BRPI0721170A2

BRPI0721170A2 - Métodos e composições para tratar patologias relacionadas a fibrose relacionada a il-4 ou il-13

Info

Publication number: BRPI0721170A2
Application number: BRPI0721170-8A
Authority: BR
Inventors: Lynne A Murray
Original assignee: Centocor Ortho Biotech Inc
Priority date: 2006-12-15
Filing date: 2007-12-13
Publication date: 2014-03-18
Also published as: AU2007334022A1; IL199347A0; CN101646465A; WO2008076784A3; CA2672878A1; JP2010513301A; EP2125037A2; US20100008914A1; ZA200904921B; EA200970588A1; WO2008076784A2; KR20090101924A; MX2009006457A

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MÉTODOS E COMPOSIÇÕES PARA TRATAR PATOLOGIAS RELACIONADAS A Fl- BROSE RELACIONADA A IL-4 OU IL-13".

Campo da Invenção

A presente invenção refere-se a composições e métodos para tratar ao menos uma patologia relacionada à fibrose relacionada a IL-4 ou IL- 13, incluindo composições terapêuticas, formulações, administração e dispo- sitivos. Este pedido incorpora inteiramente a título de referência U.S. 60/870.105, depositado em 15 de Dezembro de 2006.

Antecedentes da Invenção

A interleuquina-4 é uma citoquina pleitrópica derivada de células T e mastócitos com múltiplos efeitos biológicos em células B, células T e muitas células não linfóides incluindo manócitos, células endoteliais e fibro- blastos. Ela induz a secreção de IgGI e IgE por células B de ratos e lgG4 e IgE por células B humanas. A produção dependente de IL4 de IgE e possi- velmente IgGI e lgG4 é devida à comutação de isotipo induzida por IL4. Em humanos, IL4 compartilha essa propriedade com IL13. A estrutura tridimen- sional de IL4 foi determinada por RMN e cristalografia de raios-X. Ela tem uma estrutura globular compacta com um núcleo predominantemente hidro- fóbico. Um feixe de quatro hélices α com as hélices dispostas em um feixe antiparalelo à esquerda com duas conexões por cima contendo uma lâmina β antiparalela de dois filamentos até a maior parte da molécula. A estrutura é similar a GM-CSF, M-CSF e IL-3.

A interleuquina 13 (IL-13) é secretada por células T ativadas e inibe a produção de citoquinas inflamatórias (IL1, IL6, TNF, IL8) por monóci- tos estimulados por LPS. IL13 de ratos e humanos induzem a expressão de CD23 em células B humanas, promovem a proliferação de célula B em com- binação com anticorpos CD40 ou anti-lg, e estimulam a secreção de IgM, IgE e lgG4. IL13 também foi mostrado por prolongar a sobrevida de monóci- tos humanos e aumentar a expressão de superfície de MHC classe Il e CD23. A estrutura cristalina não foi determinada, mas um modelo molecular teórico foi construído. Ambas IL-4 e IL-4 ou IL-13 são proteínas terapeutica- I

mente importantes com base em suas funções biológicas. IL-4 foi mostrada como sendo capaz de inibir as doenças autoimunes, e ambas IL-4 e IL-4 ou IL-13 mostraram potenciais para otimizar as respostas imunes antitumor. Por outro lado, como ambas as citoquinas estão envolvidas na patogênese de 5 doenças alérgicas, o antagonista dessas citoquinas precisam potencialmente fornecer benefícios terapêuticos para alergia e asma alérgica.

Anticorpos (Mabs) policlonais (por exemplo, antissoro) e/ou mo- noclonais, quiméricos, não humanos e fragmentos (por exemplo, produtos de digestão proteolíticos desses) são potenciais agentes terapêuticos que 10 estão sendo desenvolvidos em alguns casos para tentar tratar certas doen- ças. Entretanto, tais anticorpos que compreendem partes não humanas pro- duzem uma resposta imune quando administrados a humanos. Tal resposta imune pode resultar em uma liberação mediada por complexos imunes dos anticorpos a partir da circulação, e fazer administração repetida inadequada 15 para terapia, desse modo reduzindo o benefício terapêutico ao paciente e limitando a readministração da proteína derivada de lg. Por exemplo, a ad- ministração repetida de anticorpos compreendendo partes não humanas po- de levar à doença do soro e/ou anafilaxia. De modo a evitar esses e outros tais problemas, um número de abordagens foi obtido para reduzir a imuno- 20 genicidade de tais anticorpos e partes desses, incluindo quimerização e “humanização”, como bem conhecido na técnica. Essas abordagens produzi- ram anticorpos tendo reduzido a imunogenicidade, mas com outras proprie- dades menos desejáveis.

Consequentemente, há uma necessidade de fornecer métodos e composições para tratar ao menos uma patologia relacionada à fibrose rela- cionada a IL-4 ou IL-13.

Sumário da Invenção

A presente invenção fornece métodos e composição para tratar ao menos uma patologia relacionada à fibrose relacionada a IL-4 ou IL-13 usando ao menos uma proteína derivada de Ig humano anti-IL-4 ou IL-13 (proteínas derivadas de Ig), incluindo imunoglobulinas, proteínas de fusão de receptor, orodutos de clivagem e outras partes específicas e variantes des- sas, bem como composições de proteína derivadas de Ig anti-IL-4 ou IL-13, ácidos nucléicos complementares ou codificados, vetores, células hospedei- ras, composições, formulações, dispositivos, animais transgênicos, plantas transgênicas, e métodos de fazer e usar esses, como descrito e habilitado 5 aqui, em combinação com o que é conhecido na técnica, para uso em tratar ao menos uma patologia relacionada à fibrose relacionada a IL-4 ou IL-13.

A presente invenção adicionalmente fornece qualquer invenção descrita aqui, e não é limitada a qualquer descrição particular, modalidade ou exemplo fornecido aqui.

Descrição da Invenção

A presente invenção adicionalmente fornece ao menos uma pro- teína derivada de Ig relacionada a IL-4 ou IL-13, parte específica ou variante em um método ou composição, quando administrada em uma quantidade terapeuticamente eficaz, para tratar ou reduzir ao menos um sinal ou sinto- 15 ma de ao menos uma condição ou doença relacionada à fibrose relacionada a IL-4 ou IL-13 em uma célula, tecido, órgão, animal ou paciente e/ou, como necessário em muitas condições diferentes, tal como, mas não-limitado a, antes de, subsequente a, ou durante uma doença relacionada ou condição de tratamento, como conhecido na técnica e/ou como descrito aqui. Exem- 20 pios não-limitantes de condições relacionadas à fibrose que podem ser tra- tadas de acordo com a presente invenção, incluem doença pulmonar inters- ticial, escleroderma, fibrose hepática, fibrose renal, sarcoidose, cicatriz hiper- trófica, cicatriz quelóide, fibrose cardíaca, degeneração macular relacionada à idade, ou doença vascular do colágeno.

A presente invenção também fornece ao menos um método para

tratar uma condição relacionada à fibrose relacionada a IL-4 ou IL-13 em uma célula, tecido, órgão ou animal, compreendendo contatar ou administrar uma quantidade eficaz modulando uma condição relacionada à fibrose de ao menos uma proteína derivada de Ig humana relacionada a IL-4 ou IL-13 30 com, ou para, a dita célula, tecido, órgão ou animal, opcionalmente onde o dito animal é um primata, opcionalmente um macaco ou um humano. O mé- todo oode ademais opcionalmente incluir onde a dita quantidade eficaz é I

0,001 a 100 mg/quilograma das ditas células, tecido, órgão ou animal. Tal método pode ademais incluir onde o dito contato ou a dita administração é por ao menos um modo selecionado a partir de intravenosa, intramuscular, bolus, intraperitoneal, subcutânea, respiratória, inalação, nasal, vaginal, re- 5 tal, bucal, sublingual, intranasal, subdérmica, ou transdérmica.

A invenção também inclui ao menos uma formulação compreen- dendo ao menos uma proteína derivada de Ig humana relacionada a IL-4 ou IL-13, e ao menos um selecionado a partir de água estérila, água tamponada estérila, ou ao menos um conservante selecionado a partir do grupo que 10 consiste em fenol, m-cresol, p-cresol, o-cresol, clorocresol, benzila álcool, alquila parabeno, cloreto de benzalcônio, cloreto de benzetônio, de- hidroacetato de sódio e timerosal, ou misturas desses em um diluente aquo- so, opcionalmente, onde a concentração de proteína derivada de Ig humana relacionada a IL-4 ou IL-13 é aproximadamente 0,1 mg/ml a aproximada- 15 mente 100 mg/ml, adicionalmente compreendendo ao menos um agente de isotonicidade ou ao menos um tampão fisiologicamente aceitável.

A invenção também inclui ao menos uma formulação compreen- dendo ao menos uma proteína derivada de Ig humana relacionada a IL-4 ou IL-13 de acordo com a forma Iiofilizada em um primeiro recipiente, e um se- 20 gundo recipiente compreendendo ao menos um de água estérila, água tam- ponada estérila, ou ao menos um conservante selecionado a partir do grupo que consiste em fenol, m-cresol, p-cresol, o-cresol, clorocresol, benzila álco-

ol, alquila parabeno, cloreto de benzalcônio, cloreto de benzetônio, de- hidroacetato de sódio e timerosal, ou misturas desses em um diluente aquo- 25 so, opcionalmente, ademais onde a concentração de proteína derivada de Ig humana relacionada a IL-4 ou IL-13 é reconstituída a uma concentração de aproximadamente 0,1 mg/ml a aproximadamente 500 mg/ml, adicionalmente compreendendo ao menos um agente de isotonicidade, ou adicionalmente compreendendo um tampão fisiologicamente aceitável.

A invenção ainda fornece ao menos um método para tratar ao

menos uma condição mediada por IL-4 ou IL-13, compreendendo adminis- trar a um paciente em necessidade desse uma formulação da invenção. Tais proteínas derivadas de Ig podem opcionalmente incluir pro- teínas de fusão de anticorpo ou de receptor que bloqueiam a ligação de IL-4 ou IL-13 a ao menos um de seus receptores e compreendem 3 ou mais, tal como, 3, 4, 5, 6, ou 7 dos seguintes critérios.

Critérios

1. Liga-se a ao menos um recombinante humano de ocorrência natu- ral ou IL-4 ou IL-13, receptor de IL-4 ou IL-13 e/ou outra muteína relacionada a IL-4 ou IL-13 específica, por exemplo, mas não-limitada a, ao menos um de Ile48, Val48, Gln90, Glu90, Leu95, Ile95, Leu96, Ile96, Leu99, Ile99,

Phe103, Tyr103, Asn130 e/ou Gln130, como aminoácidos 1 a 145, tal como, mas não-limitados a ao menos um de 1-10, 10-20, 20-30, 30-40, 40-50, 50- 60, 60-70, 70-80, 80-90, 90-100, 100-110, 110-120, 120-130, 130-140, e/ou 140-145 de SEQ ID NO: 42, 43 ou 44 (em ELISA).

2. É específico para ligação a IL-13 ou IL-4 ou receptor de IL-13 hu-

mano recombinante de ocorrência natural, e não a GM-CSF humano, uma

citoquina estruturalmente relacionada (em ELISA).

3. Inibe a interação de IL-13 humano recombinante de ocorrência na- tural preferencialmente com o receptor de IL-4 ou IL-13 humano ou um re- ceptor de IL-4 ou IL-13 animal adequado com um ND50 ^ 10 nM.

4. Inibe a proliferação dependente de IL-4 ou IL-13 humano de ocor-

rência natural de células TF-1 de tumor humano mais do que um controle negativo.

5. Tem um Kd aparente para IL-13 humano de ocorrência natural ou mutante específico < 0,5 nM (como determinado por BIAcore).

6. Inibe a produção de IgE in vitro dependente de IL-4 ou IL-13 huma-

na recombinante de ocorrência natural em células B humanas, mais inibição do que um controle negativo, bem como ensaio B9.

7. Reage cruzado com IL-13 humano de ocorrência natural nativo com potência similar a de IL-4 ou IL-13 recombinante, como pode ser determina-

do em ensaio B9 e/ou ELISA. »

A presente invenção adicionalmente fornece composições, for-

í

mulações, métodos, dispositivos, e usos de tais proteínas derivadas de Ig anti-IL-4 ou IL-13, incluindo para usos terapêuticos e diagnósticos.

A presente invenção adicionalmente fornece proteínas derivadas 5 de Ig que são adequadas para tratar ao menos uma condição relacionada à fibrose relacionada a IL-4 ou IL-13 bloqueando a ligação de IL-4 ou IL-13 a um ou mais de seus receptores.

A presente invenção fornece proteínas derivadas de Ig relaciona- das a IL-4 ou IL-3 sintéticas e/ou recombinantes, isoladas ou partes ou vari- 10 antes específicas, bem como composições e moléculas de ácido nucléico codificado compreendendo ao menos um polinucleotídeo codificando ao menos uma proteína derivada de Ig relacionada a IL-4 ou IL-13. Tais proteí- nas derivadas de Ig ou partes ou variantes específicas da presente invenção compreendem seqüências de proteínas derivadas de Ig de comprimento to- 15 tal, domínios, fragmentos, e variantes específicas desses, e métodos de fa- zer e usar os ditos ácidos nucléicos e proteínas derivadas de Ig ou partes ou variantes específicas, incluindo composições terapêuticas, métodos e dispo- sitivos.

Como usado aqui, uma “proteína derivada de Ig anti-IL-4 ou IL- 20 13”, “parte de proteína derivada de Ig anti-IL-4 ou IL-13", “fragmento de pro- teína derivada de Ig anti-IL-4 ou IL-13”, “variante de proteína derivada de Ig anti-IL-4 ou IL-13”, “proteína derivada de Ig relacionada a IL-4 ou IL-13”, “parte de proteína derivada de Ig relacionada a IL-4 ou IL-13”, “fragmento de proteína derivada de Ig relacionada a IL-4 ou IL-13” e/ou “variante de proteí- 25 na derivada de Ig relacionada a IL-4 ou IL-13” e seus similares diminui, blo- queia, inibe, anula, ou interfere com a atividade da proteína relacionada a IL-

4 ou IL-13, ligação ou atividade de receptor de proteína relacionada a IL-4 ou IL-13 ou ligação in vitro, in situ e/ou preferencialmente in vivo, e adicional- mente compreende ao menos 3 a 7 dos critérios acima.

Por exemplo, uma proteína adequada derivada de Ig relacionada

a IL-4 ou IL-13, parte ou variante específica da presente invenção pode se ligar a ao menos uma proteína ou receptor relacionado a IL-4 ou IL-13 e in- clui proteínas derivadas de Ig anti-IL-4 ou IL-13, fragmentos de ligação com antígeno desses, e partes específicas, variantes ou domínios desses que se ligam especificamente a IL-4 ou IL-13. Uma proteína derivada de Ig relacio- nada a IL-4 ou IL-13 adequada, parte ou variante específica podem também 5 diminuir, bloquear, anular, interferir, prevenir e/ou inibir RNA de proteína re- lacionada a IL-4 ou IL-13, DNA ou síntese de proteína, liberação de proteína relacionada a IL-4 ou IL-13, sinalização de receptor ou proteína relacionada a IL-4 ou IL-13, clivagem de proteína relacionada a IL-4 ou IL-13 em mem- brana, atividade relacionada a IL-4 ou IL-13, produção e/ou síntese de prote- 10 ína relacionada a IL-4 ou IL-13, por exemplo, como descrito aqui ou como conhecido na técnica.

As proteínas derivadas de Ig anti-IL-4 ou IL-13 (também chama- das proteínas derivadas de Ig anti-IL-4 ou anti-IL-13) úteis nos métodos e composições da presente invenção são caracterizadas por ligação de alta 15 afinidade a proteínas relacionadas a IL-4 ou IL-13, e opcionalmente e prefe- rencialmente tendo baixa toxicidade. Em particular, uma proteína derivada de Ig, fragmento específico ou variante da invenção, onde os componentes individuais, tal como a região variável, região constante e estrutura, individu- al e/ou coletiva, opcional e preferencialmente possui baixa imunogenicidade, 20 é útila na presente invenção. As proteínas derivadas de Ig que podem ser usadas na invenção são opcionalmente caracterizadas por sua capacidade de tratar pacientes por períodos estendidos com bom a excelente alívio dos sintomas e baixa toxicidade. A baixa imunogenicidade e/ou baixa afinidade, bem como outras propriedades adequadas, podem contribuir para os resul- 25 tados terapêuticos alcançados. “Baixa imunogenicidade” é definida aqui co- mo o aumento das respostas HAHA, HACA, ou HAMA significativas é menos de aproximadamente 75%, ou preferencialmente menos de aproximadamen- te 50% dos pacientes tratados e/ou aumento de baixas concentrações no paciente tratado (menos de aproximadamente 300, preferencialmente menos 30 de aproximadamente 100 medido com um enzima imunoensaio com antíge- no duplo) (Elliott e outros, Lancet 344: 1125 - 1127 (1994)), cada uma das referências acima inteiramente incorporada aqui a título de referência. Utilidade

Os ácidos nucléicos isolados da presente invenção podem ser usados para a produção de ao menos uma proteína derivada de Ig relacio- nada a IL-4 ou IL-13, fragmento ou variante específica dessa, que pode ser 5 usado para agir em uma célula, tecido, órgão, ou animal (incluindo mamífe- ros e humanos), para modular, tratar, aliviar, auxiliar a prevenir a incidência, reduzir os sintomas de ao menos uma condição relacionada a IL-4 ou IL-13.

Tal método pode compreender administrar uma quantidade efi- caz de uma composição ou uma composição farmacêutica compreendendo 10 ao menos uma proteína derivada de Ig relacionada a IL-4 ou IL-13 ou parte específica ou variante a uma célula, tecido, órgão, animal ou paciente em necessidade de tal modulação, tratamento, alívio, prevenção, ou redução nos sintomas, efeitos ou mecanismos. A quantidade eficaz pode compreen- der uma quantidade de aproximadamente 0,001 a 500 mg/kg por única ou 15 múltipla administração, ou para alcançar uma concentração de soro de 0,01 a 5000 pg/ml por única ou múltipla administração, ou qualquer faixa ou valor eficaz nesta, como feito e determinado usando métodos conhecidos, como descrito aqui ou conhecido nas técnicas relevantes.

Citações

Todas as publicações ou patentes citadas aqui são inteiramente

incorporadas aqui a título de referência à medida que elas mostram o estado da técnica na hora da presente invenção e/ou para fornecer a descrição e habilitação da presente invenção. As publicações referem-se a quaisquer publicações de patente ou publicações científicas, ou qualquer outra infor- 25 mação disponível em qualquer formato de mídia, incluindo todos os formatos impressos, eletrônicos ou gravados. As seguintes referências são inteira- mente incorporadas aqui a título de referência: Ausubel e outros, Ed., Cur- rent Protocols in Molecular Biology1 John Wiley & Sons, Inc., Nova Iorque, NY (1987 a 2006); Sambrok e outros, Molecular Cloning: A Laboratory Ma- 30 nual, 2a Edição, Cold Spring Harbor, NY (1989); Harlow e Lane, Ig derived proteins, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY (1989); Colligan e outros, eds., Current Protocols in Immunoloqy. John Wilev & Sons. Inc.. NY (1994-2006); Colligan e outros, Current Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, NY1 NY1 (1997 a 2006).

Proteínas Derivadas de Ig da Presente Invenção

O termo “proteína derivada de Ig” é destinado a abranger proteí- nas derivadas de Ig1 fragmentos de digestão, partes e variantes específicas dessas, incluindo miméticos de proteína derivada de Ig ou compreendendo partes de proteínas derivadas de Ig que imitam a estrutura e/ou função de um anticorpo ou fragmento específico ou parte dessas, e é também destina- do a abranger proteínas que contêm miméticos de proteínas terapêuticas, anticorpos, e fragmentos de digestão, partes e variantes específicas dessas, onde a proteína compreende ao menos uma região de ligação com Iigante de proteína relacionada a IL-4 ou IL-13 funcional (LBR) que opcionalmente substitui ao menos uma região de determinação de complementaridade (C- DR) do anticorpo a partir do qual a proteína derivada de IG1 parte ou variante é derivada. Em uma modalidade, a proteína derivada de Ig compreende ao menos uma CDR ou região de ligação alvo que especificamente se liga ao menos um alvo biologicamente ativo (por exemplo, IL-4 ou IL-13 ou receptor de IL-4 ou IL-13) e adicionalmente compreende ao menos 10 a 384 - 500 aminoácidos de ao menos uma SEQ ID NOs: 1 a 41, ou ao menos uma par- te de ao menos uma região de uma seqüência de aminoácido de cadeia leve ou pesada correspondente como descrito na Tabela 1, opcionalmente adi- cionalmente compreendendo ao menos uma substituição, inserção, ou apa- gamento como descrito nas Figuras 1 a 41 de PCT WO 05/05604, publicado em 20 de Janeiro de 2005, depositado em 17 de Junho de 2004, inteiramen- te incorporado aqui a título de referência. Tais proteínas derivadas de Ig re- lacionadas a IL-4 ou IL-13, partes ou variantes específicas incluem aqueles que imitam a estrutura e/ou função de ao menos um antagonista de proteína relacionada a IL-4 ou IL-13, tal como um anticorpo de proteína relacionada a IL-4 ou IL-13 ou receptor ou proteína ligante, ou fragmento ou análogo. Os fragmentos funcionais incluem fragmentos de ligação com antígeno que se ligam a proteínas relacionadas a IL-4 ou IL-13 ou fragmentos dessas. Por exemplo, os fragmentos de proteína derivada de Ig capazes de se Iiqar a I

proteínas relacionadas a IL-4 ou IL-13 humana ou fragmentos desses, inclu- indo, mas não-limitados a fragmentos Fab (por exemplo, por digestão de papaína), Fab’ (por exemplo, por digestão de papaína e redução parcial) e F(ab’)2 (por exemplo, por digestão de pepsina), facb (por exemplo, por di- 5 gestão de plasmina), pFc’ (por exemplo, por digestão de pepsina ou plasmi- na), Fd (por exemplo, por digestão de pepsina, redução parcial e reagrega- ção), Fv ou scFv (por exemplo, por técnicas de biologia molecular), são a- brangidos pela invenção (vide, por exemplo, Colligan, Immunology, acima).

Tais fragmentos podem ser produzidos por técnicas de clivagem enzimática, sintéticas ou recombinantes, como conhecido na técnica e/ou como descrito aqui. As proteínas derivadas de Ig podem também ser produ- zidas em uma variedade de formas truncadas usando genes de proteínas derivadas de Ig nos quais um ou mais códons de parada foram introduzidos a montante do sítio de parada natural. Por exemplo, um gene quimérico co- dificando uma parte de cadeia pesada F(ab’)2 pode ser projetado para incluir seqüências de DNA codificando o domínio CHi e/ou região de articulação da cadeia pesada. As várias partes de proteínas derivadas de Ig podem ser u- nidas quimicamente por técnicas convencionais, ou podem ser preparadas como uma proteína contígua usando técnicas de engenharia genética. Por exemplo, um ácido nucléico codificando as regiões variáveis e constantes de uma proteína derivada de Ig humana pode ser expresso para produzir uma proteína contígua. Vide, por exemplo, Colligan, Immunology, acima, seções 2.8 e 2.10, para fragmentação e Ladner e outros, Patente U.S. No. 4.946.778 e Bird, R.E. e outros, Science, 242: 423 a 426 (1988), consideran- do proteínas derivadas de Ig de cadeia única, cada publicação é inteiramen- te incorporada aqui a título de referência.

Como usado aqui, o termo “proteína derivada de Ig humana” re- fere-se a uma proteína derivada de Ig na qual substancialmente cada parte da proteína (por exemplo, CDR, LBR, estrutura, domínios CL, Ch (por exem- 30 pio, CH1, Ch2, Ch3), articulação, (VL, Vh)) é substancialmente não imunogê- nica, com somente mudanças de seqüência ou variações secundárias. Tais mudanças ou variações opcionalmente e preferencialmente retêm ou redu- zem a imunogenicidade em humanos em relação a proteínas derivadas de Ig humanas não modificadas. Assim, uma proteína derivada de Ig humana é distinta de uma Ig quimérica ou humanizada. Uma proteína derivada de Ig humana pode ser produzida por um animal não humano ou célula procarióti- 5 ca ou eucariótica que é capaz de expressar genes de imunoglobulina huma- na funcionalmente rearranjada (por exemplo, cadeia pesada e/ou cadeia le- ve). Ademais, quando uma proteína derivada de Ig humana é uma proteína derivada de Ig de cadeia única, ela pode compreender um peptídeo Iigante que não é encontrado em proteínas derivadas de Ig humana nativas. Por 10 exemplo, um Fv pode compreender um peptídeo ligante, tal como dois a a- proximadamente oito glicinas ou outros resíduos de aminoácido, que conec- ta a região variável da cadeia pesada e a região variável da cadeia leve. Tais peptídeos Iigantes são considerados como sendo de origem humana. As proteínas derivadas de Ig relacionadas a IL-4 ou IL-13 que compreendem ao 15 menos um ligante de proteína relacionada a IL-4 ou IL-13 ou receptor desse podem ser projetadas contra um ligante apropriado, tal como uma proteína isolada e/ou relacionada a IL-4 ou IL-13, ou uma parte dessa (incluindo mo- léculas sintéticas, tal como peptídeos sintéticos). A preparação de tais prote- ínas derivadas de Ig relacionadas a IL-4 ou IL-13 é executada usando técni- 20 cas conhecidas para identificar e caracterizar regiões de ligação com ligante ou seqüências de ao menos uma proteína relacionada a IL-4 ou IL-13 ou parte dessa.

As proteínas derivadas de Ig humanas que são específicas para a subunidade p40 podem ser elevadas contra um antígeno imunogênico a- 25 propriado, tal como proteína relacionada a IL-4 ou IL-13 isolada ou uma par- te dessa (incluindo moléculas sintéticas, tal como peptídeos sintéticos). A preparação de antígenos imunogênicos, e a produção de proteína derivada de Ig monoclonal podem ser executadas usando qualquer técnica adequada. Uma variedade de métodos foi descrita (vide, por exemplo, Kohler e outros, 30 Nature, 256: 495 a 497 (1975) e Eur. J. Immunol. 6: 511 a 519 (1976); Mils- tein e outros, Nature 266: 550 a 552 (1977); Koprowski e outros, Patente U.S. No. 4.172.124: Harlow. E. e D. Lane. 1988. Iq derived proteins: A Labo- ratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory: Cold Spring Harbor, NY); Current Protocols In Molecular Biology, Vol. 2 (por exemplo, Suplemento 27, Verão de 94), Ausubel, F.M. e outros, Eds., (John Wiley & Sons: Nova Ior- que, NY), Capítulo 11, (1991 a 2006)), cada um dos quais é inteiramente incorporado aqui a título de referência. Geralmente, um hibridoma é produzi- do pela fusão de uma linhagem celular imortal (por exemplo, uma linhagem celular de mieloma tal como, mas não-limitada a, Sp2/0, Sp2/0-AG14, NSO, NS1, NS2, AE-1, L.5, >243, P3X63Ag8.653, Sp2 SA3, Sp2 MAI, Sp2 SS1, Sp2 SA5, U937, MLA 144, ACT IV, MOLT4, DA-1, JURKAT, WEHI, K-562, COS, RAJI, NIH 3T3, HL-60, MLA 144, NAMAIWA, NEURO 2A, ou seus si- milares, ou heteromilomas, produtos de fusão desses, ou qualquer célula ou célula de fusão derivada desse, ou qualquer outra linhagem celular adequa- da como conhecido na técnica, vide, por exemplo, www.atcc.org, www.lifetech.com, e seus similares, cada um dos quais é inteiramente incor- porado aqui a título de referência) com células produzindo proteína derivada de Ig, tal como, mas não-limitadas a, células do baço isoladas ou clonadas, ou quaisquer outras células expressando estrutura constante ou variável de cadeia leve ou pesada ou seqüências de DNA, ou como ácido nucléico en- dógeno ou heterólogo, como DNA recombinante ou endógeno, viral, bacteri- ano, de algas, procariótico, de anfíbio, de inseto, de réptila, de peixe, de mamífero, de roedores, de eqüinos, de ovinos, de cabras, de ovelhas, de primatas, eucarióticos, genômico, cDNA, rDNA, DNA ou RNA mitocondrial, DNA ou RNA de cloroplastos, hnRNA, mRNA, tRNA, de filamento único, du- plo ou triplo, hibridizado, e seus similares ou qualquer combinação desses. Vide, por exemplo, Ausubel, acima, e Colligan, Immunology, acima, Capítulo

2, cada um inteiramente incorporado aqui a título de referência.

As células produzindo proteína derivada de Ig podem ser obtidas a partir de sangue periférico, ou preferencialmente do baço ou nódulos linfá- ticos, de humanos ou outros animais adequados que foram imunizados com 30 o antígeno de interesse. Qualquer outra célula hospedeira adequada pode também ser usada para expressar ácido nucléico heterólogo ou endógeno codificando uma proteína derivada de Iq. fragmento específico ou variante desse, da presente invenção. As células fundidas (hibridomas) ou células recombinantes podem ser isoladas usando condições de cultura seletivas ou outros métodos conhecidos adequados, e clonadas por diluição Iimitante ou classificação celular, ou outros métodos conhecidos. As células que produ- 5 zem proteínas derivadas de Ig com a especificidade desejada podem ser selecionadas por um ensaio adequado (por exemplo, ELISA).

Outros métodos adequados de produzir ou isolar anticorpos da especificidade de requisito podem ser usados, incluindo, mas não-limitados a, métodos que selecionam anticorpo recombinante a partir de uma bibliote- 10 ca de peptídeo ou proteína (por exemplo, mas não-limitada a, bacteriófago, ribossomo, oligonucleotídeo, RNA, cDNA, ou seus similares), biblioteca de exibição; por exemplo, como disponível a partir de Cambridge Antibody Te- chnologies, Cambridgeshire, Reino Unido; MorphoSys, Martinsreid/Planegg, DE; Biovation, Aberdeen, Escócia, Reino Unido; Biolnvent, Lund, Suécia; 15 Dyax Corp., Enzon, Affymax/Biosite; Xoma, Berkeley, CA; Ixsys. Vide, por exemplo, EP 368.684, PCT/GB91/01134; PCT/GB92/01755; PCT/GB92/002240; PCT/GB92/00883; PCT/GB93/00605; US 08/350260(5/12/94); PCT/GB94/01422; PCT/GB94/02662;

PCT/GB97/01835; (CAT/MRC); WO 90/14443; WO 90/14424; WO 90/14430; PCT/US94/1234; WO 92/18619; WO 96/07754; (Scripps); WO 96/13583, WO 97/08320 (MorphoSys); WO 95/16027 (Biolnvent); WO 88/06630; WO 90/3809 (Dyax); Patente US 4.704.692 (Enzon); PCT/US91 /02989 (Affymax); WO 89/06283; EP 371 998; EP 550 400; (Xoma); EP 229 046; PCT/US91/07149 (Ixsys); ou peptídeos ou proteínas estocasticamente gera- dos - US 5723323, 5763192, 5814476, 5817483, 5824514, 5976862, WO 86/05803, EP 590 689 (Ixsys, now Applied Molecular Evolution (AME), cada um inteiramente incorporado aqui a título de referência) ou que contam com imunização de animais transgênicos (por exemplo, ratos SCID, Nguyen e outros, Microbiol. Immunol. 41 :901 a 907 (1997); Sandhu e outros, Crit. Rev. Biotechnol. 16:95 a 118 (1996); Eren e outros, Immunol. 93: 154 a 161 (1998), cada um dos quais inteiramente incorporado a título de referência bem como patentes e pedidos relacionados) que são capazes de produzir I

um repertório de anticorpos humanos, como conhecido na técnica e/ou como descrito aqui. Tais técnicas incluem, mas não estão limitadas a, exibição de ribossomo (Hanes e outros, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 94: 4937 a 4942 (Maio de 1997); Hanes e outros, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 95: 14130 a 5 14135 (Nov. 1998)); tecnologias de produção de anticorpo de célula única (por exemplo, método de anticorpo de linfócito selecionado ("SLAM") (Paten- te. US No. 5.627.052, Wen e outros, J. Immunol. 17:887 a 892 (1987); Babcook e outros, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 93:7843 a 7848 (1996)); mi- crogotículas de gel e citometria de fluxo (Powell e outros, Biotechnol. 8:333 a 10 337 (1990); One Cell Systems, Cambridge, MA; Gray e outros, J. Imm. Meth. 182:155 a 163 (1995); Kenny e outros, Bio/Technol. 13:787 a 790 (1995)); B- cell selection (Steenbakkers e outros, Molec. Biol. Reports 19: 125 a 134 (1994); Jonak e outros, Progress Biotech, Vol. 5, In Vitro Immunization in Hybridoma Technology, Borrebaeck, ed., Elsevier Science Publishers B.V., 15 Amsterdam, Holanda (1988)), cada um dos quais é inteiramente incorporado aqui a título de referência.

Os métodos para humanizar proteínas derivada de Ig não huma- nas podem também ser usados e são bem conhecidos na técnica. Geral- mente, um anticorpo humanizado tem um ou mais resíduos de aminoácido 20 introduzidos nele a partir de uma fonte que não é humana. Esses resíduos de aminoácido não humanos são frequentemente referidos como resíduos de “importação”, que são tipicamente obtidos a partir de um domínio variável de “importação”. A humanização pode ser essencialmente executada se- guindo o método de Winter e parceiros (Jones e outros, Nature 321 :522 25 (1986); Riechmann e outros, Nature 332:323 (1988); Verhoeyen e outros, Science 239: 1534 (1988), cada um dos quais é aqui inteiramente incorpora- do a título de referência), substituindo CDRs ou seqüências de CDR de roe- dores pelas seqüências correspondentes de um anticorpo humano. Conse- quentemente, tais proteínas derivadas de Ig “humanizadas” são proteínas 30 derivadas de Ig quiméricas (Cabilly e outros, acima), onde substancialmente menos do que um domínio variável humano intacto foi substituído pela se- qüência correspondente de uma espécie não humana. Na prática, as oroteí- nas derivadas de Ig humanizadas são tipicamente proteínas derivadas de Ig humanas nas quais alguns resíduos de CDR e possivelmente alguns resí- duos de FR são substituídos por resíduos de sítios análogos em proteínas derivadas de Ig de roedores.

A escolha de domínios variáveis humanos, ambos pesados e le-

ves, a serem usados na fabricação de proteínas derivadas de Ig humaniza- das pode ser usada para reduzir a antigenicidade. De acordo com o então chamado método “Best-fit”, a seqüência do domínio variável de um anticorpo de roedor é varrida contra a biblioteca inteira de seqüências de domínio vari- 10 ável humanas conhecidas. A seqüência humana que está mais próxima da- quela dos roedores é então aceita como a estrutura humana (FR) para o an- ticorpo humanizado (Sims e outros, J. Immunol. 151 : 2296 (1993); Chothia e Lesk, J. Mol. Biol. 196:901 (1987), cada um dos quais é inteiramente incor- porado aqui a título de referência). Outro método usa uma estrutura particu- 15 Iar derivada da seqüência de consenso de todas as proteínas derivadas de Ig humanas de um subgrupo particular de cadeias leves ou pesadas. A mesma estrutura pode ser usada para várias proteínas diferentes derivadas de Ig humanizadas (Carter e outros, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 89:4285

(1992); Presta e outros, J. Immunol. 151 :2623 (1993), cada um dos quais é inteiramente incorporado aqui a título de referência).

As proteínas derivadas de Ig podem também opcionalmente ser humanizadas com retenção de alta afinidade pelo antígeno e outras proprie- dades biológicas favoráveis. Para alcançar esse objetivo, de acordo com um método preferencial, as proteínas derivadas de Ig humanizadas são prepa- 25 radas por um processo de análise das seqüências parentais e vários produ- tos humanizados conceituais usando modelos tridimensionais das seqüên- cias parental e humanizadas. Os modelos de imunoglobulina tridimensionais são comumente disponíveis e são familiares aos versados na técnica. Os programas de computador estão disponíveis, os quais ilustram e exibem es- 30 truturas conformacionais tridimensionais prováveis de seqüências de imuno- globulina candidatas selecionadas. A inspeção dessas exibições permite a análise da funcão provável dos resíduos no funcionamento da seqüência de I

imunoglobulina candidata, isto é, a análise de resíduos que influenciam a capacidade da imunoglobulina candidata se ligar a seu antígeno. Dessa for- ma, os resíduos de FR podem ser selecionados e combinados a partir das seqüência de consenso e de importação tal que a característica de anticorpo 5 desejada, tal como a afinidade aumentada para o antígeno(s) alvo, é alcan- çada. Em geral, os resíduos de CDR são diretamente e mais substancial- mente envolvidos em influenciar a ligação com o antígeno.

As proteínas derivadas de Ig monoclonais humanas podem ser feitas pelo método de hibridoma. As linhagens celulares de mieloma humano 10 e heteromieloma humano e de ratos para a produção de proteínas derivadas de Ig monoclonais humanas foram descritas, por exemplo, por Kozbor, J. Immunol. 133:3001 (1984); Brodeur e outros, Monoclonal Antibody Producti- on Techniques and Applications, pág. 51 a 63 (Mareei Dekker, Inc., Nova Iorque, 1987); e Boerner e outros, J. Immunol. 147:86 (1991), cada um dos 15 quais é inteiramente incorporado aqui a título de referência.

Alternativamente, a tecnologia de exibição de fagos e como a- presentado acima pode ser usada para produzir proteínas derivadas de Ig humanas e fragmentos de anticorpos in vitro, a partir de repertórios de gene de domínio variável (V) de imunoglobulina a partir de doadores unimuniza- dos. De acordo com um exemplo não-limitante dessa técnica, os genes de domínio V de anticorpo são clonados em quadro em ou um gene de proteína de revestimento primário ou secundário de um bacteriófago filamentoso, tal como M13 ou fd, e exibidos como fragmentos de anticorpos funcionais na superfície da partícula de fagos. Como a partícula filamentosa contém uma cópia de DNA de filamento único do genoma de fagos, as seleções basea- das nas propriedades funcionais do anticorpo também resultam na seleção do gene codificando o anticorpo exibindo aquelas propriedades. Assim, o fago imita algumas das propriedades da célula B. A exibição de fagos pode ser executada em uma variedade de formatos; para sua revisão vide, por exemplo, Johnson e outros, Current Opinion in Structural Biology 3:564

(1993), cada um dos quais é inteiramente incorporado aqui a título de refe- rência. Várias fontes de segmentos de qene V podem ser usadas para exibi- ção de fagos. Clackson e outros, Nature 352:624 (1991) isolou um arranjo diverso de proteínas derivadas de Ig antioxasolona a partir de uma pequena biblioteca combinatorial aleatória de genes V a partir dos baços de ratos í- munizados. Um repertório de genes V a partir de doadores humanos unimu- 5 nizados pode ser construído e proteínas derivadas de Ig para um arranjo diverso de antígenos (incluindo autoantígenos) podem ser isoladas essenci- almente seguindo as técnicas descritas por Marks e outros, J. Mol. Biol. 222:581 (1991), ou Griffith e outros, EMBO J. 12:725 (1993), cada um dos quais é inteiramente incorporado aqui a título de referência.

Em uma resposta imune natural, os genes de anticorpo acumu-

lam mutações em uma alta taxa (hipermutação somática). Algumas das mu- danças introduzidas conferirão afinidade mais alta, e células B exibindo imu- noglobulina de superfície de alta afinidade são preferencialmente replicadas e diferenciadas durante subsequente provocação de antígeno. Esse proces- 15 so natural pode ser imitado empregando-se a técnica conhecida como “rear- ranjo de cadeia” (Marks e outros, Bio/Technol. 10:779 (1992)). Nesse méto- do, a afinidade de proteínas derivadas de Ig humanas “primárias” obtidas por exibição de fagos podem ser otimizadas substituindo-se seqüencialmente os genes de região V de cadeia leve e pesada com repertórios de variantes o- 20 correndo naturalmente (repertórios) de genes de domínio V obtidos a partir de doadores unimunizados. Essa técnica permite a produção de proteínas derivadas de Ig e fragmentos de anticorpos com afinidades na faixa de nM. Uma estratégia de produzir repertórios de anticorpo de fagos muito grandes foi descrita por Waterhouse e outros, Nucl. Acids Res. 21 :2265 (1993). O 25 rearranjo de genes pode também ser usado para derivar proteínas derivadas de Ig humanas a partir de proteínas derivadas de Ig de roedores, onde o an- ticorpo humano tem afinidades e especificidades similares ao anticorpo de roedor de partida. De acordo com esse método, que é também referido co- mo “impressão de epítopo”, o gene de domínio V de cadeia pesada ou leve 30 de proteínas derivadas de Ig de roedores obtidas pela técnica de exibição de fagos é substituído com um repertório de genes de domínio V humanos, cri- ando quimeras roedor-humano. A seleção com antíqeno resulta em isola- mento de variável humana capaz de restaurar um sítio de ligação com antí- geno funcional, isto é, o epítopo governa (imprime) a escolha do parceiro. Quando o processo é repetido de modo a substituir o domínio V de roedores restante, um anticorpo humano é obtido (vide PCT WO 93/06213, publicado 5 em 1 de abrila 1993). Diferente da humanização tradicional de proteínas de- rivadas de Ig de roedores por enxertia de CDR, essa técnica fornece proteí- nas derivadas de Ig completamente humanas, que não tem estrutura ou re- síduos de CDR de origem de roedores.

As proteínas derivadas de Ig biespecíficas podem também ser 10 usadas, as quais são monoclonais, proteínas derivadas de Ig preferencial- mente humanas ou humanizadas que têm especificidades de ligação para ao menos dois antígenos diferentes. No caso presente, uma das especifici- dades de ligação é para ao menos uma proteína relacionada a IL-4 ou IL-13, a outra é para qualquer outro antígeno. Por exemplo, as proteínas derivadas 15 de Ig biespecíficas especificamente se ligando uma proteína relacionada a IL-4 ou IL-13 e ao menos um fator neurotrópico, ou dois tipos diferentes de polipeptídeos relacionados a IL-4 ou IL-13 estão dentro do escopo da pre- sente invenção.

Os métodos de produzir proteínas derivadas de Ig biespecíficas são conhecidos na técnica. Tradicionalmente, a produção recombinante de proteínas derivadas de Ig biespecíficas é baseada na coexpressão de dois pares de cadeia leve-cadeia pesada de imunoglobulina, onde as duas cadei- as pesadas têm diferentes especificidades (Milstein e Cuello, Nature 305:537 (1983)). Por causa da variedade aleatória de cadeias pesadas e leves de imunoglobulina, esses hibridomas (quadromas) produzem uma mistura po- tencial de 10 diferentes moléculas de anticorpo, das quais somente uma tem a estrutura biespecífica correta. A purificação da molécula correta, que é u- sualmente feita por etapas de cromatografia por afinidade, é de preferência inconveniente, e os rendimentos do produto são baixos. Os procedimentos similares são descritos em WO 93/08829 publicado em 13 de Maio de 1993, e em Trauneckere outros, EMBO J. 10:3655 (1991), inteiramente incorpora- do aaui a título de referência. De acordo com uma abordagem diferente e mais preferencial, os domínios variáveis de anticorpo com as especificidades de ligação deseja- das (sítios de combinação de antígeno-anticorpo) são fundidos a seqüências de domínio constante de imunoglobulina. A fusão preferencialmente é com 5 um domínio constante de cadeia pesada de imunoglobulina, compreendendo ao menos parte da articulação, a segunda região constante de cadeia pesa- da (C.sub.H 2), e a terceira região constante de cadeia pesada (C.sub.H 3). É preferencial ter a primeira região constante de cadeia pesada (C.sub.H 1), contendo o sítio necessário para ligação de cadeia leve, presente em ao 10 menos uma das fusões. Os DNAs codificando as fusões de cadeia pesada de imunoglobulina e, se desejado, a cadeia leve de imunoglobulina, são in- seridos em vetores de expressão separados, e são cotransfectados em um organismo hospedeiro adequado. Isso fornece grande flexibilidade em ajus- tar as proporções mútuas dos três fragmentos de polipeptídeo em modalida- 15 des quando relações desiguais das três cadeias de polipeptídeo usadas na construção fornecem os rendimentos ótimos. É, entretanto, possível inserir as seqüências de codificação para duas ou todas as três cadeias de polipep- tídeo em um vetor de expressão quando a produção de ao menos duas ca- deias de polipeptídeos em razões iguais resulta em altos rendimentos ou 20 quando as razões são de significância não particular. Em uma modalidade preferencial dessa abordagem, as proteínas derivadas de Ig biespecíficas são compostas de uma cadeia pesadas de imunoglobulina híbrida com uma primeira especificidade de ligação em um braço, e um par de cadeia Ieve- cadeia pesada de imunoglobulina hibrida (fornecendo uma segunda especi- 25 ficidade de ligação) no outro braço. Essa estrutura assimétrica facilita a se- paração do composto biespecífico desejado de combinações de cadeia de imunoglobulina indesejadas, à medida que a presença de uma cadeia leve de imunoglobulina em somente uma metade da molécula biespecífica forne- ce uma forma fácila de separação. Para detalhes adicionais de gerar proteí- 30 nas derivadas de Ig biespecíficas, vide, por exemplo, Suresh e outros, Me- thods in Enzymology 121:210 (1986). Proteínas derivadas de Ig heteroconjugadas estão também den- tro do escopo da presente invenção. As proteínas derivadas de Ig heterocon- jugadas são compostas de duas proteínas derivadas de Ig covalentemente unidas. Tais proteínas derivadas de Ig1 por exemplo, foram propostas para 5 direcionar células de sistema imune a células indesejadas (Patente U.S. No. 4.676.980), e para tratamento de infecção por HIV (WO 91/00360; WO 92/00373; e EP 03089). As proteínas derivadas de Ig heteroconjugadas po- dem ser produzidas usando quaisquer métodos de reticulação convenientes. Os agentes de reticulação adequados são bem conhecidos na técnica, e são 10 descritos na Patente U.S. No. 4.676.980, junto com um número de técnicas de reticulação.

Em uma modalidade preferencial, ao menos uma proteína deri- vada de Ig relacionada a IL-4 ou IL-13 ou parte ou variante específica da presente invenção é produzida por uma linhagem celular, uma linhagem ce- Iular misturada, uma célula imortalizada ou população clonal de células imor- talizadas. As células de produção de IL-4 ou IL-13 imortalizadas podem ser produzidas usando métodos adequados, por exemplo, fusão de uma célula produzindo proteína derivada de Ig humano e um heteromieloma ou imortali- zação de uma célula B humana ativada via infecção com vírus Epstein Barr (Niedbala e outros, Hybridoma, 77(3):299 a 304 (1998); Zanella e outros, J Immunol Methods, 156(2):205 a 215 (1992); Gustafsson e outros, Hum Ig derived proteins Hybridomas, 2(1)26 a 32 (1991)). Preferencialmente, as pro- teínas relacionadas a IL-4 ou IL-13 anti-humanas ou fragmentos ou partes ou variantes específicas são geradas por imunização de um animal transgê- nico (por exemplo, camundongos, ratos, hamsters, primatas não humanos, e seus similares) capazes de produzir um repertório de proteínas derivadas de Ig humanas, como descrito aqui e/ou como conhecido na técnica. As células que produzem proteína derivada de Ig anti-IL-4 ou IL-13 podem ser isoladas de tais animais e imortalizada usando métodos adequados, tais como os métodos descritos aqui.

Ratos transgênicos que podem produzir um repertório de proteí- nas derivadas de Iq humanas oue se Iiqam a antíqenos humanos podem ser produzidos por métodos conhecidos (por exemplo, mas não-limitados a, Pa- tentes U.S. Nos. 5.770.428, 5.569.825, 5.545.806, 5.625.126, 5.625.825, 5.633.425, 5.661.016 e 5.789.650 emitidas a Lonberg e outros; Jakobovits e outros WO 98/50433, Jakobovits e outros WO 98/24893, Lonberg e outros 5 WO 98/24884, Lonberg e outros WO 97/13852, Lonberg e outros. WO 94/25585, Kucherlapate e outros WO 96/34096, Kucherlapate e outros EP 0463 151 BI, Kucherlapate e outros. EP 0710 719 Al, Surani e outros Pa- tente US. No. 5.545.807, Bruggemann e outros WO 90/04036, Bruggemann e outros EP 0438 474 BI, Lonberg e outros EP 0814 259 A2, Lonberg e ou- 10 tros GB 2 272 440 A, Lonberg e outros Nature 368:856 a 859 (1994), Taylor e outros, Int. Immunol. 6(4)579 a 591 (1994), Green e outros, Nature Gene- tics 7: 13-21 (1994), Mendez e outros, Nature Genetics 15: 146 a 156 (1997), Taylor e outros, Nucleic Acids Research 20(23):6287 a 6295 (1992), Tuaillon e outros, Proc Natl Acad Sci USA 90(8)3720 a 3724 (1993), Lonberg e ou- 15 tros, Int Rev Immunol 13(l):65 a 93 (1995) e Fishwald e outros, Nat Biotech- nol 14(7):845 a 851 (1996), cada um dos quais é inteiramente incorporado aqui a título de referência). Geralmente, esses ratos compreendem ao me- nos um transgene compreendendo DNA de ao menos um lócus de imuno- globulina humana que é funcionalmente rearranjado, ou que pode passar por 20 rearranjo funcional. O Ioci da imunoglobulina endógena em tais ratos podem ser rompidos ou apagados para eliminar a capacidade do animal para pro- duzir proteínas derivadas de Ig codificadas por genes endógenos.

O termo “funcionalmente rearranjado”, como usado aqui refere-se a um segmento de DNA a partir de um lócus de imunoglobulina que tenha 25 passado por recombinação V(D)J, desse modo produzindo um gene de imu- noglobulina que codifica uma cadeia de imunoglobulina (por exemplo, cadeia pesada, cadeia leve), ou qualquer parte dessa. Um gene de imunoglobulina funcionalmente rearranjado pode ser direta ou indiretamente identificado u- sando métodos adequados, tal como, por exemplo, sequenciamento de nu- 30 cleotídeo, hibridização (por exemplo, Southern blotting, Northern blotting) usando sondas que anelam para codificar as junções entre segmentos de gene ou amplificação enzimática de genes de imunoglobulina (por exemplo. i

reação em cadeia da polimerase) com iniciadores que podem anelar para codificar junções entre os segmentos de gene. Se uma célula produz uma proteína derivada de Ig compreendendo uma região variável particular ou uma região variável compreendendo uma seqüência particular (por exemplo, ao menos uma seqüência de CDR) pode também ser determinada usando métodos adequados. Em um exemplo, o mRNA pode ser isolado a partir de uma célula produzindo proteína derivada de Ig (por exemplo, um hibridoma ou célula recombinante ou outra fonte adequada) e usado para produzir cD- NA codificando a proteína derivada de Ig ou parte ou variante específica dessa. O cDNA pode ser clonado e sequenciado ou pode ser amplificado (por exemplo, por reação em cadeia da polimerase ou outros métodos co- nhecidos e adequados) usando um primeiro iniciador que anela especifica- mente para uma parte da região variável de interesse (por exemplo, CDR, junção de codificação) e um segundo iniciador que anela especificamente para seqüências de região não variável (por exemplo, Ch1, Vh).

Varrer a proteína derivada de Ig ou partes ou variantes específi- cas por ligação específica para proteínas ou fragmentos similares pode ser convenientemente alcançado usando bibliotecas de exibição de peptídeos. Esse método envolve a varredura de grandes coleções de peptídeos por 20 membros individuais tendo a função ou estrutura desejada. A varredura de proteína derivada de Ig de bibliotecas de exibição de peptídeos é bem co- nhecida na técnica. As seqüências de peptídeo exibidas podem ser de 3 a 5000 ou mais aminoácidos em comprimento, frequentemente de 5 a 100 a- minoácidos de comprimento, e frequentemente de aproximadamente 8 a 25 25 aminoácidos de comprimento. Em adição aos métodos sintéticos químicos diretos para gerar bibliotecas de peptídeos, vários métodos de DNA recom- binante foram descritos. Um tipo envolve a exibição de uma seqüência de peptídeos na superfície de um bacteriófago ou célula. Cada bacteriófago ou célula contém a seqüência de nucleotídeo codificando a seqüência de peptí- 30 deo exibida particular. Tais métodos são descritos na Publicação de Patente PCT Nos. 91/17271, 91/18980, 91/19818, e 93/08278. Outros sistemas para gerar bibliotecas de peptídeos têm aspectos de ambos os métodos recombi- nantes e síntese química in vitro. Vide, Publicação de Patente PCT Nos. 92/05258, 92/14843, e 96/19256. Vide também, Patentes U.S. Nos. 5.658.754; e 5.643.768. As bibliotecas de exibição de peptídeos, vetor, e kits de varredura estão comercialmente disponíveis a partir de tais fornecedores 5 como Invitrogen (Carlsbad, CA), e Cambridge Ig derived protein Technologi- es (Cambridgeshire, UK). Vide, por exemplo, Pat. U.S. Nos. 4704692, 4939666, 4946778, 5260203, 5455030, 5518889, 5534621, 5656730, 5763733, 5767260, 5856456, atribuídas a Enzon; 5223409, 5403484, 5571698, 5837500, atribuídas a Dyax, 5427908, 5580717, atribuídas a Affy- 10 max; 5885793, atribuídas a Cambridge Ig derived protein Technologies; 5750373, atribuída a Genentech, 5618920, 5595898, 5576195, 5698435, 5693493, 5698417, atribuídas a Xoma, Colligan, acima; Ausubel, acima; ou Sambrook, acima, cada uma das patentes acima e publicações são inteira- mente incorporadas aqui a título de referência.

As proteínas derivadas de Ig, partes e variantes específicas da

presente invenção podem ser também preparadas usando ao menos uma proteína derivada de Ig relacionada a IL-4 ou IL-13 ou parte ou variante es- pecífica codificando ácido nucléico para fornecer animais ou mamíferos transgênicos, tal como cabras, vacas cavalos, ovelhas, e seus similares, que 20 produzem tais proteínas derivadas de Ig ou partes ou variantes específicas em seu leite. Tais animais podem ser fornecidos usando métodos conheci- dos. Vide, por exemplo, mas não-limitado a, Patentes U.S. Nos. 5.827.690, 5.849.992, 4.873.316, 5.849.992, 5.994.616, 5.565.362, 5.304.489, e seus similares, cada um dos quais é inteiramente incorporado aqui a título de refe- 25 rência.

As proteínas derivadas de Ig, partes e variantes específicas da presente invenção podem adicionalmente ser preparadas usando ao menos uma proteína derivada de Ig relacionada a IL-4 ou IL-13 ou parte ou variante específica codificando ácido nucléico para fornecer plantas transgênicas e 30 células de plantas cultivadas (por exemplo, mas não-limitadas a tabaco e milho) que produzem tais proteínas derivadas de Ig, partes ou variantes es- pecíficas nas partes das plantas ou em células cultivadas a partir delas. Co- I

mo um exemplo não-limitante, folhas de tabaco transgênico expressando proteínas recombinantes foram usadas com sucesso para fornecer grandes quantidades de proteínas recombinantes, por exemplo, usando um promotor induzível. Vide, por exemplo, Cramer e outros, Curr. Top. Microbiol. Immu- 5 nol. 240:95 a 118 (1999) e referências citadas aqui. Também, milho transgê- níco foi usado para expressar proteínas de mamíferos em níveis de produ- ção comercial, com atividades biológicas equivalentes às produzidas em ou- tros sistemas recombinantes ou purificados a partir de fontes naturais. Vide, por exemplo, Hood e outros, Adv. Exp. Med. Biol. 464: 127 a 147 (1999) e 10 referências citadas aqui. As proteínas derivadas de Ig foram também produ- zidas em grandes quantidades de sementes de plantas transgênicas incluin- do fragmentos de proteína derivada de Ig, tal como proteínas derivadas de Ig de cadeia única (scFv’s), incluindo sementes de tabaco e tubérculos de bata- ta. Vide, por exemplo, Conrad e outros, Plant Mol. Biol. 38:101 a 109 (1998) 15 e referência citada aqui. Assim, as proteínas derivadas de Ig, partes e vari- antes específicas da presente invenção podem também ser produzidas u- sando plantas transgênicas, de acordo com os métodos conhecidos. Vide, também, por exemplo, Fischer e outros, Biotechnol. Appl. Biochem. 30:99 a 108 (Outubro de 1999), Ma e outros, Trends Biotechnol. 13:522 a 527 20 (1995); Ma e outros, Plant Physiol. 109:341 a 346 (1995); Whitelam e outros, Biochem. Soc. Trans. 22:940 a 944 (1994); e referências citadas aqui. Cada uma das referências acima é inteiramente incorporada aqui a título de refe- rência.

As proteínas derivadas de Ig da invenção podem se ligar a prote- 25 ínas relacionadas a IL-4 ou IL-13 ou fragmentos com uma ampla faixa de afinidades (KD). Em uma modalidade preferencial, ao menos um anticorpo humano da presente invenção pode opcionalmente se ligar a proteínas rela- cionadas a IL-4 ou IL-13 humanas ou fragmentos com alta afinidade. Por exemplo, um anticorpo humano pode se ligar a proteínas relacionadas a IL-4 30 ou IL-13 humanas ou fragmentos com um KD igual ou menor a aproxima- damente 10'9 M ou, mais preferencialmente, com um KD igual ou menor a aproximadamente 0,10 a 9,99 (ou qualquer faixa ou valor nesta) X 10'8, 10'9, 10'10, 10111 10~12, 10'13, 10'14, 10~15, ou qualquer faixa ou valor neste.

A afinidade ou avidez de uma proteína derivada de Ig por um an- tígeno pode ser determinada experimentalmente usando qualquer método 5 adequado, (vide, por exemplo, Berzofsky, e outros, "Ig derived protein- Antigen lnteractions," In Fundamental Immunology, Paul, W. E., Ed., Raven Press: Nova Iorque, NY (1984); Kuby, Janis Immunology, W. H. Freeman and Company: Nova Iorque, NY (1992); e métodos descritos aqui). A afini- dade medida de uma interação antígeno-proteína derivada de Ig particular 10 pode variar se medida sob diferentes condições (por exemplo, concentração de sal, pH). Assim, as medidas de afinidade e outros parâmetros de ligação de antígeno (por exemplo, KD, Ka, Kd) são preferencialmente feitas com soluções padrão de proteína derivada de Ig e antígeno, e um tampão padro- nizado, tal como o tampão descrito aqui.

Moléculas de Ácido Nucléico

Usando a informação fornecida aqui, tal como as seqüências de nucieotídeo codificando ao menos 90 a 100% dos aminoácidos contínuos de ao menos uma proteína derivada de Ig relacionada a IL-4 ou IL-13 da pre- sente invenção, fragmentos específicos, variantes ou seqüências de con- 20 senso dessas, ou um vetor depositado compreendendo ao menos uma des- sas seqüências, uma molécula de ácido nucléico da presente invenção codi- ficando ao menos uma proteína derivada de Ig relacionada com IL-4 ou IL-13 ou parte ou variante específica pode ser obtida usando métodos descritos aqui ou como conhecido na técnica.

As moléculas de ácido nucléico da presente invenção podem es-

tar na forma de RNA, tal como mRNA, hnRNA, tRNA, ou qualquer outra for- ma, ou na forma de DNA, incluindo, mas não-limitadas a, cDNA e DNA ge- nômico obtido por clonagem ou produzido sinteticamente, ou quaisquer combinações desses. O DNA pode ser de filamento triplo, de filamento duplo 30 ou de filamento único, ou qualquer combinação desses. Qualquer parte de ao menos um filamento do DNA ou RNA pode ser o filamento de codificação, I

também conhecido como o filamento de senso, ou pode ser o filamento de não codificação, também referido como filamento antissenso.

As moléculas de ácido nucléico isoladas da presente invenção podem incluir moléculas de ácido nucléico compreendendo um quadro de leitura aberto (ORF), opcionalmente com um ou mais íntrons, por exemplo, mas não-limitados a ao menos uma parte específica de ao menos um CDR, como CDR1, CDR2 e/ou CDR3 de ao menos uma cadeia pesada ou cadeia leve, respectivamente; moléculas de ácido nucléico compreendendo a se- qüência de codificação para uma proteína derivada de Ig relacionada a IL-4 ou IL-13 ou parte ou variante específica; e moléculas de ácido nucléico que compreendem uma seqüência de nucleotídeo substancialmente diferente da descrita acima, mas que, devido à degeneração do código genético, ainda codificam ao menos uma proteína derivada de Ig relacionada a IL-4 ou IL-13 como descrito aqui e/ou como conhecido na técnica. É claro que o código genético é bem conhecido na técnica. Assim, seria rotina para os versados na técnica gerar tais variantes de ácido nucléico degeneradas para código para proteína derivada de Ig relacionada a IL-4 ou IL-13 específica ou partes ou variantes específicas da presente invenção. Vide, por exemplo, Ausubel e outros, acima, e tais variantes de ácido nucléico são incluídas na presente invenção.

Como indicado aqui, as moléculas de ácido nucléico da presente invenção que compreendem um ácido nucléico codificando uma proteína derivada de Ig relacionada a IL-4 ou IL-13 ou parte ou variante específica podem incluir, mas não estão limitadas àquelas codificando a seqüência de 25 aminoácido de um fragmento de proteína derivada de Ig, por ela mesma; a seqüência de codificação para a proteína derivada de Ig inteira ou uma parte dessa; a seqüência de codificação para uma proteína derivada de Ig, frag- mento ou parte, bem como seqüências adicionais, tal como a seqüência de codificação de ao menos um leitor de sinal ou peptídeo de fusão, com ou 30 sem as seqüências de codificação adicional mencionadas acima, tal como ao menos um íntron, junto com seqüências de não codificação adicionais, incluindo, mas não-limitadas às seqüências de não codificação 5’ e 3’. tal como as seqüências não traduzidas transcritas que executam uma função na transcrição, no processamento de mRNA, incluindo sinais de montagem de genes e poliadenilação (por exemplo, ligação de ribossomo e estabilidade de mRNA); e seqüência de codificação adicional que codifica aminoácidos 5 adicionais, tal como aqueles que fornecem funcionalidades adicionais. As- sim, a seqüência codificando uma proteína derivada de Ig ou parte ou vari- ante específica pode ser fundida a uma seqüência marcadora, tal como uma seqüência codificando um peptídeo que facilita a purificação da proteína de- rivada de Ig fundida ou parte ou variante específica compreendendo um 10 fragmento ou parte de proteína derivada de Ig.

Polinucleotídeos que Seletivamente Hibridizam em um Polinucle- otídeo como Descrito aqui

A presente invenção fornece ácidos nucléicos isolados que hibri- dizam sob condições de hibridização em um polinucleotídeo codificando uma 15 proteína derivada de Ig relacionada a IL-4 ou IL-13 da presente invenção. Assim, os polinucleotídeos dessa modalidade podem ser usados para isolar, detectar e/ou quantificar ácidos nucléicos compreendendo tais polinucleotí- deos. Por exemplo, os polinucleotídeos da presente invenção podem ser usados para identificar, isolar ou amplificar clones parciais ou completos em 20 uma biblioteca depositada. Em algumas modalidades, os polinucleotídeos são seqüências de cDNA ou genômico isolado, ou de outra forma, comple- mentares a cDNA de uma biblioteca de ácido nucléico humano ou de mamí- fero.

Preferencialmente, a biblioteca de cDNA compreende ao menos 25 80% das seqüências completas, preferencialmente ao menos 85% ou 90% das seqüências completas, e mais preferencialmente ao menos 95% das seqüências completas. As bibliotecas de cDNA podem ser normalizadas pa- ra aumentar a representação de seqüências raras. As condições de hibridi- zação de rigor baixo a moderado são tipicamente, mas não exclusivamente, 30 empregadas com seqüências tendo uma identidade de seqüência reduzida em relação a seqüências complementares. As condições de rigor moderado e alto oodern opcionalmente ser empregadas oara seauências de maior i- dentidade. As condições de baixo rigor permitem hibridização seletiva de seqüências tendo aproximadamente 70% de identidade de seqüência e po- dem ser empregadas para identificar seqüências ortólogas ou parálogas.

Opcionalmente, os polinucleotídeos desta invenção codificarão 5 ao menos uma parte de uma proteína derivada de Ig ou parte ou variante específica codificada pelos polinucleotídeos descritos aqui. Os polinucleotí- deos desta invenção abrangem seqüências de ácido nucléico que podem ser empregadas para hibridização seletiva em um polinucleotídeo codificando uma proteína derivada de Ig ou parte ou variante específica da presente in- 10 venção. Vide, por exemplo, Ausubel, acima; Colligan, acima, cada um dos quais é inteiramente incorporado aqui a título de referência.

Construção de Ácidos Nucléicos

Os ácidos nucléicos isolados da presente invenção podem ser produzidos usando (a) métodos recombinantes, (b) técnicas sintéticas, (c) técnicas de purificação, ou combinações dessas, bem conhecidas na técni- ca.

Os ácidos nucléicos podem convenientemente compreender se- qüências em adição a um polinucleotídeo da presente invenção. Por exem- plo, um sítio multiclonagem compreendendo um ou mais sítios de restrição a 20 endonuclease pode ser inserido no ácido nucléico para ajudar no isolamento do polinucleotídeo. Também, as seqüências traduzíveis podem ser inseridas para auxiliar no isolamento do polinucleotídeo traduzido da presente inven- ção. Por exemplo, uma seqüência de marcador hexa-histidina fornece um meio conveniente para purificar as proteínas da presente invenção. O ácido 25 nucléico da presente invenção - excluindo a seqüência de codificação - é opcionalmente um vetor, adaptador, ou ligante para clonagem e/ou expres- são de um polinucleotídeo da presente invenção.

Seqüências adicionais podem ser adicionadas a tais seqüências de clonagem e/ou expressão para otimizar sua função em clonagem e/ou expressão, para auxiliar no isolamento do polinucleotídeo, ou para otimizar a introdução do polinucleotídeo em uma célula. O uso de vetores de clona- gem, vetores de expressão, adaptadores, e Iigantes é bem conhecido na técnica, (vide, por exemplo, Ausubel, acima; ou Sambrook, acima).

Métodos Recombinantes para Construção de Ácidos Nucléicos

As composições de ácido nucléico isoladas desta invenção, tal 5 como RNA, cDNA, DNA genômico, ou qualquer combinação desses, podem ser obtidas a partir de fontes biológicas usando qualquer número de metodo- logias de clonagem conhecidas pelos versados na técnica. Em algumas mo- dalidades, sondas de oligonucleotideo que seletivamente hibridizam, sob condições rigorosas, nos polinucleotídeos da presente invenção são usados 10 para identificar a seqüência desejada em uma biblioteca de cDNA ou DNA genômico. O isolamento de RNA, e a construção de cDNA e bibliotecas ge- nômicas, são bem conhecidos pelos versados na técnica. (Vide, por exem- plo, Ausubel, acima; ou Sambrook, acima).

Métodos de Isolamento e Varredura de Ácido Nucléico Uma biblioteca de cDNA ou de DNA genômico pode ser varrida

usando uma sonda com base na seqüência de um polinucleotídeo da pre- sente invenção, tal como os descritos aqui. As sondas podem ser usadas para hibridizar com seqüências de DNA genômico ou cDNA para isolar ge- nes homólogos nos mesmos organismos ou organismos diferentes. Os ver- 20 sados na técnica apreciarão que vários graus de rigor de hibridização podem ser empregados no ensaio; e ou a hibridização ou o meio de lavagem pode ser rigoroso. À medida que as condições para hibridização se tornam mais rigorosas, precisa haver um grau maior de complementaridade entre a sonda e o alvo para formação dupla ocorrer. O grau de rigor pode ser controlado 25 por um ou mais dentre temperatura, resistência iônica, pH e a presença de um solvente parcialmente desnaturante tal como formamida. Por exemplo, o rigor da hibridização é convenientemente variado mudando-se a polaridade da solução reagente através, por exemplo, de manipulação da concentração de formamida dentro da faixa de 0% a 50%. O grau de complementaridade 30 (identidade de seqüência) exigido para ligação detectável variará de acordo com o rigor do meio de hibridização e/ou do meio de lavagem. O grau de complementaridade será otimamente 100%, ou 90 a 100%. ou qualquer fai- I

xa ou valor ali contido. Entretanto, dever-se-ia entender que variações se- cundárias na seqüência nas sondas e iniciadores podem ser compensadas reduzindo-se o rigor da hibridização e/ou do meio de lavagem.

Métodos de amplificação de RNA ou DNA são bem conhecidos 5 na técnica e podem ser usados de acordo com a presente invenção sem experimentação indevida, com base nos ensinamentos e diretrizes apresen- tados aqui.

Os métodos conhecidos de amplificação de DNA ou RNA inclu- em, mas não estão limitados a, reação em cadeia da polimerase (PCR) e processos de amplificação relacionados (vide, por exemplo, Patentes U.S. Nos. 4.683.195, 4.683.202, 4.800.159, 4.965.188, para Mullis, e outros; 4.795.699 e 4.921.794 para Tabor, e outros; 5.142.033 para Innis; 5.122.464 para Wilson, e outros; 5.091.310 para Innis; 5.066.584 para Gyllensten1 e outros; 4.889.818 para Gelfand, e outros; 4.994.370 para Silver, e outros; 4.766.067 para Biswas; 4.656.134 para Ringold) e amplificação mediada por RNA que usa RNA antissenso para a seqüência alvo como um modelo para síntese de DNA de filamento duplo (Patente U.S. No. 5.130.238 para Malek, e outros, com a marca NASBA), os conteúdos inteiros dos quais são incor- porados aqui a título de referência. (Vide, por exemplo, Ausubel, acima; ou Sambrook, supra).

Por exemplo, a tecnologia de reação de cadeia de polimerase (PCR) pode ser usada para amplificar as seqüências de polinucleotídeos da presente invenção e genes relacionados diretamente a partir de bibliotecas de cDNA ou DNA genômico. PCR e outros métodos de amplificação in vitro 25 podem ser também úteis, por exemplo, para clonar seqüências de ácido nu- cléico que codificam proteínas a serem expressas, para produzir ácidos nu- cléicos para usar como sondas para detectar a presença do mRNA desejado nas amostras, para sequenciamento de ácido nucléico, ou para outros pro- pósitos. Exemplos de técnicas suficientes para direcionar os versados na 30 técnica através de métodos de amplificação in vitro são encontradas em Berger, acima, Sambrook, acima, e Ausubel, acima, bem como Mullis, e ou- tros, Patente U.S. No. 4.683.202 (1987): e Innis, e outros, PCR Protocols - A Guide to Methods and Applications, Eds., Academic Press Inc., San Diego, CA (1990). Os kits comercialmente disponíveis para amplificação de PCR genômico são conhecidos na técnica. Vide, por exemplo, Advantage-GC Genomic PCR Kit (Clontech). A Proteína T4 Gene 32 (Boehringer Man- 5 nheim) pode ser usada para otimizar o rendimento de produtos PCR longos. Métodos Sintéticos para Construir Ácidos Nucléicos

Os ácidos nucléicos isolados da presente invenção podem ser também preparados por síntese química direta por métodos conhecidos (vi- de, por exemplo, Ausubel e outros, acima). A síntese química geralmente 10 produz um olinucleotídeo de filamento único, que pode ser convertido em DNA de filamento duplo por hibridização com uma seqüência complementar, ou por polimerização com um DNA polimerase usando o filamento único co- mo um modelo. Um versado na técnica reconhecerá que enquanto a síntese química de DAN pode ser limitada a seqüências de aproximadamente 100 15 ou mais bases, seqüências mais longas podem ser obtidas pela ligação de seqüências mais curtas.

Cassetes de Expressão Recombinantes

A presente invenção adicionalmente fornece cassetes de expres- são recombinantes compreendendo um ácido nucléico da presente inven- ção. Uma seqüência de ácido nucléico da presente invenção, por exemplo, uma seqüência de cDNA ou de DNA genômico codificando uma proteína derivada de Ig ou parte ou variante específica da presente invenção, pode ser usada para construir um cassete de expressão recombinante que pode ser introduzido em ao menos uma célula hospedeira desejada. Um cassete de expressão recombinante compreenderá tipicamente um polinucleotídeo da presente invenção operacionalmente ligado a seqüências regulatórias de iniciação transcricional que direcionarão a transcrição do polinucleotídeo na célula hospedeira pretendida. Ambos promotores heterólogos e não heteró- Iogos (isto é, endógenos) podem ser empregados para direcionar a expres- são dos ácidos nucléicos da presente invenção.

Em algumas modalidades, os ácidos nucléicos isolados que ser- vem como promotor, intensificador, ou outros elementos, oodem ser introdu- zidos na posição apropriada (a montante, a jusante, ou em íntrons) de uma forma não heteróloga de um polinucleotídeo da presente invenção tal como para regular para cima e para baixo a expressão de um polinucleotídeo da presente invenção. Por exemplo, os promotores endógenos podem ser alte- rados in vivo ou in vitro por mutação, apagamento e/ou substituição.

Um polinucleotídeo da presente invenção pode ser expresso ou na orientação senso ou antissenso, como desejado. Aprecia-se que o con- trole da expressão de gene ou na orientação senso ou antissenso pode ter um impacto direto nas características observáveis.

Outro método de supressão é supressão senso. A introdução de

ácido nucléico configurado na orientação senso revelou-se um meio eficaz pelo qual se bloqueia a transcrição de genes alvo.

Uma variedade de agentes de reticulação, agentes alquilantes e espécies de geração de radical à medida que grupos pendentes em polinu- cleotídeos da presente invenção podem ser usados para ligar, rotular, detec- tar e/ou clivar ácidos nucléicos. Knorre, e outros, Biochimie 67:785 a 789 (1985); Vlassov, e outros, Nucleic Acids Res. 14:4065 a 4076 (1986); Iverson e Dervan, J. Am. Chem. Soe. 109:1241 a 1243 (1987); Meyer, e outros, J. Am. Chem. Soc. 111 :8517 a 8519 (1989); Lee, e outros, Biochemistry 27: 3197 a 3203 (1988); Home, e outros, J. Am. Chem. Soc. 112:2435 a 2437 (1990); Webb e Matteucci, J. Am. Chem. Soc. 108:2764 a 2765 (1986); Nu- cleic Acids Res. 14:7661 a 7674 (1986); Feteritz, e outros, J. Am. Chem. Soc. 113:4000 (1991). Vários compostos para ligar, rotular, e/ou clivar ácidos nucléicos são conhecidos na técnica, Patentes U.S. Nos. 5.543.507; 5.672.593; 5.484.908; 5.256.648; e 5.681.941, cada uma das quais é intei- ramente incorporada aqui a título de referência.

Vetores e Células Hospedeiras

A presente invenção também refere-se a vetores que incluem moléculas de ácido nucléico isoladas da presente invenção, células hospe- deiras que são geneticamente elaboradas com os vetores recombinantes, e à produção de ao menos uma proteína derivada de Ig relacionada a IL-4 ou IL-13 ou parte ou variante específica por técnicas recombinantes, como é bem conhecido na técnica. Vide, por exemplo, Sambrook e outros, acima; Ausubel e outros, acima, cada um dos quais é inteiramente incorporado aqui a título de referência.

Os polinucleotídeos podem opcionalmente ser unidos a um vetor 5 contendo um marcador selecionável para a propagação em um hospedeiro. Geralmente, um vetor plasmídeo é introduzido em um precipitado, tal como um precipitado de fosfato de cálcio, ou em um complexo com um lipídeo car- regado. Se o vetor é um vírus, ele pode ser embalado in vitro usando uma linhagem celular de embalagem apropriada e então traduzido nas células 10 hospedeiras.

O elemento de inserção de DNA deveria ser operacionalmente ligado a um promotor apropriado. Padrões de expressão adicionalmente conterão sítios para iniciação de transcrição, terminação e, na região trans- crita, um sítio de ligação de ribossomo para tradução. A parte de codificação 15 dos transcritos maduros expressos pelos padrões incluirá preferencialmente uma tradução iniciando no códon de início e de terminação (por exemplo, UAA, UGA, ou UAG) apropriadamente posicionado no fim do mRNA a ser traduzido, com UAA e UAG preferenciais para expressão de células de ma- míferos ou eucarióticas.

Os vetores de expressão preferencialmente, mas opcionalmente

incluirão ao menos um marcador selecionável. Tais marcadores incluem, por exemplo, mas não estão limitados a, metotrexato (MTX), di-hidrofolato redu- tase (DHFR, patente U.S. Nos. 4.399.216; 4.634.665; 4.656.134; 4.956.288; 5.149.636; 5.179.017, ampicilina, neomicina (G418), ácido micofenólico, ou 25 glutamina sintetase (GS, patentes U.S. Nos. 5.122.464; 5.770.359; 5.827.739) resistência para cultura de células eucarióticas, e genes de resis- tência à tetraciclina ou ampicilina para cultivar E. coli e outras bactérias ou procarióticas (as patentes acima são inteiramente incorporadas aqui a título de referência). Os meios de cultura apropriados e condições para as células 30 hospedeiras acima descritas são conhecidos na técnica. Os vetores ade- quados estarão prontamente aparentes aos versados na técnica. A introdu- ção de um padrão de vetor em uma célula hospedeira pode ser efetuada por I

transfecção de fosfato de cálcio, transfecção mediada por DEAE-dextrano, transfecção mediada por lipídeo catiônico, eletroporação, transdução, infec- ção ou outros métodos conhecidos. Tais métodos são descritos na técnica, tal como Sambrook, acima, Capítulos 1 a 4 e 16 a 18; Ausubel, acima, Capi- 5 tulos 1, 9, 13, 15, 16.

Ao menos uma proteína derivada de Ig ou parte ou variante es- pecífica da presente invenção pode ser expressa em uma forma modificada, tal como uma proteína de fusão, e pode incluir não somente sinais de secre- ção, mas também regiões funcionais heterólogas adicionais. Por exemplo, uma região de aminoácidos adicionais, particularmente aminoácidos carre- gados, pode ser adicionada ao N-término de uma proteína derivada de Ig ou parte ou variante específica para melhorar a estabilidade e persistência na célula hospedeira, durante a purificação, ou durante manipulação e armaze- namento subsequente. Também, porções de peptídeo podem ser adiciona- das a uma proteína derivada de Ig ou parte ou variante específica da presen- te invenção para facilitar a purificação. Tais regiões podem ser removidas antes da preparação final de uma proteína derivada de Ig ou ao menos um fragmento dessa. Tais métodos são descrito em muitos manuais de laborató- rio padrão, tal como Sambrook, acima, Capítulos 17.29 a 17.42 e 18.1 a 18.74; Ausubel, acima, Capítulos 16, 17 e 18.

Os versados na técnica conhecem nos numerosos sistemas de expressão disponíveis para expressão de um ácido nucléico codificando uma proteína da presente invenção.

Alternativamente, os ácidos nucléicos da presente invenção po- 25 dem ser expressos em uma célula hospedeira por ligação (por manipulação) em uma célula hospedeira que contém DNA endógeno codificando uma pro- teína derivada de Ig ou parte ou variante específica da presente invenção. Tais métodos são bem conhecidos na técnica, por exemplo, como descrito nas Patentes U.S. Nos. 5.580.734, 5.641.670, 5.733.746, e 5.733.761, intei- 30 ramente incorporadas aqui a título de referência.

Ilustrativos de culturas celulares úteis para a produção das prote- ínas derivadas de Ia, partes ou variantes específicas dessas, são células de mamíferos. Os sistemas de células de mamíferos frequentemente estarão na forma de monocamadas de células embora as suspensões de células de mamíferos ou biorreatores possam também ser usadas. Um número de li- nhagens celulares hospedeiras adequadas capazes de expressar proteínas glicosiladas intactas foi desenvolvido na técnica, e inclui linhagens celulares COS-1 (por exemplo, ATCC CRL 1650), COS-7 (por exemplo, ATCC CRL- 1651), HEK293, BHK21 (por exemplo, ATCC CRL-10), CHO (por exemplo, ATCC CRL 1610) e BSC-1 (por exemplo, ATCC CRL-26), células Cos-7, CHO, hep G2, P3X63Ag8.653, SP2/0-Agl4, 293, HeLa e seus similares, que estão prontamente disponíveis a partir, por exemplo, American Type Culture Collection, Manassas, Va. Células hospedeiras preferenciais são células P3X63Ag8.653 (ATCC Número de Acesso CRL-1580) e SP2/0-Agl4 (ATCC Número de Acesso CRL-1851). Em uma modalidade particularmente prefe- rencial, a célula recombinante é uma célula P3X63Ab8.653 ou uma célula SP2/0-Agl4.

Os vetores de expressão para essas células podem incluir uma ou mais das seguintes seqüências de controle de expressão, tal como, mas não-limitadas a uma origem de replicação; um promotor (por exemplo, pro- motores SV40 tardios ou precoces, o promotor CMV (Patente U.S. Nos. 5.168.062 e 5.385.839), um promotor tk HSV, um promotor PGK (fosfoglice- rato quinase), um promotor EF-1 alfa (Patente U.S. No. 5.266.491), ao me- nos um promotor de imunoglobulina humana; um intensificador, e/ou sítios de informação de processamento, tal como sítios de ligação de ribossomo, sítios de união de RNA, sítios de poliadenilação (por exemplo, um sítio de adição SV40 grande T Ag poli A), e seqüências terminadoras transcricionais. Vide, por exemplo, Ausubel e outros, acima; Sambrook e outros, acima. Ou- tras células úteis para a produção de ácidos nucléicos ou proteínas da pre- sente invenção são conhecidas e/ou disponíveis, por exemplo, a partir do Catálogo da Coleção de Cultura de Tipo Americana de Linhagens Celulares e Hibridomas (www.atcc.org) ou outras fontes comerciais ou conhecidas.

Quando as células hospedeiras eucarióticas são empregadas, as seauências terminadoras de poliadenilação ou transcricão são tipicamente I

incorporadas no vetor. Um exemplo de uma seqüência terminadora é a se- qüência de poliadenilação do gene de hormônio de crescimento bovino. As seqüências para montagem de genes precisa do transcrito podem também ser incluídas. Um exemplo de uma seqüência de montagem de genes é o 5 íntron VP1 de SV40 (Sprague, e outros, J. Virol. 45:773 a 781 (1983)). Adi- cionalmente, as seqüências de genes para controlar a replicação na célula hospedeira podem ser incorporadas no vetor, como conhecido na técnica.

Purificação de uma Proteína Derivada de Ig ou Parte ou Variante Específica Dessa

Uma proteína derivada de Ig relacionada a IL-4 ou IL-13 ou parte

ou variante específica dessa pode ser recuperada e purificada a partir de culturas celulares recombinantes por métodos bem conhecidos incluindo, mas não-limitados a, purificação de proteína A, precipitação de sulfato de amônio ou etanol, extração de ácido, cromatografia por troca de ânions ou 15 cátions, cromatografia por fosfocelulose, cromatografia por interação hidro- fóbica, cromatografia por afinidade, cromatografia por hidroxilapatita, e cro- matografia por lectina. A cromatografia a líquido de alto desempenho (Ή- PLC”) pode também ser empregada para purificação. Vide, por exemplo, Colligan, Current Protocols in Immunology, or Current Protocols in Protein 20 Science, John Wiley & Sons, NY, NY1 (1997 a 2006), por exemplo, Capítulos

1, 4, 6, 8, 9, 10, cada um dos quais é inteiramente incorporado aqui a título de referência.

As proteínas derivadas de Ig ou partes ou variantes específicas da presente invenção incluem produtos naturalmente purificados, produtos 25 de procedimentos sintéticos químicos, e produtos produzidos por técnicas recombinantes a partir de um hospedeiro eucariótico, incluindo, por exemplo, levedura, plantas vasculares, células de inseto e mamífero. Dependendo do hospedeiro empregado em um procedimento de produção recombinante, a proteína derivada de Ig ou parte ou variante específica da presente invenção 30 pode ser glicosilada ou pode ser não glicosilada, com glicosilado preferenci- almente. Tais métodos são descritos em manuais de laboratório padrão, tal como Sambrook. acima, Seções 17.37 a 17.42; Ausubel. acima. Capítulos 10, 12, 13, 16, 18 e 20, Colligan, Protein Science, acima, Capítulos 12 a 14, todos inteiramente incorporados aqui a título de referência.

Proteínas Derivadas de Ig relacionadas a IL-4 ou IL-13, Fragmen- tos e/ou Variantes

5 As proteínas derivadas de Ig isoladas da presente invenção

compreendem uma proteína derivada de Ig ou parte ou variante específica codificada por qualquer um dos polinucleotídeos da presente invenção como discutido mais completamente aqui, ou qualquer proteína derivada de Ig iso- lada ou preparada, ou parte ou variante específica dessa.

Preferencialmente, a proteína derivada de Ig humana ou frag-

mento de ligação com antígeno se liga a proteínas ou fragmentos relaciona- dos a IL-4 ou IL-13 e, desse modo substancialmente neutraliza a atividade biológica da proteína. Uma proteína derivada de Ig, ou parte ou variante dessa, que parcial ou preferencialmente substancialmente neutraliza ao me- 15 nos uma atividade biológica de ao menos uma proteína ou fragmento rela- cionado a IL-4 ou IL-13 pode se ligar à proteína ou fragmento e desse modo inibir atividades mediadas através da ligação de IL-4 ou IL-13 a ao menos um receptor de IL-4 ou IL-13 ou através de outros mecanismos mediados ou dependentes de IL-4 ou IL-13. Como usado aqui, o termo “proteína derivada 20 de Ig neutralizante” refere-se a uma proteína derivada de Ig que pode inibir atividade dependente relacionada a proteína ou fragmento p40 ou p19 hu- mana em aproximadamente 20 a 120%, preferencialmente em ao menos aproximadamente 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% ou mais dependendo do ensaio. A capacidade da proteína derivada de Ig rela- 25 cionada a IL-4 ou IL-13 humana ou parte ou variante específica de inibir ati- vidade dependente relacionada a IL-4 ou IL-13 é preferencialmente avaliada por ao menos uma proteína derivada de Ig relacionada a IL-4 ou IL-13 ade- quada ou ensaio com proteína, como descrito aqui e/ou como conhecido na técnica. Uma proteína derivada de Ig humana ou parte ou variante específica 30 da invenção pode ser de qualquer classe (IgG, IgA, IgM, IgE, IgD, etc.) ou subclasse (por exemplo, IgAI, lgA2, IgGI, lgG2, lgG3, lgG4, e seus simila- res) ou isotipo e pode compreender uma cadeia leve kapa ou lambda. Em uma modalidade, a proteína derivada de Ig humana ou parte ou variante es- pecífica compreende uma cadeia pesada de IgG ou fragmento definido, por exemplo, ao menos um dentre os isotipos, IgGI, lgG2, lgG3 ou lgG4. As proteínas derivadas de Ig desse tipo podem ser preparadas empregando-se 5 um rato transgênico ou outro mamífero não humano transgênico compreen- dendo ao menos uma cadeia leve humana (por exemplo, transgenes IgG, IgA e IgM (por exemplo, yl, γ2, γ3, γ4)) como descrito aqui e/ou conhecido na técnica. Em outra modalidade, a proteína derivada de Ig relacionada a IL-4 ou IL-13 humana ou parte ou variante específica dessa compreende uma 10 cadeia pesada de IgGI e uma cadeia leve de IgGI.

Ao menos uma proteína derivada de Ig ou parte ou variante es- pecífica da invenção se liga a ao menos um epítopo especificado específico a ao menos uma proteína relacionada a IL-4 ou IL-13, subunidade, fragmen- to, parte ou qualquer combinação desses. Ao menos um epítopo pode com- 15 preender ao menos uma região de ligação de proteína derivada de Ig que compreende ao menos uma parte da dita proteína, epítopo que é preferenci- almente compreendido de ao menos uma parte extracelular, solúvel, hidrofí- lica, externa ou parte citoplásmica da dita proteína. Como exemplos não- limitantes, (a) uma proteína derivada de Ig relacionada a IL-4 ou IL-13 ou 20 parte ou variante específica especificamente se liga a ao menos um epítopo compreendendo ao menos 1 a 3, à seqüência de aminoácido inteira, sele- cionado a partir do grupo que consiste em ao menos uma subunidade de um IL-4 ou IL-3 humana, tal como, mas não-limitado a, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 ou 14 aminoácidos de ao menos um de 1-10, 10- 20, 20-30, 25 30-40, 40-50, 50-60, 60-70, 70-80, 80-90, 90-100, 100-110, 110-120, 120- 130, 130- 140, 140-145 de SEQ ID No. 42, 43 ou 44.

Geralmente, a proteína derivada de Ig humana ou fragmento de ligação com antígeno da presente invenção compreenderá uma região de ligação com antígeno que compreende ao menos uma região de determina- 30 ção de complementaridade humana (CDR1, CDR2 e CDR3) ou variante de ao menos uma região variável de cadeia pesada e ao menos uma região de determinação de complementaridade humana (CDR1, CDR2 e CDR3) ou variante de ao menos uma região variável de cadeia leve. Como um exem- plo não-limitante, a proteína derivada de Ig ou parte de ligação de antígeno ou variante pode compreender ao menos um da CDR3 de cadeia pesada, e/ou de uma CDR3 de cadeia leve. Em uma modalidade particular, a proteí- 5 na derivada de Ig ou fragmento de ligação com antígeno pode ter uma regi- ão de ligação com antígeno que compreende ao menos uma parte de ao menos uma CDR de cadeia pesada (isto é, CDR1, CDR2 e/ou CDR3) tendo a seqüência de aminoácido das CDRs 1, 2, e/ou 3 correspondentes. Em ou- tra modalidade particular, a proteína derivada de Ig ou parte de ligação de 10 antígeno ou variante pode ter uma região de ligação com antígeno que com- preende ao menos uma parte de ao menos uma CDR de cadeia leve (isto é, CDR1, CDR2 e/ou CDR3) tendo a seqüência de aminoácido das CDRs cor- respondentes 1, 2 e/ou 3. Tais proteínas derivadas de Ig podem ser prepa- radas unindo quimicamente as várias partes (por exemplo, CDRs, estrutu- 15 ras) da proteína derivada de Ig usando técnicas convencionais, preparando e expressando uma (isto é, uma ou mais) molécula de aminoácido que codi- fica a proteína derivada de Ig usando técnicas convencionais de tecnologia de DNA recombinante ou usando qualquer outro método adequado.

A proteína derivada de Ig relacionada a IL-4 ou IL-13 pode com- preender ao menos uma de uma região variável de cadeia pesada ou leve tendo uma seqüência de aminoácido definida. Por exemplo, em uma modali- dade preferencial, a proteína derivada de Ig relacionada a IL-4 ou IL-13 compreende ao menos uma região variável de cadeia pesada e/ou ao me- nos uma região variável de cadeia leve. As proteínas derivadas de Ig huma- nas que se ligam a proteínas ou fragmentos relacionados a IL-4 ou IL-13 e que compreendem uma região variável de cadeia leve ou pesada podem ser preparadas usando métodos adequados, tal como exibição de fagos (Kat- sube, Y., e outros, Int J Mol. Med, l(5):863 a 868 (1998)) ou métodos que empregam animais transgênicos, como conhecido na técnica e/ou como descrito aqui. Por exemplo, um rato transgênico, compreendendo um trans- gene de cadeia pesada de imunoglobulina humana funcionalmente rearran- iado e um transgene compreendendo DNA de um lócus de cadeia leve de imunoglobulina humana que pode passar por rearranjo funcional, pode ser imunizada com proteínas relacionadas a IL-4 ou IL-13 ou fragmentos dessas para produzir proteínas derivadas de lg. Se desejado, as células de produ- ção de proteína derivada de Ig podem ser isoladas e hibridomas ou outras 5 células de produção de proteína derivada de Ig imortalizadas podem ser preparadas como descrito aqui e/ou como conhecido na técnica. Alternati- vamente, a proteína derivada de Ig, parte específica ou variante pode ser expressa usando o ácido nucléico codificante ou parte desse em uma célula hospedeira adequada.

A invenção também refere-se a proteínas derivadas de Ig, frag-

mentos de ligação com antígeno, cadeias de imunoglobulina e CDRs com- preendendo aminoácidos em uma seqüência que é substancialmente a mesma de uma seqüência de aminoácido descrita aqui. Preferencialmente, tais proteínas derivadas de Ig ou fragmentos de ligação com antígeno e pro- teínas derivadas de Ig compreendendo tais cadeias ou CDRs podem se ligar a proteínas relacionadas a IL-4 ou IL-13 ou fragmentos com alta afinidade (por exemplo, K0 menor ou igual a aproximadamente 10~9 M). As seqüências de aminoácido que são substancialmente as mesmas das seqüências des- critas aqui incluem seqüências compreendendo substituições de aminoácido conservativas, bem como apagamentos e/ou inserções de aminoácido. Uma substituição conservativa de aminoácido refere-se à substituição de um pri- meiro aminoácido por um segundo aminoácido que tem propriedades quími- cas e/ou físicas (por exemplo, carga, estrutura, polaridade, hidrofobicida- de/hidrofilicidade) que são similares às do primeiro aminoácido. As substitui- ções conservativas incluem substituição de um aminoácido por outro dentro dos seguintes grupos: Iisina (K), arginina (R) e histidina (H); aspartato (D) e glutamato (E); asparagina (N), glutamina (Q), serina (S), treonina (T), tirosina (Y), K, R, H, D e E; alanina (A), valina(V), Ieucina (L), isoleucina (I), prolina (P), fenilalanina (F), triptofano (W)1 metionina (M), cisteína (C) e glicina (G); F, W e Y; C, S e T.

Códigos de Aminoácido Os aminoácidos que produzem as proteínas derivadas de Ig rela- cionadas a IL-4 ou IL-13 ou partes ou variantes específicas da presente in- venção são frequentemente abreviados. As designações de aminoácidos podem ser indicadas designando o aminoácido por seu código de única Ie-

tra, seu código de três letras, nome, ou códons de três nucleotídeos como é bem entendido na técnica (vide Alberts, B., e outros, Molecular Biology of The Cell, Third Ed., Garland Publishing, Inc., Nova Iorque, 1994):

Código de Código de Nome Códon(s) de três nucleotí¬ Única Le¬ Três Letras deos tra A Ala Alanina GCA, GCC, GCG, GCU C Cys Cisteína UGC, UGU D Asp Ácido aspártico GAC, GAU E Glu Ácido glutâmico GAA1 GAG F Phe Fenilanina UUC, UUU G Gly Glicina GGA, GGC, GGG, GGU H His Histidina CAC, CAU I Ile Isoleucina AUA, AUC, AUU K Lys Lisina AAA, AAG L Leu Leucina UUA, UUG, CUA, CUC, CUG, CUU M Met Metionina AUG N Asn Asparagina AAC, AAU P Pro Prolina CCA, CCC, CCG, CCU Q Gln Glutamina CAA, CAG R Arg Arginina AGA, AGG, CGA, CGC, CGG, CGU S Ser Serina AGC, AGU, UCA, UCC, UCG, UCU T Thr Treonina ACA, ACC, ACG, ACU \/ Vp! N/plinp Gl IA Gl ir. fil )Π Gl Il I I ‘ ........ I I

W Trp Triptofano UGG Y Tyr Tirosina UAC, UAU Uma proteína derivada de Ig relacionada a IL-4 ou IL-13 ou parte

ou variante específica da presente invenção pode incluir uma ou mais substi- tuições, apagamentos ou adições de aminoácido, ou a partir de mutações naturais ou de manipulação humana, como especificado aqui.

É claro que o número de substituições de aminoácido que um

versado na técnica faria depende de muitos fatores, incluindo aqueles des- critos acima. Geralmente falando, o número de substituições, inserções ou apagamentos de aminoácidos para qualquer dados polipeptídeo relacionado a IL-4 ou IL-13 não serão maior do que 40, 30, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1, tal como 1 a 30 ou qualquer faixa ou valor neste, como especificado aqui.

Aminoácidos em uma proteína derivada de Ig relacionada a IL-4 ou IL-13 ou parte ou variante específica da presente invenção que são es- senciais para funcionar podem ser identificados por métodos conhecidos na técnica, tal como mutagênese sítio-dirigida ou mutagênese de varredura de alanina (por exemplo, Ausubel, acima, Capítulos 8, 15; Cunningham e Wells, Science 244: 1081 a 1085 (1989)). O último procedimento introduz únicas mutações de alanina em cada resíduo na molécula. As moléculas mutantes resultantes são então testadas por atividade biológica, tal como, mas não- limitadas a uma atividade de neutralização de IL-4 ou IL-13. Os sítios que são cruciais para ligação de proteína derivada de Ig ou parte ou variante es- pecífica podem também ser identificados por análise estrutural tal como cris- talização, ressonância magnética nuclear ou rótulo de fotoafinidade (Smith, e outros, J. Mol. Biol. 224:899 a 904 (1992) e de Vos, e outros, Science 255:306 a 312 (1992)).

As proteínas derivadas de Ig ou partes ou variantes específicas da presente invenção, ou variantes específicas dessas, podem compreender qualquer número de resíduos de aminoácido contíguos a partir de uma pro- teína derivada de Ig ou parte ou variante específica da presente invenção, onde esse número é selecionado p. partir do grupo rie inteiros que consiste* em 10 a 100% do número de resíduos contíguos em uma proteína derivada de Ig relacionada a IL-4 ou IL-13 ou parte ou variante específica. Opcional- mente, essa subsequência de aminoácidos contíguos é ao menos aproxima- damente 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 5 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250 ou mais aminoácidos em comprimento, ou qualquer faixa ou valor neste. Ademais, o número de tais subsequências pode ser qualquer inteiro selecionado a partir do grupo que consiste em 1 a 20, tal como ao menos 2, 3, 4 ou 5.

Como os versados na técnica apreciarão, a presente invenção 10 inclui ao menos uma proteína derivada de Ig biologicamente ativa ou parte ou variante específica da presente invenção. As proteínas derivadas de Ig biologicamente ativas ou parte ou variantes específicas têm uma atividade específica ao menos 20%, 30%, ou 40%, e preferencialmente ao menos 50%, 60%, ou 70%, e mais preferencialmente ao menos 80%, 90%, ou 95% 15 a 1000% daquela da proteína derivada de Ig conhecida e relacionada ou endógena nativa (não sintética) ou parte ou variante específica. Os métodos de ensaiar e quantificar medidas de atividade enzimática e especificidade de substrato, são bem conhecidos pelos versados na técnica.

Em outro aspecto, a invenção refere-se a proteínas derivadas de Ig humanas e fragmentos de ligação com antígeno, como descrito aqui, que são modificadas pela ligação covalente de uma porção orgânica. Tal modifi- cação pode produzir uma proteína derivada de Ig ou fragmento de ligação com antígeno com propriedades farmacocinéticas (por exemplo, meia-vida de soro in vivo aumentada). A porção orgânica pode ser um grupo polimérico hidrofílico linear ou ramificado, grupo de ácidos graxos, ou grupo de éster de ácido graxo. Em modalidades particulares, o grupo polimérico hidrofílico po- de ter um peso molecular de aproximadamente 800 a aproximadamente 120.000 Daltons e pode ser um polialcano glícol (por exemplo, polietileno glicol (PEG), polipropileno glicol (PPG), polímero de carboidrato, polímero de aminoácido ou polivinila pirrolidona e grupo de ácido graxo ou éster de ácido graxo pode compreender de aproximadamente oito a aproximadamente qua- renta átomos de carbono. I

As proteínas derivadas de Ig modificadas e fragmentos de liga- ção com antígeno da invenção podem compreender uma ou mais porções orgânicas que são covalentemente ligadas, direta ou indiretamente, à proteí- na derivada de Ig ou parte ou variante específica. Cada porção orgânica que 5 está ligada a uma proteína derivada de Ig ou fragmento de ligação com antí- geno pode independentemente ser um grupo polimérico hidrofílico, um grupo de ácido graxo ou um grupo de éster de ácido graxo. Como usado aqui, o termo “ácido graxo” abrange ácidos monocarboxílicos e ácidos dicarboxíli- cos. Um “grupo polimérico hidrofílico”, como o termo é usado aqui, refere-se 10 a um polímero orgânico que é mais solúvel em água do que em octano. Por exemplo, a polilisina é mais solúvel em água do que em octano. Assim, uma proteína derivada de Ig modificada pela ligação covalente de polilisina é a- brangida pela invenção. Os polímeros hidrofílicos adequados para modificar as proteínas derivadas de Ig da invenção podem ser lineares ou ramificados 15 e incluem, por exemplo, polialcano glicóis (por exemplo, PEG, monometoxi- polietileno glicol (mPEG), PPG e seus similares), carboidratos (por exemplo, dextrano, celulose, oligossacarídeos, polissacarídeos e seus similares), po- límeros de aminoácidos hidrofílicos (por exemplo, polilisina, poliarginina, po- Iiaspartato e seus similares) e polivinila pirrolidona. Preferencialmente, o po- 20 límero hidrofílico que modifica a proteína derivada de Ig da invenção tem um peso molecular de aproximadamente 800 a aproximadamente 150.000 Dal- tons como uma entidade molecular separada. Por exemplo, PEG5000 e PEG20.000, quando o subscrito é o peso molecular médio do polímero em Dal- tons, pode ser usado.

O grupo polimérico hidrofílico pode ser substituído com grupos

éster de ácido graxo ou grupo de ácido graxo de um a aproximadamente seis alquila. Os polímeros hidrofílicos que são substituídos com um grupo de ácido graxo ou éster de ácido graxo podem ser preparados empregando mé- todos adequados. Por exemplo, um polímero compreendendo um grupo a- 30 mina pode ser acoplado a um carboxilato do ácido graxo ou éster de ácido graxo, e um carboxilato ativado (por exemplo, ativado com Ν,Ν-carbonila di- imidazol) em um ácido graxo ou éster de ácido graxo pode ser acoplado a um grupo hidroxila em um polímero.

Os ácidos graxos e ésteres de ácido graxo para modificar proteí- nas derivadas de Ig da invenção podem ser saturados ou podem conter uma ou mais unidades de insaturação. Os ácidos graxos que são adequados pa- ra modificar proteínas derivadas de Ig da invenção incluem, por exemplo, n- dodecanoato (Ci2, laurato), n-tetradecanoato (Ci4, miristato), n- octadecanoato (Ci8, estearato), n-eicosanoato (C2O, araquidato), n- docosanoato (C22, behenato), n-triacontanoato (C30), n-tetracontanoato (C40)1 cis-A9-octadecanoato (C18, oleato), todos cis- A5,8,11,14-eicosatetraenoato (C2o, araquidonato), ácido octanodióico, ácido tetradecanedióico, ácido octa- decanedióico, ácido docosanedióico, e seus similares. Os ésteres de ácido graxo adequados incluem monoésteres de ácidos dicarboxílicos que com- preendem um grupo alquila inferior linear ou ramificado. O grupo alquila infe- rior pode compreender de um a aproximadamente doze, preferencialmente um a aproximadamente seis átomos de carbono.

As proteínas derivadas de Ig humanas modificadas e fragmentos de ligação com antígeno podem ser preparadas usando métodos adequa- dos, tal como por reação com um ou mais agentes de modificação. Um “a- 20 gente de modificação” como o termo é usado aqui, refere-se a um grupo or- gânico adequado (por exemplo, polímero hidrofílico, um ácido graxo, um és- ter de ácido graxo) que compreende um grupo de ativação. Um “grupo de ativação” é uma porção química ou grupo funcional que podem, sob condi- ções apropriadas, reagir com um segundo grupo químico formando desse 25 modo uma ligação covalente entre o agente de modificação e o segundo grupo químico. Por exemplo, os grupos de ativação amina reativos incluem grupos eletrofílicos tais como tosilato, mesilato, halo (cloro, bromo, flúor, io- do), ésteres de N-hidroxisuccinimidila (NHS) e seus similares. Os grupos de ativação que podem reagir com tióís incluem, por exemplo, maleimida, iodo- 30 acetila, acrilolila, piridila dissulfetos, ácido 5-tiol-2-nitrobenzóico tiol (TNB- tiol), e seus similares. Um grupo funcional aldeído pode ser acoplado a mo- léculas contendo amina ou hidrazida, e um qruoo azida oode reaqir com um I

grupo fosforoso trivalente para formar ligações fosforamidato ou fosforimida. Os métodos adequados para introduzir os grupos de ativação em moléculas são conhecidos na técnica (vide, por exemplo, Hermanson1 G. T., Bioconju- gate Techniques, Academic Press: San Diego, CA (1996)). Um grupo de ati- 5 vação pode ser ligado diretamente ao grupo orgânico (por exemplo, polímero hidrofílico, ácido graxo, éster de ácido graxo), ou através de uma porção Ii- gante, por exemplo, um grupo C1-Ci2 divalente onde um ou mais átomos de carbono podem ser substituídos por um heteroátomo tal como oxigênio, ni- trogênio ou enxofre. As porções Iigantes incluem, por exemplo, tetraetileno 10 glicol, -(CH2)3-, -NH-(CH2)6-NH-, -(CH2)2-NH- e -CH2-O-CH2-CH2-O-CH2-CH2- 0-CH-NH-. Os agentes modificantes que compreendem uma porção Iigante podem ser produzidos, por exemplo, reagindo um mono-Boc-alquildiamina (por exemplo, mono-Boc-etilenodiamina, mono-Boc-diamino-hexano) com um ácido graxo na presença de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodi-imida 15 (EDC) para formar uma ligação amida entre a amina livre e o carboxilato de ácido graxo. O grupo de proteção Boc pode ser removido do produto por tratamento com ácido trifluoracético (TFA) para expor uma amina primária que pode ser acoplada a outro carboxilato como descrito, ou pode ser reagi- da com anidrido maléico e o produto resultante ciclizado para produzir um 20 derivado de maleimido ativado do ácido graxo. (vide, por exemplo, Thomp- son e outros, WO 92/16221, seus ensinamentos são incorporados aqui a título de referência).

As proteínas derivadas de Ig modificadas da invenção podem ser produzidas reagindo-se uma proteína derivada de Ig humana ou fragmento 25 de ligação com antígeno com um agente modificante. Por exemplo, as por- ções orgânicas podem ser ligadas à proteína derivada de Ig de uma maneira não sítio-específica empregando um agente de modificação reativo à amina, por exemplo, um éster NHS de PEG. As proteínas derivadas de Ig humanas ou fragmentos de ligação com antígeno podem também ser preparados re- 30 duzindo-se as ligações dissulfeto (por exemplo, ligações dissulfeto intraca- deia) de uma proteína derivada de Ig ou fragmento de ligação com antígeno. A proteína derivada de Ig reduzida ou fragmento de ligação com antígeno pode então ser reagido com um agente modificante reativo ao tiol para pro- duzir a proteína derivada de Ig modificada da invenção. As proteínas deriva- das de Ig modificadas e os fragmentos de ligação com antígeno compreen- dendo uma porção orgânica que é ligada a sítios específicos de uma proteí- 5 na derivada de Ig ou parte ou variante específica da presente invenção po- dem ser preparadas usando métodos adequados, tais como proteólise re- versa (Fisch e outros, Bioconjugate Chem., 3:147 a 153 (1992); Werlen e outros, Bioconjugate Chem., 5:411 a 417 (1994); Kumaran e outros, Protein Sei. 6(10):2233 a 2241 (1997); Itoh e outros, Bioorg. Chem., 24(1 ):59 a 68 10 (1996); Capellas e outros, Biotechnol Bioeng., 56(4):456 a 463 (1997)), e os métodos descritos em Hermanson, G. T., Bioconjugate Techniques, Acade- mic Press: San Diego, CA (1996).

Proteína Derivada de Ig Relacionada a IL-4 ou IL-13 ou Parte Específica ou Composições Variantes A presente invenção também fornece ao menos uma proteína

derivada de Ig relacionada a IL-4 ou IL-13 ou parte específica ou composi- ção variante compreendendo ao menos uma, ao menos duas, ao menos três, ao menos quatro, ao menos cinco, ao menos seis ou mais proteínas derivadas de Ig relacionadas a IL-4 ou IL-13 ou partes específicas ou varian- 20 tes dessas, como descrito aqui e/ou como conhecido na técnica são forneci- das em uma composição, mistura ou forma não ocorrendo naturalmente. Tais composições compreendem composições não ocorrendo naturalmente compreendendo a menos uma ou duas variantes apagadas no C-terminal e/ou N-terminal, domínios, fragmentos, ou variantes específicas, a seqüência 25 de aminoácido de proteína derivada de Ig relacionada a IL-4 ou IL-13, ou fragmentos específicos, domínios ou variantes dessa. Tais porcentagens de composição são em peso, volume, concentração, molaridade, ou molaridade como soluções líquidas ou secas, misturas, suspensões, emulsões ou colói- des, como conhecido na técnica ou como descrito aqui.

A proteína derivada de Ig relacionada a IL-4 ou IL-13 ou parte

específica ou composições variantes da presente invenção pode adicional- mente compreender ao menos um de qualquer auxiliar adequado, tal como. I

mas não-limitado a, diluente, iigante, estabilizante, tampões, sais, solventes iipofiiicos, conservantes, adjuvantes ou seus similares. Os auxiliares farma- ceuticamente aceitáveis são preferenciais. Exemplos não-limitados e méto- dos para preparar tais soluções estéreis são bem conhecidos na técnica, tal

5 como, mas não-limitados a, Gennaro, Ed., Remington's Pharmaceutical Sci- ences, 18a Edição, Mack Publishing Co. (Easton, PA) 1990. Os veículos far- maceuticamente aceitáveis podem ser rotineiramente selecionados, os quais são adequados para o modo de administração, solubilidade e/ou estabilida- de da composição relacionada a IL-4 ou IL-13 bem conhecida na técnica ou 10 como descrito aqui.

Os excipientes e aditivos farmacêuticos úteis na presente com- posição incluem, mas não estão limitados a proteínas, aminoácidos, lipídeos, e carboidratos (por exemplo, açúcares, incluindo monossacarídeos, di-, tri-, tetra-, e oligossacarídeos; açúcares derivatizados tal como aditóis, ácido al- dônico, açúcares esterificados e seus similares; e polissacarídeos ou políme- ros de açúcar), que podem estar presentes exclusivamente ou em combina- ção, compreendendo sozinhos ou em combinação de 1 a 99,99% em peso ou volume. Os excipientes de proteína exemplificados incluem albumina de soro tal como albumina de soro humano (HSA), albumina humana recombi- nante (rHA), gelatina, caseína, e seus similares. O aminoácido/proteína deri- vada de Ig representativo ou parte específica ou componentes variantes, que podem também funcionar em uma capacidade de tamponagem, incluem a- lanina, glicina, arginina, betaína, histidina, ácido glutâmico, ácido aspártico, cisteína, lisina, leucina, isoleucina, valina, metionina, fenilalanina, aspartame, e seus similares. Um aminoácido preferencial é glicina.

Os excipientes de carboidrato adequados para uso na invenção incluem, por exemplo, monossacarídeos tal como frutose, maltose, galacto- se, glicose, D-manose, sorbose, e seus similares; dissacarídeos, tal como lactose, sacarose, tre-halose, celobiose, e seus similares; polissacarídeos, 30 tal como rafinose, melezitose, maltodextrinas, dextranos, amidos, e seus similares; e alditóis tal como manitol, xilitol, maltitol, lactitol, xilitol sorbitol (glucitol), mioinositol, e seus similares. Os excipientes de carboidrato prefe- renciais para uso na presente invenção são manitol, tre-halose e rafinose.

As composições de proteína derivadas de Ig relacionadas a IL-4 ou IL-13 podem também incluir um tampão ou um agente de ajustamento de pH; tipicamente, o tampão é um sal preparado a partir de um ácido orgânico ou base. Os tampões representativos incluem sais de ácido orgânico tal co- mo sais de ácido cítrico, ácido ascórbico, ácido glucônico, ácido carbônico, ácido tartárico, ácido succínico, ácido acético, ácido ftálico; Tris, cloridrato de trometamina, os tampões de fosfato. Os tampões de fosfato para uso nas presentes composições são sais de ácido orgânico tal como citrato.

Adicionalmente, a proteína derivada de Ig relacionada a IL-4 ou IL-13 ou parte específica ou composições variantes da invenção pode incluir excipientes/aditivos poliméricos tais como polivinilpirrolidonas, Ficoll (um a- çúcar polimérico), dextratos (por exemplo, ciclodextrinas, tal como 2- hidroxipropil-p-ciclodextrina), polietileno glicóis, agentes flavorizantes, agen- tes antimícrobianos, adoçantes, antioxidantes, agentes antiestáticos, tensoa- tivos (por exemplo, polisorbatos tais como “TWEEN 20” e “TWEEN 80”), lipí- deos (por exemplo, fosfolipídeos, ácidos graxos), esteróides (por exemplo, colesterol), e agentes quelantes (por exemplo, EDTA).

Esses e excipientes farmacêuticos conhecidos adicionais e/ou aditivos adequados para uso nas composições relacionadas a IL-4 ou IL-13 de acordo com a invenção são conhecidos na técnica, por exemplo, como listado em “Remington: The Science & Practice of Pharmacy", 19a ed., Willi- ams & Williams, (1995), e no "Physician's Desk Reference", 52a ed., Medicai Economics, Montvale, NJ (1998), as descrições dos quais são inteiramente incorporadas aqui a título de referência. O veículo ou materiais excipientes adicionais são carboidratos (por exemplo, sacarídeos e alditóis) e tampões (por exemplo, citrato) ou agentes poliméricos.

Composições de Proteína Derivada de Ig compreendendo Com- ponentes terapêuticos adicionais

A composição pode opcionalmente adicionalmente compreender uma quantidade eficaz de ao menos um componente ou proteína seleciona- I

do a partir de ao menos um dentre um fármaco anti-infectivo, um fármaco para o sistema cardiovascular (CV)1 um fármaco para o sistema nervoso central (CNS)1 um fármaco para o sistema nervoso autônomo (SNA), um fármaco para o trato respiratório, um fármaco para o trato gastrointestinal 5 (Gl), um fármaco hormonal, um fármaco para equilíbrio de fluidos ou eletróli- to, um fármaco hematológico, um antineoplásico, um fármaco imunomodula- ção, um fármaco oftálmico, ótico ou nasal, um fármaco tópico, um fármaco nutricional ou seus similares. Tais fármacos são bem conhecidos na técnica, incluindo formulações, indicações, dosagem e administração para cada um 10 apresentado aqui (vide, por exemplo, Nursing 2001 Handbook of Drugs, 21a edição, Springhouse Corp., Springhouse, PA, 2001; Health ProfessionaTs Drug Guide 2001, ed., Shannon, Wilson, Stang, Prentice-Hall1 lnc, Upper Saddle River, NJ; Pharmcotherapy Handbook, Wells e outros, ed., Appleton

& Lange1 Stamford, CT, cada um inteiramente incorporado aqui a título de referência).

O fármaco anti-infectivo pode ser ao menos um selecionado a partir de amebicídas ou ao menos um dentre antiprotozoários, antelmínticos, antifúngicos, antimalários, antituberculóticos, ou ao menos um dentre antile- próticos, aminoglicosídeos, penicilinas, cefalosporinas, tetraciclinas, sulfo- 20 namidas, fluorquinolonas, antivirais, anti-infectivos macrolida, anti-infectivos miscelâneos. O fármaco para CV pode ser ao menos um selecionado a partir de inotrópicos, antiarrítmicos, antianginais, antihipertensivos, antilipêmicos, fármacos cardiovasculares miscelâneos. O fármaco para CNS pode ser ao menos um selecionado a partir de analgésicos não narcóticos ou ao menos 25 um selecionado a partir de antipiréticos, fármacos anti-inflamatórios não es- teroidais, narcóticos ou ao menos um analgésico opióide, hipnóticos sedati- vos, anticonvulsivos, antidepressivos, fármacos antiansiedade, antipsicóti- cos, estimulantes do sistema nervoso central, antiparkinsonianos, fármacos do sistema nervoso central miscelâneos. O fármaco para ANS pode ser ao 30 menos um selecionado a partir de colinérgicos (parasimpatomiméticos), anti- colinérgicos, adrenérgicos (simpatomiméticos), bloqueadores adrenérgicos (simpatolíticos). relaxantes do músculo esqueletal. bloqueadores neuromus- culares. O fármaco para o trato respiratório pode ser ao menos um selecio- nado a partir de anti-histaminas, broncodilatadores, expectorantes ou ao menos um fármaco antitussígeno, respiratório miscelâneo. O fármaco para o trato Gl pode ser ao menos um selecionado a partir de antiácidos ou ao me- 5 nos um absorvente ou ao menos um antiflatulentos, enzimas digestivas ou ao menos solubilizantes de cálculo biliar, antidiarréicos, laxativos, antieméti- cos, fármacos antiúlcera. O fármaco hormonal pode ser ao menos um sele- cionado a partir de corticoesteróides, andrógenos ou ao menos um esteróide anabólico, estrógenos ou ao menos uma progestina, gonadotropinas, fárma- 10 cos antidiabéticos ou ao menos um glucagon, hormônios para tiróide, anta- gonistas do hormônio da tiróide, hormônios da pituitária, fármacos tipo para- tiróide. O fármaco para equilíbrio de fluido e eletrólito pode ser ao menos um selecionado a partir de diuréticos, eletrólitos ou ao menos uma solução de substituição, acidificantes ou ao menos um alcalinizante. O fármaco hemato- 15 lógico pode ser ao menos um selecionado a partir de hematínicos, anticoa- gulantes, derivados de sangue, enzimas trombolíticas. Os antineoplásicos podem ser ao menos um selecionado a partir de fármacos alquilantes, anti- metabólitos, antineoplásicos antibióticos, antineoplásicos que alteram o equi- líbrio hormonal, antineoplásicos miscelâneos. O fármaco de imunomodula- 20 ção pode ser ao menos um selecionado a partir de imunosupressores, vaci- nas ou ao menos um toxóide, antitoxinas, ou ao menos um antiveninas, so- ros imunes, modificadores da resposta biológica. Os fármacos oftálmicos, óticos e nasais podem ser ao menos um selecionado a partir de anti- infectivos oftálmicos, anti-inflamatórios oftálmicos, mióticos, midriáticos, va- 25 soconstritores oftálmicos, oftálmicos miscelâneos, fármacos óticos, nasais. O fármaco tópico pode ser ao menos um selecionado a partir de anti-infectivos locais, escabicidas ou ao menos um pediculicidas, corticoesteróides tópicos.

O fármaco nutricional pode ser ao menos um selecionado a partir de vitami- nas, minerais, ou calóricos. Vide, por exemplo, o conteúdo de Nursing 2001 Drug Handbook, acima.

Ao menos um amebicida ou antiprotozoário pode ser selecionado a partir de atovaauona, cloridrato de cloroquina. fofosfato de cloroauina. me- tronidazol, cloridrato de metronidazol, isetionato de pentamidina. Ao menos um antelmíntico pode ser selecionado a partir de mebendazol, pamoato de pirantel, tiabendazol. Ao menos um antifúngico pode ser selecionado a partir de anfotericina B1 complexo de sulfato de colesterila e anfotericina B1 com- 5 plexo de lipídeo e anfotericina B1 anfotericina B lipossômica, fluconazol, fluci- tosina, griseofulvina microsize, griseofulvina ultramicrosize, itraconazol, ce- toconazol, nistatina, cloridrato de terbinafina. Ao menos um antimalário pode ser selecionado a partir de cloridrato de cloroquina, fosfato de cloroquina, doxiciclina, sulfato de hidroxicloroquina, cloridrato de mefloquina, fosfato de 10 primaquina, pirimetamina, pirimetamina com sulfadoxina. Ao menos um anti- tuberculótico ou antileprótico pode ser selecionado a partir de clofazimina, cicloserina, dapsona, cloridrato de etambutol, isoniazida, pirazinamida, rifa- butina, rifampina, rifapentina, sulfato de estreptomicina. Ao menos uma ami- noglicosida pode ser selecionada a partir de sulfato de amicaina, sulfato de 15 gentamicina, sulfato de neomicina, sulfato de estreptomicina, sulfato de to- bramicina. Ao menos uma penicilina pode ser selecionada a partir de amoxi- lina/clavulanato de potássio, tri-idrato de amoxilina, ampicilina, ampicilina de sódio, tri-idrato de ampicilina, ampicilina de sódio/sulbactama de sódio, clo- xacilina de sódio, dicloxacilina de sódio, mezlocilina de sódio, nafcilina de 20 sódio, oxacilina de sódio, benzatina de penicilina G1 penicilina G potássio, penicilina G procaína, penicilina G sódio, penicilina V potássio, piperacilina de sódio, piperacilina de sódio/tazobactama de sódio, ticarcilina dissódio, ticarcilina dissódio/clavulanato de potássio. Ao menos uma cefalosporina pode ser selecionada a partir de cefaclor, cefadroxila, cefazolina de sódio, 25 cefdinir, cloridrato de cefepime, cefixima, cefmetazol de sódio, cefonicida de sódio, cefoperazona de sódio, cefotaxima de sódio, cefotetano dissódio, ce- foxitina de sódio, cefpodoxima proxetila, cefprozila, ceftazidima, ceftibuteno, ceftizoxima de sódio, ceftriaxona de sódio, cefuroxima axetila, cefuroxima de sódio, cloridrato de cefalexina, monoidrato de cefalexina, cefradina, Ioracar- 30 bef. Ao menos uma tetraciclina pode ser selecionada a partir de cloridrato de demeclociclina, doxiciclina de cálcio, hiclato de doxiciclina, cloridrato de do- xiciclina, monoidrato de doxiciclina, cloridrato de minociclina, cloridrato de tetraciclina. Ao menos uma sulfonamida pode ser selecionada a partir de cotrimoxazol, sulfadiazina, sulfametoxazol, sulfisoxazol, sulfisoxazol acetila. Ao menos uma fluorquinolona pode ser selecionada a partir de mesilato de alatrofloxacina, ciprofloxacina, enoxacina, levofloxacina, cloridrato de Iome- 5 floxacina, ácido nalidíxico, norfloxacina, ofloxacina, esparfloxacina, mesilato de trovafloxacina. Ao menos antiviral pode ser selecionado a partir de sulfato de abacavir, aciclovir de sódio, cloridrato de amantadina, amprenavir, cidofo- vir, mesilato de delavirdina, didanosina, efavirenz, famciclovir, fomivirsen de sódio, foscarnet de sódio, ganciclovir, sulfato de indinavir, lamivudina, Iami- 10 vudina/zidovudina, mesilato de nelfinavir, nevirapina, fosfato de oseltamivir, ribavirina, cloridrato de rimantadina, ritonavir, saquinavir, mesilato de saqui- navir, stavudine, cloridrato de valaciclovir, zalcitabina, zanamivir, zidovudina. Ao menos um anti-infectivo de macrolina pode ser selecionado a partir de azitromicina, claritromicina, diritromicina, base de eritromicina, estolato de 15 eritromicina, etilsuccinato de eritromicina, Iactobionato de eritromicina, estea- rato de eritromicina. Ao menos um anti-infectivo miscelâneo pode ser sele- cionado a partir de aztreonam, bacitracin, sucinato de sódio e cloranfenicol, cloridrato de clindamicina, cloridrato de palmitato de clindamicina, fosfato de clindamicina, imipenem e cilastatina de sódio, meropenem, macrocristais de 20 nitrofurantoina, microcristais de nitrofurantoina, quinupristina/dalfopristina, cloridrato de espectinomicina, trimetoprim, cloridrato de vancomicina. (Vide, por exemplo, pág. 24 a 214 de Nursing 2001 Drug Handbook).

Ao menos um inotrópico pode ser selecionado a partir de Iactato de amrinona, digoxina, Iactato de milrinona. Ao menos um antiarrítmico pode 25 ser selecionado a partir de adenosina, cloridrato de amiodarona, sulfato de atropina, tosilato de bretilio, cloridrato de diltiazem, disopiramida, fosfato de disopiramida, cloridrato de esmolol, acetato de flecainida, fumarato de ibutili- da, cloridrato de idocaína, cloridrato de mexiletina, cloridrato de moricizina, fenitoína, fenitoína de sódio, cloridrato de procainamida, cloridrato de propa- 30 fenona, cloridrato de propranolol, bissulfato de quinidina, gluconato de quini- dina, poligalacturonato de quinidina, sulfato de quinidina, sotalol, cloridrato de tocainida, cloridrato de Veraoamil. Ao menos um antianqinal pode ser se- I

lecionado a partir de besilato de anlodipidina, nitrito de amila, cloridrato de bepridila, cloridrato de diltiazem, dinitrato de isosorbida, mononitrato de iso- sorbida, nadolol, cloridrato de nicardipina, nifedipina, nitroglicerina, cloridrato de propranolol, verapamila, cloridrato de verapamil. Ao menos um antihiper- 5 tensivo pode ser selecionado a partir de cloridrato de acebutolol, besilato de anlodipina, atenolol, cloridrato de benazeprila, cloridrato de betaxolol, fuma- rato de bisoprolol, candesartan cilexetila, captoprila, cloridrato de carteolol, carvedilol, clonidina, cloridrato de clonidina, diazoxida, cloridrato de diltia- zem, mesilato de doxazosina, enalaprilat, maleato de enalaprila, mesilato de 10 eprosartana, felodipina, mesilato de fenoldopam, fosinoprila de sódio, aceta- to de guanabenz, sulfato de guanadrel, cloridrato de guanfacina, cloridrato de hidralazina, irbesartana, isradipina, cloridrato de labetalol, lisinoprila, Io- sartana de potássio, metildopa, cloridrato de metildopato, succinato de me- toprolol, tartarato de metoprolol, minoxidila, cloridrato de moexiprila, nadolol, 15 cloridrato de nicardipina, nifedipina, nisoldipina, nitroprussida de sódio, sulfa- to de penbutolol, perindoprila erbumina, mesilato de fentolamina, pindolol, cloridrato de prazosina, cloridrato de propranolol, cloridrato de quinaprila, ramiprila, telmisartan, cloridrato de terazosina, maleato de timolol, trandola- prila, valsartana, cloridrato de verapamil. Ao menos um antilipêmico pode ser 20 selecionado a partir de atorvastatina de cálcio, cerivastatina de sódio, coles- tiramina, cloridrato de colestipol, fenofibrato (micronizado), fluvastatina de sódio, gemfibrozila, lovastatina, niacina, pravastatina de sódio, simvastatina. Ao menos um fármaco para CV miscelâneo pode ser selecionado a partir de abciximabe, alprostadila, cloridrato de arbutamina, cilostazol, bissulfato de 25 clopidogrel, dipiridamol, eptifibatida, cloridrato de midodrina, pentoxifilina, cloridrato de ticlopidina, cloridrato de tirofiban. (Vide, por exemplo, pág. 215 a 336 de Nursing 2001 Drug Handbook).

Ao menos um analgésico não narcótico ou antipirético pode ser selecionado a partir de acetaminofeno, aspirina, trisalicilato de magnésio colina, diflunisal, salicilato de magnésio. Ao menos um fármaco anti- inflamatório não esteroidal pode ser selecionado a partir de celecoxibe, diclo- fenaco de potássio, diclofenaco de sódio, etodolaco. fenoprofeno de cálcio, flurbiprofeno, ibuprofeno, indometacina, tri-idrato de indomethacina de sódio, cetoprofeno, cetorolaco trometamina, nabumetona, naproxeno, naproxeno de sódio, oxaprozina, piroxicam, rofecoxibe, suiindaco. Ao menos um anal- gésico opióide ou narcótico pode ser selecionado a partir de cloridrato de 5 alfentanila, cloridrato de buprenorfina, tartarato de butorfanol, fosfato de co- deína, sulfato de codeina, citrato de fentanila, sistema transdérmico de fen- tanila, fentanila transmucosal, cloridrato de hidromorfona, cloridrato de me- peridina, cloridrato de metadona, cloridrato de morfina, sulfato de morfina, tartarato de morfina, cloridrato de nalbufina, cloridrato de oxicodona, pectina- 10 to de oxicodona, cloridrato de oximorfona, cloridrato de pentazocina, cloridra- to de pentazocina e cloridrato de naloxona, Iactato de pentazocina, cloridrato de propoxifeno, napsilato de propoxifeno, cloridrato de remifentanila, citrato de sufentanial, cloridrato de tramadol. Ao menos um hipnótico-sedativo pode ser selecionado a partir de hidrato cloral, estazolam, cloridrato de fluraze- 15 pam, pentobarbital, pentobarbital de sódio, fenobarbital de sódio, secobarbi- tal de sódio, temazepam, triazolam, zaleplon, tartarato de zolpidem. Ao me- nos um anticonvulsivo pode ser selecionado a partir de acetazolamida de sódio, carbamazepina, clonazepam, clorazepato dipotássio, diazepam, di- valproex de sódio, etosuximda, fosfenitoína de sódio, gabapentina, Iamotrigi- 20 na, sulfato de magnésio, fenobarbital, fenobarbital de sódio, fenitoína, fenito- ína de sódio, fenitoína de sódio (estendido), primidona, cloridrato de tiagabi- na, topiramato, valproato de sódio, ácido valpróico. Ao menos um antide- pressivo pode ser selecionado a partir de cloridrato de amitriptilina, pamoato de amitriptilina, amoxapina, cloridrato de bupropion, bromidrato de citalo- 25 pram, cloridrato de clomipramina, cloridrato de desipramina, cloridrato de doxepina, cloridrato de fluoxetina, cloridrato de imipramina, pamoato de imi- pramina, mirtazapina, cloridrato de nefazodona, cloridrato de nortriptilina, cloridrato de paroxetina, sulfato de fenelzina, cloridrato de sertralina, sulfato de tranilcipromina, maleato de trimipramina, cloridrato de venlafaxina. Ao 30 menos um fármaco antiansiedade pode ser selecionado a partir de alprazo- lam, cloridrato de buspirona, clordiazepoxida, cloridrato de clordiazepoxida, clorazeoato de dipotássio, diazeoam, cloridrato de doxepina, embonato de hidroxizina, cloridrato de hidroxizina, pamoato de hidroxizina, lorazepam, mefrobamato, cloridrato de midazolam, oxazepam. Ao menos um fármaco antipsicótico pode ser selecionado a partir de cloridrato de clorpromazina, clozapina, decanoato de flufenazina, fluefenazina enantato, cloridrato de flu- 5 fenazina, haloperidol, decanoato de haloperidol, Iactato de haloperidol, clori- drato de loxapina, succinato de loxapina, besilato de mesoridazina, cloridrato de molindona, olanzapina, perfenazina, pimozida, proclorperazina, quetiapi- na fumarato, risperidona, cloridrato de tioridazina, tiotixeno, cloridrato de tio- tixeno, cloridrato de trifluoperazina. Ao menos um estimulante do sistema 10 nervoso central pode ser selecionado a partir de sulfato de anfetamina, cafe- ína, sulfato de dextroanfetamina, cloridrato de doxapram, cloridrato de me- tanfetamina, cloridrato de metilfenidato, modafinila, pemolina, cloridrato de fentermina. Ao menos um antiparkinsoniano pode ser selecionado a partir de cloridrato de amantadina, mesilato de benztropina, cloridrato de biperidena, 15 Iactato de biperideno, mesilato de bromocriptina, carbidopa-levodopa, enta- capona, levodopa, mesilato de pergolida, dicloridrato de pramipexol, cloridra- to de ropinirol, cloridrato de selegiiina, tolcapona, cloridrato de trihexifenidil. Ao menos um fármaco para o sistema nervoso central miscelâneo pode ser selecionado a partir de cloridrato de bupropiona, cloridrato de donepezila, 20 droperidol, maleato de fluvoxamina, carbonato de lítio, citrato de lítio, clori- drato de naratriptano, nicotina polacrilex, sistema transdérmico de nicotina, propofol, benzoato de rizatriptano, monohidrato cloridrato de sibutramina, succinato de sumatríptano, cloridrato de tacrina, zolmitriptano. (Vide, por exemplo, pág. 337 a 530 de Nursing 2001 Drug Handbook).

Ao menos um colinérgico (por exemplo, parasimpatomimético)

pode ser selecionado a partir de cloreto de betanecol, cloreto de edrofônio, brometo de neostigmina, metilsulfato de neostigmina, salicilato de fisostigmi- na, brometo de piridostigmina. Ao menos um anticolinérgico pode ser sele- cionado a partir de sulfato de atropina, cloridrato de diciclomina, glicopirrola- 30 to, hiosciamina, sulfato de hiosciamina, brometo de propantelina, escopola- mina, butilbrometo de escopolamina, bromidrato de escopolamina. Ao me- nos um adrenérqico (simpatomimético) pode ser selecionado a partir de cio- ridrato de dobutamina, cloridrato de dopamina, bitartarato de metaraminol, bitartarato de norepinefrina, cloridrato de fenilefrina, cloridrato de pseudoefe- drina, sulfato de pseudoefedrina. Ao menos um bloqueador de adrenérgico (simpatolítico) pode ser selecionado a partir de mesilato de di- 5 hidroergotamina, tartarato de ergotamina, maleato de metisergida, cloridrato de propranolol. Ao menos um relaxante muscular pode ser selecionado a partir de baclofeno, carisoprodol, clorzoxazona, cloridrato de ciclobenzapri- na, dantroleno de sódio, metocarbamol, cloridrato de tizanidina. Ao menos um bloqueador neuromuscular pode ser selecionado a partir de besilato de 10 atracurio, besilato de cisatracurio, cloreto de doxacurio, cloreto de mivacurio, brometo de pancuronio, brometo de pipecuronio, brometo de rapacuronio, brometo de rocuronio, cloreto de succinilcolina, cloreto de tubocurarina, bro- meto de vecuronio. (Vide, por exemplo, págs. 531a 584 de Nursing 2001 Drug Handbook).

Ao menos uma anti-histamina pode ser selecionada a partir de

maleato de bronfeniramina, cloridrato de cetirizina, maleato de clorfenirami- na, fumarato de ciemastina, cloridrato de ciproheptadina, cloridrato de difeni- dramina, cloridrato de fexofenadina, loratadina, cloridrato de prometazina, teoclato de prometazina, cloridrato de triprolidina. Ao menos um broncodila- 20 tador pode ser selecionado a partir de albuterol, sulfato de albuterol, aminofi- lina, sulfato de atropina, sulfato de efedrina, epinefrina, bitartarato de epine- frina, cloridrato de epinefrina, brometo de ipratropio, isoproterenol, cloridrato de isoproterenol, sulfato de isoproterenol, cloridrato de levalbuterol, sulfato de metaproterenol, oxtrifilina, acetato de pirbuterol, xinafoato de salmeterol, 25 sulfato de terbutalina, teofilina. Ao menos um expectorante ou antitussígeno pode ser selecionado a partir de benzonatato, fosfato de codeina, sulfato de codeína, bromidrato de dextrometorfano, cloridrato de difenidramina, guaife- nesina, cloridrato de hidromorfona. Ao menos um fármaco respiratório mis- celâneo pode ser ao menos um selecionado a partir de acetilcisteína, dipro- 30 pionato de beclometasona, beractante, budesonida, calfactante, cromolina de sódio, dornase alfa, epoprostenol de sódio, flunisolida, propionato de fluti- casona. montelucast de sódio, nedocromila de sódio, oalivizumabe. acetoni- da de triamcinolona, zafirlucast, zileuton. (Vide, por exemplo, págs. 585 a 642 de Nursing 2001 Drug Handbook).

Ao menos um antiácido, absorvente, ou antiflatulento pode ser selecionado a partir de carbonato de alumínio, hidróxido de alumínio, carbo- nato de cálcio, magaldrato, hidróxido de magnésio, óxido de magnésio, si- meticona, bicarbonato de sódio. Ao menos uma enzima digestiva ou solubili- zante de cálculo biliar pode ser selecionado a partir de pancreatina, pancre- lipase, ursodiol. Ao menos um antidiarréico pode ser selecionado a partir de atapulgita, subsalicilato de bismuto, poiicarbofila de cálcio, cloridrato de dife- noxilato ou sulfato de atropina, loperamida, acetato de octreotida, tintura de ópio, tintura de ópio (canforada). Ao menos um Iaxativo pode ser seleciona- do a partir de bisocodila, policarbofilo de cálcio, cascara sagrada, cascara sagrada aromática fluidextrato, cascara sagrada fluidextrato, óleo de rícino, docusato de cálcio, docusato de sódio, glicerina, lactulose, citrato de magné- sio, hidróxido de magnésio, sulfato de magnésio, metilcelulose, óleo mineral, polietileno glicol ou solução de eletrólito, plantago, senna, fosfato de sódio. Ao menos um antiemético pode ser selecionado a partir de cloridrato de clorpromazina, dimenidrinato, mesilato de dolasetron, dronabinol, cloridrato de granisetron, cloridrato de meclizina, cloridrato de metocloproamida, clori- drato de ondansetron, perfenazina, proclorperazina, edisilato de proclorpera- zina, maleato de proclorperazina, cloridrato de prometazina, escopolamina, maleato de tietilperazina, cloridrato de trimetobenzamida. Ao menos um fár- maco antiúlcera pode ser selecionado a partir de cimetidina, cloridrato de cimetidina, famotidina, lansoprazol, misoprostol, nizatidina, omeprazol, rabe- prozol de sódio, rantidina citrato de bismuto, cloridrato de ranitidina, sucralfa- to. (Vide, por exemplo, pág. 643 a 695 de Nursing 2001 Drug Handbook).

Ao menos um corticoesteróide pode ser selecionado a partir de betametasona, acetato de betametasona ou betametasona fosfato de sódio, acetato de cortisona, dexametasona, acetato de dexametasona, dexameta- 30 sona fosfato de sódio, acetato de fludrocortisona, hidrocortisona, acetato de hidrocortisona, cipionato de hidrocortisona, hidrocortisona fosfato de sódio, hidrocortisona succinato de sódio, metilprednisolona. acetato de metilpredni- solona, metilprednisolona succinato de sódio, prednisolona, acetato de pred- nisolona, prednisolona fosfato de sódio, tebutato de prednisolona, predniso- na, triancinolona, acetonida de triamcinolona, diacetato de triancinolona. Ao menos um androgênio ou esteróides anabólicos podem ser selecionados a 5 partir de danazol, fluoximesterona, metiltestosterona, decanoato de nandro- lona, fenpropionato de nandrolona, testosterona, cipionato de testosterona, enantato de testosterona, propionato de testosterona, sistema transdérmico de testosterona. Ao menos um estrogênio ou progestina pode ser seleciona- do a partir de estrogênio esterificado, estradiol, cipionato de estradiol, siste- 10 ma transdérmico de estradiol/acetato de noretindrona, valerato de estradiol, estrogênios (conjugados), estropipato, etinila estradiol, etinila estradiol e de- sogestrel, etinila estradiol e diacetato de etinodiol, etinila estradiol e deso- gestrel, etinila estradiol e diacetato de etinodiol, etinila estradiol e Ievonor- gestrel, etinila estradiol e noretindrona, etinila estradiol e acetato de noretin- 15 drona, etinila estradiol e norgestimato, etinila estradiol e norgestrel, etinila estradiol e noretindrona e acetato e fumarato ferroso, levonorgestrel, acetato de medroxiprogesterona, mestranol e noretindrona, noretindrona, acetato de noretindrona, norgestrel, progesterona. Ao menos um gonadroptropina pode ser selecionada a partir de acetato de ganirelix, acetato de gonadorelina, 20 acetato de histrelina, menotropinas. Ao menos um antidiabético ou glucago- na pode ser selecionada a partir de acarbose, clorpropamida, glimepirida, glipizida, glucagona, gliburida, insulinas, cloridrato de metformina, miglitol, cloridrato de pioglitazona, repaglinida, maleato de rosiglitazona, troglitazona. Ao menos um hormônio da tiróide pode ser selecionado a partir de Ievotiro- 25 xina de sódio, Iiotironina de sódio, liotrix, tiróide. Ao menos um antagonista de hormônio da tiróide pode ser selecionado a partir de metimazol, iodeto de potássio, iodeto de potássio (solução saturada), propiltiouracila, iodo radioa- tivo (iodeto de sódio 131I), forte solução de iodo. Ao menos um hormônio da pituitária pode ser selecionado a partir de corticotropina, cosintropina, aceta- 30 to de desmofressina, acetato de leuprolida, corticotropina repositória, soma- trem, somatropina, vasopressina. Ao menos um fármaco tipo paratiróide po- de ser selecionado a oartir de calcifediol. calcitonina (humana), calcitonina I

(salmão), calcitriol, di-hidrotaquisterol, etidronato dissódio. (Vide, por exem- plo, pág. 696 a 796 de Nursing 2001 Drug Handbook).

Ao menos um diurético pode ser selecionado a partir de acetazo- lamida, acetazolamida de sódio, cloridrato de amilorida, bumetanida, clortali- dona, etacrinato de sódio, ácido etacrínico, furosemida, hidroclorotiazida, indapamida, manitol, metolazona, espironolactona, torsemida, triantereno, ureia. Ao menos uma solução de eletrólito ou de substituição pode ser sele- cionada a partir de acetato de cálcio, carbonato de cálcio, cloreto de cálcio, citrato de cálcio, glubionato de cálcio, gluceptato de cálcio, gluconato de cál- cio, Iactato de cálcio, fosfato de cálcio (dibásico), fosfato de cálcio (tribásico), dextrano (alto peso molecular), dextrano (baixo peso molecular), hetamido, cloreto de magnésio, sulfato de magnésio, acetato de potássio, bicarbonato de potássio, cloreto de potássio, gluconato de potássio, injeção de Ringer, injeção de Ringer (lactada), cloreto de sódio. Ao menos um acidificante ou alcalinizante pode ser selecionado a partir de bicarbonato de sódio, Iactato de sódio, trometamina. (Vide, por exemplo, pág. 797 a 833 de Nursing 2001 Drug Handbook).

Ao menos um hematínico pode ser selecionado a partir de fuma- rato ferroso, gluconato ferroso, sulfato ferroso, sulfato ferroso (seco), dextra- no de ferro, sorbitol de ferro, polissacarídeo - complexo de ferro, complexo de gluconato férrico e sódio. Ao menos um anticoagulante pode ser selecio- nado a partir de ardeparina de sódio, dalteparina de sódio, danaparóide de sódio, enoxaparina de sódio, heparina de cálcio, heparina de sódio, warfari- na de sódio. Ao menos um derivado de sangue pode ser selecionado a partir de albumina a 5%, albumina a 25%, fator ant-ihemofílico, complexo anticoa- gulante e inibidor, antitrombina Ill (humana), fator IX (humana), complexo de fator IX, frações de proteína de plasma. Ao menos uma enzima trombolítica pode ser selecionada a partir de alteplase, anistreplase, reteplase (recombi- nante), estreptoquinase, uroquinase. (Vide, por exemplo, págs. 834 a 866 de Nursing 2001 Drug Handbook).

Ao menos um fármaco alquilante pode ser selecionado a partir de busulfano. carboplatina. carmustina. clorambucila. cisplatina. ciclofosfamida. ifosfamida, lomustina, mecloretamina cloridrato, melfalano, cloridrato de mel- falano, estreptozocina, temozolomida, tiotepa. Ao menos um metabólito pode ser selecionado a partir de capecitabina, cladribina, citarabina, floxuridina, fosfato de fludarabina, fluorouracila, hidroxiureia, mercaptopurina, metotrexa- 5 to, metotrexato de sódio, tioguanina. Ao menos um antineoplásico antibiótico pode ser selecionado a partir de sulfato de bleomicina, dactinomicina, citrato de daunorrubicina lipossômica, cloridrato de daunorrubicina, cloridrato de doxorrubicina, cloridrato de doxorrubicina lipossômica, cloridrato de epirrubi- cina, cloridrato de idarrubicina, mitomicina, pentostatina, plicamicina, valrru- 10 bicina. Ao menos um antineoplásico que altera o equilíbrio hormonal pode ser selecionado a partir de anastrozol, bicalutamida, estramustina fosfato de sódio, exemestano, flutamida, acetato de goserelina, letrozol, acetato de leuprolida, acetato de megestrol, nilutamida, citrato de tamoxifeno, testolac- tona, citrato de toremifeno. Ao menos um antineoplásico miscelâneo pode 15 ser selecionado a partir de asparaginase, bacilo de Calmette-Guerin (BCG) (vivo intravesical), dacarbazina, docetaxel, etoposida, fosfato de etoposida, cloridrato de gencitabina, cloridrato de irinotecano, mitotano, cloridrato de mitoxantrona, paclitaxel, pegaspargase, porfimero de sódio, cloridrato de procarbazina, rituximabe, teniposida, cloridrato de topotecano, trastuzumabe, 20 tretinoina, sulfato de vinblastina, sulfato de vincristina, tartarato de vinorelbi- na. (Vide, por exemplo, págs. 867 a 963 de Nursing 2001 Drug Handbook).

Ao menos um imunosupressor pode ser selecionado a partir de azatioprina, basiliximabe, ciclosporina, daclizumabe, imunoglobulina de linfó- cito, muromonabe-CD3, micofenolato mofetila, cloridrato de micofenolato 25 mofetila, sirolimus, tacrolimus. Ao menos uma vacina ou toxóide pode ser selecionada a partir da vacina BCG, vacina para cólera, toxóides de diftenia e tétano (adsorvidos), toxóides de diftenia e tétano e vacina pertussis acelu- Iar adsorvida, toxóides de diftenia e tétano e vacina pertussis de célula inte- gral, vacina conjugada de Haemophilus b, vacina da hepatite A (inativa), va- 30 cina da hepatite B (recombinante), vacina do vírus influenza 1999-2000 triva- Iente tipos A & B (antígeno de superfície purificado), vacina do vírus influen- za 1999-2000 trivalente tipos A & B (subvírion ou subvírion purificado), vaci- I

na do vírus influenza 1999-2000 trivalente tipos A & B (vírion integral), vacina do vírus da encefalite Japonesa (inativa), vacina da doença de Lyme (re- combinante OspA), vacina do vírus de sarampo e caxumba e rubéola (vivo), vacina do vírus de sarampo e caxumba e rubéola (vivo atenuado), vacina do 5 vírus do sarampo (vivo atenuado), vacina de polissacarídeo meningocócito, vacina do vírus da caxumba (vivo), vacina para pragas, vacina pneumocóci- ca (polivalente), vacina do poliovírus (inativa), vacina do poliovírus (vivo, o- ral, trivalente), vacina da raiva (adsorvida), vacina da raiva (célula diplóide humana), vacina do vírus da rubéola e caxumba (vivo), vacina do vírus da 10 rubéola (vivo, atenuado), toxóide de tétano (adsorvido), toxóide de tétano (fluido), vacina tifóide (oral), vacina tifóide (parenteral), vacina de polissaca- rídeos Vi contra febre tifóide, vacina do vírus da varicela, vacina da febre amarela. Ao menos uma antitoxina ou antivenina pode ser selecionada a partir de antivenina da aranha viúva negra, antivenoma Crotalidae (polivalen- 15 te), antitoxina de difteria (equina), antivenina Micrurus fulvius. Ao menos um soro imune pode ser selecionado a partir de imunoglobulina do citomegaloví- rus (intravenosa), imunoglobulina da hepatite B (humana), imunoglobulina intramuscular, imunoglobulina intravenosa, imunoglobulina da raiva (huma- na), imunoglobulina intravenosa do vírus sincitial respiratório (humano), imu- 20 ne globulina Rh0(D) (humana), imunoglobulina Rh0(D) intravenosa (humana), imune globulina de tétano (humana), imunoglobulina de varicela-zoster. Ao menos um modificador de resposta biológica pode ser selecionado a partir de aldesleucina, epoetina alfa, filgrastim, acetato de glatiramer para injeção, interferon alfacon-1, interferon alfa-2a (recombinante), interferon alfa-2b (re- 25 combinante), interferon beta-1a, interferon beta-1b (recombinante), interferon gama-1b, cloridrato de levamisol, oprelvecina, sargramostim. (Vide, por exemplo, págs. 964 a 1040 de Nursing 2001 Drug Handbook).

Ao menos um anti-infectivo oftálmico pode ser selecionado a par- tir de bacitracina, cloranfenicol, cloridrato de ciprofloxacina, eritromicina, sul- fato de gentamicina, ofloxacina a 0,3%, sulfato de polimixina B, sulfacetami- da de sódio a 10%, sulfacetamida de sódio a 15%, sulfacetamida de sódio a 30%. tobramicina. vidarabina. Ao menos um anti-inflamatório oftálmico pode ser selecionado a partir de dexametasona, dexametasona fosfato de sódio, diclofenaco de sódio 0,1%, fluorometolona, flurbiprofeno de sódio, cetorolaco de trometamina, acetato de prednisolona acetate (suspensão), prednisolona fosfato de sódio (solução). Ao menos um miótico pode ser selecionado a partir de cloreto de acetilocolina, carbacol (intraocular), carbacol (tópico), iodeto de ecotiopato, pilocarpina, cloridrato de pilocarpina, nitrato de pilocar- pina. Ao menos um midriático pode ser selecionado a partir de sulfato de atropina, cloridrato de ciclopentolato, cloridrato de epinefrina, borato de epi- nefrila, bromidrato de homatropina, cloridrato de fenilefrina, bromidrato de escopolamina, tropicamida. Ao menos um vasoconstritor oftálmico pode ser selecionado a partir de cloridrato de nafazolina, cloridrato de oximetazolina, cloridrato de tetra-hidrozolina. Ao menos um oftálmico miscelâneo pode ser selecionado a partir de cloridrato de apraclonidina, cloridrato de betaxolol, tartarato de brimonidina, cloridrato de carteolol, cloridrato de dipivefrina, clo- ridrato de dorzolamida, difumarato de emedastina, fluoresceína de sódio, fumarato de cetotifeno, latanoprost, cloridrato de levobunolol, cloridrato de metipranolol, cloreto de sódio (hipertônico), maleato de timolol. Ao menos um ótico pode ser selecionado a partir de ácido bórico, peróxido de carbami- da, cloranfenicol, polipeptídeo oleato de trietanolamina condensado. Ao me- nos um fármaco nasal pode ser selecionado a partir de dipropionato de be- clometasona, budesonida, sulfato de efedrina, cloridrato de epinefrina, fluni- solida, propionato de fluticasona, cloridrato de nafazolina, cloridrato de oxi- metazolina, cloridrato de fenilefrina, cloridrato de tetra-hidrozolina, triancino- lona acetonida, cloridrato de xilometazolina. (Vide, por exemplo, págs. 1041 a 1097 de Nursing 2001 Drug Handbook).

Ao menos um anti-infectivo local pode ser selecionado a partir de aciclovir, anfotericina B, creme de ácido azelaico, bacitracina, nitrato de bu- toconazol, fosfato de clindamicina, clotrimazol, nitrato de econazol, eritromi- cina, sulfato de gentamicína, cetoconazol, acetato de mafenida, metronidazol 30 (tópico), nitrato de miconazol, mupírocina, cloridrato de naftifina, sulfato de neomicina, nitrofurazona, nistatina, sulfadiazina de prata, cloridrato de terbi- nafina. terconazol, cloridrato de tetraciclina. tioconazol, tolnaftato. Ao menos um escabicida ou pediculicida pode ser selecionado a partir de crotamiton, lindano, permetrina, piretrinas. Ao menos um corticoesteróide tópico pode ser selecionado a partir de dipropionato de betametasona, valerato de beta- metasona, propionato de clobetasol, desonida, desoximetasona, dexameta- 5 sona, dexametasona fosfato de sódio, diacetato de diflorasona, acetonida de fluocinolona, fluocinonida, flurandrenolida, propionato de fluticasona, halcio- nida, hidrocortisona, acetato de hidrocortisona, butirato de hidrocortisona, valerato de hidrocortisona, furoato de mometasona, acetonida de triancino- lona. (Vide, por exemplo, págs. 1098 a 1136 de Nursing 2001 Drug 10 Handbook).

Ao menos uma vitamina ou mineral pode ser selecionado a partir de vitamina A, complexo de vitamina B, cianocobalamina, ácido fólico, hidro- xocobalamina, Ieucovorina de cálcio, niacina, niacinamida, cloridrato de piri- doxina, riboflavina, cloridrato de tiamina, vitamina C, vitamina D, colecalcife- 15 rol, ergocalciferol, análogo de vitamina D, doxercalciferol, paricalcitol, vitami- na E, análogo de vitamina K, fitonadiona, fluoreto de sódio, fluoreto de sódio (tópico), microelementos, cromo, cobre, iodo, manganês, selênio, zinco. Ao menos um calórico pode ser selecionado a partir de infusões de aminoácido (cristalino), infusões de aminoácido em dextrose, infusões de aminoácido 20 com eletrólitos, infusões de aminoácido com eletrólitos em dextrose, infu- sões de aminoácido para insuficiência hepática, infusões de aminoácido pa- ra alto estresse metabólico, infusões de aminoácido para insuficiência renal, dextrose, emulsões de gordura, triglicerídeos de cadeia média (Vide, por exemplo, págs. 1137 a 1163 de Nursing 2001 Drug Handbook).

Formulações

Como notado acima, a invenção fornece formulações estáveis, que são preferencialmente tampão de fosfato com solução salina ou um sal escolhido, bem como soluções preservadas e formulações contendo um conservante bem como formulações preservadas multiuso para uso farma- 30 cêutico ou veterinário, compreendendo ao menos uma proteína derivada de Ig relacionada a IL-4 ou IL-13 ou parte específica ou variante em uma formu- lação farmaceuticamente aceitável. As formulações preservadas contêm ao menos um conservante conhecido ou opcionalmente selecionado a partir do grupo que consiste em ao menos um fenol, m-cresol, p-cresol, o-cresol, clo- rocresol, benzila álcool, nitrito fenilmercúrico, fenoxietanol, formaldeido, clo- robutanol, cloreto de magnésio (por exemplo, hexa-hidrato), alquilparabeno 5 (metila, etila, propila, butila e seus similares), cloreto de benzalcônio, cloreto de benzetônio, de-hidroacetato de sódio e timerosal, ou misturas desses em diluente aquoso. Qualquer concentração ou mistura adequada pode ser u- sada como conhecido na técnica, tal como 0,001 a 5%, ou qualquer faixa ou valor nesta, tal como, mas não-limitado a 0,001, 0,003, 0,005, 0,009, 0,01, 10 0,02, 0,03, 0,05, 0,09, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4„ 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9,

3,0, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4,0, 4,3, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, ou qualquer faixa ou valor contido na mesma. Exemplos não-limitantes incluem, não conservantes, 0,1 a 2% de m-cresol (por exemplo, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,9, 15 1,0%), 0,1 a 3% de benzila álcool (por exemplo, 0,5, 0,9, 1,1,, 1,5, 1,9, 2,0, 2,5%), 0,001 a 0,5% timerosal (por exemplo, 0,005, 0,01), 0,001 a 2,0% fe- nol (por exemplo, 0,05, 0,25, 0,28, 0,5, 0,9, 1,0%), 0,0005 a 1,0% alquilpara- beno(s) (por exemplo, 0,00075, 0,0009, 0,001, 0,002, 0,005, 0,0075, 0,009, 0,01, 0,02, 0,05, 0,075, 0,09, 0,1, 0,2, 0,3, 0,5, 0,75, 0,9, 1,0%), e seus simi- 20 lares.

Como notado acima, a invenção fornece um artigo de fabricação, compreendendo material de embalagem e ao menos um frasco compreen- dendo uma solução de ao menos uma proteína derivada de Ig relacionada a IL-4 ou IL-13 ou parte específica ou variante dessa com os tampões prescri- 25 tos e/ou conservantes, opcionalmente em um diluente aquoso, onde o dito material de embalagem compreende uma etiqueta que indica que tal solução pode ser mantida por um período de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 9, 12, 18, 20, 24, 30, 36, 40, 48, 54, 60, 66, 72 horas ou mais. A invenção adicionalmente compreen- de um artigo de fabricação, compreendendo material de embalagem, um 30 primeiro frasco compreendendo Iiofilizado ao menos uma proteína derivada de Ig relacionada a IL-4 ou IL-13 ou parte especifica ou variante, e um se- gundo frasco compreendendo um diluente aquoso de tampão prescrito ou I

conservante, onde o dito material de embalagem compreende uma etiqueta que instrui um paciente para reconstituir ao menos uma proteína derivada de Ig relacionada a IL-4 ou IL-13 ou parte específica ou variante no diluente a- quoso para formar uma solução que pode ser mantida por um período de vinte e quatro horas ou mais.

Ao menos uma proteína derivada de Ig relacionada a IL-4 ou IL- 13 ou parte específica ou variante usada de acordo com a presente invenção pode ser produzida por meios recombinantes, incluindo preparações trans- gênicas ou de células de mamíferos, ou pode ser purificada a partir de ou- tras fontes biológicas, como descrito aqui ou como conhecido na técnica.

A faixa de ao menos uma proteína derivada de Ig relacionada a IL-4 ou IL-13 ou parte específica ou variante no produto da presente inven- ção inclui quantidades resultantes da reconstituição, se em um sistema a úmido/a seco, concentrações de aproximadamente 1,0 pg/ml a aproxima- 15 damente 1000 mg/ml, embora concentrações mais baixas e mais altas sejam operáveis e sejam dependentes do veículo de liberação pretendido, por e- xemplo, formulações de solução diferirão do emplastro transdérmico, méto- dos pulmonares, transmucosais, ou osmóticos ou de microbomba.

Preferencialmente, o diluente aquoso opcionalmente adicional- 20 mente compreende um conservante farmaceuticamente aceitável. Os con- servantes preferenciais incluem aqueles selecionados a partir do grupo que consiste em fenol, m-cresol, p-cresol, o-cresol, clorocresol, benzila álcool, alquila parabeno (metila, etila, propila, butila e seus similares), cloreto de benzalcônio, cloreto de benzetônio, de-hidroacetato de sódio e timerosal, ou 25 misturas desses. A concentração de conservante usado na formulação é uma concentração suficiente para produzir um efeito antimicrobiano. Tais concentrações são dependentes do conservante selecionado e são pronta- mente determinadas pelo versado na técnica.

Outros excipientes, por exemplo, agentes de isotonicidade, tam- pões, antioxidantes, intensificadores, conservantes, podem ser opcional e preferencialmente adicionados ao diluente. Um agente de isotonicidade, tal como alicerina, é comumente usado em concentracões conhecidas. Um tampão fisiologicamente tolerado é preferencialmente adicionado para forne- cer controle de pH otimizado. As formulações podem cobrir uma ampla faixa de pHs, tal como de aproximadamente pH 4 a aproximadamente pH 10, e faixas preferenciais de aproximadamente pH 5 a aproximadamente pH 9, e uma faixa mais preferencial de aproximadamente 6,0 a aproximadamente

8,0. Preferencialmente, as formulações da presente invenção têm pH entre aproximadamente 6,8 a aproximadamente 7,8. Os tampões preferenciais incluem tampões de fosfato, mais preferencialmente, fosfato de sódio, parti- cularmente solução salina tamponada com fosfato (PBS).

Outros aditivos, tal como solubilizantes farmaceuticamente acei- táveis, como Tween 20 (monolaurato de polioxietileno (20) sorbitana), Tween 40 (monopalmitato de polioxietileno (20) sorbitana), Tween 80 (mono-oleato de polioxietileno (20) sorbitana), Pluronic F68 (copolímeros de bloco de poli- oxietileno polioxipropileno), e PEG (polietileno glicol), ou tensoativos não- iônicos tal como polisorbato 20 ou 80 ou poloxâmero 184 ou 188, polióis Plu- ronic®, outros copolímeros de bloco, e quelantes tais como EDTA e EGTA podem ser opcionalmente adicionados às formulações ou composições para reduzir a agregação. Esses aditivos são particularmente úteis se uma bomba ou recipiente de plástico é usado para administrar a formulação. A presença de tensoativo farmaceuticamente aceitável suaviza a propensão da proteína agregar.

As formulações da presente invenção podem ser preparadas por um processo que compreende misturar ao menos uma proteína derivada de Ig relacionada a IL-4 ou IL-13 ou parte específica ou variante e um conser- vante selecionado a partir do grupo que consiste em fenol, m-cresol, p- cresol, o-cresol, clorocresol, benzila álcool, alquila parabeno, (metila, etila, propila, butila e seus similares), cloreto de benzalcônio, cloreto de benzetô- nio, de-hidroacetato de sódio e timerosal ou misturas desses em um diluente aquoso. A mistura de ao menos uma proteína derivada de Ig relacionada a IL-4 ou IL-13 ou parte específica ou variante e conservante em um diluente aquoso é executada usando procedimentos de mistura e dissolução conven- cionais. Para preparar uma formulação adequada, por exemplo, uma auanti- I

dade medida de ao menos uma proteína derivada de Ig relacionada a IL-4 ou IL-13 ou parte específica ou variante em solução tamponada é combina- da com o conservante desejado em uma solução tamponada em quantida- des suficientes para fornecer a proteína e conservante nas concentrações 5 desejadas. As variações desse processo seriam reconhecidas por um ver- sado na técnica. Por exemplo, a ordem em que os componentes são adicio- nados, se os aditivos são usados, a temperatura e o pH no qual a formula- ção é preparada, são todos fatores que podem ser otimizados para a con- centração e os meios de administração usados.

As formulações reivindicadas podem ser fornecidas a pacientes

como soluções claras ou como frascos duplos compreendendo um frasco de Iiofilizado de ao menos uma proteína derivada de Ig relacionada a IL-4 ou IL- 13 ou parte específica ou variante que é reconstituída com um segundo fras- co contendo água, um conservante e/ou excipientes, preferencialmente um 15 tampão de fosfato e/ou solução salina e um sal escolhido, em diluente aquo- so. Ou um frasco com uma única solução ou frasco duplo exigindo a recons- tituição, pode ser reutilizado múltiplas vezes e pode bastar para um único ciclo ou múltiplos ciclos de tratamento do paciente e assim podem fornecer um regime de tratamento mais conveniente do que atualmente disponível.

Os presentes artigos de fabricação reivindicados são úteis para

administração ao longo de um período de imediatamente vinte e quatro ho- ras ou mais. Consequentemente, os artigos de fabricação presentemente reivindicados oferecem vantagens significativas ao paciente. As formulações da invenção podem opcionalmente ser armazenadas de forma segura em 25 temperaturas de aproximadamente 2 a aproximadamente 40°C e retêm a atividade biológica da proteína por períodos estendidos de tempo, assim permitindo uma etiqueta de embalagem indicando que a solução pode ser mantida e/ou usada por um período de 6, 12, 18, 24, 36, 48, 72, ou 96 horas ou mais. Se o diluente preservado é usado, tal etiqueta pode incluir usar até 30 1 a 12 meses, meio ano, um ano e meio, e/ou dois anos.

As soluções de ao menos uma proteína derivada de Ig relaciona- da a IL-4 ou IL-13 ou parte específica ou variante na invenção podem ser preparadas por um processo que compreende misturar ao menos uma prote- ína derivada de Ig ou parte específica ou variante em um diluente aquoso. A mistura é executada usando procedimentos de mistura e dissolução conven- cionais. Para preparar um diluente adequado, por exemplo, uma quantidade 5 medida de ao menos uma proteína derivada de Ig ou parte específica ou variante em água ou tampão é combinada em quantidades suficientes para fornecer a proteína e opcionalmente um conservante ou tampão nas concen- trações desejadas. As variações desse processo seriam reconhecidas pelos versados na técnica. Por exemplo, a ordem em que os componentes são 10 adicionados, se aditivos são usados, a temperatura e o pH no qual a formu- lação é preparada, são todos fatores que podem ser otimizados para a con- centração e meios de administração usados.

Os produtos reivindicados podem ser fornecidos a pacientes co- mo soluções claras ou como frascos duplos compreendendo um frasco de 15 Iiofilizado de ao menos uma proteína derivada de Ig relacionada a IL-4 ou IL- 13 ou parte específica ou variante que é reconstituída com um segundo fras- co contendo o diluente aquoso. Ou um frasco com uma única solução ou frasco duplo exigindo a reconstituição, pode ser reutilizado múltiplas vezes e pode bastar para um único ciclo ou múltiplos ciclos de tratamento do pacien- 20 te e assim podem fornecer um regime de tratamento mais conveniente do que atualmente disponível.

Os produtos reivindicados podem ser fornecidos indiretamente a pacientes fornecendo a farmácias, clínicas ou outras tais instituições e insta- lações, soluções claras ou frascos duplos compreendendo um frasco de Iiofi- 25 Iizado de ao menos uma proteína derivada de Ig relacionada a IL-4 ou IL-13 ou parte específica ou variante que é reconstituída com um segundo frasco contendo o diluente aquoso. A solução clara nesse caso pode ser até um litro ou até maior em tamanho, fornecendo um grande reservatório a partir do qual partes menores de ao menos uma proteína derivada de Ig relacionada a 30 IL-4 ou IL-13 ou parte especifica ou solução variante podem ser recuperadas uma ou múltiplas vezes para transferir para frascos menores e fornecidas pela farmácia ou clínica a seus consumidores e/ou pacientes. Dispositivos reconhecidos compreendendo esses sistemas de único frasco incluem aqueles dispositivos injetores tipo caneta para liberação de uma solução tal como Canetas BD1 BD Autojector®, Humaject®, Novo- Pen®, Caneta B-D®, AutoPen®, e OptiPen®, GenotropinPen®, Genotronorm Pen®, Humatro Pen®, Reco-Pen®, Roferon Pen®, Biojector®, Iject®, J-tip Ne- edle-Free Injector®, Intraject®, Medi-Ject®, por exemplo, com ofeito ou de- senvolvido por Becton Dickensen (Franklin Lakes, NJ1 www.bectondickenson.com), Disetronic (Burgdorf, Suíça, www.disetronic.com; Bioject, Portland, Oregon (www.bioject.com); National Medicai Products, Weston Medicai (Peterborough, UK, www.weston- medical.com), Medi-Ject Corp (Minneapolis, MN, www.mediieet.com). Os dispositivos reconhecidos compreendendo um sistema de frasco duplo in- cluem aqueles sistemas injetores tipo caneta para reconstituir um fármaco Iiofilizado em um cartucho para liberação da solução reconstituída tal como a HumatroPen®.

Os produtos presentemente reivindicados incluem material de embalagem. O material de embalagem fornece, em adição à informação exi- gida pelas agências regulatórias, as condições sob as quais o produto pode ser usado. O material de embalagem da presente invenção fornece instru- 20 ções ao paciente para reconstituir ao menos uma proteína derivada de Ig relacionada a IL-4 ou IL-13 ou parte específica ou variante no diluente aquo- so para formar uma solução e para usar a solução por um período de 2 a 24 horas ou mais para o produto em dois frascos, a úmido/a seco. Para o pro- duto de solução de único frasco, a etiqueta indica que tal solução pode ser 25 usada por um período de 2 a 24 horas ou mais. Os produtos presentemente reivindicados são úteis para uso de produto farmacêutico humano.

As formulações da presente invenção podem ser preparadas por um processo que compreende misturar ao menos uma proteína derivada de Ig relacionada a IL-4 ou IL-13 ou parte específica ou variante e um tampão 30 selecionado, preferencialmente um tampão de fosfato contendo solução sa- lina ou um sal escolhido. A mistura de ao menos uma proteína derivada de Ia relacionada a IL-4 ou IL-13 ou parte específica ou variante e tampão em um diluente aquoso é executada usando procedimentos de mistura e disso- lução convencionais. Para preparar uma formulação adequada, por exemplo, uma quantidade medida de ao menos uma proteína derivada de Ig ou parte específica ou variante em água é combinada com o agente de tamponagem desejado em água em quantidades suficientes para fornecer a proteína e tampão nas concentrações desejadas. As variações desse processo seriam reconhecidas por um versado na técnica. Por exemplo, a ordem em que os componentes são adicionados, se aditivos são usados, a temperatura e o pH no qual a formulação é preparada, são todos fatores que podem ser otimiza- dos para a concentração e meios de administração usados.

As formulações preservadas ou estáveis reivindicadas podem ser fornecidas a pacientes como soluções claras ou como frascos duplos com- preendendo um frasco de liofílizado de ao menos uma proteína derivada de Ig relacionada a IL-4 ou IL-13 ou parte específica ou variante que é reconsti- tuída com um segundo frasco contendo um conservante ou tampão e excipi- entes em um diluente aquoso. Ou um frasco com uma única solução ou frasco duplo exigindo a reconstituição, pode ser reutilizado múltiplas vezes e pode bastar para um único ciclo ou múltiplos ciclos de tratamento do pacien- te e assim pode fornecer um regime de tratamento mais conveniente do que atualmente disponível.

Ao menos uma proteína derivada de Ig relacionada a IL-4 ou IL- 13 ou parte específica ou variante ou nas formulações ou soluções estáveis ou preservadas descritas aqui, pode ser administrada a um paciente de a- cordo com a presente invenção via uma variedade de métodos de liberação incluindo injeção SC ou IM; bomba transdérmica, pulmonar, transmucosal, implante, bomba osmótica, cartucho, microbomba, ou outros meios aprecia- dos pelos versados na técnica, como bem conhecido na técnica.

Aplicações Terapêuticas

A presente invenção também fornece um método para modular ou tratar ao menos uma condição ou patologia relacionada a fibrose relacio- nada a IL-4 ou IL-13, em uma célula, tecido, órgão, animal, ou paciente in- cluindo, mas não-limitado a, ao menos uma dentre doença pulmonar intersti- I

ciai, escleroderma, fibrose hepática, fibrose renal, sarcoidose, cicatriz hiper- trófica, cicatriz quelóide, fibrose cardíaca, degeneração macular relacionada à idade, ou doença vascular do colágeno, e seus similares. Vide, por exem- plo, o Manual da Merck, 12a a 17a Edições, Merck & Company, Rahway, NJ 5 (1972, 1977, 1982, 1987, 1992, 1999), Pharmacotherapy Handbook, Wells e outros, eds., Segunda Edição, Appleton e Lange, Stamford, Conn. (1998, 2000), cada um inteiramente incorporado a título de referência.

A maior parte da cicatrização de feridas através de reparo, signi- ficando que o novo tecido formado é estrutural e quimicamente diferente do 10 tecido original (tecido de cicatriz). No estágio anterior do reparo de tecido, um processo que é quase sempre envolvido na formação de uma nova ma- triz de colágeno extracelular por fibroblastos. Essa nova matriz de colágeno extracelular é então o suporte para um tecido conjuntivo durante o processo de cicatrização final. A cicatrização final é, na maioria dos tecidos, uma for- 15 mação de cicatriz contendo tecido conjuntivo. Em tecidos que têm proprie- dades regeneradoras, tal como, por exemplo, pele e osso, a cicatrização final inclui regeneração do tecido de origem. Esse tecido regenerado tem frequentemente também algumas características de cicatriz, por exemplo, um espessante de uma fratura de osso cicatrizada.

Os estágios de cicatrização de feridas normalmente incluem in-

flamação (normalmente de 1 a 3 dias), migração (normalmente de 1 a 6 di- as), proliferação (normalmente de 3 a 24 dias) e maturação (normalmente de

1 a 12 meses). O processo de cicatrização é um processo fisiológico com- plexo e bem orquestrado que envolve migração, proliferação e diferenciação de uma variedade de tipos de células bem como a síntese de componentes de matriz. O processo de cicatrização pode ser separado nas seguintes três fases:

i) Hemostasia e Inflamação - Quando plaquetas estão presentes fora do sistema circulatório e expostas à trombina e colágeno, elas se tor- nam ativadas e elas se agregam. Assim, as plaquetas iniciam o processo de reparo por agregação e formando um plugue temporário para assegurar a hemostasia e impedir a invasão de bactérias. As plaquetas ativadas iniciam o sistema de coagulação e iiberam fatores de crescimento como fator de crescimento derivados de plaqueta (PDGF) e fatores de crescimento epi- dérmicos (EGFs) e fatores de transformação do crescimento (TGFs). As pri- meiras células para invadirem a área da ferida são neutrófilos seguidos por 5 monócitos que são ativados por macrófagos.

A função principal dos neutrófilos parece ser se livrar da ferida ou defender a ferida contra bactérias contaminantes e melhorar a cicatrização da ferida removendo células mortas e plaquetas. A infiltração de neutrófilos cessa dentro de aproximadamente as primeiras 48 horas já que nenhuma 10 contaminação bacteriana está presente na ferida. Neutrófilos em excesso são fagocitados por macrófagos de tecido recrutados da piscina de circula- ção de monócitos de origem no sangue. Acredita-se que os macrófagos são essenciais para a cicatrização eficaz da ferida já que eles também são res- ponsáveis pela fagocitose de organismos patogênicos e limpar restos de 15 tecido. Ademais, eles liberam fatores numerosos envolvidos em eventos subsequentes do processo de cicatrização. Os macrófagos atraem fibroblas- tos que iniciam a produção de colágeno.

ii) Formação de Tecido de Granulação e Reepitelização - Dentro de 48 horas após a ferida, os fibroblastos começam a se proliferar e migrar 20 no espaço da ferida a partir do tecido conjuntivo na borda da ferida. Os fi- broblastos produzem colágeno e glicosaminoglicanos e entre outros, baixa tensão de oxigênio na ferida estimula a proliferação de células endoteliais. As células endoteliais elevam a formação de uma nova rede capilar.

Colagenases e ativadores de plasminogênio são secretados a 25 partir de queratinócitos. Se a ferida é deixada intacta e bem nutrida com oxi- gênio e nutrientes, queratinócitos migrarão sobre a ferida. Acredita-se que os queratinócitos somente migram sobre tecido viável e, consequentemente, os queratinócitos migram na área abaixo do tecido morto e da crosta da ferida. A área da ferida é adicionalmente diminuída por contração.

iii) Remodelagem Dérmica - Tão logo a reepitelização seja com-

pletada, a remodelagem do tecido se inicia. Essa fase, que dura por vários dias. restaura a resistência ao tecido ferido. Todos os processos de cicatrização mencionados acima tomam um tempo considerável. A taxa de cicatrização é influenciada pela liberdade de infecção da ferida, a saúde geral do indivíduo, presença dos corpos es- tranhos, etc. Algumas condições patológicas como infecção, maceração, 5 desidratação, saúde geralmente pobre e mau nutrição podem levar à forma- ção de uma úlcera crônica tal como, por exemplo, úlceras isquêmicas. Até que ao menos a cicatrização superficial tenha ocorrido, a ferida permanece em risco de nova infecção ou infecção continuada. Então, quanto mais rápi- do a ferida pode cicatrizar, tão logo o risco é removido. Assim, qualquer pro- 10 cedimento que pode influenciar a taxa de cicatrização da ferida ou influenciar favoravelmente a cicatrização das feridas é de grande valor. Ademais, como quase todos os processos de reparo de tecido incluem a formação de tecido conjuntivo anterior, um estímulo desses e os processos subsequentes são observados como melhorando a cicatrização da ferida.

No presente contexto, o termo “cicatrização clínica” é usado para

denotar uma situação onde nenhuma interrupção de tecido pode ser visual- mente observada e somente sinais discretos de inflamação estão presentes tal como uma Iuz avermelhada ou um tecido discretamente inchado. Em adi- ção, nenhuma reclamação de dor está presente quando o órgão é relaxado ou não tocado.

Como mencionado acima, a invenção refere-se ao uso de matriz de esmalte, derivados de matriz de esmalte e/ou proteínas de matriz de es- malte como um agente de cicatrização de ferida, isto é, um agente que ace- lera, estimula, ou promove a cicatrização de feridas dérmicas ou mucosais. 25 Consequentemente, um uso importante é também o uso como regeneração de tecido e/ou agentes de reparo. Ademais, devido ao efeito de cicatrização de ferida, a matriz de esmalte, derivados de matriz de esmalte e/ou proteí- nas da matriz de esmalte têm efeito de alívio da dor.

Tal método pode opcionalmente compreender administrar uma quantidade eficaz de ao menos uma composição ou composição farmacêuti- ca compreendendo ao menos uma proteína derivada de Ig relacionada a IL- 4 ou IL-13 ou parte específica ou variante a uma célula, tecido, órgão, animal ou paciente em necessidade de tal modulação, tratamento ou terapia. Tratamentos Terapêuticos.

Qualquer método da presente invenção pode compreender um 5 método para tratar uma desordem mediada por fibrose relacionada a IL-4 ou IL-13, compreendendo administrar uma quantidade eficaz de uma composi- ção ou composição farmacêutica compreendendo ao menos uma proteína derivada de Ig relacionada a IL-4 ou IL-13 ou parte específica ou variante a uma célula, tecido, órgão, animal ou paciente em necessidade de tal modu- 10 lação, tratamento ou terapia.

Tipicamente, o tratamento de condições patológicas é efetuado administrando-se uma quantidade eficaz ou dosagem de ao menos uma composição de proteína relacionada a Ig relacionada a IL-4 ou IL-13 que totaliza, em média, uma faixa de ao menos aproximadamente 0,01 a 500 miligramas de ao menos uma proteína derivada de Ig relacionada a IL-4 ou IL-13 ou parte específica ou variante/quilograma de paciente por dose, e pre- ferencialmente de ao menos aproximadamente 0,1 a 100 miligramas de pro- teína derivada de Ig ou parte específica ou variante/quilograma de paciente por única administração ou administração múltipla, dependendo da atividade específica do contido na composição. Alternativamente, a concentração de soro eficaz pode compreender 0,1 a 5000 pg/ml de concentração de soro por única administração ou administração múltipla. As dosagens adequadas são conhecidas pelos profissionais médicos e dependerão, é claro, do esta- do da doença particular, da atividade específica da composição sendo admi- nistrada, e do paciente particular passando por tratamento. Em alguns ca- sos, para alcançar a quantidade terapêutica desejada, pode ser necessário fornecer administração repetida, isto é, administrações individuais repetidas de uma dose medida ou monitorada particular, onde as administrações indi- viduais são repetidas até que a dose diária desejada ou efeito seja alcança- do.

As doses preferenciais podem opcionalmente incluir 0,1, 0,2, 0,3, 0.4. 0.5. 0,6. 0.7. 0,8. 0,9, 1, 2, 3. 4. 5. 6. 7, 8. 9, 10. 11. 12. 13. 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97,

98, 99 e/ou 100 mg/kg/administração, ou qualquer faixa, valor ou fração des- sa, ou para alcançar uma concentração de soro de 0,1, 0,5, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2,

1.5, 1,9, 2,0, 2,5, 2,9, 3,0, 3,5, 3,9, 4,0, 4,5, 4,9, 5,0, 5,5, 5,9, 6,0, 6,5, 6,9,

7,0, 7,5, 7,9, 8,0, 8,5, 8,9, 9,0, 9,5, 9,9, 10, 10,5, 10,9, 11, 11,5, 11,9, 20,

12.5, 12,9, 13,0, 13,5, 13,9, 14,0, 14,5, 4,9, 5,0, 5,5, 5,9, 6,0, 6,5, 6,9, 7,0, 7,5, 7,9, 8,0, 8,5, 8,9, 9,0, 9,5, 9,9, 10, 10,5, 10,9, 11, 11,5, 11,9, 12, 12,5,

12,9, 13,0, 13,5, 13,9, 14, 14,5, 15, 15,5, 15,9, 16, 16,5, 16,9, 17, 17,5, 17,9,

18, 18,5, 18,9, 19, 19,5, 19,9, 20, 20,5, 20,9, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28,

29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 96, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500,

e/ou 5000 pg/ml de concentração de soro por única administração ou admi- nistração múltipla, ou qualquer faixa, valor ou fração dessa.

Alternativamente, a dosagem administrada pode variar depen- dendo dos fatores conhecidos, tal como as características farmacodinâmicas do agente particular, e seu modo e via de administração; idade, saúde, e 20 peso do recebedor; natureza e grau dos sintomas, tipo de tratamento simul- tâneo, frequência de tratamento, e o efeito desejado. Usualmente, uma do- sagem de ingrediente ativo pode ser aproximadamente 0,1 a 100 miligramas por quilograma de peso corporal. Normalmente 0,1 a 50, e preferencialmente 0,1 a 10 miligramas por quilograma por administração ou em forma de Iibe- 25 ração sustentada é eficaz para obter os resultados desejados.

Como um exemplo não-limitante, o tratamento de humanos ou animais pode ser fornecido como uma dosagem única ou periódica de ao menos uma proteína derivada de Ig ou parte ou variante específica da pre- sente invenção de 0,1 a 100 mg/kg, tal como 0,5, 0,9, 1,0, 1,1, 1,5, 2, 3, 4, 5, 30 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90 ou 100 mg/kg, por dia, em ao menos um do dia 1, 2. 3. 4, 5. 6, 7. 8. 9. 10. 11. 12, 13. 14. 15. 16. 17. 18. 19. 20. 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, ou 40, ou alternativamente ou adicionalmente, ao menos uma da semana 1, 2,

3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 5 46, 47, 48, 49, 50, 51, ou 52, ou alternativamente ou adicionalmente, ao me- nos um de 1, 2, 3, 4, 5, 6,, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, ou 20 anos, ou qualquer combinação desses, usando doses únicas, por infusão ou repetidas.

As formas de dosagem (composição) adequadas para adminis- 10 tração interna geralmente contêm de aproximadamente 0,1 miligrama a a- proximadamente 500 miligramas de ingrediente ativo por unidade ou recipi- ente. Nessas composições farmacêuticas, o ingrediente ativo estará nor- malmente presente em uma quantidade de aproximadamente 0,5 a 99,999% em peso com base no peso total da composição.

Para administração parenteral, a proteína derivada de Ig ou parte

específica ou variante pode ser formulada como uma solução, suspensão, emulsão ou pó Iiofilizado em associação, ou separadamente fornecida, com um veículo parenteral farmaceuticamente aceitável. Exemplos de tais veícu- los são água, solução salina, solução de Ringer, solução de dextrose, e 1 a 20 10% de albumina de soro humano. Lipossomos e veículos não aquosos, tal como óleos fixos podem ser usados também. O veículo ou pó Iiofilizado po- de conter aditivos que mantêm isotonicidade (por exemplo, cloreto de sódio, manitol) e estabilidade química (por exemplo, tampões e conservantes). A formulação é esterilizada por técnicas conhecidas ou adequadas.

Carreadores farmacêuticos adequados são descritos na edição

mais recente de Remington1S Pharmaceutical Sciences, A. Osol, um texto de referência padrão nesse campo.

Administração Alternativa

Muitos modos conhecidos e desenvolvidos podem ser usados de acordo com a presente invenção para administrar quantidades farmaceuti- camente eficazes de ao menos uma proteína derivada de Ig relacionada a IL-4 ou IL-13 ou parte específica ou variante de acordo com a presente in- I

venção. Enquanto a administração pulmonar é usada na seguinte descrição, outros modos de administração podem ser usados de acordo com a presen- te invenção com resultados adequados.

As proteínas derivadas de Ig relacionadas a IL-4 ou IL-13 da pre- 5 sente invenção podem ser liberadas em um carreador, como uma solução, emulsão, colóide, ou suspensão, ou como um pó seco, usando qualquer de uma variedade de dispositivos e métodos adequados para administração por inalação ou outros modos descritos aqui na técnica ou conhecidos na técni- ca.

Formulações Parenterais e Administração

As formulações para administração parenteral podem conter co- mo excipientes comuns água estérila ou solução salina, polialquileno glicóis tal como piletileno glicol, óleos de origem vegetal, naftalenos hidrogenados e seus similares. As suspensões aquosas ou oleosas para injeção podem ser 15 preparadas usando um emulsificante apropriado ou umectante e um agente de suspensão, de acordo com métodos conhecidos. Os agentes para injeção podem ser um agente diluente administrável não oralmente, não-tóxico tal como uma solução aquosa ou uma solução injetável estérila ou suspensão em um solvente. Como o veículo usado ou solvente, água, solução de Rin- 20 ger, solução salina isotônica, etc. são permitidos; como um solvente normal, ou solvente em suspensão, óleo não-volátil estérila pode ser usado. Para esses propósitos, qualquer tipo de óleo não-volátil e ácido graxo pode ser usado, incluindo óleos graxos ou ácidos graxos semissintéticos ou sintéticos ou naturais; mono-, ou di-, ou triglicerídeos naturais ou sintéticos ou semis- 25 sintéticos. A administração parenteral é conhecida na técnica e inclui, mas não está limitada a, meios convencionais de injeções, um dispositivo de inje- ção sem agulha pressionado a gás como descrito na Patente U.S. No. 5.851.198, e um dispositivo perfurador a laser como descrito na Patente U.S. No. 5.839.446 inteiramente incorporada aqui a título de referência.

Liberação Alternativa

A invenção adicionalmente refere-se à administração de ao me- nos uma proteína derivada de Iq relacionada a IL-4 ou IL-13 ou parte especí- fica ou variante por meios parenterais, subcutâneos, intramusculares, intra- venosos, em bolus, vaginais, retais, bucais, sublinguais, intranasais, ou transdérmicos. Uma proteína derivada de Ig anti-IL-4 ou IL-13 ou parte es- pecífica ou composições variantes pode ser preparada para uso para admi- 5 nistração parenteral (subcutânea, intramuscular, ou intravenosa) particular- mente na forma de soluções líquidas ou suspensões; para uso em adminis- tração vaginal ou retal particularmente em formas semissólidas tal como cremes e supositórios; para administração bucal, ou sublingual particular- mente na forma de comprimidos ou cápsulas; ou particularmente de forma 10 intranasal na forma de pós, gotas nasais, ou aerossóis ou certos agentes; ou de forma transdérmica particularmente na forma de um gel, pomada, loção, suspensão, ou sistema de liberação de emplastro com intensificadores quí- micos tal como dimetila sulfóxido para ou modificar a estrutura da pele ou para aumentar a concentração de fármaco no emplastro transdérmico (Jun- 15 ginger e outros, em "Drug Permeation Enhancement"; Hsieh, D. S., Eds., págs. 59 a 90 (Mareei Dekker, Inc. New York 1994, inteiramente incorporado aqui a título de referência), ou com agentes oxidantes que habilitam a apli- cação de formulações contendo proteínas e peptídeos na pele (WO 98/53847), ou aplicações de campos elétricos para criar caminhos de trans- 20 porte transientes tal como eletroporação, ou para aumentar a mobilidade de fármacos carregados através da pele tal como iontoforese, ou aplicação de ultrassom tal como sonoforese (Patentes U.S. Nos. 4.309.989 e 4.767.402) (as publicações acima e patentes são inteiramente incorporadas aqui a título de referência).

Administração Pulmonar/Nasal

Para administração pulmonar, preferencialmente ao menos uma proteína derivada de Ig relacionada a IL-4 ou IL-13 ou parte específica ou composição variante é liberada em um tamanho de partícula eficaz para al- cançar as vias aéreas inferiores do pulmão ou sinus. De acordo com a in- 30 venção, ao menos proteína derivada de Ig relacionada a IL-4 ou IL-13 ou parte específica ou variante pode ser liberado por quaisquer de uma varie- dade de dispositivos de inalação ou nasais conhecidos na técnica para ad- I

ministração de um agente terapêutico por inalação. Esses dispositivos capa- zes de depositar formulações aerolisadas na cavidade do sinus ou alvéolo de um paciente incluem inaladores de dose medidas, nebulizadores, gerado- res de pó seco, aspersões, e seus similares. Outros dispositivos adequados 5 para direcionar a administração pulmonar ou nasal de proteína derivada de Ig ou parte específica ou variantes são também conhecidos na técnica. To- dos tais dispositivos podem usar formulações adequadas para a administra- ção para a liberação de proteína derivada de Ig ou parte específica ou vari- ante em um aerossol. Tais aerossóis podem ser compreendidos de ou solu- 10 ções (ambas aquosas e não aquosas) ou partículas sólidas. Os inaladores de dose medida como o inalador de dose medida, tipicamente usam um gás popelente e exigem ativação durante a inspiração (Vide, por exemplo, WO 94/16970, WO 98/35888). Inaladores de pó seco como Turbuhaler® (Astra), Rotahaler® (Glaxo), Diskus® (Glaxo), inalador Spiros® (Dura), dispositivos 15 comercializados pela Inhale Therapeutics, e o inalador de pó Spinhaler® (Fi- sons), usam ativação por respiração de um pó misturado (US 4668218 As- tra, EP 237507 Astra1 WO 97/25086 Glaxo, WO 94/08552 Dura, US 5458135 lnhale, WO 94/06498 Fisons, inteiramente incorporados aqui a título de refe- rência). Nebulizadores como AEPvX® Aradigm, o nebulizador Ultravent® 20 (Mallinckrodt), e o nebulizador Acorn II® (Marquest Medicai Products) (US 5404871 Aradigm, WO 97/22376), as referências acima inteiramente incor- poradas aqui a título de referência, produzem aerossóis a partir de soluções, enquanto os inaladores de dose medida, inaladores de pó seco, etc. geram aerossóis de pequenas partículas. Esses exemplos específicos de dispositi- 25 vos de inalação comercialmente disponíveis são destinados a serem repre- sentativos de dispositivos específicos adequados para a prática desta inven- ção, e não são Iimitantes do escopo da invenção. Preferencialmente, uma composição compreendendo ao menos uma proteína derivada de Ig relacio- nada a IL-4 ou IL-13 ou parte específica ou variante é liberada por um inala- 30 dor de pó seco ou um aspersor. Há várias características desejáveis de um dispositivo de inalação para administrar ao menos uma proteína derivada de Iq ou parte específica ou variante da presente invenção. Por exemplo, a Iibe- ração pelo dispositivo de inalação é vantajosamente confiável, reproduzível e precisa. O dispositivo de inalação pode opcionalmente liberar pequenas partículas secas, por exemplo, menos de aproximadamente 10 pm, prefe- rencialmente aproximadamente 1 a 5 pm, para boa respirabilidade.

5 Administração de proteína derivada de Ig relacionada a IL-4 ou

IL-13 ou parte específica ou composições variantes como uma aspersão

Uma aspersão incluindo proteína derivada de Ig relacionada a IL-

4 ou IL-13 ou parte específica ou proteína de composição variante pode ser produzida forçando-se uma suspensão ou solução de ao menos uma proteí- na derivada de Ig relacionada a IL-4 ou IL-13 ou parte específica ou variante através de um bocal sob pressão. O tamanho e a configuração do bocal, a pressão aplicada, a taxa de alimentação de líquido pode ser escolhida para alcançar a saída desejada e o tamanho de partícula. Uma eletroaspersão pode ser produzida, por exemplo, por um campo elétrico em conjunto com um capilar ou alimentação de bocal. Vantajosamente, partículas de ao me- nos uma proteína derivada de Ig relacionada a IL-4 ou IL-13 ou parte especí- fica ou proteína de composição variante liberada por um aspersor tem um tamanho de partícula menor que aproximadamente 10 pm, preferencialmen- te na faixa de aproximadamente 1 pma aproximadamente 5 pm, e mais pre- ferencialmente aproximadamente 2 pm a aproximadamente 3 pm.

As formulações de ao menos uma proteína derivada de Ig rela- cionada a IL-4 ou IL-13 ou parte específica ou proteína de composição vari- ante adequada para uso com um aspersor tipicamente incluem proteína de- rivada de Ig ou parte específica ou proteína de composição variante em uma 25 solução aquosa em uma concentração de aproximadamente 0,1 mg a apro- ximadamente 100 mg de ao menos uma proteína derivada de Ig relacionada a IL-4 ou IL-13 ou parte específica ou proteína de composição variante por ml de solução ou mg/gm, ou qualquer faixa ou valor nesta, por exemplo, mas não-limitada a 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 30 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29,

30, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90 or 100 mg/ml ou mg/gm. A formulação pode incluir aaentes tais como um excipiente, um tampão, um aqente de isotonici- I

dade, um conservante, um tensoativo, e preferencialmente, zinco. A formu- lação pode também incluir um excipiente ou agente para estabilização da proteína derivada de Ig ou parte específica ou proteína de composição vari- ante, tal como um tampão, um agente redutor, uma proteína a granel, ou um 5 carboidrato. As proteínas a granel úteis em formular proteína derivada de Ig ou parte específica ou proteína de composição variante incluem albumina, protamina ou seus similares. Os típicos carboidratos úteis em formular prote- ína derivada de Ig ou parte específica ou proteína de composição variante incluem sacarose, manitol, lactose, tre-halose, glicose, ou seus similares. A 10 proteína derivada de Ig ou parte específica ou formulação de proteína de composição variante pode também incluir um tensoativo, que pode reduzir ou impedir a agregação induzida em superfície da proteína derivada de Ig ou parte específica ou proteína de composição variante causada por atomiza- ção da solução em formar um aerossol. Vários tensoativos convencionais 15 podem ser empregados, tal como polioxietileno ésteres de ácido graxo e al- coóis, e polioxietileno ésteres de ácido graxo de sorbitol. Quantidades esta- rão geralmente na faixa entre 0,001 e 14% em peso da formulação. Os ten- soativos especialmente preferenciais para propósitos desta invenção são mono-oleato de polioxietileno sorbitana, polisorbato 80, polisorbato 20, ou 20 seus similares. Os agentes adicionais conhecidos na técnica para formula- ção de uma proteína tal como proteínas derivadas de Ig relacionadas a IL-4 ou IL-13, ou partes específicas ou variantes, podem também ser incluídos na formulação.

Administração de proteína derivada de Ig relacionada a IL-4 ou IL-13 ou parte específica ou composições variantes por um Nebulizador

A proteína derivada de Ig ou parte específica ou proteína de composição variante pode ser administrada por um nebulizador, tal como nebulizador a jato ou nebulizador ultrassônico. Tipicamente, em um nebuli- zador a jato, uma fonte de ar comprimido é usada para criar um jato de ar de 30 alta velocidade através de um orifício. À medida que o gás se expande além do bocal, uma região de baixa pressão é criada, que direciona uma solução de proteína derivada de Iq ou parte especifica ou proteína de composição variante através de um tubo capilar conectado a um reservatório de líquido.

O fluxo de líquido a partir do tubo capilar é separado em filamentos instáveis e gotículas à medida que ele sai do tubo, criando o aerossol. Uma faixa de configurações, taxas de fluxo, e tipos de defletores pode ser empregada pa- 5 ra alcançar as características de desempenho desejado a partir de um dado nebulizador a jato. Em um nebulizador ultrassônico, a energia elétrica de alta frequência é usada para criar energia mecânica vibracional, tipicamente em- pregando um transdutor piezelétrico. Essa energia é transmitida à formula- ção da proteína derivada de Ig ou parte específica ou proteína de composi- 10 ção variante ou diretamente ou através de um fluido de acoplamento, crian- do um aerossol incluindo a proteína derivada de Ig ou parte específica ou proteína de composição variante. Vantajosamente, as partículas de proteína derivada de Ig ou parte específica ou proteína de composição variante libe- radas por um nebulizador têm um tamanho de partícula menor que aproxi- 15 madamente 10 pm, preferencialmente na faixa de aproximadamente 1 pm a aproximadamente 5 pm, e mais preferencialmente aproximadamente 2 pm a aproximadamente 3 pm.

As formulações de ao menos uma proteína derivada de Ig rela- cionada a IL-4 ou IL-13 ou parte específica ou variante adequadas para uso com um nebulizador, ou a jato ou ultrassônico, tipicamente incluem uma concentração de aproximadamente 0,1 mg a aproximadamente 100 mg de ao menos uma proteína derivada de Ig relacionada a IL-4 ou IL-13 ou parte específica ou proteína de composição variante por ml de solução. A formula- ção pode incluir agentes tais como um excipiente, um tampão, um agente de isotonicidade, um conservante, um tensoativo, e preferencialmente, zinco. A formulação pode também incluir um excipiente ou agente para estabilização de ao menos uma proteína derivada de Ig relacionada a IL-4 ou IL-13 ou par- te específica ou proteína de composição variante, tal como um tampão, um agente de redução, uma proteína a granel, ou um carboidrato. As proteínas a granel úteis na formulação de ao menos uma proteína derivada de Ig rela- cionada a IL-4 ou IL-13 ou parte específica ou proteína de composição vari- ante incluem albumina. protamina. ou seus similares. Os carboidratos típicos I

úteis na formulação de ao menos uma proteína derivada de Ig relacionada a IL-4 ou IL-13 ou parte específica ou variante incluem sacarose, manitol, Iac- tose, tre-halose, glicose, ou seus similares. Ao menos uma proteína derivada de Ig relacionada a IL-4 ou IL-13 ou parte específica ou formulação variante 5 pode também incluir um tensoativo, que pode reduzir ou impedir a agrega- ção induzida em superfície de ao menos uma proteína derivada de Ig rela- cionada a IL-4 ou IL-13 ou parte específica ou proteína de composição vari- ante causada por atomização da solução em formar um aerossol. Vários tensoativos convencionais podem ser empregados, tal como polioxietileno 10 ésteres de ácido graxo e alcoóis, e polioxietileno ésteres de ácido graxo de sorbital. As quantidades geralmente estarão na faixa entre 0,001 e 4% em peso da formulação. Os tensoativos especialmente preferenciais para pro- pósitos desta invenção são mono-oleato de polioxietileno sorbitana, polisor- bato 80, polisorbato 20, ou seus similares. Os agentes adicionais conhecidos 15 na técnica para formulação de uma proteína tal como proteína derivada de Ig relacionada a IL-4 ou IL-13 ou parte específica ou proteína de composição variante podem também ser incluídos na formulação.

Administração de proteína derivada de Ig relacionada a IL-4 ou IL-13 ou parte específica ou proteína de composição variante por um Inala- dor de Dose Medida

Em um inalador de dose medida (MDI), um propelente, ao menos uma proteína derivada de Ig relacionada a IL-4 ou IL-13 ou parte específica ou variante, e quaisquer excipientes ou outros aditivos estão contidos em um tubo como uma mistura incluindo um gás comprimido liqüefeito. A ativação 25 da válvula de medição libera a mistura como um aerossol, preferencialmente contendo partículas na faixa de tamanho de menos de aproximadamente 10 pm, preferencialmente aproximadamente 1 pm a aproximadamente 5 pm, e mais preferencialmente aproximadamente 2 pm a aproximadamente 3 pm. O tamanho de partícula desejado do aerossol pode ser obtido empregando-se 30 uma formulação de proteína derivada de Ig relacionada a IL-4 ou IL-13 ou parte específica ou proteína de composição variante produzida por vários métodos conhecidos oelos versados na técnica, incluindo moagem a iato. secagem por aspersão, condensação em ponto crítico, ou seus similares. Os inaladores de dose medida preferenciais incluem aqueles fabricados por 3M ou Glaxo e empregando um propelente de hidrofluorocarboneto.

As formulações de ao menos uma proteína derivada de Ig rela- 5 cionada a IL-4 ou IL-13 ou parte específica ou variante para uso com um dispositivo inalador de dose medida incluirão geralmente um pó finamente dividido contendo ao menos uma proteína derivada de Ig relacionada a IL-4 ou IL-13 ou parte específica ou variante como uma suspensão em um meio não aquoso, por exemplo, suspensão em um propelente com o auxílio de um 10 tensoativo. O propelente pode ser qualquer material convencional emprega- do para esse propósito, tal como clorofluorocarboneto, um hidroclorofluoro- carboneto, um hidrofluorocarboneto, ou um hidrocarboneto, incluindo tricloro- fluorometano, diclorodifluorometano, diclorotetrafluorometanol, e 1,1,1,2- tetrafluoroetano, HFA-134a (hidrofluoroalcano-134a), HFA-227 (hidrofluoro- 15 alcano-227), ou seus similares. Preferencialmente, o propelente é um hidro- fluorocarboneto. O tensoativo pode ser escolhido para estabilizar ao menos uma proteína derivada de Ig relacionada a IL-4 ou IL-13 ou parte específica ou variante como uma suspensão no propelente, para proteger o agente ati- vo contra degradação química e seus similares. Os tensoativos adequados 20 incluem trioleato de sorbitana, Iecitina de soja, ácido oléico, ou seus simila- res. Em alguns casos, os aerossóis de solução são preferenciais usando solventes tais como etanol. Os agentes adicionais conhecidos na técnica para a formulação de uma proteína podem também ser incluídos na formula- ção.

Um versado na técnica reconhecerá que os métodos da invenção

atual podem ser alcançados por administração pulmonar de ao menos uma proteína derivada de Ig relacionada a IL-4 ou IL-13 ou parte específica ou proteína de composição variante via dispositivos não descritos aqui. Formulações Orais e Administração As formulações para administração oral na coadministração de

adjuvantes (por exemplo, resorcinóis e tensoativos não-iônicos tal como po- lioxietileno oleila éter e n-hexadecilDolietileno éter) para aumentar artificial- t

mente a permeabilidade das paredes do intestino, bem como a coadminis- tração de inibidores enzimáticos (por exemplo, inibidores de tripsina pancre- ática, di-isopropilfluorofosfato (DFF) e trasilol) para inibir a degradação enzi- mática. O composto constituinte ativo da forma de dosagem do tipo sólida 5 para administração oral pode ser misturado com ao menos um aditivo, inclu- indo sacarose, lactose, celulose, manitol, tre-halose, rafinose, maltitol, dex- trano, amidos, agar, arginatos, quitinas, quitosanas, pectinas, goma de tra- gacanto, goma arábica, gelatina, colágeno, caseína, albumina, polímero sin- tético ou semissintético, e glicerídeos. Essas formas de dosagem podem 10 também conter outros tipos de aditivos, por exemplo, agente de diluição ina- tivo, lubrificante tal como estearato de magnésio, parabeno, agente conser- vante tal como ácido sórbico, ácido ascórbico, alfa-tocoferol, antioxidante tal como cisteína, desintegrador, ligante, espessante, agente de tamponagem, agente adoçante, agente flavorizante, agente aromatizante, etc.

Os comprimidos e pílulas podem ser adicionalmente processados

em preparações revestidas entéricas. As preparações líquidas para adminis- tração oral incluem preparações de emulsão, xarope, elixir, suspensão e so- lução permitidas para uso médico. Essas preparações podem conter agen- tes diluentes inativos normalmente usados no dito campo, por exemplo, á- 20 gua. Os Iipossomos foram também descritos como sistemas de liberação de fármaco para insulina e heparina (Patente U.S. No. 4.239.754). Mais recen- temente, microesferas de polímeros artificiais de aminoácidos misturados (protenóides) foram usadas para liberar farmacêuticos (Patente U.S. No. 4.925.673). Ademais, os compostos carreadores descritos na Patente U.S. 25 No. 5.879.681 e Patente U.S. No. 5.871.753 que são usados para liberar agentes biologicamente ativos oralmente são conhecidos na técnica. Formulações Mucosais e Administração

Para absorção através das superfícies mucosais, as composi- ções e métodos de administrar ao menos uma proteína derivada de Ig rela- cionada a IL-4 ou IL-13 ou parte específica ou variante incluem uma emulsão compreendendo uma pluralidade de partículas de submícron, uma macromo- lécula mucoadesiva, um peptídeo bioativo. e uma fase contínua aquosa, que promove a absorção através das superfícies mucosaís alcançando a mucoa- derência das partículas de emulsão (Patente U.S. No. 5.514.670). As super- fícies mucosais adequadas para aplicação das emulsões da presente inven- ção podem incluir as vias de administração córnea, conjuntiva, bucal, sublin- 5 gual, nasal, vaginal, pulmonar, estomacal, intestinal e retal. As formulações para administração vaginal ou retal, por exemplo, supositórios, podem conter como excipientes, por exemplo, polialquileno glicóis, vaselina, manteiga de cacau, e seus similares. As formulações para administração intranasal po- dem ser sólidas e contêm como excipientes, por exemplo, Iactose ou podem 10 ser soluções aquosas ou oleosas de gotas nasais. Para administração nasal, os excipientes incluem açúcares, estearato de cálcio, estearato de magné- sio, amido pregelatinado, e seus similares (Patente U.S. No. 5.849.695). Formulações Transdérmicas e Administração

Para a administração transdérmica, ao menos uma proteína deri- vada de Ig relacionada a IL-4 ou IL-13 ou parte específica ou proteína de composição variante é encapsulada em um dispositivo de liberação tal como um Iipossomo ou nanopartículas poliméricas, micropartículas, microcápsu- las, ou microesferas (referidas coletivamente como micropartículas a menos que de outra forma determinado). Um número de dispositivos adequados é conhecido, incluindo micropartículas feitas de polímeros sintéticos, tal como ácidos poli-hidróxi tal como ácido polilático, ácido poliglicólico, e copolímeros desses, poliortoésteres, polianidridos, e polifosfazenos, e polímeros naturais tal como colágeno, poliaminoácidos, albumina e outras proteínas, alginato e outros polissacarídeos, em combinações desses (Patente U.S. Nos. 5.814.599).

Administração Prolongada e Formulações

Pode ser às vezes desejável liberar os compostos da presente invenção ao sujeito por períodos prolongados de tempo, por exemplo, por períodos de uma semana a um ano de uma única administração. Várias for- 30 mas de dosagem de implante ou depósito de liberação lenta podem ser utili- zadas. Por exemplo, uma forma de dosagem pode conter um sal não-tóxico farmaceuticamente aceitável dos compostos que têm um baixo qrau de so- I

Iubilidade nos fluidos corporais, por exemplo, (a) um sal com adição de ácido com um ácido polibásico tal como ácido fosfórico, ácido sulfúrico, ácido cítri- co, ácido tartárico, ácido tânico, ácido pamóico, ácido algínico, ácido poliglu- tâmico, ácidos naftaleno mono ou dissulfônicos, ácido poligalacturônico, e seus similares; (b) um sal com um cátion de metal polivalente tal como zinco, cálcio, bismuto, bário, magnésio, alumínio, cobre, cobalto, níquel, cádmio, e seus similares, ou com um cátion orgânico formado a partir de, por exemplo, Ν,Ν’-dibenzil-etilenodiamina ou etilenodiamina; ou (c) combinações de (a) e (b), por exemplo, um sal de tanato de zinco. Adicionalmente, os compostos da presente invenção ou, preferencialmente, um sal relativamente insolúvel tal como aqueles que acabaram de ser descritos, podem ser formulados em um gel, por exemplo, um gel de monoestearato de alumínio com, por exem- plo, óleo de gergelim, adequado para injeção. Os sais particularmente prefe- renciais são sais de zinco, sais de tanato de zinco, sais de pamoato, e seus similares. Outro tipo de formulação de depósito de liberação lenta para inje- ção conterá o composto ou sal disperso para encapsulado em um polímero não antigênico, não-tóxico, de degradação lenta tal como um polímero de ácido polilático/ácido poliglicólico, por exemplo, como descrito na Patente U.S. N°. 3.773.919. Os compostos ou, preferencialmente, sais relativamente insolúveis tal como aqueles descritos acima podem ser também formulados em peletes de silástico de matriz de colesterol, particularmente para uso em animais. As formulações de implante ou depósito de liberação lenta, por e- xemplo, Iipossomos líquidos ou gasosos, são conhecidas na literatura (Pa- tente U.S. No. 5.770.222 e "Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems", J. R. Robinson ed., Marcel Dekker, Inc., N.Y., 1978).

Tendo geralmente descrito a invenção, a mesma será mais pron- tamente entendida através da referência aos seguintes exemplos, que são fornecidos a título de ilustração e não são limitantes.

Exemplo 1: Geração, Clonagem e Expressão de uma proteína derivada de imunoglobulina anti-IL-4 ou anti-IL-13 em Células de Mamíferos As proteínas derivadas de Ig anti-IL-4 ou anti-IL-13 são geradas usando métodos conhecidos, tal como ratos transqênicos ou roedores que expressam anticorpos humanos que são imunizados com a IL-4 ou IL-13 humana, e para os quais as células B são isoladas, clonadas e selecionadas por especificidade e atividade inibidora para IL-4 ou IL-13 usando métodos e ensaios conhecidos, por exemplo, como conhecido na técnica e como des- 5 crito aqui (vide, por exemplo, www.copewithcvtokines.de, sob IL-4 ou IL-13, para descrição e referências às proteínas relacionadas a IL-4 ou IL-13, en- saios relacionados a IL-4 ou IL-13, incorporados integralmente aqui a título de referência, como conhecido na técnica).

Os clones expressando anticorpos específicos IL-4 ou IL-13 ou proteínas de fusão, como proteínas derivadas de Ig anti-IL-4 ou anti-IL-13 da presente invenção são selecionados tal que eles neutralizam ou inibem ao menos uma IL-4 ou IL-13, e que alcançam ao menos 3-7 dos seguintes crité- rios, usando métodos conhecidos na técnica:

Critérios

1. Ligar ao menos uma IL-4 ou IL-13, receptor de IL-4 ou IL-13

e/ou outra muteína específica de IL-4 ou IL-13 humana purificada ou recom- binante de ocorrência natural, por exemplo, mas não-limitado a, ao menos um Ile48, Val48, Gln90, Glu90, Leu95, Ile95, Leu96, Ile96, Leu99, Ile99, Phe103, Tyr103, Asn130 e/ou Gln130, as 1-145 aminoácidos, tal como, mas 20 não-limitados a ao menos um de 1-10, 10-20, 20-30, 30-40, 40-50, 50-60, 60-70, 70-80, 80-90, 90-100, 100-110, 110-120, 120-130, 130-140, e/ou 14- 145 de SEQ ID NO:42, 43 ou 44 (em ELISA).

2. É específico para ligar à IL-4 ou IL-13 ou receptor de IL-4 ou IL-13 humana recombinante de ocorrência natural, e não ao GM-CSF huma-

no, uma citocina estruturalmente relacionada (em ELISA).

3. Inibe a interação de IL13 humana recombinante de ocorrência natural preferencialmente com o receptor de IL-4 ou IL-13 humana ou um receptor de IL-4 ou IL-13 animal adequado com um ND50 <10 Nm.

4. Inibe a proliferação dependente de IL-4 ou IL-13 humana de ocorrência natural de células de tumor TF-1 humano mais do que um contro- le negativo. I

5. Tem um Kd aparente para IL13 humana de ocorrência natural

i

‘ ou mutante especifico < 0,5 nM (como determinado por BIAcore).

6. Inibe IL-4 ou IL-13 humana recombinante de ocorrência natural

I

dependente da produção de IgE in vitro em células B humanas recentes,

5 mais inibição do que o controle negativo, bem como o ensaio B9.

7. Reage cruzado com 1L13 humana de ocorrência natural nativa com potência similar à para IL-4 ou IL-13 recombinante, como pode ser de- terminado no ensaio B9 e/ou ELISA.

As CDRs de cadeia pesada ou de cadeia leve, regiões variáveis, 10 ou regiões constantes e variáveis são clonadas e colocadas em vetores de expressão apropriados. Um típico vetor de expressão de mamífero contém ao menos um elemento promotor que media a iniciação da transcrição de mRNA, a proteína derivada de Ig ou parte específica ou variante codificando a seqüência, e sinais exigidos para o término da descrição e poliadenilação 15 da transcrição. Elementos adicionais incluem os intensificadores, seqüências Kozak e seqüências intervenientes flanqueadas pelos sítios do doador ou receptor para junção de RNA. A transcrição altamente eficaz pode ser alcan- çada com promotores precoces e tardios de SV40, as repetições de terminal longo (LTRS) de Retrovirus, por exemplo, RSV, HTLVI, HIVI e o promotor 20 precoce de citomegalovírus (CMV). Entretanto, os elementos celulares po-

x.'·

dem também ser usados (por exemplo, promotor de actina humana). Os ve- tores de expressão adequados para uso na prática da presente invenção incluem, por exemplo, vetores tais como pIRESIneo, pRetro-Off, pRetro-On, PLXSN, ou pLNCX (Clonetech Labs, Palo Alto, CA), pcDNA3.1 (+/-), pcD- 25 NA/Zeo (+/-) or pcDNA3.1/Hygro (+/-) (Invitrogen), PSVL and PMSG (Phar- macia, Uppsala, Suécia), pRSVcat (ATCC 37152), pSV2dhfr (ATCC 37146) e pBC12MI (ATCC 67109). As células hospedeiras de mamíferos que pode- riam ser usadas incluem as células humanas Hela 293, H9 e células Jurkat, células de rato C127 e NIH3T3, Cos 1, Cos 7 e CV 1, células QC1-3 de co- 30 dorna, células L de rato e células (CHO) de ovário de hamster chinês.

De forma alternativa, o gene pode ser expresso em linhagens celulares estáveis que contêm o gene integrado em um cromossomo. A co- transfecção com um marcador selecionável tais como o dhfr, gpt, neomicina, ou higromicina permite a identificação e o isolamento das células transfecta- das.

O gene transfectado pode também ser amplificado para expres-

5 sar grandes quantidades de proteína derivada de Ig codificada ou parte es- pecífica ou variante. O marcador DHFR (di-hidrofolato redutase) é útila no desenvolvimento de linhagens celulares que carregam várias centenas ou mesmo vários milhares de cópias do gene de interesse. Outro marcador de seleção útila é a enzima glutamina sintase (GS) (Murphy, e outros, Biochem. 10 J. 227:277 a 279 (1991); Bebbington, e outros, Bio/Technology 10: 169 a 175 (1992)). Usando esses marcadores, as células de mamíferos que estão crescendo em meio seletivo e as células com a resistência mais alta são se- lecionadas. Essas linhagens celulares contêm o(s) gene(s) amplificado(s) integrado(s) em um cromossomo. As células de ovário de hamster chinês 15 (CHO) e células NOS são frequentemente usadas para a produção de prote- ína derivada de Ig ou partes específicas ou variantes.

Os vetores de expressão pC1 e pC4 contêm o promotor resisten- te (LTR) do Rous Sarcoma Vírus (Cullen e outros, Molec. Cell. Biol. 5:438 a 447 (1985)) mais um fragmento do intensificador CMV (Boshart, e outros, 20 Cell 41 :521 a 530 (1985)). Múltiplos sítios de clonagem, por exemplo, com os sítios de clivagem de enzima de restrição BamHI1 Xbal e Asp718, facili- tam a clonagem do gene de interesse. Os vetores contêm em adição o íntron 3’, a poliadenilação e sinal de terminação do gene de preproinsulina de rato. Clonagem e Expressão em Células CHO 25 O vetor pC4 é usado para a expressão de proteína derivada de Ig

relacionada a IL-4 ou IL-13 ou parte específica ou variante. O plasmídeo pC4 é um derivado do plasmídeo pSV2-dhfr (ATCC No. De acesso 37146). O plasmídeo contém o gene DHFR de rato sob controle do promotor precoce SV40. As células de ovário de hamster chinês ou outras células carentes de 30 atividade de di-hidrofolato que são transfectadas com esses plasmídeos po- dem ser selecionadas pelo crescimento de células em um meio seletivo (por exemplo, alpha minus MEM, Life Technoloqies. Gaithersburq. MD) suple- I

mentados com o agente quimioterápico metotrexato. A amplificação dos ge-

i

nes DHFR em células resistentes ao metotrexato (MTX) foi bem documenta- da (Vide, por exemplo, F. W. Alt, e outros, J. Biol. Chem. 253: 1357 a 1370 (1978); J. L. Hamlin e C. Ma, Biochem. et Biophys. Acta 1097: 107 a 143 5 (1990); e M. J. Page e Μ. A. Sydenham, Biotechnology 9:64 a 68 (1991)). As células cultivadas em concentrações crescentes de MTX desenvolvem resis- tência ao fármaco devido à produção demasiada de enzima alvo, DHFR1 como um resultado da amplificação do gene DHFR. Se um segundo gene é ligado ao gene DHFR, ele é usualmente coamplificado e superexpresso. Sa- 10 be-se na técnica que essa abordagem pode ser usada para desenvolver li- nhagens celulares carregando mais de 1.000 cópias dos genes amplificados. De forma subsequente, quando o metotrexato é retirado, as linhagens celu- lares são obtidas, as quais contêm o gene amplificado integrado em um ou mais cromossomos da célula hospedeira.

O plasmídeo pC4 contém, para expressar o gene de interesse, o

promotor resistente de repetição de longo terminal (LTR) do Rous Sarcoma Vírus (Cullen, e outros, Molec. Cell. Biol. 5:438 a 447 (1985)) mais um frag- mento isolado do intensificador de gene precoce imediato do citomegalovírus humano (CMV) (Boshart, e outros, Cell 41 :521 a 530 (1985)). Ajusante do 20 promotor estão os sítios de clivagem de enzima de restrição BamHI, Xbal1 and Asp718 que permitem a integração dos genes. Atrás desses sítios de clonagem o plasmídeo contém o intron 3’ e o sítio de poliadenilação do gene de preproinsulina de rato. Outros promotores de alta eficácia podem também ser usados para expressão, por exemplo, o promotor de b-actina humana, os 25 promotores tardio e precoce de SV40 ou as repetições de terminal longo a partir de outros retrovírus, por exemplo, o HIV e o HTLVI. Os sistemas de expressão de gene Tet-Off e Tet-On da Clontech e sistemas similares po- dem ser usados para expressar a IL4 ou IL-13 de uma forma regulada em células de mamíferos (M. Gossen1 e H. Bujard1 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 30 89: 5547 a 5551 (1992)). Para a poliadenilação do mRNA, outros sinais, por exemplo, dos genes de hormônio de crescimento humano ou de globina po- dem ser usados também. As linhagens celulares estáveis carregando um gene de interesse integrado nos cromossomos odem também ser seleciona- dos mediante cotransfecção com um marcador selecionável tal como o gpt, G418 ou higromicina. É vantajoso usar mais de um marcador selecionável no início, por exemplo, G418 mais metotrexato.

5 O plasmídeo pC4 é digerido com enzimas de restrição e então

desfosforilado usando fosfatase intestinal de bezerro através de procedimen- tos conhecidos na técnica. O vetor é então isolado a partir de gel agarose a 1%.

A seqüência de DNA codificando a proteína derivada de Ig rela- 10 cionada a IL-4 ou IL-13 completa ou parte específica ou variante é usada, correspondente às regiões variáveis HC e LC de uma proteína derivada de Ig relacionada a IL-4 ou IL-13 da presente invenção, de acordo com as eta- pas do método conhecido. O ácido nucléico isolado codificando uma região constante humana adequada (isto é, as regiões HC e LC) é também usado 15 nesta construção (por exemplo, fornecido no vetor p1351).

A região constante e variável isolada codificando o DNA e o vetor desfosforilado são então ligados com a T4 DNA ligase. As células XL-1 Blue ou as células HB101 de E. coli são então transformadas e as bactérias são identificadas, as quais contêm o fragmento inserido no plasmídeo pC4 usan- do, por exemplo, a análise de enzimas de restrição.

As células de ovário de hamster chinês (CHO) carentes de um gene DHFR ativo são usadas para transfecção. 5 μς do plasmídeo de ex- pressão pC4 são cotransfectados com 0,5 μg do plasmídeo pSV2-neo usan- do lipofectina. O plasmídeo pSV2-neo contém um marcador selecionável 25 dominante, o neo gene de Tn5 codificando uma enzima que confere resis- tência a um grupo de antibióticos incluindo G418. As células são semeadas no MEM alfa minus suplementado com 1 μg/ml de G418. Após 2 dias, as células são tripsinizadas e semeadas em placas de clonagem de hibridoma (Greiner, Alemanha) em MEM alfa minus suplementadas com 10, 25, ou 50 30 ng/ml de metotrexato mais 1 μg/ml de G418. Após aproximadamente 10 a 14 dias, os únicos clones são tripsinizados e então semeados em frascos de 10 ml ou placas petri de 6 cavidades usando diferentes concentracões de meto- trexato (50 nM, 100 nM, 200 nM, 400 nM, 800 nM). Clones crescendo nas

i

concentrações mais altas de metotrexato são então transferidos às novas placas com 6 cavidades contendo concentrações ainda mais altas de meto- trexato (1 mM, 2 mM, 5 mM, 10 mM, 20 mM). O mesmo procedimento é re- 5 petido até que os clones sejam obtidos, os quais crescem em uma concen- tração de 100 a 200 Mm. A expressão do produto de gene desejado é anali- sada, por exemplo, através do SDS-PAGE e através de Western blot ou aná- lise HPLC de fase reversa.

As proteínas derivadas de Ig anti-IL-4 e anti-IL-13 completamente 10 humanas são adicionalmente caracterizadas. Espera-se que várias das pro- teínas derivadas de Ig tenham constantes de afinidade entre 1x109 e 9x1012. Tais altas afinidades dessas de proteínas derivadas de Ig monoclonais com- pletamente humanas as tornam adequadas para aplicações terapêuticas em doenças dependentes de proteína relacionada a IL-4 e IL-13, patologias ou 15 condições relacionadas.

Exemplo: 3: Fibrose e IL-13 e IL4 Detecção de IL-13 em Biópsias de Pulmão

As amostras de biópsia de pulmão foram fornecidas através de uma MTA com o Dr. Cory Hogaboam na Universidade de Michigan. As a- 20 mostras de biópsia de pulmão da UIP e as margens normais de tumores no pulmão foram homogeneizadas em PBS contendo o Inibidor de Protease Completo (Roche). Os níveis de IL-13 foram medidos por luminex, seguindo o protocolo do fabricante. A proteína total foi medida em cada amostra de biópsia de pulmão usando o ensaio BCA. Os níveis de IL-13 foram normali- 25 zados para miligramas de proteína em cada amostra do paciente.

Isolamento e Purificação de Fibroblasto

As linhagens celulares foram fornecidas pelo Dr. Cory Hogaboam na Universidade de Michigan. Todas as linhagens de fibroblasto primário foram isoladas como previamente descrito (21). Os fibroblastos pulmonares 30 foram isolados das biópsias de pulmão tiradas de pacientes da UIP (n = 4) e essas deverão ser referidas como “fibroblastos fibróticos". Os fibroblastos foram também isolados do tecido de pulmão tirado durante resecção de tu- mor de pulmão (n = 5) e essas amostras foram confirmadas como sendo não fibróticas através da análise histológica. Esses fibroblastos derivados de te- cido não fibrótico deverão ser referidos como “fibroblastos não fibróticos”. Expressão do gene de fibroblasto 5 Os fibroblastos de pulmão humano foram colocados em placas

de 24 cavidades (Costar, Corning, NY) em 100.000 células/cavidades e permitidos a aderir por 8 horas. As células foram então lavadas com PBS e cultivadas durante toda a noite em meio isento de soro (DMEM com 1- Glutamina, Pen/Strep). As células foram então estimuladas por 24 horas na 10 presença ou ausência de TGFp-1 (1 ou 10 ng/mL), PDGF-AB (20 ou 200 ng/mL), IL-4 (1 ou 10 ng/mL) ou IL-13 (1 ou 10 ng/mL). TGFpil PDGF-AB, IL-

4 e IL-13 foram adquiridos a partir da R&D Systems. O sobrenadantes foram removidos e o RNA foi isolado subsequentemente usando os Mini Kits RNe- asy Plus (QIAGEN, Valencia, CA) como por instruções do fabricante e o 15 RNA foi transcrito reverso no cDNA usando os Reagentes de Transcrição Reversa TaqMan® (Applied Biosystems, Foster City, CA). A expressão de gene profibrótico foi determinada por PCR em tempo real usando o PCR Master Mix Universal Taqman® (Applied Biosystems) e Ensaios de Expres- são de Gene pré-desenvolvidos Taqman® (Applied Biosystems) como pelas 20 instruções do fabricante.

A expressão de gene quantitativa foi calculada usando o método Ct comparativo, onde os valores Cj são determinados como o número limite de ciclos para os quais a expressão de gene é primeiramente detectada. As modulações na expressão de gene para os genes de interesse foram primei- 25 ro normalizadas para o gene referência 18S, fornecendo os valores ACt . As modulações na expressão entre os fibroblastos não fibróticos e fibróticos foram calculadas como: ACT(não fibrótico) - ΔΟγ^ιόηοο) = ΔΔΟγ, onde a expressão de gene fibrótico serviu como o calibrador. As modulações na expressão de gene devido ao estímulo in vitro foram calculadas por àACy = ACj(não estimuia- 30 do) - ACx(estimuiado)i onde a amostra não estimulada serviu como calibrador. O cálculo 2'aact então fornece um valor relativo para a modulação final quando comparada ao calibrador. )

Níveis de proteína relacionada a IL-13 em biópsias de pulmão a

í

partir de pacientes não fibróticos e UIP

A IL-13 foi mostrada como sendo regulada para cima em pacien- tes da UIP (9). Foram detectados níveis elevados de IL-13 no nível de prote- 5 ína em biópsias de pulmão a partir de pacientes com fibrose pulmonar com- parado a biópsias obtidas de tecido de pulmão não fibrótico. (* p<0,05, teste t não emparelhado de Student com correção de Welch).

Aumentos na expressão de vários genes associados com fibrose em fibroblastos UIP em comparação aos fibroblastos isolados a partir de sí- 10 tios de pulmão não fibrótico.

Chave:

aSMA: actina de músculo relaxado alfa PCOL1 : procolágeno I PCOL3: procolágeno Ill 15 CTGF: fator de crescimento de tecido conjuntivo TGFp-1: fator de transformação de crescimento -1 TGFpRI: receptor de TGFp tipo !

TGFPR2: receptor de TGFp tipo Il IL13Ra1: Subunidade alfa 1 de receptor de Interleuquina 20 IL13Ra2: Subunidade alfa 2 de receptor de Interleuquina

Para determinar se a expressão de linha de base na expressão de gene profibrótico estava diferente nos fibroblastos UIP (n = 3) comparado aos fibroblastos não fibróticos (n = 4), a expressão de gene foi comparada entre as células não estimuladas a partir de ambos os grupos de pacientes. 25 Os dados mostraram que os fibroblastos UIP têm maior expressão de gene fibrótico de linha de base em todos os genes analisados.

Efeito de TGFpi, PDGF, IL-13 e IL-4 sobre a expressão aSMA

Os miofibroblastos são relativamente ausentes de tecido não fi- brótico (4). Os miofibroblastos contêm fibras de actina de músculo relaxado 30 que fornecem às células um fenótipo contrátila, que serve para fechar feri- mentos. A expressão de gene de actina de músculo relaxado alfa (aSMA) é então um marcador para miofibroblastos. O TGFB1 é um fator de crescimen- to profibrótico prototípico que foi previamente mostrado como induzindo a expressão de aSMA (22). Aqui se observa TGFpi induzindo aSMA em fibro- blastos fibróticos e não fibróticos, com a magnitude de indução sendo maior em fibroblastos fibróticos. PDGF, IL-13 e IL-4 somente induziram um aumen- 5 to moderado na expressão de aSMA somente nos fibroblastos fibróticos.

Efeito de TGFpi, PDGF, IL-13 e IL-4 na expressão de gene pro- colágeno I (A) e procolágeno Ill (B)

O depósito de colágeno é uma marca chave da fibrose. Os dois genes procolágeno I e procolágeno Ill foram previamente mostrados associ- 10 ados com UIP. O procolágeno I e Ill se mostraram elevados em amostras UIP, ambos no pulmão e sistematicamente (23) (24) (25). Os dados apre- sentados aqui mostram que a IL-13 e IL-4 induzem ambos o procolágeno I e procolágeno Ill nos fibroblastos UIP. Ademais, a extensão da indução de gene é comparável a ambos os TGFpI e PDGF-AB nos fibroblastos fibróti- 15 cos. A IL-4 também induziu um aumento moderado no procolágeno Ill em fibroblastos não fibróticos.

Expressão de gene TGFpi induzida por TGFpI, PDGF, IL-13 e IL-4

A função profibrótica de TGFpi foi sugerida. O TGFpi também tem um ciclo de geração autócrino já que o TGFpi induz adicionalmente a 20 produção de TGFpi (26, 27). Esse fenômeno foi também observado aqui em ambos os fibroblastos fibróticos e não fibróticos. Os dados gerados mostra- ram que a IL-13 e a IL-4 podem também aumentar a expressão de gene TGFpi. Similar ao TGFpi, a extensão da indução do gene TGFpi por PDGF e ambas as citocinas tipo 2 foi maior nos fibroblastos fibróticos.

Expressão de gene CTGF induzida por TGFpi, PDGF, IL-13 e IL-4

O fator de crescimento de tecido conjuntivo (CTGF) foi mostrado como mediando muitos dos efeitos de TGFpi incluindo a produção de colá- geno (28) (29) (30). O TGFpi induziu um aumento na expressão de gene CTGF em ambos os fibroblastos fibróticos e não fibróticos. Ademais, PDGF 30 em dose baixa (20 ng/ml), bem como a IL-13 e IL-4 induziram um aumento na expressão de gene CTGF nos fibroblastos UIP. I

Expressão de gene TGFpRI (A) e TGFpRII (B) induzida por TGFpi, PDGF, IL-13 e IL-4

Bem como aumentando a expressão de gene TGFpI, TGFpi e PDGF induziram o aumento em ambas as subunidades de receptor de 5 TGFpI nos fibroblastos UIP. Os receptores de TGFpI revelaram-se eleva- dos nos fibroblastos de escleroderma (31, 32). Os dados gerados também mostraram que a IL-13 e a IL-4 induziram um aumento em ambas as subu- nidades de receptor de TGFp nas células fibróticas, com o IL-4 mediando a maior indução de gene de TGFPRII.

10 Expressão de gene IL13Ra1 (A) e IL13Ra2 (B) induzida por TGFP1, PDGF, IL-13 e IL-4

Como já foi relatado na literatura, e descrito neste relatório, a IL- 13 é encontrada em níveis elevados nos pulmões de pacientes da UIP. A IL- 13 é profibrótica in vitro e durante os modelos in vivo. A IL-13 induz a gera- 15 ção de colágeno e a proliferação de fibroblastos (12-14). Ademais, a inibição da atividade de IL-13 foi mostrada como sendo benéfica em uma variedade de modelos de fibrose pulmonar de ratos (17-20). TGFpi, PDGF, IL-4 e IL- 13 induzem um uma regulação para cima na expressão de IL13Ra2 em fi- broblastos da UIP. Todos os quatro mediadores induziram uma regulação 20 para cima na expressão de IL13Ra2, desse modo tornando essas células

K.'

potencialmente mais sensíveis às respostas mediadas por IL-13. Também, a sinalização através de IL13Ra2 foi recentemente demonstrada como sendo profibrótica através da indução de TGFpi (15).

Expressão de gene CD44 induzida por TGFpi, PDGF, IL-13 e IL-4 25 O hialuronano, derivado de fibroblastos, foi previamente demons-

trado como se correlacionando com a fibrose usando modelos animais de fibrose pulmonar (33). O hialuronano liberado que forma fibroblastos é pró- inflamatório exacerbando potencialmente assim a resposta fibrótica. O hialu- ronano liga-se ao CD44. Mostrou-se aqui que todos os mediadores induzem 30 uma regulação para cima na expressão de gene CD44 nos fibroblastos da UIP indicando que essas células podem ser hiperresponsivas aos eventos a iusante mediados pelo hialuronano. Expressão de gene de fibronectina induzida por TGFpI, PDGF, IL-13 e IL-4 A fibronectina é um componente da matriz extracelular. A evidên- cia indicada aqui sugere que todos os mediadores induzem diretamente uma regulação para cima na expressão do gene de fibronectina nos fibroblastos 5 da UIP, que podem adicionar à deposição da matriz extracelular excessiva associada com fibrose pulmonar.

Expressão de gene PDGFRA (A) e PDGFRB (B) induzida por TGFpi, PDGF, IL-13 e IL-4

O PDGF (fator de crescimento derivado de plaqueta) é um fator 10 de crescimento que tem sido demonstrado como promovendo a proliferação de fibroblastos. Ademais, a inibição da sinalização do receptor de PDGF foi recentemente demonstrada como limitando a fibrose in vivo (34). Neste es- tudo, TGFpi, PDGF, IL-13 e IL-4 induziram um aumento em ambas as ca- deias do receptor de PDGF nos fibroblastos da UIP. Isso indica que todos os 15 mediadores testados podem melhorar a susceptibilidade dos fibroblastos da UIP aos eventos a jusante induzidos por PDGF tal como proliferação. Vantagens

Essa é a primeira descrição relatada conhecida de responsivida- de funcional de fibroblastos da UIP para ambas IL-4 e IL-13. Este estudo também destaca a importância de comparar os fibroblastos não fibróticos e os fibroblastos fibróticos quando se avalia a função dos agentes terapêuticos potenciais para fibrose. A inibição de IL-4 e/ou IL-13 se mostrou benéfica em vários modelos animais de fibrose. Mecanisticamente, a inibição de fibrose em modelos animais tem sido atribuída à proliferação de fibroblasto reduzida e à produção de colágeno. Entretanto, este estudo adota mais de uma abor- dagem de medicina translacional comparando os fibroblastos a partir de sí- tios de fibrose com células derivadas de tecido não fibrótico. Também esse estudo elucida um número de genes que é aumentado seguindo estímulo in vitro com ou o IL-4 ou IL-13. Geralmente, esta invenção descreve como dire- cionar a IL-4 e/ou IL-13 pode ser benéfico em pacientes com fibrose pulmo- nar como um número grande de genes são induzidos seguindo o estímulo com qualquer uma dessas duas citocinas tipo 2. Ademais, a extensão de I

regulação para cima do gene para alguns dos mediadores profibróticos foi comparável a essa induzida pelos mediadores profibróticos clássicos TGFpi e PDGF. Também dois dos fatores de crescimentos prototípicos encontrados no tecido fibrótico, TGFpI e PDGF, induziram uma regulação para cima das 5 subunidades do receptor de IL-13 indicando que a responsividade dos fibro- blastos da UIP a IL-13 será melhorada adicionalmente no ambiente de tecido fibrótico. Finalmente, além disso, devido ao número de genes diretamente modulados por IL-4 e IL-13, esses genes (por exemplo, procolágeno I e III, IL13Ra2) podem servir como biomarcadores clínicos para pacientes que 10 estão sendo tratados com terapias que inibem IL-4 e IL-13 como indicativo de resposta à terapia. Geralmente, esta invenção descreve como direcionar IL-4 e/ou IL-13 pode ser benéfico em pacientes com doença pulmonar inters- ticial como um grande número de genes são induzidos seguindo o estímulo com essas citocinas tipo 2. Ademais, o direcionamento de IL-4 e/ou IL-13 15 pode ser benéfico em um número de outras doenças com patologias fibróti- cas incluindo, mas não-limitadas à doença pulmonar intersticial, escleroder- ma (local e difusa), fibrose hepática, fibrose renal, sarcoidose, cicatriz hiper- trófica, cicatriz quelóide, fibrose cardíaca, degeneração macular relacionada à idade, doença vascular do colágeno e outras doenças relacionadas.

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Estará claro que a invenção pode ser praticada de forma diferen- te do que foi particularmente descrito na descrição precedente e nos exem- plos.

Numerosas modificações e variações da presente invenção são possíveis em face aos ensinamentos acima e, então, estão dentro do escopo das reivindicações em anexo. Tabela 1

SEQ AA REGIÕES ID FR1 CDR1 FR2 CDR2 FR3 CDR3 FR4 No. 1 Vh1 125 1-31 32 33-46 47 48-79 80 81-125 2 Vh2 97 1-30 31 32-45 46 47-78 79 80-97 3 Vh3a 102 1-30 31 32-45 46 47-78 79 80-102 4 Região vari¬ Vh3b 102 1-30 31 32-45 46 47-78 79 80-102 Vh3c 94 1-30 31 32-45 46 47-78 79 80-94 6 deia pesada Vh4 106 1-30 31 32-45 46 47-78 79 80-106 7 Vh5 97 1-30 31 32-45 46 47-78 79 80-97 8 Vh6 91 1-30 31 32-45 46 47-78 79 80-91 9 Vh7 91 1-30 31 32-45 46 47-78 79 80-91 k1-4 73 1-23 24 25-39 40 41-72 73 11 k2 73 1-23 24 25-39 40 41-72 73 12 k3 73 1-23 24 25-39 40 41-72 73 13 k5 73 1-23 24 25-39 40 41-72 73 14 k novo 67 1-17 18 19-33 34 35-66 67 1 k novo 65 1-15 16 17-31 32 33-64 65 2 16 72 1-22 23 24-38 39 40-71 72 17 λ1ό 73 1-23 24 25-39 40 41-72 73 18 Região vari¬ λ1ο 72 1-22 23 24-38 39 40-71 72 19 A.3a 72 1-22 23 24-38 39 40-71 72 X3b 72 1-22 23 24-38 39 40-71 72 21 λ3ε 72 1-22 23 24-38 39 40-71 72 22 λ3β 72 1-22 23 24-38 39 40-71 72 23 XAa 72 1-22 23 24-38 39 40-71 72 24 λ4b 72 1-22 23 24-38 39 40-71 72 λ5 75 1-22 23 24-39 40 41-74 75 26 λ6 74 1-22 23 24-38 39 40-73 74 27 λ7 72 1-22 23 24-38 39 40-71 72 28 λ8 72 1-22 23 24-38 39 40-71 72 29 λ9 72 1-22 23 24-38 39 40-71 72 λ10 72 1-22 23 24-38 39 40-71 72 » 106

I

SE ID AA REGIÕES CH1 Dobra¬ Dobra¬ Dobra¬ Dobra¬ CH2 CH3 diça 1 diça 2 diça 3 diça 4 31 Região cons¬ IgAI 354 1-102 103- 123- 223- tante de ca¬ 122 222 354 32 lgA2 340 1-102 103- 109- 210- 108 209 340 33 IgD 384 1-101 102- 136- 160- 268- 135 159 267 384 34 IgE 497 1-103 104- 211- 210 318 Igd 339 1-98 99-113 114- 224- 223 339 36 igG2 326 1-98 99-110 111- 220- 219 326 37 igG3 377 1-98 99-115 116- 131- 146- 161- 271- 130 145 160 270 377 38 igG4 327 1-98 99-110 111- 221- 220 327 39 IgM 476 1-104 105- 218- 217 323 40 Região cons¬ Igkc 107 41 Ιςλο 107 IL-4 60

120

125

60

97

60

102

60

102

60

94

60

106

60

97

60

91

60

107

Listagem de Seqüência

<110> MURRAY, Lynne A.

<120> MÉTODOS E COMPOSIÇÕES PARA TRATAR PATOLOGIAS RELACIONADAS A IL-13

<130> CEN5067 <160> 42

<170> PatentIn Vide 3.1 SEQ ID NO:1

QVQLLVQSGA EVKKPGASVK VSCKASGYTF YMELSSLRSE DTAVYYCARX WGQGTLVTVS KDYFP

SEQ ID NO:2

QITLKESGPA LVKPTQTLTL TCTFSGFSLS LTMTNMDPVD TATYYCARXW GQGTLVTVSS SEQ ID NO:3

EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS LQMNSLRAED TAVYYCARXW GQGQGTLVTV SEQ ID NO:4

EVQLVESGGG LVKPGGSLRL SCAASGFTFS LQMNSLKTED TAVYYCTTXW GQGTLVTVSS SEQ ID NO:5

EVQLVESGGG LVQPGRSLRL SCTASGFTFG LQMNSLKTED TAVYYCTRXV TVSSGSTKGP SEQ ID NO:6

QVQLQESGPG LVKPSETLSL TCTVSGGSIS LKLSSVTAAD TAVYYCARXW GQQGTLVTVS SEQ ID NO:7

EVQLVQSGAE VKKPGESLKI SCKGSGYSFT LQWSSLKASD TAMYYCARXW GQGTLVTVSS SEQ ID NO:8

QVQLQQSGPG LVKPSQTLSL TCAISGDSVS LQLNSVTPED TAVYYCARXW GQGTLVTVSS SEQ ID NO:9

QVQLVQSGSE LKKPGASVKV SCKASGYTFT

TXWVRQAPGQ GLEWMGXRVT MTRDTSTSTA SGSTKGPSVF PLAPSSKSTS GGTTiALGCLV

XWIRQPPGKA LEWLAXRLTI SKDTSKNQVV GSASAPS

XWVRQAPGKG LEWVSXRFTI SRDNSKNTLY SSGSTKAPSV FP

XWVRQAPGKG LEWVGXRFTI SRDDSKNTLY ASTKGPSVFP LA

XWVRQAPGKG LEWVGXRFTI SRDDSKSIAY SVLP

XWIRQPPGKG LEWIGXRVTI SVDTSKNQFS SAPTKAPDVF PIISGC

XWVRQMPGKG LEWMGXQVTI SADKSISTAY ASTKGPS

XWIRQSPSRG LEWLGXRITI NPDTSKNQFS G

XWVRQAPGQG LEWMGXRFVF SLDTSVSTAY I

LQISSLKAED TAVYYCARXW GQGTLVTVSS S 91 Í SEQ ID NO:10

DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCXWYQQKP GKAPKLLIYX GVPSRFSGSG SGTDFTLTIS 60

SLQPEDFATY YCX 73 SEQ ID NO:11

DIVMTQSPLS LPVTPGQPAS ISCXWYLQKP GQSPQLLIYX GVPDRFSGSG SGTDFTLKIS 60

RVEAEDVGVY YCX 7 3 SEQ ID NO:12

EIVLTQSPGT LSLSPGERAT LSCXWYQQKP GQAPRLLIYX GIPDRFSGSG SGTDFTLTIS 60

RLEPEDFAVY YCX 73 SEQ ID NO:13

ETTLTQSPAF MSATPGDKVN ISCXWYQQKP GEAAIFIIQX GIPPRFSGSG YGTDFTLTIN 60

NIESEDAAYY FCX 7 3 SEQ ID NO:14

15 EIVMTQSPVN LSMSAGEXWY QQKPGQAPRL FIYXGISARF SGSGSGTDFT LTITSLQSED 60

FAVYYCX 67 SEQ ID NO:15

ELTQSPGTLS LSPGEXWYQH KPGQAPRLVI HXGISDRFSG SGSGTDFTLT ITRLEPEDFA 60

LYYCX 65 SEQ ID NO:16

QSVLTQPPSA SGTPGQRVTI SCXWYQQLPG TAPKLLIYXG VPDRFSGSKS GTSASLAISG 60

LQSEDEADYY CX 72 SEQ ID NO:17

AQSVLTQPPS VSAAPGQKVT ISCXWYQQLP GTAPKLLIYX GIPDRFSGSK SGTSATLGIT 60

GLQTGDEADY YCX 7 3 SEQ ID NO:18

QSALTQPASV SGSPGQSITI SCXWYQQHPG KAPKLMIYXG VSNRFSGSKS GNTASLTISG 60

LQAEDEADYY CX 7 2 SEQ ID NO:19

,30 SYELTQPPSV SVSPGQTARI TCXWYQQKPG QAPVLVIYXG IPERFSGSSS GTTVTLTISG 60

VQAEDEADYY CX 72 SEQ ID NO:20

SYVLTQPPSV SVAPGQTARI TCXWYQQKPG QAPVLVVYXG IPERFSGSNS GNTATLTISR 60

VEAGDEADYY CX 72 SEQ ID NO:21

SYELTQPPSV SVSPGQTASI TCXWYQQKPG QSPVLVIYXG IPERFSGSNS GNTATLTISG 60

TQAMDEADYY CX 72 SEQ ID NO:22

SSELTQDPAV SVALGQTVRI TCXWYQQKPG QAPVLVIYXG IPDRFSGSSS GNTASLTITG 60

AQAEDEADYY CX 72 SEQ ID NO:23

QLVLTQSPSA SASLGASVKL TCXWHQQQPE KGPRYLMKXG IPDRFSGSSS GAERYLTISS 60

LQSEDEADYY CX 72 SEQ ID NO:24

QPVLTQSSSA SASLGSSVKL TCXWHQQQPG KAPRYLMKXG VPDRFSGSSS GADRYLTISN 60

LQSEDEADYY CX 72 SEQ ID NO:25

QAVLTQPSSL SASPGASASL TCXWYQQKPG SPPQYLLRYX GVPSRFSGSK DASANAGILL 60

ISGLQSEDEA DYYCX 75 SEQ ID NO:26

NFMLTQPHSV SESPGKTVTI SCXWYQQRPG SAPTTVIYXG VPDRFSGSID SSSNSASLTI 60

SGLKTEDEAD YYCX 74 SEQ ID NO:27

QTWTQEPSL TVSPGGTVTL TCXWFQQKPG QAPRALIYXW TPARFSGSLL GGKAALTLSG 60

VQPEDEAEYY CX 72 SEQ ID NO:28

QTVVTQEPSF SVSPGGTVTL TCXWYQQTPG QAPRTLIYXG VPDRFSGSILA GNKAALTITG 60

AQADDESDYY CX 72 SEQ ID NO:29

QPVLTQPPSA SASLGASVTL TCXWYQQRPG KGPRFVMRXG IPDRFSVLGS GLNRYLTIKN 60

IQEEDESDYH CX 72 SEQ ID NO:30

QAGLTQPPSV SKGLRQTATL TCXWLQQHQG HPPKLLSYXG ISERFSASRS GNTASLTITG 60

LQPEDEADYY CX 7 2 SEQ ID NO:31

A-SPTSPKVFP LSLCSTQPDG NVVIACLVQG FFPQEPLSVT WSESGQGVTA RNFPPSQDAS 60

GDLYTTSSQL TLPATQCLAG KSVTCHVKHY TNPSQDVTVP CPVPSTPPTP SPSTPPTPSP 120

SCCHPRLSLH RPALEDLLLG SEANLTCTLT GLRDASGVTF TWTPSSGKSA VQGPPERDLC 180 GCYSVSSVLP GCAEPWNHGK TFTCTAAYPE SKTPLTATLS KSGNTFRPEV HLLPPPSZEE 240 LALNELVTLT CLARGFSPKD VLVRWLQGSQ ELPREKYLTW ASRQEPSQGT TTFAVTSILR 300 VAAEDWKKGD TFSCMVGHEA LPLAFTQKTI DRLAGKPTHV NVSVVMAEVD GTCY 354 SEQ ID NO:: 32 ASPTSPKVFP LSLDSTPQDG NVVVACLVQG FFPQEPLSVT WSESGQNVTA RNFPPSQDAS 60 GDLYTTSSQL TLPATQCPDG KSVTCHVKHY TNPSQDVTVP CPVPPPPPCC HPRLSLHRPA 120 LEDLLLGSEA NLTCTLTGLR DASGATFTWT PSSGKSAVQG PPERDLCGCY SVSSVLPGCA 180 QPWNHGETFT CTAAHPELKT PLTANITKSG NTFRPEVHLL PPPSEELALN ELVTLTCLAR 240 GFSPKDVLVR WLQGSQELPR EKYLTWASRQ EPSQGTTTFA VTSILRVAAE DWKKGDTFSC 300 MVGHEALPLA FTQKTIDRLA GKPTHVNV SV VMAEVDGTCY 340 SEQ ID NO: : 33 APTKAPDVFP IISGCRHPKD NSPVVLACLI TGYHPTSVTV TWYMGTQSQP QRT FPEIQRR 60 DSYYMTSSQL STPLQQWRQG EYKCVVQHTA SKSKKEIFRW PESPKAQASS VPTAQPQAEG 120 SLAKATTAPA TTRNTGRGGE EKKKEKEKEE QEERETKTPE CPSHTQPLGV YLLTPAVQDL 180 WLRDKATFTC FVVGSDLKDA HLTWEVAGKV PTGGVEEGLL ERHSNGSQSQ HSRLTLPRSL 240 WNAGTSVTCT LNHPSLPPQR LMALREPAAQ APVKLSLNLL ASSDPPEAAS WLLCEVSGFS 300 PPNILLMWLE DQREVNTSGF APARPPPQPR STTFWAWSVL RVPAPPSPQP ATYTCVVSHE 360 DSRTLLNASR SLEVSYVTDH GPMK 384 SEQ ID NO:34

ASTQSPSVFP LTRCCKNIPS NATSVTLGCL ATGYFPEPVM VTWDTGSLNG TTMTLPATTL 60 TLSGHYATIS LLTVSGAWAK QMFTCRVAHT PSSTDWVDNK TFSVCSRDFT PPTVKILQSS 120 CDGGGHFPPT IQLLCLVSGY TPGTINITWL EDGQVMDVDL STASTTQEGE LASTQSELTL 180 SQKHWLSDRT YTCQVTYQGH TFEDSTKKCA DSNPRGVSAY LSRPSPFDLF IRKSPTITCL 240 VVDLAPSKGT VNLTWSRASG KPVNHSTRKE EKQRNGTLTV TSTLPVGTRD WIEGETYQCR 300 VTHPHLPRAL MRSTTKTSGP VGPRAAPEVY AFATPEWPGS RDKRTLACLI QNFMPEDISV 360 QWLHNEVQLP DARHSTTQPR KTKGSGFFVF SRLEVTRAEW EQKDEFICRA VHEAASPSQT 420 VQRAVSVNPG KDVCVEEAEG EAPWTWTGLC IFAALFLLSV SYSAALTLLM VQRFLSATRQ 480 GRPQTSLDYT NVLQPHA 497 SEQ ID NO: : 35 ASTKGPSVFP LAPSSKSTSG GTAALGCLVK DYFPEPVTVS WN S GALT S GV HTFPAVLQSS 60 GLYSLSSVVT VPSSSLGTQT YICNVNHKPS NTKVDKKVEP KSCDKTHTCP PCPAPELLGG 120 PSVFLFPPKP KDTLMISRTP EVTCVVVDVS HEDPEVKFNW YVDGVEVHNA KTKPREEQYN 180 STYRVVSVLT VLHQDWLNGK EYKCKVSNKA LPAPIEKTIS KAKGQPREPQ VYTLPPSRDE 240 LTKNQVSLTC LVKGFYPSDI AVEWESBNGQ PENNYKTTPP VLDSDGSFFL YSKLTVDKSR 300 60

120

180

240

300

326

60

120

180

240

300

360

377

60

120

180

240

300

327

60

120

180

240

300

360

420

476

60

111

WQQGNVFSCS VMHEALHNHY TQKSLSLSPG SEQ ID NO:36

ASTKGPSVFP LAPCSRSTSE STAALGCLVK GLYSLSSVVT VPSSNFGTQT YTCNVDHKPS LFPPKPKDTL MISRTPEVTC VVVDVSHEDP VVSVLTVVHQ DWLNGKEYKC KVSNKGLPAP QVSLTCLVKG FYPSDIAVEW ESNGQPENNY VFSCSVMHEA LHNHYTQKSL SLSPGK SEQ ID NO:37

ASTKGPSVFP LAPCSRSTSG GTAALGCLVK GLYSLSSVVT VPSSSLGTQT YTCNVNHKPS DTPPPCPRCP EPKSCDTPPP CPRCPEPKSC LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVQFKWYVD QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKTK GFYPSDIAVE WESSGQPENN YNTTPPMLDS ALHNRFTQKS LSLSPGK SEQ ID NO:38

ASTKGPSVFP LAPCSRSTSE STAALGCLVK GLYSLSSVVT VPSSSLGTKT YTCNVDHKPS FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSQED RWSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKGLPS NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSLGK SEQ ID NO:39

GSASAPTLFP LVSCENSPSD TSSVAVGCLA RGGKYAATSQ VLLPSKDVMQ GTDEHVVCKV DGFFGNPRSK SKLICQATGF SPRQIQVSWL STLTIKESDW LSQSMFTCRV DHRGLTFQQN TKLTCLVTDL TTYDSVTISW TRQNGEAVKT RFTCTVTHTD LPSPLKQTIS RPKGVALHRP DVFVQWQMQR GQPLSPEKYV TSAPMPEPQA ALPNRVTERT VDKSTGKPTS ADEEGFENLW SEQ ID NO:40

RTVAAPSVFI FPPSDEQLKS GTASVVCLLN

KTHTCPPCP

DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS NTKVDKTVER KCCVECPPCP APPVAGPSVF EVQFNWYVDG VEVHNAKTKP REEQFNSTFR IEKTISKTKG QPREPQVYTL PPSREEMTKN KTTPPMLDSD GSFFLYSKLT VDKSRWQQGN

DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS NTKVDKRVEL KTPLGDTTHT CPRCPEPKSC DTPPPCPRCP APELLGGPSV FLFPPKPKDT GVEVHNAKTK PREEQYNSTF RVVSVLTVLH GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLTCLVK DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NIFSCSVMHE

DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS NTKVDKRVES KYGPPCPSCP APEFLGGPSV PEVQFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQFNSTY SIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSQEEMTK YKTTPPVLDS DGSFFLYSRL TVDKSRWQEG

QDFLPDSITF SWKYKNNSDI SSTRGFPSVL QHPNGNKEKN VPLPVIAELP PKVSVFVPPR REGKQVGSGV TTDQVQAEAK ESGPTTYKVT ASSMCVPDQD TAIRVFAIPP SFASIFLTKS HTNISESHPN ATFSAVGEAS ICEDDWNSGE DVYLLPPARE QLNLRESATI TCLVTGFSPA PGRYFAHSILA TVSEEEWNTG ETYTCVVAHE ATASTFIVLY NVSLVMSDTA GTCYVK

NFYPREAKVQ WKVDNALQSG NSQESVTEQD SKDSTYSLSS TLTLSKADYE KHKVYACEVT HQGLSSPVTK SFNRGEC SEQ ID NO:41

GQPKAAPSVT LFPPSSEELQ ANKATLVCLI SDFYPGAVTV AWKADSSPVK AGVETTTPSK QSNNKYAASS YLSLTPEQWK SHRKSYSCQV THEGSTVEKT VAPTECS IL-13 Humana <210> 42

<211> 146

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<4 00> 42

Met His Pro Leu Leu Asn Pro Leu Leu Leu Ala Leu Gly Leu Met Ala 15 10 15

Leu Leu Leu Thr Thr Val He Ala Leu Thr Cys Leu Gly Gly Phe Ala 20 25 30

Ser Pro Gly Pro Val Pro Pro Ser Thr Ala Leu Arg Glu Leu He Glu 35 40 45

Glu Leu Val Asn He Thr Gln Asn Gln Lys Ala Pro Leu Cys Asn Gly 50 55 60

Ser Met Val Trp Ser He Asn Leu Thr Ala Gly Met Tyr Cys Ala Ala 65 70 75 80

Leu Glu Ser Leu He Asn Val Ser Gly Cys Ser Ala He Glu Lys Thr 85 90 95

Gln Arg Met Leu Ser Gly Phe Cys Pro His Lys Val Ser Ala Gly Gln 100 105 110

Phe Ser Ser Leu His Val Arg Asp Thr Lys He Glu Val Ala Gln Phe 115 120 125

Val Lys Asp Leu Leu Leu His Leu Lys Lys Leu Phe Arg Glu Gly Gln 130 135 140

Phe Asn

145

IL-4 Humana <210> 43

<211> 146

<212> PRT

107

60

107 <213> Homo sapiens

<4 00> 43

Met Gly Leu Thr Ser Gln Leu Leu Pro Pro Leu Phe Phe Leu Leu Ala 15 10 15

Cys Ala Gly Asn Phe Val His Gly His Lys Cys Asp He Thr Leu Gln 20 25 30

Glu He He Lys Thr Leu Asn Ser Leu Thr Glu Gln Lys Thr Leu Cys 35 40 45

Thr Glu Leu Thr Val Thr Asp He Phe Ala Ala Ser Lys Asn Thr Thr 50 55 60

Glu Lys Glu Thr Phe Cys Arg Ala Ala Thr Val Leu Arg Gln Phe Tyr 65 70 75 80

Ser His His Glu Lys Asp Thr Arg Cys Leu Gly Ala Thr Ala Gln Gln 85 90 95

Phe His Arg His Lys Gln Leu He Arg Phe Leu Lys Arg Leu Asp Arg 100 105 110

Asn Leu Trp Gly Leu Ala Gly Leu Asn Ser Cys Pro Val Lys Glu Ala 115 120 125

Asn Gln Ser Thr Leu Glu Asn Phe Leu Glu Arg Leu Lys Thr He Met 130 135 140

Arg Glu Lys Tyr Ser Lys Cys Ser Ser 145 150

Junta variante de IL-4 humana <210> 44

<211> 137

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<4 00> 44

Met Gly Leu Thr Ser Gln Leu Leu Pro Pro Leu Phe Phe Leu Leu Ala

1 5 10 15

Cys Ala Gly Asn Phe Val His Gly His Lys Cys Asp He Thr Leu Gln 20 25 30

Glu He He Lys Thr Leu Asn Ser Leu Thr Glu Gln Lys Asn Thr Thr 35 40 45 Glu Lys Glu Thr Phe Cys Arg Ala Ala Thr Val Leu Arg Gln Phe Tyr I 50 55 60

Ser His His Glu Lys Asp Thr Arg Cys Leu Gly Ala Thr Ala Gln Gln 65 70 75 80

Phe His Arg His Lys Gln Leu He Arg Phe Leu Lys Arg Leu Asp Arg

85 90 95

Asn Leu Trp Gly Leu Ala Gly Leu Asn Ser Cys Pro Val Lys Glu Ala 100 105 110

Asn Gln Ser Thr Leu Glu Asn Phe Leu Glu Arg Leu Lys Thr Ile Met

115 120 125

Arg Glu Lys Tyr Ser Lys Cys Ser Ser 130 135

Claims

1. Método para tratar ao menos uma patologia relacionada à fi- brose relacionada a IL-4 ou IL-13, compreendendo contatar ou administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz de ao menos um antagonista de proteína derivada de Ig relacionada a IL-4 ou IL-13 às células, tecido ou a- nimal, em que a dita proteína derivada de Ig relacionada a IL-4 ou IL-13 inibe ao menos uma atividade biológica da dita IL-4 ou IL-13, in vivo, in vitro ou in situ.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, em que a dita pato- Iogia relacionada a IL-4 ou IL-13 é selecionada a partir de ao menos uma doença pulmonar intersticial, escleroderma, fibrose do fígado, fibrose renal, sarcoidose, cicatriz hipertrófica, cicatriz quelóide, fibrose cardíaca, degene- ração macular relacionada à idade, ou doença vascular do colágeno.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1, em que a dita prote- ína derivada de Ig se liga a ao menos um epítopo de uma proteína ou Iigante relacionado a IL-4 ou IL-13 humana biologicamente ativa.

4. Método, de acordo com a reivindicação 2, em que o dito epí- topo compreende ao menos 1 a 3, para a seqüência inteira de aminoácido, selecionada a partir do grupo que consiste em 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11,12 , 13 ou 14 aminoácidos de ao menos um de 1-10, 10-20, 20-30, 30-40, 40 -50, 50-60, 60-70, 70-80, 80-90, 90-100, 100-110, 110-120, 120-130, 130-140, ou 140-145 de SEQ ID NO: 42, 43 ou 44.

5. Método, de acordo com a reivindicação 1, em que a dita prote- ína derivada de Ig relacionada a IL-4 ou IL-13 se liga a IL-4 ou IL-13 ou a um receptor de IL-4 ou IL-13 com uma afinidade de ao menos um selecionado a partir de ao menos 10'9 M, ao menos 10'10 M, ao menos 10'11 M, ou ao me- nos 10'12 M, ou ao menos 10'13 M, ou ao menos 10'14 M.

6. Método, de acordo com a reivindicação 1, em que a dita prote- ína derivada de Ig relacionada a IL-4 ou IL-13 é selecionada a partir de um anticorpo, e proteína de fusão de anticorpo ou uma proteína de fusão de re- ceptor.

7. Método, de acordo com a reivindicacão 1, em aue a dita quan- tidade eficaz é 0,001 a 50 mg/quilograma da dita célula, tecido, órgão ou animal.

8. Método, de acordo com a reivindicação 1, em que o dito con- tato ou a dita administração é por ao menos um modo selecionado a partir de parenteral, subcutâneo, intramuscular, intravenoso, intra-articular, intra- bronquial, intra-abdominal, intracapsular, intracartilaginoso, intracavitário, intracelial, intracerebelar, intracerebroventricular, intracólico, intracervical, intragrástrico, intrahepático, intramiocardial, intraosteal, intrapélvico, intrape- ricárdico, intraperitoneal, intrapleural, intraprostático, intrapulmonar, intrarre- tal, intrarrenal, intrarretinal, intraespinhal, intrassinovial, intratorárico, intrau- terino, intravesical, bolus, vaginal, retal, bucal, sublingual, intranasal, ou transdérmico.