BRPI0819526B1 - SEQUÊNCIA DE ÁCIDO NUCLEICO DE PRECURSOR DE miRNA ARTIFICIAL, CONSTRUÇÃO RECOMBINANTE E MÉTODO PARA REDUZIR A EXPRESSÃO DE UMA SEQUÊNCIA ALVO - Google Patents

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(54) Título: SEQUÊNCIA DE ÁCIDO NUCLEICO DE PRECURSOR DE MIRNA ARTIFICIAL, CONSTRUÇÃO RECOMBINANTE E MÉTODO PARA REDUZIR A EXPRESSÃO DE UMA SEQUÊNCIA ALVO (51) Int.CI.: C12N 15/82; A01H 5/00 (30) Prioridade Unionista: 18/12/2007 US 61/014,512 (73) Titular(es): E. I. DU PONT DE NEMOURS AND COMPANY (72) Inventor(es): BRIAN MCGONIGLE

1/54 “SEQUÊNCIA DE ÁCIDO NUCLEICO DE PRECURSOR DE miRNA

ARTIFICIAL, CONSTRUÇÃO RECOMBINANTE E MÉTODO PARA REDUZIR

A EXPRESSÃO DE UMA SEQUÊNCIA ALVO”

Referência Cruzada ao Pedido de Patente Relacionado [001] O presente pedido reivindica o benefício do Pedido de Patente Provisório US 61/014.512, depositado em 18 de dezembro de 2007, a revelação do qual está incorporada aqui por referência em sua totalidade.

Campo Da Invenção [002] O campo da presente invenção refere-se, geralmente, a biologia molecular da planta. Em particular, refere-se a métodos e construções para regular negativamente (down-regulate) a expressão de sequências objetivadas.

Antecedentes Da Invenção [003] Os microRNAs (miRNAs) foram identificados pela primeira vez somente alguns poucos anos atrás, mas já está claro que eles desempenham um papel importante na regulagem da atividade genética. Estes RNAs não codificados com 20-22 nucleotídeos têm a habilidade de hibridizar através de emparelhamento de base com mRNAs alvo específicos e regular negativamente a expressão destas transcrições, por mediação tanto de clivagem de RNA ou por repressão translacional.

[004] Estudos recentes indicaram que os miRNAs têm funções importantes durante o desenvolvimento. Em plantas, eles mostraram que controlam uma variedade de processos de desenvolvimento incluindo o tempo de florescimento, a morfologia da folha, a polaridade do órgão, a morfologia floral, e o desenvolvimento da raiz (revisada por Mallory e Vaucheret (2006) Nat Genet 38:S31-36). Devido ao papel regulatório estabelecido de miRNAs, é possível que eles também estejam envolvidos no controle de alguns dos maiores traços de cultura, tais como, a tolerância à seca e a resistência contra

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2/54 doenças.

[005] Os miRNAs são transcrições pela RNA polimerase II como mensagens de poliadenilação e completas chamadas de pri-miRNAs. Estes primiRNAs são processados em transcrições menores chamadas de pré-miRNAs e estes precursores têm a habilidade de formar estruturas de gancho estáveis (revisadas por Bartel (2004) Cell 116:281 a 297; Jones-Rhoades MW, Bartel DP, Bartel B. MicroRNAs e os seus papéis regulatórios nas plantas. Annu Rev Plant Biol. 2006; 57:19 a 53.) Enquanto os pri-miRNAs são processados para pré-miRNAs por Drosha no núcleo e cleaves de Dicer no citoplasma de metazoários, a maturação do miRNA nas plantas difere da trajetória em animais porque as plantas não têm um homólogo Drosha. Ao invés disso, a enzima RNase III como um DICER 1 (DCL1), que é homólogo ao Dicer animal, pode ter a função Drosha além de sua função conhecida em processo de gancho (Kurihara e Watanabe (2004) Proc Natl Acad Sci 101:12.753 a 12.758).

[006] Os microRNAs artificiais (amiRNAs) foram recentemente descritos nas sequências de mRNA virais que objetivam a Arabidopsis (Niu et al. (2006) Biotecnologia da Natureza [Nature Biotechnology] 24:1.420 a 1.428) ou de genes endógenos (Schwab et al. (2006) Célula da Planta [Plant Cell] 18:1.121 a 1.133). A construção do amiRNA pode ser expressada sob promotores diferentes a fim de mudar o padrão espacial de silenciamento (Schwab et al. (2006) Plant Cell 18:1.121 a 1.133). Os miRNAs artificiais substituem o microRNA e a sua sequência de estrela complementar em um miRNA precursor e substitui as sequências que objetivam um mRNA a ser silenciado. O silenciamento por miRNAs endógenos pode ser encontrado em uma variedade de padrões espaciais, temporais e de expressões de desenvolvimento (Parizotto et al. (2007) Genes Dev 18:2.237 a 2.242; Alvarez et al. (2006) Célula da Planta [Plant Cell] 18:1.134 a 51). O miRNA artificial pode ser construído para tanto capturar como estender a diversidade e a

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3/54 especificidade nos padrões de silenciamento. Até hoje, não houve relatórios sobre o uso de amiRNAs em plantas cultivadas.

[007] O documento WO 2004/009779 publicado em 29 de janeiro de 2004 descreve as composições e métodos para modular a expressão gênica em plantas.

[008] O Cessionário do Depositante da Publicação do Pedido de Patente 2005/0138689 publicado em 23 de junho de 2005 descreve os miRNAs e seu uso no silenciamento de uma sequência alvo.

Breve Descrição Da Listagem De Sequências [009] A presente invenção pode ser mais bem entendida a partir da descrição detalhada seguinte e que acompanha a Listagem da Sequência, que forma uma parte deste pedido.

[010] As descrições da sequência resumem a Listagem das Sequências anexada aqui. A Listagem da Sequência contém códigos de uma letra para caracteres de sequência de nucleotídeos e o único e códigos de três letras para ácidos de amino como definidos nos padrões IUPAC-IUB descritos no Nucleic Acids Research 13:3.021 a 3.030 (1985) e no Biochemical Journal 219(2):345 a 373 (1984).

[011] SEQ ID Nos: 1 a 12 correspondem aos primers úteis para a amplificação dos precursores de microRNAs (miRNA) dos genomas de soja.

[012] SEQ ID Nos: 13 a 18 correspondem às sequências do precursor miRNA de soja para 156c, 159, 166b, 168c, 396b e 398b, respectivamente.

[013] SEQ ID Nos: 19 a 21 correspondem à sequência do miRNA (amiRNA) artificial usado para silenciar a lipoxigenase de soja (lox), desaturases de ácido graxo 2-1 (fad2-1), ou transcrições de desaturases de ácidos graxos 2-2 (fad2-2), respectivamente.

[014] SEQ ID Nos: 22 a 30 correspondem às “sequências de

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4/54 estrelas” contidas dentro dos precursores de amiRNA para 156c-lox, 159-lox,

166b-lox, 168c-lox, 398b-lox, 159-fad2-1b, 166b-fad2-1b, 396b-fad2-1b, e 159fad2-2, respectivamente. As sequências de estrelas são as sequências complementares em grande parte dentro do precursor de miRNA que formam um duplex com o miRNA.

[015] SEQ ID Nos: 31 a 39 correspondem aos precursores do amiRNA para 156c-lox, 159-lox, 166b-lox, 168c-lox, 398b-lox, 159-fad2-1b, 166b-fad2-1b, 396b-fad2-1b, e 159-fad2-2, respectivamente. Estes precursores, quando expressados em soja, direcionam o silenciamento do lox endógeno, fad2-1, ou transcrições fad2-2.

[016] SEQ ID Nos: 40 a 42 correspondem à sequência de amiRNA objetivando fatB, uma sequência de tioesterase de soja, e as sequências de estrela correspondentes para os precursores 159 e 396b, respectivamente.

[017] SEQ ID Nos: 43 a 46 correspondem a quatro versões (a-d) de sequências de amiRNA objetivando a fosfoglucomutase de soja, respectivamente.

[018] SEQ ID No: 47 a 50 correspondem a quatro sequências de estrela para uso no precursor de amiRNAs objetivando a fosfoglucomutase de soja. Os precursores contendo estas sequências de estrelas são 159-PGMa, 168c-PGMb, e 159-PGMd, respectivamente.

Descrição Resumida Da Invenção [019] A presente invenção diz respeito a um fragmento de ácido nucleico isolado compreendendo um miRNA precursor, dito miRNA precursor correspondendo substancialmente à sequência de desoxirribonucleotídeos definida na SEQ ID No: 13 (i) em que os nucleotídeos 513 a 533 da SEQ ID No: 13 são substituídos por uma primeira subsequência variável de nucleotídeos que varia de tamanho de cerca de 19 a cerca de 30 nucleotídeos

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5/54 dependendo da sequência alvo cuja expressão deve ser reduzida e (ii) ainda, em que os nucleotídeos 384 a 407 da SEQ ID No: 13 são substituídos por uma segunda subsequência variável de nucleotídeos que varia de tamanho de cerca de 19 a cerca de 30 nucleotídeos, dita segunda subsequência variável de nucleotídeos sendo capaz de hibridizar com a primeira subsequência variável do miRNA precursor.

[020] Outros fragmentos nucleicos isolados que são também de interesse incluem os seguintes:

(a) um fragmento de ácido nucleico isolado compreendendo um miRNA precursor, dito miRNA precursor correspondendo substancialmente à sequência de desoxirribonucleotídeos definida na SEQ ID No: 14 (i) em que os nucleotídeos 275 a 295 da SEQ ID No: 14 são substituídos por uma primeira subsequência variável de nucleotídeos que varia de tamanho de cerca de 19 a cerca de 30 nucleotídeos dependendo da sequência alvo cuja expressão deve ser reduzida e (ii) ainda, em que os nucleotídeos 121 a 141 da SEQ ID No: 14 são substituídos por uma segunda subsequência variável de nucleotídeos que varia de tamanho de cerca de 19 a cerca de 30 nucleotídeos, dita segunda subsequência variável de nucleotídeos sendo capaz de hibridizar com a primeira subsequência variável do miRNA precursor;

(b) um fragmento de ácido nucleico isolado compreendendo um miRNA precursor, dito miRNA precursor correspondendo substancialmente à sequência de desoxirribonucleotídeos definida na SEQ ID No: 15 (i) em que os nucleotídeos 262 a 282 da SEQ ID No: 15 são substituídos por uma primeira subsequência variável de nucleotídeos que varia de tamanho de cerca de 19 a cerca de 30 nucleotídeos dependendo da sequência alvo cuja expressão deve ser reduzida e (ii) ainda, em que os nucleotídeos 155 a 175 da SEQ ID No: 15 são substituídos por uma segunda subsequência variável de nucleotídeos que varia de tamanho de cerca de 19 a cerca de 30 nucleotídeos, dita segunda

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6/54 subsequência variável de nucleotídeos sendo capaz de hibridizar com a primeira subsequência variável do miRNA precursor;

(c) um fragmento de ácido nucleico isolado compreendendo um miRNA precursor, dito miRNA precursor correspondendo substancialmente à sequência de desoxirribonucleotídeos definida na SEQ ID No: 16 (i) em que os nucleotídeos 249 a 269 da SEQ ID No: 16 são substituídos por uma primeira subsequência variável de nucleotídeos que varia de tamanho de cerca de 19 a cerca de 30 nucleotídeos dependendo da sequência alvo cuja expressão deve ser reduzida e (ii) ainda, em que os nucleotídeos 316 a 336 da SEQ ID No: 16 são substituídos por uma segunda subsequência variável de nucleotídeos que varia de tamanho de cerca de 19 a cerca de 30 nucleotídeos, dita segunda subsequência variável de nucleotídeos sendo capaz de hibridizar com a primeira subsequência variável do miRNA precursor;

(d) um fragmento de ácido nucleico isolado compreendendo um miRNA precursor, dito miRNA precursor correspondendo substancialmente à sequência de desoxirribonucleotídeos definida na SEQ ID No: 17 (i) em que os nucleotídeos 196 a 216 da SEQ ID No: 17 são substituídos por uma primeira subsequência variável de nucleotídeos que varia de tamanho de cerca de 19 a cerca de 30 nucleotídeos dependendo da sequência alvo cuja expressão deve ser reduzida e (ii) ainda, em que os nucleotídeos 262 a 282 da SEQ ID No: 17 são substituídos por uma segunda subsequência variável de nucleotídeos que varia de tamanho de cerca de 19 a cerca de 30 nucleotídeos, dita segunda subsequência variável de nucleotídeos sendo capaz de hibridizar com a primeira subsequência variável do miRNA precursor; e (e) um fragmento de ácido nucleico isolado compreendendo um miRNA precursor, dito miRNA precursor correspondendo substancialmente à sequência de desoxirribonucleotídeos definida na SEQ ID No: 18 (i) em que os nucleotídeos 127 a 147 da SEQ ID No: 18 são substituídos por uma primeira

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7/54 subsequência variável de nucleotídeos que varia de tamanho de cerca de 19 a cerca de 30 nucleotídeos dependendo da sequência alvo cuja expressão deve ser reduzida e (ii) ainda, em que os nucleotídeos 53 a 73 da SEQ ID No: 18 são substituídos por uma segunda subsequência variável de nucleotídeos que varia de tamanho de cerca de 19 a cerca de 30 nucleotídeos, dita segunda subsequência variável de nucleotídeos sendo capaz de hibridizar com a primeira subsequência variável do miRNA precursor.

[021] Qualquer um desses fragmentos de ácido nucleico isolado pode ser usado para fazer uma construção recombinante compreendendo esses fragmentos de ácido nucleico isolados operacionalmente ligados a pelo menos uma sequência regulatória.

[022] Estas construções podem ser transformadas em células de plantas, para que a célula de planta transformada compreende a construção recombinante no seu genoma.

[023] Em outro aspecto, a presente invenção refere-se a um método para reduzir a expressão de um gene alvo em uma célula de planta, dito método compreendendo:

(a) transformar pelo menos uma célula de planta com uma construção de ácido nucleico compreendendo qualquer um dos fragmentos de ácido nucleico isolado descrito aqui; e (b) selecionar aquela(s) célula(s) de planta transformada(s) cujo nível de expressão da sequência alvo é reduzido quando comparado ao nível de expressão do gene alvo em uma célula de planta do tipo selvagem.

Descrição Detalhada Da Invenção [024] Informações pertinentes a este pedido podem ser encontradas nos Pedidos de Patentes No. 10/963.238 e 10/963.394, depositados em 12 de outubro de 2004. Os conteúdos completos dos pedidos acima estão aqui incorporados por referência.

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8/54 [025] Outras referências que podem ser úteis para o entendimento da presente invenção incluem o Pedido de Patente US

10/883.374, depositado em 01 de julho de 2004; Pedido de Patente US

10/913.288, depositado em 06 de agosto de 2004; e Pedido de Patente US

11/334.776, depositado em 06 de janeiro de 2006.

[026] A revelação de cada referência definida aqui é incorporada aqui por referência a sua totalidade.

[027] Conforme usada aqui e nas reivindicações em anexo, as formas no singular “um”, “uma”, e “o/a” incluem uma referência no plural, ao menos que o contexto claramente indique o contrário. Assim, por exemplo, a referência a “uma planta” inclui uma pluralidade das ditas plantas, referência á “uma célula” inclui uma ou mais células e equivalentes a estas conhecidas por técnicos no assunto, e assim por diante.

[028] No contexto desta revelação, inúmeros termos e de abreviações são usados. As seguintes definições são fornecidas.

[029] “microRNA ou miRNA” referem ao ácido oligoribonucleico, que regula a expressão de um polinucleotídeo compreendendo a sequência alvo. Os microRNAs (miRNAs) são RNAs não codificados de cerca de 19 a cerca de 24 nucleotídeos (nt) em comprimento que foram identificados tanto em animais como em plantas (Lagos-Quintana et al., Science 294:853 a 858 2001, Lagos-Quintana et al., Curr. Biol. 12:735 a 739 2002; Lau et al., Science 294:858 a 862 2001; Lee e Ambos, Science 294:862 a 864 2001; Llave et al., Plant Cell 14:1.605 a 1.619 2002; Mourelatos et al., Genes.Dev. 16:720 a 728 2002; Park et al., Curr. Biol. 12:1.484 a 1.495 2002; Reinhart et al., Genes. Dev. 16:1.616 a 1.626 2002), que regulam a expressão de um polinucleotídeo compreendendo a sequência alvo. Eles são processados a partir de transcrições de precursores mais longas que variam no tamanho de aproximadamente 70 a 2000 nt ou mais longos, e estas transcrições

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9/54 precursores têm a habilidade de formar estruturas de gancho estáveis. Em animais, a enzima envolvida no processamento de precursores miRNAs é chamada de Dicer, uma proteína assemelhada ao RNAse III (Grishok et al., Cell 106:23 a 34 2001; Hutvagner et al., Science 293:834 a 838 2001; Ketting et al., Genes. Dev. 15:2.654 a 2.659 2001). As plantas também têm uma enzima assemelhada à Dicer, DCL1 (anteriormente chamada de CARPEL FACTORY/SHORT INTEGUMENTS1/SUSPENSOR1), e uma evidência recente indica que ela, tal como a Dicer, está envolvida no processamento dos precursores de gancho para gerar miRNAs maduros (Park et al., Curr. Biol. 12:1.484 a 1.495 2002; Reinhart et al., Genes. Dev. 16:1.616 a 1.626 2002). Ademais, está se tornando claro a partir de trabalhos recentes que pelo menos alguns precursores de gancho miRNA surgem como transcrições poliadenilados mais longas, e vários miRNAs diferentes e de gancho associados podem estar presentes em um único transcrições (Lagos-Quintana et al., Science 294:853 a 858 2001; Lee et al., EMBO J 21:4.663 a 4.670 2002). Trabalhos recentes também examinaram a seleção do fio de miRNA a partir do produto dsRNA que surge a partir do processamento do gancho por DICER (Schwartz et al., 2003, Cell 115:199 a 208). Aparentemente, a estabilidade (ou seja, o conteúdo e/ou incompatibilidades de G:C vs A:U,) das duas extremidades do dsRNA processado afeta a seleção do fio, com a extremidade de baixa estabilidade sendo mais fácil de desenrolar por uma atividade da helicase. O fio da extremidade 5' na extremidade de baixa estabilidade é incorporado no complexo RISC, enquanto o outro fio é degradado.

[030] Os “pri-miRNAs” ou miRNAs primários” são RNAs longos, poliadenilados transcrições por RNA polimerase II que codifica os miRNAs. Os “pré-miRNAs” são miRNAs primários que foram processados para formar uma sequência mais curta que tem a capacidade de formar um gancho estável e é ainda processada para liberar um miRNA. Em plantas, tanto os dois passos de

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10/54 processamento são executados pelo assemelhado de dicer e é, portanto, difícil diferenciar funcionalmente entre “pri-RNAs” e “pré-miRNAs”. Assim sendo, um miRNA precursor ou um miRNA primário, é funcionalmente definido aqui como uma sequência de nucleotídeos que é capaz de produzir um miRNA. Devido a esta definição funcional, e como ficará claro a partir dos exemplos e discussões aqui, um precursor miRNA, um miRNA primário e/ou uma miRNA da presente invenção pode ser representada como um ácido ribonucleico ou alternativamente, em uma forma de ácido desoxirribonucleico que “corresponde substancialmente” ao miRNA precursor, miRNA primário e/ou miRNA. É entendido que o DNA em uma forma de duplo fio irá compreender um fio capaz de ser transcrições no precursor de miRNA descrito. Construções de expressão, construções de DNA recombinante, e organismos transgênicos incorporando o miRNA que codifica DNA que resulta na expressão dos precursores miRNA descritos são descritos.

[031] Uma “subsequência de nucleotídeos variáveis” refere a uma porção de uma sequência de nucleotídeos que substitui uma parte de uma sequência de pré-miRNA desde que esta subsequência seja diferente da sequência que está sendo substituída, i.e. ela não pode ser a mesma sequência.

[032] Um “gene alvo” refere-se a um gene que codifica um RNA alvo, ou seja, um gene a partir do qual um RNA alvo é transcrições. O gene pode codificar um mRNA, tRNA, um RNA pequeno, etc.

[033] A “sequência alvo” refere-se a um RNA cuja expressão deve ser modulada, ou seja, regulada para baixo. A sequência alvo pode ser uma porção de uma moldura de leitura aberta, uma região não traduzida de 5' ou 3', exon(s), íntron(s), regiões flanqueadas, etc.

[034] Uma “sequência estrela” é a sequência complementar dentro de um precursor miRNA que forma um duplex com o miRNA. A

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11/54 complementaridade da sequência estrela não precisa ser perfeita. As substituições de interrupção não-helicoidais (ou seja, emparelhamento de base

G:T, etc.) são encontradas às vezes, bem como as incompatibilidades 1-3.

[035] O termo “genoma” refere-se ao seguinte: (1) o complemento inteiro do material genético (sequências não codificadas e de genes) presente em cada célula de um organismo, ou vírus ou organelas; (2) um conjunto completo de cromossomos herdados uma unidade (haploide) de um pai.

[036] “Descendência” compreende uma geração subsequente de uma planta. Descendência irá herdar, e segregar de maneira estável, genes e transgenes de sua planta(s)-mãe.

[037] Unidades, prefixos e símbolos podem ser denotados na sua forma SI aceita. Salvo se indicado de outra maneira, os ácidos nucleicos são escritos da esquerda para a direita com orientação 5' a 3'; sequências de aminoácidos são escritos da esquerda para a direita com uma orientação de amino para carboxila, respectivamente. Alcances numéricos recitados dentro da especificação são inclusive dos números definindo o alcance e inclui cada inteiro dentro do alcance definido. Os aminoácidos podem ser chamados aqui tanto por símbolos de três letras conhecidos normalmente ou pelos símbolos de uma letra recomendados pela Comissão de Nomenclatura Bioquímica IUPAC-IUB. Os nucleotídeos, da mesma forma, podem ser chamados por seus códigos aceitos comumente de uma única letra. Salvo se provido de outra maneira, os termos de software, os termos elétricos e os de eletrônica como usados aqui são definidos no Novo Dicionário de Padronização IEEE de Termos Elétricos e de Eletrônica (5^â Edição, 1993). Os termos definidos abaixo são melhores definidos por completo, por referência à especificação como um todo.

[038] Os termos “construção recombinante”, “construção de

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12/54 expressão”, “construção quimérica”, “construção” e “construção de DNA recombinante” são usadas aqui de maneira intercambiável. Uma construção recombinante compreende uma combinação artificial de fragmentos de ácido nucleico, ou seja, sequências regulatórias e de codificação que não são encontradas juntas na natureza. Por exemplo, uma construção quimérica compreende sequências regulatórias e sequências de codificação que são derivadas de fontes diferentes, ou sequências regulatórias e sequências de codificação derivadas da mesma fonte, porém organizadas de uma maneira diferente do que a encontrada na natureza. Dita construção pode ser usada sozinha ou pode ser usada em conjunto com um vetor. Se o vetor é usado, então a escolha do vetor depende do método que será usado para transformar as células anfitriãs como é bem conhecido por técnicos no assunto. Por exemplo, um vetor de plasmídeo pode ser usado. O artesão habilidoso está bem consciente dos elementos genéticos que devem estar presentes no vetor, a fim de transformar, selecionar e propagar, de forma bem sucedida, as células anfitriãs compreendendo qualquer um dos fragmentos de ácido nucleico isolado da presente invenção. O artesão habilidoso irá reconhecer que diferentes eventos de transformação independentes irão resultar em níveis e padrões de expressão diferentes (Jones et al., EMBO J.4:2411-2418 (1985); De Almeida et al., Mol. Gen. Genetics 218:78-86 (1989)), e assim, que eventos múltiplos devem ser entelados para obter linhas que exibem o nível e padrão de expressão desejados. Dita entelamento pode ser alcançado pela análise do sul do DNA, análise do norte da expressão mRNA, análise por immunoblotting de expressão de proteína, ou análise fenotípica, entre outras.

[039] Esta construção pode compreender qualquer combinação de desoxirribonucleotídeos, ribonucleotídeos, e/ou nucleotídeos modificados. A construção pode ser transcritas para formar um RNA, e que o RNA pode ser capaz de formar um RNA de fio duplo, e/ou uma estrutura de gancho. Esta

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13/54 construção pode ser expressa na célula, ou isolada ou produzida sinteticamente. A construção pode ainda compreender um promotor, ou outras sequências que facilitam a manipulação ou expressão da construção.

[040] Como usados aqui, “supressão” ou “silenciamento” ou “inibição” são usadas de maneira intercambiável para denotar a regulação negativa de um produto de uma sequência alvo relativa ao seu nível de expressão normal em um organismo do tipo selvagem. A supressão inclui a expressão que é reduzida por cerca de 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 100%, em relação com o nível de expressão do tipo selvagem.

[041] Conforme usado aqui, “codificar” ou “codificando” refere-se uma sequência de DNA a qual pode ser processada para gerar um RNA e/ou um polipeptídio.

[042] Conforme usado aqui, “expressão” ou “expressando” refere-se à produção de um produto funcional, tal como, a geração de uma transcrição de RNA a partir de uma construção introduzida, uma sequência de DNA endógena, ou uma sequência de DNA heteróloga incorporada de maneira estável. O termo pode também referir-se a um polipeptídio produzido a partir de um mRNA gerado a partir de qualquer dos precursores de DNA. Assim, a expressão de um fragmento de ácido nucleico pode referir à transcrição do fragmento de ácido nucleico (ou seja, a transcrição que resulta em mRNA ou em outro RNA funcional) e/ou tradução de RNA em um precursor ou proteína madura (polipeptídio).

[043] Conforme usado aqui, “heteróloga” em relação a uma sequência significa uma sequência que origina a partir de espécies estrangeiras, ou, se a partir da mesma espécie, é substancialmente modificada a partir de sua forma nativa em composição e/ou lugar genômico por intervenção humana deliberada. Por exemplo, com relação a um ácido

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14/54 nucleico, ele pode ser um ácido nucleico que origina a partir de espécies estrangeiras, ou é projetado sinteticamente, ou, se a partir da mesma espécie, é modificado substancialmente a partir da sua forma nativa em composição e/ou lugar genômico por intervenção humana deliberada. Uma proteína heteróloga pode originar a partir de uma espécie estrangeira, ou, se a partir da mesma espécie, é modificada substancialmente a partir de sua forma original por intervenção humana deliberada.

[044] O termo “célula anfitriã” refere-se a uma célula que contém ou na qual é introduzida uma construção de ácido nucleico e sustenta a replicação e/ou a expressão da construção. As células anfitriãs podem ser células procarióticas, tal como E. coli, ou células eucarióticas, tais como células de fungi, de fermento, de inseto, de anfíbio, de nematoide, ou de mamíferos. Alternativamente, as células anfitriãs são células de plantas monocotiledôneas ou dicotiledôneas. Um exemplo de uma célula anfitriã monocotiledônea e uma célula anfitriã de milho.

[045] “Planta” inclui referência a plantas completas, órgãos de plantas, tecidos de plantas, sementes de plantas, e células de plantas e a descendência das mesmas. As células de plantas incluem, sem limitação, células de sementes, culturas por suspensão, embriões, regiões meristemáticas, tecidos de calos, folhas, raízes, brotos, gametófito, esporófitos, pólen e micrósporos.

[046] O termo “partes de plantas” inclui tecidos diferenciados e não diferenciados incluindo, mas não limitado aos seguintes: raízes, caules, brotos, folhas, pólen, sementes, tecido tumoroso e várias formas de células e de cultivo (por exemplo, células únicas, protoplastos, embriões, e tecidos de calos). O tecido de planta pode ser em planta ou em um órgão de planta, tecido ou cultura celular.

[047] O termo “órgão de planta” refere-se ao tecido de planta ou

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15/54 grupo de tecidos que constituem uma parte distinta morfológica e funcionalmente de uma planta.

[048] O termo “introduzir” significa prover um ácido nucleico (por exemplo, construção da expressão) ou a proteína em uma célula. Introduzida inclui referência à incorporação de um ácido nucleico em uma célula eucariótica ou procariótica, em que o ácido nucleico pode ser incorporado no genoma da célula, e inclui referência à provisão transiente de um ácido nucleico ou proteína para a célula. Introduzir inclui referência aos métodos de transformação estável ou transiente, bem como o cruzamento sexual. Assim, “introduzir” no contexto de inserir um fragmento de ácido nucleico (por exemplo, uma construção de DNA/construção de expressão recombinante) em uma célula, significa “transfecção” ou “transformação” ou “transdução” e inclui referência à incorporação de um fragmento de ácido nucleico em uma célula eucariótica ou procariótica, em que o fragmento do ácido nucleico pode ser incorporado no genoma da célula (por exemplo, cromossoma, DNA de plasmídeo, DNA de plastídio ou mitocondrial), convertido em replicon autônoma, ou expressada de forma transiente (por exemplo, mRNA transfectado).

[049] O termo “genoma” como é aplicado a uma célula de planta abrange não somente DNA de cromossoma encontrado dentro do núcleo, mas também DNA de organela encontrado dentro de componentes subcelulares (por exemplo, mitocondrial, plastídio) da célula.

[050] O termo “isolado” refere-se a materiais, tais como um ácido nucleico ou uma proteína, que é: (1) livre substancial ou essencialmente de componentes que geralmente acompanham ou interagem com o material tal como encontrado no seu ambiente de ocorrência natural ou (2) se o material está no seu ambiente natural, o material foi alterado por intervenção humana deliberada para uma composição e/ou colocada em um lugar na célula que não

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16/54 é o lugar nativo do material.

[051] Conforme usado aqui, “domínio” ou domínio funcional” refere-se à sequência(s) de ácido nucleico que são capazes de obter uma resposta biológica em plantas. A presente invenção refere-se à mRNAS compostos de pelo menos 21 sequências de nucleotídeos que agem tanto individualmente, como em relação com outras sequências de miRNA, desta forma, um domínio pode se referir a tanto miRNAs individuais ou a grupos de miRNAs. Também, as sequências de miRNAs associadas com suas sequências da coluna vertebral podem ser consideradas domínios úteis para processar o miRNA em sua forma ativa. Conforme usado aqui, “subdomínios” ou “subdomínios funcionais” referem-se a subsequências de domínios que são capazes de obter uma resposta biológica em plantas. Um miRNA pode ser considerado um subdomínio de uma sequência de coluna vertebral. As sequências ou domínios “contíguos” referem-se às sequências que são ligadas sequencialmente sem nucleotídeos adicionados que intervêm entre os domínios. Um exemplo de uma série de domínio contíguo é encontrada na SEQ ID No:7.957 que representa SEQ ID Nos: 1 a 2.652 como uma série contínua que pode ser pensada como sequências de miRNA 2652 ligadas juntas em uma concatenação sequencial.

[052] A interferência de RNA refere-se ao processo de silenciamento de gene pós-transcripcional de sequência específica em animais mediada por RNAs de interferência curta (siRNAs) (Fire et al., Natureza 391:806 1998). O processo correspondente em plantas é referido comumente como um silenciamento de gene pós-transcripcional (PTGS) ou silenciamento de RNA e é também referido como dominação em fungi. O processo de silenciamento de gene pós-transcripcional é considerado como um mecanismo de defesa celular de conservação evolucionária usada para prevenir a expressão de genes estrangeiros e é compartilhada comumente pela flora e fila

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17/54 diversificadas (Fire et al., Trends Genet. 15:358 1999). Dita proteção a partir da expressão de genes estrangeiros pode ser evoluída em resposta à produção de RNAs de duplo fio (dsRNAs) derivados a partir da infecção viral ou a partir da integração aleatória de elementos de transposon em um genoma anfitrião via uma respostas celular que destrói especificamente RNA de único fio homólogo de RNA genômico viral. A presença de dsRNA em células desencadeia a resposta do RNAi através de um mecanismo que precisa ainda ser caracterizado completamente.

[053] A presença de dsRNAs longos em células estimula a atividade de uma enzima de ribonuclease III chamada de “dicer”. O dicer é envolvido no processamento do dsRNA em partes pequenas de dsRNA conhecidas como RNAs de interferência curta (siRNAs) (Bernstein et al., Nature 409:363 2001) e/ou pré-miRNAs em miRNAs. Os RNAs de interferência curta derivada da atividade do dicer são tipicamente cerca de 21 a cerca de 23 nucleotídeos em comprimento e compreendem cerca de 19 duplexes de emparelhamento de base (Elbashir et al., Genes Dev. 15:188 2001). O dicer foi também implicado na excisão de 21- e 22- nucleotídeos de RNAs temporais pequenos (stRNAs) a partir do RNA precursor da estrutura conservada que são implicados no controle translacional (Hutvagner et al., 2001, Science 293:834). A resposta do RNAi também destaca um complexo de endonuclease, chamada comumente de um complexo de silenciamento de indução de RNA (RISC), que media a clivagem de RNA de único fio que tem sequência de complementaridade ao fio anti-sense do duplex de siRNA. A clivagem do RNA alvo ocorre no meio da região complementar para o fio anti-sense do duplex de siRNA (Elbashir et al., Genes Dev. 15:188 2001). Além disso, a interferência de RNA pode também envolver um RNA pequeno (por exemplo, microRNA ou miRNA) que media o silenciamento do gene, presumivelmente através de mecanismos celulares que regulam a estrutura de cromatina e desta forma,

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18/54 previne a transcrição das sequências de gene alvo (vide, por exemplo, Allshire, Science 297:1.818 a 1.819 2002); Volpe et al., Science 297:1.833 a 1.837 2002; Jenuwein, Science 297:2.215 a 2.218 2002; e Hall et al., Science 297:2.232 a 2.237 2002). Como tal, as moléculas de miRNA da presente invenção podem ser usadas para mediar o silenciamento do gene via a interação com transcrições de RNA ou alternativamente por interação com as sequências de gene particulares, em que dita interação resulta no silenciamento do gene tanto no nível transcripcional ou pós-transcripcional.

[054] O RNAi foi estudado em uma variedade de sistemas. Fire et al. (Nature 391:806 1998) foram os primeiros a observar RNAi em C. elegans. Wianny e Goetz (Nature Cell Biol. 2:70 1999) descreve o RNAi mediado por dsRNAs em embriões de camundongos. Hammond et al. (Nature 404:293 2000) descreve o RNAi em células transfectadas de Drosophila com dsRNA. Elbashir et al., (Nature 411:494 2001) descreve o RNAi induzido por introdução de duplexes de RNAs 21-nucleotídeo sintéticos em células de mamíferos em cultura incluindo células de rim embrionário humano e de HeLa.

[055] Os RNAs pequenos têm um papel importante no controle da expressão gênica. A regulação de muitos processos de desenvolvimento, incluindo o florescimento, é controlada pelos RNAs pequenos. É possível agora engenhar mudanças na expressão gênica de genes de plantas pelo uso de construções transgênicas que produzem RNAs pequenos na planta.

[056] Os RNAs pequenos parecem funcionar por emparelhamento de base para complementar as sequências alvo de DNA ou de RNA. Quando ligados ao RNA, os RNAs pequenos desencadeiam tanto a clivagem do RNA como a inibição translacional da sequência alvo. Quando ligados às sequências alvo de DNA, é considerado que os RNAs pequenos podem mediar a metilação do DNA da sequência alvo. A consequência destes eventos, independentemente do mecanismo específico, é que a expressão

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19/54 gênica é inibida.

[057] As microRNAs (miRNAs) são RNAs não codificados de cerca de 19 a cerca de 24 nucleotídeos (NT) em comprimento que foram identificados tanto em animais como em plantas (Lagos-Quintana et al., Science 294:853 a 858 2001, Lagos-Quintana et al., Curr. Biol. 12:735 a 739 2002; Lau et al., Science 294:858 a 862 2001; Lee e Ambros, Science 294:862 a 864 2001; Llave et al., Plant Cell 14:1.605 a 1.619 2002; Mourelatos et al., Genes Dev. 16:720 a 728 2002; Park et al., Curr. Biol. 12:1.484 a 1.495 2002; Reinhart et al., Genes Dev. 16:1.616 a 1.626 2002). Eles são processados a partir de transcrições precursores mais longos que variam de tamanho a partir de aproximadamente 70 a 200 nt, e estes transcrições precursores têm a habilidade de formar estruturas de gancho estáveis. Em animais, a enzima envolvida no processamento de precursores de miRNA é chamada de Dicer, uma proteína assemelhada à RNAse III (Grishok et al., Cell 106:23 a 34 2001; Hutvagner et al., Science 293:834 a 838 2001; Ketting et al., Genes. Dev. 15:2.654 a 2.659 2001). As plantas também têm uma enzima assemelhada à Dicer, DCL1 (chamada anteriormente como CARPEL FACTORY/SHORT INTEGUMENTS1/SUSPENSOR1), e evidências recentes indicam que ela, tal como a Dicer, está envolvida no processamento dos precursores de gancho para gerar miRNAs maduros (Park et al., Curr. Biol. 12:1.484 a 1495 2002; Reinhart et al., Genes Dev. 16:1.616 a 1.626 2002). Ademais, está se tornando mais claro a partir de trabalhos recentes que pelo menos os precursores de gancho de miRNA originam como transcrições poliadeniladas mais longas, e vários miRNAs diferentes e ganchos associados podem estar presentes em um único transcrições (Lagos-Quintana et al., Science 294:853 a 858 2001; Lee et al., EMBO J 21:4.663 a 4.670 2002). Um trabalho recente examinou a seleção do fio de miRNA a partir do produto de dsRNA que surgiu a partir do processamento do gancho pelo DICER (Schwartz et al., 2003, Cell 115:199 a

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208). Parece que a estabilidade (ou seja, conteúdo e/ou incompatibilidades de G:C vs. A:U) das duas extremidades do dsRNA processado afeta a seleção do fio, com a extremidade com baixa estabilidade sendo mais fácil de desenrolar por uma atividade em espiral [helicase]. O fio da extremidade 5' na extremidade com baixa estabilidade é incorporada ao complexo RISC, ao passo que o outro fio é degradado.

[058] Em animais, existe uma evidência direta indicando um papel para os miRNAs específicos no desenvolvimento. Os miRNAs lin-4 e let7 em C. elegans foram considerados como controlando o desenvolvimento temporal, baseado nos fenótipos gerados quando os genes que produzem os miRNAs lin-4 e let-7 são mutados (Lee et al., Cell 75:843 a 854 1993; Reinhart et al., Nature 403:901 a 906 2000). Além disso, os dois miRNAs exibem um padrão de expressão temporal consistente com os seus papéis na cronometragem de desenvolvimento. Outros miRNAs de animais exibem padrões de expressão regulados por desenvolvimento, tanto temporal como específico de tecido (Lagos-Quintana et al. Science 294:853 a 853 2001, Lagos-Quintana et al., Curr. Biol. 12:735 a 739 2002; Lau et al., Science 294:858 a 862 2001; Lee e Ambros, Science 294:862 a 864 2001), conduzindo para a hipótese de que miRNAs podem, em muitos casos, estar envolvidas na regulação de processos de desenvolvimento importantes. Da mesma forma, em plantas, os padrões de expressão diferenciais de muitos miRNAs sugerem um papel no desenvolvimento (llave et al., Plant Cell 14:1.605 a 1.619 2002; Park et al., Curr. Biol. 12:1.484 a 1.495 2002; Reinhart et al., Genes Dev. 16:1.616 a 1.626 2002). Porém, um papel de desenvolvimento para os miRNAs ainda não foi testado diretamente em plantas, porque até hoje, não existe nenhum relatório de um fenótipo de desenvolvimento associado com um miRNA de uma planta específica.

[059] Os microRNAs aparecem para regular os genes alvo pela

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21/54 união com sequências complementares localizadas nas transcrições produzidas por estes genes. No caso dos lin-4 e let-7, os locais alvo estão localizados nos 3'UTRs dos mRNAs alvo (Lee et al., Cell 75:843 a 854 1993; Wightman et al., Cell 75:855 a 862 1993; Reinhart et al., Nature 403:901 a 906 2000; Slack et al., Mol. Cell 5:659 a 669 2000), e existem várias incompatibilidades entre os miRNAs lin-4 e let-7 e seus lugares alvo. A união dos miRNA lin-4 ou let-7 parecem causar a regulagem negativa de níveis de estado constante da proteína codificada pelo mRNA alvo sem afetar as próprias transcrições (Olsen e Ambros, Dev. Biol. 216:671 a 680 1999). Por outro lado, uma evidência recente sugere que os miRNAs podem, em alguns casos, causar a clivagem de RNA específico das transcrições do alvo dentro do lugar alvo (Hutvagner e Zamore, Science 297:2.056 a 2.060 2002; Llave et al., Plant Cell 14:1.605 a 1.619 2002). Parece provável que os miRNAs podem entrar em pelo menos duas trajetórias de regulação de gene alvo; regulagem negativa de proteína e clivagem de RNA. Os microRNAs que entram na trajetória de clivagem do RNA incorporados em um complexo de silenciamento de RNA induzido (RISC) que é similar ou idêntico ao que foi visto para o RNAi.

[060] A presente invenção refere-se a um fragmento de ácido nucleico isolado compreendendo um miRNA precursor, dito miRNA precursor correspondendo substancialmente à sequência de desoxirribonucleotídeos definida na SEQ ID No: 13 (i) em que nucleotídeos 513 to 533 da SEQ ID No: 13 são substituídos por uma primeira subsequência de nucleotídeos variável que varia de tamanho de cerca de 19 a cerca de 30 nucleotídeos dependendo da sequência alvo cuja expressão deve ser reduzida e (ii) ainda, em que os nucleotídeos 384 a 407 da SEQ ID No: 13 são substituídos por uma segunda subsequência de nucleotídeos variável que varia de tamanho de cerca de 19 a cerca de 30 nucleotídeos, dita segunda subsequência de nucleotídeos variável sendo capaz de hibridizar com a primeira subsequência variável do miRNA

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22/54 precursor.

[061] Este fragmento de ácido nucleico isolado que compreende um miRNA precursor pode ser também chamado de “coluna vertebral do miRNA”. É bem conhecido por técnicos no assunto que é difícil diferenciar se uma transcrição é um pri-mRNA ou um pré-mRNA de comprimento total. Assim sendo, um miRNA precursor é definido funcionalmente como uma sequência de nucleotídeos que é capaz de produzir um miRNA.

[062] Outros fragmentos nucleicos isolados de interesse incluem o seguinte:

(a) transcrição a partir de um fragmento de ácido nucleico isolado compreendendo um miRNA precursor, dito miRNA precursor correspondendo substancialmente à sequência de desoxirribonucleotídeos definida na SEQ ID No: 14 (i) em que os nucleotídeos 275 a 295 da SEQ ID No: 14 são substituídos por uma primeira subsequência de nucleotídeos variável que varia de tamanho de cerca de 19 a cerca de 30 nucleotídeos dependendo da sequência alvo cuja expressão deve ser reduzida e (ii) ainda, em que os nucleotídeos 121 a 141 da SEQ ID No: 14 são substituídos por uma segunda subsequência de nucleotídeos variável que varia de tamanho de cerca de 19 a cerca de 30 nucleotídeos, dita segunda subsequência de nucleotídeos variável sendo capaz de hibridizar com a primeira subsequência variável do miRNA precursor;

(b) um fragmento de ácido nucleico isolado compreendendo um miRNA precursor, dito miRNA precursor correspondendo substancialmente à sequência de desoxirribonucleotídeos definida na SEQ ID No: 15 (i) em que os nucleotídeos 262 a 282 da SEQ ID No: 15 são substituídos por uma primeira subsequência variável de nucleotídeos que varia de tamanho de cerca de 19 a cerca de 30 nucleotídeos dependendo da sequência alvo, cuja expressão deve ser reduzida e (ii) ainda, em que os nucleotídeos 155 a 175 da SEQ ID No: 15

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23/54 são substituídos por uma segunda subsequência variável de nucleotídeos que varia de tamanho de cerca de 19 a cerca de 30 nucleotídeos, dita segunda subsequência variável de nucleotídeos sendo capaz de hibridizar com a primeira subsequência variável do miRNA precursor;

c) um fragmento de ácido nucleico isolado compreendendo um miRNA precursor, dito miRNA precursor que corresponde substancialmente à sequência de desoxirribonucleotídeos definida na SEQ ID No: 16 (i) em que os nucleotídeos 249 a 269 da SEQ ID No: 16 são substituídos por uma primeira subsequência variável de nucleotídeos que varia de tamanho de cerca de 19 a cerca de 30 nucleotídeos dependendo da sequência alvo, cuja expressão deve ser reduzida e (ii) ainda, em que os nucleotídeos 316 a 336 da SEQ ID No: 16 são substituídos por uma segunda subsequência variável de nucleotídeos que varia de tamanho de cerca de 19 a cerca de 30 nucleotídeos, dita segunda subsequência variável de nucleotídeos sendo capaz de hibridizar com a primeira subsequência variável do miRNA precursor;

d) um fragmento de ácido nucleico isolado compreendendo um miRNA precursor, dito miRNA precursor que corresponde substancialmente à sequência de desoxirribonucleotídeos definida na SEQ ID No: 17 (i) em que os nucleotídeos 196 a 216 da SEQ ID No: 17 são substituídos por uma primeira subsequência variável de nucleotídeos que varia de tamanho de cerca de 19 a cerca de 30 nucleotídeos dependendo da sequência alvo, cuja expressão deve ser reduzida e (ii) ainda, em que os nucleotídeos 262 a 282 da SEQ ID No: 17 são substituídos por uma segunda subsequência variável de nucleotídeos que varia de tamanho de cerca de 19 a cerca de 30 nucleotídeos, dita segunda subsequência variável de nucleotídeos sendo capaz de hibridizar com a primeira subsequência variável do miRNA precursor; e

e) um fragmento de ácido nucleico isolado compreendendo um miRNA precursor, dito miRNA precursor que corresponde substancialmente à

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24/54 sequência de desoxirribonucleotídeos definida na SEQ ID No: 18 (i) em que os nucleotídeos 127 a 147 da SEQ ID No: 18 são substituídos por uma primeira subsequência variável de nucleotídeos que varia de tamanho de cerca de 19 a cerca de 30 nucleotídeos dependendo da sequência alvo, cuja expressão deve ser reduzida e (ii) ainda, em que os nucleotídeos 53 a 73 da SEQ ID No: 18 são substituídos por uma segunda subsequência variável de nucleotídeos que varia de tamanho de cerca de 19 a cerca de 30 nucleotídeos, dita segunda subsequência variável de nucleotídeos sendo capaz de hibridizar com a primeira subsequência variável do miRNA precursor.

[063] Qualquer um desses fragmentos de ácido nucleico isolado pode ser usado para fazer uma construção recombinante compreendendo esses fragmentos de ácido nucleico isolados operacionalmente ligados a pelo menos uma sequência regulatória. Estas construções podem ser transformadas em células de plantas, para que a célula de planta transformada compreenda a construção recombinante no seu genoma. Preferencialmente, a célula da planta pode ser uma célula de planta dicotiledônea. Exemplos de células de plantas dicotiledôneas incluem, mas não estão limitadas a, soja, colza, girassol, linhaça, algodão, alfafa, cevada, feijão, ervilha, tabaco e Arabidopsis.

[064] A célula de planta dicotiledônea mais preferida é soja.

[065] Em outro aspecto, a presente invenção refere-se a um método para reduzir a expressão de um gene alvo em uma célula de planta, dito método compreendendo:

(a) transformar pelo menos uma célula de planta com uma construção de ácido nucleico compreendendo qualquer um dos fragmentos de ácido nucleico isolado descrito aqui; e (b) selecionar aquela(s) célula(s) de planta transformada(s) cujo nível de expressão da sequência alvo é reduzido quando comparado ao nível

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25/54 de expressão da sequência em uma célula de planta do tipo selvagem.

[066] As abordagens bioinformáticas têm sido usadas com sucesso para prever alvos para miRNAs de plantas (Llave et al., Plant Cell 14:1.605 a 1.619 2002; Park et al., Curr. Biol. 12:1.484 a 1.495 2002; Rhoades et al., Cell 110:513 a 520 2002), e assim, parece que os miRNAs de planta têm uma complementaridade geral superior com os seus alvos putativas do que os miRNAs de animais. A maioria destas de transcrições alvo previstas de componentes codificados dos miRNAs de plantas das famílias de fatores de transcrição implicou na padronização do desenvolvimento de planta ou na diferenciação celular.

[067] As categorias em geral de sequências de interesse incluem, por exemplo, aqueles genes envolvidos na regulação ou na informação, tais como, dedos de zinco, fatores de transcrição, genes homeóticos, ou ciclos de células e moduladores de morte celular, estes envolvidos na comunicação, tais como, quinases, e aqueles envolvidos na manutenção doméstica, tais como, proteínas de choque de calor.

[068] As sequências alvo podem incluir as regiões codificadas e as regiões não codificadas, tais como promotores, acentuadores, terminadores, íntrons e assemelhados.

[069] A sequência alvo pode ser uma sequência endógena, ou pode ser uma sequência heteróloga introduzida, ou um transgene. Por exemplo, os métodos podem ser usados para alterar a regulação ou a expressão de um transgene, ou para remover um transgene ou outra sequência introduzida, tais como um lugar introduzido de recombinação específica de lugar. A sequência alvo pode ser uma sequência a partir de um patógeno, por exemplo, a sequência alvo pode ser a partir de um patógeno de planta, tais como um vírus, um mofo ou fungo, um inseto ou um nematoide. Um miRNA pode ser expressado em uma planta, o qual, no momento da infecção

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26/54 ou da infestação, iria dirigir-se ao patógeno e conferir algum grau de resistência para a planta.

[070] Em plantas, outras categorias de sequências alvos incluem genes que afetam traços agronômicos, a resistência contra insetos, a resistência contra doenças, a resistência contra herbicidas, a esterilidade, características de grãos, e produtos comerciais. Os genes de interesse também incluem aqueles envolvidos no metabolismo do óleo, do amido, do carboidrato ou do nutriente, bem como aqueles que afetam, por exemplo, o tamanho do grão do cereal, a carga de sacarose, e afins. A qualidade do grão é refletida nos traços, tais como níveis e tipos de óleos, saturados e insaturados, qualidade e quantidade de aminoácidos essenciais, e níveis de celulose. Por exemplo, os genes da trajetória Biosintética de ácido fítico podem ser suprimidos para gerar um alto fenótipo fosforoso disponível. Veja, por exemplo, as enzimas biossintéticas de ácido fítico incluem polinucleotídeos de quinase-2 polifosfato inositol, revelado no documento WO 02/059324, polinucleotídeos de quinase-5/6 trifosfato-1,3,4 inositol, revelado no documento WO 03/027243, e sintase de fosfato-1 mioinositol e outros polinucleotídeos biossintéticos de ftato, revelados no documento WO 99/05298, todos os quais estão incorporados aqui por referência. Os genes na trajetória de lignificação podem ser suprimidos para acentuar a digestibilidade ou a disponibilidade de energia. Os genes que afetam o ciclo celular ou a morte celular podem ser suprimidos para afetar o crescimento ou a resposta ao estresse. Os genes que afetam o reparo do DNA e/ou a recombinação podem ser suprimidos para aumentar a variabilidade genética. Os genes que afetam o tempo de florescimento podem ser suprimidos, bem como os genes que afetam a fertilidade. Qualquer sequência alvo pode ser suprimida a fim de avaliar ou confirmar o seu papel em um traço particular ou fenótipo, ou para dissecar uma trajetória ou rede molecular, regulatória, bioquímica ou proteômica.

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27/54 [071] Um número de promotores pode ser usado. Estes promotores podem ser selecionados com base no resultado desejado. É reconhecido que as aplicações diferentes serão acentuadas pelo uso de promotores diferentes nas fitas de expressão de plantas para modular a cronometragem, a localização e/ou o nível de expressão do miRNA. Ditas fitas de expressão de plantas podem também conter, se desejado, uma região regulatória promotora (por exemplo, uma conferindo uma expressão seletiva/específica de tecido ou de célula, por indução, constitutiva, regulada pelo ambiente ou pelo desenvolvimento), um lugar de início de iniciação de transcrição, um lugar de união de ribossomos, um sinal de processamento de RNA, um lugar de terminação de transcrição e/ou um sinal de poliadenilação.

[072] Os promotores constitutivos, tecidos preferidos ou induzíveis podem ser empregados. Exemplos de promotores constitutivos incluem a região de iniciação de transcrição 35S de vírus de mosaico de couveflor (CaMV), o promotor 1' ou 2' a partir de T-DNA de Agrobacterium tumefaciens, o promotor de ubiquitina 1, o promotor Smas, o promotor de desidrogenase de álcool cinnamyl (Patente US 5.683.439), o promotor Nos, o promotor pEmu, o promotor do rubisco, o promotor GRP1-8 e outras regiões de iniciação de transcrição a partir de vários genes de plantas conhecidos por aqueles com habilidade. Se a expressão de baixo nível é desejada, o(s) promotor(es) fraco(s) pode(m) ser usado(s). Os promotores constitutivos fracos incluem, por exemplo, o promotor principal do promotor Rsyn7 (WO 99/43838 e Patente US 6.072.050), o promotor principal 35S CaMV, e os afins. Outros promotores constitutivos incluem, por exemplo, Patente US 5.608.149; US 5.608.144, US 5.604.121; US 5.569.597; US 5.466.785; US 5.399.680; US 5.268.463; e US 5.608.142. Veja, também, Patente US 6.177.611, incorporada aqui por referência.

[073] Os exemplos de promotores induzíveis são o promotor

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Adh1 que é induzível por hipóxia ou estresse de frio, o promotor Hsp70 que é induzível por estresse de calor, o promotor PPDK e o promotor de pepcarboxilase que são os dois induzíveis pela luz. Os promotores também úteis são os quimicamente induzíveis, tais como o promotor In2-2 que é induzido com proteção (Patente US 5.364.780), o promotor de ERE que é induzido com estrógeno, e o promotor Axig1 que é induzido com auxina e tapetum específico, mas também ativo em calos (PCT US01/22169).

[074] Os exemplos de promotores sob controle de desenvolvimento incluem promotores que iniciam a transcrição preferencialmente em determinados tecidos, tais como folhas, raízes, frutas, sementes ou flores. Um promotor exemplificativo é o promotor antera específico 5126 (Patentes US 5.689.049 e US 5.689.051). Os exemplos de promotores de sementes preferidas incluem, mas não estão limitados a, um promotor de zein gamma 27 kD e um promotor de graxa, Boronat, A. et al. (1986) Plant Sci. 47:95 a 102; Reina, M. et al. Nucl. Acids Res. 18(21) :6.426; E Loesgen, R. B. et al. (1986) Mol. Gen. Genet. 203:237 a 244. Os promotores que expressam no embrião, pericarpo, e endosperma estão revelados na Patente US 6.225.529 e publicação do PCT WO 00/12733. As revelações cada duma destas estão incorporadas aqui por referência à sua totalidade.

[075] Em algumas modalidades, será benéfico expressar o gene a partir de um promotor induzível, particularmente a partir de um promotor de induzível por patógeno. Ditos promotores incluem aquelas proteínas relacionados com patogênese (proteínas PR), que são induzidas seguindo a infecção por um patógeno; por exemplo, proteínas PR, proteínas SAR, beta1,3-glucanase, quitinase, etc.. Vide, por exemplo, Redolfi et al., (1983) Neth. J. Plant Pathol. 89:245 a 254; Uknes et al. (1992) Plant Cell 4:645 a 656; e Van loon (1985) Plant Mol. Virol. 4:111 a 116. Vide também WO 99/43819, incorporada aqui por referência.

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29/54 [076] De interesse, são os promotores que são expressos localmente em ou próximo ao lugar da infecção por patógeno. Vide, por exemplo, Marineau et al. (1987) Plant Nol. Biol. 9:335 a 342; Matton et al. (1989) Molecular Plant-Microbe Interactions 2:325 a 331; Somsisch et al. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:2.427 a 2.430; Somsisch et al. (1988) Mol. Gen. Genet. 2:93 a 98; e Yang (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:14.972 a 14.977. Vide também, Chen et al. (1996) Plant J. 10:955 a 966; Zhang et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:2.507 a 2.511; Warner et al. (1993) Plant J. 3:191 a 201; Siebertz et al. (1989) Plant Cell 1:961 a 968; Patente US 5.750.386 (induzível por nematoide); e as referências citadas aqui. De interesse em particular está o promotor induzível para o gene PRms de milho, cuja expressão é induzida pelo patógeno Fusarium moniliforme (vide, por exemplo, Cordero et al. (1992) Physiol. Mol. Plant Path. 41:189 a 200).

[077] Adicionalmente, na medida em que os patógenos encontram a entrada em plantas através de feridas ou danos por insetos, um promotor induzível de ferida pode ser usado nas construções dos polinucleotídeos. Ditos promotores induzíveis por ferida incluem o gene (Ryan (1990) inibidor (pin II) de proteinase de batata Ann. Ver. Phytopath. 28:245 a 449; Duan et al. (1996) Nature Biotech. 14:494 a 498), WUN 1 E WUN2, Patente US 5.428.148; win1 e win2 (Stanford et al. (1989) Mol. Gen. Genet. 215:200 a 208); systemin (McGurl et al. (1992) Science 225:1.570 a 1.573); WIP1 (Rohmeier et al. (1993) Plant Mol. Biol. 22:783 a 792; Eckelkamp et al. (1993) FEBS Lett. 323:73 a 76); gene MPI (Corderok et al. (1994) Plant J. 6(2):141 a 150); e assemelhados, aqui incorporados por referência.

[078] Os promotores regulados químicos podem ser usados para modular a expressão de um gene em uma planta através da aplicação de um regulador químico exógeno. Dependendo do objetivo, o promotor pode ser um promotor induzível químico, em que a aplicação do químico induz a expressão

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30/54 gênica, ou um promotor repressor químico, em que a aplicação do químico reprime a expressão gênica. Os promotores de indução químicos são conhecidos no estado da técnica e incluem, mas não estão limitados a, o promotor In2-2 de milho, que é ativado por protetores herbicidas de benzeno sulfonamida, promotor GST de milho, que é ativado por compostos eletrofílicos hidrofóbicos que são usados como herbicidas pré-emergentes, e o promotor de tabaco PR-1a, que é ativado por ácido salicílico. Outros promotores regulados químicos de interesse incluem os promotores de resposta por esteroides (vide, por exemplo, o promotor de indução por glucocorticoide em Schena et al. (1991) Proc. Natl. Acd. Sci. USA 88:10.421 a 10.425 e McNellis et al. (1998) Plant J. 14(2):2.447 a 257) e promotores induzíveis por tetraciclina e reprimidos por tetraciclina (vide, por exemplo, Gatz et al. (1991) Mol. Gen. Genet. 227:229 a 237, e Patentes US 5.814.618 e US 5.789.156, aqui incorporadas por referência.

[079] Os promotores de tecido preferidos podem ser utilizados para direcionar a expressão acentuada de uma sequência de interesse dentro de um tecido de planta particular. Os promotores de tecido preferidos incluem Yamamoto et al. (1997) Plant J. 12(2):255 a 265; Kawamata et al. (1997) Plant Cell Physiol. 38(7):792 a 803; Hansen et al. (1997) Mol. Gen Genet. 254(3):337 a 343; Russell et al. (1997) Transgenic Res. 6(2):157 a 168; Rinehart et al. (1996) Plant Physiol. 112(3):1.331 a 1.341; Van Camp et al. (1996) Plant Physiol. 112(2):525 a 535; Canevascini et al. (1996) Plant Physiol. 112(2):513 a 524; Yamamoto et al. (1994) Plant Cell Physiol. 35(5):773 a 778; Lam (1994) Results Probl. Cell. Differ. 20:181 a 196; Orozco et al. (1993) Plant Mol. Biol. 23(6):1.129 a 1.138; Matsuoka et al. (1993) Proc Natl.Acad. Sci. USA 90(20): 9.586 a 9.590; e Guevara a Garcia et al. (1993) Plant J. 4(3):495 a 505. Ditos promotores podem ser modificados, se necessário, por expressão fraca.

[080] Os promotores de folha preferidos são conhecidos no

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31/54 estado da técnica. Vide, por exemplo, Yamamoto et al. (1997) Plant J. 12(2):255 a 265; Kwon et al. (1994) Plant Physiol. 105:357 a 67; Yamamoto et al. (1994) Plant Cell Physiol. 35(5):773 a 778; Gotor et al. (1993) Plant J. 3:509 a 18; Orozco et al. (1993) Plant Mol. Biol. 23(6):1.129 a 1.138; e Matsuoka et al. (1993) Proc. Natl. Acd. Sci. USA 90(20):9.586 a 9.590. Além disso, os promotores de cab e rubisco podem ser também usados. Vide, por exemplo, Simpson et al. (1958) EMBO J 4:2.723 a 2.729 e Timko et al. (1988) Nature 318:57 a 58.

[081] Os promotores de raízes preferidas são conhecidos e podem ser selecionados a partir de muitos disponíveis a partir da literatura ou isolados de novo a partir das várias espécies compatíveis. Vide, por exemplo, Hire et al. (1992) Plant Mol. Biol 20(2):207 a 218 (gene sintetase glutamina de raiz específica de soja); Keller e Baumgartner (1991) Plant Cell 3(10):1.051 a 1.061 (elemento de controle específico de raiz no gene de GRP 1.8 do feijão francês); Sanger et al. (1990) Plant Mol. Biol. 14(3):433 a 443 (promotor de raiz específica da síntase de manopina (MAS) gene de Agrobacterium tumefaciens); e Miao ET al. (1991) Plant Cell 3(1):11-22 (sintetase de glutamina citosólica codificada de clone cDNA de comprimento inteiro(GS), que são expressados em raízes e nódulos de raiz de soja). Vide também Bogusz et al. (1990) Plant Cell 2(7):633 a 641; em que os dois promotores isolados de raiz específica a partir de genes da hemoglobinas a partir da não-leguminosa de fixação de nitrogênio Parasponia andersonii e não-leguminosa de fixação de não-nitrogênio relacionado Trema tomentosa são descritos. Os promotores destes genes foram ligados com um gene repórter β-glucuronidase e introduzido nas duas nãoleguminosas Nicotiana tabacum e na leguminosa Lotus comuculatus, e nos dois casos a atividade do promotor de raiz específico foi preservada. Leach e Aoyagi (1991) descrevem suas análises dos promotores dos genes altamente expressos de raiz de indução roID e roID de Agrobacterium rhizogenes (vide Plant Science

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32/54 (Limerick) 79(1):69 a 76). Eles concluíram que o acentuador e os determinantes de DNA de tecido preferido estão associados nestes promotores. Teeri et al. (1989) usou fusão de gene para lacZ para mostrar que a sintase ocopine codificada de gene T-DNA da Agrobacterium é especialmente ativa na epiderme da ponta da raiz e que o gene TR2' é específico de raiz na planta intacta e estimulado por lesão no tecido da folha, uma combinação especialmente desejada de características para uso com um gene de inseticida ou de larvicida (Vide EMBO J. 8(2):343 a 350). O gene TR1', fusionado com nptII (neomicina fosfotransferase II) mostrou características similares. Os promotores de raiz preferidos adicionais incluem o promotor de gene VfENOD-GRP3 (Kuster et al. (1995) Plant Mol. Biol. 29(4):759 a 772); e o promotor rolB (Capana et al. (1994) Plant Mol. Biol. 25(4):681 a 691. Vide também Patentes US 5.837.876; US 5.750.386; US 5.633.363; US 5.459.252; US 5.401.836; US 5.110.732; e US 5.023.179. O gene faseolina (Murai et al. (1983) Science 23:476 a 482 e Sengopta-Gopalen et al. (1988) PNAS 82:3.320 a 3.324.

[082] Os protocolos de transformação bem como os protocolos de para introduzir as sequências de nucleotídeos em plantas pode variar dependendo do tipo de planta ou de células de planta, ou seja, monocotiledônea ou dicotiledônea, direcionada para transformação. Os métodos adequados para introduzir a construção do DNA incluem microinjeção (Crossway et al. (1986) Biotechniques 4:320 a 334; e Patente US 6.300.543, cruzamento sexual, eletroporação (Riggs et al. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:5.602 a 5.606), transformação mediada por Agrobacterium (Townsend et al., Patente US 5.563.055; e Patente US 5.981.840), transferência direta de gene (Paszkowski et al. (1984) EMBO J. 3:2.717 a 2.722), e aceleração balística de partículas (vide, por exemplo, Sanford et al., Patente US 4.945.050; Tomes et al., Patente US 5.879.918; Tomes et al., Patente US 5.886.244; Bidney et al., Patente US 5.932.782; Tomes et al.

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33/54 (1995) “Direct DNA Transfer into Intact Plant Cells via Microprojectile Bombardment”, em Plant Cell, Tissue, and Organ Culture: Fundamental Methods, Ed. Gamborg e Phillips (Springer-Verlag, Berlin); e McCabe et al. (1988) Biotechnology 6:923 a 926). Também vide Weissenger et al., (1988) Ann. Rev. Genet. 22:421 a 477 ; Sanford et al. (1987) Particulate Science and Technology 5:27 a 37 (cebola); Christou et al. (1988) Plant Physiol. 87:671 a 674 (soja); Finer e McMullen (1991) In Vitro Cell Dev. Biol. 27P:175 a 182 (soja); Singh et al. (1988) Theor. Appl. Genet. 96:319 a 324 (soja); Datta et al. (1990) Biotechnology 8:736 a 740 (arroz); Klein et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:4.305 a 4.309 (milho); Klein et al. (1988) Biotechnology 6:559 a 563 (milho); Tomes, Patente US 5.240.855; Buising et al., Patentes US 5.322.783 e US 5.324.646; Klein et al. (1988) Plant Physiol. 91:440 a 444 (milho); Fromm et al. (1990) Biotechnology 8:833 a 839 (milho); Hooykaas-Van Slogteren et al. (1984) Nature (London) 311:763 a 764; Bowen et al., Patente US 5.736.369 (cereais); Bytebier et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:5.345 a 5.349(Liliaceae); De Wet et al. (1985) em The Experimental Manipulation of Ovule Tissues, Ed. Chapman et al. (Longman, New York), PP. 197 a 209 (pólen); Kaeppler et al. (1990) Plant Cell Reports 9:415 a 418 e Kaeppler et al. (1992) Theor. Appl. Genet. 84:560 a 566 (transformação mediada por whisker [vibrissas]); D'Hallium et al. (1992) Plant Cell 4:1.495 a 1.505 (eletroporação); Li et al. (1993) Plant Cell Reports 12:250 a 255 e Christou e Ford (1995) Annals of Botany 75:407 a 413 (arroz); Osjoda et al. (1996) Nature Biotechnlogy 14:745 a 750 (milho via Agrobacterium tumefaciens); e Patente US 5.736.369 (transformação meristem), todos os quais estão aqui incorporados aqui por referência.

[083] As construções de nucleotídeos podem ser introduzidas em plantas pelo contato de plantas com um vírus ou ácidos nucleicos de vírus. Geralmente, ditos métodos envolvem a incorporação de uma construção de

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34/54 nucleotídeo da presente invenção em um DNA viral ou molécula de RNA. Ademais, é reconhecido que os promotores úteis abrangem os promotores utilizados para transcrição por RNA polimerases virais. Os métodos para introduzir as construções de nucleotídeos em plantas e expressar uma proteína codificada neste, envolvendo moléculas de DNA viral ou de RNA, são conhecidos no estado da técnica. Vide, por exemplo, Patentes US 5.889.191, US 5.889.190, US 5.866.785, US 5.589.367 e US 5.316.931; incorporadas aqui por referência.

[084] Em algumas modalidades, a expressão transiente pode ser desejada. Em outros casos, as técnicas de transformação padrão de transientes podem ser usadas. Ditos métodos incluem, mas não estão limitados a, métodos de transformação virais, e micro-injeções de DNA ou de RNA, bem como outros métodos bem conhecidos no estado da técnica.

[085] As células das plantas que incorporaram de forma estável a sequência de nucleotídeos podem ser cultivadas em plantas de acordo com os meios convencionais. Vide, por exemplo, McCormick et al. (1986) Plant Cell Reports 5:81 a 84. Estas plantas podem então ser cultivadas, e tanto polinizadas com o mesmo esforço transformado como com esforços diferentes, e o híbrido resultante que tem uma expressão constitutiva da característica do fenótipo desejado conferida pela sequência de nucleotídeos de interesse e/ou dos marcadores genéticos contidos no lugar alvo ou na fita de transferência. Duas ou mais gerações podem ser cultivadas para garantir a expressão das características do fenótipo desejado seja mantida estável e herdada e então as sementes colhidas para garantir que a expressão das características do fenótipo desejado foi alcançada.

[086] As lipoxigenases são dioxigenases que catalisam, como uma primeira reação, a hidroperoxidação, pelo oxigênio molecular, de ácido linoleico (18:2) e quaisquer outros lipídios poliinsaturados que

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35/54 contém um cis, uma fração de cis-pentadieno 1-4. As lipoxigenases (também chamadas de LOX) são enzimas ubíquas associadas a membranas que catalisam o primeiro passo de uma trajetória de metabolismo de ácido graxo. Os produtos desta trajetória são encontrados como moléculas de sinais, envolvidas na regulação do crescimento e do desenvolvimento, em senescência, e na resposta à invasão por patógeno e estresse por lesão (Rosahl (1996) Z. Naturforsch. (C) 51:123 138). As lipoxigenases com especificidades diferentes, localização subcelular, e padrões de expressão de tecido específico foram identificados em várias plantas incluindo arroz, cevada, soja, tomate, pepino e batata.

[087] As sementes de soja contêm níveis altos de lipoxigenase. As três isozimas expressas por semente, as lipoxigenases designadas 1, 2 e 3 (também chamada de LOX1, LOX2, e LOX3) foram identificadas e bem caracterizadas de maneira enzimática. Os genes que codificam as três isozimas de sementes de soja foram clonados e sequenciados. No entanto nenhum papel fisiológico claro foi ainda atribuído às lipoxigenases de sementes de soja (Siedow (1991) Annu. Ver. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 42:145 a 188).

Exemplos

Exemplo 1 [088] As sequências que codificam partes dos precursores do microRNA de soja encontradas na miRBase (miRBase: sequências de microRNA, alvos e nomenclaturas de genes. Griffiths-Jones S. Grocock RJ, van Dongen S, Bateman A, Enright AJ. NAR, 2006, 34, Database Issue, D140-D144; O Registro de microRNA. Griffiths-Jones S. NAR, 2004, 32, Matéria de Base de dado, D109-D111; Dezulian T, Palatnik JF, Huson DH, Weigel D (2005) Conservação e divergência de famílias de microRNA em plantas) foram usadas como perguntas para a análise de BLAST da coleção da Pioneer

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Unisoy 3.0 de rótulos de sequências expressas. Os primers seguintes (adquiridos de MWG-BIOTECH Inc.) foram projetados para amplificar uma seleção de seis destas sequências (vide Tabela 1).

Tabela 1: Primers para Amplificação dos Precursores de MicroRNA

Genômico

Primer	Sequência de Primer	SEQ ID No	Direção
156cA	5’-ggtacctcgagtttcatcaaagaaaataacttctgaac-3’	1	Sense
156cS	5’-ggatccatggtagaatcntacactttggtagccctg-3’	2	Anti-sense
159A	5’-ggtacctcgagttctagctagctagggtttgggtag-3’	3	Sense
159S	5’-ggatccatggagatttgtttataaaaatccaacaatc-3’	4	Anti-sense
166bA	5’-ggtacctcgaggtgcagattgagagaaagatgaaag-3’	5	Anti-sense
166bS	5’-ggatccatgggggaactataaggcttcggaccagg-3’	6	Sense
168cA	5’-ggtacctcgaggtgctctttataaataacccctcg-3’	7	Sense
168cS	5’-ggatccatggaattactttgacatagtagtatgc-3’	8	Anti-sense
396bA	5’-ggtacctcgagcttatatataacaagccataaaatc-3’	9	Anti-sense
396bS	5’-ggatccatgggcgagaaactttgtatgggcatgg-3’	10	Sense
398bA	5’-ggtacctcgagtatatttccacaatgatgttattcttac-3’	11	Anti-sense
398bS	5’-ggatccatgggttttgctcattcaaatgttcttcctag-3’	12	Sense

[089] Todos os primers com um sufixo “A” (SEQ ID Nos: 1, 3, 5,

7, 9, 11) incluíram os nucleotídeos que codificaram um lugar de Kpn I (GGTACC) e de Xho I (CTCGAG). Todos os primers com um sufixo “S” (SEQ ID Nos: 2, 4, 6, 8, 10, 12) incluíram os nucleotídeos que codificaram um lugar de Bam HI (GGATCC) e de Nco I (CCATGG).

[090] As sementes de Glycine max vs. Jack foram cultivadas em uma estufa e os DNA genômicos foram feitos a partir de tecidos de folhas usando um Kit de Qiagen DNeasy Plant Maxi de acordo com as instruções do fabricante. Os produtos de DNA foram amplificados usando o DNA genômico como padrão e pares de primers acima com polimerase ExTaq (TaKaRa Bio Inc.). Os produtos resultantes foram clonados em pCR2.1 (Invitrogen) e sequenciada completamente. Os precursores de microRNA caracterizados estão resumidos na Tabela 2.

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Tabela 2: Sequências de Precursores de MicroRNA

Precursor de microRNA	seq ID No	Comprimento (nucs)
156c	13	847
159	14	958
166b	15	394
168c	16	1068
396b	17	574
398b	18	463

Exemplo 2

Projeto de Sequências de microRNA Artificiais [091] As microRNAs artificiais (amiRNAs) que teriam a habilidade de silenciar os genes alvo desejados foram projetadas amplamente de acordo com as regras descritas em Schwab R, et al. (2005) Dev Cell 8: 517 a 27. Para resumir, as sequências de microRNA são de 21 nucleotídeos de comprimento, inicia na sua extremidade 5' com um “U”, uma instabilidade de exibição de 5' relacionada com a sua sequência estrela que é alcançada pela inclusão de um C ou G na posição 19, e seu 10° nucleotídeo é tanto um “A” ou um “U”. Um requerimento adicional para um projeto de microRNA artificial foi que os amiRNAs têm um alto delta-G livre conforme calculado usando o algoritmo ZipFold (Markham, N. R. & Zuker, M. (2005) Nucleic Acids Res. 33:W577 a W581.) Opcionalmente, uma mudança de par de base foi adicionada dentro da parte 5' do amiRNA a fim de que a sequência diferida a partir da sequência alvo por um nucleotídeo. O amiRNA que foi usado para silenciar a lipoxigenase foi 5'-ucaucagucauccauggagac-3' (SEQ ID No: 19). O amiRNA que foi usado para silenciar fad2-1 foi 5'-ugagggaaaaggguugaggaa-3' (a sequência de DNA que corresponde a este amiRNA é representado por SEQ ID No:20). O amiRNA que foi usado para silenciar o fad2-2 foi ‘5-uccacauaaauacacucucuu-3' (a sequência de DNA que corresponde a este amiRNA é representada por SEQ ID No:21).

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Exemplo 3

Projeto de umas sequências de estrela artificiais [092] As “sequências estrela” são aquelas que os pares de base com as sequências de amiRNAs, no RNA precursor, formam as estruturas de caule imperfeitas. Para formar uma estrutura de caule perfeita, a sequência estrela seria o complemento inverso exato do amiRNA. A sequência de precursor do milho conforme descrito por Zhang et al. no Material suplementar da Tabela 1 foi dobrada usando mfold (M. Zuker (2003) Nucleic Acids Res. 31: 3406 a 15; e D.H. Mathews, J. et al. (1999) J. Mol. Biol. 288:911 a 940). A sequência de miRNA foi então substituída pela sequência de amiRNA e a sequência estrela endógena foi substituída pelo complemento inverso intacto do amiRNA. As mudanças da sequência estrela artificial foram introduzidas a fim de que a estrutura do caule fosse permanecer a mesma como na estrutura endógena. A sequência alterada foi então dobrada com mfold e as estruturas originais e alteradas foram comparadas de olho. Se necessário, alterações adicionais na sequência estrela artificial foram introduzidas para manter a estrutura original. As sequências de DNA que corresponde às sequências de estrela artificiais que foram usadas para silenciar os genes alvo desejados estão mostradas na Tabela 3.

Tabela 3: As Sequências Estrela de microRNA artificiais

Precursor de amiRNA	Sequência Estrela	SEQ ID No
156c-lox	5’caatccctgttcgactgtaca-3’	22
159-lox	5’-gtctccatggagaactgatgt-3’	23
166b-lox	5’-cactccatttatgactcttga-3’	24
168c-lox	5'-ctctccctggatg actgttga-3'	25
398b-lox	5’-gtcgccagtggatgactgatga-3’	26
159-fad2-1b	5’-ttcctcaacccaattccctct-3’	27
166b-fad2-1b	5’-cccctcaaggcttttcaatca-3’	28
396b-fad2-1b	5’-ttactcaacccttttccctca-3’	29
159-fad2-2	5’-aagagagtgtacctatgtggt-3’	30

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Exemplo 4

Conversão de Precursores de MicroRNA Genômico para Precursores de

MicroRNA Artificiais [093] Os genes de precursores de miRNA genômico podem ser convertidos para amiRNAs usando uma sobreposição PCR e os DNAs resultantes são sequenciados por completo. Estes DNAs são então clonados no curso descendente de um promotor adequado em um vetor capaz de se transformar em soja.

[094] Alternativamente, os amiRNAs podem ser sintetizados comercialmente, por exemplo, por Dispositivos de Codon (Cambridge, MA). O DNA sintetizado é então clonado no curso descendente de um promotor adequado em vetor capaz de se transformar em soja.

Exemplo 5

Conversão de Precursores de MicroRNA Genômico para Precursores de

MicroRNA Artificiais [095] Os genes precursores genômicos foram convertidos para precursores de amiRNA usando a sobreposição de PCR como descrito em um exemplo 4 e os DNAs resultantes foram sequenciados por completo. Os nove seguintes precursores de amiRNAs foram fabricados:

Tabela 4: Sequências de Precursores de MicroRNA Artificiais

Precursor de microRNA	SEQ ID No	Comprimento (nucs)	Construção de Expressão
156-lox	31	844	PHP34018
159-lox	32	958	PHP32803
166b-lox	33	358	PHP34019
168c-lox	34	1072	PHP31104
398b-lox	35	463	PHP34044
159-fad2-1b	36	958	PHP32511
166b-fad2-1b	37	358	PHP32421
396b-fad2-1b	38	604	PHP32510
159-fad2-2	39	958	Vide abaixo

[096] SEQ IDs NOS: 31-38 foram então clonados individualmente

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40/54 no curso descendente do promotor beta-conglicinina em plasmídeo PHP27253 (também chamado de plasmídeo KS332, descrito no Pedido de Patente US 60/939.872, a designação do depositante BB-1623 US PRV) para formar as construções de expressão PHP34018, PHP32803, PHP34019, PHP31104, PHP34044, PHP32511, PHP32421, e PHP32510, respectivamente. Um segundo precursor de amiRNA, 159-fad2-2 (SEQ ID No:39) foi clonado 3' (no curso descendente) de 396b-fad2-1b (SEQ ID 38; que foi clonado em PHP27253 para formar PHP32510) em PHP32510 para formar a construção PHP32843. De uma maneira similar, 159-fad2-2 foi clonado 3' (no curso descendente) de 159-fad-2-1b (SEQ ID 36; PHP32511) para formar a construção PHP32869.

Exemplo 6

Transformação da Soja

Condições da Cultura [097] As culturas de suspensão embriogênica de soja (cv. Jack) são mantidas num meio líquido com 35 mL SB196 (infra) em uma batedeira rotativa, 150 rpm, 26°C com lâmpadas brancas frias fluorescentes no fotoperíodo 16:8 hs dia/noite na intensidade de luz de 60-85 pE/m^2/s. As culturas são subcultivadas a cada 7 dias durante 2 semanas por inoculação aproximadamente 35 mL de tecido em um líquido fresco SB196 (o intervalo de subcultivo preferido é a cada 7 dias).

[098] As culturas de suspensão embriogênicas de soja são transformadas com plasmídeos de expressão de soja pelo método de bombardeio por pistola de partículas (Klein et al., Nature, 327:70 (1987) usando um instrumento DuPont Biolístico PDS1000/HE (retroadaptação por hélio) para todas as transformações.

Iniciação da Cultura de Suspensão Embriogênica de Soja:

[099] A cultura de soja é iniciada duas vezes a cada mês com 5 a

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Ί dias entre cada iniciação. As vagens com as sementes imaturas de plantas de soja disponíveis 45 a 55 dias após a plantação são retiradas, removidas de suas cascas e colocadas em uma caixa magenta esterilizada. As sementes de soja são esterilizadas por agitação delas por 15 minutos em uma solução de 5% de Cloro com 1 gota de sabão marfim (i.e., 95 mL de água destilada de autoclave mais 5 mL de cloro e 1 gota de sabão, bem misturados). Sementes são lavadas usando 2 garrafas de 1 litro de água destilada estéril e estas menos do que 4 mm são colocadas nas lâminas de microscópio individuais. A extremidade pequena da semente é cortada e os cotilédones prensados para fora da camada da semente. Os cotilédones são transferidos para placas contendo um meio SB1 (25 a 30 cotilédones por placa). As placas são embaladas com fita de fibra e armazenadas por 8 semanas. Após este período, os embriões secundários são cortados e colocados em um meio líquido SB196 por 7 dias.

Preparação de DNA por bombardeio:

[0100] Tanto um plasmídeo intacto como um fragmento de plasmídeo de DNA contendo os genes desaturase delta-5 de interesse e os genes de marcadores selecionáveis são usados para o bombardeio. Os fragmentos a partir de plasmídeos de expressão de soja compreendem um desaturase delta-5 da presente invenção são obtidas por isolamento de gel de plasmídeos digestíveis. Os fragmentos de DNA resultantes são separados por eletroforese de gel em agarose GTG de SeaPlaque 1% (Aplicações Moleculares BioWhitaker) e os fragmentos de DNA contendo fitas de genes são cortados a partir do gel de agarose. O DNA é purificado a partir da agarose usando a enzima digestiva GELase seguindo o protocolo do fabricante.

[0101] Uma alíquota de 50 pL de água destilada estéril contendo 3 mg de partículas de ouro é adicionada a 5 pL de uma solução de DNA de 1 pg/pL (tanto plasmídeo intacto ou o fragmento de DNA preparado conforme descrito acima), 50 pL de CaCl2 e 20 pL de 0.1 M espermidina.

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42/54 [0102] A mistura é agitada durante 3 minutos no nível 3 de uma batedeira de vórtice e girada por 10 segundos em uma microcentrífuga de bancada. Após uma lavagem com 400 μΙ_ de etanol a 100%, o grânulo é suspenso por sonicação em 40 μ_ de etanol a 100%. A suspensão do DNA (5 μ_) é dispensada para cada disco voador do disco de instrumento Biolistic PDS1000/HE. Cada alíquota de 5 μ_ contém aproximadamente 0,375 mg partículas de ouro por bombardeio (ou seja, por disco).

Preparação do Tecido e Bombardeio com DNA:

[0103] Aproximadamente 150 a 200 mg de culturas de suspensão embrionárias com 7 dias de vida são colocadas em um disco petri de 60 X 15 mm estéril vazio, e o disco coberto com um aramado plástico. O tecido é bombardeado com 1 ou 2 disparos por placa com a pressão de ruptura de membrana definida a 1100 PSI e a câmara é evacuada para um vácuo de 27 a 28 polegadas de mercúrio. O tecido é colocado aproximadamente a 3,5 polegadas a partir da tela de retenção/interrupção.

Seleção dos Embriões Transformados:

[0104] Os embriões transformados são selecionados usando higromicina como o marcador selecionável. Especificamente, seguindo o bombardeio, o tecido é colocado em um meio fresco SB196, e cultivados conforme definido acima. Seis dias após o bombardeio, o SB196 é trocado com o SB196 fresco contendo 30 mg/_ de higromicina. O meio de seleção é refrescado semanalmente. De quatro a seis semanas após a seleção, tecido verde transformado é observado crescendo a partir de grupos embrionários necrosados não-transformados. O tecido verde isolado é removido e inoculado em placas de vários furos para gerar novas culturas de suspensão embrionárias transformadas propagadas por clonagem.

Maturação do Embrião:

[0105] Os embriões são cultivados por 4 a 6 semanas a 26°C em

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SB196 sob luz fria branca fluorescente (Econowatt F40/CW/RS/EW fria branca da Phillips) e lâmpadas Agro (Phillips F40 Agro) (40 watts) em um foto-período de 16:8 hs com intensidade de luz de 90 a 120 pE/m²s. Após este período, os grupos de embriões são removidos para um meio Agar sólido, SB166, por 1 a 2 semanas. Os grupos são então subcultivados no meio SB103 por 3 semanas. Durante este período, os embriões individuais são removidos dos grupos e protegidos para alterações nas suas composições de ácido graxo conforme descrito acima.

Receitas de meio:

SB196 - Meio de Proliferação de Líquido Leve FN (por litro)

MS FeEDTA - 100X Estoque 1 10 mL

MS Sulfato - 100x Estoque 2 10 mL

Haletos Leves FN - 100x Estoque 3 10mL

FN Leve P, B, Mo - 100x Estoque 4 10mL

Vitaminas B5 (1 mL/L) 1,0 mL

2,4-D (10 mg/L concentração final) 1,0 mL KNO3 2,83 gm (NH4)2SO4 0,463 gm

Asparagina 1,0 gm

Sacarose (1%) 10 gm pH 5,8

SOLUÇÕES DE ESTOQUE LEVE FN

Número de Estoque 1000 mL 500 mL

MS Fe EDTA 100x Estoque

Na2 EDTA* 3,724 g 1,862 g

FeSO4 - 7H2O 2,784 g 1,392 g *Adicione primeiro, dissolva em garrafa escura enquanto misturar

Sulfato MS 100x Estoque

MgSO4 - 7H2O 37,0 g 18,5 g

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MnSO4 - H2O	1,69 g	0,845 g
ZnSO4 - 7H2O	0.86 g	0,43 g
CuSO4-5H2O	0,0025 g	0,00125 g
Haletos Leves FN 100x Estoque
CaCl2 - 2H2O	30,0 g	15,0 g
Kl	0,083 g	0,0715 g
CoCl2 - 6H2O	0,0025 g	0,00125 g

FN Leve P, B, Mo 100x Estoque

KH2PO4	18,5 g	9,25 g
H3BO3	0,62 g	0,31 g
Na2MoO4 - 2H2O	0,025 g	0,0125 g
Meio Sólido SB1 (por litro)

pacote de sais MS (Gibco/ BRL - Cat. No. 11117-066) mL vitaminas B5 1000x estoque

31,5 g sacarose mL 2,4-D (20 mg/L concentração final) pH 5,7 g TC Agar

Meio Sólido SB 166 (por litro) pacote de sais MS (Gibco/ BRL - Cat. No. 11117-066) mL vitaminas B5 1000x estoque g maltose

750 mg MgCl2 hexahidrato g carvão ativado pH 5,7 g gelrite

Meio Sólido SB 103 (por litro) pacote de sais MS (Gibco/ BRL - Cat. No. 11117-066)

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45/54 mL vitaminas B5 1000x estoque 60g maltose

750 mg MgCl2 hexahidrato pH 5,7 2g gelrite

Meio Sólido SB 71-4 (por litro) garrafa de sais B5 de Gamborg com sacarose (Gibco/ BRL Cat. No. 21153-036) pH 5,7 5 g TC Agar

Estoque 2,4-D

Obtenha pré-manufaturado de Phytotech Cat. No. D 295 concentração 1 mg/mL

Estoque de Vitaminas B5 (por 100 mL)

Armazene alíquotas a -20°C 10 g mio-inositol 100 mg ácido nicotínico 100 mg piridoxina HCI 1 g tiamina

Se a solução não dissolver rápido o suficiente, aplique um nível baixo de calor via uma placa de mistura quente.

Análise Funcional em Embriões de Soja Somáticos [0106] Os embriões de soja somáticos maduros são um bom modelo para embriões zigóticos. Enquanto estiver no estado de embrião globular em cultura líquida, os embriões de soja somáticos contêm quantidades muito baixas de triacilglicerol (TAG) ou depósito de proteínas típicos de embriões de soja zigóticos, amadurecendo. Neste estágio de desenvolvimento, a proporção do total de triacilglicerídeo por total de lipídio polar (fosfolipídios e

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46/54 glicolipídios) é de cerca de 1:4, como é típico de embriões de soja zigóticos no estágio de desenvolvimento, cujo cultivo do embrião somático foi iniciado. No estágio globular igualmente, os mRNAs para as proteínas de sementes proeminentes, α’-subunidade de β-conglicinina, inibidor de tripsina kunitz 3, e lecitina de semente são essencialmente ausentes. No momento da transferência para o meio sem hormônio para permitir a diferenciação para o estado do embrião somático amadurecendo, o TAG se torna a classe de lipídio mais abundante. Igualmente, os mRNAs para a α’-subunidade de βconglicinina, inibidor de tripsina kunitz 3, e a lecitina de semente se torna mensagens muito abundantes no total da população de mRNA. Nesta base, o sistema de embrião de soja somático se comporta muito similarmente aos embriões in vivo de soja zigóticos amadurecendo, e é, então, um sistema de modelo bom e rápido para analisar os efeitos fenotípicos para modificar a expressão gênica na trajetória da biossíntese de ácidos graxos (vide Publicação do PCT No. WO 2002/00904). O sistema modelo é também previsível da composição de ácido graxo de sementes de plantas derivadas a partir dos embriões transgênicos.

Exemplo 7

Ensaio de Fenótipos de Lipoxigenase e Resultados [0107] As transformações de Glycine max cv. Jack foram executadas com cinco construções contendo as sequências de microRNA artificiais direcionadas contra as sequências de lipoxigenase sob o controle de um promotor específico de semente. O amiRNA seria aguardado para silenciar todas as três lipoxigenases específicas de sementes na medida em que ele tem uma diferença de BP a partir das sequências de lipoxigenase 1 e de lipoxigenase 3 e duas mudanças BP a partir da sequência de lipoxigenase 2. Após a transformação dos embriões somáticos de soja foram coletados para uso no ensaio da lipoxigenase.

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Preparação do Extrato de Embrião Somático de Soja [0108] Os embriões de soja somáticos foram individualmente triturados em 500 μL de 2 mM de sódio taurodeoxiquolate em uma placa de microtitulação (placas de microtitulação com poço de 96 profundidade com um volume de trabalho de 1,2 a 2 mL por poço) usando uma bola de trituração de aço de 4 mm ou de 5/32” por embrião. Os embriões foram triturados com dois ciclos de 30 a 45 segundos a 1500 golpes/min usando um Geno/Triturador™ (SPEX CertiPrep, Metuchen, NJ). As placas de microtitulação foram então centrifugadas usando uma Centrífuga Eppendorf 5804R com rotor A-2-MTP a 4000 rpm por 5 minutos para remover os resíduos celulares.

Preparação do Extrato de Semente de Volume de Soja [0109]O ensaio da enzima LOX1 foi também para ensaiar a soja cv sementes Jack como um controle positivo para atividade de lipoxigenase e sementes carregando uma mutação nula de lox triplo como um controle negativo para a atividade de lipoxigenase. O ensaio com sementes múltiplas foi executado conforme se segue. As sementes foram colocadas em um Triturador/Geno™ com uma bola de aço inoxidável de 9/16 polegadas sendo colocado sobre as sementes. As sementes foram trituradas usando o Triturador/Geno™ a 1600 rpm por 30 segundos; triturações adicionais de 30 segundos das sementes foram feitas até que as sementes foram pulverizadas para um pó homogêneo. Uma pequena quantidade (aproximadamente 10 a 15 mg) de pó de soja pulverizado foi transferida para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL e o pó de soja foi suspenso, por vórtice, em 800 μL de DDI filtrado estéril H2OL. Os frascos contendo as amostras foram então invertidos e permitidos ficarem na bancada em temperatura ambiente por aproximadamente 2 a 3 minutos. Os resíduos foram compactados por centrifugação usando uma microcentrífuga na velocidade máxima.

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Ensaio para Soja LOX1 [0110] A atividade de lipoxigenase foi determinada usando um ensaio espectrofotométrico em que um linoleato de sódio é hidroperoxidado aumentando a absorvência de 234 nm da amostra. Quando medindo a atividade LOX1 em sojas (Glycine Max cv. Jack) a absorvência a 234 nm aumenta em 1 a 3 minutos para cerca de 0,5 ou 0,6 OD234nm min-1.

[0111] O substrato de linoleato de sódio foi preparado a partir de ácido linoleico conforme se segue. Setenta MG de ácido linoleico e 70 mg de Tween 20 foram pesados em um tubo de 50 mL e homogeneizado em 4 mL de H2O (ddi) deionizada duplamente filtrada estéril. Cerca de 0,55 mL de 0,5 N NaOH foi adicionado a fim de obter uma solução simples. A H2O (ddi) deionizada duplamente filtrada estéril foi adicionada para trazer a solução até 25 mL do volume total. A solução foi dividida em alíquotas de 2 mL que foram armazenadas a -20°C sob gás argônio. A concentração de estoque final de linoleato de sódio foi de 10 mM.

[0112] Para medir a atividade de lipoxigenase em embriões somáticos de soja ou em sementes de soja 100 pL de 0,2 mM de linoleato de sódio (18:2) em 0,1 M de borato de sódio, pH 9,0 foi adicionado primeiro para uma placa de microtitulação de grau UV padrão de poço-96 adequado para um leitor de placa de microtitulação, então 10 pL de extrato de soja foi adicionado em cada poço e o aumento da absorvência a 234 nm foi monitorada por 5 minutos em um intervalo de 9 segundos usando um leitor de placa de microtitulação SpectraMax 190 (Molecular Devices Corp., Sunnyvale, CA).

[0113] O ensaio descrito neste Exemplo foi específico para a detecção de LOX1. Nenhuma atividade de lipoxigenase foi observada quando este ensaio foi desempenhado em sementes de um mutante de soja com mutações em todos os três genes de lipoxigenase expressos enquanto um alto nível de atividade foi encontrado em cv. sementes Jack.

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Tabela 5: Eficácia de Silenciamento de amiRNAs

Construção #	amiRNA	% silenciamento
PHP34018	156c-lox	0
PHP32803	159-lox	82
PHP34019	166b-lox	0
PHP31104	168c-lox	76
PHP37825	396b-lox	83
PHP34044	398b-lox	0

[0114] Estes resultados mostram que os precursores de amiRNA são capazes de produzir amiRNAs que são efetivas no silenciamento dos genes.

Exemplo 8

Ensaio de Fenótipos de ácido Graxo e Resultados [0115] As transformações de Glycine Max cv. Jack foram executadas com três construções contendo sequências de microRNA artificiais direcionadas contra desaturase de ácidos graxos 2-1 sob o controle de um promotor específico de semente. As transformações adicionais de Glycine Max cv. Jack foram executadas com duas construções contendo duas sequências de microRNA artificiais; uma direcionada contra desaturase de ácidos graxos 21 e uma direcionada contra desaturase de ácidos graxos 2-2, as duas sob o controle do mesmo promotor específico de semente. O silenciamento da desaturase de ácidos graxos 2-1 seria esperado que conduzisse a níveis elevados de embriões somáticos de ácido oleico e de sementes como comparado com as sementes não-transformadas e aos embriões somáticos. O silenciamento de desaturase de ácidos graxos 2-1 e de desaturase de ácidos graxos 2-2 seria esperado que conduzisse a níveis elevados de ácido oleico em embriões somáticos e sementes como comparado com embriões e sementes somáticos não-transformados. Após a transformação dos embriões somáticos de soja, foram coletados para uso no ensaio de lipoxigenase.

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50/54 [0116] A análise GC de FAME foi empregada para investigar se a expressão do amiRNA altera o perfil do ácido graxo dos embriões somáticos de soja. Aproximadamente 5 embriões somáticos foram analisados por evento e 25 a 50 eventos foram analisados por construção. Cada embrião somático foi colocado em um frasco GC. Para transesterificação, 50 μΙ_ de hidróxido de trimetil sulfônio (TMSH) foram adicionados ao frasco GC e foram incubados por 30 minutos em uma temperatura ambiente durante a agitação. Então, 0,4 m_ de heptano foram adicionados ao frasco GC e incubados por 30 minutos em temperatura ambiente durante a agitação. Os ésteres de metil de ácido graxo (5 μ_ injetado da camada de heptano) foram separados e quantificados usando um Cromatógrafo de Gás da Hewlett-Packard 6890 ajustado com um Omegawax 320 fundido com uma coluna capilar de sílica (Catálogo No. 24152, Supelco Inc.). A temperatura do forno foi programa para manter em 220°C por 2,6 minutos, aumentar para 240°C em 20^qC/minutos e então manter por um tempo adicional de 2,4 minutos. O gás condutor foi suprido por um gerador de hidrogênio Whatman. Os tempos de retenção foram comparados com aqueles para os ésteres de metil de padrões disponíveis comercialmente (Nu-Chek Prep, Inc.). Um evento foi considerado silenciado se três ou mais embriões somáticos mostraram níveis de ácido oleico superiores a 20%.

Tabela 6: Eficácia de Silenciamento de amiRNAs

Construção #	amiRNA % silenciamento
PHP32511	159-fad2-1b	26
PHP32421	166b-fad2-1b	0
PHP37826	168c-fad2-1b	0
PHP32510	396b-fad2-1b	30
PHP32843	396b-fad2-1b & 159-fad2-2	80
PHP32869	159-fad2-1b & 159-fad2-1b	80

[0117] Estes resultados mostram que alguns dos precursores de

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51/54 amiRNA são capazes de produzir amiRNAs que são efetivos no silenciamento de genes.

Exemplo 9

Geração e Análise de sementes com um fenótipo silenciado [0118] Os embriões que foram desidratados como descritos no Exemplo 6 foram germinados e plantas foram geradas. As sementes das plantas transgênicas foram colhidas e ensaiadas por atividade de lipoxigenase como no exemplo 7 ou o conteúdo de ácido graxo como o exemplo 8. Os fenótipos obtidos foram consistentes com os resultados obtidos nos embriões transgênicos (dados não mostrados). A proteína extraída das sementes de plantas transformadas com as construções de lipoxigenase foi examinada usando a análise de gel de poliacrilamida SDS. A lipoxigenase é uma proteína tão abundante que a banda pode ser identificada visualmente em géis manchados usando Jack (controle do tipo selvagem) e um mutante não produz lipoxigenase de sementes como comparadores. As sementes transgênicas não tiveram a produção de lipoxigenase visível de acordo com os resultados obtidos dos ensaios de lipoxigenase (dados não mostrados).

[0119] As sementes transgênicas foram plantadas também na estufa e as plantas foram permitidas para se autofecundar. As sementes serão coletadas e analisadas por atividade de lipoxigenase como no Exemplo 7 ou no conteúdo de ácido graxo como no Exemplo 8. Esta análise irá mostrar que o efeito destas construções é hereditário e estável.

Exemplo 10

Construções para silenciar fad2-1 e fatB [0120] Algumas vezes, é desejável silenciar mais do que um gene com uma dada construção. Os precursores de amiRNA individuais podem ser ligados operacionalmente ao mesmo ou a diferentes promotores. Alternativamente, dois ou mais precursores de amiRNA podem ser ligados

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52/54 operacionalmente entre eles e então ligados a um promotor. A partir da dita construção, dois ou mais amiRNAs seriam produzidos. Ditas construções para silenciar fad2-1 e fad2-2 estão descritas no Exemplo 4 e no Exemplo 8. Como um exemplo adicional, as construções foram feitas para silenciar tanto o fad2-1 como o fatB. O Fad2-1 é descrito acima. O fatB é um tioesterase codificando um tioesterase palmitoil (Kinney, A.J (1997) Genetic engineering of oilseeds for desired traits. Em: Genetic Engineering, Vol. 19, (Setlow J.K. Plenum Press, New York, NY, páginas 149 a 166). A regulação negativa de fatB iria resultar em níveis reduzidos de ácidos graxos saturados, principalmente uma redução em palmitato, em que a regulação negativa de fad2-1 resulta em níveis elevados de ácido oleico e uma redução em ácidos graxos poliinsaturados.

[0121] O amiRNA, sequência de estrela para fad2-1 descrita nos Exemplo 2 e 3, foi usada e convertida em precursores de amiRNA conforme descritos no Exemplo 4. Para fatB, o amiRNA foi projetado conforme descrito no Exemplo 2, o microRNA é 5'-ugcugcuuuuccccuuaccc -3’(a sequência de DNA correspondente a este amiRNA é representado por SEQ ID No:40). As sequências de estrela artificiais foram projetadas conforme descrito no Exemplo 3 e são mostradas na Tabela 7. Os precursores de amiRNA foram criados conforme explicado no Exemplo 4.

Tabela 7: Sequências De Estrela De MicroRNA Artificial

Precursor de amiRNA	Sequência de Estrela	SEQ ID No
159-fatB	gggtaagggggctaagcagcta	41
396b-fatB	gggcaagggggaaaagcagca	42

[0122] Estes precursores foram clonados no curso descendente de precursores de fad 2-1 (descritos no Exemplo 4) para criar as fitas descritas na Tabela 8. As fitas foram clonadas no curso descendente de um promotor específico de embrião como descrito previamente. A transformação de soja foi desempenhada conforme descrito no Exemplo 6 e os embriões foram

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53/54 ensaiados por fenótipo de ácido graxo conforme descrito no Exemplo 8.

Nenhum embrião mostrou o fenótipo esperado por silenciamento de fatB.

[0123] O exame de vários ESTs que codificam fatB sugere que muitos dos ESTs têm um sinal de poliadenilação no curso ascendente da sequência complementar da microRNA de fatB, assim, eles não seriam silenciados. Alternativamente, é conhecido que as três estruturas dimensionais do mRNA podem inibir a clivagem e então, o silenciamento do gene (Long et al. (2007) Potent Effect of target structure on microRNA function Nature Structural & Molecular Biology 14, 287 a 294. Publicado on-line: 1° de Abril de 2007) e é possível que as três estruturas dimensionais de fatB inibam a função do amiRNA projetado. Os amiRNAs adicionais foram construídos e estão sendo testados.

Tabela 8: As construções de miRNA artificiais contendo amiRNAs

PROJETADOS para SILENCIAR TANTO O FAD 2-1 COMO O FATB

Número PHP	fita
PHP33278	159-fad2-1/ 159-fatB
PHP33283	159-fad2-1/ 396b-fatB
PHP33284	396b-fad2-1/ 159-fatB
PHP33285	396B-FAD2-1/ 396B-fatB

EXEMPLO 11

Construção para silenciar fosfoglucomutase (PGM) [0124] Os exemplos acima mostram o silenciamento da soja fad21, fad2-2 e genes lipoxigenase, mas é conhecido por técnicos no assunto que amiRNAs podem ser construídos para silenciar muitos genes. Como um exemplo de outro gene que pode ser silenciado, um amiRNA direcionado para fosfoglucomutase (PGM, Patente US 7.323.560) foi projetado conforme descrito no Exemplo 2, e a sequência de DNA correspondente a estes amiRNAs é mostrado na Tabela 9. As sequências de estrela artificiais foram projetadas como descrito no Exemplo 3 e são mostrados na Tabela 10. Os precursores de amiRNA foram criados como explicado no Exemplo 4.

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Tabela 9: Sequências de microRNA Artificiais

Designação	microRNA artificial	SEQ ID No
A	ttccaaaactctcttccccgc	43
B	tcgcccatcacctcccaacac	44
C	tcccaaaaaatttccaaccag	45
D	taaacttaataccccaatcat	46

Tabela 10: Sequências de Estrela de microRNA artificiais

Precursor de amiRNA	Sequência de Estrela	SEQ ID No
159-PGMa	gcggggaagaggtttttggat	47
168c-PGMb	ctgttgtgaggtgatggccga	48
159-PGMc	ctggttggaaaccttttgggt	49
159-PGMd	atgattggggtcataagtttt	50

[0125] Os precursores de amiRNA foram clonados no curso descendente de um promotor específico de embrião como descrito previamente e construções foram transformadas em soja como descrito no Exemplo 6. As sojas transgênicas nas quais PGM foram silenciadas mostram um fenótipo de amido reduzido em embriões de estágio atrasado. O silenciamento foi determinado por um exame visual de embriões manchados com potássio iodado. Alternativamente, o amido foi também medido usando cromatografia a gás. Duas construções deram o silenciamento do gene enquanto os resultados estão pendentes para as duas construções remanescentes (Tabela 11).

Tabela 11: Construções de miRNA artificiais silenciam PGM

Construção	% de silenciamento
159-PGMa	22
168c-PGMb	33
159-PGMc	Não disponível
159-PGMd	Não disponível

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Claims (4)

1. Reivindicações

   1. SEQUÊNCIA DE ÁCIDO NUCLEICO DE PRECURSOR DE miRNA ARTIFICIAL, caracterizada por compreender a sequência de desoxirribonucleotídeos definida em SEQ ID NO: 17 (i) em que os nucleotídeos 196 a 216 da SEQ ID NO:17 são substituídos por uma primeira subsequência variável de nucleotídeos que varia de tamanho de 19 a 30 nucleotídeos dependendo da sequência alvo cuja expressão deve ser reduzida e (ii) ainda, em que os nucleotídeos 262 a 282 de SEQ ID NO:17 são substituídos por uma segunda subsequência variável de nucleotídeos que varia de tamanho de 19 a 30 nucleotídeos, dita segunda subsequência variável de nucleotídeos sendo capaz de hibridizar com a primeira subsequência variável do miRNA precursor, e em que o precursor de miRNA artificial resultante corresponde à sequência de desoxirribonucleotídeos definida na SEQ ID NO: 38.
2. 2. CONSTRUÇÃO RECOMBINANTE, caracterizada pelo fato de que compreende a sequência de ácido nucleico de precursor de miRNA artificial, conforme descrita na reivindicação 1, ligada operacionalmente a pelo menos uma sequência regulatória.
3. 3. MÉTODO PARA REDUZIR A EXPRESSÃO DE UMA SEQUÊNCIA ALVO, em uma célula de planta, caracterizado pelo fato de que o dito método compreende:

   (a) transformar pelo menos uma célula de planta com uma construção de ácido nucleico compreendendo a sequência de ácido nucleico de precursor de miRNA artificial correspondendo à sequência de desoxirribonucleotídeos definida na SEQ ID NO: 17 (i) em que os nucleotídeos 196 a 216 da SEQ ID NO:17 são substituídos por uma primeira subsequência variável de nucleotídeos que varia de tamanho de 19 a 30 nucleotídeos dependendo da sequência alvo cuja expressão deve ser reduzida e (ii) ainda, em que os nucleotídeos 262 a 282 de SEQ ID NO:17 são substituídos por uma

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   2/2 segunda subsequência variável de nucleotídeos que varia de tamanho de 19 a

   30 nucleotídeos, dita segunda subsequência variável de nucleotídeos sendo capaz de hibridizar com a primeira subsequência variável do miRNA precursor, e em que o precursor de miRNA artificial resultante corresponde à sequência de desoxirribonucleotídeos definida na SEQ ID NO: 38; e (b) selecionar aquela(s) célula(s) de planta transformada(s) cujo nível de expressão da sequência alvo é reduzido quando comparado ao nível de expressão da sequência alvo em uma célula de planta do tipo selvagem.
4. 4. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que a célula de planta é uma célula de planta monocotiledônea.

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