasito.

A infecQao pode ocorrer de dois modos: visceral ou cutanea. A forma visceral e uma doen?a sist§mica que acomete particularmente figado, bago, medula ossea e linfonodos. A forma cutanea acomete pele e mucosas (nasal e oral), manifestando- se clinicamente nos formatos classico, tegumentar de mucosa e tegumentar difusa. Uma forma cutanea, tambem denominada Leishmaniose Tegumentar Americana, inclui ao mesmo tempo Iesdes cutaneas e de mucosa. A doenga e endemica em muitas partes do mundo e tem ampla distribuigao.

Esta localizada, majoritariamente, em regioes de pobreza, sendo reconhecidamente negligenciada. Alem do envolvimento da saCide e do bem-estar psicologico do doente, constitui um significante entrave ao desenvolvimento socioeconomico (THOMAZ-SOCCOL et al. A new focus of cutaneous leishmaniasis in the central area of Parana State, southern Brazil. Acta Tropica 111: 308-315, 2009).

Existem cerca de 350 milhoes de pessoas sob risco de infecgao em 88 paises; destes, 72 sao paises em desenvolvimento. A prevalencia da Ieishmaniose e de aproximadamente 12 milhoes de casos em todo ο mundo. Estima-se a revelagao de dois milh5es de novos casos anuais, sendo 1,5 milhoes correspondentes a Ieishmaniose cutanea e 500 mil de Ieishmaniose visceral (WHO - World Health Organization. Leishmaniasis and Leishmania/HIV co-infection. WHO report on global surveillance of epidemic-prone infectious diseases. Acessado em: http://www.who.int/csr/resources/publications/surveillance/Leishmaniasis, 2011). A Ieishmaniose visceral tern ampla distribuigao, ocorrendo na Asia, na Europa, no Oriente Medio, na Africa e nas Am6ricas. De acordo com dados da Organizagao Mundial da SaCide (OMS)1 90% de novos casos ocorrem no Brasil1 India, Nepal, Bangladesh e Sudao (WHO - World Health Organization, Research on leishmaniasis. Acessado em: http://www.who.int/leishmaniasis/ 2011); (GRADONl, L.; SOTERIADOU, K.; LOUZIR, H.; DAKKAK, A·; TOZ1 S. 0.; JAFFE, C·; DEDET1 J.- P.; CAMPINO, L.; CANAVATE, C.; DUJARDIN, J.-C. Drug regimens for visceral leishmaniasis in Mediterranean countries. Tropical Medicine & International Health 13: 1272-1276, 2008).

A Leishmaniose Tegumentar Americana, a forma cutanea mais grave,

distribui-se amplamente no continente americano, extendendo-se desde ο sul dos Estados Unidos ate ο norte da Argentina. Esta presente principalmente no BrasiI, com casos em todos os estados do Brasil. (CDC - Centers for Disease Control and Prevention. The yellow book, health information for travelers, CDC 20斤0); (SVS / MS - Secretaria de Vigilancia em SaCide1 Ministerio da Saiide. Fundagao Nacional de Saude. Manual de Vigilancia da Leishmaniose Tegumentar Americana. 2.ed. Brasilia, 2007).

De mod ο geral, as Ieishmanioses sao de dificil erradicagao, pois possuem uma diversidade de aspectos epidemiologicos e clinicos. Mesmo ^ara patologias semelhantes, ha grande variagao de antigenicidade, que impede ο desenvolvimento de uma vacina eficaz (SUVERCHA BHARDWAJ A1 R.K. VASISHTA B, SUNIL K. ARORA. Vaccination with a novel recombinant Leishmania antigen plus MPL provides partial protection against L. donovani challenge in experimental model of visceral leishmaniasis. Experimental Parasitology 121: 29-37，2009).

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Fungos, macromicetos e micotecnologia

Os fungos sao organismos com caracteristicas diferentes dos vegetais e animais. Sao eucariotos. Podem ser aquaticos, terrestres e ate mesmo aereos. Sao aclorofilados e, portanto, heterotroficos, devendo retirar o. material e a energia para sua constituigao da decomposigao de material organico. Podem ser saprobios, parasitas ou simbiontes. Sao capazes de realizar reprodugao assexuada e, em alguns casos, sexuada. Alguns sao unicelulares, como as Ieveduras e outros sao

multicelulares, como os mofos, bolores e cogumelos. A maior parte das especies de fungos e classificada como pertencente ao reino Fungi, porem algumas sao consideradas, por alguns autores, como pertencentes a outros reinos, como protozoa e chromista (PUTZKE, J.; PUZKE, M. T. L. Generalidades sobre fungos. In: Os reinos dos fungos. 2a ed.’ 1(1): 21-30, ed. Edunisc, Santa Cruz do Sul1 2004).

Estima-se que exista aproximadamente 1,5 milhao de especies de fungos no

planeta. Destas, menos de 70.000 sao conhecidas (HAWKSWORTH, D.L. The fungal dimension of biodiversity: magnitude, significance, and conservation. Mycological Research, 95, (6): 641-655, 1991). Menos de 0,5% das especies conhecidas sao utilizados para processos produtivos industrials. Peio menos 3.608 especies de fungos nativos do Brasil foram descritas e encontram-se na Lista de Especies da Flora, organizada pelo Ministerio do Meio Ambiente. Das especies nativas descritas, 523 sao endemicas (ΜΑΙΑ, L. C.; CARVALHO JR., A. A. Fungos. In: Lista de Especies da Flora do Brasii. Jardim Botanico do RJ. http://floradobrasil.jbrj.gov.br/2010/FB000003, 2010). Macromicetos ou macrofungos, popularmente conhecidos como cogumelos,

sao fungos que produzem corpos de frutifica?ao visiveis a olho nu. O ciclo de vida desses organismos pode ser resumido nas seguintes etapas: 1. Os corpos de frutificagao produzem esporos; 2. Os esporos, sob condigoes propicias, germinam dando origem a estruturas multicelulares filamentosas mononucleadas haploides, denominadas micelio primario; 3. Dois micelios primarios compativeis se fundem para formar um micelio com dois niicleos haploides por celula, denominado micelio secundario; 4. ο micelio secundario e capaz de gerar os tecidos que dao origem a corpos de frutificagao, fechando ο ciclo. Os macromicetos podem ser classificados em basidiomicetos ou ascomicetos, dependendo da forma das estruturas que produzem esporos. A maioria dos macrofungos sao basidiomicetos (ARORA, D. What is a mushroom. In: Mushrooms Demystified, a comprehensive guide to the fleshy fungi, 2a ed·, c.1, pp.4-5. Ten Speed Press, Berkeley, 1986); (WRIGHT, J. E.; ALBERTO, E. Hongos. Guia de Ia region pampeana. v. I (Hongos con laminillas). Ed. L.O.L.A., Buenos Aires, 2002). Podemos utilizar ο termo micotecnologia para classificar as tecnologias

decorrentes do emprego de fungos. Desde as fermentagoes mais tradicionais, como as empregadas na produgao de bebidas alcoolicas, paes e queijos ate ο cultivo

micelial submerso de Iinhagens geneticamente modificadas podem ser consideradas micotecnologias. Outros exemplos incluem: ο cultivo de cogumelos comestiveis e medicinais, a produgao de alimentos fermentados como ο shoyu, ο tempeh e ο miso (SOCCOL, C. R. Aproveitamento do residuo de soja da fabricagao de extrato hidrossolCivel para a elaboragao de pasta de soja fermentada. In: IX Congresso Brasileiro de Ci§ncia e Tecnologia de Alimentos, Curitiba1 1986); (SOCCOL, C. R. Aproveitamento do residuo de soja da fabricagao do extrato hidrossolCivel para a elaboragao de molho fermentado de soja. In: III Encontro Sul Brasileiro de Ciencia e: Tecnologia de Alimentos. Londrina1 1988).

Alguns produtos de aplicagao industrial, como ο acido citrico e diversas enzimas, tambem sao produzidos em Iarga escala atraves do cultivo de fungos filamentosos (MACIEL, G. M.; VANDENBERGUE, L. P. S.; HAMINIUK C. W. I.; SOCCOL, C. R.; Characterization and stability of xylanase produced by SSF with Aspergillus niger, using sugar cane bagasse and soybean meal as substrate. In: XVI Simposio Naciona丨 de Bioprocessos. Anais SINAFERM 2007，p. 1-13, Curitiba1 2007); (RODRIGUEZ, C.; VANDENBERGHE, L. P. S.； SPIER, M. R.; ROEPCKR, C.

B. S.; SOCCOL1 C. R. Increase of citric acid production by solid-state fermentation using citric pulp as substrate and random mutagenesis induced by UV in Aspergillus niger. In: XVI Simposio Nacional de Bioprocessos - Anais SINAFERM _’ p.1-10, GRAFFIT, Curitiba1 2007). Uma aplicagao de grande destaque na atualidade e a

produpao de biocombustiveis, notadamente ο etanol, a partir da fermentagao dos mais variados substratos por leveduras. Os substratos usuais sao ricos em mono e dissacarideos (SIQUEIRA, P.; KARP1 S.; CARVALHO, J.; STURM, W.; RODRIGUEZ-LEON, J.; THOLOZAN, J.; SINGHANIA, R.; PANDEY1 A.; SOCCOL,

C.; SOCCOL, C. R. Production of bio-ethanol from soybean molasses by Saccharomyces cerevisiae at laboratory, pilot and industrial scales. Bioresource

Technology 99:8156-8163, 2008)，por6m esta em fase de pesquisa ο chamado etanol de segunda geragao, que podera ser obtido a partir de diversos materials Iignocelulosicos atraves de processos que dependem tanto de fungos filamentosos, como de leveduras (PI0221003887192; SELEGHIM, P.; POLIKARPOV, I. Desafios para transformer conceitos em realidade. In: Scientific American Brasil1 87: 32-37, Dossie Biocombustivel, 2009).

Outra aplica?ao com potencial grandemente inexplorado no Brasil e ο cultivo de cogumelos. Existem dezenas de especies de cogumelos comestiveis e medicinais produzidos comercialmente no mundo inteiro (LEIFA, F.; SOCCOL1 C. R.; PANDEY1 A.; PAN, H. Production of mushrooms. In: Advances in Fermentation Technology. (Org.: PANDΕΥ, A.; LARROCHE, C.; SOCCOL, C. R.; DUSSAP, C.-G·)’ AsiaTech Publisher,INC, v. 1: 445-46, Nova Deli, 2008). Destas, apenas quatro sao produzidas em grande escala no pais (URBEN，A. F. Produgao de cogumelos por meio de tecnologia chinesa modificada. Embrapa Recursos Geneticos e Biotecnologia (CENARGEN), Brasilia, 2005). Seguindo uma tendencia atual de procura por alimentos saudaveis, espera-se que ο consumo possa aumentar nos proximos anos, se houver um aumento na produgao de novas especies e uma queda nos pregos. Pouco se sabe sobre a comestibilidade de macromicetos nativos de distribuigao mais restrita, porem diversas especies apresentam textura e aroma atrativos. Mais estudos sobre composigao quimica e toxicidade devem ser conduzidos, com ο objetivo de identificar especies potencialmerite comestiveis (MEIJER1 A. A. R. Biodiversidade de macrofungos da Mata Atlantica com potencial de uso na alimentagao. Em: Simposio de Recursos Geneticos para a America Latina e Caribe (SIRGEALC), anais do congresso, Embrapa, Brasilia, 1999).

Devem existir muitas especies comestiveis desconhecidas na Mata Atlantica, Ievando em consideragao ο ηCimero de especies comestiveis conhecidas em alguns paises micofilos. O investimento em pesquisa nessa area e estrat^gico. Ha um mercado promissor no proprio pais e de uma maneira mais imediata, nos paises micofilos, especialmente na Europa e na Asia (NASS- National Agricultural Statistics Service. Mushrooms statistics. U. S. Department of Agriculture. Acessado em: http://usda.mannlib.cornell.edu/usda/current/); (BOA, E. Wild edible fungi, a global overview of their use and importance to people. In: Non-wood forest products, 17’ Food and Agriculture Organization of the United Nations, Roma, 2004).

O Brasii e um grande produtor agroindustrial e madeireiro. Da mesma forma, e um grande produtor de residuos lignocelulosicos, como palhas, cascas, bagagos, sabugos, farelos, etc. Estes materials geralmente sao queimados para obtengao de energia ou misturados a adubos ou ragoes animais. Nenhuma destas aplica^oes apresenta tantas vantagens como a produ?ao de etanol ou ο cuItivo de cogumelos.

Alem de gerar produtos de alto valor comercial, ο residuo gerado apos ο cuItivo de cogumelos tern propriedades nutricionais incrementadas em rela?ao aos substratos antes do cultivo, devido a biomassa micelial desenvolvida e a decomposigao do substrato pelas enzimas fiingicas. Por esse motivo, os residuos Iignocelulosicos tornam-se melhores componentes de ragoes e adubos depois de utilizados como substrato para cuItivo de macromicetos (FAN, L.; PANDEY1 A.; SOCCOL, C.R. Flammulina velutipes on coffee husk and coffee spent-ground. Braz.

Archieves of Biology and Technology 44: 205-212’ 2001); (BEAUX, M. R.; SOCCOL, C. R. Cultivo do fungo comestivel Lentinula edodes em residuos agroindustriais do Parana atraves do uso de fermentagao no estado solido. Boletim do CEPPA 14(1), 1996); (STAMETS, P. Cultivating gourmet mushrooms on agricultural waste products. In: Growing Gourmet and Medicinal Mushrooms, c.18, p.181-189, ed. Ten Speed Press, Berkeley, 1993); (STAMETS, P. Maximizing substrate's potential through species sequencing. In: Growing Gourmet and Medicinal Mushrooms, c.18, pp.419-422, ed. Ten Speed Press, Berkeley, 1993).

Nao apenas os residuos agroindustriais e da industria madeireira podem ser utilizados, mas, a exemplo da China, diferentes especies de capim podem ser cultivadas para obtengao de biomassa para ο cultivo de fungos. Nos paises asiaticos, dezenas de especies de cogumelos comestiveis e medicinais sao cultivadas utilizando-se esta tecnica, elegantemente nomeada "jun-cao", que significa Iiteralmente cogumelo-capim em chines. Pesquisadores da Embrapa testaram com sucesso, diversas especies de capim nativas do Brasil para cultivar diferentes especies de macromicetos (URBEN, A. F. Produgao de cogumelos por meio de tecnologia chinesa modificada. Embrapa Recursos Geneticos e Biotecnologia (CENARGEN), Brasilia, 2005).

Os fungos sao excelentes decompositores de materia organica, constituindo Iiteralmente os recicladores da natureza. Esta capacidade pode ser utilizada eficientemente para a degradagao de poluentes em estates de tratamento de efluentes ou mesmo em acidentes ambientais, atraves da utilizagao de inoculos adequados. As industrias serao cada vez mais pressionadas a procurar alternativas de processamento para os seus residuos nocivos, visando a transformagao destes em substSncias Citeis ou, no minimo, mais amigaveis ao meio ambiente e a saCide. A resposta muitas vezes podera vir da micotecnologia (STAMETS, P. The medicinal mushroom forest/ Mycorestoration. In: Mycelium running: how mushrooms can help save the world, pp.33-120, Ten Speed Press, 2005); (SOCCOL, C. R.; VANDENBERGUE, L. P. S.; WOICIECHOWSKI, A. L.; DECHECHI, E.; PANDEY, A.; THOMAZ-SOCCOL, V. Bioremediation: an important alternative for soil and industrial wastes clean-up. Indian Journal of Experimental Biology 41: 1030-1045，Nova Deli, 2003).

Algumas outras aplicagoes possiveis sao a utilizagao de fungos para controle biologico de pragas e ο uso de fungos ectomicorrizicos como irioculantes. Ambas aproveitam relagdes ecologicas naturais: parasitismo e simbiose, respectivamente.

Habilidades metabolicas muito especificas dos fungos podem ser exploradas para a biotransformagao de moleculas. Novos esteroides ja estao sendo produzidos desta forma. Esteroides tradicionais sao adicionados ao meio de cultivo e a versao modificada das moleculas e extraida ao fim do processo. As modificapoes provocadas pelas enzimas fiingicas precisariam de um grande nCimera de etapas para serem realizadas de maneira totalmente siritetica (MOORE, D. Fungi in medicine- antibiotics and other pharmaceuticals. In: Slayers, saviors, servants and sex. An expose of kingdom fungi. 2(5):1-7. Springer-Verlag1 Nova York, 2001). o niimero de especies de fungos atualmente disponivel para a pesquisa nos

bancos de germoplasma ao redor do mundo e bastante grande. Estima-se que mais de 1.600.000 cepas de microrganismos, incluindo mais de 500.000 Iinhagens de fungos sejam mantidas no mundo inteiro, atualmente, gra?as ao trabalho de mais de 6.000 pessoas. O Brasil e um dos paises que mantem ο maior niimero de colegOes de Iinhagens de microrganismos. De acordo com ο World Federation for Culture Collections (WFCC), existem pelo menos 60 institui?oes que dispoem de bancos de germoplasma microbiano no Brasil1 mantendo aproximadamente 150.000 cepas de microrganismos (WFCC- World Federation for Culture Collections. The culture collection in this world. WDCM Statistics. Acessado em: http://wdcm.nig.ac.jp/statistics.htm!. 2011).

Potencial Biotecnol0gico de fungos

Diversos produtos obtidos a partir de fungos se destacam por suas aplicagaes na area farmaceutica. O exemplo mais classico e a penicilina, produzida por fungos do genero Penicillium, descoberta em 1928 e amplamente utilizada ate os dias atuais. Uma serie de outros antibioticos tambem foi descoberta em fungos, como por exemplo: a cefalosporina, ο acido fusidico e a griseofulvina. Macromicetos tambem tem sido considerados quanto a produgao de antibioticos (OLIVEIRA-SOUZA, C. M. C·; SOCCOL, C. R.; LEIFA1 F.; PARADA, J. L.; DELINSKI G. Atividade antimicrobiana dos caldos da fermentagao submersa de Lentinus edodes. In: XVI Simposio Nacional de Bioprocessos- Anais SINAFERM, p.1-8, 2007); (MOORE, D.; Fungi in medicine- antibiotics and other pharmaceuticals. In: Slayers, saviors, servants and sex. An expose of kingdom fungi. 2(5): 1-7. Springer-Verlag, Nova York, 2001).

Existem muitas outras importantes substancias de aplicagao medicinal produzidas por fungos. A ciclosporina e um imunossupressor, que inibe a rejeigao de orgaos transplantados. A gliotoxina e uma substancia imunomoduladora, tambem util no pos-operatorio do transplante de orgaos. A mevinolina e um agente hipocolesterolemico, cujos derivados pravastatina, Iovastatina e sinvastatina constituem as substancias ativas principals de medicamentos que renderam bilhoes de dolares nos anos 90 (US 6,372,462); (MOORE, D. Fungi in medicine- antibiotics and other pharmaceuticals. In: Slayers, saviors, servants and sex. An expose of kingdom fungi. 2(5): 1-7. Springer-Verlag1 Nova York, 2001).

As substancias de aplicagao famacologica mais importantes derivadas de macromicetos sao provavelmente uma serie de polissacarideos com agao antitumoral indireta, derivados de varias especies, incluindo Lentinula edodes, Schizophyllum commune, Grifola frondosa e Ganoderma lucidum. Sugere-se que estes polissacarideos modulam ο sistema imunologico, favorecendo ο combate a tumores, aumentando a resistencia a infecQoes e controlando reaves alergicas. Produtos como capsulas, xaropes, pos e ampolas injetaveis sao correntemente receitados e ministrados paralelamente a quimioterapia e radioterapia em alguns paises asiaticos (US 7,682,615); (RUBEL, R.; DALLA SANTA, H. S.; FERNANDES, L. C.; FILHO, J. H. C. L.; FIGUEIREDO, B. C.; Dl BERNARDI, R.; MORENO, A. N.; LEIFA, F.; SOCCOL, C. R. High immunomodulatory and preventive effects against Sarcoma 180 in mice fed with ling zhi or reishi mushroom Ganoderma lucidum (W. Curt.: Fr.) P. Karst. (AphylIophoromycetideae) mycelium. International Journal of Medicinal Mushrooms 10: 37-48，2008); (CHANG, S.-T.; MSHIGENI, K. E. Mushrooms and human health: their growing significance as potent dietary supplements. University of Namibia. Namibia, 2001).

Outras atividades medicinais detectadas, atraves da apiicagao de

metodologias cientificas, em substancias derivadas de macromicetos incluem: ativida.de antioxidante, hipocolesterolemica, hipotensiva, hepatoprotetora, antimi.c_robi.ana, antiparasitaria e mesmo antiviral (SOCCOL, C. R.; DALLA SANTA, H. S.; RUBEL, R.; VITOLA, F. M. D.; LEIFA1 F·; PANDEY, A.; SOCCOL, V. T. Mushrooms - a promising source to produce pharmaceutical and nutraceutical bioproducts. In: Current topics on bioprocesses in food industry (ed. Koutinas1 A.; Pandey1 A.; Larrouche1 C.), v. 2，Asiatech, 2008); (RUBEL, R.; DALLA SANTA, H. S.; LIMA FILHO, J. H. C.; L曰FA, F·; VITOLA, F. M. D.; SOCCOL, C. R. Diet supplemented with Ganoderma Iucidum shown preventive effect against development of Sarcoma 180 in mice. In: XVI Simposio Nacional de Bioprocessos. Anais SINAFERM 2007. GRAFFIT, CD. p. 1-11, Curitiba1 2007); (RUBEL, R; DALLA SANTA, H. S.; L曰FA, L.; LORQUIN, J.; LIMA FILHO1 J. H. C.; FIGUEIREDO, B. C.; URBEN, A. F·; SOCCOL, C. R. Hypolipidic action on mice after intaking feed supplemented with Ganoderma lucidum. In: Il Simposio International sobre Cogumelos no Brasil. Ariais: EMBRAPA Documentos, 116: 190. Brasilia, 2004); (CHANG, S.-T.; MSHIGENI, K. E.; Mushrooms and human health: their growing significance as potent dietary supplements. University of Namibia. Namibia, 2001).

No Brasil, apenas produtos derivados de Agaricus brasiliensis (sin. A. subrufescens), conhecido como "cogumelo-do-sol", sao popularmente empregados

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para diversas finalidades medicinais. Trata-se de uma especie nativa do interior do estado de Sao Paulo, Ievada ao Japao nos anos 70 para ser estudada. Algumas atividades farmacologicas foram detectadas em experimentos cientificos com esta especie. Destas1 podem ser destacadas: atividade imunomoduladora e antitumoral (LIMA, L. F. 0.; HABU1 S·; GERN, J. C.; NASCIMENTO, B. M.; PARADA1 J. L.; NOSEDA1 M. D.; GONQALVES, A. G.; NISHA, V. R.; PANDEY, A.; SOCCOL, V. T.; SOCCOL, C. R. Production and Characterization of the Exopolysaccharides Produced by Agaricus brasiliensis in Submerged Fermentation. Applied Biochemistry and Biotechnology, 151: 283-294, 2008); (ALM日DA J. M.; SOCCOL, C. R.; RUBEL, R.; DALLA-SANTA, O. R.; DALLA SANTA H. S. Selegao de cepas e estudos de diferentes parametros na produgao de biomassa e extragao de exo e intra polissacarideos de Agaricus brasiliensis. In: IX Encontro Regional Sul de Ciencia e Tecriologia de Alimentos. Anais IX ERSCTA. p. 01-04, UFPR1 Curitiba1 2007); (DALLA SANTA, H. S.; RUBEL, R.; L日FA, L.; LORQUIN, J.; LIMA FILHO, J. H. C.; FIGUEIREDO, B. C.; URBEN, A. F.; SOCCOL, C. R. Hypocholesterolemic activity of Agaricus blazei in mice. In: Il Simposio Internacional sob re Cogumelos no Brasil. Anais: EMBRAPA Documentos, 116’ p.193, Brasilia, 2004); (DALLA SANTA, H. S.; RUBEL，R.; LEIFA, L.; LORQUIN, J.; LIMA FILHO, J. H. C.; FIGUEIREDO, B. C·; URBEN, A. F.; SOCCOL, C. R. Anti-tumoral effect of supplemented feed with Agaricus blazei on Sarcoma 180-bearing mice. In: Il Simposio Internacional sob re Cogumelos no Brasil, Anais: EMBRAPA Documentos, 116: 193-194, Brasilia, 2004); (LEIFA, F.; SOCCOL, A.T. ； GERMANO, S.L.; PANDEY, A; RAU1 R.; PEDROSO, Al.; SOCCOL, C.R. Production of extra-celular polyssacaharides by Agaricus blazei Murrill in submerged fermentation and antitumor effect. Int. J. Medicinal Mushrooms 4: 39-45, 2002).

〇 grupo do pesquisador Carlos Ricardo Soccol realizou trabalhos pioneiros nesta importante area tecnologica. Foi um dos primeiros no Brasil a avaliar ο potencial de residuos agroindustriais como substrato para diversos bioprocessos, inclusive ο cultivo de macromicetos (LEIFA, F.; PANDEY, A. & SOCCOL, C. R. In: Proceedings, 3rd International conference on mushroom biology and mushroom products, Sydney, Autralia, pp.293-311, 1999); (BEAUX, M. R.; SOCCOL, C. R. CuItivo do fungo comestivel Lentinula edodes em residuos agroindustriais do Parana atraves do uso de fermentapao no estado solido. Boletim do CEPPA 14(1), 1996); (TONIAL, T. M.; SOCCOL, C. R.; RAMOS, L. P.; CHIARELLO, M D Produgao de biomassa e metabolitos por Volvariella volvacea em fermentagao submersa a partir de refugo de batata e mandioca. Boletim do Centra de Pesquisa e Processamento de Alimentos (CEPPA)1 14(2): 205-216, Curitiba1 1996). Contribuiu em muitas areas da micotecnologia, incluindo a produgao de metabolitos como acid ο I^tico e acido citrico, produgao de enzimas, farmacos, biocombustiveis, nutraceuticos, antibioticos, biopigmentos, bioaromas, tratamento de efluentes, biorremediagao, dentre outras aplicapoes (PI0221003887192); (SOCCOL, C. R.; DALLA SANTA, H. S.; RUBEL, R.; VITOLA, F. M. D.; LEIFA, F·; PANDEY, A.; SOCCOL, V. T. Mushrooms- a promising source to produce pharmaceutical and nutraceutical bioproducts. In: Current topics on bioprocesses in food industry (ed. Koutinas1 A.; Pandey, A.; Larrouche, C.), v. 2, Asiatech, 2008); (SOCCOL, C. R.; VANDENBERGUE, L. P. S.; WOICIECHOWSKI, A. L.; DECHECHI, E.; PANDEY, A.; THOMAZ-SOCCOL, V. Bioremediation: an important alternative for soil and industrial wastes clean-up. Indian Journal of

Experimental Biology, 41: 1030-1045, Nova Deli1 2003). Alguns dos trabalhos mais importantes deste grupo foram: Estudo da agao antitumoral in vivo de poiissacarideos produzidos pelo cultivo micelial submerso de Agaricus brasiliensis (LEIFA, F. Production of extra-cellular polyssaccharide from Agaricus blazei by submerged and solid state culture and its antitumor effect. 111 p. Tese de Doutorado em Processos Biotecnologicos, UFPR1 Curitiba, 2003); (LEIFA, F.; SOCCOL, A.T.; GERMANO, Si.; PANDEY1 A; RAU1 R.; PEDROSO, Ai.; SOCCOL, C.R. Production of extra-celular polyssacaharides by Agaricus blazei Murrill in submerged fermentation and antitumor effect. Int. J. Medicinal Mushrooms 4: 39-45，2002). UtiIizaQao de diversos residuos agroindustriais como substrato para ο cultivo de diversas especies de macromicetos (LEIFA, F.; SOCCOL, C. R.; PANDEY, A.; PAN, H. Production of mushrooms. In: Advances in Fermentation Technology. (Org.: PANDEY, A·; LARROCHE, C.; SOCCOL, C. R.; DUSSAP, C.-G.), AsiaTech Publisher,INC, v. 1，#445-46, Nova Deli, 2008); (SOCCOL, C. R.; L日FA, F.; Coffee residues for shiitake cultivation. In: Mushroom grower's handbook. 1(2): 110-113, MUSHWORLD, Seul1 2005).

Avaliagao de uma serie de parametros associados a propriedades farmacologicas das especies Ganoderma Iucidum e Agaricus brasiliensis, incluirido: atividade antitumoral in vivo, atividade hipocolesterolemica (dentre outras alterapoes

.；等...

no perfil lipidico) e imunomodulasao. Citometria de fluxo foi utilizadalpara quantificar alteragdes nas principals popula?oes de Iinfbcitos e no perfil de citocinas produzidas em camundongos alimentados com cereais fermentados pelo micelio dos macrofungos citados. Foranri detectadas atividades farmacologicas significativas em tod as as areas pesquisadas. As metodologias implantadas serao Citeis na prospecgao de substancias em macromicetos nativos (DALLA SANTA H. S.; SOUSA, N. J.; PITTNER E.; DALLA SANTA, O. R·; SOCCOL, C. R. Controle Biologico de Pragas de Ilex paraguariensis (A.St.-Hil) com Fungo Beauveria sp.; Floresta (UFPR. Impress。)，39: 67-76, 2009); (DALLA SANTA, H. S.; RUBEL1 R.; LEIFA, L.; LORQUIN, J.; LIMA FILHO1 J. H. C.; FIGU日REDO, B. C.; URBEN1 A. F.; SOCCOL, C. R. Hypocholesterolemic activity of Agaricus blazei in mice. In: Il Simposio Internacional sobre Cogumelos no Brasil. Anais: EMBRAPA Documentos, 116,p.193, Brasilia, 2004); (DALLA SANTA, H. S·; RUBEL, R.; L曰FA, L.; LORQUIN, J.; LIMA FILHOj J. H. C.; FIGUEIREDO, B. C.; URBEN1 A. F.; SOCCOL, C. R. Anti-

tumoral effect of supplemented feed with Agaricus blazei on Sarcoma 180-bearing mice. In: Il Simposio Internacional sobre Cogumelos no Brasil, Anais: EMBRAPA Documentosj 116: 193-194, Brasilia, 2004); (RUBEL, R; DALLA SANTA, H. S.; LEIFA, L; LORQUIN, J.; LIMA FILHO, J. H. C.; FIGUEIREDO, B. C.; URBEN1 A. F.; SOCCOL, C. R. Immunestimulating activity of supplemented feed with Ganoderma Iucidum on Sarcoma 180-bearing mice. In: Il Simposio Internacional sobre Cogumelos no Brasil, Anais: EMBRAPA Documentos 116, p.191, Brasilia, 2004); (SOCCOL, C. R.; RUBEL, R.; SANTA, H. S. D,; LEIFA, F. ProdugSo de exopolissacarideos por Agaricus brasiliensis e Ganoderma Iucidum em cultura submersa e avalia?ao da agao arititumoral em animais. In: Second International Symposium on Mushrooms in Brazil. Anais Il SICOG. EMBRAPA 1: 165-169， Brasilia, 2004). Estudos relativos a produ?ao de enzimas por diversos fungos, especialmente deuteromicetos. Uma enzima de interesse, cuja produ^ao vem sendo otimizada rios Iaboratorios da UFPR e a fitase, iitil no processamentoitie ragoes, por promover maior absorgao de nutrientes, especialmente fosforo, pelos animais (SPIER, M. R.; LETTI1 L. A. J.; WOIC旧CHOWSKI’ A. L.; SOCCOL1 C. R. A simplified model for A. niger FS3 growth during phytase formation in solid-state fermentation. Brazilian Archives of Biology and Technology, 52: 151-158, 2009); (SPIER, M. R.; GREINER, R.; RODRIGUEZ-LEON, J. A.; WOIC旧CHOWSKI，A. L.; SOCCOL, V. T.; SOCCOL, C. R. Phytase production using citric _p and other residues of the agro-industry in SSF by fungal isolates. Food Technology and Biotechnology 46: 178-182, 2008); (SPIER, M. R.; WOIC旧CHOWSKI, A. L.; RODRIGUEZ-LEON, D. E.; ARAKAKI, A.; SCHEIDT, G. N.; SOCCOL, C. R. Comparison of phytase production by a new fungus isolated strain in different types of bioreactor. In: XVI Simposio Nacional de Bioprocessos. Anais SINAFERM 2007. p. 1-9， Curitiba, 2007). Outras enzimas fungicas, com importantes atividades cataliticas, pesquisadas no laborat0rio incluem xilanases, amilases e proteases (MACIEL, G. M.; VANDENBERGHE, L. P. S.; HAMINIUK C. W. I.; SOCCOL, C. R. Characterization and stability of xylanase produced by SSF with Aspergillus niger, using sugar cane bagasse and soybean meal as substrate. In: XVI Simposio Nacional de Bioprocessos. Anais SINAFERM 2007, p. 1-13，Curitiba1 2007); (SPIER, M. R.; WOICIECHOWSKI, A. L.; VANDENBERGUE, L. P. S.; SOCCOL, C. R. Production and characterization of amylases by Aspergillus niger under solid-state

fermentation using agroindustrial products. International Journal of Food Engineering, 2: 1-19, 2006); (SOCCOL, C. R.; KRIEGER, N.; VANDENBERGUE, L. P. S·; LEBEAULT, J. Μ. Production of proteolytic enzymes by filamentous fungi in solid state fermentation. In: 3° Seminario Brasileiro de Tecnologia Enzimatica1 Rio de Janeiro, 1997). Outra Iinha de pesqusa do grupo constitui ο estudo do potencial antioxidante e antitumoral de extratos obtidos a partir do cultivo micelia! submerso de Iinhagens combinadas de macromicetos (P10221003887192).

O Iaboratorio mantem um banco de cepas de macromicetos com aproximadamente uma centena de Iinhagens de mais de 80 diferentes especies, aproximadamente 20 isoladas da Mata Atlantica. Os micelios sao mantidos por repique periodico e refrigeragao a 4°C. Outras tecnicas para preservagao por Iongos periodos estao sendo testadas, como Iiofilizagao e criopreservagao em nitrogenio Iiquido e freezer -80°C.

A fabricagao de farmacos utilizando fungos demonstra, poi|anto, grande potencial. Especiaimente no caso de medicamentos obtidos a partir de macromicetos, a afirmagao e confirmada pelas vendas mundiais estimadas em mais de $10 bilhoes de dolares por ano. Alem do mais, estas vendas tendem ao crescimento desde 2003, quando foram Iangados medicamentos cosmeticos feitos com shiitakes. Antes da expansao da tecnologia, fungos eram cultivados em meio liquido, principalmente para estudos sobre a fisiologia (Johnson & Johnson Consumer Companies, Inc. Discover the Science of Active Naturals, Natural shiitake, 2005. Acessado em: http://www.aveeno.com/active-naturals-shiitake 2011).

Diversidade macrofiingica regional

A maioria das especies de macrofungos da Floresta Ombrofila Mista e saprofita. Um nCimero relativamente menor de especies e facuItativa ou obrigatoriamente ectomicorrizica. Ha ainda especies que sao parasitas de plantas, artropodes, nematodeos e mesmo de outras especies de fungos (MEIJER, A. A. R. Macrofungos notaveis das florestas de pinheiro-do-Parana. Ministerio da Agricultura, Pecuaria e Abastecimento/ Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuaria (Embrapa) Florestas. Colombo, 2008).

Os fungos decompositores de madeira podem ser classificados como podridao branca ou podridao marrom. Os fungos da podridao branca sao capazes de produzir enzimas para decompor tanto celulose e hemicelulose como lignina. Os fungos da podridao marrom sintetizam enzimas que degradam seletivamente celulose e hemicelulose, mas nao Iignina (PANDEY, K. K.; PITMAN, A. J. FTIR studies of the changes in wood chemistry following decay by brown-rot and white-rot fungi. International Biodeterioration and Biodegradation. 52: 151-160, 2003). Um pequeno nijmero de especies de fungos da podridao marrom e um grande niimero de especies da podridao branca sao encontrados na Mata de Araucaria (MEIJER, A. A. R. Macrofungos notaveis das florestas de pinheiro-do-Parana. Ministerio da Agricultura, Pecuaria e Abastecimento/ Empresa BrasiIeira de Pesquisa Agropecuaria (Embrapa) Florestas. Colombo, 2008). Apenas em tecidos do pinheiro-do-parana foram encontradas pelo menos 135

especies de macrofungos (118 no estado do Parana) (MEIJER, A. A. R. Preliminary list of the macromycetes from the Brazilian state of Parana. Boletim do Museu Botanico Municipal 68: 1-55, 2006). Tais fungos podem ser interessantes do:玲onto de vista tecnologico. Com a aplicagao da micotecnologia, residuos da agroindustria e da industria madeireira podem ser convertidos em bioprodutos de alto valor agregado, que vao desde cogumelos comestiveis e medicinais ate etanol, antibioticos, antitumorais (SELEGHIM, P.; POLIKARPOV, I. Desafios para transformar conceitos em realidade. In: Scientific American Brasil 87: 32-37, Dossie Biocombustivei, 2009); (SOCCOL, C. R.; DALLA SANTA, H. S.; RUBEL, R.; VlloLA, F. M. D.; LEIFA, F.; PANDEY, A.; SOCCOL1 V. T. Mushrooms- a promising source to produce pharmaceutical and nutraceutical bioproducts. In: Current topics on bioprocesses in food industry (ed. Koutinas, A.; Pandey, A.; Larroche1 C.), v. 2, Asiatech, 2008); (STAMETS, P. The medicinal mushroom forest/ Mycorestoration. In: Mycelium running: how mushrooms can help save the world, pp.33-120, Ten Speed Press, 2005) e compostos aritiparasitarios, como e ο caso da presente patente.

Nao e simples estimar a diversidade fiingica na Mata Atlantica. E possivel que existam 8.400 especies de fungos na Floresta Ombrofila Mista e estima-se que existam pelo menos 2.000 especies de macrofungos no estado do Parana. Apenas 976 destas especies foram descritas em trabalhos cientificos e nao mais que algumas dezenas foram pesquisadas em busca de aplicagoes tecnologicas (MEIJER, A. A. R. Macrofungos notaveis das florestas de pinheiro-do-Parana. Ministerio da Agricultura, Pecuaria e Abastecimento/ Empresa Brasileira de Pesquisa

Agropecuaria (Embrapa) Florestas. Colombo, 2008). Exploragao da biodiversidade macrofiingica na Mata Atlantica

Um ηLimero relativamente pequeno de pesquisadores esteve e esta envolvido com ο estudo da biodiversidade fiingica da Mata Atlantica. Os primeiros registros da coleta de macrofungos nesta regiao datam do seculo XVIII, porem apenas comegaram a ser mais bem documentadas a partir do seculo XIX. O primeiro fungo coletado no Brasil, que se tern registro, foi um exemplar de Pycnoporus sanguineus, coletado pelo frances Philibert Commerson1 proximo a baia de Guanabara, em 1767 (FIDALGO, O. A historia da micologia brasileira: I. Brasil colonia. Revista Brasileira de Historia da Ciencia, v.- n°2, 1985).

Dentre os botanicos estrangeiros que chegaram ao Brasil a partir de 1816, alguns coletaram e descreveram macrofungos, porem apenas um pequeno numero de especies nas primeiras decadas de trabalho. Destacam-se os pioneiros K. F, P. Von Martius (alemao), C. G. Beaupre (frances), W. J. Burchell (britanico), H. A. Weddell (frances), H. W. von Fernsee (austriaco) e A. F. M. Glaziou (frances). Em 1828, instalou-se na Bahia1 ο micologo sui?o J. S. Blanchet, que dentre outras realiza^oes, coletou ο material tipo de Lentinula boryana, especie popularmente conhecida como "shiitake americano" (MATA, J. L.; PETERSEN, R. H.; HUGHES, K. W. The genus Lentinula in the Americas. Mycologia 93(6): 1102-1112，2001). A coleta de macrofungos na Mata Atlantica comegou a se intensificar a partir da

segunda metade do seculo XIX e inicio do seculo XX. Em 1877, Berkeley & Cooke publicaram uma Iista de todos os macrofungos conhecidos ate entao. O espanhol 丄I. Puiggari, que chegou ao Brasil tambem em 1877, coletou muitos macrofungos na fronteira entre os estados de Sao Paulo e Parana, de 1881 a 1889. Outros coletores que contribuiram significativamente nesta fase foram C.A.W. Schwacke (alemao), A. Puttemans (Belga), e especialmente os alemaes F.A.G.J. MoIIer e E.H.G. Ule. O material usualmente era enviado a micologos, no exterior, para descrigao e classificagao. Esses micologos estrangeiros foram: J.P.F.C. Montaigne (frances; 1784-1866), J.-H. Leveille (frances; 1796-1870), M.J. Berkeley (britanico; 1803- 1889)，P.C. Hennings (alemao; 1841-1908), C丄.Spegazzini (italiano; 1858-1926) e ο proprio Moller (1860-1922). Outros pesquisadores coletaram macrofungos em territorio brasileiro no seculo XX, porem nao na Floresta Atlantica, mas

principalmente na Floresta Amazonica e algumas regioes do Rio Grande do Sul (MEIJER, A. A. R. Macrofungos notaveis das florestas de piriheiro-do-Parana. Ministerio da Agricuitura, Pecuaria e Abastecimento/ Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuaria (Embrapa) Florestas. Colombo, 2008).

Otero & Cook (OTERO, J. 1.; COOK, M. T. A bibliography of mycology and phytopathology of Central and South America, Mexico and the West Indies. Journal of the Agricultural University, 21: 249-486, Puerto Rico, 1937) publicaram uma bibliografia de tod a a Iiteratura micologica existente na America do SuI e America Central ate entao. Desde essa epoca muitos micologos estrangeiros coletararam macromicetos na Mata Atlantica. Os mais importantes foram R. Singer (alemao; 1906-1994) e E.J.H. Comer (britanico; 1906-1996). Mesmo a pequena porpao argentina da Mata Atlantica recebeu importantes micologos estrangeiros, incluindo ο proprio R. Singer, alem dos taxonomistas argentinos J.E. Wright e M. Rajchenberg (WRIGHT, J. E.; ALBERTO, E. Hongos. Guia de Ia region pampeana. v. I (Hongos con laminillas). Ed. L.O.L.A., Buenos Aires, 2002). Cientistas brasileiros comegaram a colaborar nos estudos da micobiota da Mata

Atl^ntica apenas no inicio do seculo vinte. Os principals representantes dessa fase sao A.P. Viegas (1906-1986) e A.C. Batista (1916-1967). Pesquisadores do Instituto de Botanica (SP)1 fundado em 1938, tambem realizaram importantes estudos sob re macromicetos coletados na Mata Atlantica e diversos assuntos relacionados a micologia. A.R. Teixeira (1918-2003), M.E.P. Kauffmann-Fidalgo (1928-1970), O. Fidalgo (1928-) e J.S. Furtado (1934-) foram os cientistas do Instituto de Bot§nica que mais desenvolveram pesquisa na area de macromicetos (FIDALGO, O. Introdu^ao a historia da micologia brasileira. Rickia, 3: 1-44, 1968).

O pesquisador que mais se destaca atualmente na descrigao e classifica?ao de especies de macrofungos nas florestas de pinheiro-do-Parana e ο holandes Andre de Meijer. Ele tem realizado um extenso trabalho na regiao desde 1979 (MEIJER, A. A. R. Mycological work in the Brazilian state of Parana. Nova Hedwigia 72: 105-159, 2001). A Iista mais completa de especies de macrofungos do Parana ja publicada e de sua autoria (MEIJER, A. A. R. Preliminary list of the macromycetes from the Brazilian state of Parana. Boletim do Museu Botanico Municipal 68: 1-55, 200.6). Publicou recentemente um Iivro1 pela editora da Empresa Brasileira de Tecnologia Agropecuaria (EMBRAPA), contendo descrigoes detalhadas e ilustra?oes de cem

especies notaveis (MEIJER, A. A. R. Macrofungos notaveis das florestas de pinheiro-do-Paraná. Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento/ Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária (Embrapa) Florestas. Colombo, 2008). A Lista de Espécies da Flora Brasileira cita diversas vezes o seu trabalho.

Mesmo com todo o trabalho citado, restam muitas espécies de macromicetos ainda não descritas cientificamente nesta região da Mata Atlântica. Muitas mais ainda por serem isoladas, cultivadas e estudadas. Temos à disposição uma enorme biblioteca química e genética, constituída por inúmeras espécies de organismos com inimagináveis capacidades metabólicas e imensurável potencial biotecnologia).

O gênero Perenniporia

Classificação: Fungi, Basidiomycota, Agaricomycotina, Agaricomycetes, Polyporales, Polyporaceae, Perenniporia.

Perenniporia Murrill 1942 é um gênero cosmopolita, abrangente, que foi largamente expandido nas últimas décadas, como conseqüência de múltiplas adições de novas espécies, ou da transferência de taxa existentes. No presente, pelo menos 77 espécies são descritas como pertencentes a este gênero, incluindo algumas espécies neotropicais (DECOCK, C.; RYVARDEN, L. Pereniiiporiella gen. nov. segregated from Perenniporia, including a key to neotropical Perenniporia species with pileate basidiomes. Mycology Research, 107(1):93-103, 2003); (DAI, Y.-C.; NIEMELÃ, T.; KINNUNEN, J. The polypore genera Abundisporus and Perenniporia (Basidiomycota) in China, with notes on Haploporus. Annales Botanici Fennici 39: 169-182, 2002).

De acordo com a definição moderna o gênero apresenta estrutura de hifas di ou trimítica, com grampos nas hifas generativas. Os basidiósporos apresentam paredes lisas e espessas, sendo globosos a elipsóides, hialinos a amarelados e freqüentemente truncados. As hifas vegetativas e esporos apresentam-se dextrinóides em um grau variável. Os fungos deste gênero pertencem ao grupo dos causadores da chamada "podridão branca" da madeira (DAI, Y.-C.; NIEMELÃ, T.; KINNUNEN, J. The polypore genera Abundisporus and Perenniporia (Basidiomycota) in China, with notes on Haploporus. Annales Botanici Fennici 39: 169-182, 2002). Os basidiomas são perenes, ressupinados a pileados, com píleo liso, ocráceo a preto com a maturação (GERBER, A.L.; NEVES, M.A.; LOGUERCIO- LEITE1 C. Some species of Perenniporia Murrill (Poriales, Basidiomycotina) from Southern Brazil. Revista Brasileira de Botânica 22(2): 185-193, 1999).

A espécie tipo, Polyporus medulla-panis (Jaqu. : Fr.), foi selecionada por Cooke em 1953 (RYVARDEN, L.; Genera of polypores - Nomenclature and taxonomy. Fungiflora, Oslo, 1991). Estudos como (RYVARDEN, L. African polypores - a review. Belgian Journal of Botanics. 131: 150-155, 1998) e (PARMASTO, E.; HALLENBERG, N. The genus Abundisporus (Hymenomycetes, Basidiomycotina). Karstenia 40: 129-138, 2000) discutem a dificuldade de separar os gêneros Abundisporus, Loweporus e Perenniporia. Refere-se ao gênero Perenniporia sensu lato como incluindo os gêneros Abundisporus e Loweporus.

O artigo (BOIDIN, J.; MUGNIER, J. ; CANALES, R. Taxonomie moleculaire des Aphyllophorales. Mycotaxon 66: 445-491, 1998) apresenta estudos sobre o grupo dos Aphyllophorales, aplicando técnicas de biologia molecular. A comparação de seqüências da região ITS do DNA de 360 espécies levou ao reconhecimento de 12 ordens: Atheliales, Botryobasidiales, Fomitopsidales, Hericiales, Hymenochaetaies, Hyphodermatales, Lachnocladiales, Pereriniporiales, Phanerochaetales, Phlebiales, Podoscyphales e Trametales.

No artigo (DAI, Y.-C.; NIEMELÃ, T.; KINNUNEN, J. The polypore genera Abundisporus and Perenniporia (Basidiomycota) in China, with notes on Haploporus.Annales Botanici Fennici 39: 169-182, 2002) foram ressaltadas as características: coloração dos esporos e reação com Azul de Algodão. Os esporos de espécies do gênero Perenniporia são hialinos e cianófilos. As hifas vegetativas da maior parte das espécies também são cianófilas.

As espécies deste gênero estão altamente dispersas pelo mundo. Espécimens de diversas espécies foram encontrados no Uruguai, Cuba, Porto Rico, África, Itália, Costa Rica, China, Venezuela, Argentina, Brasil, Paquistão, Antilhas Francesas, Ilhas Samoa, Peru, Colômbia, Filipinas, Panamá, Trinidad-Tobago, Java, Marrocos, Nova Zelândia, Sibéria Central, Guiana Francesa, Austrália, Estados Unidos, Canadá, Taiti, índia, Japão e Coréia (DECOCK, C.; FIGUEROA, S.H. Studies in Perenniporia Navisporus ortizii, a synonym of Perenniporia martius, and a note on Navisporus and Perenniporia in Cuba. Cryptogamie, Mycology, 21 (3):153- 162, 2000); (GERBER, A.L.; NEVES, M.A.; LOGUERCIO-LEITE, C. Some species of Perenniporia Murrill (Poriales1 Basidiomycotina) from Southern Brazil. Revista Brasileira de Botânica 22(2): 185-193, 1999).

Em (DAI, Y.-C.; NIEMELÃ, T.; KINNUNEN, J. The polypore genera Abundisporus and Perenniporia (Basidiomycota) in China, with notes on Haploporus.

Annales Botanici Fennici 39: 169-182, 2002) estão listadas e descritas 24 espécies do gênero encontradas na China.

Estão registradas em (GIBERTONI, T.B. Aphyllophorales (Basidiomycotina) em áreas de Mata Atlântica do nordeste brasileiro. Tese de Doutorado. Universidade Federal de Pernambuco, Recife, 2004) novas ocorrências de quatro espécies do gênero Perenniporia na região nordeste do Brasil: P. aurantiaca, P. contraria, P. martiusii e P. medulia-panis, nos estados de Alagoas, Paraíba, Pernambuco, Sergipe e Rio Grande do Norte. Este trabalho oferece chaves para identificação das diferentes espécies de Perenniporia descritas.

No artigo (GERBER, A.L.; NEVES, M.A.; LOGUERCIO-LEITE, C. Some species of Perenniporia Murrill (Poriales, Basidiomycotina) from Southern Brazil. Revista Brasileira de Botânica 22(2): 185-193, 1999) foram descritas sete espécies do gênero, para a região sul do país, incluindo o primeiro registro da espécie P. martius para o estado do Paraná. Pelo menos treze espécies deste gênero foram registradas ao todo para esta região:

Espécie Referência P. contraria (Berk. & Curt.) Ryv. (RYVARDEN, L. Type studies in the Polyporaceae - 20 Species described by G. Bresadola. Mycotaxon 33:303-327, 1988), P. detrita (Berk.) Ryv. (RYVARDEN, L. Type studies in the Polyporaceae - 16 Species described by J. M, Berkeley, either alone or with other mycologists from 1856 to 1886. Mycotaxon 20: 329-363, 1984). P. glaucopora (Líoyd) Ryv. (JESUS, M.A. Contribution to the knowledge of wood-rotting fungi in Brazil. II. Checklist of fungi from Maracá Island, Rondônia State. Mycotaxon 57:323-329. 1996). P. infiexibilis (Berk.) Ryv. (RYVARDEN, L. Type studies in the Polyporaceae - 16 Species described by J. M. Berkeley1 either alone or with other mycologists from 1856 to 1886. Mycotaxon 20:329-363, 1984), Ρ. martius (Berk.) Ryv. (RYVARDEN, L. Type studies in the Polyporaeeae - 16 Speeies described by J. M. Berkeley, either alone or with other mycologists from 1856 to 1886. Mycotaxon 20: 329-363, 1984). Ρ. medulla-panis (Jacq.: Fr.) Donk (RYVARDEN, L. Type studies in the Polyporaceae - 16 Speeies described by J. M. Berkeley1 either alone or with other mycologists from 1856 to 1886. Mycotaxon 20: 329-363, 1984) (RAJCHENBERG, M.; MEIJER1 A.A.R. New and noteworthy Polypores from Paraná and São Paulo States, Brazil.Mycotaxon 38:173- 185. 1990) (LOGUERCIO-LEITE, C.; GERBER, A L. Non- pileate Polypores on Santa Catarina Island, SC, Brazil. Mycotaxon 64:285-301, 1997) Ρ. neofulva (LIoyd) Ryv. (RYVARDEN, L.; Type studies in the Polyporaceae - 22. Species described by C. G. Lloyd in Polyporus. Mycotaxon 38:83-102, 1990) (GUGLIOTTA, A.; CAPELARI, M. Polyporaceaefrom Ilha do Cardoso, SP, Brazil. Mycotaxon 56: 107-113; 1995) Ρ. ochroleuca (Berk.) Ryv. (RYVARDEN, L.; Type studies in the Polyporaceae - 16 Species described by J. M. Berkeley, either alone or with other mycologists from 1856 to 1886. Mycotaxon 20:329-363, 1984) Ρ. ohiensis (Berk.) Ryv. (LOGUERCIO-LEITE, C.; WRIGHT, J.E. Contribution to a biogeographical study of the austro-americanxylophilouspolypores (AphylIophoraIes) from Santa Catarina Island1 SC1 Brazil.Mycotaxon 41: 161-166, 1991). Ρ. piperis (Rick) Rajch. (RAJCHENBERG, M. Type studies of Polyporaceae (AphylIophoraIes) described by J. Riek. Nordie Journal of Botany 7:553-568, 1987). (SILVEIRA, R.M.B.; GUERRERO, R.T. Aphyllophorales poliporóides (Basidiomyeetes) no Parque Nacional de Aparados da Serra, Rio Grande do Sul. Boletim do Instituto de Biociência - UFRGS 48:1-127, 1991) (LOGUERCIO-LEITE, C.; WRIGHT, J.E. Contribution to a biogeographical study of the austro-american xylophilous polypores (AphylIophoraIes) from Santa Catarina Island1 SC1 Brazil. Mycotaxon 41:161-166, 1991), Ρ. sinuosa Ryv. (RYVARDEN, L. New and noteworthy polypores from tropical America. Mycotaxon 28:525-541; 1987). Ρ. stipitata Ryv. (RYVARDEN, L.; New and noteworthy polypores from tropical America. Mycotaxon 28:525-541;1987). (LOGUERCIO-LEITE, C.; WRIGHT, J.E. Contribution to a biogeographical study of the austro-american xylophilous polypores (AphylIophoraIes) from Santa Catarina Island, SC, Brazil. Mycotaxon 41:161-166, 1991). P. tephropora (Mont.) Ryv. (WRIGHT, J.E. Loweporus, a new genus of pore fungi. Memoirs of The New York Botanical Garden 28: 225-231, 1976). Perenniporia martiusii (BerkeIey) Ryvarden 1972

A espécie originalmente classificada e nomeada como Polyporus martius, por Hooke, em 1956, foi reclassificada e renomeada como Perenniporia martius por Ryvarden, em 1972. Ocorrências desta espécie foram registradas em diversos pontos do território brasileiro, incluindo os estados: Bahia (GÓES-NETO, A. Polypore diversity in the state of Bahia, Brazil: a historical review. Mycotaxon 72: 43-56, 1999), Paraná (RYVARDEN, L.; MEIJER, A. A. R. Studies in neotropical polypores 14. New species from the state of Paraná, Brazil. Synopsis Fungorum 15: 34-69; 2002), Rio Grande do Sul (GROPOSO, C.; LOGUERCIO-LEITE, C. Fungos poliporóides xilófilos (Basidiomycetes) da Reserva Biológica Tancredo Neves, Cachoeirinha, Rio Grande do Sul, Brasil. Iheringia, sér. bot., 57(1): 39-59, 2002), São Paulo (TEIXEIRA, A.R. Himenomicetos brasileiros IV. Bragantia 8: 75-80. 1948), Santa Catarina (GERBER, A.L.; NEVES, M.A.; LOGUERCIO-LEITE, C. Some species of Perenniporia Murrill (Poriales, Basidiomycotina) from Southern Brazil. Revista Brasileira de Botânica 22(2): 185-193, 1999), Paraíba, Pernambuco e Rio Grande do Norte (GIBERTONI, T.B. Aphyllophorales (Basidiomycotina) em áreas de Mata Atlântica do nordeste brasileiro. Tese de Doutorado. Universidade Federal de Pernambuco, Recife, 2004); (GIBERTONI, T.B.; SANTOS, P.J.P.; CAVALCANTI, M.A.Q. Ecological aspects of Aphyllophorales in the Atlantic rain forest in northeast Brazil. Fungai Diversity 25: 49-67, 2007). A maior parte dos corpos de frutificação de P. martiusii foi encontrada em madeira de dicotiledôneas. Alguns em árvores vivas e alguns em madeira em decomposição (GIBERTONI, T.B. Aphyllophorales (Basidiomycotina) em áreas de Mata Atlântica do nordeste brasileiro. Tese de Doutorado. Universidade Federal de Pernambuco, Recife, 2004); (GIBERTONI, T.B.; SANTOS, P.J.P.; CAVALCANTI, M.A.Q. Ecological aspects of Aphyllophorales in the Atlantic rain forest in northeast Brazil. Fungai Diversity 25: 49-67, 2007).

Os corpos de frutificação da espécie P. martiusii apresentam píleo com uma superfície escura e glabrosa, com textura semelhante à de madeira, com uma margem branca e coriácea. A região escura do píleo apresenta sulcos e faixas de cor ligeiramente mais amarelada ou acinzentada no sentido concêntrico. O córtex pilear, de cor preta, se estende por cerca de 2mm de espessura. A superfície dos poros (himênio) apresenta coloração entre o creme (quase branco) e marrom amarelado claro. Os poros são circulares (aproximadamente 4 a 6 por milímetro). Os tubos podem ter até 6cm de profundidade, estratificados em camadas de até 8mm, sendo as camadas mais jovens de coloração mais clara.

Os basidiósporos de P. martiusii são lisos e lacrimóides: contorno aproximadamente elíptico e uma das extremidades abruptamente atilada; com paredes grossas, diâmetros entre 6,5 e θ,Ομηη; hialinos e variavelmente dextrinóides. As hifas generativas, hialinas, apresentam paredes finas e grampos de conexão. As hifas conectivas, hialinas, apresentam paredes grossas. As hifas esqueléticas, hialinas, apresentam paredes grossas. Todas as hifas apresentam paredes com espessura entre 1,0 e 2,7ym, são fortemente dextrinóides e apresentam coloração hialina a amarelada em KOH. Características que permitem diferenciar P. martiusii de outras espécies do mesmo gênero são: o formato lacrimóide dos esporos e a alta dureza e densidade dos basidiomas após secagem (putras espécies se apresentam mais macias e leves) (GERBER, A.L.; NEVES, MA; LOGUERCíÔ-LEITE, C. Some species of Perenniporia Murrill (Poriales, Basidiomycotina) from Southern Brazil. Revista Brasileira de Botânica 22(2): 185-193, 1999); (GIBERTONI, T.B. Aphyllophorales (Basidiomycotina) em áreas de Mata Atlântica do nordeste brasileiro. Tese de Doutorado. Universidade Federal de Pernambuco, Recife, 2004).

Aplicações tecnológicas de espécies do gênero Perenniporia

P. fraxinophila é um agente de decomposição da madeira, que parasita árvores vivas. Apesar de, usualmente, não matarem as plantas hospedeiras, as infecções reduzem seu ritmo de crescimento e as torna mais frágeis e susceptíveis às condições ambientais (LESICA, P.; ATTHOWE, H.E.; DUGAN, F.M. Incidence of Perenniporia fraxinophila and its effects on green ash (Fraxinus pennsyivanica) woodlands in eastern Montana, USA. Forest Ecology and Management 182:153- 159, 2003). O micélio desta espécie tem sido cultivado e estudado para a produção de metaloproteases, úteis para aplicações terapêuticas contra doenças cardiovasculares (KIM, J.-S.; KIM, J.-E., CHOI, B.-S.; PARK, S.-E.; SAPKOTA, K.; KIM, S.; LEE, H.-H.; KIM, C.-S.; PARK, Y.; KIM, M.-K.; KIM, Y.-S.; KIM, S.-J. Purification and characterization of fibrinolytic metaloprotease from Perenniporia fraxinea mycelia. Mycological Research, in press, 2008). Perenniporia medula-panis foi estudada para a produção de compostos redutores de ferro, úteis para a degradação de materiais lignocelulósicos, como os efluentes do processo de branqueamento do papel (ARANTES, V.; MILAGRES, A.M.F. Evaluation of different carbon sources for production of iron-reducing compounds by Wolfiporia cocos and Perenniporia medulia-panis. Process Biochemistry 41:887-891, 2006).

No trabalho (SANTOS, M. M.; AMAZONAS, M. A. L. A.; MITCHELL, D. A.; KRIEGER, N. Seleção de Macrofungos Produtores de Lipases e Proteases. In: XIV Simpósio nacional de Fermentações - SINAFERM, Florianópolis-SC, 2003) foi identificada uma cepa da espécie P. martiusii como produtora de proteases.

Seis terpenóides, derivados de perenniporiol, foram extraídos com benzeno, do micélio cultivado de Perenniporia ochroleuca, e caracterizados (INO, C.; HIROTANI, M.; FURUYA, T. Two perenniporiol derivatives, lanostane-type triterpenoids, from the cultured mycelia of Perenniporia Phytochemistry 23 (12), 2885-2888, 1984); (HIROTANI, M.; INO, C.; FURUYA, T.; SHIROT, M. Perenniporiol derivatives six triterpenoids from the cultured mycelia of Perenniporia Phytoehemistry 23(5), 1129-1134, 1984).

Estado da técnica

Tratamento de Leishmanioses

A principal opção no combate de Ieishmanioses são os medicamentos.

Entretanto, se não apropriadamente empregados em conjunto com diagnóstico adequado, a doença resulta em elevadas taxas de morbidade e letalidade. Casos de Ieishmaniose visceral, por exemplo, levam a 60 mil óbitos por ano no mundo.

Apesar de úteis, os tratamentos atuais apresentam uma série de problemas. São extensos, caros e algumas vezes inúteis devido à intolerância causada por elevada toxicidade. Ainda incluem restrições tais como efeitos colaterais diversos, variável eficácia de recuperação e possível seleção de parasitas resistentes à medicação (CROFT, S.L.; YARDLEY, V. Chemotherapy of leishmaniasis. Current Pharmaceutical Design, 8: 319-42, 2002). As primeiras evidências de eficácia no tratamento contra Ieishmaniose

utilizaram um composto antimonial trivalente, o tartarato de antimônio e potássio, também denominado tártaro emético. O fato foi primeiramente descrito em 1912 pelo brasileiro Gaspar Vianna, que relatou melhorias no tratamento da Ieishmaniose tegumentar americana (VIANNA, G. Tratamento da Leishmaniose Tegumentar por injeções intravenosas de Tártaro Emético. IN: 7o Congresso Brasileiro de Medicina e Cirurgia, 4., 1912, Anais do 7o Congresso Brasileiro de Medicina e Cirurgia, 426- 428, 1912.)· Em 1915, foram relatados tratamentos eficazes também para casos de manifestação clínica de Ieishmaniose visceral (Di CHRISTINA, G.; CARONIA, G. BULL. Soe. Pathol. Exot., 8, 63. 1915).

O medicamento inicial era agente de intolerância gastrintestinal e efeitos cardiotóxicos. Em vista disto foi logo substituído por tratamentos com antimoniais pentavalentes, minimizando-se os quadros de efeitos colaterais agudos. Antimoniais pentavalentes foram aplicados pela primeira vez contra

Leishmania há quase noventa anos e permanecem até hoje como a primeira escolha terapêutica. A primeira formulação com antimonial pentavalente foi a uréia estibamina, desenvolvida na índia em 1922 por Bramachari (BRAHMACHARI, U. N. Chemotherapy of antimonial compounds in kala-azar infection. Part I., 1922. Indian Journal of Medicai Research 89: 492-522, 1989), que obteve um derivado uréico do ácido p-aminofenil estibínico. Em 1936, Schmidt difundiu o uso de gluconato de antimônio (V) sódico, conhecido comercialmente como Solustibosan (Bayer) ou Pentostam (Glaxo Wellcome) (RATH, S. et al. Antimoniais empregados no tratamento da leishmaniose: Estado da Arte. Química Nova, SP, 26(4), 2003). Na ocasião da Segunda Guerra Mundial, na França, o fármaco antimoniato de

meglumina (antimoniato de N-metil glucamina) - comercialmente denominado Glucantime - foi fabricado sinteticamente pela empresa Rhône-Poulenc-Rohrer. Surgiu como alternativa aos medicamentos produzidos em outros países. Um dos processos de sua síntese química envolve a dissolução lenta de antimônio pentavalente na forma de ácido antimônico ou KSb(OH)6 em N-metil-glucamina (NMG) a 60-70°C por 2 horas, seguida de precipitação por acetona gelada. Isto resulta no antimônio pentavalente complexado em várias formas químicas com a N- metil-glucamina e fórmula geral SbnNMGn+1 e SbnNMGn (DEMICHELI, C.; FIGUEIREDO, T.L.; CARVALHO, S.; SINESTERRA, R.D.; LOPES, J.C.D.; FREZARD, F. Physico-chemical characterization of meglumine antimoniate. BioMetaIs, 12: 63-66, 1999).

Esquemas de administração ininterruptos são imprescindíveis no tratamento de leishmanioses. Altas dosagens diárias das drogas antimoniais são necessárias, normalmente aplicadas por via parenteral intramuscular ou endovenosa. Estes esquemas são consideravelmente tóxicos, embora mais de 80% do antimônio administrado seja excretado por via renal dentro de 24 horas de forma inalterada (NAVA, A.; ROMAN1 S.S. Efeito do antimoniato de meglumina sobre a performance reprodutiva de camundongos prenhes. Vivências. 1:201-12; 2006).

O antimônio acumula-se principalmente no fígado, baço e rins, pois possui grande afinidade por tecidos e órgãos vascularizados (FELICETTI, S.A.; THOMAS R.G.; McCLELLAN R.O. Metabolism of two valence states of inhaled antimony in hamsters. Am Ind Hyg Assoc J. 35:292-300, 1974); (SAMPAIO, R.N.; PAULA, C.D.; SAMPAIO, J.H.; FURTADO, R.S.; LEAL, P.P.; ROSA, T.T. et al. The evaluation of the tolerance and nephrotoxicity of pentavalent antimony administered in a dose of 40 mg Sb V/kg/day, 12/12 hr, for 30 days in the mucocutaneous form of leishmaniasis. Rev Soc Bras Med Trop.; 30:457-63; 1997). Isto favorece efeitos colaterais com sintomas típicos de intoxicação crônica por antimônio (REES, P. H.; KESTING, Μ. I.; KAGER, Ρ. A.; HOCKMEYER, W. T. Lancet 2, 226; 1980); (MARSDEN, P.D.; SAMPAIO R.N.; CARVALHO E.M.; VEIGA J.P.; COSTA J.L.; LLANOS- CUENTAS E.A. High continuous antimony therapy in two patients with unresponsive mucosal leishmaniasis. American Journal of Tropical Medicine;. 34, 710-3; 1985). Assim sendo, não se deve ultrapassar o limite de 850 mg de antimônio administrado ao dia, segundo preconiza a OMS (WHO - Worid Health Organization, Research on leishmaniasis. Acessado em: http://www.who.int/ieishmaniasis/ 2011).

Até o presente não se tem certeza do mecanismo de ação da quimioterapia com antimônio pentavalente. Desconfia-se que as vias metabólicas de beta- oxidação de ácidos graxos e glicólise do parasita sofrem interferência do antimônio trivalente; forma para qual o antimônio pentavalente é convertido após sua administração. O desequilíbrio gerado leva a uma depleção dos níveis de ATP intracelular, resultando na morte do parasito (BALAI^A-FOUCE, R.; REGUERA, R-M.; CUBRÍA, C.; ORDÓNEZ, D. General Pharmacology 30, 435, 1998); (ROBERTS, W. L.; MCMURRAY, W. J.; RAINΕΥ, Ρ. M. Antimicrob. Agents Chemother 42, 1076, 1998).

Alguns novos medicamentos de segunda escolha tornaram-se disponíveis na última década. Formulações foram padronizadas e registradas para ensaios clínicos e, em alguns países, até mesmo para utilização (SVS / MS - Secretaria de Vigilância em Saúde, Ministério da Saúde - Brasil. Atlas de Leishmaniose Tegumentar Americana - Diagnóstico Clínico e Diferencial. 1a ed. Brasília, 2006); (SVS / MS - Secretaria de Vigilância em Saúde, Ministério da Saúde. Fundação Nacional de Saúde. Manual de Vigilância da Leishmaniose Tegumentar Americana. 2.ed. Brasília, 2007). Os resultados da combinação destas novas terapias com antimoniais pentavalentes são promissores, mas variam conforme cada caso.

Apesar de ativos no tratamento de diversas formas de leishmaniose, esses fármacos não têm uso generalizado. Nenhum apresenta um bom índice terapêutico associado a uma baixa toxicidade. Além disso, apresentam altos custos, facilidade de desenvolvimento de resistência clínica, e possivelmente, contribuição para aumentar a incidência de co-infecções (MITROPOULOS, P.; PETE, K.; KONIDAS D.O.; DURKIN-KONIDAS, M. NewWorId cutaneous leishmaniasiç: Updated review of current and future diagnosis and treatment. Review. Journal of the American Academy of Dermatology, 63:2, 2010); (SVS / MS - Ministério da Saúde Secretaria de Vigilância em Saúde Programa Nacional De DST e AIDS. Manual de Recomendações para Diagnóstico, Tratamento e Acompanhamento da Co-infecção Leishmania-HIV. Série A. Normas e Manuais Técnicos, 2004).

Destacam-se entre os medicamentos representantes de segunda linha: anfotericina B, pentamidina, miltefosine e paromomicina.

A anfotericina B forma complexos com esteróis substituídos, causando poros que alteram o equilíbrio de íons, o que desencadeia a morte de Leishmania. Contudo, é um fármaco altamente nefrotóxico. Necessita administração parenteral lenta ao longo de quatro horas, muitas vezes resultando em graves reações agudas (HERWALDT B. L. Leishmaniasis - seminar. The Lancet 354: October 2, 1999). Várias formulações coloidais e Iipossomais foram desenvolvidas e são um avanço na minimização de efeitos colaterais, como por exemplo, o AmBisome. No entanto são economicamente inviáveis para a população comprometida (DAVIS, A.J.; MURRAY, H.W.; HANDMAN, E. Drugs against leishmaniasis: a synergy of technology and partnerships. Trends in Parasitology, 20: 73-76, 2004).

Pentamidina, uma diamidina catiônica, age na mitocôndria. É usada contra os parasitas resistentes a antimoniais. Porém em cerca de 25% dos casos, os parasitas tornam-se resistentes também a este fármaco (JHA, T.K. Drug unresponsiveness & combination therapy for kala-azar. Indian J Med Res 123: 389-398, 2006.). Além disso, o paciente necessita de acompanhamento clínico durante o tratamento.

Miltefosine, pertencente ao grupo de alquilfosfocolinas, é o primeiro medicamento oral disponível no tratamento de leishmanioses. Em estudos experimentais apresentou alta eficiência, mesmo sem refrigeração. Por outro lado, esta droga possui custo limitante, não pode ser administrada durante a gravidez e ocasiona problemas gastrointestinais (PALUMBO, E. Oral Miltefosine Treatment in Children With Visceral Leishmaniasis: a Brief Review. The Brazilian Journal of Infectious Diseases 12(1):2-4, 2008). Por fim, a Paromomicina, um antibiótico aminoglicosídeo, está na última fase

de ensaios clínicos. Normalmente serve de apoio a outros tratamentos. Utiliza-se formulação parenteral contra Ieishmaniose visceral; tópica ou parenteral contra a forma tegumentar (JHINGRAN, A.; CHAWLA, B.; SAXENA, S.; BARRETT, P.; MADHUBALA, R. Paromomycin: uptake and resistance in Ieishmania donovani. Molecular & Biochemical Parasitology doi:10.1016/j.molbiopara.2008.12.007).

Compostos Antileishmania

O documento de patente US 4,209,519 refere-se a um método de tratamento de leishmanioses que inclui uma etapa de administração parenteral ou oral de um derivado Iepidine ou sais destes compostos. O método compreende fornecer uma quantidade eficaz da composição Ieishmanicida a um animal infectado. Mais especificamente, se relaciona com a administração de derivados de 8-amino-6- metoxi-lepidine. O autor cita a importância das cadeias alquila para atividade dos compostos.

O trabalho anterior foi complementado por Werbel et al. (1987) no documento

de patente US 4,659,708, que propôs novas substituições eficientes para aumento de ação leishmanicida. Neste trabalho, derivados de 8-quinolinamine demonstraram atividade extraordinária. De acordo com esta invenção, é possível fazer substituições com parafinas de 10 ou mais carbonos; alquilas linear ou de cadeia ramificada; grupos arila mononucleares, como fenila, fenila substituída com grupos alquila, alcóxi, aralkoxy, amino, alquilamino, hidróxi ou hidrogênio; e grupos heterocíclicos como grupos piridil ou naftil. O documento de patente US 4,594,241 se refere a uma formulação farmacêutica melhorada, com novas formas de Iipossomas contendo antimônio. Preocupa-se principalmente com o processo de preparação e com a eficiência de incorporação do antimônio. Descobriram que um controle cuidadoso da relação entre antimônio, conteúdo lipídico das paredes do Iipossoma e composição da fase aquosa externa favorece a produção de grandes quantidades de fármaco Ieishmanicida encapsulado, além de aumentar estabilidade de armazenamento.

O documento de patente US 5,541,196 estuda uma composição farmacêutica para o tratamento da leishmaniose, que compreende como princípio ativo pelo menos um composto do grupo das quinolinas e derivados.

A invenção da patente US 5,663,155 refere-se a composições compreendendo um derivado de adenosina deaminase e um inibidor para a prevenção e tratamento de infecções parasitárias.

O documento de patente US 6,403,576 evidenciou novas composições antifúngicas e antiparasitárias identificando os mecanismos bioquímicos dos fármacos sobre a síntese de lipídios, metabolismo e excreção dos parasitos.

O principal objetivo da invenção BRPI0902841-2 A2 trata de composições contendo um composto químico da família das chalconas encapsulada erp Iipossomas voltada para produção de um medicamento antiparasitárip. No documento de patente BRPI0800947A2, Rabello et al. (2009) purificaram

dois metabólitos Ieishmanicidas a partir do micélio do fungo Cochliobolus sp. O cultivo foi realizado somente em placas de Petri, contendo Agar extrato de malte. O processo de produção utilizou pelo menos 160 placas de 90mm de diâmetro. A extração foi realizada com acetato de etila, rendendo um total de 2,04g de extrato bruto. A quantidade de extrato obtida foi satisfatória para realizar fracionamento.

O presente documento, de maneira diferente, propõe processos de cultivo micelial em equipamentos adequados para escalas industriais. As cepas, parâmetros de cultivo e processos de purificação aqui descritosforam combinados de maneira inédita e não-óbvia, gerando produtos que constituem alternativas tecnológicas economicamente viáveis e que se mostraram até mesmo mais eficazes que medicamentos atualmente disponíveis, em testes preliminares. Patentes prévias envolvendo fungos do gênero Perenniporia

Os documentos US 4,447,531 e US 4,431,733 defendem o processo de conversão de dextrose em frutose, por enzimas glucose-isomerases, produzidas por fungos de diversos gêneros, incluindo Perenniporia, em particular a espécie P. compacta. Os mesmos autores também patentearam as próprias enzimas e a obtenção de frutose a partir de amido liqüefeito, utilizando enzimas produzidas pelos mesmos fungos.

Em US 4,605,619 foi patenteado o processo de obtenção de frutose a partir de amido, utilizando alfa-amilases e glucose-isomerases produzidas por fungos de alguns gêneros, incluindo Perenniporia, em particular a espécie P. compacta.

As espécies do gênero Perenniporia foram incluídas na lista de fungos cultiváveis utilizando o processo de cultivo patenteado no documento US 5,123,203.

Nos documentos de patente US 5,750,005 e US 6,402,887 foram patenteados processos de biopolpação envolvendo a aplicação da espécie P. meduila-panis. Van Barneveld (WO 01/19940 A1) patenteou processos de compostagem que

empregam diversas espécies de fungos, incluindo P. tephropora. Esta mesma espécie foi utilizada na patente W02004/029017 A1, como modelo de fungo de "podridão branca" em testes de atividade fungicida, para comprovar a eficácia de compostos quaternários de amônio. Os fungos do gênero Perenniporia também são apontados na patente W02005/089156 A2 como patógenos vegetais de importância econômica.

A aplicação de três espécies do gênero Perenniporia para a detoxificação e descoloração de resíduos líquidos foi patenteada em WO 03/035561 A2. Estas espécies são: P. medulla-panis, P. ochroieuca e P. tephropora. Uma Iectina imunoestimulante, extraída do cogumelo Perenniporia fraxinea

(sin. Fomitella fraxinea) foi patenteada em US 7,438,915 para aplicação em galinhas, para aumentar a resistência dos animais à coccidiose.

No pedido de patente US 2009/0005340 foram requeridos processos envolvendo o cultivo submerso de basidiomicetos, incluindo espécies do gênero Perenniporia, para obtenção de diversas classes de substâncias ativas para variadas aplicações na área de saúde. O mesmo inventor patenteou também processos para produção de nutracêuticos e kits de medicamentos anticancer a partir do cultivo submerso do micélio de basidiomicetos, incluindo algumas espécies do gênero Pwenniporia (US 2009/0143280 e US 2010/0086647).

Perenniporia subacida e P. tephrosia estão listadas como úteis na fabricação de biodiesel em processos patenteados recentemente (US 7,824,453).

Perenniporia é citado ainda como um dos gêneros de fungos com aplicação

no tratamento de resíduos sólidos na patente W02010/055093 A1.

Fermentação Submersa

Os métodos de cultivo de macromicetos em meio de cultura líquido são notoriamente conhecidos e divulgados. Um amplo espectro de produtos obtidos a partir de fungos, com propriedades alimentícias, terapêuticas e cosméticas, já foram produzidos por Processos de Fermentação Submersa.

O trabalho inicial mais importante nesta área foi o de Treschovy (TRESCHOW, C. Nutrition of the cultivated mushroom, Dansk Bot. Ark., 11, 1-180, 1944), que tratou sobre a nutrição de Agaricus bisporus. Além de revisar trabalhos anteriores, descobriu uma série de compostos necessários para crescimento de micélio em meio líquido, sugerindo certas fontes fundamentais de carbono, aminoácidos, minerais e oligoelementos.

Também utilizando meio líquido, Ghosh & Sengupta estudaram as necessidades nutricionais de VoIvarieIIa volvacea (GHOSH, A.K. and SENGUPTA, S. Studies on biochemistry of higher fungi. I. Submerged growth of VoIvarieIIa volvacea in synthetic médium, J. Food Sei. Technol., 14, 6-9, 1977). Recomendaram o uso de aminoácidos ao invés de sais inorgânicos de amônio nos processos de decomposição de celulose, indicando a asparagina como melhor fonte de nitrogênio. Alguns trabalhos, como o de Ingold1 analisaram precisamente a fisiologia de

fungos macromicetos. Para isso, utilizaram meios líquidos de composição definida em fermentação submersa, desenvolvendo ainda mais a técnica. O crescimento dos fungos foi avaliado por meio do peso seco (INGOLD, C.T. The Biology of Mucor and Its Allies, Edward Arnold, London, 1978). Leatham relatou a obtenção de frutificação a partir de estoques dicarióticos de

Lentinula edodes em um meio quimicamente definido após de 45 dias da inoculação (LEATHAM, G.F.A. ChemicaIIy defined médium for the fruiting of Lentinus edodes, Mycologia1 75: 905-908, 1983). Em 1951, Η. Humfeld, Ε. Aeschlimann & J. R. Hoffman (US 2,542,031), patentearam ο biorreator clássico para cultivo submerso, no qual se pode realizar culturas com agitação e aeração forçadas. O dispositivo tem montagem de uma tampa acoplada sobre um tanque fechado, dando suporte ao eixo de agitação, entradas e conexões.

Desde então vários processos foram descritos e fizeram utilização deste invento, incluindo o cultivo micelial submerso de macromicetos. Isto é exemplificado nas patentes US 2,693,665, US 2,761,246, US 2,850,841 e US 6,490,824.

No atual estado da arte, entre uma infinidade de composições, um meio de cultura líquido tipicamente utilizado contém por litro: 50 g de sacarose, 10 g de nitrato de amônio, 5 g de fosfato de sódio, 2 g de sulfato de magnésio e 0,2 g de sulfato ferro, como descrito em US 6,490,824.

O documento de patente US 2,693,665 fornece processos para o crescimento do micélio de cogumelos em condições de aeração e fermentação submersa. Tem como objeto de invenção utilizar um meio de cultura composto por resíduos agrícolas, principalmente resíduos cítricos, de pera ou de aspargos. O processo descrito refere-se ao uso destes resíduos, materiais de pouco valor agregado na indústria de processamento de alimentos, para obtenção de micélio fúngico para aplicação em gêneros alimentícios.

O documento de patente US 2,761,246 tem como objeto de invenção a produção de micélio de cogumelos comestíveis da família Helvellaceae, principalmente do gênero Morchella. Fornece métodos de cultivo em meio líquido em condição aeróbica. Recomenda uma vasta gama de substratos e nutrientes de baixo custo, com tolerância a altas concentrações ou contaminações. Particularmente usa melaço, resíduos de alcachofra e meios totalmente sintéticos com sais de amônio. De acordo com a invenção, o próprio cogumelo é capaz de sintetizar compostos promotores de seu crescimento, como as vitaminas. Além disso, o produto final deve ter aroma, sabor e textura de alta qualidade.

O documento de patente US 2,850,841 refere-se ao crescimento aeróbio de micélio de cogumelos comestíveis em um substrato líquido para obtenção de um produto alimentício em forma compactada. A invenção inclui a obtenção de um produto comestível feito com o micélio do cogumelo crescido em condições aeróbicas submersas. Este produto tem sabor e aroma agradáveis, similares ao do corpo de frutificação. Além disso, fornece métodos de rápido crescimento de micélio, em quantidades abundantes, a um custo relativamente baixo, especialmente vantajoso comercialmente.

O documento de patente US 2,928,210 revela um processo para a produção de micélio de cogumelos comestíveis compreendendo um meio de cultura líquido contendo sulfite Iiquor e resíduos com baixo teor de dióxido de enxofre como fonte de carbono. Ainda reivindica a adição de alguns resíduos como fontes de nitrogênio e fósforo. Durante o processo, o inóculo é adicionado ao meio de cultivo descoberto pela invenção, permanecendo sob condições controladas de temperatura, pH e aeração até o final do crescimento.

O documento de patente US 3,086,320 faz uso do leite como um complemento de fermentação para o crescimento de fungos em fermentação submersa. Desta forma conseguiu expandir o uso da tecnologia para o crescimento de fungos do filo Eumicofita e Ficomicetos e das classes Ascomieetos, Basidiomicetos e Deuteromicetos. Até a época, o leite natural nunca havia sido usado como fonte de proteína para essa finalidade.

O documento de patente US 6,372,964 é dirigido a<? cultivo de Basidiomicetos superiores do gênero Pleurotus em cultura submersa para servirem como alimentos funcionais. As particularidades do processo incluem período de ihcubação mais curto que o tempo de frutificação. Além disso, os rendimentos de compostos, tais como Proteinai aminoácidos e vitaminas foram maiores que o corpo de frutificação padrão.

O documento de patente US 6,490,824 diz respeito a um novo e eficiente método de cultivo de um fungo basidiomiceto em um meio de cultura líquido. Particularmente, refere-se a um método para cultivar um fungo comestível como Agaricus blazei Murill1 Cortinellus shuitake, Lyophyllum aggregatum, Pleurotus ostreatus e similares. O objetivo principal foi obter agregados do fungo em meio líquido, de vários tamanhos, acarretado pela adição de materiais insolúveis em água que servem como suporte de crescimento do micélio.

O documento de patente US 7,635,492 fornece métodos de preparação de diversos gêneros alimentícios com fragmentos de micélio seco de cogumelos comestíveis. Reivindica métodos de utilização dessas formulações para promoção de bem-estar. Fornece, para isso, um método de preparação de uma suspensão de fungos comestíveis, o qual inclui o processamento da mistura de fungos comestíveis em meio aquoso e redução de tamanho dos fragmentos.

Fermentação no Estado Sólido

Pode se definir Fermentação no Estado Sólido (FES) como um conjunto de

técnicas utilizadas para cultivar microrganismos em substratos sólidos umedecidos, na ausência, ou quase-ausência de água livre. Os sistemas de FES são trifásicos: além do substrato sólido umedecido, é necessário o contato das células com uma fase gasosa.

Os organismos mais adaptados a este tipo de meio incluem fungos

filamentosos e leveduras. Podem ser realizadas fermentações naturais (sem um controle preciso sobre a composição da microbiota) ou utilizando culturas puras. Diversos processos produtivos, empregando FES1 vêm sendo ^utilizados pela humanidade desde tempos imemoriais, como por exemplo, na silagem, compostagem e na fabricação de pães, queijo, tempeh e fermentados de soja, como shoyu e misô. Porém, apenas com estudos realizados no século XX, sobre as exigências nutricionais de microrganismos e o desenvolvimento da microbiologia, tem sido possível dar uma abordagem científica aos métodos de cultivo no estado sólido (PANDEY, A.; SOCCOL, C. R.; LARROCHE, C. Introductln. In: Current Developments in Solid-State Fermentation. Ed.: Pandey, A.; Soccol, C.R. & Larroche, C.; Springer, pp.3-12, 2008); (STYER, J. F. Nutrition of the cultivated mushroom. American Journal of Botany 17(10): 983-994, 1930).

Apenas mais recentemente, desenvolvimentos tecnológicos sistemáticos têm sido realizados na área de FES, gerando aplicações industriais importantes, incluindo o tratamento de resíduos, o enriquecimento de materiais para a alimentação animal, a produção de cogümelos, e a obtenção de uma série de compostos de alto valor agregado, como biocombustíveis, enzimas, antibióticos, ácidos orgânicos, aminoácidos e metabólitos secundários biologicamente ativos (SINGHANIA, R.R.; PATEL, A. K.; SOCCOL, C.R.; PANDEY, A. Recent advances in solid-state fermentation. Biochemical Engineering Journal, 44(1): 13-18, 2009); (SOCCOL, C. R.; VANDENBERGHE, L. P. S. Overview of applied solid-state fermentation in Brazil. Biochemicai Engineering Journal 13: 205-218, 2003); (PANDEY, A.; SOCCOL, C. R.; RODRIGUEZ-LEÓN, J. A.; NIGAM, P. Production of Organic Acids by Solid-state Fermentation. In: Solid-state Fermentation in Bioteehnology - Fundamentais and Applications. New Delhi: Asiatech Publishers, Inc., pp.113-126, 2001).

O documento de patente US 7,754,653 descreve a produção de biopesticidas por fermentação no estado sólido. O documento US 6,667,066 diz respeito a uma preparação enzimática obtida por fermentação no estado sólido. A patente US 6,927,047 propõe a produção de ácido micofenólico por FES. Outros documentos de patente que envolvem fermentação no estado sólido incluem: produção de goma xantana a partir de resíduos de batata (US 7,727,747), produção de ácido giberélico (US 7,846,699) e produção de ácido metileno-succínico a partir de bagaço de cana (US 6,171,831).

Técnicas e parâmetros de cultivo para diversas espécies de macromicetos estão disponíveis em livros e artigos. Algumas destas tecnologias foram inclusive patenteadas. A patente US 2,005,365, de 1935, foi concedida para inóculo de cogumelos ("spawn") em forma de pellets, descrevendo a produção de inóculos com grãos, serragem velha, palha inutilizada, madeira apodrecida, capim e folhas deterioradas.

Desde então, os pedidos de patentes nessa área têm aumentado bastante. Exemplos são as patentes US 4,637,163; US 4,646,466 e US 4,833,821, que tratam de técnicas para a produção de cogumelos comestíveis.

Diversos materiais orgânicos podem ser utilizados como substrato para FES, incluindo resíduos industriais, agroindustriais e urbanos, tais como palhas, bagaços, cascas, farelos, esterco, serragem, cepilho, papel e papelão, dentre muitos outros. Alguns exemplos são: bagaços de cana, mandioca, uva e maçã; palhas, grãos e farelos de trigo, milho, arroz e sorgo; palha de diversos tipos de capim; esterco de bovinos e de aves; cascas de soja e de batata; serragem e cepilho de pinus e eucalipto.

Diversos documentos de patente dizem respeito a formulações de meios de cultivo sólidos. O documento de patente US 3,560,190 foi concedido, em 1971 para formulações de substratos sólidos, à base de serragem e resíduos da produção de algodão e óleo de algodão, para o cultivo de cogumelos. O documento US 3,940,883 descreve a formulação de meios para o cultivo de cogumelos, à base de serragem e farelos de trigo e arroz. A patente US 4,127,964 protege uma formulação específica, à base de esterco, para a produção de substrato compostado para o cultivo de cogumelos. A patente US 3,942,969 propõe a utilização de proteína desnaturada e óleos, como suplementos para o cultivo de cogumelos.

O documento de patente US 4,512,103 descreve a utilização de suportes sólidos, inertes ou não (como tijolo e telhas moídas ou cepilho) embebidos em meios líquidos nutritivos para o cultivo de fungos, incluindo cogumelos. O documento de patente US 7,043,874 estende esta tecnologia, propondo a utilização de resíduos da indústria de óleo de oliva, empregando perlita como suporte. A patente US 4,333,757 descreve uma técnica semelhante, utilizando materiais lignocelulósicos como suporte.

Algumas vantagens da FES sobre a fermentação submersa são: risco reduzido de contaminação bacteriana e maior concentração final de produtos, devido à ausência de água livre. Por outro lado, existem dificuldades técnicas significativas inerentes à FES, como: homogeneização e manutenção da temperatura, umidade e concentração de gases no substrato, devido aos padrões de transferência de massa e energia, característicos deste tipo de processo. Pequenas variações na umidade afetam significativamente o crescimento de microrganismos na FES: o excesso de água livre impede a difusão de oxigênio e favorece a anaerobiose; por outro lado, a falta de umidade impede que os microrganismos secretem as enzimas necessárias para a digestão dos substratos, originalmente insolúveis. Outra dificuldade consiste na transferência de materiais sólidos, como inóculo, substrato e produtos fermentados, de maneira a evitar contaminações (meios líquidos são facilmente bombeados através de tubulações) (PANDEY, A.; SOCCOL, C. R.; LARROCHE, C. General considerations about Solid-state fermentation processes. In: Current Developments in Solid-State Fermentation. Ed.: Pandey1 A.; Soccol, C.R. & Larroche, C.; Springer1 pp.13-25, 2008); (DURAND, A. Bioreactor designs for solid state fermentation. Biochemical Engineering Journal 13:113-125, 2003).

Em sistemas estáticos, a dispersão de calor e a difusão de gases podem constituir problemas. Podem ser formados gradientes de temperatura e de concentração de gases ao longo do reator, proporcionando condições de cultivo que se afastam do ideal em diversos pontos do leito. Recursos empregados para solucionar os problemas de transferência de massa e calor incluem: agitação intermitente; aeração forçada, com ar adequadamente umidificado e aquecido ou resfriado e trocadores de calor (DURAND, A. Bioreactor designs for solid state fermentation. Biochemical Engineering Journal 13: 113-125, 2003); (RAGHAVARAO1 K.S.M.S.; RANGANATHAN, T.V.; KARANTH, N.G. Some engineering aspects of solid-state fermentation. Biochemical Engineering Journal 13: 127-135, 2003).

No cultivo de fungos filamentosos, a agitação deve ser realizada em intervalos não muito curtos, para evitar o cisalhamento excessivo das hifas; e não muito longos, para evitar o crescimento de micélio entre as partículas sólidas. Usualmente, estes biorreatores operam em batelada, muitas vezes incluindo sistemas para esterilização do substrato e processamento do produto, in situ, para evitar contaminações.

Sensores de temperatura, umidade e de concentração de gases (O2 e CO2) podem ser instalados para monitorar variáveis de estado e controlar variáveis de processo, como as taxas de aeração, aquecimento, umidificação e a freqüência de agitação. Algumas outras análises são difíceis de implantar em sistemas on-line, como: quantificação da biomassa microbiana, identificação da biomassa e quantificação de substratos e produtos (RODRIGUEZ-LEON, J. A.; SOCCOL, C. R.; PANDEY, A.; RODRIGUEZ, D. E. Kinetics in Solid-state Fermentation. In: Current Developments in Solid-State Fermentation. Ed.: Pandey, A.; Soccol, C.R. & Larroche, C.; Springer, pp.48-73, 2008). Por isso também é desejável um sistema para coleta de amostras do biorreator, para as análises off-line.

Alguns desenhos de biorreatores para FES vêm sendo desenvolvidos e patenteados, assim como processos e produtos decorrentes destas tecnologias. Admite-se, porém, ainda serem possíveis e necessárias melhorias nestes equipamentos, especialmente para grandes escalas. Pesquisadores estão buscando elucidar os princípios físicos e químicos envolvidos, para viabilizar estratégias mais eficientes de projeto e operação para estes equipamentos (RAGHAVARAO, K.S.M.S.; RANGANATHAN, T.V.; KARANTH, N.G. Some engineering aspects of solid-state fermentation. Biochemical Engineering Journal 13:127-135, 2003).

Os modelos mais freqüentes de biorreatores para cultivo no estado sólido podem ser classificados, basicamente em: estáticos ou agitados, com aeração forçada ou não, podendo aerar e agitar de maneira contínua ou intermitente. O modelo mais antigo, porém ainda bastante utilizado, é tradicionalmente utilizado para a fabricação de shoyu. Neste sistema, prateleiras recebem camadas de substrato inoculado e são mantidas em salas climatizadas. Devido à dificuldade de se manter condições assépticas em grandes salas de cultivo, sacos de polipropileno podem ser utilizados para manter a esterilidade do substrato ao longo do processo. O documento dê patente US 4,311,477 sugere um modelo de sacos plásticos especialmente desenhados para FES.

Foram desenvolvidos também, reatores fechados e esterilizáveis, contendo prateleiras, dispondo de aeração forçada e trocadores de calor. Os reatores agitados, usualmente consistem de tambores rotatórios. Por enquanto, relativamente poucos desenvolvimentos foram realizados para biorreatores em condições estéreis, o que limita os desenvolvimentos nas áreas de alimentos e fármacos (DURAND, A. Bioreactor designs for solid state fermentation. Biochemical Engineering Journal, 13: 113-125,2003).

Muitas das dificuldades técnicas para grandes escalas foram solucionadas no modelo de reator denominado Zymotis, um reator estático compàrtimentado, com sistemas para controle de temperatura, umidade e aeração (ROUSSOS, S; RAIMBAULT, M.; PREBOIS, J. P.; LONSANE, Β. K. Zymotis: a large-scale solid- state fermenter. Design and evaluation. Applied Biochemistry and Biotechnology, 42: 37-52, 1993). Os documentos de patente US 6,197,573 e US 6,664,095 propõem um biorreator para FES em condições estéreis, denominado F>lafractorR. Este equipamento apresenta estrutura modular e controles de temperatura, umidade e concentração de gases. A esterilização dos substratos e a extração de produtos são realizadas no interior do próprio biorreator. A patente US 6,958,110 sugere um modelo específico de biorreator para biopolpação. Em US 7,476,534 encontramos um modelo dê prateleiras.

Dado o progresso atual na área de FES, muitos produtos biotecnológicos que estão em fase piloto podem se tornar economicamente viáveis em grande escala muito em breve. No âmbito da presente patente, a produção de substâncias com ação antiparasitária, a partir do cultivo do micélio de macromicetos pode ser realizada tanto utilizando meios líquidos, como meios sólidos. As duas abordagens são complementares, permitindo o processamento de uma grande variedade de substratos, para a obtenção de substâncias farmacológicas de grande valor. Sumário da invenção

A presente invenção trata de um processo para a produção de compostos antiparasitários por cultura de micélios macrofúngicos em biorreator. Isto foi confirmado experimentalmente, pela inibição de parasitos do gênero Leishmania, quando confrontados com produtos resultantes dos processos aqui descritos.

A Ieishmaniose é uma doença negligenciada, com casos severos, elevada prevalência, ampla distribuição, com expansão nas áreas de ocorrência e método de tratamento obsoleto. Nesta problemática, focou-se a solução desta parasitose.

Portanto, o principal objetivo desta invenção é produzir uma COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA Ieishmanicida segundo os processos e etapas aqui descritos. Para a fabricação de tal composição, é indicado que a cultura de micélio seja de alguma espécie do gênero Perenniporia1 preferencialmente Perenniporia martiusii.

O primeiro objeto desta invenção trata dos processos de preparação e produção em biorreator de micélio fúngico em meio líquido pelo processo de fermentação submersa.

O segundo objeto desta invenção trata dos processos de preparação e produção em biorreator de micélio fúngico em meio sólido pelo processo de fermentação em estado sólido.

O terceiro objeto desta invenção é produzir um MEDICAMENTO contendo uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA leishmanicida, o qual compreenda extrato de micélio de Perenniporia martiusii ou extrato de sobrenadante de caldo fermentado liofilizado, que é útil para o tratamento de Ieishmaniose do ser humano.

O quarto objeto desta invenção trata do uso das referidas composições farmacêuticas para o combate e tratamento de parasitoses em animais mamíferos, principalmente as leishmanioses.

Em resumo, esta invenção situa-se na pesquisa de novas terapêuticas contra doenças parasitárias. A busca por inovação em processos de fabricação de fármacos é uma estratégia ótima ao desenvolvimento tecnológico. Isto é evidente no caso de parasitoses negligenciadas, como as leishmanioses, para as quais não há investimento em pesquisa, sobretudo na inovação de processos industriais. Listagem de Figuras

A seguir, faz-se referência aos desenhos anexos ao texto para melhor compreensão dos exemplos e concretizações apresentados, nos quais:

A Figura 1 é um esboço diagramático das etapas necessárias para produção de uma composição antiparasitária adotando o processo de cultivo de micélios macrofúngicos em biorreator por fermentação submersa. De acordo com a invenção, a composição é leishmanicida. A numeração refere-se a 1: sistema de compressor de ar; 2: rotâmetro e indicador de fluxo de ar; 3: filtro de ar estéril; 4: Recipiente com inóculo; 5: soluções diversas (ácidos, bases, antiespumantes, etc.); 6: bomba dosadora; 7: estoque de meio de cultura estéril; 8: trocador de calor; 9: linha de vapor; 10: Biorreator para cultivo líquido; 11: dispersor de ar; 12: eixo de agitação mecânico (M: motor); 13: dreno do biorreator; 14: condensador; 15: válvula de segurança; 16: Tanque de espera resfriado; 17: filtro; 18: centrífuga; 19: biomassa; 20: caldo; 21: secador; 22: triturador; 23: extrator e/ ou coluna de cromatografia; 24: solvente; 25: esterilização por filtração; 26: evaporador; 27: misturador; 28: excipientes; 29: instrumentação; 30: controlador programável e (- : transferência de material; —: linha de ar comprimido; -III- sinais eletromagnéticos).

A Figura 2 é um esboço diagramático das etapas necessárias para produção de uma composição antiparasitária adotando o processo de cultivo de micélios macrofúngicos em biorreator por fermentação no estado sólido. De acordo com a invenção, a composição é leishmanicida. A numeração refere-se a 1: sistema de compressor de ar; 2: rotâmetro e indicador de fluxo de ar; 3: filtro de ar estéril; 4: Recipiente com inóculo líquido; 5: recipiente com inóculo principal em estado sólido; 6: linha de vapor; 7: soluções diversas (ácidos, bases, antiespumantes, etc.); 8: bomba dosadora; 9: reservatório de solução de umidificação ou complementação; 10: Biorreator principal para fermentação no estado sólido; 11: dispersor de ar; 12: eixo de agitação mecânico (M: motor); 13: dispersor de umidade; 14: secador; 15: triturador; 16: extrator e/ ou coluna de cromatografia; 17: solvente orgânico; 18: esterilização por filtração; 19: evaporador; 20: misturador; 21: excipientes; 22: instrumentação; 23: controlador programável; 24: condensador (- : transferência de material; —: linha de ar comprimido; -III- sinais eletromagnéticos).

Nas Figuras 3 e 4 foi adotado um código de duas letras para designar cada uma das espécies de macrofungos testadas: Pleurotus djamor (PD), P. calvescens (PC), Lycoperdon marginatum (LM), Perenniporia martiusii (PM), Plectania sp. (PL), Ganoderma australe (GA)1 Ganoderma stipitatum (GS) e Oudemansiella canarii (OC). Nestas figuras, a sigla Eac se refere a substâncias extraídas com acetona, a partir do caldo de fermentação submersa de macromicetos.

A figura 3 é um gráfico que expressa os resultados de atividade inibitória de

12 extratos obtidos a partir do caldo de fermentação de 8 diferentes espécies de macromicetos sobre a proliferação de protozoários da espécie Leishmania infantum pelo método da timidina radiomarcada. No eixo y está representada a intensidade de emissão radioativa, proporcional à intensidade de proliferação de parasitas em cada uma das amostras analisadas. Quanto menor o valor medido, maior a atividade inibitória do extrato testado. O controle positivo consistiu de Glucantime (300mg/mL), o controle negativo consistiu de protozoários cultivados em meio LIT modificado, contendo timidina radiomarcada, porém na ausência de extratos de macromicetos.

A figura 4 é um gráfico que apresenta os resultados de atividade inibitória dos sete extratos mais ativos avaliados pelo método da timidina radiomarcada sobre a proliferação de protozoários da espécie L. infantum. O eixo y representa a percentagem de atividade antiproliferativa de cada um dos extratos em relação ao controle positivo, Glucantime (300mg/mL).

A figura 5 mostra a cinética do processo de fermentação submersa em biorreator de bancada com capacidade de 14 litros. Os dados são representativos de quatro repetições independentes, executadas em batelada. No eixo y encontram-se as variáveis de estado analisadas ao longo do tempo (eixo x).

A figura 6 mostra o fluxograma e os rendimentos de cada etapa de processo de produção de uma composição farmacêutica leishmanicida. Os números representam as seguintes operações: 1- filtração; concentração, secagem e trituração; 2- extração, esterilização por filtração; 3- extração, esterilização por filtração; 4- cromatografia de adsorção, reagrupamento, esterilização por filtração. As letras de A a F representam as frações obtidas.

A figura 7 mostra os resultados dos ensaios das composições farmacêuticas contra parasitas da espécie Leishmania (V.) braziliensis (MHOM/BR/OO/LTBSOO). Exibe o número de promastigotas por mL (eixo y esquerda) e absorbância (eixo y direita), resultados respectivos do método Parasitológico e do método do MTT. Asterisco: diferença significativa com p<0,05 quando comparado com o respectivo controle negativo (C-, não tratado). Fármaco referência: Glucantime (G, 2000 pg/mL). Composições farmacêuticas, 1000 pg/mL: Xdcm - extrato diclorometano a partir de biomassa; Xsup - extrato aquoso a partir de biomassa; Xinf - extrato clorofórmico a partir de biomassa; Xac - extrato acetona a partir de biomassa; Sdcm - extrato diclorometano a partir de caldo de fermentação; Sac - extrato acetona a

partir de caldo de fermentação.

A figura 8 mostra os resultados dos ensaios das composições farmacêuticas contra parasitas da espécie Leishmania (L.) infantum (MHOM/FR/71/LRM75). Exibe o número de promastigotas por mL (eixo y esquerda) e absorbância (eixo y direita), resultados respectivos do método Parasitológico e do método do MTT. Asterisco: diferença significativa com p<0,05 quando comparado com o respectivo controle negativo (C-, não tratado). Fármaco referência: Glucantime (G, 2000 pg/mL). Composições farmacêuticas, 1000 pg/mL: Xdcm - extrato diclorometano a partir de biomassa; Xsup - extrato aquoso a partir de biomassa; Xinf- extrato clorofórmico a partir de biomassa; Xac - extrato acetona a partir de biomassa; Sdcm - extrato diclorometano a partir de caldo de fermentação; Sac - extrato acetona a partir de

caldo de fermentação. .

A figura 9 resume os valores de inibição das composições farmacêuticas em relação ao controle negativo (não tratado), contra as espéciès Leishmania braziliensis, Leishmania infantum e Leishmania amazonensis. A presença de asterisco significa que o resultado é estatisticamente diferente do respectivo controle em um nível de significância p<0,05. Os valores utilizados são referentes a experimentos realizados em triplicada com pelo menos duas repetições independentes.

A figura 10 é um quadro com fotomicrografias da contagem de promastigotas de Leishmania braziliensis sobreviventes após 48 horas tratamento das formas amastigotas internalizadas em macrófagos. Contagem de promastigotas realizada após sete dias de incubação em meio para diferenciação. Foto superior esquerda: controle negativo (não tratado). Foto superior direita: Composição Farmacêutica obtida a partir de biomassa de Perenniporia martiusii processada, extraída com clorofórmio (Xirrfl 1000 pg/mL). Foto inferior esquerda: Fármaco referência (Glucantime, 2000 pg/mL). Foto inferior direita: Composição Farmacêutica obtida a partir de caldo de fermentação de Perenniporia martiusii processada, extraída com diclorometano (Sdcm. 1000 pg/mL).

A figura 11 é um gráfico de inibição de formas amastigotas de Leishmania braziliensis internalizadas em macrófagos. Comparações são feitas em relação ao controle não tratado. Tratamentos: composição farmacêutica obtida a partir de biomassa de Perenniporia martiusii processada, extraída com clorofórmio (Xinf, 1000 pg/mL); Composição Farmacêutica obtida a partir de caldo de fermentação de Perenniporia martiusii processada, extraída com diclorometano (Sdcm, 1000 pg/mL); Composição Farmacêutica obtida a partir de biomassa de Perenniporia martiusii processada, extraída com diclorometano (Xdcm, 1000 pg/mL); Fármaco referência (Glucantime, 2000 pg/mL). A presença de asterisco significa que o resultado é estatisticamente diferente do respectivo controle em um nível de significância p<0,05.

Descrição detalhada da Invenção:

A presente invenção inova em fornecer novos processos e condições para produção e preparação de fármacos leishmanicidas, superando desvantagens do

If

atual estado da técnica. Destaca-se dos demais métodos porque emprega processos biotecnológicos em biorreator, facilitando a produção em çfrande escala e em menor período de tempo.

A maioria dos estudos e patentes referidos no estado da arte faz menção a processos de produção de fungos para fins alimentícios ou tão somente a métodos de tratamento com determinada composição biologicamente ativa. Além disso, muitos desses procedimentos são demorados e complexos, exigindo um tempo de oito semanas ou mais. Isso reflete no custo relativamente elevado.

Nenhuma referência anterior a esta invenção proporcionou processos e etapas para produção de uma composição farmacêutica Ieishmanicida tal como aqui descrito. Tanto quanto se sabe, as matérias-primas e os processos empregados nunca foram usados para essa finalidade no campo da fermentação industrial. Medicamentos usados no tratamento de Ieishmanioses são basicamente fabricados sinteticamente.

O cultivo em biorreator é uma alternativa tecnológica vantajosa, pois o produto final não é resultante de síntese química. A produção de fármacos sintéticos muitas vezes tem etapas delicadas, às vezes em condições perigosas, e inclui o uso de algumas matérias-primas que geram subprodutos tóxicos ao fim do processo.

Além disso, nem todos os compostos naturais bioativos podem ser completamente sintetizados por via química. Um grande número de compostos têm estruturas complexas, que são muito difíceis e caras de serem sintetizadas em escala industrial. Processos que envolvam síntese biológica, como os desta invenção, não apresentam esta restrição. Tais tipos de processos são cada vez mais requeridos, uma vez que empregam matérias-primas renováveis e ocorrem em condições brandas e controladas.

Neste contexto, a presente invenção apresenta um processo de produção

mais econômico e prático, escalonável para indústria. Assim, outra finalidade da presente invenção é proporcionar composições farmacêuticas menos tóxicas, mais efetivas e de fácil administração. Deste modo, busca disseminar a acessibilidade aos medicamentos que auxiliem no tratamento de leishmanioses.

Os itens apresentados descrevem as etapas de processo necessárias na

produção e preparação de uma COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA com propriedade inibitória sobre a replicação de parasitas, especialmente sobre o gênero Leishmania.

Os processos propostos na presente invenção estão representados nas Figuras 1 e 2 em forma de fluxogramas. Respectivamente, Ifesquematizam

processos que envolvem a tecnologia de fermentação submersa e a tecnologia de fermentação no estado sólido.

A seguir será detalhada a série de etapas destes processos, desde a preparação inicial das matérias-primas até a obtenção final de uma composição com ação leishmanicida.

A etapa fundamental dos processos compreende a cultura de micélios

macrofúngicos em biorreator (figs. 1.10 e 2.10); fornecendo condições apropriadas para o cultivo. Ao final, procedimentos específicos de processamento de micélio e substratos fermentados devem ser incluídos para melhorar a qualidade e facilitar manuseio do produto acabado.

O início do processo consiste no acondicionamento de fontes de carbono,

nitrogênio e sais inorgânicos no compartimento do biorreator. O tipo de compartimento depende do tipo de fermentação realizada. No caso de fermentação submersa, os nutrientes são dissolvidos em meio líquido, o qual pode ser depositado em biorreatores clássicos, tais como tanque agitado, coluna de bolhas e airlift, ou em biorreatores não convencionais.

No caso de fermentação em estado sólido, corresponde à distribuição de substratos sólidos e suficiente umidade em reatores clássicos do tipo bandeja ou tambores rotativos.

Tal COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA inclui, particularmente, produtos de processos fermentativos industriais de cultivo micelial de fungos, os quais são produzidos em biorreator por fermentação submersa ou por fermentação em estado sólido. Ao final dos processos de fermentação submersa, dois produtos genéricos são obtidos: micélio macrofúngico e parte extracelular do meio líquido de fermentação. Respectivamente, essas fontes de matéria-prima serão doravante denominadas biomassa e caldo. No caso dos processos no estado sólido, o produto de fermentação consiste de substrato sólido miceliado, devido à dificuldade de separar o micélio do substrato ao fim do processo.

Estes produtos serão convertidos em PRODUTOS SEMI-ELABORADOS, os quais após processamento servirão como INSUMO FARMACÊUTICO (Lei n° 5.991/73 Art. 4o, Item III. Decreto 79.094/77 Art. 3o IVe Lei n° 11.951 de 24 de junho de 2009. Brasil.)

As características das matérias-primas utilizadas na preparação do meio de

cultura são de fundamental importância na qualidade do produto final. Em alguns casos é necessário efetuar ajustes, principalmente em relação às quantidades de substrato presentes, que podem estar em deficiência ou excesso.

Às vezes a matéria-prima não está em conformidade para uso e necessita passar por tratamentos prévios. Vários tipos de adequação podem ser incluídos a critério do operador. Entre as opções, muitas são corriqueiramente utilizadas como ajuste da granulometria, maceração, filtração, homogeneização, resfriamento, aquecimento, esterilização, complementação nutricional, diluição, ajuste de pH, hidrólises ácidas, hidrólises básicas e tratamentos enzimáticos. O sucesso de um bioprocesso depende de fermentações produtivas e da

manutenção somente das espécies de microrganismos inoculadas a cultura. O procedimento de eliminação de contaminantes pode ser feito tanto por filtração ou destruição por calor. Antes da adição do inóculo é essencial esterilizar o meio de cultura e os equipamentos a serem utilizados durante o processo. Para evitar a contaminação pode ser acrescida uma ou mais etapas de esterilização.

Um procedimento clássico de esterilização é o de submeter o meio de cultura e o biorreator ao processo de esterilização em autoclave. Qualquer outro método equivalente, todavia, pode ser aplicado. A passagem direta de vapor através do meio de cultura, pelos equipamentos e pelo vaso de fermentação, por exemplo, é igualmente eficiente. Uma alternativa possível é realizar procedimentos de pasteurização, ou repetindo-se o processo após certo intervalo de tempo, a fim de eliminar esporos latentes não desativados numa primeira vez por tindalização. Para realização de fermentação em estado sólido, uma baixa atividade de água favorece o processo com poucas contaminações bacterianas.

No método descrito de fermentação submersa, o meio foi preparado, inserido em um reator BIOFLO 110 (New Brunswick) e foi então esterilizado em autoclave a 1210C por um período de trinta minutos. Para a fermentação no estado sólido, o substrato foi esterilizado a 1210C por 40 minutos e transferido para o interior do reator esterilizado.

Normalmente adiciona-se o inóculo logo após resfriar o meio de cultura pós- esterilização. O micélio acrescentado é suavemente agitado por vários dias até o final do crescimento. De acordo com a força de agitação, diversos agregados de micélio se formam em vários diâmetros; principalmente em forma globular. Tais agregados se estabelecem em virtude do material polissacarídico formado na superfície do micélio, o qual age como um aderente.

Após o resfriamento dos meios líquidos até a temperatura de 28°C, o pH pode ser ajustado para 6,1 com ácido fosfórico e hidróxido de sódio esterilizados.

O inóculo deve ser previamente preparado em outro recipiente. A finalidade é obter uma quantidade inicial suficiente para dar início à fermentação. A preparação do inóculo deve começar com culturas puras de uma espécie de cogumelo escolhido. Diversas linhagens de macromicetos, incluindo duas da espécie P. martiusii foram isoladas de espécimes coletados de regiões da Mata Atlântica paranaense pelo próprio grupo.

A preparação de tais culturas é conhecida e compreendida por todos aqueles aptos no estado da arte. Na presente invenção, novas culturas foram iniciadas tanto por esporos como por fragmentos de basidiocarpos.Foi experimentalmente determinado que as seguintes espécies são particularmente desejáveis e adaptadas para o processo adiante descrito: Pleurotus djamor, P. calvescens, Lycoperdon marginatum, Perenniporia martiusii, Plectania sp., Ganoderma australe, Ganoderma stipitatum e Oudemansiella canarii. Destas espécies, a mais desejável para a realização desta invenção foi P. martiusii.

A preparação de um inóculo conforme a presente invenção proporciona uma operação em dois estágios. O primeiro é a transferência asséptica de micélio macrofúngico crescido em placas de Petri para um frasco contendo meio de cultura líquido. O segundo é a transferência para um frasco maior com maior volume de meio líquido. Nos dois estágios o material é incubado em temperatura ótima, sob agitação constante. No caso de cultivos no estado sólido, pode ser utilizado inóculo sólido, também conhecido como "semente" ou "spawn", usualmente preparado com grãos de cereais esterilizados e inoculados com culturas puras de macromícetos. O processo de transferência de inóculo pode ocorrer de várias maneiras.

Inóculos produzidos em meios líquidos podem, por exemplo, ser adicionados por pressão positiva. Conecta-se uma linha de ar comprimido a um filtro de ar com capacidade de reter partículas maiores que 0,22 μηη. Esta linha de entrada de ar pressurizado deve estar conectada a um recipiente que contenha o inóculo (figs. 1.4 e 2.4). Então se aplica pressão suficiente para impelir o inóculo por outra tubulação vinculada ao recipiente, como uma cânula ou mangueira. Desta forma o inóculo é encaminhando em condições assépticas até o vaso principal do biorreator, juntando- se ao meio de cultivo esterilizado.

Por medidas de segurança, todos os recipientes devem ser dimensionados para suportar pressão maior que a de trabalho. Além disso, devem suportar a esterilização prévia, levando em consideração o vácuo criado durante resfriamento. Igualmente, linhas, válvulas e conexões devem suportar tais condições. Uma saída de ventilação sempre deve ser considerada.

Em alguns casos o recipiente deve estar adaptado às condições de cultivo, principalmente quando se tratar de grandes volumes de inóculo. Se trabalhar com pequenos volumes, pode ser feita a transferência manual do inóculo para este recipiente, desde que em condições assépticas, como por exemplo, dentro de um fluxo laminar. No processo de fermentação, a cultura pode ser realizada de forma contínua se o meio de cultura é retirado em fluxo contínuo, enquanto meio novo é introduzido ao fermentador na mesma taxa (fig. 1.7). Contudo, processos em batelada são igualmente eficazes, desde que a formulação aquosa preparada seja adequada.

O controle direto do processo pode ser feito com auxílio de sistemas clássicos

de controle de temperatura (figs 1.8), pH (figs. 1.5 e 2.7), aeração (figs. 1.1, 1.2, 1.3, 1.11, 2.1, 2.2, 2.3 e 2.11) e agitação (figs. 1.12 e 2.12). Os controles podem utilizar instrumentação variada, desde que suportem as condições de esterilização e cultivo.

Se possível, a temperatura deve ser monitorada e mantida constante durante todo o experimento utilizando um sistema automatizado de controle. Trocadores de calor convencionais já satisfazem essa exigência.

Outro fator a ser considerado é a aeração. Ela deve suprir as necessidades aeróbias do cultivo de micélio macrofúngico. A aeração é feita por injeção de ar comprimido ou ar enriquecido com oxigênio. A compressão dos gases pode ser feita por um compressor normal, entretanto, obrigatoriamente deve ser esterilizado por filtros apropriados.

Para melhorar a eficiência de transferência de massa de oxigênio para o meio líquido faz-se agitação forçada. Em fermentação submersa a agitação pode ser feita por um eixo mecânico movido por motor ou pela injeção turbulenta dê ar. Para meios sólidos, o usual são tambores rotatórios, com agitação lenta e intermitente, para evitar um excesso de danos ao micélio.

A agitação ideal serve para que o micélio se fragmente e não permita aglomeração e aumento de viscosidade que impossibilite a adequada dissolução de oxigênio. A velocidade de rotação deve ser suficiente para homogeneização e dispersão do ar injetado. Entretanto, não deve proporcionar a perda de capacidade de crescimento. Na agitação mecânica, o micélio pode ser danificado se a velocidade de rotação do eixo for muito elevada. No caso de um agitador do tipo hélice a velocidade deve estar entre 100 e 400 rpm.

Chegando ao fim do processo, a fermentação deve ser descontinuada. Para o rendimento máximo deve-se recolher a cultura no momento em que a glicose se esgote devido à utilização pelo micro-organismo. Este ponto pode ser facilmente verificado pelo pH da cultura que começa a subir devido à autólise do micélio. Um período de tempo suficiente de crescimento, por exemplo, leva cerca de 120 horas. A amostragem da cultura pode ser feita em qualquer momento para verificação de rendimento, o qual é determinado por pesagem após separação do micélio da fase líquida. Da mesma forma pode ser analisada a concentração momentânea de açúcares, proteínas solúveis ou qualquer outro nutriente por metodologias específicas para cada caso. No caso dos meios sólidos, devido à dificuldade de separar o micélio do substrato sólido ao fim do processo, a determinação da biomassa apenas pode ser realizada por metodologias indiretas, como a dosagem de ergosterol (lipídeo produzido pelo fungo) no fermentado.

O produto resultante logo a seguir da fermentação em biorreator não é o mais adequado para ser adicionado diretamente à COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA proposta na presente invenção. O processamento dos fermentados permite a obtenção de produtos mais eficazes e específicos. Se possível, o material deve ter fácil manuseio para ser de possível quantificação e inclusão n§ composição, conforme sugerido.

O micélio é recuperado a partir da cultura por filtração ou, preferencialmente,

por centrifugação e é, portanto, separado. Este micélio úmido é de preferência lavado com solução tamponada em um pH na faixa de 6-7 para remover o meio de cultura. Ele está pronto para ser usado como uma matéria-prima para a obtenção de compostos leishmanicidas. No caso dos fermentados sólidos, o micélf) não pode ser facilmente separado do meio de cultivo, dessa maneira todo o fermentado deve ser utilizado para os processos extrativos.

Tanto micélios recuperados de fermentação submersa, como fermentados sólidos podem ser desidratados (figs. 1.21 e 2.14) para que se mantenha boa condição de conservação e para isso qualquer uma das técnicas usuais de secagem que não ultrapassem 50 graus Celsius podem ser empregadas. Sugere-se a aplicação do processo de liofilização, no qual o material é congelado e então submetido à vácuo para sublimação da água.

O processo inclui ainda a etapa de aproveitamento do caldo de cultivo fermentado, que é igualmente útil como matéria-prima para composição leishmanicida. Da mesma forma o caldo pode ser desidratado para obtenção de produto com menor grau de umidade.

O processo de redução de tamanho e fragmentação, aqui descrito, de preferência envolve o uso de um aparelho capaz de submeter a mistura a uma força de cisalhamento alta (figs. 1.22 e 2.15). Tal processo de redução de tamanho inclui o uso de uma superfície metálica perfurada com furos dispostos em diagonais para afetar o corte e fragmentação do material processado por raspagem.

Em uma modalidade, o aparelho de redução de tamanho pode incluir um misturador de alto cisalhamento. Em outra modalidade, o aparelho pode incluir um homogeneizador, moinho ou liqüidificador. Em geral, o uso de uma superfície metálica perfurada é preferível ao homogeneizador. Em algumas modalidades, o processo de redução de tamanho pode usar dois aparelhos devidamente operados seqüencialmente.

1G Em algumas situações, por exemplo, quando em escala de planta piloto, outro

aparelho pode ser usado. As forças de cisalhamento geradas dentro dos equipamentos de processo devem ser configuradas devidamente para obtenção de redução de tamanho para pelo menos Mesh-80.

Os materiais liofilizados, finamente particulados, de biomassa, caldo ou fermentado sólido, devem ser suspensos em solvente orgânico e mantidos a temperatura ambiente e pressão atmosférica. Sugere-se agitação contínua durante um período de doze horas.

Após extração, o solvente deve ser filtrado para a remoção de sólidos em suspensão. Depois disso deve-se proceder a evaporação do solvente, deixando apenas o resíduo de fundo. Esta etapa pode ser realizada preferencialmente em um evaporador a vácuo do tipo rotativo.

A utilização de solventes orgânicos para extração deve ser feita com material sem a presença de água. Isto permite a extração direta com solvente orgânico sem a presença de emulsões água-solvente. Para melhorar os processos de extração e recuperação, o material pode ser

submetido a processos físicos ou químicos conhecidos, tais como o uso de sonicação, homogeneização de células, enzimas líticas, tensoativos, etc.

A seguir, o extrato obtido pode ser separado através de uma coluna de adsorção. Por exemplo, pode ser utilizada uma coluna de sílica compactada ou coluna Sephadex (LH20) para o fracionamento (figs. 1.23 e 2.16). Alternativamente, o micélio ou fermentado, podem ser usados diretamente na composição.

O material deve ser pesado para determinação da quantidade de aplicação. Posteriormente, os compostos devem ser dissolvidos em solvente apropriado. O uso de dimetilsulfóxido (DMSO) é indicado, desde que a concentração final não chegue a mais de 1%.

As amostras devem ser filtradas assepticamente por membrana 0,22 μιη para esterilização sem interferência de calor (figs. 1.25 e 2.18). Nesta fase o extrato está pronto para ser usado em uma composição farmacêutica. Sugere-se que os produtos finais dos processos descritos anteriormente devem ser armazenados em freezer até o momento de sua utilização.

A determinação de atividades foi realizada por bioensaios in vitro contra parasitos do gênero Leishmania. Nos bioensaios, os produtos resultantes do processo foram diluídos na proporção adequada para se chegar à concentração final estabelecida.

Os exemplos desta invenção servem para comprovar que os produtos resultantes de fermentação em biorreator e etapas posteriores são efetivos na produção de uma composição farmacêutica com atividade leishmanicida. Foram utilizados quatro protocolos distintos, cada um destes com um

fundamento diferente, independente dos demais na quantificação de atividade.

Foram realizados os seguintes tipos de bioensaios:

1. Parasitológico com contagem de parasitos vivos em câmara de Neubauer;

2. Determinação de viabilidade por quantificação da atividade

mitocondrial por ensaio de metabolização do Sal Tetrazolium (MTT);

3. Quantificação de incorporação de Timidina marcada ao DNA por cintilografia;

4. Determinação de atividade antiamastigota por contagem de parasitas viáveis.

Os ensaios realizados com os extratos foram estatisticamente válidos e significativamente diferentes em relação aos controles sem tratamento. Muitas vezes, inclusive, o tratamento com os extratos foi superior à atividade da droga padrão Glucantime. Dentro destas circunstâncias, os resultados obtidos comprovam que os passos do processo proposto são eficazes para produção de uma composição farmacêutica leishmanicida.

Esta invenção também se refere a um método de tratamento de doenças causadas por parasitas, sobretudo no caso de leishmanioses, pela administração de quantidade eficaz da composição farmacêutica da presente invenção. Assim, a COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA pode ser utilizada na prevenção e no tratamento da Ieishmaniose visceral, Ieishmaniose cutânea e Ieishmaniose mucocutânea.

A COMPOSIÇÃO pode ser usada in vivo, associada a algum um aditivo, para tratar pacientes humanos infectados ou suspeitos de estarem infectados com um organismo parasita, ou in vitro para avaliar o efeito sobre um produto biológico.

As infecções parasitárias que também são tratáveis e evitáveis com estas composições farmacêuticas incluem a malária, a tripanossomíase, toxoplasmose, esquistossomose, trematódeos do sangue e da elefantíase. Os pacientes que podem ser tratados com a referida composição

farmacêutica incluem mamíferos, principalmente o ser humano, mas também canídeos, roedores, marsurpiais, xenartros (preguiça e tamanduá), eqüídeos e mulas. Primatas, em geral, também podem adquirir infecções parasitárias, do mesmo modo tratáveis com referida composição. A eliminação do parasita também pode ser feita diretamente com o tratamento

do hospedeiro animal. Isto possibilita eliminar ou prevenir a transmissão para seres humanos a partir de animais selvagens. Como as composições da invenção não são tóxicas em concentrações eficazes podem ser seguramente utilizadas para tratar pacientes humanos.

Ressalta-se que a composição final deve necessariamente incluir uma

quantidade farmaceuticamente eficaz de algum dos produtos de processo propostos. Conforme a espécie de fungo utilizada durante a fermentação, o material final terá características específicas. No caso do uso de Perenniporia martiusii para produção de uma composição leishmanicida, o material final tem aspecto líquido grosso, de cor amarela e odor amadeirado.

De acordo com a presente invenção, o material resultante do processo de produção de caldo e biomassa pode ser utilizado em formulação que aplique excipientes sabidamente empregados na produção de medicamentos como, por exemplo, aerossóis, alcoolatos, alcoolaturas, ampolas, cápsulas, cataplasmas, colutórios, comprimidos, cremes, drágeas, elixires, emulsões, frascos herméticos, géis, linimentos, loções, óvulos, pastas, pastilhas, pensos transdérmicos, pílulas, poções, pomadas, pós, seringas, soluções, supositórios, suspensões, tabletes, tinturas, ungüentos e xaropes; os mesmos válidos na Farmacopéia Brasileira, volumes 1 e 2 / Agência Nacional de Vigilância Sanitária. Brasília: ANVISA, 2010.

Os excipientes empregados nesta invenção também podem ser adsorventes, agentes reguladores de pH, conservantes, corantes, diluentes, dimetilsulfóxido, edulcorantes, éstabilizantes, flavorizantes, solventes, umectantes, mas não limitados a estes. Preferencialmente, os excipientes empregados são aqueles sabidamente adotados para a produção de medicamentos de uso externo e parenteral.

Os excipientes farmaceuticamente aceitáveis podem ainda incluir lipossomas, sendo possível empregar os de forma esférica, unilamelar ou multilamelar, compostos por Iecitina1 fosfatidilcolina, fosfatidilserina, fosfatidiíglicerol ou esfingomielina; aplicados como lipossomas convencionais, lipossomas de longa duração, lipossomas sítio-específico ou lipossomas polimórficos.

Assim, as composições farmacêuticas, de acordo com a invenção, podem ainda compreender de um a três outros agentes antiparasitários como ingrediente ativo ou associado, administrados de modo simultâneo, separado ou seqüencial. Desde que seguras e eficazes, as combinações podem incluir antimoniato de meglumina, estibogluconato de sódio, alopurinol, aminosidine, anfotericina B, benzinidazol, diminazeno, eflornitina, fungicidas azólicos usados como inibidores da biossíntese de esterol, inibidores da adenosilmetionina desçarboxilase, melarsoprol, miltefosina, nifurtimox, pafuramidine, paromomicina, pentamidina, plumbagina, sitemaquine, suramina ou uréia estibamina.

Métodos que envolvam combinações de terapias podem seguir protocolos simultâneos, intermitentes ou determinados empiricamente, desde que resulte em efeitos aditivos, logarítmicos ou sinérgicos. Os efeitos de um tratamento bem sucedido incluem a diminuição e regressão

de lesões, diminuição e desaparecimento dos sintomas de infecçâo, morte ou inativação do parasita, redução da carga parasitária ou parasitemia, ou a eliminação completa do parasita. Preferencialmente, o paciente tem recuperação estimada de um a três meses, se possível com parasitemia indetectável ou pelo menos reduzida

em 50% após o tratamento.

A parasitemia pode ser determinada a partir de amostras biológicas obtidas do paciente com suspeita de ainda estar infectado. Em culturas adequadas, os parasitas que ainda estejam vivos nas amostras podem se desenvolver e multiplicar. Desta forma, o número de parasitas visualizados é diretamente ou indiretamente

contado por microscopia.

Na seqüência, a presente invenção é explicada em pormenor com base nos

exemplos experimentais. Estes exemplos demonstram eficácia dos processos na

produção de uma composição leishmanicida. Além disso, são concebidos apenas

para explicar esta invenção em detalhes. O fato de que essa invenção não se limita

aos exemplos experimentais a seguir serão óbvias para quem tem um conhecimento

comum no campo ao qual pertence esta invenção. O âmbito de aplicação técnica da

presente invenção, no entanto, não será limitado a estes exemplos.

Exemplo 1 - Triagem de macromicetos para a produção de substâncias com atividade leishmanicida pelo método da timidina radiomarcada

A) Quantificação da proliferação celular pelo método da timidina

radiomarcada

A proliferação celular pode ser quantificada com metodologias fundamentadas na utilização de timidina radiomarcada. Isto se baseia no fato de que células em proliferação incorporam nucleotídeos livres, como a timidina, quando estes estão

presentes no meio de cultivo.

Moléculas de timidina, sintetizadas com isótopos radioativos (?H ou 14C), são adicionadas ao meio de cultura. Durante a multiplicação celular, o DNA é replicado. As moléculas de timidina são incorporadas durante este processo.

Após incubação das células em meio contendo timidina radiomarcada, as células são recuperadas com um coletor de células ("cell harvester") e transferidas para papel filtro. Moléculas de timidina não incorporadas são lavadas. O papel filtro contendo as células é transferido para um tubo e imerso em um reagente

denominado solução de cintilação.

A intensidade de emissão radioativa do conteúdo de cada tubo é quantificada com um equipamento denominado cintilador e comparada com a radioatividade emitida pela concentração total de timidina adicionada inicialmente no meio de cultivo.

Muitos grupos de pesquisa aplicam metodologias fundamentadas na timidina radiomarcada para avaliar a bioatividade de substâncias sobre células tumorais, células do sistema imunológico e mesmo sobre parasitas (ROCHE APPLIED SCIENCE. Cell proliferation/viability assay methods. Methodsfor studying cell proliferation and viability in cell populations In: Apoptosis, Cell Death1 and Cell Proliferation Manual. 85-85, 2008). Estas metodologias apresentam uma alta sensibilidade. O principal ponto negativo é a manipulação de substâncias radioativas.

Para avaliar a atividade de extratos do caldo de cultivo submerso de macromicetos contra parasitas do gênero Leishmania, o método da timidina radiomarcada foi adaptado, conforme descrito a seguir.

B) Cultivo micelial submerso e elaboração de extratos Em etapas preliminares do experimento, doze diferentes espécies de

macromicetos, coletadas no estado do Paraná, foram identificadas, isoladas e cultivadas em meio líquido. De cada caldo de cultivo foram elaborados cinco diferentes extratos, que foram testados contra três espécies de protozoários do gênero leishmânia (L enrietti, L. braziliensis e L infantum). A partir deste experimento inicial, foram selecionados doze dos sessenta extratos, para serem avaliados pelo método da timidina radiomarcada.

Para a produção dos doze extratos selecionados, foram cultivadas oito diferentes espécies de macrofungos: Pleurotus djamor, P. calvescens, Lycoperdon marginatum, Perenniporia martiusii, Plectania sp., Ganoderma australè, Ganoderma stipitatum e Oudemansieila canarii. O meio de cultivo utilizado consistiu de: glucose (10g/L), extrato de levedura (4g/L), KH2PO4 (0,06g/L) e MgSO4 (0,06g/L), pH 6.0, autoclavado por 15 minutos. Os cultivos foram realizados em frascos Erlen-Meyer de 500mL, contendo 250mL de meio e inoculados com fragmentos de micélios de culturas puras previamente preparadas em placas de Petri contendo meio BDA. Os frascos foram incubados em agitador orbital ("shaker") a 120 rpm e 30°C por 30 dias.

Após a recuperação do caldo de cultivo, por filtração à vácuo., este foi processado por dois diferentes métodos: concentração e extração com acetona. A concentração foi conduzida em rotoevaporador a 75°C até redução a 50% do volume inicial. A extração seguiu etapas descritas por Falkenberg (FALKENBERG, M. B.; Quinonas. In: Farmacognosia. Da planta ao medicamento. 5a ed., Ed. UFSC/ UFRGS, pp. 657-683, 2003), para a recuperação de quinonas. Após filtração e concentração, conforme o método já descrito, foram adicionados quatro volumes de acetona aos caldos concentrados, que foram então armazenados em congelador (- 2°C) por 24 horas, para precipitação de impurezas, posteriormente eliminadas por centrifugação a 5000rpm por 10 minutos. Após a extração, a acetona foi totalmente evaporada em câmara de exaustão, com o auxílio de uma chapa de aquecimento elétrica.

O pH dos extratos foi ajustado para 7.0+0.5 com HCI e NaOH. Após o ajuste

de pH, cada extrato foi filtrado em membrana com poros de 0,22pm para esterilização. Esta filtração foi conduzida em câmara de fluxo laminar. Os extratos foram armazenados em freezer (-2°C) até a sua utilização.

C) Avaliação da atividade Ieishmanicida de extratos obtidos a partir do caldo de fermentação submersa do micélio de macromicetos, pelo método da

timidina radiomarcada

Protozoários da espécie Leishmania infantum foram cultivados em garrafas de Roux, em meio LIT modificado, a 23°C. Amostras foram tiradas periodicamente, para monitorar a concentração e a atividade dos parasitas. A contagem dos parasitas foi realizada em câmara de Thoma.

Quando a concentração de parasitas atingiu a faixa de 106~107 (parasitas/mL), as culturas foram diluídas com o respectivo meio de cultura até a faixa de 105-IO6 (parasitas/mL). As culturas adequadamente diluídas foram distribuídas em microplacas de 96 poços, 100μΙ_ por poço. Então, 100pL de cada extrato a ser testado foi adicionado a cada poço da placa (em triplicata). Controles positivo, negativo e um branco também foram adicionados.

O controle positivo consistiu de 100pL Glucantime (300mg/mL) ao invés do extrato de macromiceto. O controle negativo consistiu de 100pL do meio de cultura respectivo, ao invés do extrato. O branco consistiu de 200μί de meio de cultivo apenas, sem parasitas e sem a adição de extratos de macromicetos.

Cada poço recebeu 20pL de timidina radiomarcada, numa concentração de 0,1 μC/', diluída no meio de cultivo dos parasitas. Foi utilizada timidina marcada com carbono 14 (14C). 20pL de cada solução radiomarcada foram armazenados como um controle de leitura.

As placas foram incubadas por 40h a 23°C. Após a incubação, os

protozoários foram recuperados de cada poço e transferidos para uma membrana filtrante, com o auxílio de um coletor de células ("cell harvester"). Os pedaços de papel filtro, contendo os parasitos foram transferidos para tubos, contendo 3mL de solução de cintilação. A intensidade de emissão radioativa de cada amostra foi determinada em um leitor de cintilação (cintilador). Os resultados foram comparados por ANOVA de uma via e diferenças entre as amostras e os controles foram determinadas através do pós-teste de Multi Comparação de Dunnett para níveis de significância de 1 e 5%. As análises estatísticas foram realizadas com o software GraphPad Prism 3.0.

Os resultados deste experimento estão expressos nas Figuras 3 e 4. O extrato concentrado de P. martiusii exibiu mais atividade que o controle positivo para um nível de significância de % (P<0,01). O extrato concentrado de Plectania sp. também foi mais ativo que o controle positivo, para um nível de significância de 5%.Os extratos concentrados de P. calvescens e G. stipitatum foram estatisticamente tão ativos quanto Glucantime 300mg/mL para um nível de significância de 5%. Nenhum dos extratos de acetona apresentou diferença estatística em relação ao controle positivo para P<0,05. O valor médio de CPM para sete dos extratos testados foi menor que aquela do controle positivo. Os resultados mais expressivos de inibição foram observados para os extratos concentrados obtidos a partir do cultivo micelial submerso de P. martiusii e Piectania sp. Estes extratos foram 47% e 33%, respectivamente, mais ativos que o medicamento Glucantime® 300mg/mL.

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EXEMPLO 2 - Processo de produção de composição farmacêutica Ieishmanicida envolvendo Fermentação Submersa em Biorreator

O fungo Perenniporia martiusii, pertencente à família Polyporaceae, foi escolhido e utilizado nas experimentações a seguir. De acordo com o exemplo 1, o extrato deste macromiceto apresentou a melhor atividade leishmanicida, dentre as espécies avaliadas.

A) Manutenção e cultivo de Perenniporia martiusii

Os micélios são mantidos por repique periódico (subcultura) em ágar batata dextrosado (BDA) e refrigeração a 4°C. Em paralelo, estão sendo mantidos a -80°C, seguindo o protocolo descrito por Homolka, Lisa & Nerud (HOMOLKA, L.; LISÁ, L.; NERUD, F. Basidiomycete cultures on perlite survive successfuliy repeated freezing and thawing in cryovials without subculturing. Journal of Microbiological Methods 69: 529-532, 2007). Esta espécie apresenta fácil cultivo e crescimento relativamente rápido (entre 0,3 e 0,7cm/s de crescimento radial, a 27°C em BDA). Os micélios foram cultivados em uma ampla faixa de temperatura (15~35°C, com ponto ótimo em tomo de 27°C) e uma grande diversidade de substratos orgânicos. Apresentaram coloração inicial branca e após consolidação do crescimento, em placas de Petri, se expostos a certo grau de luminosidade, formam regiões de coloração preta. Pode ocorrer a formação de pequenos basidiomas na superfície da placa após consolidação do crescimento micelial. Quando cultivados em meio líquido, sob agitação, os micélios formam pellets de diâmetro variável. Se cultivados sem agitação, formam uma camada na superfície do meio, e pequenos basidiomas podem se formar sobre esta camada.

Este fungo também pode ser cultivado em substratos à base de grãos, como milho e trigo ou à base de cepilho de madeiras como eucalipto ou pinus, suplementado com farelo de trigo e CaCC>3. Resíduos agroindustriais como palhas e bagaços, adequadamente suplementados, também se mostraram eficientes para serem utilizados como substrato para o cultivo desta espécie. Após o completo crescimento micelial, em meios sólidos, pequenas frutificações puderam ser induzidas, expondo o substrato miceliado à iluminação circadiana suave e um pouco de ventilação (diminuição da concentração de CO2).

B) Cultivo de micélio para preparo de inóculo Culturas estoque foram mantidas e subculturas foram realizadas normalmente

a cada quatorze dias.

O inóculo de micélio foi preparado pela transferência de culturas frescas que apresentassem crescimento uniforme. Foram recolhidos discos de Icm2 de Agar com micélio crescido com o auxílio de um tubo de metal esterilizado. O material foi então transferido para frascos contendo meio líquido.

Na primeira etapa da preparação do inóculo, as culturas puras foram cultivadas em meio líquido relatado por Fan Leifa (FAN, L. Production of extra- cellular polyssacharide from Agaricus blazei by submerged and solid state fermentation and its antitumor effect. Tese de Doutorado, Programa de Pós Graduação em Processos Tecnológicos, Universidade Federal do Paraná, 30-50p, 2002), constituído por glicose, 20 g/L; extrato de levedura, 3 g/L; extrato de malte, 1 g/L; fosfato dibásico de sódio, 0,1 g/L; sulfato de magnésio 0,1 g/L e cloreto de cálcio 0,02g/L. A solução do meio de cultura teve pH ajustado entre 4,5 e 8,0. A efetiva distribuição e homogeneização do micélio foi mantida a fim de permitir que o inóculo crescesse distribuído.

O cultivo foi feito sob agitação em frascos Erlenmeyer (250mL - 500mL), incubados em agitador rotativo a uma velocidade de 120 rpm.

Com agitação menor, o micélio tende a obstruir ou crescer formando agregados. Após cinco dias de agitação à temperatura 30°C, a cultura foi suficientemente desenvolvida para transferência para a fase seguinte de preparação de inóculo. Na segunda etapa, uma unidade maior, com mais volume de meio de cultura foi utilizada. Procedeu-se então a transferência do inóculo preparado para o biorreator.

C) Cultivo de micélio de fungo em biorreator

No processo de fermentação submersa, um vaso de biorreator cilíndrico pressurizável com capacidade de 14 litros foi carregado com 10 litros de meio de cultura líquido. Um meio foi preparado como se segue: 200g de glicose, 30g de extrato de levedura e 10g de extrato de malte dissolvidos em dez litros de água deionizada e suplementados com 1,2g de fosfato dibásico de sódio, 1,2g de sulfato de magnésio, 0,2g de cloreto de cálcio. O material foi homogeneamente misturado até obtenção de concentrações adequadas. O reator com o meio de cultivo foi esterilizado por vapor úmido a 1210C por 30

minutos. Em seguida foi resfriado e teve o pH inicial ajustado em 6,1 com H3PO4 ou NaOH esterilizados. O ar pressurizado foi introduzido no fermentador pelo fundo a uma taxa de um volume de ar por minuto por litro de cultura. A agitação foi mantida em 250 rpm com eixo de agitação do tipo hélice. Um inóculo de 30 gramas (calculado em base seca) de micélio fúngico foi

transferido por pressão positiva para o biorreator de bancada para fermentação submersa. O cultivo prosseguiu por um período de 120 horas a 28°C. A amostragem foi realizada a cada 12 horas.

O resultado da cinética fermentação, representada pelo consumo de glicose, formação de biomassa e proteína solúvel, além das variações de oxigênio dissolvido (d02) e pH estão representados na Figura 5. 10

O rendimento da reação (Yx/s) de biomassa (X) a partir de substrato (S) foi de 0,43 gramas de biomassa por grama de glicose, com consumo de 94% da glicose para o crescimento e manutenção.

A fermentação submersa foi escolhida neste exemplo porque converteu todo o açúcar disponível para a biomassa e produto em apenas 48h, um período de tempo relativamente curto. Em cultura líquida o fungo apresentou formação distribuída de micélio, sem afetar as características de fluxo quando sob agitação contínua. Em alguns lugares, houve ocorrência de depósito, principalmente em regiões não agitadas.

EXEMPLO 3 - Processo de produção de composição farmacêutica leishmanicida envolvendo Fermentação no Estado Sólido

Outra via para a produção de compostos macrofúngicos com atividade leishmanicida é a fermentação no estado sólido. Assim como no exemplo 2, o fungo Perenniporia martiusii foi escolhido, pois de acordo com o exemplo 1, o extrato deste macromiceto apresentou a melhor atividade leishmanicida dentre as espécies de macromicetos avaliadas.

A) Manutenção do fungo

Culturas estoque foram mantidas em meio sólido de Batata Dextrose Agar (BDA), contidas em tubos de ensaio (inclinados) ou em placas de Petri. Subculturas foram realizadas pela transferência de pedaços de micélio depois que este mudasse de cor branca para marrom-acinzentada, normalmente a cada quatorze dias. Uma segunda fonte estoque foi mantida por meio da inoculação em substrato constituído de grão de milho e carbonato de cálcio (0,2%). A cepa foi incubada a 28°C e após crescimento foi preservada e estocada a 4°C por período de até três meses.

B) Cultivo de micélio de fungo em meio líquido para preparo de inócuío

O inóculo de micélio foi preparado pela transferência de culturas frescas que apresentassem crescimento uniforme. Recolhiam-se discos de 1cm2 de Agar com micélio crescido por sete dias com o auxílio de um tubo de metal esterilizado. Neste experimento o meio líquido utilizado foi o relatado por Fan Leifa (FAN, L. Production of extra-cellular polyssacharide from Agaricus blazei by submerged and solid state fermentation and its antitumor effect. Tese de Doutorado, Programa de Pós Graduação em Processos Tecnológicos, Universidade Federal do Paraná, 30-50p, 2002), constituído por Glicose, Extrato de Levedura, Extrato de malte, Fosfato de sódio dibásico, Sulfato de Magnésio e Cloreto de cálcio. O cultivo foi feito sob agitação em meio líquido em frascos Erlerimeyer (250mL - 500mL), incubados em shaker (120rpm, 28°C) por 5 dias.

C) Preparo de inóculo sólido

Também denominado popularmente como "semente" ou "spawn", o inóculo para fermentação sólida foi preparado, no presente exemplo, utilizando grãos de milho como substrato principal. Os grãos foram cozidos, sua umidade foi ajustada para próximo de 70% e 1% de carbonato de cálcio (em relação à massa seca de grãos) foi adicionado. A mistura foi acondicionada em sacos de polipropileno com filtros adaptados. O substrato empacotado foi autoclavado a 121°C por 40 minutos. Após resfriar à temperatura ambiente, os pacotes foram inoculados com culturas de micélio em meio líquido, preparadas conforme descrito no item anterior. Os pacotes inoculados foram incubados a 25°C por 30 dias até a completa miceliação. D) Fermentação no estado sólido em sacos de polipropileno

O substrato de produção escolhido para o presente exemplo consistiu de cepilho de eucalipto, suplementado com 20% de farelo de trigo e 1% de carbonato de cálcio. Foi adicionada água, ajustando a umidade para aproximadamente 70% e a mistura foi acondicionada em sacos de polipropileno com filtros adaptados. O substrato empacotado foi autoclavado a 1210C por 40 minutos. Após resfriar à temperatura ambiente, os pacotes receberam inóculo sólido ("semente", "spawn") em uma taxa de inoculação de aproximadamente 10%. Os pacotes inoculados foram incubados a 25°C por 30 dias, até a completa miceliação do substrato.

E) Fermentação no estado sólido em biorreator O processo descrito neste item está ilustrado na figura 2. Conforme o item

anterior, o substrato de produção escolhido consistiu de cepilho de eucalipto, suplementado com 20% de farelo de trigo e 1% de CaCO3. Foi adicionada água, ajustando a umidade para aproximadamente 70% e a mistura foi acondicionada em um biorreator do tipo tambor rotatório. O substrato foi autoclavado in situ, a 121°C por 40 minutos. Após resfriar à temperatura ambiente, o reator recebeu inóculo líquido, em condições assépticas, transferido por pressão positiva em uma taxa de inoculação de aproximadamente 10%. O reator operou a 25°C por 30 dias, com rotação intermitente (1 minuto de rotação 5rpm a cada meia hora) e umidade controlada em aproximadamente 70%, até a completa miceliação do substrato.

EXEMPLO 4 - Preparação de uma composição farmacêutica Ieishmanicida

Este é um exemplo que trata da elaboração de uma COMPOSIÇÃO

FARMACÊUTICA a partir de produtos resultantes de fermentação em biorreator.

Ao término da fermentação submersa, o material foi submetido a filtraçáo em papel Wathman 1, resultando em biomassa e caldo de fermentação.

Em seguida o volume de caldo foi centrifugado para remoção completa de biomassa. Em média, o rendimento de material a cada 10 litros de meio de cultura foi de 109 gramas de micélio (base seca) e 20 gramas de caldo liofilizado.

A biomassa foi congelada e Iiofilizada a -40°C durante um período de três dias. O caldo de fermentação foi concentrado por evaporação a vácuo em baixa temperatura (35°C), removendo-se 37,5% de teor de líquido. Depois disso foi congelado com espessura de 8mm em bandejas e liofilizado a menos 40°C por seis dias. O material, já seco, foi ralado manualmente, atingindo granulometria menor que Mesh 80.

Extrações com os seguintes solventes orgânicos foram realizadas: acetona, diclorometano e clorofórmio. A quantificação dos compostos foi feita usando uma balança analítica, podendo-se quantificar os rendimentos.

Os resultados de rendimentos e fluxograma dos processos para preparação de uma composição farmacêutica estão apresentados na Figura 6. O material foi processado individualmente até que fossem feitos bioensaios in vitro contra formas promastigotas e amastigostas de espécies de Leishmania. Uma das principais amostras ativas correspondeu à extração do caldo

liofilizado com diclorometano (Sdcm)- Para fracionamento, 256mg deste extrato foram aplicados ao topo de uma coluna de cromatografia (45x5 cm). Esta estava devidamente preenchida com sílica gel (Vetec, Mesh 60-240).

A fase móvel aplicada foi de polaridade crescente de solventes. O fracionamento ocorreu pelo princípio de adsorção, resultando em 225 frações. A taxa de eluição da coluna foi de 1 mL por minuto, utilizando-se os seguintes solventes: éter de petróleo, acetato de etila, etanol e água destilada. Antes da aplicação da amostra, a sílica foi ativada em mufla a 550°C por 24 horas. Para obtenção de uma composição Ieishmanicida três etapas foram realizadas. A primeira consistiu em evaporar o solvente da fase móvel, restando apenas os compostos separados. A segunda etapa consistiu no reagrupamento das frações em amostras semelhantes (A; B; C; D; E; F). Isto foi realizado de acordo com os deslocamentos analisados por cromatografia em camada delgada. Os seguintes valores de Rfforam obtidos: A - 0,6 a 0,7; B - 0,5 a 0,6; C - 0,2 a 0,4; D - 0,8; E - 0,1 a 0,2; F - 0 a 0,1.

As 225 frações foram reunidas em seis grupos, os quais foram testados para composição farmacêutica da presente invenção. A terceira etapa consistiu na solubilização dos grupos em solução fisiológica, ajuste de pH para 7.2+0.5 e esterilização individual por filtração em membrana 0,22μηι. Esta filtração foi conduzida em condições assépticas.

O material resultante dos processos é a composição , farmacêutica leishmanicida, a qual foi armazenada em freezer até a sua utilização.

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EXEMPLO 5 - Bioensaios aplicando a composição leishmanicida contra

L.braziliensis, L.infantum e L.amazonensis

Este exemplo se refere a confrontos experimentais contra L. (V.) braziliensis (MHOM/BR/00/LTB300), Leishmania (L.) infantum (MHOM/FR/71/LRM75) e Leishmania (L) amazonensis (MHOM/BR/73/M2269). Foram realizados dois métodos independentes para avaliação de atividade: o Parasitológico e o de Viabilidade por MTT. As espécies utilizadas são os principais agentes etiológicos das principais manifestações clínicas de leishmaniose, incluindo Ieishmaniose cutânea difusa, visceral e mucocutânea. A) Método Parasitológico

O método parasitológico é a técnica mais bem adotada para o cultivo de parasitas do gênero Leishmania em estágio promastigota. O procedimento se realiza in vitro em meios de cultura bifásicos, compostos por uma fase sólida com nutrientes e outra líquida para crescimento. O encontro entre amostra e parasita ocorreu na fase líquida de meios de

cultura Nicole Nevy McNeaI (Nicolle, C. Culture du parasite du bouton dOrient. Comptes Rendus de 1'Académie des Sciences 146:842-843, 1908), que são compostos por Agar (16 g/L); Cloreto de Sódio (9 g/L); e sangue de coelho (10%). Para padronização dos experimentos foram utilizados promastigotas da fase final de crescimento exponencial, em concentração inicial ajustada para 2x106 Leishmania por ml_, incubados a 23°C por 72 horas de confronto.

O volume total de reação na fase líquida foi de 500 pL, consistindo em alíquotas de 100 pL de solução de Leishmania, 100 pL de amostra e 300 pL de solução de cloreto de sódio 0,9% estéril. A solubilização das amostras foi feita em DMSO 5% em solução de cloreto de sódio 0,9%.

Para as amostras, as concentrações foram especificadas conforme cada caso. A alíquota de amostra foi substituída por solução fisiológica DMSO 5% nos controles negativos (não tratados) ou por antimoniato de meglumina em DMSO 5% (GIucantime) nos controles positivos.

A concentração final de Glucantime foi de 2000 pg/mL, correspondente a 540pg/mL de antimônio ativo, padrão de referência no tratamento de leishmanioses.

A concentração final de teste foi de 1000 pg/mL no caso dos seguintes extratos primários de material de Perenniporia martiusii produzido em biorreator:

Xdcm - extrato diclorometano a partir de biomassa;

Xsup - extrato aquoso a partir de biomassa;

Xinf - extrato clorofórmico a partir de biomassa;

Xac - extrato acetona a partir de biomassa; Sdcm - extrato diclorometano a partir de caldo de fermentação;

Sac - extrato acetona a partir de caldo de fermentação.

No caso da fração D, obtida a partir do fracionamento de extrato diclorometano a partir de caldo de fermentação (Sdcm), as concentrações variaram entre 125 pg/mL a 2000 pg/mL. Ao final do confronto, o número de promastigotas por mL foi contado com a

ajuda de uma câmara de Neubauer (BOECO - Alemanha, com duas câmaras) e lamínula ultra plana. Todas as amostras foram homogeneizadas antes da leitura. Quando havia aglomeração (formação de rosetas) foi utilizada uma seringa BD com agulha fina para a separação dos parasitas. Para contar o número total de parasitas vivos, primeiro foram realizadas

diluições (1:2, 1:4 ou 1:8) em solução estéril (tampão fosfato, formaldeído 2%, azul de Evans 0,1%, pH 7,2). Esta solubilização foi feita a fim de reforçar o contraste, facilitando a quantificação do número total. Em cada repetição de amostra foi realizada a contagem direta do número de promastigotas em microscópio ótico com auxílio de um contador estatístico, observando-se pelo menos 50 campos. Para o cálculo de promastigotas / mL foram considerados o fator diluição em cada caso e o volume da câmara de contagem fornecido pelo fabricante.

B) Método MTT

A metodologia do MTT foi empregada com o intuito de verificar quantitativamente a viabilidade do parasita após diferentes tratamentos.

O fundamento analítico utilizado neste exemplo foi a quantificação de atividade metabólica de parasitas viáveis por ensaio colorimétrico. Aplicou-se o método in vitro com sal tetrazólio MTT (3-(4,5-dimetil-2-il)-2,5-brometo difeniltetrazolium) (Mosmann, T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays. Journal of immunological methods 65 (1-2): 55-63, 1983). Este método tem sido utilizado com sucesso para determinação de atividade

Ieishmanicida de vários fármacos em diversas referências (KIDERLEN, A.F.; KAYE, P.M. A modified colorimetric assay of macrophage activation for intracellular cyto- toxicity against Leishmania parasites. J Immunol Methods 127: 11-17, 1978); (DUTTA A., BANDYOPADHYAY S., MANDAL C., CHATTERJEE M. Elevelopment of a modified MTT assay for screening antimonial resistant field isolates of Indian visceral leishmaniasis. Parasitology International 54: 119-122, 2005); (PALIT P. AND NAHID ALI. Oral therapy with sertraline, a selective serotonin reuptake inhibitor, shows activity against Leishmania donovani. Journal of Antimicrobial Chemotherapy 61: 1120-1124, 2008). Exclusivamente determina-se a atividade de células viáveis, pois sais de tetrazólio são quimicamente reduzidos a sal insolúvel de formazan apenas por células metabolicamente ativas.

As espécies de Leishmania foram pré-cultivadas a 23°C até o final da fase logarítmica em garrafas contendo meio RPMI 1640 (Sigma) suplementado com 10% Soro Fetal Bovino (Gibco), com pH ajustado para 7,2. O crescimento foi quantificado em câmara de contagem. O material foi centrifugado, o meio de cultura antigo foi descartado e os parasitas sedimentados foram ressuspendidos em meio de cultura novo até concentração desejada. A preparação e esterilização das amostras foi realizada de acordo com o Exemplo 3. Ao final da distribuição aleatória de alíquotas nos ensaios, a concentração inicial de Leishmania foi de 2x106 por mL. A concentração de amostra foi de 1000 pg/mL para extratos primários, ou outra diversa quando especificado.

O confronto entre parasita e fármaco teve volume total de ensaio de 1000 pL, sendo 100 pL correspondentes a alíquota de amostra e 900 pL a meio de cultivo com Leishmania.

O ensaio foi finalizado após 72 horas de incubação a 23°C. Descartou-se o sobrenadante após centrifugação e adicionou-se reagente MTT (5mg/mL) em solução tamponada com fosfato (pH7,2). Os parasitas foram ressuspendidos para metabolização do MTT1 que ocorreu durante um período estabelecido de 4 horas.

A reação ocorre a partir do sal tetrazólio MTT que é amarelo e solúvel em solução aquosa. O produto metabolizado, um sal formazan, é insolúvel em solução aquosa. Este foi separado e solubilizado em dimetilsulfóxido (DMSO), apresentando cor roxa. A quantidade de formazan foi avaliada pela leitura de absorbância em um

leitor de microplacas (BioRad, 570nm).

A intensidade de cor resultante é diretamente proporcional à atividade

metabólica de parasitas viáveis.

Os resultados dos bioensaios pelo método Parasitológico e pelo método do MTT estão apresentados nas Figuras 7 e 8, respectivamente, para I. braziliensis e L. infantum; as espécies com maior inibição pelas composições obtidas. Nos gráficos estão expressos os resultados de contagem (eixo y esquerda) e de absorbância após formação de sal formazan (eixo y direita). Os resultados que foram estatisticamente validados, diferentes do controle negativo (não tratado) receberam um asterisco, representando um nível de significância de 5% por

comparação de multivariada.

A Figura 9 representa o cálculo das inibições (diferença em relação ao total

sem tratamento) para os três tipos de Leishmania testados.

Os ensaios tratados tiveram quantidade final de parasitas menor que os controles não tratados. O índice calculado de inibição em relação ao controle não tratado demonstrou a maior inibição de 50% para a fração D, obtida a partir da preparação do extrato de caldo de fermentação de Perenniporia martiusii extraído

com diclorometano. Demonstra-se uma redução da concentração-dependerite de tratamento com extratos de caldo e biomassa. Os dados apresentados em pontos ou intervalos são as médias e o desvio padrão de triplicatas a partir de dois experimentos independentes.

EXEMPLO 6 - Bioensaios aplicando a composição Ieishmanicida contra formas amastiqotas de L.braziliensis

Este experimento teve por objetivo verificar a quantidade total de amastigotas viáveis internalizados em macrófagos.

Células residentes peritoneais foram coletadas de camundongos BALB / c e semeadas em fundo de placas de 24 poços para cultura de tecidos (TFP). As células não-aderentes foram removidas após 2 horas a 37°C em incubadora de CO2 (5%) e macrófagos aderentes que se fixaram foram incubadas durante doze horas em meio RPMI 1640 suplementados com 10% SFB (Gibco) (v/v), nas mesmas condições, como descrito acima (NOLETO, G.R.; MERCÊ, A.L.R.; IACOMINI, M.; GORIN, ρAJ.; THOMAZ-SOCCOL, V.; OLIVEIRA, M.B.M. Effects of a Iichen galactomannan and its vanadyl(IV) complex on peritoneal macrophages and Ieishmanicidal activity. Molecular and Cellular Biochemistry 233: 73-83, 2002); (MARCOLINO, M.M.K. Avaliação de Atividade Ieishmanicida in vitro de heteropolissacarídeos ácidos: não sulfatados e naturalmente sulfatados. Dissertação Mestrado em Bioquímica e Biologia Molecular-Universidade Federal do Paraná 2010).

Promastigotas do cultivo in vitro foram retirados e lavados em PBS1 então adicionados aos macrófagos aderidos em razão parasita:células de 5: 1. Após 12 horas a 34 0 C em 5% de C02, os parasitas livres foram removidos por lavagens repetidas. Novo meio de cultura foi adicionado e as culturas foram incubadas com tratamento das composições farmacêuticas na concentração de 1000 pg / mL em condições tal como descritas anteriormente por um período adicional de 72h.

O meio de cultura foi descartado e acrescentou-se 400pL de solução fisiológica. Em seguida os macrófagos aderentes foram raspados da superfície usando uma haste metálica esterilizada com ponta não-afiada. A raspagem foi realizada de forma padronizada, obedecendo duas vezes o seguinte ciclo: dez vezes da esquerda para a direita, dez vezes de cima para baixo, dez vezes sudoeste- nordeste, dez vezes noroeste-sudeste e mais duas vezes raspagem circular. Para a quantificação de sobrevivência de amastigotas dentro de macrófagos, o material raspado em solução salina foi colocado em contato com meio Tobbie Evans, que é um dos melhores meios padronizados para fins de diagnóstico e transformação de volta da fase amastigotas em promastigotas.

A distribuição homogênea da aderência e da quantidade de macrófagos

peritoneais de camundongos e sua infecção com amastigotas internalizados foram evidenciados por microscopia. A eficiência do método de raspagem também ocorreu como esperado. O experimento foi conduzido sob condições ótima de cultivo para os macrófagos.

O meio foi retirado e lavado duas vezes com PBS pH 7,2 e, portanto, todos os

nutrientes extra que poderiam permitir que as diferenças nos resultados de crescimento foram lavadas, deixando apenas o padrão bifásico em meios Tobbie Evans com solução salina.

Após a raspagem e a colheita dos macrófagos, a transformação de Leishmania de volta para as formas promastigotas demorou cerca de sete dias de incubação no meio Tobbie Evans, a 24°C. O número total de promastigotas foi contado em Câmara de Neubauer.

As diferenças foram observadas em cada repetição, em quantidade total final, demonstrando atividade de Glucantime em 2000 pg / mL, extrato diclorometano a partir de caldo de fermentação (Sdcm) e a extrato clorofórmico a partir de biomassa (Xinf) em 1000 pg/mL.

Claims (82)

1. COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS COM AÇÃO LEISHMANICIDA E PROCESSOS PARA PRODUÇÃO DOS MESMOS, caracterizadas pelo fato de compreender uma etapa de fermentação em biorreator, com cultivo de diferentes espécies de fungos, preferencialmente basidiomicetos, mais preferencialmente do gênero Perenniporia.

2.PROCESSOS, de acordo com reivindicação 01, caracterizados por compreender pelo menos três etapas seqüenciais dentre: esterilização de meio de cultura, esterilização de equipamentos, preparo e homogeneização de inóculo, maceração do inóculo, transferência asséptica do inóculo, fermentação submersa em biorreator, fermentação em estado sólido em biorreator, filtração, centrifugação, concentração, concentração a vácuo, congelamento, secagem por liofilização, secagem por ventilação, secagem em estufa, trituração do material seco, extração com solvente orgânico, evaporação de solvente orgânico, fracionamento por cromatografia, solubilização em solução fisiológica ou tamponada e esterilização por membrana.

3.PROCESSOS, de acordo com quaisquer das reivindicações 01 e 02, caracterizados pelo meio de cultura ter os substratos solubilizsfdos em fase líquida, consistindo em um meio de fermentação submersa com fontes de carbono, nitrogênio e sais inorgânicos.

4.PROCESSOS, de acordo com a reivindicação 03, em que o meio de cultivo seja caracterizado por conter uma fonte de carbono, compreendendo, glucose, sacarose, amido , incluindo quaisquer combinações dos mesmos, numa faixa de concentrações de 5 a 90 gramas por litro de meio líquido (g/L), preferencialmente numa faixa entre 8 e 30 g/L.

5.PROCESSOS, de acordo com a reivindicação 03, em que o meio de cultivo seja caracterizado por compreender uma fonte de nitrogênio, incluindo, mas não se limitando a extrato de levedura, extrato de malte e peptona, compreendendo quaisquer combinações dos mesmos, numa concentração entre 0,5 e 15 g/L, preferencialmente entre 2 e 6 g/L, mais preferencialmente -3 g/L.

6. PROCESSOS, de acordo com a reivindicação 03, em que o meio de cultivo seja caracterizado por utilizar fontes inorgânicas de magnésio e enxofre, compreendendo sulfato de magnésio (MgSO4) em uma concentração entre 0,01 e 0,6 g/L, preferencialmente entre 0,02 e 0,12 g/L, mais especificamente 0,06g/L.

7. PROCESSOS, de acordo com a reivindicação 03, em que o meio de cultivo seja caracterizado por utilizar uma fonte de potássio e fósforo, compreendendo fosfato de potássio monobásico (KH2PO4) em uma concentração entre 0,01 e 0,6 g/L, preferencialmente entre 0,02 e 0,12 g/L, mais preferencialmente 0,06 g/L.

8. PROCESSOS, de acordo com a reivindicação 03, em que o meio de cultivo seja caracterizado por utilizar uma fonte de cálcio, compreendendo cloreto de cálcio (CaCb) em uma concentração entre 0,001 e 0,2 g/L, preferencialmente entre 0,01 e 0,03 g/L, mais preferencialmente 0,02 g/L.

9. PROCESSOS, de acordo com a reivindicação 03, em que o meio de cultivo seja caracterizado por compreender entre 0,01 a 0,5% de um supressor de espuma, incluindo compostos a base de silicone inertes.

10. PROCESSOS, de acordo com quaisquer das reivindicações 01 e 02, caracterizados pelo meio de cultura para o crescimento micelial ser sólido, consistir em um meio de fermentação compreendendo fontes de carbono, nitrogênio e sais inorgânicos.

11. PROCESSOS, de acordo com a reivindicação 10, em que o meio de cultivo seja caracterizado por conter subprodutos e resíduos agroindustriais em sua formulação, podendo compreender, mas não se limitando a: farelos, cascas, bagaços, água de cozimento de cereais e tubérculos, palhas, cepilhos, serragens, melaço, borra de café, soro de leite, incluindo quaisquer combinações dos mesmos.

12. PROCESSOS, de acordo com a reivindicação 10, em que o meio de cultivo seja caracterizado por compreender grãos de cereais, incluindo grãos inteiros, triturados e combinações dos mesmos, em sua formulação, incluindo trigo, milho, soja, arroz, sorgo, incluindo quaisquer combinações dos mesmos.

13. PROCESSOS, de acordo com a reivindicação 10, em que os meios de cultivo sejam caracterizados por compreender suplementos em sua formulação, incluindo CaC03 em uma concentração entre 0,5 e 2% relação mássica (m/m),e CaS04 em uma concentração entre 0,5 e 2% (m/m).

14. PROCESSOS, de acordo com quaisquer das reivindicações 01 e 02, caracterizados pelo tempo de cultivo estar entre 2 a 240h, prefencialmente entre 80 e 160 horas.

15. PROCESSOS, de acordo com quaisquer das reivindicações 01 e 02, caracterizados pela pasteurização dos meios de cultivo, através da elevação de temperatura entre 70°C e 300°C, por um período de 10 a 600 segundos, preferencialmente entre 100 e 200°C por 20 a 100 segundos.

16. PROCESSOS, de acordo com quaisquer das reivindicações 01 e 02,, caracterizados pela esterilização dos meios de cultivo,, recipientes, biorreatores e aparatos auxiliares através de vapor úmido e entre 90°C e 150°C, por um período de 10 a 50 minutos, mais especificamente 121°C por minutos.

17. PROCESSOS, de acordo com quaisquer das reivindicações 01 e 02,, caracterizados pelo acondicionamento dos meios de cultivo em recipientes resistentes ao processos de esterilização, como descrito na reivindicação 16.

18. PROCESSOS, de acordo com a reivindicação 17, em que os recipientes resistentes compreendem, mas não se limitam a: recipientes de vidro, recipientes de plásticos, recipientes de metal, biorreatores de bancada, biorreatores piloto, biorreatores industriais, reatores de aço inox, tanques, piscinas, sacos de polipropileno, bandejas, bandejas metálicas, tambores metálicos.

19. PROCESSOS, de acordo com a reivindicação 18, caracterizados pelo fato de os recipientes apresentarem um sistema difusor de ar acoplado para circulação forçada, o qual deve ser capaz de borbulhar, umidificar, filtrar, aquecer e resfriar o ar que por ele passe, além de controlar a taxa de passagem de ar entre 0,1 a 10 litros de ar por litro de meio de cultivo a cada minuto (v.v.m).

20. PROCESSOS, de acordo com a reivindicação 03, caracterizado pelo fato de o cultivo submerso ser conduzido em biorreator cilíndrico com eixo de agitação, preferencialmente do tipo hélice.

21. PROCESSOS, de acordo com reivindicação 20, caracterizados pelo fato de não ser afetado pela capacidade de volume do biorreator.

22. PROCESSOS, de acordo com reivindicação 03, caracterizados por compreender três etapas consecutivas de crescimento em recipientes em separado por período de pelo menos 24 horas; sendo que as etapas envolvem volume cada vez maior de meio de cultivo, de tal modo que primeira etapa envolva volumes entre um e dez litros; a segunda entre 10 e 100 litros; e a terceira entre 100 a 60.000 litros.

23. PROCESSOS, de acordo com quaisquer das reivindicações 01 e 02, caracterizados pelo fato de haver controle, incluindo automatizado, de temperatura durante o cultivo, para que a temperatura fique entre 4°C a 50°C, preferencialmente mantendo-se entre 20 e 35°C.

24. PROCESSOS, de acordo com quaisquer das reivindicações 01 e 02„ caracterizados por agitar o meio de cultura de forma contínua ou intermitente, através de eixo de agitação, com rotação entre 50 e 500rpm, preferencialmente de 200 a 300 rpm.

25. PROCESSOS, de acordo com quaisquer das reivindicações 01 e 02,, caracterizados pelo controle automatizado de pH entre 3,5 a 8,5, preferencialmente de 5 a 7, com adição de um par de compostos ácido/básico, incluindo os ácidos fosfórico e sulfúrico e hidróxido de sódio, incluindo quaisquer combinações dos mesmos.

26. PROCESSOS, de acordo com quaisquer das reivindicações 01 e 02, caracterizados pelo condicionamento da cultura com uma mudança forçada de pH entre 3 e 9.

27. PROCESSOS, de acordo com quaisquer das reivindicações 01 e 02,, caracterizados pela aeração do meio de cultura com ar, incluindo ar normal e ar enriquecido, com pelo menos 25% em volume de oxigênio; mantendo-se o esquema de tal forma que esteja disponível pelo menos 1% de oxigênio dissolvido.

28. PROCESSOS, de acordo com quaisquer das reivindicações 01 e 02,, caracterizado pela manutenção de pressão absoluta na faixa entre 0,101 e 0,5 MPa.

29. PROCESSOS, de acordo com quaisquer das reivindicações 01 e 02,, caracterizados pela utilização de técnicas assépticas, que compreendem a etapa de adicionar ao biorreator um inóculo de 0,1% a 40% (em relação mássica), constituído de micélio, incluindo micélio úmido, micélio drenado, micélio seco de macromicetos e quaisquer combinações destes.

30. PROCESSOS, de acordo com a reivindicação 29, caracterizados por empregar a inoculação de massas miceliais em fase de crescimento logarítmica, preferencialmente de culturas puras previamente incubadas a temperatura de 22 a 35°C em meios de cultura, compreendendo meios líquidos e sólidos.

31. PROCESSOS, de acordo com a reivindicação 29, em que o inóculo é produzido por fermentação submersa, em recipientes contendo volumes entre 0,05 e 2 litros de meio de cultivo, preferencialmenté de 0,5 a 1 litro, mantidos sob agitação entre 60 e 180rpm em shaker tipo rotativo, preferencialmente entre 100 e 150rpm.

32. PROCESSOS, de acordo com a reivindicação 29, caracterizados pela fragmentação e homogeneização do micélio do inóculo por força mecânica, previamente à inoculação.

33. PROCESSOS, de acordo com a reivindicação 29, caracterizados pela preparação do inóculo para fermentação submersa, principalmente aplicando uma etapa de homogeneização e maceração deste, podendo utilizar qualquer equipamento de macereção e homogeneização, compreendendo bastão, haste, peneira, espátula.

34. PROCESSOS, de acordo com a reivindicação 29, caracterizados pela preparação do inóculo para fermentação submersa, incluindo a homogeneização e fragmentação do micélio por meio de aplicação rotação alta do eixo de agitação do biorreator, resultando em taxas de cisalhamento médias a altas.

35. PROCESSOS, de acordo com qualquer das reivindicações 01 a 34, no qual um método semi-contínuo de cultivo é utilizado em que de 5% a 50% do volume final da fermentação é mantido como um inóculo inicial do cultivo seguinte; processo denominado "pé de cuba".

36. PROCESSOS, de acordo com reivindicação 35, repetidos em intervalos regu lares, caracterizados pela adição subseqüente de um meio de cultura, em estado que inclui pasteurizado e estéril, sem que se necessite submeter o equipamento inteiro ao processo de esterilização.

37. PROCESSOS, de acordo com qualquer das reivindicações 01 a 34, no qual o bioprocesso relacionado compreende regimes de batelada, batelada- alimentada e contínuo, incluindo processos em série e em paralelo.

38. PROCESSOS, de acordo com qualquer das reivindicações 01 a 34, caracterizados pela indução de mudança de cor do micélio de macromicetos em cultivo, por meio de quaisquer dos seguintes fatores: exposição à luz, mudança forçada de temperatura de 28°C para uma temperatura inferior a 18°C, preferencialmente 18°C, por um período de uma a 48 horas, preferencialmente por 2 horas.

39. PROCESSOS, de acordo com qualquer das reivindicações 01 a 34, caracterizados pela etapa de remoção e fragmentação de agregados de micélio de fungo acumulado em partes estagnadas do biorreator, resultando em diminuição de viscosidade global.

40. PROCESSOS, de acordo com qualquer das reivindicações 01 a 34, no qual o bioprocesso relacionado compreende regimes de exposição a iluminação em fotoperíodo cíclico por um período que pode variar de 8 a 12 horas.

41. PROCESSOS, de acordo com qualquer das reivindicações 01 a 34, que sejam utilizados para a obtenção de micélio de macromicetos, preferencialmente da espécie Perenniporia martiusii.

42. PROCESSOS, de acordo com a reivindicação 41, caracterizados pela separação do micélio do meio de cultivo, compreendendo etapas de gravitação forçada, incluindo filtração e centrifugação, incluindo a filtração através de uma tela de tecido, compreendendo quaisquer combinações destes.

43. PROCESSOS, de acordo com a reivindicação 41, caracterizados pela separação do caldo de fermentação, compreendendo etapas de gravitação forçada, incluindo filtração e centrifugação, incluindo a filtração através de uma tela de tecido, compreendendo quaisquer combinações destes.

44.PROCESSOS de secagem de fermentado sólido, ou micélio de fungo, produzido de acordo com reivindicação 42, caracterizados pela incubação de produtos de fermentação, incluindo o micélio e o fermentado deste, em temperaturas entre -40°C e 18°C e subsequente exposição ao ar desumidificado por pelo menos 24 horas, preferencialmente em baixa pressão e alta circulação.

45.PROCESSOS de preparação de uma composição farmacêutica leishmanicida, caracterizados por compreender os produtos resultantes obtidos de acordo com a reivindicação 44.

46.PROCESSOS de secagem de caldo de fermentação, produzidos de acordo com reivindicação 43, caracterizados pela incubação deste em temperaturas entre -40°C e 18°C e subsequente exposição a ar desumidificado por pelo menos 24 horas, preferencialmente em baixa pressão e alta circulação.

47.PROCESSOS de preparação de uma composição farmacêutica leishmanicida, caracterizados por compreender os produtos resultantes obtidos de acordo com a reivindicação 46.

48.PROCESSOS de obtenção de fermentado sólido, ou micéíiò de fungo, processados, conforme reivindicação 44, caracterizados pelo material ser obtido por algumas etapas preliminares, dentre as quais: separação do micélio do meio líquido por processo de gravitação forçada, incluindo filtração , centrifugação e quaisquer combinações dos mesmos, congelamento, liofilização, compactação do material, trituração até particulado fino.

49.PROCESSOS de obtenção de caldo de fermentação processado, conforme reivindicação 46, caracterizado pelo material de caldo de fermentação ser obtido por algumas etapas preliminares, dentre as quais estão compreendidas: separação do micélio do meio líquido por processo de gravitação forçada incluindo filtração e centrifugação, congelamento, liofilização, compactação do material, trituração até particulado fino.

50.MÉTODO, de acordo com a reivindicação 48, caracterizado pela extração do micélio processado ou de fermentado sólido, utilizando solventes incluindo diclorometano, álcool, tetracloreto de carbono, clorofórmio, acetona, água e quaisquer combinações destes.

51. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 49, caracterizado pela extração do caldo de fermentação processado com solventes incluindo diclorometano, álcool, tetracloreto de carbono, clorofórmio, acetona, água e quaisquer combinações destes.

52. MÉTODO, de acordo com as reivindicações 50 e 51, caracterizado pelo material de extração ser filtrado, concentrado por evaporação de solvente, solubilizado em solução adequada, incluindo soluções fisiológicas e tamponadas, e esterilizado por filtração em membrana.

53. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 50, caracterizado pela separação do extrato apoiar de biomassa processada extraída com diclorometano, compreendendo: misturar água e clorofórmio com o material seco, agitar e separar por decantação, resultando em uma fase enriquecida com os compostos mais apolares na fase orgânica.

54. MÉTODO, de acordo com as reivindicações 50 a 53, de obtenção de porção purificada a partir da extração orgânica de material com diclorometano, com atividade leishmanicida; caracterizado pelo processo de separação em cromatografia de adsorção com fase móvel de polaridade crescente, incluindo éter de petróleo, acetato de etila, etanol, água e quaisquer combinações destes.

55. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA com atividade antiparasitária, caracterizada por compreender produtos do processo de produção de biomassa de fungo, incluindo basidiomicetos, do gênero Perenniporia, em biorreator por fermentação, incluindo submersa e em estado sólido, e veículo farmaceuticamente aceitável.

56. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, de acordo com quaisquer das reivindicações 1, 2, e 55, caracterizada por empregar micélio de fungo produzido em biorreator por processo de fermentação, incluindo fermentação submersa e no estado sólido.

57. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, de acordo com quaisquer das reivindicações 1, 2 e 55, caracterizada por empregar pelo menos uma das espécies de macromiceto; incluindo Agaricus bisporus, Agaricus subrufescens, Lentinus edodes, Pleurotus ostreatus, Pleurotus eryngii, Pleurotus djamor, Pleurotus sajor-caju, Pleurotus pulmonarius, Ganoderma lucidum, Ganoderma applanatum, Ganoderma stipitatum, Ganoderma coffeatum, Lepista sórdida, Pycnoporus sanguineus, Coprinus comatus, Hericium herinaceum, Flammulina velutipes, Volvariella volvacea, Hypsizygus marmoreus, Tremella fusciformis.eas diversas espécies de cogumelos poliporáceos, incluindo as do gênero Perenniporia, como: P. corticola, P. cystidiata, P. detrita, P. fraxinea, P. grammothele, P. japonica, P. latissima, P. maackiae, P. martius, P. medulla-panis, P. minor, P. narymica, P. ochroleuca, P. ohiensis, P. rhizomorpha, P. straminea, P. subacida, P. tephropora e P. truncatospora,

58. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, de acordo com quaisquer das reivindicações 1, 2 e 55, caracterizada por empregar o fungo da espécie Perenniporia martiusii.

59. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, de acordo com quaisquer das reivindicações 1, 2 e 55, caracterizada por empregar material processado originado da produção em biorreator, por processo de fermentação submersa, incluindo caldo de fermentação e biomassa.

60. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, de acordo com as reivindicações 10 e 55, caracterizada por empregar material processado originado da produção em biorreator, por processo de fermentação no estado sólido, incluindo biomassa e substrato residual macerado com solvente, incluindo solventes orgânicos e água.

61. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, de acordo com as reivindicações 59 e 60, caracterizada por empregar o fungo da espécie Perenniporia martiusii.

62. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, de acordo com quaisquer das reivindicações 01, 02 e 55, caracterizada por compreender uma quantidade eficaz de um extrato purificado derivado do processo de fermentação, incluindo uma quantidade eficaz de uma fração purificada derivada de Perenniporia martiusii, inculindo qualquer mistura destes, opcionalmente em combinação com pelo menos um excipiente biologicamente aceitável, onde a composição compreende extrato de micélio processado na faixa de 10%-90% em peso e extrato de caldo de fermentação processado na faixa de 90-10% em peso.

63. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, de acordo com quaisquer das reivindicações 01, 02 e 55, caracterizado por empregar em sua formulação compostos orgânicos que podem pertencer às seguintes classes de substâncias: proteínas, peptídeos, lipídeos, polissacarídeos, proteoglucanas, glicoproteínas, lipoproteínas, compostos fenólicos, cumarinas, cromonas, xantonas, flavonóides, taninos, quinonas, saponinas, terpenóides, alcalóides, incluindo quaisquer combinações destes.

64. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, de acordo com quaisquer das reivindicações 01, 02 e 55, caracterizado por empregar em sua formulação compostos de degradação obtidos a partir da morte do micélio por um processo induzido durante o processo de fermentação.

65. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA de acordo com quaisquer das reivindicações 1, 2 e 55, caracterizada pelo fato de que o veículo farmaceuticamente aceitável é uma solução estéril isosmótica contendo de 5 a 12 g de cloreto de sódio (NaCI) para cada 1 litro de água destilada.

66. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA de acordo com quaisquer das reivindicações 1, 2 e 55, caracterizada pelo fato de que o veículo farmaceuticamente aceitável é uma solução estéril isosmótica tamponada com fosfato contendo cloreto de sódio, cloreto de potássio, fosfato de potássio monobásico e fosfato de sódio dibásico.

67. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, de acordo com reivindicação 55, caracterizada por compreender qualquer combinação de excipiente(s) e aditivo(s) farmaceuticamente aceitáveis.

68. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, de acordo com a reivindicação 55, caracterizado por compreender aditivos de um nutriente selecionado do grupo constituído por proteínas, carboidratos, açúcar, estearato de magnésio, talco, celulose, carbonato de cálcio e derivados de amido.

69. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, de acordo com a reivindicação 55, caracterizado por compreender um veículo farmaceuticamente aceitável, excipiente, diluente e solvente.

70. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, de acordo com a reivindicação 55, em que o composto é caracterizado por compreender a incorporação a Iipossomas dos tipos: específicos, de longa duração, polimórficos, peguilados, elásticos, convencionais formados por fosfolipídios, formados por lecitinas, fosfatidilcolinas, esfingomielinas, fosfatidilglicerol, fosfatidilserina, esteróides e outras substâncias lipídicas.

71. MÉTODO PARA TRATAR, inibir, prevenir ou amenizar sintomas de uma parasitose em mamíferos, sendo que tal método é caracterizado por etapas de administração de doses terapeuticamente eficazes de uma COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, obtida de acordo com quaisquer das reivindicações de 01 a 70, a um mamífero infectado.

72. MÉTODO DE TRATAMENTO, de acordo com a reivindicação 71, em que a parasitose é compreendida do grupo consistindo de leishmanioses, tripanossomíases, toxoplasmoses, malária, esquistossomose, trematódeos do sangue e da elefantíase.

73. MÉTODO DE TRATAMENTO, de acordo com a reivindicação 71, principalmente no caso de a parasitose ser uma leishmaniose, abrangendo as manifestações de leishmaniose cutânea simples, mucocutânea, tegumentar difusa e leishmaniose visceral.

74. MÉTODO DE TRATAMENTO, de acordo com a reivindicação 71, em qual a dose terapeuticamente eficaz é uma dose diária está compreendida entre 03 mg/kg a 100 mg/kg de peso corpóreo de uma COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA obtida semelhantemente às reivindicações 1 a 70.

75. MÉTODO DE TRATAMENTO de acordo com reivindicação 71, que compreende a administração de uma quantidade farmaceuticamente eficaz de extrato bruto ou parte purificada de micélio processado, a um indivíduo infectado com leishmaniose.

76. Um método como alegado na reivindicação 75, onde o extrato bruto ou parte purificada de micélio processado é administrada ao paciente na forma de uma composição que compreende caldo ou biomasssa e aditivo ou aditivos farmaceuticamente aceitáveis, e onde a composição é administrada ao indivíduo em uma quantidade eficaz para reduzir os níveis de infecção das células do hospedeiro por cerca de 50%.

77.PROCESSOS para produção de composição farmacêutica antiparasitária, de acordo com reivindicação 69, caracterizados por compreender etapa de cultivo micelial da espécie Perenniporia martiusii.

78. PROCESSOS, de acordo com quaisquer das reivindicações 1 e 2, em que as substâncias produzidas sejam caracterizadas por apresentar atividade inibitória, podendo ser tóxica, contra protozoários do gênero Leishmania, incluindo L braziliensis, L.amazonensis e L. infantum.

79. USO DE COMPOSTOS bioativos antiparasitários, obtidos de acordo com quaisquer das reivindicações 01, 02 e 55, no tratamento de leishmanioses, principalmente aquelas causadas por Leishmania braziliensis, Leishmania infantum e Leishmania amazonensis.

80. Processo para o armazenamento e utilização de uma formulação do fungo Perenniporia martiusii caracterizado pelo fato de serem utilizados micélios produzidos por um processo de fermentação em biorreator e processados tal como descrito nas reivindicações de 41 a 70.

81. Método de uso dos compostos e extratos produzidos de acordo com reivindicação 55, para o uso em testes e experimentos in vitro com finalidades de utilizar como agente bloqueador de replicação celular e do ácido desoxirribonucléico; inibidores enzimáticos. incluindo agentes de promoção, regulação, inibição e quaisquer combinações destes.

82. Método para a produção de um medicamento antiparasitário, principalmente para o tratamento de leishmanioses em mamíferos, de acordo com qualquer das reivindicações anteriores, caracterizado por conter produtos de fermentação e biomassa processados.