BRPI1013216A2

BRPI1013216A2 - isopreno de origem microbiana e métodos para sua fabricação

Info

Publication number: BRPI1013216A2
Application number: BRPI1013216-3A
Authority: BR
Inventors: Derek McPhee
Original assignee: Amyris, Inc.
Priority date: 2009-03-03
Filing date: 2010-03-02
Publication date: 2020-11-03
Also published as: EP2403816A2; US9233894B2; US8492605B2; US20100261942A1; US10125376B2; WO2010101855A3; US20130030227A1; WO2010101855A2; US20160083750A1; US9885061B2; US8324442B2; US20180155741A1; US20130221280A1

Abstract

ISOPRENO DE ORIGEM MICROBIANA E MÉTODOS PARA SUA FABRICAÇÃO. Método para produzir isopreno que compreende um meio aquoso que inclui células hospedeiras modificadas geneticamente capazes de produzir isopreno, sendo que a composição de isopreno resultante é processada através de, pelo menos um processo de separação e/ou purificação para fornecer um composição enriquecida com isopreno e um system para fazer o mesmo.

Description

: “ISOPRENO DE ORIGEM MICROBIANA E MÉTODOS PARA SUA FABRICAÇÃO”

REFERÊNCIA CRUZADA AOS PEDIDOS RELACIONADOS O presente pedido reivindicado o benefício da prioridade decorrente do Pedido Provisório Nº U.S. 61/202.474, depositado em 3 de março de 2009. O pedido de prioridade, em sua totalidade, é incorporado ao mesmo por meio de citação.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO O isopreno é um hidrocarboneto de cinco carbonos (2-metil-l,3-butadieno), que é uma substância química industrial utilizada em uma gama de aplicações industriais tais como pneus, calçados, artigos esportivos, látex, í fitas, etiquetas, e produtos médicos descartáveis. O õ 15 isopreno também é um composto natural fabricado em sistemas À biológicos. Apesar de o isopreno ser fabricado naturalmente em vários organismos, desde micróbios 2 animais, à maior parte do isopreno de ocorrência natural tem sido tradicionalmente extraído de plantas da borracha. No entanto, os rendimentos da extração são baixos e essas quantidades estão significativamente abaixo das requeridas a muitas aplicações comerciais. Em consequência disso, o isopreno é primordialmente produzido sinteticamente a partir de fontes do petróleo, com mais Frequência a partir do etileno utilizando um processo de craqueamento à vapor. Em virtude da crescente atenção às mudanças climáticas e, portanto, a uma demanda em fabricar os produtos que necessitamos de forma mais sustentável, urge a necessidade de isopreno de origem biológica ou renovável o que colaborará em atender as demandas globais de isopreno,

: mas que possam ser produzidos de forma mais amigável ao meio ambiente. A presente invenção aborda esta necessidade.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO A presente invenção proporciona composições de disopreno de origem microbiana e métodos para fabricar e purificar essas composições. Em um aspecto da invenção, é fornecida uma composição de isopreno gasoso que compreende: isopreno e água em que a água está presente em uma quantidade superior ao à cerca de 70t de sua quantidade de saturação e en due à composição de isopreno gasoso compreende 1 parte por milhão ou menos que 1 parte por milhão de qualquer uma das seguintes impurezas: alcinos C23-Cs, ciclopentadieno, x piperileno, e 1,4-pentadieno. + 15 Sm outro aspecto é fornecida uma composição de : isopreno líquido que compreende: ao menos 65% de isopreno em peso e em que a composição de isopreno compreende 1 parte por milhão ou inferior a 1 parte por milhão de qualquer uma das seguintes impurezas: alcinos C2-Cs, ciclopentadieno, piperileno, e 1,4-pentadieno. Em outro aspecto, é fornecido um método para fabricar e purificar o isopreno. O método compreende: a. obter uma primeira composição gasosa que compreende isopreno e água, em que a composição gasosa compreende um montante igual ou inferior a 1 parte por milhão de alcinos C2z-Cs; b. fluir a primeira composição gasosa através de um primeiro resfriador em que o primeiro resfriador tem uma temperatura entre cerca de 10ºC e cerca de -15ºC,

: resultando desta forma em uma segunda composição gasosa e em que a segunda composição gasosa compreende menos água que a primeira composição gasosa; c. fluir a segunda composição gasosa através de um segundo resfriador, em que o segundo resfriador tem uma temperatura inferior a -35ºC; e d. coletar a composição de isopreno líquido resultante.

Em outro aspecto, é fornecido um método adicional. O método compreende: a. cultivar uma pluralidade de células hospedeiras capazes de fabricar o isopreno; b. criar uma primeira composição gasosa que t compreende isopreno e água, em que à água está presente em uma quantidade superior a cerca de 70% de sua quantidade de A saturação; Cc. submeter a primeira COmMpPosSição gasosa à uma primeira etapa de resfriamento, e dessa forma substancialmente toda a água é removida da primeira composição gasosa, resultando na segunda composição gasosa; e d. submeter a segunda composição gasosa a uma segunda etapa de resfriamento e desse modo a composição de isopreno líquido é coletada.

Em outro aspecto, é fornecido outro método. O método compreende: a. cultivar uma pluralidade de células hospedeiras capazes de fabricar isopreno; b. criar uma primeira Composição gasosa due compreende isopreno e água, em que a água está presente em

: uma quantidade superior a cerca de 70% de sua quantidade de saturação; c. submeter a primeira composição gasosa a uma primeira etapa de resfriamento e desse modo substancialmente toda a água é removida da primeira composição gasosa resultando na segunda composição gasosa; d. submeter a segunda composição gasosa a uma segunda etapa de resfriamento e desse modo a composição de dsopreno liquido é coletada; e e. opcionalmente, colocar à primeira composição gasosa, a segunda composição gasosa e/ou a composição de isopreno líquido em contato com uma membrana contendo zeólitos modificados ou peneira molecular para proporcionar 3 uma composição de isopreno purificada. Em outro aspecto, outro método é fornecido. O * método compreende: a. contatar uma pluralidade de células hospedeiras capazes de fabricar isopreno em um meio aquoso, em que o meio aquoso está em contato com um líquido orgânico imiscível e O meio aquoso, as células hospedeiras, e o líquido orgânico imiscível estão em um receptáculo fechado; e b. cultivar as células hospedeiras no meio aquoso e desse modo as células hospedeiras fabricam o isopreno e O isopreno é capturado no líquido orgânico imiscível.

Em outro aspecto, é tornecido um método adicional. O método compreende: a. obter uma primeira composição gasosa que compreende:

s - i. isopreno em uma quantidade entre cerca de 0,1% e cerca de 15% em volume; di. dióxido de carbono em uma quantidade entre cerca de 0,04% e cerca de 35% em volume; dii. oxigênio em uma quantidade entre cerca de 1% e cerca de 20% em volume; iv. nitrogênio em uma quantidade superior a cerca de 50% em volume;

4. argônio em uma quantidade inferior a cerca de 0,9% em volume; vi. água em uma quantidade superior a cerca de 70% de sua quantidade de saturação, vii. um montante igual ou inferior a 1 parte por ú milhão de alcino Co-Cs, cielopentadieno, piperileno, e 1,4- pentadieno; e : viii. etanol; b. fluir a primeira composição gasosa através de UM primeiro restfriador e de um tambor de vaporização conectado de forma operacional, em que o primeiro resfriador tem uma temperatura entre cerca de 10ºC e cerca de -15ºC resultando desta forma em uma segunda composição gasosa e em que A segunda composição gasosa compreende menos água que a primeira composição gasosa; c. fluir a segunda composição gasosa através de um segundo resfriador e de um tambor de Vvaborização conectado de forma operacional, em que o segundo resfriador tem uma temperatura entre cerca de 35ºC e cerca de -85ºC; e dad. coletar a composição de isopraeno líquido resultante.

Um sistema de produção de isopreno que compreende: a. um biorreator capaz de cultivar uma pluralidade de células hospedeiras; b. um primeiro resfriador e um tambor de WVvaporização conectado de forma operacional à corrente superior do biorreator, o primeiro resfriador sendo capaz de Operar em uma faixa de temperatura entre 10ºC e -15º60; é c. um segundo resfriador e tambor de vaporização conectado de forma operacional à corrente superior de saída do primeiro resfriador e tambor de vaporização, o segundo resfriador sendo capaz de operar em uma temperatura dnferior a -235ºC.

Em ainda outro aspecto, é fornecido um sistema de à produção de isopreno. O sistema compreende: a. um receptáculo fechado; b. um meio aquoso, no interior do receptáculo, criando uma primeira fase; c. uma pluralidade de células hospedeiras, no interior do meio aquoso, capaz de fabricar isopreno; e, d. uma segunda fase orgânica líquida, capaz de capturar o isopreno fabricado pelas células hospedeiras, em contato com a primeira fase.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A Figura 1 é uma representação esquemática de um sistema de separação exemplificativo.

A Figura 2 é outra representação esquemática de outro sistema de separação exemplificativo.

A Figura 3 é uma representação esquemática da via do mevalonato (“MEV”) para a produção de difosfato de dsopentila ("IPP").

| A Figura 4 é uma representação esquemática da via do DXP para a produção de IPP e pirofosfato de dimetilalila ("DMAPP"). Dxs é a l-deoxi-D-xilulose-5-fosfato sintase; Dxr é l-deoxi-D-xilulose-5-fosfato redutoisomeroase (também denominada I&8pC); ISPD é 4- difosfocitidil-2C-metil-D-eritritol sintase; ISpE é 4- difosfocitidil-2C-metil-D-eritritol sintase; IspF é 2C- metil-D-eritritol 2,4-ciclodifosfato sintase; IspG é l-hidroxi-2- metil-2-(E)-butenil 4-difosfato sintase (ISpG); e ispH é discpentenil/dimetilalil dirfrosfato sintase. A Figura 5 mostra a recuperação de isopreno a partir de um líquido orgânico imiscível (miristato de â disopropila) oriundo de um sistema de fermentação fechado, A Figura 6 mostra um mapa do plasmídeo ” pAMI547. As Figuras 7A-G mostram mapas dos insertos dos vetores pAM489, pAM491, pAM493, pAM495, pAM497, e pAM584, e do cassete de integração natA-Pogs* º? “PÉ. A Figura 8 mostra um mapa do vetor de Entrada PMULE.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO Definições A menos que seja definido em contrário, todos os termos técnicos e científicos utilizados neste documento assumem o significado idêntico ao comumente entendido por um indivíduo versado na técnica básica a que pertence esta invenção. São citados diversos termos que serão definidos e que adotarão os significados adiante:

"Composto bio-orgânico" se refere a um composto orgânico que tem ao menos cinco átomos de carbono que pode ser fabricado por uma célula hospedeira assimilando uma fonte de carbono carboidrato e convertendo a fonte de carbono carboidrato no produto desejado.

"Via da deoxixilulose 5-fosfato" ou "via do DXP" é aqui utilizada para se referir à via que converte o gliceraldeído-3-fosfato e piruvato em IPP e DMAPP. A via do DXP é ilustrada esquematicamente na Figura 4.

"Endógeno" se refere a uma substância ou processo capaz de ocorrer naturalmente, por exemplo, em uma célula hospedeira não recombinante.

"Ácido nucléico heterólogo" como usado neste à documento se refere a um ácido nucléico em que ao menos uma das seguintes afirmações é verdadeira: (a) O ácido nucléico : é estranho ("exógeno") a (ou seja, não é naturalmente encontrado em) uma dada célula hospedeira; (b) o ácido nmucieico compreende uma sequência de nucleotideo que & naturalmente encontrada em (ou seja, é "endógeno a") uma dada célula hospedeira, mas a sequência de nucleotídeo é produzida em quantidades artificiais (por exemplo, superior à esperada ou maior que a encontrada naturalmente) na célula; (c) o ácido nucléico compreende uma sequência de nucleotídeo que difere da sequência de uma sequência de nucleotídeo endógena, mas sequência de — nucleotídeo encodifica a mesma proteína (possui uma sequência de amincácidos idêntica ou substancialmente idêntica) e é produzida em quantidades artífiíciais (por exemplo, superior à esperada OU maior que à encontrada naturalmente) ha célula; ou (d) o ácido nucléico compreende duas ou mais sequências de nucleotídeo que não são encontradas na mesma relação entre si na natureza (por exemplo, o ácido nucléico é recombinante).

"Célula hospedeira" e "microorganismo" são utilizados de forma intercambiável para se referir à célula viva Archae, bacteriana, ou eucariótica na qual um ácido nucléico heterólogo pode ser ou foi inserido. O termo também se refere à progênie da célula original, cuja morfologia pode não ter necessariamente uma morfologia ou 20 complemento de DNA total ou gênico totalmente idênticos à matriz original, em decorrência de mutação natural, acidental, ou deliberada.

"Isoprenóide" e "composto isoprenóide" são ? utilizados de forma intercambiável e se referem a um composto derivável do difosfato de isopentila.

: "Isolado" e "isolar" quando citados em relação a um composto bio-orgânico é o enriquecimento da quantidade de composto bio-orgânico em uma composição. Consequentemente, a quantidade do composto bio-orgânico em uma composição depois de o composto bio-orgânico ter sido isolado ou submetido a uma etapa de isolamento é maior que a quantidade presente na composição antes de tal etapa. "Via do mevalonato" ou "via NEV" é utilizada para denominar uma via Biosintética que converte a acetil-CoA em IPP.AvIaNEV E ilustrada esquematicamente na Figura 3. "Ocorrência natural" como aplicada a um ácido nucléico, uma enzima, uma célula, ou um organismo, se refere a um ácido nucléico, enzima, célula, ou organismo que é encontrado na natureza. Por exemplo, um polipeptídeo ou sequência de polinucleotideo que está presente em um organismo passível de ser isolado de uma fonte na natureza e que não foi voluntariamente modificado pelo homem em laboratório é de ocorrência natural. "Opeional" ou "opcionalmente" significa que à estrutura ou atributo descrito posteriormente pode ou não estar presente, ou que o evento ou circunstância descrito posteriormente pode ou não ocorrer, e que à descrição inclui casos em que um atributo ou estrutura particular está presente e casos em que o atributo ou estrutura está ausente, Ou casos em que o evento ou circunstância ocorre e casos em que O evento ou circunstância não ocorre. "Pirofosfato" é utilizado de forma intercambiável com "difosfato". t Como usado neste documento, uma composição que é um composto "substancialmente puro" estã substancialmente : isenta de um ou mais compostos adicionais, isto é, a composição contém mais que 80% em volume, mais que 90% em volume, mais que 95% em volume, mais que 96% em volume, mais que 97% em volume, mais que 98% em volume, mais que 99% em volume, mais que 99,5% em volume, mais que 99,6% em volume, mais que 99,7% em volume, mais que 99,8% em volume, mais que 99,9% em volume do composto; ou menos que 20% em volume, menos que 10% em volume, menos que 5% em volume, menos que 4% em volume, menos que 3% em volume, menos que 2% em volume, menos que 1% em volume, menos que 0,5% em volume, menos que 0,1% em volume, ou menos que 0,01% em volume de um ou mais compostos adicionais, com base no volume total da composição.

Na descrição adiante, todos os números aqui divulgados são valores aproximados, não importando se as palavras "cerca de" ou "aproximado" forem utilizadas em associação. Esses valores podem variar em 1 por cento, 2 por cento, 5 por cento, ou, certas vezes, 10 à 20 por cento. Sempre que uma faixa numérica com um limite, RL e um limite superior, RU, for divulgada, qualquer número confinado nesta faixa é especificamente divulgado. Em particular, os números adiante contidos na faixa são especificamente divulgados: R=RL+k* (RU-RL), em que k é uma variável com variações de 1 por cento a 100 por cento com incrementos de 1 por cento, isto é, k é 1 por cento, 2 por cento, 3 por cento, 4 por cento, 5 por cento,..., 50 por cento, 51 por cento, 52 por cento,..., 95 por cento, 96 por cento, 97 por cento, 98 por cento, 99 por cento, ou 100 por a cento. Mais ainda, qualquer faixa numérica definida por "015 dois números R como definido acima também é especificamente : divulgado.

Além das definições acima, determinados compostos descritos neste pedido têm um ou mais ligações duplas que podem existir como o isómero 2 ou E. A invenção em determinadas modalidades engloba esses compostos como isômeros individuais em uma forma substancialmente pura, bem como misturas de vários isômeros, por exemplo, misturas racêmicas de estereoisômero.

Fontes Atuais de Isopreno O isopreno é naturalmente fabricado pelas plantas da borracha (tipicamente Hevea brasiliensis) ou é fabricado sinteticamente a partir das fontes do petróleo. Quando fabricado naturalmente, o extrato semelhante à seiva (conhecida como látex e é uma versão polimerizada do isopreno) é coletado das plantas da borracha e é a fonte

: primária da borracha natural. Como o látex e a borracha natural podem ser de qualidade variável (distribuição molecular irregular), os análogos sintéticos de borracha natural ou polisopreno frequentemente é preferido em função de sua maior uniformidade.

O isopreno sántetizado quimicamente é fabricado basicamente pelas fontes do petróleo. O método mais corriqueiro envolve o craqueamento a vapor de um fluxo de petrôleo para fabricar o etileno, que por sua vez é em seguida convertido em isopreno. Outros métodos para fabricação do isopreno incluem carbonilação do isobutileno e a desidrogenação do isopentano. O isopreno resultante é produzido e vendido em diferentes concentrações. O isopreno 2 bruto tem uma pureza entre 15% e 65%. O isopreno refinado é : 145 definido como um isopreno dotado de uma pureza entre 65% e : 95%. O isopreno de elevada pureza é definido como o isopreno que tem uma pureza entre 95% e 99,5%. O isopreno de classificação polimérica é o isopreno com uma pureza superior a 99,5%.

Em consequência de seu modo de fabricação, isopreno sintético contém uma série de impurezas, inclusive diversos acetilenos e dienos, tais como ciclopentadieno e piperileno. Muito embora esses “catalisadores sejam indesejáveis por inibiren a polimerização, em geral é antieconômico eliminá-los completamente e à Pureza do isopreno é compatibilizada com o produto final desejado. Por exemplo, a pureza do isopreno pureza requerida para fabricar a borracha de butila é substancialmente inferior à requerida para fabricar polímeros SIS (classificação polimérica).

Composições de Isopreno Gasoso de Origem Microbiana A presente invenção proporciona composições de isopreno de origem microbiana e métodos para sua fabricação e purificação. Composições de isopreno de origem microbiana diferem das fontes derivadas do petróleo pelo fato de as composições praticamente não incluírem nenhum das seguintes impurezas: alcinos C;-Cs; ciclopentadieno, piperileno e 1,4-pentadieno.

Em um aspecto da invenção, é fornecida uma composição de isopreno gasoso. A Composição compreende disopreno e água, Sendo que à água está presente em uma quantidade que é ao menos cerca de 70% de sua quantidade de % saturação e a composição compreende um montante igual ou inferior a 1 parte por milhão de alcinos C;-Cs. Exemplos 3 ilustrativos —de alcinos Cy-Cs incluem —acetileno, isopropilacetileno, 1-pentino, 2-pentino, e 2-butino.

Em outro aspecto da invenção, é fornecida outra composição de isopreno gasoso. A composição compreende isopreno e Água, sendo que à água está presente em uma quantidade que é ao menos cerca de 70% de sua quantidade de saturação e a composição compreende um montante igual ou inferior a 1 parte por milhão de ciclopentadieno.

Em outro aspecto da invenção, outra composição de isopreno gasoso é fornecida. A composição compreende isopreno e água, sendo que a água está presente em uma quantidade que é ao menos cerca de 70% de sua quantidade de saturação e a Composição compreende um montante igual ou inferior a 1 parte por milhão de piperileno.

Em outro aspecto d invenção, outra composição de isopreno gasoso é fornecida. A composição compreende isopreno e água, sendo que a água está presente em uma quantidade que é ao menos cerca de 70% de sua quantidade de S saturação e à composição compreende um montante igual ou ánferior à 1 parte por milhão de 1,4-pentadieno.

Em outro aspecto da invenção, é fornecida outra composição de isopreno gasoso. A composição compreende isopreno e água, sendo que a água está presente em uma 40 quantidade que é ao menos cerca de 70% de sua quantidade de saturação e a composição compreende um montante igual ou ánferior a 1 parte por milhão de alcinos C3;-Cs, ciclopentadieno, piperileno, e 1,4-pentadieno - individualmente.

: 15 Em algumas modalidades, a composição de isopreno " gasoso compreende isopreno que está presente entre cerca de 0,1% e cerca de 15% em volume. Em outras modalidades, O isopreno está presente entre cerca de 1 e 10% em volume. Em outras modalidades mais, o isopreno está presente entre cerca (de 1 e 5% em volume. Em outras modalidades ainda, O isopreno está presente entre cerca de 5% e cerca de 10% em volume. Em modalidades adicionais, O isopreno está presente entre em uma quantidade superior a cerca de 10% em volume.

Em outras modalidades, a composição de isopreno gasoso compreende água em uma quantidade que é superior a cerca de 70%; 75%, 80%, 85%, 90%, 95% e 99% de sua quantidade de saturação. Em outras modalidades mais, a composição de isopreno gasoso compreende água saturada.

Em outras modalidades, à composição de isopreno gasoso compreende ainda dióxido de carbono que está

: presente em uma quantidade que é superior a cerca de 0,04% em volume. Em outras modalidades mais, o dióxido de carbono está presente em uma quantidade que é superior a cerca de 0,05%, 0,1%, 0,5%, 1,0%, e 5% em volume. Em modalidades adicionais, o dióxido de carbono está presente em uma quantidade que é superior a cerca de 10%, cerca de 20%, cerca de 30% em volume. fm outras modal idades complementares, o dióxido de carbono está presente em uma quantidade que está entre cerca de 1% e cerca de 358 em volume. Em outras modalidades mais, o dióxido de carbono está presente em uma quantidade que está entre cerca de 10% e cerca de 30% em volume.

Em outras modalidades, a composição de isopreno " gasoso compreende ainda oxigênio. Em algumas modalidades, o oxigênio está presente em uma quantidade que é inferior a - cerca de 20,9% em volume. Em outras modalidades, o oxigênio está presente em uma quantidade que está entre cerca de 1% em volume e cerca de 20% em volume. Em outras modalidades, o oxigênio está presente em uma quantidade que está entre cerca de 8% e cerca de 15% em volume. Em outras modalidades, o oxigênio está presente em uma quantidade que é inferior à cerca de 20%, 15%, 10%, 9%, 8%, 7t, 6%, 5%, d%, 3%, e 2%. Em outras modalidades mais, O OXiGgênio está presente em uma quantidade que é inferior a cerca de 1% em volume. Em modalidades adicionais, o oxigênio está presente entre cerca de 1% e cerca de 15% em volume. Em outras modalidades ainda, o oxigênio está presente entre cerca de 5% e cerca de 156 em volume. Em outras modalidades, a composição de isopreno gasoso compreende adicionalmente nitrogênio. Em algumas modalidades, o nitrogênio está presente em uma quantidade entre cerca de 50% e cerca de 75% em volume. Em modalidades adicionais, o nitrogênio está presente em uma quantidade que é superior a cerca de 70%. Em outras modalidades, o nitrogênio está presente em uma quantidade que é superior a cerca de 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, e 80%.

Em outras modalidades, a composição de isopreno gasoso “compreende adicionalmente argônio. Em algumas modalidades, O argônio está presente em uma quantidade que é inferior a cerca de 0,9% em volume. Em Outras modalidades, o argônio está presente em uma quantidade que é inferior à cerca de 1,0% em volume. Em outras modalidades, a composição de isopreno - gasoso compreende adicionalmente etanol. Em algumas modalidades, O etanol está presente em uma quantidade que é inferior a cerca de 0,5% em volume. Em outras modalidades, o etanol está presente em uma quantidade que é superior à cerca de 1% em volume.

Em outras modalidades, a composição de isopreno gasoso de origem microbiana pode compreender: isopreno em uma quantidade entre cerca de 0,1% e cerca de 15% em volume; água em uma quantidade que é superior a cerca de 70% de gua quantidade de saturação; dióxido de carbono em uma quantidade que está entre cerca de 0,04% e cerca de 35% em volume; oxigênio em uma quantidade que está entre cerca de 1º & cerca de 20% em volume; nitrogênio em uma quantidade que é superior a cerca de 50% em volume; argônio em uma quantidade que é inferior a cerca de 0,9% em volume; etanol em uma quantidade que é inferior à cerca de 0,5% em volume; um montante igual ou inferior a 1 parte por milhão de alcinos C;-Cs; um montante igual ou inferior a 1 parte por milhão de ciclopentadieno; um montante igual Ou dnferior a 1 parte por milhão de piperíleno; e um montante igual ou inferior a 1 parte por milhão de 1,4-pentadieno.

Em outras modalidades, a composição de isopreno gasoso de origem microbiana pode compreender: isopreno em uma quantidade entre cerca de 0,1% e cerca de 15% em volume; água em uma quantidade que é superior a cerca de 70% de sua quantidade de saturação; dióxido de carbono em uma quantidade que está entre cerca de 0,04% e cerca de 35% em volume; Oxigênio em uma quantidade que está entre cerca de 1% e cerca de 20% em volume; nitrogênio em uma quantidade que é superior a cerca de 50% em volume; argônio " em uma quantidade que é superior à cerca de 1.0% em volume, “15 etanol em uma quantidade que é superior a cerca de 1% em / volume; um montante igual ou inferior a 1 parte por milhão de alcinos C:-Ckx; um Montante igual ou inferior à 1 parte por milhão de ciclopentadieno; um montante igual Ou inferior a 1 parte por milhão de piperileno; e um montante igual ou inferior a 1 parte por milhão de 1,4-pentadieno.

Em determinadas outras modalidades, é fornecida outra composição de isopreno gasoso. Esta composição compreende: a. isopreno em uma quantidade entre cerca de 0,1% el1l5% em volume; b. dióxido de carbono em uma quantidade entre cerca de 1º e 35% em volune; e, c. água em uma quantidade que é superior a cerca de 70$ de sua quantidade de saturação e em que à composição de isopreno gasoso compreende um montante igual ou inferior

| a 1 parte por milhão de alcinos C;-Cs.

Em outras modalidades, a composição de isopreno gasoso compreende um montante igual ou inferior a 1 parte por milhão de cada um dos seguintes aleinos C:-C;, ciclopentadieno, piperíleno, e 1,4-pentadieno.

Em outras modalidades mais, a composição de dágopreno gasoso compreende água saturada.

Em outras modalidades ainda, a composição de isopreno gasoso compreende adicionalmente oxigênio em uma quantidade entre cerca de 8% é cerca de 15% em volume ou nitrogênio em uma do quantidade entre cerca de 508 e 75% em volume ou ambos.

A temperatura das composições gasosas descritas acima é ao menos 30ºC.

Em alguns casos, a temperatura está entre cerca de 30ºC e cerca de 60ºC.

Em outros casos, a - temperatura está entre cerca de sS0ºC e cerca de s8ºC. í 15 A pressão das composições gasosas descritas acima - está entre cerca de 1 e cerca de 2,5 atmosferas.

Para algumas das composições gasosas descritas acima, a temperatura está entre cerca de 30ºC e cerca de 35ºC e está a uma pressão entre cerca de 1 e cerca de 2,5 atmosferas.

Composições de Isopreno Líquido de Origem Microbiana Empregando os métodos aqui descritos, as composições de isopreno gasoso da presente invenção podem ser adicionalmente purificadas ao isopreno líquido.

Portanto, em outro aspecto da invenção, é fornecida uma composição de isopreno líquido que resulta dos métodos dinventivos.

A composição de isopreno líquido resultante compreende ao menos 65% de isopreno em peso e a composição de isopreno líquido compreende um montante igual Ou inferior a 1 parte por milhão de alcinos C:-Cs, ciclopentadieno, piperileno, e 1,4-pentadieno.

Em algumas modalidades, à composição de isopreno líquido compreende ao menos cerca de 70%, 75%, 80%, 85%, e 90% de isopreno em peso. Em outras modalidades, o isopreno líquido compreende ao menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% & 99,5% de isopreno em peso. EM outras modalidades mais, a composição de isopreno líquido compreende isopreno em uma quantidade que é superior à cerca de 99,5% em peso.

Em outras modalidades, a composição de isopreno líquido compreende adicionalmente dióxido de carbono. Em algumas modalidades, o dióxido de carbono está presente em uma quantidade que está entre cerca de 0,01% em peso e cerca de 1% em peso. Em outras modalidades, o dióxido de carbono está presente em uma quantidade que está entre : cerca de 0,05% e cerca de 1% em peso. Em modalidades adicionais, o dióxido de carbono estã presente em uma quantidade que está entre cerca de 0,1% e cerca de 1% em peso. Em outras modalidades ainda, o dióxido de carbono está presente em uma quantidade que está entre cerca de 0,2% e cerca de 0,7% em peso.

Em outras modalidades, a composição de isopreno líquido compreende adicionalmente nitrogênio. Em algumas modalidades, o nitrogênio está presente em uma quantidade que está entre cerca de 0,001% em peso e cerca de 1% em peso. Em outras modalidades, o dióxido de carbono está presente em uma quantidade que está entre cerca de 0,01% e cerca de 0,5% em peso. Em modalidades adicionais, o dióxido de carbono está presente em uma quantidade que está entre cerca de 0,05% e cerca de 0,5% em peso.

Em outras modalidades, à composição de isopreno líquido compreende adicionalmente etanol. Em algumas modalidades, o etanol está presente em uma quantidade que é superior a cerca de 0,01% em peso. Em outras modalidades, Oo etanol está presente em uma quantidade que é superior a cerca de 0,1%, 0,2%, 0,3%, 0,4%, 0,5%, 0,68%, 0,7%, 0,8%, e 0,9% em peso. Em modalidades adicionais, o etanol está presente em uma quantidade que & superior à cerca de 1% em peso.

Em outras modalidades, a composição de isopreno líquido pode compreender água em uma quantidade que é inferior a cerca de 1%, 0,5%, 0,1%, e 0,05% em peso. Em outras modalidades, a composição de isopreno líquido pode * compreender água em uma quantidade que é inferior a cerca E 15 de 500 ppm, 250 ppm, 100 ppm, e 50 ppm em peso. Em outras : modalidades, a composição de isopreno líquido pode compreender água em uma quantidade, em peso, que está abaixo do nível de detecção. Em outras modalidades, a composição de isopreno líquido de origem microbiana pode compreender: isopreno em uma quantidade de ao menos cerca de 65% até uma quantidade Superior a cerca de 99,5% em peso; dióxido de carbono em uma quantidade que está entre cerca de 0,01% e cerca de 1% em peso; nitrogênio em uma quantidade que está entre cerca de 0,001% e cerca de 1% em peso; etanol em uma quantidade superior a cerca de 0,01% até uma quantidade superior a cerca de 1% em peso; água em uma quantidade que é inferior a cerca de 1% em peso até uma quantidade que está abaixo do nível de detecção; alcinos Cx-Ck em uma quantidade igual ou inferior a 1 parte por milhão; ciclopentadieno em uma quantidade igual ou inferior a 1 parte por milhão; piperileno em uma quantidade igual ou inferior a 1 parte por milhão; e 1,4-pentadieno em uma quantidade igual ou inferior a 1 parte por milhão.

Em determinadas outras modalidades, outra composição de isopreno líquido é fornecida. Esta composição compreende: a. isopreno em uma quantidade superior a cerca de 65% em peso; ao b. etanol em uma quantidade superior à cerca de 0,01% em peso; e, c. dióxido de carbono em uma quantidade entre cerca de 0,01% e cerca de 1% em peso em que à composição de . isopreno líquido compreende um montante igual ou inferior a 015 1 parte por milhão de alcinos C3-Cs, ciclopentadieno e [ piperileno alcinos C3;-Cs. Em algumas modalidades, O dsopreno está presente em uma quantidade superior à cerca de 85% em peso; Em outras modalidades mais, O isopreno está presente em uma quantidade superior a cerca de 90% em peso.

Em modalidades adicionais, O isopreno está presente em uma quantidade superior a cerca de 90% em peso e etanol está presente em uma quantidade que está entre cerca de 0,01% e cerca de 1% em peso.

Para algumas das composições de isopreno líquido descritas acima, às composições tem uma temperatura abaixo de -95ºC e à pressão entre 0,01 e cerca de 2? atmosferas. Em outras modalidades, as composições têm uma temperatura entre -45ºC e cerca de -85ºC e a pressão abaixo cerca de 1 atmosfera. Em mais modalidades ainda, as composições têm uma temperatura abaixo -45ºC e uma pressão abaixo cerca de 0,5 atmosfera. Células Hospedeiras Microbianas Quaisquer células hospedeiras microbianas capazes de produzir isopreno podem ser utilizadas nos presentes métodos, as quais resultariam nas composições de isopreno da invenção.

Exemplos ilustrativos de células hospedeiras adequadas são micróbios que demonstraram fabriear O 140 isopreno naturalmente. Essas cepas ánciuem aquelas descritas na Patente Nº U.S. 5.849,970 e incluem: Bacillus amyloliquiefaciens; Bacillus cereus; Bacillus subtillis 6051; Basillus substillis 23059; Bacillus subtillis 23856; r Micrococcus luteus; Rhococcus rhodochrous; Acinetobacter : 15 calcoacetiucus; Agrobacternum rhizogenes; Escherichia coli; : Erwinia herbicola; Pseudomonoas aeruginosa; e Psuedomonas citronellolis. No entanto, os micróbios que fabricam isopreno naturalmente são produzidos em níveis extremamente baixos.

O isopreno é fabricado a partir de pirofosfato de isopentenila (IPP) através da isopreno sintase. Como todas as células hospedeiras microbianas são capazes de fabricar o IPP, quaisquer células hospedeiras podem ser fabricadas para a fabricação do isopreno através da inserção da isopreno sintase em seu genoma. Exemplos ilustrativos das sequências de nucleotídeo adequadas incluem, entre outras, : (EFPG3SR224, Populue albal; (AJ294519, Populue alba x Populus tremula); (AM410988, Populus nigra); (AV341431, Populus tremuloides); (EF147555, Populus trichocarpa); e (AY316691, Pueraria montana var. lobata). A adição de uma isopreno sintase heteróloga às células hospedeiras microbianas que fabricam o isopreno naturalmente aperfeiçoarão também os rendimentos dos produtores de isopreno natural.

Qualquer célula hospedeira microbiana adequada S pode ser geneticamente modificada para fabricar o isopreno.

Uma célula hospedeira geneticamente modificada é aquela em que as moléculas de ácido nucléico foram inseridas, excluídas ou modificadas (isto é, mutadas; por exemplo, por inserção, deleção, substituição, e/ou inversão de nucleotídeos), para produzir isopreno. Exemplos ilustrativos de células hospedeiras adequadas incluem qualquer célula de Archae, bacteriana, Ou eucariótica.

Exemplos de células Archae incluem, sem fins limitantes, aquelas pertencentes aos gêneros: Aeropyrum, Archaeglobus, “15. Halobacterium, Methanococcus, Methanobacterium, Pirococcus, * Sulfolobus, e Thermoplasma. Exemplos ilustrativos de espécies de Archae incluem, sem fins limitantes: Aeropyrum pernix, Archaeoglobus fulgidus, Methanococcus jannaschii, Methanobacterium thermoautotrophicum, Pirococcus abyssi, Pirococcus horikoshii, Thermoplasma acidophilum, Thermoplasma volcanium.

Exemplos de células bacterianas incluem, sem fins limitantes aquelas pertencentes aos gêneros: Agrobacterium, Aliciclobacillus, Anabaena, Anacystis, Arthrobacter, Azobacter, Bacillus, Brevibacterium, Chromatium, Clostrídium, Corynebacterium, Enterobacter, ESryinia, Escherichia, Lactobacillus, Lactococcus, Mesorhizobium, Metilobacterium, Microbacterium, Phormidium, Pseudomonas, Rhoddbacter, Rhodopseudomonas, Rhodospirillum, Rhodococcus,

Salmonella, Scenedesmun, Serratia, Shigella, Stephiococcus, Strepromyces, Synnecoccus, e Zymomonas.

Exemplos espécies bacterianas incluem, sem fins dimitantes: Bacillus subrilis, Bacillus amyloligqueftacines, Brevibacterium ammoniagenes, Brevibacterium immariophilum, Clostridium beigerinckii, Enterobacter sakazakii, Escherichia coli, Lactococcus lactis, Mesorhizobium loti, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas mevalonii, Pseudomonas pudica, Rhodobacter capsulatus, Rhodobacter sphaeroides, ao Rhodospirilium rnsubrum, Salmonella enterica, Salmonella typhi, Salmonella typhimurium, Shigella dysenterias, Shigella flexneri, Shigella sonnei, Staphylococcus aureus, e outras similares. " De modo geral, se uma célula hospedeira “015 bacteriana for utilizada, é preferencial que seja uma cepa J não patogênica.

Exemplos ilustrativos de espécies com cepas não patogênicas incluem, sem fins limitantes: Bacillus subtilis, Escherichia coli, Lactibacillus acidophilus, Lactobacillus helveticus, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas mevalonii, Pssudomonas pudita, Rhodobacter sphaeroides, Rodobacter capsulatus, Rhodospirillum rubrum, e outras similares.

Exemplos de células eucarióticas incluem, sem fins limitantes, células fúngicas.

Exemplos de células fúngicas incluem, sem fins limitantes aquelas pertencentes aos gêneros: Aspergillus, Candida, Chrysosporium, Cryotococcus, Fusarium, Kluyveromyces, Neotyphodium, Neurospora, Penicillium, Pichia, Saccharomyces, Trichoderma e Xanthophyllomyces (anteriormente Phaffia).

Exemplos ilustrativos de células eucarióticas dncluem, sen fins limitantes: Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Candida albicans, Chrysosporium lucknowense, Fusarium graminearum, Fusarium venenatum, Kluyveromyces lactis, Neurospora crassa, Pichia angusta, Pichia finlandica, Pichia Kkodamae, Pichia membranaefaciens, Pichia nmetanolica, richia opuntiae, Pichia pastoris, Pichia pij peri, Pichia quercuum, Pichia salictaria, Pichia thermotolerans, Pichia trehalophila, Pichia stipitis, Streptomyces ambofaciens, Streptomyces aureofaciens, Streptomyces aureus, Saccaromyces bayanus, Saccaromyces boulardi, Saccharomyces cerevisiae, Streptomyces fungicidicus, Streptomyces griseochromogenes, % Streptomyces griseus, Streptomyces lividans, Streptomyces í 15 olivogriseus, Streptomyces rameus, Streptomyces : tanashiensis, Streptomyces vinaceus, Trichoderma reesei e Xanthophyllomyces dendrorhous lanteriormente Phaffia rhodozyma) .

De modo geral, se uma célula eucariótica for utilizada, é preferível que seja uma cepa não patogênica. Exemplos ilustrativos de espécies com cepas não patogênica incluem, sen fins limitantes: Fusarium graminearum, Fusarium venenatum, Pichia pastoris, Saccaromyces boulardi, e Saccaromyces cerevisiae.

Em algumas modalidades, as células hospedeiras da presente invenção foram designadas pela Food and Drug Administration como GRAS ou Geralmente Consideradas Seguras. Exemplos ilustrativos de tais cepas incluem: Bacillus subtilis, Lactibacillus acidophilus, Dactobacillus 20 helveticus, é Saccharomyces cerevísiae.

Além do ácido nucléico heterólogo que encodifica uma isopreno sintase, a célula hospedeira microbiana pode ser ainda modificada para aumentar os rendimentos de isopreno.

Essas modificações incluem, entre outras, a S expressão de uma ou mais moléculas do ácido nucléico heterólogo que encodifica uma ou mais enzimas na via do mevalonato ou via do DXPs.

Via MEV Uma representação esquemática da via NEV é descrita na Figura 3. Em termos gerais, à via compreende seis etapas.

Na primeira etapa, duas moléculas de acetil- coenzima A são enzimaticamente combinadas para formar sr acetoacetil-CoA.

Uma enzima conhecida por catalisar esta À 15 etapa, por exemploy é a acetil-Coa tiolase (também : denominada acetil-CoA acetiltransferase). Exemplos ilustrativos das sequências de nucleotídeo incluem, sem contudo limitar-se a, os números de acesso do GenBank a seguir e oO organismo do qual as sequências derivaram: (NC 000913 REGION: 2324131..2325315; Escherichia coli), (D49362; Paracoccus denitrificans), e (L20428; Saccharomyces cerevisiae). Na segunda etapa da via do MEV, acetoacetil-CoA é enzimaticamente condensado com outra molécula de acetil-CoaA para formar 3-hidróxi-3-metilglutaril-CoA (HMG-CoA). Uma enzima conhecida por catalisar esta etapa é, por exemplo, HMG-CoA sintase.

Exemplos ilustrativos de sequências de nucleotídeo incluem, mas não estão limitadas a: (NC 001145. complemento — 19061..20536; Saccharomyces cerevisiae), (X96617; Saccharomyces cerevisiae), (X83882; Arabidopsis thaliana), (ABO37907; Kitasatospora griseola), (BTO07302; Homo sapiens), e (NC 002758, Locues tag GSAVOS46, GenelD 1122571; Staphylococcus aureus). Na terceira etapa, HMG-CoA é enzimaticamente convertido em mevalonato. Uma enzima conhecida por catalisar esta etapa é, por exemplo, HMG-CoA reductase. Exemplos ilustrativos de sequências de nucleotídeo incluem, mas não estão limitados a: (NM 206548; Drosophila melanogaster), (NC 002758, Locus tag SAV2545, GeneID 1122570; Staphylococcus aureus), (NM 204485; Gallus gallus), (ABOl 5627; Streptomyces sp. KO 3988), (AF542543; MWicotiana attenuata), (AB0OS7907; Kitasatospora griseola), (AX128213, ao fornecer a encodificação de sequência de um rn HMGR truncado; Saccharomyces cerevisiae), e (NC 001 145: ' 15 complemento (115734..118898; Saccharomyces cerevísiae).

: Na quarta etapa, o mevalonato é enzimaticamente fosforilado para formar mevalonato 5-fosfato. Uma enzima conhecida por catalisar esta etapa &, por exemplo, mevalonato quinase. Exemplos ilustrativos de sequências de nucleotídeo incluem, mas não estão limitados a: (177688; Arabidopsis thaliana), e (X55875; Saccharomyces cerevisiae).

Na quinta etapa, um segundo grupo fosfato é enzimaticamente adicionado ao mevalonato 5-fosfato para formar mevalonato S-pirofosfato. Uma enzima conhecida por catalisar esta etapa é, por exemplo, fosfomevalonato quinase. Exemplos ilustrativos de sequências de nucleotídeo incluem, mas não estão limitados a: (APA29305; Hevea brasiliensis), (NM 006556; Homo sapiens), e (NC 001145.

complemento 712315..713670; Saccharomyces cerevisiae).

Na sexta etapa, O mevalonato 5-pirofosfato é enzimaticamente convertido em IPP.

Uma enzima conhecida por catalisar esta etapa é, por exemplo, mevalonato pirofosfato descarboxilase.

Exemplos ilustrativos de sequências de nucleotídeo incluem, mas não estão limitados a: (X97557; Saccharomyces cerevisiae), (AF290095; Enterococcus faecium), e (U49260; Homo sapiens). Via de DxP Uma representação esquemática da via de DXP é descrito na Figura 4. Em general, a via de DXP compreende gete etapas.

Na primeira etapa, O piruvato é condensado com D-gliceraldeído 3-fosfato para produzir 1-deoxi-D-xilulose- S-fosftato.

Uma enzima conhecida por catalisar esta etapa é, - por exemplo, 1 deoxi-D-xiluloss-S-fosfato sintase.

Exemplos : 15 ilustrativos de sequências de nucleotídeo incluem, mas não . estão limitados a: (AFO35440; Escherichia coli), (NC 002947, locus tag PPO0527; Pseudomonas putida KT2440), (CP000026, locus tag SPA2301; Salmonella enterica Paratyphi, ver ATCC 9150), (NC 007493, locus tag RSP 0254; Rhodobacter sphaeroides 2.4.1), (NC 005296, locus tag RPA0952; Rhodopseudomonas palustris CGAOO9), (NC 004556, locus tag PDl293; Xylella fastidiosa Temeculal), e (NC 003076, locus tag AT5G11380; Arabidopsis thaliana). Na segunda etapa, l-deoxi-D-xilulose-5-fosfato é convertido em 2C-metil-D-eritritol-4-fosfato.

Uma enzima conhecida por catalisar esta etapa é, por exemplo, l1-deoxi- D-xilulose-5-fosfato reductoisomerase.

Exemplos ilustrativos de sequências de nucleotídeo incluem, mas não estão limitados a: (ABO 13300; Escherichia coli), (AF 148852; Arabidopsis thaliana), (NC 002947, locus tag PP

1597; Pseudomonas putida KT2440), (AL939124, locus tag SCOSGS94; Streptomyces coelicolor A3(2)), (NC 007453, locus tag RSP 2709; Rhodobacter sphaeroides 2.4.1), e (NC 007492, locus tag PfI 1107; Streptomyces coelicolor PfO-1). Ss Na terceira etapa, 2C-metil-D-eritritol-4-fosfato é convertido em 4-difosfocitidil-2C-metil-D-eritritol. Uma enzima conhecida por catalisar esta etapa é, por exemplo, 4-difosfocitidil-2C-metil-D-eritritol sintase. Exemplos ilustrativos de sequências de nucleotídeo incluem, mas não estão limitados as (AF230736; Escherichia coli), (NC 007493, locus tag RSP 2835; Rhodobacter sphaeroides

2.4.1), (NC 003071, locus tag AT2G02500; Arabidopsis thaliana), e (NC 002947, locus tag PPI614; Pseudomonas - putida KT2440). : 15 Na quarta etapa, 4-difostocitidil cctmeril-D- : eritritol é convertido em 4-difosfocitidil-ac-metil-D- eritritol-2-fosfato. Uma enzima conhecida por catalisar esta etapa é, por exemplo, 4-difosfocitidil-2C-metil-D- eritritol quinase. Exemplos ilustrativos de sequências de nucleotídeo incluem, mas não estão limitados a: (AF216300; Escherichia coli) e (NC 007493, locus tag FSP 1770; Rhodobacter sphaeroides 2.4.1). Na quinta etapa, 4 -difostocitidil-2C-metil-D- eritritol-2-fosfato é convertido em 2C-metil-D-eritritol 2,4-ciclodifosfato. Uma enzima conhecida por catalisar esta etapa é, por exemplo, 2C-metil-D-eritritol 2, 4- ciclodifosfato sintase. Exemplos ilustrativos de sequências de nucleotídeo incluem, mas não estão limitados a: (AF230738; Escherichia coli), (NC 007493, locus tag RSP

6071; Rhodobacter sphaeroides 2.4.1), e (NC 002947, locus tag PP1618; Pseudomonas putida KT2440). Na sexta etapa, 2C-metil-D-eritritol 2, ao ciclodifosfato é convertido em 1-hidróxi-2-metil-2-(E)- S butenil-i-difosfato, Uma enzima conhecida por catalisar esta etapa é, por exemplo, 1-hidróxi-2-metil-2-(E)-butenil- 4-difosfato sintase.

Exemplos ilustrativos de sequências de nucleotideo incluem, mas não estão limitados a: (AVYOSSS15; Escherichia coli), (NC 002947, 10cus tag PPO0BS3; Pseudomonas putida KT2440), e (NC 007493, locus tag RSP 2982; Rhodobacter sphaeroides 2.4.1). Na sétima etapa, 1-hidróxi-2-metil-2-(E)-butenil- 4-difosfato é convertido em IPP ou em seu isômero, DMAPP. . Uma enzima conhecida por catalisar esta etapa é, Por ' 15 exemplo, isopentil/dimetilalil difosfato sintase.

Exemplos : ilustrativos de sequências de nucleotídeo incluem, mas não estão limitados a: (AVOG2212,; Escherichia coli) e (NC 002947, locus tag PPO606; Pseudomonas putida KT2440). Em algumas modalidades, "troca de sinais" (ou interferência) entre os próprios processos metabólicos da célula hospedeira e aqueles processos envolvidos com a produção de IPP como fornecido pela presente invenção são totalmente minimizados ou eliminados.

Por exemplo, a troca de sinais é totalmente minimizada ou eliminada quando o microrganismo hospedeiro conta exclusivamente com a via de DXP para sintetizar IPD, e uma via do MEV é introduzida para fornecer IPP adicional.

Tais organismos hospedeiros não seriam equipados para alterar a expressão das enzimas de via do MEV ou processar os intermediários associados com a via do MEV.

Os organismos que contam exclusivamente ou x ar predominantemente com a via de DXP incluem, por exemplo, Escherichia coli.

Em algumas modalidades, a célula hospedeira produz IPP pela via do MEV, seja exclusivamente ou em combinação com a via de DXP.

Em outras modalidades, uma via de DXP hospedeira é funcionalmente incapacitada tal que a célula hospedeira produz IPP exclusivamente através de um via do MEV heterologamente introduzida.

A via de DXP pode ser funcionalmente incapacitada ao incapacitar a expressão de gene ou ao neutralizar a função de uma ou mais das enzimas de via de DXP que ocorrem naturalmente.

Em outras modalidades, a célula hospedeira produz IPP por meio da via de DXP, seja exclusivamente ou em m combinação com a via do MEV.

Em outras modalidades, uma via À 15 do MEV hospedeira é funcionalmente incapacitada tal que a : célula hospedeira produz IPP exclusivamente através de uma via de DXP heterologamente introduzida.

A via do MEV pode ser funcionalmente incapacitada ao incapacitar expressão de gene ou ao neutralizar a função uma ou mais das enzimas de via de DXP que ocorrem naturalmente. os métodos para modificar geneticamente organismos hospedeiros e sua cultivação foram previamente descrita.

Exemplos ilustrativos incluem Patentes dos Estados Unidos nº 6.689.593; 7.172.886; 7.183.089: Publicação de Patente dos Estados Unidos nº Us 2008/0171378; US 2008/0274523; e US 2009/0203102 e Fublicações PCT nº WO 2007/139924; WO 2009/076676; WO 2010/003007; e WO 2009/132220, que são todas incorporadas a esta invenção Por referência integralmente, Métodos adicionais para modificar organismos hospedeiros para

. 32 produzir isoprene são também fornecidos nos Exemplos abaixo.

Purificação e Recuperação de Isoprene Gasoso Derivado Microbialmente A presente invenção fornece métodos para lidar com uma composição de isoprene gasoso produzido a partir das células microbianas hospedeiras.

Quando as composições de isoprene gasoso resultantes ou as composições de isoprene gasoso descritas acima são tratadas com os seguintes métodos, então os resultados são as composições de isoprene líquido descritas acima.

Em um aspecto, um sistema para purificar isoprene sem destilação extrativa é fornecido. à destilação nm extrativa é definida como destilação na presença de um É 15 solvente que formam no azeótropo com outros componentes na . mistura e é utilizada para separar misturas que não podem ser separadas por destilação simples devido à volatilidade de pelo menos dois dos componentes na mistura ser quase a mesma, fazendo com que evaporem praticamente na mesma temperatura em uma taxa similar.

Em geral miscível, com alto ponto de ebulição, e relativamente não-volátil, o solvente de destilação de extração interage diferentemente com os componentes na mistura, permitindo que a mistura seja separada por destilação normal.

A destilação extrativa &é quase sempre utilizada para purificar isoprene derivado de petróleo.

Uma vez que a destilação extrativa exige equipamento especial e requer inerentemente grande energia, é parte substancial dos custos associados com a produção de isoprene.

Em muitas modalidades da presente invenção, as composições de isoprene resultantes não incluem quantidades vestigiais de uma solvente de destilação de extração porque os solventes de destilação extrativa não são utilizados. Exemplos ilustrativos de tais solventes incluem, mas não estão limitados a acetonitrila e dimetilformamida.

A Figura 1 é uma representação esquemática de um sistema exemplificativo de separação. As células hospedeiras são cultivadas em um biorreator e Oo isoprene produzido pelas células vaporiza e forma uma composição de isoprene gasoso (1). De forma opcional, a composição de isoprene gasoso pode passar através de um processo de secagem para remover parte do vapor d'água (não mostrado). A composição de isoprene gasoso (1) é direcionada para um primeiro resfriador 102 que resfria a composição de isoprene gasoso até uma temperatura entre cerca de 10ºC e í 15 cerca de -15ºC. A composição de isoprene gasoso resfriada - (7) então passa através de tambor 104, onde o vapor d'água na composição de isoprene gasoso se condensa em um líquido e é descarregado do processo (5). A composição de isoprene gasoso (8) de saída pode passar através de um processo de secagem para remover qualquer água vemansscente (não mostrado). àA composição de isoprene gasoso (8) é direcionada para um segundo resfriador 106 resfriando ainda mais a composição até uma temperatura abaixo de -35ºC. A composição de isoprene líquido (9) resultante flui para o tambor 108. De forma opcional, a corrente de fundo (10) do tambor 108 pode então ser passada para O separador de nitrogênio 110 enquanto a corrente de topo (11) é reciclada de volta ao primeiro restriador 102 para ajudar em (ou para servir como um refrigerante para) resfriar isoprene gasoso (1) que chega e então liberar uma corrente de subproduto

« 34 (6). O nitrogênio substancialmente puro (2) é introduzido no separador de nitrogênio 110 pelo qual a COMposição de isoprene líquido (3) é recuperada e o subproduto de gás de nitrogênio (4) pode ser descarregado ou recuperado em uma subsequente etapa de recuperação (não mostrada).

Em outra modalidade, o sistema compreende: a. um biorreator capaz de cultivar uma pluralidade de células hospedeiras, preferivelmente oO biorreator tem um capacidade maior do que 100 litros; ao b. um primeiro restriador e tambor de vaporização operavelmente conectados à corrente suspensa do biorreator, O primeiro resfriador preferivelmente capaz de operar em uma faixa de temperatura entre 10ºC e -15ºC; . c. um segundo resfriador e tambor de vaporização E 15 operavelmente conectados à corrente suspensa que deixa o : primeiro resfriador e tambor de vaporização, o segundo resfriador “preferivelmente capaz de operar em uma temperatura abaixo de -35ºC, por exemplo, entre cerca de - 65ºC e cerca de -85ºC; d. de forma opcional, à corrente suspensa que deixa o segundo resfriador e tambor de vaporização pode ser operavelmente conectada à entrada do refrigerante ou corrente de resfriamento do primeiro resfriador; e e. de forma opcional, a corrente condensado que deixao segundo resfriador e tambor de vaporização pode ser operavelmente conectada a um separador de nitrogênio.

Em outro aspecto, o método para recuperar dsoprens ao utilizar tal um sistema & fornecido. O método compreende:

s 35 a. obter uma primeira composição gasosa que compreende isoprene e água em que à composição gasosa compreende 1 parte por milhão ou menos de C,;-Cs alcinos; b. fluir a primeira composição gasosa através de um primeiro resfriador em que o primeiro resfriador tem uma temperatura entre cerca de 10ºC e cerca de -15ºC, com isso resultando em uma segunda composição gasosa e em que a segunda composição gasosa compreende menos água do que a primeira composição gasosa, por exemplo à segunda composição de gás compreende cerca de 3% por peso ou menos de água; c. fluir a segunda composição gasosa através de um segundo resfriador em que oO segundo resfriador tem uma . temperatura abaixo de -35ºC; e d. coletar a composição de isoprene líquido : resultante.

Em outras modalidades, o método para recuperar isoprene compreende reduzir o teor de água presente na primeira composição gasosa ao fluir a primeira composição gasosa através de um primeiro resfriador em que o primeiro resfriador tem uma temperatura entre cerca de 10ºC e cerca de -195ºC, com isso resultando em uma segunda Composição gasosa e em que à segunda composição gasosa compreende menos água do que a primeira composição gasosa, por exemplo a segunda composição de gás compreende menos do que cerca de 3% por peso de água. Em outras modalidades, a segunda composição de gás compreende menos do que cerca de 2% por peso de água, menos do que 1%, 0,5%, 0,1%, e 0,05% por peso. Em outras modalidades, a segunda composição de gás

: 36 compreende menos do que cerca de 500 ppm por peso de água, menos do que 250 ppm, 100 ppm e 50 ppm por peso.

Em outro aspecto, oO método para srecuperar isoprene ao utilizar tal sistema é fornecido. O método compreende: a. obter uma primeira composição gasosa que compreende isoprene e água em que a composição gasosa compreende 1 parte por milhão ou menos de C,-Cs alcinos; b. fluir a primeira composição gasosa através de um primeiro resfriador em que o primeiro resfriador tem uma temperatura entre cerca de 10ºC e cerca de -15ºC, com isso resultando em uma segunda composição gasosa e em que a segunda composição gasosa compreende menos água do que a . primeira composição gasosa, por exemplo a segunda composição de gás compreende cerca de 3% por peso ou menos de água; c. fluir a segunda composição gasosa através de um segundo resfriador em que o segundo resfriador tem uma temperatura abaixo de -35ºC com isso resultando em uma composição de isoprene líquido, em que a composição de isoprene líquido compreende menos de um ou mais dos seguintes componentes do que a segunda composição gasosa, que compreende: i. água em quantidade menor do que cerca de 1% por peso ou menos; di. aióxido de carbono em quantidade menor do que 1% por peso; iii. nitrogênio em quantidade menor do que 1% por peso; e

: 37 d. coletar a composição de isoprene líquido resultante.

Em algumas modalidades, o método compreende ainda separação de nitrogênio da composição de isoprene líquido.

Esta separação de nitrogênio pode ser executada por qualquer método adequado incluindo passar um corrente de nitrogênio substancialmente pura através da composição enriquecida de isoprene líquido.

Esta corrente de nitrogênio serve para remover adicionalmente gases dissolvidos (tal, como por exemplo, oxigênio, dióxido de carbono, nitrogênio, e argônio) e ou/água remanescente.

Em outras modalidades, a separação de nitrogênio da composição de isoprene líquido pode compreender remover: oxigênio : dissolvido a níveis menores do que cerca de 1%, 0,5%, 0,1%, : 15 e 0,05% por peso; dióxido de carbono dissolvido a níveis : menores do que cerca de 1%, 0,5%, 0,1%, e 0,05% por peso; nitrogênio dissolvido a níveis menores do que cerca de 1%, 0,5%, 0,1%, e 0,05% por peso; argônio dissolvido a níveis menores do que cerca de 1%, 0,5%, 0,1%, e 0,05% por peso; e qualquer água remanescente a níveis menores do que cerca de 1%, 0,5%, 0,1%, 0,05% por peso a níveis menores do que O nível de detecção.

Em algumas modalidades, o método compreende ainda extrair impurezas de hidrocarboneto em algum ponto no processo de purificação de isoprene.

Esta extração de hidrocarboneto pode ser executada ao passar uma porção ou toda a primeira composição dasosa, a segunda composição gasosa e/ou a composição de isoprene líquido por ou através de uma membrana de zeólito modificada &e/Ou peneira molecular. (A membrana de zeólito e/ou peneiras moleculares pode ser modificada adsorver seletivamente apenas isoprene e não os outros hidrocarbonetos presentes na composição tratada ou vice-versa (adsorver outros hidrocarbonetos na composição tratada e não isoprene). Em algumas modalidades, os zeólitos e/ou peneiras moleculares são modificados por carbonização para fornecer a adsortividade selecionada.

Em algumas modalidades, os zeólitos podem ser tipo-L, tipo-Y, ZSM-5, e/ou tipo-beta.

Em algumas modalidades um método para aprimorar a seletividade de um zeólito por carbonização controlada como detalhado na Patente dos Estados Unidos nº 7.041.616, que é incorporada aqui integralmente por referência, pode ser utilizado.

Em outras modalidades, a primeira composição .-. gasosa compreende ainda dióxido de carbono.

Ainda em outras modalidades, a primeira composição gasosa compreende ainda oxigênio.

Ainda em outras modalidades, a primeira composição gasosa compreende ainda nitrogênio.

Em outras modalidades, a primeira composição gasosa compreende 1 parte por milhão ou menos de C2-Cs alcinos e ciclopentadieno, Em modalidades adicionais, a primeira composição gasosa compreende ainda 1 parte por milhão ou menos de C,;-C;s alcinos e piperileno.

Ainda em outras modalidades, a primeira composição gasosa compreende 1 parte por milhão ou menos de C;-C;s alcinos e 1,4- pentadieno.

Ainda em outras modalidades, a primeira composição gasosa compreende 1 parte por milhão ou menos de C2-Cs alcinos, ciclopentadieno, piperileno, e 1,4- pentadieno.

Em outras modalidades, a primeira composição So gasosa é fluída através de um secador antes de fluir

. 39 através do primeiro resfriador. Ainda em outras modalidades, a primeira composição gasosa é fluída através de um secador após fluir através do primeiro resfriador, mas antes de fluir através do segundo resfriador. ts Em outras modalidades, o primeiro resfriador tem uma temperatura de cerca de -5ºC.

Em outras modalidades, oO primeiro restriador & resfriado ao utilizar um sistema de refrigeração de propileno. Ainda em outras modalidades, o primeiro resftriador é resfriado ao utilizar um sistema de refrigeração de amônio.

Em outras modalidades, o segundo resfriador tem uma temperatura menos do que cerca de -50ºC. Em outras DD modalidades, o segundo restriador tem uma temperatura de | 15 cerca de -60ºC a cerca de -sbºC. Ainda em outras o modalidades, o segundo resfriador tem uma temperatura de menos do que cerca de -65ºC. Ainda em outras modalidades, o segundo resfriador tem uma temperatura entre cerca de -35ºC e cerca de -8s5ºC. Em Outras modalidades, à composição de isoprene líquido compreende pelo menos cerca de 70%, 75%, 80%, 85%, e 90% isoprene por peso. Em outras modalidades, O isoprene líquido compreende pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% e 99,5% isoprene por peso. Ainda em outras modalidades, à composição de isoprene líquido compreende isoprene em uma quantidade que é maior do que cerca de 99,5% por peso.

Em outras modalidades, o segundo resfriador é resíriado ao utilizar UM sistema de refrigeração de etileno.

: 40 Em outro aspecto, outro método é fornecido. O método compreende: a. cultivar uma pluralidade de células hospedeiras capaz de produzir isoprene; b. formar uma primeira composição gasosa que Compreende isoprene e água em que à água está presente em uma quantidade maior do que cerca de 70% de sua quantidade de saturação; c. expor a primeira composição gasosa a uma primeira etapa de resfriamento pela qual substancialmente toda a água é removida a partir da práimeira composição gasosa resultando em uma segunda composição gasosa; qd. expor a segunda composição gasosa a uma - segunda etapa resfriamento pela qual uma composição de : 15 isoprene líquido é coletada. a Em algumas modalidades, o método compreende ainda separação de nitrogênio da composição de isoprene líquido. Em outras modalidades, a primeira Composição gasosa compreende ainda dióxido de carbono. Ainda em outras modalidades, a primeira composição gasosa compreende ainda oxigênio. Ainda em outras modalidades, a primeira composição gasosa compreende ainda nitrogênio.

Em outras modalidades, à primeira composição gasosa compreende 1 parte por milhão ou manos de C-C, alcinos e ciclopentadieno. Em modalidades adicionais, a primeira composição gasosa compreende ainda 1 parte por milhão ou menos de C;7-C; alcinos e piperileno. Ainda em outras modalidades, a primeira composição gasosa compreende 1 parte por milhão ou menos de C7-C;s alcinos e 1,4- pentadieno. Ainda em outras modalidades, a primeira

. 41 composição gasosa compreende 1 parte por milhão ou menos de CarCs alcinos, ciclopentadieno, piperileno, e 1,4- pentadieno. Em outras modalidades, a primeira composição gasosa é exposta através de um secador antes da primeira etapa de resfriamento, Ainda em outras modalidades, à primeira composição gasosa é exposta através de um secador após a primeira etapa de resfriamento, mas antes da segunda etapa de resfriamento.

Em outras modalidades, a primeira etapa de resfriamento resfria a primeira composição de isoprene gasoso para uma temperatura entre cerca de 10ºC e cerca de -15ºC, entre cerca de 10ºC e cerca de -10ºC, cerca de 5ºC e -- cerca de -5ºC, e cerca de 5ºC e cerca de -10ºC.

: 15 Em outras modalidades, a primeira etapa de a resfriamento utiliza um sistema de refrigeração de propileno. Ainda em outras modalidades, a primeira etapa de resfriamento utiliza resfriador em um eistema de refrigeração de amônio.

Em outras modalidades, a segunda etapa de restriamento resfíria à segunda composição de isoprene gasoso até uma temperatura menor do que -35ºC. Em outras modalidades, 2 segunda etapa de resfriamento resfria à segunda composição de isoprene gasoso até uma temperatura menor do que cerca de -50ºC. Ainda em outras modalidades, a segunda etapa de resfriamento resfria a segunda composição de isoprene gasoso até uma temperatura cerca de -60ºC a cerca de -85ºC. Ainda em modalidades adicionais, a segunda etapa de resfriamento resfria a segunda composição de

: 42 isoprene gasoso até uma temperatura de menos do que cerca de -65ºC.

Em outras modalidades, a segunda etapa de resfriamento utiliza um sistema de refrigeração de etileno.

Em outras modalidades, a composição de isoprene líquido compreende pelo menos cerca de 70%, 75%, 80%, 85%, e 90% de isoprene por peso. Em outras modalidades, o isoprene líquido compreende pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% e 99,5% de isoprene por peso. Ainda em outras modalidades, a composição de isoprene líquido compreende isoprene em uma quantidade que é maior do que cerca de 99,5% por peso. Em outras modalidades, as células hospedeiras são - selecionadas a partir do gênero Bacillus, Escherichia ou ' 15 Acinetobacter. Ainda em outras modalídades, às celulas hospedeiras são Escherichia coli. Em modalidades adicionais, as células hospedeiras são levedura. Ainda em modalidades — adicionais, as células hospedeiras são Saccharomyces cerevisiae. Em outro aspecto, outro método é fornecido. O método compreende: a. colocar em contato uma pluralidade de células hospedeiras capaz de produzir isoprene em um meio aquoso em que o meio aquoso está em contato com um líquido orgânico imiscível e o meio aquoso, as células hospedeiras, e oO líquido orgânico imiscível é em um recipiente fechado; e b. cultivar as células hospedeiras no meio aquoso pela qual as células hospedeiras produzem isoprene e o isoprene é capturado no líquido orgânico imiscível.

- 43 Em algumas modalidades, o método compreende ainda separar o líquido orgânico imiscível do meio aquoso e separar o isoprene do líquido orgânico imiscível.

Em outras modalidades, o líquido orgânico imiscível é selecionado a partir de acetato de butila, acetato de etila, miristato de isopropila, isobutil cetona de metila, oleato de metila, e tolueno. Em certas modalidades, o solvente é acetato de butila. EM outras modalidades, o líquido orgânico imiscível é isopropil miristrato.

Em outras modalidades, o isoprene é separado do líquido orgânico imiscível ao aquecer o líquido orgânico imiscível até uma temperatura acima de 34ºC.

.- À composição de isoprens gasoso resultante pode : 15 então ser adicionalmente purificada ao utilizar os métodos - descritos acima.

Em Outro aspecto, Um sistema para produzir isoprene microbiano é fornecido. Um exemplo ilustrativo de tal sistema é mostrado na Figura 2. O biorreator 202 é um sistema fechado onde as células hospedeiras capazes de produzir isoprene são cultivadas em um meio aquoso e com um líquido orgânico imiscível no topo do meio aquoso. Uma vez que o biorreator 202 é um sistema fechado, o isoprene produzido pelas células hospedeiras é capturado pelo líquido orgânico imiscível. O líquido orgânico imiscível enriquecido com isoprene (A) pode então direcionado para qualquer método de separação gás-líquido adequado. Neste exemplo, o líquido orgânico imiscível enriquecido com isoprene é direcionado para um aquecedor 204 que volatiza o isoprene em uma composição de isoprene gasoso (1). Esta

“ 4a composição de isoprene gasoso (1) pode então ser purificada ainda ao utilizar os sistemas e métodos descritos acima. O líquido orgânico imisceível (BB) pode Opcionalmente ser reciclado e utilizado em biorreações subsequentes para produzir isoprene.

Em outra modalidade, o sistema compreende: a. um recipiente fechado; b. um meio aquoso, dentro do recipiente, que forma uma primeira fase; c. uma pluralidade de células hospedeiras, dentro do meio aquoso, capaz de produzir isoprene; e d. uma segunda fase orgânica líquida, capaz de capturar o isoprene produzido pelas células hospedeiras, em = contato com a primeira fase. : 15 Em algumas modalidades, o lígGuido orgânico : imiscível é selecionado a partir de acetato de butila, acetato de etila, miristato de isopropila, isobutil cetona de metila, oleato de metila, e tolueno. Em certas modalidades, o solvente é acetato de butila. Em outras modalidades, O líquido orgânico imiscível é isopropil miristrato.

Em outras modalidades, as células hospedeiras são selecionadas a partir do gênero Bacillus, Escherichia ou Acinetobacter. Ainda em outras modalidades, as células hospedeiras são Escherichia coli. Em modalidades adicionais, as células hospedeiras são levedura. Ainda em modalidades adicionais, as células hospedeiras são Saccharomyces cerevisiae.

. 45

EXEMPLOS A prática da presente invenção pode empregar, exceto se indicado em contrário, técnicas convencionais da indústria biossintética e similares, que fazem parte da habilidade na técnica. Assim sendo, tais técnicas não são descritas integralmente nesta invenção, àa pessoa pode encontrar ampla referência a elas na literatura científica.

Nos seguintes exemplos, esforços foram feitos para garantir precisão com relação aos números utilizados (por exemplo, quantidades, temperatura, e demais), mas variação e desvio podem ser mencionados, e no caso de um erro crucial nos números relatados nesta invenção existir, a pessoa de habilidade comum na técnica a qual esta - invenção pertence pode deduzir a quantidade correta em vista da descrição remanescente nesta invenção. Exceto se . indicado em contrário, a temperatura é relatada em graus Celsius, e pressão está em ou próxima à pressão atmosférica ao nível do mar. Todos os reagentes, exceto se indicado em contrário, foram obtidos comercialmente. Os seguintes exemplos se prestam para propósitos ilustrativos apenas e não limitam de qualquer forma o escopo da presente invenção.

Exemplo 1 Este exemplo descreve métodos para detectar aprisionado isoprene em um líquido orgânico imiscível em um sistema fechado de fermentação.

Neste exemplo, o miristato de isopropila (IPM) e soluções de IPM com adição de 103 mg/L, 10,3 mg/L e O mg/L isoprene foram preparados e armazenados em garrafas de meio tampadas deldo ml.

. 46 125 ml frascos não-defletidos com tampas/divisórias de parafuso foram ajustados triplamente. Os frascos continham meio de 40 ml (meios de Base Nitrogenada de Levedura com 4% de galactose, 0.29% glicose, S Leu) inoculado com cultura de levedura de um dia para O outro (o que não produz isoprene) cultivado em um OD = 0,05 com E ml de soluções IPM com as várias concentrações de isoprene. Os frascos selados foram incubados por 72 horas a 30ºC e 200 rpm.

Após a incubação, à cobertura de IPM teve suas fases separadas por transferência manual para ampolas GC primárias, então transferida para ampolas GC secundárias e encaminhada não-diluída em GC-FID. Em adição às amostras e dos frascos, as soluções originais de 103 e 10,3 mg/L de õ 15 isoprene em IPM (não sacudido por 72 horas a 200 rpm, 30ºC) - foram também analisadas. Como mostrado pela Figura 5, mais de 90% do isoprene adicionado foi recuperado a partir da camada de IPM. O crescimento de células para culturas com 103, 10,3, e0mg/Lde isoprene na camada de IPM foi indistinguível. Exemplo 2 Este exemplo descreve métodos para produzir ácidos nucléicos para expressar em isoprene sintases heterólogas de Saccharomyces cerevisiae.

O DNA genômico foi isolado a partir de Saccharomyces cerevisiae cepas Y002 (CEN.PK2 background MATA ura3-52 trpl-289 Ieu2-3,112 his3A0l MAL2-8C SUC2) (van Dijken et al. (2000) Enzyme and Microbial Technology 26:706-714), YO07 (S288C background MATA trpl1Ã63) (ATCC S0 número 200873), YOS1 (S26SC background), e EG123 (ATCC

.. 47 número 204278). As cepas foram cultivadas de um dia para o outro em meio líquido contendo 1% de extrato de levedura, 2% de Bacto-peptona, e 2% de Dextrose (meio de YPD). As células foram isoladas a partir de culturas líquidas 10 mL por centrifugação a 3.100 rpm, lavagem de pelotas de célula em 10 mL água ultra-pura, e re-centrifugação.

O DNA genômico foi extraído ao utilizar o conjunto de extração de DNA de levedura Y-DER (Pierce Biotechnologies, Rockford, IL) pelo protocolo sugerido pelo fabricante.

O DNA genômico extraído foi ressuspenso em 100 uL 10 mM Tris-Cl, pH 8,5, e leituras ODz60/2s0 foram tomadas em um espectrofotômetro ND- 1000 (NanoDrop Technologies, Wilmington, DE) para determinar a concentração e pureza do DNA genômico,. . A amplificação de DNA por Reação em Cadeia de ” 15 Polimerase (PCR) foi efetuada em um Termociclador Applied : Biosystems 2720 (Applied Biosystems Inc, Foster City, CA) ao utilizar o sistema de Polimerase de DNA Phusion De Alta Fidelidade (Finnzymes OY, Espoo, Finlândia) pelo protocolo sugerido pelo fabricante.

Após a conclusão de uma amplificação de PCR de um fragmento de DNA que foi designado para ser inserido no vetor pCRº4Blunt-TOPO (Invitrogen, Carlsbad, CA), cadeias secundárias de nucleotídeo foram criada ao adicionar 1 pL de Polimerase Qiagen Tag (Qiagen, Valencia, CA) à mistura de reação e realizar uma etapa adicional de extensão de PCR por 10 minutos, a 72ºC, seguida por resfriamento até 4ºC.

Após a conclusão de uma amplificação de PCR, 8 ul de uma solução

50% de glicerol foi adicionada à mistura de reação.

Eletroforese de gel de agarose foi realizada ao utilizar um gel de agarose de 1% TBE (0,89 M Tris, 0,89 M de ácido bórico, 0,02 M EDTA de sal de sódio) contendo 0,5 pg/ml brometo de etídio, a 120 V, 400 mA por 30 minutos.

As fitas de DNA foram visualizadas ao utilizar luz ultravioleta.

As fitas de DNA foram removidas do gel com uma lâmina de navalha estéril, e o DNA removido foi purificado com gel ao utilizar o Conjunto de Remoção de DNA em Gel Zymoclean (Zymo Research, Orange, CA) de acordo com os protocolos sugeridos pelo fabricante.

O DNA purificado foi eluído em 10 pl água ultra-pura, e leituras ODa60/280 foram tomadas em um espectrofotômetro ND-1000 pata determinar a concentração e pureza do DNA.

As ligações foram realizadas ao utilizar 100-500 ug de produto de PCR purificado e Ligase de DNA T4 de Alta - Concentração (New England Biolabs, Ipswich, MA) pelo = 15 protocolo sugerido pelo fabricante.

Para propagação de . plasmídeo, construtos ligados foram transformados em células quimicamente competentes de Escherichia coli DHSo (Invitrogen, Carlsbad, CA) pelo protocolo sugerido pelo fabricante.

Os transformantes positivos foram selecionados em meios sólidos contendo 1,5% de Bacto Agar, 1% de Triptona, 0,58 Extrato de Levedura, 1% Nacl, e uma antibiótico apropriado.

Os transformantes isolados foram cultivados por 16 horas em meio líquido LB contendo 50 Vpg/mL de antibiótico carbenicilina ou canamicina a 37ºC, e o plasmídeo foi isolado e purificado ao utilizar um conjunto Miniprep Spin OQOTlAprep Spin Miniprep (Oiagen, Valencia, CA) pelo protocolo sugerido pelo fabricante.

Os construtos foram verificados ao realizar digestões de enzima de restrição de diagnóstico, resolver os fragmentos de DNA em um gel agarose, e visualizar as fitas ao utilizar o 49 luz ultravioleta. Os construtos selecionados foram também verificados por sequenciamento de DNA, que foi efetuado por Elim Biopharmaceuticals Inc. (Hayward, CA). O plasmídeo de expressão pAM353 foi gerado ao inserir uma encodificação de sequência de nucleotídeo uma sintase B-farnesene mo vetor pRS425-Gall (Mumberg et. al. (1994) Nucl. Acids. Res. 22(25): S767-5768). À sequência de nucleotídeo inserida foi gerada sinteticamente, ao utilizar como um modelo a sequência de codificação da sintase B- farnesene de gene de Artemisia annua (GenBank número de catalogação AY835398) otimizado em códon para expressão em Saccharomyces cerevisiae (SEQ ID NO: 1). A sequência de nmueleotíideo sinteticamente gerada foi flanqueado pelos -- locais de restrição 5' BamHI e 3' Xhol, e pode então ser ” 15 clonada em locais de restrição compatíveis de um vetor de - clonagem como um vetor original padrão pUC ou pACYC. A sequência de nucleotídeos sinteticamente gerada foi isolada pela digestão total do construto ao utilizar endonucleases de restrição BamHI e Xhol. A mistura de reação foi resolvida por eletroforese de gel, o fragmento de DNA de aproximadamente 1,7 kb que compreende a sintase B-farnesene de sequência de coditicação foi purificada com gel, e o fragmento isolado de DNA foi ligado no local de restrição BamHI Xhol do veto pRS425-Gall, produzindo plasmídeo de expressão pAM353.

O plasmídeo de expressão pAM404 foi gerado ao inserir uma encodificação de sequência de nucleotideo na sintase B-farnesene de Artemisia annua (GenBank número de catalogação AVYSZSS398) otimizado em códon para expressão em Saccharomyces cerevisiae no vetor pAMI178 (SEQ ID NO: 2). A

- 50 encodificação de sequência de nucleotídeo da sintase B- farnesene foi amplificada por PCR a partir de pAM353 ao utilizar oe iniciadores 52-84 pAM326 BamHI (SEO ID NO: 21) e 52-84 paAM326 Nhel (SED ID NO: 22). O resultante produto de PCR foi digerido integralmente ao utilizar às endonueleases de restrição BamHI e Nhel, à mistura de reação foi resolvida por eletroforese de gel, o fragmento de DNA de aproximadamente 1,7 kb que compreende a sequência de codificação de sintase B-farnesene foi purificada por gel, e o fragmento de DNA isolado foi ligado no local de restrição BamHI Nhel do vetor pAM 178, produzindo o plasmídeo de expressão pAM404. O plasmídeo Genetrix2080 foi gerado ao inserir a uma encodificação de sequência de nucieotideo em um Z 15 isoprene sintase no vetor pUCl9. A inserção foi gerada : sinteticamente como dois fragmentos de DNA de tamanhos aproximadamente idênticos, fragmento 2080 1 (SEQ ID NO: 3) e fragmento 2080 2 (SEO ID NO: 4), ao utilizar como um modelo a sequência de codificação do isoprene sintase o gene RKudzu otimizado em códon para expressão em Saccharomyces cerevisiae.

Cada fragmento de DNA foi flanqueado por locais de restrição Lgul, e compreende uma sequência de sobreposição de par de 40 bases em uma extremidade.

Os fragmentos de DNA sinteticamente gerados foram ligados em extremidade cega no local de restrição Smal do vetor de clonagem pUC19, a partir do qual as duas inserções foram removidas novamente ao digerir integralmente 500 vg do construto ao utilizar a endonuclease de restrição Lgul (Fermentas, Glen Burnie, MD). A endonuclease de restrição foi neutralizada por calor

-. 51 por 20 minutos a 65ºC, e os fragmentos de DNA foram costurados juntos por uma primeira rodada de amplificação de PCR (um ciclo de desnaturação a 98ºC por 2 minutos; 5 ciclos de desnaturação a 98ºC por 30 segundos e têmpera/extensão a 72ºC por 30 segundos por produto de PCR quilobase; nenhum iniciador foi utilizado). As amostras foram colocadas em gelo, 0,5 uM de cada iniciador terminal TRIX L 494 (SEQ ID NO: 79) e TRIX L 495 (SEQ ID NO: &0) foram adicionados à mistura de reação, e uma segundo rodada de amplificação de PCR foi realizada (um ciclo de desnaturação a 98ºC por 2 minutos; 35 rodadas de desnaturação a 98ºC por 12 segundos e têmpera/extensão a 72ºC por 20 segundos por produto de PCR quilobase; um ciclo x de extensão final a 72ºC por 7 minutos; e uma retenção final a 4ºC). A mistura de reação foi resolvida por ! eletroforese de gel, o fragmento de DNA reunido foi purificado por gel, tratada com quinase de polinucleotídeo T4 (PNI) (New England Biolabs, Ipswich, MA), e ligado em extremidade cega no local de restrição Smal do vetor pUC19, produzindo plasmídeo Genetrix2080.

O plasmídeo Genetrix2081 foi gerado ao inserir uma encodificação de sequência de nucleotídeo um isoprene sintase no vetor pUCl9. A inserção foi gerada sinteticamente como dois fragmentos de DNA de tamanhos aproximadamente idênticos, fragmento 2081 1 (SEQ ID NO: 5) e fragmento 2081 2 (SEQ ID NO: 6), ao utilizar como um modelo a sequência de codificação do gene isoprene sintase de Populus nigra otimizado em códon para expressão em Saccharomyces cerevisiae. Cada fragmento de DNA foi flanqueado por locais de restrição Lgul, e compreende uma

” 52 sequência de sobreposição de par de 30 bases em uma extremidade.

Os fragmentos de DNA sinteticamente gerados foram ligados em extremidade cega no local de restrição fnal do vetor de clonagem pUCl!S, a partir do qual as duas inserções foram removidas novamente por digestão completa de 500 ug do construto ao utilizar endonuclease de restrição Lgus (Fermentas, Glen Burnie, MD). À endonuclease de restrição £oi neutralizada por calor por 20 minutos à 65ºC, e os fragmentos de DNA foram costurados juntos por uma primeira rodada de amplificação de PCR (um ciclo de desnaturação a 98ºC para 2 minutos; 5 ciclos de desnaturação a 98ºC para 30 segundos e têmpera/extensão a 72ºC para 30 segundos por produto de PCR quilobase; nenhum x iniciador foi utilizado). As amostras foram colocadas em 7 15 gelo, 0,5 yM de cada iniciador terminal TRIX L 497 (SEQ ID : NO: 81) e TRIXT 498 (SEQ ID NO: 82) foi adicionado à mistura de reação, e uma segunda rodada de amplificação de PCR foi realizada (um ciclo de desnaturação a 98ºC por 2 minutos; 35 rodadas de desnaturação a 98ºC por 12 segundos e têmpera/extensão à 72ºC por 20 segundos por produto de PCR quilobase; um ciclo de final extensão a 72ºC por 7 minutos; e uma retenção final a 4ºC). A mistura de reação foi resolvida por eletroforese de gel, o fragmento de DNA reunido foi purificado por gel, tratado com quinase de polinucleotídeo T4 (PNK) (New England Biolabs, Ipswich, MA), e iigado em extremidade cega no local de restrição

Smal do vetor pUCl9, produzindo o plasmídeo Genetrix2081. O plasmídeo Genetrix2082 foi gerado inserindo-se uma sequência de mnucleotídeo que codifica uma isopreno sintase no vetor pUCl9. A inserção foi gerada

. 53 sinteticamente como dois fragmentos de DNA de tamanho aproximadamente igual, o fragmento 2082 1 (SEQ ID NO: 7) e o fragmento 2062 2 (SKQ0 1D NO: 8), usados como um modelo da sequência de codificação do gene da isopreno sintase ofPopulus alba x Populus tremula otimizado por códon para expressão em Saccharomyces cerevisiae.

Cada fragmento de DNA foi flanqueado por locais de restrição Lgul, e compreendeu uma sequência de sobreposição de 40 pares de base em uma extremidade. os fragmentos de DNA sinteticamente gerados foram ligados por embotamento no local de restrição Smal do vetor de clonagem pUC19, a partir do qual duas inserções foram excisadas novamente por digestão por completo de 500 ug do construto com uso de r endonuclease de restrição Lqgul (Fermentas, Glen Burnie, > 15 MD). A endonuclease de restrição foi inativada por calor & por 20 minutos a 65ºC, e os fragmentos de DNA foram unidos juntos por uma primeira sessão de amplificação por PCR (um ciclo de desnaturação a 98ºC por 2 minutos; 5 ciclos de desnaturação a 98ºC por 30 segundos e recozimento/extensão a 72ºC por 30 segundos por quilobase de produto PCR; nenhum iniciador foi usado). As amostram foram colocadas em gelo, 0,5 uM de cada iniciador terminal TRIX L 500 (SEQ ID NO:83) e TRIX À 501 (SED ID NO: 84) foram adicionados à mistura de reação, e uma segunda sessão de amplificação por PCR foi realizada (um ciclo de desnaturação a 98ºC por 2 minutos; 35 sessões de desnaturação a 98ºC por 12 segundos e recozimento/extensão a 72ºC por 20 segundos por quilobase de produto PCR; um ciclo de final estendido à 72º por 7 minutos; e uma manutenção final a 4ºC). A mistura de reação foi separada por eletroforese em gel, o fragmento de DNA

. 54 montado foi purificado em gel, tratado com polinucleotídeo quinase Ti (PNK) (New England Biolabs, Ipswich, MA), e 1igados por embotamento no local de restrição Smal do vetor pUCl9, rendendo o plasmídeo Genetrix2082.

O plasmídeo de expressão pAMl 547 foi gerado substituindo-se a sequência de codificação da B-farneseno sintase de expressão do plasmídeo paAM404 pela sequência de codificação da isopreno sintase do plasmídeo Genetrix2080. O Eragmento de DNA IS2080 foi gerado por amplificação por PCR do plasmídeo Genetrix2080 com uso dos iniciadores YD- 198-70A (SEQ ID NO: 85) e YD-198-70B (SEQ ID NO: 86), digestão do produto de PCR por completo com uso de endonucleases de restrição BamHI e Nhel, resolvendo a = mistura de reação por eletroforese em gel, e purificando em Y 15 gel o fragmento de DNA de aproximadamente 1,8 kb que : compreende à sequência de codificação de iscopreno sintase. O plasmídeo de expressão pAM404 foi digerido por completo com uso de endonucleases de restrição BamHI e Nhel, a mistura de reação foi separada por eletroforese em gel, à cadeia principal do vetor de aproximadamente 7,3 kb (sem a sequência de codificação de fB-farneseno sintase) foi purificada em gel, e a cadeia principal do vetor purificada foi ligada ao fragmento de DNA IS2080, rendendo pAM1547 (vide a Figura 6 para um mapa de plasmídeo).

O plasmídeo de expressão pAMl 548 foi gerado substituindo-se a Sequência de codificação de Pp-farneseno sintase do plasmídeo de expressão pAM404 por uma versão truncada da sequência de codificação da isopreno sintase do plasmideo Cenetrix2080. O tragmento de DNA IS2PO080T foi gerado por amplificação por PCR do plasmídeo Genetrix2080 com uso de iniciadores YD-198-70B (SEQ ID NO: 86) e YD-198- 70G (SEQ ID NO: 91), digestão do produto de PCR por completo com uso de endonucleases de restrição BamHI e Nhel, separação da mistura de reação por eletroforese em S qel, e purificação em qel do Fragmento de DNA de aproximadamente 1,65 kb que compreende a sequência de codificação truncada da isopreno sintase.

O pAM404 foi digerido por completo com uso de endonucleases de restrição BamHI e Nhel, a mistura de reação foi separada por eletroforese em gel, a cadeia principal de aproximadamente 7,3 kb (sem a sequência de codificação de B-farneseno sintase) foi purificada em gel, e a cadeia principal do vetor purificada foi ligada ao fragmento de DNA amplificado

7 I1S2080T, rendendo pAM1548. . 15 O plasmídeo de expressão pAMl 549 foi gerado por À substituição da sequência de codificação de B-farneseno sintase do plasmídeo de expressão pAM404 pela sequência de codificação de isopreno sintase do plasmídeo Genetrix2081. O fragmento de DNA IS2081 foi gerado por amplificação por PCR do plasmídeo Genetrix2081 com uso dos iniciadores YD- 198-70C (SEQ ID NO: 87) e YD-198-70D (SEQ ID NO: 88), digestão do produto de PCR por completo com uso de endonucieases de restrição PamHI e Nhel, separação da mistura de reação por eletroforese em gel, e purificação em qgel do fragmento de DNA de aproximadamente 1,68 kb que compreende a sequência de codificação de isopreno sintase.

O plasmídeo de expressão pAM404 foi digerido por completo com uso de endonucieases de restrição BamHI e Nhel, à mistura de reação foi separada por eletroforese em gel, a cadeia principal do vetor de aproximadamente 7,3 kb (sem a

' 56 sequência de codificação de fB-farneseno sintase) foi purificada em gel, e a cadeia principal do vetor purificada foi ligada ao fragmento de DNA IS2081, rendendo pAM1549. O plasmídeo de expressão pAMl 550 foi gerado por substituição da sequência de codificação de B-farneseno sintase do plasmídeo de expressão pAM404 por uma versão truncada da sequência de codificação de isopreno sintase do plasmideo Genetrix20ns1, O fragmento de DNA IS2081T foi gerado por amplificação por PCR do plasmídeo Cenetrixoa0s) com use dos iniciadores vD-198-70D (SEG TD NO: 88) e YD- 198-70H (SEQ ID NO: 92), digestão do produto de PCR por completo com uso de endonucleases de restrição BamHI e Nhel, separação da mistura de reação por eletroforese em 7 del, e purificação em gel do fragmento de DNA de > 15 aproximadamente 1,6 kb que compreende a sequência de * codificação de isopreno sintase truncada.

O plasmídeo de expressão pAM404 foi digerido por completo com uso de endonucleases de restrição BamHI e Nhel, a mistura de reação foi separada por eletroforese em gel, cadeia principal do vetor de aproximadamente 7,3 kb (sem a sequência de codificação de fG-farneseno sintase) foi purificada em gel, e a cadeia principal do vetor purificada foi ligada ao fragmento de DNA IS2081T, rendendo pAMI550. O plasmídeo de expressão pAMl 551 foi gerado por substituição da sequência de codificação de B-farneseno sintase do plasmídeo de expressão pAM404 pela sequência de codificação de isopreno sintase do plasmídeo Genetrix2082. O fragmento de DNA IS2082 foi gerado por amplificação por PCR do plasmídeo Genetrix2082 com uso dos iniciadores YD- 198-70E (SEQ ID NO: 89) e YD- 198-70F (SEQ ID NO: 90),

. 57 digestão do produto de PCR por completo com uso de endomnuclieases de restrição BamHIT e Nhel, separação da mistura de reação por eletroforese em gel, e purificação em gel do fragmento de DNA de aproximadamente 1,8 kb que compreende a sequência de codificação de isopreno sintase. O plasmídeo de expressão pAM404 foi digerido por completo com uso de endonucleases de restrição BamHI e Nhel, a mistura de reação foi separada por eletroforese em gel, a cadeia principal do vetor de aproximadamente 7,3 kb (sem a sequência de codificação de B-farneseno sintase) foi purificada em gel, e a cadeia principal do vetor purificada £ol ligada ao fragmento de DNA IS2082, rendendo paMISSOI.

O plasmídeo de expressão pAMl 552 foi gerado por = substituição da sequência de codificação de fB-farneseno - 15 sintase do plasmídeo de expressão pAM404 por uma versão a truncada da sequência de codificação de isopreno sintase do plasmídeo Genetrix2082. O fragmento de DNA IS2082T foi gerado por amplificação por PCR do plasmídeo Genetrix2082 com uso dos iniciadores YD-198-70F (SEQ ID NO: 90) e YD- 198-701 (SEQ ID NO: 93), digestão do produto de PCR por completo com uso de endonucleases de restrição BamHI e Nhel, separação da mistura de reação por eletroforese em gel, e purificação em gel do fragmento de DNA de aproximadamente 1,64 kb que compreende a sequência de codificação de isopreno sintase truncada. O plasmídeo de expressão paM404 foi digerido por completo com uso de endonucleases de restrição BamHI e Nhel, a mistura de reação foi separada por eletroforese em gel, a cadeia principal do vetor de aproximadamente 7,3 kb (sem a sequência de codificação de fB-farneseno sintase) foi purificada em gel, e a cadeia principal do vetor purificada foi ligada ao fragmento de DNA IS2082T, rendendo pAMIL1552. O plasmídeo pAMB40 foi gerado por inserção da sequência de codificação do gene MSG no vetor pCR(R)2.1- TOPO (Invitrogen, Carlsbad, CA). À sequência de codificação do gene hisG foi amplificada por PCR com uso dos iniciadores KB34 (SEQ ID NO: 75) e KB39 (SEQ ID NO: 76) e o plasmídeo pNKYS1 (Alani et al. (1987) Genetics 116(4) :541- 555) como modelo. O fragmento de DNA amplificado foi ligado ao vetor Topo conforme pelo protocolo sugerido do fabricante, rendendo pAMBS40.

O Plasmídeo pAM728 foi gerado introduzindo-se a sequência de codificação do gene da farneseno sintase da T Artemisia annua (número de acesso do GenBank AY835398) É 15 otimizado por códon para expressão na Saccharomyces à cerevisiae e sob o controle do promotor do gene GAL7 da Sacharomyces —* cerevisiae (Peaz7) no plasmídeo pRS425 (Christianson et al. (1992) Cens 110(1): 119-122). Um fragmento de DNA de aproximadamente 0,5 kb que compreende Pam; foi amplificado por PCR a partir do DNA genômico Y002 usando os iniciadores GW-110-26-pGAL7-PstI F (SEQ ID NO: 119) e GW-1 10-26-pGAL7 R (SEQ ID NO: 120) e foi purificado em gel. Um fragmento de DNA de aproximadamente 2 kb que compreende a sequência de codificação do gene da farneseno sintase foi amplificado por PCR usando os iniciadores GW- 110-26- pGAL7-FS F (SEQ ID NO: 121) e GW-110-26-FS-BamHI R (SEQ ID NO: 122). Os dois fragmentos de DNA foram alinhados juntos úsando iniciadores PCR GW-110-26-DGALY-Psti F (SED TD NO: 119) e GW-1 10-26-FS-BambHI R (SEO 1D NO: 122) para criar uma inserção Pan7- FS-tCYCl. A inserção Pen7-FS-tCYCl

. 59 e o plasmídeo pRS425 foram digeridos por completo usando as endonucleases de restrição Pstl e BamHI e os dois fragmentos de DNA foram ligados, que rende o pAM728. O Plasmídeo pAM940 foi gerado introduzindo-se a sequência da farneseno sintase do plasmídeo pAM7?S no plasmídeo pRS426 (Christianson et al. (1992) Gene 110(1): 1 19 a 122). Os Plasmídeos pAM728 e pRS426foram digeridos por completo usando as endonucleases de restrição Xhol e BamHI, a reação das misturas foram separadas por eletroforese em gel, a cadeia principal do vetor pr9426 de aproximadamente 5,7 kbe a inserção Pan, FS-tCYCl de aproximadamente 2,5 kb do paM728 foram purificadas em gel e os dois fragmentos de DNA foram ligados, que rende o plasmídeo pAM940.

z= O Plasmídeo pAM489 foi gerado inserindo-se a S 15 inserção ERG20-Pska-tHMGR do vetor pAM471 no vetor pAM466. O vetor pAM471 foi gerado inserindo-se o fragmento de DNA ERG20-Pean-tHMGR, que compreende oO quadro de leitura aberto (ORF) do gene ERG20 da Saccharomyces cerevisiae (posições de nucleotídeo ERG20 1 a 1208; O A do códon de início ATG é o nucleotídeo 1) (ERG20), o lócus genético que contém os promotores divergentes GALI e GALIO da Saccharomyces cerevisiae (posição de nucleotídeo GAL1 -1 a -668) (Pa) e um ORF cortado do gene HMG1 da Saccharomyces cerevisiae (posições de nucleotídeo HMG1 1586 a 3323) (tHMGR), mo vetor de clonagem TOPO Zero Blunt II (Invitrogen, Carlsbad, CA). O vetor pAM466 foi gerado inserindo-se o fragmento de DNA TRPL1765º a 548 O que compreende um gegmento do l6cue de tipo selvagem TRPl da Saccharomyces cerevisiae que se estende da posição de nucleotídeo -856 para a posição 548 e abrioa um local de restrição de Xmal interno não nativo

. 60 entre as bases -226 E -225, no vetor de clonagem TOPO TA pCR2.1 (Invitrogen,q Carlisbad, CA), Os fragmentos de DNA ERG20- Poam-tHMGR e TRPLº *?* ***º foram gerados por amplificação por PCR como esquematizado Tabela 1. Para a construção do pAM489, 400 ng de pAM471 e 100 ng de pAM466 foram digeridos por completo usando a enzima de restrição mal (New England Biolabs, Ipswich, MA), os fragmentos de DNA que correspondem à inserção ERG20-Po-tHMGR e o vetor PAMI6S linearizado foram purificados em gel e 4 molares equivalentes das inserções foram ligados 1 molar equivalente do vetor linearizado purificado, que rende pAMABO.

À Figura 7 A mostra um mapa da inserção ERG20-Pçu" tHMGR, e SEQ ID NO: 9 mostra a sequência de nucleotídeo do = fragmento de DNA e as sequências de TRPI de flanqueamento. > Tabela 1 - Amplificações por PCR realizadas para gerar à paAM489 Sessão Modelo Iniciador 1 Iniciador 2 Produto de de PCR PCR 1 100 ng de DNA 61-67- 61-67- qPpRI1 SS ?* - genômico Y051 CPKO001-G CPK002-G ses (SEQ ID NO: (SEQ ID NO: 23) 24) 61-67- 61-67- TPR175 ? CPK003-G CPK004-G 2518 (SEQ ID NO: (SEQ ID NO: 25) 26) 100 ng de DNA 61-67- 61-67- ERG20 genômico EG123 CPK0O25-G CPKO50-G (SEG ID NO: (SEO 1D NO: 47) 55)

. 61 100 ng de DNA 61-67- 61-67- Paaz genômico Y002 CPKO51-G CPKO052-G (SEQ ID (SEQ ID NO: NO:56) 57) 61-67- 61-67- tHMGR CPKO53-G CPK031-G (SEQ ID NO: (SEQ ID NO: 58) 48) 2 100 ng cada de 61-67- 61-67- TpR1 to . produtos de CPK001-G CPK004-G 54 PCR TPR1º* * - (SEQ ID NO: (SEQ ID NO: 826 «à TPRITº º 23) 26) ses - 100 ng cada de 61-67- 61-67- ERG20-Pea " produtos de CPK025-G CPKO052-G : PCR ERGAO e (SEQ ID NO: (SEQ ID NO: Pear 47) 57) 3 100 ng cada de 61-67- 61-67- ERG20- Pan produtos de CPK025-G CPKO031-G tHMGR PCR ERG20-Pkr (SEQ ID NO: (SEQ ID NO: e tHMGR 47) 48) O plasmídeo pAM491 foi gerado inserindo-se a inserção ERG13-Pew-tHMGR do vetor pAM472 no vetor pAM467. O vetor paMAI7? foi gerado inserindo-se O fragmento de DNA —ERGI3-PGAL-tHMGR, que compreende o ORF do gene ERG13 da Saccharomyces cerevisiae (posições de nucleotídeo ERG13 1 a 1626) (ERG13), o lócus genético que contém os promotores divergentes GALI e GALIO da Saccharomyces cCerevisiae (posição de nucleotídeo GAL1 -1 a -668) (Pam), e um ORF

- 62 cortado do gene HMG1 da Saccharomyces cerevisiae (posição de nucleotídeo HMG1 1586 a 3323) (tHMGR), no vetor de clonagem TOPO Zero Blunt 11. O vetor pAM4E67 foi gerado inserindo-se o fragmento de DNA URA3 7??? 7º, que compreende um segmento do lócus URA3 de tipo selvagem da Saccharomyces Cerevisiae que se estende da posição de nucleotídeo -723 para a posição -224 e abriga um local de restrição de Xinal interno não entre as bases -224 e -223, no vetor de clonagem TOPO TA pCR2.1. Os fragmentos de DNA ERG13-Pon- tHMGR e URA3* ?7º foram gerados por amplificação por PCR como esquematizado na Tabela 2, Para àa construção do pAM491, 400 ng de paM472 e 100 ng de pAM467 foram digeridos por completo usando a enzima de restrição Xmal, Os ç fragmentos de DNA que correspondem à inserção ERG13-Pen- " 15 tHMGR e O vetor pAMA67 linearizado foram purificados em gel . e 4 molares equivalentes da inserção purificada foram ligados com 1 molar equivalente do vetor linearizado purificado, que rende o pAM491. A Figura 7B mostra um mapa da inserção ERG13-Par-tHMGR e a SEQ ID NO: 10 mostra a sequência de nucleotídeo do fragmento de DNA e as sequências de URA3 de flanqueamento.

Tabela 2 - Amplificações por PCR realizadas para gerar paAM491 Sessão Modelo Iniciador 1 Iniciador 2 Produto de de PCR PCR 1 100 ng de DNA 61-67- 61-67- URAZIT? a - genômico Y007 CPKO005-G CPK006-G 221 (SEQ ID NO: (SEQ ID NO: 27) 28) 61-67- 61-67- URA3 722? a TO

, 63 CPK007-G CPK008-G (SFQ TD NO: (SEO 1D NO: 29) 30) 100 ng de DNA 61-67- 61-67- ERG13 genômico Y002 CPK032-G CPKO54-G (SEQ ID NO: (SEQ ID NO: 49) 59) 61-67- 61-67- Penr CPKO052-G CPKO055-G (SEQ ID NO: (SEQ ID NO: 57) 60) 61-67- 61-67- tHMGR CPKO031-G CPKO053-G ç (S8EQ TD NO: (SEO ID NO: 48) 58) . 2 100 ng cada de 61-67- 61-67- URA37 a - produtos de CPKO005-G CPK008-G ou PCR URA3 7??? *º “ (SEQ ID NO: (SEQ ID NO: 7º e URA3?P ? 27) 30) 701 100 ng cada de 61-67- 61-67- ERG13- Pon produtos de CPK032-G CPKO52-G PCR ERG13e Po (SEQ ID NO: (SEQ ID NO: 49) 57) 3 100 ng cada de 61-67- 61-67- ERG13-Pcan- produtos de CPK031-G CPK032-G tHMGR PCR ERG1IS-Poaw (SEO ID NO: (sEQ ID NO: e tHMGR 48) 49)

. 64

O plasmídeo pAM493 foi gerado inserindo-se a inserção IDI 1 -Ph-tHMGR do vetor pAM473 no vetor pAM468. O vetor pAM473 foi gerado inserindo-se o fragmento de DNA IDI1-Pon-tHMGR, que compreende o ORP do gene da Saccharomyces cerevisiae (posição de nucleotídeo IDI1l 1 a 1017) (IDI1), O lócus genético que contém os promotores divergentes GAL1I e GALIO da Saccharomyces cerevisiae (posição de nucleotídeo GAL1 -1 a -668) (Pon), e um ORF cortado do gene HMGl da Saccharomyces cerevisiae (posições de nucleptideo HMGl 1586 a 3323) ([LHMCR), no vetor de clonagem TOPO Zero Blunt II.

O vetor pAM468 foi gerado inserindo-se o fragmento de DNA ADE1*?* ? ***, que compreende um segmento do lócus ADE1 de tipo selvagem da Saccharomyces ç- cerevisiae que se estende da posição de nucleotídeo -225 > 15 para a posição 653 e abriga um local de restrição de Xmal 1 interno não nativo a entre as bases -226 e -225, no vetor de clonagem TOPO TA pCR2.1. Os fragmentos de DNA IDI1-Peau- tHMGR e ADE 1 *?ºº** foram gerados por amplificação por PCR como esquematizado na Tabela 3. Para a construção do pAM493, 400 ng de pAM473 e 100 ng epAM468 foram digeridos por completo usando à enzima de restrição Xmal, Os fragmentos de DNA que correspondem à inserção IDI1l-Pea- tHMGR e O vetor pAM468 linearizado foram purificados em gel, e 4 molares equivalentes da inserção purificada foram ligados com 1 molar equivalente do vetor linearizado purificado, que rende o pAM493. A Figura 7C mostra um mapa da inserção IDI1l-Poa-tHMGR, e a SEO ID NO: 11 mostra a sequência de nucleotídeos do fragmento de DNA e as sequências de ADE1 de flanqueamento.

Tabela 3 - Amplificações por PCR realizadas para gerar pAM493 Sessão Modelo Iniciador 1 Iniciador 2 Produto de de PCR PCR 1 100 ng de DNA 61-67- 61-67- ADEI PIS e genômico Y007 CPK0NI-G CPK010-G es (SEQ ID NO: (SEQID NO: 31) 32) 61-67- 61-67- ADEI??S à 653 CPK011-G CPK012G (SEQ ID NO: (SEQ ID NO: 33) 34) 100 ng de DNA 61-67- 61-67- IDI1 ç genômico Y002 CPK047-G CPK064-G & (SEQ ID NO: (SEQ ID NO: : 54) 69) 61-67- 61-67- Parz CPKO052-G CPKO65-G (SEQ ID NO: (SEQ ID NO: 57) 70) 61-67- 61-67- tHMGR CPKO031-G CPKO053-G (SEQ ID NO: (SFQ 1D NO: 48) 58) 2 100 ng cada de 61-67- 61-67- ADET SIS a — produtos de CPK009-G CPK012-G es PCR ADEI*º º - (SEQ ID NO: (SEQ ID NO: 99º al ADETISSSS DST) 34) 653 200 nq cada de 61-67- 61-67- IDI1-Pon produtos de CPKO047-C CPKU5S2-G PCR IDI1 e Per (SEQ ID NO: (SEQ ID NO:

54) 57)

3 100 ng cada de 61-67- 61-67- IDI1l-Peon-

produtos de CPKO031-G CPK047-G tHMGR PCR IDIl-Pk e (SEQ ID NO: (SEQ ID NO: tHMGR 48) 54)

O plasmídeo pAM4A9S toi gerado inserindo-se à inserção ERG10-Pe-ERG12 do paAM474 no vetor pAM469. O vetor paM47A Foi gerado inserindo-se o fragmento de DNA ERGIU-

Por ERG12, que compreende o ORF do gene ERGIO da Saccharomyces cerevisiae (posição de nucleotídeo ERG10 1 a

- 1347) (ERGIO), o lócus genético que contém promotores * divergentes GAL1I e GALIO da Saccharomyces cerevisiae . (posição de nucleotídeo GAL1 -1 a -668) (Pam), e o ORF do gene ERG 12 da Saccharomyces cerevisiae (posição de nucleotídeo ERG 12 1 a 1482) (ERG 12), no vetor de clonagem

TOPO Zero Blunt II.

O vetor pAM469 foi gerado inserindo-se o fragmento de DNA HIS3?? ? O HISMX- HIS3% à MM, que compreende dois segmentos do lócus HIS da Saccharomyces cerevisiae que se estende da posição de nucleotídeo -32 para a posição - 1000 e da posição de nucleotídeo 504 para a posição 1103, um marcador HISMX e um local de restrição de Xmal não nativo entre a sequência HIS3 9º * 90 e Q marcador HISMX, no vetor de clonagem TOPO TA pCR2.1. Os

Fragmentos de DNA ERGIO-Pa-ERGIO a HISa º o? FISSturonX- HIS35º* à 1º foram gerados por amplificação por PCR como esquematizado na Tabela 4. Para a construção do pAM495, 400 ng de pAM474 el00 ng de pAM469 foram digeridos por completo usando a enzima de restrição Xmal, os fragmentos de DNA que correspondem à inserção ERG10-Pk-ERG12 e O vetor pAM469 linearizado foram purificados em gel, 4 molares equivalentes da inserção purificada foram ligados com 1 molar equivalente do vetor linearizado, que rende o vetor PpAM495. A Figura 7D mostra um mapa da inserção ERG10-Pon- ERG12 e à SEO ID NO: 12 mostra a sequência de nucleotídeos do fragmento de DNA e as sequências de HIS3 de flanqueamento.

Tabela 4 - Amplificações por PCR realizadas para gerar pAM495 Sessão Modelo Iniciador 1 Iniciador 2 Produto de de PCR PCR 7 1 100 ng de DNA 61-67- 61-67- HISZA 2 & genômico Y007 CPKO13-G CPKO0O14alt-G 29% . (SEQ ID NO: (SEQ ID NO: 35) 36) 61-67- 61-67- HIS a CPKO017-G CPK0018G no? (SEQ ID NO: (SEQ ID NO: 39) 40) 61-67- 61-67- ERG10 CPKO03-G CPKO56-G (SEQ ID NO: (SEQ ID NO: 50) 61) 61-67- 61-67- Pon CPKO57-G CPKO58-G (SEO ID NO: (SPO TD NO: 62) 63) 61-67- 61-67- ERG12

CPK040-G CPK059-G (SEQ 1D NO: (SEG ID NO: 51) 64) 100 ng de DNA 61-67- 61-67- HISMX de plasmídeo CPKOI5alt-G CPKO016-G pAM330*+* (SEQ ID NO: (SEQ ID NO: 37) 38) 2 160 no cada de 61-67- 61-67- HIS359º a - produtos de CPKO015alt-G CPK018-G us PCR HIS3”* *º “ (SEQ ID NO: (SEQ ID NO: 2º e HISMX 37) 40) 100 ng cada de 61-67- 61-67- ERG10-Pen produtos de CPKO035-G CPKO58-G - PCR ERGIO e (SEQ ID NO: (SEQ ID NO: 7 Porx 50) 63) 2 3 100 ng cada de 61-67- s1-67- HI93/222o au e produtos de CPK013-G CPK018-G 200º -HISMX- PCR HISSº º — (SEO ID NO: (SEO ID NO: H193º ? 2º e HISMX- 35) 40) 2000 prggãa a - 1000 100 ng cada de 61-67- 61-67- ERG10 - Pam produtos de CPKO035-G CPK040-G - ERG12 PCR ERGIO - (SPO ID NO; (SEO ID NO: Pon & ERGI12 50) 51) ** O marcador HISMX em pAM330 originado a partir do prFA6a- HISMX6-PGAL1 conforme descrito por van Dijken ET AL. ((2000) Enzyme Microb.

Technol. 26(9 à 10): 706 a 714). O plasmídeo pAM497 foi gerado inserindo-se a inserção ERG8-Pa-ERG19 do pAM475 no vetor pAM470. O vetor pAM475 foi gerado inserindo-se o fragmento de DNA ERG8-Pon-

ERG19, que compreende o ORF do gene ERG8 da Saccharomyces cerevisiae (posição de nucleotídeo ERG8 1 a 1512) (ERG8), O lócus genético que contém os promotores divergentes GAL1 e GAL10 da Saccharomyces cerevisiae (posição de nucleotídeo GAL1I -1 a -668) (Par), & O ORF do gene ERGI9 da Saccharomyces cerevisiae (posição de nucleotídeo ERG1I9 1 à 1341) (ERG19), no vetor de clonagem TOPO Zero Blunt II.

O vetor pAM470 foi gerado inserindo-se o fragmento de DNA LEUZOS a 450 Coro LEUANOS 2 191790 que compreende dois segmentos do lócus LEU2 da Saccharomyces cerevisiae que se estende da posição de nucleotídeo -100 para a posição 450 e da posição de nucleotiídeo 1096 para àa posição 1770, um marcador HISMX, e um local de restrição de Xmal não nativo - entre a sequência LEU2*ºº* ? 17”? e o marcador HISMX, no vetor & 15 de clonagem TOPO TA pCR2.1. Os fragmentos de DNA LEU2*% *? . 450 HISMX- LEU2!º% à 17º foram gerados por amplificação por PCR como esquematizado na Tabela 5. Para a construção do PpAM497, 400 ng de paAM475 e 100 ng de pAM470 foram digeridos por completo usando a enzima de restrição Xmal, os tragmentos de DNA que correspondem à inserção ERGS-Poy- ERÇ19 e ao vetor pAMATO linearizado foram purificados e à molares equivalentes da inserção purificada foram ligados com 1 molar equivalente do vetor linearizado, que rende o vetor paAM497. A Figura 7E para um mapa da inserção ERG8- Pea-ERG19, e a SEQ ID NO: 13 mostra a sequência de nucleotídeos do fragmento de DNA e as sequências de LEU2 de flanqueamento.

Tabela 5 - Amplificações por PCR realizadas para gerar pAM495 Sessão Modelo Iniciador 1 Iniciador 2 Produto de de PCR PCR 1 1400 nq de DNA 61-67- 61-67- LEU 109 à 450 genômico Y007 CPKO019-G CPK020-G (SEQ ID NO: (SEQ ID NO: 41) al 61-67- 61-67- LEU2*0º : CPK023-G CPK024G mo (SEQ TD NO: (SEO ID NO: 45) 46) 100 ng de DNA 61-67- 61-67- HISMX - de plasmídeo CPK021-G CPK022-G & PpAM330** (SEQ ID NO: (SEQ ID NO: - 43) 44) 100 ng de DNA 61-67- 61-67- ERG8 genômico Y007 CPKO041-G CPK022-G (SEQ ID NO: (SEQ ID NO: 52) 65) 61-67- 61-67- Poar CPK061-G CPKO062-G (SEQ ID NO: (SEQ ID NO: 66) 67) 61-67- 61-67- ERG19 CPK046-G CPK063-G (SEQ ID NO: (SEQ ID NO: 53) 68) 2 200 no cada de 61-67- 61-67- HISNMX- produtos de CPK021-G CPK024-G LEU2/9º5 .

et PCR LEU? à (8R0 ID NO: (SEQ TD NO: 12º 17% HISMX 43) 46) 100 ng cada de 61-67- 61-67- ERG8-Pon produtos de CPKO041-G CPK062-G PCR ERGS à Pow (SEO ID NO: (SEO ID NO: 52) 67) 3 100 ng cada de 61-67- 61-67- LEU27200 a 450 produtos de CPK019-G CPK024-G - HISMX- PCR LESS º (SEO ID NO: (smQ TD NO: LeEDIIOS 5 459 & HISMXO- 41) 46) 17 LEU 105 a 1770 100 ng cada de 61-67- 61-67- ERG8 - Pom produtos de CPKO41-G CPK046-G - ERG19 - PCR ERG8 - Pow (SEQ ID NO: (SEQ ID NO: . e ERG19 52) 53) . ** O marcador HISMX em pAM330 originado a partir do pFA6a- HISMX6-PGAL1 conforme descrito por van Dijken ET AL. ((2000) Enzyme Microb.

Technol. 2619 à 10): 705 a 7214). O plasmídeo pAM584 foi gerado inserindo-se o fragmento de DNA GAL7º º *2º HPH-GAL17? $ 25º no vetor de clonagem TOPO ZERO Blunt II (Invitrogen, Carlsbad, CA). O fragmento de DNA GAL7º ? *º*-HPH-GAL1*6?? ? ?5º? compreende um segmento do ORF do gene GAL7 da Saccharomyces cerevisiae (posições de nucleotídeo GAL7 4 a 1021) (GAL7º **%), o cassete de resistência a higromicina (HPH) e um segmento da região não traduzida 3' (UTR) do gene GALI da Saccharomyces cerevisiae (posição de nucleotídeos GAL1 1637 a 2587). O fragmento de DNA foi gerado por amplificação por PCR como esquematizado na Tabela 6. A Figura 7F mostra um mapa e à

SEQ ID NO: 102 a sequência de nucleotídeo do fragmento de DNA GAL7! * "Cl. upu-GAnLÇ 1997 a 2597, Tabela 6 - Amplificações por PCR realizadas para gerar PAM495 Sessão Modelo Iniciador 1 Iniciador 2 Produto de de PCR PCR 1 100 ng de DNA 91-014- 91-014- RAD7! a a02% genômico Y002 CPK236-G CPK237-G (SEQ ID NO: (SEQ ID NO: 126) 127) 951-014- 91-014- GAL1*67 . CPK232-G CPK233-G eSom (SRQ 1D NO: (SEO 1D NO: - 124) 125) õ 100 ng de DNA 91-014- 91-014- HPH ê de plasmídeo CPK231-G CPK238-G PAM330** (SEQ ID NO: (SEQ ID NO: 123) 128) 2 100 ng cada de 91-014- 91-014- GAL7' º 102 produtos de CPK231-G CPK236-G - HPH PCR GAL7º º *ºº (SEQ ID NO: (SEQ ID NO: e HPH 123) 126) 3 100 ng cada de 91-014- 91-014- GAL1*S” , produtos de CPK233-G CPK236-G 2587 — Gan7i PCR GALI”º” º (SEQ ID NO: (SEQ ID NO: º** - HPH ** e GAL? 619% 125) 126) - HPH ** O plasmídeo pAM547 foi gerado sinteticamente e compreende o cassete HPH, que consiste da sequência de codificação para a higromicina B fosfotransferase de Escherichia coli flanqueada pelo promotor e terminador do gene Tefl de Kluyveromyces lactis.

O cassete integração natA-Pergs* º “** foi gerado emplificando-se por PCR oO marcador nata usando Os iniciadores PW287-002-CPK1217 (SEQ ID NO: 104) e DE PW91- 027-CPK262-G (SEQ ID NO: 99) e usando o DNA de plasmídeo que compreende o promotor TEFI e o terminator do Kluyveromyces Jactis (acesso do GenBank CR382122 REGIONS:788874..789380 e 787141..787496, respectivamente) e o marcador de resistência nat. Em adição, o promotor do gene CTR3 gene da Saccharomyces cerevisiae foi amplificado por PCR a partir do DNA genômico Y002 das posições -1 a - 734 usando os iniciadores PW287- 002-CPK1232 (SEQ ID NO: 200) e DE PW91-027-CPIKISI-G (SEO ID NO: 101). Os 2 produtos q de PCR foram unidos em uma reação de PCR secundária usando e 25 ng de cada um dos fragmentos de PCR purificados em gel e os iniciadores PW287-002-CPK1217 e PW287- 002-CPK1232, que rende o cassete de integração natA-Perga *?º PA Os cassetes de integração recombinante adicionais foram gerados unindo-se os RABits. Os RABits foram gerados inserindo-se os fragmentos de DNA de interesse (MULEsS) no vetor de Entrada pMULE.

O vetor de Entrada pMULE foi amplificado por PCR usando os iniciadores Kl 62 (SEQ ID NO: 73) e Kl 63 (SEQ ID NO: 74) e o vetor de Entrada pRYSE 8 (SEQ ID NO: 14) como modelo. A mistura de reação foi separada por eletroforese emgel ea cadeia principal do vetor de aproximadamente 2,2 kb foi purificado em gel. Um fragmento de DNA que compreende a sequência de codificação lacZ foi gerado digerindo-se por completo o vetor de Entrada pRYSE 8 usando a enzima de restrição Schl, inativando por calor a enzima (20 min. a 65ºC), separando a mistura de reação por eletroforese em gel, e purifiícando em gel o fragmento de DNA de aproximadamente O,5 kb, O fragmento de DNA que compreende a sequência de codificação lacZ foi ligado com a cadeia principal do vetor purificada, rendendo o vetor de Entrada pMULE (veja a Figura 8 para um mapa de plasmídeo). Os MULEs foram amplificados PCR usando modelos e iniciadores como esquematizado na Tabela 7. As 4o amplificações por PCR foram feitas usando à polimerase de DNA Phusion (New England Biolabs, Ipswich, MA) conforme pelo protocolo sugerido do fabricante.

Tabela 7 - MULESs amplificados x.

MULE Iniciadores Modelo Tamanho É (bp) .- 5'ERG20- YD-198-75A (SEQ ID pAM489 1.012 pGAL1/10 NO: 94) YD-198-75B (SEQ ID NO: 95) mIS2081 YD-198-75F (SEQ ID Genetrix2081 1.836 NO: 96) YD-198-75H (SEQ ID NO: 98) mIS2081T YD-198-75G (SEQ ID Genetrix2081 1.668 NO: 97) YD-198-75H (SEQ ID NO: 98) tTDH3 RYSE 4 (SEQ ID NO: RABite63*+ 311 77) RYSE 7 (SEQ ID NO:

78) Hyg YD-198-75L (SEQ ID RABit21* 1.962 NO: 105) YD-198-75M (SEQ ID NO: 106) TRPL YD-198-75N (SEQ ID pAM489 S86 NO: 107) YD-198-750 (SEQ ID NO: 108) * RABit21 compreende a SEQ ID NO: 15 e RABit63 compreende a SEQ ID NO: 16. Os RABits foram gerados inserindo-se os MULEs no - vetor de Entrada pMULE.

As reações de PCR separadas por SR eletroforese em gel, os MULEs foram purificados em gel, os . 5 MULES purificados foram tratados com quinase de polinucleotídeo T4 (PNK) (New England Biolabs, Ipswich, MA) conforme pelo protocolo sugerido do fabricante e a PNK foi inativada por calor a 65ºC por 20 minutos.

O vetor de Entrada pMULE foi digerido por completo usando a enzima de restrição Schl, as cadeias principais do vetor de Entrada PMULE de aproximadamente 2,2 Kb (sem Jaca) foram purificadas em gel, a cadeia principal do vetor de Entrada PpMULE foi tratada com Fosfatase Antártica (New England Biolabs, Ipswich, MA) e a fosfatase foi inativada por calor à 65º por 20 minutos.

À cadeia principal do vetor de Entrada PpMULE foi ligada com cada um dos MULES amplificados, rendendo 05 RaARits, Os RABits a serem unidos (Tabela 8) foram postos juntos em um tubo (333 fmole de cada RABIt) e digeridos por completo usando a enzima de restrição Lou! (Fermentas, Glen Burnie, MD). A enzima de restrição foi inativada por calor por 20 minutas à G65ºC, às “eações de digestão do RABIt foram divididas em três reações de 30 ul; água, tampão, dnNTPs e polimerase de DNA foram adicionados para cada mistura de reação e uma primeira sessão de amplificação por PCR foi iniciada. As amostras foram postas no gelo, 0,5 uM de cada iniciador terminal (Tabela 8) foi adicionado às misturas de reação e uma segunda sessão de amplificação por PCR foi realizada. As três misturas de reação de PCR foram combinadas em um tubo, as misturas de reação foram separadas por eletroforese em gel e os produtos de PCR foram purificados em gel. A Figura 7G mostra um mapa dos . cassetes de integração. : Tabela 8 - Amplificação de Cassetes de Integração H Cassetes — RABits a serem combinados Iniciadores de Terminais para 2º Integração sessão de amplificação Dor

PCR 100280 5' ERG20-pGAL1/10 - mIS2081 - YD-l198-75A (SEQ ID tTDH3 - Hyg - TRP1 NO: 94) 100281 5' ERG20-pGAL1/10 - mIS2081T - YD-l98-750 (SEQ ID tTDH3 - Hyg - TRP1 NO: 108) A primeira sessão de amplificação por PCR foi realizada conforme segue: um ciclo de desnaturação a 98ºC por 2 minutos; 5 ciclos de desnaturação a 98ºC por 30 segundos e recozimento/extensão a 72ºC por 30 segundos por quilobase de produto de PCR. A segunda seção de amplificação por PCR foi realizada conforme segue: um ciclo de desnaturação a 98ºC por 2 minutos; 35 sessões de desnaturação a 98ºC por 12 segundos e recozimento/extensão a 72ºC por 20 segundos por quilobase de produto de PCR; um ciclo de extensão final a 72ºC por 7 minutos; e uma manutenção final a 4ºC.

Exemplo 3 Este exemplo descreve os métodos para gerar cepas de Saccharomyces cerevisiae que expressam isopreno sintase heterólogas.

As cepas de Saccharomyces cerevisiae CEN.PK2-1C (Y002) (MATA; ura3-52; trpl-289; Ieu2-3,112; his3A1l ; MAL2- 8C; SUC2) e CEN.PK2-1D (Y003) (MATalpha; ura3-52; trpl-289,; Ieu2-3,112; his3Al ; MAL2-8C; SUC2) (van Dijken et al. (2000) Enzyme Microb. Technol. 26(9-10):706 a y14) foram e 10 preparadas por introdução dos genes de via do MEV ? induzíveis substituindo-se o promotor ERG9 pelo promotor : MET3 Saccharomyces cerevisiae, e o ORF ADEl pelo gene LEU2 Candida glabrata (CgLEU2). Isto foi feito amplificando-se por PCR a região KanMX-PMET3 do vetor pAM328 (SEQ ID NO: 17) usando os iniciadores 50-56-pwl00-G (SEQ ID NO: 19) e 50-56-pwl01-G (SEQ ID NO: 20), que incluem 45 pares de base de homologia para o promotor ERG9 nativo, transformando 10 vg do produto PCR resultante em células YO002 de Y003 de crescimento “exponencial usando 40% de peso/peso de Polietileno Glicol 3350 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), 100 mM de Acetato de (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) e 10 ug de DNA de Esperma de Salmão (invitrogen Corp., Carlisbad, CA), e incubando as células a 30ºC por 30 minutos seguido por choque térmico a 42ºC por 30 minutos (Schiestl and Gietz.

(1989) Curr. Genet. 16, 339-346). Recombinações positivas foram identificadas por sua habilidade de crescer em meio rico que contém 0,5 pa/ml de Cenetícina (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA), e colônias selecionadas foram confirmadas por diagnostico de PCR.

Aos clones resultantes foram dadas as designações Y93 (MAT A) e Y94 (MAT alfa). O lócus genético CgLEU2 de 3,5 kb foi então amplificado a partir do DNA genômico da Candida glabrata (ATCO, Manassas, VA) usando os iniciadores 61-67- CPK066-G (SEQ ID NO: 71) e 61- 67-CPK0657-G (SEO ID NO: 72), que contém 50 pares de base de momologia flanqueada do ORF ADE1I, e 10 ug do produto de PRC 140 resultante foram transformados em células Y93 e Y94 de crescimento exponencial, recombinantes positivos foram selecionados para crescimento na ausência de suplementação de leucina e aos clones selecionados foram dadas as e. designações Y 176 (MATA) e Y177 (MAT alfa). : 15 A cepa Y188 foi gerada digerindo-se 2 pg de DNA : de plasmídeo pAM491 e DpAM495 por completo usando endonuclease de restrição Pmel (New England Biolabs, Beverly, MA), e introduzindo a inserção de DNA purificado nas células Y176 de crescimento exponencial. os recombinantes positivos foram selecionados por crescimento em meio sem uracila e histidina e a integração no lócus genético correto foi confirmada por diagnóstico de PCR.

A cepa Y189 foi gerada digerindo-se 2 ug DNA de plasmídeo pAM489 e pAM497 plasmídeo DNA por completo usando endonuclease de restrição Pmel, e introduzindo a inserção de DNA purificado nas células Yl177 de crescimento exponencial.

Os recombinantes positivos foram selecionados por crescimento em meio sem triptofano e histidina e a integração no lócus genético correto foi confirmada por diagnóstico de PCR.

A cepa v238 foi gerada misturando-se aproximadamente 1 X 10º células das cepas VISA e VY189 em uma placa média YPD por é horas à temperatura ambiente para permitir a combinação e disposição em placa da cultura de célnlia misturada para meio sem histidina, uracila e triptofano para selecionar para crescimento de células diplóides, digerindo 2 pg de DNA de plasmídeo pAM493 por completo usando a endonuclease de restrição Pmel, e introduzindo a inserção de DNA purificada nas células diplóides de crescimento exponencial. Os recombinantes positivos foram selecionados por crescimento em meio sem adenina e a integração no lócus genético correto foi confirmada por diagnóstico de PCR.

1 As cepas Y210 (Mat A) e Y211 (MAT alfa) foram : 15 geradas esporulando-se a cepa Y238 em 2% de Acetato de : Potássio e 0,02% de meio líquido de Rafinose, isolando aproximadamente — 200 tétrades genéticas usando um micromanipulador Singer Instruments série MSMSOO (Singer Instrument LTD, Somerset, UK), identificando isolados genéticos independentes que contêm o complemento apropriado de material genético introduzido por sua habilidade de crescimento na ausência de adenina, histidina, uracila e triptofano e confirmando a integração de todos Os DNAS introduzidos por diagnostico de PCR.

A Cepa Y258 foi gerada transformando-se a cepa N211 com o DNA de plasmídeo paAM40ÕA4, Transformantes de célula hospedeira foram selecionados em meios definidos sintéticos, que contêm 2% de glicose e todos os aminoácidos exceto lecina (SM-glu) . As colônias únicas foram transferidas para ampolas de cultura que contêm 5 mL de líquido SM-glu sem leucina, e as culturas foram incubadas por agitação 30ºC até que o crescimento alcançou a fase estacionaria. As células foram armazenadas a -80ºC em ampolas criogênicas em 1 mL de alíquotas congeladas feitas de 400 ul 50% de glicerol esterilizado e 600 ul de cultura líquida.

As cepas Y225 (MAT A) e Y227 (MAT alfa) foram geradas transformando-se às células Y210 e Y211 de crescimento exponencial, respectivamente, com 2 ug de paAM426 (SEQ ID NO: 18), que compreende m promotor GAL1 promoter vinculado de maneira operável à sequência de codificação de um gene da amorfa-4,11-dieno sintase que é otimizado por códon para expressão na Saccharomyces ." cerevisiae (Merke et al. (2000) Ach. Biochem. Biophys. 381 < 15 : 173 à 180). Transformantes de cêálula hospedeira foram ; selecionados em meios definidos sintéticos completos sem leucina.

A Cepa Y337 foi gerada a partir da cepa Y227 tornando a cepa incapaz de catabolizar galactose. Para esse fim, o DNA de plasmídeo pAM584 foi digerido por completo usando endonuclease de restrição Pmel, e a inserção de DNA purificada GAL7º º *ººº-HPH- GAL16?? 2? foi introduzida nas células Y227 de crescimento exponencial. Os recombinantes positivos foram selecionados por crescimento em meio sólido sem adenina, leucina, lisina, histiídina, metionina, uracila e triptofano e que contêm 900 upg/mL de higromicina B (Sigma, St. Louis, MO). A integração no lócus genético correto foi confirmada por diagnostico de PCR e testando-se a cepa por inabilidade de usar galactose como uma fonte de carbono.

Cepa YE6l5 foi gerada a partir da cepa Y337 substituindo-se a quadro de leitura aberto URA3 pelo quadro de leitura aberto hisc da Salmonella 5p.. Um fragmento de DNA que compreende o quadro de leitura aberto hisG foi Ss amplifícado por PCR do paMS40 usando os iniciadores 100- 150-KB034-G (SEQ ID NO: 109) e 100-150-KB039-G (SEQ ID NO: 110), e o fragmento de DNA purificado foi introduzido nas células Y337 de crescimento exponencial. Os recombinantes positivos foram selecionados por sua habilidade de crescimento em meio que contém ácido 5-fluorótico e por sua inabilidade de crescer em meio sem uracila. A integração no lócus genético correto foi confirmada por diagnostico de PCR. .. A Cepa YI775 foi gerada a partir da cepa Y61l5 T 15 substituindo-se o marcador kanMX pelo marcador URA3. Um : fragmento de DNA que encodifica o marcador auxotrófico URA3 da S. cerevisiae foi amplificado por PCR a partir do pAM64 (SEQ ID NO: 103) usando os iniciadores PW-191-046-CPK1212-G (SEQ ID NO: 11 1) e PW-191-046-CPK1213-G (SEQ ID NO: 112), eo fragmento de DNA purificado foi introduzido nas células Y615 de crescimento exponencial. Os recombinantes positivos foram selecionados por crescimento em meio sem adenina, leucina, lisina, histidina, metionina, uracila e triptofano. A integração no lócus genético correto foi confirmada por diagnostico de PCR.

A Cepa ViI79! foi gerada a partir da cepa v1775 restaurando-se o lócus ERG9. Um fragmento de DNA que compreende o quadro de leitura aberto ERG9 foi ampiifiícado por PCR a partir do DNA genômico Y002 usando os iniciadores so PW-2191-015-CPK947-G (SEO ID NO: 2113) e PW-191-015-CPK950-6

(SEQ ID NO: 114), e o fragmento de DNA purificado foi introduzido nas células Y1775 de crescimento exponencial. Os recombinantes positivos foram selecionados por sua habilidade de crescimento em meio que contém ácido 5- fluorótico e sua inabilidade de crescer em meio sem uracila. A integração no lócus genético correto foi confirmada por diagnostico de PCR. A Cepa Y1856 foi gerada a partir da cepa Y1791 restaurando-se os lócus GAL1, GAL10 e GAL7. Um fragmento de DNA que compreende a região genômica GALI, GALIO e GALT7 foi amplificado por PCR a partir do DNA genômico Y002 usando os iniciadores PW-91-093 - CPK453-G (SEQ ID NO: 115) e PW-091- 144-CPK689-G (SEQ ID NO: 116), e o fragmento de DNA ve purificado foi introduzido nas células Y1791 de crescimento 7 15 exponencial. Os recombinantes positivos foram selecionados < por crescimento em meio que contém 20 9/1 de glacatose e sua inabilidade de crescer em meio que contém 900 pg/mL de higromicina B.

A cepa Yl 857 foi gerada a partir da cepa Yl 856 20 pelo rompimento do lócus Peoario- ERG20. Um fragmento de DNA que encodifica o marcador auxotrófico de S. cerevisiae URA3 foi amplificado por PCR a partir de pAM64 (SEQI ID NO: 130) pelo uso de iniciadores PW-287-002-CPKl215-G (SEQ ID NO: 117) e PW-287-002-CPK1I216-G (SEQ ID NO: 1 18), e oO fragmento de DNA purificado foi introduzido nas células 856 cultivadas exponencialmente, Os xrecombinantes positivos foram selecionados por crescimento em meio sem adenina, leucina, 2isina, histidina, metionina, uracila e triptofano. A integração no lócus genético correto foi confirmada pelo diagnóstico de PCR.

A cepa Vl 895 foi gerada à partir da cepa Yl 857 pela cura da cepa a partir de pAM426. A cepa Yl 857 foi propagada em um meio de Extrato de Levedura-Peptona- Dextrose (YPD) rico que contém 0,5% de leucina (p/vi por 5 dias. A cada 12 horas, novo YPD com 0,5% de LEU era inoculado a um ODskowo de 0,05 que utilizava as 12 horas de crescimento antecedentes. Após 5 dias, as células foram plaqueadas em meio YPD Agar com 0,5% de leucina e incubadas a 30ºC por 2 dias. As células curadas foram identificadas 109 por sua habilidade de crescer em meio minimo que contém dleucina e suas inabilidade de crescer em meio em sem leucina.

A cepa Y736 foi gerada a partir da cepa Y227 pela be substituição do marcador URA3 com um marcador hisG. Para a 15 esse fim, o marcador hisG foi amplificado por PCR pelo uso É de iniciadores KB34 (SEQ ID NO: 75) e KB39 (SEQ ID NO: 76) e plasmídeo pAMB40 como modelo. As células Y211 de crescimento exponencial foram transformadas com a mistura PCR e foram, então, plaqueadas em YPD durante uma noite. As células hospedeiras transformadas foram selecionadas por células de replicação em placa a partir das placas YPD em meios sólidos de Meio Sintético Completo (CSM) sem metionina e leucina e que contém 0,1% 5-FOA e 0,1 mg/ml de uracila.

A cepa Y737 foi gerada a partir da cepa Y736 pela transformação de células em crescimento exponencial com PpAM940, e seleção de transformantes de célula hospedeira em meios sólidos de CSM sem leucina e uracila.

A cepa Y846 foi gerada a partir da cepa Y737 pela cura da cepa de pAM426. Para essa finalidade, a cepa Y737 foi cultivada por 3 noites sucessivas em meios ricos suplementados com 6x a concentração normal de leucina, sendo diluída a cada manhã 100x. As células foram, então, plaqueadas em colônias únicas bem separadas em meios ricos e replicadas em placas em meio mínimo sem leucina. As colônias cultivadas em meio rico, mas não crescem na ausência de leucina foram coletadas, cultivadas e testadas por PCR para verificar que o plasmídeo não estava mais presente. Tal colônia positiva foi estocada como Y846. ao A cepa Yl 858 foi gerada a partir da cepa Yl 895 por expressão heteróloga de uma sintase de isopreno. Para essa finalidade, células v1 895 de crescimento exponencial foram transformadas com expressão de plasmídeo pAM1547. As o células hospedeiras transformadas foram selecionadas em CSM 3 15 com Agar sem metionina e leucina e que contém 2% de : glicose.

A cepa Yl 859 foi gerada a partir da cepa Yl 895 por expressão heteróloga de uma sintase de isopreno. Para essa finalidade, as células Yl 895 de crescimento exponencial foram transformadas com expressão de plasmídeo PAM1548. As células hospedeiras transformadas foram selecionadas em CSM com Agar sem metionina e leucina e que contém 2% de glicose.

A cepa Yl 860 foi gerada a partir da cepa Yl 895 por expressão heteróloga de uma sintase de isopreno. Para essa finalidade, às células *Yvl 895 de crescimento exponencial foram transformadas com expressão de plasmídeo paMI549. As células hospedeiras transformadas foram selecionadas em CSM com Agar sem metionina e leucina e que contém 2% de glicose.

$s5 A cepa Yl 861 foi gerada a partir da cepa Yl 895 por expressão heteróloga de uma sintase de isopreno. Para exsa finalidade, as células Y 1895 de crescimento exponencial foram transformadas com expressão de plasmídeo paMIS5O0. As células hospedeiras transformadas foram selecionadas em CSM com Agar sem metionina e leucina e que contém 2% de glicose. AÀ cepa vi 713 foi gerada à partir da cepa VYSAE pela substituição do gene ERG30 com à sequência de códigos por uma isopreno sintase. Para essa finalidade, células Y846 de crescimento exponencial foram transformadas com cassete de integração 100280. As células hospedeiras transformadas foram selecionadas em YPD com Agar que contém al 2% de glicose e 300 [ng/ml] de higromicina B (A.G.

7 15 Scientific, San Diego, CA).

A cepa Yl 714 foi gerada a partir da cepa Y846 pela substituição do gene ERG290O com uma sequência de códigos para uma isopreno sintase truncada. Para essa finalidade, as células Y846 de crescimento exponencial foram transformadas com cassete de integração 100281. As células hospedeiras transformadas foram selecionadas em YPD com Agar que contém 2% glicose e 300 [ug/ml de higromicina B (A.G. Scientific, San Diego, CA).

A cepa Yl 732 foi gerada a partir da cepa Y846 por expressão heteróloga de uma isopreno sintase. Para essa finalidade, as células Y846 de crescimento exponencial foram transformadas com expressão de plasmídeo pAM1549. As células hospedeiras transformadas foram selecionadas em CSM com Agar sem metionina e leucina e que contém 2% de 80 glicose.

A cepa Yl 733 foi gerada a partir da cepa Y846 por expressão heteróloga de uma isopreno sintase truncada.

Para essa finalidade, as células Y846 de crescimento exponencial foram transformadas com expressão de plasmídeo S pAMISSO.

As células hospedeiras transformadas foram selecionadas em CSM com Agar sem metionina e leucina e que contém 2% de glicose.

A cepa yl 837 foi gerada pela transformação células Yl 713 de crescimento exponencial com expressão de plasmídeo pAMI549. As células hospedeiras transformadas foram selecionadas em CSM com Agar sem metionina e leucina e que contém 2% de glicose.

A cepa Y 1838 foi gerada pela transformação de - células Y 1714 de crescimento exponencial com expressão de : 15 plasmídeo pAMIS5S0. As células hospedeiras transformadas f foram selecionadas em CSM com Agar sem metionina e leucina e que contém 2% de glicose.

A cepa 1907 foi gerada a partir da cepa Y 1850 pela substituição do promotor ERG20 com o marcador de resistência de noureeothrícin (nata) e o promotor repressível. de cobre do gene CTR3 do Saccharomyces cerevisiae.

Para essa finalidade, células Yl 860 que de crescimento exponencial foram transformadas com 200 ug do cassete de integração natA-Pcrrai-1 a -734. OS transformantes de células hospedeiras forma selecionados pelo crescimento em meios de YPD ricos que contém 300 ug/mL de nourseothricin (Werner Bio Agents, Jena, Alemanha). Exemplo 4 Esse exemplo descreve métodos para produzir isopreno em cepas hospedeiras de Saccharonyees cerevisiae,

As colônias únicas de transformantes de célula hospedeira foram transferidas para ampoilas de cultura que contém 5 ml, de Meio de Semente de Pássaro que contém 0,25 pM de CuSO4. No dia seguinte, 20 ml. de Meio de Produção de Pássaro que contém 1,8% de galactose, 0,2% de glicose e 32 uM de CuSO4, com 4 mL de isopropilmiristato, foi inoculado com o transformante de célula hospedeira Yl 858, Y1859, yT1860, ou Y1861 a um ODS0O0 de 0,05. Do mesmo modo, 20 mb de Meio de Produção de Pássaro que contém 1,8% de galactose e 0,2% de glicose, con 4 mL de isopropilmiristato, foi inoculado com isolados 3, 6, ou 9 de transformante de célula hospedeira vY1 907 à um ODS00 de 0,05. À cultura Y1907, 0,25 1uM de CuSO4, 50 uM de CuSO4 ou 150 UM de CuSO4 cn foi adicionado. Os frascos agitados foram vedados para ô 15 cultivo anaeróbico e incubados a 30ºC em um agitador £ rotativo a 200 rpm.

Após 72 horas de cultivo, as culturas foram testadas em ensaio para O crescimento celular. AO mesmo tempo, 200 pL de isopropilmiristato foi removido de cada frasco e foram injetados diretamente em um gás Agilent 7980 equipado com cromatógrafo com um detector de ionização de chama. Para acelerar o tempo de execução, o programa de temperatura e a matriz de coluna foram modificadas para atingir uma resolução ideal e O menor tempo de execução total (15.0 minutos). Casa amostra de 2 pl foi dividida em 10:1 e foi separada pelo uso de uma sílica fundida Varian CP-PoraBond PLOT U (25 m x 0,32 mm x 7 um; comprimento x largura x espessura de filme) coluna com hidrogênio como o gás de carreira. O programa de temperatura para a análise 20 foi o seguinte: a coluna foi inicialmente mantida a 100ºC por 1 minuto, seguida por um gradienta de temperatura de 10ºC/min para um temperatura de 14ºC, seguida por um gradiente de temperatura de 40ºC/min para uma temperatura de 25ºC, seguida pela retenção da coluna a 25ºC por 6,5 minutos. Sob essas condições, O isopreno elui em 5,8 minutos.

a

Claims

REIVINDICAÇÕES di. Método de purificação de isopreno caracterizado pelo fato de compreender: a. obter uma primeira composição gasosa que compreende isopreno e água, sendo que a composição gasosa compreende 1 parte por milhão ou menos de C2-C5 alcino; b. fluir a primeira composição gasosa através de um primeiro resfriador em que o primeiro resfriador tem uma temperatura entre cerca de 10ºC e carca de -15ºC, o que resulta em uma segunda composição gasosa e sendo que a segunda composição gasosa compreende menos água do que a primeira composição gasosa; c. fluir a segunda composição gasosa através de um segundo resfriador sendo que o segundo resfriador tem % 15 uma temperatura abaixo de -35ºC; e r. d. coletar a composição de isopreno líquido resultante.
2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a água está presente em uma primeira composição gasosa em uma quantidade que é maior do que 70% de sua quantidade saturada.
3. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a primeira composição de isopreno gasoso compreende adicionalmente dióxido de carbono em uma quantidade entre cerca de 0,1% e cerda de 35% em volume.
4, Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a primeira composição gasosa compreende adicionalmente 1 parte por milhão ou menos de ciclopentadieno, piperileno e 1 ,4-pentadieno.
5. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o primeiro resfriador & resfriado pelo uso de um sistema de refrigeração de propileno.
Ss 6. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o primeiro resfriador & resfriado pelo uso de um sistema de refrigeração de amônia.
7. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a composição gasosa é escoada através de um secador antes de fluir através do primeiro resfriador.
8. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a composição gasosa éÉ escoada através de um secador após fluir através do É 15 primeiro resfriador.
" 9. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o segundo resfriador tem uma temperatura de cerca de -60ºC a cerca de -85ºC.
10. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o segundo resfriador tem uma temperatura de menos do que cerca de -65ºC.
11. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o segundo resfriador é resfriado pelo uso de um sistema de refrigeração de etileno.
12. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de compreender adicionalmente nitrogênio que remove a composição de isopreno líquido.
13. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de compreende adicionalmente passar sa a primeira composição gasosa através de uma membrana de zeólito modificada para separar impurezas de hidrocarboneto do isopreno.
de. Método, de acordo com à reivindicação 1, caracterizado pelo fato de compreende adicionalmente passar a segunda composição gasosa através de uma membrana de zeólito modificada para separar impurezas de hidrocarboneto do isopreno.
15. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de compreende adicionalmente passar a composição de isopreno líquido através de uma membrana de zeólito modificada para separar impurezas de hidrocarboneto do isopreno.
16. Método para produzir isopreno caracterizado : 15 pelo fato de compreender: - a. cultivar uma pluralidade de células hospedeiras capazes de produzir isopreno; b. formar uma primeira composição gasosa que compreende isopreno e S9ua, sendo que à água astá presente em uma quantidade maior do que cerca de 70% de sua quantidade saturada; c. submeter a primeira composição gasosa a um primeira etapa de resfriamento pela qual, substancialmente, toda a água é removida da primeira composição gasosa, o que resulta em uma segunda composição gasosa; e d. submeter a segunda composição gasosa a uma segunda etapa de resfriamento pela qual uma composição de dsopreno líquido é coletada.
17. Método, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de compreende adicionalmente nitrogênio que separa a composição de isopreno líquido.
18. Método, de acordo com à reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que o isopreno está presente em Uma quantidade que é cerca de 0,1% e cerca de 15% em volume na primeira composição gasosa.
19. Método, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que a primeira composição gasosa compreende adicionalmente dióxido de carbono em uma quantidade entre cerca de 1% e cerca de 35% em volume.
20. Método, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que a primeira etapa de resfriamento resfria a primeira composição gasosa até uma : 15 temperatura entre cerca de 10ºC e cerca de -15ºC,.
& 21. Método, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que a primeira etapa de resfriamento é restriada pelo uso de um sistema de refrigeração de propileno.
22. Método, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que a primeira etapa de resfriamento é resfriada por um sistema de refrigeração de amônia.
23. Método, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que a segunda etapa de resfriamento resfria a segunda composição gasosa até uma temperatura entre cerca de -60ºC e cerca de -85ºC.
24. Método, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que a segunda etapa de resfriamento é resfriada pelo uso de um sistema de refrigeração de etileno.
25. Método, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que as células hospedeiras são 5 selecionadas a partir dos gêneros Bacillus, Escherichia ou Acinetobacter.
26. Método, de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que as células hospedeiras são Escherichia coli.
27. Método, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que as células hospedeiras são levedura.
28. Método, de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de que as células hospedeiras são : 15 Saccharomyces cerevisie.
x 29. Composição de isopreno gasoso, caracterizada pelo fato de compreender isopreno e água, sendo que a água está presente em uma quantidade que é maior do que cerca de 70% de sua quantidade saturada e sendo que a composição de isopreno gasoso compreende 1 parte por milhão ou menos do que os C2-C5 alcinos.
30. Composição, de acordo com a reivindicação 29, caracterizada pelo fato de que O isopreno está presente em uma quantidade entre cerca de 0,1% e cerca de 15% em volume.
31. Composição, de acordo com a reivindicação 29, caracterizada pelo fato de compreender adicionalmente dióxido de carbono em uma quantidade entre cerca de 1% e cerca de 35% em volume.
32. Composição de isopreno gasoso, de acordo com a reivindicação 29, caracterizada pelo fato de que oO isopreno está presente em uma quantidade entre cerca de 0,1% e cerca de 15% em volume e a água está presente em uma quantidade que é maior do que cerca de 90% de sua quantidade saturada e sendo que a composição de isopreno gasoso compreende adicionalmente dióxido de carbono em uma quantidade entre cerca de 1% e cerca de 35% em volume e nitrogênio em uma quantidade entre cerca de 50% e cerca de 75% em volume.
33. Composição de isopreno líquido caracterizada pelo fato de compreender, pelo menos, 65% de isopreno por peso e sendo que a composição de isopreno compreende 1 parte por milhio ou menos de C2-C5 alcinos, E 15 ciclopentadieno, piperileno e 1 ,4-pentadieno.
- 34. Composição, de acordo com a reivindicação 33, sendo Que a Composição é caracterizada pelo fato de compreender, pelo menos, 95% de isopreno por peso.
35. Composição, de acordo com a reivindicação 33, sendo que à composição é caracterizada pelo fato de compreender, pelo menos, 99% de isopreno por peso.
36. Composição, de acordo com a reivindicação 33, sendo que a composição é caracterizada pelo fato de compreender, pelo menos, 99,5% de isopreno por peso.
37. Composição, de acordo com a reivindicação 33, caracterizada pelo fato de que a composição de isopreno líquido compreende adicionalmente dióxido de carbono dissolvido que está presente em uma quantidade maior do que cerca de 0,01% por peso.
38. Composição, de acordo com a reivindicação 33, caracterizada pelo fato de que a composição de isopreno líquido compreende adicionalmente dióxido de carbono dissolvido que está presente em uma quantidade maior do que cerca de 0,1% por peso.
39. Método para produzir isopreno caracterizado pelo fato de compreender: a. estabelecer o contato com uma pluralidade de células hospedeiras capazes de produzir isopreno em um meio aquoso, sendo que O meio aquoso está em contato com um líquido orgânico imiscivel e O meio aquoso, as células hospedeiras e oO líquido orgânico imiscível estão em um recipiente fechado; e b. cultivar as células hospedeiras no meio aquoso : 15 pelo qual as células hospedeiras produzem isopreno e O 7 dsopreno é capturado no líquido orgânico imiscível.
40. Método, de acordo com a reivindicação 39, caracterizado pelo fato de compreender adicionalmente quantificar a quantidade de isopreno no líquido orgânico dAmiscível.
41. Método, de acordo com a reivindicação 39, caracterizado pelo fato de compreender adicionalmente separar o líquido orgânico ámiscivel do meio aquoso e separar o isopreno do líquido orgânico imiscível.
42. Método, de acordo com a reivindicação 39, caracterizado pelo fato de que oO isopreno é separado do líquido orgânico pelo aquecimento do líquido orgânico até uma temperatura acima de 34ºC.
43. Método, de acordo com a reivindicação 39, caracterizado pelo fato de que as células hospedeiras são selecionadas a partir dos gêneros Bacillus, Escherichia ou Acinetobacter,
44, Método, de acordo com a reivindicação 43, caracterizado pelo fato de que as células hospedeiras são Ss Escherichia coli.
45. Método, de acordo com a reivindicação 39, caracterizado pelo fato de que as células hospedeiras são levedura.
46. Método, de acordo com a reivindicação 45, caracterizado pelo fato de que as células hospedeiras são Saccharomyces cerevisie.
47. Sistema de produção de isopreno, caracterizado pelo fato de compreender: a. um recipiente fechado; : 15 Db. um meio aquoso, dentro do recipiente, que z forma uma primeira fase; c. uma pluralidade de células hospedeiras, dentro do meio aquoso, capazes de fazer isopreno; e d. uma segunda fase de líquido orgânico, capaz de capturar o isopreno produzido pelas células hospedeiras, em contato com a primeira fase.
48. Sistema de produção de isopreno caracterizado pelo Fato de compreender: a. um biorreator capaz de cultivar uma pluralidade de células hospedeiras; b. um primeiro restriador e um tambor de vaporização operável conectado à corrente suspensa do biorreator, sendo que oO primeiro resfriador é capaz de operar em uma faixa de temperatura entre 10ºC e -15ºC; e

Ss c. um segundo resfríador e tambor de vaporização Operáveis conectados à corrente suspensa que saí do primeiro resfriador e do tambor de vaporização, sendo que o segundo restriador é capaz de Operar em uma temperatura abaixo de -35ºC.
49. Sistema de produção de isopreno, de acordo Com à reivindicação 48, caracterizado pelo fato de que O biorreator ter uma capacidade maior do que 100 litros.
50. Sistema de produção de isopreno, de acordo com a reivindicação 48, caracterizado pelo fato de que a corrente suspensa que sai do segundo resfriador e do tambor de vaporização é operável conectada à entrada da corrente de resfriamento do primeiro resfriador.
51. Sistema de produção de isopreno, de acordo & 15 com a reivindicação 48, caracterizado pelo fato de que o . sistema compreende adicionalmente um separador de nitrogênio operável conectado à corrente de fundo que sai do segundo resfriador e tambor de vaporização.
52. Sistema de produção de isopreno, de acordo com a reivindicação 48, caracterizado pelo fato de que O segundo resfriador é capaz de operar entre cerca de -65ºC e cerca de -85ºC.
53. Método de purificação de isopreno caracterizado pelo fato de compreender: a. obter uma primeira composição gasosa que compreende: i) isopreno em uma quantidade entre cerca de 0,1% e cerca de 15% em volume; di) dióxido de carbono em uma quantidade entre cerca de 0,04% e cerca de 35% em volume;

iii) oxigênio em uma quantidade entre cerca de 1% e cerca de 20% em volume; iv) nitrogênio em uma quantidade maior do que cerca de 50% em volume; Ss v) argônio em uma quantidade menor do que cerca de 0,9% em volume; vi) água em uma quantidade maior do que cerca de 70% de sua quantidade saturada; vii) 1 parte por milhão ou menos de C2-C5 alcino, do ciclopentadieno, piperileno e 1 ,4-pentadieno; e viii) etanol; b. fiuir à primeira composição gasosa através um primeiro resfriador e um tambor de vaporização operavelmente conectado, sendo que O primeiro resfriador É 15 tem uma temperatura de entre cerca de 10ºC e cerca de -15ºC . que, assim, resulta em uma segunda composição gasosa e sendo que a segunda composição gasosa compreende menos água do que a primeira composição gasosa; c. fluir a segunda composição gasosa através de uma segundo resfriador e tambor de vaporização operavelmente conectado, sendo que o segundo resfriador tem uma temperatura entre cerca de -35ºC e cerca de -85ºC; e d. coletar a composição de isopreno líquido resultante.
54. Método, de acordo com a reivindicação 53, caracterizado pelo fato de a primeira composição gasosa ser obtida pela cultura de uma pluralidade de celulas hospedeiras capazes de fazer isopreno.
55. Método, de acordo com a reivindicação 54, caracterizado pelo fato de que as células hospedeiras são levedura.
S6. Método, de acordo com a reivindicação 54, caracterizado pelo fato de que as células hospedeiras são Saccharomyces cerevisie.
57. Método, de acordo com a reivindicação 53, caracterizado pelo fato de a segunda composição gasosa resultante compreender menos de cerca de 3% por peso de áqua.
58. Método, de acordo com a reivindicação 53, caracterizado pelo fato de que a composição de isopreno líquido resultante compreende menos do que cerca de 1% por peso de água.
Ê 15 59. Método, de acordo com a reivindicação 53, à caracterizado pelo fato de que à composição de isopreno 2iquido resultante compreende menos do que cerca de 1% por peso de dióxido de carbono.
60. Método, de acordo com a reivindicação 53, caracterizado pelo fato de que a composição de isopreno líquido resultante compreende menos do que cerca de 1% por peso de nitrogênio.
61. Método, de acordo com a reivindicação 53, caracterizado pelo fato de que a composição de isopreno líquido resultante compreende: i) pelo menos 65% de isopreno por peso; e ii) menos do que 1% água por peso.
62. Método, de acordo com a reivindicação 53, caracterizado pelo fato de que a composição de isopreno líquido resultante compreende menos do que cerca de 1% por peso de etanol.
63. Método, de acordo com a reivindicação 53, caracterizado pelo fato de compreender adicionalmente nitrogênio que remove a composição de isopreno líquido.
64. Método, de acordo com a reivindicação 63, caracterizado pelo fato de que a composição de isopreno líquido compreende pelo menos 70% de isopreno por peso e menos do que 1% por peso de dióxido de carbono dissolvido.
65. Método, de acordo com a reivindicação 63, caracterizado pelo fato de que à composição de isopreno líquido compreende, pelo menos, 90% de isopreno por peso e menos do que 1% por peso de dióxido de carbono dissolvido.
66. Método, de acordo com a reivindicação 63, : 15 caracterizado pelo fato de que a composição de isopreno 2 líquido compreende, pelo menos, 95% de isopreno por peso e menos do que 1% por peso de dióxido de carbono dissolvido.
67. Método, de acordo com a reivindicação 63, caracterizado pelo fato de que a composição de isopreno líquido compreende, pelo menos, 99% de isopreno por peso e menos do que 0,05% por peso de dióxido de carbono dissolvido.