BRPI1009965B1 - METHOD FOR PRODUCTION OF ENVIRONMENTAL STRESS TOLERANT PLANTS, THEIR USES AND RECOMBINANT DNA VECTOR - Google Patents
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Abstract
MÉTODO PARA PRODUÇÃO DE PLANTAS TOLERANTES A ESTRESSES AMBIENTAIS, SEUS USOS E VETOR DE DNA RECOMBINANTE. As plantas são influenciadas por um grande número de fatores ambientais bióticos e abióticos e recorrentemente estresses abióticos são mais graves, afetando todas as funções da planta, resultando em redução do crescimento e da produtividade. Nesse sentido, a identificação e a compreensão dos mecanismos de tolerância abióticos são fundamentais no desenvolvimento de novas cultivares tolerantes à seca. Dessa forma, a presente invenção proporciona um método de produção de plantas que contém em suas células uma seqúência de nucleotídeos de cana-de-açúcar e a superexpressão desse gene leva a planta em questão à maior tolerância a estresses abióticos. De uma forma mais ampla, descreve-se um polinucleotídeo que codifica a proteína de cana-de-açúcar, o qual é expresso por um promotor e um terminador que funcionam em plantas. Verifica-se que este gene confere tolerância a diferentes estresses abióticos.METHOD FOR PRODUCTION OF ENVIRONMENTAL STRESS TOLERANT PLANTS, THEIR USES AND RECOMBINANT DNA VECTOR. Plants are influenced by a large number of biotic and abiotic environmental factors and recurrent abiotic stresses are more severe, affecting all plant functions, resulting in reduced growth and productivity. In this sense, the identification and understanding of abiotic tolerance mechanisms are fundamental in the development of new drought-tolerant cultivars. Thus, the present invention provides a method of producing plants that contain in their cells a sequence of sugarcane nucleotides and the overexpression of this gene leads the plant in question to greater tolerance to abiotic stresses. More broadly, a polynucleotide encoding sugar cane protein, which is expressed by a promoter and terminator that function in plants, is described. It is verified that this gene confers tolerance to different abiotic stresses.
Description
As plantas são influenciadas por um grande número de fatores ambientais, bióticos e abióticos e recorrentemente estresses abióticos, como seca, salinidade, temperatura, poluição, radiação e etc, são mais graves e afetam todas as funções da planta, resultando em redução do crescimento e da produtividade. Estima-se que esse tipo de estresse afete geralmente fatores fisiológicos, bioquímicos e os níveis morfológicos, podendo reduzir a produtividade em 50% e em alguns casos até 70%. Isso tem levado a esforços no entendimento da resposta das plantas a estresses.Plants are influenced by a large number of environmental, biotic and abiotic factors and recurrent abiotic stresses, such as drought, salinity, temperature, pollution, radiation, etc., are more severe and affect all plant functions, resulting in reduced growth and growth. of productivity. It is estimated that this type of stress generally affects physiological, biochemical and morphological levels, and can reduce productivity by 50% and in some cases up to 70%. This has led to efforts to understand the response of plants to stress.
Nesse sentido, a identificação e a compreensão dos mecanismos de tolerância abióticos são fundamentais no desenvolvimento de novas cultivares tolerantes a diferentes estresses abióticos. Dessa forma, a presente invenção descreve um método para produção de plantas transgênicas tolerantes a estresses ambientais graças à introdução de um vetor que compreende um gene que codifica nova proteína de cana-de-açúcar, de função até então desconhecida, além da construção do vetor e seus usos.In this sense, the identification and understanding of abiotic tolerance mechanisms are fundamental in the development of new cultivars tolerant to different abiotic stresses. Thus, the present invention describes a method for the production of transgenic plants tolerant to environmental stresses thanks to the introduction of a vector that comprises a gene that encodes a new sugarcane protein, of unknown function, in addition to the construction of the vector and its uses.
Um dos principais problemas na agricultura é a seca, que de longe é o estresse ambiental mais importante. Muitos esforços têm sido feitos para melhorar a produtividade das plantas sob condições limitantes de água. Nas ultimas décadas tem-se investido fortemente na produção de plantas transgênicas tolerantes a estresses, dentre os quais se destacam a seca e o estresse salino. Isso tem permitido compreender melhor as respostas fisiológicas e moleculares das plantas aos estresses, abrindo perspectivas de aumentar o rendimento em condições de estresses.One of the main problems in agriculture is drought, which is by far the most important environmental stress. Many efforts have been made to improve plant productivity under limiting water conditions. In recent decades, there has been a strong investment in the production of transgenic plants tolerant to stress, among which drought and saline stress stand out. This has allowed a better understanding of the physiological and molecular responses of plants to stress, opening perspectives to increase yield under stress conditions.
Dentre as tecnologias para produção de plantas tolerantes, a transformação por Agrobacterium (Hooykaas PJ, Schilperoort RA (1992) Agrobacterium and plant genetic engineering. Plant Mol Biol 19: 15-38; Barton KA, Chilton MD (1983) Agrobacterium Ti plasmids as vectors for plant genetic engineering. Methods Enzymol 101: 527-539), a transferência direta de genes em protoplastos (Gharti-Chhetri GB, Cherdshewasart W, Dewulf J, Paszkowski J, Jacobs M, et al. (1990) Hybrid genes in the analysis of transformation conditions. 3. Temporal/spatial fate of NPTII gene integration, its inheritance and factors affecting these processes in Nicotiana plumbaginifolia. Plant Mol Biol 14: 687-696; Lyznik LA, Peng JY, Hodges TK (1991) Simplified procedure for transient transformation of plant protoplasts using polyethylene glycol treatment. Biotechniques 10: 294-300; Rodenburg KW, de Groot MJ, Schilperoort RA, Hooykaas PJ (1989) Single-stranded DNA used as an efficient new vehicle for transformation of plant protoplasts. Plant Mol Biol 13: 711-719 e Ballas N, Zakai N, Loyter A (1987) Transient expression of the plasmid pCaMVCAT in plant protoplasts following transformation with polyethyleneglycol. Exp Cell Res 170: 228-234) e o bombardeamento de partículas (Klein TM, Wolf ED, Sanford JC (1987) High-velocity microprojectiles for delivering nucleic acids into living cells. Nature 327: 70-73) são as mais utilizadas.Among the technologies for the production of tolerant plants, transformation by Agrobacterium (Hooykaas PJ, Schilperoort RA (1992) Agrobacterium and plant genetic engineering. Plant Mol Biol 19: 15-38; Barton KA, Chilton MD (1983) Agrobacterium Ti plasmids as vectors for plant genetic engineering. Methods Enzymol 101: 527-539), direct gene transfer in protoplasts (Gharti-Chhetri GB, Cherdshewasart W, Dewulf J, Paszkowski J, Jacobs M, et al. (1990) Hybrid genes in the analysis of transformation conditions. 3. Temporal/spatial fate of NPTII gene integration, its inheritance and factors affecting these processes in Nicotiana plumbaginifolia. Plant Mol Biol 14: 687-696; Lyznik LA, Peng JY, Hodges TK (1991) Simplified procedure for transient Biotechniques 10: 294-300; Rodenburg KW, de Groot MJ, Schilperoort RA, Hooykaas PJ (1989) Single-stranded DNA used as an efficient new vehicle for transformation of plan t protoplasts. Plant Mol Biol 13: 711-719 and Ballas N, Zakai N, Loyter A (1987) Transient expression of the pCaMVCAT plasmid in plant protoplasts following transformation with polyethyleneglycol. Exp Cell Res 170: 228-234) and particle bombardment (Klein TM, Wolf ED, Sanford JC (1987) High-velocity microprojectiles for delivering nucleic acids into living cells. Nature 327: 70-73) are the most used.
Nos últimos anos tem-se obtido grande avanço nas tecnologias para a transformação de plantas e as pesquisas têm se voltado para a necessidade de desenvolver eficazes métodos de transformação genética das principais espécies de interesse experimental e econômico. A agrotransformação tem ganhado grande aceitação pela facilidade do método de transformação e a alta taxa de plantas transgênicas geradas a partir desse método. Por outro lado, o tabaco tem sido utilizado amplamente como ferramenta de transformação gênica pela facilidade de transformação e rápida obtenção de gerações transformadas. Desta forma, genes de diferentes espécies podem ser avaliados inicialmente em tabaco, pela facilidade e rapidez na produção e análise das plantas transgênicas. Isso tem ocorrido com genes de cereais, produtos hortícolas, plantas ornamentais, medicinais, árvores frutíferas, pastagens, dentre outros. Assim, embora o tabaco seja uma planta dicotiledônea, ele oferece evidência clara que genes de monocotiledôneas, como cana-de-açúcar, milho, trigo e arroz, possam conferir tolerância a estresses abióticos tanto em plantas monocotiledôneas como dicotiledôneas.In recent years, great advances have been made in technologies for plant transformation and research has focused on the need to develop effective methods of genetic transformation of the main species of experimental and economic interest. Agrotransformation has gained wide acceptance due to the ease of the transformation method and the high rate of transgenic plants generated from this method. On the other hand, tobacco has been widely used as a tool for gene transformation due to the ease of transformation and rapid obtaining of transformed generations. In this way, genes from different species can be initially evaluated in tobacco, due to the ease and speed in the production and analysis of transgenic plants. This has occurred with genes from cereals, vegetables, ornamental and medicinal plants, fruit trees, pastures, among others. Thus, although tobacco is a dicotyledonous plant, it offers clear evidence that genes from monocots, such as sugarcane, corn, wheat, and rice, can confer tolerance to abiotic stresses in both monocots and dicots.
Nos últimos anos, com a chegada de novas tecnologias como o seqüenciamento genômico, microarrays e outras tecnologias (Mardis ER (2008) Next-generation DNA sequencing methods. Annu Rev Genomics Hum Genet 9: 387-402) têm aumentado as informações sobre os genes, até o ponto do patenteamento de genomas completos (Stix G (2006) Owning the stuff of life. Sci Am 294:76-83 e Stott M, Valentine J (2003) Impact of gene patenting on R&D and commerce. Nat Biotechnol 21: 729-731; author reply 731). A partir dessas novas abordagens, um grande número de genes vem sendo identificado. Dessa forma, tem-se buscado cada vez mais o patententeamento de plantas ricas em alguns nutrientes e vitaminas, que apresentem aumento na produção ou na tolerância a estresses, entre outros.In recent years, with the arrival of new technologies such as genomic sequencing, microarrays and other technologies (Mardis ER (2008) Next-generation DNA sequencing methods. Annu Rev Genomics Hum Genet 9: 387-402) information about genes has increased. , to the point of patenting whole genomes (Stix G (2006) Owning the stuff of life. Sci Am 294:76-83 and Stott M, Valentine J (2003) Impact of gene patenting on R&D and commerce. Nat Biotechnol 21: 729-731; author reply 731). From these new approaches, a large number of genes have been identified. In this way, the patenting of plants rich in some nutrients and vitamins, which present an increase in production or tolerance to stress, among others, has been increasingly sought.
Dentro dos estresses, os de tipo abiótico têm tido um interesse particular para aplicação na agricultura devido ao efeito negativo sobre o desenvolvimento e a produtividade em geral, bem como pelo temor às mudanças climáticas. Um dos tipos de estresses mais estudados e conseqüentemente com alto número de patentes é a seca, que é a principal causa de déficit hídrico ou estresse osmótico nas plantas (Cattivelli L, Rizza F, Badeck FW, Mazzucotelli E, Mastrangelo AM, et al. (2008) Drought tolerance improvement in crop plants: An integrated view from breeding to genomics. Field Crops Research 105:1-14).Among the stresses, the abiotic types have been of particular interest for application in agriculture due to the negative effect on development and productivity in general, as well as the fear of climate change. One of the most studied types of stress and consequently with a high number of patents is drought, which is the main cause of water deficit or osmotic stress in plants (Cattivelli L, Rizza F, Badeck FW, Mazzucotelli E, Mastrangelo AM, et al. (2008) Drought tolerance improvement in crop plants: An integrated view from breeding to genomics. Field Crops Research 105:1-14).
Apesar do avanço na identificação de genes nos mais diversos genomas existem um grande grupo de genes em todo genoma que ainda não se conhece sua função. Esses genes podem estar envolvidos em muitas das mais importantes vias de resposta da planta a estresses, crescimento, fotossíntese, etc. Uma das mais recentes técnicas denominada microarrays ou chips de DNA tem permitido associar função a esses genes até então desconhecidos. Essa técnica de baixo custo permite conhecer a seqüências de DNA de centenas de milhares de genes distintos usando tagsmoleculares fluorescentes que se acendem quando se liga uma fita complementar. Desta forma os chips têm permitido conhecer e identificar genes envolvidos em diferentes processos da planta, como resposta a estresses abióticos, regulação gênica, acúmulo de sacarose, além de resistência a pragas, tolerância à escassez de água, interação planta- patógeno e etc.Despite advances in the identification of genes in the most diverse genomes, there is a large group of genes throughout the genome whose function is still unknown. These genes may be involved in many of the most important plant response pathways to stress, growth, photosynthesis, etc. One of the most recent techniques called microarrays or DNA chips has made it possible to associate function with these hitherto unknown genes. This low-cost technique makes it possible to know the DNA sequences of hundreds of thousands of distinct genes using fluorescent molecular tags that light up when a complementary strand is ligated. In this way, chips have made it possible to know and identify genes involved in different plant processes, such as response to abiotic stresses, gene regulation, sucrose accumulation, as well as resistance to pests, tolerance to water scarcity, plant-pathogen interaction, etc.
Os mecanismos de tolerância à seca em plantas têm semelhanças com outros tipos de estresses (Yamaguchi-Shinozaki K, Shinozaki K (2006) Transcriptional regulatory networks in cellular responses and tolerance to dehydration and cold stresses. Annual Review of Plant Biology 57: 781-803), uma vez que as mesmas proteínas e osmoprotetores estão envolvidas em respostas moleculares para diferentes tipos de estresse. Adicionalmente, a maioria dos estresses abióticos começa com um tipo de estresse, por exemplo, osmótico que logo desencadeiam os outros. Isto implica que um gene ou via de transdução de sinais identificados como resposta a um estresse especifico pode estar envolvido nas respostas de vários outros tipos de estresses (Yamaguchi-Shinozaki K, Shinozaki K (2006) e Zhu JK (2002) Salt and drought stress signal transduction in plants. Annu Rev Plant Biol 53: 247-273).The mechanisms of drought tolerance in plants have similarities with other types of stresses (Yamaguchi-Shinozaki K, Shinozaki K (2006) Transcriptional regulatory networks in cellular responses and tolerance to dehydration and cold stresses. Annual Review of Plant Biology 57: 781-803 ), since the same proteins and osmoprotectants are involved in molecular responses to different types of stress. Additionally, most abiotic stresses start with one type of stress, eg osmotic, which soon trigger the others. This implies that a gene or signal transduction pathway identified as a response to a specific stress may be involved in responses to several other types of stress (Yamaguchi-Shinozaki K, Shinozaki K (2006) and Zhu JK (2002) Salt and drought stress signal transduction in plants. Annu Rev Plant Biol 53: 247-273 ).
Ao nível celular, as membranas celulares servem como uma barreira permeável para a perda de água e de algumas moléculas importantes. Porém, durante o estresse osmótico, a disponibilidade de água intercelular é restrita, o que altera as concentrações extracelulares de solutos, levando a um desequilíbrio osmótico. Desta forma ocorre um fluxo de água para fora das células, causando uma diminuição na turgência da célula e um aumento nas concentrações intracelulares de solutos. As espécies reativas de oxigênio e toxinas geradas durante esse processo também podem causar um dano extensivo para a célula.At the cellular level, cell membranes serve as a permeable barrier to the loss of water and some important molecules. However, during osmotic stress, the availability of intercellular water is restricted, which alters the extracellular concentrations of solutes, leading to an osmotic imbalance. In this way, water flows out of the cells, causing a decrease in cell turgor and an increase in intracellular concentrations of solutes. The reactive oxygen species and toxins generated during this process can also cause extensive damage to the cell.
Muitas são as patentes que descrevem diferentes proteínas capazes de conferir tolerância a fatores abióticos como seca e estresse salino, tais como os elementos de ligação a DNA ativados em resposta a desidratação (DREB/CBF), os quais compõem uma importante família com um papel chave na regulação de transdução de sinal induzida pelo estresse (Oh S, Song S, Kim Y, Jang H, Kim S, Kim M, Kim Y, Nahm B, Kim J. (2005). Arabidopsis CBF3/DREB1A and abf3 in transgenic Rrice increased tolerance to abiotic stress without stunting growth. Plant Physiology. 138:341-351; Stockinger E, Gilmour S, Thomashow M. (1997). Arabidopsis Thaliana CBF1 Encodes An AP2 Domain-Containing Transcription Activator That Binds To The C-Repeat/DRE, A Cis-Acting DNA Regulatory Element That Stimulates Transcription In Response To Low Temperature And Water Deficit. Proceedings of the National Academy of Sciences. 94:1035-1040). Proteínas CBF/DREB possuem diferentes domínios e foram identificadas em diferentes espécies. Os documentos US7368630, US7259297 e US7253000 utilizam estes importantes reguladores da transcrição para a produção de plantas transgênicas tolerantes ao estresse hídrico.There are many patents that describe different proteins capable of conferring tolerance to abiotic factors such as drought and salt stress, such as the DNA binding elements activated in response to dehydration (DREB/CBF), which make up an important family with a key role. in the regulation of stress-induced signal transduction (Oh S, Song S, Kim Y, Jang H, Kim S, Kim M, Kim Y, Nahm B, Kim J. (2005). Arabidopsis CBF3/DREB1A and abf3 in transgenic Rrice increased tolerance to abiotic stress without stunting growth. Plant Physiology. 138:341-351; Stockinger E, Gilmour S, Thomashow M. (1997). Arabidopsis Thaliana CBF1 Encodes An AP2 Domain-Containing Transcription Activator That Binds To The C-Repeat/ DRE, A Cis-Acting DNA Regulatory Element That Stimulates Transcription In Response To Low Temperature And Water Deficit. Proceedings of the National Academy of Sciences. 94:1035-1040). CBF/DREB proteins have different domains and have been identified in different species. Documents US7368630, US7259297 and US7253000 use these important transcriptional regulators for the production of transgenic plants tolerant to water stress.
A patente US7368630 descreve um método para usar o gene DREB1A para produzir uma linha de células vegetais, tecidos ou plantas com este fator de transcrição, assim como os genes induzidos por desidratação a partir de estudos de microarrays. Por sua vez, o documento US7259297, descreve plantas transgênicas criadas pela introdução de um gene que codifica um fator de transcrição DREB que se liga ao elemento de resposta a seca DRE/CRT (Drought Response Element/Crepeat) e ativa a transcrição de genes localizados em promotores com o referido motivo DRE. Segundo essa patente, a superexpressão do fator de transcrição DREB ativa os genes Rd29A, Rd29B, Rdl7, Rd22, DREB1A, Cor6, Corl5a, Erdl e Kinl, induzindo uma resposta rápida na planta quando esta submetida ao estresse.US7368630 patent describes a method for using the DREB1A gene to produce a plant cell line, tissue or plant with this transcription factor, as well as dehydration-induced genes from microarray studies. In turn, document US7259297 describes transgenic plants created by introducing a gene that encodes a DREB transcription factor that binds to the drought response element DRE/CRT (Drought Response Element/Crepeat) and activates the transcription of localized genes. in promoters with said DRE motif. According to this patent, the overexpression of the transcription factor DREB activates the genes Rd29A, Rd29B, Rdl7, Rd22, DREB1A, Cor6, Corl5a, Erdl and Kinl, inducing a rapid response in the plant when it is subjected to stress.
Da mesma forma, a patente US7253000 compreende uma seqüência de ácido nucléico que utiliza um dos genes pertencentes ao grupo CBF (C-repeat/dehydration-responsive element binding factor, que e outro nome dado aos fatores DREB).Likewise, the patent US7253000 comprises a nucleic acid sequence that uses one of the genes belonging to the CBF group (C-repeat/dehydration-responsive element binding factor, which is another name given to the DREB factors).
Outras patentes descrevem o uso de vários fatores de transcrição envolvidos na tolerância ao estresse em plantas como, por exemplo, a W02005024028 e JP2006158402, que empregam fatores de transcrição tipo dedo de zinco (Zinc finger)para conferir tolerância a estresse hídrico nas plantas. Por sua vez, o documento US2008163397, utilizou o fator de transcrição CAAT-binding, conferindo tolerância a seca e ao estresse por frio, utilizando o dominio B do fator de transcrição. Da mesma forma, na patente US2009265813 utiliza-se o fator de transcrição AP2, para obtenção de plantas transgênicas relacionadas com múltiplas características, incluindo o crescimento reforçado da raiz e obtendo tolerância à seca como resultado final.Other patents describe the use of various transcription factors involved in stress tolerance in plants, such as W02005024028 and JP2006158402, which employ zinc finger transcription factors (Zinc finger) to confer water stress tolerance in plants. In turn, the document US2008163397 used the transcription factor CAAT-binding, conferring tolerance to drought and cold stress, using the B domain of the transcription factor. Likewise, in patent US2009265813 the transcription factor AP2 is used to obtain transgenic plants related to multiple characteristics, including enhanced root growth and obtaining drought tolerance as a final result.
As patentes aqui mencionadas são reflexo do potencial biotecnológico dos genes que codificam fatores de transcrição, proteínas quinases e outras proteínas envolvidas nas respostas das plantas à seca. Essas proteínas atuam protegendo diretamente componentes celulares durante a desidratação, bem como amplificando o sinal molecular da percepção do estresse hídrico, permitindo a planta antecipar e acelerar os mecanismos de defesa. Nenhum documento apresenta proteção sobre genes relacionados ao gene Scdr2, cuja seqüência encontra-se descrita em SEQ ID: 1 (Anexo 1 A).The patents mentioned here reflect the biotechnological potential of genes that encode transcription factors, protein kinases and other proteins involved in plant responses to drought. These proteins act by directly protecting cellular components during dehydration, as well as amplifying the molecular signal of the perception of water stress, allowing the plant to anticipate and accelerate defense mechanisms. No document presents protection on genes related to the Scdr2 gene, whose sequence is described in SEQ ID: 1 (Annex 1 A).
Apesar do crescimento em pesquisas com cana-de-açúcar, são poucos os exemplos de invenções que utilizam genes de cana para produção de plantas com maior tolerância a estresses abióticos (Affenzeller MJ, Darehshouri A, Andosch A, Lutz C, Lutz-Meindl U (2009) Salt stress-induced cell death in the unicellular green alga Micrasterias denticulata. J Exp Bot 60: 939-954 e Molinari HBC, Marur Cl, Daros E, de Campos MKF, de Carvalho JFRP, et al. (2007) Evaluation of the stress-inducible production of proline in transgenic sugarcane (Saccharum spp.): osmotic adjustment, chlorophyll fluorescence and oxidative stress. Physiologia Plantarum 130: 218-229). E o uso de genes de cana que dão tolerância a estresses abióticos, em contraponto a genes de outras espécies, permite a produção de plantas transgênicas da cana contendo genes da própria cana, os quais têm maior aceitação pelos consumidores. De fato, 70% dos consumidores dão suporte a modificações genéticas envolvendo genes da própria espécie, em contraste com o suporte de 26% quando se tratam de genes de outras espécies (Rommens CM (2010) Barriers and paths to market for genetically engineered crops. Plant Biotechnology Journal 8:101-111).Despite the growth in sugarcane research, there are few examples of inventions that use sugarcane genes to produce plants with greater tolerance to abiotic stresses (Affenzeller MJ, Darehshouri A, Andosch A, Lutz C, Lutz-Meindl U (2009) Salt stress-induced cell death in the unicellular green algae Micrasterias denticulata J Exp Bot 60: 939-954 and Molinari HBC, Marur Cl, Daros E, de Campos MKF, de Carvalho JFRP, et al (2007) Evaluation of the stress-inducible production of proline in transgenic sugarcane (Saccharum spp.): osmotic adjustment, chlorophyll fluorescence and oxidative stress. Physiologia Plantarum 130: 218-229). And the use of sugarcane genes that give tolerance to abiotic stresses, as opposed to genes from other species, allows the production of transgenic sugarcane plants containing genes from the sugarcane itself, which have greater acceptance by consumers. In fact, 70% of consumers support genetic modifications involving genes from their own species, in contrast to 26% support when dealing with genes from other species (Rommens CM (2010) Barriers and paths to market for genetically engineered crops. Plant Biotechnology Journal 8:101-111).
Portanto, esta invenção relaciona-se com a direta manipulação de uma seqüência de DNA que codifica uma proteína de cana-de-açúcar. O conhecimento prévio no estado da arte não permite associar qualquer função específica ao gene alvo desta invenção. Esta invenção descreve também a construção de vetores que contém a 'seqüência da proteína de cana-de- açúcar, bem como um processo de produção de plantas transgênicas de forma a produzir um fenótipo de tolerância a estresse hídrico, salino, maior biomassa e maior fotossíntese, dentre outros possíveis.Therefore, this invention relates to the direct manipulation of a DNA sequence encoding a sugarcane protein. Prior knowledge in the state of the art does not allow any specific function to be associated with the target gene of this invention. This invention also describes the construction of vectors that contain the 'sugarcane protein sequence, as well as a process for producing transgenic plants in order to produce a phenotype of tolerance to water, saline stress, higher biomass and higher photosynthesis. , among others possible.
A presente invenção proporciona um método de produção de plantas que contém em suas células uma seqüência de nucleotídeos de cana-de-açúcar e a expressão desse gene leva à maior tolerância a estresses abióticos à planta em questão.The present invention provides a method of producing plants that contain in their cells a sequence of sugarcane nucleotides and the expression of this gene leads to greater tolerance to abiotic stresses in the plant in question.
Em uma forma mais ampla, o polinucleotídeo codificando a proteína de cana-de-açúcar é expresso por um promotor e um terminador que funcionam em plantas. Mais especificamente, a presente invenção proporciona um polinucleotídeo de DNA recombinante no sentido 5' para 3', que compreende um promotor que funciona em plantas, operacionalmente ligado a um segundo polinucleotídeo que codifica uma proteína de cana, operavelmente ligado ao terminador que finaliza a transcrição do polinucleotídeo de DNA fornecendo um sítio de poliadenilação.In a broader form, the polynucleotide encoding the sugarcane protein is expressed by a promoter and terminator that function in plants. More specifically, the present invention provides a recombinant DNA polynucleotide in the 5' to 3' direction, which comprises a promoter that functions in plants, operably linked to a second polynucleotide that encodes a sugarcane protein, operably linked to the terminator that terminates transcription. of the DNA polynucleotide providing a polyadenylation site.
A invenção também descreve uma seqüência de DNA recombinante em que o promotor é selecionado do grupo constituído por promotores induzíveis, promotores constitutivos, promotores regulados temporalmente, promotores com preferência por tecidos, promotores de estresses específicos, promotores induzíveis por seca, promotores induzíveis pelo déficit de água, e os promotores tecido-específicos.The invention also describes a recombinant DNA sequence in which the promoter is selected from the group consisting of inducible promoters, constitutive promoters, temporally regulated promoters, tissue-preferred promoters, stress-specific promoters, drought-inducible promoters, deficit-inducible promoters. water, and tissue-specific promoters.
Também são descritas células vegetais e plantas que contêm em seu genoma moléculas de DNA recombinante, tal como descrito e os propágulos e descendentes delas produzidas. As plantas incluem, mas não estão limitadas a plantas de cultivo, monocotiledôneas ou dicotiledôneas e dentre elas podem-se incluir cana-de-açúcar, soja, milho, canola, arroz, algodão, cevada, aveia, grama, trigo, pinhão manso, mangueira, goiabeira, limoeiro, abacateiro, laranjeira, ameixeira, pitagueira, jabuticabeira, macieira, pessegueira, batateira, ervilheira, tomateiro, roseira, girassol, feijão, eucalipto, abacate, morango, pêra, maçã, goiaba, cacau, limão, maracujá, palma forrageira, mamona, mandioca, seringueira, mate, jacarandá, café, abóbora, melancia, pêssego, pitanga e caju.Also described are plant cells and plants that contain recombinant DNA molecules in their genome, as described, and the propagules and descendants produced from them. Plants include, but are not limited to, crop plants, monocots or dicots and may include sugarcane, soybeans, corn, canola, rice, cotton, barley, oats, grass, wheat, jatropha, mango, guava, lemon, avocado, orange, plum, pitta, jabuticaba, apple, peach, potato, pea, tomato, rose, sunflower, beans, eucalyptus, avocado, strawberry, pear, apple, guava, cocoa, lemon, passion fruit, forage palm, castor bean, manioc, rubber tree, mate, rosewood, coffee, pumpkin, watermelon, peach, pitanga and cashew.
A invenção também proporciona um método para produção de plantas tolerantes aos estresses abióticos, graças à transformação genética com uma molécula de DNA recombinante que expressa uma proteína de cana, bem como as plantas e suas células e propágulos, como sementes, contiverem em seu genoma moléculas desse DNA recombinante.The invention also provides a method for producing plants tolerant to abiotic stresses, thanks to genetic transformation with a recombinant DNA molecule that expresses a sugarcane protein, as well as the plants and their cells and propagules, such as seeds, containing molecules in their genome. of this recombinant DNA.
Tais plantas apresentam uma ou mais das seguintes propriedades: uma maior taxa de crescimento em condições onde a seca e/ou o estresse salino seriam limitantes para o crescimento de uma planta não-transformada da mesma espécie, uma maior taxa de crescimento em condições onde a água seria limitante para o crescimento de uma planta não- transformada da mesma espécie, uma maior taxa de crescimento, sob condições em que o aumento de sais ou ions no solo e/ou água seria limitante para o crescimento de uma planta não-transformada da mesma espécie, maior porcentagem de plantas sobreviventes após um período prolongado de seca ou sob estresse salino do que uma planta não-transformada da mesma espécie, um rendimento maior quando comparado a uma planta não-transformada da mesma espécie, ou maior tolerância à seca em comparação com uma planta não-transformada da mesma espécie.Such plants have one or more of the following properties: a higher growth rate under conditions where drought and/or saline stress would limit the growth of an untransformed plant of the same species, a higher growth rate under conditions where water would be limiting for the growth of an untransformed plant of the same species, a higher growth rate, under conditions where the increase of salts or ions in the soil and/or water would be limiting for the growth of an untransformed plant of the same species. same species, higher percentage of plants surviving after a prolonged period of drought or under salt stress than an untransformed plant of the same species, a higher yield when compared to an untransformed plant of the same species, or greater drought tolerance in compared to an untransformed plant of the same species.
A presente invenção compreende a propagação de plantas desta invenção, por exemplo, com a finalidade de gerar sementes, por simplesmente plantar tais sementes no solo, ou bem a partir de brotação, como é o caso de uso de toletes em cana-de-açúcar, e que permite a essas plantas crescer, por exemplo, sob condições de estresse. Mais especificamente, esta invenção fornece um método para produzir uma planta que tem como uma das características, tais como tolerância a estresses abióticos, aumento ou incremento no rendimento da massa de raízes. A invenção compreende as etapas de inserir no genoma de uma célula de planta, a construção de uma molécula de DNA recombinante compreendendo um gene cana-de-açúcar, a obtenção de uma célula de planta transformada ou células transformadas, a regeneração de plantas transformadas de células vegetais e a seleção de plantas que apresentam melhores características agronômicas. Uma das características da invenção é o fato das plantas selecionadas apresentarem maior tolerância a estresses abióticos selecionado do grupo consistindo de tolerância ao estresse salino, tolerância à seca e sobrevivência após o a combinação de estresses abióticos.The present invention comprises the propagation of plants of this invention, for example, with the purpose of generating seeds, by simply planting such seeds in the soil, or from sprouting, as is the case of using stalks in sugarcane. , and which allows these plants to grow, for example, under stress conditions. More specifically, this invention provides a method for producing a plant which has as one of the characteristics, such as tolerance to abiotic stresses, an increase or increment in root mass yield. The invention comprises the steps of inserting into the genome of a plant cell, the construction of a recombinant DNA molecule comprising a sugarcane gene, the obtaining of a transformed plant cell or transformed cells, the regeneration of transformed plants from plant cells and the selection of plants that present better agronomic characteristics. One of the features of the invention is that the selected plants show greater tolerance to abiotic stresses selected from the group consisting of salt stress tolerance, drought tolerance and survival after the combination of abiotic stresses.
Figura 1: Avaliação da expressão por real-time PCR do gene Scdr2 em plantas submetidas a estresse hídrico por 24, 72 and 120 horas. VI: SP83-5073, V2: SP90-1638, V3: SP83-2847 and V4: SP86-155. VI e V3 são variedades de cana-de-açúcar tolerantes, e V2 e V4 são variedades de cana-de-açúcar sensíveis. O asterisco indica amostras com valores com diferença estatisticamente significativa.Figure 1: Evaluation of the expression by real-time PCR of the Scdr2 gene in plants subjected to water stress for 24, 72 and 120 hours. VI: SP83-5073, V2: SP90-1638, V3: SP83-2847 and V4: SP86-155. VI and V3 are tolerant sugarcane varieties, and V2 and V4 are sensitive sugarcane varieties. The asterisk indicates samples with values with a statistically significant difference.
Figura 2: Efeito de manitol e NaCI sob a germinação de plantas contendo a SEQ ID NO: 1. Porcentagem de germinação de plantas transgênicas de tabaco contendo a SEQ ID NO: 1 (Scdr2-1, Scdr2-2 e Scdr2-3) e plantas selvagens (wt) em diferentes concentrações de manitol e NaCI, avaliadas ao longo de 15 dias. (A): controle; (B): 200 mM manitol; (C): 300 mM manitol; (D): 100 mM NaCI e E): 175 mM NaCI.Figure 2: Effect of mannitol and NaCl on germination of plants containing SEQ ID NO: 1. Percentage of germination of transgenic tobacco plants containing SEQ ID NO: 1 (Scdr2-1, Scdr2-2 and Scdr2-3) and wild plants (wt) at different concentrations of mannitol and NaCI, evaluated over 15 days. (A): control; (B): 200 mM mannitol; (C): 300 mM mannitol; (D): 100 mM NaCl and E): 175 mM NaCl.
Figura 3: Efeitos dos estresses salino e hídrico sobre a fotossíntese (A), Concentração interna de CO2 (Ci), condutância estomática (gs) e taxa de transpiração de plantas selvagens e plantas transgênicas contendo a SEQ ID NO: 1. Plantas de 30 dias foram submetidas a 10 dias de irrigação com 200 mM manitol ou 175 mM NaCI e após isso reidratadas por 3 dias com água, a- c: fotossíntese (A), d-f: Concentração interna de CO2 (Ci); g-i: condutância estomática (gs); j-l: taxa de transpiração (E); a,d, g e J: tratamento controle, b, e, h e k: 200 mM mannitol, c, f, i e I: 175 mM NaCI.Figure 3: Effects of salt and water stress on photosynthesis (A), Internal CO2 concentration (Ci), stomatal conductance (gs) and transpiration rate of wild plants and transgenic plants containing SEQ ID NO: 1. Plants of 30 days they were submitted to 10 days of irrigation with 200 mM mannitol or 175 mM NaCI and after that they were rehydrated for 3 days with water, a- c: photosynthesis (A), df: Internal concentration of CO2 (Ci); g-i: stomatal conductance (gs); j-l: transpiration rate (E); a,d, g and J: control treatment, b, e, h and k: 200 mM mannitol, c, f, i and I: 175 mM NaCl.
Figura 4: Conteúdo de água em folhas estressadas de plantas selvagens e plantas transgênicas contendo a SEQ ID NO: 1. Plantas de 30 dias foram expostas durante 10 dias a 200 mM mannitol ou 175 mM NaCI, e após o estresse foram irrigadas com água por 3 dias. No tratamento controle as plantas foram irrigadas durante o experimento todo com água (n=5).Figure 4: Water content in stressed leaves of wild plants and transgenic plants containing SEQ ID NO: 1. 30-day-old plants were exposed for 10 days to 200 mM mannitol or 175 mM NaCl, and after stress they were irrigated with water for 3 days. In the control treatment, the plants were irrigated throughout the experiment with water (n=5).
Figura 5: Efeitos da seca e estresse salino sob massa seca das plantas selvagens e plantas transgênicas contendo a SEQ ID NO: 1. Plantas de 30 dias foram expostas durante 10 dias a 200 mM mannitol ou 175 mM NaCI, e reidratadas por 3 dias com água.Figure 5: Effects of drought and salt stress on dry mass of wild-type plants and transgenic plants containing SEQ ID NO: 1. 30-day-old plants were exposed for 10 days to 200 mM mannitol or 175 mM NaCl, and rehydrated for 3 days with Water.
Figura 6: Fenótipo de plantas de tabaco selvagens (wt) e plantas transgênicas contendo a SEQ ID NO: 1 mantidas sob estresse hídrico e salino. Linha Superior: wt e plantas de três eventos independentes contendo a SEQ ID NO: 1 (Scdr2-1, Scdr2-2 e Scdr2-3) crescidas em condições normais por 5 semanas. Linha do meio: plantas irrigadas com 200 mM manitol por 10 dias e irrigadas com água novamente por 3 dias. Linha inferior: plantas irrigadas por 10 dias com 175 mM NaCI e irrigadas novamente por 3 dias.Figure 6: Phenotype of wild (wt) tobacco plants and transgenic plants containing SEQ ID NO: 1 maintained under water and salt stress. Top row: wt and three independent event plants containing SEQ ID NO: 1 (Scdr2-1, Scdr2-2 and Scdr2-3) grown under normal conditions for 5 weeks. Middle row: plants irrigated with 200 mM mannitol for 10 days and irrigated with water again for 3 days. Bottom row: plants irrigated for 10 days with 175 mM NaCI and irrigated again for 3 days.
Anexo 1: (A) Sequência de polinucleotídeo correspondente à SEQ ID NO: 1. (A) Sequência de DNA e (B) Proteína deduzida do fragmento de DNA obtido a partir do gene Scdr2 de cana-de- açúcar.Annex 1: (A) Polynucleotide sequence corresponding to SEQ ID NO: 1. (A) DNA sequence and (B) Protein deduced from the DNA fragment obtained from the sugarcane Scdr2 gene.
A presente invenção descreve um método para produção de plantas transgênicas tolerantes a estresses ambientais graças à introdução de um gene que codifica uma nova proteína de cana-de-açúcar, de função até então desconhecida. O gene, nomeado Scdr2 (sugarcane drought-related),é descrito na seqüência SEQ ID NO: 1 (Anexo IA), e a proteína deduzida a partir dessa seqüência de DNA está indicada na SEQ ID NO:2 (Anexo 1B).The present invention describes a method for producing transgenic plants tolerant to environmental stresses thanks to the introduction of a gene that encodes a new sugarcane protein, whose function was previously unknown. The gene, named Scdr2 (drought-related sugarcane), is described in the sequence SEQ ID NO: 1 (Appendix 1A), and the protein deduced from this DNA sequence is shown in SEQ ID NO:2 (Appendix 1B).
O invento descrito neste documento refere-se a um vetor de DNA recombinante compreendendo a seqüência de nucleotídeos SEQ ID NO: 1, útil para produzir plantas transgênicas e um método para produção de plantas geneticamente modificadas que superexpressam uma molécula de ácido nucléico, um novo gene de cana de açúcar, que compreende a SEQ ID NO: 1, envolvida na resposta das plantas a estresses abióticos, e cuja superexpressão produz uma melhora significativa na resposta da planta a esses estresses. Assim, determina-se que o gene indicado na SEQ ID NO:1 controla direta ou indiretamente a resposta de plantas contra esses estresses.The invention described in this document relates to a recombinant DNA vector comprising the nucleotide sequence SEQ ID NO: 1, useful for producing transgenic plants and a method for producing genetically modified plants that overexpress a nucleic acid molecule, a novel gene. from sugarcane, which comprises SEQ ID NO: 1, involved in the response of plants to abiotic stresses, and whose overexpression produces a significant improvement in the plant's response to these stresses. Thus, it is determined that the gene indicated in SEQ ID NO:1 directly or indirectly controls the response of plants against these stresses.
Como tal, as aplicações da invenção incluem, mas não estão limitadas, à melhoria da produção de plantas que sejam tolerantes a esses estresses abióticos. Da mesma forma, a invenção compreende as seqüências com identidade igual ou superior a 60% à SEQ ID NO: 1, mas não limitantes a somente elas.As such, applications of the invention include, but are not limited to, improving the production of plants that are tolerant of such abiotic stresses. Likewise, the invention comprises sequences with an identity equal to or greater than 60% to SEQ ID NO: 1, but not limited thereto.
A seqüência de DNA descrita em SEQ ID NO: 1 compreende a região codificante do gene Scdr2 que é usada como parte de um DNA quimérico capaz de aumentar a expressão em células vegetais.The DNA sequence described in SEQ ID NO: 1 comprises the coding region of the Scdr2 gene which is used as part of a chimeric DNA capable of increasing expression in plant cells.
O vetor de transformação de plantas usado para introduzir o ácido nucléico na célula vegetal pode ser um plasmídeo, em que o DNA SEQ ID NO:1 é inserido em sítios de divagem de endonucleases de restrição ou por recombinação mediada por outros tipos de proteína. O DNA é inserido no vetor de clonagem utilizando procedimentos padrão facilmente conhecidos. Isso geralmente envolve o uso de enzimas de restrição e ligases do DNA, conforme descrito, por exemplo, por Sambrook et al (Wood EJ (1983) Molecular-Cloning - a Laboratory Manual - Maniatis,T, Fritsch,Ef, Sambrook,J. Biochemical Education 11: 82-82). O plasmídio resultante, que inclui a SEQ ID NO:1 pode então ser usado para transformar uma célula vegetal, plantas ou partes de plantas por métodos convencionais de transformação.The plant transformation vector used to introduce the nucleic acid into the plant cell may be a plasmid, in which DNA SEQ ID NO:1 is inserted into restriction endonuclease cleavage sites or by recombination mediated by other types of protein. The DNA is inserted into the cloning vector using easily known standard procedures. This usually involves the use of restriction enzymes and DNA ligases, as described, for example, by Sambrook et al (Wood EJ (1983) Molecular-Cloning - a Laboratory Manual - Maniatis, T, Fritsch, Ef, Sambrook, J. Biochemical Education 11: 82-82). The resulting plasmid, which includes SEQ ID NO:1, can then be used to transform a plant cell, plants, or plant parts by conventional transformation methods.
Para a transformação de plantas, o plasmídeo de preferência também inclui um gene marcador de seleção na transformação de plantas, embora existam métodos que prescindam do uso desse tipo de gene marcador. Marcadores seleção de vegetais comumente usados incluem o gene de resistência a canamicina, (neomicina fosfotransferase II ou nptll), o gene de resistência a higromicina (higromicina fosfotransferase ou HPT), o gene de fosfinotricina acetil transferase (bar), o gene 5-enolpiruvilshiquimato-3-fosfato sintase (EPSPS), ou gene da acetolactato sintase (ALS). Na presente invenção, o marcador de seleção é o gene Nptll, que permite a seleção dos transformantes com canamicina.For plant transformation, the plasmid preferably also includes a selectable marker gene in plant transformation, although there are methods that dispense with the use of this type of marker gene. Commonly used plant selection markers include the kanamycin resistance gene, (neomycin phosphotransferase II or nptll), the hygromycin resistance gene (hygromycin phosphotransferase or HPT), the phosphinothricin acetyl transferase (bar) gene, the 5-enolpyruvylshikimate gene -3-phosphate synthase (EPSPS), or acetolactate synthase (ALS) gene. In the present invention, the selection marker is the Nptll gene, which allows the selection of transformants with kanamycin.
O plasmídeo também pode incluir um gene repórter que fornece uma indicação clara de que a transformação genética foi efetuada através da detecção da atividade da proteína codificada pelo gene repórter. Os genes repórteres mais comumente utilizados são os que codificam a beta-glucuronidase (GUS), a luciferase e a proteína verde fluorescente (GFP). Genes repórter são muitas vezes colocados em frame da região promotora e nas proximidades do gene de interesse para assegurar que elas são expressas em conjunto e não separadas por eventos do crossover.The plasmid may also include a reporter gene which provides a clear indication that the genetic transformation has taken place by detecting the activity of the protein encoded by the reporter gene. The most commonly used reporter genes are those encoding beta-glucuronidase (GUS), luciferase and green fluorescent protein (GFP). Reporter genes are often placed in frame of the promoter region and in close proximity to the gene of interest to ensure that they are expressed together and not separated by crossover events.
O plasmídeo, de preferência também inclui os promotores adequados para a expressão do ácido nucléico indicado na SEQ ID NO: 1 e também para a expressão do gene marcador de seleção, assim como o gene repórter. O promotor do vírus do mosaico couve-flor 35S (CaMV 35S) é comumente utilizado para a transformação de plantas, bem como o do gene da actina 1 de arroz (Actl), da ubiquitina 1 (Ubil), o promotor do gene da alfa-amilase, e promotores de genes induzidos por estresse. Na presente invenção, o promotor utilizado é o promotor CaMV 35S, mas outros promotores também podem ser utilizados.The plasmid preferably also includes promoters suitable for the expression of the nucleic acid indicated in SEQ ID NO: 1 and also for the expression of the selection marker gene as well as the reporter gene. The cauliflower mosaic virus 35S (CaMV 35S) promoter is commonly used for plant transformation, as is the
No plasmídeo, o DNA descrito em SEQ ID NO:1 pode estar sob o controle de um promotor constitutivo ou pode estar sob o controle do promotor do mesmo gene ou de um promotor diferente. Para a transformação de plantas, o plasmídeo de preferência inclui também uma molécula de ácido nucléico codificando o terminator, como a região 3' não codificante dos genes que codificam um inibidor de protease de actina, do vírus do mosaico da couve-flor, ou da nopalina (NOS). Na presente invenção, o plasmídeo inclui o terminador da nopalina sintase (NOS).In the plasmid, the DNA described in SEQ ID NO:1 may be under the control of a constitutive promoter or it may be under the control of the promoter of the same gene or a different promoter. For plant transformation, the plasmid preferably also includes a terminator-encoding nucleic acid molecule, such as the 3' non-coding region of genes encoding an actin protease inhibitor, cauliflower mosaic virus, or cauliflower mosaic virus. nopaline (NOS). In the present invention, the plasmid includes the nopaline synthase (NOS) terminator.
O plasmídeo é de preferência um vetor de transformação de plantas binário em que os genes de interesse são inseridos dentro das bordas do T-DNA. Exemplos de tais vetores de transformação de plantas que podem ser usados na presente invenção são vetores obtidos a partir de fontes comerciais, tais como a serie pCambia, pBH21 ou pGreenll que contém uma origem RK2 de baixa replicação, o gene marcador da neomicina-fosfotransferase (nptll), e o terminador da nopalina sintase (NOS), promotor constitutivo e um sinal de 3' NOS de poliadenilação.The plasmid is preferably a binary plant transformation vector in which the genes of interest are inserted within the borders of the T-DNA. Examples of such plant transformation vectors that can be used in the present invention are vectors obtained from commercial sources, such as the pCambia, pBH21 or pGreenII series which contain a low replication RK2 origin, the neomycin phosphotransferase marker gene ( nptII), and the nopaline synthase (NOS) terminator, constitutive promoter, and a 3' NOS polyadenylation signal.
Para a transformação das plantas, qualquer método adequado para a transformação de monocotiledôneas ou dicotiledôneas pode ser usado, como por exemplo, a transformação mediada por Agrobacterium ou bombardeamento de partículas (também conhecida como transformação de biobalística). Na transformação mediada por Agrobacterium, as células vegetais são colocadas em contato com um inóculo de bactérias transformadas com o plasmídeo contendo o DNA indicado na SEQ ID NO: 1 da invenção, por exemplo, através da inoculação de células de plantas com uma suspensão de bactérias transformadas. Bactérias do gênero Agrobacterium que podem ser utilizados para transformar células vegetais incluem espécies de Agrobacterium rhizogenes, Agrobacterium tumefaciensde preferência cepas de A. tumefaciensLBA4404, EHA105 ou GV301. Agrobacterium spp. são transformadas com o plasmídeo por métodos convencionais conhecidos.For plant transformation, any suitable method for transforming monocots or dicots can be used, for example Agrobacterium-mediated transformation or particle bombardment (also known as bioballistics transformation). In Agrobacterium-mediated transformation, plant cells are contacted with an inoculum of bacteria transformed with the plasmid containing the DNA indicated in SEQ ID NO: 1 of the invention, for example, by inoculating plant cells with a suspension of bacteria transformed. Bacteria of the genus Agrobacterium that can be used to transform plant cells include species of Agrobacterium rhizogenes, Agrobacterium tumefaciens, preferably strains of A. tumefaciensLBA4404, EHA105 or GV301. Agrobacterium spp. are transformed with the plasmid by known conventional methods.
Por sua vez, utilizando-se um protocolo de transformação de discos foliares, bactérias de A. tumefaciens com o DNA indicado na SEQ ID NO:1 clonado no vetor binário são cultivadas em um meio de crescimento na presença de antibióticos, como por exemplo, canamicina, paraIn turn, using a leaf disc transformation protocol, A. tumefaciens bacteria with the DNA indicated in SEQ ID NO:1 cloned in the binary vector are cultivated in a growth medium in the presence of antibiotics, such as, for example, kanamycin, for
selecionar as células bacterianas que possuem o plasmídeo binário. Em seguida, folhas de tabaco selvagem são esterilizadas superficialmente, cortadas em pequenos discos e incubadas numa suspensão de A. tumefacienspor um tempo adequado. Diferentes tecidos podem ser utilizados para a transformação, tais como folhas, talo, flor dentre outros. Após a incubação com A. tumefaciens as folhas infetadas são transferidas ao meio de cultura in vitropor determinado período de tempo. A seleção das plantas transgênicas é iniciada colocando-se as plantas infetadas no meio de seleção in vitrocom antibiótico. Após o desenvolvimento de plântulas com raízes ocorre a transferência para solo e o crescimento em câmara de crescimento.select the bacterial cells that have the binary plasmid. Then, wild tobacco leaves are superficially sterilized, cut into small discs and incubated in a suspension of A. tumefaciens for a suitable time. Different fabrics can be used for the transformation, such as leaves, stem, flower, among others. After incubation with A. tumefaciens, the infected leaves are transferred to the in vitro culture medium for a certain period of time. The selection of transgenic plants is initiated by placing the infected plants in the in vitro antibiotic selection medium. After the development of seedlings with roots, they are transferred to soil and grown in a growth chamber.
Adicionalmente, a presente invenção refere-se a produção de plantas transgênicas transformadas com plasmídeos contendo a seqüência indicada em SEQ ID NO:1, aumentando sua tolerância a estresses abióticos, como seca e alta salinidade.Additionally, the present invention relates to the production of transgenic plants transformed with plasmids containing the sequence indicated in SEQ ID NO:1, increasing their tolerance to abiotic stresses, such as drought and high salinity.
Outra abordagem para se aumentar os níveis de expressão de SEQ ID NO: 1 pode ser a produção de plantas geneticamente modificadas que superexpressem genes que induzam a atividade do promotor do gene endógeno, como é o caso de genes que codificam fatores de transcrição.Another approach to increasing expression levels of SEQ ID NO: 1 may be to produce genetically modified plants that overexpress genes that induce endogenous gene promoter activity, such as genes encoding transcription factors.
Assim, a invenção descreve o método para produção de plantas transgênicas que contém em suas células um gene quimérico com capacidade de expressão em células vegetais, assim como as subseqüentes gerações compreendendo uma seqüência de DNA de SEQ ID NO: 1 e seqüências de DNA que permitam a expressão da referida proteína em células vegetais.Thus, the invention describes the method for producing transgenic plants that contain in their cells a chimeric gene capable of being expressed in plant cells, as well as subsequent generations comprising a DNA sequence of SEQ ID NO: 1 and DNA sequences that allow the expression of said protein in plant cells.
Plantas transgênicas, de acordo com a invenção, incluem, sem limitação, os cereais, como trigo, cevada, milho, arroz, aveia, gramíneas forrageiras, turfa, outras monocotiledôneas como cana-de-açúcar, miscanthus, ou qualquer espécie de cultura de outros alimentos como o feijão, a soja, ervilha, tomate, colza, bem como outras espécies de interesse econômico, como o tabaco, a laranja, etc.Transgenic plants according to the invention include, without limitation, cereals such as wheat, barley, maize, rice, oats, forage grasses, peat, other monocots such as sugar cane, miscanthus, or any other crop species of other foods such as beans, soybeans, peas, tomatoes, rapeseed, as well as other species of economic interest, such as tobacco, oranges, etc.
Para avaliar o padrão de expressão do gene Scdr2 sob seca foi feito um Real time-PCR quantitativo conforme descrito por Rocha ef al (Rocha FR, Papini-Terzi FS, Nishiyama MY, Vencio RZN, Vicentini R, et al. (2007) Signal transduction-related responses to phytohormones and environmental challenges in sugarcane. Bmc Genomics 8) utilizando folhas de variedades de cana com maior tolerância à seca (SP83-5073 e SP83-2847) e duas com maior sensibilidade à seca (SP86-155 e SP90-1638) mantidas sob irrigação ou em sequeiro (com suspensão de rega, equivalente à estresse por seca). Como gene de referência foi utilizado o gene GAPDH (Gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase ) de cana.To assess the expression pattern of the Scdr2 gene under drought, a quantitative Real-time-PCR was performed as described by Rocha ef al (Rocha FR, Papini-Terzi FS, Nishiyama MY, Vencio RZN, Vicentini R, et al. (2007) Signal transduction-related responses to phytohormones and environmental challenges in sugarcane. Bmc Genomics 8) using leaves of sugarcane varieties with greater drought tolerance (SP83-5073 and SP83-2847) and two with greater drought sensitivity (SP86-155 and SP90- 1638) kept under irrigation or rainfed (with irrigation suspension, equivalent to drought stress). The sugarcane GAPDH (Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase) gene was used as a reference gene.
A expressão sob seca (sequeiro) foi determinada a partir do método 2-ΔΔCT (Livak KJ, Schmittgen TD (2001) Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods 25: 402-408), utilizando amostras não submetidas ao estresse (irrigadas) como controle. A significância estatística das diferenças de expressão gênica relativas foi determinada assumindo-se um modelo log-normal que calcula a probabilidade Pr (amostra > referência>) e Pr (amostra < referência) para genes induzidos e reprimidos, respectivamente. O Perfil de expressão foi considerado válido quando P>0,95. Para cada tratamento foram usadas folhas de seis plantas.Expression under dry (rainfed) was determined using the 2-ΔΔCT method (Livak KJ, Schmittgen TD (2001) Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method Methods 25: 402-408), using unstressed (irrigated) samples as a control. The statistical significance of the relative gene expression differences was determined by assuming a log-normal model that calculates the probability Pr (sample > reference >) and Pr (sample < reference) for induced and repressed genes, respectively. The Expression profile was considered valid when P>0.95. For each treatment, leaves of six plants were used.
O resultado da análise mostrou que a expressão do gene Scdr2 foi fortemente induzida após 24 horas de estresse nas variedades tolerantes à seca, e tardiamente induzido (72horas) nas variedades sensíveis, o que poderia explicar os contrastantes níveis de tolerância a seca (Figura 1). Esses dados sugeriram que o gene Scdr2 poderia estar envolvido na tolerância à seca em cana.The result of the analysis showed that the expression of the Scdr2 gene was strongly induced after 24 hours of stress in drought tolerant varieties, and lately induced (72 hours) in sensitive varieties, which could explain the contrasting levels of drought tolerance (Figure 1). . These data suggested that the Scdr2 gene could be involved in drought tolerance in sugarcane.
Um clone com seqüência do gene Scdr2 de cana-de-açúcar foi obtido do Brazilian Clone Collection Center (BCCCENTER, Jaboticabal, Brasil). A partir desse DNA a seqüência codificante completa, indicada na SEQ ID NO: 1 (Anexo 1), foi amplificada por PCR utilizando oligonucleotideos específicos 5'-GGATCCCTCATCGCCAGCTCCCAT-3-' e 5'- TCTAGACCTGTGCAGTGTCGGATTATTC-3', e clonada no vetor pGEMT-Easy (Promega, EUA).A clone with the sugarcane Scdr2 gene sequence was obtained from the Brazilian Clone Collection Center (BCCCENTER, Jaboticabal, Brazil). From this DNA, the complete coding sequence, indicated in SEQ ID NO: 1 (Appendix 1), was amplified by PCR using specific oligonucleotides 5'-GGATCCCTCATCGCCAGCTCCCAT-3-' and 5'-TCTAGACCTGTGCAGTGTCGGATTATTC-3', and cloned into the pGEMT vector -Easy (Promega, USA).
Posteriormente, a região codificante do gene Scdr2 contendo a SEQ ID NO: 1 foi retirada com as enzimas BamHI e Xbal e inserida no vetor pRT104 digerido com as mesmas enzimas. O cassete de expressão foi liberado pela digestão com Hindlll e clonado no vetor de expressão pCAMBIA 2301 (Cambia, Australia), também digerido com a mesma enzima. A construção recombinante final resultante (pCAMBIA2301::Scdr2) foi introduzida em Agrobacterium tumefaciens cepa GV3101 (CLONTECH, EUA).Subsequently, the coding region of the Scdr2 gene containing SEQ ID NO: 1 was removed with the enzymes BamHI and XbaI and inserted into the pRT104 vector digested with the same enzymes. The expression cassette was released by digestion with HindIII and cloned into the expression vector pCAMBIA 2301 (Cambia, Australia), also digested with the same enzyme. The resulting final recombinant construct (pCAMBIA2301::Scdr2) was introduced into Agrobacterium tumefaciens strain GV3101 (CLONTECH, USA).
Sementes selvagens de tabaco (Nicotiana tabacum, var. SR1) foram germinadas em placas de Petri contendo meio Murashige-Skoog (MS) com 0,9% (w/v) de agar. As plântulas foram transplantadas para solo, composto de Baccto (Michigan Peat Co., EUA) e areia (4:1, v/v) em potes de 325 mL. Quando as plantas desenvolveram entre 10 e 12 folhas, foram transplantadas para potes de 1 L contendo a mesma mistura antes mencionada.Wild tobacco seeds (Nicotiana tabacum, var. SR1) were germinated in Petri dishes containing Murashige-Skoog (MS) medium with 0.9% (w/v) agar. Seedlings were transplanted into soil composed of Bacto (Michigan Peat Co., USA) and sand (4:1, v/v) in 325 mL pots. When the plants developed between 10 and 12 leaves, they were transplanted into 1 L pots containing the same mixture mentioned above.
As plantas foram crescidas em câmara de crescimento com fotoperíodo de 16/8h luz/escuro (300-400 μmol fótons m’2s-1) a 25°C e umidade relativa de 75-80%. Para a produção de sementes, as plantas foram induzidas à floração por extensão do tempo de exposição à luz.The plants were grown in a growth chamber with a photoperiod of 16/8h light/dark (300-400 μmol photons m'2s-1) at 25°C and relative humidity of 75-80%. For seed production, plants were induced to flower by extending the time of exposure to light.
Folhas de tabaco selvagem foram esterilizadas em sua superfície, cortadas em pequenos discos e incubadas numa suspensão de A. tumefaciens por 5 a 20 min. Após isto, as folhas infetadas foram transferidas ao meio MS (suplementado com 2 mg L’1 benzil-adenina e 0,1 mg L’1 ácido naftilacético) por 3 dias.Wild tobacco leaves were surface sterilized, cut into small discs and incubated in a suspension of A. tumefaciens for 5 to 20 min. After that, the infected leaves were transferred to MS medium (supplemented with 2 mg L'1 benzyl-adenine and 0.1 mg L'1 naphthylacetic acid) for 3 days.
A seleção das plantas transgênicas foi iniciada colocando as plantas infetadas no meio de seleção (MS, 2 mg/L’1 benziladenina, 0,1 mg/L’1 ácido naftilacético e 100 mg/L’1 canamicina, ou 30 mg/L1 higromicina e 500 mg/L1 carbenicilina). Os explantes que então se desenvolveram foram transferidas para o meio MS com 0,1 mg/L’l ácido 3-indol acético, 100 mg/L1 canamicina, ou 30 mg/L’1 higromicina, e 500 mg/L’1 carbenicillina enquanto as plantas enraizadas foram transferidas para solo e crescidas em câmara de crescimento com fotoperíodo de 16/8h luz/escuro (300-400 μmol fótons m-2 s’1) à 25°C e umidade relativa de 75-80%.The selection of transgenic plants was initiated by placing the infected plants in the selection medium (MS, 2 mg/L'1 benzyladenine, 0.1 mg/L'1 naphthylacetic acid and 100 mg/L'1 kanamycin, or 30 mg/L1 hygromycin and 500 mg/L1 carbenicillin). The explants that then developed were transferred to MS medium with 0.1 mg/L'1 3-indole acetic acid, 100 mg/L'1 kanamycin, or 30 mg/L'1 hygromycin, and 500 mg/L'1 carbenicillin while the rooted plants were transferred to soil and grown in a growth chamber with a photoperiod of 16/8h light/dark (300-400 μmol photons m-2 s'1) at 25°C and relative humidity of 75-80%.
A caracterização inicial das plantas enraizadas e transferidas para solo foi feita primeiramente por o ensaio histoquímico utilizando-se o X-Gluc como substrato para a detecção do gene beta-glucuronidase, também inserido no cassette de expressão.The initial characterization of plants rooted and transferred to soil was carried out primarily by the histochemical assay using X-Gluc as a substrate for the detection of the beta-glucuronidase gene, also inserted in the expression cassette.
Observou-se que um grande número de plantas apresentou forte coloração azul, as quais foram utilizadas para confirmar a integração do transgene contendo o gene Scdr2 indicado na SEQ ID NO:1 por PCR, utilizando-se DNA genômico como molde.It was observed that a large number of plants showed strong blue staining, which were used to confirm the integration of the transgene containing the Scdr2 gene indicated in SEQ ID NO:1 by PCR, using genomic DNA as a template.
Em seguida foi extraído DNA total de amostras de folha de plantas selvagens e plantas transgênicas. Para tal, coletaram-se cerca de 50 - 150 mg de folha, que foram transferidos rapidamente para um almofariz contendo nitrogênio líquido. Após evaporação no nitrogênio, o material foi pulverizado até obter um pó bastante fino, ao qual se acrescentaram 3 mL de tampão de extração. Imediatamente a solução foi transferida para tubos plásticos estéreis de 1,5 mL, os quais foram mantidos em banho-maria a 65°C, por 30 minutos, com agitação suave a cada 10 minutos.Then, total DNA was extracted from leaf samples of wild plants and transgenic plants. For this, about 50 - 150 mg of leaves were collected, which were quickly transferred to a mortar containing liquid nitrogen. After evaporation in nitrogen, the material was pulverized until obtaining a very fine powder, to which 3 mL of extraction buffer was added. Immediately the solution was transferred to 1.5 mL sterile plastic tubes, which were kept in a water bath at 65°C for 30 minutes, with gentle agitation every 10 minutes.
Logo depois, foram adicionados aos tubos 10 microlitros de Proteinase K e os mesmos foram incubados novamente em banho-maria a 65°C por 30 minutos, com agitação suave a cada 10 mim. Em seguida, os tubos foram centrifugados numa microcentrífuga a 10.000 rpm durante 10 minutos. O sobrenadante foi então transferido para um novo tubo plástico de 1,5 mL e, após atingir a temperatura ambiente, foi feita a primeira extração de DNA utilizando-se fenol-clorofórmio (1:1), na proporção de 1:1 (1 parte do sobrenadante: 1 parte de fenol- clorofórmio).Soon after, 10 microliters of Proteinase K were added to the tubes and they were incubated again in a water bath at 65°C for 30 minutes, with gentle agitation every 10 minutes. Then, the tubes were centrifuged in a microcentrifuge at 10,000 rpm for 10 minutes. The supernatant was then transferred to a new 1.5 mL plastic tube and, after reaching room temperature, the first DNA extraction was performed using phenol-chloroform (1:1), at a ratio of 1:1 (1 part supernatant: 1 part phenol-chloroform).
Em seqüência, o tubo foi invertido suavemente por várias vezes para conseguir uma emulsão homogêna e as amostras foram centrifugadas a 10.000 rpm durante 10 minutos.In sequence, the tube was gently inverted several times to obtain a homogeneous emulsion and the samples were centrifuged at 10,000 rpm for 10 minutes.
Imediatamente após os tubos serem retirados cuidadosamente da microcentrífuga, a fase superior (aquosa) foi transferida para um novo tubo de 1,5 mL, evitando-se os contaminantes da fase inferior. Logo em seguida foi adicionada RNAse 100 mg/mL (1:100) e a mistura foi incubada a 37°C por 30 minutos.Immediately after the tubes were carefully removed from the microcentrifuge, the upper (aqueous) phase was transferred to a new 1.5 mL tube, avoiding contaminants from the lower phase. Soon after, 100 mg/mL RNAse (1:100) was added and the mixture was incubated at 37°C for 30 minutes.
Na última fase da extração foi adicionado o mesmo volume da solução de clorofil (24 partes de clorofórmio: 1 parte de álcool isoamílico) e a mistura foi colocada sob agitação suave por 5 minutos. Os tubos foram centrifugados a 10.000 rpm durante 10 minutos e a fase superior foi transferida para um novo recipiente.In the last phase of the extraction, the same volume of chlorophyll solution (24 parts of chloroform: 1 part of isoamyl alcohol) was added and the mixture was placed under gentle agitation for 5 minutes. The tubes were centrifuged at 10,000 rpm for 10 minutes and the upper phase was transferred to a new container.
Finalmente, adicionou-se o mesmo volume da solução de clorofil e a mistura foi agitada suavemente. Em seguida, centrifugaram-se os tubos a 10.000 rpm durante 10 minutos e a fase superior foi transferida para um novo tubo. A essa fase aquosa superior, adicionou-se 1 volume de álcool isopropílico e a solução foi, então, homogeneizada até a formação de um precipitado de DNA. O DNA precipitado foi lavado no próprio tubo em álcool 70%, por três vezes e foram adicionados 100 μL de água ultra pura. O DNA genômico foi armazenado a 4°C.Finally, the same volume of the chlorophyll solution was added and the mixture was gently stirred. The tubes were then centrifuged at 10,000 rpm for 10 minutes and the upper phase was transferred to a new tube. To this upper aqueous phase, 1 volume of isopropyl alcohol was added and the solution was then homogenized until a DNA precipitate formed. The precipitated DNA was washed in the tube itself in 70% alcohol, three times and 100 μL of ultra pure water was added. Genomic DNA was stored at 4°C.
A presença de SEQ ID NO: 1 no DNA genômico extraído de plantas transgênicas de tabaco foi confirmada pela reação em cadeia da polimerase (PCR). Inicialmente foram utilizados lμL de DNA, l,5μL 4 dNTP (lOmM), l,4μL MgCI2 (25mM), lμL de Primer sense (10μM), lμL Primer antisense (lOμM), 2,5μL Tampão Taq lOx, 0,3μL Taq Polimerase (Fermentas), 16,3μL de água MilliQ e essa reação foi submetida ao seguinte programa de amplificação: 3 minutos à 94°C mais 30 ciclos de 30 segundos à 94°C, 30 segundos a uma temperatura de 54°C, 2 minutos a 72°C e 7 minutos a 72°C.The presence of SEQ ID NO: 1 in genomic DNA extracted from transgenic tobacco plants was confirmed by polymerase chain reaction (PCR). Initially, lμL of DNA, 1.5
O produto dessa reação foi visualizado em gel de agarose 0,8% em TAE contendo brometo de etídeo, sob iluminação de luz ultra-violeta. Dentre 12 amostras de plantas supostamente transgênicas, a presença da SEQ ID NO:1 foi confirmada em 8. Essas plantas foram utilizadas nos ensaios posteriores para observar os efeitos do gene Scdr2 indicado na SEQ ID NO:1 nas características das plantas de tabaco.The product of this reaction was visualized on a 0.8% agarose gel in TAE containing ethidium bromide, under ultraviolet light. Among 12 samples of supposedly transgenic plants, the presence of SEQ ID NO:1 was confirmed in 8. These plants were used in further assays to observe the effects of the Scdr2 gene indicated in SEQ ID NO:1 on the characteristics of tobacco plants.
Para determinar os efeitos do estresse hídrico sobre a germinação foram utilizadas sementes de plantas de tabaco do tipo selvagem e de plantas transgênicas identificadas no Exemplo 4.To determine the effects of water stress on germination, seeds from wild type tobacco plants and from transgenic plants identified in Example 4 were used.
As sementes foram esterilizadas superficialmente com álcool 70% por 1 min, incubadas em NaCIO 2% por 30 min e lavadas por cinco a seis vezes em água destilada estéril. As sementes foram semeadas em placas de Petri (30 sementes por placa) contendo meio Murashige-Skoog (MS) sólido, pH 5,8, em uma câmara a 23°C com fotoperiodo 16 / 8 h luz/escuro (300-400 mmol fótons m'2 s1).The seeds were superficially sterilized with 70% alcohol for 1 min, incubated in 2% NaClO for 30 min and washed five to six times in sterile distilled water. The seeds were sown in Petri dishes (30 seeds per dish) containing solid Murashige-Skoog (MS) medium, pH 5.8, in a chamber at 23°C with photoperiod 16 / 8 h light/dark (300-400 mmol photons m'2 s1).
Então, as sementes que foram transformadas em três eventos independentes (Scdr2-1, Scdr2-2 e Scdr2-3), foram utilizadas para avaliar a porcentagem de germinação em meio de cultura contendo manitol verificando-se a resposta ao estresse hídrico. Para testar o efeito da seca foi utilizado manitol no meio de cultura nas concentrações de 0, 200, 300 e 400 mM. O número de sementes germinadas foi observado diariamente durante 15 dias e a germinação foi definida como o surgimento do hipocótilo.Then, the seeds that were transformed in three independent events (Scdr2-1, Scdr2-2 and Scdr2-3), were used to evaluate the percentage of germination in culture medium containing mannitol, verifying the response to water stress. To test the effect of drought, mannitol was used in the culture medium at concentrations of 0, 200, 300 and 400 mM. The number of germinated seeds was observed daily for 15 days and germination was defined as the emergence of the hypocotyl.
Na condição controle sem manitol, sementes de plantas selvagens e plantas contendo a SEQ ID NO: 1 apresentaram similar porcentagem de germinação (Figura 2A). O estresse hídrico inibe ou reduz a germinação em plantas de tabaco. No meio contendo 200 mM manitol as sementes das plantas contendo a SEQ ID NO: 1 apresentaram uma germinação mais rápida comparada com as sementes selvagens (Figura 2B). Em condições de estresse hídrico mais alto (300 mM), a germinação de plantas selvagens, porem as plantas transgênicas atingiram aproximadamente o 60% (Figura 2C). Portanto, as plantas com o gene Scdr2 indicado em SEQ ID NO: 1 apresentaram maior nível de tolerância ao estresse hídrico.In the control condition without mannitol, seeds from wild plants and plants containing SEQ ID NO: 1 showed similar germination percentage (Figure 2A). Water stress inhibits or reduces germination in tobacco plants. In the medium containing 200 mM mannitol seeds from plants containing SEQ ID NO: 1 showed faster germination compared to wild-type seeds (Figure 2B). Under conditions of higher water stress (300 mM), germination of wild plants, however, transgenic plants reached approximately 60% (Figure 2C). Therefore, plants with the Scdr2 gene indicated in SEQ ID NO: 1 showed a higher level of tolerance to water stress.
Em numerosas plantas cultivadas, a germinação e o crescimento inicial de plântulas são as fases mais sensíveis a estresses abióticos. Por exemplo, alguns fatores ambientais, como baixas temperaturas, altas concentrações de sal ou de déficit hídrico no meio retardam significativamente a germinação e reduzem a taxa de eventos germinativos. A baixa taxa de germinação de sementes pode resultar no estabelecimento irregular no solo, e redução da produtividade. Uma característica da planta desejável para a produção de cultivares comerciais em condições de campo é a habilidade da semente para germinar rapidamente e de forma homogênea sob condições de estresse.In numerous cultivated plants, germination and the initial growth of seedlings are the most sensitive phases to abiotic stresses. For example, some environmental factors such as low temperatures, high salt concentrations or water deficit in the medium significantly delay germination and reduce the rate of germination events. The low rate of seed germination can result in irregular establishment in the soil, and reduced productivity. A desirable plant characteristic for the production of commercial cultivars under field conditions is the ability of the seed to germinate quickly and homogeneously under stress conditions.
As plantas transgênicas contendo a SEQ ID NO: 1 germinaram 40% a mais que as plantas selvagens em altas concentrações de estresse. O desempenho de sementes transgênicas de tabaco carregando o gene de interesse foi melhor do que plantas selvagens em condições de estresse hídrico, indicando que o gene de estudo desempenha um papel protetor nos estágios iniciais de desenvolvimento da planta.Transgenic plants containing SEQ ID NO: 1 germinated 40% more than wild plants at high stress concentrations. The performance of transgenic tobacco seeds carrying the gene of interest was better than wild plants under water stress conditions, indicating that the study gene plays a protective role in the early stages of plant development.
Para determinar os efeitos do estresse hídrico salino sobre a germinação foram utilizados sementes de plantas transgênicas de tabaco do tipo selvagem e transgênicas, identificadas no exemplo 4.To determine the effects of saline water stress on germination, seeds from transgenic wild-type and transgenic tobacco plants identified in example 4 were used.
As sementes foram esterilizadas superficialmente com álcool 70% por 1 min, incubadas em NaCIO 2% por 30 min e lavadas cinco a seis vezes em água destilada estéril. As sementes foram semeadas em placas de Petri (30 sementes por placa) contendo meio Murashige-Skoog (MS) sólido, pH 5,8, em uma câmara a 23°C com fotoperíodo 16/8 h luz/escuro (300-400 mmol fótons m'2 s'1) e para testar o efeito do estresse salino foi utilizado NaCI (0, 100, 175 mM) no meio de cultura. O número de sementes germinadas foi observado diariamente durante 15 dias, sendo a germinação foi definida como o surgimento do hipocótilo.The seeds were superficially sterilized with 70% alcohol for 1 min, incubated in 2% NaClO for 30 min and washed five to six times in sterile distilled water. The seeds were sown in Petri dishes (30 seeds per dish) containing solid Murashige-Skoog (MS) medium, pH 5.8, in a chamber at 23°C with a photoperiod of 16/8 h light/dark (300-400 mmol photons m'2 s'1) and to test the effect of salt stress, NaCI (0, 100, 175 mM) was used in the culture medium. The number of germinated seeds was observed daily for 15 days, and germination was defined as the appearance of the hypocotyl.
Quando as sementes foram plaqueadas em 100 mM NaCI as plantas transgênicas contendo a SEQ ID NO: 1 germinaram muito mais rápido que as plantas selvagens. O 50% da germinação das plantas transgênicas foi atingido no sétimo dia, enquanto as plantas selvagens atingiram o 50% somente no décimo primeiro dia 11 (Figura 2D). No entanto, utilizando-se uma concentração de estresse mais severo (175 mM NaCI), a germinação foi totalmente inibida em sementes selvagens, mas só moderadamente nas plantas contendo SEQ ID NO: 1, as quais atingiram 20% de germinação (Figure 3E). Os resultados demonstram que o gene Scdr2, indicado na SEQ ID NO:1 em plantas transgênicas, melhora a germinação sob estresse salino.When seeds were plated in 100 mM NaCl the transgenic plants containing SEQ ID NO: 1 germinated much faster than wild-type plants. The 50% germination of the transgenic plants was reached on the seventh day, while the wild plants reached 50% only on the eleventh day 11 (Figure 2D). However, using a more severe stress concentration (175 mM NaCI), germination was totally inhibited in wild seeds, but only moderately in plants containing SEQ ID NO: 1, which reached 20% germination (Figure 3E) . The results demonstrate that the Scdr2 gene, indicated in SEQ ID NO:1 in transgenic plants, improves germination under saline stress.
Diferentes respostas a estresses abióticos são o resultado de interações cooperativas entre os vários componentes bioquímicos, fisiológicos e de caracteres morfológicos. Essas interações podem variar entre espécies e mesmo variedades, como observado para o estresse hídrico. Plantas contendo a SEQ ID NO: 1 apresentaram alta nível de tolerância ao estresse salino.Different responses to abiotic stresses are the result of cooperative interactions between the various biochemical, physiological and morphological character components. These interactions can vary between species and even varieties, as observed for water stress. Plants containing SEQ ID NO: 1 showed a high level of salt stress tolerance.
Como mencionado anteriormente, a germinação e o crescimento da plântula são fases muito sensíveis às condições estressantes. Por sua vez, a salinidade dos solos é um problema global, que não só impede o uso de grandes áreas para a agricultura, mas também pode reduzir a produtividade em certas áreas agrícolas, em decorrência do aumento salino ocorrido devido à irrigação com água inapropriada por apresentar elevado conteúdo de sais.As mentioned earlier, germination and seedling growth are phases that are very sensitive to stressful conditions. In turn, soil salinity is a global problem, which not only prevents the use of large areas for agriculture, but can also reduce productivity in certain agricultural areas, as a result of the increase in salinity due to irrigation with inappropriate water by have a high salt content.
Em condições de alta salinidade, enquanto as plantas selvagens apresentaram total inibição da germinação, as plantas transgênicas contendo a SEQ ID NO: 1 apresentaram maior porcentagem de germinação. Conseqüentemente, esta invenção mostra que a SEQ ID NO: 1 é útil para a produção de plantas geneticamente modificadas com maior tolerância à salinidade.Under high salinity conditions, while wild plants showed total inhibition of germination, transgenic plants containing SEQ ID NO: 1 showed a higher percentage of germination. Consequently, this invention shows that SEQ ID NO: 1 is useful for producing genetically modified plants with increased salinity tolerance.
Para avaliar a resposta ao estresse hídrico, plantas selvagens e plantas transgênicas contendo a SEQ ID NO: 1 foram germinadas durante 16 dias e logo transferidas para potes contendo Plantmax HT (Eucatex, Brasil) em câmara de crescimento, a 22°C e com 18 horas de luz. As plantas foram irrigadas diariamente com 70 ml de água por 4 semanas antes de começar o estresse.To evaluate the response to water stress, wild plants and transgenic plants containing SEQ ID NO: 1 were germinated for 16 days and then transferred to pots containing Plantmax HT (Eucatex, Brazil) in a growth chamber at 22°C and 18 hours of light. The plants were irrigated daily with 70 ml of water for 4 weeks before stress began.
Para o estresse hídrico utilizaram-se cinco plantas por tratamento e por genótipo (selvagem e transgênico), as quais foram irrigadas com 100 ml de manitol 200 mM por 10 dias e depois foram irrigadas novamente com água por três dias, como descrito por Zhang et al. (Zhang XX, Liu SK, Takano T (2008) Two cysteine proteinase inhibitors from Arabidopsis thaliana, AtCYSa and AtCYSb, increasing the salt, drought, oxidation and cold tolerance. Plant Molecular Biology 68:131-143).For water stress, five plants per treatment and per genotype (wild and transgenic) were used, which were irrigated with 100 ml of 200 mM mannitol for 10 days and then irrigated again with water for three days, as described by Zhang et al. al. (Zhang XX, Liu SK, Takano T (2008) Two cysteine proteinase inhibitors from Arabidopsis thaliana, AtCYSa and AtCYSb, increasing the salt, drought, oxidation and cold tolerance. Plant Molecular Biology 68:131-143).
Para estimar a condutância estomática de CO2 (gs), taxa de transpiração (E), fotossíntese (A) e concentração interna de C02 (Ci), sob condições controle e sob estresse hídrico, foram utilizadas folhas completamente expandidas na mesma posição das plantas de tabaco.To estimate the stomatal conductance of CO2 (gs), transpiration rate (E), photosynthesis (A) and internal concentration of C02 (Ci), under control conditions and under water stress, fully expanded leaves were used in the same position of the plants of tobacco.
Avaliaram-se três eventos independentes de plantas transgênicas contendo a SEQ ID NO:_1 e plantas selvagens. As medições foram realizadas com equipamento IRGA (LCpro+; ADC bioscientific, Reino Unido), numa concentração de CO2 de 360 μL L'1, intensidade de luz de 1000 μmol m^s'1, fluxo de gás 200 mL min1 e temperatura dentro da câmara de 25°C (Guo Q, Zhang J, Gao Q, Xing S, Li F, et al. (2008) Drought tolerance through overexpression of monoubiquitin in transgenic tobacco. Journal of Plant Physiology 165:1745-1755).Three independent events were evaluated from transgenic plants containing SEQ ID NO:_1 and wild-type plants. Measurements were performed with IRGA equipment (LCpro+; ADC bioscientific, United Kingdom), at a CO2 concentration of 360 μL L'1, light intensity of 1000 μmol m^s'1, gas flow of 200 mL min1 and temperature inside the chamber. 25°C chamber (Guo Q, Zhang J, Gao Q, Xing S, Li F, et al. (2008) Drought tolerance through overexpression of monoubiquitin in transgenic tobacco. Journal of Plant Physiology 165:1745-1755 ).
Todas as variáveis fisiológicas analisadas foram negativamente afetadas pelo estresse hídrico, tanto nas plantas selvagens como nas plantas transgênicas contendo a SEQ ID NO: 1. No entanto, as plantas transgênicas apresentaram melhor desempenho nas análises fisiológicas realizadas. A taxa de fotossíntese (A) nas plantas transgênicas contendo SEQ ID NO: 1, submetidas a estresse hídrico, apresentou uma rápida recuperação quando as plantas foram reidratadas durante 3 dias, ao contrario das plantas selvagens que não conseguiram recuperá-la (dia 13 na Figura 3B).All physiological variables analyzed were negatively affected by water stress, both in wild plants and in transgenic plants containing SEQ ID NO: 1. However, the transgenic plants showed better performance in the physiological analyzes performed. The photosynthesis rate (A) in transgenic plants containing SEQ ID NO: 1, subjected to water stress, showed a rapid recovery when the plants were rehydrated for 3 days, unlike wild plants that failed to recover (day 13 in Figure 3B).
Da mesma forma, tanto gs (Figura 3H) como E (Figura 3K) foram rapidamente recuperadas durante a reidratarão após o estresse hídrico. Ci mostrou valores similares sob condições normais, enquanto que sob condições de estresse as plantas contendo a SEQ ID NO: 1 apresentaram melhor desempenho que as plantas selvagens (Figura 3E). Em resumo, foi observada uma clara diferença entre plantas transgênicas e selvagens em todos os parâmetros fotossintéticos avaliados em condições de seca.Likewise, both gs (Figure 3H) and E (Figure 3K) were rapidly recovered during rehydration after water stress. Ci showed similar values under normal conditions, while under stress conditions plants containing SEQ ID NO: 1 performed better than wild plants (Figure 3E). In summary, a clear difference between transgenic and wild plants was observed in all photosynthetic parameters evaluated under drought conditions.
As culturas agrícolas usualmente experimentam escassez de água em algum momento ao longo do seu ciclo de vida e, dependendo da duração e intensidade do estresse hídrico, podem ocorrer perdas expressivas na produtividade. Parâmetros importantes da fisiologia das plantas quando submetidas a estresse hídrico foram menos afetados naquelas que continham a SEQ ID NO: 1, comparativamente às plantas selvagens. Isto indica que a presente invenção contribui para a produção de plantas geneticamente modificadas com melhor desempenho em condições de escassez de água.Agricultural crops usually experience water scarcity at some point throughout their life cycle and, depending on the duration and intensity of water stress, significant losses in productivity can occur. Important parameters of plant physiology when subjected to water stress were less affected in those containing SEQ ID NO: 1, compared to wild plants. This indicates that the present invention contributes to the production of genetically modified plants with better performance in conditions of water scarcity.
Para avaliar o efeito da SEQ ID NO: 1 em condições de estresse salino, plantas selvagens e plantas transgênicas contendo a SEQ ID NO: 1 foram germinadas durante 16 dias e logo transferidas para potes contendo Plantmax HT (Eucatex, Brasil) em câmara de crescimento a 22°C e 18 horas de luz. As plantas foram irrigadas diariamente com 100 ml de água por 4 semanas antes de começar o estresse.To evaluate the effect of SEQ ID NO: 1 under salt stress conditions, wild plants and transgenic plants containing SEQ ID NO: 1 were germinated for 16 days and then transferred to pots containing Plantmax HT (Eucatex, Brazil) in a growth chamber. at 22°C and 18 hours of light. The plants were irrigated daily with 100 ml of water for 4 weeks before stress began.
Para avaliar o efeito do estresse salino, plantas transgênicas e selvagens foram regularmente irrigadas com água por cinco semanas (tratamento controle), enquanto um grupo de plantas foi irrigado com 175 mM NaCI por 10 dias e posteriormente foram reidratadas por três dias com água (nas plantas controle foi mantida a irrigação durante o tempo do experimento).To assess the effect of salt stress, transgenic and wild-type plants were regularly irrigated with water for five weeks (control treatment), while a group of plants was irrigated with 175 mM NaCI for 10 days and then rehydrated for three days with water (in the control plants were kept under irrigation during the time of the experiment).
Três eventos independentes de plantas transgênicas contendo a SEQ ID NO: 1 foram avaliados em termos de condutância estomática (gs), taxa de transpiração (E), fotossíntese (A), e concentração interna de COz (Ci), sob condições controle e sob estresse salino.Three independent events from transgenic plants containing SEQ ID NO: 1 were evaluated in terms of stomatal conductance (gs), transpiration rate (E), photosynthesis (A), and internal CO2 concentration (Ci), under control conditions and under saline stress.
A avaliação da taxa de fotossíntese (A) em plantas transgênicas contendo a SEQ ID NO: 1 foi reduzida em resposta ao estresse salino, apresentando uma rápida recuperação quando as plantas foram reidratadas durante três dias, enquanto que as plantas selvagens não apresentaram essa recuperação (Figura 3C). Por sua vez, tanto gs, (Figura 31) como E (Figura 3L) foram rapidamente recuperados durante a reidratação após o estresse salino. Ci mostrou similares valores sob condições normais, embora sob condições de estresse as plantas contendo a SEQ ID NO: 1 apresentaram melhor desempenho que as plantas selvagens (Figura 3F).The assessment of photosynthesis rate (A) in transgenic plants containing SEQ ID NO: 1 was reduced in response to saline stress, showing a rapid recovery when plants were rehydrated for three days, while wild plants did not show such recovery ( Figure 3C). In turn, both gs (Figure 31) and E (Figure 3L) were rapidly recovered during rehydration after saline stress. Ci showed similar values under normal conditions, although under stress conditions plants containing SEQ ID NO: 1 performed better than wild plants (Figure 3F).
Em resumo, foi observada que as plantas contendo a SEQ ID NO: 1 apresentaram melhor performance que as plantas selvagens em todos os parâmetros fotossintéticos avaliados durante o estresse salino.In summary, it was observed that plants containing SEQ ID NO: 1 performed better than wild plants in all photosynthetic parameters evaluated during salt stress.
Sementes de tabaco selvagens e transgênicas contendo a SEQ ID NO: 1 foram germinadas por 16 dias em placas de Petri contendo meio MS e pH 5,8. As plântulas foram então transferidas para vasos de 500 ml contendo Plantmax HT (Eucatex, Brasil) durante 3 semanas mantidos em uma câmara de crescimento a 23 °C com fotoperíodo 16/8 h luz/escuro e adubadas semanalmente com solução nutritiva (EPPQ, Brasil). Cada planta foi irrigada com 100 ml de uma solução de 200 mM de manitol por 10 dias e, em seguida, irrigada por três dias com água pura para a recuperação.Wild and transgenic tobacco seeds containing SEQ ID NO: 1 were germinated for 16 days in Petri dishes containing MS medium and pH 5.8. The seedlings were then transferred to 500 ml pots containing Plantmax HT (Eucatex, Brazil) for 3 weeks kept in a growth chamber at 23 °C with 16/8 h light/dark photoperiod and fertilized weekly with nutrient solution (EPPQ, Brazil ). Each plant was irrigated with 100 ml of a 200 mM mannitol solution for 10 days and then irrigated for three days with pure water for recovery.
Para estimar-se o teor de água na folha, amostras de plantas foram incubadas a 80 °C por 24 horas para avaliar o seu peso seco. O teor de água na Folha foi calculado como 100x(FW- DW)/(FW), sendo FW a massa fresca e DW o peso seco. Sob estresse hídrico o conteúdo de água nas folhas foi reduzido drasticamente nas plantas selvagens (Figura 4). Em contraste, plantas transgênicas contendo SEQ ID NO: 1 foram capazes de manter quase inalterado seu conteúdo de água, indicando que a SEQ ID NO: 1 confere uma capacidade maior de manutenção da turgência sob condições de estresse hídrico.To estimate leaf water content, plant samples were incubated at 80 °C for 24 hours to assess their dry weight. Leaf water content was calculated as 100x(FW-DW)/(FW), with FW being the fresh mass and DW the dry weight. Under water stress the water content in leaves was drastically reduced in wild plants (Figure 4). In contrast, transgenic plants containing SEQ ID NO: 1 were able to maintain their water content almost unchanged, indicating that SEQ ID NO: 1 confers a greater ability to maintain turgor under water stress conditions.
Sementes de tabaco selvagens e transgênicas contendo a SEQ ID NO: 1 foram germinadas por 16 dias em placas de Petri contendo meio MS e pH 5,8. As plântulas foram transferidas para vasos de 500 ml contendo Plantmax HT (Eucatex, Brasil) durante 3 semanas e mantidas em câmara de crescimento a 23 °C com fotoperíodo 16/8 h luz/escuro, sendo adubadas semanalmente com solução nutritiva (EPPQ, Brasil). Cada planta foi irrigada com 100 ml de uma solução de 175 mM de NaCI por 10 dias e, em seguida, irrigada por três dias com água pura para a recuperação.Wild and transgenic tobacco seeds containing SEQ ID NO: 1 were germinated for 16 days in Petri dishes containing MS medium and pH 5.8. The seedlings were transferred to 500 ml pots containing Plantmax HT (Eucatex, Brazil) for 3 weeks and kept in a growth chamber at 23 °C with 16/8 h light/dark photoperiod, being fertilized weekly with nutrient solution (EPPQ, Brazil ). Each plant was irrigated with 100 ml of a 175 mM NaCl solution for 10 days and then irrigated for three days with pure water for recovery.
Para estimar o teor de água na folha, amostras de plantas foram incubadas a 80 °C por 24 horas para avaliar o seu peso seco. O teor de água na folha foi calculado como ÍOOx(FW-DW) /(FW), sendo FW a massa fresca e DW o peso seco.To estimate leaf water content, plant samples were incubated at 80 °C for 24 hours to assess their dry weight. The water content in the leaf was calculated as 100x(FW-DW) /(FW), with FW being the fresh mass and DW the dry weight.
O estresse salino diminuiu o conteúdo de água nas plantas selvagens, enquanto que as plantas transgênicas contendo a SEQ ID NO: 1 foram capazes de manter quase inalterado o conteúdo de água na folha (Figura 4), indicando que as plantas que superexpressam Scdr2 são capazes de manter a turgência sob condições de estresse.Salt stress decreased water content in wild plants, while transgenic plants containing SEQ ID NO: 1 were able to maintain almost unchanged leaf water content (Figure 4), indicating that plants that overexpress Scdr2 are able to to maintain turgor under stress conditions.
Plantas de tabaco selvagens e plantas transgênicas contendo SEQ ID NO: 1 foram germinadas durante 16 dias e logo transferidas para recipientes contendo Plantmax HT (Eucatex, Brazil). As plantas foram depositadas numa câmara de crescimento a 22°C com 18 horas de luz e irrigadas diariamente com 100 ml de água por 4 semanas antes de começar o estresse. Para o estresse hídrico as plântulas foram irrigadas com 100 ml de manitol 200 mM, por 10 dias, e depois foram irrigadas novamente com água por três dias, como descrito por Zhang et al. (Zhang XX, Liu SK, Takano T (2008) Two cysteine proteinase inhibitors from Arabidopsis thaliana, AtCYSa and AtCYSb, increasing the salt, drought, oxidation and cold tolerance. Plant Molecular Biology 68:131-143).Wild tobacco plants and transgenic plants containing SEQ ID NO: 1 were germinated for 16 days and then transferred to containers containing Plantmax HT (Eucatex, Brazil). The plants were placed in a growth chamber at 22°C with 18 hours of light and irrigated daily with 100 ml of water for 4 weeks before stress began. For water stress, the seedlings were irrigated with 100 ml of 200 mM mannitol for 10 days, and then they were irrigated again with water for three days, as described by Zhang et al. (Zhang XX, Liu SK, Takano T (2008) Two cysteine proteinase inhibitors from Arabidopsis thaliana, AtCYSa and AtCYSb, increasing the salt, drought, oxidation and cold tolerance. Plant Molecular Biology 68:131-143).
Amostras das plantas foram coletadas e mantidas a 80 °C por 24 horas para avaliação da massa seca nas raízes e na parte aérea, como descrito por Guo et al. (Guo Q, Zhang J, Gao Q, Xing S, Li F, et al. (2008) Drought tolerance through overexpression of monoubiquitin in transgenic tobacco. Journal of Plant Physiology 165:1745-1755).Plant samples were collected and kept at 80 °C for 24 hours to evaluate the dry mass in the roots and shoots, as described by Guo et al. (Guo Q, Zhang J, Gao Q, Xing S, Li F, et al. (2008) Drought tolerance through overexpression of monoubiquitin in transgenic tobacco. Journal of Plant Physiology 165:1745-1755 ).
Observou-se uma redução na massa das plantas selvagens e transgênicas quando submetidas à seca, comparativamente às do tratamento controle. No entanto, ao final do tratamento de estresse hídrico, as plantas transgênicas contento a SEQ ID NO:1 apresentaram mais massa seca que as plantas selvagens (Figura 5).A reduction in the mass of wild and transgenic plants was observed when submitted to drought, compared to the control treatment. However, at the end of the water stress treatment, transgenic plants containing SEQ ID NO:1 had more dry mass than wild plants (Figure 5).
Plantas de tabaco selvagens e plantas transgênicas contendo a SEQ ID NO: 1 foram germinadas durante 16 dias e logo transferidas para potes contendo Plantmax HT (Eucatex, Brazil), permaneceram localizadas numa câmara de crescimento a 22°C com 18 horas de luz e foram irrigadas diariamente com 100 ml de água por 4 semanas antes de começar o estresse. Para o estresse salino as plantas foram irrigadas com 100 ml de NaCI 175 mM, por 10 dias, e depois foram irrigadas novamente com água por três dias, como descrito por Zhang et al. (Zhang XX, Liu SK, Takano T (2008) Two cysteine proteinase inhibitors from Arabidopsis thaliana, AtCYSa and AtCYSb, increasing the salt, drought, oxidation and cold tolerance. Plant Molecular Biology 68:131-143).Wild tobacco plants and transgenic plants containing SEQ ID NO: 1 were germinated for 16 days and then transferred to pots containing Plantmax HT (Eucatex, Brazil), remained located in a growth chamber at 22°C with 18 hours of light and were irrigated daily with 100 ml of water for 4 weeks before stress starts. For saline stress, the plants were irrigated with 100 ml of 175 mM NaCI for 10 days, and then they were irrigated again with water for three days, as described by Zhang et al. (Zhang XX, Liu SK, Takano T (2008) Two cysteine proteinase inhibitors from Arabidopsis thaliana, AtCYSa and AtCYSb, increasing the salt, drought, oxidation and cold tolerance. Plant Molecular Biology 68:131-143).
Amostras das plantas transformadas foram coletadas e mantidas a 80 °C por 24 horas para avaliação da massa seca nas raízes e na parte aérea, como descrito por Guo et al. (Guo Q, Zhang J, Gao Q, Xing S, Li F, et al. (2008) Drought tolerance through overexpression of monoubiquitin in transgenic tobacco. Journal of Plant Physiology 165:1745-1755).Samples of the transformed plants were collected and kept at 80 °C for 24 hours to evaluate the dry mass in the roots and shoots, as described by Guo et al. (Guo Q, Zhang J, Gao Q, Xing S, Li F, et al. (2008) Drought tolerance through overexpression of monoubiquitin in transgenic tobacco. Journal of Plant Physiology 165:1745-1755 ).
Observou-se que o estresse salino reduz a massa seca de plantas selvagens e transgênicas. No entanto, a presença da SEQ ID NO: 1 nas plantas transgênicas associou-se à uma maior capacidade de acumulação de matéria seca em condições de estresse salino (Figura 5).It was observed that saline stress reduces the dry mass of wild and transgenic plants. However, the presence of SEQ ID NO: 1 in the transgenic plants was associated with a greater ability to accumulate dry matter under saline stress conditions (Figure 5).
Para avaliar a resposta aos estresses hídrico e salino, plantas selvagens e plantas transgênicas contendo a SEQ ID NO:1 foram germinadas durante 16 dias e logo transferidas para potes contendo Plantmax HT (Eucatex, Brasil) em câmara de crescimento a 22°C com 18 horas de luz e irrigadas diariamente com 100 ml de água por 4 semanas antes de começar o estresse. Para avaliar o efeito do estresse hídrico as plântulas foram irrigadas com 100 ml de manitol 200 mM por 10 dias e depois foram irrigadas novamente com água por três dias, como descrito por Zhang et al.(Zhang XX, Liu SK, Takano T (2008) Two cysteine proteinase inhibitors from Arabidopsis thaliana, AtCYSa and AtCYSb, increasing the salt, drought, oxidation and 5 cold tolerance. Plant Molecular Biology 68: 131-143) e para avaliar o efeito do estresse salino as plantas foram irrigadas com 175 mM NaCI por 10 dias e posteriormente foram reidratadas por três dias com água. No tratamento controle as plantas foram irrigadas durante o tempo do experimento.To evaluate the response to water and salt stress, wild plants and transgenic plants containing SEQ ID NO:1 were germinated for 16 days and then transferred to pots containing Plantmax HT (Eucatex, Brazil) in a growth chamber at 22°C with 18 hours of light and irrigated daily with 100 ml of water for 4 weeks before stress starts. To assess the effect of water stress, seedlings were irrigated with 100 ml of 200 mM mannitol for 10 days and then again irrigated with water for three days, as described by Zhang et al. (Zhang XX, Liu SK, Takano T (2008) ) Two cysteine proteinase inhibitors from Arabidopsis thaliana, AtCYSa and AtCYSb, increasing the salt, drought, oxidation and 5 cold tolerance. Plant Molecular Biology 68: 131-143) and to evaluate the effect of salt stress the plants were irrigated with 175 mM NaCI for 10 days and later they were rehydrated for three days with water. In the control treatment, the plants were irrigated during the time of the experiment.
Em condições controle, todas as plantas tiveram resultados semelhantes (figura 6), 10 enquanto sob estresse hídrico e salino as folhas das plantas selvagens apresentaram murchas. Por sua vez, as plantas transgênicas contendo a SEQ, ID NO: 1 exibiram um fenótipo praticamente similar às plantas mantidas sem estresse (figura 6).Under control conditions, all plants had similar results (figure 6), 10 while under water and saline stress the leaves of wild plants were wilted. In turn, transgenic plants containing SEQ ID NO: 1 exhibited a phenotype practically similar to plants maintained without stress (figure 6).
Essas mesmas plantas foram usadas nas análises mostradas nos exemplos 7 e 8 e estão em concordância com a melhor performance das plantas em quanto ao parâmetros 15 fotossintéticos. Da mesma forma, esse fenótipo observado na Figura 6 também é um reflexo dos maiores teores de água mostrados nos exemplos 9 e 10, bem como com a maior massa seca mostrada nos exemplos 11 e 12.These same plants were used in the analyzes shown in examples 7 and 8 and are in agreement with the best performance of the plants in terms of photosynthetic parameters. Likewise, this phenotype seen in Figure 6 is also a reflection of the higher water contents shown in Examples 9 and 10, as well as the higher dry mass shown in Examples 11 and 12.
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