BRPI1003119B1

BRPI1003119B1 - Biorreator com sistema de agitação e aeração específico para cultivo de células aderentes e/ou sensíveis ao cisalhamento

Info

Publication number: BRPI1003119B1
Application number: BRPI1003119-7A
Authority: BR
Inventors: Márcio Ramalho Prata Arnaldo; Luis Ferraz André; Domingos Marcelo; Moreira Da Silva Junior José
Original assignee: Universidade De São Paulo - Usp
Priority date: 2010-08-17
Filing date: 2010-08-17
Publication date: 2018-02-06
Also published as: BRPI1003119A2

Abstract

biorreator com sistema de agitação e aeração específico para cultivo de células aderentes e/ou sensíveis ao cisalhamento. a presente invenção se refere a um biorreator com um sistema de agitação e aeração especifico para o cultivo de células aderentes e/ou sensíveis ao cisalhamento, preferencialmente alguns fungos filamentosos e ainda mais preferencialmente para o cultivo de basideomicetos. o biorreator da presente invenção compreende: um tanque (1), um eixo central rotacional oco em forma de "l" (2), um motor com rotor central (3), uma entrada de ar (4) ligada ac eixo rotacional em forma de "l", uma saída para retirada de amostra (5), uma entrada para alimentação de líquidos (6), uma saida para os gases de exaustão (7) e uma câmara de entrada de ar (8).

Description

(54) Título: BIORREATOR COM SISTEMA DE AGITAÇÃO E AERAÇÃO ESPECÍFICO PARA CULTIVO DE CÉLULAS ADERENTES E/OU SENSÍVEIS AO CISALHAMENTO (51) Int.CI.: B01J 19/18; C12M 1/00 (52) CPC: B01J 19/18,C12M 21/00,C12M 23/00 (73) Titular(es): UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO - USP (72) Inventor(es): ARNALDO MÁRCIO RAMALHO PRATA; ANDRÉ LUIS FERRAZ; MARCELO DOMINGOS; JOSÉ MOREIRA DA SILVA JUNIOR

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Relatório Descritivo da Patente de Invenção para:

BIORREATOR COM SISTEMA DE AGITAÇÃO E AERAÇÃO ESPECÍFICO PARA CULTIVO DE CÉLULAS ADERENTES E/OU SENSÍVEIS AO

CISALHAMENTO.

Campo da Invenção

A presente invenção se refere a um biorreator que compreende um sistema de agitação e aeração especifico para o cultivo de células aderentes e sensíveis ao cisalhamento. Em particular, a presente invenção se refere a um sistema de agitação e aeração simultâneo, utilizado no cultivo de células aderentes e sensíveis ao cisalhamento, tais como alguns fungos filamentosos, células animais e vegetais.

Antecedentes da Invenção

Os biorreatores são equipamentos usados para o cultivo de microorganismos, células animais ou vegetais.

Existem diversos tipos de biorreatores empregados em processos biotecnológicos. Entre eles podem-se destacar os tanques agitados e aerados tipo STR (Stirred Tank Reactor) , os sistemas agitados por aeração tipo Airlift e os de coluna de bolhas. Os biorreatores são amplamente utilizados com o objetivo de proporcionar as condições adequadas de temperatura, pH, concentração de substrato, sais minerais, vitaminas e oxigênio, para organismos aeróbios, para que microrganismos e células cresçam e

2/24 produzam os metabólitos de interesse.

Bactérias e leveduras são facilmente e tradicionalmente cultivadas em reatores tipo STR, que possuem sistema de agitação côm turbinas de pás planas e aeração por injeção de ar através de uma placa sinterizada ou uma coroa com vários orifícios.

Pode ser citado como exemplo o biorreator descrito na patente US 5,795,732 que apresenta um melhoramento dos biorreatores do tipo STR, ao proporcionar um sistema de pás e discos intercalados que promovem a agitação do meio de cultura. Tal -biorreator é empregado em processos enzimáticos ou microbiológicos, cujo referido sistema de pás e discos intercalados permite sua utilização tanto em escala laboratorial quanto em escala industrial. No entanto, as pás do referido biorreator, quando em movimento, acarretam cisalhamento significativo de células sensíveis, principalmente de hifas de fungos f ilamentosos. Outra característica importante diz respeito ao seu sistema de distribuição de ar em tubo circular com micro-orifícios, o qual representa um potencial ponto de adesão das células cultivadas, particularmente, quando se trata do cultivo de fungos filamentosos. Tal adesão leva ao entupimento dos referidos micro-orifícios limitando assim a entrada de ar ou oxigênio no meio de cultivo.

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Outro exemplo de biorreator com sistema de agitação por pás pode ser visto no pedido de patente mexicano n° MX

2007009794, onde os inventores descrevem um biorreator particularmente usado no cultivo de microorganismos aeróbios. O referido biorreator consiste, basicamente, de um tanque aerado, onde os inventores apresentam um sistema de agitação por pás, as quais foram projetadas aerodinamicamente com o objetivo de reduzir a resistência mecânica contra o meio de cultivo. Além disso, os inventores também descrevem o uso de defletores instalados verticalmente e de forma helicoidal sobre a superfície interna do tanque, com o objetivo de diminuir a quantidade de espuma no interior do biorreator. Embora se tenha reduzido a resistência mecânica, tanto as pás quanto os referidos defletores configuram pontos potenciais de adesão das células cultivadas, particularmente, quando se trata do cultivo de fungos filamentosos. Tal adesão resulta na formação de aglomerados de células, os quais impedem a distribuição homogênea de ar e nutrientes no interior do biorreator. Deste modo, o referido biorreator fica limitado ao cultivo de microorganismos unicelulares que não formam aglomerados por adesão às superfícies internas do biorreator.

Frente ao que é conhecido do estado da técnica,

4/24 podemos dizer que a agitação é um parâmetro importante em um biorreator. O processo de agitação do meio de cultivo contribui para uma adequada homogeneidade, auxiliando na aeração, possibilitando que os nutrientes cheguem mais facilmente à célula, evitando gradientes de pH e auxiliando na transferência de calor. Entretanto, a agitação também pode causar mudanças na morfologia celular, variação na taxa de crescimento e na formação de produtos. Em produções industriais envolvendo culturas submersas de fungos, a morfologia micelial pode variar entre a formação de grumos e formas filamentosas dispersas, dependendo das condições de cultivo e da espécie fúngica em uso.

Por exemplo, os caldos fermentativos contendo microrganismos filamentosos exibem frequentemente um comportamento pseudo-plástico não convencional, ou diferente daquele observado no cultivo de organismos unicelulares como as bactérias. Este comportamento pseudo-plástico exerce um profundo efeito no desempenho do biorreator, afetando o padrão de mistura e os processos de transferência de massa e energia.

Ademais, o aumento na viscosidade do caldo fermentativo em biorreatores convencionais tipo tanque agitado e aerado pode ser parcialmente compensado pelo aumento no valor das variáveis operacionais (frequência

5/24 de rotação do eixo contendo as pás e vazão específica de alimentação de ar) , a fim de manter um adequado coeficiente volumétrico de transferência de oxigênio (k_La) . Contudo, altas frequências de rotação do eixo contendo as pás levam à alta taxa de cisalhamento, o que pode causar mudanças morfológicas irreversíveis no microrganismo, mudanças reológicas no caldo fermentativo, e, por consequência, prejuízo no desempenho do cultivo e no aumento de biomassa. O excesso de cisalhamento pode ainda resultar em rompimento celular e decréscimo da biomassa.

Embora as células animais e vegetais, assim como alguns fungos filamentosos, necessitem de intenso fornecimento de oxigênio e os sistemas de agitação conhecidos até o momento, sabidamente melhorem a aeração do meio de cultivo frente à biorreatores sem agitação, tais células se mostram extremamente sensíveis a agitações bruscas e ao impacto contra as turbinas de agitação de biorreatores tais como os mencionados acima.

Frente ao que foi acima exposto, é de conhecimento de um versado na técnica que os biorreatores de coluna de bolha e os do tipo Airlift são, até o presente momento, os mais apropriados para o cultivo de células sensíveis ao cisalhamento, mais particularmente para o cultivo de fungos filamentosos, por proporcionarem uma baixa força

6/24 de cisalhamento.

Podemos citar a patente americana US 4,649,117 como exemplo de um tipo de biorreator que utiliza a própria inserção de ar como uma forma de agitar o meio de cultura. A patente descreve um biorreator que é utilizado para o cultivo de células e fermentação, compreendendo um tanque de reação com um desenho distinto. Tal desenho permite a inserção de um fluxo de ar suave e centralizado no fundo do tanque, proporcionando uma agitação do meio de cultura com uma baixa força de cisalhamento mecânico.

Apesar de minimizar a força de cisalhamento no interior do tanque aerado, esse desenho de biorreator também é susceptível a adesão das células cultivadas, particularmente, quando se trata do cultivo de fungos filamentosos. Tipicamente, nesse tipo de biorreator, ocorre a adesão inicial de hifas do fungo cultivado sobre a placa microperfurada usada para a entrada de ar e a subsequente formação de um aglomerado de células fúngicas que obstruem o tubo interno usado para a ascensão da coluna de bolhas de ar. Essa obstrução acarreta na diminuição significativa da eficiência de transferência de oxigênio para o meio de crescimento, além de impedir a homogeneização do' líquido contido no biorreator que, nesse caso, é feita pelo deslocamento ascendente da coluna de bolhas de ar.

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Já a patente US 4,545,945 revela um processo para melhorar a distribuição de ar em um biorreator do tipo

Airlift onde o referido processo descreve basicamente um compartimento guia para a entrada de ar, instalado dentro do tanque de cultivo. O referido compartimento guia proporciona a divisão do liquido de cultivo em duas zonas, uma onde o fluxo de liquido é ascendente, devido à inserção de ar, e outra onde o fluxo de liquido é descendente. O ar é inserido no referido compartimento por uma pluralidade de entradas, formando uma corrente de agitação no meio de cultura. Nesse tipo de biorreator, que se configura como um autêntico biorreator agitado por coluna de bolhas de ar, o limitante para o cultivo de fungos filamentosos, preferencialmente de basidiomicetos, é a adesão dos referidos fungos na superfície microperf urada utilizada para a inserção de ar no referido biorreator. Após a adesão inicial das hifas sobre essa superfície, ocorre a formação de aglomerados de células fúngicas que efetivamente impedem ou limitam a entrada de ar no biorreator de forma homogênea, minimizando a eficiência da transferência de oxigênio e da homogeneização do líquido.

Conforme descrito anteriormente, mesmo com a diminuição da força de cisalhamento, o crescimento de alguns fungos filamentosos, mais preferencialmente de

8/24 basidiomicetos, ainda se apresenta de forma complicada e problemática nesses biorreatores.

O problema do cultivo de tais fungos é que seu micélio apresenta uma mucilagen externa à hifa, composta de exopolissacarideos, que ocasiona a adesão do micélio em quaisquer superfícies rugosas, ou mesmo lisas e polidas que se mantenham estáticas, presentes no interior do biorreator. Em função da adesão do micélio nessas superfícies há a formação de aglomerados que impedem a correta homogeneização do meio de crescimento e a adequada difusão e solubilização do oxigênio.

Além dos tipos de biorreatores descritos aqui, ainda existem outros sistemas de aeração e agitação de líquidos em recipientes, tais como o descrito na patente americana

US 4,267,052. Embora a invenção descrita na referida patente americana não seja direcionada a biorreatores, esta descreve um sistema de agitação e aeração de líquidos, utilizando um eixo central oco em forma de T ligado a um rotor, em que o referido eixo central oco apresenta orifícios para entrada de ar e para a entrada de líquido, além de um pequeno tubo posicionado no interior do referido eixo central, logo abaixo dos orifícios de entrada de ar, que devido ao movimento de rotação suga o ar do ambiente para o interior do eixo, despejando esse ar no líquido sob agitação. O limitante

9/24 desse sistema de aeração e agitação de líquidos para uso no cultivo de fungos filamentosos é, novamente, a clara possibilidade de adesão das hifas tanto no eixo central quanto no tubo interno, na altura dos orifícios para entrada de líquido, configurado como uma trompa de aspiração. Neste ponto, a oferta de oxigênio para as células fúngicas cultivadas seria alta, favorecendo seu rápido crescimento e adesão, tanto na parte externa como interna do sistema de aspiração. Uma vez obstruída essa pequena passagem de líquido e ar, o sistema de agitação e aeração em questão deixaria de operar para a finalidade de promover a eficiente aeração do líquido de cultivo em questão.

Entretanto, mesmo com uma diversidade de sistemas de aeração e agitação disponíveis, ainda se observa que os problemas de cultivo de basidiomicetos em biorreatores convencionais são notórios. Outro fato importante é que apesar de existirem estudos sobre as condições apropriadas para o crescimento dessa classe de fungos, tais estudos estão relacionados a ajustes nos reatores existentes, com a tentativa de controlar os problemas de agregação de micélio, cisalhamento de hifas e consequente perda de viabilidade. Deste modo, inexistem avaliações de reatores desenhados especificamente para esse tipo de cultivo.

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Nesse contexto, a estrutura do equipamento é de fundamental importância na medida em que interfere na morfologia e na quantidade da biomassa formada. Embora estudos venham demonstrando que o mecanismo de agitação e aeração pode claramente determinar o tipo de crescimento e influenciar na produtividade, em nenhum dos casos foi revelado um modelo de reator que permita revolucionar a forma de produzir micélio dessa classe de fungos.

Sumário da invenção

Para solucionar os problemas acima mencionados a presente invenção propiciará vantagens significativas em relação aos biorreatores utilizados atualmente, possibilitando um aumento do seu desempenho e apresentando uma relação custo/benefício mais favorável.

A presente invenção se refere a um biorretor que compreende um sistema de aeração rotatória, que permite a aeração e agitação do meio líquido de forma simultânea, evitando assim a obstrução da(s) saída(s) de ar que se encontra(m) em movimento contínuo e apresenta (m) um maior diâmetro quando comparado aos tradicionais microorifícios comumente usados. Essas características permitem então uma eficiente dissolução de oxigênio no meio líquido, além de promover uma homogeneização contínua, com uma baixa força de cisalhamento e minimização da adesão das células às superfícies internas

11/24 do biorreator. Tudo isso contribui para a inibição da formação de aglomerados no interior do biorreator, bem como para uma redução na taxa de cisalhamento.

As características do biorreator da presente invenção são importantes, principalmente, para o cultivo de células aderentes e sensíveis ao cisalhamento, preferencialmente alguns fungos filamentosos e ainda mais preferencialmente para o cultivo de basideomicetos.

O biorreator da presente invenção proporciona uma maior produção de biomassa, o que significa um aumento da produtividade de inóculos de basidiomicetos, os quais são de grande importância para diversos processos, tais como a biopolpação, a biorremediação de solos contaminados, a produção de cogumelos comestíveis, etc.

Breve Descrição das Figuras _

A estrutura e operação da invenção, juntamente com vantagens adicionais da mesma poderão ser melhor entendidas mediante referência aos desenhos em anexo e às seguintes descrições:

A Figura 1 representa uma vista em perspectiva do biorreator de acordo com a presente invenção;

A figura 2 representa uma vista lateral do eixo rotacional oco em forma de L de acordo com a presente invenção;

A figura 3 representa uma vista lateral em corte de

12/24 parte do eixo rotacional, com orifícios, que fica dentro da câmara de entrada de ar;

A figura 4 representa uma vista superior da câmara de entrada de ar;

A figura 5 mostra uma curva de crescimento e consumo de açúcares por C. subvermispora em reator convencional

STR, com agitação por pás a 166 rpm e aeração contínua de

1,0 vvm. Na referida curva de crescimento os valores referentes aos açúcares redutores são representados pelo quadrado (□) ; à biomassa pelo círculo preenchido (·) ; e ao pH pelo triângulo ( Δ) ;

A figura 6 mostra uma curva de crescimento e consumo de açúcares por C. subvermispora no biorreator de acordo com a presente invenção, com aeração de 1,0 vvm. Na referida curva de crescimento os valores referentes aos açúcares redutores são representados pelo quadrado (Π) ; ao O2/IO pelo círculo (O) ; à biomassa pelo círculo preenchido (·); e ao pH pelo triângulo (Δ) ;

A figura 7 mostra uma curva de crescimento e consumo de açúcares por C. subvermispora no biorreator de acordo com a presente invenção, com aeração de 1,0 vvm e adição de 5g/L de sacarose após 5 dias de cultivo. Na referida curva de crescimento os valores referentes aos açúcares redutores são representados pelo quadrado (□) ; ao O₂/10 pelo círculo (O); à biomassa pelo círculo preenchido (·) ;

13/24 e ao pH pelo triângulo (Δ) . Descrição Detalhada da Invenção

Embora a presente invenção possa ser suscetível a diferentes modalidades, é mostrada nos desenhos e na seguinte discussão detalhada, uma modalidade preferida com o entendimento de que a presente descrição deve ser considerada uma exemplificação dos princípios da invenção e não pretende limitar a presente invenção ao que foi ilustrado e descrito aqui.

De acordo com a presente invenção é possível promover uma adequada aeração e agitação em meios ' líquidos, em uma condição que evite a formação de aglomerados e minimize o cisalhamento de células cultivadas em biorreatores. Tais características são importantes principalmente para o cultivo de células aderentes e sensíveis ao cisalhamento, preferencialmente alguns fungos filamentosos e ainda mais preferencialmente para o cultivo de basideomicetos. Para tal, a presente invenção se refere a um biorreator que compreende um sistema de aeração rotatória, que permite a aeração e agitação do meio líquido de forma simultânea.

A distribuição das bolhas em um movimento circular contínuo promove ainda agitação adicional do meio. Essa característica permite então uma eficiente dissolução de oxigênio no meio líquido, além de promover uma

14/24 homogeneização contínua. Tudo isso contribui para a inibição da formação de aglomerados no interior do biorreator e para uma redução na taxa de cisalhamento.

A figura 1 ilustra uma modalidade do biorreator, de acordo com a presente invenção, em que compreende um tanque (1), um eixo central rotacional oco em forma de

L (2), um motor com rotor central (3), uma entrada de ar (4) ligada ao eixo rotacional L, uma saída para retirada de amostra (5), uma entrada para alimentação de líquidos (6), uma saída para os gases de exaustão (7) e uma câmara.de entrada de ar (8), em que:

O tanque (1) é apresentado, preferencialmente, em um formato cilíndrico, podendo ser constituído de ao menos um dos materiais do grupo que consiste de: vidro, aço inox ou qualquer outro material rígido resistente ao calor e de baixa rugosidade. Em uma modalidade da presente invenção, o tanque (1) apresenta 420 mm de altura por 220 mm de diâmetro, conferindo uma capacidade de 14 L com um volume operante de 10 L. Entretanto, esses valores podem variar em escala, desde que sejam mantidas as proporções entre as partes.

O eixo central rotacional oco em forma de L (2), preferencialmente constituído de aço inoxidável ou de qualquer outro material rígido passível de polimento, ainda mais preferencialmente constituído de aço

15/24 compreende,

central
do	eixo
por	sua
ar	(8) ,
(5)	é

inoxidável AISI-316 com superfície externa polida, compreende micro-orifícios ou orifícios, distribuídos ao longo de toda a circunferência da porção do eixo que fica no interior da câmara de entrada de ar (8), tal como pode ser melhor visualizado na figura 3.

O motor com rotor central (3) preferencialmente, um sistema de ajuste da velocidade de rotação e está conectado ao eixo central (2) .

A entrada de ar (4) é ligada ao eixo central rotacional em L, preferencialmente na porção do eixo (2) contendo micro-orifícios ou orifícios, que por sua vez se encontra dentro da câmara de entrada de ar (8), tal como pode ser melhor visualizado na figura 3

A saída para retirada de amostra preferencialmente conectada a; uma torneira ou qualquer dispositivo (não mostrado nas figuras) que permita regular a retirada de amostra.

A entrada para alimentação de líquidos (6) é preferencialmente um tubo, o qual atravessa a tampa, paralelamente à câmara de entrada de ar (8), tal como pode ser melhor visualizado na figura 4, permitindo adicionar soluções de nutrientes, ácidos ou qualquer outro líquido de interesse diretamente no interior do tanque (1) .

A saída para os gases de exaustão (7), assim como a

16/24 entrada de alimentação de líquidos (6), é preferencialmente um tubo, o qual atravessa a tampa, paralelamente à câmara de entrada de ar (8), tal como pode ser melhor visualizado na figura 4, permitindo a saída dos gases de exaustão que são formados no interior do tanque (1) .

A câmara de entrada de ar (8) é constituída de ao menos um dos materiais do grupo que consiste de: teflon, borracha de silicone, borracha vulcanizada ou qualquer outro material maleável e resistente ao calor. Ela é o dispositivo que permite a aeração e agitação simultânea por compreender dois rolamentos selados, posicionados, preferencialmente, um em cada extremidade da câmara de entrada de ar (8), tal como pode ser melhor visualizado na figura 3, permitindo o movimento rotacional do eixo central (2) e de forma simultânea a aeração do meio líquido, através da entrada de ar (4) e dos microorifícios ou orifícios distribuídos ao longo de toda a circunferência da porção do eixo (2) que fica no interior da câmara de entrada de ar (8).

A figura 2 ilustra o eixo central rotacional oco em forma de L (2), em que compreende uma saída de ar (9) para o meio líquido de cultivo e uma porção (10) que compreende a parte do eixo rotacional (2), que fica dentro da câmara de entrada de ar, que compreende micro17/24 orifícios ou orifícios distribuídos ao longo de toda a circunferência do eixo de rotação.

A figura 3 ilustra a tampa do biorreator, ou melhor, a câmara de entrada de ar (8), que compreende em seu interior: a porção (10) do eixo rotacional(2), contendo micro-orifícios ou orifícios (11) ao longo de toda a sua circunferência; o tubo para entrada de ar (4), cuja extremidade fica no interior da câmara e se comunica com os orifícios do eixo rotacional; os rolamentos (12) posicionados preferencialmente um em cada extremidade da câmara, permitindo a fixação do eixo na câmara e seu livre movimento de rotação; e o tubo de entrada de alimentação de líquidos (6), permitindo a adição de soluções nutrientes, ácido, ou qualquer outro líquido de interesse.

A figura 4 ilustra a tampa do biorreator, ou melhor, a câmara de entrada de ar (8), em uma vista superior, em que compreende: o tubo de saída para os gases de exaustão (7); o tubo de entrada de alimentação de líquidos (6); e o tubo para entrada de ar (4) em conexão com a porção (10) do eixo rotacional (2).

Em outra modalidade da presente invenção pode ser utilizado um sistema de controle de temperatura, interno ou externo, para manutenção dos níveis desejados, dependendo de cada tipo de cultivo realizado. De forma

18/24 preferencial, o sistema de controle de temperatura é externo, promovido por uma estufa ou uma sala de temperatura controlada, ou ainda ligado diretamente ao biorreator pela inclusão de uma camisa externa termostatizada com água, possibilitando o funcionamento do biorreator em ambiente com temperaturas variadas e/ou variáveis.

Em outra modalidade da presente invenção, a parte inferior do eixo central rotacional oco em forma de L, que corresponde à saida do ar para o meio de cultivo, poderão ser adicionadas outras, saidas, pelo menos uma saída, preferencialmente de uma a três saídas. De forma mais preferencial, poderão ser adicionadas três saídas, ficando um total de quatro saídas de ar, o que proporcionará uma melhoria na aeração do meio, possibilitando maior produção de biomassa do fungo ou célula a ser cultivada.

Em outra modalidade da presente invenção, o tanque (1) indicado na figura 1, que é preferencialmente construído de vidro, pode ser construído de aço inox, compreendendo um visor de vidro que possibilita o monitoramento do processo que ocorre no seu interior.

Neste caso, o controle de temperatura por camisa externa termostatizada com água fica facilitado.

Em outra modalidade da presente invenção para

19/24 aumento de escala, visando-se trabalhar com volumes de

100 L ou mais, o biorreator deve ser construído em aço inox. Neste caso, devido à altura da coluna de líquido, o eixo central rotacional deve conter saídas laterais equidistantes, paralelas à saída inferior (que constitui o L) e de mesmo diâmetro que esta. O número destas saídas laterais, assim como a distância entre elas, dependerá de um estudo prévio para se verificar a eficiência do sistema. Dependendo, ainda, da ordem de grandeza do biorreator, o motor destinado a girar o eixo rotacional pode ser fixado no próprio corpo do equipamento, ficando independente de suporte externo, como demonstrado na figura 1. Poderão, também, compreender outras saídas para coleta de amostras, possibilitando uma amostragem mais representativa do meio, tanto para fins de pesquisa quanto para controle do processo em escala industrial.

Além disso, em outra modalidade, a boca do biorreator, ou seja, a parte superior que contém a câmara de entrada de ar e os rolamentos que permitem a rotação do eixo poderá apresentar um diâmetro maior ou menor, de acordo com a necessidade de comportar mais ou menos orifícios para inserção, por exemplo, de sondas para determinação de oxigênio dissolvido e/ou eletrodo para medição de pH, dependendo das necessidades operacionais

20/24 do processo desejado.

EXEMPLOS

Para permitir uma melhor compreensão da presente invenção e demonstrar claramente os avanços técnicos obtidos são agora apresentados como exemplos os resultados dos diferentes ensaios efetuados com relação a presente invenção.

O k_La (coeficiente volumétrico de transferência de oxigênio) do biorreator da presente invenção foi medido em meio liguido composto de 2% de sacarose e 3,21% de milhocina, pH 4,5 e correspondeu a 9,36 h^_1. A operação e a funcionalidade do biorreator foi verificada através de vários cultivos do basidiomiceto teste, Ceriporiopsis subvermispora, em meio composto por 2% de sacarose e

3,21% de milhocina, pH 4,5. Para efeito de comparação de eficiência, o mesmo tipo de cultivo foi conduzido em um reator STR convencional, disponível no mercado.

As Figuras 5 a 7 ilustram um comparativo de eficiência para o crescimento de biomassa nos dois reatores em guestão. Estas figuras representam as concentrações de açúcares redutores e de biomassa fúngica obtidas guando se cultivou o fungo filamentoso Ceriporiopsis subvermispora no biorreator objeto da presente invenção e em um biorreator convencional. Estes dados foram registrados e utilizados para comparação por

21/24 representarem o objetivo do processo fermentativo em questão. Ou seja, deseja-se que o fungo consuma a maior quantidade possível de substrato e forme a maior quantidade possível de biomassa, uma vez que esta biomassa será empregada no processo de biopolpação da madeira para a produção de papel e celulose.

Nos ensaios acima mencionados, verifica-se claramente que o biorreator da presente invenção proporcionou maiores níveis de biomassa acumulada, além de ter se mostrado passível de controle externo por adição de agentes controladores de pH ou ainda adição de nutrientes ao longo de um cultivo. Enquanto o biorreator

STR proporcionou acúmulo máximo de biomassa igual a 7 g/L, com 12 horas de fermentação (Figura 5) , o biorreator objeto do presente invenção chegou a níveis tão elevados quanto 14 g/L, também com 12 horas de processo (Figura

7). Estes valores estão indicados por uma seta nos respectivos gráficos. Mesmo sem o uso da facilidade de adição de substrato durante o cultivo, o biorreator objeto desta invenção possibilitou que fosse alcançada uma produção de 10 g/L, em cerca de 8 horas de processo (seta, Figura 6).

Além da maior produtividade de biomassa, o biorreator da presente invenção foi notoriamente· mais eficiente para prevenir a formação de aglomerados de

22/24 micélio durante o cultivo. No biorreator STR houve a formação de aglomerados, tipicamente observados nos reatores convencionais. Entretanto, no biorreator da presente invenção, se observa a distribuição homogênea de pellets abundantes e de pequeno tamanho, além da inexistência de aglomerados de micélio observados. Esta distribuição homogênea e ausência de aglomerados são importantes para o desenvolvimento do fungo com as características adequadas para o emprego a que se destina. Além disso, sob o ponto de vista prático, como, por exemplo, a manipulação do meio visando prepará-lo para o emprego a que se destina (neste caso específico, biopolpação da madeira), esta homogeneidade é de fundamental importância.

Os resultados obtidos nos ensaios aqui apresentados demonstram que o biorreator apresentado na presente invenção proporciona uma solução definitiva para os cultivos de fungos filamentosos, preferencialmente, basidiomicetos em cultivos submersos.

A partir da presente invenção, foi possível minimizar os danos às hifas causados pelas forças de cisalhamento, comumente impostas por reatores agitados por pás (STR).

O biorreator da presente invenção provou ainda ser muito eficiente para eliminar a formação de aglomerados

23/24 de micélio, que usualmente se aderem às superfícies rugosas ou estáticas dos reatores convencionais, quer do tipo STR ou os de coluna de bolha e air-lift. As duas melhorias tomadas em conjunto proporcionaram o maior acúmulo de biomassa no interior do novo biorreator, o que significa a possibilidade de aumentar a produtividade de inóculos de basidiomicetos. Esses inóculos são amplamente conhecidos por representar uma grande demanda para diversos processos, tais como a biopolpação, a biorremediação de solos contaminados, a produção de cogumelos comestíveis, de enzimas e a produção de exopolisacarídeos com utilidades farmacêuticas.

Com base nas características de baixo cisalhamento e eficiente aeração/agitação, o novo biorreator objeto da presente invenção proporciona a capacidade de também ser empregado com sucesso no cultivo de outras células aderentes e sensíveis ao cisalhamento, tais como as de origem animal e vegetal.

Assim, embora tenha sido mostrada apenas uma modalidade da presente invenção, será entendido que várias omissões, substituições e alterações podem ser feitas por um técnico versado no assunto, sem se afastar do espírito e escopo da presente invenção.

É expressamente previsto que todas as combinações dos elementos que desempenham a mesma função substancialmente

24/24 da mesma forma para alcançar os mesmos resultados estão dentro do escopo da invenção. Substituições de elementos de uma modalidade descrita para outra são também totalmente pretendidos e contemplados.

Também é preciso entender que os desenhos não estão necessariamente em escala, mas que eles são apenas de natureza conceituai. Ά intenção é, portanto, ser limitada, tal como indicado pelo escopo das reivindicações anexas.

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Claims

REIVINDICAÇÕES

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FIGURA 1

1. Biorreator com sistema de agitação e aeração específico para cultivo de células aderentes e sensíveis ao cisalhamento compreendendo um tanque (1), um eixo central rotacional (2), um motor com rotor central (3), uma entrada de ar (4), uma saída para retirada de amostra (5), uma entrada para alimentação de líquidos (6) e uma saída para gases de exaustão (7) caracterizado pelo fato de que o sistema de agitação e aeração específico compreende uma câmara de entrada de ar (8).

2/5 ί

i i

i

FIGURA 2

2/5 rolamentos (12) fixam a porção (10) do eixo central rotacional (2) à câmara de ar (8).

6. Biorreator, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que a câmara de entrada de ar (8) e os rolamentos (12) podem variar de diâmetro de acordo com a necessidade de comportar um maior ou menor número de orifícios.

7. Biorreator, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que aos referidos orifícios são para inserção de sondas para determinação de oxigênio dissolvido e/ou eletrodos para medição de pH.

8. Biorreator, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que o tanque (1) é constituído de ao menos um dos materiais do grupo que consiste de: vidro e aço inox.

9. Biorreator, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que as dimensões e a capacidade do biorreator são proporcionais a 420 mm de altura por 220 mm de diâmetro e capacidade de 14L com volume operante de 10L.

10. Biorreator, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que o eixo central rotacional (2) é oco e na forma de L.

11. Biorreator, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o eixo central rotacional

2. Biorreator, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a câmara de entrada de ar (8) é constituída de ao menos um dos materiais do grupo que consiste de: teflon, borracha de silicone e borracha vulcanizada.

3/5

FIGURA 4

3/5 (2) é constituído de aço inoxidável.

12. Biorreator, de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 ou 11, caracterizado pelo fato de que o eixo central rotacional (2) compreende raicroorifícios ou orifícios (11) .

13. Biorreator, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que os microorif í cios ou orifícios (11) estão distribuídos ao longo de toda a circunferência da porção (10) do eixo central rotacional (2), onde a referida porção (10) está preferencialmente alojada no interior da câmara de entrada de ar (8) .

14. Biorreator, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizado pelo fato de que o motor com rotor central (3) compreende um sistema de ajuste da velocidade de rotação.

15. Biorreator, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizado pelo fato de que a entrada de ar (4) se comunica com o eixo central rotacional (2) preferencialmente na sua porção (10), no interior da câmara de ar (8).

16. Biorreator, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, caracterizado pelo fato de que a saída para retirada de amostra (5) é preferencialmente conectada a uma torneira ou qualquer dispositivo que permita regular a retirada de amostra.

3. Biorreator, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a câmara de entrada de ar (8) compreende ao menos dois rolamentos (12).

4/5 .1

FIGURA 5

Açúcares (g/L);

FIGURA 6

4/5

17. Biorreator, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 16, caracterizado pelo fato de que compreende um sistema de controle de temperatura.

18. Biorreator, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 17, caracterizado pelo fato de que, o controle de temperatura é externo.

19. Biorreator, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que o referido sistema de controle de temperatura pode ser uma estufa, uma sala de

temperatura controlada ou uma camisa externa termostatizada com água, ligada diretamente no biorreator. 20. Biorreator, de acordo com qualquer uma das

reivindicações 1 a 19, caracterizado pelo fato de que a parte inferior do eixo central rotacional (2) pode apresentar pelo menos uma saída adicional, mais preferencialmente de uma a três saídas adicionais a saída principal. 21. Biorreator, de acordo com qualquer uma das

reivindicações 1 a 20, caracterizado pelo fato de que o eixo central rotacional (2) pode compreender saídas de ar laterais equidistantes, paralelas à saída de ar inferior principal.

22. Biorreator, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 21, caracterizado pelo fato de que

5/5 pode compreender mais de uma saída para retirada amostra (5) .

de

4. Biorreator, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que os rolamentos (12) são selados e estão preferencialmente posicionados nas extremidades da câmara de entrada de ar (8) .

5. Biorreator, de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 ou 4, caracterizado pelo fato de que os

5/5

Tempo de cultivo (dias)

Bioomasssa seca (g/L); pH do meio de cultivo

FIGURA 7