BRPI1003682A2 - composiÇço farmacÊutica contendo eupomatenàide-5 extraÍdo de piper regnelli e seu uso em composiÇÕes medicamentosas destinadas para o tratamento de cÂncer - Google Patents

Abstract

COMPOSIÇAO FARMACEUTICA CONTENDO EUPOMATENOIDE-5 EXTRAIDO DE Piper regnellii E SEU USO EM COMPOSIÇÕES MEDICAMENTOSAS DESTINADAS PARA O TRATAMENTO DE CANCER A presente invenção trata-se de uma composição farmacêutica contendo eupomatenóide-5, seu uso em composições medicamentosas destinadas para o tratamento de câncer e um método de extração da neolignana eupomatenóide-5 de Piper regnellii (Mig) . C. DC. var. regnellii. A composição farmacêutica compreende extrato bruto de Piper regnellii com pelo menos 13% de eupomatenáide-5. A neolignana eupomatenóide-5 foi identificada como um dos principais compostos envolvidos na atividade anticâncer, sem apresentar sinais de toxicidade, com baixa citoxicidade em algumas linhagens tumorais e redução significativa dos volumes dos tumores, sendo diferenciais em se tratando do desenvolvimento de um medicamento guimioterápico.

Description

"COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA CONTENDO EUPOMATENÓIDE-5 EXTRAÍDO DE Piper regnellii E SEU USO EM COMPOSIÇÕES MEDICAMENTOSAS DESTINADAS PARA O TRATAMENTO DE CÂNCER"

CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção trata-se de uma composição

farmacêutica contendo eupomatenóide-5 extraído de Piper regnellli (Miq)— C. DC. var, regnell i i. e - seu uso em composições medicamentosas destinadas para o tratamento de câncer.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

Plantas têm sido utilizadas como medicamentos por ·' milhares de anos, inicialmente em sua forma bruta, como tinturas, chás, e outras formulações. Freqüentemente são utilizadas com o intuito de substituir ou auxiliar terapias.

convencionais no tratamento de várias doenças. Entre outros fatores, a preferência no uso das plantas medicinais decorre da facilidade de obtenção e do baixo custo. Porém, sabe-se que plantas medicinais apresentam ampla diversidade de metabólitos secundários com diferentes atividades

biológicas (Simões CMO, Schenkel EP, Gosmann G, Mello JCP, Mentz LA, Petrovick PR. Farmacognosia: da planta ao medicamento. 5a ed. Porto Alegre/Florianópolis: Editora da UFRGS/Editora da UFSC, 2003), justificando a necessidade de um aprofundamento no conhecimento das propriedades das espécies vegetais e sua utilização na formulação de medicamentos.

A invenção de medicamentos de plantas medicinais tem exercido um papel importante no tratamento do câncer. A utilização de plantas como fonte de produtos terapêuticos remonta os tempos antigos na história da humanidade, e apesar do enorme desenvolvimento- da - síntese química,, ainda cerca de 25% das drogas prescritas no mundo são de origem vegetal, sendo que 121 princípios ativos são de uso corrente (Calixto JB, Beirith A, Ferreira J, Santos ARS, Filho VC, Yunes RA. A review of the plants of the genus Phyllanthus: their chemistry, pharmacology and therapeutic potential. Medicinal Research Reviews, 18: 225-258, 1998; Balunas MJ, Kinghorn AD. Drug Discovery from Medicinal Plants. Life Sciences, 78: 431-441, 2005; Koehn FE, Carter GT. The evolving role of natural products in drug discovery. Nature Reviews in Drug Discovery, 4(3): 206-20, 2005) . Atualmente cerca de 60% dos quimioterápicos são produtos naturais ou derivados desses (Cragg GM, Newman DJ. Nature: a vital source of leads for anticancer drug development. Phytochemistry Reviews, 8: 313-331, 2009).

As plantas têm sido um excelente recurso para o desenvolvimento de potenciais fármacos, principalmente contra o câncer. No período de 1961 a 1999 nove compostos vegetais foram aprovados como fármacos anticâncer nos EUA, sendo eles: vinblastina, vincristina, vinorelbina, etoposida, teniposida, paclitaxel, docetaxel, topotecan e irinotecan (Lee RH. Anticâncer drug design based on plant- derived natural products. Journal of Biomedical Science, 6: 236-250, 1999) .

Um dos exemplos, de fármacos obtidos- de -espécies vegetais mais significantes é a vincristina, um alcalóide extraído da Vinca (Catharanthus roseus) . A introdução da vincristina foi responsável por um aumento nas taxas de cura para a doença de Hodgkin e algumas formas de leucemia. Outro exemplo de agente ativo derivado de plantas é a lignana etoposídeo, derivada da epipodofilotoxina, encontrada em Podophyllum peltatum e Podophyllum emodi. Este composto apresenta grande eficácia na cura do câncer de testículo, quando utilizado em combinação com bleomicina (também derivada de produto natural) e cisplatina. Seu efeito citotóxico está relacionado com a inibição da divisão celular na metáfase, bloqueando a duplicação dos cromossomos e retendo a divisão celular no estado mitótico do ciclo celular, além de ser inibidor da topoisomerase II, enzima nuclear essencial para o funcionamento do DNA e sobrevivência da célula, sendo, portanto, ferramenta importante na quimioterapia do câncer (Wink M, Alfermann AW, Franke R, Wetterauer Β, Distl Μ, Windhovel J, Krohn Ο, Fuss Ε, Garden Η, Mohagheghzadeh Α, Wildi Ε, Ripplinger Ρ. Sustainable bioproduction of phytochemicals by plant in vitro cultures: anticancer agents. Plant Genetic Resources 3(2): 90-100, 2005; Nittis JL. Targeting DNA topoisomerase II in câncer chemotherapy. Nature Reviews Câncer, 9(5): .338-350, .2009) .

Os taxanos paclitaxel e docetaxel, derivados de Taxus brevifolia. e Taxus baccata apresentam expressiva atividade antitumoral contra cânceres de mama, ovário e outros tipos de tumores malignos. Os derivados da comptotecina (irinotecano e topotecano) têm demonstrado atividade antitumoral contra câncer coloretal e de ovário, respectivamente. Novas moléculas de origem vegetal oferecem uma grande oportunidade para avaliar não somente novas classes químicas de agentes tumorais, mas também novos e potencialmente relevantes mecanismos de ação (Rocha AB, Lopes RM, Schwartsmann G. Natural products in anticancer therapy. Current Opinion in Pharmacology, 1: 364-369, 2001; Itokawa H, Morris-Natschke SL, Akiyama T, Lee KH. Plant- derived natural product research aimed at new drug discovery. Journal of Natural Medicines, 62: 263-280, 2008) . A toxicidade de compostos vegetais é muito importante e relevante, uma vez que as neoplasias são responsáveis por elevadas taxas de mortalidade e muitos dos tratamentos utilizados nessas neoplasias, como os radioterápicos e quimioterápicos, têm efeitos colaterais indesejáveis (Machado V, Cabral A, Monteiro P, Gonçalves L, Providência LA... 0 carvedi oi como. protector da ca rdi o toxicidade induz ida pelas antraciclinas (doxorrubicina). Revista Portuguesa de Cardiologia, 27(10, 1277-1296, 2008). Portanto, há uma incessante busca de fármacos eficientes, que tenham baixa toxicidade e, conseqüentemente, causem o mínimo de efeitos colaterais (Verçosa Jr D, Melo MM, Cassali GD, Dantas- Barros AM, Silva Jr PGP. Influência de Agaricus blazei Murrill sobre o tumor sólido de Ehrlich e linfonodos poplíteos de camundongos. Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinária e Zootecnia, 59(1): 150-154, 2007).

Diante de todo estado da técnica a presente invenção traz vantajosamente uma composição farmacêutica contendo eupomatenóide-5 que apresentou atividade anticâncer, sem apresentar sinais de toxicidade, com baixa citoxicidade em algumas linhagens tumorais e redução significativa dos volumes dos tumores. BREVE DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO A presente invenção trata-se de uma composição farmacêutica contendo eupomatenóide-5 extraído de Piper regnellii (Miq) . C. DC. var. regnellii. e seu uso em composições medicamentosas destinadas para o tratamento de câncer.

A neolignana eupomatenóide-5 foi identificada como um dos principais compostos envolvidos - na --atividade anticâncer, sem apresentar sinais de toxicidade, com baixa citoxicidade em algumas linhagens tumorais e redução significativa dos volumes dos tumores, sendo diferenciais em se tratando do desenvolvimento de um medicamento quimioterápico. BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

A Figura 1 refere-se ao cromatograma e fragmentograma obtidos através de análise por cromatografia gasosa acoplada a detector seletivo de massas (CG/EM) da neolignana eupomatenóide-5 (m/z = 294), composto obtido no tempo retenção de 31.270 min.

A Figura 2 apresenta a estrutura química do composto eupomatenóide-5.

A Figura 3 refere-se à atividade anticâncer do extrato bruto diclorometânico (EBD) previamente extraído com hexano das folhas de Piper regnellii, em cultura de células tumorais humanas, relacionando porcentagem de crescimento versus concentração do extrato (UACC-62 - melanoma, MCF7 - mama, 786-0 - rim, NCI-H460 - pulmão, PC-3 - próstata, OVCAR-3 - ovário, HT29 - cólon e K-562 - leucemia).

A Figura 4 refere-se à atividade anticâncer da fração de média polaridade (FB), proveniente do fracionamento do EBD por meio de coluna filtrante, em cultura de células tumorais- humanas,, relacionando porcentagem de crescimento versus concentração da fração (UACC-62 - melanoma, MCF7 - mama, 786-0 - rim, NCI-H460 - pulmão, PC-3 - próstata, OVCAR-3 - ovário, HT29 - cólon e K-562 - leucemia).

A Figura 5 refere-se à atividade anticâncer da neolignana eupomatenóide-5, obtida através de precipitação com hexano da FB, em cultura de células tumorais humanas, relacionando porcentagem de crescimento versus concentração do composto (UACC-62 - melanoma, MCF7 - mama, 786-0 - rim, NCI-H4 60 - pulmão, PC-3 - próstata, OVCAR-3 - ovário, HT29 - cólon e K-562 - leucemia).

A Figura 6 refere-se à avaliação do volume tumoral em função do tempo de tratamento, em dias, para cada dose testada no ensaio de Tumor Sólido de Ehrlich para o EBD. *p<0.05, * *p<0.01, ***p<0.001. Teste de Duncan, p<0.01 (ANOVA).

A Figura 7 refere-se à avaliação do volume tumoral em função do tempo de tratamento, em dias, para cada dose testada no ensaio de Tumor Sólido de Ehrlich para a Fração B. *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001. Teste de Duncan, p<0.01 (ANOVA).

A Figura 8 refere-se à avaliação do volume tumoral em função do tempo de tratamento, em dias, para cada amostra testada no ensaio de Tumor Sólido de Ehrlich para o

composto___eupom.aten0i.de-.5 . . *p<0 . 05, **p<0 .01, ***p<0 . 001..

Teste de Duncan, p<0.01 (ANOVA).

A Figura 9 refere-se às variações de peso úmido dos órgãos dos grupos experimentais: salina, 5-fluoracil e eupomatenóide-5. *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001. Teste de Duncan, p<0.001 (ANOVA). DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Embora a presente invenção possa ser suscetível a diferentes modalidades, é mostrada nos desenhos e na seguinte discussão detalhada, uma modalidade preferida com o entendimento de que a presente descrição deve ser considerada uma exemplificação dos princípios da invenção e não pretende limitar a presente invenção ao que foi ilustrado e descrito aqui.

A presente invenção trata-se de uma composição farmacêutica contendo eupomatenóide-5 extraído de Piper regnellii (Miq). C. DC. var. regnellii e excipientes farmaceuticamente aceitáveis. A dita composição farmacêutica compreende um extrato bruto de Piper regnellii com pelo menos 13% de eupomatenóide-5.

A composição medicamentosa para o tratamento de câncer compreende a seguinte estrutura molecular:

É um objeto adicional o uso do composto químico eupomatenóide-5 em composições medicamentosas destinadas para o tratamento de câncer como componente principal. Método de extração da neolignana eupomatenóide-5 de Piper regnellii (Miq). C. DC. var. regnellii.

0 método de extração aqui descrito é pertencente ao estado da técnica. As folhas de Piper regnellii (Miq.) C. DC. var. regnellii foram secas em estufa. Estas folhas foram extraídas primeiramente com solvente hexano, em uma proporção de 1:5 (material vegetal:solvente), por 3 vezes consecutivas. Posteriormente o resíduo vegetal foi extraído com solvente diclorometano, na mesma proporção, por 4 vezes consecutivas. Os solventes foram evaporados através de rotaevaporador, e as amostras concentradas, sendo obtidos

5

CH3O

HO

10 os extratos brutos hexânico e diclorometânico (EBH e EBD, respectivamente).

A extração prévia com hexano potencializou a atividade do EBD, sendo este escolhido para fracionamento.

0 EBD foi fracionado por meio de coluna filtrante,

utilizando silica-gel como fase estacionária (na proporção de 1:10 amostra :_silica)_. 0 gradiente de solventes utilizado para eluir a coluna envolveu os solventes hexano, diclorometano e metanol em proporções crescentes de polaridade, de acordo com a Tabela 1.

Tabela 1: Gradiente de solventes, em porcentagem, utilizado para o fracionamento em coluna filtrante do EBD.

15

20

Hexano (%) Diclorometano (%) Metanol (%) 100 0 0 90 10 0 80 20 0 70 30 0 60 40 0 50 50 0 40 60 0 70 0 80 0 90 0 0 100 0 0 99 1 0 97 3 0 95 5 0 0 100

As frações ativas oriundas do extrato bruto diclorometânico com perfis cromatográficos semelhantes foram agrupadas e denominadas FB (Ig). O composto eupomatenóide-5 foi precipitado com hexano a partir deste agrupamento de frações ativas.

Análise Cromatográfica das frações ativas do EBD A análise das frações ativas foi realizada através de

cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massas (CC-EM). A "coluna utilizada foi HP-5MS 5% Phenyl Methyl Siloxane, 30cm de comprimento, 0,25mm de espessura e 0,25pm de espessura de filme, sob as condições da Série AA. 0 tempo de corrida foi de Ih e o gás de arraste utilizado foi o He (gás Hélio), com fluxo de arraste de Iml/min.

Um dos compostos obtido pela precipitação das frações ativas apresentou pico ion molecular em 341 m/z, com pico base em 294 m/z (Fig. 1·) . Identificação do composto eupomatenóide-5

O eupomatenóide-5 foi identificado por meio de ressonância magnética. Os espectros de ressonância magnética nuclear (RMN) foram obtidos em espectrômetro Brüker, modelo Avance DRX-500, operando a 500 MHz na freqüência do hidrogênio e a 125 MHz na freqüência do carbono-13. 0 solvente utilizado na dissolução dos compostos para obtenção dos espectros foi o clorofórmio deuterado (CDCl3, Isotec - INC). Os dados coletados foram comparados com dados espectrais (Tabela 2) descritos para compostos isolados de Piper regnellii (Pessini GL, Dias Filho BP, Nakamura CV, Ferreira AG, Cortez DAG. Neolignanas e análise do óleo essencial das folhas de Piper regnellii (Miq.) C. DC. var. pallescens (C. DC.) Yunck. Brazilian Journal of Pharmaceutical Sciences, 15(3): 199-204, 2005), Por comparação de seus dados de ponto de fusão, massas, RMN1H e RMN13C com os da literatura (Pessini GL, Dias Filho BP, Nakamura CV, Ferreira AG, Cortez DAG. Neolignanas e análise do óleo essencial das folhas de Piper regnellii (Miq.) C. DC. var. pallescens (C. DC.) Yunck. Brazilian Journal of Pharmaceutical Sciences, 15(3): 199-204, 2005), a estrutura do eupomatenóide-5 foi confirmada (Fig. 2) . 0 composto eupomatenóide-5 apresentou ponto de fusão em uma faixa de 113,9 - 115,2°C, consistente com dados de literatura (Chauret DC, Bernard CB, Arnason JT, Durst T, Krishnamurty HG, Sanchezvindas P, Moreno N, Sanroman L, Poveda L. Insecticidal neolignans from Piper decurrens. Journal of Natural Products, 59:152-155, 1996) de 114 - 115°C. Este valor revela que o composto é puro. Tabela 2: Dados espectrais de RMN1H e RMN13C do composto eupomatenóide-5 obtidos por meio de ressonância magnética

nuclear (RMN) e comparados com dados da literatura.

Carbono Eupomatenóide-5 5C (PESSINI et al., 2005) 1' 123. 9 123. 9 2' 120 . 4 120 . 5 2 151. 3 151. 4 3 109. 8 109. 9 3' 114 . 6 114 . 6 3a 131. 6 13 Γ. 7 4 116.1 116.2 4' 146. 7 146.8 132 . 7 132.8 . 5' 145 . 7 145.8 6 109.2 109.3 6' 122 .2 122 . 3 7 110. 6 110.7 7a 152 . 9 153. 2 8 131.3 131. 4 9 124 . 2 124 . 3 18 . 5 18 . 4 CH30 56.1 56.0 CH3-3 9.4 9.2

Atividade antiproliferativa in vitro

A avaliação da atividade anticâncer foi realizada em oito linhagens tumorais humanas, sendo estas: UACC-62 (melanoma), MCF-7 (mama), NCI-H460 (pulmão), OVCAR-3 (ovário), PC-3 (próstata), HT-29 (colon), 786-0 (rim) e K- 562 (leucemia) de acordo com o método descrito abaixo, o qual é conhecido pelo estado da técnica.

As células foram inseridas em microplacas em meio RPMI/SFB/gentamicina nas suas respectivas densidades de inoculação. As placas foram incubadas por 2 4 horas a 370C em atmosfera de 5% de CO2 em ambiente úmido. Após esse período as culturas foram expostas a diferentes concentrações do EBD, fração ativa e composto isolado eupomatenóide-5 (0,25; 2,5; 25 e 250 pg/mL). As placas foram então incubadas por 48 horas e, após este período, o experimento "foi interrompido através da fixação das células pela adição de TCA a 50%, e incubação por 1 hora a 4°C. A seguir as placas foram submetidas a quatro lavagens consecutivas com água para a remoção dos resíduos de TCA, meio, SFB e metabólitos secundários, sendo mantidas à temperatura ambiente até a secagem completa. Para determinar a quantidade de células após 48 horas de tratamento, as células fixadas foram coradas com sulforradamina B (SRB) (corante pro.téico) .

A leitura espectrofotométrica da absorbância foi feita em leitor, de microplacas a 540nm. A sulforrodamina B é um corante protéico que se liga aos aminoácidos básicos das proteínas de células que estavam viáveis no momento da fixação. Por isso, quanto maior a quantidade de SRB ligada ao compartimento, menor a atividade citotóxica da amostra em teste. Os resultados de absorbância foram utilizados para construção de gráficos que relacionam a porcentagem de crescimento celular em função da concentração de amostra aplicada. Através da regressão sigmóide das curvas obtidas com as médias da porcentagem de crescimento, foram calculados os valores TGI (total growth inhibition), ou seja, concentração necessária para inibir totalmente o crescimento celular. Esses valores são utilizados para comparar a potência dos compostos e evidenciando a seletividade. - Citotoxicidade in vitro

A avaliação da citotoxicidade in vitro do EBD demonstrou potência, com boa relação entre concentração e efeito, sendo o EBD mais seletivo para as linhagens de próstata e ovário, com TGI = 10.97 e 12.05 pg/mL, respectivamente (Tabela 3 e Fig. 3) . A fração ativa, de média polaridade, apresentou efeitos citotóxicos para pulmão, rim, melanoma e mama (TGI = 6.09, 8.33, 10.18 e 10.77 pg/mL), sendo seletiva para a linhagem de próstata, com TGI = 5.44 pg/mL (Tabela 3 e Fig. 4). Assim como a fração ativa, o composto eupomatenóide-5 apresentou efeitos citotóxicos para rim, mama, próstata e melanoma (Fig. 5) , sendo potente para rim (TGI = 1.93 pg/mL). Além disso, foi seletivo também para a linhagem tumoral de ovário (TGI = 5.5 pg/mL), como o EBD.

Tabela 3: Valores de TGI (Total Growth Inhibition) do Extrato Bruto Diclorometânico (EBD), Fração Ativa e Eupomatenóide-5 em yg/mL, obtidos em cultura de células

tumorais humana.

Linhagem EBD Fração Ativa Evipoma tenóide-5 Melanoma 26.45 10. 18 8.21 Mama 39.58 10.77 6.27 Rim 21. 93 8 . 33 1 . 93 Pulmão 20.39 6.09 10.26 Próstata 10.97 5.44 6.47 Ovário 12. 05 17 . 61 5.50 Cólon 42 .09 12 . 39 14.28 Leucemia. 158.44 19.21 99. 63

Atividade terapêutica in vivo A atividade terapêutica in vivo do eupomatenóide-5 foi

avaliada utilizando Tumor Sólido de Ehrlich.

Para avaliar a ação sistêmica das substâncias com atividade em cultura de células foi utilizado o modelo descrito a seguir. Foram utilizados camundongos da linhagem Balb-C e inoculadas aleatoriamente 2,5 χ IO6 células/ 0,5 mL por animal, na região interplantar da pata posterior direita. Os animais foram separados em grupos de 10 animais e o tratamento iniciado no dia posterior à inoculação. Os animais foram tratados com solução salina 0,9% (controle negativo) , 5-Fluoracil® na dose de 15mg/Kg (controle positivo) e as amostras do EBD (doses de 100, 300 e lOOOmg/kg); Fração Ativa (doses de 30 e lOOmg/Kg) e o composto isolado eupomatenóide-5 (dose de 30mg/Kg), via intraperitoneal, a cada três dias durante quinze dias. A evolução tumoral foi avaliada a cada três dias através da determinação do volume tumoral com a utilização de um pletismômetro. Ao final os animais foram submetidos à eutanásia por deslocamento cervical, o tumor retirado, pesado e medido.

As amostras avaliadas in vivo em tumor sólido de

Ehrlich . reduziram........significativamente - o- volume- tumoral. O

EBD reduziu o volume em 33.3 e 41.9% (doses de 300 e lOOOmg/Kg). A dose de lOOmg/Kg da fração ativa e o composto eupomatenóide-5 na dose de 30mg/Kg reduziram em 30.9 e 30.4% o volume tumoral, respectivamente, demonstrando que o eupomatenóide-5 é um dos compostos responsáveis pela atividade antitumoral (Figuras 6 a 8).

Assim como o composto eupomatenóide-5, o

quimioterápico 5-Fluoracil® reduziu o volume tumoral a partir do sétimo dia e manteve sua atividade antiproliferativa, reduzindo o tumor em 58.6%. Os dados do peso relativo dos órgãos indicam que o quimioterápico 5- Fluoracil® apresentou toxicidade, sendo os órgãos fígado, pulmões e baço os órgãos mais afetados por esta toxicidade (Fig. 9) . Estes dados corroboram com o estudo de caso clínico que reportou toxicidade pulmonar em pacientes em tratamento quimioterápico com 5-Fluoracil® (Ruiz-Casado A, Garcia MD, Racionero MA. Pulmonary toxicity of 5-fluoracil and oxiplatin. Clinicai and Translational Oncology, 8(8): 624, 2006).

0 composto eupomatenóide-5 apresentou atividade anticâncer, sem apresentar sinais de toxicidade nos animais. Os dados de toxicidade são muito importantes e relevantes, uma vez que as neoplasias são responsáveis por elevadas taxas de mortalidade e muitos dos· tratamentos utilizados nessas neoplasias, como os radioterápicos e quimioterápicos, têm efeitos colaterais indesejáveis. Portanto, há uma incessante busca de fármacos eficientes, que tenham baixa toxicidade e, conseqüentemente, causem o mínimo de efeitos colaterais. EXEMPLOS

Para permitir uma melhor compreensão da presente invenção e demonstrar claramente os avanços técnicos obtidos são agora apresentados como exemplos os resultados dos diferentes ensaios efetuados com relação à invenção em tela.

Estes Exemplos são apresentados a título meramente ilustrativo e não devem ser de forma alguma considerados como limitativos do âmbito e do alcance da presente invenção.

Exemplo 1: Obtenção dos extratos brutos diclorometânico (EBD) e etanólico (EBE) Primeiramente as folhas de Piper regnellii (200g) foram secas em estufa, a 40°C, por 72 horas, e maceradas com solvente diclorometano, na proporção de 1:5 (amostra:solvente). 0 material foi evaporado em rotaevaporador e o extrato concentrado, originando o extrato bruto diclorometânico (EBD). Posteriormente o resíduo veqetal foi extraído com etanol 7 0%, originando o extrato bruto etanólico (EBE). Ambos os extratos foram testados em cultura de células tumorais, porém o EBE não apresentou atividade anticâncer.

Exemplo 2: Obtenção dos extratos brutos hexânico (EBH) e diclorometânico (EBD)

As folhas de Piper regnellii (200g) foram secas em estufa, a 40°C, por 72 horas, e maceradas primeiramente com solvente hexano, na proporção de 1:5 (amostra:solvente). O material foi evaporado em rotaevaporador e o extrato concentrado, originando o extrato bruto hexânico (EBH). Posteriormente o resíduo vegetal foi extraído com diclorometano, originando o extrato bruto diclorometânico (EBD). Ambos os extratos foram testados em cultura de células tumorais, sendo que o EBH não apresentou atividade anticâncer significativa. Quando comparados os dois EBD, foi visto uma melhora na atividade do extrato quando primeiramente extraído com o solvente hexano, sendo este considerado para o fracionamento e a obtenção do composto isolado.

Exemplo 3: Fracionamento dos extratos brutos hexânico (EBH) e diclorometânico (EBD)

Os extratos brutos EBH e EBD foram submetidos a

fracionamento através de coluna filtrante, utilizando silica-gei. como .fase estacionária (na proporção de 1:10 amostra:silica). 0 gradiente de solventes utilizado para eluir a coluna envolveu os solventes hexano, diclorometano e metanol em proporções crescentes de polaridade. As frações foram coletadas e agrupadas conforme perfil observado por Cromatografia4 em Camada Delgada, sendo divididas em 3. grupos: frações apolares, frações de média polaridade e frações polares. Os três grupos foram testados em cultura de células tumorais humanas (in vitro), sendo que apenas as frações de média polaridade (denominadas FB) do EBD apresentaram atividade anticâncer promissória. As frações obtidas do EBH não apresentaram atividade anticâncer significante. Exemplo 4: Isolamento de princípios ativos

0 isolamento dos compostos da fração FB de média polaridade foi realizado através de um novo fracionamento, envolvendo os solventes diclorometano e metanol, em proporções crescentes de polaridade. As subfrações foram coletadas e agrupadas conforme perfil observado por Cromatografia em Camada Delgada. Estas foram enviadas para análise em Cromatografia gasosa acoplada a detector seletivo de massas (CG-EM), sendo identificadas as neolignanas conocarpano, eupomatenóide-3 e eupomatenóide-5. Exemplo 5: Isolamento da neolignana eupomatenóide-5

A fração FB de média polaridade foi submetida à precipitação com solvente hexano, sendo formados um precipitado e um sobrenadante. O precipitado foi coletado e enviado para análise em ressonância magnética nuclear (RMN). Os resultados foram comparados com dados espectrais descritos para compostos isolados de Piper regnellii (PESSINI et al., 2005) e a neolignana eupomatenóide-5 foi confirmada.

Claims (5)

1. Composição farmacêutica caracterizada por conter eupomatenóide-5 e excipientes farmaceuticamente aceitáveis.

2. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por compreender um extrato bruto de Piper regnellii com pelo menos 13% de eupomatenóide-5.

3. Composição medicamentosa para o tratamento de câncer caracterizada por compreender a seguinte estrutura molecular:

4. Composição farmacêutica caracterizada por compreender eupomatenóide-5 e ser utilizada na elaboração de medicamentos com aplicação no tratamento de câncer.

5. Uso do composto químico eupomatenóide-5 caracterizado por ser o principal componente na elaboração de medicamentos com aplicação no tratamento de câncer.