BRPI0907026A2 - vacinas de influenza canina - Google Patents

Abstract

VACINAS DE INFLUENZA CANINA A presente invenção engloba vacinas de influenza, em particular vacinas de influenza canina. A vacina pode ser uma vacina de poxvírus recombinante ou uma vacina inativada. A invenção também engloba vetores poxvírus recombinantes codificando e expressando antígenos de influenza, epítopos ou imunógenos os quais podem ser usados para proteger animais, em particular cães, contra influenza.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para: “VACINAS i DE INFLUENZA CANINA”. à. INCORPORAÇÃO POR REFERÊNCIA Este pedido reivindica prioridade ao pedido de patente americano Nº de Série 12/020,656, depositado no dia 28 de janeiro de 2008, o qual é um pedido de continuação em parte do pedido de patente americano Nº de Série 11/264,622, depositado no dia 1º de novembro de 2005, o qual é uma continuação em parte do pedido de patente americano Nº de Série 11/211,983, depositado no dia 25 de agosto de 2005, os quais são ambos aqui incorporados por referência.

Os pedidos precedentes e todos os documentos citados neles ou durante o seu processamento (“documentos citados no pedido”) e todos os documentos citados ou referenciados nos documentos citados no pedido, e todos os documentos citados ou referenciados aqui (“documentos aqui citados”), e todos os documentos citados Ou referenciados nos documentos aqui citados, juntamente com quaisquer instruções, descrições, especificações de produto e encartes de produtos do fabricante para quaisquer produtos aqui mencionados, ou em qualquer documento aqui incorporado por referência, são por meio deste documento incorporados por referência, e podem ser utilizados na prática da invenção.

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CAMPO DA INVENÇÃO i A presente invenção engloba vacinas de influenza, : particularmente vacinas de influenza canina. A vacina pode ser uma vacina poxvírus recombinante ou Uma vacina inativada.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO Doenças respiratórias que lembram influenza têm infectado milhares de cães nos Estado Unidos. Surtos recorrentes de doença respiratória severa caracterizada por tosse e febre têm ocorrido em galgo em canis de corrida. Descriçãos patológicas incluíam hemorragia pulmonar e plural severa, traqueíte, bronquite e bronquiolite e broncopneumonia hiperplásica erosiva de aguda a subaguda. Em 2004, oito galgos em Jacksonville, Flórida, foram mortos por um vírus influenza equino que saltou a barreira de espécie dos cavalos para os cães. Influenza equina é uma doença de cavalos, € O vírus está no mesmo grupo dos vírus que causam gripe em pessoas. A doença está presente em populações de cavalos pela Europa, América do Norte e partes da Ásia, com cavalo tipicamente desenvolvendo uma febre e tosse seca &e intermitente. Nos estágios iniciais da doença, os cavalos relutam em comer ou beber durante vários dias, mas geralmente se recuperam em duas ou três semanas.

Na 3 os subtipos H3N8 de influenza equina foram i anteriormente isolados dos pulmões de dois cães da Flórida s e um cão do Texas o qual morreu da infecção.

A análise de sequência genética e as comparações filogenéticas determinaram que todos os três isolados caninos estavam intimamente relacionados e evoluíram de cepas contemporâneas de influenza equina H3N8. A imunoistoquímica acusou antígeno de influenza nas células epiteliais da glândula bronquial, nas células epiteliais bronquiais e bronquiolares e nos macrófagos alveolares.

A soroconversão para o vírus da influenza canina foi demonstrada por ensaios de inibição da hemaglutinação e de microneutralização.

A análise molecular e antigênica de três vírus influenza isolados dos ataques de doença respiratória severa em galgos de corrida revelou que eles eram intimamente relacionados com o vírus influenza equino H3N8 (ver, por exemplo, Crawford et al., Science. 21 de outubro de 2005; 310(5747):482-5. Epub 26 de setembro de 2005). A análise filogenética indicou que os genomas do vírus influenza canino formam um grupo monofilético, consistente com uma transferência de vírus entre espécies individuais.

As mudanças moleculares na hemaglutinina sugeriram evolução adaptativa no novo hospedeiro.

O papel etiológico do vírus

| 4 na doença respiratória foi sustentado pela associação NS temporal dos títulos de anticorpo de rinsagem e pelos f estudos de inoculação experimentais. A expansão geográfica da infecção e sua persistência por vários anos indica a transmissão eficiente do vírus influenza canino entre galgos. Evidência de infecção em cães de estimação sugere que esta infecção pode também se tornar enzoótica nesta população. Em 2005, uma forma modificada da gripe aviária (vírus H3N8) foi reportada como tendo —" matado galgos em Massachussets. Deste modo, há uma necessidade por uma vacina eficaz contra influenza em caninos. Citação ou identificação de qualquer documento neste pedido não é uma aceitação de que tal documento representa como técnica anterior para a presente invenção.

RESUMO DA INVENÇÃO A presente invenção engloba vacinas de influenza canina, as quais podem ser uma vacina de influenza canina recombinante ou uma vacina de influenza canina inativada. Em uma modalidade em que a vacina de influenza canina é uma vacina recombinante, vantajosamente o vetor é um vetor de expressão avipox o qual pode compreender um polinucleotídeo “codificando um antígeno, epítopo "ou

| 5 imunógeno do influenza. O antígeno, epítopo ou imunógeno do influenza pode ser uma hemaglutinina, proteína de matriz, i neuraminidase, proteína não estrutural, nucleoproteína, polimerase ou qualquer fragmento seu.

Em uma modalidade vantajosa, o antígeno, epítopo Ou imunógeno de influenza canina é derivado de um canino infectado com influenza. Por exemplo, mas sem limitação, oO vírus influenza pode ser isolado da lavagem broncoalveolar e/ou dos tecidos pulmonares do vírus influenza infectando o cão pode ser feito por experimentação rotineira por uma pessoa normalmente versada na técnica.

O antígeno, epítopo ou imunógeno de influenza pode ser isolado de influenza equina. A influenza equina pode ser uma influenza equina de Ohio, influenza equina de Kentucky ou uma influenza equina de Newmarket.

O vetor de expressão avipox pode ser um vetor de expressão avipox atenuado. Em uma modalidade, o vetor de expressão avipox pode ser um vetor canaripox, vantajosamente ALVAC. O antígeno, epítopo ou imunógeno de influenza pode ser uma hemaglutinina, como H3. O vetor canarypox pode ser CP 2242, CP1529 ou CP1533 ou expressando o H3 de um isolado de influenza canino vCP2328.

A presente invenção também engloba uma vacina de influenza inativada. A vacina de influenza inativada pode

| 6 ser uma influenza canina inativada. Em outra modalidade, a i vacina de influenza inativada pode ser uma influenza á equina, vantajosamente uma influenza equina de Ohio influenza equina de Kentucky ou uma influenza equina de Newnarket. A vacina pode ser inativada com formalina ou beta-propiolactona.

A invenção também se refere ao método de eliciar uma resposta imune contra influenza em um canino, o que pode compreender a administração de uma formulação compreendendo ' qualquer uma das vacinas influenza recombinantes acima ou vacina inativada e um carreador, excipiente ou veículo farmaceuticamente ou veterinariamente aceitável em uma quantidade eficaz para eliciar uma resposta imune. Em uma modalidade vantajosa, um adjuvante pode ser adicionado. O adjuvante pode ser hidróxido de alumínio, fosfato de alumínio, um carbômero ou uma emulsão óleo-em-água, &e opcionalmente pode compreender CpG. Vantajosamente, a administração pode ser subcutânea ou intramuscular.

A invenção ainda se refere ao método de indução de uma resposta imune contra influenza em um canino, a qual pode compreender a administração de uma formulação compreendendo qualquer uma dentre a vacina de influenza recombinante ou vacina inativada acima e um carreador, excipiente Ou veículo farmaceuticamente ou veterinariamente aceitável em i FT uma quantidade eficaz de indução de uma resposta imune.

Em uma modalidade vantajosa, um adjuvante pode ser adicionado. ' O adjuvante pode ser hidróxido e alumínio, fosfato de alumínio, um carbômero ou uma emulsão óleo-em-água, complexo de imunoestimulação (ISCOM) e opcionalmente pode compreender CpG.

Vantajosamente, a administração pode ser subcutânea ou intramuscular.

A invenção ainda engloba um kit para efetuar um método de eliciar ou induzir uma resposta imune, a qual pode compreender qualquer uma das vacinas de influenza recombinantes ou vacinas inativadas e instruções para efetuar o método.

É verificado que nesta descrição e particularmente nas reivindicações e/ou parágrafos, termos como “compreende”, “compreendido”, “compreendendo” e semelhantes podem ter o significado atribuído a eles na lei de patentes americana; i por exemplo, eles podem significar “inclui”, “incluído”, “incluindo” e semelhantes; e que termos como “consistindo essencialmente de” e “consiste essencialmente em” têm o significado atribuído a eles na lei de patentes americana, por exemplo,eles permitem elementos não explicitamente citados, mas exclui elementos que são encontrados na técnica anterior ou que afetam uma característica básica ou nova da invenção.

| | 8 Essas e outras modalidades são reveladas ou são óbvias de e englobadas pela Descrição Detalhada a seguir. : BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A descrição detalhada a seguir, dada a título de exemplo, mas não intencionada a limitar a invenção somente às modalidades específicas descritas, pode ser mais bem compreendida juntamente com os desenhos associados, nos quais: A Figura 1 ilustra a sequência da inserção em PJTOO4 (SEQ ID Nº 1);

A Figura 2 ilustra a sequência da inserção em PJTOOS (SEQ ID Nº 2);

A Figura 3 ilustra uma comparação da sequência de aminoácidos da cepa EIV Ohio 03 HA com aquela da cepa New

Market H3 HA (SEQ ID NOs: 3 e 4);

A Figura 4A ilustra uma construção de um plasmídeo doador ALVAC para a geração de um EIV H3 HA otimizado de códon de expressão recombinante ALVAC (Ohio 03);

A Figura 4B ilustra EIV H3 HA sintética - pALVAC cs

H6b, pILISTL.1;

A Figura 5A ilustra uma sequência de aminoácidos prevista do(s) produto(s): EIV H3 HA;

A Figura 5B ilustra uma sequência de nucleotídeos dos braços e inserção com tradução;

| 9 A Figura 6 ilustra uma análise de Western blot de | vCP2242. Uma diluição 1/1.000 de anticorpo anti-EIV ' agrupado foi usado para a análise. Raia 1: 5 1uL de marcador de proteína Fermentas Prestain, raia 2: 15 ul de pélete de célula ALVAC, raia 3: 15 ÀuLl de pélete de célula vCP2242, raia 4: 15 uL de pélete de célula vCP2242, raia 5: 15 4L de pélete de célula vCP1533, raia 6: espaço, raia 7: 40 ul de sobrenadante ALVAC, raia 8: 40 1uL de vCP2242.sobrenadante, raia 9: 40 ul de vCP2242.sobrenadante e raia 10: 40 ul de sobrenadante vCP1533.

A Figura 7 ilustra as respostas do anticorpo HI ao vírus da influenza canina (CIV) em cães vacinados com vacinas do vírus influenza equina vetorizadas com canarypox (EIV) expressando ou o gene da hemaglutinina de A/equino/Kentucky/94 (vCP1529) ou o gene da hemaglutinina d A2/equino/Ohio/03 vCP2242). vCP2242 foi administrado pela via subcutânea (SC na Figura 7) ou pela via transdérmica (TD na Figura 7), enquanto que vCP1529 foi administrado subcutaneamente (SC na Figura 7).

A Figura 8 ilustra os títulos virais médions encontrados nos swabs nasais em animais de controle e em animais vacinados após o desafio intranasal com influenza

| 10 A/canina/NY/110659. Dados - logl10 dos título de isolamento do vírus em células MDCK. ' A Figura 9 ilustra as temperaturas corporais médias dos cães de controle e dos cães vacinados subcutaneamente duas vezes em um intervalo de 21 dias com o gene da hemaglutinina de A2/equino/Ohio/03 (vCP2242) seguido pelo desafio no dia 43 com isolado de CIV-NYO5S (influenza A/canino/NY/110659). A Figura 10 ilustra as temperaturas corporais médias dos cães de controle (CON) e dos cães vacinados subcutaneamente duas vezes em um intervalo de 21 dias com o gene da hemaglutinina de A2/equino/Ohio/03 (vCP2242) (VAC) seguido pelo desafio no dia 43 com isolado de CIV-NYOS5 nos dias 42, 44 e 45. Esta figura é um box plot que tem a média (simbolizada como um +) e a mediana (linha horizontal), o 25º e o 75º percentil (embaixo e em cima do box), observações mínima e máxima (bigodes) e outliers (pequenos quadrados). : A Figura 11 ilustra as respostas ao anticorpo HI ao antígeno CIV HA de A2/equino/Ohio/03 (vCP2242) seguido pelo desafio no dia 43 com isolado de CIV-NYOS em três semanas após a segunda vacinação e duas semanas após o desafio (Vac57) e no cães de controle em duas semanas após oO desafio (Cont57).

| 11 A Figura 12 ilustra a resposta imunoprotetora de i vCP2242 conforme caracterizado pelo tempo reduzido de ' cadência di vírus na cavidade nasal dos cães vacinados subcutaneamente duas vezes em um intervalo de 21 dias com o gene da hemaglutinina de A2/equino/Ohio/03 (vCP2242) seguido pelo desafio no dia 43 com isolado de CIV-NYO5S em comparação com os cães de controle. A Figura 13 ilustra a resposta imunoprotetora de vCP2242 conforme caracterizado pela duração reduzida de cadência viral na cavidade nasal dos cães vacinados subcutaneamente duas vezes em um intervalo de 21 dias com o gene da hemaglutinina de A2/equino/Ohio/03 (vCP2242) seguido pelo desafio no dia 43 com isolado de CIV-NYO5 em comparação com os cães de controle.

DESCRIÇÃO DETALHADA A presente invenção se baseia, em parte, nos estudos do requerente demonstrando que HA influenza equino expressando canarypox recombinante é imunogênico em cães. A presente invenção engloba qualquer antígeno, epítopo ou imunógeno de influenza que elicie uma resposta imunogênica em um animal, vantajosamente em um vertebrado, mais vantajosamente em um cão. O antígeno, epítopo Ou imunógeno de influenza pode ser qualquer antígeno, epítopo ou imunógeno de influenza tal como, porém sem se limitar, a

| 12 uma proteína, peptídeo ou fragmento seu, que elicie, induza i ou estimule uma resposta em um animal, vantajosamente em um ' vertebrado, mais vantajosamente em um cão. Em uma modalidade vantajosa, o antígeno, epítopo ou imunógeno de influenza canino é derivado de um canino infectado com influenza. Por exemplo, mas sem limitação, o vírus influenza pode ser isolado da lavagem broncoalveolar e/ou tecidos pulmonares de um cão afetado. O isolamento e caracterização da sequência de nucleotídeos do influenza infectando o cão pode ser feito por experimentação rotineira por uma pessoa normalmente versada na técnica.

Em outra modalidade vantajosa, o influenza canino, antígeno, epítopo ou imunógeno pode ser derivado de um equino infectado com influenza, ou uma cepa de influenza equina. Vantajosamente, a cepa de influenza equina é um influenza equino de Ohio, cepa de influenza equino de Kentucky ou uma cepa de influenza equino de Newmarket. O antígeno, epítopo ou imunógeno de influenza canino pode ser determinado por uma pessoa normalmente versada na técnica das sequências de nucleotídeo dos Exemplos 4 e 5. Vantajosamente, o antígeno e influenza canino, epítopo ou imunógeno é uma hemaglutinina (HA) (por exemplo, precursor HA, Hl, H2, proteína, proteína de matriz (por exemplo, proteína de matriz Ml ou M2) neuraminidase, proteína não

| | 13 estrutural (NS) (por exemplo, NSl ou NS2), nucleoproteína | (NP) e polimerase (por exemplo, PA polimerase, PBl

: polimerase 1 ou PB2 polimerase 2). Exemplos de cepas de influenza equina de Kentucky que podem ser usadas nos métodos da presente invenção incluem, mas não estão limitadas, às cepas de influenza equina A/ep/Kentucky/98 (ver, por exemplo, Crouch et al, Vaccine. 2 de dezembro de 2004; 23(3): 418-25), A/Equi 2 (Kentucky 81) (ver, por exemplo, Short et al., J Vet Pharmacol Ther.

Dezembro de 1986; 9(4):426-32, Homer & Ledgard, N Z Vet JJ.

Dezembro de 1988; 36(4):205-6), A/equino/Kentucky/1/81 (Eq/Ky) (ver, por exemplo, Breathnach et al., Vet Immunol Immunopathol.

Abril de 2004; 98(3-4): 127-36), A/Equino/Kentucky/1/81 (H3N8) (ver, por exemplo, Olsen et al., Vaccine.

Julho de 1997; 15(10):1149-56, Morley et al.

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Junho de 1995; 45(1):81-92, Ozaki et al., Vet Microbiol. 20 de setembro de 2001; 82(2):111-9, Sugiura et al., J Virol Methods.

Outubro de 2001; 98(1): 1-8, ver, por exemplo, Sugiura et al., J Virol Methods.

Outubro de 2001; 98(1): 1-8, Goto et al., J Vet Med Sci.

Fevereiro de 1993; 55(1): 33-7, Goto et al., J Vet Med Sci.

Fevereiro de 1993; 55(1):33-7), A/Equino/Kentucky/1/91 (H3NB) (ver, por exemplo, Youngner et al., Am J Vet Res.

Agosto de 2001; 62(8): 1290-4), A/Equino/Kentucky/1277/90 (Eq/Kentucky)

| 14 (ver, por exemplo, Webster & Thomas, Vaccine. 1993; 11(10) :987-93), A/Equino/Kentucky/2/91 (H3N8) (ver, por ' exemplo, Donofrio et al., J Vet Diagn Invest. Janeiro de 1994; 6(1):39-43), A/Equino/Kentucky/79 (H3N8) (ver, por exemplo, Donofrio et al., J Vet Diagn Invest. Janeiro de 1994; 6(1):39-43), A/equino/Kentucky/81 (ver, por exemplo, Sugiura et al., J Virol Methods. Outubro de 2001; 98(1): 1- 8), A/equino/Kentucky/91 (H3NB8) (ver, por exemplo, Gross et al, Equine Vet J. Novembro de 1998; 30(6):489-97), A/equino-2/Kentucky/95 (H3N8) (ver, por exemplo, Heldens et al., Vet J. Março de 2004; 167(2): 150-7) e A/equino- 2/Kentucky/98 (ver, por exemplo, Chambers et al., Equine Vet J. Novembro de 2001; 33(7):630-6), as descriçãos dos quais sendo aqui incorporadas por referência nas suas totalidades.

Exemplos das cepas de influenza equina Newmarket que podem ser usados nos métodos da presente invenção incluem, mas não estão limitados, às cepas de influenza equina A/ep/Newmarket/1/77 (ver, por exemplo, Lindstron et al., Arch Virol. 1998; 143(8): 1585-98), A/eq/Newmarket/5/03 (ver, por exemplo, Edlund Toulemonde et al., Vet Rec. 19 de março de 2005; 156(12): 367-71), A/Equi 2 (H3N8), Newmarket 1/93 (ver, por exemplo, Mohler et al., Biotechnol Bioeng. 5 de abril de 2005; 90(1): 46-58, Nayak et al., J Chromatogr

| 15

B Analyt Technol Biomed Life Sci. 8 de julho de 2005), A/equi-2/Newmarket-1/93 (ver, por exemplo, Heldens et al., ' J Immunol Methods. 1º de junho de 2002; 264(1-2): 11-7), A/equino/Newnmarket/2/93 (ver, por exemplo, Wattrang et al., Viral Immunol. 2003; 16(1): 57-67), A/equino/Newmarket/79 (H3N8) (ver, por exemplo, Duhaut & Dimmock, Virology. 30 de setembro de 2000; 275(2):278-85, Noble & Dimmock, J Gen Virol.

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Julho de 1989; 21(3-4):327-37, Hannant et al., Vet Microbiol.

Abril de 1989; 19(4):293-303, Hannant et al., Vet Rec. 6 de fevereiro de 1988; 122(6):125-8, Richards et al., Vet Immunol Immunopathol.

Junho de 1992; 33(1-2): 129-43, Heldens et al., Vet J.

Março de 2004; 167(2):150-7), A/equino/Newmarket/1/77 (H7N7) (ver, por exemplo, Goto et al., J Vet Med Sci.

Fevereiro de 1993; 55(1):33-7, Sugiura et al., J Virol Methods.

Outubro de 2001; 98(1): 1-8, Sugiura et al., J Virol Methods.

Outubro de 2001; 98(1):1- 8) e A/equino-2/Newmarket-2/93 (ver, por exemplo, Heldens et al., Vet J.

Março de 2004; 167(2):150-7), as descriçãos dos quais sendo incorporadas por referência nas Suas totalidades.

o 16 A presente invenção também engloba outros vírus de influenza equinos, tais como, porém sem se limitar, ao ' vírus de influenza A/eq/Miami/63 (H3N8) (ver, por exemplo, van Maanen et al., Vet Microbiol. 10 de junho de 2003; 93(4):291-306), A/equi 1 (cepa de Praga) (ver, por exemplo, Homer & Ledgard, N Z Vet J.

Dezembro de 1988; 36(4) :205-6, Short et al., J Vet Pharmacol Ther.

Dezembro de 1986; 9(4) :426-32), A/Equi 2 (Miami) (ver, por exemplo, Short et al., J Vet Pharmacol Ther.

Dezembro de 1986; 9(4):426-32), A/equi-l/Prague/56 (Pr/56) (ver, por exemplo, Heldens et al., J Immunol Methods. 1º de junho de 2002; 264(1-2):11- 7), A/equi-2/Suffolk/89 (Suf/89) (ver, por exemplo, Heldens et al., J Immunol Methods. 1º de junho de 2002; 264(1- 2):11-7), A/equino 2/Sussex/89 (H3N8) (ver, por exemplo, Mumford et al., Vet Rec. 12 de fevereiro de 1994; 134 (7): 158-62), A/equino/Sussex/89 (ver, por exemplo, Wattrang et al., Viral Immunol. 2003;16(1): 57-67), A/equino-2/Saskatoon/90 (ver, por exemplo, Chambers et al., Equine vet o.

Novembro de 2001; 33(7) : 630-6), A/Equino/Prague/ 1/56 (H7N7) (ver, por exemplo, Donofrio et al, J Vet Diagn Invest.

Janeiro de 1994; 6(1): 39-43, Morley et al.

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Junho de 1995; 45(1):81-92), A/equino/Miami/1/63 (H3N8) (ver, por exemplo, Morley et al.

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Junho de 1995; 45(1): 81-92, Ozaki et al.,

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Junho de 1988; 100(3):501-10, Donofrio et al., J Vet Diagn Invest.

Janeiro de 1994; 6(1): 39-43, Mumford et al., J Hyg (Lond). Junho de 1983; 90(3): 385-95), A/Aichi/2/68 (H3N2) (ver, por exemplo, Ozaki et al., Vet Microbiol. 20 de setembro de 2001; 82(2):111-9), A/equino/Tokyo/2/71 (H3N8) (ver, por exemplo, Goto et al., J Vet Med Sci.

Fevereiro de 1993; 55(1):33-7), A/eq/LaPlata/1/88 (ver, por exemplo, Lindstrom et al., Arch Virol. 1998; 143(8): 1585-598), A/Equino/Jilin/1/89 (Eq/Jilin) (ver, por exemplo, Webster & Thomas, Vaccine. 1993; 11(10): 987-93), A/Equino/Alasca/1/91 (H3N8) (ver, por exemplo, Webster & Thomas, Vaccine. 1993; 11(10):987- 93), A/equino/Saskatoon/1/91 (H3NB) (ver, por exemplo, Morley et al.

Vet Microbiol.

Junho de 1995; 45(1): 81-92), A/equino/Roma/5/91 (H3N8) (ver,por exemplo, Sugiura et al., J Virol Methods.

Outubro de 2001; 98(1):1-8), A/equino/La Plata/1/93 (H3N8) (ver, por exemplo, Ozaki et al., Vet Microbiol. 20 de setembro de 2001; 82(2): 111-9), A/equino/La Plata/1/93 (LP/93) (ver, por exemplo, Sugiura et al., J Virol Methods.

Outubro de 2001; 98(1): 1-8), A/eq/Holanda/1/95 (H3N8) (ver, por exemplo, van Maanen et al., Vet Microbiol. 10 de junho de 2003; 93(4):291-306) e

| 18 . A/eq/Holanda/2/95 (H3N8) (ver, por exemplo, van Maanen et al., Vet Microbiol. 10 de junho de 2003; 93(4): 291-306), as descriçãos dos quais sendo aqui incorporadas por referência nas suas totalidades.

Em outra modalidade vantajosa, a influenza canina, antígeno, epítopo ou imunógeno pode ser derivado de um equino infectado com influenza ou uma cepa de influenza equina derivada de um isolado recente.

O antígeno, epítopo ou imunógeno de influenza pode ser também isolado de qualquer cepa influenza tal como, porém sem se limitar, ao vírus influenza H5Nl aviária, A/Hong Kong/156/97 (A/HK/156/97) (ver, por exemplo, Leneva et al., Antimicrob Agents Chemother. Abril de 2001; 45(4): 1216- 24), cepa de influenza avian H7N1l aviária (ver, por exemplo, Foni et al., New Microbiol. Janeiro de 2005; 28 (1) :31-5), vírus influenza HO9N2 aviário (ver, por exemplo, Leneva et al., Antimicrob Agents Chemother. Abril de 2001; 45(4): 1216-24), vírus influenza aviário A/Galinha/HK/G9/97 (H9N2) (ver, por exemplo, Leneva et al., Antimicrob Agents Chemother. Abril de 2001; 45(4): 1216- 24), vírus influenza aviário A/Quail/HK/G1/97 (H9N2) (ver, por exemplo, Leneva et al., Antimicrob Agents Chemother. Abril de 2001; 45(4): 1216-24), vírus influenza aviário A/Teal/HK/W312/97 (H6N1l) (ver, por exemplo, Leneva et al.,

| 19 Antimicrob Agents Chemother.

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Maio de 1997; 71(5): 3385-90), as descriçãos dos quais sendo incorporadas por referência.

i Pá Conforme aqui utilizado, o termo “antígeno” ou “imunógeno” significa uma substância que induz uma resposta . imunológica específica em um animal hospedeiro. O antígeno pode compreender um organismo como um todo, morto, atenuado ou vivo; uma subunidade ou porção de um organismo; um vetor recombinante contendo uma inserção com propriedades imunogênicas; uma peça ou fragmento de DNA capaz de induzir uma resposta imune na apresentação a um animal hospedeiro; uma proteína, um polipeptídeo, um peptídeo, um epítopo, um hapteno ou qualquer combinação desses. Alternativamente, o imunógeno ou antígeno pode compreender uma toxina ou antitoxina.

O termo “proteína ou peptídeo imunogênico”, conforme aqui utilizado, também se refere e inclui peptídeos e polipeptídeos que são imunologicamente ativos no sentido de que uma vez administrados ao hospedeiro, é capaz de provocar uma resposta imune do tipo humoral e/ou celular direcionada contra a proteína. Preferivelmente, o fragmento de proteína é tal que ele tem substancialmente a mesma atividade imunológica que a proteína total. Deste modo, um fragmento de proteína de acordo com à invenção compreende ou consiste essencialmente em ou consiste em pelo menos um epítopo ou determinante antigênico. O termo epítopo se refere a um sítio de proteína capaz de induzir uma reação

| 26 imune do tipo humoral (células B) e/ou do tipo celular

(células T). |

7 O termo “proteína ou peptídeo imunogênico” ainda | contempla eliminações, adições e substituições à sequência, | contanto que as funções do polipeptídeo produzam uma | resposta imunológica conforme aqui definidas.

Sob este | aspecto, substituições particularmente preferidas serão | geralmente conservativas por natureza, por exemplo, aquelas | substituições que ocorrem em uma família de aminoácidos. |

|

Por exemplo, aminoácidos são geralmente divididos em quatro famílias: (1) ácidos - aspartato e glutamato; (2) básicos - lisina, arginina, histidina; (3) não polares - alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptofano; e (4) polar descarregado - glicina,

asparagina, glutamina, cistina, serina, treonina, tirosina.

Fenilalanina, triptofano e tirosina são algumas vezes classificados como aminoácidos aromáticos.

É aceitavelmente previsível que uma substituição isolada de leucina com isoleucina ou valina, ou vice-versa; um aspartato com um glutamato ou vice-versa; uma treonina com uma serina ou vice-versa; ou uma substituição conservativa similar de um aminoácido com um aminoácido estruturalmente relacionado, não tem um efeito principal na atividade biológica.

Proteínas com substancialmente a mesma sequência de aminoácidos que a molécula de referência, porém possuindo substituições de aminoácidos menores que não afetam ' substancialmente a imunogenicidade da proteína estão, deste modo, dentro da definição do polipeptídeo de referência.

O termo “epítopo” se refere ao sítio em um antígeno ou hapteno ao qual as células B específicas e/ou células T respondem. O termo também é usado intercambiavelmente com “determinante antigênico”, ou “sítio determinante antigênico”. Anticorpos que reconhecem o mesmo epítopo podem ser identificados em um imunoensaio simples, mostrando a capacidade de um anticorpo de bloquear a ligação de outro anticorpo a um antígeno alvo.

Uma “resposta imunológica” a uma composição ou vacina é o desenvolvimento no hospedeiro de uma resposta imune celular e/ou mediada por anticorpo a uma composição Ou vacina de interesse. Comumente, uma “resposta imunológica” inclui, mas não está limitada, a um ou mais dos seguintes efeitos: a produção dos anticorpos, células B, células T auxiliadoras e/ou células T citotóxicas, direcionadas especificamente a um antígeno ou antígenos incluídos na composição ou vacina de interesse. Preferivelmente, o hospedeiro irá apresentar ou uma reposta imunológica terapêutica ou protetora de modo que a resistência à novas infecções será aumentada, e/ou à severidade clínica da

' , 28 doença reduzida. Tal proteção será demonstrada por uma ' redução ou falta de sintomas normalmente exibidos por um * hospedeiro infectado, um tempo de recuperação mais rápido e/ou um título viral reduzido no hospedeiro infectado.

Os termos proteína ou polipeptídeo “imunogênico”, conforme aqui utilizados, se referem a uma sequência de aminoácidos a qual elicia uma resposta imunológica conforme aqui descrito. Uma proteína ou polipeptídeo “imunogênico”, conforme aqui utilizado, inclui a sequência de comprimento total da proteína, seus análogos ou fragmentos imunogênicos seus. Por “fragmento imunogênico” se entende um fragmento de uma proteína o qual inclui um ou mais epítopos e, deste modo, elicia a resposta imunológica descrita acima. Tais fragmentos podem ser identificados usando qualquer quantidade de técnicas de mapeamento de epítopos bem conhecidos na técnica. Ver, por exemplo, Epitope Mapping Protocols em Methods in Molecular Biology, Vol. 66 (Glenn E. Morris, Ed., 1996) Humana Press, Totowa, N.J. Por exemplo, epítopos lineares podem ser determinados, por exemplo, pela síntese concomitante de grandes quantidades de peptídeos em suportes sólidos, os peptídeo correspondendo às porções da molécula de proteína, e reagindo os peptídeos com os anticorpos enquanto O peptídeos ainda estão ligados aos suportes. Tais técnicas

. 29 são conhecidas na arte e descritas por exemplo, na Patente Americana Nº 4.708.671; Geysen et al. (1984) Proc. Natl. * Acad. Sci. USA 81: 3998-4002; Geysen et al. (1986) Molec. Immunol. 23: 709-715, todas aqui incorporadas por referência nas suas totalidades. Semelhantemente, epítopos conformacionais são prontamente identificados pela determinação da conformação espacial dos aminoácidos como, por exemplo, cristalografia de raio-X e ressonância magnética nuclear bidimensional. Ver, por exemplo, Epitope Mapping Protocols, supra. Métodos especialmente aplicáveis às proteínas de T. parva são totalmente descritos no Pedido PCT Nº de Série PCT/US2004/022605, aqui incorporado por referência na sua totalidade.

Antígenos sintéticos são também incluídos na definição, por exemplo, de poliepítopos, epítopos flanqueadores e ouros antígenos recombinantes ou sinteticamente derivados. Ver, por exemplo, Bergmann et al. (1993) Eur. J. Immunol. 23: 2777-2781; Bergmann et al. (1996) J. Immunol. 157: 3242-3249; Suhrbier, A. (1997) Immunol, e Cell Biol. 75:402-408; Gardner et al. (1998) 12º Conferência Mundial de AIDS, Genebra, Suíça, 28 de junho-3 de julho de 1998. Fragmentos imunogênicos, para fins da presente invenção, irão geralmente incluir pelo menos cerca de 3 aminoácidos, preferivelmente pelo menos cerca de 5

| | 30 aminoácidos, mais preferivelmente pelo menos cerca de 10 a 15 aminoácidos, e mais preferivelmente 25 ou mais aminoácidos da molécula.

Não há limite superior crítico ao comprimento do fragmento, os quais poderiam compreender quase todo o comprimento da sequência de proteína, ou mesmo uma proteína de fusão compreendendo pelo menos um epítopo da proteína.

Deste modo, uma estrutura mínima de um polinucleotídeo expressando um epítopo é que compreenda ou consista essencialmente de ou consista de nucleotídoes para codificar um epítopo ou determinante antigênico de uma proteína ou poliproteína de influenza.

Um polinucleotídeo codificando um fragmento da proteína ou poliproteína total, mais vantajosamente, compreende ou consiste essencialmente em ou consiste em um mínimo de 21 nucleotídeos, vantajosamente de pelo menos 42 nucleotídeos,e preferivelmente de pelo menos 57, 87 ou 150 nucleotídeos consecutivos ou contíguos da sequência codificando a proteína ou poliproteina total.

Os procedimentos de determinação de epítopo, como a geração de bibliotecas de peptídeos sobreponíveis (Hemmer B. et al., Immunology Today, 1998, 19 (4), 163-168), Pepscan (Geysen et al., (1984) Proc.

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Peptide Synthesis Kits de | Chiron) e algoritmos (De Groot A. et al., (1999) Nature Biotechnology, 17, 533-561), e no Pedido PCT Nº de Série PCT/US2004/022605, todos os quais sendo aqui incorporado por referência nas suas totalidades, podem ser usados na prática da invenção, sem experimentação demasiada.

Outros documentos aqui citados ou incorporados também podem ser consultado para os métodos para determinar epítopos de um imunógeno ou antígeno e, deste modo, moléculas de ácido nucléico que codificam tais epítopos.

Um “polinucleotídeo” é uma forma polimérica de nucleotídeos de qualquer comprimento, o qual contém desoxirribonucleotídeos, ribonucleoídeos e análogo em qualquer combinação.

Polinucleotídeos podem ter estrutura tridimensional, e podem efetuar qualquer função, conhecida ou desconhecida.

O termo “polinucleotídeo” inclui moléculas de hélice de fita simples ou dupla e tripla.

A não ser que seja especificado ou requerido de outra forma, qualquer modalidade da invenção aqui descrita que seja um polinucleotídeo engloba tanto a forma de fita dupla e cada uma das duas formas complementares conhecidas ou previstas

| ! 32 . para compor à forma de fita dupla da molécula de DNA, RNA ou híbrida. ' os seguintes são exemplos não limitativos de polinucleotídeos: um gene ou fragmento de gene, éxons, Ss íntrons, RNAm, RNAt, RNAr, ribozimas, DNAc, polinucleotídeos recombinantes, polinucleotídeo ramificados, plasmídeos, vetores, DNA isolado de qualquer sequência, RNA isolado de qualquer sequência, sondas e iniciadores de ácido nucléico.

Um polinucleotídeo pode compreender “nucleotídeos modificados, como nucleotídeos metilados e análogos de nucleotídeo, uracil, outros açúcares e grupos de ligação como fluorribose e tiolato, e ramificações de nucleotídeos.

A sequência dos nucleotídeos pode ser ainda modificada depois da polimerização, como por conjugação, com um componente de marcação.

Outros tipos ou modificações incluídos nesta definição são grupos protetores, a substituição de um ou mais dos nucleotídeos de ocorrência natural com um análogo, e a introdução de meio para fixar o polinucleotídeo às proteínas, íons metálicos, componentes de marcação, outros polinucleotídeos ou suporte sólido.

Os polinucleotídeos podem ser obtidos por síntese química ou derivados de um microrganismo.

A invenção compreende ainda uma fita complementar a um polinucleotídeo codificando um antígeno, epítopo —Oou

| | 33 . imunógeno de influenza. A fita complementar pode ser polimérica e de qualquer comprimento, e pode conter ' desoxirribonucleotídeos, ribonucleotídeos e análogos em qualquer combinação.

Os termos “proteína”, “peptídeo”, “polipeptídeo” e “fragmento de polipeptídeo” são usados aqui intercambiavelmente para se referir aos polímeros dos resíduos de aminoácidos de qualquer comprimento. O polímero pode ser linear ou ramificado, ele pode compreender aminoácidos modificados ou análogos de aminoácidos, e ele pode ser interrompido por porções químicas que tenham sido modificadas naturalmente ou por intervenção; por exemplo, formação de ligação dissulfeto, glicosilação, lipidação, acetilação, fosforilação ou qualquer outra manipulação ou modificação, como conjugação com um marcador ou componente bioativo.

Um polinucleotídeo ou polipeptídeo “isolado” é um o qual é substancialmente livre dos materiais com os quais ele está associado no seu ambiente natural. Por substancialmente livre, se entende pelo menos 50%, vantajosamente pelo menos 70%, mais vantajosamente pelo menos 80% e ainda mais vantajosamente pelo menos 90% livre desses materiais.

' ' 34 Reações de hibridização podem ser efetuadas sob ' condições de diferente “severidade”. Condições que aumentam ' a severidade de uma reação de hibridização são bem conhecidas. Ver, por exemplo, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", segunda edição (Sambrook et al. 1989). Exemplos de condições relevantes incluem (em ordem de crescente severidade): temperaturas de incubação de 25 ºC, 37 ºC, 50 ºC e 68 ºC; concentrações tampão de 10 x SSC, 6 x SSC, 1 x SSC, 0,1 x SSC (onde SSC é NaCl 0,15 M e tampão citrato 15 mM) e suas equivalentes usando ouros sistemas tampões; concentrações de formamida de 0%, 25%, 50% e 75%; tempos de incubação de 5 minutos a 24 horas; 1, 2 ou mais etapas de lavagem; tempos de incubação de lavagem de 1, 2 ou 15 minutos; e soluções de lavagem de 6 x SSC, 1 x SSC, 0,1 x SSC ou água deionizada.

A invenção ainda engloba polinucleotídeos codificando variantes e derivados funcionalmente equivalentes dos polipeptídeos de influenza e fragmentos funcionalmente equivalentes seus os quais podem aumentar, reduzir ou não afetar significativamente as propriedades dos polipeptídoes codificados por eles. Essas variantes, derivados e fragmentos funcionalmente equivalentes apresentam a capacidade de reter atividade influenza. Por exemplo, mudanças em uma sequência de DNA que não mude a sequência o 35 de aminoácidos codificada, assim como aquelas que resultam em substituições conservativas dos resíduos de aminoácidos, ' uma ou algumas eliminações ou adições de aminoácidos, e substituição de resíduos de aminoácidos por análogos de aminoácidos são aquelas as quais não afetarão significativamente as propriedades do polipeptídeo codificado.

Substituições de aminoácidos conservativas são glicina/alanina; valina/isoleucina;leucina; asparagina/glutamina; ácido —“aspártico/ácido glutâmico; serina/treonina/metionina; lisina/arginina; e fenilalanina/tirosina/triptofano.

Em uma modalidade, as variantes têm pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de homologia ou identidade ao polinucleotídeo ou polipeptídeo de influenza de interesse.

Para os propósitos da presente invenção, a identidade ou homologia de sequência é determinada pela comparação das sequências “quando alinhada de modo a maximizar a sobreposição e identidade, enquanto minimiza o intervalos de sequência.

Particularmente, identidade de sequência pode o 36 . ser determinada usando qualquer quantidade de algoritmos matemáticos. Um exemplo não limitativo de um algoritmo matemático usado pará comparação de duas sequências é oO algoritmo de Karlin & Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1990; 87: 2264-2268, modificado com em Karlin & Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1993;90: 5873-5877. Outro exemplo de um algoritmo matemático usado para comparação de sequências é o algoritmo de Myers & Miller, CABIOS 1988; 4: 11-17. Tal algoritmo é incorporado no programa ALIGN (versão 2.0) o qual é parte do pacote de software de alinhamento da sequência GCG. Ao utilizar o programa ALIGN para comparar sequência de aminoácidos uma tabela de resíduo de peso PAM1I20, uma penalidade de comprimento de intervalo de 12, e uma penalidade de intervalo de 4 pode ser usada. Ainda outro algoritmo útil para identificar regiões de similaridade e de sequência local e alinhamento é o algoritmo FASTA conforme descrito em Pearson & Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1988; 85: 2444-2448, É vantajoso para uso de acordo com a presente invenção o software WU-BLAST (Washington University BLAST) versão

2.0. Pode ser feito o download dos programas executáveis WU-BLAST versão 2.0 para várias plataformas UNIX de ftp: //blast.wustl.edu/blast/executables. Este programa é

| 37 baseado em WU-BLAST versão 1.4, O qual é por sua vez baseado no domínio público NCBI-BLAST versão 1.4 (Altschul s & Gish, 1996, Local alignment statistics, Doolittle ed., Methods in Enzymology 266: 460-480; Altschul et al, Journal of Molecular Biology 1990; 215: 403-410; Gish & States, 1993; Nature Genetics 3: 266-272; Karlin & Altschul, 1993; Proc.

Natl.

Acad.

Sci.

USA 90: 5873-5877; todos os quais sendo incorporado aqui por referência). | Em geral, a comparação das sequências de aminoácidos é efetuada pelo alinhamento de uma sequência de aminoácidos de um polipeptídeo de uma estrutura conhecida com a sequência de aminoácidos de um polipeptídeo de estrutura conhecida.

Aminoácidos nas sequências são então comparados e grupo de aminoácidos que são homólogos são agrupados juntos.

Este método detecta regiões conservadas dos polipeptídeos e responde por inserções e eliminações de aminoácidos.

A homologia entre as sequências de aminoácido pode ser determinada pelo uso de algoritmos comercialmente disponíveis (ver também a descrição de homologia acima). Além daquelas aqui mencionadas, faz-se também menção dos programas BLAST, BLAST intervalado, BLASTN, BLASTP e PSI- BLAST, fornecida pelo Centro Nacional para Informações de Biotecnoloogia (National Center for Biotechnology Information). Esses programas são amplamente usados na

| | 38 técnica para este fim e podem alinhar regiões homólogas de duas sequências de aminoácidos.

Em todos os programas de busca no pacote, as rotinas de alinhamento intervalado são integrantes ao próprio banco de dados de busca.

A colocação de intervalos pode ser desligada, caso seja necessário.

A penalidade predefinida (Q) para um intervalo e comprimento um é Q = 9 para proteínas e BLASTP, e Q =10 para BLASTN, porém pode ser mudada para qualquer número inteiro.

A penalidade por resíduo predefinida para prolongar um intervalo (R) é R= 2 para as proteínas e BLASTP, e R = 10 para BLASTN, porém pode ser mudada para qualquer número inteiro.

Qualquer combinação de valores para Q e R pode ser usado para alinhar sequências de modo a minimizar a sobreposição e identidade durante a minimização de intervalos “de sequência.

A matriz de comparação de aminoácidos padrão é ; BLOSUM62, porém outras matrizes de comparação de aminoácidos como PAM podem ser utilizadas.

Alternativamente ou adicionalmente, o termo “homologia” ou “identidade”, por exemplo, em relação a uma sequência de nucleotídeo ou aminoácido, pode indicar uma medida quantitativa de homologia entre as duas sequências.

A homologia de sequência porcentual pode ser calculada como (Nres — Nais)*100/Nres, EM que Nair é a quantidade total de o 39 É resíduos não idênticos nas duas sequências quando alinhadas e onde Nrefr É à quantidade de resíduos em uma das i sequências. Deste modo, a sequência de DNA AGTCAGTC terá uma identidade de sequência de 75% com a sequência AATCAATC (Nref - 8; Nais = 2).

Alternativamente ou adicionalmente, “homologia” ou “identidade” em relação às sequências pode se referir ao número de posições com nucleotídeos ou aminoácidos idênticos dividido pela quantidade de nucleotídeos ou aminoácido na mais curta das duas sequências em que O alinhamento das duas sequências pode ser determinado de acordo com o algoritmo de Wilbur e Lipman (Wilbur & Lipman, Proc Natl Acad Sci USA 1983; 80:726, aqui incorporado por referência), por exemplo, usando um tamanho de janela de 20 nucleotídeos, comprimento de palavra de 4 nucleotídeos,e uma penalidade de intervalo de 4, e a análise auxiliada por computador e a interpretação dos dados de sequência incluindo o alinhamento pode ser convenientemente efetuada usando programas comercialmente disponíveis (por exemplo, Intelligenetics * Suite, Intelligenetics Inc. CA). Quando sequências de DNA são consideradas como sendo semelhantes, ou têm um grau de identidade ou homologia de sequência com sequências de DNA, timidina (T) na sequência de DNA é considerada igual à uracila (U) na sequência de RNA. Deste

É 40 modo, sequências de RNA estão dentro do escopo da invenção ' e podem ser derivadas de sequências de DNA, por timidina ' (T) na sequência de DNA sendo considerada igual à uracila (U) nas sequências de RNA.

sem experimentação demasiada, o profissional habilitado pode consultar muitos outros programas ou referências para determinar a homologia porcentual.

A invenção ainda engloba os polinucleotídeos influenza contidos em uma molécula de vetor ou em um vetor de expressão e operativamente ligados a um elemento promotor e opcionalmente a um intensificador.

O vetor é vantajosamente um poxvírus, particularmente um vírus vaccinia ou um vírus avipox, como um vírus fowlpox e canarypox. Vantajosamente, o vírus é um vírus canarypox.

Vantajosamente, cepas canarypox podem ser uma cepa atenuada. O vetor pode expressar pelo menos um epítopo de cepas de Kentucky, cepas Newnarket e/ou cepas Ohio. Vantajosamente, constructos canarypox incluem, sem limitação, vCP 1529, vCP 1533 e vCP 2242. Vírus avipox recombinantes (ver, por exemplo, as Patentes Americanas Nos. 5.505941 e 5.756.103), como um vírus canarypox recombinante atenuado, por exemplo ALVAC, ou um vírus fowlpox atenuado, por exemplo, TROVAC, são especialmente vantajosos. Em uma modalidade vantajosa, a vacina ALVAC

| 41 . recombinante descrita por Edlund Toulemonde et al., Vet Rec. 19 de março de 2005; 156(12):367-71) pode ser usada como uma vacina de influenza canino.

Outros vírus que podem ser usados nos métodos da invenção incluem, porém não estão limitados, aos vírus de vaccinia, como um vírus de vaccinia atenuado, por exemplo NYVAC, adenovírus, como adenovírus canino (CAV) e herpesvírus, como herpesvírus canino (CHV) ou um herpesvírus felino (FHV). Um “vetor” se refere a um plasmídeo ou vírus de DNA ou RNA recombinante que compreende um polinucleotídeo heterólogo a ser distribuído a uma célula alvo, seja in vitro ou in vivo.

O polinucleotídeo heterólogo pode compreender uma sequência de interesse para fins de terapia, e pode estar opcionalmente na fora de um cassete de expressão.

Conforme aqui utilizado, um vetor precisa não ser capaz de se replicar na célula ou indivíduo alvo final.

O termo inclui vetores de clonagem, estão também inclusos os vetores virais.

O termo “recombinante” significa um polinucleotídeo semi-sintético, ou de origem sintética, o qual ocorre ou não na natureza ou está ligada a outro polinucleotídeo em um arranjo não encontrado na natureza.

O termo “Heterólogo” significa derivado de uma entidade geneticamente distinta do resto da entidade à qual

Y 42 ele está sendo comparado.

Por exemplo, um polinucleotídeo pode ser colocado pelas técnicas de engenharia genética em 7 um plasmídeo ou vetor derivado de uma fonte diferente, e é um polinucleotídeo heterólogo.

Um promotor removido de sua sequência codificadora natural e operativamente ligado a uma sequência codificadora diferente da sequência natural é um promotor heterólogo.

Os —polinucleotídeos da presente invenção podem compreender sequências adicionais, como sequências codificadoras adicionais na mesma unidade de transcrição, elementos de controle como promotores, sítios de ligação ao ribossomo, sítios de poliadenilação, unidades de transcrição adicionais sob o controle de um promotor igual ou diferente, sequências que permitam a clonagem, expressão, recombinação homóloga e transformação de uma célula hospedeira, e qualquer tal constructo conforme pode ser desejável para fornecer modalidades desta invenção.

Elementos para a expressão do antígeno, epítopo ou imunógeno de influenza estão vantajosamente presentes em um vetor da invenção.

De maneira mínima, isto compreende, consiste essencialmente em ou consiste em um códon de iniciação (ATG), um códon de parada e um promotor, e opcionalmente também uma sequência de poliadenilação para certos vetores, como um plasmídeo e certos vetores virais,

| ' 43 por exemplo, vetores virais diferentes de poxvírus. Quando o polinucleotídeo codifica um fragmento de poliproteína, ' por exemplo, um peptídeo influenza, vantajosamente no vetor, um ATG é colocado 5' da estrutura de leitura e um códon de parada é colocado em 3'. Outros elementos para o controle da expressão podem estar presentes como sequências intensificadoras, sequências estabilizadoras, como sequências de íntron e de sinal que permitam a secreção da proteína.

Métodos para fazer e/ou administrar um vetor ou recombinantes ou plasmídeo para a expressão dos produtos de gene ou genes da invenção seja in vivo ou in vitro podem ser quaisquer métodos desejados, por exemplo, um método o qual seja por ou análogo aos métodos revelados em, ou revelados nos documentos citados: nas Patentes Americanas Nos. 4.603.112; 4.769.330; 4.394.448; 4.722.848; 4.745.051;

4.769.331; 4.945.050; 5.494.807; 5.514.375; 5.744.140;

5.744.141; 5.756.103; 5.762.938; 5.766.599; 5.990.091;

5.174.993; 5.505.941; 5.338.683; 5.494.807; 5.591.639;

5.589.466; 5.677.178; 5.591.439; 5.552.143; 5.580.859;

6.130.066; 6.004.777; 6.130.066; 6.497.883; 6.464.984;

6.451.770; 6.391.314; 6.387.376; 6.376.473; 6.368.603;

6.348.196; 6.306.400; 6.228.846; 6.221.362; 6.217.883;

6.207.166; 6.207.165; 6.159.477; 6.153.199; 6.090.393;

| 44 . 6.074.649; 6.045.803; 6.033.670; 6.485.729; 6.103.526;

6.224.882; 6.312.682; 6.348.450 e 6.312.683; Pedido de i Patente Americana Nº de Série 920.197, depositado no dia 16 de outubro de 1986; WO 90/01543; W091/11525; WO 94/16716; WO 96/39491; WO 98/33510; EP 265785; EP O 370 573; Andreansky et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1996; 93: 11313-11318; Ballay et al, EMBO J. 1993; 4: 3861-65; Feigner et al, J. Biol. Chem. 1994; 269:2550-2561; Frolov et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1996; 93: 11371-11377; Graham, Tibtech 1990; 8:85-87; Grunhaus et al., Sem. Virol. 1992; 3:237-52; Ju et al., Diabetologia 1998;4 : 736-739; Kitson et al., J. Virol. 1991; 65: 3068-3075; McClements et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1996; 93: 11414-11420; Moss, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1996; 93: 11341-11348; Paoletti, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1996; 93: 11349-11353; Pennock et al., Mol. Cell. Biol. 1984; 4: 2399-406; 1 Richardson (Ed), Methods in Molecular Biology 1995; 39, "Baculovirus Expression Protocols," Humana Press Inc.; Smith et al. (1983) Mol. Cell. Biol. 1983; 3: 2156-2165; Robertson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1996; 93: 11334-11340; Robinson et al., Sem. Immunol. 1997; 9:271; e Roizman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1996; 93: 11307-11312. , Deste modo, o vetor na invenção pode ser qualquer vírus ou r vetor de vírus recombinante, como um poxvírus (por exemplo,

| 45 . vírus vaccinia, vírus avipox, vírus cCanarypox, vírus fowlpox, vírus raccoonpox, vírus swinepox, etc.), adenovírus (por exemplo, adenovírus humano, adenovírus canino), herpesvírus (por exemplo, herpesvírus canino), baculovírus, retrovírus, etc. (como nos documentos aqui incorporados por referência); ou o vetor pode ser um plasmídeo.

Os documentos aqui citados e aqui incorporados por referência, além de fornecer exemplos dos vetores úteis na prática da invenção, podem também fornecer fontes para peptídeos não influenza ou fragmentos seus a serem expressos por vetor ou vetores em, ou incluídos nas composições da invenção.

A presente invenção também se refere às preparações compreendendo vetores, como vetores de expressão, por exemplo, composições terapêuticas.

As preparações podem compreender, consistir essencialmente de ou consistir de um ou mais vetores, por exemplo, vetores de expressão, como vetores de expressão in vivo, compreendendo, consistindo essencialmente ou consistindo de (e vantajosamente expressando) um ou mais antígenos, epítopos ou imunógenos de influenza.

Vantajosamente, o vetor contém e expressa um polinucleotídeo que inclui, consiste essencialmente em ou . consiste em um polinucleotídeo codificando (e + vantajosamente expressando) um antígeno, epítopo ou

| | 46 . imunógeno de influenza, em um carreador, excipiente ou veículo farmaceuticamente ou veterinariamente aceitável. Deste modo, de acordo com uma modalidade da invenção, o outro vetor ou vetores na preparação compreende, consiste be essencialmente em ou consiste em um polinucleotídeo que codifica, e sob circunstâncias apropriadas o vetor expressa uma ou mais outras proteínas de um antígeno, epítopo Ou imunógeno de influenza (por exemplo, hemaglutinina, neuraminidase, nucleoproteína) ou um fragmento seu.

De acordo com outra modalidade, o vetor ou vetores na preparação compreendem, ou consistem essencialmente em, ou consistem em polinucleotídeo(s) codificando uma ou mais proteínas ou fragmento(s) seus de um antígeno, epítopo ou imunógeno de influenza, o vetor ou vetores expressando o(s) polinucleotídeo(s). A preparação da invenção vantajosamente compreende, consiste essencialmente em ou consiste em pelo menos dois vetores compreendendo, consistindo essencialmente de ou consistindo de, e vantajosamente também expressando, vantajosamente in vivo sob condições apropriadas ou condições adequadas Ou em uma célula hospedeira adequada, polinucleotídeos de diferentes isolados caninos codificando as mesmas proteínas e/ou para . proteínas diferentes, porém vantajosamente as mesmas . proteínas. Preparações contendo um ou mais vetores

' : 47 contendo, consistindo essencialmente de ou consistindo de polinucleotídeos codificando, e vantajosamente expressando, ' vantajosamente in vivo um antígeno de influenza, proteína de fusão ou um epítopo do mesmo. A invenção também é direcionada em misturas de vetores que contêm, consistem essencialmente em ou consistem da codificação para, e expressam diferentes antígenos, epítopos ou imunógenos de influenza, por exemplo, um antígeno, epítopo ou imunógeno de influenza de diferentes espécies tais como, porém sem se limitar, a seres humanos, porcos, além de espécies de aves incluindo galinhas, patos e gansos.

De acordo com uma modalidade da invenção, o vetor de expressão é um vetor viral, particularmente um vetor de expressão in vivo. Em uma modalidade vantajosa, o vetor de expressão é um vetor de adenovírus. Vantajosamente, o adenovírus é um vetor Ad5 humano, um adenovírus El- eliminado e/ou E3-eliminado.

Em uma modalidade particular, o vetor viral é um poxvírus, por exemplo, um vírus vaccinia ou um vírus vaccinia atenuado (por exemplo, MVA, uma cepa Ankara modificada obtida depois de mais de 570 passagens da cepa de vacina Ankara em fibroblastos de embriões de galinha; . ver Stickl & Hochstein-Mintzel, Munch. Med. Wschr., 1971, 113, 1149-1153; Sutter et al, Proc. Natl. Acad. Sci. »

| : 48 U.S.A., 1992, 89, 10847-10851; disponível como ATCC VR- 1508; ou NYVAC, ver a Patente Americana Nº 5.494.807, por ' exemplo, Exemplos 1 a 6 e et seq. da Patente Americana Nº

5.494.807, a qual discute a construção de NYVAC, assim como variações de NYVAC com ORFs adicionais eliminadas do genoma do vírus vaccinia cepa Copenhagen, assim como a inserção de moléculas de ácido nucléico codificadoras heterólogas em sítios deste recombinante, e também o uso de promotores emparelhados; ver também WO96/40241), um vírus avipox ou um vírus avipox atenuado (por exemplo, canaripox, fowlpox, dovepox, pigeonpox, quailpox, ALVAC ou TROVAC; ver, por exemplo, as Patentes Americanas Nos. 5.505.941 e

5.494.807), swinepox, raccoonpox, camelpox ou vírus da mixomastose.

De acordo com outra modalidade da invenção, o vetor poxvírus é um vírus canarypox ou um vetor do vírus fowlpox, vantajosamente um vírus canarypox ou vírus fowlpox atenuado. Sob este aspecto, o canarypox fica disponível da ATCC sob o número de acesso VR-111. Vírus canarypox atenuados são descritos na Patente Americana Nº 5.756.103 (ALVAC) e WO01/05934. Várias cepas de vacinação do vírus fowlpox também são disponíveis, por exemplo, a cepa : DIFTOSEC CT comercializada por MERIAL e a vacina NOBILIS VARIOLE comercializada por INTERVET, e é também feita

| 49 . referência à Patente Americana Nº 5.766.599, a qual pertence à cepa fowlpox atenuada TROVAC. Para informação sobre o método para gerar seus recombinantes e como administrar seus recombinantes, O profissional habilitado pode se referir aos documentos aqui citados e ao WO90/12882, por exemplo, como menção ao vírus vaccinia é feita das Patentes Americanas Nos. 4.769.330,

4.722.848, 4.603.112, 5.110.587, 5.494.807 e 5.762.938 inter alia; como ao fowlpox, menção é feita das Patentes Americanas Nos. 5.174.993, 5.505.941 e US-5.766.599 inter alia; como ao canarypox, menção é feita da Patente Americana No; 5.756.103 inter alia; como ao swinepox, menção é feita da Patente Americana Nº 5.382.425, inter alia;/ e como ao raccoonpox, menção é feita de WOO00/03030, inter alia.

Quando o vetor de expressão é um vírus vaccinia, O sítio ou sítio de inserção para o polinucleotídeo Ou polinucleotídeos a serem expressos estão vantajosamente no gene ou sítio de inserção da timidina quinase (TK), o gene ou sítio de inserção de hemaglutinina (HA), a região que codifica o corpo de inclusão do tipo A (ATI); ver também os documentos aqui citados, especialmente aqueles pertencentes . ao vírus vaccinia. No caso de canarypox, vantajosamente o & sitio ou sítios de inserção são ORF(s), C3, C5 e/ou C6; ver

| h 50 também os documentos ali citados, especialmente aqueles i pertencentes ao vírus canarypox. No caso de fowlpox, ' vantajosamente o sítio ou sítios de inserção são ORFs F7 e/ou FB; ver também os documentos aqui citados, especialmente aqueles pertencentes ao vírus fowlpox. O sítio ou sítios de inserção para a área do vírus MVA vantajosamente como em várias publicações, incluindo Carroll M. W. et al, Vaccine, 1997, 15 (4), 387-394; Stittelaar K. J. et al, J. Virol, 2000, 74 (9), 4236-4243; Sutter G. et al., 1994, Vaccine, 12 (11), 1032-1040; e, sob este aspecto, também é verificado que o genoma MVA completo é descrito em Antoine G., Virology, 1998, 244, 365-39%, o qual permite que o profissional habilitado use outros sítios de inserção ou outros promotores.

Vantajosamente, o polinucleotídeo a ser expresso é inserido sob o controle de um promotor poxvírus específico, por exemplo, o promotor vaccinia de 7,5 KDa (Cochran et al., J. Virology, 1985, 54, 30-35), o promotor de vaccinia 13L (Riviere et al., J. Virology, 1992, 66, 3424- 3434), o promotor de vaccinia HA (Shida, Virology, 1986, 150, 451- 457), o promotor de cowpox ATI (Funahashi et al., J. Gen. Virol., 1988, 69, 35-47), o promotor de vaccinia H6 (Taylor " J. et al., Vaccine, 1988, 6, 504-508; Guo P. et al. O.

. Virol, 1989, 63, 4189-4198; Perkus M. et al, J. Virol, 1989, 63, 3829-3836), inter alia. i Em uma modalidade particular, o vetor viral é um adenovirus, como um adenovirus humano (HAV) ou um adenovírus canino (CAV).

Em uma modalidade, o vetor viral é um adenovírus humano, particularmente um adenovírus do sorotipo 5, tornado incompetente para replicação por uma eliminação na região El do genoma viral, particularmente aproximadamente do nucleotídeo 459 ao nucleotídeo 3510 por referência à sequência hAd5 revelada em Genbank sob o número de acesso M73260, e na publicação referenciada J. Chroboczek et al Virol. 1992, 186, 280-285. O adenovírus eliminado é propagado em células El-expressando 293 (F. Graham et al O. Gen. Virol. 1977, 36, 59-72) ou em células PER, particularmente PER.C6 (F. Falloux et al Human Gene Therapy 1998, 9, 1909-1917). O adenovírus humano pode ser eliminado na regiãoE3, particularmente por volta do nucleotídeo 28592 até aproximadamente o nucleotídeo 30470. A eliminação na região El pode ser feita juntamente com uma eliminação na região E3 (ver, por exemplo, J. Shriver et al. Nature, 2002, 415, 331-335, F. Graham et al Methods in Molecular . Biology Vol. 7: Gene Transfer and Expression Protocols . Editado por E. Murray, The Human Press Inc, 1991, p 109-

| 52 128; Y.

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Virol. 1996, 70, 4805-4810). Os sítios de inserção podem ser os locais (regiões) El e/ou E3 eventualmente após uma eliminação parcial ou completa das regiões El e/ou E3. Vantajosamente, quando o vetor de expressão é um adenovírus, o polinucleotídeo a ser expresso é inserido sob o controle de um promotor funcional em células eucarióticas, como um promotor forte, preferivelmente um promotor de gene inicial imediato ao citomegalovírus (promotor CMV-IE), particularmente a região intensificadora/promotora de aproximadamente o nucleotídeo -734 até o nucleotídeo +7 em M.

Boshart et al Cell 1985, 41, 521-530 ou a região intensificadora/promotora do vetor pCcI de Promega Corp.

O promotor CMV-IE é vantajosamente de origen de murino ou humana.

O promotor do fator de alongamento la também pode ser usado.

Um promotor músculo específico pode ser também usado (X.

Li et al Nat. . Biotechnol. 1999, 17, 241-245). Promotores fortes também são discutidos aqui em relação aos vetores de plasmídeo.

Em i 53 uma modalidade, uma sequência de união pode estar localizada à jusante da região intensificadora/promotora. . Por exemplo, o íntron 1 isolado do gene CMV-IE (R.

Stenberg et al J.

Virol. 1984, 49, 190), o íntron isolado do gene da B-globina de coelho ou humana, particularmente o íntron 2 do gene da b-globina,y o íntron isolado do gene da imunoglobulina, uma sequência de união do gene inicial SV40 ou a sequência de íntron quimérica isolada do vetor pcI de Promege Corp. compreendendo a sequência doadora do gene da BfB-globina humana fundido à sequência aceptora da imunoglobulina de camundongo (aproximadamente do nucleotídeo 890 até aproximadamente o nucleotídeo 1022 no Genbank com o número de acesso CVU47120). Uma sequência de poli(A) e uma sequência terminadora podem ser inseridas à jusante do polinucleotídeo a ser expresso, por exemplo, um gene do hormônio de crescimento bovino, particularmente de À cerca do nucleotídeo 2339 até aproximadamente o nucleotídeo 2550 no Genbank sob o número de acesso BOVGHRH, um gene da B-globina de coelho ou um sinal de poliadenilação do gene tardio SV40. Em outra modalidade, o vetor viral é um adenovírus canino, particularmente um CAV-2 (ver, por exemplo, L. . Fischer et al.

Vaccine, 2002, 20, 3485-3497; Patente o 54 : Americana Nº 5.529.780; Patente Americana Nº 5.688.920; Publicação PCT Nº WO95/14102). Para CAV, oO sítios de i inserção podem estar na região E3 e/ou na região localizada entre a região E4 e a região ITR da direita (ver a Patente Americana Nº 6.090.393; a Patente Americana Nº 6.156.567).

Em uma modalidade, a inserção está sob o controle de um promotor, como um promotor do gene inicial imediato do citomegalovírus “(promotor CMV-IE) ou um promotor já descrito para o vetor de adenovírus humano. Uma sequência de poli(A) e uma sequência terminadora podem ser inseridas à jusante do polinucleotídeo a ser expresso, por exemplo, um gene do hormônio de crescimento bovino ou um sinal de gene poliadenilação do gene da fB-globina de coelho.

Em outra modalidade particular, o vetor vital é um herpesvírus como um herpesvírus canino (CHV) ou um herpesvírus felino (FHV). Para CHV, os sítios de inserção i podem estar particularmente no gene da timidina quinase, ou em ORF3, ou em ORF UL43 (ver a Patente Americana Nº

6.159.477). Em uma modalidade, e o polinucleotídeo a ser expresso é inserido sob o controle de um promotor funcional em células eucarióticas, vantajosamente um promotor CMV-IE (murino ou humano). Uma sequência de poli(A) e sequência . terminadora podem ser inseridas à jusante do - polinucleotídeo a ser expresso, por exemplo, hormônio de i ; 55 crescimento bovino ou um sinal de poliadenilação do gene f-

globina de coelho. ' De acordo ainda com outra modalidade da invenção, o veto de expressão é um vetor de plasmídeo ou um vetor de plasmídeo de DNA, particularmente um vetor de expressão in vivo.

Em um exemplo específico não limitativo, o plasmídeo pVR1020 ou 1012 (VICAL Inc.; Luke C. et al., Journal of Infectious Diseases, 1997, 175, 91-97; Hartikka 0. et al., Human Gene Therapy, 1996, 7, 1205-1217, ver, por exemplo, as Patentes Americanas Nos. 5.846.946 e 6.451.769) podem ser utilizadas como um vetor para à inserção de uma sequência de polinucleotídeo.

O plasmídeo pVR1020 é derivado de pVR1012 e contém a sequência de sinal tPA humana.

Em uma modalidade, o sinal tPA humano compreende do aminoácido M(1) até o aminoácido S(23) no Genbank sob o número de acesso HUMTPAl4. Em outro exemplo não limitativo específico, o plasmídeo utilizado como um vetor para a inserção de uma sequência de polinucleotídeo pode conter a sequência de peptídeo de sinal de IGF1 equina do aminoácido M(24) até o aminoácido A(48) no Genbank sob o número de acesso U28070. Informação adicional dos plasmídeos de DNA a qual pode ser consultada ou utilizada na prática é . encontrada, por exemplo, nas Patentes Americanas Nos.

| 56 E 6.852.705; 6.818.628; 6.586.412; 6.576.243; 6.558.674;

6.464.984; 6.451.770; 6.376.473 e 6.221.362. i O termo plasmídeo engloba qualquer unidade de transcrição de DNA compreendendo um polinucleotídeo de acordo com a invenção e os elementos necessário para a sua expressão in vivo em uma célula ou células do hospedeiro ou alvo desejado; e, sob este aspecto, é verificado que um plasmídeo circular superenovelado ou não enovelado, assim | como uma forma linear, são intencionados a estarem dentro do escopo da invenção.

Cada plasmídeo compreende, contém ou consiste essencialmente em, além do polinucleotídeo codificando um antígeno, epítopo ou imunógeno influenza, opcionalmente fundido com uma sequência de peptídeo heteróloga, uma variante, análogo ou fragmento, operativamente ligado a um promotor ou sob o controle de um promotor ou dependente de i um promotor. Em geral, é vantajoso empregar um promotor forte funcional em células eucarióticas. O promotor forte preferido é o promotor de citomegalovírus inicial imediato (CMV-IE) de origem humana ou murina, ou opcionalmente com outra origemy como de rato ou porquinho-da-índia. O promotor CMV-IE pode compreender a parte promotora efetiva, . a qual pode ou não estar associada com a parte E intensificadora. Pode ser feita referência ao EP-A-260 148,

| 57 EP-A-323 597, Patentes Americanas Nos. 5.168.062,

5.385.839, e 4.968.615, assim com ao Pedido PCT No . WOB87/03905. O promotor CMV-IE é vantajosamente um CMV-IE humano (Boshart M. et al, Cell, 1985, 41, 521-530) ou CMV- TE de murino. Em termos mais gerais, o promotor tem origem ou viral ou celular. Um promotor viral forte diferente de CMV-IE que pode ser utilmente empregado na prática da invenção é o promotor inicial/tardio do vírus SV40 ou o promotor LTR do vírus de sarcoma Rous. Um promotor celular forte que pode ser utilmente empregado na prática da invenção é o promotor de um gene do citoesqueleto, como, por exemplo, o promotor | de desmina (Kwissa M. et al., Vaccine, 2000, 18, 2337- | 2344), ou O promotor de actina (Miyazaki J. et al., Gene, 1989, 79, 269-277). Subfragmentos funcionais desses promotores, isto é, i porções desses promotores que mantêm uma atividade promotora adequada, estão incluídos na presente invenção, por exemplo, promotores CMV-IE truncados de acordo com o Pedido PCT Nº WO98/00166, ou a Patente Americana Nº

6.156.567 podem ser usados na prática da invenção. Um promotor na prática da invenção consequentemente inclui . derivados e subfragmentos de um promotor de comprimento total que mantém uma atividade promotora adequada e, deste o 58 modo funciona como um promotor, preferivelmente promovendo | atividade substancialmente similar àquela do promotor ' efetivo ou de comprimento total do qual o derivado ou subfragmento é derivado, por exemplo, semelhante à atividade dos promotores CMV-IE truncados da Patente Americana Nº 6.156.567, à atividade dos promotores de CMV- IE de comprimento total. Deste modo, um promotor CMV-IE na prática da invenção pode compreender ou consistir essencialmente de ou consistir da porção promotora do promotor de comprimento total e/ou da porção intensificadora do promotor de comprimento total, assim como derivados e subfragmentos. Preferivelmente, os plasmídeos compreendem ou consistem essencialmente em outros elementos de controle de expressão. É particularmente vantajoso incorporar sequência(s) estabilizante(s), por exemplo, sequência(s) de íntron(s), preferivelmente o primeiro íntron de hCMV-IE (Pedido PCT Nº WOB89/01036), o íntron II do gene da BfB- globina de coelho (van Ooyen et al, Science, 1979, 206, 337-344).

Como com o sinal de poliadenilação (poliA) para os plasmídeos e vetores virais diferentes dos poxvírus, o uso “ pode ser mais feito do sinal de poli(A) do gene do hormônio do crescimento bovino (bGH) (ver a Patente Americana Nº

| | 59 . 5.122.458), ou o sinal poli(A) do gene fB-globina de coelho ou o sinal poli(A) do vírus SV40. De acordo com outra modalidade da invenção, os vetores de expressão são vetores de expressão usados para a expressão in vitro das proteínas em um sistema celular apropriado.

As proteínas expressas podem ser coletadas em ou do sobrenadante da cultura depois, ou não depois da secreção (se não houver secreção, uma lise celular tipicamente ocorre ou é efetuada), opcionalmente concentrada por métodos de concentração como ultrafiltração e/ou purificadas por meios de purificação, como métodos de cromatografia por afinidade, troca iônica ou filtração em gel.

Uma “célula hospedeira” denota uma célula procariótica ou eucariótica que foi geneticamente alterada, Ou que é capaz de ser geneticamente alterada pela administração de à um polinucleotídeo exógeno, como um plasmídeo ou vetor recombinante.

Ao se referir às células geneticamente alteradas, o termo se refere tanto à célula originalmente alterada quando à sua progenia.

Células hospedeiras vantajosas incluem, mas não estão limitadas, às células do rim de filhotes de hâmster (BHK), células de carcinoma de : cólon (Caco-2), células COS-7, células MCF-7, células MCF- . 10A, linhagens de rim canino Madin-DArby (MDCK), células de i ' so pulmão de marta (MvlLlu), células MRC-5, células U937 e células VERO. Polinucleotídeos compreendendo uma sequência f desejada podem ser inseridos em um vetor de clonagem ou expressão adequado, e o vetor por sua vez pode ser introduzido em uma célula hospedeira adequada para replicação e amplificação. Polinucleotídeos podem ser introduzidos nas células hospedeiras por quaisquer meios conhecidos na técnica. os vetores contendo o polinucleotídeos de interesse podem ser introduzidos na célula hospedeira por qualquer quantidade de meios apropriado, incluindo absorção direta, endocitose, transfecção, f-emparelhamento, eletroporação, transfecção utilizando cloreto de cálcio, cloreto de rubídio, fosfato de cálcio, DEAE-dextrana ou outras substâncias; bombardeamento por microprojétil; lipofecção; e infecção (onde o vetor é infeccioso, por exemplo, um vetor retroviral). A escolha da introdução de vetores ou polinucleotídeos irá comumente depender das características da célula hospedeira.

Em uma modalidade vantajosa, a invenção fornece a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma formulação para a distribuição e expressão de um . antígeno, epítopo ou imunógeno de influenza em uma célula alvo. A determinação da quantidade terapeuticamente eficaz é experimentação de rotina para uma pessoa normalmente versada na técnica.

' Em uma modalidade, a formulação compreende um vetor de - expressão compreendendo um polinucleotídeo que expressa um antígeno epítopo ou imunógeno de influenza e um carreador, veículo ou excipiente farmaceuticamente ou veterinariamente aceitável. Em uma modalidade vantajosa, O carreador, veículo ou excipiente farmaceuticamente ou veterinariamente aceitável facilita a transfecção e/ou melhora à conservação do vetor ou proteína. os carreadores, veículos ou excipientes farmaceuticamente ou veterinariamente aceitáveis são bem conhecidos por uma pessoa versada na técnica. Por exemplo, um carreador ou veículo ou excipiente farmaceuticamente o veterinariamente aceitável pode ser uma solução de NaCl 0,9% (por exemplo, salina) ou um tampão fosfato. Outro carreador ou veículo ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis que podem ser usados para os métodos desta invenção incluem, mas não estão limitados, ao poli(L- glutamato) ou polivinilpirrolidona. O carreador ou veículo ou excipientes farmaceuticamente ou veterinariamente aceitáveis pode ser qualquer composto ou combinação de compostos que facilitem a administração do vetor (ou proteína expressa de um vetor da invenção in vitro);

. vantajosamente, o carreador, veículo ou excipiente pode facilitar a transfecção e/ou melhorar a conservação do i vetor (ou proteína). Doses e volumes de doses são aqui discutidos na descrição geral e podem ser também determinados pelo profissional habilitado a partir desta descrição lida juntamente com o conhecimento na técnica, sem qualquer experimentação demasiada.

Os lipídeos catiônicos contendo um sal de amônio quaternário, os quais são Vvantajosamente, porém não exclusivamente adequados para plasmídeos, são vantajosamente aqueles com a seguinte fórmula: o + Roo QRmoR RES OR CH; : " na qual R é um radical alifático de cadeia linear saturado ou insaturado com de 12 a 18 átomos de carbono, R; é outro radical alifático ' contendo 2 ou 3 átomos de carbono, e X é um grupo amina ou hidroxila, por exemplo, DMRIE.

Em outra modalidade, o lipídeo catiônico pode estar associado com um lipídeo neutro, por exemplo, DOPE.

Dentre esses lipídeos catiônicos, é dada preferência ao DMRIE (N- (2-hidroxietil)-N,N-dimetil-2,3- Y bis (tetadecilóxi)-l-propanoamônio; wo 96/34109),

vantajosamente associado com um lipídeo neutro, vantajosamente DOPE (dioleoilfosfatidiletanolamina); Behr ' J. P., 1994, Bioconjugate Chemistry, 5, 382-389), para formar DMRIE-DOPE.

Vantajosamente, a mistura de plasmídeos com o adjuvante é formada extemporaneamente e vantajosamente ao mesmo tempo com a administração da preparação ou logo antes da administração da preparação; por exemplo, logo antes ou previamente à administração, a mistura adjuvante de plasmídeo é formada, vantajosamente de modo a fornecer tempo suficiente antes da administração para a mistura formar um complexo, por exemplo, entre cerca de 10 e cerca de 60 minutos antes da administração, como aproximadamente 30 minutos antes da administração.

Quando DOPE está presente, a proporção molar DMRIE:DOPE é vantajosamente de cerca de 95:cerca de 5 até cerca de 5:cerca de 95, mais vantajosamente de cerca de l:cerca de 1, por exemplo, 1:1.

A proporção em peso de adjuvante DMRIE ou DMRIE- DOPE:plasmídeo pode estar entre cerca de 50:cerca de 1 e cerca de l:cerca de 10, como cera de 10:cerca de 1 e cerca de l:cerca de 5, e vantajosaménte cerca de l:cerca de l e : cerca de l:cerca de 2, por exemplo, 1:1 e 1:2.

| 1 64 A invenção também fornece vacinas influenza caninas i inativadas. Conforme aqui utilizado, o termo “vacina ' inativada” significa uma composição de vacina contendo um organismo ou patógeno infeccioso que não é mais capaz de se replicar ou crescer. A inativação pode ser feita por uma variedade de métodos suficientes para evitar a replicação ou crescimento do organismo, enquanto mantém a sua imunogenicidade.

A vacina inativada pode ser uma forma inativada de um isolado de um vírus influenza de um cão afetado. O vírus pode ser isolado dos alvéolos ou pulmão de um cão afetado. Em outra modalidade, a vacina inativada pode ser uma influenza equina inativada. Em uma modalidade vantajosa, a influenza equina é uma influenza equina de Kentucky ou Newmarket. A vacina inativada pode ser uma versão inativada de qualquer uma das cepas de influenza descritas acima.

Uma vacina inativada pode ser preparada, assim como do fluido de cultura coletado. O vírus pode ser produzido ou por inoculação de ovos embrionados do dia 10-11 (J. Violay et al US 6.048.537), ou por inoculação de cultura de células BHK-21 (C. Ross et al Archiv. Fur die gesamte Virusforschung 1970, 30, 82-88; T. Tolstova et al Acta . Virol. 1966, 10, 315-321; Ho. Merten et al Adv. Exp. Med. Biol. 1996, 397, 141-151), de cultura de células MDCK (JJ.

| 65 : Tree et al Vaccine 2001, 19, 3444-3450; Y. Ghendon et al Vaccine 2005, 23, 4678-4684; R. Brands et al Dev. Biol.

Stand. 1999, 98, 93-100; R. Youil et al 3 Virol. Methods 2004, 120, 23-31), de cultura de células Vera (O. Kistner et al Vaccine 1998, 16, 960-968; E. Govorkova et al O. Virol. 1996, 70, 5519-5524). O fluido alantóico ou o sobrenadante da cultura celular pode ser clarificado por baixa centrifugação e/ou filtração. O vírus pode ser concentrado por ultrafiltração e pode ser purificado por centrifugação regional no gradiente de sacarose (J. Violay et al US 6.048.537; O. Kistner et al idem), por filtração em gel (D. Nayak et al J. Chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. 2005, 823, 75-81; S. Tomita et al Kitasato Arch. Exp. Med. 1971, 44, 185-196).

A inativação pode ser conseguida pelo tratamento do vírus por qualquer um dos métodos comumente utilizados para fazer vacinas inativadas. Esses métodos incluem, porém não estão limitados, ao tratamento com formaldeído (O. Kistner et al idem; A. Garcia et al Avian Diseases 1998, 42, 248- 256), tratamento com betapropiolactona (B. Bdowsky et al Vaccine 1991, 9, 398-402 e Vaccine 1993, 11, 343-348; N. Keverin et al Arch. Virol. 2000, 145, 1059-1066), - tratamento com etilenimina (D. Swayne et al Avian Diseases . 2001, 45, 355-365), tratamento com solventes orgânicos,

! 66 tratamento com detergentes, tratamento com Tween-éter ou i tratamento com Triton X-100 (J. Vilay et al idem) para o ' fluido alantóico. Para a inativação, a concentração pode ser de cerca de 0,01 a 0,2% p/v para o formaldeído; cerca de 0,03 a 0,2% p/v para a betapropiolactona; cerca de 0,5 a 20 mM para a etilenimina. Os métodos aqui citados servem como exemplos conhecidos na técnica para inátivar vírus. Vacinas de vírus inativados são comumente administradas misturadas com um adjuvante. A vacina inativada pode ser administrada ao animal por qualquer uma dentre uma pluralidade de métodos os quais incluem, porém não estão limitados, à inoculação intramuscular, intradérmica Ou Subcutaneamente, por pulverização, ocularmente, nasalmente, oralmente ou in ovo.

As composições e vacinas imunogênicas de acordo com a invenção podem compreender ou consistir essencialmente de um ou mais adjuvantes. Adjuvantes adequados para uso na prática da presente invenção são (1) polímeros do ácido acrílico ou metacrílico, anidrido maléico e polímeros derivados de alquenil, (2) sequências de imunomarcação (ISS), como sequências de oligodesoxirribonucleotídeo com uma ou mais unidades CpG não metiladas (Klinman et al., . Proc. Natl. Acad. Seil., USA, 1996, 93, 2879-2883; WO98/16247), (3) uma emulsão óleo em água, como a emulsão

: ; 67 SPT descrita na p 147 de "Vaccine Design, The Subunit and i Adjuvant Approach" publicada por M. Powell, M. Newman, ' Plenum Press 1995, e a emulsão MF59 descrita na página 183 do mesmo trabalho, (4) lipídeos catiônicos contendo um sal de amônio quaternário, por exemplo, citocinas DDA (5), (6) hidróxido de alumínio ou fosfato de alumínio, (7) saponina ou (8) outros adjuvantes discutidos em qualquer documento citado e incorporado por referência no presente pedido, ou (9) quaisquer combinações ou misturas suas, ou (10) complexos de imunoestimulação (ISCOMS) que são complexos tipo gaiola aberta formados por colesteróis, lipídeos, imunógenos e saponinas do córtex da árvore Quillaia saponaria Molina (Sjolander et al., J. Leukocyte Biol, 1998, 64 (6), 7113-723).

A emulsão óleo-em-água (3), a qual é especialmente apropriada para vetores virais, pode ser à base de: óleo de parafina líquida leve (tipo farmacopéia européia), óleo isoprenóide como esqualano, esqualeno, óleo resultante da oligomerização de alquenos, por exemplo, isobuteno ou deceno, ésteres de ácidos ou alcoóis com grupo alquil de cadeia linear, como óleos vegetais, oleato de etila, propilenoglicol, di (caprilato/caprato), glicerol . tri (caprilato/caprato) e dioleato de propilenoglicol, ou

| 68 . ésteres de alcoóis ou ácidos graxos ramificados, especialmente ésteres do ácido isoesteárico.

O óleo é usado em combinação com emulsificantes para formar uma emulsão. Os emulsificantes podem ser tensoativos não iônicos, como: ésteres de, por um lado, sorbitano, manide (por exemplo, oleato de anidromanitol), glicerol, poliglicerol ou propilenoglicol e, por outro lado, ácidos oléico, isoesteárico, ricinoleico ou hidroxiesteárico, os referidos ésteres sendo opcionalmente etoxilados, ou bloco de copolímero de polioxipropleno-polioxietileno, como Pluronic, por exemplo, L121.

Os adjuvantes tipo matriz complexa de imunoestimulação tipo (1) (matriz ISCOM") são escolhas vantajosas de acordo com a invenção, especialmente uma vez que tenha sido demonstrado que esta classe de adjuvantes é capaz de Suprarregular a expressão de MHC classe II por APCs. Uma : matriz ISCOM" consiste em saponinas (opcionalmente fracionadas) (triterpenóides) de Quillaja, saponária, colesterol e fosfolipídeo, quando misturada com a proteína imunogênica, a formulação particulada resultante é o que é conhecido como uma partícula ISCOM onde a saponina constitui de 60 a 70% p/p, o colesterol e fosfolipídeo de . 10-15% p/p, e a proteina de 10-15% p/p. Detalhes . relacionados com a composição e uso de complexo de

. imunoestimulação podem ser, por exemplo, encontrados em Morein B et al., 1995, Clin. Immunother. 3: 461-475 assim i como em Barr IG e Mitchell GF, 1996, Immunol, and Cell Biol. 74: 8-25 (ambos aqui incorporados por referência) fornecem instruções úteis para o preparo de complexos de imunoestimulação completos.

Dentre os polímeros adjuvantes tipo (1), é dada preferência aos polímeros do ácido acrílico ou metacrílico reticulados, especialmente reticulados pelos polialqueniléteres de açúcares ou polialcoóis. Esses compostos são conhecidos com o nome carbômero (Pharmeuropa, vol. 8, no. 2, Junho de 1996). Uma pessoa versada na técnica pode também se referir à Patente Americana Nº

2.909.462, a qual fornece tais polímeros acrílicos reticulados por um composto poliidroxila com pelo menos três grupos hidroxila, preferivelmente não mais do que oito dos tais grupos, os átomos de hidrogênio de pelo menos três grupos hidroxila sendo substituídos por radicais insaturados alifáticos com pelo menos dois átomos de carbono. Os radicais preferidos são aqueles contendo de 2 à 4 átomos de carbono, por exemplo, vinilas, alilas e outros grupos etilenicamente insaturados. Os radicais insaturados . podem também conter outros substituintes, como metil. : Produtos vendidos com o nome Carbopol (BF Goodrich, Ohio,

| : 7O EUA) são especialmente adequados. Eles são reticulados por alilsacarose ou por alilpentaeritritol. Dentre eles, : referência é feita ao Carbopol 974P, 934P e 971P. Como com os copolímeros derivados de anidrido maléico- alquenila, é dada preferência ao EMA (Monsanto), os quais são copolímeros de etileno-anidrido maléico de cadeia linear ou reticulados e eles são, por exemplo, reticulados com éter divinila. É também feita referência ao J. Fields et al, Nature 186: 778-780, 4 de junho de 1960.

Considerando a estrutura, os polímeros do ácido acrílico ou metacrílico e EMA são preferivelmente formados por unidades básicas com a seguinte fórmula:

PEA tolos; Soo COOK ' na qual: - R e R»7, os quais podem ser iguais ou diferentes, : representam H ou CH; - x=00oul, preferivelmente x = 1 -y=l1lou2,comx+y=- 2, Para EMA, x = 0 e y = 2, e para os carbômeros, x = y=

1.

Esses polímeros são solúveis em água ou em solução = salina fisiológica (20 g/L de NaCl) e o pH pode ser

. ajustado até 7,3 a 7,4, por exemplo, por soda (NaOH) para fornecer a solução adjuvante na qual o(s) vetor(es) de expressão pode(m) ser incorporado(s). A concentração de polímero na composição de vacina final pode variar entre 0,01 e 1,5% p/v, vantajosamente de 0,05 a 1% p/v, e preferivelmente de 0,1 a 0,4% p/v.

A citocina ou citocinas (5) pode(m) estar na forma de proteína na composição imunogênica ou vacina, ou pode (m) ser co-expressa(s) no hospedeiro com oO imunógeno ou imunógenos ou seu(s) epítopo(s). É dada preferência à co- expressão da citocina ou citocinas, seja pelo menos vetor que aquele expressando o imunógeno ou imunógeno "Ou epítopo(s) seus, ou por um vetor separado para ele.

A invenção compreende o preparo de tais composições de combinação; por exemplo, pela mistura dos componentes ativos, vantajosamente juntos e com um adjuvante, i carreador, citocina e/ou diluente.

Citocinas que podem ser usadas na presente invenção incluem, mas não estão limitadas, ao fator de estimulação de colônia de granulócito (G-CSF), fator de estimulação de colônia de granulócito/macrófago (GM-CSF), interferon a (IFN a), interferon À (IFN fB), interferon y (IEN 7%), ] interleucina-lo (IL-la), interleucina-18B (IL-18B),

| T2 ' interleucina-2 (IL-2), interleucina-3 (IL-3), interleucina- 4 (IL-4), interleucina-5 (IL-5), interleucina-6 (IL-6), i interleucina-7 (IL-7), interleucina-8 (IL-8), interleucina- 9 (IL-9), interleucina-10 (IL-10), interleucina-11 (IL-11), interleucina-12 (IL-12), fator de necrose tumoral a (RNF a), fator de necrose tumoral BP (TNF RP), e fator de crescimento transformante f (TGF BB). É entendido que as citocinas podem ser co-administradas e/ou sequencialmente administradas com a composição imunogênica ou de vacina da presente invenção.

Deste modo, por exemplo, a vacina da presente invenção pode também conter uma molécula de ácido nucléico exógena que expresse in vivo uma citocina adequada, por exemplo, uma citocina emparelhada com este hospedeiro a ser vacinado ou no qual uma resposta imunológica é para ser eliciada (por exemplo, uma citocina canina para preparações a serem administradas aos cães). Vantajosamente, as composições farmacêuticas e/ou terapêuticas e/ou formulações de acordo com a invenção compreendem ou consistem essencialmente em ou consistem em uma quantidade eficaz para eliciar uma resposta terapêutica de um ou mais vetores de expressão e/ou polipeptídeos, conforme aqui discutido; e, uma quantidade eficaz pode ser ' determinada a partir dessa descrição, incluindo os

* 73 documentos aqui incorporados, e o conhecimento na técnica, sem experimentação demasiada. ' No caso de composições terapêuticas e/ou farmacêuticas à base de um vetor de plasmídeo, uma dose pode compreender, consistir essencialmente de ou consistir, em termos gerais, de cerca de 1 ug a cerca de 2000 ug, vantajosamente de cerca de 50 uq a cerca de 1000 ug, e mais vantajosamente de cerca de 100 ug a cerca de 800 ug de plasmídeo expressando o antígeno, epítopo ou imunógeno de influenza. Quando as composições terapêuticas e/ou farmacêuticas à base de um vetor de plasmídeo são administradas com eletroporação, a dose do plasmídeo está geralmente entre cerca de 0,1 ugel mg, vantajosamente entre cerca de 1 ug e 100 no, vantajosamente entre cerca de 2 ug e 50 ug. Os volumes de dose podem estar entre cerca de O0O,l e cerca de 2 mL, vantajosamente entre cerca de 0,2 e cerca de 1 mL. Essas doses e volumes de doses são adequados para o tratamento de caninos e outras espécies alvo de mamíferos, como equinos e felinos.

A composição terapêutica e/ou farmacêutica contém por dose de cerca de 10º a cerca de 10", vantajosamente de cerca de 10º a cerca de 10", e mais vantajosamente de cerca ' de 10º a cerca de 10º partículas virais de adenovírus í 74 . recombinante expressando um antígeno, epítopo ou imunógeno de influenza. No caso de composições terapêuticas e/ou farmacêuticas à base de um poxvírus, uma dose pode estar entre cerca de 10º pfu e cerca de 10º pfu. A composição farmacêutica contém de cerca de 10º a 10º pfu de poxvírus ou herpesvírus recombinante expressando o antígeno epítopo ou imunógeno de influenza.

O volume de dose das composições para espécies alvo que são mamíferos, por exemplo, o volume de dose das composições caninas, baseadas em vetores virais, por exemplo, composições à base de vetores virais não poxvírus, é geralmente entre cerca de 0,l a cerca de 2,0 mL, preferivelmente entre cerca de 0,1 a cerca de 1,0 mL, e mais preferivelmente entre cerca de 0,5 mL a cerca de 1,0 mL.

Com composições inativadas do vírus ou organismo ou i patógeno produzido na nova cultura celular, o animal pode ser administrado com aproximadamente 10º-10º equivalentes de CCIDso (título antes da inativação), vantajosamente aproximadamente 10º-10º equivalentes de CCIDW, em uma unidade de dosagem individual. Alternativamente, ovos de galinha embrionados podem fornecer um substrato para a . propagação de patógeno, em cujo caso a unidade de medida é : a dose infecciosa do ovo média (EIDso). o volume da unidade

: 75 . de dose individual pode ser entre 0,2 mL e 5,0 mL e vantajosamente entre 0,5 mL e 2,0 mL e, mais vantajosamente, de cerca de 2,0 mL. Uma ou mais administrações podem ser feitas; por exemplo,dias injeções a 2-4 semanas de intervalo, e vantajosamente com um estímulo em cerca de 3 semanas depois da primeira injeção.

Em uma modalidade vantajosa, um animal, vantajosamente um cão, é vacinado com duas doses de vacina inativada em intervalos de cerca de 3 a 4 semanas através da via subcutânea, embora uma via intramuscular também seja contemplada. Amostras de sangue depois da segunda vacinação para determinar os níveis de anticorpos específicos de vírus anti-influenza pelos métodos conhecidos por uma pessoa versada na técnica, por exemplo, neutralização de vírus, inibição de hemaglutinação, ELISA ou testes de hemólise radial individual.

A eficácia das vacinas inativadas pode ser testada em cerca de 2 a 4 semanas depois da segunda imunização pelos animais de desafio, vantajosamente cães, com uma cepa virulenta de influenza, vantajosamente a cepa H3N8S de influenza. O animal pode ser desafiado por spray, intranasalmente, intra-traquealmente e/ou oralmente.O ". desafio viral pode ser de cerca de 10º"** EIDs, em um volume : dependendo da via de administração. Por exemplo, se a i 76 administração for por spray, uma suspensão de vírus é pulverizada para gerar cerca de 1 à 100 um de gotículas, se ' a administração for intranasal, intra-traqueal ou oral, o volume do vírus desafio sendo de cerca de 0,5 mL, l-2 mL e 95-10 mL, respectivamente. Animais podem ser observados diariamente por 14 dias após o desafio por sinais clínicos, por exemplo, febre, tosse, descarga nasal ou ocular, estresse respiratório, anorexia e letargia. Além disso, grupos de animais podem ser eutanasiados e avaliados por descriçãos patológicas de hemorragia pulmonar e pleural, traqueíte, bronquite, bronquiolite e broncopneumonia. Swabs da traquéia podem ser coletados de todos os animais após os dias 1-14 de desafio para isolamento viral. A presença ou ausência de antígenos virais em tecidos respiratórios pode ser avaliada por imunoistoquímica, por exemplo, nos dias 3, 7 e 10 pós-desafio. Amostras de sangue podem ser coletadas depois do desafio (por exemplo, nos dias 7 e 14 pós- desafio) e pode ser analisada em relação à presença de anticorpo específicos ao vírus H3N8 anti-influenza.

Deve ser compreendido por uma pessoa versada na técnica que a descrição daqui é fornecida à título de exemplo e a presente invenção não está limitada à isso. À b partir da descrição da presente invenção e do conhecimento da técnica, o profissional habilitado pode determinar a

Vá | quantidade de administrações, a via de administração e as doses a serem usadas para cada protocolo de injeção, sem | qualquer experimentação demasiada.

A presente invenção contempla pelo menos uma administração a um animal de uma quantidade eficiente da composição terapêutica feita de acordo com a invenção.

O animal pode ser macho, fêmea, fêmea grávida e recém- nascido.

Esta administração pode ser através de várias vias incluindo, mas sem se limitar, às injeções intramuscular (IM), intradérmica (ID) ou subcutânea ou através de administração intranasal ou oral.

A composição terapêutica de acordo com a invenção também pode ser administrada por um aparelho sem agulha (como, por exemplo, com um aparelho Pigjet, Biojector ou Vitajet (Bioject, Oregon, EUA)). Outra abordagem para administrar composições de plasmídeo é o uso da eletroporação (ver, por exemplo, S.

Tollefsen et al. j Vaccine, 2002, 20, 3370-3378; S.

Tollefsen et al.

Scand.

JJ.

Immunol, 2003, 57, 229- 238; S.

Babiuk et al., Vaccine, 2002, 20, 3399-3408; Pedido PCT Nº WO99/01158). Em outra modalidade, a composição terapêutica é distribuída ao animal por arma de gene ou bombardeamento de partícula de ouro.

Em uma modalidade vantajosa, o animal é um - vertebrado.

Em uma modalidade mais vantajosa, o vertebrado é um cão.

Pl 79 distribuição em uma quantidade eficaz para eliciar uma resposta imune no animal. ' A invenção será agora descrita a título dos seguintes exemplos não limitativos.

EXEMPLO 1: Vacinação de Cães com Genes HE Expressando Canarypox Um estudo foi efetuado no qual os cães foram cães vacinados nos dias O e 21 com canarypox expressando genes H3 de influenza equino de Kentucky (CP1529) e Newmarket (CP1533). A construção de CP1529 e CP1533 é descrita nos Exemplos 1 (local c5), 4 e 5 do Pedido de Patente ? Internacional WO99/44633, a descrição do qual sendo incorporada por referência.

As sequências de nucleotídeos dos plasmídeos doadores pJTO04 e pJT0O0O5S são apresentadas nas FIGS. le 2. Soro foi coletado e testado contra vírus influenza H3N8 e os outros vírus.

Conforme mostrado na Tabela 1, canarypox expressando genes H3 de hemaglutinina induziram uma quantidade substancial de anticorpos os quais reagiram especificamente com cepas H3N8, mas não com HINl ou H7N7. De modo importante, os anticorpos foram detectáveis em duas semanas depois da primeira imunização. . Deste modo, um canarypox expressando um gene HA de influenza é imunogênico em cães.

. : 80 Tabela 1: Vacinação de cães com canarypox expressando genes de hemaglutinina H3. Antí- Sangria | GRUPO VACINADO GRUPO DE CONTROLE Eprr—EE=

TE EEE E E EEE D21 104, | 91,4 [121, | 74,6 | 121,5 | ns ns ns ns ns "FrFFFFÍA D36 106 86,7 | 111, 123,6 | ns ns ns ns E sld o ee on es pa O es |es fes je |) a o e dereoseoacdosioA mana pre o asa Joga | aa 199.9 des des js joe | | D21 86,2 | 71,4 | 102, | 65,3 ns ns ns ns FFFrFrFTE Eos pEe sa EaAsEs

EPA DT AAA Co dele reabre ever O e re e mA EA AS e ea nd a re ririeto Esc

EEE ss res o a re oreca li resdireiese dn [del

EE EE | Sa O A A LR A A AA zo 81 n.s. = sem amostra ' EXEMPLO 2: Construção do plasmídeo doador pALVAC C5 “ H6p-sintético EIV H3 HA, pJY 1571.1). O gene HA foi derivado da cepa H3N8 Ohio 03 de vírus influenza equino (EIV) isolado de um cavalo em 2003. O gene HA foi sintético com a otimização de códon para a expressão em células de mamíferos. A sequência de aminoácidos de HA cepa Ohio 03 EIV foi comparada com aquela da cepa HA NewMarket H3 e é apresentada na Figura 3.

O propósito foi a construção de um plasmídeo doador ALVAC para a geração de um HA HE EIV otimizado com códon expressando ALVAC recombinante (Ohio 03). O nome do plasmídeo foi HA H3 EIV H6p-sintético pALVAC C5, pJY

1571.1. a estrutura de plasmídeo é pALVAC C5 H6p. O promotor foi um promotor H6.

A descrição da construção de plasmídeo foi como a seguir e foi apresentada esquematicamente na Figura 4A. O HA H3 EIV sintético (Ohio 03) foi isolado de um plasmídeo de HA H3N8 pEIV por digestão EcoRV/Xhol, e ligado ao plasmídeo doador digerido EcoRV/Xhol pALVAC C5 H6p para criar HA H3 EIV H6p-sintético pALVAC C5. No plasmídeo resultante, existem vários sítios de clonagem consistindo de Xhol, Xba I, Cla I e Sma I entre a ORF HA e a sequência T5SAT a qual serve como o sinal de terminação de

. 82 transcrição.

Para aproximar a ORF de HA e a sequência T5AT entre si, aqueles sítios de clonagem foram a seguir ' subsequentemente removidos pela ligação do sítio XhoI repreenchido com o sítio Sma 1. O plasmídeo resultante pJIY1571.1 foi a seguir segquenciado e conformado como mantendo a sequência correta.

Um diagrama do plasmídeo resultante é apresentado na Figura 4B.

A sequência de aminoácido prevista de HA H3 EIV é mostrada na Figura 5A e a sequência de nucleotídeos dos braços e inserção com tradução é mostrada na Figura 5B.

EXEMPLO 3: Construção do canarypox recombinante vCP2242 o propósito deste exemplo foi a geração e caracterização de ALVAC recombinante contendo o HA otimizado com códon H3N8 EIV inserido no local C5 de ALVAC (vCP2242). O vírus de origem foi ALVAC, o plasmídeo doador ! foi pJY1571.1, o sítio de inserção foi um local C5, o promotor foi um promotor H6 e as células para recombinação in vitro foram células de fibroblasto de embriões de galinha primárias (1º CEF). A recombinação in vitro (IVR) foi efetuada por transfecção de células 1º CEF com 15 ug de plasmídeo doador . não IO0linearizado pJIY1571.1. As células transfectadas foram subsequentemente infectadas com ALVAC como vírus de resgate

. 83 em MOI de 10. Depois de 24 h, as células infectadas ' transfectadas foram coletadas, submetidas ao ultra-som e . usadas para varredura de vírus recombinante. Placas recombinantes foram testadas com base no método de hibridização plaque lift usando uma sonda HA EIV syn de 821 pb específica marcada com peroxidase de rábano silvestre (HRP) de acordo com o protocolo do fabricante. Depois de quatro ciclos sequenciais de purificação de placa, o recombinante designado como vCP2242 foi gerado e confirmado por hibridização como 100% positivo para a inserção de HA EIV syn e 100% negativo para a ORF C5.

A análise de expressão e a análise de sequência foram efetuadas. A análise de expressão foi efetuada por Western blot. As células CEF primárias foram infectadas com estoque de vCP2242 em MOI de 10 e incubadas a 37 ºC por 26,5 horas. As células e o sobrenadante celular foram a seguir coletados. As proteínas de amostra foram separadas em um gel SDS-PAGE 10%, transferidas para membrana de náilon Immobilon, e com sinda com uma reunião de anticorpos anti- EIV HA de camundongo monoclonal (anti-Eq/AK/91: 124-1D9-1, 124-3E3-3, 124-4F3-2 e reunião de H3N8 A Eq/miami/63 em diluição de 1/1.000). Antissoro anti-camundongo de cabra conjugado com peroxidase foi usado como um anticorpo secundário e as bandas foram visualizadas usando reagentes

. 84 luminol. vCP2242 mostrou um perfil de expressão de proteína com uma proteína de 80 KDa expressa em pélete celular, porém não no meio de cultura conforme apresentado na Figura

6.

5 Os resultados da análise de sequência demonstraram que as sequências de EIV syn HA e C5L e C5R de ALVAC foram corrigidos.

EXEMPLO 4: Sequências de Nucleotídeo de Influenza Equino de Kentucky DEFINIÇÃO Gene da proteína não estrutural de vírus de influenza A (A/equino/Kentucky/5/02(H3N8)), cds completo. ACESSO AYB55345; SEQ ID Nº 8 1 agcaaaagca gggtgacaaa aacataatgg attccaacac tgtgtcaage tttcaggtag 61 actgttttoct ttggcatgtoe cgcaaacgat tegeagacoca agaactgggt gatgccocat 121 tceettgacog gettegeega gaccagaagt ccctaagggg aagaggtatc actettagte 181 tggacatcga aacagccact catgcaggaa agcagatagt ggagcagatt ctggaaaagg 241 aatcagatga ggcacttaaa atgaccattg cctetgttec tactteacge tacttaacto 301 acatgactct tgatgagatg tcaagagact ggttcatgct catgcccaag caaaaagtaa 361 caggctecoct atgtataaga atggaccagg caatcatgga taagaacatc atacttaaag 421 caaactttag tgtgattttc gaaaggctgg aaacactaat actacttaga gcettcaceg 481 aagaaggage agtegttago gaaatttcac cattacctte tettecagga catactaatg 541 aggatgtcaa aaatgcaatt ggggtcctca teggaggact taaatggaat gataatacgg 601 ttagaatctc tgaaactocta cagagattcg cttggagaag cagtcatgag aatgggagac 661 ctteattece ttcaaageag aaatgaaaaa tggagagaac aattaagcca gaaatttgaa 721 gaaataagat ggttgattga agaagtgcga catagattga aaaatacaga aaatagtttt 781 gaacaaataa catttatgca agccttacaa ctattgcttg aagtagaaca agagataaga 841 actttctegt ttcagottat ttaatgataa aaaacaccect tgtttctact DEFINIÇÃO Gene da proteína de matriz do vírus influenza A (A/equino/Kentucky/5/02 (H3N8), cds completo. ACESSO AYB8S55344; SEQ ID Nº 9

“ 85 1 agcaaaagca ggtagatatt taaagatgag tcettetgace gaggtcgaaa cgtacgttct a: 61 ctcetategta ccateaggee cecteaaage cgagategeg cagagacttag aagatgtett 121 tgcagggaag aacacegate ttgaggcact catggaatgg ctaaagacaa gaccaatcet 181 gtcacctttg actaaaggga ttttaggatt tgtattcacg ctcacegtgc ccagtgageg " 241 aggactgcag cgtagacgct ttgtccaaaa tgoccttagt ggaaacggag atccaaacaa 301 catggacaga gcagtaaaac tgtacaggaa gcttaaaaga gaaataacat tcecatgggge 361 aaaagaggtg gcactaagect attccactag tgcactagco agctgcatgg gactcatata 421 caacagaatg ggaactgtga caaccgaagt ggcatttggc ctagtatgeg ccacatgtga 481 acagattgct gattcccage ategatetcea caggcagatg gtgacaacaa ccaaccceatt 541 aatcagacat gaaaacagaa tggtattagc cagtaccacg gctaaageca tggaacagat 601 ggcaggatca agtgagcagg cagcagagge catggagatt gctagtaagg ctaggcagat 661 ggtacaggca atgagaacca ttgggaccca ccetagetece agtgcegatt tgaaagatga 721 tetecttgaa aatttacagg cctaccagaa acggatagga gtgcaaatgc agcegattcaa 781 gtgatcctct cgttattgca gcaagtatca ttgggatett gcacttgata ttgtggatto 841 ttgategtot tttottoaaa ttcatttate gregecttaa atacgggttg aaaagagagge 901 cttctacgga aggagtacct gagtctatga gggaagaata teggcaggaa cagcagaato 961 ctgtaggatgt tgacgatagt cattttgtca acatagagct ggagtaaaaa actaccettat 1021 ttctact DEFINIÇÃO Gene da neuramninidase do vírus influenza A (A/equino/Kentucky/5/02 (H3N8), cds completo.

ACESSO AYBSS55343; SEQ ID Nº 10 1 agcaaaagca ggagtttaaa atgaatccaa atcaaaagat aatagcaatt ggatttgcat 61 cattggggat attaatcatt aacgtcattc tccatgtagt cagcattata gtaacagtac 121 tggtcoteaa taacaatgga acaggtctga actgcaaagg gacgatcata agagagtaca 181 atgaaacagt aagagtagaa aaaattactc aatggtataa taccagtgca attaagtaca 241 tagagagacc tccaaatgaa tactacatga acaacaccga accactttgt gaggcccaag 301 getttgcace attttccaaa gataatggaa tacgaattgg gtegagaggoe catgttttto 361 tgataagaga accttttgta tcatgttego cctragaatg tagaacottt ttcocteacao 421 agggctcatt actcaatgac aaacattecta acggcacagt aaaggaccga agtccatata 481 ggactttgat gagtgtcaaa atagggcaat cacctaatgt gtatcaagct aggtttgaat 541 cggtggcatg gtcagcaaca gcatgccatg atggaaaaaa atggatgaca gttggagtca 601 cagggccega caatcaagea attgcagtag tgaactatgg aggtattcog gttgatatta 661 ttaattcatg ggcaggggat atcttaagaa cccaagaato atcatgcacc tgcattaaag i 721 gagactgtta ttaggtaatg actgatggac cggcaaatag gcaagctaaa tataggatat 781 tcaaagcaaa agatggaaga gtaattggac agactgatat aagtttcaat gggggacaca 841 tagaggagtg ttcttgttac cccaatgaag ggaaggtgga atgcatatgoc agggacaatt 901 ggactggaac aaatagacca attctggtaa tatcttetga totategtac acagttggat 961 atttgtagtgo tggcattece actgacacte ctaggagaga ggatagtcaa ttcacaggct 1021 catgtacaag acctttggga aataaaggat acggtotaaa aggtttegag tttegacaag 1081 gaactgacgt atgggccgga aggacaatta gtaggacttc aagatcagga ttogaaataa 1141 taaaaatcag gaatggttgg acacagaaca gtaaagacca aatcaggagg caagtgatta 1201 tegatgaccc aaattggtca ggatatageg gttetttcac attgceggtt gaactaacaa 1261 aaaagggatg tttggtococe tgtttetagg ttgaaatgat tagaggtaaa cctgaagaaa 1321 caacaatatg gacctctagoc agetecattg tgatgtatgg agtagatcat aaaattgcca 1381 gttggtcatg gcacgatgga gotattette cetttgacat cgataagatg taatttacga 1441 aaaaactect tgtttctact DEFINIÇÃO Gene da nucleoproteína do vírus de influenza . A (A/equino/Kentucky/5/02 (H3N8), cds completo.

: 86 ACESSO AYB855342; SEQ ID Nº 11 1 agcaaaagca gggtagataa tcactcactg agtgacatca aagtcatgge gtetcaagge 61 accaaacgat cctatgaaca gatggaaact gatggggaac gccagaatgoc aactgaaate j 121 agagcatctg teggaaggat ggtgggagga ateggceggt tttatgttca gatgtgtact 181 gagcttaaac taaacgacca tgaagggegg ctgattcaga acagcataac aatagaaago 241 atggtacttt cggcattega cgaaagaaga aacaagtatc tegaggagea teceagtget 301 ggaaaagacc ctaagaaaac gggaggccog atatacagaa ggaaagatgg gaaatagato 361 agggaactca tcctccatga taaagaagaa atcatgagaa tctggegtca ggccaacaat 421 ggtgaagacg ctactgctgg tcttactcat atgatgatct ggcactccaa teteaatgac 481 accacatacc aaagaacaag ggctettgtt cggactaggga tggatceccag aatgtgctct 541 ctgatgcaag gctcaacoct cccacggaga tetggageeg ctagtgctgc agtaaaagot 601 gttggaacaa tggtaatgga actcatcaga atgatcaaac gcggaataaa tgatcggaat 661 ttctggagag gtgaaaatgg togaaggace agaattgctt atgaaagaat gtgcaatatc 721 ctcaaaggga aatttcagac agcagcacaa cgggctatga tggaccaggt gagggaagge 781 cgcaatcetg gaaacgctga gattgaggat ctcattttct tagcacgate agcacttatt 841 ttgagaggat cagtagccca taaatcatge ctacetgcoct gtgtttatag ccttgcagta 901 accagtgggt atgactttga gaaggaagga tactctotgg ttaggaattga tectttcaaa 961 ctactccaga acagtcaaat tttcagtcta atcagaccaa aagaaaaccec agcacacaag 1021 agccagttag tgtogatage ataccattct gcagcattta aggacctgag agttttgaat 1081 ttcattagag gaaccaaagt aatcccaaga ggacagttaa caaccagagg agttcaaatt 1141 gcttcaaatg aaaacatgga gacaatagat tctagcacac ttgaactgag aagcaaatat 1201 tgggcaataa ggaccagaag tggaggaaac accagtcaac agagagcatc tgcaggacag 1261 ataagtgtgc aacctacttt ctcagtacag agaaatettec cetttgagag agcaaccatt 1321 atggctgcat tcactagtaa cactgaaggg aggacttcog acatgagaac ggaaatcata 1381 aggatgatgg aaagtgccaa atcagaagat gtgtctttco aggggegggg agtettegag 1441 ctcteggacg aaaaggcaac gaaccegateo gtgcetteot ttgacataag caatgaagag 1501 tettatttct teggagacaa tgctgaggaa tttgacagtt aaagaaaaat accettottt 1561 ctact DEFINIÇÃO Precursor de hemaglutinina de vírus influenza A (A/equino/Kentucky/5/02 (H3N8), gene, cds completo.

ACESSO AYB55341; SEQ ID Nº 12

. 87 1 agcaaaagca ggggatattt ctgtcaatca tgaagacaac cattattttg atactactga i. 61 cccattaggge ctacagtcaa aacccaatca gtggcaacaa cacageecaca ttogtotcetog 121 gacaccatgc agtagcaaat ggaacattog taaaaacaat aagtgatgat caaattgagg 181 tgacaaatgc tacagaatta gttcagagca tttcaatogo gaaaatatgc aacaactcat ” 241 atagaattct agatggaaga aattgcacat taatagatgc aatgctagga gaccccecact 301 gtgacgtctt tcagtatgag aattgggacc tectttataga aagaagcage gotttcagea 361 attgctacco atatgacatc cctgactatg categetoog atecattata geatecteag 421 gaacattgga attcacagca gagogattca catggacagg tgtcactcaa aacggaagaa 481 gtggagcctg caaaagggga tcageegata gtttetttag cogactgaat tagctaacaa 541 aatctggaaa ctcttacccec acattgaato tgacaatgcc taacaataaa aatttcgaca 601 agctatacat ctgggggatt catcaccega gcetcoaaatca agagcagaca aaattgtaca 661 tccaagaatce aggacgagta acagtctcaa caaaaagaag tcaacaaaca ataatcccecta 721 acatcggatc tagacegtog gtcagaggtc aatcaggecag gataagcata tactggacca 781 ttgtaaaacc tggagatatc ctaatgataa acagtaatog caacttagtt gcaccgeggg 841 gatattttaa attgaaaaca gggaaaagct ctgtaatgag atcagatgca cccatagaca 901 tttgtgtgto tgaatgtatt acaccaaatg gaagcatctc caacgacaag ccattccaaa 961 atgtgaacaa agttacatat ggaaaatgcc ccaagtatat caggcaaaac actttaaagt 1021 tggccactog gatgaggaat gtaccagaaa agcaaatcag aggaatcttt ggagcaatag 1081 cgggattcat cgaaaacgge tgggaaggaa tagttgatag gtagtataga ttecgatate 1141 aaaactctga aggaacaggg caagctgcag atctaaagag cactcaagca gccategace 1201 agattaatog aaagttaaac agagtgattog aaagaaccaa tgagaaattc catcaaatag 1261 agaaggaatt ctcagaagta gaaggaagaa ttcaggactt ggagaaatat gtagaagaca 1321 ccaaaataga cctatggtce tacaatgcag aattgctggt ggctetagaa aatcaacata 1381 caattgactt aacagatgca gaaatgaata aattattcga gaagactaga cgcceagttaa 1441 gagaaaacgc agaagacatg ggaggtggat gtttcaagat ttaccacaaa tgtgataatg 1501 catgcattog atcaataaga aatgggacat atgaccatta catatacaga gatgaagcat 1561 taaacaaccg atttcaaatc aaaggtottg agttgaaatc aggctacaaa gattggatac 1621 tgtagatttc attegoecata tcatacttet taatttacgt tattctattg gatttcatta 1681 tgtgggcttg ccaaaaaggec aacatcagat gcaacatttg catttgagta aactgatagt 1741 taaaaacacc cttgtttcta ct DEFINIÇÃO Gene da PA polimerase do vírus influenza A (A/equino/Kentucky/5/02 (H3N8), cds completo.

ACESSO AY85534; SEQ ID Nº 13

. 88 1 agecgaaagea ggtactgatc caaaatggaa gactttgtgo gacagtgctt caatccaato ” 61 atcgtegage ttgcggaaaa ggcaatgaaa gaatatggag aggaccegaa aatcgaaaca 121 aacaaatttg cagcaatatg cactcacttg gaagtctgct tcatgtacte ggatttecac 181 tttattaatg aactgggtga gtcagtggto atagagtctg gtgacccaaa tgctetttto 2 241 aaacacagat ttgaaatcat tgagaggaga gatcgaacaa tggcatagac agtagtaaac 301 agcatctgca acaccacaag agctgaaaaa cctaaattte ttecagattt atacgactat 361 aaggagaaca gatttgttga aattggtgtg acaaggagag aagttcacat atactacctg 421 gagaaggcca acaaaataaa gtctgagaaa acacatatcc acattttcte atttacagga 481 gaggaaatgg ctacaaaage ggactatact cttgatgaag agagtagagc caggatcaag 541 accagactat tcactataag acaagaaatg gccagtagag gcectetagga ttectttogt 601 cagtcegaga gaggcgaaga gacaattgaa gaaagatttg aaatcacagg gacgatgege 661 aagecttgcca attacagtect cccacegaao ttetecagec ttgaaaattt tagagtctat 721 gtggatagat tcgaacegaa cggctgcatt gagagtaage tttctcaaat gtocaaagaa 781 gtaaatgcca gaategaacc attttcaaag acaacacccocc gaccactceaa aatgccaggt 841 ggtccacect gecateageg atetaaatto ttgctaatagg atgctctgaa actgagcatt 901 gaggacccaa gtcacgaggg agagggaata ccactatatg atgcaatcaa atgcatgaaa 961 actttctttg gatggaaaga goccagtatt gttaaaccac atgaaaaggg tataaacceg 1021 aactatctcc aaacttggaa gcaagtatta gaagaaatac aagaccttga gaacgaagaa 1081 aggaccceca agaccaagaa tatgaaaaaa acaagccaat tgaaatgggc actaggtaaa 1141 aatatggcac cagagaaagt ggattttgag gattgtaaag acatcagtga tttaaaacag 1201 tatgacagcg atgagccaga aacaaggtct cttgcaagtt ggattcaaag tgagttcaac 1261 aaagcttgtg agctgacaga ttcaagctgg atagageteg atgaaattgg ggaggatato 1321 geccocaatag aatacattgc gagcatgagg agaaattatt ttactgctga gatttccecat 1381 tgtagagcaa cagaatatat aatgaaagga gtgtacatca acactgctet actcaatgca 1441 tectgtagctaga cgatggatga atttcaatta attccgatga taagtaaatg caggaccaaa 1501 gaagggagaa ggaaaacaaa tttatatgga ttcataataa agggaaggtc ccatttaaga 1561 aatgatactg acgtggtgaa ctttgtaagt atggaatttt ctctoactga tecaagattt 1621 gagccacaca aatgggaaaa atactgcgtt ctagaaatto gagacatgct tetaaggact 1681 gctgtaggtc aagtgtcaag acccatgttt ttgtatgtaa ggacaaatgg aacctctaaa 1741 attaaaatga aatggagaat ggaaatgagg cgctgcotee tteagtetet gcaacagatt 1801 gaaagcatga tegaagetga gtcotcagte aaagaaaago acatgaccaa agaatttttt 1861 gagaacaaat cagagacatg gcctatagga gagtcccoca aaggagtaga agagggetca 1921 atcgggaagg tttgcaggac cttattagca aaatctgtgt ttaacagttt atatgcatct 1981 ccacaactgg aagaggtttte agetgaatct aggaaattac ttctcattgt tcaggetett 2041 agggataacc taggaacctagg aacctttgat attggggggt tatatgaatec aattgaggag 2101 tgcctgatta atgatccotg ggttttgctt aatgcatectt ggtteaacte cttecttaca 2161 catgcactga agtagttgtg gcaatgctac tatttgctat ccatactgtec caaaaaagta 2221 ccttgtttct act DEFINIÇÃO Gene da PBl polimerase 1 do vírus influenza A (A/equino/Kentucky/5/02 (H3N8), cds completo.

ACESSO AY855339; SEQ ID Nº 14

. 89 1 agcgaaagca ggcaaaccat ttgaatogat gtcaatecga ctetactttt cttaaaggto 61 ccagegcaaa atgctataag cacaacattc ccttatactg gagatcoteco ctacagtcat 121 ggaacaggga caggatacac catggatact gtcaacagaa cacaccaata ttcagaaaag 181 gggaaatgga caacaaacac tgagattgga gcaccacaac ttaatccaat cgatggacca 241 cttcctgaag acaatgaacc aagtgggtac gcccaaacag attotatatt ggaagcaato b 301 getttecttg aagaatccca tcceggaato tttgaaaatt cgtatcttga aacgatoggag 361 gtgattcagc agacaagagt ggacaaacta acacaaggcc gacaaactta tgattggacc 421 ttgaatagga atcaacctgc cgcaacagca cttgctaata caattgaagt gttcagatca 481 aatggtctga cttccaatga atcagggagg ttgatggact tcctraaaga tgtcatggag 541 tecatgaaca aggaagaaat ggaaataaca acacacttcc aacgaaagag aagagtaaga 601 gacaacatga caaagagaat ggtaacacag agaaccatag ggaagaaaaa acaacgatta 661 aacagaaaga gttatctaat cagaacatta accctaaaca caatgaccaa ggacgctgag 721 agagggaaat tgaaacgacg agcaatcgca accccaggga tgcagataag aggatttgta 781 tattttgttg aaacactagc ccegaagaata tgtgaaaagec ttgaacaatc aggattgcca 841 gttggcagta atgagaaaaa ggccaaacto gectaatgtcg tcagaaaaat gatgactaat 901 tcccaagaca ctgaactete cttcaccate actggggaca ataccaaatg gaatgaaaat 961 cagaacccac gcatattcct ggcaatgatoc acatacataa ctagaaacca gccagaatag 1021 ttcagaaatg ttctaagcat tgcacegatt atgttctcaa ataaaatggc aagactagag 1081 aaaggatata tgtttgaaag caaaagtato aaactgagag ctcaaataco agcagaaato 1141 ctagcaagca ttgacctgaa atatttcaat gattcaacaa aaaagaaaat taaaaagata 1201 egaccactte tggttgacgg gactgcttca ctgagtcetg gcatgatgat gagaatatte 1261 aacatgttga gcactgtgct gggtgtatco atattaaacec tgggccagag gaaatacaca 1321 aagaccacat actggtagga tggtctgcaa tcatcegatg actttgcttt gatagtgaat 1381 gegectaatc atgaaggaat acaagctoga gtagacagat tctatagaac ttgcaaacto 1441 gtegggatca acatgagcaa aaagaagtcc tacataaata gaaccggaac attcegaattc 1501 acaagctttt tcetaceggta tggttttgta gcocaatttca gcatggaact acccagtttt 1561 ggggtttcog gaataaatga atctgcagac atgagcattg gagtgacagt catcaaaaac 1621 aacatgataa ataatgatct Ccggtectgco acggcacaaa tggcacteoca actetteatt 1681 aaggattacc ggtacacata cceggtgccat agaggtgata cccagataca aaccagaaga 1741 tettttgagt tgaagaaact gtgggaacag actegatcaa agactgagtct actggtatca 1801 gatgggggte caaacctata taacatcaga aacctacaca teceggaagt ttgtttaaaa 1861 tgggagctaa tggatgaaga ttataagggg agactatgca atccattaaa tectttegtt 1921 agtcacaaag aaattgaatc agtcaacagt gcagtagtaa tgcctgcgca tagecotaco 1981 aaaagcatog agtatgatgc tgttgcaaca acacattctt ggatccocaa gaggaacega 2041 tccatattga acacaageca aaggggaata ctegaagatg agcagatgta tcagaaatgo 2101 tgcaacctgt ttgaaaaatt cttccccage agetcataca gaagaccagt cggaatttct 2161 agtatggttg aggccatagt gtccagagec cgcattgatg cacgaattga cttogaatet 2221 ggacggataa agaaggatga gttcgctgag atcatgaaga tetgttocac cattgaagag ' 2281 ctcagacggc aaaaatagto aatttagctt gatcttcatg aaaaaatgco ttgtttctac 2341 t DEFINIÇÃO Gene da PB2 polimerase 2, vírus influenza A (A/equino/Kentucky/5/02 (H3N8), cds completo.

ACESSO AY855338; SEQ ID Nº 15

. 90

1 agcegaaagca ggtcaaatat attcaatatg gagagaataa aagaactgag agatctgatg : 61 ttacaatccc gcaccegega gatactaaca aaaactactg tggaccacat ggccataato 121 aagaaataca catcaggaag acaagagaag aaccetgcac ttaggatgaa atggatgatg 181 gcaatgaaat acccaattac agcagataag aggataatog agatgattcc tgagagaaat . 241 gaacagggac aaaccctttg gagcaaaacg aacgatgctg gcteagaceg cataatagta 301 tcacctetgg cagtgacatg gtagaatagg aatggaccaa caacgagcac aattcattat 361 ccaaaagtct acaaaactta ttttgaaaag gttgaaagat tgaaacacgo aaccetttgge 421 ccegtteatt ttaggaatca agtcaagata agacgaagag ttgatgtaaa ccectggteac 481 geggacctca gtgccaaaga agcacaagat gtgatcatag aagttgtttt cccaaatgaa 541 gtgggageca gaattetaac atcggaatca caactaacaa taaccaaaga gaaaaaggaa 601 gaacttcagg actgcaaaat tgctcccttg atggtagcat acatgctaga aagagagtto 661 gtcogaaaaa caaggttect cccagtoagea ggcgagaacaa gcagtgtata cattgaagto 721 ttgcatctga ctcagggaac atgctgggag caaatgtaca cccraggagg agaagttaga 781 aacgatgata ttgatcaaag tttaattatt gcagcccocgga acatagtgag aagagegaca 841 gtatcagcag atccactagec atcecctactg gaaatatacc acagtacaca gattggtgga 901 ataaggatogg tagacatcct taagcagaat ccaacagagg aacaagetgt ggatatatgc 961 aaagcagcaa tgggattgag aattagctca tcattcaget ttogtoagatt caccttcaaa 1021 agaacaagtg gatcatcagt caagagagaa gaagaaatgc ttacgggcaa ccttcaaaca 1081 ttgaaaataa gagtgcatga gggctatgaa gaattcacaa tggtcggaag aagagcaaca 1141 gccattetea gaaaggeaac cagaagattg attcaattga tagtaagtog gagagatgaa 1201 caatcaattg ctgaagcaat aattgtagcc atggtaotttt cgcaagaaga ttgcatgata 1261 aaagcagttc gaggogattt gaactttatt aatagagcaa atcagcgttt gaaccccato 1321 catcaactct tgaggcattt ccaaaaagat gcaaaagtooc ttttccaaaa ttoggagaatt 1381 gaacccatcg acaatgtaat gagaatgatt ggaatattgc ctgacatgac cccaageace 1441 gagatgtcat tgagaggagt gagagtcagc aaaatoggag tggatgagta ctccageact 1501 gagagagtgg tggtgagcat tgaccgtttt ttaagagttc gggatcaaag gggaaacata 1561 ctactgtccc ctgaagaagt cagtgaaaca caaggaacgg aaaagotgac aataatttat 1621 tegteateaa tgatgtggga gattaatagt ccegaateag tgttggtcaa tacttatcaa 1681 tggatcatca ggaactggga aattgtaaaa attcagtggt cacaggaccc cacaatogtta 1741 tacaataaga tagaatttga gccattccag tocetagtec ctagggecac cagaagccaa 1801 tacageggtt tegtaagaac cctgtttcag caaatgcgag atatacttgg aacatttgat 1861 actgctcaaa taataaaact ccteccetttt gocgetgcte ctecggaaca gagtaggatog 1921 cagttctett ctttgactgt taatgtaaga ggatcgggaa tgaggatact tgtaagaggec 1981 aattccccag tgttcaacta caataaagcc actaaaagge tcacagtect cggaaaggat 2041 gcaggtgege ttactgagga cccagatgaa ggtacggetg gagtagaatc tactatteta 2101 agagggtttc tcattttagg taaagaaaac aagagatatg gcccageact aagcatcaat 2161 gaactaagca aacttgcaaa aggggagaaa gccaatgtac taattgggca aggggacgta 2221 gtgttggtaa tgaaacggaa acgtgactct agcatactta ctgacagcca gacagegace 2281 aaaaggattc ggatggccat caattagtot tgaattgttt aaaaacgacc ttogtttctac

2341 t DEFINIÇÃO Gene precursor da hemaglutinina do vírus de influenza A (A/equino/Kentucky/1/91 (H3N8), cds completo. 3 ACESSO L39918; SEQ ID Nº 16

91 Y 1 agcaaaagea gaoggatattt ctgtcaatca tgaagacaac cattattttg atactactga - 61 cccattaggt ctacagtcaa aacccaacca gtggcaacaa cacagecaca ttatgtetgg 121 gacaccatgc agtagcaaat ggaacattog taaaaacaat aactgatgac caaattgagg 181 tgacaaatgc tactgaatta gttcagagca tttcaatagg gaaaatatgoc aacaactcat FP” 241 atagagttct agatggaaga aattocacat taatagatgc aatgctagga gacceceact 301 gtgatgtctt tcagtatgag aattgggacc tcettcataga aagaagcage getttcagca 361 gttgctaccc atatgacate cetgactato categeteeg gtecattata gceatecteag 421 gaacattgga attcacagca gagogattca catggacagg tgtcactcaa aacggaagaa 481 gtagatcctg caaaagggga teagoogata gtttctttag cogactgaat tggctaacaa 541 aatctggaaa ctcttaccco acattgaatg tgacaatgcc taacaataaa aatttcgaca 601 aactatacat ctgggogatt catcaccoga gctcaaacga agagcagaca aaattgtaca 661 tecaagaate aggacgagta acagtctcaa caaaaagaag tcaacaaaca ataatccecta 721 acatcggatc tagacegtag gtcaggggte aatcaggcag gataagcata tactggacca 781 ttgtaaaacc tggagatatc ctaatgataa acagtaatog caacttagtt gcacegeggg 841 gatattttaa attgaaaaca gggaaaagct ctgtaatgag atcagatgca cccatagaca 901 tttgtgtato tgaatgtatt acaccaaatg gaagcatccco caacgacaaa ccatttcaaa 961 atgtgaacaa agttacatat ggaaaatgcc Cccaagtatat caggcaaaac actttaaagc 1021 tggccactgg gatgaggaat gtaccagaaa agcaaatcag aggaatcttt ggagcaatag 1081 cgggattcat agaaaacogc tgggaaggaa taggttgatag gtagtatgga ttcogatato 1141 aaaactcegga aggaacagga caagctgcag atctaaagag cactcaagca geccategace 1201 agatcaatgg aaaattaaac agagtgattg aaaggaccaa tgagaaattc catcaaatag 1261 agaaggaatt ctcagaagta gaagggagaa tccaggattt ggagaagtat gtagaagaca 1321 ccaaaataga cctatggteo tacaatgcag aattgctogt ggctctagaa aatcaacata 1381 caattgactt aacagatgca gaaatgaata aattattcga gaagactaga cgccagttaa 1441 gagaaaacge ggaagacatog ggaggtagat gtttcaagat ataccacaaa tgtgataato 1501 catgcattgg atcaataaga aatgggacat atgaccatta catatacaga gatgaagcat 1561 taaacaaceg gtttcaaatc aaaggtgttg agttgaaatc aggctacaaa gattggatac 1621 tgtagatttc attegecata teatacttet taatttgocgt tattctatta gotttcatta 1681 tgtggacttg ccaaaaagge aacatcagat gcaacatttog catttgagta aactgatagt 1741 taaaaacacc cttaotttota ct DEFINIÇÃO Gene precursor da hemaglutinina do vírus influenza A (A/equino,Kentucky/1/92 (H3N8), cds completo ACESSO L39917; SEQ ID Nº 17

92 e 1 agcaaaagca gaggatattt ctgtcaatca tgaagacaac cattatttto atactactga . 61 cccattgggt ctacagtcaa aacccaacca gtggcaacaa cacagcoaca ttatgtctag 121 gacaccatgc agtagcaaat ggaacattgg taaaaacaat aactgatgac caaattgago 181 tgacaaatgc tactgaatta gttcagagca tttcaatagg gaaaatatgc aacaactcat . 241 atagggttct agatggaaga aattgcacat taatagatgc aatgctagga gacceceact 301 gtgatgtctt tcagtatgag aattgggacc tettcoataga aagaagcage getttcagea 361 attgctaccc atatgacatc cetgactatg categetoeog gtocattata gcatectcag 421 gaacattaga attcacagca gagggattca catggacagg tgtcactcaa aacggaagaa 481 gtggagecctg caaaagggga tcagcoegata gtttctttag cegactgaat tggctaacaa 541 aatctggaaa ctcttaccce acattgaatg tgacaatgcc taacaataaa aatttegaca 601 aactatacat ctgggggatt catcaccoga getcaaacaa tgagcagaca aaattgtata 661 tcecaagaaac aggacgagta acagtctcaa caaaaagaag tcaacaaaca ataatccecta 721 acateggate tagacegtgg gtcaggggte aatcaggcag gataagcata tactaggacca 781 ttgtaaaacc taggagatatc ctaatgataa acagcaatgg caacttagtt gcacegegaog 841 gatattttaa attgagaaca gggagaagect ctgtaatgag atcagatgca cccatagaca 901 tttgtgtgto tgaatgtatt acaccaaatg gaagcatcce Caacgacaaa ccatttcaaa 961 atgtgaacaa agttacatat ggaaaatgcc ccaaatatat caggcaaaac actttaaage 1021 tggccactgg gatgaggaat gtaccagaaa agcaaatcag aggaatcttt ggagcaatag 1081 cgggattcat agaaaacggc tgggaaggaa tggttgatag gtagtatgga tteegatate 1141 aaaactcgga aggaacagga caagctgcag atctaaagag cactcaageca gccategace 1201 agatcaatgg aaaattaaac agagtgattg aaaggaccaa tgagaaattc catcaaatag 1261 agaaggaatt ctcagaagta gaagggagaa tccaggattt ggagaagtat gtagaagaca 1321 ccaaaataga cctatggtce tacaatgcag aattgctagt ggctcetagaa aatcaacata 13681 caattgactt aacagacgca gaaatgaata aattattcga gaagactaga cogccagttaa 1441 gagaaaacgc ggaagacatag ggaggtagat gtttcaagat ttaccacaaa tgtgataato 1501 catgcattgg atcaataaga aatgggacat atgaccatta catatacaga gatgaagcat 1561 taaacaaccg atttcaaatc aaaggtottg aattaaaatc aggctacaaa gattggatac 1621 tgtggatttc attegoecata tceatgettet taatttgtgt tgttctattg gatttcatta 1681 tgtgggcttg ccaaaaagge aacatcagat gcaacattto catttgagta aactgatagt 1741 taaaaacacc cttagtttcta ct DEFINIÇÃO Gene precursor da hemaglutinina do vírus influenza A (A/equino/Kentucky/1/90 (H3N8), cds completo.

S ACESSO L39915; SEQ ID Nº 18

. 93 . 1 agcaaaagca ggggatattt ctgtcaatca tgaaaacaac cattatttto atactactga 61 cccattgggt ctacagtcaa aacccaacca gtggcaacaa cacagccaca ttatgtctogg , 121 gacaccatgc agtagcaaat ggaacattgg taaaaacaat aactgatgac caaattgagg 181 tgacaaatgc tactgaatta gttcagagca tttcaatagg aaaaatatgc aacaactcat . 241 atagggttct agatggaaga aattgcacat taatagatgc aatgctagga gacceteact 301 gtgatgtctt tcagtatgag aattgggacc tettoataga aagaagcagec gettteagea 361 attgctacco atatgacatc cetgactatg categeteeg gtecattgta gcatecteag 421 gaacattaga attcacagca gagggattca catggacagg tatcactcaa aacggaggaa 481 gtggagcctg caaaagagga tcagcogata gtttctttag cegactgaat tggctaacaa 541 aatctggaaa ctettaccoco acattgaatg tgacaatgcc taacaataaa aatttcgaca 601 aactatacat ctgggggatt catcaccega gctcaaacaa tgagcagaca aaattgtata 661 tccaagaate aggacgagta acagtctcaa caaaaagaag tcaacaaaca ataatcecta 721 acatcggatc tagacegtag gtcaggggte aatcaggcag gataagcata tactggacca 781 ttgtaaaacc tggagatatc ctaatgataa acagtaatgg caacttagtt gcaccgcggg 841 gatattttaa attgagaaca gggaaaaget ctgtaatgag atcagatgca cccatagaca 901 cttgtgtgtc tgaatgtatt acaccaaatg gaagcatccc caacgacaaa ccatttcaaa 961 atgtgaacaa agttacatat ggaaaatgcc ccaagtatat caggcaaaac actttaaagc 1021 tggccactgg gatgaggaat gtaccagaaa agcaaatcag aggaatcttt ggagcaatag 1081 cgggattcat agaaaacgge tgggaaggaa tagttgatag gtagtataga ttcogatate 1141 aaaactcgga aggaacagga caagctgcag atctaaagag cactcaagca gccategace 1201 agatcaatgg aaaattaaac agagtgattg aaaggaccaa tgagaaattc catcaaatag 1261 agaaggaatt ctcagaagta gaagggagaa tcaaggactt ggagaagtat gtagaagaca 1321 ccaaaataga cctatggtcce tacaatgcag aattgctggt ggctcetagaa aatcaacata 1381 caattgactt aacagatgca gaaatgaata aattattcga gaagactaga ecgccagttaa 1441 gagaaaacgec ggaagacatg ggaggtagat gtttcaagat ctaccacaaa tgtgataatg 1501 catgcattgg atcaataaga aatgggacat atgaccatta catatacãaa gatgaagcat 1561 taaacaacocg atttcaaatc aaaggtgttg agttgaaatc aggctacaaa gattagatac 1621 tgtggatttc attegecata teatgottot taatttacgt tgttctattag ggtttcatta 1681 tgtgggcttg ccaaaaagge aacatcagat gcaacattto catttgagta aactgatagt 1741 taaaaacacc cttottteta ct DEFINIÇÃO Gene Precursor de hemaglutinina do vírus influenza A (A/equino/Kentucky/1/94 (H3N8), cds completo.

ACESSO L39914; SEQ ID Nº 19

: 94 . 1 agcaaaagca ggggatattt ctatcraatca tgaagacaac cattattttg atactactga 61 cccattgggt ctacagtcaa aacccaacca gtggcaacaa cacagccaca ttatagtctgg Í 121 gacaccatgc agtagcaaat ggaacattgg taaaaacaat aactgatgac caaattgago 181 tgacaaatgc tactgaatta gttcagagca tttcaatagg gaaaatatgc aacaactcat » 241 atagagttct agatggaaga aattgcacat taatagatgc aatgctagga gacccecact 301 gtgatagtctt tcagtatgag aattaggacc tcettcataga aagaagcage getttoagea 361 attgctacce atatgacatc cctgactatg categeteog gtecattgta gcatecteag 421 gaacattgga attcacagca gagggattca catggacagg tgtcactcaa aacggaagaa 481 gtggagcctg caaaagggga tcagcocgata gtttctttag cogactgaat taggotaacaa 541 aatctggaaa ctcttacceco acattgaatg tgacaatgcc taacaataaa aatttogaca 601 aactatacat ctgggggatt catcacccga gctcraaacca acagcaaaca gaattgtaca 661 tccaagaatc aggacgagta acagtctcaa caaaaagaag tcaacaaacg ataatcceta 721 atatcggatc tagacegtag gtraggggte aatcaggcag gataagecata tactggacca 781 ttgtaaaacc tggagatatoc ctaatgataa acagtaatgg caacttagtt gcaccgeggg 841 gatattttaa attgaaaaca gggaaaagct ctgtaatgag atcagatgca cccatagaca 901 tttgtgtgto tgaatgtatt acaccaaatg gaagcatccc caacgacaaa ccatttcaaa 961 atgtgaacaa agttacatat ggaaaatgcc ccaagtatat caggcaaaac actttaaage 1021 tggccactgg gatgaggaat gtaccagaaa agcaaatcag aggaatcttt ggagcaatag 1081 cgggattcat agaaaacggc tgggaaggaa togttgatag gtagtatgga ttocgatato 1141 aaaactcgga aggaacagga caagctgcag atctaaagag cactcaagca gocategace 1201 agattaatgg aaaattaaac agagtgattg aaaggaccaa tgagaaattc catcaaatag 1261 agaaggaatt ctcagaagta gaagggagaa tccaggactt ggagaagtat gtagaagaca 1321 ccaaaataga cctatggtco tacaatgcag aattgctggt ggctctagaa aatcaacata 1381 caattgactt aacagatgca gaaatgaata aattattcga gaagactaga cgccagttaa 1441 gagaaaacgc ggaagacatg ggaggtagat gtttcaagat ttaccacaaa tgtgataato 1501 catgcattgg atcaataaga aatgggacat atgaccatta catatacaga gatgaagcat 1561 taaacaaccg atttcaaatc aaaggtgttg agttgaaatc aggctacaaa gattggatac 1621 tgtagatttco attogecata teatgcttet taatttacgt tgttotattg ggtttcatta 1681 tgtgggcttg ccaaaaagge aacatcagat gcaacatttg catttgagta aactgatagt 1741 taaaaacace cttgtttcta ct DEFINIÇÃO Gene da nucleoproteína do vírus influenza A (A/equino/Kentucky/1/81 (H3N8), cds completo.

ACESSO AY291288; SEQ ID Nº 20 . x

, . 95 : 1 agcaaaagea gggtagataa tcactcactg agtgacatca aagtcatago gteteaagge - 61 accaaacgat cttatgagca gatggaaact ggtggggaac gccagaatgco aactgaaatc 121 agagcatctg ttggaaggat ggtgggagga ateggecggt tctatgttca aatgtgtact 181 gagcttaaac tcaacgacca tgaagggegg ctgattcaga acagcataac aatagaaago +* 241 atggtacttt cggcattcga cgaaagaaga aacaagtacc tegaggagea tececagtagct 301 gggaaagacc ccaagaaaac gggaggccog atatacagaa ggagagataog gaaatagatg 361 agagaactca tcctccatga taaagaagaa atcatgagga tctagegtcea ggccaacaat 421 ggtgaagacg ctactgctag tcottactcat atgatgatct ggcactccaa tetcaatgac 481 accacctacc aaagaacaag gagctcttott cgggctgagga tggatcccag aatgtagctct 541 ctgatgcaag gatcaactct cccacggaga tetggageta ceggtgctogo agtgaagagt 601 gttggaacaa tggtaatagga actcatcagg atgatcaaac gcgggataaa tgatogaaaco 661 ttctggagag gtgaaaatag tegaagaacc agaattgctt atgaaagaat gtacaacatc 721 ctcaagggga aattccaaac agcagcacaa cgagcaatga tggaccaagt gagggaggge 781 cgcaatecctg gaaatactga gattgaggat ctceattttct tggcacgatc agcactcoeatt 841 ctgagaggat cagtagcecca taaatcatgc ctacctgcot gtgtttatoag ccttacagta 901 gecagtagggt atgactttga gaaagaggga tactctetgg ttggaattga tcotttcaaa 961 ctactccaga acagccaaat tttcagtcta atcagaccga aagaaaatcc agcacacaag 1021 agccagetgg tgtggatgge atgccattct gcagecattto aggacctgag agtttcgaat 1081 ttcattagag gaaccaaagt aatcccaaga ggacagttag caaccaggog agtagcaaatt 1141 gcttcaaatg aaaacatgga gacaatagat tctagcacac tcgaactgag gagcagatat 1201 tgggcaataa ggaccaggag tagggggaac accagtcaac agagagcatc tgcaggacag 1261 ataagtgtgc aacccacttt ctcagtgcag agaaatctte cctttgaaag agcaaccatt 1321 atggctgcat tcactggaaa cactgagggg aggacttceg acatgagaac ggaaatcata 1381 aggatgatgg aaaatgccag atcagaagat gtgtettteco aggggegggg agtcettogag 1441 ctcteggacg aaaaggcaac gaaccegate gtgccttect ttgacatgag caatgaaggo 1501 tettatttct toggagacaa tgctgaggag tttgacagtt aaagaaaaat acccttottt 1561 ctact

DEFINIÇÃO Gene do vírus influenza A (A/equino/Kentucky/1/92 (H3N8)) para o precursor da hemaglutinina, cds parciais

ACESSO D30683; SEQ ID Nº 21 1 gtcaatcatg aagacaacca ttattttgat actactgacc cattgggtct acagtcaaaa 61 cccaaccagt ggcaacaaca cagccacatt atgtctggga caccatgcag tagcaaatog 121 aacattggta aaaacaataa ctgatgacca aattgaggtg acaaatgcta ctgaattagt 181 tcagagcatt tcaataggga aaatatgcaa caactcatat agggttctag atggaagaaa 241 ttgcacatta atagatgcaa tgctaggaga ceeceactgt gatgtctttc agtatgagaa 301 ttgggacctc ttcatagaaa gaagcagoge tttcagecaat tgctacccat atgacatcce 361 tgactatgca tegetecggt ccattatage atcctcagga acattagaat tcacagcaga 421 gggattcaca tggacaggtg tcactcaaaa cggaggaagt ggagcetgca aaaggggato 481 agcegatagt ttctttagco gactgaattg gctaacaaaa tectggaaact cttaccecac 541 attgaatgtg acaatgccta acaataaaaa tttogacaaa ctatacatct gggggattca 601 tcaccegage traaacaatg agcagacaaa attgtatatc caagaaacag gacgagtaac 661 agtctcaaca aaaagaagtc aacaaacaat aatccetaac atcggatceta gacegtaggt 721 caggggtcaa tcaggcagga taagcatata ctagaccatt gtaaaacctg gagatatcct 781 aatgataaac agcaatggca acttagttgc accgegggga tattttaaat tgagaacagg 841 gagaagctct gtaatgagat cagatgcacc catagacatt tgtgtgtctg aatgtattac 901 accaaataga agcatcccca acgacaaacec atttcaaaat gtgaacaaag ttacatatog 961 aaaatgcccc aaatatatca ggcaaaacac tttaaagctg gccactagga tgaggaatgt * 1021 accagaaaag caaatcagag gaatctttog agcaatageg ggattcatag aaaacggctg ” 1081 ggaaggaatg gttgat

96 * l DEFINIÇÃO RNAm do precursor de hemaglutinina do vírus influenza A (A/equino/Kentucky/1/97 (H3N8), cds parciais. .. ACESSO AF197249; SEQ ID Nº 22 1 agcaaaagca gagggatattt ctgtcaatca tgaagacaac cattattttg atactactga 61 cccattgggo ctacagtcaa aacccaatca gtagcaacaa cacagccaca ttgtgtetgg 121 gacaccatgc agtagcaaat ggaacattgg taaasacaat aactgatgat caaattgagg 181 tgacaaatgc tactgaatta gttcagagca tttcaatagg gaaaatatgc aacaactcat 241 atagagttct agatggaaga aattgcacat taatagatgc aatgctagga gacceceact 301 gtgatgtctt tcagtatgag aattgggacc tectttataga aagaagcage getttcagca 361 attgctacco atatgacatc cetgactatg categetoeog gtecattata gcatecteag 421 gaacattgga attcacagca gagagattca catggacagg tgtcactcaa aacggaagaa 481 gtggagecetg caaaagggga tcageegata gtttctttag cogactgaat tggctaacaa 541 aatctggaaa ctecttaccce acattgaato tgacaatgcc taacaataaa aatttcgaca 601 aactatacat ctgggggatt catcaccega getoaaacea agagcagaca aaattgtaca 661 tccaagaatec aggacgagta acagtctcaa caaaaagaag tcaacaaaca ataatcccta 721 acatcggatc tagaccgtgg gtcaggggto aatcaggcag gataagcata tactggacca 781 ttgtaaaacc tggagatatc ctaatgataa acagtaatog caacttagtt gcacegeggo 841 gatattttaa attgaaaaca gggaaaagct ctgtaatgag atcagatgca cccatagaca 901 tttgtgtgte tgaatgtatt acaccaaatg gaagcatctc caacgacaaa ccattecaaa 961 atgtgaacaa agttacatat ggaaaatgcc ccaagtatat caggcaaaac actttaaage 1021 tggccactag gatgaggaat gaaccagaaa agcaaatcag a DEFINIÇÃO RNAm do precursor de hemaglutinina do vírus influenza A (A/equino/Kentucky/1/96 (H3N8), cds parciais. ACESSO AF197248 ; SEQ ID Nº 23 1 agcaaaagca ggggatattt ctgtcaatca tgaagacaac cattattttg atactactga 61 cccattgggt ctacagtcaa aacccaacca gtggcaacaa cacagecaca ttatgtctgg 121 gacaccatgc agtagcaaat ggaacattgg taaaaacaat aactgatgac caaattgagg 181 tgacaaatgc tactgaatta gttcagagca tttcaatagg gaaaatatgc aacaactcat 241 atagagttct agatggaaga aattgcacat taatagatgc aatgctagga gaccceecact 301 gtgatgtctt ccagtatgag aattgggacc tetteataga aagaagcagec getttcageca 361 attgoctacco atatgacatc cctgactatg categeteeg gtecattgta gcatectoag t 421 gaacattaga attcacagca gagagattca catggacagg tgtcactcaa aacggaagaa j 481 gtggagcctg caaaagggga tcagoecgata gtttctttag cogactgaat tggctaacaa % 541 aatctggaaa ctcttacccoo acattgaato tgacaatgco taacaataaa aatttogaca 601 aactatacat ctgggggatt catcaccega gctoaaacea aaagcagaca gaattgtaca 661 tccaagaate aggacgagta acagtctcaa caaaaagaag tcaacaaacg ataatccocta 721 atatcggate tagacegtag gttaggggte aatcaggcag gataagcata tactggacca 781 ttgtaaaacc tggagatatc ctaatgataa acagtaatgg caacttagtt gcaccgeggg 841 gatattttaa attgaaaaca gggaaaagect ctgtaatgag atcagatgca cccatagaca 901 tttgtgtate tgaatgtatt acaccaaato gaagcatcco caacgacaaa ccatttcaaa 961 atgtgaacaa agttacatat ggaaaatgcc ccaagtatat caggcaaaac actttaaage 1021 tggccactgg gatgaggaat gtaccagaaa agcaaatcag a e

É bh 97 “ DEFINIÇÃO RNAm do precursor de hemaglutinina do vírus influenza A (A/equino/Kentucky/9/95 (H3N8), cds parciais. * ACESSO AF197247; SEQ ID Nº 24 1 agcaaaagea ggggatattt ctgtcaatca tgaagacaac cattattttg atactactga 61 cccattaggt ctacagtcaa aacccaacca gtggaaacaa cacagcceaca ttatgtetag 121 gacaccatgc agtagcaaat ggaacattgg taaaaacaat aactgatgac caaattgagg 181 tgacaaatgc tactgaatta gttcagagca tttcaatagg gaaaatatgc aacaactceat 241 atagagttct agatggaaga aattgcacat taatagatgc aatgctagga gacccececact 301 gtgatgtctt ccagtatgag aattgggacc tettcataga aagaagcage getttcoagca 361 attgctacco atatgacatc cetgactato categeteeg gtecattgta gcatecteag 421 gaacattaga attcacagca gagggattca catggacagg tgtcactcaa aacggaagaa 481 gtggagcetg caaaagggga tcagecgata gtttctttag cogactgaat taggctaacaa 541 aatctggaaa ctcttacecoo acattgaato tgacaatgcc taacaataaa aatttcgaca 601 aactatacat ctgggggatt catcacccga gctcaaacca aaagcagaca gaattgtaca 661 tcecaagaatoe aggacgagta acagtctcaa caaaaagaag tcaacaaacg ataatcccta 721 atatcggatc tagacegtog gtcaggggte aatcaggcag gataagcata tactggacca 781 ttgtaaaacc tggagatatc ctaatgataa acagtaatgg caacttagtt gcacegeggg 841 gatattttaa attgaaaaca gggaaaagct ctgtaatgag atcagatgca cccatagaca 901 tttatatate taaataotatt acaccaaatg gaagcatccc caacgacaaa ccatttcaaa 961 atgtgaacaa agttacatat ggaaaatgcc ccaagtatat caggcaaaac actttaaagc 1021 tggccactag gatgaggaat gtaccagaaa agcaaatcag a DEFINIÇÃO RNAm do precursor de hemaglutinina do vírus influenza A (A/equino/Kentucky/1/98 (H3N8), cds parciais.

ACESSO AF197241; SEQ ID NO: 25 1 agcaaaagca ggggatattt ctgtcaatca tgaagacaac cattattttg atactactga 61 cccattagggt ctacagtcaa aacccaacca gtggaaacaa cacagccaca ttatgtetag 121 gacaccatgc agtagcaaat ggaacattgg taaaaacaat aactgatgac caaattgagg 181 tgacaaatgc tactgaatta gttcagagca tttcaatagg gaaaatatgc aacaactcat 241 ataaagttct agatggaaga aattgcacat taatagatgc aatgctagga gacceceact 301 gtgatgtott ccagtatgag aattgggaco tettcataga aagaagcage getttoagea 361 attgctaccc atatgacatc cetgactatg categetecg gtccattgta gcatectcoag 421 gaacattaga attcacagca gagggattca catggacagg tgtcactcaa aacggaagaa . 481 gtggagceetg caaaagggga tcagecegata gtttctttag cegactgaat tagctaacaa 541 aatctggaaa ctcttaccoc acattgaato tgacaatgcoc taacaataaa aatttecgaca 601 aactatacat ctgggggatt catcaccega geteaaacea acagcagaca gaattgtaca » 661 tccaagaatc aggacgagta acagtctcaa caaaaagaag tcaacaaacg atagtcocta 721 atatcggatce tagacegtagg gttaggggte aatcaggcag gataagcata tactggacca 781 ttgtaaaacc tggagatatc ctaatgataa acagtaatag caacttagtt gcaccegeggg 841 gatattttaa attgaaaaca gogaaaagct ctgtaatgag atcagatgca cccatagaca 901 tttgtagtato tgaatatatt acaccaaatg gaagcateccoc caacgacaaa ccatttcaaa 961 atgtgaacaa agttacatat ggaaaatgcc ccaagtatat caggcaaaac actttaaagc 1021 tggccactgg gatgaggaat ataccagaaa agcaaatcag a

98 « DEFINIÇÃO RNAm da hemaglutinina do vírus influenza A (A/eq/Kentucky/81 (H3N8), cds completo. " ACESSO US8195; SEQ ID NO: 26 1 agcaaaagca ggggatactt tctgteraate atgaagacaa ccattatttt gatactactg 61 acccattggg tctacagtca aaacccaacoe agtggcaaca acacagccecac actatgtetg 121 ggacaccatg cagtagcaaa tggaacattg gtaaaaacaa taactgatga ccaaattgag 181 gtgacaaatg ctactgaatt agttcagagc acttcaatag ggaaaatatg caacaaccca 241 tatagggttc tagatggaag aaactgcaca ttaatagatg caatgctagg agatcececac 301 tgtgatattt ttcagtatga gaattgggac ctettoatag aaagaageag cegettteage 361 aattgctacc catatgacat ccctgactat geategeteo gatetattgt ggcatettca 421 ggaacattag aattcacagec agagggattc acatggacag gtgtcactca aaacggagga 481 agtggagcct gcagaagggg gtoagecegat agtttettta gecgactgaa ttggctaaca 541 aaatctaggaa attcttaccc cacattgaat gtaacaatgc ctaacaataa caatttegat 601 aaactataca tctgggggat ccatcaccog agcacaaaca atgagcagac aaaattgtat 661 atccaagaat cagggoegagt aacagtctca acaaaaagaa gtcaacaaac aataatccco 721 aacatcggat ctagaccgtg ggtcaggggt caatcaggca ggataagcat atattggacc 781 attgtgaaac ctggagatat cctaatgata aacagtaatg gcaacttagt tgcaccgegg 841 ggatatttta aaatgcgaac agggaaaage tetgtaatga gatcagatgc acccatagac 901 acttgtgtgt ccgagtgtat tacaccaaat ggaagcatoc ccaacgacaa accatttcaa 961 aatgtgaaca aagttacata tggaaaatgc cccaagtata tcaagcagaa tactttgaag 1021 ctggccactg ggatgaggaa tgtaccagaa aagcaaatca gaggaatctt tggagcaata 1081 gcgggattca tagaaaacgg ctgggaagga atggttgatg gatagtatag attcegatat 1141 cagaattcgg aaggaacagg acaagctgca gatctaaaga gcactcaage agecategac 1201 cagatcaatg gaaaattgaa cagagtgatt gaaaggacca atgagaaatt ccatcaaata 1261 gagaaggaat tctcagaagt agaagggaga atccaggact tggagaagta tgtagaagac 1321 accaaaatag acctatggtc ctacaatgca gagttactagg tggctctaga aaatcaacat 1381 acgattgact taacagatgc agaaatgaat aaattattcg agaagactag gegecagtta 1441 agagaaaacg cggaagacat ggggggtaga tgtttcaaga tttatcacaa atgtgataat 1501 gcatgcattg gatcaataag aaatgggaca tatgaccatt acatatacag agatgaagca 1561 ttaaacaaco gatttcaaat taaaggtgtt gaattgaaat caggctacaa agattggata 1621 ctgtggattt cattcgccat atcatgctto ttaatttgog ttgttoetatt gagtttoate 1681 atgtgggctt gccaaaaagg caacatcaga tgcaacattt gcatttgagt aaactgataa 1741 ttaaaaacac ccttgtttct act DEFINIÇÃO Genes M2 da proteína de membrana e Ml da . proteína de membrana do vírus influenza A (A/equino/Kentucky/2/86 (H3N8), cds completo.

ACESSO M63540; SEQ ID NO: 27

. 99 « 1 agcaaaagca ggtagatatt taaagatgag tottctaace gaggtcgaaa cgtacgttct 61 ctetattgta ccatcaggec ccetraaage cgagatogeg cagagacttg aagatgtett Í 121 tgcagggaag aacacegate ttgaggcact catggaatgg ctaaagacaa gaccaatcect 181 gtcacctcetg actaaaggga ttttaggatt tgtattcacg ctcacegtge ceagtgageg 241 aggactgcaa cgtagacgct ttgtccaaaa tgcocttagt ggaaacggag atccaaataa . 301 catggacaga gcagtaaaac tgtacaagaa gcttaaaaga gaaataacat tecatgggge 361 aaaagaggtg gcactcagect attccactog tgcactagce agctgcatgg gactcatata 421 caacagaatg gggactgtga caaccgaagt ggcatttage ctagtatgog ccacatgtga 481 acagattgct gattcccage ategatoetca caggcagatg gtgacaacaa ccaacecact 541 aatcagacat gaaaacagaa tggtactagc cagtaccáãca gctaaaacca tggagcaggt 601 ggcagggtcg agtgagcagg cagcagagge catggaggtt gctagtaagg ccaggcagat 661 ggtgcaggca atgaggacca ttgggaccoca ccetagetec agtacegatt tgaaagatga 721 tettettgaa aatttgcagg cctaccagaa acggatggga gtgcaaatgc ageggttcaa 781 gtgatcetet egttattgca gcaagtatca ttagggatett gcacttgata ttgtggattc 841 ttgategoct tttettoaaa tteatttate gtetecttaa atacggtttg aaaagagggoc 901 cttctacgga aggagtacct gagtctatga gggaagaata tcggcaggaa cagcagaatog 961 ctgtggatgt tgacgatggt cattttgtca acatagagct ggagtaaaaa actaccttgt 1021 ttetact DEFINIÇÃO Proteína não-estrutural do isolado do vírus influenza A /equino/Kentucky/76, cds completo.

ACESSO M80971, SEQ ID NO: 28 1 agcaaaagca gggtgacaaa aacataatgg attccaacac tgtgtcaage ttteaggtag 61 actgttttct ttggcatgte cgcaaacgat ttgcagacca agaactaggt gatgccccat 121 tcettgacog gettegeoga gaccagaagt ccctaaaagg aagaggcage actettagte 181 tggacatcga aacagccact cgtgcaggaa agcagatagt ggagcagatt ctggaagagg 241 agtcagatga ggcacttaaa atgaccattg cctetgttce tgcttoacge tacttaacto 301 acatgactct tgatgagatg tcaagagact ggttcatgct Catgcccaag cagaaagtaa 361 caggetecet atgtataagg atggaccagg caatcatgga taagaacatc atactaaaag 421 caaactttag tgtgattttc gaaaggctagg agacactaat actacttaga gctttcacecg 481 aagaaggagc agtegttage gaaatttocac cattgectte tecttecagga catactaata 541 aggatgtcaa aaatgcaatt ggggtcctca teggaggact taaatggaat gataacacag 601 ttagaatctc tgaaactcta cagagatteg cttggagaag cagtcatgag aatgggagac 661 cttcattcco tecaaageag aaacgaaaaa tggcgagaac aattgagtca gaagtttgaa - 721 gaaataaggt ggttgattga agaagtagcga catagattga aaaatacaga aaatagtttt 781 gaacaaataa catttatgca agccecttacaa ctattgcttog aagtagaaca agagataaga 841 actttctegt ttcagottat ttaatgataa aaaacaccct tatttctact . DEFINIÇÃO Gene das Proteínas de matriz Ml e M2 do vírus influenza A (A/eq/Kentucky/92 (H3N8), cds completo.

ACESSO AFO01683; SEQ ID NO: 29

* b 100 % 1 atgagtcttc tgaccgaggt cgaaacgtac gtteteteta tegtaccate aggeccececte 61 aaagcegaga tegogcagag acttgaagat gtctttgcag ggaagaacac cgatcttgag " 121 gcactcatgg aatggctaaa gacaagacca atccectgtcac ctetgactaa agggatttta 181 ggattegtat tcacgeteac cgtgcccagt gagegaggac tgcagegtag acgctttgtc . 241 caaaatgccc ttagtggaaa cggagatcca aacaacatgg acagagcagt aaaactgtac 301 aggaaactta aaagagaaat aacattccat ggggcaaaag aggtggcact cagctattce 361 actggtgcac tagoccagetg catgggacte atatacaaca gaatgggaac tgtgacaacc 421 gaagtggcat ttggcctagt atgcgccaca tgtgaacaga ttgctgattc ccagcatega 481 tctceacagge agatggtgac aacaaccaac ccattaatca gacatgaaaa cagaatogta 541 ttagccagta ccacggetaa agccatggag cagatggcag ggtcgagtga gcaggcagca 601 gaggccatag aggttgctag taaggctagg cagatggtac aggcaatgag gaccattggg 661 acccacecta getecagtgo cggtttgaaa aatgatctocc ttgaaaattt gcaggectac 721 cagaaacgga tgggagtgca aatgcagoga ttcaagtgat cetetegtta ttgcagcaag 781 tatcattggg atcttgcact tgatattato gattcttgat cacoettttot tcoaaattcat 841 ttategtege cttaaatacg ggttgaaaag agggoecttet acggaaggag tacctgagte 901 tatgagggaa gaatatcggc aggaacageca gaatgctgtg gatagttgacg atggtcattt 961 tgtcaacata gagctaogagt aa DEFINIÇÃO Proteínas da matriz Ml e M2 do vírus influenza A (A/eq/Kentucky/81 (H3N8), cds completo.

ACESSO AFO01676; SEQ ID NO: 30 1 atgagtcttc taacogaggt cgaaacgtac gttcteteta tegtaccate aggececete 61 aaagcegaga tegegeagag acttgaagat gtoetttgcag ggaagaacac cgatcttgag 121 gcactcatgg aatggctaaa gacaagacca atcetgtcac ctetgactaa agaggatttta 181 ggatttgtgt tcacgoeteac cgtgcccagt gagegaggac tgcagegtag acgcetttgte 241 caaaatgccc ttagtggaaa cggagatcca aacaacatgg acagagcagt aaaactgtac 301 aggaagctta aaagagaaat aacattccat ggggcaaaag aggtggcact cagctattce 361 actggtgcac tagccagetg catgggacte atatacaaca gaatggggac tgtgacaacc 421 gaagtggcat ttggoctagt atgcgocaca tatgaacaga ttagctgatteo ccagcatega 481 tctcacagge agatggtgac aacaaccaac ccactaatca gacatgaaaa cagaatggta 541 ctagccagta ccacagectaa agccatggaa cagatggcag ggtcgagtga gcaggcagea 601 gaggccatag aggttgctag taaggccagg cagatggtac aggcaatgag gaccattggg 661 acccacceta getecagtgoc cggtttgaaa gatgatctte ttgaaaattt gcaggoectac . 721 cagaaacgga tgggagtaca aatgcagega ttcaagtgac cetetegtta ttgcagcaag 781 tatcattggg atcttgcact tgatattgta gattcttgat cacottttot toaaattoat 841 ttategtego cttaaatacg gtttgaaaag agggccttot acagaaggag tacctgagtc 901 tatgagggaa gaatateggc aggaacagea gaatgctgtg gatgttgacg atogtcattt ] 961 tgtcaacata gagctagagt aa DEFINIÇÃO Gene das Proteínas não-estruturais NS1 e NS2 do vírus influenza A (A/eq/Kentucky/92 (H3N8B), cds completo.

ACESSO AFO01671; SEQ ID NO: 31

1 atggattoca acactgtgtc aagettteag gtagactott ttetttggea tgatocgcaaa 61 cgattcgcag accaagaact gggtgatgcc ccatteotta aceggetteg cegagaceag 7 121 aagtccctaa aaggaagagg tageactett ggtctggaca tegaaacage cactegtagca 181 ggaaagcaga tagtggagca gattctggaa gaggaatcag atgaggcact taaaatgacc 241 attgcctetg ttectgctto acgetactta actgacatga ctcttgatga gatgtcaaga * 301 gactggttca tgctcatgcc caagcagaaa gtaacaggct ccetatgtat aagaatagac 361 caggcaatca tggataagaa catcatactt aaagcaaact ttagtgtgat tttcgaaagg 421 ctggaaacac taatactact tagagcette accgaagaag gagcagtegt tggegaaatt 481 tcaccattgc cttetetteo aggacatact aatgaggatg tcaaaaatgc aattogaggteo 541 ctcatcggag gacttaaatg gaatgataat acggttagaa tctctgaaac tctacagaga 601 ttegecttgga gaagcagtea tgagaatagg agaccttcat tccetocaaa gcagaaacga 661 aaaatggaga gaacaattga gccagaagtt tgaagaaata agatggttga ttgaagaagt 721 gegacataga ttgaaaaata cagaaaatag ttttgaacaa ataacattta tgcaagectt 781 acaactattg cttgaagtag aacaagagat aagaactttec tegttteage ttatttaa DEFINIÇÃO: Gene das proteínas não-estruturais NS1 e NS2 (NS) do vírus influenza A, cds completo.

ACESSO AFOO01664; SEQ ID NO: 32 1 atggattcca acactgtgtc aagctttcag gtagactgtt ttctttggca tgtcegcaaa 61 cgatttgcag accaagaact gggtgatgco ccattectta aceggetteg cegagaceag 121 aagtccctaa aaggaagagg cagcactett ggtctggaca tegaaacage cactegtaca 181 ggaaagcaga tagtggagca gattctaggaa gaggaatcag atgaggcact taaaatgacc 241 attgcctetg ttectactte acgotactta actgacatga ctcttgatga gatgtcaaga 301 gactagttca tgctcatgco caagcagaaa gtaacaggct cccoctatgtat aaggatggac 361 caggcaatca tggataagaa catcatacta aaagcaaact ttagtgtgat tttcgaaagg 421 ctggagacac taatactact tagagoctte accgaagaag gagcagtegt tagcgaaatt 481 tcacceattge cttetettee aggacatact aatgaggatg tcaaaaatgc aattggggte 541 ctcatcggag gacttaaatg gaatgataat acagttagag tctctgaaac tctacagaga 601 ttegettgga gaagcagtea tgagaatggg agaccttcat tecetocaaa gcagaaacga 661 aaaatggcga gaacaattga gccagaagtt tgaagaaata agatggttga ttgaagaagt 721 gegacataga ttgaaaaata cagaaaatag ttttgaacaa ataacattta tgcaageett 781 acaactattg cttgaagtag aacaagagat aagaactttc tegttteage ttatttaa DEFINIÇÃO RNAm da nucleoproteina do Influenza A/equino/Kentucky/2/86 (H3N8( (seg 5), cds completo.

ACESSO M30751; SEQ ID NO: 33 - 1 agcaaaagca gaggtagataa tcactcacta agtgacatca aagtcatgge gtcteaagge 61 accaaacgat cttatgagca gatggaaact ggtggggaac gccagaatgc aactgaaatc 121 agagcatctg tcggaaggat ggtgggagga atcggceggt tetatgttoa gatatatact 181 gagcttaaac tcaacgacca tgaagggegg ctgattcaga acagcataac aatagaaago 241 atggtacttt cogcattega cgaaagaaga aacaagtacc tegaggagea teccagtact 301 gagaaagacc ccaagaaaac gggaggceceg atatacagaaz ggaaagatag gaaataogato 361 agagaactca tcctecatga taaagaagaa atcatgagga tcetggogtoa ggccaacaat

Paso SAL A 102 421 ggtgaagacg ctactgctgg tcttactcat atgatgatct ggcactecaa teteaatgac : 481 accacatacc aaagaacaag ggctettatt cgggetagga tggateccag aatgtgctet 541 ctgatgcaag gatcaaccct cccacggaga tetagagetg coeggtactgo agtaaaaggt 601 gttggaacaa tggtaataga actcatcagg atgatcaaac gegggataaa tgatogaaat = 661 ttctagagag gtgaaaatag tegaagaace agaattgctt atgaaagaat gtgcaatatc 721 ctcaaaggga aattccaaac agcagcacaa cgggcaatga tggaccaagt gagggagage 781 cgcaatcctg gaaatgctga gattgaggat ctcattttoct tggcacgatce agcactceatt 841 ttgagaggat cagtagccca taaatcatge ctacetgeet gtgtttatgg ccttacagta 901 gccagtaggt atgactttga gaaggaagga tactctctag ttagaattga tcectttcaaa 961 ctactccaga acagccaaat tttcagtecta atcagaccga aagaaaatcc agcacacaag 1021 agccagttag tatagatage atgccattet gcagcatttg aggacctgag agttttgaat 1081 ttcattagag gaaccaaagt aatcccaaga ggacagttag caaccagagg agtgcaaatt 1141 gottcaaatg aaaacatgga gacaatagat tctagcacac tegaactgag gagcagatat 1201 tgggcaataa ggaccaggag tagagggaac accagtcaac agagagcatc tgcaggacag 1261 ataagtgtgc aacccacttt ctcagtgcag agaaatette cetttgaaag agcaaccatt 1321 atggctgcat tcactgggaa cactgagecgg aggacttceg acatgagaac ggaaatcata 1381 aggatgatgg aaaatgccag atcagaagat gtgtctttoo aggggeggagg agtettegag 1441 ctcteggacg aaaaggcaac gaaccegate gtgccttect ttgacatgag caatgaaggg 1501 tettatttot teggagacaa tgctgaggag tttgacagtt aaagaaaaat acceettgttt 1561 ctact DEFINIÇÃO PB2 polimerase de influenza A/equino/Kentucky/2/86 (H3N8), cds completo.

ACESSO M73526 M36049; SEQ ID NO: 34

103 . 1 agcaaaagca ggtcaaatat attcaatatg gagagaataa aagaactgag agatctaatg 61 tcacagtocco gcacecegoga gatactaaca aaaactactg tggaccatat ggccataato . 121 aagaaataca catcaggaag acaagagaag aacccegeac ttaggatgaa gtagatgato 181 gcaatgaaat acccaattac agcagataag aggataatog aaatgattcc tgagagaaat 241 gaacagggge aaaccctttg gagcaaaacg aacgatgctg gctoagaceg cgtaatagta - 301 tcaccetcetagg cagtgacatg gtagaatagg aatggaccaa caacgagcac aattcattat 361 ccaaaagtct acaaaactta ttttgaaaaa gttgaaaggt taaaacacgg aacctttaggc 421 ccegttcatt ttaggaatca agtcaagata agacggagag ttgacgtaaa ccetagtcoac 481 geggaccetca gtgccaaaga agcacaagat gtgatcatgg aagttotttt cccaaatgaa 541 gtgggagcca gaattctaac atcggaatca caactaacaa taaccaaaga gaaaaaagaa 601 gaacttcagg actgcaaaat tgcccccttg atggtagcat acatgctaga aagagagtto 661 gtcegaaaaa caaggttoect cccagtaget ggcggaacaa gcagtatata cattgaggto 721 ttgcatctga ctcagggaac gtgctgggaa caaatgtaca ccccaggagg agaagttaga 781 aacgatgaca ttgatcaaag tttaattatt gctgcccgga acatagtgaa aagagegaca 841 gtatcagcag atccactagc atccotactg gagatgtaco acagtacaca gattogtaga 901 ataaggatgg tagacatcct taagcagaat ccaacagagg aacaagctgt ggatatatac 961 aaagcagcaa tggggttaag aattagctca tcattcagct ttagtagatt cacctttaag 1021 agaacaagtg gatcatcagt caagagagaa gaagaaatgc ttacgggcaa ccttcaaaca 1081 ttgaaaataa gagtgcatga gggctatgaa gaattcacaa tggtcggaag aagagcaaca 1141 gecattctca gaaagacaac cagaagattg attcaattga tagtaagtog gagagatgaa 1201 cagtcaattg ctgaagcaat aattgtagcc atggtatttt cgcaagaaga ttgcatgata 1261 aaagcagttc gaggogattt gaacttegtt aatagagcaa atcagegett gaaccecata 1321 catcaactct tgaggcattt ccaaaaggat gcaaaagtgo ttttccagaa ttaggggatt 1381 gaacccatocg acaatgtgat gggaatgatc ggaatattgc ccgacatgac cccaageace 1441 gagatgtcat tgagaggagt gagagtcagc aaaatgggag togatgagta ctccageact 1501 gagagagtgg tggtgagcat tgacogtttt ttaagagttc ggagatcaaag gggaaacata 1561 ctactgtccc ctgaagaggt cagtgaaaca caaggaacgg aaaagctgac aataatttat 1621 tcatcatcaa tgatgtggga gattaatggt ccogagtcag tattagtcaa tacttatcaa 1681 tggatcatca gaaactaggga aattgtgaaa attcaatogt cacaggatcc cacaatgtta 1741 tacaataaga tagaatttga gccattccag tecetagtec ctagggecac cagaagecaa 1801 tacagcggtt tegtaaggac cctagtttcag caaatgcgag atgtacttagg aacatttgac 1861 actgctcaaa taataaaact cotcecetttt geegetacte ctocggaaca gagtagaato 1921 cagttctett ctttgactgt taatgtaaga ggatcgggaa tgaggatact tgtaagaggo 1981 aattccccag tgttcaacta caacaaagec actaagaggc tcacagtoct cggaaaggat 2041 gcaggtgege ttactgaaga cccagatgaa ggtacggcetg gagtagaate tgctatteta 2101 agagggtttc tcoatcttagg taaagaaaac aagagatatg gcccageact aagcatcaat 2161 gaactgagca aacttacaaa aggggagaaa gctaatgtgc taattgggca aggggacato 2221 gtgttggtaa tgaaacggaa acgtgactct agcatactta ctgacagtca gacagegace 2281 aaaaggattc ggatggccat caattagtgt tgaattgttt aaaaacgacc ttgtttctac

2341 t

DEFINIÇÃO RNA de hemaglutinina de Influenza . A/equino/Kentucky/1/87 (H3NB8) (HA) (seg. 4), cds completo.

ACESSO M24728 J04336; SEQ ID NO: 35

' 104 | 1 agcaaaagca gagggatattt ctgtcaatca tgaagacaac cattgttttg atactactga 61 cccattgggt ctacagtcaa aacccaacca gtggcaacaa cacagocaca ttatgtctag " 121 gacaccatgc agtagcaaat ggaacactog taaaaacaat aactgatgac cagattgagg 181 tgacaaatgoc tactgaatta gttcagagca tttcaatagg gaaaatatgc aacaactcat 241 atagagttct agatggaaga aattgcacat taatagatgc aatgctagga gacceccact 301 gtgatgtttt tengtatgag aattgggacc tettoataga aagaagcage getttcagea 361 attgctacco atatgacatc cctgactatg catcgcteog gtetattgtg gcatectoag 421 gaacattaga attcacagca gagggattca catggacagg tgtcactcaa aacggaagaa 481 gtggagcctg caaaagggga tcagcogata gtttctttag cogactgaat tagctaacaa 541 aatctggaaa ttcttaccco acattgaatg tgacaatgcc taacaataac aatttcgata 601 aactatacat ctgggggatt catcacccga gctcaaacaa tgagcagaca aaattgtata 661 tccaagaatc aggacgagta acagtctcaa caaaaagaag tcaacaaaca ataatcccca 721 acatcggatc tagaccgtag gtcaggggatoe aatcaggcag gataagecata tattggacca 781 ttgtgaaacc tggagatatc ctaatgataa acagtaatgg caacttagtt gcaccgeggg 841 gatatttcaa attgagaaca gggaaaagct ctgtaatgag atcagatgca cccatagaca 901 cttgtgtgtc tgaatgtatt acaccaaatg gaagcatcco caacgacaaa ccattccaaa 961 atgtgaacaa agttacatat ggaaaatgcc ccaagtatat caggcaaaac actttgaagc 1021 tggccactgg gatgaggaat gtaccagaaa agcaaatcag aggaatcttt ggagcaatag 1081 cgggattcat agaaaacggc tgggaaggaa tggttgatag gtagtataga ttccogatato 1141 aaaattcgga aggaacagga caagctagag atctaaagag cactcaagca gccategace 1201 agatcaatog aaaattaaac agagtgattg aaaggaccaa tgagaaattc catcaaatag 1261 agaaggaatt ctcagaagta gaagggagaa tccaggactt ggagaagtat gtagaagaca 1321 ccaaaataga cctatggtcc tacaatgcag aattgctggt ggctctagaa aatcaacata 1381 caattgactt aacagatgca gaaatgaata aattattcga gaagactagg cgccagttaa 1441 gagaaaacgc ggaagacatg ggaggtagat gtttcaggat ttaccacaaa tgtgataatg 1501 catgcattgg atcaataaga aatgggacat atgaccatta catatacaga gatgaagcat 1561 taaacaaccg atttcaaatt aaaggtgttg agttgaaatc aggctacaaa gattggatac 1621 tgtaggatttc attegecata teatgcttot taatttgcogt tattctattg ggtttcatta 1681 tgtagggcttg ccaaaaagge aacatcagat gcaacatttg catttgagta aactgatagt 1741 taaaaacacc cttgtttocta ct DEFINIÇÃO RNA da hemaglutinina de Influenza A/equino/Kentucky/2/86 (H3NB8) (HA) (seg.4), cds completo.

ACESSO M24727 304336; SEQ ID NO: 36 " 1 agcaaaagca ggggatattt ctgtcaatca tgaagacaac cattattttg atactactga 61 cccattgggt ctacagtcaa aacccaacca gtggcaacaa cacagccaca ttatgtctogg e. 121 gacaccatgc agtagcaaat ggaacattgg taaaaacaat aactgatgac caaattgagg 181 tgacaaatgc tactgaatta gttcagagca tttcaatagg gaaaatatgc aacaactcat 241 atagggttct agatggaaga aattgcacat taatagatgc aatgctagga gaccceecact 301 gtgatgtttt tengtatgag aattgggacc tetteataga aagaageage gettecagea 361 attgctaccc atatgacatc cetgactatg categeteog gtetattata gcatecteag 421 gaacattaga attcacagca gagggattca catggacagg tgtcactcaa aacggaagaa Y 481 gtggagcectg caaaagggga toageogata gtttotttag cogactgaat tggctaacaa 541 aatctggaaa ttcttaccco acattgaatg tgacaatgcc taacaataac aatttocgata 601 agctatacat ctgggggatce catcaccoga getoaaacaa tgagcagaca aaattgtata 661 tccaagaatc aggacgagta acagtctcaa caaaaagaag tcaacaaaca ataatcccca 721 acatcggatc tagacegtgg gtceaggggte aatcaggcag gataagecata tattggacca 781 ttgtgaaacc tggagatatc ctaataataa acagtaatgg caacttagtt gcaccgeggg

|| 105 841 gatatttcaa attgcgaaca gggaaaaget ctgtaatgag atcagatgca cccatagaca . 901 cttgtgtgto tgaatgtatt acaccaaatg gaagcatcco caacgacaaa ccatttcaaa 961 atgtgaacaa agttacatat ggaaaatgcc ccaagtatat caggcaaaac actttgaage 1021 tagccactag gatgaggaat gtaccagaaa agcaaatcag aggaatcttt ggagcaatag - 1081 cgggattcat agaaaacggc toggaaggaa tagttgatag gtagtataga ttccgatato 1141 aaaactcgga aggaacagga caagetggag atctaaagag cactcaagea gecategace 1201 agatcaatgg aaaattgaac agagtgattg aaaggaccaa tgagaaattc catcaaatag 1261 agaaggaatt ctcagaagta gaagggagaa tccaggactt ggagaagtat gtagaagaca 1321 ccaaaataga cctatggtce tacaatgcag agttgctggt ggctetagaa aatcaacata 1381 caattgactt aacagatgca gaaatgaata aactattcga gaagactagg cgceagttaa 1441 gagaaaacgc ggaagacatg ggaggtagat gtttcaagat ttatcacaaa tgtgataato 1501 catgcattgg atcaataaga aatgggacat atgaccatta catatacaga gatgaagcat 1561 taaacaaccg atttcaaatt aaaggtotag agctgaaatoc aggctacaaa gattagatac 1621 tgtagattte attoegecata teatgottet taatttgcot tottetattog gatttcatta 1681 tgtgggcttg ccaaaaagge aacatcagat gcaacatttg catttgagta aactgatagt 1741 taaaaacacc cttgttteta ct EXEMPLO 5: Sequências de nucleotídeo de Influenza Equino Newnmarket DEFINIÇÃO Gene NS1 do vírus influenza A (A/equino 2/Suffolk/89 (H3N8). ACESSO X80060; SEQ ID NO: 37 1 atggattcca acactgtgto aagcttteag gtagactott ttctttagca tgtecgcaaa 61 cgatttgcag accaagaact gggtgatgcc ccattecttg aceggettog cegagaceag 121 aagtccotaa aaggaagagg tagcactett ggtctagaca tegaaacage cactegtagca 181 ggaaagcaga tagtggagea gattctaggaa gaggaatcag atgaggcatt taaaatgacc 241 attgcctctg ttoctgotto acgotactta actgacatga ctcttgatga gatgtcaaga 301 gactggttca tgctcatgoo caagcagaaa gtaacaggct ccetatagtat aagaatggac 361 caggcaatca tggataagaa catcatactt aaagcaaact ttagtotgat tttegaaagg 421 ctggagacac taatactact cagggcette accgaagaag gagcagtegt taggegaaatt - 481 tcaccattgc cttetettoo aggacatact aatgaggatg tcaaaaatago aattagggtc 541 ctcateggag gacttaaatg gaatgataat acggttagag tctctgaaac toetacagaga 601 ttegettgga gaagcagtea tgagaatagg agaccttcat toecotocaaa gcagaaacga - 661 aaaatggaga gaacaattga gtcagaagtt tga DEFINIÇÃO Gene HAI do vírus influenza A (A/eq/Newmarket/93/(H3N8) para a subunidade HAY de hemaglutinina, RNA genômico.

ACESSO X85089; SEQ ID NO: 38 ã | 106 1 atgaagacaa ccattatttt gatactacto acccattagg tctacagtca aaacocaace 61 agtggcaaca acacageccac attatgtcto ggacaccatg cagtagcaaa tggaacatto - 121 gtaaaaacaa taactgatga ccaaattgag gtgacaaatg ctactgaatt agtccagagc 181 atttcaatag ggaaaatatg caacaactca tatagogttc tagatagaag aaattgcaca 241 ttaatagatg caatgctagg agaccecoccat tgtgatgatt ttcagtatga gaattaggac - 301 ctcttcatag aaagaagecag cactttcage aattoctacc catatgacat ccctgactat 361 gcategetoee ggtecattot agcatectca ggaacattag aattcacagc agaggggttoe 421 acatggacag gtgtcactca aaacggagga agtggagcet gcaaaagggg atcagcegat 481 agtttcttta gcegactgaa ttggctaaca aaatctogaa attcttaccc catattgaat 541 gtgacaatgc ctaacaataa aaatttcgat aaactataca tctgggggat tcatcaceeg 601 agctcaaaca aagagcagac aaaattatat atccaagaat caggacgagt aacagtctca 661 acagaaagaa gtcaacaaac agtaatccet aacatcggat ctaggcegtg gatcaggaggt 721 caatcaggca ggataagcat atactggacc attgtaaaac ctggagatat tctaatgata 781 aacagtaatg gcaacttagt tgcaccgcag ggatatttta aattgagaac agggaaaage 841 tctgtaatga gatcagatgc actcatagac acttgtgtgt ctgaatgtat tacaccaaat 901 ggaagcatcc ccaacgacaa accatttcaa aatgtgaaca aaattacata tggaaaatgc 961 cccaagtata tcaggcaaaa cactttaaag ctggecactg ggatgaggaa tgtaccagaa 1021 aagcaaatca ga DEFINIÇÃO Gene HAI do vírus influenza A (A/eq/Newmarket/93/(H3N8)) para a subunidade HAY de hemaglutinina, RNA genômico.

ACESSO X85088; SEQ ID NO: 39 1 atgaagacaa ccattatttt gatactactg acccattggg tctacagtca aaacccaace 61 agtggcaaca acacagccac attatgtctg ggacaccatg cagtagcaaa tggaacatto 121 gtaaaaacaa taactgatga ccaaattgag gtgacaaato ctactgaatt agttcagagc 181 atttcaatag ggaaaatatg caacaactca tatagagttc tagatggaag aaattgcaca 241 ttaatagatg caatgctagg agacccecac tgtgatgtct ttcagtatga gaattgggac 301 ctcettcatag aaagaageag cactttcage aattgctace catatgacat ccctgactat 361 geategetece ggtecattgt agcatectoa ggaacattog aattcacagc agagggatto 421 acatggacag gtgtcactca aaacggaaga agtoggagcct gcaaaagggg atcagcecgat . 481 agtttcttta gccgactgaa ttggctaaca aaatctggaa actcttaccc cacattgaat 541 gtgacaatgc ctaacaataa aaatttcgac aaactataca tetggggagat teateaceeg 601 agctcaaace aacagcagac agaattgtac atccaagaat caggacgagt aacagtctca 661 acaaaaagaa gtcaacaaac gataatccct aatatcggat ctagaccatg ggtcagaggt - 721 caatcaggca ggataagcat atactggacc attgtaaaac ctggagatat cctaatgata 781 aacagtaatg gcaacttagt tagcaccgegg ggatatttta aattgaaaac agggaaaagoc 841 tetgtaatga gatcagatgc acccatagac atttogtgtat ctgaatgtat tacaccaaat : 901 ggaagcatcc ccaacgacaa accatttcaa aatgtgaaca aagttacata tggaaaatgo 961 cccaagtata tcaggcaaaa cactttaaag ctggccactg ggatgaggaa tgtaccagaa 1021 aagcaaatca ga DEFINIÇÃO Gene HAI do vírus influenza A (A/eq/Sussex/89/(H3N8)) para a subunidade HAY da hemaglutinina, RNA genômico.

ACESSO X85090; SEQ ID NO: 40 7 1 atgaagacaa ccattatttt gatactactg acccattagg tcetacagtca aaacccaace 61 agtggcaaca acacagccac attatgtctg ggacaccato cagtagcaaa tggaacatto 121 gtaaaaacaa taactgatga ccaaattgag gtgacaaatg ctactgaatt agttcagagc 7 181 atttcaatag ggaaaatatg caacaactca tatagggttc tagatggaag aaattgcaca 241 ttaatagatg caatgctagg agacceccac tatagatattt ttcagtatga gaattggagac 301 ctetteatag aaagaageag cgetttceage aattgctacc catatgacat ccctgactat 361 geategeteo ggtecattgt agcatectca ggaacattag aattcacagec agagggatte 421 acatggacag gtgtcactca aaacggaaga agtggagcct gcaaaagggg atcagcegat 481 agtttcttta gcogactgaa ttggctaaca aaatctggaa attettacco catattgaat 541 gtgacaatgc ctaacaataa aaatttecgat aaactataca tcetgggggat teateaceog 601 agctcaaaca aagagcagac aaaattgtat atccaagaat caggacgagt aacagtctca 661 acagaaagaa gtcaacaaac agtaatccect aacatcggat ctagaccgta ggatcagggat 721 caatcaggca ggataagcat atactggacc attgtaaaac ctggagatat tctaatgata 781 aacagtaatg gcaacttagt tgcacegegg ggatatttta aattgagaac agggaaaage 841 tctgtaatga gatcagatgc actcataggo acttatgtgt ctgaatgtat tacaccaaat 901 ggaagcatcc ccaacgacaa accatttcaa aatgtgaaca aagttacata tggaaaatgc 961 cccaagtata tcaggcaaaa cactttaaag ctggccactg ggatgaggaa tgtaccagaa 1021 aagcaaatca ga DEFINIÇÃO Gene HAI do vírus influenza A (A/eq/Lambourn/92/(H3N8) para a subunidade HAY de hemaglutinina, RNA genômico.

ACESSO X85087SEQ ID NO: 41 1 atgaagacaa ccattatttt gatactactg acccattaggg tcetacagtca aaacccaace 61 agtggcaaca acacagccac attatgtctg ggacaccatg cagtagcaaa tggaacattg 121 gtaaaaacaa taactgatga ccaaattgag gtgacaaato ctactgaatt agttcagagc 181 atttcaatag ggaaaatatg caacaactca tatagagttc tagatggaag aaattgcaca 241 ttaatagatg caatgctagg agacccecat tatgatgatt ttcagtatga gaattgggac 301 ctcttcatag aaagaageag tgctttcage aattgctace catatggcat cccectgactat À 361 gcategeteo ggtecattat agcatectca ggaacattag aattcacage agaggggtte 421 acatggacag gtgtcactca aaacggaaga agtggagcet gcaaaagggg atcagcegat 7 481 agtttcttta goccgacteaa ttggctaaca aaatctggaa attcttaccc catattgaat 541 gtgacaatgoc ctaacaataa aaatttcgat aaactataca tctaggaggat tcatcaceeg 601 agctcaaaca aagagcagac aaaattatat atccaagaat caggacgagt aacagtctca * 661 acagazagaa gtcaacaaac agtaatccct aacateggat ctaggccgto gatcagggat 721 caatcaggca ggataagcat atactaggacc attgtaaaac ctggagatat tctaatgata 781 aacaataatg gcaacttagt tgcaccgcgg ggatatttta aattgagaac agggaaaage 841 tctgtaatga gatcagatgc actcatagac acttgtatgt ctgaatgtat tacaccaaat 901 ggaagcatcc ccaacgacaa accatttcaa aatgtgaaca aagttacata tggaaaatgc 961 cccaagtata tcaggcaaaa cactttaaag ctagccactag ggatgaggaa tataccagaa 1021 aagcaaatca ga DEFINIÇÃO Gene HAI do vírus influenza A w 108 (A/eq/Ella/89/(H3N8) para a subunidade HAY da hemaglutinina, RNA genômico F ACESSO X85086; SEQ ID NO: 42 1 atgaagacaa ccattatttt gatactactg acccattagg tctacagtca aaacccaace 61 agtggcaaca acacagccac attatgtctg ggacaccatoa cagtagcaaa tggaacatto 121 gtaaaaacaa taactgatga ccaaattgag gtgacaaato ctactgaatt agttcagagec 181 atttcaatag ggaaaatatg caacaactca tatagggttc tagatagaag aaattgcaca 241 ttaatagatg caatgctagg agacccccac tgtgatgttt ttcagtatga gaattgggac 301 ctcttcatag aaagaageag cgcttteage aattgctace catatgacat ctcetgactat 361 gcategetec ggtecattgt agcatcetca ggaacattag aattcacagc agagagatte 421 acatggacag gtgtcactca aaacggaaga agtggagcct gcaaaagggg atcagcegat 481 agtttcttta gcogactgaa ttggctaaca aaatctggaa attcttacce catattgaat 541 gtgacaatgc ctaacaataa aaatttcgat aaactataca tctgggagat tcateaceeg 601 agctcaaaca aagagcagac aaaattgtat atccaagaat caggacgagt aacagtctca 661 acagaaagaa gtcaacaaac agtaatccct aacateggat ctagaccgtg ggatcaggggt 721 caatcaggca ggataagcat atactggacc attgtaaaac ctagagatat tctaatgata 781 aacagtaatg gcaacttagt tgcaccgocgg gaatatttta aattgagaac agggaaaage 841 tctgtaatga gatcagatge acccatagge acttgtgtgt ctgaatgtat tacaccaaat 901 ggaagcatce ccaacgacaa accatttcaa aatgtgaaca aagttacata tggaaaatgoc 961 cccaagtata tcaggcaaaa cactttaaag ctggccactg ggatgaggaa tgtaccagaa 1021 aagcaaatca ga DEFINIÇÃO Gene HAI do vírus influenza A (A/eq/Arundel/91/(H3N8) para a subunidade HAY da hemaglutinina, RNA genômico.

ACESSO X85085; SEQ ID NO: 43 1 atgaagacaa ccattatttt gatactacto acccattggg tetacagtoa aaacccaace 61 agtggcaaca acacagccac attatgtctg ggacaccatg cagtagcaaa tggaacattog 121 gtaaaaacaa taactgatga ccaaattgag gtgacaaatg ctactgaatt agttcagagc 181 atttcaatag ggaaaatatg caacaactca tatagagtte tagatggaag aaattgcaca 241 ttaatagatg caatgoctagg agaccceccac tgtgatgtet ttcagtatga gaattaggac í 301 ctcttcatag aaagaagecag cgctttcage aattgctace catatgacat ccectgactat 361 gcategeteo ggtecattgt agcatectoa ggaacattag aattcacage agagagatteo 421 acatggacag gtgtcactca aaacggaaga agtggagect gcaaaaggog atcagcogat * 481 agtttcttta gcogactgaa ttagctaaca aaatctggaa attcttacce catattgaat 541 gtgacaatgc ctaacaataa aaatttcgat aaactataca tctgggggat teatcaceeg 601 agctcaaaca aagagcagac aaaattgtac atccaagaat caggacgagt aacagtctca 661 acaaaaagaa gtcaacaaac aataatccct aacatcggat ctagacegtg ggtcaggagt 721 caatcaggca ggataagcat atactggacc attgtaaaac Cctggagatat cctaatgata 781 aacagtaatg gcaacttagt tgcaccegegg ggatatttta aattgagaac agggaaaagc 841 tctgtaatga gatcagatgo acccatagac atttgtotat ctgaatgtat tacaccaaat 901 ggaagcatcco ccagegacaa accatttcaa aatgtaaaca aagttacata tggaaaatgo 961 cccaagtata tcaggcaaaa cactttaaag ctggcecactg ggatgaggaa tataccagaa 1021 aagcaaatca ga á 109 DEFINIÇÃO Gene HA do vírus influenza A (A/equino/Suffolk/89 (H3NB) para a hemaglutinina. é ACESSO X868437; SEQ ID NO: 44 1 ctgtcaatca tgaagacaac cattattttg atactactga cccattagggt ctacagtcaa 61 aacccaacca gtggcaacaa cacagccaca ttatgtctgg gacaccatgo agtagcaaat 121 ggaacattgg taaaaacaat aactgatgac caaattgagg tgacaaatgc tactgaatta 181 gttcagagca tttcaatagg gaaaatatgc aacaactcat atagggttct agatggaaga 241 aattgcacat taatagatgc aatgctagga gaccecoeact gtgatgtttt tcagtatgag 301 aattgggacc tettcataga aagaageage gettteagea attgctacco atatgacatc 361 cctgactatg categeteoeg gtecattgta gcatectoag gaacattaga attcacagca 421 gagggattca catggacagg tgtcactcaa aacggaagaa gtggagcctg caaaagggga 481 tcagecegata gtttetttag cegactgaat tggctaacaa aatetggaaa ttettacecee 541 atattgaatg tgacaatgcc taacaataaa aatttcgata aactatacat ctgggggatt 601 catcaccega gctoraaacaa agagcagaca aaattgtata tocaagaate aggacgagta 661 acagtctcaa cagaaagaag tcaacaaaca gtaatccocta acateggatc tagacegtgg 721 gtcaggggtc aatcaggcag gataageata tactggacca ttgtaaaace tggagatatt 781 ctaacgataa acagtaatgg caacttagtt gcaccgeggg gatattttaa attgagaaca 841 gggaaaagect ctgtaatgag atcagatgca cccatagaca cttgtgtgto tgaatgtatt 901 acaccaaatg gaagcatccc caacgacaaa ccatttcaaa atgtgaacaa agttacatat 961 ggaaaatgcc ccaagtatat caggcaaaac actttaaagc tggccacoegg gatgaggaat 1021 gtaccagaaa agcaaatcag aggaatcttt ggagcaatag cgggattcat agaaaacgge 1081 tgggaaggaa taggttgatgg gtogtataga ttccgatato aaaactogga aggaacagga 1141 caagctgcag atctaaagag cactcaagca gccategaco agatcaatag aaaattaaac 1201 agagtgattg aaaggaccaa tgagaaattc catcaaatag agaaggaatt ctcagaagta 1261 gaagggagaa tccaggattt ggagaagtat gtagaagaca ccaaaataga cctatggtce 1321 tacaatgcag aattgctggt ggctctagaa aatcaacata caattgactt aacagatgca 1381 gaaatgaata aattattcga gaagactagg cgccagttaa gagaaaacgc ggaagacatoa 1441 ggaggtagat gtttcaagat ttaccacaaa tgtgataatg catgcattgg atcaataaga 1501 aatgggacat atgaccatta catatacaga gatgaagcat taaacaacocg atttcaaatc 1561 aaaggtgttg agttgaaatc aggctacaaa gattggatac tgtggatttc attcgecata 1621 tcatgcttct taatttgogt tgttctattg gatttcatta tgtgggcttg ccaaaaagge 1681 aacatcagat gcaacatttg catttgagta aactgatagt taaaaacacc cttgtttcta 1741 ct DEFINIÇÃO Gene do vírus influenza A * (A/equino/Newmarket/1/77 (H7N7) para a hemaglutinina.

ACESSO X62554; SEQ ID NO: 45

1 nonANAAAAA ANAANAANANANa aatgaacact cagattctaa tattagccat tteggcatte Í 61 ctetgtgtac gtgcagataa aatctgccta ggacatcatg ctgtgtctaa tggaaccaaa 121 gtagacaccc ttactgaaaa gggaatagaa gtcogtcraatg caacagaaac agttgaacaa 181 aaaaacatcc ccaagatctg ctcraaaaggg aaacagacta ttgaccttag tcaatgtgga ' 241 ttactaggga ccactattgg tcccceccaa tgogacraat ttcttagaatt ctcetgctaat 301 ttaataattg agagaagaga aggtgatgat atttgttatc caggcaaatt tgacaatgaa 361 gaaacattga gacaaatact cagaaaatcc ggaggaatta aaaaggagaa tatgggattc 421 acatataccg gagtgagaac caatggagag actagegeect gtagaaggtc aagatettec 481 ttttatgcag aaatgaaatg gctcctatct aacacagaca atgggagatatt cccacaaato 541 acaaaatcct acaagaacac taagaaggag ccagctetga taatctgggg aatccaccac 601 tcaggatcaa ctgctgaaca gactagattg tatggaagto gaaacaagtt gataacagtt 661 tggagttcca aataccaaca atcttttgcoc ccaaacectg gaccaaggcce gcaaatgaat 721 ggccaatcag gaagaattga cttttactgg ctgatgttag atcccaatga tactattaat 781 ttceagtttta atggggcctt tatagcacect gacegegeca gttttctaag aggtaaatct 841 ctaggaattc agagtgacgc acaacttgac aacaattogto aaggtgaatg ttatcatatt 901 ggaggtacca taattagcaa cttgcccttt caaaacatta atagcagagc aattgggaaa 961 tgccccagat acgtaaagca aaaaagetta atgctagcaa ccggaatgaa aaatgttcct 1021 gaaaattcta cacacaaaca gttaactcat cacatgcgca aaaaaagago tttatttagt 1081 gcaatagcag gatttattga aaatggatgg gaaggattaa tagatoagatg gtatggatac 1141 agacatcaga atgcacaagg agaaggaact gctgcagact acaaaagtac acaatctgct 1201 gtcaatcaaa taaccgggaa attaaacaga ctaatagaaa aaaccaacca gcaatttgaa | 1261 ctaatagata atgaattcaa tgaaatagaa aagcaaatto gcaatgttat taactagact 1321 agagattcta tcatcegaaat atggtcatat aatgcagaat tcctegtage agtggagaat 1381 caacacacta ttgatttaac tgattcagag atgaacaaat tatatgaaaa ggtaagaaga 1441 cagctgagag aaaatgctga ggaagatagt aatggctatt ttgaaatatt tcaccaatgt 1501 gacaatgatt gcatggccag cattagaaac aatacatatg atcataaaaa atacagaaag 1561 gaggcaatac aaaacagaat tcagattgat gcagtaaagt tgagcagogg ttacaaagaa 1621 ataatacttt ggtttagctt cggggcatca tatttoettat ttcttgocat tacaataggtt 1681 cttgctttca tatgcataaa aaatggaaac atgcggtgca ctatttgtat ataagtttga 1741 aaaaacaccc ttgtttoetan n DEFINIÇÃO Gene parcial de HA do vírus influenza A para hemaglutinina, RNA genômico, cepa A/equino/Newnarket-Bob Champion/89 (H3N8). " ACESSO AJ223193 SEQ ID NO: 46 .

DN 111 " 1 agtcaaaacc caaccagtgg caacaacaca gecacattat gtctgggaca ccatgcagta 61 gcaaatggaa cattaggtaaa aacaataact gatgaccaaa ttgaggtgac aaatgctact 121 gaattagttc agagcatttc aatagggaaa atatgcaaca actcatatag gottctagat . 181 ggaagaaatt gcacattaat agatgcaatg ctaggagacc cccactagtga toatttttcag 241 tatgagaatt gggacctctt catagaaaga agcagegctt tcagcaattg ctacccatat 301 gacatccctg actatgcatc geteeggtoo attgtagcat coteaggaao attagaattec 361 acagcagagg gattcacatg gacaggtgtc actcaaaacg gaagaagtag agcctgcaaa 421 aggggatcag ccegatagttt ctttagoccga ctgaattggec taacaaaate tggaaattct 481 taccccatat tgaatgtgac aatgcctaac aataaaaatt tegataaact atacatctgg 541 gggattcatc accegagete aaacaaagag cagacaaaat tgtatatcca agaatcagga 601 cgagtaacag tctcaacaga aagaagtcaa caaacagtaa tccctaacat cogatctaga 661 ccgtaggtea gaggtoaate aggcaggata agcatatact ggaccattgt aaaacctgga 721 gatattctaa tgataaacag taatggcaac ttagttgctc cgcggagata ttttaaatto 781 agaacaggga aaagctctgt aatgagatca gatgcaccca tagacactta tgtgtctgaa 841 tatattacac caaatggaag catccccocaac gacaaaccat ttcaaaatgt gaacaaagtt 901 acatatggaa aatgccccaa gtatatcagg caaaacactt taaagctoge cactagggatog 961 aggaatgtac cagaaaageca aatcagagga atctttggag caatagagag attcatagaa 1021 aacggctggg aaggaatagt tgatgggtag tatggattcc gatatcaaaa ctoggaagga 1081 acaggacaag ctgcag a» DEFINIÇÃO Gene do vírus influenza A % (A/equino/Newmarket/D64/79 (H3N8) para o precursor de hemaglutinina, cds parcial.

ACESSO D39677; SEQ ID NO: 47 1 ctgtcaatca tgaagacaac cattattttg atactactga cccattoggt ctacagtcaa 61 aacccaacca gtggcaacaa cacagecaca ctatgtctgg gacaccatgc agtagcaaat 121 ggaacattgg taaaaacaat aactgatgac caaattgagg tgacaaatgc cactgaatta 181 gttcagagca cttcaatagg gaaaatatgc aacaacccat atagggttct agatggaaga 241 aactgcacat taatagatgc aatgctagga gatcccocact gtgatatttt teagtatgag 301 aattgggacc tctteataga aagaagcage goettteagea attgctacee atatgacatc 361 cctgactatg categetoog gtetattato gcatcttcag gaacattaga attcacagca 421 gagggattca catggacagg tgtcactcaa aacggaagaa gtggcgcotg cagaagggga 481 tcagcegata gtttctttag ccgactgaat tagctaacaa aatctggaga ttcettacece 541 acattgaatg tgacaatgcc taacaataac aatttogata aactatacat ctagggggate . 601 catcacccga gcacaaacaa tgagcagaca aaattgtato tccaagaatc agggogagta 661 acagtctcaa caaaaagaag tcaacaaaca ataatcceca acateggate tagaccgtgg 721 gtcaggggte aaccaggcag gataageata tattggacca ttgtgaaacc tagagatatc . 781 ctaatgataa acagtaatgg caacttagtt gcacegeggg gatatttcaa aatgcgaaca 841 ggaaaaagct ctataatgag atcagatgca cccatagaca cttgtgtate egagtgtatt 901 acaccaaatg gaagcatcce caacgacaaa ccatttcaaa atgtgaacaa agttacatat 961 gggaaatgcc ccaagtatat caagcagaat actttgaagec tagecactog gatgaggaat 1021 gtaccagaaa agcaaatcag aggaatcttt ggagcaatag cgggattcat agaaaatgge 1081 tgggag DEFINIÇÃO Proteínas da matriz Ml e M2 (M) do vírus influenza A (A/eq/Newmarket/1/77 (H7N7), cds completo.

. 112 ACESSO AFOO01686; SEQ ID NO: 48 1 atgagtcttc tgaccegaggt cgaaacgtac gttcteteta tegtaccate aggcececte “ 61 aaagcoegaga tegegeagag acttgaagat gtctttgcag gaaagaacac cgatcttgag 121 gcactcatgg aatggctaaa gacaagacca atcctgtcac ctetgactaa gaggatttta 181 ggatttgtat tcacgctoac cgtgcccagt gagoegaggac tgcagegtag acactttgte 241 caaaatgccc ttaatgggaa cogagatcca aacaacatog acagagcagt aaaactgtac 301 aggaagctta aaagggaaat aacattccat ggggcaaaag aggtggeact cagoetatteo 361 actggtgcac tagccagetg catgggacte atatacaaca gaatggggac tgtgacaacc 421 gaagtggcat ttggcctggt atgogocaca tgtgaacaga ttgctgatte ccageacega 481 tctcacagac agatggtgac aacaaccaac ccactaatca gacacgagaa cagaatagta 541 ctagccagta ccacagctaa agccatggag cagatggcag ggtegagtga gcaggcagea 601 gagaccatag aggttactag tcaggccagg cagatggtgc aggcaatgag aaccattggg 661 acccacceta getecagtge cggtttgaaa aatgatoetto ttgaaaattt gcaggcctac 721 cagaaacgga tgggagtgca aatgcagoega tteaagtgat cectetegtta ttacageaag 781 tatcattggg atcttgcact tgatattgtg gattcttgat catettttot tcaaatgcat 841 ttatcgtegt cttaaatacg gtttgaaaag agggocttect acggaaggag tacctgagte 901 tatgagggaa gaatatcggc aggaacagca gagtgctgtg gatgttgacg atagtcattt 961 tgtcaacata gagctagagt aa ” DEFINIÇÃO Gene das Proteínas de matriz M1 e M2 (M) do À vírus influenza A (A/eq/Newmarket/79 (H3N8), cds completo. o ACESSOAFO01675; SEQ ID NO: 49 1 atgagtcttc taaccgaggt cgaaacgtac gttctctota tegtacocate aggcececte 61 aaagcegaga tegegcagag acttgaagat gtctttgcag ggaagaacac cgatcttgag 121 gcactcatgg aataggctaaa gacaagacca atcctgtcac ctetgactaa agogatttta 181 ggatttgtgt tcacgecteac cgtgcccagt gagegaggao tgcagegtag acgctttgtc 241 caaaatgccec ttagtagaaa cggagatcca aacaacatog acagagcagt aaaactgtac 301 aggaagctta aaagagaaat aacattccat ggggcaaaag aggtggeact cagetatteo 361 actggtgcac tagccagetg catgggactc atatacaaca gaatggggac tgtgacaacc 421 gaagtagcat ttggcctagt atgegeccaca tgtgaacaga ttgctgatte ccageatega 481 tctcacagge agatggtagac aacaaccaac ccactaatca gacatgaaaa cagaatogta 541 ctagccagta ccacagetaa agccatggag cagatggcag ggtegagtga gcaggcagea . 601 gaggccatag aggttactag taaggccago cagatggtac aggcaatgag gaccattogo 661 acccacecta getecagtge cggtttgaaa gatgatoctto ttgaaaattt gcaggectac 721 cagaaacgga tgggagtgca aatgcagecga ttcaagtgat cetetegtta ttgcageaag . 781 tatcattggg atcttgcact tgatattgtg gattcttgat cgcottttot teaaatteat 841 ttategtege cttaaatacg gtttgaaaag agggocttet acggaaggag tacctgagtce 901 tatgagggaa gaatatcggc aggaacagea gaatgctgto gatgttgacg atogtcattt & 961 tgtcaacata gagctagagt aa DEFINIÇÃO Gene das Proteínas não-estruturais NS1 e NS2 (NS) do vírus influenza A (A/eq/Newnarket/1/77 (H7N7), cds completas.

ACESSO AFOO01663; SEQ ID NO: 50.

1 atggattcca acactgtgtc aagetttoag gtagactgtt ttotttggoca tgtocgcaaa ' 61 cgatttgcag accaagaact gggtgatgcc ccatteettag aceggettoeg cegagaceag 121 aagtccctaa aaggaagagg cagcactett ggtetggaca tegaaacage cactceatgca 181 ggaaagcaga tagtggageg aattctggaa gaggaatcag atgaggcact taaaatgace 1 241 atagcetetg ttectactte acgetactta actgacatga ctcttgatga gatgtcaaga 301 gactggttca tgctcatgoc caagcagaaa gtaacaggect ccctatgtat aaggatggac 361 caagcaatca tggataagaa catcatacta aaagcaaact ttagtgtgat tttcgaaagg 421 ctggagacac taatactact tagagctttc accogaagaag gagcagtegt tggogaaatt 481 tcaccattgc cttetettoo aggacatact aatgaggatg tcaaaaatgo aattggggto 541 ctcateggag gacttaaatg gaatgataac acagttagag tctoctgaaac tctacagaga 601 ttegettaga gaagcagtca tgagaatggg agaccttcat tccctecaaa gcagaaacga 661 aaaatggoga gaacaattga gtcagaagtt tgaagaaata aggtggttga ttgaagaagt 721 gagacataga ttgaaaaata cagaaaatag ttttgaacaa ataacattta tgcaagecctt 781 acaactattg cttgaagtag aacaagagat aagaactttc tegtttceage ttatttaa DEFINIÇÃO Gen das proteínas não-estruturais NS1 e NS2 (NS) do vírus influenza A (A/eq/Newmarket/D63/79(H3N8), cds ,' completo. , ACESSO AFO001662; SEQ ID NO: 51 1 atggattcca acactgtotc aagctttcag gtagactogtt ttcetttagoca tgtecogcaaa 61 cgatttgcag accaagaact gggtgatace ceattecttg aceggettog coegagaceag 121 aagtccctaa aaggaagagg cagcactcett ggtetggaca togaaacage cactegtgca 181 ggaaagcaga tagtggagecg gattctggaa gaggagtcag atgaggcact taaaatgacc 241 attgcctctg ttcctgctto acgetactta actgacatga ctcttgatga gatgtcaaga 301 gactggttca tgctcatgco caagcagaaa gtaacagget cectatgtat aaggatggac 361 caggcaatca tggataagaa catcatacta aaagcaaact ttagtgtgat tttcgaaagg 421 ctggagacac taatactact tagagccttc accgaagaag gagcagtoegt tagocgaaatt 481 tcaccattgo cttctettco aggacatact aatgaggatg tcaaaaatgc aattaggggte 541 ctcatcggag gacttaaatg gaatgataat acagttagag tctctgaaac tctacagaga 601 ttegettaga gaagcagtca tgagaatagg agaccttcat teccteocaaa gcagaaacga 661 aaaatggcga gaacaattga gccagaagtt tgaagaaata agatggttga ttgaagaagt 721 gegacataga ttgaaaaata cagaaaatag ttttgaacaa ataacattta tgcaagcctt . 781 acaactattg cttgaagtag aacaagagat aagaactttec tegtttcage ttatttaa . EXEMPLO 6: Eficácia da vacina de vírus influenza inativado em caninos.

O ingrediente ativo da vacina (AI) é produzido ou em ovos de galinha embrionados de 9 a 11 dias de idade ou em culturas de células contínuas como células MDCK.

Produção de ovos,coleta e purificação. A produção de

' 114 vacina AI em ovos de galinha embrionados é preparada pela inoculação de 0,1 a 0,25 mL de suspensão de vírus contendo | de 100 a 1000 EID50O (dose infecciosa de ovo) na cavidade alantóica. O fluido alantóico é coletado depois da incubação a 33-37 “C por 2-6 dias e reunidos. A reunião de vírus é clarificada pela centrifugação a 1500 - 4000 g por 5 - 15 minutos e filtrada através de um filtro de 20 um (1). O vírus pode ser concentrado por ultrafiltração usando uma membrana de 300 KDa com um fator de concentração máxima * 10 de 20 (2).

' Adicionalmente, o vírus concentrado é opcionalmente purificado pela ultracentrifugação regional em um gradiente de sacarose seguido pela filtração da fração contendo vírus através de uma membrana de 0,5 um. Esta etapa pode ser repetida. A fração contendo vírus é diluída em um tampão adequado, como um tampão fosfato (3).

A purificação consiste do tratamento com Tween/éter em uma concentração final de 0,1% (p/v) e 50% de concentração " final (Pp/P), respectivamente. A solução resultante é centrifugada e a fase aquosa é coletada.Esta etapa pode ser repetida. A fase aquosa é tratada com nitrogênio para remover o éter residual (4).

Produção, Coleta e Purificação de Cultura de Células.

' 115 O ingrediente ativo é preparado em células (por exemplo, células MDCK, BHK, PerC6) por inoculação em uma taxa de MOI de 0,001 a 1 TCIDS5S0. A cultura é coletada depois da incubação a 35-37 ºC por 48-96 h quando o efeito citopático (CPE) é de aproximadamente 50 a 90%. A cultura é submetida ao ultra-som e centrifugada a 1500 - 4000 g por 5 - 15 minutos (1). O vírus é concentrado por ultra-som usando uma membrana de 300 Kd com um fator de concentração máximo de 20 (2).

* is O vírus é opcionalmente purificado por cromatografia ' de exclusão (Sepharose 6 de fluxo rápido) (3).

Inativação. Vírus (fração 1, 2, 3 ou 4) são inativados pela adição de formalina ou beta-propiolactona até uma concentração final de 0,05% (p/v) ou 0,01% (p/v), respectivamente e à suspensão é mantida respectivamente a 5 ºC por 16-18 horas ou a 20 ºC por 25-36 horas com agitação contínua.

' A inativação do ingrediente ativo é confirmada pela . inoculação em ovos de galinha embrionados ou em células MDCK.

Preparação da Vacina Final. A vacina consiste do vírus influenza inativado e um adjuvante, como hidróxido de alumínio, fosfato de alumínio, CArbômero ou emulsão óleo- em-água, a qual pode conter outros componentes

' 116 : imunoestimuladores “como CpG (1-100 —ug/dose). Vacina tipicamente contém de 15 a 50 ug de hemaglutinina medido por imunodifusão radial individual (SRD) de > de 400 unidades de hemaglutinação. A vacina é administrada por via subcutânea Ou intramuscular. Duas doses são administradas em um intervalo de 2 a 5 semanas aos filhotes de cachorro a partir de 4 semanas de idade. Duração da imunidade: 6 a 12 meses depois de um curso de vacinação primário. ' 10 Protocolo de Vacinação/Desafio. Cachorros (com menos Ú de 4 semanas de idade) são vacinados com 2 doses de vacina inativada em um intervalo de 3 a 4 semanas pela via subcutânea. Amostras de sangue são coletadas no dia da primeira e segunda vacinação em 2-4 semanas depois da segunda vacinação para determinar os níveis de anticorpos específicos para o vírus anti-influenza usando neutralização de vírus, inibição de hemaglutinação, ELISA ' ou testes de hemólise radial individual (SRH).

» De duas a 4 semanas depois da 2º imunização, os cachorros são desafiados com uma cepa virulenta de influenza H3N8 para determinar a eficácia das vacinas.

O cachorros vacinados e controle são desafiados pela seguinte via: Por spray: os animais são colocados em um recipiente

' 117 fechado ou uma máscara é colocada no nariz dos cachorros e a suspensão viral é pulverizada para gerar gotículas de la 100 UM. Os animais são mantidos nas câmaras de pulverização por 30 minutos para permitir a inalação do aerossol. Alternativamente, eles podem ser desafiados por qualquer uma das seguintes vias: Intranasalmente: 0,5 mL contendo 10*º EID50 de vírus desafio é gotejado em cada narina com a ajuda de um conta- gotas.

à. 10 Intra-traquealmente: 1-2 mL contendo 10ºº EID50 de á vírus é diretamente instilado na traquéia.

Oralmente: 5 a 10 mL contendo 10º de vírus desafio é oralmente administrado. os animais são observados diariamente por 14 dias após o desafio por sinais clínicos incluindo febre, tosse, descarga nasal ou ocular, estresse respiratório, anorexia e letargia. Além disso, grupos de animais são eutanasiados e avaliados em relação às : descobertas patológicas de hemorragia pulmonar e pleural, . traqueíte, bronquite, bronquiolite e broncopneumonia.

Swabs nasais são coletados de todos os animais após 1- 14 dias de desafio para o isolamento viral.

A presença ou ausência dos antígenos virais nos tecidos respiratórios é avaliada por imunoistoquímica nos dias 3, 7 e 10 após o desafio.

: As amostras de sangue são coletadas nos dias 7 e 14 após o desafio e são analisadas pela presença de anticorpo | específico do vírus H3N8 anti-influenza.

EXEMPLO 7: Vacinação de Cachorros com Vacinas Influenza Equino para Induzir uma Resposta Imune Humoral Contra CIV

Um estudo foi efetuado no qual 35 cachorro foram aleatoriamente alocados em quatro grupos de 9, 9, 9 e 8 cachorros.

Nenhum dos cachorros teve anticorpo detectáveis y 10 ao CIV, conforme determinado pelos testes HI (abaixo) no ' início do estudo.

Um grupo foi imunizado com vCP1529 (gene HA expressando canarypox recombinante de influenza equino Kentucky, A/eq/Kentucky/94), dose de 10º TCIDs/1 mL, à qual foi administrada subcutaneamente, e dois grupos foram imunizados com vCP2242 (gene HA expressando canarypox recombinante de A/egqg/Ohio/03), o qual foi administrado a um grupo subcutaneamente (10º? TCIDso/l mL de dose) . Os ' vacinados receberam 2 doses de vacina no Dia O e no Dia 28. . O quarto grupo não foi vacinado e serviu como controle.

Todos os cachorros foram examinados por reações locais no sítio de inoculação e por sinais clínicos gerais.

Amostras de sangue foram coletadas para sorologia nos dias -1, 7, 13, 21, 28, 35 e 42 para todos os grupos.

Um teste de inibição de hemaglutinação (HI) foi efetuado

' 115 . conforme descrito anteriormente (Karaca et al., 2007). Resumidamente, soros foram separados e foram inativados por | calor (56 ºC por 30 minutos.

RBCs de peru foram adicionados, e as placas foram incubadas por mais 30 minutos.

Os poços foram a seguir examinados por evidências de hemaglutinação.

A diluição mais baixa do soro testado foi de 1:8, e os títulos de anticorpo correspondendo ao recíproco da diluição mais alta que inibiu a hemaglutinação foram apresentados como títulos médios geométricos (GMTs). Todos os cachorros toleraram o poço de inoculação.

Nenhum dos cachorros teve uma reação adversa sistêmica ou local, independentemente do inóculo ou via de administração.

As respostas de anticorpo dos cachorros, conforme medidas pelos testes HI, são mostradas na FIG. 7. No dia -1, todos os cachorros foram soronegativos (títulos de anticorpo < 8). Os cachorros de controle permaneceram soronegativos por toda a duração do estudo.

Todos os ' cachorros inoculados tiveram anticorpos detectáveis contra - CIV nos dias 13, 21 e 28 depois da inoculação inicial.

Embora não tenha havido diferença significativa nos títulos de anticorpo entre grupos subcutaneamente inoculados, os títulos de anticorpo do grupo transdermicamente inoculado foram significativamente maiores do que os outros depois da primeira e segunda inoculações (ANOVA das medições

' 120 . repetidas, p < 0,01). EXEMPLO 8: Vacinação de cachorros com Vacinas de | Influenza Equino e desafio com um isolado de Influenza Canino virulento.

Um estudo foi efetuado no qual 33 cachorros foram aleatoriamente alocados a um ou dois grupos.

Os cachorros do grupo 1 (n = 16) não foram inoculados e serviram com o controle.

Cachorros do grupo 2 (n = 17) foram inoculados subcutaneamente no dia 0 e no dia 28 com 10º? TCIDsº de ET.

CP2242 (gene HA expressando canarypox recombinante de ' A/eqg/Ohio/03). Todos os cachorros foram desafiados no dia 43 com 107*º TCIDso de CIV-NYO5S primeiro por 0,5 mL de seringa diretamente nas narinas seguido pelo desafio com aerossol em uma câmara fechada por 5-15 minutos, com oxigênio fornecido usando um nebulizador comercialmente disponível.

Todos os cachorros foram clinicamente observados antes e depois do desafio de acordo com a linha ' de tempo na Tabela 2. . Tabela 2: Linha de Tempo (VI = isolamento do vírus; Bb = isolamento de Bordetlla bronchiseptica)

a 121 ! sítio de injeção | de linha de base Swab nasal para VI e Bb

EO D1-4 Observações do = D7 Observações do sítio de injeção ' Pesagem D16-18 Observações do sítio de injeção de linha de base D21 Observações do sítio de injeção de linha de base ; Pesagem * Swabs nasais para VI e Bb Coleta de sangue d elinha de base para a sorologia eee poe eme o D22-25 Observações do = D28 Observações do sítio de injeção Observações clínicas de linha de base * Swabs nasais para ' VI e Bb Coleta de sangue de linha de base para sorologia D42 Observações clínicas de linha de base (peso) : Swabs nasais para SS VI eBb Coleta de sangue de linha de base para sorologia

| 123 ame po areas D44-48 1-5 Observações clínicas Swabs nasais para VI e Bb Observações clínicas (peso) Swabs nasais para VI e Bb DSO 7 Observações ' clínicas (peso) Swabs nasais para VI e Bb Sangue para sorologia D52-53 29-10 Observações clínicas i Swabs nasais para "” VI e Bb D57 14 Observações clínicas (Peso) Swabs nasais para VI e Bb i 124 | Sangue para sorologia Eutanásia - Fim do Estudo * Dias após o desafio Os sinais clínicos que foram registrados como ausente ou presente incluem tosse (espontânea ou induzível por y apalpação da traquéia suave), descarga ocular/nasal (serosa . 5 ou purulenta), temperatura retal (ºF), depressão/letargia, dispnéia e perda de peso.

Todos os cachorros foram avaliados para a carga viral CIV, temperatura corporal, respostas do anticorpo HI ao antígeno CIV HA e cadência viral. Para determinar as cargas virais CIV, swabs nasais foram coletados dos animais nos dias —-4, 21, 28 e 42 de amostras pré-desafio e nos dias 44- . 50, 52, 53 e 57 (1-7, 9, 10 e 14 dias após o desafio). Os níveis de vírus foram determinados usando um ensaio de titulação de vírus nas células do rim canino Madine Darby (MDCK) e os resultados do título foram expressos como TCIDso. A FIG. 8 ilustra e descreve os títulos virais médios de extratos de swab nos controles e vacinados. Neste exemplo, um TCIDso de 1,45 é o título mínimo detectável,

i 125 deste modo um título de 1,45 = nenhum vírus detectado. Os animais vacinados interronpem a cadência no dia 47, enquanto que os animais de controle fazem cadência até o dia 49. Os controles tiveram um título significativamente mais alto do que os vacinados no dia 44 (p < 0,0001), dia 46 (p= 0,0016), dia 47 (p = 0,0027) e dia 48 (p < 0,0001).

As temperaturas corporais dos cachorros foram avaliadas em todo o estudo. As temperaturas corporais médias dos cachorros vacinados com vCP2242 foram mais ' 10 baixas do que as temperaturas médias corporais dos ' cachorros de controle (FIGS. 9 e 10).

FIG. 9 mostra a temperatura média no decorrer do tempo do dia 28 ao dia 57. Os controles mostram um aumento de linha de base de - 102 ºF até - 104 ºF, 24 horas depois do desafio, enquanto que à temperatura dos vacinados aumenta de 102 ºF até - 102,5 ºF (diferença estatisticamente significativa naquele dia com p < 0,0001). Os controles ã também têm uma temperatura corporal média - significativamente mais alta no dia 49 (p = 0,048).

FIG. 10 é um boxplot para os dias 42 (1 dia antes do desafio), 44 e 45 (1 e 2 dias depois do desafio).

FIG. 11 mostra os títulos HI no dia 42 (1 dia antes do desfio) e dia 57 (14 dias depois do desafio). Um desafio CIV-NYO5 virulento estimula os títulos HI dos cachorros i 126 vacinado com vCP2242. Embora os animais não-vacinados se soroconverteram depois do desafio, seus títulos HI do dia 57 médios foram significativamente mais baixos do que os vacinados. Isto é uma evidência da iniciação eficiente proporcionada pela vacina.

Em média, os cachorros vacinados com antígeno HA de A2/equino/Ohio/03 (vCP2242) seguido pelo desafio no dia 43 com isolado de CIV-NYO5 demonstrou uma quantidade reduzida dos dias de cadência em comparação com os cachorros de ' 10 controle (FIG. 12), assim como duração reduzida da cadência Ú viral na cavidade nasal (FIG. 13).

FIG. 12 mostra a quantidade de dias de cadência ilustrando o decréscimo na quantidade de dias de cadência nos vacinados vc. controles.

FIG. 13 mostra o decréscimo na duração da cadência viral nos vacinados.

A invenção é ainda descrita pelos seguintes parágrafos NM numerados: - 1. Método de eliciar uma resposta imune contra influenza em um canino, compreendendo a administração de uma formulação compreendendo vetor de expressão avipox compreendendo um polinucleotídeo codificando um antígeno, epítopo o imunógeno de influenza, e um carreador, excipiente ou veículo farmaceuticamente ou veterinariamente i 127 aceitável em uma quantidade eficaz para eliciar uma resposta imune.

2. Método de indução de uma resposta imune contra influenza em um canino, compreendendo a administração de uma formulação compreendendo um vetor de expressão avipox compreendendo um polinucleotídeo codificando um antígeno, epítopo ou imunógeno de influenzay e um carreador, excipiente ou veículo farmaceuticamente ou veterinariamente aceitável em uma quantidade eficaz para induzir uma : 10 resposta imune. | : 3. Método, de acordo com o parágrafo 1 ou 2, em que a formulação ainda compreende um adjuvante.

4. Método, de acordo com os parágrafos 1 a 3, em que o antígeno, epítopo ou imunógeno de influenza é uma hemaglutinina, proteína de matriz, proteína de membrana, neuraminidase, proteína não-estrutural, nucleoproteína, polimerase ou qualquer fragmento seu.

' 5. Método, de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 . a 4, em que o antígeno, epítopo ou imunógeno de influenza é isolado de um canino infectado com influenza.

6. Método do parágrafo 5, em que o antígeno, epítopo ou imunógeno de influenza é isolado da lavagem broncoalveolar e/ou dos tecidos pulmonares do canino.

7. Método, de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 4, em que o antígeno, epítopo ou imunógeno de influenza é isolado de um influenza equino.

8. Método do parágrafo 7, em que o influenza equino é um influenza equino de Ohio, um influenza de equino Kentucky ou um influenza equino Newmarket.

9. Método de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 8, em que o vetor de expressão avipox é um vetor de expressão avipox atenuado.

10. Método do parágrafo 9, em que o vetor de expressão : 10 avipox é um vetor canarypox. ' 11. Método do parágrafo 10, em que o vetor canarypox é ALVAC.

12. Método do parágrafo 10 ou 11, em que o antígeno, epítopo ou imunógeno de influenza é uma hemaglutinina.

13. Método do parágrafo 12, em que a hemaglutinina é H3.

14. Método do parágrafo 12 ou 13, em que o vetor ' canarypox é CP1529 ou CP1533. . 15. Método de eliciar uma resposta imune contra influenza em um canino compreendendo a administração de uma formulação compreendendo uma vacina influenza inativada e um carreador, excipiente ou veículo farmaceuticamente ou veterinariamente aceitável em uma quantidade eficaz para eliciar uma resposta imune.

| 129

16. Método de indução de uma resposta imune contra influenza em um canino, compreendendo a administração de uma formulação compreendendo uma vacina influenza inativada e um carreador, excipiente ou veículo farmaceuticamente ou veterinariamente aceitável em uma quantidade eficaz para induzir uma resposta imune.

17. Método do parágrafo 15 ou 16, em que a formulação ainda compreende um adjuvante.

18. Método, de acordo com qualquer dos parágrafos 15 à 17, em que a vacina influenza inativada é influenza canino Ú inativado.

19. Método de acordo com qualquer um dos parágrafos 15 a 17, em que a vacina influenza inativada é um influenza equino inativado.

20. Método do parágrafo 19, em que o influenza equino é influenza equino Ohio, influenza equino Kentucky ou influenza equino Newmarket. ã 21. Método, de acordo com qualquer um dos parágrafos . 15 a 20, em que à vacina influenza inativada é inativada com formalina ou beta-propiolactona.

22. Método, de acordo com qualquer um dos parágrafos 17 a 21, em que o adjuvante é hidróxido de alumínio, fosfato de alumínio, um carbômero ou uma emulsão óleo-em- água.

i 130

23. Método, de acordo com qualquer um dos parágrafos 17 a 22, em que o adjuvante compreende ainda Cp6.

24. Método, de acordo com qualquer um dos parágrafos 15 a 23, em que a administração é subcutânea Ou intramuscular.

25. Kit para efetuar qualquer um dos métodos dos parágrafos 1 a 24 compreendendo a vacina ou qualquer um dos parágrafos 1 a * e instruções para efetuar o método de qualquer um dos parágrafos 1 a 24.

0 Deste modo, tendo descrito em detalhes modalidades : preferidas da presente invenção, é para ser compreendido que a invenção definida nos parágrafos acima não é para ser limitada aos detalhes particulares “estabelecidos na descrição acima, uma vez que muitas variações da mesma são possíveis sem sair do espírito ou escopo da presente invenção.

Claims (20)

1. *. WS ,

   Í

   REIVINDICAÇÕES +” Vacina Canidae caracterizada pelo fato de compreender uma quantidade eficaz de um vetor de expressão compreendendo e expressando in vivo em um canino um polinucleotídeo codificando um antígeno de influenza equino compreendendo a influenza equina H3 operativamente ligada ao promotor e opcionalmente a um potencializador e um vetor, veículo ou excipiente farmacêutica ou veterinariamente aceitável.
2. 2. Vacina, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o polinucleotídeo compreende hemaglutinina de H3NB códon otimizada.
3. 3. Vacina, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o polinucleotídeo é isolado de um canino infectado com influenza equina.
4. 4, Vacina, de acordo com a reivindicação 3, caracterizada . pelo fato de que o polinucleotídeo é isolado de uma lavagem broncoalveolar de um canino infectado.
5. 5. Vacina, de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que o polinucleotídeo é isolado do tecido pulmonar de um canino infectado.
6. 6. Vacina, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o polinucleotídeo é isolado de um isolado de vírus de influenza equina.

   A ; ,
7. 7. Vacina, de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de que o isolado de influenza equina é selecionado do grupo consistindo de um isolado de influenza equina de Ohio, um isolado de influenza equina de Kentucky, um isolado de influenza equina de Newmarket ou misturas dos mesmos.
8. 8. Vacina, de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de que o polinucleotídeo é isolado de um isolado de influenza equina de Ohio.
9. 9. Vacina, de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de que o polinucleotídeo é isolado de um isolado de influenza equina de Kentucky.
10. 10. Vacina, de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de que o polinucleotídeo é isolado de um isolado de influenza equina de Newmarket.
11. 11. Vacina, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o vetor de expressão é um poxvírus.
12. 12. Vacina, de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pelo fato de que o vetor de expressão é um vírus avipox.
13. 13. Vacina, de acordo com a reivindicação 12, caracterizada pelo fato de que o vetor de expressão é um Vírus canarypox.
14. À ã 14, Vacina, de acordo com a reivindicação 13, caracterizada pelo fato de que o vírus canarypox é ALVAC.
15. 15. Vacina, de acordo com a reivindicação 13, caracterizada pelo fato de que o vírus canarypox é selecionado de CP1529, CP1533 ou CP2242,.
16. 16. Uso de uma quantidade eficaz de um vetor de expressão o qual contém e expressa in vivo em um canino um polinucleotídeo codificando um antígeno de influenza equina compreendendo influenza equina H3 operativamente ligado a um promotor e opcionalmente a um potencializador e um vetor, excipiente ou veículo farmacêutica ou veterinariamente aceitável caracterizado pelo de ser para a preparação de um medicamento contra influenza canina.
17. 17. Uso, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que o medicamento compreende ainda um adjuvante.
18. 18. Uso, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo é isolado de um isolado de influenza equina selecionado do grupo consistindo de um isolado de influenza equina de Ohio, um isolado de influenza equina de Kentucky, um isolado de influenza equina de Newmarket ou misturas dos mesmos.

    ) À : !
19. 19. Uso, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que o adjuvante é um lipídeo catiônico contendo um sal de amônio quaternário.
20. 20. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 16 a 19, caracterizado pelo fato de que o medicamento é uma vacina.