BRPI0802649B1

BRPI0802649B1 - derivados porfirínicos, processo de obtenção e composição farmacêutica compreendendo os mesmos

Info

Publication number: BRPI0802649B1
Application number: BRPI0802649-1A
Authority: BR
Inventors: Maurício Da Silva Baptista; Adjaci Uchoa Fernandes
Original assignee: Universidade De São Paulo - Usp; Fundação De Amparo À Pesquisa Do Estado De São Paulo - Fapesp
Priority date: 2008-08-19
Filing date: 2008-08-19
Publication date: 2020-11-17
Also published as: BRPI0802649A2; BRPI0802649B8

Abstract

DERIVADOS PORFIRÍNICOS, PROCESSO DE OBTENÇÃO E COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA COMPREENDENDO OS MESMOS. A presente invenção pertence ao campo dos compostos derivados das porfirinas. Especificamente, os derivados da presente invenção são compostos fotossensíveis e podem ser utilizados na Terapia Fotodinâmica. O processo de preparo dos compostos da presente invenção compreende uma etapa final de metilação e opcionalmente compreende o uso de uma clorofilina como composto de partida uma clorofilina a qual é previamente submetida à uma etapa de remoção do metal/cobre. A invenção compreende ainda, composições farmacêuticas compreendendo tais compostos que pode ser utilizada no tratamento de doenças como o câncer, artrites reumatóides, psoríase dentre outras possíveis.

Description

Campo da Invenção

[001] A presente invenção pertence ao campo dos compostos derivados porfirínicos. Especificamente, os derivados da presente invenção são compostos anfifílicos fotossensíveis e podem ser utilizados na Terapia Fotodinâmica.

[002] A presente invenção descreve ainda um processo de preparo dos compostos e composições farmacêuticas compreendendo tais compostos que pode ser utilizada no tratamento de doenças como o câncer, artrites reumatóides, psoríase dentre outras possíveis.

Antecedentes da Invenção

[003] O efeito fotodinâmico refere-se à destruição do tecido vivo por luz visível em presença de um fotossensibilizador (Fs) e de oxigênio. A energia luminosa é absorvida pelo Fs e transferida para o meio, gerando espécies reativas de oxigênio (ROS), incluindo oxigênio singleto e radicais, que causam danos às biomoléculas. A região espectral do FS afeta a atividade fotodinâmica. A região espectral de 600nm a 900nm é chamada de janela terapêutica, uma vez que apresenta maior penetração em tecido vivo (Walker et al 2004, Kunz et al 2007).

[004] O uso deste efeito na medicina - Terapia Fotodinâmica (PDT do inglês Photodynamic Therapy) - é promissor para o tratamento de vários tipos de câncer, sendo uma alternativa cada vez mais utilizada em detrimento dos tratamentos tradicionais (cirurgia, quimioterapia e radioterapia). Também outras doenças, tais como psoríase, artrite reumatóide sistêmica, degeneração macular da retina, micoses fungóides, infestações bacterianas, verrugas, arteriosclerose e controle de doenças oportunistas relacionadas com AIDS, têm sido tratadas com PDT (Mccaughan 1999; Roberts e co-autores 1995; Bonnett, e co-autores 2001).

[005] Na década de 70, surgiram várias preparações de derivados porfirínicos levando ao desenvolvimento de novos Fs e ao melhoramento doHpD, denominado Photofrin II (Potter e co-autores 1987).Em 1975 a PDT ganhou um novo impulso com os trabalhos de Dougherty e co-autores (1998). Na década de 80, o HpD foi otimizado, conseguindo sua aprovação em 1993 para tratamento do câncer por PDT pela FDA/EUA (Food and Drug Administration), sendo posteriormente aprovado em outros países: Canadá, Alemanha, França, Japão e Brasil.

[006] A droga que foi aprovada para uso, Photofrin, tinha diversos inconvenientes: i) estrutura química indefinida; ii) pequena absorção na janela terapêutica sendo necessário o uso de fontes luminosas intensas e de custo elevado como laser de corante; iii) mecanismo de ação baseado principalmente na destruição da vasculatura tumoral, levando à morte por hipóxia. Neste caso o próprio mecanismo de ação levava a diminuição da eficiência da terapia que necessita de oxigênio, levando a recorrência frequente; iv) custo elevado estando restrita a poucos centros cirúrgicos no mundo que podiam dispor de lasers de grande custo de aquisição e manutenção.

[007] Essas deficiências levaram a uma intensa atividade de pesquisa nas décadas de 80-90, na busca de Fs mais eficientes. Busca-se as seguintes características: i) Absorção na janela foto-terapêutica (600-800 nm); ii) Características fotofísicas favoráveis: alto rendimento quântico de formação de tripletes, de oxigênio singlete e pequena constante de supressão destes; iii) Baixa citotoxicidade no escuro; iv) Farmacocinética favorável e fácil eliminação pelo organismo, evitando fotossensibilidade prolongada; v) Formulação definida, permitindo estabelecer a relação entre a estrutura e a atividade; vi) Solubilidade em meio fisiológico, facilitando a aplicação da droga; vii) Facilidade de obtenção em escala industrial, com boa reprodutibilidade e custos reduzidos; viii) Mecanismo de ação intracelular para evitar as recorrências observadas com os protocolos que envolviam Photofrin.

[008] O desenvolvimento de fotossensibilizadores mais eficientes propiciou a utilização de equipamentos de iluminação mais simples e menos custosos do que os lasers de corante, incluindo lasers de diodo, diodos emissores de luz (LEDs do inglês light emitting diodes) e fontes não-coerentes (Tardivo e co-autores 2005). Muitas patentes na área de desenvolvimentos de novas fontes luminosas para PDT foram depositadas e concedidas.

[009] Esse desenvolvimento possibilitou a expansão da técnica para diversos outros países. Diversas outras moléstias tais como degeneração macular da retina, verrugas, psoríase controle de infecções bacterianas, fúngicas e virais, também têm sido tratadas com PDT (Mang 2004; Tardivo e co-autores, 2005). No entanto, mesmo com o grande desenvolvimento, a PDT ainda continua inviável para pacientes de baixa renda. Por exemplo, uma dose do Fs Foscan®, custa hoje em torno de EU 8.000,00. Desta forma, incluindo os custos do clínico e da fonte de luz, um tratamento de PDT usando Foscan não é realizado por menos do que R$ 30.000,00. Este fato é de grande importância para um país como o Brasil com uma grande população de baixa renda, que poderia se beneficiar deste tratamento. A busca do conhecimento dos mecanismos de ação da PDT, o desenvolvimento de FSs mais eficientes e de fontes de luz acessíveis, podem e devem trazer benefícios para muitos pacientes, inclusive pacientes desprivilegiados monetariamente (Tardivo 2005; Tardivo et al 2006).

[0010] A maioria das drogas que estão sendo utilizadas em tratamentos de câncer por PDT ou que estão em testes clínicos em PDT são eficientes geradoras de 1Ü2 e o mecanismo de ação destas moléculas depende da presença de oxigênio. O 1O2 pode ser detectado por sua emissão característica de luz no Infravermelho próximo (NIR) que desenvolvemos para medir o decaimento radiativo do oxigênio singlete a 1270 nm (Engelmann e co-autores, 2004; Araki e co-autores, 2003).

[0011] Um dos objetivos de pesquisa atual em PDT é o desenvolvimento de sensibilizadores que destruam diretamente e especificamente organelas celulares, por exemplo mitocôndrias, de tumores e que atuem na presença e na ausência de oxigênio. A mitocôndria é uma organela intracelular que apresenta potencial eletroquímico negativo (Δψ=-180mV). Os corantes positivos, por exemplo derivados das fenotiazinas, por serem relativamente lipofílicos e possuírem carga positiva, permeiam membranas e são atraídos pelo potencial negativo das mitocôndrias, devendo atuar nesta organela (Gabrieli e co-autores 2004; Tardivo e co-autores 2005; Tardivo, e co-autores 2006).Embora sejam eficientes para causar morte cellular in-vitro as suas aplicações in-vivo são reduzidas devido a problemas de distribuição tecidual e redução para a forma leuco inativa. Uma estratégia que tem sido considerada para o desenvolvimentode novos Fs é a utilização de Fs anfifilicos (Engelmann e colaboradores 2007). Estes compostos exibem alta afinidade por lipoproteínas de baixa densidade (LDL) do sangue (Michels e co-autores 2003). Sabe-se que tecidos em metástase possuem alta concentração de receptores deste tipo de lipoproteína (em comparação com células normais). Esta propriedade promove um maior acúmulo de Fs porfirínicos em tecidos doentes (Jori e co-autores 1984).A incorporação é um fator dependente da interação do fotossensibilizador com sistemas biológicos, tais como com membranas e organelas. Porfirinas assimétricas, embora tenham excelente penetração celular, localização mitocondrial e excelente atividade fotodinâmica, não apresentam absorção de luz adequada na janela terapêutica (Bonnett e co-autores 2001).

[0012] As porfirinas apresentam características óticas espectrais com fortes transições π—>π* na região dos 400 nm, conhecida com banda soret ou banda B, e usualmente quatro bandas Q na região do visível, que são numeradas por algarismos romanos, em ordem decrescente de energia. Interessantemente, dependendo das características estruturais algumas porfirinas podem apresentar banda Q intensa na janela terapêutica (600-900 nm)

[0013] A Cu2+-Clorofilina é uma porfirina tricarboxilada nas posições 131, 152 e 173, apresenta uma banda Q intensa em 630nm. Cu2+-Clorofilina é precursora da clorofila a na síntese de Woodward (Woodward e co-autores 1990) com facilidade de obtenção a baixo custo. Embora essa estrutura de substituição no anel forneça características favoráveis para PDT, sua utilização e de seus derivados não foi explorada até o momento em PDT.

Fórmula estrutural Cu2+-clorofilina

[0014] A presente invenção refere-se ao método de obtenção, bem como, às moléculas com estruturas químicas novas derivadas desta síntese, que são fotossensibilizadores anfifílicos derivados da Clorofilina. As novas moléculas obtidas apresentem características ideais para utilização em PDT, como absorção na janela terapêutica, eficiência de geração de oxigênio singlete, estrutura molecular assimétrica e que seja de fácil obtenção para viabilizar protocolos de PDT de baixo custo.

[0015] A busca na literatura patentária apontou alguns documentos relevantes que serão descritos a seguir.

[0016] O documento WO 2002/098882 relata um método de obtenção de derivados de porfirinas solúveis em água que podem ser utilizados na terapia fotodinâmica. Especificamente o processo de obtenção destes compostos compreende uma etapa de alcólise ácida para a formação de uma porfirina ácida e uma etapa seguinte de reação com uma amina orgânica hidrofílica em um meio que pode compreender água ou um solvente orgânico.

[0017] O documento WO 2007/104723 relata uma série de derivados das porfirinas utilizados na terapia fotodinâmica cujo processo de preparo compreende uma etapa de reação com cianeto de potássio.

[0018] O documento US 5,250,668 relata uma série de derivados de porfirinas que compreendem um metal como átomo central.

[0019] O documento US 4,988,808 relata uma série de derivados da benzoclorina que compreendem um metal como átomo central. Opcionalmente, o metal central é substituído por 2 hidrogénios que se ligam à 2 nitrogénios.

[0020] O documento WO 1997/20846 relata uma série de porfirinas substituídas que compreendem um metal como átomo central. Opcionalmente, as moléculas podem não compreender o átomo central e compreenderem 2 hidrogénios que se ligam em 2 nitrogénios.

[0021] A presente invenção difere destes documentos por apresentar compostos diferentes aos já descritos. Portanto, não foi encontrado na literatura nenhum documento que antecipe ou sequer sugira as particularidades da presente invenção.

[0022] As características espectroscópicas das clorofilinas foram aproveitadas para sintetizar novos compostos. Inicialmente foi otimizada a maneira de extrair os íons cobre, seguido da funcionalização com compostos bi-funcionais para formação de espécies polares nas posições periféricas. Este processo proporcionou compostos com propriedades fotofísicas favoráveis para utilização em PDT como deslocamento da banda Qiv, para 650 nm, alto rendimento quântico de triplete e de oxigênio singlete, ligação mitocondrial e internalização celular favoráveis, e grande eficiência de morte celular fotoinduzida. Além da possibilidade de obter Fs que absorvam na janela terapêutica, esta porfirina é tricarboxilada em um dos lados da molécula, oferecendo a possibilidade de modificações químicas para obter outros Fs assimétricos.

[0023] As novas moléculas obtidas apresentam características ideais para utilização em PDT, como absorção na janela terapêutica, eficiência de geração de oxigênio singlete, estrutura molecular assimétrica e que seja de fácil obtenção para viabilizar protocolos de PDT de baixo custo.

Sumário da Invenção

[0024] É objeto da presente invenção, derivados porfirínicos anfifílicos deacordo com a fórmula geral (I):

[0025] Onde:

[0026] R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8 e R9 são, independentemente, escolhidos do grupo que compreende H, CFb, CH2-CH3, e (CH2)2;

[0027] n é um número inteiro entre 1 e 20;

[0028] X é escolhido do grupo que compreende O, NH e S; e

[0029] Y é escolhido do grupo que compreende N(CH3)2, N+(CH3)3, SOsH, SO3, PO3H, PO3-, SH,S‘,Si(O(CH2)nCH3, ácidos carboxílicos, carboidratos, aminoácidos, peptídeos, oligopeptídeos, nucleotídeos, ácidos nucléicos e mistura dos mesmos.

[0030] Os derivados porfirínicos anfifílicos da presente invenção são compostos fotossensíveis que apresentam absorção entre 600 e 900 nm.

[0031] É um adicional objeto da presente invenção, um método de preparo de derivados porfirínicos anfifílicos que compreende as etapas de:

[0032] Desmetalação e esterificação de um composto porfirínico;

[0033] Hidrólise em meio ácido ou básico;

[0034] Formação de cloretos de acila; e

[0035] Reação com grupo funcional.

[0036] Opcionalmente, 0 processo de obtenção dos derivados porfirínicos anfifílicos pode compreender uma etapa posterior de purificação.

[0037] É ainda um objeto da presente invenção, uma composição farmacêutica compreendendo: a) pelo menos um derivado anfifílico das porfirinas de fórmula geral (I)

[0038] Onde:

[0039] R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8 e R9 são, independentemente, escolhidos do grupo que compreende H, CH3, CH2-CH3, e (CH2)2;

[0040] n é um número inteiro entre 1 e 20;

[0041] X é escolhido do grupo que compreende O, NH e S; e

[0042] Y é escolhido do grupo que compreende N(CH3)2, N+(CH3)3, SOsH, SOí, PO3H, PO3-, SH,S‘,Si(O(CH2)nCH3, ácidos carboxílicos, carboidratos, aminoácidos, peptídeos, oligopeptídeos, nucleotídeos, ácidos nucléicos e mistura dos mesmos. b) um veículo farmaceuticamente aceitável

[0043] Opcinalmente, a composição farmacêutica pode compreender derivados porfirínicos anfifílicos encapsulado em micelas, lipossomos, emulsões, dentre outras formas possíveis de encapsulamento de compostos.

[0044] Numa realização preferencial, os compostos anfifílicos da presente invenção são utilizados na Terapia Fotodinâmica, no tratamento de câncer, psoríase, artrite reumatóide, micoses, degeneração macular da retina, infestações bacterianas, verrugas, arteriosclerose e no controle de doenças oportunistas com AIDS dentre outras possíveis tanto em humanos como em animais.

[0045] Estes e outros objetos da invenção serão melhor compreendidos à luz das Figuras, da Descrição Detalhada e dos Exemplos mostrados a seguir.

Breve Descrição das Figuras

[0046] A Figura 1 mostra o esquema reacional detalhado (B) para a obtenção dos derivados (compostos 5 e 6) de Cu2+-clorofilina (composto 1). Composto 1: cupro clorofilina de sódio; composto 5: ChINpNA: 8-vinil-13-etil- 3,7,12,17-tetrametil-21 /-/,23/-/-porfine-18-[3-(dimetilamino)propil-3-carboxilato]- 20-[3-(dimetilamino)propil-3-ilacetato]-2-[3-(dimetilamino)propil-3-propanoato]; composto 6: ChINpNI: Triiodeto-8-vinil-13-etil-3,7,12,17-tetrametil-21 H,23H- porfine-18-/V,/V,Mtrimetil-3-[(3-ilcarbonil)oxi]propan-1-aminium-20-/V,/V,/V-trimetil -3-[(3-ilacetil)oxi]propan-1-aminium-2-/V,/V,/V-trimetil-3-[(3-propanoil)oxi]propan- 1-aminium onde 1 é HCI/MeOH, 2 é HCI/H2O, 3 é CH3I/CH2CI2, a é ChINpN e b é ChINpNA.

[0047] A Figura 2 mostra os espectros de absorção em metanol de (A) ChlnpnA, (B) Chlnpnl e (C) Cu2+-clorofilina. O eixo X é o comprimento de onda (nm) e o eixo Y é a absorbância.

[0048] A Figura 3 mostra os espectros de fluorescência em metanol para (A) ChINpNA e (B) ChINpNI, excitados em 532 nm com fendas de 8 mm e Abs de 0,04 em 532 nm. O eixo X é o comprimento de onda (nm) e o eixo Y a intensidade (u.a.).

[0049] A Figura 4 mostra o espectro de emissão de 1O2 obtido por excitação de solução metanólica de ChINpNA, excitado com laser em 532 nm, com 5 mJ/pulso, 10 pulsos/segundo. Amostra com absorbância de 0,2 em 532 nm. O eixo X é o comprimento de onda (nm) e o eixo Y é a intensidade de emissão (u.a.).

[0050] A Figura 5 mostra o log Po/a para os novos fotossensibilizadores derivados de clorofilina: (A) ChlnpnA e (B) Chlnpnl em função do pH. O eixo X é o pH e o eixo Y é o log Po/a.

[0051] A Figura 6 mostra a comparação das taxas de incorporação das moléculas (1) ChINpNA, (2) ChINpNI e (3) HP IX a 20 pM em (A)106 células.mL' 1, (B) lipossomo aniônico de fosfatidicolina «Img.mL'1 e (C) mitocôndrias13mg.ml_'1. Experimentos realizados em triplicata. O eixo Y representa a taxa de incorporação (%).

[0052] A Figura 7 mostra a fotocitoxicidade dos novos fotossensibilizadores ChINpNA (3) e ChINpNI (4), azul de Metileno (2) a 20 pM em células tipo HeLa, 106 células.mL'1, irradiadas em 650 nm, com dose de 2,4 mJ.cm'2. O grupo controle (1) compreende células sem a adição de qualquer composto. O eixo Y representa a viabilidade celular (%).

Descrição Detalhada da Invenção

[0053] Os exemplos aqui descritos não têm a intenção de limitar a invenção, mas apenas de exemplificar uma das formas possíveis de concretizá- la.

Derivados anfifílicos das porfirinas

[0054] Os derivados porfirínicos anfifílicos da presente invenção são derivados de fórmula geral (I):

[0055] Onde:

[0056] R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8 e R9 são, independentemente, escolhidos do grupo que compreende H, CH3, CH2-CH3, e (CH2)2;

[0057] n é um número inteiro entre 1 e 20;

[0058] X é escolhido do grupo que compreende O, NH e S; e

[0059] Y é escolhido do grupo que compreende N(CH3)2, N+(CHs)3, SO3H, SO3-, PO3H, PO3-, SH,S’,Si(O(CH2)nCH3, ácidos carboxílicos, carboidratos, aminoácidos, peptídeos, oligopeptídeos, nucleotídeos, ácidos nucléicos e mistura dos mesmos.

[0060] Os compostos preferenciais da presente invenção são compostos de acordo com a fórmula geral (I) onde R1, R4, R7 e R9 são CH3, R2, R5 e R8 são H, R3 é CH2CH3, R6 é (CH2)2, X é NH, n é 3 e Y ser escolhido dentre N+(CH3)3 e N(CH3)2. Adicionalmente, os nitrogénios centrais da porfirina podem ser metalados com zinco ou paládio.

Processo de preparo

[0061] O processo de preparo dos derivados porfirínicos compreende as etapas de:

[0062] Desmetalação e esterificação de um composto porfirínico;

[0063] A desmetalação pode ser realizada preferencialmente através de três diferentes métodos: eliminação com ácido sulfúrico concentrado (método 1);eliminação com 30% ácido sulfúrico em ácido trifluoroacético (método 2) e um terceiro método (método 3), no qual a porfirina foi refluxada com HCI saturado em metanol previamente seco.

[0064] Dependendo do método utilizado, a desmetalação já produz um derivado esterificado, preferencialmente o éster metílico.

[0065] Hidrólise em meio ácido ou básico;

[0066] A hidrólise é feita de forma a regenerar as carboxilas das cadeias laterais do anel porfirínico, preparando-as para futuras substituições.

[0067] Formação de cloretos de acila; e

[0068] A formação dos respectivos cloretos de acila a partir das carboxilas tem o intuito de facilitar a substituição nucleofílica no carbono carbonílico.Tal reação é preferencialmente realizada com cloreto de oxalila, embora qualquer outro reagente capaz de promover formação dos cloretos de acila.

[0069] Reação com grupo funcional de fórmula (II): Z - (CH2)n - Y (II)

[0070] Onde:

[0071] n é um número inteiro entre 1 e 20;

[0072] Z é escolhido do grupo que compreende OH, NH2 e SH; e

[0073] Y é escolhido do grupo que compreende N(CH3)2, N+(CH3)3, SOsH, SO3-, PO3H, PO3-, SH,S‘,Si(O(CH2)nCH3, ácidos carboxílicos, carboidratos, aminoácidos, peptídeos, oligopeptídeos, nucleotídeos, ácidos nucléicos e mistura dos mesmos.

[0074] A reação com o respectivo grupo funcional dependerá da natureza desse grupo, embora a reação seja uma substituição nucleofílica por natureza. O grupo funcional pode adicionalmente sofrer reações subsequentes com o intuito de promover a ionização de partes da molécula.

[0075] Exemplos de grupos funcionais incluem, mas não se limitam a diaminas.

[0076] Adicionalmente, o processo compreende uma etapa de metalação do anel porfirínico com zinco ou paládio. Tal metalação é realizada através de processos comumente conhecidos no estado da técnica.

Composição farmacêutica

[0077] Para efeitos desta invenção, por “composições farmacêuticas” entende-se toda e qualquer composição que contenha um princípio ativo, com fins profiláticos, paliativos e/ou curativos, atuando de forma a manter e/ou restaurar a homeostase, podendo ser administrada de forma tópica, parenteral, enteral e/ou intratecal.

[0078] A expressão “farmaceuticamente aceitável” é empregada aqui para se referir a compostos, materiais, composições, e/ou forma de dosagem que são, dentro do âmbito da medicina, apropriados para uso em contato com os tecidos de humanos e animais sem toxicidade excessiva, irritação, resposta alérgica, ou outro problema ou complicação, proporcional com uma relação razoável de benefício/risco.

[0079] A composição da presente invenção pode ser administrada em forma de dosagem oral, como tabletes, cápsulas (cada qual inclui a liberação sustentada ou formulações com tempo de liberação) pílulas, pós, granulados, elixires, tinturas, suspensões, xaropes e emulsões. Eles podem ser administrados sozinhos, mas geralmente serão administrados com um veículo farmacêutico selecionado na base de rota de administração escolhida e da prática farmacêutica padrão.

[0080] Estes compostos podem ser veiculados superficialmente ou através de injeção local ou através da via intravenosa. Devido a sua característica anfifílica podem ser solubilizados em solução aquosa ou de solvente orgânico, na presença ou na ausência de agentes emulsionantes e lipossomos. Soluções ou composições contendo o Fs nas concentrações de 0.00001 % a 10% do Fs.

[0081] Após o paciente ter recebido a aplicação do Fs, o local a ser tratado deve ser irradiado com luz. Qualquer tipo de luz que seja absorvido pelo Fs pode ser utilizado incluindo luz coerente monocromática de laser nas regiões do vermelho e do azul ou luz policromática incluindo fontes luminosas elétricas ou LEDs.

[0082] As infermidades que podem ser tratadas são todas aquelas que se utilizam do princípio da PDT incluindo cânceres, combate a infecções microbianas e virais, degenerescência da mácula ligada a idade, bio-estimulação da pele e de folículos pilosos.

[0083] A composição farmacêutica da presente invenção compreende: a) pelo menos um composto de acordo com a fórmula geral (I):

[0084] Onde:

[0085] R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8 e R9 são, independentemente, escolhidos do grupo que compreende H, CH3, CH2-CH3, e (CH2)2j

[0086] n é um número inteiro entre 1 e 20;

[0087] X é escolhido do grupo que compreende O, NH e S; e

[0088] Y é escolhido do grupo que compreende N(CH3)2, N+(CHs)3, SO3H, SO3-, PO3H, PO3-, SH,S‘,Si(O(CH2)nCH3, ácidos carboxílicos, carboidratos, aminoácidos, peptídeos, oligopeptídeos, nucleotídeos, ácidos nucléicos e mistura dos mesmos; e

[0089] um veículo farmaceuticamente aceitável;

[0090] Adicionalmente, os nitrogénios centrais da porfirina podem ser metalados com zinco ou paládio. Exemplo 1. Obtenção dos derivados porfirínicos anfifílicos a) As metaloporfirinas de Cu2+ não formam estado triplete, pois o estado excitado Si apresenta tempo de vida curto devido a decaimentos não radiativos através dos níveis vibracionais dos orbitais d vazios do Cu2+, que é paramagnético liberam a energia absorvida na forma de calor. Portanto, as Cu2+- porfirinas não são bons Fs para PDT e é necessário remover os íons Cu2+ paraobter estruturas com aplicação em PDT.A interação entre Cu2+ e o anel porfirínico é relativamente estável.

[0091] Nesta invenção, a desmetalação foi realizada através de três diferentes métodos: eliminação com ácido sulfúrico concentrado (método 1); eliminação com 30% ácido sulfúrico em ácido trifluoroacético (método 2) e um terceiro método (método 3), no qual a porfirina foi refluxada com HCI saturado em metanol previamente seco. Desta forma, a eliminação do Cu+2 foi acoplado à esterificação dos carboxilatos facilitando a transferência para um solvente orgânico e diminuindo a eficiência de re-metalação que ocorre em meio aquoso.

[0092] Os ensaios foram realizados com fração das amostras pré- purificadas por partição em diclorometano. Os resultados (Tabela 1) mostram uma maior taxa de eliminação do ion Cu2+ no procedimento de desmetalação com HCI em MeOH, sendo este processo superior à eliminação por ácido sulfúrico concentrado e muito superior à desmetalação com 30% de ácido sulfúrico em ácido trifluoroacético. Para que o processo de desmetalação fosse mais efetivo, este foi repetido por três vezes consecutivas e a amostra foi purificada por cromatografia em coluna. O processo global mostrou em torno de 80% de rendimento.Tabela 1: Comparação dos métodos de eliminação do íon Cu2+ de Cu2+- clorofilina

*Desvio padrão (n= 3 medidas)

[0093] A trimetoxiclorofilina foi hidrolisada com HCI/H2O para a obtenção da clorofilina (reação B, Figura 1B). As carboxilas foram transformadas em cloreto de ácido com cloreto de oxalila (reação C, Figura 1B). Em seqüência efetuou-se uma substituição do Cl por 3-Dimetilamino-1-propilamina para obtenção de ChINpNA (reação D, Figura 1B), que foi metilada com CH3I para formação do quaternário ChINpNI (reação E, Figura 1B).

[0094] Os compostos foram purificados por cromatografia em coluna utilizando alumina como fase estacionária e um gradiente de diclorometano/metanol como eluente. O rf de 0,6 para ChINpNI foi determinado em TLC com gel de sílica como suporte e diclorometano/metanol 20:1 como eluente. Exemplo 2. Caracterização dos compostos formados a) Os compostos sintetizados e purificados foram caracterizados por espectroscopia eletrônica (Uv-vis e fluorescência), vibracional infravermelho FTIR, espectrométrica de massas, usando a técnica de spray de elétrons para a ionização e RMN a 500 MHz. Os espectros de 1H e 13C foram determinados usando as técnicas unidimensional e bidimensional, cosy e hetcorr (vide dados citados abaixo). Vale notar que devido a estes compostos apresentarem uma parte apoiar considerável (anel porfirínico) e as cargas estarem situadas todas do mesmo lado e na periferia da molécula, estes apresentam características anfifílicas favoráveis para interação com membranas (Figura 1). ChINpNA: IV: C=O, 1661 cm-1, Massa: Pico base 648,7, para (C37H44N8O3) RMN de 1H (500 MHz CDCI3): ÔH 10,09 (s,1H, CH; 10) 9.67 (s,1H, CH; 20) 8.77 (s, H, CH; 5) 7.99 (m, 1H, 31) 6.46-6.36 (m,2H, 32) 4,09 (2H, CH2, 151) 4,07 (2H, CH2, 171) 3,58(2H, CH2, 172) 3.37-3.27 (3s, 12H, CH3, 21,71 e 121) 2,99-2,86 (m, OCNÇH2CH2CH2N) 2,40(OCNCH2CH2ÇH2N) 2.131 e 2.132 (6s, 6CH3, -N(CH3)2) 1,64; 1,63 e 1,62(OCNCH2ÇH2CH2N) 1,56 (t, 3H,CH3, 82) -2.3(s, 2H, H-pirrol) RMN de 13C (500 MHz CDCI3): 191,65; 185.04 e 173.35 (OCN) 58,45; 58,32 e 58,13(CNCCÇH2N(CH3)2) 45,45; 45,32; 45,23; 45,21 e 44,98 (6C, 6CH3, N(CH3)2) 31,08 (3C, OCNÇH2CH2CH2N) 38,01(1C, CH2,151) 32,1(1C, CH2, 172) 29,89 (OCNCH2ÇH2CH2N(CH3)3) 25,96(C,CH2, 81) 22,87 (1C, CH2, 171) 19,94; 14,46; 14,29; 12,20 (4C, CH3, 21, 82, 121 e 181). ChINpNI: IV C=O 1657 cm'1 Massa: 1021 m/z para M- (3I‘) RMN de 1H (500 MHz DMSO D6): ÔH 9.35 (s,1H, CH; 10) 9.02 (s,1 H, CH; 5) 8.48, 1H, CH; 20) 8,14-8,08(m, 1H, CH; 31) 6,12-6,08( m, 2H, 32) 4,21 (2H, CH2, 151) 4,02 (2H, CH2, 171) 3,43(2H, CH2, 81) 3,31 (2H, CH2, 172) 3.39 (9s, 9CH3, N+(CH3)3) 3,14; 3,12 e 3,10 (4s, 12H, CH3, 21,71 e 121) 3,09-3,07 (m, OCNÇH2) 2,90-2,77 (OCNCH2CH2ÇH2N) 2,06-1,78 (OCNCH2ÇH2CH2N) 1,83 (t, 3H,CH3, 82) -2.38(s, 2H, H-pirrol) RMN de 13C (500 MHz DMSO DΘ): 172,49 e 161,48(OCN) 63,55; 63,41 e 62,41 (CNCCCH2N(CH3)2) 52,49; 52,46; 52,44; 52,35; 52,32 e 52,30 (9C, 9CH3, N+(CH3)3) 36,25; 35,50 e 34,20 (3C, OCNÇH2CH2CH2N) 35,25(1 C, CH2,151) 35,50(1 C, CH2, 172) 22,97; 22,11 e 19,36 (OCNCH2ÇH2CH2N(CH3)3) 22,87(1 C, CH2, 171) 19,94(C,CH2, 81) 17,27; 14,18; 13,98 e 13,91 (4C, CH3, 21, 82, 121 e 181).

Exemplo 2.1. Propriedades fotofísicas dos derivados anfifílicos porfirínicos obtidos.

[0095] Os espectros UV-vis dos derivados da clorofilina e 0 espectro do composto de partida Cu2+-clorofilina estão apresentados na Figura 2. Quando comparamos os espectros UV-vis observa-se um deslocamento para o azul da banda soret, para os derivados ChlnpnA e Chlnpnl. A banda de 625 nm de Cu2+- clorofilina foi deslocada para 651 nm em ChlnpnA e 650 nm em Chlnpnl. Este deslocamento ocorreu devido à eliminação dos íons Cu2+. O máximo de absorção dos compostos sintetizados está posicionado na janela terapêutica, justificando o grande potencial destes compostos de atuarem como eficientes Fs para PDT. O espectro de fluorescência (Figura 3) mostra que ambos os compostos, apresentam fluorescência na região de 630-680 com um pequeno rendimento quântico de fluorescência de 1,4% e 1,3% para ChlnpnA e Chlnpnl, respectivamente. Estes rendimentos quânticos de fluorescência pequenos sugerem grande eficiência de formação de espécies tripletes e consequementemente de formação de oxigênio singlete.

[0096] O espectro de emissão no Infravermelho próximo a partir da fotoexcitação de solução da ChINpNA apresenta máximo em 1270 nm, caracterizando a geração de oxigênio singlete (Figura 4). Espectros semelhantes de oxigênio singlete foram obtidos através fotoexitação de Chlnpnl. O 1O2 também foi caracterizado através do tempo de vida em metanol (~10 JJ,S) e o rendimento quântico foi determinado por comparação direta entre a intensidade do transiente emitido pelos novos compostos e do emitido por hematoporfirina IX (Hp IX), tomado com padrão (Tabela 2).

[0097] Os novos compostos atuam como bons fotossensibilizadores, conduzindo há um bom rendimento quântico de formação de oxigênio singlete (ψΔ) acima de 50%. Vale ressaltar que estes compostos também absorvem na janela terapêutica, são de fácil obtenção e de baixo custo.Tabela 2: Absorção em 532nm, intensidade de emissão em 1270nm e rendimento quântico de formação de oxigênio singlete em metanol.

Exemplo 3. Avaliação da ligação em membranas e em células dos derivados anfifílicos das porfirinas. a) Outra propriedade fundamental dos Fs para serem eficientes em PDT é a interação com membranas. O parâmetro mais utilizado para avaliar a ligação em membranas, é a partição octanol água, usualmente expresso na forma logarítimica (logPo/a). A variação do logPo/a em função do pH (Figura 5) mostra que os compostos ChINpNA e ChINpNI apresentam logPo/a entre -1.5 e 1 em todos os pHs, o que é considerado ideal para aplicação in-vivo, sendo que o ChINpNA apresenta maior lipossolubilidade e ChINpNI é mais hidrossolúvel.

[0098] Os ensaios de incorporação em lipossomo foram efetuados em pH 7,2. A Figura 6 apresenta as taxas de incorporação em lipossomos, mitocôndrias e células.Os resultados mostram uma ótima taxa de incorporação para ambos os compostos ensaiados nos três sítios de incorporação. Em lipossomos ChINpNA apresenta 28% de incorporação e ChINpNI 48%, mostrando que o composto catiônico (ChINpNI) tem uma afinidade superior com os lipossomos de cargas opostas e bastante superior ao observado para Hp IX (em torno de 2,5%). A incorporação em mitocôndrias é semelhante para ambos os compostos (58% de incorporação para ChINpNA e 61% para ChINpNI), provavelmente devido a protonação do derivado de amina no espaço entre-membranas das mitocôndrias. A incorporação em células é também bastante expressiva (11% para ChINpNA e 13% para ChINpNI), compado com 1,7% para a Hp IX. Foideterminada uma pequena tendência de maior incorporação do ChINpNI em células e em mitocôndrias. De forma geral estes compostos apresentam características favoráveis à interação com sistemas biológicos, podendo ser incorporados em células e organelas e atraídos mais intensamente por sítios com potencial negativo, tais quais os das mitocôndrias. Os resultados de incorporação das porfirinas ChINpNA e ChINpNI são muito superiores do que os da HP IX.

Exemplo 4. Avaliação da toxicidade e da fototoxicidade

[0099] A maneira de testar a real eficiência de um Fs para PDT é testar a fototoxicidade em modelos celulares.A citotoxicidade e a fototoxicidade foram determinadas em células HeLa, em experimentos realizados em triplicatas. Nos experimentos de citotoxicidade, não foi observada toxicidade significativa para ambas as drogas ensaiadas na concentração de 20 piM, sendo que as diferenças entre viabilidade das células incubadas com as drogas e as células controle se encontram dentro do desvio padrão. a) Para a determinação da fotocitotoxicidade, além do controle na ausência do fotossensibilizador também foi realizada uma análise comparativa com azul de metileno, composto com fotocitotoxicidade conhecida. O azul de metileno foi tomado como referência, visto que é uma droga cuja atividade em PDT está bem estabelecida e ambas as drogas (azul de metileno e as porfirinas aqui ensaiadas) podem ser irradiadas no mesmo comprimento de onda, permitindo uma comparação direta.

[00100] A incubação com azul de metileno e irradiação resultou em 88 % de morte celular com desvio padrão de 1 %. Para os novos Fs, observou-se 92% de morte celular com 3% de desvio padrão para ChINpNA (grupo funcional amina) e 95% com desvio padrão de 1% para o composto catiônico, ChINpNI (Figura 7). Este dado bruto sugere que estes novos compostos apresentam fotoatividade semelhante à do Azul de metileno, o que já é um bom resultado, considerando que AM é já estabelecido como um bom Fs em PDT. No entanto, é importante comparar a quantidade de fótons absorvidas em cada situação para poder comparar a eficiência quântica de morte celular de cada Fs. Pode-se estimar o fator de absorção (fração de luz absorvida por um meio qualquer, (a =1-10'Abs) utilizando o ε de cada composto, a percentagem de incorporação nas células e a concentração utilizada, que foi constante para todos os Fs e igual a 20p,M. O ε do azul de metileno em 650nm é igual a 68000 M'1cm'1. O ε das porfirinas neste comprimento de onda é 3584 e 3797 para ChINpNI e ChINpNA, respectivamente.

[00101] A fração de incorporação em células HeLa é 70% para AM (Oliveira, C.S.Tese de Doutorado - Instituto de Química - Universidade de São Paulo 2006.), 61% para ChINpNI e 58% para ChINpNA. Multiplicando-se a fração de incorporação pela concentração e pelo ε, obtem-se os valores de absorção, e utilizando estes na equação 1 obtem-se os fatores de absorção que são 0,9 para suspensão de células tratadas com AM; 0,09 para células tratadas com ChINpNI e 0,09 para células tratadas com ChINpNA. Ou seja, as células tratadas com as novas porfirinas absorvem 10 vezes menos fótons do que aquelas tratadas com AM. Conseqüentemente, as novas porfirinas induzem morte celular muito mais frequentemente por fóton absorvido.A razão desta diferença deve ser devido a diversos fatores, incluindo, citolocalização e eficiência fotodinâmica intracelular. Cabe mencionar que o AM pode ser reduzido no ambiente celular, tendo atividade fotodinâmica diminuída, o que não acontece com as porfirinas.

[00102] A rota sintética proposta forneceu novos compostos químicos com estrutura molecular inédita e com excelentes propriedades fotofísicas, de interação com membranas e de fotoatividade, suplantando as deficiências de Fs de baixo custo disponíveis. Espera-se assim que estes compostos possam ser utilizados em diversas enfermidades tratáveis por PDT para o benefício da população em geral.

Claims

1. Derivados porfirínicos caracterizados por compreenderem estrutura de acordo com a fórmula geral (I):

onde: R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8 e R9 são, independentemente, escolhidos do grupo que compreende H, CH3, CH2-CH3, e (CHΣJΣ; n é um número inteiro entre 1 e 20; X é escolhido do grupo que compreende O, NH e S; e Y é escolhido do grupo que compreende N(CH3)2, N+(CH3)3, SO3H, SOs', PO3H, PO3-, SH,S',Si(O(CH2)nCH3, ácidos carboxílicos, carboidratos, aminoácidos, peptídeos, oligopeptídeos, nucleotídeos, ácidos nucléicos e mistura dos mesmos.

2. Derivados, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por R1, R4, R7 e R9 serem CH3; R2, R5 e R8 serem H; R3 ser CH2CH3; R6 ser (CH2)2; X ser NH; n ser 3 e Y ser escolhido dentre N+(CH3)3 e N(CH3)2.

3. Derivados de acordo com as reivindicações 1 e 2 caracterizado pelo fato dos nitrogénios centrais da porfirina serem metalados com zinco ou paládio.

4. Processo de obtenção de derivados porfirínicos definidos nas reivindicações 1 a 3, caracterizado por compreender as etapas de: a) Desmetalação e esterificação de um composto porfirínico; b) Hidrólise em meio ácido ou básico; c) Formação de cloretos de acila; e d) Reação com grupo funcional de fórmula (II): Z-(CH2)n - Y (II) onde: n é um número inteiro entre 1 e 20; Z é escolhido do grupo que compreende OH, NH2 e SH; e Y é escolhido do grupo que compreende N(CH3)2, N+(CH3)3, SO3H, SOs’, PO3H, PO3-, SH,S',Si(O(CH2)nCH3, carboidratos, aminoácidos, peptídeos, oligopeptídeos, nucleotídeos, ácidos nucléicos e mistura dos mesmos..

5. Processo, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pela etapa de desmetalação ser realizada com ácido sulfúrico concentrado.

6. Processo, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pela etapa de desmetalação ser realizada com aproximadamente 30% ácido sulfúrico em ácido trifluoroacético.

7. Processo, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pela etapa de desmetalação ser realizada com refluxo de HCI saturado em metanol.

8. Processo, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pela formação de cloretos de acila ser realizada com cloreto de oxalila.

9. Processo, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo grupo funcional possuir estrutura onde Z é NH2, n é 3 e Y é N(CHs)2.

10. Processo, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por compreender uma etapa adicional de metalação do anel porfirínico com zinco ou paládio.

11. Composição farmacêutica caracterizada por compreender: a) pelo menos um composto definido nas reivindicações 1 a 3, de acordo com a fórmula geral (I):

onde: R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8 e R9 são, independentemente, escolhidos do grupo que compreende H, CH3, CH2-CH3, e (CH2)2; n é um número inteiro entre 1 e 20; X é escolhido do grupo que compreende O, NH e S; e Y é escolhido do grupo que compreende N(CH3)2, N+(CH3)3, SO3H, SO3', PO3H, PO3-, SH,S',Si(O(CH2)nCH3, ácido carboxílico, carboidratos, aminoácidos, peptídeos, oligopeptídeos, nucleotídeos, ácidos nucléicos e mistura dos mesmos; e b) um veículo farmaceuticamente aceitável;

12. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 11, caracterizada por R1, R4, R7 e R9 serem CH3; R2, R5 e R8 serem H; R3 ser CH2CH3; R6 ser (CH2)2; X ser NH; n ser 3 e Y ser escolhido dentre N+(CH3)3 e N(CH3)2.

13. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pelo fato dos nitrogénios centrais da porfirina serem metalados com zinco ou paládio.

13. Uso de um composto definido nas reivindicações 1 a 3, -de acordo com a fórmula geral (I):

onde: R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8 e R9 são, independentemente, escolhidos do grupo que compreende H, CH3, CH2-CH3, e (CH2)2j n é um número inteiro entre 1 e 20; X é escolhido do grupo que compreende O, NH e S; e Y é escolhido do grupo que compreende N(CH3)2, N+(CH3)3, SO3H, SOs", PO3H, PO3-, SH,S-,Si(O(CH2)nCH3, carboidratos, aminoácidos, peptídeos, oligopeptídeos, nucleotídeos, ácidos nucléicos e mistura dos mesmos; caracterizado por ser na manufatura de um medicamento para terapia fotodinâmica.

14. Uso, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de os nitrogénios centrais da porfirina serem metalados com zinco ou paládio.