BRPI0916498B1 - Método para produção de biomassa enriquecida com carboidratos - Google Patents

Abstract

método para produção de biomassa enriquecida com carboidratos a presente invenção trata de biomassa previamente tratada utilizando uma solução solvente orgânica sob condições alcalinas na presença de uma ou mais alquilaminas e, opcionalmente, um ou mais nucleófilos adicionais para fragmentar e extrair lignina. a biomassa previamente tratada é adicionalmente hidrolisada com um conjunto de enzimas de sacarificação. açúcares fermentáveis liberados por meio de sacarificação podem ser utilizados para a produção de substâncias alvo por meio de fermentação.

Description

1/68 “MÉTODO PARA PRODUÇÃO DE BIOMASSA ENRIQUECIDA COM CARBOIDRATOS”

Referência Cruzada a Pedido Relacionado [001] O presente pedido reivindica o benefício do Pedido Provisório US 61/139147, depositado em 19 de dezembro de 2008, cujo relatório descritivo é integralmente incorporado ao presente como referência.

Campo da Invenção [002] A presente invenção fornece métodos para fácil produção de biomassa lignocelulósica enriquecida com carboidrato sacarificável. Especificamente, é preparada biomassa previamente tratada por meio de fragmentação simultânea e extração seletiva de lignina em uma solução solvente orgânica sob condições alcalinas e temperaturas elevadas na presença de uma ou mais alquilaminas e diversos nucleófilos. Os sólidos restantes enriquecidos com carboidratos na biomassa previamente tratada podem em seguida ser submetidos à sacarificação enzimática para obter açúcares fermentáveis, que podem ser submetidos a processamento adicional para a produção de produtos alvo.

Antecedentes da Invenção [003] Resíduos e estoques de alimentação celulósicos e lignocelulósicos, tais como resíduos agrícolas, madeira, resíduos florestais, lama de fabricação de papel e resíduos sólidos municipais e industriais, fornecem um estoque de alimentação renovável potencialmente grande para a produção de substâncias, plásticos, combustíveis e alimentos. Estoques de alimentação e resíduos celulósicos e lignocelulósicos, compostos de celulose, hemicelulose, pectinas e lignina, são geralmente tratados por uma série de meios químicos, mecânicos e enzimáticos para liberar principalmente açúcares de hexose e pentose, que podem ser fermentados em seguida em produtos úteis.

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2/68 [004] Métodos de tratamento prévio são frequentemente utilizados para tornar os polissacarídeos de biomassa lignocelulósica mais facilmente acessíveis para enzimas celulóticas. Um dos principais impedimentos para a digestão por enzimas celulóticas é a presença de lignina, uma barreira que limita o acesso das enzimas aos seus substratos e uma superfície à qual as enzimas se ligam de forma não produtiva.

[005] Devido ao custo significativo associado à sacarificação enzimática, é desejável minimizar a carga de enzimas por meio da desativação da adsorção de lignina em enzima ou sua extração direta. Um outro desafio é a falta de acesso à celulose para hidrólise enzimática devido à sua proteção por hemicelulose e lignina ou à sua cristalinidade. Os métodos de tratamento prévio que tentam superar esses desafios incluem: explosão de vapor, água quente, ácido diluído, explosão com fibra de amônia, hidrólise alcalina (incluindo percolação reciclada com amônia), delignificação oxidativa e organossolvente.

[006] Métodos de organossolventes, conforme praticado anteriormente para o tratamento de biomassa de lignocelulose, para a produção de polpa ou para aplicações de biocombustíveis, embora geralmente bem sucedidos na remoção de lignina, apresentaram baixa recuperação de açúcar, particularmente de xilose. O uso de misturas de etanol e água levemente ácidas (tais como 42% em peso de EtOH) à temperatura elevada para remoção de lignina de biomassa lignocelulósica, por exemplo (Kleinert, T. N., Tappi, 57: 99102, 1974), resultou em perda substancial de carboidrato. Hidrólise ácida diluída a 95 °C seguida por extração de solvente orgânico e sacarificação enzimática (Lee, Y-H. et al., Biotech. Bioeng., 29: 572-581, 1987) resultou em perda substancial de hemicelulose durante a hidrólise, perda adicional de carboidratos mediante extração com solvente orgânico e baixo rendimento (cerca de 50% do total de carboidratos) mediante sacarificação enzimática do resíduo. O uso de solvente orgânico aquoso que contém amônia a temperaturas elevadas para o

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3/68 tratamento de biomassa lignocelulósica (Park, J.-K. e Phillips, J. A., Chem. Eng. Comm. 65: 187-205, 1988) necessitou do uso de uma alta razão entre líquido e sólidos no tratamento prévio e resultou em perda substancial de hemicelulose e baixa sacarificação enzimática de celulose. Tratamento de biomassa com água gasosa e metilamina seguido por extração com solvente orgânico e extração em seguida com água necessitou de três etapas e resultou em perda substancial de carboidratos (Siegfried, P. e Gotz, R., Chem. Eng. Technol., 15: 213-217, 1992). Tratamento com poliaminas ou etilamina em misturas de álcool alifático e água mais catalisador à temperatura elevada necessitou de alta razão entre líquido e sólidos e baixas concentrações de álcool geraram baixa recuperação de açúcar, particularmente de xilano (Patente US 4.597.830A). Tioglicolato em solução alcalina aquosa utilizada para tratar biomassa lignocelulósica à temperatura elevada, seguido por lavagem em água quente, necessitou do uso de hidróxidos de metais alcalinos ou alcalino-terrosos. Este método necessita do descarte de íons inorgânicos sob alto custo, alto percentual em peso de tioglicolato e uso de grandes volumes de água (Patente US 3.490.993). Tratamento com misturas de solvente orgânico e água na presença de sulfeto e bissulfeto a temperaturas elevadas necessitou de alta razão entre solvente e sólidos e elevado teor de enxofre, resultando em perda substancial de carboidratos (Patente US 4.329.200).

[007] Desvantagens adicionais de métodos aplicados anteriormente incluem fluxos separados de hexose e pentose (tais como ácido diluído), extração inadequada de lignina ou falta de separação de lignina extraída de polissacarídeo, particularmente nos estoques de alimentação com alto teor de lignina (tais como bagaço de cana de açúcar, madeira mole), descarte de produtos residuais (tais como sais por meio da neutralização de ácido ou base) e baixa recuperação de carboidratos devido à decomposição ou perda em etapas de lavagem. Outros problemas incluem o alto custo de energia, capital de

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4/68 equipamento e recuperação de catalisador antes do tratamento, bem como a incompatibilidade com enzimas de sacarificação.

[008] Um dos principais desafios do tratamento prévio de biomassa é a maximização da extração ou neutralização química (com relação à ligação não produtiva de enzimas celulóticas) da lignina mediante minimização da perda de carboidratos (celulose mais hemicelulose) por meio de processos eficientes de baixo custo. Quanto mais alta a seletividade, mais alto o rendimento geral de açúcares monoméricos após o tratamento prévio e sacarificação enzimática combinados.

[009] No presente relatório descritivo, utiliza-se fragmentação mediada por organossolventes e extração seletiva de lignina a temperaturas elevadas e condições alcalinas em combinação com uma ou mais alquilaminas e, opcionalmente, diversos nucleófilos, em um processo eficaz para seu custo, para produzir biomassa enriquecida com carboidrato que é altamente suscetível a sacarificação enzimática, produzindo rendimentos muito altos de açúcares fermentáveis (glicose, bem como xilose) para bioconversão em produtos alvo (tais como combustíveis e substâncias com valor agregado). Surpreendentemente, o uso de alquilaminas no presente relatório descritivo resultou em fragmentação e extração de lignina significativamente aprimoradas e alta retenção de carboidratos.

Descrição Resumida da Invenção [010] A presente invenção fornece um método para produção de biomassa enriquecida com carboidrato facilmente sacarificável e extração seletiva de lignina de biomassa lignocelulósica mediante retenção quase quantitativa de carboidratos. Os métodos incluem o tratamento de biomassa lignocelulósica com uma solução solvente orgânica, tal como organossolvente, e uma ou mais alquilaminas sob condições alcalinas e temperaturas elevadas em uma única etapa. Em certas realizações, a solução de solvente compreende adicionalmente

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5/68 componentes nucleofílicos adicionais tais como amônia, tióis e sulfetos. Após o tratamento prévio, a biomassa pode ser adicionalmente tratada com um conjunto de enzimas de sacarificação para produzir açúcares fermentáveis. Esses açúcares podem ser submetidos a processamento adicional para a elaboração de produtos alvo.

[011 ] Consequentemente, a presente invenção fornece um método para produção de biomassa enriquecida com carboidrato que compreende:

(a) fornecimento de biomassa lignocelulósica que compreende lignina;

(b) suspensão da biomassa de (a) em uma solução solvente orgânica que compreende água e uma ou mais alquilaminas sob condições alcalinas, por meio da qual é formada uma suspensão biomassa-solvente;

(c) aquecimento da suspensão biomassa-solvente até uma temperatura de cerca de 100 °C a cerca de 220 °C por cerca de 5 minutos a cerca de 5 horas, por meio da qual a lignina é fragmentada e é dissolvida na suspensão; e (d) filtragem do líquido livre, por meio da qual a lignina dissolvida é removida e por meio da qual a biomassa enriquecida com carboidrato é produzida.

[012] Alquilaminas particularmente apropriadas incluem as selecionadas a partir do grupo que consiste em R-NH2, R2-NH, R3N, (H2N-R-NH2), (H2N-R(NH2)2), (HO-R-NH2), ((HO)2-R-NH2), (HO-R-(NH2)2), (HS-R-NH2), ((HS)2-RNH2), (HS-R-(NH2)2), (H2N-R(OH)(SH)) e combinações dos mesmos, em que R é independentemente um alcano, alceno ou alcino com um a seis carbonos monovalente, divalente ou trivalente, linear, cíclico ou ramificado.

[013] Estoques de alimentação particularmente apropriados para uso nos métodos de acordo com a presente invenção incluem, mas sem limitações, switchgrass, resíduo de papel, lama de fabricação de papel, fibra de milho, espigas de milho, cascas de milho, forragem de milho, gramas, trigo, palha de trigo, feno, cevada, palha de cevada, palha de arroz, bagaço de cana de açúcar, palha de cana

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6/68 de açúcar, álamo amarelo, sorgo, soja, componentes obtidos por meio do processamento de grãos, árvores, ramos, raízes, folhas, lascas de madeira, serragem, arbustos e moitas, legumes, frutos, flores, esterco animal e combinações dos mesmos.

[014] Em uma outra realização, a presente invenção fornece um método de fragmentação e extração seletiva simultâneas de lignina a partir de biomassa lignocelulósica para produzir uma biomassa substancialmente livre de lignina, em que o método compreende as etapas de:

(a) fornecimento de:

1. uma quantidade de biomassa lignocelulósica;

2. uma solução solvente com múltiplos componentes que compreende cerca de 40% a cerca de 70% de etanol em água; e

3. uma ou mais alquilaminas sob condições alcalinas;

(b) contato da dita biomassa com a solução solvente com múltiplos componentes de (a) para formar uma mistura biomassa-solvente;

(c) colocação da mistura biomassa-solvente em um recipiente de pressão vedado, por meio do qual a mistura de (b) é aquecida a uma temperatura de cerca de 100 °C a cerca de 220 °C por cerca de 5 minutos a cerca de 5 horas, por meio da qual a lignina é fragmentada e dissolvida no solvente; e (d) remoção da lignina dissolvida de (c) por filtragem; e (e) lavagem da biomassa residual com solvente orgânico, por meio da qual é produzida biomassa substancialmente livre de lignina.

Breve Descrição das Figuras

Figuras 1A e 1B [015] A Figura 1A (monômero de glicose) e a Figura 1B (monômero de xilose) exibem o período de tempo de sacarificação enzimática na presença e ausência de Tween 20 a 1 % (p/v) após o tratamento prévio a 187

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7/68 °C por uma hora em EtOH a 70% em H2O (v/v) e 14% de metilamina (p/p de biomassa) com ou sem 2% de tioglicolato (p/p de biomassa).

Figuras 2A e 2B [016] A Figura 2A exibe os espectros de absorbância de UV de filtrados (diluídos 1:5000 com EtOH a 70% em H2O (v/v)) após tratamento prévio a 187 °C por uma hora em EtOH a 70% em H2O (v/v) mais 14% de metilamina (p/p de biomassa) e com 14% de metilamina (p/p de biomassa) mais 2% de ácido tioglicólico (p/p de biomassa) e em 70% de EtOH em H2O (v/v) mais 14% de etilamina (p/p de biomassa) e com 14% de etilamina (p/p de biomassa) mais 2% de ácido tioglicólico (p/p de biomassa). A Figura 2B exibe os espectros de absorbância de UV de filtrados (diluídos a 1:50000 com EtOH a 70% em H2O (v/v)) após tratamento prévio a 187 °C em EtOH a 70% em H2O (v/v) mais 14% de metilamina (p/p de biomassa) e com 14% de metilamina (p/p de biomassa) mais 2% de ácido glicólico (p/p de biomassa) ou 2% de glicina (p/p de biomassa).

Figuras 3A e 3B [017] A Figura 3A exibe os espectros de absorbância de UV de filtrados (diluídos a 1:5000 com EtOH a 70% em H2O (v/v)) após tratamento prévio a 187 °C por uma hora em EtOH a 70% em H2O (v/v) mais 14% de metilamina (p/p de biomassa) com ou sem 2% ou 6% de (NH4)2S (p/p de biomassa). A Figura 3B exibe os espectros de absorbância de UV de filtrados (diluídos a 1:5000 com EtOH a 70% em H2O (v/v)) após o tratamento prévio a 187 °C por uma hora em EtOH a 70% em H2O (v/v) mais 14% de metilamina (p/p de biomassa) com ou sem 2% de enxofre elementar (p/p de biomassa).

Descrição Detalhada da Invenção [018] Os depositantes incorporam especificamente todo o teor de todas as referências mencionadas no presente relatório descritivo. A menos que indicado em contrário, todos os percentuais, partes, razões etc. são em peso. As marcas comerciais são exibidas em caixa alta. Além disso, quando uma

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8/68 quantidade, concentração ou outro valor ou parâmetro for fornecido na forma de faixa, faixa preferida ou lista de valores preferíveis superiores e valores preferíveis inferiores, deve-se compreender como descrevendo especificamente todas as faixas formadas a partir de qualquer par de qualquer limite de faixa ou valor preferido superior e qualquer limite de faixa ou valor preferido inferior, independentemente se as faixas forem descritas separadamente. Quando for indicada no presente uma faixa de valores numéricos, a menos que indicado em contrário, pretende-se que a faixa inclua as suas extremidades e todos os números inteiros e frações dentro da faixa. Não se pretende que o escopo da presente invenção seja limitado pelos valores específicos indicados ao definir-se uma faixa.

[019] A presente invenção fornece um processo de tratamento de biomassa, a fim de produzir biomassa enriquecida com carboidrato facilmente sacarificável para aprimorar a etapa de sacarificação enzimática subsequente, de tal forma que possam ser obtidos açúcares facilmente fermentáveis por meio de sacarificação.

[020] É empregado um processo que envolve uma etapa de tratamento prévio, na qual lignina é simultaneamente fragmentada e extraída utilizando um solvente orgânico sob condições alcalinas e temperaturas elevadas na presença de uma ou mais alquilaminas. Podem ser empregados nucleófilos adicionais para maior benefício. A biomassa tratada é filtrada e lavada em seguida para remover lignina solubilizada, ácido acético, acetamidas, alquilamidas e reagente em excesso e digerida em seguida com um conjunto de enzimas de sacarificação para produzir açúcares facilmente fermentáveis. Os açúcares podem ser adicionalmente processados em seguida em um ou mais produtos alvo. A lignina removida pode também ser adicionalmente processada e utilizada para outros propósitos (tais como queima para obtenção de energia) para aumentar a eficiência.

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Definições [021] São utilizadas as definições a seguir no presente relatório descritivo:

“Temperatura ambiente” e “ambiente”, quando utilizado com referência a temperatura, indicam qualquer temperatura de cerca de 15 °C a cerca de 25 °C.

“Açúcares fermentáveis” designa um teor de açúcar que compreende principalmente monossacarídeos e alguns dissacarídeos que podem ser utilizados como fonte de carbono por um micro-organismo (alguns polissacarídeos podem estar presentes) em um processo de fermentação para gerar um produto alvo. “Açúcares facilmente fermentáveis” indica que não é necessário processamento caro adicional e/ou que um micro-organismo fermentativo pode ser colocado em contato com os açúcares resultantes com impedimentos mínimos de inibidores ou outros componentes que podem prejudicar a fermentação.

“Lignocelulósico” indica um material que compreende lignina e celulose. Material lignocelulósico pode também compreender hemicelulose. Nos processos descritos no presente, lignina é dissolvida e substancialmente removida da biomassa lignocelulósica para produzir uma biomassa enriquecida com carboidrato.

“Lignina dissolvida”, da forma indicada no presente, designa a lignina que é dissolvida em uma solução solvente orgânica.

“Lignina AI” indica lignina insolúvel em ácido.

“Auto-hidrólise” indica a hidrólise de biomassa na presença de solvente (água ou solvente orgânico mais água) mais calor sem outras adições, tal como sem a adição de enzimas hidrolíticas ou bases ou ácidos exógenos.

“Celulósica” designa uma composição que compreende celulose.

“Produto alvo” indica uma substância, combustível ou bloco

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10/68 produtor de substâncias produzido por meio de fermentação. O produto é utilizado em sentido amplo e inclui moléculas tais como proteínas, que incluem, por exemplo, peptídeos, enzimas e anticorpos. Também são contemplados na definição de produto alvo etanol e butanol.

“Peso seco de biomassa” designa o peso da biomassa que possui toda ou essencialmente toda a água removida. Peso seco é tipicamente medido de acordo com o Padrão E1756-01 da Sociedade Norte-Americana de Testes e Materiais (ASTM) E1756-01 (Método de Teste Padrão para Determinação do Total de Sólidos em Biomassa) ou o Padrão da Technical Association of the Pulp and Paper Industry, Inc. (TAPPI) T-412 om-02 (Umidade em Polpa, Papel e Papelão).

“Extração seletiva” indica a remoção de lignina mediante remoção substancial de carboidratos.

“Solução solvente” e/ou “solução solvente orgânica”, da forma utilizada no presente, é uma mistura solvente orgânica em água que inclui qualquer líquido orgânico que dissolva um soluto sólido, líquido ou gasoso, resultando em uma solução. As soluções de solventes mais apropriadas para a presente invenção são solventes orgânicos tais como etanol, metanol, npropanol, isopropanol, n-butanol, 2-butanol, isobutanol, t-butanol, pentanol, hexanol e dióis com o mesmo número de carbonos. Eles podem também incluir solventes apróticos. As soluções de solvente podem incluir componentes adicionais em mistura com a solução; a solução de solvente pode incluir, por exemplo, um ou mais nucleófilos.

“Biomassa” e “biomassa lignocelulósica”, da forma utilizada no presente, designam qualquer material lignocelulósico, incluindo material celulósico e hemicelulósico, tal como safras bioenergéticas, resíduos agrícolas, resíduos sólidos municipais, resíduos sólidos industriais, resíduos de jardim, madeira, resíduos florestais e combinações dos mesmos, conforme descrito

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11/68 adicionalmente abaixo. Biomassa contém teor de carboidratos que compreende polissacarídeos e oligossacarídeos e pode também compreender componentes adicionais, tais como proteínas e/ou lipídios.

“Altamente conservado”, da forma utilizada no presente, designa o teor de carboidratos do material lignocelulósico após as etapas de processamento descritas no presente. Em uma realização da presente invenção, o teor de carboidratos altamente conservado fornece rendimentos de açúcar após a sacarificação que são substancialmente similares a rendimentos teóricos com perda mínima de rendimento de açúcar por meio dos processos descritos no presente. Em uma realização da presente invenção, altamente conservado com referência ao teor de carboidratos designa a conservação de 85% ou mais do carboidrato da biomassa em comparação com biomassa antes do tratamento prévio conforme descrito no presente.

“Processamento prévio”, da forma utilizada no presente, designa o processamento de biomassa lignocelulósica antes do tratamento prévio. O processamento prévio é qualquer tratamento de biomassa que prepare a biomassa para tratamento prévio, tal como moagem mecânica e/ou secagem até o teor de umidade apropriado.

“Suspensão biomassa-solvente” designa uma mistura de biomassa e solvente. A suspensão biomassa-solvente pode compreender componentes adicionais, tais como alquilaminas, tioglicolato, amônia, sulfetos etc.

“Sacarificação” designa a produção de açúcares fermentáveis principalmente com polissacarídeos por meio da ação de enzimas hidrolíticas. A produção de açúcares fermentáveis com biomassa previamente tratada ocorre por meio de sacarificação enzimática pela ação de enzimas celulóticas e hemicelulóticas.

“Tratamento prévio de biomassa” ou “prévio tratamento de

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12/68 biomassa”, da forma utilizada no presente, designa a submissão de biomassa nativa ou previamente processada à ação química ou física, ou qualquer combinações dos mesmos, tornando a biomassa mais susceptível à sacarificação enzimática ou outros meios de hidrólise antes da sacarificação. Os métodos reivindicados no presente podem ser denominados, por exemplo, processos de tratamento prévio que contribuem para tornar a biomassa mais acessível a enzimas hidrolíticas para sacarificação.

“Filtrado pré-tratamento” indica o líquido livre que se encontra em contato com a biomassa após o tratamento prévio e que é separado por filtragem.

“Biomassa previamente tratada”, da forma utilizada no presente, designa biomassa nativa ou previamente processada que tenha sido submetida à ação química, física ou biológica, ou qualquer de suas combinações, tornando a biomassa mais susceptível à sacarificação enzimática ou outros meios de hidrólise antes da sacarificação.

“Secagem a ar da biomassa filtrada” pode ser realizada permitindo-se a secagem da biomassa por meio de equilíbrio com o ar da atmosfera ambiente.

“Biomassa facilmente sacarificável” indica biomassa que é enriquecida com carboidrato e que se torna mais propensa à hidrólise por enzimas celulóticas ou hemicelulóticas para a produção de açúcares monoméricos e oligoméricos, ou seja, biomassa previamente tratada conforme descrito no presente.

“Enriquecido com carboidratos”, da forma utilizada no presente, indica a biomassa produzida por meio dos tratamentos de processo descritos no presente. Em uma realização, a biomassa enriquecida com carboidrato facilmente sacarificável produzida por meio dos processos descritos no presente possui concentração de carboidratos maior ou igual a cerca de 85% da biomassa

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13/68 seca em peso, mediante remoção de 75% ou mais do teor de lignina da biomassa inicial com base em peso seco.

“Aquecimento da suspensão de biomassa” indica a submissão da biomassa suspensa em solvente até uma temperatura maior que a temperatura ambiente. As temperaturas relevantes para os tratamentos prévios do presente são de cerca de 100 a cerca de 220 °C, cerca de 140 a cerca de 180 °C ou qualquer temperatura dentro ou dessas faixas ou perto delas.

“Filtragem de líquido livre sob pressão” indica a remoção de líquido não ligado por filtragem, com alguma diferença de pressão sobre faces opostas do filtro.

“Alcalino” ou “sob condições alcalinas” indica pH de mais de 7,0. Na presente invenção, “sob condições alcalinas” também indica um pH da suspensão biomassa-solvente maior ou igual aos pKas dos nucleófilos presentes, de tal forma que estes sejam substancialmente desprotonados e mais altamente reativos que nos seus estados protonados. Esses nucleófilos incluiríam alquilaminas e amônia, tióis, polissulfetos e hidrossulfeto (quando presente).

“Alcano divalente” indica um alcano linear, ramificado ou cíclico com duas valências abertas.

“Alquilamina” indica um alcano que contém um grupo -NH2 no lugar de um, dois ou três átomos de H; tais como monometilamina, dimetilamina, trimetilamina, etilamina, isopropilamina, etil-hexilamina, ciclo-hexilamina e conforme definido adicionalmente abaixo.

“Amostra seca em ar” indica uma amostra previamente tratada que se mantém em secagem no ar à pressão e temperatura ambiente até o ponto em que o seu teor de umidade encontra-se em equilíbrio com o do ar ambiente, tipicamente > 85% de matéria seca.

“Biomassa substancialmente livre de lignina” indica uma amostra

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14/68 previamente tratada na qual cerca de > 75% da lignina são removidos.

“Biomassa seca” indica biomassa com teor de matéria seca > 85%.

Métodos de secagem da biomassa incluem exposição à temperatura ambiente a vácuo ou fluxo de ar à pressão atmosférica e/ou aquecimento em forno ou forno a vácuo.

“Solvente com múltiplos componentes” indica um solvente que contém solvente orgânico, água e reagentes capazes de ataque químico sobre a lignina.

“Recipiente de pressão” é um recipiente vedado que pode ser ou não equipado com um mecanismo de agitação de uma suspensão biomassasolvente, na qual se desenvolve uma pressão positiva mediante aquecimento da biomassa lignocelulósica.

“Nucleófilo” é um reagente químico capaz de formar uma ligação covalente com o seu parceiro de reação por meio de contribuição dos dois elétrons de ligação.

“Hidrolisado” designa o líquido em contato com a biomassa lignocelulósica que contém os produtos de reações hidrolíticas que agem sobre a biomassa (seja ela enzimática ou não), neste caso açúcares monoméricos e oligoméricos.

“Organossolvente” indica uma mistura de solvente orgânico e água que se encontra tipicamente em contato com biomassa e na qual a lignina ou seus fragmentos são solúveis.

“Conjunto de enzimas” ou “conjunto de enzimas de sacarificação” é uma coleção de enzimas, normalmente secretadas por um micro-organismo, que, no presente caso, conterá tipicamente uma ou mais celulases, xilanases, glicosidases, ligninases e esterases.

“Açúcares monoméricos” ou “açúcares simples” consistem de uma única unidade de pentose ou hexose, tal como glicose.

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15/68 “Delignificação” é o ato de remoção de lignina de biomassa lignocelulósica. No contexto do presente pedido, delignificação indica fragmentação e extração de lignina da biomassa lignocelulósica utilizando um solvente orgânico sob condições alcalinas e temperaturas elevadas na presença de alquilaminas e, opcionalmente, diversos nucleófilos.

“Fragmentação” é um processo no qual a biomassa lignocelulósica é tratada com solvente orgânico sob condições alcalinas para decompor a lignina em subunidades menores.

“Extração seletiva” é um processo por meio do qual lignina fragmentada é dissolvida por tratamento com um solvente orgânico sob condições alcalinas, deixando para trás o polissacarídeo.

“Fragmentação simultânea e extração seletiva”, da forma utilizada no presente, designa uma reação de fragmentação realizada em solvente orgânico, de tal forma que os fragmentos de lignina entrem em solução assim que forem liberados da biomassa a granel.

[022] São fornecidos métodos de tratamento prévio de biomassa lignocelulósica para a fácil produção de biomassa sacarificável. Estes métodos fornecem processos econômicos para tornar os componentes da biomassa lignocelulósica mais acessíveis ou mais propensos a sacarificação enzimática. O tratamento prévio pode ser químico, físico ou biológico, ou qualquer combinação dos acima. No presente relatório descritivo, o tratamento prévio é realizado na presença de nucleófilos, especificamente de uma ou mais alquilaminas sob condições alcalinas. Podem também estar presentes nucleófilos adicionais, tais como NH3, tiol, reagentes de sulfeto ou combinações dos mesmos. A presença de um solvente orgânico e condições alcalinas assistem na fragmentação de lignina e na remoção e recuperação de carboidratos.

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16/68 [023] Além disso, os métodos descritos no presente relatório descritivo minimizam a perda de carboidratos durante o processo de tratamento prévio e maximizam o rendimento de açúcares (monoméricos e oligoméricos) solubilizados na sacarificação.

[024] Conforme discutido acima, os métodos descritos no presente incluem o tratamento prévio de material lignocelulósico com uma solução de solvente que compreende os componentes descritos abaixo, para produzir uma biomassa enriquecida com carboidrato facilmente sacarificável.

Solventes [025] Os métodos descritos no presente incluem o uso de um solvente orgânico para o tratamento prévio de biomassa e, especificamente, para fragmentação e extração de lignina. Os solventes úteis nos métodos do presente são frequentemente denominados na técnica organossolventes (por exemplo, E. Muurinen (2000), Organosolv Pulping, A Review and Distillation Study Related to Peroxyacid Pulping Thesis, Universidade de Oulu, pág. 314; S. Aziz, K. Sarkanen, Tappi J, 72/73: 169-175, 1989; A. K. Varsheny e D. Patel, J. Sci. Ind. Res., 47: 315319, 1988; A. A. Shatalov e H. Pereira, BioResources 1: 45-61, 2006; T. N. Kleinert, Tappi J., 57: 99-102, 1979; foi descrita a prática de tecnologia de organossolventes para biocombustíveis, derivada de Kleinert, que avançou para a escala piloto utilizando EtOH/H2O (WO 20071051269) e X. Pan, N. Gilkes, J. Kadla, K. Pye, S. Saka, D. Gregg, K. Ehara, D. Xie, D. Lam e J. Saddler, Biotechnol. Bioeng., 94: 851861, 2006. Embora ainda em escala de laboratório, o uso de acetona e H2O é descrito na Patente US 4.470.851. Detalhes adicionais sobre tecnologias de tratamento prévio relativas ao uso de solventes e outros tratamentos prévios podem ser encontrados, por exemplo, em Wyman et al (Bioresource Tech. 96: 1959, 2005); Wyman et al (Bioresource Tech. 96: 2026, 2005); Hsu (Pretreatment of Biomass em Handbook on Bioethanol: Production and Utilization, Wyman, Taylor e Francis Eds., págs. 179-212, 1996); e Mosier et al (Bioresource Tech., 96: 673, 2005). Os solventes são utilizados

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17/68 no presente para o tratamento prévio de biomassa para a remoção de lignina. A delignificação é tipicamente conduzida a temperaturas de 165 a 225 °C, em razões entre líquido e biomassa de 4:1 a 20:1, em composições líquidas com 50% de solvente orgânico (volume/volume (v/v)) e por tempos de reação de 0,5 a 12 horas. Diversos álcoois mono e póli-hidróxi foram testados como solventes. Foram utilizados etanol, butanol e fenol nessas reações (Park, J. K. e Phillips, J. A., Chem. Eng. Comm., 65: 187-205, 1988).

[026] O tratamento prévio com organossolvente ou solução solvente orgânica nos métodos do presente pode compreender uma mistura de água e um solvente orgânico sob parâmetros de condição selecionados que incluem temperatura, tempo, pressão, razão entre solvente e água e razão entre sólidos e líquido. O solvente pode compreender, mas sem limitações, álcoois e solventes apróticos (solventes que não contêm um átomo de hidrogênio ligado a um oxigênio como em um grupo hidroxila ou um nitrogênio como em um grupo amina ou um enxofre como em um grupo tiol, tal como cetonas). Os álcoois podem incluir metanol, etanol, propanol, butanol, pentanol, hexanol e seus isômeros, bem como dióis com a mesma quantidade de átomos de carbono, tais como 1,2-etanodiol, 1,2-propanodiol, 1,3-propanodiol e 1,3-hexanodiol.

[027] A concentração do solvente em solução (ou seja, água) de acordo com a presente invenção é de cerca de 2% a cerca de 90% (v/v), cerca de 10% a cerca de 85%, cerca de 20% a cerca de 80%, cerca de 30% a cerca de 80% ou, de maior preferência, cerca de 40% a cerca de 70% (v/v). Especificamente, para os propósitos de uma realização dos métodos do presente, misturas de EtOH em H2O com concentrações de cerca de 0% a 80% (v/v) de etanol foram examinadas e soluções contendo 40 a 70% (v/v) de EtOH foram consideradas as mais eficazes.

Alquilaminas [028] As alquilaminas são utilizadas para tratamento prévio de biomassa de acordo com os métodos do presente como componentes da

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18/68 solução de solventes. Alquilaminas são materiais de baixo custo e, quando utilizados no tratamento prévio de biomassa, contribuem com o fornecimento de um processo econômico geral. Além disso, alquilaminas podem ser recicladas durante o tratamento prévio, de forma a aumentar a eficiência e a economia dos métodos do presente.

[029] As alquilaminas apropriadas para a presente invenção compreendem: metilamina (MA), dimetilamina (DMA), trimetilamina (TMA), etilamina, propilamina e butilamina. As alquilaminas mais apropriadas para a presente invenção incluem, mas sem limitações, MA e DMA. A concentração das alquilaminas de acordo com o método do presente pode ser de cerca de 1% a cerca de 20% em peso de biomassa seca.

[030] As alquilaminas empregadas no presente possuem uma combinação de liberação de elétrons, fatores de ligação de H e estéricos que influenciam na estabilidade dos cátions de amônio substituídos em solventes polares próticos, que afetam a natureza básica de aminas (pKa) e afetam a sua atividade como nucleófilos.

[031] Segundo os métodos do presente, descobriu-se inesperadamente que alquilaminas, especialmente MA e DMA, são altamente ativos em uma faixa de concentrações de 10 a 14% com relação ao peso seco de biomassa. Nessa faixa de concentrações, existe alquilamina suficiente para garantir que o pH da solução de solventes permaneça alto e que a concentração de alquilamina seja suficiente para garantir a fragmentação de lignina contínua à medida que ocorre o tratamento prévio.

[032] Durante o tratamento prévio de biomassa descrito no presente, as alquilaminas promovem a fragmentação da lignina, cujo mecanismo poderá incluir ataque nucleofílico sobre as ligações de aril éter de lignina, ataque nucleofílico na posição α dos metídeos de quinona, formados sob condições alcalinas, que promovem a ruptura da ligação β-aril éter, ou redução do metídeo

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19/68 de quinona com eliminação do β-aril éter. Esta fragmentação da lignina em componentes com peso molecular inferior e a dissolução desses fragmentos no solvente organossolvente aumenta a exposição das cadeias de polissacarídeos a enzimas celulóticas e hemicelulóticas (tais como celulases e hemicelulases) para liberação hidrolítica de açúcares oligoméricos e monoméricos.

[033] Alquilaminas são bases fortes devido à doação de elétrons ao nitrogênio amina pelos carbonos de cadeia alquila e consistem de aminas primárias (R-NH2), aminas secundárias (R-N-R') e aminas terciárias em que R é uma cadeia alquila. Especificamente, R poderá ser selecionado a partir de um grupo que consiste em um alcano, alceno ou alcino com um a seis carbonos monovalente, divalente ou trivalente, linear, cíclico ou ramificado. Exemplos de alquilaminas incluem mono, di e trimetilamina, mono, di e trietilamina, mono, di e tripropilamina, mono, di e tributilamina. Alquilaminas incluem mono, di e triaminas, aminas de álcool (HO-R-NH2), diolaminas ((HO)2-R-NH2), diaminas de álcool (HO-R-(NH2)2), tiolaminas (HS-R-NH2), ditiolaminas ((HS)2-R-NH2), tioldiaminas (HS-R-(NH2)2) e tiolaminas de álcool (H2N-R(OH)(SH) em que R é conforme definido.

[034] Alquilaminas também são nucleófilos fortes com pKas de cerca de 9 a 11. Os pKas de metilamina e dimetilamina (DMA), por exemplo, são de 10,62 e 10,64, respectivamente. Eles foram selecionados, portanto, para estudar os seus efeitos sobre a biomassa lignocelulósica. Surpreendentemente, o uso de alquilaminas nos métodos do presente resultou em fragmentação e extração da lignina substancialmente aprimoradas.

[035] Além disso, a recuperação de carboidratos e, por fim, de açúcares foi aprimorada com o uso das alquilaminas que podem funcionar para proteger as extremidades redutoras das cadeias de polissacarídeos por meio da formação de uma imina (base Schiff), de forma a reduzir as perdas de açúcar a

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20/68 “descascamento” sob pH alcalino e subsequente formação de furfural e hidroximetil furfural.

[036] Além disso, observou-se aumento da recuperação de polissacarídeos com o aumento da concentração de etanol (solvente) na solução de solvente, o que provavelmente reflete redução da hidrólise de glucano e xilano durante o tratamento prévio, acompanhado por redução da solubilidade de oligômeros de xilose no filtrado pré-tratamento. O aumento da fragmentação e extração de lignina com o aumento da concentração de etanol na solução de tratamento prévio que compreende uma ou mais alquilaminas reflete provavelmente um aumento da forma desprotonada da alquilamina e o aumento da solubilidade dos fragmentos de lignina no solvente cada vez menos polar nos métodos do presente.

Componentes Adicionais da Solução de Solvente [037] Segundo o método do presente, a solução de solvente que compreende uma ou mais alquilaminas pode compreender opcionalmente componentes adicionais. Os componentes adicionais podem incluir outros nucleófilos, tais como pelo menos uma base (inorgânica) adicional, tal como hidróxido de sódio, amônia, carbonato de sódio, hidróxido de potássio, carbonato de potássio, hidróxido de cálcio e carbonato de cálcio.

[038] A uma ou mais bases adicionais podem ser agregadas em uma quantidade que é combinada com alquilamina para formar uma quantidade de base total que é de menos de cerca de 20% em peso com relação ao peso seco de biomassa. Preferencialmente, a base adicional mais alquilamina total encontra-se em uma quantidade de menos de cerca de 16% ou cerca de 0%, 2%, 4%, 6%, 8%, 10%, 12%, 14% ou 16% com relação ao peso seco de biomassa. A uma ou mais bases adicionais podem ser utilizadas em diversas concentrações de pelo menos 0,5% a cerca de 16%. São mais apropriadas as

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21/68 concentrações de 1% a 10%. São mais apropriadas as concentrações de 2% a 8%.

[039] Em uma realização, NaOH pode ser empregado como componente adicional da solução de solvente na presença de alquilaminas, o que resulta no aumento da fragmentação e extração de lignina e resulta em um aumento da acessibilidade da biomassa enriquecida com carboidrato a sacarificação enzimática. Pode-se utilizar NaOH especificamente em uma solução de solvente EtOH em H2O. O uso de NaOH pode incluir a adição de um catalisador, tal como antraquinona, à solução de solvente para fragmentação de lignina adicional.

[040] Em uma outra realização, pode-se empregar amônia como componente adicional da solução de solvente na presença de alquilaminas, o que resulta em aumento da fragmentação e extração de lignina e resulta em aumento da acessibilidade da biomassa enriquecida com carboidrato a sacarificação enzimática. Uma realização específica adicional é o uso de amônia e metilamina na solução de solvente. Um aspecto inclui o uso de enxofre elementar e amônia em soluções de solvente que compreendem metilamina como a alquilamina da solução de solvente. Essa solução de solvente pode compreender, por exemplo, de 20 a 80% v/v de EtOH em H2O com 1% de enxofre elementar, 2% a 16% de NH3 (p/p de biomassa) e metilamina.

[041] Foram observados altos rendimentos de sacarificação de glicose e xilose a partir de biomassa lignocelulósica após o tratamento prévio em soluções de solvente que compreendem EtOH a 70% em H2O (v/v), 1% de enxofre elementar e 14% de metilamina (ambos p/p de biomassa). Tratamentos prévios com aumento da substituição de metilamina por amônia em EtOH a 70% em H2O, entretanto, na presença de 1% de enxofre elementar (p/p de biomassa), resultaram em redução da quantidade de açúcar monomérico liberada mediante sacarificação enzimática subsequente (Exemplo 11).

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22/68 [042] Em uma outra realização, adiciona-se tioglicolato à solução de solventes na presença de alquilaminas, o que resulta em aumento da extração e fragmentação de lignina e, consequentemente, aumento da acessibilidade da biomassa facilmente sacarificável a sacarificação enzimática. Na presente invenção, podem ser utilizadas concentrações de tioglicolato de 0,5 a 15%. Mais especificamente, são mais úteis concentrações de 1 a 3%. Ainda mais especificamente, seriam mais úteis concentrações de cerca de 2% para a presente invenção.

[043] Em uma outra realização, adiciona-se sulfeto de amônia à solução de solvente na presença de alquilaminas, o que resulta em aumento da fragmentação e extração de lignina e resulta em aumento da capacidade de acesso da biomassa enriquecida com carboidrato a sacarificação enzimática. Sulfeto é um bom nucleófilo e redutor. Além disso, o sulfeto pode ser potencialmente gerado na solução solvente orgânica alcalina de tratamento prévio por meio de pulverização com H2S ou de desproporcionamento de enxofre elementar. Na presente invenção, poderão ser utilizadas concentrações de sulfeto de amônio de 0,5% a 15%. Mais especificamente, são mais úteis concentrações de 1% a 6%. Ainda mais especificamente, seriam mais úteis as concentrações de 2% a 4% para a presente invenção.

[044] Em uma outra realização, conforme mencionado acima, adiciona-se enxofre elementar à solução de solvente na presença de alquilaminas, o que resulta na solubilização e desproporcionamento do enxofre para produzir polissulfeto, sulfeto e hidrossulfeto. Como no caso de sulfeto de amônio, esta adição é benéfica para o tratamento prévio, aumentando a extração e fragmentação de lignina e resultando em aumento da acessibilidade da biomassa facilmente sacarificável a sacarificação enzimática. Na presente invenção, poderão ser utilizadas concentrações de enxofre elementar de 0,05% a 5% (p/p de biomassa). Mais especificamente, são mais úteis concentrações de

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0,5 a 2% (p/p de biomassa). Ainda mais especificamente, concentrações de cerca de 1% (p/p de biomassa) seriam as mais úteis para a presente invenção.

Biomassa lignocelulósica [045] A biomassa lignocelulósica previamente tratada do presente inclui, mas sem limitações, safras bioenergéticas, resíduos agrícolas, resíduo sólido municipal, resíduo sólido industrial, lama de fabricação de papel, resíduos de jardim, madeira e resíduos florestais. Exemplos de biomassa incluem, mas sem limitações, espigas de milho, resíduos de safra tais como cascas de milho, forragem de milho, gramas, trigo, palha de trigo, cevada, palha de cevada, feno, palha de arroz, switchgrass, resíduos de papel, bagaço de cana de açúcar, palha de cana de açúcar, álamo amarelo, sorgo, soja, componentes obtidos por meio da moagem de grãos, árvores, ramos, raízes, folhas, lascas de madeira, serragem, arbustos e moitas, legumes, frutas, flores e esterco animal.

[046] Em uma realização, a biomassa lignocelulósica inclui resíduos agrícolas tais como forragem de milho, palha de trigo, palha de cevada, palha de aveia, palha de arroz, palha de canola e forragem de soja; gramas, tais como switchgrass, Miscanthus, grama de corda e capim amarelo; resíduos de processo de fibras tais como fibra de milho, polpa de beterraba, rejeitos e finos de moagem de polpa e bagaço de cana de açúcar; palha de cana de açúcar e sorgo; resíduos florestais, tais como álamo amarelo, madeira de álamo, outras madeiras duras, madeira mole e serragem; e produtos de resíduos de papel pósconsumo; bem como outras safras com material lignocelulósico suficientemente abundante.

[047] Em uma outra realização, a biomassa que é útil para a presente invenção possui teor de carboidratos relativamente alto, é relativamente densa e/ou de coleta, transporte, armazenagem e/ou manipulação relativamente fáceis.

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24/68 [048] Em uma outra realização da presente invenção, biomassa que é útil inclui espigas de milho, forragem de milho, bagaço de cana de açúcar, palha de cana de açúcar, álamo amarelo e switchgrass.

[049] A biomassa lignocelulósica pode ser derivada de uma única fonte ou pode compreender uma mistura derivada de mais de uma fonte; a biomassa poderá compreender, por exemplo, uma mistura de espigas de milho e palha de milho, ou uma mistura de hastes ou caules e folhas.

[050] No método do presente, o peso seco de biomassa encontrase em uma concentração inicial de pelo menos cerca de 9% até cerca de 80% do peso da suspensão biomassa-solvente durante o tratamento prévio. Mais adequadamente, o peso seco de biomassa encontra-se em concentração de cerca de 15% a cerca de 70%, 15% a cerca de 60% ou cerca de 15% a cerca de 50% do peso da suspensão biomassa-solvente. O percentual de biomassa na suspensão biomassa-solvente é mantido alto para reduzir o volume total de material de tratamento prévio, reduzir a quantidade de solvente e de reagentes necessários e tornar o processo mais econômico.

[051] A biomassa pode ser utilizada diretamente conforme obtido da fonte ou pode ser submetida a algum processamento prévio; pode-se, por exemplo, aplicar energia à biomassa para reduzir o tamanho, aumentar a extensão exposta e/ou aumentar a capacidade de acesso de lignina e de celulose, hemicelulose e/ou oligossacarídeos presentes na biomassa a tratamento prévio com organossolvente e a enzimas de sacarificação utilizadas, respectivamente, nas segunda e terceira etapas do método. Meios de energia úteis para reduzir o tamanho, aumentar a extensão exposta e/ou aumentar a acessibilidade da lignina e da celulose, hemicelulose e/ou oligossacarídeos presentes na biomassa ao tratamento prévio com organossolvente alcalino e enzimas de sacarificação incluem, mas sem limitações, moagem, fragmentação, trituração, corte em tiras, rasgo, refino em disco, ultrassom e micro-ondas. Essa

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25/68 aplicação de energia pode ocorrer antes ou durante o tratamento prévio, antes ou durante a sacarificação ou qualquer de suas combinações.

[052] A secagem antes do tratamento prévio pode também ocorrer por meios convencionais, tais como exposição à temperatura ambiente a vácuo ou fluxo de ar à pressão atmosférica e/ou aquecimento em um forno à pressão atmosférica ou um forno a vácuo.

Condições de Tratamento Prévio [053] O tratamento prévio de biomassa com a solução de solvente que compreende uma ou mais alquilaminas é conduzido em qualquer recipiente apropriado. Tipicamente, o recipiente é aquele que pode suportar pressão, possui um mecanismo de aquecimento e possui um mecanismo de mistura do conteúdo. Os recipientes disponíveis comercialmente incluem, por exemplo, o reator Zipperclave® (Autoclave Engineers, Erie PA), o reator Jaygo (Jaygo Manufacturing, Inc., Mahwah NJ) e um reator de disparador de vapor (descrito nos Métodos Gerais, Autoclave Engineers, Erie PA). Podem ser utilizados reatores em escala muito maior com capacidades similares. Alternativamente, a biomassa e a solução de organossolvente podem ser combinadas em um recipiente e transferidas em seguida para um outro reator. Além disso, a biomassa pode ser previamente tratada em um recipiente e processada adicionalmente em seguida em um outro reator, tal como um reator disparador de vapor (descrito em Métodos Gerais; Autoclave Engineers, Erie PA).

[054] A reação de tratamento prévio pode ser realizada em qualquer recipiente apropriado, tal como um reator de bateladas ou um reator contínuo. Os técnicos no assunto reconhecerão que, a temperaturas mais altas (acima de 100 °C), é necessário um recipiente de pressão. O recipiente apropriado pode ser equipado com um meio, tal como impulsores, para agitar a mistura de biomassa e organossolvente. O projeto do reator é discutido em Lin,

K.-H. e Van Ness, H. C. (em Perry, R. H. e Chilton, C. H. (Eds.), Chemical

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Engineer’s Handbook, quinta edição (1973), Capítulo 4, McGraw-HilI NY). A reação de tratamento prévio pode ser conduzida na forma de processo em bateladas ou contínuo.

[055] Antes do contato da biomassa com solvente, pode-se aplicar vácuo ao recipiente que contém a biomassa. Evacuando-se ar dos poros da biomassa, pode-se atingir melhor penetração do solvente na biomassa. O período de tempo para aplicação de vácuo e a quantidade de pressão negativa que é aplicada à biomassa dependerão do tipo de biomassa e podem ser determinados empiricamente de forma a atingir tratamento prévio ideal da biomassa (conforme medido por meio da produção de açúcares fermentáveis após a sacarificação).

[056] O aquecimento da biomassa com a solvente é conduzido à temperatura de cerca de 100 °C a cerca de 220 °C, cerca de 150 °C a 200 °C ou cerca de 165 °C a cerca de 195 °C. A solução aquecida pode ser resfriada rapidamente em seguida à temperatura ambiente. Em ainda outra realização, o aquecimento da biomassa é conduzido à temperatura de cerca de 180 °C. O aquecimento da suspensão biomassa-solvente pode ocorrer por cerca de 5 minutos a cerca de 5 horas, cerca de trinta minutos a cerca de três horas ou, de maior preferência, cerca de uma a duas horas.

[057] O tratamento prévio de biomassa com a solução de solvente e uma ou mais alquilaminas ocorre sob condições alcalinas sob pH que é maior ou igual ao pKa dos nucleófilos presentes. A desprotonação aumenta tipicamente a reatividade do nucleófilo. Os nucleófilos presentes, além da alquilamina, podem incluir amônia, tióis, polissulfetos ou hidrossulfeto.

[058] Para os métodos de tratamento prévio descritos no presente, a temperatura, pH, tempo de tratamento prévio e concentração de reagentes tais como o solvente orgânico e soluções de alquilamina e a concentração de um ou mais reagentes adicionais, concentração de biomassa, tipo de biomassa e

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27/68 tamanho de partículas de biomassa são relacionados; desta forma, essas variáveis podem ser ajustadas conforme o necessário para cada tipo de biomassa, para otimizar os processos de tratamento prévio descritos no presente.

[059] Após o tratamento prévio à temperatura elevada, a biomassa é filtrada sob pressão. A filtragem pode ser precedida ou não pelo resfriamento. Após a filtragem, a biomassa pode ser lavada uma ou mais vezes com solvente orgânico hidratado à temperatura ambiente ou elevada. Ela pode ser lavada em seguida com água ou seca para remover o solvente orgânico e sacarificada em seguida. Métodos de secagem da biomassa incluem exposição à temperatura ambiente a vácuo ou fluxo de ar à pressão atmosférica e/ou aquecimento em forno à pressão atmosférica ou em um forno a vácuo conforme descrito mais completamente no presente.

[060] Para determinar o desempenho do tratamento prévio, ou seja, a produção de biomassa enriquecida com carboidrato facilmente sacarificável e sacarificação subsequente, separadamente ou em conjunto, o rendimento teórico de açúcares que podem ser derivados da biomassa inicial pode ser determinado e comparado com rendimentos medidos. O desempenho do tratamento prévio pode ser adicionalmente determinado relacionando-se como as cargas de enzimas afetam os rendimentos de produto alvo no desempenho geral do sistema.

Processamento Adicional

Sacarificação [061] Após o tratamento prévio, a biomassa enriquecida com carboidrato facilmente sacarificável compreende uma mistura de solvente orgânico tal como tioglicolato ou amônia; lignina fragmentada e extraída; e polissacarídeos. Antes do processamento adicional, a uma ou mais alquilaminas e/ou componentes de solvente adicionais tais como tioglicolato ou amônia e

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28/68 fragmentos de lignina podem ser removidos da biomassa previamente tratada por filtragem e lavagem da amostra com EtOH em H2O (0% a 100% EtOH v/v) ou água. A biomassa pode ser lavada com água para remover EtOH ou seca, o que resulta em biomassa enriquecida com carboidrato facilmente sacarificável e a concentração de glucano, xilano e o teor de lignina insolúvel em ácido da dita biomassa podem ser determinados utilizando meios analíticos bem conhecidos na técnica. É um benefício real da presente invenção que a biomassa previamente tratada pode ser lavada com água ou seca para sacarificação. A biomassa facilmente sacarificável pode ser adicionalmente hidrolisada em seguida na presença de um conjunto de enzimas de sacarificação para liberar oligossacarídeos e/ou monossacarídeos em um hidrolisado.

[062] Tensoativos tais como Tween 20 ou Tween 80 ou polioxietilenos tais como PEG 2000, 4000 ou 8000 podem ser adicionados para aprimorar o processo de sacarificação (Patente US 7.354.743 B2, incorporada ao presente como referência). A adição de tensoativo (tal como Tween 20) à sacarificação enzimática frequentemente aumenta a velocidade e o rendimento da liberação de açúcar monomérico. É provável que o tensoativo revista qualquer lignina residual, reduzindo a ligação não produtiva da enzima à lignina. Uma abordagem alternativa é o aumento da extração de lignina no tratamento prévio ou a modificação química da lignina de tal forma que menos enzima seja perdida para adsorção de lignina.

[063] Enzimas de sacarificação e métodos de tratamento de biomassa são analisados em Lynd, L. R. et al (Microbiol. Mol. Biol. Rev., 66: 506577, 2002). O conjunto de enzimas de sacarificação pode compreender uma ou mais glicosidases; as glicosidases podem ser selecionadas a partir do grupo que consiste em glicosidases de hidrólise de celulose, glicosidases de hidrólise de hemicelulose e glicosidases de hidrólise de amido. Outras enzimas do conjunto

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29/68 de enzimas de sacarificação podem incluir peptidases, lipases, ligninases e esterases.

[064] O conjunto de enzimas de sacarificação compreende uma ou mais enzimas selecionadas principal, mas não exclusivamente, a partir do grupo “glicosidases” que hidrolisam as ligações éter de di, oligo e polissacarídeos e são encontradas na classificação de enzimas EC 3.2.1.x (Enzyme Nomenclature 1992, Academic Press, San Diego CA com Suplemento 1 (1993), Suplemento 2 (1994), Suplemento 3 (1995), Suplemento 4 (1997) e Suplemento 5 (em Eur. J. Biochem., 223: 1-5, 1994; Eur. J. Biochem., 232: 1-6, 1995; Eur. J. Biochem., 237: 1-5, 1996; Eur. J. Biochem., 250: 1-6, 1997; e Eur. J. Biochem., 264: 610650, 1999, respectivamente)) do grupo geral “hidrolases” (EC 3). As glicosidases úteis no presente método podem ser categorizadas pelo componente de biomassa que hidrolisam. Glicosidases úteis para o presente método incluem glicosidases de hidrólise de celulose (tais como celulases, endoglucanases, exoglucanases, celobio-hidrolases, β-glucosidases), glicosidases de hidrólise de hemicelulose (tais como xilanases, endoxilanases, exoxilanases, β-xilosidases, arabinoxilanases, manases, galactases, pectinases, glucuronidases) e glicosidases de hidrólise de amido (tais como amilases, α-amilases, β-amilases, glucoamilases, α-glucosidases, isoamilases). Além disso, pode ser útil adicionar outras atividades ao conjunto de enzimas de sacarificação tais como peptidases (EC 3.4.x.y), lipases (EC 3.1.1.x e 3.1.4.x), ligninases (EC 1.11.1.x) e feruloil esterases (EC 3.1.1.73) para ajudar a liberar polissacarídeos de outros componentes da biomassa. Sabe-se bem na técnica que os micro-organismos que produzem enzimas de hidrólise de polissacarídeos frequentemente exibem uma atividade, tal como degradação de celulose, que é catalisada por diversas enzimas ou um grupo de enzimas que possuem diferentes especificidades de substratos. Desta forma, uma “celulase” de um micro-organismo pode compreender um grupo de enzimas, todas as quais podem contribuir com a

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30/68 atividade de degradação de celulose. Preparações de enzimas comerciais ou não comerciais, tais como celulase, podem compreender numerosas enzimas, dependendo do esquema de purificação utilizado para obter a enzima. Desta forma, o conjunto de enzimas de sacarificação de acordo com o presente método pode compreender atividade enzimática, tal como “celulase”, mas reconhece-se que essa atividade pode ser catalisada por mais de uma enzima.

[065] Enzimas de sacarificação podem ser obtidas comercialmente, em forma isolada, tais como celulase Spezyme® CP (Genencor International, Rochester NY) e xilanase Multifect® (Genencor). Além disso, enzimas de sacarificação podem ser expressas em micro-organismos hospedeiros na fábrica de biocombustíveis, incluindo o uso de micro-organismos recombinantes.

[066] Os técnicos no assunto saberiam como determinar a quantidade eficaz de enzimas para uso no conjunto e ajustar as condições para atividade enzimática ideal. Os técnicos no assunto também saberiam como otimizar as classes de atividades enzimáticas necessárias no conjunto para obter sacarificação ideal de um dado produto de tratamento prévio sob as condições selecionadas.

[067] Preferencialmente, a reação de sacarificação é realizada à temperatura e pH ideais ou próximos dos ideais para as enzimas de sacarificação. A temperatura ideal utilizada com o conjunto de enzimas de sacarificação no método do presente varia de cerca de 15 °C a cerca de 100 °C. Em uma outra realização, a temperatura ideal varia de cerca de 20 °C a cerca de 80 °C e, mais tipicamente, de 45 a 50 °C. O pH ideal pode variar de cerca de 2 a cerca de 11. Em uma outra realização, o pH ideal utilizado com o conjunto de enzimas de sacarificação no método do presente varia de cerca de 4 a cerca de 5,5.

[068] A sacarificação pode ser realizada por um período de cerca de vários minutos a cerca de 120 horas e, preferencialmente, cerca de vários minutos a cerca de 48 horas. O tempo de reação dependerá da concentração de enzimas e da

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31/68 atividade específica, bem como do substrato utilizado, sua concentração (ou seja, carga de sólidos) e das condições ambientais, tais como temperatura e pH. Os técnicos do presente podem determinar facilmente as condições ideais de temperatura, pH e tempo a serem utilizadas com um substrato específico e conjunto de enzima(s) de sacarificação.

[069] A sacarificação pode ser realizada em bateladas ou na forma de processo contínuo. A sacarificação pode também ser realizada em uma etapa ou em uma série de etapas. Enzimas diferentes necessárias para sacarificação, por exemplo, podem exibir diferentes pH ou temperatura ideais. Pode-se realizar tratamento primário com enzima(s) a uma temperatura e pH, seguido por tratamentos secundário ou terciário (ou mais) com enzima(s) diferente(s) a temperaturas e/ou pH diferentes. Além disso, tratamento com enzimas diferentes em etapas sequenciais podem estar no mesmo pH e/ou temperatura ou diferentes pHs e temperaturas, utilizando, por exemplo, hemicelulases estáveis e mais ativas a temperaturas e pHs mais altos seguidas por hemicelulases que são ativas a temperaturas e pHs mais baixos.

[070] O grau de solubilização de açúcares de biomassa após a sacarificação pode ser monitorado por meio de medição da liberação de monossacarídeos e oligossacarídeos. Métodos de medição de monossacarídeos e oligossacarídeos são bem conhecidos na técnica. A concentração de açúcares redutores pode ser determinada, por exemplo, utilizando o teste de ácido 1,3dinitrossalicílico (Miller, G. L., Anal. Chem., 31: 426-428, 1959). Alternativamente, os açúcares podem ser medidos por meio de HPLC utilizando uma coluna apropriada conforme descrito abaixo.

Fermentação em Produtos Alvo [071] A biomassa facilmente sacarificável produzida por meio dos métodos do presente pode ser hidrolisada por enzimas conforme descrito acima para produzir açúcares fermentáveis que podem ser fermentados em um produto

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32/68 alvo. “Fermentação” designa qualquer processo de fermentação ou qualquer processo que compreende uma etapa de fermentação. Os produtos alvo incluem, sem limitações, álcoois (tais como arabinitol, butanol, etanol, glicerol, metanol, 1,3-propanodiol, sorbitol e xilitol); ácidos orgânicos (tais como ácido acético, ácido acetônico, ácido adípico, ácido ascórbico, ácido cítrico, ácido 2,5diceto-D-glucônico, ácido fórmico, ácido fumárico, ácido glucárico, ácido glucônico, ácido glucurônico, ácido glutárico, ácido 3-hidroxipropiônico, ácido itacônico, ácido láctico, ácido málico, ácido malônico, ácido oxálico, ácido propiônico, ácido succínico e ácido xilônico); cetonas (tais como acetona); aminoácidos (tais como ácido aspártico, ácido glutâmico, glicina, lisina, serina e treonina); gases (tais como metano, hidrogênio (H2), dióxido de carbono (CO2) e monóxido de carbono (CO)).

[072] Processos de fermentação também incluem processos utilizados na indústria de álcool consumível (tal como cerveja e vinho), indústria de laticínios (tais como produtos lácteos fermentados), indústria do couro e indústria do fumo.

[073] Além do acima, os açúcares produzidos por meio da sacarificação da biomassa previamente tratada conforme descrito no presente podem ser utilizados para produzir, de forma geral, produtos orgânicos, substâncias, combustíveis, substâncias commodities e especializadas tais como xilose, acetona, acetato, glicina, lisina, ácidos orgânicos (tais como ácido láctico), 1,3-propanodiol, butanodiol, glicerol, 1,2-etanodiol, furfural, póli-hidroxialcanoatos, cis, ácido cismucônico e ração animal (Lynd, L. R., Wyman, C. E. e Gerngross, T. U., Biocom. Eng., Biotechnol. Prog., 15: 777-793, 1999; e Philippidis, G. P., Cellulose Bioconversion Technology, em Handbook on Bioethanol: Production and Utilization, Wyman, C. E., Ed., Taylor & Francis, Washington DC, 179-212, 1996; e Ryu, D. D. Y. e Mandels, M., Cellulases: Biosynthesis and Applications, Enz. Microb. Technol., 2: 91-102, 1980).

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33/68 [074] Podem também ser gerados coprodutos potenciais, tais como diversos produtos orgânicos de carboidrato fermentável. Resíduos ricos em lignina restantes após o tratamento prévio e a fermentação podem ser convertidos em substâncias derivadas de lignina, blocos de construção químicos ou utilizados para a produção de energia.

[075] Métodos convencionais de fermentação e/ou sacarificação são conhecidos na técnica, incluindo, mas sem limitações, sacarificação, fermentação, fermentação e hidrólise separadas (SHF), fermentação e sacarificação simultâneas (SSF), sacarificação e cofermentação simultâneas (SSCF), hidrólise e fermentação híbridas (HHF) e conversão microbiana direta (DMC).

[076] SHF utiliza etapas de processo separadas para hidrolisar enzimaticamente em primeiro lugar celulose em açúcares tais como glicose e xilose e, em seguida, fermentar os açúcares em etanol. Em SSF, a hidrólise enzimática de celulose e a fermentação de glicose em etanol são combinadas em uma etapa (Philippidis, G. P., acima). SSCF inclui a cofermentação de diversos açúcares (Sheehan, J. e Himmel, M., Bioethanol, Biotechnol. Prog. 15: 817-827, 1999). HHF inclui duas etapas separadas conduzidas no mesmo reator, mas a diferentes temperaturas, ou seja, sacarificação enzimática à alta temperatura seguida por SSF à temperatura mais baixa que a linhagem de fermentação pode tolerar. DMC combina todos os três processos (produção de celulase, hidrólise de celulose e fermentação) em uma etapa (Lynd, L. R., Weimer, P. J., van Zyl, W. H. e Pretorius, I. S., Microbiol. Mol. Biol. Rev., 66: 506-577, 2002).

[077] Estes processos podem ser utilizados para gerar produtos alvo a partir da biomassa facilmente sacarificável produzida por meio dos métodos de tratamento prévio descritos no presente.

Vantagens dos Métodos do Presente [078] Os métodos descritos na presente invenção para o tratamento prévio da biomassa lignocelulósica utilizando fragmentação e

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34/68 extração seletiva de lignina a temperaturas elevadas sob condições alcalinas em combinação com uma ou mais alquilaminas e diversos nucleófilos fornecem um processo eficaz para seu custo de obtenção de biomassa enriquecida com carboidrato para sacarificação enzimática. Essa biomassa produz em seguida rendimentos muito altos de açúcares fermentáveis (glicose, bem como xilose) para sua bioconversão em combustíveis e substâncias com valor agregado.

[079] Dentre as principais fraquezas de processos de organossolventes atuais descritos na literatura, encontram-se: as más recuperações de carboidrato, particularmente xilose, após o tratamento prévio, a necessidade de fluxos separados de hexose e pentose, a elaboração de produtos de decomposição de açúcar, o uso de grandes quantidades de solvente e alto custo de capital. Certos processos existentes incluem, por exemplo, o uso de condições de organossolventes ácidos e produzem hidrolisados de hemicelulose e celulose. A maior instabilidade da hemicelulose sob condições ácidas resulta na formação de produtos de decomposição de xilose monomérica (tais como furfural), reduzindo muito a recuperação de xilose (Pan et al., acima). Em uma versão desse processo (Arato, C., Pye, E. K. e Gjennestad, G., Appl. Biochem. Biotech. 121-124: 871-882, 2005), a hemicelulose é hidrolisada sob condições ácidas e a celulose, após a neutralização, é hidrolisada enzimaticamente. A necessidade de neutralização do ácido antes da sacarificação, a perda parcial de xilose e o processamento de fluxos separados de pentose e hexose agregam custos ao processo. Além disso, o uso de condições ácidas necessita do uso de ligas nos reatores e tubulação que aumentam substancialmente o custo de capital do equipamento.

[080] O presente relatório descritivo descreve o desenvolvimento de um processo altamente seletivo no qual a lignina é seletivamente fragmentada e extraída utilizando reagentes baratos e a hemicelulose e a celulose permanecem juntas na biomassa para sacarificação enzimática posterior. A

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35/68 quantidade de lignina extraída na solução solvente orgânica é >75% e as recuperações de xilano e glucano na biomassa residual são próximas da quantitativa. Surgem altas recuperações de polissacarídeo devido ao uso de condições alcalinas que reduzem a hidrólise de hemicelulose e decomposição de açúcar, o uso de amônia ou alquilaminas que evitam o descascamento de polissacarídeo sob condições alcalinas e o alto teor de etanol da solução solvente orgânica que limita a hidrólise de carboidrato e torna insolúveis os oligômeros de xilose. Além disso, as condições alcalinas utilizadas não necessitam do uso de ligas exóticas no equipamento, de forma a reduzir o custo de capital. A realização desse processo com pouco ou nenhum sal inorgânico entre os reagentes ou produtos (tais como NaOH, Na2CO3, CaSO4) resulta em pouco ou nenhum custo associado ao descarte de material de resíduo inorgânico no final. Os reagentes não reagidos (tais como EtOH, alquilamina e HS^-/S=) são recicláveis, no caso de EtOH e alquilamina, com baixos pontos de ebulição e baixos aquecimentos de vaporização com relação à água, de forma a reduzir as necessidades de energia e custo de operação. Muitos dos processos descritos na literatura utilizam grandes razões entre solvente e biomassa. No caso presente, o uso de condições alcalinas e a fragmentação substancial da lignina pelos nucleófilos adicionados indicam que os fluxos de solvente podem acumular altas concentrações de lignina, o que reduz a necessidade de grandes volumes de solvente e, ao mesmo tempo, reduz a perda de quantidades de traço de carboidrato solubilizado. Por fim, o carboidrato residual sacarifica-se bem utilizando enzimas, provavelmente devido ao alto nível de extração de fragmentos de lignina no tratamento prévio, à cisão efetiva de ligações de éster entre hemicelulose e lignina e alguma redução do grau de polimerização do polissacarídeo. O uso de solvente orgânico aumenta a umectação da biomassa e a capacidade de penetrar facilmente nos poros do substrato. A combinação das condições alcalinas utilizando uma base orgânica com alto pKa (tal como

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36/68 alquilamina) e a presença de nucleófilos fortes (tais como alquilaminas e sulfeto) permite que este processo produza facilmente biomassa sacarificável, mesmo para os estoques de alimentação com alto teor de lignina (tais como switchgrass e bagaço). A universalidade do tratamento prévio é demonstrada nos Exemplos 12 e 14, nos quais se demonstra que uma ampla série de materiais lignocelulósicos, representados no presente por espiga de milho, switchgrass, bagaço de cana de açúcar, palha de cana de açúcar e álamo amarelo, sacarificase bem após o tratamento prévio.

Exemplos Tratamento Prévio de Biomassa Para a Obtenção de Biomassa Enriquecida com Carboidratos Facilmente Sacarificável:

[081] O objetivo do trabalho experimental descrito abaixo foi o de desenvolver um processo de tratamento prévio econômico para lignocelulose que maximizasse a extração de lignina e retenção de açúcar e para produzir uma biomassa enriquecida com carboidrato facilmente sacarificável que, mediante sacarificação enzimática, geraria rendimentos máximos de açúcar monomérico. A abordagem adotada foi a extração e fragmentação seletiva da lignina em um solvente apropriado mediante retenção dos açúcares no resíduo sólido. Descobriu-se que a presença combinada de um solvente orgânico, alquilaminas e, opcionalmente, certos nucleófilos como NH3, tiol, polissulfeto e sulfeto fragmentou seletivamente e dissolveu os componentes de lignina da biomassa, deixando para trás biomassa enriquecida com carboidrato facilmente sacarificável.

[082] switchgrass, espiga de milho, palha de cana de açúcar, álamo amarelo e bagaço de cana de açúcar foram moídos em um moinho de faca Wiley através de uma peneira de 1 mm antes do tratamento prévio.

[083] As abreviações a seguir são utilizadas nos Exemplos:

“HPLC” é Cromatografia de Líquidos de Alto Desempenho, “C” é graus

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37/68 centígrados ou Celsius, “%” é percentual; “wt” é peso; “p/p” é peso por peso; “ml” é mililitro; “OD” é diâmetro externo; “ID” é diâmetro interno; “h” é hora(s); “rpm” é revolução por minuto; “EtOH” é etanol; “mg/g” é miligrama por grama; “g/100 ml” é grama por cem mililitros; “N” é normal; “g” é grama; “NaOH” é hidróxido de sódio, “p/v” é peso por volume; “v/v” é volume por volume; NH3 é amônia; “mm” é milímetro; “ml/min” é mililitro por minuto; “min” é minuto; “mM” é milimolar.

Materiais [084] Ácido sulfúrico, hidróxido de amônio, ácido acético, acetamida, extrato de levedura, ácido 2-morfolinoetanossulfônico (MES), fosfato de potássio, glicose, xilose, triptona, cloreto de sódio e ácido cítrico, monometila e dimetilamina foram obtidos por meio da Sigma-Aldrich (St. Louis MO). Spezyme CP e Multifect CX12L foram da Genecor (Genecor International, Palo Alto CA) e Novozyme 188 foi da Novozyme (Novozyme, 2880 Bagsvaerd, Dinamarca).

Exemplo 1

Concentração Efetiva de Etanol [085] O propósito do presente Exemplo foi o de examinar o efeito da concentração de solvente (tal como etanol) em água sobre a recuperação de carboidrato e sobre a solubilização e extração de lignina na ausência de controle de pH. Bagaço (0,2 g, 95,78% de matéria seca) foi suspenso em 1,56 ml de uma solução de EtOH e água que contém diversas concentrações (de 0 a 80%) de EtOH. As suspensões foram carregadas em tubulação de aço inoxidável tipo 316 (diâmetro interno de 6,3 mm, diâmetro externo de 9,5 mm, 101,6 mm de comprimento) tampada por encaixes Swagelock (Penn Fluid System Technologies, Huntingdon Valley PA). Estes foram colocados em um banho de areia fluidificado (Techne Modelo SBS-4, Techne Inc., Burlington NJ) e aquecidos a 180 °C por duas horas e rapidamente resfriados por meio de imersão em um banho de água à

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38/68 temperatura ambiente. As amostras foram removidas dos tubos e filtradas por meio de centrifugação a 14.000 rpm utilizando filtros Spin-X (Costar, Corning Inc., Corning NY) à temperatura ambiente em uma centrífuga de mesa (Spectrifuge 16M, Labnet International Inc., Edison NJ) para remover a lignina dissolvida. O retido de cada amostra foi lavado (4x) com 0,5 ml de EtOH/H2O utilizando a mesma concentração de EtOH utilizada no tratamento a 180 °C (0 a 80% EtOH em H2O). As amostras foram mantidas em seguida em secagem no ar à temperatura ambiente (até cerca de 92% de matéria seca) e os teores de glucano, xilano e lignina insolúvel em ácido dos resíduos foram determinados utilizando o procedimento do Laboratório Nacional de Energia Renovável (NREL) (Determination of Structural Carbohydrates and Lignin in Biomass - Versão 2006, Amie Sluiter et al., disponível no website do NREL).

Sacarificação Enzimática Subsequente [086] A amostra seca em ar preparada acima foi suspensa em 50 mM de tampão de citrato, pH 4,6, em carga de sólidos de cerca de 14%. As enzimas de sacarificação, tais como Spezyme CP, Multifect CX12L e Novozyme 188, foram adicionadas em concentrações de 6:3:6 mg/g de celulose, respectivamente. Também foram adicionados 1% (p/v) de Tween 20 e 0,01% (p/v) de NaN3, este último para evitar crescimento microbiano. Amostras (cerca de 0,4 ml) foram colocadas em ampolas com tampa de rosca contendo duas esferas de vidro de 5 mm e incubadas a 46 °C sobre um agitador giratório conduzido a 250 rpm. Parcelas foram removidas para análise após quatro horas e em intervalos de 24 horas a partir do início e diluídas em 41,25 vezes com 0,01 N de H2SO4. As amostras foram filtradas em seguida através de filtros Spin-X e os filtrados foram analisados por meio de HPLC (Agilent série 1100/1200, Agilent Technologies, Wilmington DE). Foi utilizada uma coluna BioRad HPX-87H Aminex (Bio-Rad Laboratories,

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Hercules CA 94547) para fracionar os açúcares liberados utilizando 0,01 N de H2SO4 como a fase móvel em velocidade de fluxo de 0,6 ml/min. A coluna foi mantida em 60 °C. Um detector de índice de refração diferencial foi utilizado para detectar os açúcares eluídos e mantido a 55 °C. Os tempos de retenção de glicose, xilose e arabinose foram de 9,05, 9,72 e 10,63 minutos, respectivamente. A Tabela 1A descreve os percentuais de recuperação de glucano e xilano e o percentual de alteração do teor de lignina insolúvel em ácido (AI) após tratamentos prévios em concentrações de EtOH de 0% a 80%.

Tabela 1A

Recuperação de Glucano e Xilano Após Tratamento Prévio de Acordo com o Exemplo 1

Tratamento prévio (% EtOH em água)	% recuperação de glucano em resíduo	% recuperação de xilano em resíduo	% alteração do teor de lignina Ai
0	83,0%	29,0%	+27,6%
20	88,7%	30,8%	+15,2%
40	86,0%	57,6%	-10%
60	91,9%	87,4%	-25,6%
80	88,6%	91,1%	-28,8%

[087] Os resultados exibidos na Tabela 1A indicam que a extração de lignina aumentou com o aumento do teor de EtOH, presumivelmente porque a solubilidade de lignina aumentou com o aumento da concentração de EtOH. A quantidade de lignina extraída permaneceu modesta, entretanto, mesmo sob altas concentrações de etanol.

[088] A hidrólise de hemicelulose e a solubilidade de oligômeros de xilose caem com o aumento de EtOH, aumentando a recuperação de xilano e oligômeros de xilose no resíduo. A quantidade de acetato liberada pelo tratamento prévio também cai com o aumento do teor de EtOH, de forma consistente com a redução da auto-hidrólise da biomassa em concentração de EtOH crescente.

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40/68 [089] A Tabela 1B exibe os rendimentos de glicose e xilose após 96 horas de sacarificação enzimática seguindo-se ao tratamento prévio sob diferentes concentrações de EtOH. A sacarificação de celulose aumentou quando a concentração de EtOH em tratamento prévio aumentou de 0 para 20%, mas caiu em seguida com concentrações de EtOH no tratamento prévio mais altas. Observou-se uma redução similar da hidrólise parcial de lignina e celulose (aumento do grau de polimerização de celulose que reduziu o rendimento de glicose mediante sacarificação subsequente Tabela 1B) em concentrações de mais de 20% de EtOH.

Tabela 1B

Rendimentos de Glicose Monomérica e Xilose Após Sacarificação

Enzimática por 96 Horas, Previamente tratada Conforme Descrito no Exemplo 1

% EtOH em água (v/v)	Sacarificação apenas de monômero de glicose (% rendimento teórico)	sacarificação apenas de monômero de xilose (% rendimento teórico)	Rendimento geral de monômero de glicose (% rendimento teórico)	Rendimento geral de monômero de xilose (% rendimento teórico)
0	38,43	34,98	31,86	10,16
20	44,48	45,52	39,46	14,01
40	29,62	38,55	25,45	22,23
60	16,81	24,64	15,45	21,52
80	6,8	7,22	6,02	7,01

[090] As recuperações de açúcar monomérico (Tabela 1B), particularmente de xilose, foram muito baixas nas concentrações de EtOH mais baixas. Sob baixa concentração de EtOH, as condições ácidas produzidas sob altas temperaturas por meio de hidrólise dos grupos acetila da hemicelulose hidrolisam a hemicelulose. A xilose solubilizada e parte da glicose são perdidas na filtragem e lavagens que se seguem ao tratamento prévio. Sob concentrações mais altas de EtOH, existe hidrólise ao menos parcial da celulose, hemicelulose e lignina, o que reduz o rendimento de

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41/68 sacarificação. O comportamento nas concentrações baixa e alta de etanol juntas produz baixos rendimentos gerais de xilose e glicose monomérica.

Exemplo 2

Efeito de Tratamento Prévio de Solução Solvente Orgânica Alcalina Sobre a Extração de Lignina [091] O propósito deste Exemplo foi o de examinar o efeito da elevação do pH sobre o tratamento prévio da solução solvente orgânica sob diferentes razões de EtOH e H2O sobre a retenção de carboidratos e extração de lignina e sobre açúcar monomérico durante a sacarificação enzimática subsequente. Considerando que a auto-hidrólise reduz o pH, hidrolisa xilano e promove a perda de xilose, o pH do tratamento prévio foi elevado por meio da adição de NaOH. O efeito de pH mais alto sobre a recuperação de xilose é demonstrado abaixo. Bagaço de cana de açúcar (0,25 g, 95,78% de matéria seca) foi suspenso em 1,75 ml de um solvente que contém EtOH (20 a 80% em água) e 8% de NaOH (peso/peso de biomassa) mais 1 mg de antraquinona (AQ, um catalisador para fragmentação de lignina). O pH inicial dessa solução foi de cerca de 13,7. Conforme descrito no Exemplo 1, as suspensões foram carregadas em tubulação de aço inoxidável tipo 316, tampadas, tratadas a 168 °C por 140 minutos e resfriadas em água à temperatura ambiente. As amostras foram removidas dos recipientes de pressão, filtradas, lavadas, secas em ar e analisadas, tudo conforme descrito acima no Exemplo 1. Os teores de glucano, xilano e arabinano e a alteração do teor de lignina após o tratamento prévio são exibidos na Tabela 2A.

[092] Conduziu-se sacarificação enzimática subsequente conforme descrito no Exemplo 1, exceto pelo fato de que a razão entre Spezyme, Multifect e Novozymes 188 foi de 12:6:1,2 mg/g de sólidos secos na presença de 1% de Tween 20 (p/v). A Tabela 2B exibe os rendimentos de açúcar

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42/68 monomérico após 96 horas de sacarificação enzimática de biomassa previamente tratada nas diferentes concentrações de EtOH.

Tabela 2A

Rendimentos de Glucano, Xilano e Arabinano Após Tratamento Prévio de

Acordo com o Exemplo 2

Tratamento prévio % EtOH em água	% Recuperação de glucano no resíduo	% Recuperação de xilano no resíduo	% Recuperação de arabinano no resíduo	Alteração do % de teor de lignina AI
20	77,5%	74,6%	51,3%	-48
45	84,0%	85,1%	68,0%	-64
60	83,6%	85,5%	76,0%	-63
70	81,3%	84,2%	75,8%	-65
80	80,0%	84,2%	86,6%	-50

Tabela 2B

Rendimentos de Xilose e Glicose Monomérica Após Sacarificação

Enzimática por 96 Horas, Previamente tratada Conforme Descrito no Exemplo 2

% EtOH em H2O	sacarificação apenas de monômero de glicose (% rendimento teórico)	sacarificação apenas de monômero de xilano (% rendimento teórico)	Rendimento geral de monômero de glicose (% rendimento teórico)	Rendimento geral de monômero de xilose (% rendimento teórico)
20	57,72	68,56	44,7	51,2
45	58,19	73,08	48,9	62,2
60	49,51	64,56	41,4	55,2
70	24,48	39,06	19,9	32,9
80	0,63	1,33	0,5	1,1

[093] Como se pode observar nas Tabelas 2A e 2B, as condições alcalinas desse experimento aumentaram substancialmente a retenção de xilano no tratamento prévio em comparação com os experimentos de auto-hidrólise do Exemplo 1. Este efeito foi mais pronunciado sob baixas concentrações de EtOH. O NaOH evitou que a solução se tornasse ácida (pH final de cerca de 10,7) e, portanto, protegeu a hemicelulose da hidrólise catalisada por ácido. Além disso,

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43/68 significativamente mais lignina foi extraída, presumivelmente por meio de fracionamento da lignina catalisado por base. Os rendimentos gerais de açúcar monomérico após a sacarificação foram substancialmente mais altos que os observados no Exemplo 1. A recuperação mais alta de açúcar e a maior extração de lignina no tratamento prévio aumentaram os rendimentos da sacarificação enzimática subsequente. Os rendimentos de sacarificação de xilose e glicose apresentaram pico a cerca de 45% de EtOH em consequência de dois processos opostos, ou seja, o aumento da extração de lignina sob EtOH mais alto, que tende a aumentar os rendimentos de açúcar, e a redução da hidrólise parcial de hemicelulose e de lignina à medida que aumenta adicionalmente a concentração de EtOH. É provável que a formação de metídeos de quinona, que poderão repolimerizar-se ou reagir com açúcares, e o “descascamento” e reações de cisão alcalina de polissacarídeo juntos contribuem para limitar os rendimentos gerais de açúcar.

Exemplo 3

Efeito de Alquilaminas Sobre o Tratamento Prévio de Biomassa Antes da Sacarificação [094] O propósito do presente Exemplo foi o de estudar o efeito da presença de alquilaminas na solução solvente orgânica (EtOH a 70% em água v/v) sobre o teor de lignina da biomassa após o tratamento prévio e sobre a recuperação de carboidratos após o tratamento prévio e sacarificação.

[095] Bagaço de cana de açúcar (0,375 g, 95,78% de matéria seca) foi suspenso em 1,125 ml de solvente contendo EtOH a 70% em H2O (v/v). Além disso, o solvente continha quantidades variáveis (6, 10 ou 14%) de dimetilamina (DMA, p/p de biomassa). Os pHs iniciais desses solventes foram de 12,50, 12,68 e 12,80, respectivamente. O pH foi ajustado utilizando NaOH. As suspensões foram carregadas em recipientes de pressão de aço inoxidável tipo 316 (diâmetro interno de 4,8 mm, diâmetro externo de 6,3 mm, comprimento

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44/68 de 101,6 mm), tampadas e tratadas conforme descrito acima no Exemplo 1, exceto pelo fato de que o carregamento de sólidos era mais alto e as amostras foram aquecidas a 168 °C por 140 minutos. Os resultados do tratamento prévio encontram-se resumidos na Tabela 3A.

Tabela 3A

Rendimentos de Glucano, Xilano e Arabinano Após Tratamento do Bagaço

L/S = 3,1 (v/p
Amostra de EtOH a 70% (p/v) mais (p/p biomassa)	% Recuperação de glucano em sólidos	% Recuperação de xilano em sólidos	% Recuperação de arabinano em sólidos	% alteração de lignina Ai no teor	pH inicial
6% DMA	95,6%	103,5%	86,0%	-43%	12,50
10% DMA	98,5%	106,4%	90,0%	-48%	12,68
14% DMA	92,3%	97,1%	95%	-53%	12,80

[096] Como se pode observar na Tabela 3A, a extração de lignina aumentou com o aumento da concentração de DMA, de forma consistente com o aumento da fragmentação da lignina sob concentrações de amina mais altas. Ao contrário do Exemplo 2, a recuperação de carboidratos após o tratamento prévio com DMA em EtOH a 70% é considerada mais alta. É provável que perdas de carboidrato devido a reações de “descascamento” sob pH alcalino sejam eliminadas ou limitadas pelo uso de DMA, seja porque o pH não é tão alto com 8% de NaOH ou porque DMA ou alguma decomposição em MMA e NH3 bloqueia as reações de “descascamento” por meio da formação de iminas na extremidade de redução do polissacarídeo.

[097] Sacarificação enzimática após o tratamento prévio foi conduzida conforme descrito no Exemplo 1, exceto pelo fato de que a razão entre

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Spezyme, Multifect e Novozymes 188 foi de 6,68:3,34:1,67 mg/g de sólidos secos na presença de 1% Tween 20 (p/v). A carga de sólidos foi de 14% em peso. Os rendimentos de sacarificação monoméricos são exibidos na Tabela 3B.

Tabela 3B

Rendimentos de Glicose Monomérica e Xilose Após Sacarificação

Enzimática por 96 Horas

Amostra 70% EtOH (p/v) mais (p/p de biomassa)	Sacarificação apenas de monômero de glicose (% rendimento teórico)	sacarificação apenas de monômero de xilose (% de rendimento teórico)	Monômero de glicose total (% de rendimento teórico)	Monômero de xilose total (% de rendimento teórico)
6% DMA	70,44	63,45	67,34	65,67
10% DMA	73,04	67,44	71,94	71,75
14% DMA	73,28	72	67,64	69,91

[098] A Tabela 3B demonstra que os rendimentos de açúcar monomérico mediante sacarificação enzimática após tratamento prévio com DMA surpreendentemente foram muito mais altos que após tratamento prévio com 8% de NaOH em EtOH a 70%. Além disso, os rendimentos de açúcar monomérico aumentaram com a concentração de DMA no solvente prétratamento.

Exemplo 4

Dimetilamina Produziu o Rendimento Mais Alto Mediante Sacarificação Enzimática:

[099] O propósito do presente Exemplo foi o de comparar os rendimentos de carboidratos após tratamento prévio e sacarificação enzimática em função do teor da solução pré-tratamento, comparando DMA com NH3 isoladamente ou NH3 mais NaOH. Foi realizado um experimento no qual o tratamento prévio foi realizado conforme descrito no Exemplo 3, exceto pelo fato de que o solvente 70% EtOH/H2O (v/v) (1,125 ml), no qual o bagaço (0,375 g) foi suspenso, continha 8% de NH3, 6% de NH3 mais 2%

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46/68 de NaOH ou 14% de DMA (todos p/p de biomassa) e o experimento foi realizado por 140 minutos a 168 °C. As recuperações de tratamento prévio de glucano, xilano e arabinano e a extração de lignina encontram-se tabuladas na Tabela 4A.

[0100] A sacarificação enzimática foi conduzida conforme descrito no Exemplo 3. Os rendimentos de sacarificação na ausência de Tween 20 em 96 horas após o tratamento prévio em EtOH a 70% mais diferentes aditivos (p/p de biomassa) são exibidos na Tabela 4B.

Tabela 4A Rendimentos de Glucano, Xilano e Arabinano Após o Tratamento Prévio

Amostra EtOH a 70% em H2O (p/v) mais aditivos (p/p de biomassa)	% recuperaçã o de glucano em sólidos	% recuperaç ão de xilano em sólidos	% recuperação de arabinano em sólidos	% alteração do teor de lignina Ai	pH inicial
14% DMA	92,3%	97,1%	95%	-53%	12,80
6% NH3 + 2% NaOH	97,8	107	92,4	-47%	14,0

Tabela 4B

Rendimentos de Glicose Monomérica e Xilose Após Sacarificação

Enzimática por 96 Horas

Amostra 70% EtOH em H2O (p/v) mais aditivos (p/p de biomassa)	sacarificação apenas de monômero de glicose (% de rendimento teórico)	sacarificação apenas de monômero de xilose (% de rendimento teórico)	Monômero de glicose total (% de rendimento teórico)	Monômero de xilose total (% de rendimento teórico)
14% DMA	63,54	63,43	58,65	61,59
6% NH3 + 2% NaOH	52,38	45,7	51,23	48,89
8% NH3	39,66	36,94	36,49	36,94

[0101] Das três condições utilizadas, tratamento prévio de

DMA produziu o maior grau de fragmentação e extração de lignina, gerando

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47/68 maior acessibilidade de enzimas a celulose e hemicelulose e produzindo os rendimentos mais altos de açúcar monomérico.

Exemplo 5 Comparação de Metilamina e Dimetilamina Para Tratamento Prévio de Biomassa [0102] Neste Exemplo, o tratamento prévio foi realizado como no Exemplo 3, exceto pelo fato de que o bagaço de cana de açúcar foi suspenso em EtOH a 70% em H2O (v/v) contendo metilamina (MA) ou dimetilamina (DMA). Os tratamentos prévios foram realizados a 168 °C por 140 minutos para as amostras que contêm 6, 10 e 14% de DMA (p/p de biomassa) e a 187 °C por uma hora para as amostras que contêm 6, 10 e 14% de MA e 14% de DMA (p/p de biomassa) conforme exibido na Tabela 5A. Embora os dois conjuntos de experimentos (MA e DMA) fossem realizados em dois tempos e temperaturas diferentes, o tempo e a temperatura possuem pouco impacto sobre a recuperação do tratamento prévio e os rendimentos de sacarificação para cada uma das alquilaminas (para tratamentos prévios de 168 °C por 140 minutos e 187 °C por uma hora) e encontram-se dentro do ruído da medição (vide, por exemplo, DMA a 14% a 168 °C e 187 °C). Aparentemente, não há muita diferença nos rendimentos de tratamento prévio entre as duas alquilaminas.

Tabela 5A

Rendimentos de Glucano e Xilano Após o Tratamento Prévio de Acordo com o Exemplo 5

Amostra 70% EtOH em H2O (p/v) mais (p/p de biomassa)	% recuperação de glucano em sólidos	% recuperação de xilano em sólidos	% alteração do teor de lignina AI	pH inicial
6% MA, 187 °C	94,6	101,3	-42%	12,89
10% MA, 187 °C	91,2	94,1	-56%	13,03
14% MA, 187 °C	96,8	102,3	-60%	13,08
6% DMA, 168 °C	95,6	103,5	-43%	12,59

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Amostra 70% EtOH em H2O (p/v) mais (p/p de biomassa)	% recuperação de glucano em sólidos	% recuperação de xilano em sólidos	% alteração do teor de lignina AI	pH inicial
10% DMA, 168 °C	98,5	106,4	-48%	12,71
14% DMA, 168 °C	92,3	97,1	-53%	12,80
14% DMA, 187 °C	94,0	95,8	-53%	12,80

[0103] A sacarificação foi realizada por 96 horas conforme descrito no Exemplo 1, exceto pelo fato de que a razão entre Spezyme, Multifect e Novozymes 188 foi de 6,68:3,34:1,67 mg/g de sólidos secos na presença de 1% Tween 20 (p/v) sob carga de sólidos de 14% (p/p).

[0104] Conforme exibido na Tabela 5B, a biomassa previamente tratada com MA gerou rendimentos de sacarificação de glicose mais altos que as amostras previamente tratadas com DMA. A amostra de MA a 10% (MW = 31) deverá ser equivalente àquela com DMA a 14% (MW = 45) em termos de concentração de nucleófilos, mas o rendimento de glicose é mais alto. Os rendimentos de monômero de xilose para a mesma concentração foram equivalentes ou levemente mais altos que DMA que com MA. Pode haver uma vantagem estérica para o uso de MMA sobre DMA na fragmentação da lignina, gerando uma extensão levemente maior de extração e um rendimento de sacarificação mais alto.

Tabela 5B

Rendimentos de Glicose Monomérica e Xilose Após Sacarificação Enzimática por 96 Horas, Previamente Tratada Conforme Descrito no Exemplo 5

Amostra 70% EtOH/H2O (p/v) mais (p/p de biomassa)	sacarificação apenas de monômero de glicose (% de rendimento teórico)	sacarificação apenas de monômero de xilose (% de rendimento teórico)
6% MA, 187 °C	75,82	61,02
10% MA, 187 °C	80,42	70,87
6% DMA, 168 °C	70,44	63,85
10% DMA, 168 °C	73,04	67,04
14% DMA, 168 °C	73,35	72,9
14% DMA, 187 °C	71,82	68,59

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Exemplo 6 Efeito de Tioglicolato Como Componente Adicional da Solução de Solvente:

[0105] O propósito do presente Exemplo foi o de estudar o efeito de organomercaptanos (tais como tioglicolato) na solução de solvente. Além disso, tensoativos tais como Tween 20 frequentemente aumentam a velocidade e o rendimento de liberação de açúcar monomérico, mas com custo maior. É provável que o tensoativo revista qualquer lignina residual, reduzindo a ligação não produtiva da enzima à lignina. Poderá ser realizada economia de custo por um tratamento prévio aprimorado que elimine a necessidade de tensoativo na etapa de sacarificação. Esse aprimoramento poderá ser realizado por meio de aumento adicional da extração de lignina no tratamento prévio ou de modificação química da lignina residual de tal forma que menos enzima seja perdida para a adsorção de lignina durante a sacarificação.

[0106] Neste Exemplo, foi realizado tratamento prévio como no Exemplo 3, exceto pelo fato de que o EtOH a 70% em solvente H2O (v/v) no qual o bagaço foi suspenso continha 14% de MA com e sem 2% de ácido tioglicólico, 2% de ácido glicólico ou 2% de glicina (todos p/p de biomassa). Além disso, o tratamento prévio foi realizado a 187 °C por uma hora em vez de 168 °C por 140 minutos.

[0107] A sacarificação enzimática subsequente foi realizada como no Exemplo 5, exceto pelo fato de que a reação foi realizada na presença e na ausência de 1% Tween 20 (p/v). A Figura 1A exibe a liberação de glicose monomérica mediante sacarificação enzimática na presença e na ausência de Tween após tratamento prévio a 187 °C por uma hora em 70% EtOH/H2O e 14% MA com ou sem 2% de tioglicolato. A Figura 1B exibe a liberação de xilose monomérica mediante sacarificação enzimática na presença e na ausência de Tween após tratamento prévio

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50/68 similar na presença e na ausência de tioglicolato. A adição de ácido tioglicólico a 2% (p/p de biomassa) a 70% de EtOH/H2O (v/v) mais 14% de MA (p/p de biomassa) no tratamento prévio estimulou significativamente a velocidade de sacarificação enzimática e rendimento de açúcar monomérico na ausência de Tween 20. A comparação da cinética de sacarificação na presença e na ausência de 1% de Tween 20 e com e sem 2% de ácido tioglicólico no tratamento prévio (Figuras 1A e 1B) demonstra que ácido tioglicólico estimulou a velocidade de sacarificação e rendimento até o ponto em que Tween 20 apresentava menos influência sobre ambos.

[0108] A fim de compreender a natureza da química de ácido tioglicólico, foram realizados experimentos similares com ácido glicólico e glicina nos quais o -SH do ácido tioglicólico é substituído por -OH e -NH, respectivamente.

[0109] A Figura 2A exibe o aprimoramento por ácido tioglicólico da extração de lignina (maior absorbância de UV) no tratamento prévio descrito acima (Exemplo 5) na presença de metilamina. Por outro lado, houve pouca diferença na amplitude do espectro de UV da biomassa tratada com 70% EtOH/H2O (v/v) mais 14% de MA (p/p de biomassa) isoladamente em comparação com EtOH a 70% em H2O (v/v) mais 14% de MA mais 2% de ácido glicólico ou 2% de glicina (p/p de biomassa) (Figura 2B).

[0110] Como se pode observar na Tabela 6, a comparação após 96 horas de sacarificação enzimática na ausência de Tween 20 após tratamento prévio com 70% EtOH/H2O (v/v) mais 14% de MA (p/p de biomassa) contendo ácido tioglicólico, ácido glicólico ou glicina indicou que o ácido tioglicólico gerou velocidade de sacarificação e rendimento significativamente mais altos que ácido glicólico ou glicina. Concluiu-se que o grupo -SH foi responsável pela reatividade do ácido tioglicólico. O ácido tioglicólico reagiu de forma similar com intermediários metídeos de quinona produzidos na fragmentação da lignina sob condições alcalinas por meio de redução do metídeo de quinona ou realização de reações de adição aos metídeos

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51/68 de quinona ou por meio da substituição dos componentes α e/ou β-aril éter de lignina. Essas reações promovem, de forma similar, fragmentação adicional e extração da lignina (Figura 2). O ácido glicólico e glicina foram muito menos reativos ou não reativos.

Tabela 6

Rendimentos de Glucano e Xilano Após o Tratamento Prévio e Rendimentos de

Glicose Monomérica e Xilose Após Sacarificação Enzimática com e sem Tween de Acordo com o Exemplo 6

Amostra 70% EtOH/ H2O (p/v) mais (p/p de biomassa)	% recup. de glucano em sólidos	% recup. de xilano em sólidos	sacarif. apenas de monôm. de glicose (% rend. teórico) sem Tween	sacarif. apenas de monôm. de xilose (% rend. teórico) sem Tween	sacarif. apenas de monôm. de glicose (% rend. teórico) com Tween	sacarif. apenas de monôm. de xilose (% rend. teórico) com Tween
14% MA	96,2	104,4	69,07	58,26	75,96	67,50
14% MA + 2% ácido tioglicólico	92,3	104,0	77,37	65,78	81,89	71,38
14% MA + 2% ácido glicólico	89,4	99,4	72,3	57,5	82,43	69,70
14% MA + 2% glicina	97,0	103,7	73,06	59,85	77,63	68,27

[0111] Comparação dos perfis de HPLC de açúcar monomérico e oligomérico durante a sacarificação enzimática indicou que a adição de ácido tioglicólico no tratamento prévio (sem Tween na sacarificação) produziu um perfil muito similar ao observado após a adição de Tween 20 (sem ácido tioglicólico no tratamento prévio), ou seja, xilobiose reduzida acompanhada por aumento de xilose monomérica e aumento da celobiose acompanhada por aumento da glicose monomérica. Os rendimentos de açúcar monomérico para essas duas condições foram muito similares (Figura 1 e Tabela 6). Estas observações são consistentes com o aumento da produção de extração de lignina por meio da adição de ácido tioglicólico

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52/68 durante o tratamento prévio (vide Tabela 6). Também é possível que haja derivação da lignina pelo ácido tioglicólico para tornar a lignina residual mais hidrofílica (adição de carga negativa de carboxilato), o que resulta em perda reduzida das enzimas de celulose e xilanase para ligação não produtiva. Esse impacto reduzido de lignina sobre a sacarificação é similar à que se acreditou que acontecesse durante a adição de Tween 20 a biomassa previamente tratada na ausência de tioglicolato (ou seja, Tween liga-se a lignina, tornando-a mais hidrofílica). Em resumo, a inclusão de tioglicolato a 2% (p/p de biomassa) no tratamento prévio com EtOH a 70% e alquilamina aumentou a extração de lignina e estimulou o rendimento de sacarificação de glicose e xilose.

Exemplo 7

Aumento da Extração de Lignina por Meio da Adição de Tioglicolato em Metilamina e Etilamina Durante o Tratamento Prévio:

[0112] O tratamento prévio fio realizado como no Exemplo 3, exceto pelo fato de que o solvente EtOH a 70% em H2O (v/v) no qual o bagaço foi suspenso continha 14% de MA ou 14% de etilamina (todos p/p de biomassa) com e sem 2% de ácido tioglicólico (p/p de biomassa). A Figura 2A exibe os espectros de absorbância de UV de filtrados após o tratamento prévio em EtOH a 70% mais 14% de alquilamina com ou sem 2% de tioglicolato a 187 °C por uma hora. O aumento da absorbância de UV mediante adição de ácido tioglicólico ao solvente de tratamento prévio nos dois casos indicou que ácido tioglicólico aumentou a fragmentação e extração de lignina, de forma consistente com a redução de lignina presente no resíduo após o tratamento prévio, filtragem e lavagem com EtOH a 70% em H2O (v/v).

Exemplo 8

Tratamento Prévio de Biomassa Utilizando Sulfeto de Amônio Durante Extração de Lignina:

[0113] O propósito do presente Exemplo foi o estudo do efeito de sulfeto de amônio sobre o tratamento prévio de biomassa. O tratamento prévio

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53/68 foi realizado como no Exemplo 3, exceto pelo fato de que o solvente EtOH a 70% em H2O (v/v) no qual o bagaço foi suspenso continha 14% de MA (p/p de biomassa) mais 2% ou 6% de (NH4)2S (p/p de biomassa). Realizou-se sacarificação enzimática como no Exemplo 5. Rendimentos de sacarificação na presença e na ausência de 1 % de Tween 20 (v/v) em 96 horas após o tratamento prévio em 70% de EtOH mais 14% de MA na presença e ausência de 2% e 6% de sulfeto de amônio (p/p de biomassa) são exibidos na Tabela 7.

Tabela 7

Rendimentos de Glucano e Xilano Após Tratamento Prévio de Acordo com o Exemplo 8

Amostra	% recup. de glucano em sólidos	% recup. de xilano em sólidos	Sacarif. apenas de monômero de glicose (% rend. teórico) sem Tween	sacarif. apenas de monômero de xilose (% rend. teórico) sem Tween	sacarif. apenas de monômero de glicose (% rend. teórico) com Tween	sacarif. apenas de monômero de xilose (% rend. teórico) com Tween
14% MA	90,60	97,52	69,07	58,26	75,96	67,5
14% MA + 2% (NH4)2S	91,62	98,03	78,9	68,68	84,79	76,39
14% MA + 6% (NH4)2S	87,02	92,43	84,2	73	90,87	83,23

[0114] A comparação das sacarificações enzimáticas na ausência de Tween 20 após o tratamento prévio com EtOH a 70% em H2O (v/v) mais 14% de MA (p/p de biomassa) contendo 0%, 2% ou 6% de (NH4)2S (p/p de biomassa) demonstrou que (NH4)2S, quando presente no tratamento prévio, promoveu a sacarificação enzimática subsequente. O aumento da sacarificação foi associado, de forma similar, a um aumento da fragmentação e extração da lignina (Figura 3). A Tabela 7 demonstra que o efeito do tratamento prévio com (NH4)2S a 2% foi bastante notável para a sacarificação de xilano em xilose e de glucano em glicose. As análises de

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HPLC dos hidrolisados indicaram, como no caso de ácido tioglicólico, que o aumento da extração da lignina por (NH4)2S no tratamento prévio sem tensoativo na sacarificação comportou-se de forma similar à adição de tensoativo na sacarificação, mas sem (NH4)2S no tratamento prévio. O tensoativo reveste a lignina residual enquanto o (NH4)2S reduz a quantidade de lignina residual. A presença de (NH4)2S a 6% no tratamento prévio produz um impulso adicional no rendimento de sacarificação, bem acima da amostra sacarificada com Tween 20, mas previamente tratada na ausência de (NH4)2S.

Exemplo 9

Sulfeto de Amônio Aumentou a Extração de Lignina [0115] Tratamento prévio foi realizado como no Exemplo 3, exceto pelo fato de que o solvente EtOH a 70% em H2O (v/v) no qual o bagaço foi suspenso continha 14% de MA (p/p de biomassa) sem adições e com 2% ou 6% de (NH4)2S (p/p de biomassa). A Figura 3A exibe os espectros de absorbância dos filtrados após o tratamento prévio, diluídos em 5000 vezes com EtOH a 70% em H2O (v/v). A adição de 2% e 6% de (NH4)2S a 70% EtOH/H2O mais MA exibiu aumento muito grande da absorbância de UV do filtrado após tratamento prévio, o que indica aumento da lignina extraída. O aumento da extração de lignina por meio da inclusão de (NH4)2S no tratamento prévio é consistente com o aumento significativo da sacarificação enzimática subsequente (Tabela 7).

Exemplo 10 Tratamento Prévio de Biomassa Utilizando Enxofre Elementar Durante a Extração de Lignina [0116] O propósito do Exemplo foi o de estudar o efeito de enxofre elementar no tratamento prévio de biomassa. Consequentemente, enxofre elementar foi adicionado ou não à biomassa sob concentração igual

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55/68 a 1% ou 2% em peso da biomassa. O tratamento prévio foi realizado como no Exemplo 3, exceto pelo fato de que a biomassa com e sem enxofre foi suspensa em EtOH a 70% em H2O v/v contendo 14% de MA (p/p de biomassa). As suspensões foram colocadas em recipientes de pressão como no Exemplo 3 e aquecidas a 187 °C por uma hora. Após rápido resfriamento dos recipientes de pressão à temperatura ambiente, o conteúdo foi filtrado e lavado com EtOH a 70% em H2O (v/v) e mantido em secagem no ar. O filtrado obtido após o tratamento prévio a 2% de enxofre foi diluído a 1:5000 com EtOH a 70% em H2O (v/v) e foi registrado o espectro de UV. Conforme exibido na Figura 3B, existe um aumento substancial da absorbância de UV na presença de 14% de MA (p/p de biomassa) mais 2% de enxofre (p/p de biomassa) em comparação com 14% de MA (p/p de biomassa) isoladamente em EtOH a 70% em H2O (v/v). O aumento da extração de lignina na presença de enxofre é consistente com a redução do teor de lignina nos sólidos após tratamento prévio e o aumento do rendimento de açúcar monomérico após sacarificação enzimática (Tabela 8).

[0117] As sacarificações enzimáticas subsequentes foram conduzidas como no Exemplo 5 sobre a amostra que contém 1% de enxofre, exceto pelo fato de que foram realizadas na presença ou ausência de 1% de Tween 20 (p/v) no caso da amostra sem enxofre e na presença e ausência de 0,5% de PEG 2000 (p/p de biomassa) no caso da amostra com enxofre. Experimentos paralelos (não exibidos) indicaram que 1% de Tween 20 (p/v) e 0,5% de PEG 2000 (p/p de biomassa) geram virtualmente o mesmo grau de aumento da sacarificação enzimática. Rendimentos de tratamento prévio e rendimentos de sacarificação enzimática na presença e ausência de 1% de Tween 20 (v/v) em 96 horas após o tratamento prévio em 70% de EtOH mais 14% de MA e na presença e ausência de 0,5% de PEG 2000 (p/p de biomassa) e 1% de S (p/p de biomassa) são exibidos na Tabela 8.

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Tabela 8

Rendimentos de Glucano e Xilano Após Tratamento Prévio de Acordo com o Exemplo 10 e Rendimentos de Açúcares Monoméricos Após

Sacarificação Enzimática

Amostra	% recuperação de glucano em sólidos	% recuperação de xilano em sólidos	Lignina AI (% alteração de teor)	Glicose monomérica (% de rendimento teórico)	xilose monomérica (% de rendimento teórico)
70% EtOH, 14% MA	99,22	102,95	-51	71,8	59,1
70% EtOH, 14% MA + 1% Tween 20 (v/v)	99,22	102,95	-51	78,0	68,1
70% EtOH, 14% MA + 1% S	97,58	100,42	-77	86,0	82,8
70% EtOH, 14% MA + 1% S + 0,5% PEG 2000	97,58	100,42	-77	88,1	84,2

[0118] A adição à biomassa de 1% (p/p de biomassa) de enxofre elementar produz um aumento substancial do rendimento de sacarificação enzimática de glicose e xilose, ambos na presença e na ausência de tensoativo. A presença do enxofre, além de aumentar os rendimentos de açúcar, modifica a lignina residual até o ponto em que a adição de PEG 2000 produz apenas um aumento muito pequeno no rendimento de açúcar enzimático.

Exemplo 11

Efeito da Adição de Amônia à Solução Solvente Orgânica de Tratamento Prévio que Contém Metilamina e Enxofre Elementar [0119] Tratamento prévio foi realizado como no Exemplo 3, exceto pelo fato de que o bagaço continha 1% de enxofre elementar (p/p de biomassa) e foi suspenso em EtOH a 70% em H2O (v/v) mais 14% de MA (metilamina), 7%

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57/68 de NH3 + 7% de MA, 10% de NH3 + 4% de MA ou 14% de NH3 (todos p/p de biomassa). As amostras foram aquecidas a 187 °C por uma hora em recipientes de pressão e rapidamente resfriadas em seguida à temperatura ambiente em um banho de água. O resíduo foi filtrado, lavado e seco conforme descrito anteriormente. Sacarificação enzimática foi realizada como no Exemplo 5, mas na presença e ausência de 0,5% de PEG 2000 (p/p de biomassa).

Tabela 9

Rendimento de Açúcares Monoméricos Após Tratamento Descrito no

Exemplo 11

Amostra 70% EtOH em H2O (v/v) + 1% S (p/p de biomassa) + aditivos (p/p de biomassa)	% recuper. de glucano em sólidos	% recuper. de xilano em sólidos	Glicose monom. (% de rend. teórico) sem PEG	xilose monom. (% de rend. teórico) sem PEG	Glicose monom. (% de rend. teórico) sem PEG	xilose monom. (% de rend. teórico) com peg
14% MA	96,8	102,3	83,3	74,6	85,8	75,8
7% NH3 + 7% MA	90,80	96,98	79,5	68,2	82,9	71,1
10% NH3 + 4% MA	91,61	97,35	76,2	66,4	80,8	68,7
14% NH3	95,24	100,41	66,71	59,5	74,3	63,9

[0120] Conforme indicado na Tabela 9, a substituição de metilamina por amônia não apresenta impacto sobre a recuperação de glucano e xilano mediante tratamento prévio. Os rendimentos de sacarificação para glicose monomérica e xilose, entretanto, caem progressivamente quanto mais extensa a substituição de metilamina por amônia (Tabela 9). As diferenças entre as conduções de sacarificação com e sem PEG 2000 são de, no máximo, apenas alguns pontos percentuais. Uma análise econômica do processo geral é necessária para determinar se existe economia no custo da produção de açúcar mediante substituição de metilamina por amônia no tratamento prévio, apesar da perda de rendimento, ou mediante adição de PEG 2000 na sacarificação, apesar do custo do aditivo.

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Exemplo 12

Tratamento Prévio com Solução Solvente Orgânica de Espiga de Milho, Capim Elefante e Bagaço de Cana de Açúcar Utilizando Metilamina e Enxofre Elementar [0121] A solução solvente orgânica mais metilamina mais tratamento prévio com enxofre elementar foi testada em três estoques de alimentação diferentes utilizando condições similares às do Exemplo 10, exceto pelo fato de que a biomassa foi misturada com 1 % de enxofre elementar (p/p de biomassa) em todos os casos e suspensa em EtOH a 70% em H2O contendo 14% de metilamina (p/p de biomassa). Switchgrass e bagaço de cana de açúcar foram aquecidos a 183 °C por uma hora. Espiga de milho foi aquecida a 187 °C por uma hora. As amostras foram lavadas com EtOH a 70% em H2O (v/v) e secas em ar como no Exemplo 10 e sacarificadas em seguida conforme descrito no Exemplo 5, exceto pelo fato de que as sacarificações foram realizadas na presença e ausência de PEG 2000 (0,5% em peso de biomassa). Os rendimentos de açúcar monomérico são exibidos na Tabela 10.

Tabela 10

Rendimento de Açúcares Monoméricos Após o Tratamento Descrito no Exemplo 12

Amostra	Sacarificação apenas de monômero de glicose (% do rendimento teórico) sem PEG	sacarificação apenas de monômero de glicose (% de rendimento teórico) com peg	sacarificação apenas de monômero de xilose (% de rendimento teórico) sem peg	sacarificação apenas de monômero de xilose (% de rendimento teórico) com peg
Espiga de milho, 187 °C	81,99	82,67	39,06	47,65
Switchgrass, 183 °C	82,06	82,95	43,58	59,26
Bagaço, 183 °C	79,84	80,5	68,51	70,92

[0122] Os rendimentos de glicose monomérica diferem muito pouco entre os diferentes estoques de alimentação (tais como milho, switchgrass e

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59/68 bagaços) e existe pouco efeito da adição de PEG 2000. Os rendimentos gerais de xilose de oligômero mais monômero foram similares para os três estoques de alimentação, mas a razão entre monômero e oligômero diferiu de forma apreciável, em que o bagaço gera a razão mais alta entre monômero e oligômero e espiga de milho, a menor. A extensão da formação de monômero aumentou um pouco para espiga e switchgrass com a adição de PEG, mas muito pouco para bagaço. É provável que diferenças estruturais entre os oligômeros de xilose, solubilizadas nos diferentes estoques de alimentação, compensem as diferenças da sua conversão enzimática em monômero e não a eficácia do tratamento prévio.

[0123] Estes resultados demonstram a faixa de aplicabilidade do tratamento prévio desenvolvido a estoques de alimentação que diferem de forma apreciável na sua composição de lignina - espiga de milho, switchgrass e bagaço, cerca de 14%, 23% e cerca de 25%, respectivamente, de DM.

Exemplo 13

Comparação de Sacarificação Enzimática de Espiga de Milho Pré-tratamento Utilizando Solução Solvente Orgânica na Presença de Metilamina e Enxofre com Espiga de Milho Previamente tratada com Amônia Diluída e Espiga de Milho não Tratada

Pré-tratamento de Solução Solvente Orgânica Utilizando Enxofre Elementar e Metilamina [0124] Duas bateladas de 134 g (teor de umidade de 8,4%) de espigas de milho moídas em moinho martelo, uma com 0,5% e a outra com 1% de enxofre elementar (p/p de biomassa), cada qual suspensa em 280 ml de EtOH, 66,7 ml de água, 53,3 ml de solução de metilamina (47,4 g) e aquecida a 195 °C por uma hora à temperatura com agitação mecânica em um recipiente de pressão de um litro. Cada batelada foi lavada em seguida com EtOH a 70% em H2O (v/v) por três vezes. O material foi seco em ar e as duas bateladas foram reunidas.

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Tratamento Prévio com Amônia Diluída [0125] A 713 g (teor de umidade de 5,8%) de espigas de milho moídas com moinho martelo carregados em um reator de 5 litros, foram adicionados 138,9 g de solução de NH4OH (29% em peso de NH3) e 491,1 g de água adicional para gerar uma carga de 50% de sólidos. O reator foi aquecido a 140 °C por vinte minutos àquela temperatura. O NH3 sofreu ignição em seguida durante o resfriamento do reator e foi adicionalmente removido a vácuo. O conteúdo do reator foi removido e utilizado para sacarificação.

Biomassa não Tratada [0126] Espiga de milho moída com moinho martelo não tratada (teor de umidade de 8,4%) foi utilizada como controle para este estudo de sacarificação.

[0127] Os teores de glucano e xilano foram determinados utilizando o procedimento de NREL (vide Exemplo 1). Análise dos açúcares hidrolisados foi realizada por meio de HPLC (utilizando o método descrito acima, com exceção da temperatura da coluna, que foi de 65 °C em vez de 60 °C). A sacarificação desse material foi realizada em um frasco Erlenmeyer de vidro de um litro (Chemglass, Vineland NJ) em um agitador giratório definido a 200 rpm e 48 °C. Nas sacarificações comparativas, foram utilizados 75 mmol de tampão citrato de sódio sob pH médio de 5,4 a 5,6 para controlar o pH. Além disso, foram adicionados 5 ppm de penicilina e virginiamicina cada para inibir o crescimento bacteriano e 0,5% de PEG 2000 (% em peso de sólidos) para reduzir a adsorção de enzimas em lignina. Os sólidos foram carregados com base no seu teor de carboidratos, que foi de 18,3% em peso de carboidratos ((glucano + xilano)/(glucano + xilano + massa de líquido adicionada à biomassa)). Isso correspondeu a uma carga de sólidos de 20,8%, 25,2% e 25,6% para a solução solvente orgânica, amônia diluída e material não tratado, respectivamente. As enzimas utilizadas foram descritas no Exemplo 1. A razão em peso de proteína

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61/68 de Spezyme:Novozyme 188 foi de 4:1 e a carga da proteína total Spezyme/Novozyme 188 foi de 37,5, 25 e 10 mg de proteína/g de glucano para as cargas de enzima alta, média e baixa, respectivamente. Multifect foi carregado em 15, 10 e 4 mg/g de xilano para as cargas de enzima alta, média e baixa, respectivamente. O tampão, água adicional, enzimas, tensoativo e antibióticos foram misturados entre si em um frasco de um litro e, em seguida, foram adicionados os primeiros 60% dos sólidos. Os frascos foram aquecidos e agitados. Após uma hora, os 20% de sólidos seguintes foram adicionados a cada frasco. Os 20% finais de sólidos foram adicionados três horas mais tarde. As reações continuaram em mistura à temperatura por um total de 96 horas, após o quê elas foram removidas. Uma amostra representativa de cada uma foi transferida para um recipiente centrífugo, centrifugada na centrífuga e a fração líquida foi decantada. O sólido foi novamente suspenso em água, novamente centrifugado e o líquido separado foi novamente decantado. Isso foi repetido por quatro vezes adicionais. O líquido foi analisado para determinar o teor de monômeros utilizando o HPLC. O teor de oligômeros foi determinado por meio de hidrólise por uma hora a 121 °C de uma parte dessa fração de lavagem com ácido sulfúrico (4% p/v), reanálise sobre HPLC e a diferença com o teor de monômero foi considerada derivada dos oligômeros. O teor de monômero e oligômero produzido por meio de sacarificação enzimática é relatado como rendimento da quantidade inicial de glucano e/ou xilano nos sólidos iniciais nos frascos. Os resultados desses experimentos são exibidos na Tabela 11 abaixo.

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Tabela 11

Rendimento de Açúcar de Vários Tipos de Tratamentos Prévios Conforme

Descrito no Exemplo 13

Trat. Prévio	Carga de enzima	% rend. de glicose (mono)	% rend. de xilose (mono)	% conv. de glucano em olig. de glicose	% conv. de xilano em olig. de xilose	% rend. de glicose de sacar. (mono + oligo)	% rend. de glicose de sacar. (mono + oligo)	% rend. de glicose + xilose de sacar. (mono + oligo)
EtOH/ MA/S8	alta	80	62	13	39	95	102	98
NH3 diluído	alta	60	42	9	38	71	80	75
Não tratada	alta	24	17	3	4	25	20	23
EtOH/ MA/S8	média	72	55	10	42	84	97	90
NH3 diluído	média	51	36	8	38	60	74	66
Não tratada	média	24	17	3	4	26	20	23
EtOH/ MA/S8	baixa	45	39	5	54	52	94	70
NH3 diluído	baixa	35	25	7	42	43	68	54
Não tratada	baixa	19	14	2	2	21	16	19

[0128] Este estudo comparativo demonstra a eficácia do tratamento prévio com solução solvente orgânica, metilamina e enxofre no aumento da sacarificação de espigas de milho previamente tratadas com relação ao processo de amônia diluída e à ausência de tratamento prévio em cargas de sólidos (20,8% p/p para solução solvente orgânica) no sacarificador, consideravelmente mais alta que nos exemplos anteriores (14% p/p). A conversão enzimática em monômero mais oligômero após o tratamento prévio com solução solvente orgânica é quase quantitativa na alta carga de enzima.

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Sob todas as cargas de enzimas, o tratamento prévio com solução solvente orgânica gera a conversão mais alta em monômero glicose e xilose e em monômero mais oligômero glicose e xilose.

Exemplo 14

Comparação do Desempenho em Diversos Estoques de Alimentação de Tratamento Prévio de Solvente Orgânico na Presença de Metilamina e Enxofre Elementar:

[0129] Para comparar o efeito do tratamento prévio de solvente orgânico com metilamina (MA) e enxofre (S) sobre cinco estoques de alimentação, que diferem no seu teor de lignina, espiga de milho (lignina AI 14% de material seco (DM)), switchgrass (lignina AI 23,4% de DM), bagaço de cana de açúcar AI (lignina 25% de DM), palha de cana de açúcar (lignina AI 25% de DM) e álamo amarelo (lignina AI 20% de DM) foram tratados em etanol a 70% em água (v/v) contendo 10 ou 14% de MA e S elementar utilizando as condições detalhadas na Tabela 1. A biomassa previamente tratada foi lavada, em seguida seca e submetida à sacarificação enzimática. Antes do tratamento prévio, todos os estoques de alimentação foram moídos em primeiro lugar em um moinho de faca utilizando uma peneira de 1 mm. Os tratamentos prévios foram realizados nas cargas de sólido indicadas em EtOH a 70% em água (v/v) contendo MA e S e aquecidos às temperaturas e pela duração indicada. As amostras foram filtradas e lavadas em seguida com EtOH a 70% e mantidas em secagem em ar em seguida à temperatura ambiente. Os teores de glucano e xilano e os percentuais de recuperação após o tratamento prévio encontram-se resumidos na Tabela 12. As amostras foram sacarificadas em seguida a 48 °C utilizando Spezyme CP: Mutifect Xilanase: Novozyme 188 em razão de 6,68: 3,34: 1,67 mg/g de biomassa em carga de sólidos de 14% em 50 mM de citrato de Na, pH 4,7 e nas cargas de enzima indicadas para as outras cargas de sólidos em 50 mM de citrato de Na, pH 4,8-4,9. Foram realizadas sacarificações pelos tempos

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64/68 indicados. Os rendimentos de açúcar monoméricos foram determinados por meio de HPLC (coluna BioRad HPX-87H a 60 °C, fase móvel de 0,01 N de H2SO4) conforme indicado no Exemplo 1 e são baseados no teor de açúcar da biomassa previamente tratada que vai para o sacarificador. A concentração total de açúcar (oligômero mais monômero) foi determinada tomando-se o sobrenadante no final da sacarificação e realizando-se autoclave por uma hora a 121 °C em H2SO4 a 4% seguido por análise de HPLC. Os resultados de sacarificação são exibidos na Tabela 13.

[0130] Estes resultados demonstram que o tratamento prévio de biomassa lignocelulósica com solvente orgânico, que contém metilamina e enxofre, gera biomassa tratada com teor de glucano e xilano altamente conservado e enriquecido ao longo de uma ampla série de estoques de alimentação, que diferem apreciavelmente no seu teor de lignina. Além disso, este tratamento prévio facilita a sacarificação enzimática subsequente, gerando altos rendimentos de açúcares solúveis para a mesma coleção de estoques de alimentação.

Tabela 12

Teor de Glucano e Xilano e Recuperação Após Tratamento Prévio,

Lavagem e Secagem em Ar

Amostra	Teor de glucano (% de matéria seca)	Teor de xilano (% de matéria seca)	% recuperação de glucano após tratamento prévio	% recuperação de xilano após tratamento prévio
Espiga de milho, 195 °C, 1 h, EtOH a 70% (v/v), 14% MA, 0,75% S (peso/peso de biomassa), lavada com EtOH a 70% (v/v) e seca em ar	53	38	97	100

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Amostra	Teor de glucano (% de matéria seca)	Teor de xilano (% de matéria seca)	% recuperação de glucano após tratamento prévio	% recuperação de xilano após tratamento prévio
switchgrass, carga de sólidos de 18%, 180 °C, 1 h, EtOH a 70% (v/v), 14% MA, 1% S (peso/peso de biomassa), lavado com EtOH a 70% (v/v) e seco em ar	50	36	93	95
Bagaço de cana de açúcar, carga de sólidos de 11%, 180 °C, 1 h, EtOH a 70% (v/v), 14% de MA, 1% de S (peso/peso de biomassa), lavado com EtOH a 70% (v/v) e seco em ar	50	33	93	100
Palha de cana de açúcar, carga de sólidos de 26%, 188 °C, 1 h, EtOH a 70% (v/v), 14% de MA, 1% de S (peso/peso de biomassa), lavada com EtOH a 70% (v/v) e seca em ar	44	29	87	88
Álamo amarelo, carga de sólidos de 26%, 200 °C, 1 h, EtOH a 70% (v/v), 14% de MA, 1% de S (peso/peso de biomassa), lavado com EtOH a 70% (v/v) e seco em ar	67	26	100	89

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Tabela 13

Conversão de Glucano e Xilano em Glicose e Xilose, Respectivamente, por

Meio de Sacarificação Enzimática

Amostra	Glicose monomérica (% rendimento teórico)	Xilose monomérica (% rendimento teórico)	Monômero de glicose + oligômero solúvel (% rendimento teórico)	Monômero de xilose + oligômero solúvel (% rendimento teórico)
Espiga de milho, carga de sólidos de 26%, 190 °C, 1 h, EtOH a 70% (v/v), 10% de MA, 1% de S (peso/peso de biomassa), sacarificação 168 h, 14% de sólidos, + 0,5% de PEG 2000 (peso/peso de biomassa)	92,5	54
Espiga de milho, carga de sólidos de 26%, 195 °C, 1 h, EtOH a 70% (v/v), 14% de MA, 0,75% de S (peso/peso de biomassa), sacarificação 96 h, 18,5% de carga de carboidratos, Spe+Novo 188 (37,5 mg/g de glucano), Multifect 15 mg/g de xilano	78	59	92	96
switchgrass, carga de sólidos de 26%, 180 °C, 1 h, EtOH a 70% (v/v), 14% de MA, 1% de S (peso/peso de biomassa), sacarificação 168 h, 14% de sólidos + 0,5% de PEG 2000 (peso/peso de biomassa)	92	68
switchgrass, carga de sólidos de 18%, 180 °C, 1 h, EtOH a 70% (v/v), 14% de MA, 1% de S	71	49	78	89

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Amostra	Glicose monomérica (% rendimento teórico)	Xilose monomérica (% rendimento teórico)	Monômero de glicose + oligômero solúvel (% rendimento teórico)	Monômero de xilose + oligômero solúvel (% rendimento teórico)
(peso/peso de biomassa), sacarificação 96 h, 15% de carga de carboidratos, Spe+Novo 188 (37,5 mg/g de glucano), Multifect 15 mg/g de xilano
Bagaço de cana de açúcar, carga de sólidos 26%, 180 °C, 1 h, EtOH a 70% (v/v), 14% de MA, 1% de S, (peso/peso de biomassa), sacarificação 168 h, 14% de sólidos	89	85
Bagaço de cana de açúcar, carga de sólidos de 11%, 180 °C, 1 h, EtOH a 70% (v/v), 14% de MA, 1% de S (peso/peso de biomassa), sacarificação 96 h, carga de 11,5% de carboidratos, Spe+Novo 188 (37,5 mg/g de glucano), Multifect 15 mg/g de xilano	89	53	95	92
Palha de cana de açúcar, carga de sólidos 26%, 188 °C, 1 h, EtOH a 70% (v/v), 14% de MA, 1% de S (peso/peso de biomassa), sacarificação 144 h, 14% de sólidos + 0,5% de PEG 2000 (peso/peso de biomassa)	95	67
Álamo amarelo, carga de sólidos de 26%, 200 °C, 1 h, EtOH a 70% (v/v), 14%	90	60	100	91

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Amostra	Glicose monomérica (% rendimento teórico)	Xilose monomérica (% rendimento teórico)	Monômero de glicose + oligômero solúvel (% rendimento teórico)	Monômero de xilose + oligômero solúvel (% rendimento teórico)
de MA, 1% de S (peso/peso de biomassa, sacarificação 168 h, 14% de sólidos, + 0,5% PEG 2000 (peso/peso de biomassa)

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Claims (18)

1. Reivindicações

   1. MÉTODO PARA PRODUÇÃO DE BIOMASSA ENRIQUECIDA COM CARBOIDRATOS, caracterizado por compreender:

   (a) fornecimento de biomassa lignocelulósica que compreende lignina;

   (b) suspensão da biomassa de (a) em uma solução solvente orgânica que compreende água, etanol e alquilaminas em uma concentração de até 20% em peso de biomassa seca selecionadas a partir do grupo que consiste em metilamina e dimetilamina, sob condições de pH básico (acima de 7), por meio da qual é formada uma suspensão biomassa-solvente, em que a solução solvente orgânica para a biomassa possui uma razão em peso de 10 para 1 a 0,5 para 1 e em que o pH da suspensão biomassa-solvente é igual ou maior do que o valor pKa da alquilamina;

   (c) aquecimento da suspensão biomassa-solvente até uma temperatura de 100°C a 220°C por 5 minutos a 5 horas, por meio da qual a lignina é fragmentada e é dissolvida na suspensão; e (d) filtragem do líquido livre, por meio da qual a lignina dissolvida é removida e por meio da qual a biomassa enriquecida com carboidratos é produzida.
2. 2. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por compreender adicionalmente:

   (e) lavagem da biomassa produzida na etapa (d) com uma solução solvente que compreende etanol, água, ou combinação dos mesmos.
3. 3. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por compreender adicionalmente:

   (f) lavagem da biomassa produzida na etapa (e) com água para produzir uma biomassa enriquecida com carboidratos facilmente sacarificável.
4. 4. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado

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   2/3 por compreender adicionalmente a secagem da biomassa produzida na etapa (e) para produzir uma biomassa enriquecida com carboidratos facilmente sacarificável.
5. 5. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 3, caracterizado por compreender adicionalmente a repetição das etapas (e) e (f) uma ou mais vezes.
6. 6. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pela etapa de aquecimento de (c) ocorrer em um recipiente de pressão vedado.
7. 7. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pela etapa de filtragem de (d) ocorrer sob pressão.
8. 8. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pela alquilamina ser metilamina.
9. 9. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pela suspensão aquecida da etapa (c) ser resfriada à temperatura ambiente antes da filtragem na etapa (d).
10. 10. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por compreender adicionalmente a remoção do solvente da biomassa filtrada e lavada após a etapa (e) para produzir uma biomassa enriquecida com carboidratos facilmente sacarificável.
11. 11. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 3, 4 ou 10, caracterizado por compreender adicionalmente a sacarificação da biomassa enriquecida com carboidratos facilmente sacarificável com um conjunto de enzimas por meio dos quais são produzidos açúcares fermentáveis.
12. 12. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por compreender o contato da dita biomassa com um conjunto de enzimas após a lavagem com água na etapa (f).
13. 13. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado por compreender a fermentação dos açúcares para produzir um produto alvo.

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    3/3
14. 14. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pela biomassa ser selecionada a partir do grupo que consiste em switchgrass, resíduo de papel, lama de fabricação de papel, fibra de milho, espigas de milho, cascas de milho, forragem de milho, gramas, trigo, palha de trigo, feno, cevada, palha de cevada, palha de arroz, bagaço de cana de açúcar, palha de cana de açúcar, álamo amarelo, sorgo, soja, componentes obtidos por meio do processamento de grãos, árvores, ramos, raízes, folhas, lascas de madeira, serragem, arbustos e moitas, legumes, frutos, flores, esterco animal e combinações dos mesmos.
15. 15. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por compreender adicionalmente a etapa (e) lavagem da biomassa residual com solvente orgânico, por meio da qual é produzida biomassa enriquecida com carboidratos substancialmente livre de lignina.
16. 16. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo solvente da etapa (e) poder conter água.
17. 17. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pela temperatura da etapa (c) ser de 165°C a 195°C.
18. 18. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pela etapa (c) ser realizada em um período de 60 minutos a 140 minutos.

    Petição 870190013392, de 08/02/2019, pág. 80/154