BRPI0808855A2 - Método para produção de bibliotecas de peptídeos e uso do mesmo - Google Patents

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MÉTODO PARA PRODUÇÃO DE BIBLIOTECAS DE PEPTÍDEOS E USO DO MESMO".

CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se a um campo da bioquímica com5 putacional e projeto assistido por computador de peptídeos bioativos. Ele combina métodos usados na análise de seqüência biológica, mineração de dados bioinformáticos, representação da informação e algoritmos de classificação usando aprendizado supervisionado. Além disso, ela se refere ao projeto de bibliotecas de peptídeos e ao uso de peptídeos bioativos para pes10 quisa biomédica.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Um objetivo principal da descoberta de fármacos atualmente é o de identificar moléculas biologicamente ativas que tenham utilidade clínica prática. Muitos, se não todos os peptídeos biologicamente ativos (p. ex. 15 hormônios peptídicos) têm efeitos profundos ambos na saúde e na doença, tanto devido a papéis de estimulação do crescimento, papéis inibidores do crescimento, ou da regulação de vias metabólicas críticas.

Hormônios peptídicos são produzidos como precursores em diferentes tipos de células e órgãos, tais como glândulas, neurônios, intestino, 20 cérebro, etc. Hormônios peptídicos são inicialmente sintetizados como precursores maiores, ou pró-hormônios, e podem adquirir uma série de modificações pós-translacionais durante o transporte através das pilhas de ER e pilhas de Golgi. Eles são processados e transportados ao seu destino final para agir como substâncias ativas (primeiros mensageiros) para acionar uma 25 resposta celular através da ligação a um receptor da superfície celular.

Hormônios peptídicos são mensageiros-chave em muitos processos fisiológicos incluindo a regulação da produção; crescimento; metabolismo de água e sal; controle da temperatura; controle cardiovascular, gastrointestinal, e respiratório; comportamento; memória; e estados afetivos.

Hormônios peptídicos desempenham um papel chave em pro

cessos fisiológicos que são relevantes a muitas áreas de pesquisa biomédica, tal como diabetes (Insulina), regulação da pressão sanguínea (angiotensina), anemia (eritropoietina-α), esclerose múltipla (lnterferon-β), obesidade (leptina) e outros.

Portanto, novos peptídeos bioativos têm o potencial de serem empregados como polipeptídeos terapêuticos, alvos para intervenção medicamentosa, Iigantes para descobrir alvos relevantes (por exemplo desorfanização de GPCR órfãos) ou biomarcadores para monitorar doenças.

Bibliotecas de peptídeos foram usadas com êxito para identificar peptídeos bioativos, incluindo peptídeos antimicrobiais, agonistas e antagonistas de receptor, Iigantes para receptores da superfície celular, inibidores 10 de proteína quinase e substratos, epitopos da célula T, peptídeos que se ligam a moléculas MHC e mimótopos de peptídeos dos locais de ligação do receptor. Bibliotecas de peptídeos podem ser categorizadas de acordo com sua origem em bibliotecas baseadas em genes e sintéticas (Falciani et al., 2005).

Em bibliotecas baseadas em genes, as posições combinatórias

dentro dos polipetídios são introduzidas no nível do DNA que codifica a seqüência do polipeptídeo alvo para introduzir diversidade. Em contraste com as bibliotecas baseadas em genes, bibliotecas sintéticas adquirem sua diversidade ao nível da síntese química.

Muitas bibliotecas de peptídeos são baseadas em uma estrutura

(scaffold) ou empregam uma abordagem combinatorial aleatória para gerar estruturas primárias de polipeptídeo diferentes.

A desvantagem de ambas as abordagens é que a combinação dos 20 aminoácidos que ocorrem naturalmente permite a construção de po25 lipeptídeos que são mais variáveis e contam para um grande número de estruturas diferentes. Para dar um exemplo de quão diferentemente podem ser obtidas estruturas, considere as 160 000 diferentes possibilidades de estrutura primária para um peptídeo contendo somente 4 aminoácidos.

Houve uma necessidade de fornecer um método acurado e de alta velocidade para reduzir significativamente o número potencial de estruturas em uma biblioteca de peptídeos, para permitir o processamento de grandes quantidades de dados e para distinguir entre peptídeos que possuem uma atividade in vivo e peptídeos que não possuem uma atividade in vivo.

O objetivo da presente invenção soluciona o problema da técnica anterior. A presente invenção refere-se a um método para construir novas bibliotecas de hormônios peptídicos bioativos, usando uma estratégia de 5 bioinformática. Um algoritmo para máquina de suporte vetorial (SVM) é usado para identificar os polipeptídeos bioativos. Este método permite a descoberta de hormônios peptídicos bioativos potenciais in silico procurando o proteoma humano, levando a vantagem das características da proteína conservada, e motivos breves presentes em precursores de hormônios peptídicos. 10 Enquanto essas características são comuns a hormônios peptídicos e são responsáveis por sua maturação, surpreendentemente há muito pouca similaridade de seqüência entre precursores do hormônio peptídico que permitiriam uma procura de base de dados a nível da própria seqüência de proteína (p. ex. BLAST, FASTA). Entretanto, combinações das características de pro15 teína coocorrente e motivos para modificações pós-translacionais em precursores de hormônio peptídico (p. ex. seqüência de proteínas curtas de precursor, peptídeo de sinai, iigações de dissulfeto, locais de amidação, locais de sulfatação, locais de glicosilação, etc) podem ser usados para descobrir novos hormônios peptídicos com uma alta especificidade.

RESUMO DA INVENÇÃO

Um assunto da presente invenção refere-se a um método de identificação de peptídeos bioativos usando um algoritmo baseado na máquina de suporte vetorial binário (SVM) em um sistema à base de computador, onde:

a) um algoritmo SVM é treinado para aprender a distinguir entre

peptídeos bioativos e não-bioativos, o referido treino compreendendo as etapas de:

a-ι) geração de vetores com 49 dimensões, cada dimensão resultando do cálculo de um valor de um descritor molecular para um conjunto de peptídeos rotulados de bioativos conhecidos e rotulados de não-bioativos conhecidos, onde os rótulos indicam se o peptídeo é, respectivamente, bioativo ou não-bioativo; a2) transferência dos dados do vetor gerados na etapa ai) ao algoritmo à base de SVM1 sendo que o referido algoritmo calcula o hiperplano ótimo que separa os vetores correspondentes aos peptídeos bioativos e os peptídeos não-bioativos, respectivamente;

b) seqüências de proteína são fornecidas a partir de uma base

de dado de uma proteína humana publicamente disponível;

c) estrutura secundária e locais de clivagem em uma seqüência de proteínas fornecida na etapa b) são previstas usando métodos computacionais; um conjunto de 7 descritores moleculares é calculado baseado na

referida etapa de previsão resultando na geração de fragmentos de peptídeo;

d) é calculado um conjunto de 42 descritores moleculares correspondendo às propriedades físico-químicas dos fragmentos de peptídeos gerados na etapa c);

e) os valores calculados da etapa c) são transformados em vaIores em escala entre 0 e 1 para gerar as dimensões de 1 até 7 de um vetor

de 49 dimensões para cada fragmento de peptídeo, e os valores calculados da etapa d) são transformados em valores em escaia entre 0 e 1 para gerar as dimensões de 8 até 49 do referido vetor para cada fragmento de peptídeo;

f) os vetores gerados na etapa e) são apresentados ao algoritmo SVM treinado da etapa a) para medir a distância de cada vetor para o

hiperplano calculado na etapa a2); e

g) cada fragmento de peptídeo é classificado como peptídeo bioativo ou peptídeo não-bioativo, de acordo com a distância medida na etapaf).

Em geral, as dimensões de 1 até 7 geradas na etapa e) são as

seguintes: dimensão 1: escore ProP N-terminal; dimensão 2: escore Hmcut N-terminal; dimensão 3 : fragmento N-terminal; dimensão 4: escore ProP Cterminal; dimensão 5: escore Hmcut C-terminal ; dimensão 6: escore Hamid C-terminal; dimensão 7: fragmento C-terminal; e dimensões 8 até 49 gera30 das na etapa e) são as seguintes: dimensão 8: porcentagem de aminoácidos ácidos (E, N, Q) por polipeptídeo; dimensão 9: porcentagem de aminoácidos positivamente carregados (R, H) por polipeptídeos; dimensão 10: porcentagem de aminoácidos aromáticos (F, Y, W) por polipeptídeos; dimensão 11: porcentagem de aminoácidos alifáticos (G, V, A, I) por polipeptídeos; dimensão 12: porcentagem de prolina por polipeptídeos; dimensão 13: Porcentagem de aminoácidos reativos (S, T) por polipeptídeos; dimensão 14: Porcen

5 tagem de alanina por polipeptídeos; dimensão 15: porcentagem de cisteína por polipeptídeos; dimensão 16: porcentagem de ácido glutâmico por polipeptídeos; dimensão 17: porcentagem de fenilalanina por polipeptídeos; dimensão 18: porcentagem de glicina por polipeptídeos; dimensão 19: porcentagem de histidina por polipeptídeos; dimensão 20: porcentagem de isoleu10 cina por polipeptídeos; dimensão 21: porcentagem de asparagina por polipeptídeos; dimensão 22: porcentagem de glutamina por polipeptídeos; dimensão 23: porcentagem de arginina por polipeptídeos; dimensão 24: porcentagem de serina por polipeptídeos; dimensão 25: porcentagem de treonina por polipeptídeos; dimensão 26: porcentagem de aminoácidos não canô15 nicos por polipeptídeos; dimensão 27: porcentagem de valina por polipeptídeos; dimensão 28: porcentagem de triptofano por polipeptídeos; dimensão 29: porcentagem de tirosina por polipeptídeos; dimensão 30: teor de cisteína; dimensão 31: porcentagem de estrutura secundária helicoidal por polipeptídeos; dimensão 32: porcentagem de estrutura secundária helicoidal por 20 polipeptídeos; dimensão 33: porcentagem de estrutura secundária aleatória por polipeptídeos; dimensão 34: escore para estrutura em torno do local de clivagem C-terminal; dimensão 35: escore para estrutura em torno do local de clivagem C-terminal; dimensão 36: número de blocos em espiras por polipeptídeos; dimensão 37: ponto isoelétrico de polipeptídeos; dimensão 38: 25 peso médio molecular de polipeptídeos; dimensão 39: soma de forças Vander-Waals de cada aminoácido dentro dos polipeptídeos; dimensão 40: soma de valores de hidrofobicidade de cada aminoácido dentro dos polipeptídeos; dimensão 41 - 48: valores médios calculados baseado no princípio do escore de componentes vetores de propriedades hidrófobas, estéricas e ele30 trônicas por polipeptídeos; dimensão 49: comprimento dos polipeptídeos.

Em uma modalidade preferida do método da presente invenção, seqüências de proteína da etapa b) são somente seqüências de proteína que ocorrem naturalmente encontradas no secretoma humano.

Em uma outra modalidade preferida, peptídeos bioativos são hormônios peptídicos bioativos derivados de hormônios precursores.

Outra modalidade preferida da presente invenção refere-se a um peptídeo bioativo selecionado do secretoma humano empregando o método da presente invenção.

Em um modo de execução preferido, o peptídeo bioativo é um hormônio peptídico bioativo. Em um modo de execução preferido, o hormônio peptídico bioativo deriva de uma proteína precursora.

Ainda em um outro modo de execução preferido, o peptídeo bio

ativo tem uma seqüência selecionada do grupo que consiste em seqüências de aminoácido de SEQ ID Nos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38. 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 15 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138. 139, 140, 141, 20 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185.

A invenção refere-se ainda a uma biblioteca de peptídeos identificada através do método da presente invenção.

Em uma modalidade preferida, a biblioteca peptídica compreen

de peptídeos bioativos contendo uma seqüência selecionada do grupo que consiste nas seqüências de aminoácido da SEQ ID Nos 1-185 citada acima.

Em uma modalidade mais preferida, a biblioteca de peptídeos bioativos compreende hormônios peptídicos bioativos.

Em outra modalidade mais preferida, a biblioteca de peptídeos

compreende hormônios bioativos derivados de proteínas precursoras.

Outro assunto alvo da presente invenção refere-se a um dispositivo computacional configurado para identificar peptídeos bioativos empregando um método baseado em uma máquina de suporte vetorial binário (SVM)1 onde:

a) um algoritmo SVM é treinado para aprender a distinguir entre peptídeos bioativos e não-bioativos, sendo que o referido treinamento

compreende as etapas de:

ai) geração de vetores com 49 dimensões, cada dimensão resultando do cálculo de um valor de descritor molecular, para um conjunto de peptídeos conhecidos rotulados de bioativos e peptídeos conhecidos rotula

dos de não-bioativos, onde os rótulos indicam se o peptídeo é, respectivamente, bioativo ou não-bioativo;

82) transferência dos dados do vetor gerados na etapa ai) para o algoritmo à base de SVM, sendo que o referido algoritmo calcula o hiperplano ótimo que separa os vetores que correspondem aos peptídeos bio

ativos e os peptídeos não-bioativos, respectivamente;

b) seqüências de proteína são fornecidas de uma base de dados de proteína humana publicamente disponível;

c) estruturas secundárias e locais de clivagem dentro de uma seqüência de proteínas fornecidas na etapa b) são previstas usando méto

dos computacionais; um conjunto de 7 descritores moleculares (descriptors) é calculado baseado na referida etapa de previsão na geração de fragmentos de peptídeos;

d) um conjunto de 42 descritores moleculares correspondendo às propriedades físicos-químicas dos fragmentos de peptídeo gerados na

etapa c) é calculado;

e) os valores calculados da etapa c) são transformados em valores em escala entre 0 e 1 para gerar as dimensões 1 até 7 de um vetor de dimensão 49 para cada fragmento de peptídeo, e os valores calculados da etapa d) são transformados em valores em escala entre 0 e 1 para gerar

as dimensões 8 até 49 do referido vetor para cada fragmento de peptídeo;

f) os vetores gerados na etapa e) são apresentados ao algoritmo SVM treinado da etapa a) para medir a distância de cada vetor ao hiperplano calculado na etapa 82); e

g) cada fragmento de peptídeo é classificado como peptídeo bioativo ou peptídeo não-bioativo de acordo com a distância medida na etapaf).

A invenção refere-se ainda ao uso do método da presente in

venção para a identificação de polipeptídeos terapêuticos, alvos para a intervenção medicamentosa, Iigantes para descobrir alvos relevantes ou biomarcadores para monitorar doenças.

A invenção refere-se ainda ao uso da biblioteca de peptídeos da 10 presente invenção em uma abordagem de monitoração para interrogar caminhos sinalizadores intracelulares; para criar reagentes para a maior compreensão de um caminho; para criar novas formas de terapias e para identificar compostos farmaceuticamente ativos, alvos para intervenção medicamentosa, Iigantes para descobrir alvos relevantes ou biomarcadores para 15 monitorar doenças.

A invenção também é dirigida a uma composição farmacêutica compreendendo um peptídeo bioativo contendo uma seqüência selecionada do grupo que consiste em seqüências de aminoácidos SEQ ID NOS 1-185 como agente bioativo.

DESCRIÇÃO DAS FIGURAS Figura 1:

uma visão geral do método descrito na invenção é dada na figura 1 para explicar as etapas envolvidas na geração da biblioteca de peptídeos.

Fiaura 2:

a figura 2 mostra as seqüências ácidas de aminoácidos dos 185 peptídeos bioativos selecionadas à base das propriedades físico-químicas compartilhadas.

Figura 3:

a figura 3 mostra os vetores de entrada dos 185 peptídeos iden

tificados como bioativos pelo algoritmo SVM treinado. Figura 4:

a figura 4 mostra os valores calculados IC50 para antibióticos

em Mg/ml.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO A presente invenção é dirigida a novos polipeptídeos bioativos e

a um método in silico para identificar tais polipeptídeos bioativos.

Na presente invenção, um polipeptídeo é considerado bioativo se ele tem uma interação com ou um efeito em qualquer tecido celular no corpo humano. Peptídeos bioativos têm o potencial de serem usados como 10 polipeptídeos terapêuticos, alvos para intervenção medicamentosa, Iigantes para descobrir alvos relevantes (por exemplo desorfanização GPCR) ou biomarcadores para monitorar doenças. Peptídeos bioativos são caracterizados por sua alta especificidade bem como por sua eficácia em concentrações muito baixas. Hormônios peptídeos são inicialmente sintetizados como 15 precursores maiores, ou pró-hormônios.

Um precursor é uma substância a partir da qual é formada uma outra substância usualmente mais ativa ou madura. Um precursor de proteína é uma proteína inativa (ou peptídeo) que pode ser transformada em uma forma ativa por modificação pós-translacional. Diversos locais de clivagem 20 estão envolvidos na modificação do precursor para produzir a proteína madura: locais de clivagem de seqüência de sinal, locais de clivagem de protease, locais de amidação, etc.

O nome do precursor de uma proteína tem normalmente o prefixo pro ou pré. Precursores são normalmente usados por um organismo quando a proteína subsequente é potencialmente prejudicial, mas necessita estar disponível em pouco tempo e/ou em grandes quantidades.

Os termos "polipeptídeo", "peptídeo" e "proteína" são empregados intercambiavelmente aqui para se referir a polímero consistindo em resíduos de aminoácidos ligados por ligações covalentes. Esses termos incluem 30 partes ou fragmentos de proteínas de comprimento total, tais como, por exemplo, peptídeos, oligopeptídeos e seqüências de peptídeos mais curtas consistindo em pelo menos 2 aminoácidos, mais particularmente seqüências de peptídeo consistindo em 4-45 aminoácidos.

Além disso, esses termos incluem polímeros de aminoácidos modificados, incluindo aminoácidos que foram modificados pós-translacionalmente, por exemplo por modificação química incluindo mas não restrito a 5 reações de amidação, glicosilação, fosforilação, acetilação e/ou sulfatação, que efetivamente alteram a estrutura principal peptídica básica. Concordantemente, um polipeptídeo pode ser derivado de uma proteína que ocorre naturalmente, e em particular pode ser derivado de uma proteína de comprimento total por clivagem química ou enzimática, usando reagentes tais como 10 CNBr, ou proteases tais como tripsina ou quimotripsina, entre outros. Alternativamente, tais polipeptídeos podem ser derivados por síntese química usando métodos sintéticos peptídicos bastante conhecidos.

Um aminoácido é qualquer molécula que contém ambos amina e grupos funcionais ácido carboxílico. Resíduo aminoácido é o que resta de 15 um aminoácido uma vez que uma molécula de água tenha sido perdida (um H+ do lado nitrogenoso e um OH- do lado carboxílico) na formação de uma ligação peptídica, a ligação química que liga os monômeros aminoácidos em uma cadeia de proteína.

Cada proteína tem sua própria seqüência única de aminoácido 20 que é conhecida como sua estrutura primária. A estrutura primária é razoavelmente reta e refere-se ao número e seqüência de aminoácidos na cadeia de proteína ou de polipeptídeos. A ligação peptídica covalente é o único tipo de ligação envolvido neste nível de estrutura de proteína. A seqüência de aminoácidos em uma proteína é ditada por informação genética no DNA, 25 que é transcrito em RNA, que é então traduzido em proteína. Assim a estrutura de proteína é geneticamente determinada.

O próximo nível de estrutura de proteína geralmente refere-se à quantidade de regularidade estrutural ou forma que a cadeia de polipeptídeos adota. Uma cadeia natural de polipeptídeos se dobrará espontanea30 mente em uma forma regular e definida. Dois tipos principais de estrutura secundária foram observados em proteínas, a saber, um hélice a, e uma lâmina pregueada b. A estrutura terciária de uma cadeia polipeptídica é o próximo nível de conformação ou forma adotada pelos hélices alfa ou lâminas pregueadas beta da cadeia. A maior parte das proteínas tende a dobrar em formas que são amplamente classificadas como globulares na disposição e, 5 em algumas, particularmente proteínas estruturais, formam fibras longas. Essas são as formas principais de estrutura terciária bruta. Um termo frequentemente usado é domínio, que se refere a uma unidade compacta de estrutura globular em uma cadeia polipeptídica.

A forma única de cada proteína determina sua função no corpo. Também incluídos no âmbito da definição de um "polipeptídeo"

são as variantes de seqüência de aminoácidos. Essas podem conter uma ou mais substituições de aminoácidos, de preferência conservadoras, deleções ou inserções, em uma seqüência de aminoácido que ocorre naturalmente que não altera pelo menos uma propriedade essencial dos referidos polipep15 tídeos, tais como, por exemplo, sua atividade biológica. Tais polipeptídeos podem ser sintetizados por síntese química de polipeptídeos. Substituições aminoácidas conservadoras são bastante conhecidas na técnica. Por exemplo, um ou mais resíduos aminoácidos de uma proteína nativa podem ser substituídos conservadoramente por um resíduo aminoácido de carga, ta20 manho ou polaridade similares, os polipeptídeos resultantes retendo a capacidade funcional conforme descrito aqui. As regras para executar tais substituições são bastante conhecidas.

Mais especificamente, substituições aminoácidas conservadoras são aquelas que geralmente ocorrem dentro de uma família de aminoácidos que estão correlacionados por suas cadeias laterais.

Aminoácidos geneticamente codificados são geralmente divididos em quatro grupos: (1) ácido = aspartato, glutamato; (2) básico = lisina, arginina, e histidina; (3) não-polar = alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, e triptofano; e (4) polar não carregado = glicina, 30 asparagina, glutamina, cisteína, serina, treonina, e tirosina. Fenilalanina, tirosina e triptofano também são conjuntamente classificados como aminoácidos aromáticos. Uma ou mais substituições dentro de qualquer grupo particular tal como, por exemplo, a substituição de Ieucina por isoleucina ou valina, ou alternativamente a substituição de aspartato por glutamato ou treonina por serina, ou de qualquer outro resíduo de aminoácido com um resíduo de aminoácido estruturalmente relacionado, geralmente terão um efeito insignificante na função dos polipeptídeos resultantes.

No âmbito da definição do termo "polipeptídeo" está incluído um peptídeo cuja atividade biológica é previsível como um resultado de sua seqüência de aminoácidos correspondente a um domínio funcional. O termo "polipeptídeo" também abrange um peptídeo cuja atividade biológica não poderia ser prevista pela análise de sua seqüência de aminoácidos.

Na presente invenção, um algoritmo de máquina de suporte vetorial (SVM) é usado para distinguir entre polipeptídeos que possuem uma atividade in vivo e polipeptídeos que não possuem uma atividade in vivo. Máquina de Suporte Vetorial (SVM):

Uma máquina de suporte vetorial (SVM) é uma máquina de a

prendizado universal que, durante uma fase de treino, determina uma superfície de decisão ou "hiperplano". O hiperplano de decisão é determinado por um conjunto de vetores de suporte selecionados de uma população de vetores e por um conjunto de multiplicadores correspondentes. O hiperplano de decisão também é caracterizado por uma função nuclear.

A base matemática de uma SVM é explicada no livro de John Shawe Taylor & Nello Cristianini - Cambridge University Press, 2000, entituIado “Support Vector Machines and other kernel-based Iearning methods“ e em um artigo por Chih-Chung Chang e Chih-Jen Lin entitulado “LIBSVM - A Library for Support Vector Machines”, 2001.

Subsequente à fase de treino, um SVM opera em uma fase de teste que é usada para classificar vetores de teste com base no hiperplano de decisão previamente determinado durante a fase de treinamento (Noble, 2006).

Máquinas de suporte vetorial encontram aplicação em muitos e

variados campos. Por exemplo, em um artigo de H. Kim e H. Park entitulado "Prediction of protein relative solvent accessibility with support vector machines and long-range interaction 3d local descriptor", SVMs são aplicados ao problema de previsão com estrutura 3D de alta resolução para estudar a interação das macromoléculas.

Na presente invenção, um algoritmo da máquina de suporte vetorial (SVM) é usado para distinguir entre polipeptídeos que possuem uma atividade in vivo e polipeptídeos que não possuem atividade in vivo.

De um ponto de vista prático, um SVM é implementado por meio de um dispositivo de computação, tal como um computador pessoal na presente invenção.

O dispositivo de computação inclui um ou mais processadores

que executam uma sucessão de diferentes softwares, tal como descrito na seção do exemplo (1.1.), contendo instruções para a implementação de um processo de acordo com a presente invenção.

Treinamento de SVM e geração de modelo:

Para treinar o modelo SVM, foram gerados vetores com 49 di

mensões usando a rotina de programa descrita na seção de experimentação (1.1.) e esquematicamente mostrada na figura 1.

Para o conjunto de treinamento de SVM pode ser extraída informação acerca de peptídeos bioativos conhecidos de qualquer base de da20 dos de proteína humana disponível, tal como Swissprot. Peptídeos bioativos preferidos com um comprimento entre 4 e 55 aminoácidos foram extraídos do seu precursor de acordo com a sua anotação em Swissprot e foram rotulados como exemplos positivos usados para treinar o algoritmo SVM. Todos os outros fragmentos gerados com um comprimento entre 4-55 aminoácidos 25 dos mesmos precursores de hormônio peptídicos conhecidos, que não têm nenhuma função designada,foram usadas como conjunto de treinos negativos para o treino para SVM. Já que SVM é um sistema binário, peptídeos bioactivos foram rotulados como +1 e peptídeos não-bioativos foram rotulados como -1.

Similarmente, peptídeos bioativos e não-bioativos com um com

primento entre 56 e 300 aminoácidos foram usados para treinar um segundo modelo para prever polipeptídeos mais longos. Para não super-representar exemplos negativos, os conjuntos de treinamento SVM finais para curtos (4- 55 aminoácidos) e longos (56-300 aminoácidos) respectivamente foram ajustados a um número igual de dados de treinamento positivos e negativos selecionando aleatoriamente os mesmos números de peptídeos negativos de todos os peptídeos negativos.

Para transformar a informação escondida nos peptídeos bioativos e não-bioativos, foi definido um conjunto de 49 descritores, que foi usado para treinar um SVM. O desempenho de um modelo SVM depende fortemente da qualidade dos descritores escolhidos usados para descrever os peptídeos.

Na presente invenção, os primeiros 7 descritores refletem a probabilidade de um polipeptídeo ser produzido pelo corpo humano. Essas 7 dimensões foram calculadas pelo emprego de um conjunto de ferramentas locais de previsão de protease para a seqüência de precursor de hormônio 15 peptídico (Fig1). Os escores resultantes de cada produção do programa foram diretamente usados como descritores. As 42 dimensões remanescentes refletem importantes propriedades físicos-químicas de cada fragmento gerado (isto é um peptídeo bioativo ou um peptídeo não-bioativo). Os 49 descritores usados na presente invenção são listados no ponto 3 da seção de e20 xemplificação.

A cada peptídeo corresponde uma combinação única de 49 descritores. Os diferentes peptídeos podem ser representados como pontos em um espaço multidimensional onde cada dimensão corresponde a um dos descritores. O SVM procura encontrar uma vizinhança que melhor separe os 25 dois conjuntos de pontos que correspondem aos peptídeos bioativos e nãobioativos. Esta vizinhança é denominada de hiperplano ótimo que melhor separa as duas classes de objetos em um espaço n-dimensional, a saber os vetores que correspondem aos peptídeos bioativos e aos peptídeos nãobioativos, respectivamente.

Os modelos SVM resultantes aprendem a distinguir entre peptí

deos bioativos e não-bioativos.

O melhor modelo escolhido é o que tem o mais elevado desempenho baseado na classificação de um conjunto um testes independentes de peptídeos bioativos e não-bioativos. Para testar os modelos, o desempenho de todos os modelos gerados foi testado e os dois melhores modelos para peptídeos curtos (4-55 aminoácidos) e polipeptídeos longos (56-300 amino5 ácidos) foram escolhidos, respectivamente.

Identificação de peptídeos bioativos:

Depois do treino, o modelo SVM treinado resultante é capaz de identificar peptídeos bioativos para os quais não foi caracterizada nenhuma bioatividade.

Uma visão geral esquemática do método descrito na invenção é

dada na figura 1 para explicar as etapas envolvidas na geração da biblioteca de peptídeos. Como valor de entrada, (input) é fornecida uma seqüência de proteínas fornecida a partir de uma base de dados da proteína humana publicamente disponível, tal como Swissprot. Na etapa 1, todos os locais de 15 clivagem de protease potenciais são previstos usando um conjunto de ferramentas para prever esses eventos. As respectivas posições de local de clivagem são registradas para cada seqüência de precursor. Além disso, a estrutura secundária é deduzida para toda a seqüência de precursor de proteína. Baseado nos locais de clivagem previstos dentro da seqüência pre20 cursora, todos os fragmentos potenciais são gerados (etapa 2) e são usados como entrada (input) para a etapa 3.

A etapa 3 compreende o cálculo das propriedades físicoquímicas de cada fragmento de peptídeo (listado no ponto 3 da seção de exemplificação). Em geral, a informação da frequência de aminoácido dentro 25 de cada fragmento, a estrutura secundária de cada fragmento, o ponto isoelétrico de cada fragmento, massa molecular média de cada fragmento, hidrofobicidade de cada fragmento, a soma de todas as forças de van-der-Waals para cada aminoácido do fragmento, a soma de todos os descritores de aminoácido normalmente usados (i. é. o valor VHSE para cada aminoácido 30 baseado em Mei et al., 2005) para cada aminoácido do fragmento e o comprimento do fragmento são levados em consideração para transformar a informação biológica em valores numéricos. Os valores calculados das etapas 1 e 3 são transformados nas etapas 4a e 4b, originando valores com escala entre 0 e 1, respectivamente, para gerar um vetor de 49 dimensões para cada fragmento. Na etapa 5 os vetores são apresentados ao modelo SVM treinado para medir a distância de cada vetor ao hiperplano. O resultado do 5 SVM (SVM output) é então usado na etapa 6 para decidir se o peptídeo parece ser bioativo ou não. Vetores de 49 dimensões correspondendo aos peptídeos bioativos identificados através do método da presente invenção são listados na figura 3.

Para reduzir significativamente o número potencial de estruturas 10 em uma biblioteca de peptídeos na presente invenção, seqüências de proteína que ocorrem naturalmente encontradas nos secretomas humanos foram usadas como estruturas primárias para gerar bibliotecas de peptídeos. O secretoma humano é toda a informação codificada no DNA que corresponde a todas as proteínas humanas que são secretadas pelas células.

Proteínas humanas potenciais secretadas que foram usadas

como seqüências precursoras para encontrar novos peptídeos bioativos foram extraídas dos bancos de dados das seqüências publicamente disponíveis listadas no ponto 1.1 da seção do exemplo.

Partes distintas das seqüências primárias das proteínas secretadas, isto é, precursores de proteína, foram usados como padrões para deduzir novos peptídeos bioativos. O comprimento do peptídeo foi restrito a 4-45 aminoácidos para produzir os peptídeos que podem ser levados à síntese química.

Subsequentemente à identificação dos novos peptídeos bioativos através do método da presente invenção, foram realizados testes antimicrobiais para testar a bioatividade dos peptídeos mencionados por último. Esses testes são detalhados no ponto 6 da seção de exemplificação.

A presente invenção refere-se ainda a uma biblioteca de peptídeos compreendendo peptídeos bioativos identificados através do método do modelo SVM descrito acima. As seqüências de aminoácidos dos 185 peptídeos bioativos identificados através do método da presente invenção, e compreendidos na biblioteca de peptídeos da presente invenção, estão listados na figura 2.

Uma biblioteca de peptídeos é uma técnica recentemente desenvolvida para um estudo relativo a proteínas. Uma biblioteca de peptídeos contem um grande número de peptídeos que possuem uma combinação 5 sistemática de aminoácidos. Usualmente, as bibliotecas de peptídeos são sintetizadas na fase sólida, na maior parte em resina, que pode ser preparada como superfície plana ou de contas. Uma biblioteca de peptídeos fornece uma ferramenta poderosa para o desenvolvimento de fármacos (drug design), interações de proteína-proteína, e outras aplicações bioquímicas bem

como aplicações farmacêuticas. A biblioteca de peptídeos da presente invenção pode ser usada em uma abordagem de varredura para interrogar caminhos de sinalização intracelulares, para criar reagentes, para levar adiante a compreensão de um caminho, para criar novas formas de terapias e para identificar compostos farmaceuticamente ativos, alvos para intervenção 15 medicamentosa, Iigantes para descobrir alvos relevantes, ou biomarcadores para monitorar doenças.

Os polipeptídeos da presente invenção têm atividade hormonal. Portanto, os polipeptídeos da invenção são úteis como fármacos, por exemplo para polipeptídeos terapêuticos, Iigantes para descobrir alvos relevantes 20 (p. ex. GPCRs), alvos para intervenção medicamentosa (p. ex. alvos para fragmentos receptores de anticorpos monoclonais), biomarcadores para monitorar doenças (em combinação com anticorpos como ferramenta (tool antibodies) para detectar fragmentos de peptídeos em fluidos corporais), inibidores de proteína quinase e substratos, epitopos de célula T, mimótopos de 25 peptídeo de locais de ligação de receptores, etc.

Os DNAs codificadores de peptídeos ou precursores da invenção são úteis, por exemplo, como agentes para a terapia genética, tratamento ou prevenção de doenças cardiovasculares, tumores produtores de hormônio, diabetes, úlcera gástrica e similares, inibidores de secreção de hor30 mônio, inibidores do crescimento de tumores, atividade neural etc. Além disso, os DNAs da invenção são úteis como agentes para a diagnose de gens de doenças tais como doença cardiovascular , tumores produtores de hormônio, diabetes, úlcera gástrica e similares.

EXEMPLIFICACÃO

A invenção que está sendo geralmente descrita agora será mais prontamente compreendida com referência aos seguintes exemplos, que estão incluídos meramente com o propósito de ilustração de certos aspectos e modos de execução da presente invenção, e não são pretendidos como Iimitantes da invenção.

1. Bancos de dados e programas de computador

1.1. Bancos de dados As seguintes seqüências de bancos de dados publicamente dis

poníveis foram usadas para extrair proteínas humanas potencialmente secretadas que foram usadas como seqüências precursoras para encontrar novos peptídeos bioativos:

Genoma humano (conjunto NCBI 33, 1 de Julho de 2003) traduzido em subconjunto de proteínas;

índice de Proteína International, Swissprot (divulgação 50.3 de

11 de Juho de 2006) e TrEMBL (divulgação: Agosto 2003 - Março 2006);

Para o treinamento de algoritmos à base de SVM, foi extraída informação de peptídios bioativos conhecidos da Swissprot.

1.2. Programas de computador

1.1 Siqnal P versão 2.0 (Nielsen et al.. 1997)

Objetivo: Este programa foi usado para detectar as seqüências de sinal potenciais e determinar o secretoma humano potencial. Ele foi empregado com um escore de corte de 0,98. O sinal P versão 2,0 prevê a pre25 sença e localização dos locais de clivagem do sinal de peptídeo em seqüências de aminoácido de diferentes organismos: O método incorpora uma previsão de locais de clivagem e uma previsão de não sinal / peptídeo baseada em uma combinação de diversas redes neurais artificiais e modelos escondidos de Markov.

1.2 ProP versão 1.0 (Duckert et al.. 2004)

Objetivo: Este programa foi usado para detectar locais de clivagem potenciais em seqüências de proteína. O escore de corte utilizado foi ajustado em 0,11. Este programa prevê locais de clivagem de propeptídeos arginina e Iisina em seqüências de proteínas eucarióticas usando um conjunto de redes neurais. A previsão específica de furina é o padrão. Também é possível executar uma convertase geral de proproteínas (PC).

1.3. A previsão do local de amidacão e a previsão de locais de clivagem de protease (Rohrer 2004)

Objetivo: O programa Hamid prevê os locais de amidação em seqüências de proteína. O programa Hmcut prevê locais de clivagem de protease em seqüências de proteína que ocorrem antes de um resíduo aminoá10 cido básico (Lys, Arg). Ambos os programas são baseados em modelos escondidos de Markov e utilizam o software versão Hmmer 2.3.2 (Durbin et al. 1998).

1.4 Máouina de Vetor de Suporte (Chang e Lin. 2001)

LIBSVM é um software integrado para classificação do vetor de suporte, (C-SVC, nu-SVC ), regressão (épsilon-SVR, nu-SVR) e estimação da distribuição (SVM de classe única).

As seguintes especificações de SVM foram usadas: tipo SVM: nu-SVC; tipo Kernel: função radial básica.

1.5. PsiPred versão 2.45 (Jones. 1999)

Método para previsão da estrutura secundária de proteínas. O

método empregado foi usado conforme descrito em Jones, 1999.

1.6. Cálculo dos pontos isoelétricos

Objetivo: Calculo dos pontos isoelétricos dos polipeptídeos. Isto foi feito de acordo com Gasteiger et al. 2005.

1.7. Perl - linguagem prática de extração e linguagem de relatório

Objetivo: Perl é uma linguagem de programação dinâmica criada por Larry Wall e divulgada primeiramente em 1987.

2. Treinamento de SVM

Para o processo de aprendizado supervisionado, precursores de polipeptídeos bioativos conhecidos foram extraídos de uma base de dados pública comumente utilizada, tal como Swissprot, usando a seguinte instrução de busca SRS (Sequence Retrieval System em www.expasy.org): Organismo = vertebrados; comprimento de seqüência = 30:300; características chave = sinal; Palavras chave = citoquinas ou hormônios ou bombesina ou bradicinina ou glucagônio ou fator de crescimento ou insulina ou neuropeptídeos ou peptídeos opioides ou taquinina ou hormônio da tireóide ou vaso5 constrictor ou vasodilatador. Esta busca dá origem a um conjunto de precursores de hormônio de peptídeos conhecidos, nos quais seus peptídeos bioativos estão prontamente disponíveis pela anotação das bases de dados Swissprot. Portanto essas seqüências podem ser usadas para deduzir um conjunto de peptídeos bioativos e não-bioativos para treinamento de um mo10 delo à base de SVM.

3. Descritores moleculares usados para construir os vetores

produzido no corpo humano e foi caicuiado por uma combinação de diferentes ferramentas para previsão de locais de clivagem de protease. Os resultados dessas ferramentas estão nas primeiras 7 dimensões do vetor.

e representam as seguintes 42 dimensões do vetor.

Dimensão 8: Porcentagem de ácidos aminoácidos (E, N, Q) por polipeptídeo

Dimensão 9: Porcentagem de aminoácidos positivamente carregados (R, H) por polipeptídeo

25

20

Dimensão 1: escore de ProP N-terminal;

Dimensão 2 : escore de Hmcut N-terminal;

Dimensão 3 : escore de fragmento N-terminal (valor fixo de 0,2) Dimensão 4 : escore de ProP C-terminal;

Dimensão 5 : escore de Hmcut C-terminal;

Dimensão 6 : escore de Hamid C-terminal;

Dimensão 7 : fragmento C-terminal (valor fixo de 0,2) Propriedades físico-químicas dos polipeptídeos foram calculadas Dimensão 10: Porcentagem de aminoácidos aromáticos (F, Y, W) por polipeptídeo

Dimensão 11: Porcentagem de aminoácidos alifáticos (G, V, A, I) por polipeptídeo

Dimensão 12: Porcentagem de prolina por polipeptídeo

Dimensão 13: Porcentagem de aminoácidos reativos (S, T) por polipeptídeo

Dimensão 14: Porcentagem de alanina por polipeptídeo Dimensão 15: Porcentagem de cisteína por polipeptídeo Dimensão 16: Porcentagem de ácido glutâmico por polipeptídeo

Dimensão 17: Porcentagem de fenilalanina por polipeptídeo Dimensão 18: Porcentagem de glicina por polipeptídeo Dimensão 19: Porcentagem de histidina por polipeptídeo Dimensão 20: Porcentagem de isoleucina por polipeptídeo Dimensão 21: Porcentagem de asparagina por polipeptídeo

Dimensão 22: Porcentagem de glutamina por polipeptídeo Dimensão 23: Porcentagem de arginina por polipeptídeo Dimensão 24: Porcentagem de serina por polipeptídeo Dimensão 25: Porcentagem de treonina por polipeptídeo Dimensão 26: Porcentagem de aminoácidos não-canônicos (in

definido) por polipeptídeo

(Por favor note que esta dimensão não contém qualquer valor diferente de 0 como entrada)

Dimensão 27: Porcentagem de valina por polipeptídeo Dimensão 28: Porcentagem de triptofano por polipeptídeo

Dimensão 29: Porcentagem de tirosina por polipeptídeo Dimensão 30: teor de cisteína (zero, números pares ou ímpares de 0,5, 1 ou 0, respectivamente

Dimensão 31: Porcentagem de estrutura secundária em espiral por polipeptídeo

Dimensão 32: Porcentagem de estrutura helicoidal secundária por polipeptídeo Dimensão 33: Porcentagem de estrutura secundária aleatória por polipeptídeo

Dimensão 34: Escore para estrutura em torno do local de clivagem N-terminal

Dimensão 35: Escore para estrutura em torno do local de cliva

gem C-terminal

Dimensão 36: Número de blocos helicoidais por polipeptídeo Dimensão 37: Ponto isoelétrico de polipeptídeo Dimensão 38: Peso molecular médio de polipeptídeo Dimensão 39: Soma das forças de Van-der-Waals de cada ami

noácido dentro dos polipeptídeo

Dimensão 40: Soma dos valores de hidrofobicidade de cada aminoácido dentro dos polipeptídeo

Dimensão 41 - 48: Valores médios calculados com base nos escores dos vetores de propriedades hidrófobas, estéricas e eletrônicas dos componentes principais por polipeptídeo (Mei et al. 2005)

Dimensão 49: Comprimento do polipeptídeo Onde aplicável, os valores das dimensões 1-49 foram colocados em escala para estar na faixa entre 0 e 1.

Os vetores de entrada para o treinamento e previsão contêm 49

dimensões, entretanto, no formato atual somente 48 são utilizados, já que a dimensão 26 é ajustada em zero para todos os fragmentos (porcentagem de aminoácidos não canônicos por fragmento). Isto é devido à falta de dados de treinamento apropriados contendo os aminoácidos não-canônicos, mas podem estar incluídos nos modelos futuros.

4. Testaqem dos modelos

O melhor modelo que tem o mais alto desempenho é escolhido baseado na classificação de um conjunto de testes independentes de peptídeos bioativos e não-bioativos. Para testar os modelos, o desempenho de 30 todos os modelos gerados foi testado e os dois melhores modelos para peptídeos curtos (4-55 aminoácidos) e polipeptídeos mais longos (56-300 aminoácidos) foram escolhidos, respectivamente. Como um resultado, obtevese uma acurácia de previsão total de 90,7 % para peptídeos curtos e 94 % para peptídeos longos. Usando um conjunto de testes independentes, o método descrito identifica corretamente em torno de 93 % dos peptídeos bioativos e em torno de 91 % dos peptídeos não-ativos.

5. Identificação dos peptídeos bioativos

Durante a etapa de classificação (Etapa 6, figura 1), os peptídeos de maiores escores por precursor são escolhidos para ter um comprimento menor do que 46 aminoácidos. Neste processo de classificação, todos os fragmentos que têm, segundo a classificação SVM1 uma distância 10 maior do que |0,65| e que estão localizados com o conjunto de dados de treinamento negativo (isto é um escore de -0,65 ou menor) são prontamente descartados, mesmo que eles representem o maior escore de peptídeos por precursor de proteína.

6. Testes antimicrobiais para testar a bioatividade dos peptídeos identificados através do método da presente invenção

6.1. Teste de tecnologia

O teste de microdiiuição representa um método homogêneo para a determinação do número de células bacterianas viáveis ou células de Ievedo em cultura. Ele se baseia no fato de que a bactéria ou Ievedo vivo são turvos em cultura. A turbidez pode ser medida como absorbância de Iuz com um fotômetro e está correlacionada com o número de células na amostra.

6.2. Materiais e métodos Cepas bacterianas e de Ievedo

As cepas usadas no curso dos experimentos são Escherichia coli (E. coli ATCC 25922), Staphylococcus aureus (S. aureus ATCC 29213) e Candida albicans (C. albicans FH 2173).

Pré-cultivo de todas as cepas do teste

O cultivo da cepa começa com a construção de um crioestoque que pode ser usado para múltiplas inoculações de pré-culturas.

1. Purifique as bactérias na surperfície de uma placa de agar

Mueller Hilton (MH) usando um Ίοορ" de inoculação e incube a placa ágar por 3 dias a 37 °C. Para o Ievedo use o mesmo procedimento mas com dextrose Sabouraud dextrose (SD)-ágar.

2. Inocule um frasco de 100 ml contendo 30 ml de um caldo de MH com um grupo ("loop") de bactérias e incube o frasco por 1 dia agitando a 37 0C e 180 rpm. Para o Ievedo aplique as mesmas condições em

caldo SD.

3. Remova a solução criopreservadora hipertônica dos frascos de plástico do banco criogênico Cryobank (CRYO/G), cada qual contendo 25 contas de vidro verde, usando uma pipeta estéril.

4. Encha cada frasco com 2 ml da suspensão de bactéria/levedo, feche o frasco e misture cuidadosamente.

5. Remova tanto da cultura sobrenadante de bactéria/levedo do frasco quanto possível. A superfície das contas é agora coberta com bactéria/levedo. A quantidade de líquido remanescente no frasco deveria ser tão baixa quanto possível para a aglomeração das contas. Uma conta é usada

para a inoculação de uma pré-cultura (30 ml de caldo de MH/SD em um frasco de agitação de 100 ml).

6. Armazene os frascos de Cryobank (CRYO/G) a -80 °C.

7. Confira a qualidade/esterilidade. Remova o frasco de Cryobank (CRYO/G) do congelador e coloque-o em um Cryoblock (CRYO/Z).

Abra o frasco, remova uma conta e imediatamente purifique a conta sobre a superfície de uma placa ágar MH/SBD. Incube a placa por 3 dias a 37 °C. Verifique que somente a cepa do teste foi cultivada examinando a morfologia da colônia.

Preparação da cultura de teste usando o caldo de MH O frasco com a cepa do teste é removido do Cryobank. Uma

conta é removida com uma pipeta estéril e inoculada em um Erlenmeyer de 100 ml com 30 ml de caldo de MH e SD para bactéria e levedo, respectivamente. Cultive a cultura por 18 h a 37°C e 180 rpm. A densidade ótica é ajustada com o caldo MH a uma densidade celular correspondendo a 108 cé30 lulas/ml para todas as cepas do teste. A cultura de inóculo padrão para o ensaio é diluída 1:100 até a concentração final de 106 CFU/ml (unidades formadoras de colônias/ml). Diluições de<Peptídeo

Os compostos são diluídos de modo serial (10 etapas de diluição) da concentração padrão inicial de 125 μΜ até uma concentração final de 0,24 μΜ. Α concentração inicial de DMSO é 1,4 % em todas as amostras e controles.

Diluições Antibióticas Padrão para Curvas de Resposta Padrão

Para experimentos de resposta da dose dilua os compostos serialmente (16 etapas de diluição) com caldo MH. Faixas de concentrações de composto final variam entre 64 pg/ml e 0,002 pg/ml. A concentração de DMSO inicial é de 1,4 % em todas as amostras e controles.

Fornecedor Cat No Função Caldo Mueller Hinton (MH) Becton Dickinson 275730 Meio de Cultura Caldo Sabouraud dextrose Becton Dickinson 238230 Meio de Cultura (SD) DMSO Merck 102 931 Solvente Nistatina Calbiochem 475914 Antibióticos Cyprobay 100 Bayer Greiner, 384 Greiner 781182 Placas de Ensaio SPECTRAFIuor Plus Teean - Leitor de Absorbância Protocolo de Ensaio

* Pré-cultivar a bactéria em 30 ml de caldo MH a 37°C por 18 h (frasco de Erlenmeyer de 100 ml)

* Pré-cultivar o Ievedo em 30 ml de caldo SD a 37°C por 18 h (frasco de Erlenmeyer de 100 ml)

* Ajustar a suspensão celular com o caldo MH a 106 CFU/ml (cultura de teste) Teste:

* Adicionar 10 μΙ do composto em DMSO e 30 μΙ de caldo MH ao primeiro frasco

* Transferir 20 μΙ do primeiro frasco ao segundo que contém 20 μΙ de caldo MH

* A última etapa é repetida 8 vezes (peptídeos, 10 etapas de diluição) ou 14 vezes (antibióticos, 16 etapas de diluição). * Adicionar 10 μΙ da suspensão da cultura de teste a cada frasco (10 frascos para os peptídeos e 16 frascos para os antibióticos)

=> inóculo celular de partida 5 XlO5CFU

=> concentração de DMSO de partida 12,5 %

=> concentração do composto inicial/final 125 μΜ-0,24 μΜ

=> concentração inicial/final de antibiótico 64 pg/ml - 0,002 μο/ml

* Incubar a 37°C por 18 h a 5% de umidade relativa e 5% de CO2

* Ler absorbância a 590 nm com 5 flashes Controles:

* Controles altos : Caldo MH com bactéria (controle de crescimento, alto sinal)

* Controles baixos : Caldo MH sem bactéria (controle estéril, baixo sinal)

6.3. Teste de sensibilidade com antibióticos

Para avaliar a adequabilidade do ensaio para a identificação de 15 fármacos potenciais, os efeitos dependentes da dose de uma série de antibióticos foram testados usando as condições descritas sob ‘Matérias primas e Processos’. Cyprofloxacina esperada ser ativa contra E. coli e S. aureus e Nistatina contra C. albicans. Os valores IC50 calculados para esses antibióticos são dados na figura 4 em pg/ml.

6.4. Resultados dos ensaios

Os peptídeos foram testados contra as cepas do teste E. coli (ATCC 25922), S. aureus (ATCC 29213) e C. albicans (FH 2173). Os peptídeos A003500589 e A003500548 mostraram valores de IC50 de 7,25 pg/ml e 6,79 μg/ml, respectivamente, contra E. coli. Nenhuma atividade foi observada contra S. aureus e C. albicans. BIBLIOGRAFIA

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Claims (16)

REIVINDICAÇÕES

1. Processo para a identificação de peptídeos bioativos, em um sistema computadorizado, caracterizado pelo fato de empregar um algoritmo baseado em uma máquina vetorial de suporte binário (SVM) onde o referido processo compreende as etapas de: a) treinamento de um algoritmo SVM para aprender a distinguir entre peptídeos bioativos e não-bioativos, sendo que o referido treinamento compreende as etapas de: a1) geração de vetores com 49 dimensões, sendo que cada dimensão resulta do cálculo do valor de um descritor molecular, para um conjunto de peptídeos rotulados como bioativos conhecidos e rotulados como não-bioativos conhecidos, onde os rótulos indicam se o peptídeo é, respectivamente, bioativo ou não-bioativo; a2) transferência do vetor de dados gerados na etapa ai) para o algoritmo baseado em SVM, sendo que o referido algoritmo calcula o hiperplano ótimo que separa os vetores que correspondem aos peptídeos bioativos e os peptídeos não-bioativos, respectivamente; b) fornecimento de seqüências de proteína de um banco de dados de proteínas humanas disponível ao público; c) predição de estruturas secundárias e de locais de clivagem no âmbito de uma seqüência de proteína fornecida na etapa b) empregando métodos computacionais; um conjunto de 7 descritores moleculares é calculado com base na referida etapa de predição resultando na geração de fragmentos de peptídeo; d) cálculo de um conjunto de 42 descritores moleculares correspondentes às propriedades físico-químicas dos fragmentos de peptídeo gerados na etapa c); e) transformação dos valores calculados na etapa c) em valores em escala de 0 a 1 para gerar as dimensões 1 a 7 de um vetor de 49 dimensões para cada fragmento de peptídeo e transformação dos valores calculados na etapa d) em valores em escala de 0 a 1 para gerar as dimensões 8 a 49 do referido vetor para cada fragmento de peptídeo; f) apresentação dos vetores gerados na etapa e) para o algoritmo SVM treinado da etapa a) para medir a distância de cada vetor ao hiperplano calculado na etapa a2); e g) classificação de cada fragmento de peptídeo como peptídeo bioativo ou peptídeo não-bioativo, de acordo com a distância medida na etapaf).

2. Processo de acordo com a reivindicação 1, em que as dimensões 1 a 7 geradas na etapa e) são as seguintes: dimensão 1: escore ProP N-terminal; dimensão 2: escore Hmcut N-terminal; dimensão 3: fragmento Nterminal; dimensão 4: escore ProP C-terminal; dimensão 5: escore Hmcut Cterminal; dimensão 6: escore Hamid C-terminal; dimensão 7: fragmento Cterminal; e as dimensões 8 a 49 geradas na etapa e) são as seguintes: dimensão 8: porcentagem de aminoácidos (E, N1 Q) ácidos por polipeptídeo; dimensão 9: porcentagem de aminoácidos positivamente carregados (R, H) por polipeptídeo; dimensão 10: porcentagem de aminoácidos aromáticos (F, Y, W) por polipeptídeo; dimensão 11: porcentagem de aminoácidos alifáticos (G, V, A, I) por polipeptídeo; dimensão 12: porcentagem de prolina por polipeptídeo; dimensão 13: porcentagem de aminoácidos reativos (S, T) por polipeptídeo; dimensão 14: porcentagem de alanina por polipeptídeo; dimensão 15: porcentagem de cisteína por polipeptídeo; dimensão 16: porcentagem de ácido glutâmico por polipeptídeo; dimensão 17: porcentagem de fenilalanina por polipeptídeo; dimensão 18: porcentagem de glicina por polipeptídeo; dimensão 19: porcentagem de histidina por polipeptídeo; dimensão 20: porcentagem de isoleucina por polipeptídeo; dimensão 21: porcentagem de asparagina por polipeptídeo; dimensão 22: porcentagem de glutamina por polipeptídeo; dimensão 23: porcentagem de arginina por polipeptídeo; dimensão 24: porcentagem de serina por polipeptídeo; dimensão 25: porcentagem de treonina por polipeptídeo; dimensão 26: porcentagem de aminoácidos não canônicos por polipeptídeo; dimensão 27: porcentagem de valina por polipeptídeo; dimensão 28: porcentagem de triptofano por polipeptídeo; dimensão29: porcentagem de tirosina por polipeptídeo; dimensão 30: conteúdo de cisteína; dimensão 31: porcentagem de estruturas secundárias em espiras por polipeptídeo; dimensão 32: porcentagem de estruturas secundárias helicoidais por polipeptídeo; dimensão 33: porcentagem de estruturas secundárias aleatórias por polipeptídeo; dimensão 34: escore para estrutura no entorno do local de clivagem N-terminal; dimensão 35: escore para estrutura no entorno do local de clivagem C-terminal; dimensão 36: número de blocos helicoidais por polipeptídeo; dimensão 37: Ponto isoelétrico de polipeptídeo; dimensão 38: peso molecular médio de polipeptídeo; dimensão 39: soma das forças de Van-der-Waals de cada aminoácido nos polipeptídeos; dimensão40: soma dos valores de hidrofobicidade de cada aminoácido nos polipeptídeos; dimensão 41 - 48: valores médios calculados com base nos vetores de escore de componentes por princípio de propriedades hidrofóbicas, estéricas e eletrônicas por polipeptídeo; dimensão 49: comprimento dos polipeptídeos.

3. Processo de acordo com as reivindicações 1 e 2, em que as seqüências de proteína da etapa b) são apenas seqüências de proteínas que ocorrem naturalmente encontradas no secretoma humano.

4. Processo de acordo com as reivindicações 1 a 3, em que os referidos peptídeos bioativos são hormônios de peptídeos bioativos derivados de hormônios precursores.

5. Peptídeo bioativo selecionado do secretoma humano, que emprega os processos como definido nas reivindicações 1 e 2.

6. Peptídeo bioativo de acordo com a reivindicação 5, em que o referido peptídeo bioativo é um hormônio de peptídeo bioativo.

7. Peptídeo bioativo de acordo com a reivindicação 6, em que o referido hormônio de peptídeo bioativo deriva de uma proteína precursora.

8. Peptídeo bioativo de acordo com as reivindicações 5 a 7, em que uma seqüência selecionada do grupo que consiste nas seqüências de aminoácidos das SEQ ID NOS:1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,..30,31,32,33,34,35,30,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49,50,51,52,53,54,55,5.6,57,58,59,60,61,62,63,64,65,66,67,68,69,70,71,72,73,74,75,76,77,78,79,80,81,82,83,84,85,86,87,88,89,90,91,92,93,94,95, .96,97,98,99,100,101,102,103,104,105,106,107,108,109,110,111,112,113,114,115,116,...117,118,119,120,121,122,123,124,125,126,127,128,129,130,131,132,133,134,135,136,...137,138,139,140,141,142,143,144,145,146,147,148,149,150,151,152,153,154,155,156,...157,158,159,160,161,162,163,164,165,166,167,168,169,170,171,172,173,174,175,176,...177,178,179,180,181,182,183,184,185.

9. Biblioteca de peptídeos que compreende peptídeos bioativos identificados através do processo como definido nas reivindicações 1 a 3.

10. Biblioteca de peptídeos de acordo com a reivindicação 9, em que a referida biblioteca de peptídeos compreende peptídeos bioativos como definido na reivindicação 8.

11. Biblioteca de peptídeos de acordo com a reivindicação 9, em que os referidos peptídeos bioativos são hormônios de peptídeos bioativos.

12. Biblioteca de peptídeos de acordo com a reivindicação 11, em que os referidos hormônios de peptídeos bioativos derivam de proteínas precursoras.

13. Dispositivo computacional configurado para identificar peptídeos bioativos através do emprego de um processo com base em máquina binária de suporte vetorial (SVM), em que o referido processo compreende as etapas de: a) treinamento de um algoritmo SVM para aprender a distinguir entre peptídeos bioativos e não-bioativos, sendo que o referido treinamento compreende as etapas de: a1) geração de vetores com 49 dimensões, sendo que cada dimensão resulta do cálculo do valor de um descritor molecular, para um conjunto de peptídeos rotulados como bioativos conhecidos e rotulados como não-bioativos conhecidos,onde os rótulos indicam se o peptídeo é, respectivamente, bioativo ou não-bioativo; a2) transferência do vetor de dados gerados na etapa ai) para o algoritmo baseado em SVM, sendo que o referido algoritmo calcula o hiperplano ótimo que separa os vetores que correspondem aos peptídeos bioativos e os peptídeos não-bioativos, respectivamente; b) fornecimento de seqüências de proteína de um banco de dados de proteínas humanas disponível ao público; c) predição de estruturas secundárias e de locais de clivagem no âmbito de uma seqüência de proteína fornecida na etapa b) empregando métodos computacionais; um conjunto de 7 descritores moleculares é calculado com base na referida etapa de predição resultando na geração de fragmentos de peptídeo; d) cálculo de um conjunto de 42 descritores moleculares correspondentes às propriedades físico-químicas dos fragmentos de peptídeo gerados na etapa c); e) transformação dos valores calculados na etapa c) em valores em escala de 0 a 1 para gerar as dimensões 1 a 7 de um vetor de 49 dimensões para cada fragmento de peptídeo e transformação dos valores calculados na etapa d) em valores em escala de 0 a 1 para gerar as dimensões 8 a 49 do referido vetor para cada fragmento de peptídeo; f) apresentação dos vetores gerados na etapa e) para o algoritmo SVM treinado da etapa a) para medir a distância de cada vetor ao hiperplano calculado na etapa a2); e g) classificação de cada fragmento de peptídeo como peptídeo bioativo ou peptídeo não-bioativo, de acordo com a distância medida na etapaf).

14. Uso do processo como definido nas reivindicações 1 a 4, para a identificação de polipeptídeos terapêuticos, alvos para intervenção medicamentosa, Iigantes para descobrir alvos relevantes ou biomarcadores para monitorar doenças.

15. Uso da biblioteca de peptídeos como definida nas reivindicações 9 a 12, ser empregada em uma abordagem de varredura para interrogar caminhos de sinalização intracelular, criar reagentes para aprofundar a compreensão de um caminho, criar novas formas de terapias e identificar compostos farmaceuticamente ativos, alvos de intervenções medicamentosas, ligantes para descobrir alvos relevantes ou biomarcadores para monitorar doenças.

16. Composição farmacêutica, que compreende um peptídeo bioativo, tendo uma seqüência selecionada do grupo que consiste nas seqüências de aminoácidos SEQ ID Nos 1-185 como um agente bioativo.