BRPI1004680A2 - uso de extrato de pterodon, e composiÇço farmacÊutica contendo o mesmo para o tratamento da sepse - Google Patents

Abstract

USO DE EXTRATO DE PTERODON, E COMPOSIÇçO FARMACÊUTICA CONTENDO O MESMO PARA O TRATAMENTO DA SEPSE. A presente invenção proporciona extratos vegetais e composições farmacêuticas compreendendo tais extratos. As composições farmacêuticas da invenção compreendem extratos de uma planta do gênero Pterodon, preferencialmente Pterodon pubescens, são antiinflamatórias e são também úteis para o tratamento da sepse, podendo opcionalmente estar associadas a outros ativos.

Description

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Relatório Descritivo de Patente de invenção

Uso de Extrato de Pterodon, ε Composição Farmacêutica Contendo o Mesmo para o Tratamento da Sepse

Campo da Invenção

A presente invenção está no campo da Medicina, Biologia, Química e

Farmácia. Mais especificamente, a presente invenção proporciona extratos vegetais e composições farmacêuticas compreendendo tais extratos. As composições farmacêuticas da invenção compreendem extratos de uma planta do gênero Pterodon, preferencialmente Pterodon pubescens, são antiinflamatórias e são também úteis para o tratamento da sepse, podendo opcionalmente estar associadas a outros ativos.

Antecedentes da Invenção

Síndrome da Resposta Inflamatória Sistêmica (SRIS) é uma resposta inflamatória desencadeada pelo organismo frente causas infecciosas e não- infecciosas, incluindo pancreatite, queimadura ou trauma1. Dentre os critérios clínicos para identificação da SRIS encontram-se: temperatura > 38°C ou < 36°C; freqüência cardíaca > 90 batimentos/min; freqüência respiratória > 20 movimentos/min ou PaCO2 < 32 mmHg; leucócitos > 12000 células/mm3, menor que 4000 células/mm3 ou mais que 10% de células imaturas (Journal of Pharmacological Sciences, Kioto, v. 101, p. 189-198, 2006).

Neste contexto, define-se sepse quando a SRIS é causada por bactérias, vírus, fungos ou parasitos, sendo a sepse simples uma infecção associada a dois critérios clínicos da SRIS. A sepse severa é definida pelo desenvolvimento da SRIS associada a, no mínimo, uma disfunção orgânica (cardiovascular, respiratória, renal, hepática, neurológica, metabólica ou hematológica), hipotensão ou hipoperfusão (Criticai Care Medicine, Baltimore, v. 101, p. 864-874, jun, 1992). Quando pacientes sépticos possuem estes dois últimos sintomas associados a acidose lática, oligúria e alteração do estado mental, caracteriza-se um estado de choque séptico (Revista da Associação Médica Brasileira, São Paulo, v.45, n. 1, p. 86-92, jan-mar, 1999.).

A sepse se desenvolve quando a resposta inflamatória inicial a infecção se amplifica e torna-se desregulada e excessiva, caracterizada pela ativação do sistema complemento e hiperativação da resposta imune celular inata (Nat Rev Immunoi., v. 8, n. 10, p. 776-787, out, 2008). Os primeiros sintomas incluem febre, confusão mental, hipotensão, diurese diminuída e trombocitopenia, aparecendo de forma gradual e lenta. Se não tratada, o paciente pode desenvolver falha renal, anormalidade de coagulação e hipotensão profunda (Nature, Londres, v. 420, p. 19-26, dez, 2002).

Epidemioloaia

A sepse, apesar dos avanços no diagnóstico e tratamento, permanece uma importante causa de internação e de mortalidade em Unidades de Terapia Intensiva (UTIs) (Revista Brasileira de Terapia Intensiva, São Paulo, v. 20, n. 2, p. 128-134, abr-jun, 2008). Segundo Teles et al. (2003), a mortalidade varia entre 20% e 80% na maioria dos estudos. A incidência de sepse severa nos Estados Unidos foi estimada em 751.000 casos por ano, enquanto no Brasil a estimativa foi de 400.000 novos casos por ano (Shock, Alabama, v. 30, sup. 1, p. 47-52, mar, 2008).

No Brasil, um estudo realizado por Sales et al. (2006) mostrou uma taxa de mortalidade global nos pacientes sépticos de 46,6%, sendo que a mortalidade entre pacientes com sepse severa foi de 34,4%. Outro aspecto observado neste estudo foi a tendência de predominância do sexo masculino (55,7%) e da alta média de idade (61,7 anos) (Revista Brasileira de Terapia Intensiva, São Paulo, v. 18, n. 1, p. 9-17, jan-mar, 2006). Este estudo corrobora os dados do Estudo Brasileiro de Epidemiologia da Sepse (BASES), realizado em 2004, que mostrou média de idade de 65,2 anos e predominância de homens (58,7%); a taxa de « <

mortalidade para a sepse severa foi maior, 47,3% (Criticai Care Medicine, Baltimore, v. 8, n. 4, p. 251-260, ago, 2004).

Na Europa, um estudo observacional mostrou alta freqüência de sepse nas UTIs onde mais de 35% dos pacientes evoluíram para um quadro de sepse durante a internação. O estudo traz ainda altas taxas de mortalidade (27%) para sepse e 32,2% para a sepse severa (Criticai Care Medicine, Baltimore, v. 34, n. 2, p. 334-353, fev, 2006).

Nos Estados Unidos foi realizado um grande estudo, abrangendo um período de 22 anos (1979-2000), que constatou o aumento progressivo da idade dos pacientes com sepse, de 57,4 para 60,8 anos, ao longo desse período. Da mesma forma, verificou-se que a cada ano os homens se tornaram mais suscetíveis a ter sepse do que as mulheres. Durante este período, houve aumento no número de pacientes com sepse, triplicando a mortalidade nos hospitais. Além disso, a proporção de pacientes com sepse que tiveram alguma disfunção orgânica aumentou ao longo do tempo, de 19,1% nos primeiros onze anos para 30,2% nos últimos anos, sendo que os órgãos que mais falharam foram os pulmões (18%) e rins (15%). Ainda segundo Martin et al., as possíveis razões para aumento da incidência de sepse incluem aumento da realização de procedimentos invasivos, uso de fármacos imunossupressores, quimioterapia, transplantes, infecção por Vírus da Imunodeficiência Humana (HIV) e aumento da resistência microbiana (The New Engiand Journal of Medicine, Londres, v. 34, n. 16, p. 1547-1554, abr, 2003).

O número de casos e as altas taxas de mortalidade implicam em alto custo econômico para os países. No Brasil, estima-se que 8,5 bilhões de dólares sejam gastos somente com pacientes sépticos. Nos Estados Unidos, este valor está próximo de 17 bilhões. Nos Estados Unidos, a sepse é ainda a segunda maior causa de morte de pacientes em UTI por causas não-coronarianas e a décima causa geral de mortalidade. No Estudo COSTS (2007), observou-se que o custo médio diário com não-sobreviventes é mais alto quando comparado com o custo 1

com sobreviventes, indicando um aumento no uso de recursos nestes pacientes na tentativa de reverter o desfecho fatal (Pharmacoeconomics, v. 26, p. 425-434, 2008).

Imunopatologia da Sepse A inflamação é uma resposta protetora do organismo na qual a produção de

citocinas é controlada e os leucócitos são devidamente ativados para eliminar o agente infeccioso. Entretanto, a resposta imune inata excessiva foi relacionada ao desencadeamento da resposta hiperinflamatória desregulada na sepse (European Journal of Anaesthesiology, Cambridge, sup. 42, p. 146-153, fev, 2008). A fisiopatologia da sepse envolve complexas reações desencadeadas pelos patógenos, sendo de extrema importância identificar os componentes estruturais responsáveis pela iniciação do processo séptico (Journal of Intensive Care Medicine, Massachusetts, v. 22, n. 2, p. 63-72, mar, 2007).

As bactérias gram-positivas possuem em suas paredes peptideoglicano e ácido lipoteicóico, os quais são pró-inflamatórios e podem interagir com a superfície de receptores presentes na membrana de fagócitos. No entanto, uma importante característica das células gram-positivas é a produção de exotoxinas, algumas dessas envolvidas no choque séptico, como a toxina da síndrome do choque tóxico-1 (TSST-1) do Staphylococcus aureus e exotoxinas pirogênicas do Streptococcus pyogenes.

Em bactérias gram-negativas, o lipossacarídeo (LPS; também conhecido como endotoxina), encontrado na membrana da bactéria, se liga a superfície da molécula CD14, presente em macrófagos, monócitos e neutrófilos, transmitindo a sinalização através de uma proteína transmembrana, identificada como receptor toll-like (TLR). O LPS é mais ativo que o peptideoglicano e o ácido lipoteicóico presente em gram-positivos, possuindo um papel mais dominante na indução da sepse (Nature, Londres, v. 420, p. 19-26, dez, 2002).

A família dos TLRs (formada por dez subtipos até o momento) foi identificada com uma ampla variedade de Iigantes específicos, incluindo proteínas 1 »

bacterianas, fúngicas e de leveduras. O TLR4 é responsável pelo reconhecimento do LPS1 enquanto o TRL2 reconhece estruturas da parede celular de gram- positivos. Partículas virais também se ligam ao CD14, ativando a sinalização do TLR; o TLR3 responde ao RNA viral. A forma disseminada da infecção fúngica pode iniciar a cascata de liberação de citocinas através da interação de partículas de Cryptococcus neoformans e Aspergillus fumigatus com TLR4 Journal of Intensive Care Medicine, Massachusetts, v. 22, n. 2, p. 63-72, mar, 2007).

Citocinas

Após o estimulo inicial, há uma ampla ativação da resposta imune inata, a qual coordena a resposta envolvendo os componentes celular e humoral. Células mononucleares desempenham um importante papel liberando as clássicas interleucinas IL-1, IL-6 e fator de necrose tumoral-alfa (TNF-α), além de outras citocinas, incluindo IL-10, IL-12, IL-15 e IL-18. Este ambiente pró-inflamatório causa a liberação de mediadores secundários, entre eles citocinas, mediadores lipídicos e espécies reativas do oxigênio, amplificando o processo inflamatório. (Nat Rev Immunol., v. 8, n. 10, p. 776-787, out, 2008; Nature, Londres, v. 420, p. 19-26, dez, 2002).

O TNF-α estimula a liberação de outras citocinas como a IL-1, IL-6, interferon-γ, IL-12, síntese de oxido nítrico, moléculas de adesão celular, componentes do complemento e IL-8. A IL-1 produz aumento na concentração de fatores estimuladores de colônia, IL-6, proteínas de fase aguda hepática e reabsorção óssea. (Revista da Associação Médica Brasileira, São Paulo, v.45, n. 1, p. 86-92, jan-mar, 1999; Journal of Intensive Care Medicine, Massachusetts, v. 22, n. 2, p. 63-72, mar, 2007). A IL-6, produzida pelas células T, células B e endotélio, induz a proliferação

de células TeBea produção de proteínas de fase aguda. A IL-8 é secretada por macrófagos ativados, neutrófilos e células de Kupffer, agindo como agente quimiotático para neutrófilos e células T. Outra citocina identificada, inclusive como potencial alvo terapêutico na sepse, é o fator inibitório de migração de macrófago ι 6/33

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(MIF)1 ο qual promove a expressão de TNF-α. A liberação de MIF ocorre imediatamente após a ativação de macrófagos e monócitos. Outro alvo terapêutico identificado recentemente é o grupo de alta mobilidade B1 (HMGB1), o qual é secretado por macrófagos ativados. Ao contrário de outras citocinas associadas a sepse, o pico de liberação da HMGB1 ocorre em estágios tardios da doença e os níveis não diminuem sempre em pacientes recuperados; os níveis plasmáticos de HMGB1 não necessariamente se correlacionam com a sobrevivência ou outro desfecho (Journal of Intensive Care Medicine, Massachusetts, v. 22, n. 2, p. 63- 72, mar, 2007; Nat Rev Immunol., v. 8, n. 10, p. 776-787, out, 2008). Apoptose

A apoptose de linfócitos foi observada em modelos animais e na autópsia de pacientes que morreram de sepse. Essa depleção de linfócitos, assim como das células dendríticas, contribui para a supressão da resposta imune, devido a função protetora dos linfócitos na sepse polibacteriana e a apresentação de antígeno pelas células dendríticas. Assim, essa imunossupressão implica em um risco aumentado destes pacientes adquirirem infecção nosocomial. Ao contrário dos linfócitos e células dendríticas, a apoptose de macrófagos e neutrófilos parece não ser afetada ou até estar diminuída na sepse, o que leva ao aumento dos danos causados por suas citocinas pró-inflamatórias (Nat Rev Immunol., v. 8, n. 10, p. 776-787, out, 2008; European Journal of Anaesthesiology, Cambridge, sup. 42, p. 146-153, fev, 2008).

Coagulação e disfuncão orgânica

Existem evidências de que a sepse é uma condição que afeta, além do sistema imune, outros sistemas biológicos, como a coagulação. As anormalidades da coagulação são comuns na sepse e 30 a 50% dos pacientes possuem a forma clínica mais severa, a coagulação intravascular disseminada (CID) (Nature, Londres, v. 420, p. 19-26, dez, 2002). Os mecanismos da coagulação são iniciados pelo LPS e outros componentes microbianos, induzindo a expressão do fator tecidual. Este é responsável pela ativação de uma série de cascatas proteolíticas, ι 1

ο que resulta na conversão de protrombina em trombina e formação de fibrina. Na fase tardia da CID, a deposição microvascular de fibrina é associada ao desenvolvimento de disfunção de múltiplos órgãos (Nature, Londres, v. 420, p.19- 26, dez, 2002; Nat Rev Immunol., v. 8, n. 10, p. 776-787, out, 2008).

Tipicamente, pacientes desenvolvem primeiro a disfunção de um único

órgão, por exemplo, disfunção respiratória, desenvolvendo progressivamente falha em outros sistemas. Hipoperfusão e hipoxia, relacionadas a deposição de fibrina e oclusão microvascular, são fatores determinantes para este desfecho. O desenvolvimento de exudatos também compromete a oxigenação. Além disso, as células infiltradas lesam o tecido diretamente pela liberação de enzimas Iisossomais e espécies reativas do oxigênio, enquanto o óxido nítrico causa instabilidade vascular e pode também contribuir para a depressão do miocárdio que ocorre na sepse (Nature, Londres, v. 420, p. 19-26, dez, 2002).

Tratamento da Sepse

Apesar de ainda buscar por uma melhor compreensão da doença, houve

grandes avanços em relação ao diagnóstico precoce, rastreamento microbiano mais eficaz, ao uso de técnicas hemodinâmicas e de suporte orgânico e controle metabólico. Segundo o Protocolo Clínico da Secretária de Saúde do Distrito Federal (2010), o tratamento da sepse severa inclui duas etapas: nas primeiras seis horas segue o Pacote de Ressurreição, seguido do Pacote de Manejo que atingirá as primeiras 24 horas, não havendo mais consenso depois de decorrido este tempo (Tratamento da Sepse Grave e Choque séptico em indivíduos adultos. 2010. Disponível em: www.saude.df.gov.br/sites/100/163/00006875.doc; Acesso em: 14 abr 2010). O pacote de ressurreição trata o diagnóstico através da administração de

antibióticos de amplo espectro por via intravenosa (VI), coleta de amostras para cultura e melhora da perfusão do paciente (inicialmente utiliza-se dopamina ou noradrenalina, sendo a adrenalina o vasopressor de segunda linha). O pacote de manejo inclui como medidas a administração de corticóides (hidrocortisona intravenosa na dose de 200-300 mg/dia por sete dias), uso de proteína C ativada, ventilação mecânica preventiva e controle glicêmico, mantendo os níveis abaixo de 180 mg/dL.

A administração da antibioticoterapia empírica de amplo espectro deve ser iniciada após a identificação da sepse severa, uma vez que o risco de morte aumenta a medida que há um atraso de administração. Após os resultados de cultura, o esquema de antibióticos pode ser reduzido de acordo com a suscetibilidade do agente infeccioso (Infection and Immunity, Washington v. 37, n. 2, p. 6603-6610, dez, 1999). Em estudo realizado por Zanon et al. (2008) em UTIs de Passo Fundo,

Brasil: "Os antibióticos de uso mais freqüente foram as cefalosporinas (48,4%) agentes antianaeróbicos (36,3%) e antibióticos beta-lactâmicos (26,4%). Em 26,1% dos casos foi usado somente um antibiótico; dois em 28,6%; três ou mais em 24% dos pacientes." A preocupação no uso de antibióticos de amplo espectro e terapia

combinada está na resistência microbiana e nefrotoxicidade. O uso de monoterapia com beta-lactâmicos foi comparada ao uso combinado com aminoglicosídeos, mostrando que na monoterapia o desfecho nefrotoxicidade foi menor (2%) em relação a combinação (9%). No entanto, a falha no tratamento foi maior com a monoterapia (Projeto Diretrizes, São Paulo, p. 163-181, jun, 2009).

No caso de infecção sistêmica por Candida sp, por sua baixa toxicidade e alta sensibilidade, o fluconazol pode ser utilizado como opção terapêutica na dose de ataque de 800 mg (12 mg/kg peso), seguido de 400 mg (6 mg/kg) diariamente. No entanto, estudos multicêntricos indicam as equinocandinas como primeira opção (caspofungina: dose de ataque de 70 mg, seguida de 50 mg diariamente; ou anidulafungina: dose de ataque de 200 mg, seguida de 100 mg diariamente) e formulações de anfotericina B como segunda opção.

A despeito da terapia convencional da sepse, com a melhor compreensão do mecanismo imunopatológico, os mediadores inflamatórios e endotoxinas 9/33

tornaram-se inovadores alvos terapêuticos. Portanto, novas medicações que visam agir na cascata inflamatória e da coagulação surgem como opção de tratamento a medida que este mecanismo imunológico é identificado. A proteína C ativada recombinante, por exemplo, foi aprovada como medicamento para tratamento da sepse. Esta é uma proteína anticoagulante e sua administração visa suprimir a produção de citocinas pró-inflamatórias e a adesão de fagócitos ao tecido lesado. No entanto, sua atividade anticoagulante pode exacerbar complicações sangüíneas, como eventos hemorrágicos graves.

O uso de plantas com fins medicinais tem sido uma das práticas mais antigas na humanidade no tratamento, cura e prevenção de doenças. Mesmo com a evolução da medicina alopática, a partir de meados do século XX, são crescentes os registros por tratamentos com fitoterápicos, não somente pela tradição e benefícios do seu uso, mas pela facilidade de sua obtenção pelas populações carentes, especialmente aquelas de países em desenvolvimento (VEIGA JÚNIOR & PINTO, 2005).

A sucupira-branca tem sido utilizada na medicina popular do país como um importante adjuvante contra diferentes enfermidades, principalmente em afecções inflamatórias. Contudo, ainda são raras as pesquisas relacionadas ao seu uso no tratamento de doenças ou síndromes, sendo os efeitos demonstrados pela ciência apenas recentemente (SABINO et ai, 1999).

Estudos fitoquímicos a partir do gênero Pterodon demonstram a presença de diversos compostos como alcalóides (MORS et ai, 1966), flavonóides e isoflavonas (MARQUES et ai, 1998; BRAZ FILHO & GOTTLIEB, 1971; BRAZ FILHO et ai, 1970; ARRIAGA et ai, 2000), diterpenos (FASCIO et ai, 1976; CAMPOS et ai, 1994; OMENA et ai, 2006; VIEIRA et ai, 2008; SILVA et ai, 2004; COELHO et al., 2005; ARRIAGA et ai, 2000; MENNA-BARRETO et ai, 2008); triterpenos (MARQUES et ai, 1998), farnesol (SILVA et ai, 2004), sesquiterpenos e derivados de compostos vouacapânicos e não vouacapânicos (COELHO ef ai, 2005). De acordo com Di Mascio e colaboradores (1997) os extratos alcoólicos de sementes de sucupira-branca (Pterodon sp.) são utilizados no tratamento de doenças reumáticas, sendo os efeitos nocivos aos tecidos, por processo inflamatório, amenizados pela presença de quatro diterpenos furânicos encontrados nos extratos, que são 6a-acetoxivouacapan-17,7p-lactona, ácido 6a,7p-dihidroxivouacapan-17β-όίοο, éster 6a,7p-dihidroxivouacapan-17p-metila, 1.4-DMN02, 1,4-dimetilnafitalina endoperóxido, 6a-hidroxivouacapan-17,7p- lactona.

A partir do extrato hexânico bruto de Pterodon emarginatus Vog. pôde ser demonstrado atividade anti-inflamatória em edemas induzidos em patas e cavidades intraperitoniais de ratos pelà presença de compostos terpênicos (CARVALHO et ai, 1999).

Extrato semi-sintético hexânico desse espécime também resultou em atividade anti-fúngica sobre dermatófitos, fungos queratinofílicos causadores de infecções na pele, unha e pêlo (NEVES et al., 2007).

Extratos etanólicos obtidos de partes de Pterodon polygalaeflorus provaram, de um modo geral, atividade antibiótica expressiva na inibição do crescimento de Micrococcus flavus e de Myeobaeterium phlei, e uma menor expressão contra cepas de M. smegmatis e Mierocoeeus flavus (LIMA et al., 2006). Em adição, Omena e colaboradores (2006) demonstraram atividade Iarvicida contra o mosquito Aedes aegypti a partir da utilização de extrato etanólico bruto de P. polygalaeflorus.

Sobretudo as espécies de Pterodon pubeseens destacam-se por sua importância na medicina popular brasileira, como infusões da casca, raiz, sementes e frutos. De suas sementes e frutos achatados se obtém extrato rico em óleo fixo fortemente aromatizado e abundante (SABINO et al., 1999). Achados apontam a presença de diversos compostos e uma fração volátil no óleo bruto, sendo o seu poder terapêutico interessante quando comparado a outros óleos avaliados (MORS et al., 1966). Assim, tem sido empregado no tratamento de reumatismo, incluindo artrite reumatóide (AR) (COELHO et ai.·, 2004), inflamações de garganta (SOUZA & FELFILI, 2006; VILA VERDE et ai, 2003), infecções parasitárias por cercária de Schistosoma mansoni (MORS et aí., 1966; MORS et ai, 1967; SANTOS FILHO et ai, 1972; KATZ et ai, 1993; DIAS et ai, 1995) e pelo Trypanosoma cruzi (MENNABARRETO et ai, 2008), edemas (SILVA et ai, 2004), analgésico (COELHO et al„ 2005) e anti-plaquetário (CALIXTO et ai, 2007).

Especificamente o Pterodon pubescens é popularmente conhecida como sucupira, sucupira-branca, sucupira-lisa, fava-de-santo-inácio, fava-de-sucupira ou faveiro, que vem de fava (LORENZI, 2002; FALCÃO et ai, 2005; GONÇALVES & LORENZI, 2007). Deve-se salientar que na literatura as mesmas designações tradicionais utilizadas para P. pubescens são apontadas para outras espécies do gênero Pterodon, a citar as espécies Pterodon polygalaeflorus Benth. e Pterodon emarginatus Vog.

Efeitos anti-inflamatórios de P. pubescens têm sido testados no meio científico na presença de artrite reumatóide. A artrite induzida por colágeno (CIA) é um modelo experimental que leva à autoimunidade em camundongos e que, em alguns aspectos, se assemelha à artrite reumatóide encontrada em humanos (COURTENAY et ai, 1980). O desenvolvimento de CIA está relacionado à presença de linfócitos B (SVENSSON et ai, 1998) e T (CORTHAY et ai, 1999), sendo a participação das células B fundamental na sua severidade. Isto indica uma correlação entre o edema apresentado na pata dos animais e os anticorpos anti-colágeno Il (anti-CII) circulantes (WILLIAMS et ai, 1998). Os linfócitos T CD4+ e T CD8+ mostraram-se também envolvidos no desenvolvimento de CIA. Todavia, foram os linfócitos T CD4+ as principais células que responderam ao colágeno Il (CII) anteriormente ao aparecimento de CIA (GOLDSCHMIDT et ai, 1992).

Nesse sentido, Sabino e colaboradores (1999) após administrarem oralmente extrato hidroalcóolico de P. pubescens em camundongos machos, constataram seu potencial antiartrítico in vivo. Similar resultado foi encontrado por Coelho e colaboradores (2001), os quais comprovaram indetectável toxicidade subcutânea. Posteriormente esses autores (2004) verificaram diminuição de um terço dos níveis de IgG anti-CII no sangue de camundongos pela mesma via de administração, indicando que o tratamento reduz de forma eficaz os níveis específicos de Cll por ativação da célula B (COELHO et al., 2004). Tais resultados demonstram que o extrato de P. pubescens apresenta efeitos clínicos e imunomoduladores do Cll.

A dissertação intitulada "Atividade anti-inflamatória do óleo de Sucupira Pterodon pubescens Benth. Leguminosae - Papilionoidae" de autoria de Carina Denny, descreve um processo de obtenção do óleo de semente de Pterodon pubescens através da prensagem das sementes e posterior centrifugação, e testa sua atividade anti-inflamatória e antinociceptiva em relação à toxicidade aguda do óleo desta semente. A presente invenção difere desse documento por descrever um processo de obtenção de extratos de Pterodon pubescens através da trituração dos frutos secos e extração em seqüência com mistura de hexanos ou etanol 95% ou absoluto. A torta resultante da extração com mistura de hexanos, submetida à extração com etanol 95% ou absoluto, resultou em novo extrato com menor concentração de derivados hidrofóbicos previamente extraídos com mistura de hexanos.

A tese intitulada "Atividade do extrato de frutos de Pterodon emarginatus contra o estresse oxidativo e nitrosativo induzido por exercício agudo em ratos" de Fernanda Borges de Araújo Paula descreve um processo de obtenção do extrato hexânico bruto de Pterodon emarginatus em que seus frutos são secos à temperatura ambiente, triturados em liqüidificador industrial na presença de hexano e colocado em percoladores à temperatura ambiente sendo esgotado com hexano. O líquido extrator foi recolhido, filtrado e concentrado com auxílio de evaporador rotatório sob pressão reduzida. Esse documento nada fala sobre sua possibilidade de uso no tratamento da sepse.

A tese intitulada "Aspectos taxonômicos, reprodutivos e genéticos de Pterodon pubescens (Benth.) Í3enth. e Pterodon marginatus Vog. (Leguminosae, Dypteryxeae) de Dulce Maria Sucena da Rocha descreve um método para diferenciar as espécies de Pterodon pubescens e Pterodon marginatus. A presente invenção nada tem a ver com esse documento.

O documento WO 02/36737 descreve um método para tratamento da sepse, compreendendo a administração de um extrato de PBS da planta Melothria indica Lou1 o qual tem a capacidade de inibir a liberação de citocinas, como TNF-a por macrófago. A presente invenção, embora também descreva o uso de um extrato de planta no tratamento da sepse, difere do referido documento, entre outros motivos, por compreender um extrato hexânico e etanólico, e não de PBS, além de ser obtido de plantas totalmente distintas, sem relação alguma.

Pode-se ver claramente que, do que se depreende da literatura pesquisada, não foram encontrados documentos antecipando ou sugerindo extratos vegetais de Pterodon e composições farmacêuticas contendo os mesmos para o tratamento da sepse, de forma que, aos olhos dos inventores, a solução aqui proposta possui novidade e atividade inventiva frente ao estado da técnica.

Sumário da Invenção

Em um primeiro aspecto a presente invenção proporciona um extrato de plantas do gênero Pterodon, em especial Pterodon pubescens, que possui atividade antiinflamatória e surpreendente atividade contra a sepse. É portanto um dos objetos da presente invenção um extrato de plantas do gênero Pterodon com atividade antiinflamatória e/ou para o tratamento da sepse. Preferencialmente, o extrato é um extrato etanólico e/ou hexânico.

É outro objeto da invenção uma composição farmacêutica antiinflamatória e/ou para o tratamento da sepse contendo o extrato de plantas do gênero Pterodon. A composição farmacêutica da invenção compreende:

a) extrato hexânico e/ou etanólico de plantas do gênero Pterodon; e

b) um veículo farmaceuticamente aceitável. Um outro objeto da invenção é o uso do extrato de plantas do gênero Pterodon na preparação de composições farmacêuticas antiinflamatórias e/ou para o tratamento da sepse.

Estes e outros objetos da invenção serão imediatamente valorizados pelos versados na arte e pelas empresas com interesses no segmento, e serão descritos em detalhes suficientes para sua reprodução na descrição a seguir.

Breve Descrição das Figuras

A figura 1 mostra a curva de sobrevida (%) dos grupos estudados. Ratos controle-operatório (sham) ou submetidos à CLP. Nos dois grupos, sham e CLP, os animais foram aleatoriamente escolhidos para receber uma hora antes dos procedimentos cirúrgicos veículo (etanol 20% com uma gota de Tween 80) ou extrato LDT-PPH (50 mg/Kg). A taxa de mortalidade dos animais foi registrada por um período de 5 dias.

A figura 2 mostra os níveis de IL-6 (pg/mL) encontrados nos grupos estudados após 6 horas das intervenções cirúrgicas. Os valores correspondem à média e desvio padrão.

Descrição Detalhada da Invenção

Os exemplos aqui mostrados têm o intuito somente de exemplificar uma das inúmeras maneiras de se realizar a invenção, sem limitar, contudo, o escopo da mesma.

Pterodon

O gênero Pterodon Vog. (Fabaceae, Papilionoideae, Dipteryxeae) é um gênero pequeno com seis espécies: Pterodon apparicioi Pedersoli, P. macrophyllus Klotzsch, P. abruptus (Moric.) Benth., P pubescens (Benth.) Benth., P. polygalaeflorus (Benth.) Benth. e P emarginatus Vog. (Polhill 1981, International Plant Names Index 2005). Entretanto, segundo a base de dados "W3 Tropicos" (Missouri Botanical Garden, 2005), o gênero tem três espécies: P abruptus, Ρ. apparicioi e Ρ. emarginatus, sendo que Ρ. pubescens e P.polygalaeflorus são colocadas como sinônimos de P. emarginatus enquanto que P. macrophyllus é considerado nomen nudo. A base de dados ILDIS - International Legume Database and Information Service (2005) cita apenas duas espécies para este gênero: P. abruptus e P. emarginatus, sendo que P. apparicioi é colocada como sinônimo de P. emarginatus. P. pubescens e P. polygaiaeflorus e P. macrophyllus não são citadas nesta base de dados.

Parte dessa discrepância com relação ao número de espécies válidas de Pterodon está relacionada à delimitação das espécies Pterodon emarginatus, P. polygaiaeflorus e P. pubescens. Lewis (1987), em seu livro "Legumes da Bahia", apresentou P. pubescens e P. polygaiaeflorus como sinônimos de P. emarginatus. Desde esta publicação, e apesar da mesma não se tratar de uma revisão do gênero, essas espécies têm sido tratadas de forma discrepante por autores diversos: ora como três taxa distintos, ora como dois, ora como apenas um. P. emarginatus, como considerada por Lewis (1987), é uma espécie

dimórfica com populações de indivíduos de flores que variam do rosa claro (quase branco) ao rosa escuro, folhas pubescentes e ápice dos folíolos levemente retuso e populações de indivíduos de flores roxas/violetas (figura 2), folhas glabras e ápice dos folíolos fortemente emarginado. A presente invenção se baseia em extratos obtidos de plantas pertencentes

ao gênero Pterodon. Em especial, a planta preferida na presente invenção é Pterodon pubescens. Em especial, a parte da planta utilizada é escolhida do grupo que compreende caule, flor, fruto, folhas, galhos, sementes, raiz e mistura dos mesmos. Em uma realização preferida, a parte da planta utilizada é o fruto, que recomenda-se estar maduro, embora frutos em processo de amadurecimento possam também ser utilizados.

Pacientes Para efeitos da presente invenção, entendem-se como paciente qualquer animal suscetível à sepse. Exemplos incluem os mamíferos, como humanos, caninos, felinos, roedores, eqüinos, suínos, dentre outros. Processo de Produção do Extrato Hexânico O processo de preparo do extrato de acordo com a presente invenção

compreende as etapas de:

a) Coletar partes das plantas pertencentes ao gênero Pterodon;

b) Preparar as partes da planta para extração;

c) Extrair em seqüência com mistura de hexanos; e

d) Retirar os solventes sob pressão reduzida em temperatura de 35°C,

com remoção de traços dos solventes em sistema de alto-vácuo. Os frutos de P. pubescens coletados devem passar por uma etapa de preparação. Essa etapa envolve a maturação completa dos frutos, quando os mesmos ainda estão muito imaturos, e a secagem para eliminar qualquer excesso de água ou umidade, que pode ocorrer em temperatura ambiente (25 ± 1°C) ou também em estufas com ambientes controlados. Após secagem, eles são triturados, de modo a aumentar a superfície de exposição ao solvente, melhorando o rendimento da extração. Qualquer meio de trituração conhecido do estado da técnica pode ser utilizado, sendo que o método preferencialmente utilizado pela presente invenção é um moinho de facas à velocidade de 3600 rpm.

A extração é realizada em seqüência com mistura de hexanos, sendo preferencial um sistema com 3 extrações de 48 horas cada uma (3 χ 48 horas) em percolador com capacidade de 2,5 litros. No entanto, um técnico no assunto não deve se limitar pelo tempo e número de extrações, nem tampouco ao tipo de equipamento utilizado, estando apto a adaptar essas condições do processo conforme qualidade desejada para o extrato.

A última etapa compreende a retirada do solvente do extrato de P. pubescens (chamado ao longo desse documento de LDT-PPH) à pressão reduzida, preferencialmente em rotoevaporador em temperatura de 35°C, com remoção de traços dos solventes em sistema de alto-vácuo.

O extrato resultante desse processo está apto a ser incorporado em uma composição farmacêutica antiinflamatória e eficaz no tratamento da sepse. Processo de Produção do Extrato Etanólico após extração com mistura de hexanos

O processo de preparo do extrato de acordo com a presente invenção compreende as etapas de:

a) Coletar as partes das plantas pertencentes ao gênero Pterodorr,

b) Preparar as partes das plantas para extração;

c) Extrair torta resultante de extração com mistura de hexanos em seqüência com etanol 95% ou absoluto; e

d) Retirar os solventes sob pressão reduzida em temperatura de 50°C, com remoção de traços dos solventes em sistema de alto-vácuo.

A extração é realizada em seqüência com etanol 95% ou absoluto, sendo preferencial um sistema com 3 extrações de 48 horas cada uma (3 χ 48 horas) em percolador com capacidade de 2,5 litros. No entanto, um técnico no assunto não deve se limitar pelo tempo e número de extrações, nem tampouco ao tipo de equipamento utilizado, estando apto a adaptar essas condições do processo conforme qualidade desejada para o extrato.

A última etapa compreende a retirada do solvente do extrato etanólico de P. pubescens (chamado ao longo desse documento de LDT-PPE1) à pressão reduzida, preferencialmente em rotoevaporador à temperatura de 50°C, com remoção de traços dos solventes em sistema de alto-vácuo.

O extrato resultante desse processo está apto a ser incorporado em uma composição farmacêutica eficaz no tratamento da sepse e aumento da sobrevida de pacientes.

Processo de Produção do Extrato Etanólico O processo de preparo do extrato de acordo com a presente invenção compreende as etapas de:

a) Coletar as partes das plantas pertencentes ao gênero Pterodorr,

b) Preparar as partes das plantas para extração;

c) Extrair em seqüência com etanol 95% ou absoluto; e

d) Retirar os solventes sob pressão reduzida em temperatura de 50°C, com remoção de traços dos solventes em sistema de alto-vácuo. Os frutos de P. pubescens coletados devem passar por uma etapa de preparação. Essa etapa envolve a maturação completa, quando os mesmos ainda estão muito imaturos, e a secagem para eliminar qualquer excesso de água ou umidade, que pode ocorrer em temperatura ambiente (25 ± 1°C) ou também em estufas com ambientes controlados. Após secagem dos frutos, eles são triturados, de modo a aumentar a superfície de exposição ao solvente, melhorando o rendimento da extração. Qualquer meio de trituração conhecido do estado da técnica pode ser utilizado, sendo que o método preferencialmente utilizado pela presente invenção é um moinho de facas à velocidade de 3600 rpm.

A extração é realizada em seqüência com etanol 95% ou absoluto, sendo preferencial um sistema com 3 extrações de 48 horas cada uma (3 χ 48 horas) em percolador com capacidade de 2,5 litros. No entanto, um técnico no assunto não deve se limitar pelo tempo e número de extrações, nem tampouco ao tipo de equipamento utilizado, estando apto a adaptar essas condições do processo conforme qualidade desejada para o extrato.

A última etapa compreende a retirada do solvente do extrato etanólico de P. pubescens (chamado ao longo desse documento de LDT-PPE2) à pressão reduzida, preferencialmente em rotoevaporador em temperatura de 50°C, com remoção de traços dos solventes em sistema de alto-vácuo.

O extrato resultante desse processo está apto a ser incorporado em uma composição farmacêutica eficaz no tratamento da sepse e aumento da sobrevida de pacientes. Composição Farmacêutica

A composição farmacêutica da presente invenção compreende: a) extrato hexânico e/ou etanólico de plantas do gênero Pterodoir, e b) um veículo farmaceuticamente aceitável.

Em uma realização preferencial, a composição compreende de 0,01% p/p a 99% p/p de extrato.

O extrato obtido conforme processo descrito acima é dissolvido em um veículo farmaceuticamente aceitável, como por exemplo, uma solução de etanol 20% e uma gota de Tween 20.

O veículo farmaceuticamente aceitável é qualquer veículo que proporcione a administração do extrato pela via desejada. Exemplos de vias de administração incluem, sem limitações, via oral, parenteral, intramuscular, intraperitoneal.

A composição farmacêutica pode ainda compreender outros ativos que auxiliem no tratamento da sepse, como por exemplo agentes antimicrobianos, antifúngicos, antivirais, anti-inflàmatórios.

A solução estoque foi mantida a 5 ± 2°C até o momento do seu uso, quando administrada na dose de 50 mg/Kg por via oral (v.o.). Exemplo 1 - Uso do extrato hexânico no tratamento da sepse ANIMAIS

Foram utilizados ratos Wistar híbridos, machos, pesando 180-295 g. Os animais foram aclimatados em laboratório sete dias antes do estudo, sendo mantidos em gaiolas à temperatura ambiente, fotoperíodo de 12 horas claro/escuro e alimentação e água ad libitum. Os experimentos foram desenvolvidos seguindo normas que envolvem cuidados com animais de laboratório e normas éticas para o seu uso em experimentos que envolvam procedimentos invasivos e dolorosos. LIGADURA E PUNCÃO CECAL (CLP) A sepse foi induzida por CLP, modelo extensivamente utilizado em roedores para estudar sepse e choque séptico (HUBBARD et al., 2005). Para tanto, os ratos foram anestesiados com cetapiina 10% (100 mg/Kg) e xilazina 2% (20 mg/Kg) (Rhobifarma indústria farmacêutica - LTDA) via intramuscular (i.m.) em um dos membros posteriores, como descrito por Fidan e colaboradores (2007). O animal anestesiado foi posicionado em decúbito dorsal, no centro do campo operatório, sendo utilizado álcool iodado na anti-sepsia da região abdominal.

Em seguida, foram realizados tricotomia, incisão longitudinal de aproximadamente 3 cm na região abdominal e exposição do ceco. A sepse foi induzida por ligadura com fio algodão/poliéster n° 3-0 no segmento distai próximo à válvula íleo-cecal e perfurações com agulha na borda anti-mesentérica do ceco. Suficiente pressão foi aplicada no ceco para expulsão de fezes dos sítios perfurados (grupos CLP). O grupo controle operatório (sham) foi anestesiado e submetido, posteriormente, à Iaparotomia para manipulação do ceco sem realização de ligadura e perfuração desta região do intestino.

Os cecos foram retomados às suas respectivas cavidades abdominais. As duas camadas da incisão abdominal foram suturadas com fio de nylon 45 cm n° 3- 0. Finalmente, os animais foram posicionados em decúbito ventral recebendo 30 mL/Kg de solução salina estéril 0,9% via subcutânea (s.c.) como líquido de ressuscitação.

PADRONIZAÇÃO DA INDUÇÃO DA SEPSE SEVERA POR CLP

Os ratos foram distribuídos aleatoriamente em grupos controle (sham) e grupos CLP. Para padronizar as condições experimentais para indução da sepse severa por CLP foram utilizados diferentes calibres de agulhas e de números de furos realizados no ceco de cada rato nos grupos CLP estudados. As intervenções foram estabelecidas conforme o esquema descrito na Tabela 1.

Todos os grupos foram monitorados nos tempos 12, 24, 48, 72, 96 e 120 horas após as intervenções cirúrgicas e, então, registrado o número de óbitos nesses intervalos. Ao final das 120 horas os animais sobreviventes foram sacrificados utilizando-se éter etílico PA e a morte de cada cobaia constatada por negatividade da freqüência respiratória e cardíaca.

Tabela 1: Intervenções estabelecidas nos grupos CLP e sham durante a padronização do modelo de sepse severa por CLP em ratos. N = número de indivíduos por grupo.

GRUPOS Calibre da Agulha N0 de Furos η 2 6 22G 5 6 10 6 4 5 CLP 18G 6 3 8 3 12 3 14G 10 3 4 3 SHAM Sem perfuração do ceco 4

AVALIAÇÃO DO EFEITO DE LDT-PPH EM RATOS COM SEPSE SEVERA Determinação da sobrevida de ratos com sepse severa na presença ou ausência do pré-tratamento com LDT-PPH

Foram utilizados 36 ratos aleatoriamente divididos em grupos sham e CLP.

Nos animais dos grupos CLP, realizou-se 4 perfurações com agulha calibre 14G na borda antimesentérica do ceco para indução da sepse. Em cada grupo, os animais receberam pré tratamento com extrato hexânico de P. pubescens (50 mg/Kg) ou veículo (etanol 20% em água destilada) por via oral, através de gavagem, uma hora antes do procedimento cirúrgico. Assim sendo, os animais foram aleatoriamente divididos em 4 grupos: G1) Sham + veículo (n=8) G2) Sham + LDT-PPH (n=8) G3) CLP + veículo (n=10) G4) CLP + LDT-PPH (n=10)

Todos os grupos foram monitorados nos tempos 12, 24, 48, 72, 96 e 120 horas após as intervenções cirúrgicas, sendo o número de óbitos registrado a cada período. Após o quinto dia de observação os animais sobreviventes foram sacrificados com uso de éter étílico PA e a morte de cada cobaia constatada por negatividade da freqüência respiratória e cardíaca. Em seguida, foi feita avaliação da mortalidade e curva de sobrevivência dos grupos estudados. Quantificação das dosagens séricas de IL-6 em ratos após CLP na presença ou ausência do pré-tratamento com LDT-PPH

Intervenções cirúrgicas nos grupos de ratos e coleta do plasma

Foram utilizados 32 ratos aleatoriamente divididos em grupos sham e CLP. Nos animais dos grupos CLP, realizou-se 4 perfurações com agulha calibre 14G na borda antimesentérica do ceco para indução da sepse. Em cada grupo, os animais receberam pré-tratamento com extrato hexânico de P. pubescens (50 mg/Kg) ou veículo (etanol 20% em água destilada) por via oral, através de gavagem, uma hora antes do procedimento cirúrgico. Assim sendo, os animais foram aleatoriamente divididos em 4 grupos: G1) Sham + veículo (n=8) G2) Sham + LDT-PPH (n=8) G3) CLP + veículo (n=8) G4) CLP + LDT-PPH (n=8)

Para coleta do sangue foi realizada punção cardíaca 6 horas após as intervenções cirúrgicas nos 4 grupos de ratos. Para isto, os animais foram sedados com éter etílico PA e colocados em posição decúbito dorsal. Foi utilizado álcool iodado na anti-sepsia da região peitoral e, com auxílio de seringas de 10 mL, contendo ácido etilenodiamino tetra-acético (EDTA) 5M, foram coletados aproximadamente 2 mL de sangue do coração de cada rato, sendo as amostras reservadas em eppendorfs individuais. Ao término desse procedimento, os animais sobreviventes foram sacrificados com uso de éter etílico PA.

Imediatamente após a coleta do sangue por punção cardíaca, as amostras foram centrifugadas durante 15 minutos a 4000 rpm e com uma força de aproximadamente 1266,35g. Em seguida, o plasma foi separado e armazenado em eppendorfs a -20°C. Dosagem sérica de IL-6

Os níveis de IL-6 no plasma foram determinados pelo método ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay), sendo os ensaios realizados em duplicata conforme instruções do manufaturador (R&D Systems, Minneapolis, MN, USA). Para isto, todos os reagentes do kit foram previamente preparados à temperatura ambiente. Em cada poço da microplaca foram colocados 50 μ!_ do Ensaio Diluente RD1-54 seguido da adição de 50 μΙ_ do padrão, controle ou amostras. A placa foi gentilmente agitada por um minuto e incubada por duas horas à temperatura ambiente e ao abrigo da luz. Foram realizadas cinco lavagens, sendo usados 400 μΙ_ de tampão de lavagem por poço e tendo-se o cuidado de removê-lo completamente a cada processo. Após a última lavagem, adicionou-se a cada poço 100 μΙ_ de Conjugado IL-6 de rato. A placa foi recoberta e incubada conforme descrito anteriormente. O procedimento de lavagem foi repetido e, ao término deste procedimento, foram adicionados 100 pL de Solução Substrato em cada poço. A placa foi incubada por mais 30 minutos à temperatura ambiente e protegida da luz. Em seguida, foram adicionados 100 pL de Solução de Parada e a placa agitada para homogeneização do conteúdo. Finalmente, foi determinada a densidade ótica para cada poço em um comprimento de onda de 450 nm. Ressalta-se que as amostras com densidades óticas que ultrapassaram os

valores fornecidos pela curva-padrão foram diluídas quatro vezes e avaliadas novamente. Foram excluídas das análises estatísticas aquelas amostras com densidades óticas que estiveram fora da curva-padrão e que não puderam ser repetidas, sendo a nova composição dos grupos representada abaixo: G1) Sham + veículo (n=7) G2) Sham + LDT-PPH (n=6) G3) CLP + veículo (n=6) G4) CLP + LDT-PPH (n=4) Determinação e identificação de bactérias em sangue de rato após CLP na presença ou ausência do pré-tratamento com LDT-PPH

Determinação de Unidades Formadoras de Colônias (UFCs) Para a determinação das UFCs foram adotados 3 grupos, que receberam por gavagem LDT-PPH ou veículo (etanol 20% em água destilada) uma hora antes dos procedimentos cirúrgicos (item 2.3), conforme apresentado a seguir: G1) Sham + veículo (n=2) G2) CLP + LDT-PPH (n=2) G3) CLP + veículo (n=2)

Após 12 horas das intervenções cirúrgicas os animais foram sedados com éter etílico PA e, em posição decúbito dorsal, tiveram o sangue recolhido por punção cardíaca. A região peitoral recebeu álcool iodado na anti-sepsia e, com auxílio de seringas de 10 mL contendo EDTA 5M, foram coletados aproximadamente 1 mL de sangue do coração de cada rato, sendo as amostras reservadas em eppendorfs estéreis individuais de 1 mL no interior da câmara de fluxo laminar. Ainda em fluxo laminar, foram retirados de cada eppendorf 100 pL de sangue e diluídos em 900 pL de solução salina 0,9% (diluição 10:1). O material foi vertido ao centro de cada placa de ágar sangue de carneiro 5% (meio não seletivo) e homogeneizado pela técnica de varredura a partir de movimentos circulares e pelo uso de alça de Drigalski previamente esterilizada. Em seguida, as amostras plaqueadas foram tampadas, identificadas, invertidas e incubadas por 24 horas a 37°C, sob condições aeróbicas. Transcorrido esse período as placas foram divididas em quatro quàdrantes e as colônias contadas e registradas em UFCs. Ao término do experimento os animais sobreviventes foram sacrificados a partir do uso de éter etílico PA. I 25/33

Identificação de bactérias Coloração Gram

Após determinação das UFCs foi escolhida colônia isolada de cada placa ágar sangue e identificada por Coloração Gram. Para tanto, foi feito esfregaço de metade da colônia em lâmina de microscopia limpa e desengordurada. A fixação do esfregaço foi realizada com o auxílio de alça de platina. O esfregaço foi coberto com violeta genciana por um minuto.

Transcorrido esse período, cobriu-se com Iugol (iodo-iodeto de potássio) por mais um minuto. Os corantes foram então desprezados e a lâmina lavada com água corrente. A partir do uso de álcool-acetona 2:1 fez-se a descoloração. A água corrente foi utilizada novamente na lavagem da lâmina. Então, o esfregaço foi coberto com safranina 1:10 durante um minuto. Após esse período a safranina foi desprezada e a lâmina lavada com água corrente. O passo seguinte foi caracterizado pela secagem à temperatura ambiente das lâminas preparadas. A Coloração Gram permitiu a identificação das bactérias Gram-positivas e/ou Gram- negativas a partir da cor resultante das bactérias observadas ao microscópio óptico com aumento de 10Ox e em óleo de imersão. Cultura em ágar MacConkev

Em câmara de fluxo laminar foi escolhida colônia isolada crescida em placa agar sangue e repicada pela técnica de esgotamento de alça em meio ágar MacConkey a partir da utilização de alça de platina previamente esterilizada. Em seguida, as amostras plaqueadas foram tampadas, identificadas, invertidas e incubadas por 24 horas a 37°C, sob condições aeróbicas. A confirmação da existência ou não de micro-organismos Gram-negativos foi realizada imediatamente após o período de incubação.

Teste bioquímico para identificação específica de enterobactérias

Para a identificação de enterobactérias utilizou-se kit bioquímico (Mini kit), dessa forma, foi escolhida de cada placa ágar sangue colônia isolada e, com auxílio de agulha bacteriológica, recolheu-se metade desta colônia, que foi

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inoculada por picada e estria na superfície inclinada do meio de EPM1 deixando a tampa do tubo frouxa. Em seguida, sem flambar, foi semeado por dissolução o segundo tubo com meio de Lisina, sendo ao final selado com óleo mineral estéril e a tampa do tubo bem fechada.

Ainda sem flambar, semeou-se o terceiro tubo com picada central única no

meio de MIO, cuja tampa do tubo permaneceu frouxa. Então, a outra metade da colônia foi recolhida, semeada por dissolução em meio de Rhamnose, selada com óleo mineral estéril e a tampa do tubo bem fechada. Em outro tubo foi feito inóculo leve por estria na superfície do meio de Citrato de Simmons, cuja tampa foi mantida frouxa. Todos estes meios foram feitos em duplicata e incubados a 37°C por 24 horas, sob condições aeróbicas. Os resultados obtidos foram analisados de acordo com tabela de identificação de enterobactérias fornecida pelo kit. PADRONIZAÇÃO DAS CONDIÇÕES EXPERIMENTAIS PARA INDUÇÃO DE SEPSE SEVERA POR CLP Como demonstrado na Tabela 2, entre os animais submetidos à CLP, a

taxa de mortalidade aumentou com uso de agulhas mais calibrosas e pela maior quantidade de perfurações no ceco, com exceção do grupo que recebeu 8 furos com agulha 18 G, para cujo dano não foram observadas mortes durante os cinco dias transcorridos desde a realização da CLP. Em adição, não houve morte de animais no grupo controle operatório (sham, n=4) no período destinado à observação (120 horas), onde os animais apresentavam-se saudáveis até serem sacrificados duas semanas depois da cirurgia. Esses dados sugerem que os animais submetidos a CLP não morreram por razões inerentes ao procedimento cirúrgico, mas sim pela perfuração e extravasamento de conteúdo fecal para a cavidade abdominal.

É importante ressaltar que os óbitos ocorreram entre 12 a 24 horas após CLP, não havendo registro de mortalidades nos grupos estudados antes e após este período, para os animais que tiveram seus cecos perfurados com agulhas com diferentes calibres i.e. 22G , 18G e 14G com 4 furos. A única exceção foi 27/33

evidenciada no grupo CLP perfurado dez vezes com agulha de calibre 14G que apresentou taxa de mortalidade de 100% nas primeiras 12 horas após CLP (Entrada H), fato que poderia comprometer a realização e avaliação de intervenções no manejo da sepse.

Nos grupos experimentais em que foi utilizada agulha 22G, foi constatada

uma mortalidade de 33,3% nas primeiras 24 horas após CLP, tanto no grupo que teve cinco perfurações no ceco (Entrada B) quanto no grupo com dez perfurações (Entrada C). Para os animais dos grupos que tiveram os seus cecos perfurados com agulha de calibre 18G, apenas foi observado mortalidade no grupo com 12 perfurações, correspondendo a 33,3% (Entrada G). Em adição, pôde-se verificar que dois dos três animais que tiveram o ceco perfurado 4 vezes com agulha 14G foram a óbito entre 12 e 24 horas, representado por uma taxa de mortalidade de 66,7% (Entrada I). Desta forma, o método compreendendo 4 perfurações com agulha 14G foi utilizada para a condução dos demais experimentos, permitindo o delineamento e avaliação dos efeitos de intervenções sobre a sepse severa.

Tabela 2 - Taxa de mortalidade (%) nos grupos CLP submetidos a diferentes calibres de agulhas e número de furos durante realização dos procedimentos cirúrgicos para indução de sepse.

Entrada N0 de furos Mortalidade (%) η < 12h 12-24h >24h Agulha calibre 22G A 2 0,0 0,0 0,0 6 B 5 0,0 33,3 0,0 6 C 10 0,0 33,3 0,0 6 Agulha calibre 18G D 4 0,0 0,0 0,0 5 E 6 0,0 0,0 0,0 3 F 8 0,0 0,0 0,0 3 G 12 0,0 33,3 • 0,0 3 Agulha calibre 14G H 10 100 0,0 0,0 3 I 4 0,0 66,7 0,0 3

ESTUDO DO EFEITO DE LDT-PPH EM RATOS COM SEPSE SEVERA Efeito do extrato de P. pubescens sobre a taxa de mortalidade após CLP

Após escolha da metodologia a ser implementada para indução da sepse severa via CLP, a amostra corfi 36 ratos, dividida em quatro grupos [G1 - Sham + veículo (n=8); G2 - Sham + LDT-PPH (n=8); G3 - CLP + veículo (n=10); G4 - CLP + LDT-PPH (n=10)], foi submetida à avaliação com extrato hexânico de P. Pubescens (LDT-PPH). Os resultados evidenciaram que os 16 animais dos grupos sham (G1 e G2) permaneceram vivos nas 120 horas que transcorreram após os procedimentos cirúrgicos. Por outro lado, 40% dos animais do grupo G3 foram a óbito entre 12 e 24 horas e, posteriormente, 30% no período de 24 a 48 horas após realização da CLP. O grupo G4 não apresentou mortalidade nas primeiras 24 horas, havendo apenas uma morte (10%) entre 24 e 48 horas. Conclui-se, assim, um maior efeito protetor do extrato P. pubescens nas primeiras 24 horas, ressaltando-se que esse efeito manteve-se ao longo dos 5 dias de observação (Figura 1).

Tabela 3 - Taxa de mortalidade (%) nos grupos sham e CLP, submetidos ou não ao pré-tratamento com extrato LDT-PPH uma hora antes dos procedimentos cirúrgicos.

Grupos η Mortalidade (%) < 12h 12-24h >24h Sham + veículo 8 0% 0% 0% Sham + LDT-PPH 8 0% 0% 0% CLP + veículo 10 0% 40% 30% « 29/33

CLP + LDT-PPH 10 0% 0% 10%

N= número de indivíduos por grupo

A partir dos dados anteriormente descritos, construiu-se a curva de sobrevida dos grupos estudados (Figura 1). Assim, os grupos sham que receberam pré-tratamento com LDT-PPH ou veículo, por via oral, tiveram 100% de sobrevivência. O grupo CLP que recebeu apenas veículo foi marcado por uma taxa de sobrevida de 60% nas 24 horas após cirurgia, reduzindo para 30% nas 48 horas e mantendo-se nessa faixa até o término do período de observação. Em contraste, no grupo CLP pré-tratado com LDT-PPH foi observado 100% de sobrevivência nas 24 horas transcorridas desde o procedimento cirúrgico, reduzindo para 90% no período de 48 horas após a CLP, cujo efeito protetor de LDT-PPH manteve-se ao longo dos 5 dias de observação. Efeito do LDT-PPH sobre os níveis de IL-6 plasmáticos após CLP

Para a quantificação dos níveis de IL-6 foi utilizado um grupo amostrai inicial de 32 ratos, os quais tiveram o sangue colhido após 6 horas dos procedimentos cirúrgicos. Todâvia, ao realizar o método ELISA algumas amostras de plasmas sangüíneos tiveram os valores de absorbância acima do valor máximo da curva-padrão do kit, inviabilizando a determinação das concentrações de IL-6. Por esta razão, foram excluídos 9 animais, restando 23 animais para a avaliação dos níveis de IL-6 nos grupos sham e CLP tratados com veículo ou LDT-PPH.

Como demonstrado na Tabela 4, não foram observadas diferenças significativas entre os níveis de IL-6 nos grupos sham com ou sem tratamento com LDT-PPH (G1 e G2) e nos dois grupos CLP avaliados, com e sem pré-tratamento com LDT-PPH (G3 e G4). Por outro lado, diferenças significativas foram observadas ao comparar os níveis plasmáticos de IL-6 entre os grupos G1 e G3, G1 e G4, G2 e G3 e G2 e G4. Portanto, a análise por ELISA realizada 6 horas após a indução da CLP nos animais que receberam pré-tratamento com extrato de P. pubescens (50 mg/Kg) não evidenciou, estatisticamente, diferenças significativas quanto aos níveis plasmáticos de IL-6 observados nos animais do grupo CLP sem tratamento.

Todavia, ao comparar isoladamente os valores encontrados de IL-6, em pg/mL, pôde-se observar níveis plasmáticos maiores dessa citocina no grupo CLP + LDT-PPH (G4) quando comparados àqueles encontrados no grupo CLP + veículo (G3) (Figura 2).

Tabela 4 - Comparação dos níveis plasmáticos de interleucina-6 (IL-6), em pg/mL, entre os grupos estudados 6 horas após os procedimentos cirúrgicos.

Grupos comparados Teste Mann-Whitney Z P G1 e G2 19,50 -0,22 0,830 G1 e G3 0,00 -3,00 0,003 G1 e G4 0,00 -2,65 0,008 G2 e G3 0,00 -2,88 0,004 G2 e G4 0,00 -2,56 0,011 G3 e G4 10,00 -0,43 0,670

G1 = Sham + veículo (n=7); G2 = Sham + LDT-PPH (n=6); G3 = CLP + veículo

(n=6); G4 = CLP + LDT-PPH (n=4). Método: Teste Mann-Whitney

Determinação do perfil microbiológico em sangue de ratos submetidos a CLP na presença ou ausência do extrato LDT-PPH

Nesta fase do estudo foram utilizados 6 animais, dos quais o sangue foi colhido 12 horas após intervenções cirúrgicas para cultura em meio ágar sangue, cujos resultados estão apresentados na Tabela 5. Nas culturas de sangue do grupo sham + veículo (n=2), não foram detectadas bactérias no período de 24 horas de incubação (Entrada 1). Em contrapartida, foi confirmada a presença de bactérias nos sangues de ratos após CLP (Entrada 2), sendo a média de UFCs nos sangues dos animais que receberam tratamento com LDT-PPH reduzida em comparação àqueles que receberam apenas veículo (Entrada 3). Tabela 5 - Média de UFC/mL de sangue por grupo estudado. Entrada Grupos η Contagem de bactérias (UFC/mL) 1 Sham + veículo 2 0 2 CLP + LDTPPH 2 3,98x104 3 CLP + veículo 2 > 10s

N = número de indivíduos por grupo

A partir da Coloração Gram das bactérias encontradas, foi constatada a presença de bactérias Gram-negativas no sangue de três animais que sofreram ligadura e punção cecal e que receberam pré-tratamento com LDT-PPH ou veículo. Em contrapartida, apenas um animal (CLP + LDT-PPH) apresentou em seu sangue bactérias do tipo Gram-positiva (Quadro 3). Dessa forma, foi possível verificar a predominância de bacilos Gram-negativos (BGNs) no estudo. A confirmação desses resultados foi possível a partir do repique das colônias em meio agar MacConkey. Além disso, a partir do teste bioquímico para identificação de enterobactérias e dos dados confrontados com a tabela fornecida pelo kit, identificou-se provável presença de Escherichia coli em todos os três ratos em que se confirmou presença de bacilos Gram-negativos.

A gravidade da sepse polimicrobiana pela técnica de CLP correlaciona-se diretamente com o uso de agulhas de maior calibre e na quantidade de perfurações do ceco. Rittirsch e colaboradores (2009) salientam ainda a importância do tamanho da ligadura na indução da severidade, sendo inclusive documentado como o maior determinante na mortalidade por sepse. Assim, com a ampliação da região da ligadura há registros do aumento dos níveis de citocinas pró-inflamatórias, além de febre, apendicite perfurada, diverticulite, isquemia, hipóxia e, como resultado das diversas manifestações clínicas apresentadas, necrose do tecido ligado. Tais lesões podem aumentar a permeabilidade intestinal e possibilitar o fenômeno de translocação bacteriana que leva a uma contaminação contínua da cavidade abdominal e, consequentemente, causa peritonite que pode evoluir para sepse (IRWIN etal., 1999).

Com a padronização da sepse severa, os efeitos do tratamento com extrato hexânico de P. pubescens na presença dessa síndrome podem ser avaliados, sem que esta evoluísse para o óbito do animal antes mesmo de ocorrer ação farmacológica da terapia aplicada.

O pré-tratamento com 50 mg/Kg de LDT-PPH, uma hora antes da realização da sepse, teve efeito benéfico ao reduzir efetivamente a mortalidade, sobretudo nas primeiras 24 horas, sendo este decréscimo significativo quando comparado com o grupo CLP + veículo. Por ser a sepse uma síndrome de resposta inflamatória sistêmica secundária à infecção, o efeito protetor do extrato hexânico da P. pubescens na sepse severa corroborou com os efeitos antiinflamatórios observados em diferentes modelos animais envolvendo respostas inflamatórias aguda e crônica (COELHO et al., 2004; COELHO et ai, 2005; CALIXTO et al., 2007; CARDOSO et al., 2008). É evidente que tanto o extrato bruto como alguns de seus compostos isolados, como o isoprenóide geranilgeraniol, reduzem os níveis de PGE2 e TXA2 ao inibirem a COXi (CALIXTO et al., 2007). Na sepse, estes prostanóides são liberados pela atuação persistente de citocinas pró-inflamatórias, como TNF-α e IL-1, sendo responsáveis por induzir hipotensão arterial e alterar o perfil hemostático de células endoteliais capazes de gerar trombos e desenvolver injúria de tecidos e disfunção orgânica aguda (DINARELLO, 1996; PARRILLO, 1993; Ll etal., 2007).

É importante ressaltar que apesar da dose oral de 50 mg/Kg ser extremamente superior àquela empregada usualmente pela população ca. 5-20pg PpSO/kg e ser 10 vezes maior à estabelecida no tratamento de artrite (COELHO et al., 2001), não foram evidenciados efeitos adversos aparentes. Nesse sentido, Sabino e colaboradores (1999) relatam a não observância de efeitos tóxicos de extratos de P. pubescens em ratos que receberam doses orais cerca de mil vezes mais que aquelas comumente usadas na medicina popular. Finalmente, é notório reconhecer o efeito do LDT-PPH na sepse, sobretudo no que diz respeito à inegável sobrevida alcançada (90% de sobreviventes). Sendo assim, abre-se uma perspectiva para um novo tratamento da sepse, sendo o extrato hexânico de P. pubescens de grande relevância na terapia dessa síndrome, especialmente pela eficácia, baixo custo e fácil obtenção.

Os versados na arte valorizarão os conhecimentos aqui apresentados e poderão reproduzir a invenção nas modalidades apresentadas e em outros variantes, abrangidos no escopo das reivindicações anexas.

Claims (10)

Uso de Extrato de Pterodon, ε Composição Farmacêutica Contendo o Mesmo para o Tratamento da Sepse

1. Uso de extrato hexânico e/ou etanólico de planta do gênero Pterodon caracterizado por ser para a preparação de um medicamento antiinflamatório para o tratamento da sepse.

2. Uso de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato da planta ser Pterodon pubescens.

3. Uso de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o material vegetal é selecionado do grupo que compreende: caule; flor; fruto; folhas; galhos; sementes; raiz; e combinações dos mesmos.

4. Uso de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pela parte da planta ser o fruto.

5. Composição farmacêutica antiinflamatória e/ou para o tratamento da sepse caracterizada por compreender: a) extrato hexânico e/ou etanólico de plantas do gênero Pterodon; e b) um veículo farmaceuticamente aceitável.

6. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fato do referido extrato ser de Pterodon pubescens.

7. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 5 ou 6, caracterizada pelo fato do referido extrato ser de partes da planta compreendendo: caule; flor; fruto; folhas; galhos; sementes; raiz; e combinações dos mesmos.

8. Composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações 5-7, caracterizada pelo fato do referido extrato ser do fruto.

9. Composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações 5-8, caracterizada pelo fato de compreender de 0,01% p/p a 99% p/p de extrato hexânico e/ou etanólico de plantas do gênero Pterodon.

10. Composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações 5-9, caracterizada pelo fato de adicionalmente compreender agentes antimicrobianos, antifúngicos, antivirais, anti-inflamatórios, ou combinações dos mesmos.