BRPI0721081A2 - Móleculas de ácidos nucléicos que codificam proteínas de plantas na família c3hc4 e processos para a alteração do conteúdo de celulose e lignina da planta - Google Patents

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MOLÉCULAS DE ÁCIDOS NUCLEICOS QUE CODIFICAM PROTEÍNAS DE PLANTAS NA FAMÍLIA C3HC4 E PROCESSOS PARA A ALTERAÇÃO DO CONTEÚ- DO DE CELULOSE E LIGNINA DA PLANTA".

REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDO RELACIONADO

Esse pedido reivindica a prioridade do Pedido de Patente Provi- sório US 60/871.061, depositado em 20 de dezembro de 2006, cujo teor é aqui incorporado a título de referência na íntegra.

CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se ao campo da biotecnologia vege-

tal. Mais especificamente, essa invenção se refere à alteração do teor de celulose pela regulação da expressão de genes que codificam proteínas C3HC4.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO Durante a formação de madeira em plantas superiores, a maior

parte da glicose produzida durante o metabolismo de carboidratos é canali- zada para a celulose para deposição secundária na parede. Djerbi et ai, Cellulose 11: 301-12 (2004). A celulose é um polímero fibroso que consiste em cadeias lineares de moléculas glicana ligadas em β-(1,4) que cristalizam 20 para formar microfibrilas. As microfibrilas conferem característica de resis- tência flexível à celulose. A celulose é sintetizada em plantas superiores por grandes complexos multiméricos ligados a membranas de plasma que for- mam estruturas rosáceas nas extremidades das microfibrilas. Somerville, Ann. Rev. Dev. BioL 22:53-78 (2006).

A celulose é valiosa como polpa, como fibra e como um ponto de

partida para a síntese de polímeros comercialmente importantes. Espera-se que alterações para aumentar a deposição de celulose tenham um efeito repressivo na deposição de lignina. Hu et al., Nature Biotech. 17:808-19 (1999). Uma redução do teor de lignina em vegetais lenhosos é desejável, 30 visto que a produção industrial de celulose e a remoção química da lignina são caras e representam um enorme desafio ambiental.

A via de biossíntese da celulose não é bem compreendida em nível molecular. Genes da família da sintase de celulose (CESA), e aqueles que codificam proteínas para a síntese e processamento de N-glicana têm sido isolados em um grande número de organismos. Nicol et al., EMBO J. 17:5562-76(1998).

Um sistema experimental amplamente utilizado para estudar a

formação da madeira, especialmente a síntese e a deposição da celulose, consiste em se curvar uma árvore lenhosa para que a madeira de tensão (TW) seja formada no lado da tensão do embrião. Andersson-Gunners et al., Plant J. 45:144-65 (2006). Nas espécies de eucalipto e Populus, a madeira 10 de tensão geralmente ocorre no lado superior do embrião curvado e permite que a árvore reoriente seu eixo. A madeira de tensão é caracterizada princi- palmente pelas fibras do xilema com uma camada secundária gelatinosa extra-grossa (camada G) em seu lúmen. Essa camada G contém quase que exclusivamente microfibras de celulose com alta cristalinidade. Déjardin et 15 al., Plant BioL 6: 55-64 (2004). Como a madeira de tensão é rica em celulo- se, mas é deficiente em lignina e hemicelulose, ela pode ser usada para de- tectar e analisar genes envolvidos no controle do fluxo de carbono na lignina, celulose e hemicelulose.

Anderson-Gunners et al. (2006) identificaram genes altamente 20 expressos em TW que estão envolvidos na formação da parede celular, tais como os genes envolvidos no metabolismo de carboidratos e formação do citoesqueleto, bem como genes não destrutivos e dois genes com função desconhecida em Populus tremula (L.) x P. tremuloides (Michx). Uma proteí- na dedo de zinco (RING finger) tipo C3HC4 mostrou expressão diferencial 25 de TW, mas não há dados, neste ou em outros estudos, que impliquem seu papel na biossíntese de celulose.

Domínios de dedo de zinco são fragmentos de proteínas relati- vamente pequenos que se ligam a um ou mais átomos de zinco. Eles foram primeiramente identificados como um fragmento Iigante de DNA na transcri- 30 ção do fator TFIIIA de Xenopus laevis, entretanto, sabe-se agora que eles se ligam a DNA, RNA e substratos de lipídios e/ou proteínas. A Ring finger é um tipo especializado de dedo de zinco de 40 a 60 resíduos que se liga a dois átomos de zinco e está provavelmente envolvida na mediação das intera- ções proteína-proteína. Existem duas variantes diferentes, o tipo C3HC4 e o tipo C3H2C3. O motivo da RING finger tipo C3HC4 é encontrado em várias proteínas celulares e virais, algumas das quais mostraram que contêm ativi- 5 dade de ubiquitina E3 Iigase tanto in vivo quanto in vitro. Laity et al., Curr. Opin. Struct. Biol. 11:39-46 (2001).

Considerando-se as dificuldades associadas ao cultivo de árvo- res florestais tradicionais, tais como o progresso lento devido aos seus lon- gos períodos de geração e a dificuldade de produção de uma planta com 10 uma característica desejável, desenvolvimentos em tecnologia gênica po- dem reduzir significativamente o tempo requerido para a produção de uma nova variedade de planta e permitir um alvejamento das características con- sideradas desejáveis pela indústria florestal e de polpa em espécies de árvo- res específicas.

. 15 SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Em um aspecto, a invenção proporciona uma seqüência de áci- do nucleicos, isolada, que compreende uma seqüência selecionada do grupo que consiste em: (a) uma seqüência de ácido nucleicos revelada em SEQ ID NO:1, ou uma fita complementar desta; (b) uma seqüência de ácido nuclei- 20 cos que codifica a seqüência de aminoácidos revelada em SEQ ID NO:2, (c) uma seqüência de ácido nucleicos capaz de se hibridizar sob condições es- tringentes com uma seqüência de ácidos nucleicos de (a) ou (b), em que tal seqüência hibridizante codifica um polipeptídeo C3HC4; (d) um ácido nuclei- co que é uma variante alélica ou uma variante splice alternativa da sequên- 25 cia de ácido nucleico de (a) ou (b); e (e) uma seqüência de ácido nucleico que tem pelo menos 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% ou mais de i- dentidade de seqüência com (a) ou (b).

Em outro aspecto, a invenção proporciona uma proteína C3HC4 isolada selecionada do grupo que consiste em: (a) um polipeptídeo revelado 30 em SEQ ID NO:2; (b) um polipeptídeo com uma seqüência de aminoácidos que possui pelo menos 85% ou mais de identidade de seqüência com a se- qüência de aminoácidos revelada em SEQ ID NO:2; e (c) uma variante de um polipetídeo como definido em (a) ou (b).

Em outro aspecto, a invenção proporciona um construto de ácido nucleico que compreende uma seqüência de polinucleotídeo C3HC4 isolada operavelmente ligada a um ou mais promotores adequados que acionam a 5 expressão da seqüência de polinucleotídeo C3HC4. Em uma modalidade, uma célula de planta compreende a construto de ácido nucleico. Em uma outra modalidade, uma planta transgênica é gerada a partir da célula de planta e a planta tem o teor de celulose e/ou lignina, alterado, em compara- ção a uma planta não transgênica da mesma espécie. Em ainda outras mo- 10 dalidades, a planta é uma dicotiledônea, monocotiledônea, gimnosperma ou árvore de madeira de lei. Outras modalidades incluem progênie da planta transgênica, incluindo plantas híbridas.

Em outro aspecto, a invenção proporciona um método para alte- rar o teor de celulose e/ou lignina em uma planta compreendendo (a) intro- 15 duzir em uma célula de planta isolada, um construto de ácido nucleico que compreende uma seqüência de polinucleotídeo C3HC4 isolada, operavel- mente ligada a um ou mais promotores adequados que acionam a expres- são da seqüência de polinucleotídeo C3HC4; e (b) cultivar a dita planta sob condições que promovam o crescimento de uma planta, em que tal planta 20 superexpressa a proteína C3HC4 e tem um teor de celulose e/ou lignina aumentado se comparada a uma planta não transgênica da mesma espécie. BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

A Figura 1 mostra o perfil de expressão em um conjunto de teci- dos de eucalipto de cDNA de C3HC4. Um gene ortólogo foi clonado a partir de mRNA isolado do xilema de Populus deltoides.

A Figura 2 retrata esquematicamente o vetor de plasmídeo de expressão de planta pALELLYX-C3HC4 da invenção, o qual compreende um promotor preferido de xilema/câmbio que aciona a expressão da seqüência de nucleotídeo C3HC4 da invenção.

A Figura 3 mostra o teor de celulose de várias linhas transgêni-

cas, transformadas com pALELLYX-C3HC4, e as respectivas plantas não transgênicas de controle. O asterisco denota valores médios de celulose maiores, estatisticamente significantes.

A Figura 4 mostra o teor de celulose de dois genótipos de uma planta transgênica T1 (linha 6B) transformada com pALELLYX-C3HC4. O asterisco denota valores médios de celulose maiores, estatisticamente signi- ficantes (P<0,05, t-teste).

A Figura 5 mostra o teor de lignina de dois genótipos de uma planta transgênica T1 (linha 24B) transformada com o vetor plasmidial de expressão de plantas pALELLYX-C3HC4 da invenção. O asterisco denota valores médios de lignina maiores estatisticamente significantes (P<0,05, t- teste).

A Figura 6 mostra o teor de celulose de três genótipos de uma planta transgênica T1 (linha 24B) transformada com o vetor plasmidial de expressão de plantas pALELLYX-C3HC4 da invenção. O asterisco denota valores médios de lignina maiores estatisticamente significantes (P<0,05, t- teste).

A Figura 7 mostra o teor de celulose de três genótipos de uma planta transgênica T1 (linha 25B) transformada com o vetor plasmidial de expressão de plantas pALELLYX-C3HC4 da invenção. O asterisco denota valores médios de lignina maiores estatisticamente significantes (P<0,05, t- teste).

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

A presente invenção se refere a plantas geneticamente manipu- ladas que são caracterizadas por um aumento da expressão da proteína C3HC4. Nesse aspecto, a invenção é focada em plantas geneticamente ma- 25 nipuladas que superexpressam uma molécula de ácido nucleico que com- preende o gene C3HC4, assim modulando o teor de celulose da dita planta geneticamente manipulada. Aumentar a taxa de transcrição de um gene po- de resultar numa melhora do produto de proteína, assim intensificando a ta- xa do processo metabólico no qual esse gene está envolvido.

Nesse aspecto, os presentes inventores determinaram que plan-

tas geneticamente manipuladas que superexpressam um gene C3HC4 mos- tram um teor de celulose aumentado. Assim, os inventores determinaram que a proteína C3HC4 controla, direta ou indiretamente, gene(s) e/ou proteí- na(s) relacionados com a síntese de celulose.

Desta maneira, aplicações da invenção incluem, sem limitação, o aperfeiçoamento da produção de fibra de celulose, durante a fabricação de 5 papel, através do teor aumentado de celulose em árvores lenhosas, eoa- perfeiçoamento, da extração de fibras de celulose para a produção de têxteis através do aumento do teor de celulose em fibras de algodão. Adicionalmen- te, a deposição intensificada de celulose provavelmente tem efeito repressi- vo na deposição de lignina. A produção industrial de celulose a partir de ár- 10 vores lenhosas requer a remoção química da lignina durante o processo de polpação, que faz uso de grandes quantidades de produtos químicos con- centrados. Para a produção de papel de alta qualidade, a lignina residual necessita ser adicionalmente removida por uma etapa de alvejamento adi- cional que envolve o uso de substâncias extremamente danosas. O proces- 15 so geral é dispendioso e representa um desafio ambiental enorme. Por essa razão, espera-se que a redução do teor de lignina em plantas lenhosas, tipi- camente árvores, diminua as demandas energéticas e químicas desses pro- cessos de extração altamente custosos, e também deve diminuir a quantida- de de material efluente, um grande poluidor ambiental potencial que é de 20 processamento caro e difícil. Campbel et al., Plant PhysioL 110:3-13 (1996). Assim, engenharia genética da biossíntese de celulose pode fornecer uma estratégia para o aumento da quantidade e qualidade da celulose, ao mes- mo tempo em que reduz o teor de lignina nas plantas transgênicas.

A terminologia técnica nesta descrição está em conformidade 25 com o uso comum em bioquímica, biologia molecular e agricultura. Este uso e estes termos técnicos são explicados em: Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Terceira edição), vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001); CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Greene Publi- shing Associates and Wiley-Interscience (1988), com atualizações periódi- 30 cas; SHORT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY: A COMPENDIUM OF METHODS FROM CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (5a edição), vol. 1-2, John Wiley & Sons, Inc. (2002); GENOME ANALYSIS: A LABORATORY MANUAL, VOL 1-2, Cold spring Harbor Laboratory Press (1997). Técnicas de biologia de plantas adequadas, conforme descritas aqui, são adicionalmente explicadas em tratados de metodologia como ME- THODS IN PLANT MOLECULAR BIOLOGY: A LABORATORY COURSE 5 MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1995). Vários métodos que empregam PCR são descritos, por exemplo, em Innis et al., PCR PROTO- COLS: A GUIDE TO METHODS AND APPLICATIONS, Academy Press (1990), e por Dieffenbach e Dveksler, PCR PRIMER: A LABORATORY MA- NUAL (2a edição), Cold Spring Harbor Laboratory Press (2003). Pares de 10 iniciadores para PCR podem ser derivados de seqüências conhecidas por técnicas conhecidas tal como utilizar programas de computadores feitos para esse propósito, como Primer1 Versão 0,5, 1991 (Whitehead Institute for Bio- medical Research, Cambridge, MA). Metodologia ilustrativa para a síntese química de ácidos nucleicos é discutida, por exemplo, em Beaucage e Caru- 15 thers, Tetra. Letts. 22:1859-62 (1981), e Matteucci e Caruthers1 J. Am. Chem. Soc. 103:3185 (1981).

Digestões, fosforilações, ligações e transformações de enzimas de restrição foram feitas conforme descritas por Sambrook et al., MOLECU- LAR CLONING: A LABORATORY MANUAL (2a edição), Cold Spring Harbor 20 Laboratory Press (1989). Todos os materiais e reagentes usados para o crescimento e manutenção de células bacterianas foram obtidos de Aldrich Chemicals (Milwaukee, Wisconsin), DIFCO Laboratories (Detroit, Michigan), Invitrogen (Gaithesburg, Maryland) ou Sigma Chemical Company (St. Louis, Missouri), a não ser que seja indicado o contrário.

Os termos "que codificam" e "codificação" se referem a um pro-

cesso pelo qual um gene, através dos mecanismos de transcrição e tradu- ção, fornece informações a uma célula a partir das quais uma série de ami- noácidos pode ser montada em uma seqüência de aminoácidos específica para produzir uma enzima ativa. Devido à degeneratividade do código gené- 30 tico, certas mudanças de base na seqüência de DNA não mudam a seqüên- cia de aminoácidos de uma proteína. Entende-se, assim, que modificações na seqüência de DNA que codifica a proteína C3HC4 que não afetem subs- tancialmente as propriedades funcionais da proteína estão contempladas.

Nesta descrição, "expressão" denota a produção do produto de proteína ou polipeptídeo codificado por um gene. Alternativa ou adicional- mente, "expressão" denota a combinação de processos intracelulares, inclu- 5 indo transcrição e tradução, pelos quais passa uma molécula de DNA de codificação como um gene estrutural para produzir um polipeptídeo. "Super- expressão" se refere à expressão de uma seqüência de genes particular em que a produção de mRNA ou polipeptídeo em um organismo transgênico excede os níveis de produção em um organismo não transgênico.

O termo "ácido nucleico heterólogo" se refere a um ácido nuclei-

co, DNA ou RNA1 que foi introduzido em uma célula (ou no ancenstral da célula) através de esforços de seres humanos. Tais ácidos nucleicos exóge- nos podem ser uma cópia de uma seqüência que é naturalmente encontrada na célula na qual foi introduzida, ou fragmentos desta.

Por outro lado, o termo "ácido nucleico endógeno" se refere a

um ácido nucleico, gene, polinucleotídeo, molécula de DNA, RNA, mRNA ou cDNA presente em uma planta ou organismo que será geneticamente alte- rado. Uma seqüência endógena é "nativa" a, em outras palavras, indígena à planta ou organismo que será geneticamente alterado.

O termo "seqüências homólogas" se refere a seqüências de po-

linucleotídeos ou de polipeptídeo que são similares devido a ancestrais co- muns e conservação de seqüência.

Para os fins desta invenção, "parálogos" são homólogos produ- zidos por duplicação de genes. Eles representam genes derivados de um 25 gene ancestral comum que é duplicado dentro de um organismo e, subse- quentemente, divergido. "Ortólogos" são homólogos produzidos por especia- ção. Eles representam genes derivados de um ancestral comum que divergi- ram devido à divergência dos organismos com os quais eles estão associa- dos. Vide Brinkman e Leipe, em: BIOINFORMATICS, A PRACTICAL GUIDE 30 TO THE ANALYSIS OF GENES AND PROTEINS 323-58, Wiley-Interscience (2001).

O termo "homólogo functional" se refere a seqüências de polinu- cleotídeos ou polipeptídeos que são similares devido à genealogia comum e conservação de seqüência e têm função idêntica ou similar nos níveis catalí- ticos, celulares ou organismais.

SEQÜÊNCIAS DE C3HC4 Muitos dos processos biológicos necessários para o metabolis-

mo e desenvolvimento em um organismo são governados por famílias de genes. Esse é o caso da proteína C3HC4 que pertence a uma família de genes que compreende muitos genes. As proteínas do domínio C3HC4 per- tencem à família de proteínas chamada "dedo de zinco", caracterizada pelo 10 domínio "RING finger", que compreende oito Iigantes de metal formados pelo motivo de consenso, C3HC4. Domínios de RING finger normalmente se li- gam a dois íons de zinco em um arranjo firmado cruzado único e podem, basicamente, ser considerados um domínio de interação de proteínas. Jack- son et al., Trends Cell Biol. 10:429-39 (2000).

Proteínas de RING finger foram implicadas em diversos proces-

sos biológicos, desde a regulação transcricional e traducional até proteólise almejada e de desenvolvimento. Assim, outros membros da família C3HC4 também intensificariam o teor de celulose. Um gene C3HC4 ilustrativo reve- lado em SEQ ID NO:1 foi isolado de choupo.

Espera-se que qualquer gene de qualquer organismo que codifi-

ca um gene de RING finger, que codifica uma proteína com uma estrutura e propriedades biológicas similares ao produto da tradução de um gene C3HC4 terá o mesmo efeito no teor de celulose, conforme os inventores demonstraram para plantas transgênicas descritas nos exemplos acima. Es- 25 ses genes podem ser identificados e funcionalmente anotados por compara- ção de seqüência. Um biólogo molecular com conhecimento pode pronta- mente identificar uma seqüência relacionada à seqüência de C3HC4 com a ajuda da metodologia convencional, como o monitoramento de cDNA ou bi- bliotecas de genoma com sondas de hibridização adequadas ou por buscas 30 em bancos de dados públicos, como o NCBI's Genbank. Seqüências homó- logas também podem ser isoladas com a ajuda de oligonucleotídeos dege- nerados, utilizando-se técnicas baseadas em PCR conhecidas. Também é possível usar programas computacionais que poten- cializam várias técnicas conhecidas de identificação de genes por compara- ção de seqüência. Exemplos dessas técnicas são descritos, por exemplo, por Innis et al., PCR PROTOCOLS: A GUIDE TO METHODS AND APPLI- 5 CATIONS, Academic Press (1990), e em GENOME ANALYSIS: A LABORA- TORY MANUAL, volumes 1 e 2, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1997).

Em suas investigações acerca desta invenção, os presentes in- ventores induziram TW em plantas de um híbrido interespecífico, E. grandis 10 x E. urophylla. Diversos genes diferencialmente expressos entre TW e ma- deira normal foram assim identificados. Dentre os genes que têm suas ex- pressões alteradas em madeira de tensão, determinou-se que muitos codifi- cam um membro da família de dedo de zinco tipo C3HC4, que é altamente expresso em madeira tensão de eucalipto.

Como um membro da família de proteína C3HC4 é altamente

expresso em madeira de tensão, um tecido constituído principalmente de celulose altamente cristalina, e os membros C3HC4 parecem estar envolvi- dos no controle do meristema vascular e no crescimento secundário, pode- se esperar que a transformação genética de árvores lenhosas com constru- tos de ácido nucleico, que compreendem moléculas que codificam membros da família C3HC4, alterasse a padronização vascular e a síntese e deposi- ção de celulose. Assim, um aumento da síntese e na deposição de celulose ocorreria quando um gene C3HC4 fosse superexpresso. Inversamente, quando um gene C3HC4 é infrarregulado, os inventores antecipam uma di- minuição da síntese de celulose. Como a alteração na síntese e na deposi- ção de celulose produz, em geral, uma alteração na síntese e na deposição de lignina, vide Hu et al., Nature biotech. 17:808-19 (1999), os inventores entenderam igualmente que ao aumentar a síntese e a deposição de celulo- se, o teor de lignina da árvore lenhosa seria reduzido. O cenário oposto o- correria, se a síntese de celulose fosse reduzida.

No contexto da presente invenção, uma seqüência pode ser i- dentificada pela metodologia descrita acima, e assim pode ser funcionalmen- te anotada como pertencente à família de C3HC4. Nesta descrição, as fra- ses "seqüência de polinucleotídeo C3HC4" e "seqüência de ácido nucleico C3HC4" denotam qualquer ácido nucleico, gene, polinucleotídeo, molécula de DNA, RNA, mRNA, cDNA que codifique um polipeptídeo C3HC4 que, 5 quando superexpresso, resulta em um aumento do teor de celulose e/ou uma diminuição no teor de lignina de uma planta. As frases "seqüência de polinucleotídeo C3HC4" e "seqüência de ácido nucleico C3HC4" também englobam qualquer molécula de ácido nucleico com uma seqüência de nu- cleotídeos capaz de hibridizar, sob condições estringentes, com quaisquer 10 das seqüências aqui descritas e que codifica um polipeptídeo C3HC4 que, quando superexpresso, resulta em um aumento do teor de celulose e/ou uma diminuição do teor de lignina de uma planta. As frases também conotam seqüências que se hibridizam de forma cruzada com SEQ ID NO:1, e que preferivelmente possuem pelo menos 40%, ou mais preferivelmente pelo 15 menos 60%, ainda mais preferivelmente pelo menos 80% e, ainda mais pre- ferivelmente, pelo menos 90% de uma homologia ou de identidade com SEQ ID NO:1.

Uma seqüência de nucleotídeos da invenção também pode codi- ficar uma proteína que é homóloga ao produto de gene predito revelado em SEQ ID NO:2.

As frases "seqüência de polinucleotídeo C3HC4" e "seqüência de ácido nucleico C3HC4" também denotam aquelas seqüências represen- tadas pelos fragmentos ou variantes de SEQ ID NO:1 que compartilham pelo menos 50%, preferivelmente pelo menos 60%, mais preferivelmente pelo 25 menos 70%, ainda mais preferivelmente pelo menos 80% e, ainda mais pre- ferivelmente 90% de identidade com SEQ ID ΝΟ.Ί e codificam polipeptídeos C3HC4 que, quando sobre-expressos, resultam em um aumento no teor de celulose e/ou uma diminuição do teor de lignina de uma planta. Como prova do que é dito, as seqüências de nucleotídeos da invenção incluem aquelas 30 seqüências que codificam polipeptídeos que compreendem uma seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO:2 ou uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 50%, preferivelmente pelo menos 60%, mais preferivelmente pelo menos 70%, ainda mais preferivelmente pelo menos 80% e, ainda mais preferivelmente 90% idêntica à SEQ ID NO:2, cuja superexpressão resulta em um aumento do teor de celulose e/ou uma diminuição no teor de lignina de uma planta.

A frase "condições rigorosas" aqui conota parâmetros com os

quais a técnica está familiarizada. Polinucleotídeos de fita simples se hibridi- zam quando eles se associam baseados em diversas forças físico-químicas bem caracterizadas, como ligação de hidrogênio, exclusão de solvente e empilhamento de bases. A estringência de uma hibridização reflete o grau de 10 identidade de seqüência dos ácidos nucleicos envolvidos, de modo tal que quanto maior a estringência, mais similares serão as duas fitas de polinucle- otídeo. A estringência é influenciada por diversos fatores, incluindo tempera- tura, concentração e composição do sal, aditivos orgânicos e não orgânicos, solvente, etc. presentes na solução de lavagem e hibridização e incubações 15 (e número). Um técnico com conhecimento ordinário pode prontamente se- lecionar tais condições pela variação de temperatura durante a reação de hibridização e processo de lavagem, de concentração do sal durante a rea- ção de hibridização de processo de lavagem e assim por diante.

Para a hibridização de ácidos nucleicos complementares, que possuem mais de 100 resíduos complementares, em um filtro em um Sou- thern ou Northern blot, condições de hibridização "estringentes" são exempli- ficadas por uma temperatura que é de cerca de 5°C a 20°C mais baixa que o ponto de fusão térmico (Tm) da seqüência específica, em uma força iônica e pH definidos. ATm é a temperatura, sob força iônica e pH definidos, na qual 50% da substância-alvo hibridiza em uma perfeitamente emparelhada. Molé- culas de ácido nucleico que hibridizam sob condições estringentes hibridi- zam em uma sonda baseada ou no cDNA inteiro ou em partes selecionadas. Mais preferivelmente, "condições estringentes" aqui se referem a parâmetros familiares à técnica, como hibridização em 3,5x de SSC, 1x de solução de Denhardt, tampão de fosfato de sódio 25 mM (pH 7,0), 0,5% de SDS e EDTA 2mM por 18 horas a 65°C, seguido por 4 lavagens do filtro a 65°C por 20 minutos, em 2x de SSC, 0,1% de SDS, e uma lavagem final por até 20 minu- tos em 0,5x de SSC, 0,1% de SDS ou 0,3% de SSC e 0,1% de SDS para maior estringência, e 0,1x de SSC e 0,1% de SDS, para estringência ainda maior. Outras condições podem ser substituídas, desde que o grau de es- tringência seja substancialmente igual ao aqui fornecido, usando uma Iava- gem final de 0,5x de SSC.

Conforme indicado, "seqüência de ácido nucleico C3HC4" nesta descrição se refere a qualquer molécula de ácido nucleico com uma seqüên- cia de nucleotídeos capaz de se hibridizar sob condições estringentes com a seqüência aqui revelada, e de codificar um polipeptídeo equivalente à prote- 10 ína que possui a seqüência de aminoácidos aqui revelada em SEQ ID NO:2. A frase também inclui seqüências que se hibridizam de forma cruzada com SEQ ID NO:1, e que são preferivelmente pelo menos 55%, mais preferivel- mente 65%, mais preferivelmente 75%, mais preferivelmente 85% e ainda mais preferivelmente 90% idênticas para homologia ou identidade com SEQ 15 ID NO:1. A seqüência de nucleotídeos da invenção pode codificar uma prote- ína que é homóloga ao produto de gene predito em SEQ ID NO:2.

Modalidades adicionais incluem qualquer molécula de ácido nu- cleico que compreenda quaisquer das seqüências de bases acima com uma ou mais bases deletadas, substituídas, inseridas ou adicionadas, e que codi- 20 fica um polipeptídeo que é homólogo à proteína codificada por SEQ ID NO:2. Tais moléculas de ácido nucleico incluem variantes alélicos e variantes splice de SEQ ID NO:1.

Assim, o termo "variante" é uma seqüência de aminoácidos ou nucleotídeos que se desvia da seqüência de aminoácidos ou nucleotídeos 25 padrão, ou de um dado gene ou proteína em particular. A variante pode ter mudanças "conservativas", em que um aminoácido substituído possui pro- priedades químicas ou estruturais similares, por exemplo, substituição de Ieucina por isoleucina. Uma variante pode ter mudanças "não conservati- vas", por exemplo, substituição de Ieucina por um triptofano. Variações me- 30 nores análogas podem também incluir inserções ou deleções de aminoáci- dos, ou ambos. Orientação na determinação de que quais aminoácidos po- dem ser substituídos, inseridos ou deletados, pode ser encontrada utilizan- do-se programas computacionais bem conhecidos na técnica como o softwa- re Vector NTI Suite (InforMax, Maryland). "Variante" também pode se referir a um "gene embaralhado", como descrito, por exemplo, nas patentes US 6.506.603, US 6.132.970, US 6.165.793, e US 6.117.679.

As "seqüências de bases acima com uma ou mais bases deleta-

das, substituídas, inseridas ou adicionadas" referidas aqui, são amplamente conhecidas por aqueles com conhecimento ordinário no assunto como re- tendo atividade fisiológica mesmo quando a seqüência de aminoácidos de uma proteína que possui geralmente aquela atividade fisiológica tem um ou 10 mais aminoácidos substituídos, deletados, inseridos ou adicionados. Se- qüências de nucleotídeos que possuem tais modificações e que codificam a proteína C3HC4 estão incluídas no escopo desta invenção. Por exemplo, as regiões de cauda poli A ou de regiões não traduzidas na terminação 5' ou 3' podem ser deletadas, e as bases podem ser deletadas na medida em que os 15 aminoácidos são deletados. As bases também podem ser substituídas, des- de que não resulte em deslocamentos de quadros. Bases também podem ser "adicionadas" na medida em que aminoácidos são adicionados. Entre- tanto, é essencial que tais modificações não resultem na perda da função da proteína C3HC4. Tais ácidos nucleicos modificados podem ser obtidos, por 20 exemplo, pela modificação de seqüências de bases da invenção para que aminoácidos em locais específicos sejam substituídos, deletados, inseridos ou adicionados por mutagênese em local específico. Vide Zoller e Smith, NucIeicAcid Res. 10:6487-500 (1982).

Entende-se que seqüências de aminoácidos e de ácidos nuclei- cos podem incluir resíduos adicionais, tais como aminoácidos N ou C- terminal ou seqüências 5' ou 3'. Tais adições são adequadas desde que as seqüências resultantes codifiquem um polipetídeo que mantém as mesmas atividades biológicas de proteína ou equivalentes.

A presente invenção fornece uma seqüência de nucleotídeos que codifica a proteína C3HC4. Esta seqüência pode ser derivada de cDNA, tal como cDNA de Populus deltoides ou de DNA genômico. Um clone de cDNA típico é revelado em SEQ ID NO:1, acima, que codifica uma proteína C3HC4. De acordo com um aspecto da invenção, modifica-se o teor de celu- lose em tecidos de planta, tais como células fibrosas do xilema lenhoso ou sementes de algodão pelo controle da expressão da proteína C3HC4. Assim, células de plantas ou plantas inteiras são geneticamente modificadas, por exemplo, com a seqüência que codifica a proteína C3HC4 de, por exemplo, Populus deltoides que é expressa preferivelmente em células de fibra e cau- sam um aumento na síntese e deposição da celulose.

Adicionalmente, a invenção fornece uma molécula de ácido nu- cleico que compreende uma seqüência de nucleotídeo selecionada de (a) SEQ ID NO:1, ou uma parte desta, ou um complemento desta; (b) uma se- qüência de nucleotídeos que hibridiza na dita seqüência de nucleotídeo de (a) sob uma estringência de lavagem equivalente a 0,1 X de SSC a 1,0X de SSC, 0,1% de SDS, a 50-65°C, (c) uma seqüência de nucleotídeos que codi- fica uma proteína que possui a mesma seqüência de aminoácidos como a que é codificada pela seqüência de nucleotídeos de (a), mas é degenerada de acordo com a degenerescência do código genético; e (d) uma seqüência de nucleotídeos que codifica a mesma seqüência de aminoácidos que aque- la seqüência de nucleotídeos de (b), mas é degenerada de acordo com a degenerescência do código genético. Outra característica da invenção são proteínas e polipeptídeos

codificados pela molécula de ácido nucleico da invenção, exemplificados por, sem limitação, o polipeptídeo que tem as seqüências de aminoácidos com- preendidas em SEQ ID NO:2. Preferivelmente, os polipeptídeos da invenção possuem seqüências de aminoácidos que contêm regiões que são pelo me- nos 60% idênticas às seqüências referidas acima. Identidade superior a 70% é preferível, enquanto identidades superiores a 80%, 90% ou mesmo 95% são ainda mais preferidas.

A molécula de ácido nucleico da invenção pode ser utilizada "pu- ra" ou, preferivelmente, em construtos de vetores de expressão, para intro- dução em células, como células de plantas. Técnicas padrão de biologia mo- lecular, bem conhecidas por um técnico no assunto, podem ser utilizadas. Construtos de Ácidos Nucleicos Construtos de ácidos nucleicos recombinantes podem ser feitos utilizando técnicas padrão. Por exemplo, uma seqüência de nucleotídeos para transcrição pode ser obtida pelo tratamento de um vetor contendo tal seqüência com enzimas de restrição para cortar o segmento apropriado. A seqüência de nucleotídeos para transcrição pode também ser gerada por oligonucleotídeos de anelamento ou ligação de oligonucleotídeos sintéticos ou pelo uso de oligonucleotídeos sintéticos em uma reação em cadeia de polimerase (PCR) para que obtenção de locais de restrição apropriados em cada extremidade. A seqüência de nucleotídeos é então clonada em um ve- tor contendo os elementos reguladores adequados, como seqüências de promotores a montante e de terminadores a jusante. Tipicamente, os vetores de transformação de plantas incluem uma ou mais seqüências de codifica- ção de plantas clonadas (genômica ou cDNA) sob o controle transcricional de seqüências reguladoras 5' e 3', e um marcador selecionável. Tais vetores de transformação de plantas tipicamente contêm também um promotor, um sítio de partida de iniciação da transcrição, um sinal de processamento de RNA (tais como seqüências de sinal splicing), um sítio de terminação de transcrição e/ou um sinal de poliadenilação. Intensificadores e seqüências de alvejamento também podem estar presentes. Promotores de plantas constitutivos adequados, que podem ser

úteis para a expressão de seqüências de proteína C3HC4 incluem, sem limi- tação, o promotor do vírus mosaico da couve-flor (CaMV) 35S, os promoto- res de poliubiquitina de milho e de Populus, que conferem expressão consti- tutiva e de alto nível na maioria dos tecidos de planta (ver, por exemplo, WO 2007/00611, patente US 5.510.474; Odell et al„ Nature, 1985, 313:810-812); o promotor de nopalina sintase (An et al., 1988, Plant Physioi 88: 547-552); o promotor de FMV do vírus do mosaico da escrofulária (Patente US 5.378.619); e promotor de octopina sintase (Fromm et al., 1989, Plant Cell 1:977-984).

O vetor pode conter também seqüências de terminação, que são

posicionadas a jusante das moléculas de ácido nucleico da invenção, de tal modo que a transcrição de mRNA é terminada e seqüências de poli A são adicionadas. Terminadores típicos são o terminador do vírus mosaico da couve-flor (CaMV) 35S e o terminador do gene de nopalina sintase (NOS).

Vetores de expressão podem conter também um marcador de seleção com o qual células transformadas podem ser identificadas em uma cultura. O marcador pode estar associado a uma molécula de ácido nucleico heterólogo, ou seja, com o gene ligado operavelmente a um promotor. Como utilizado aqui, "marcador" se refere a um gene que codifica uma característi- ca ou fenótipo que permite a seleção ou o monitoramento de uma planta ou de uma célula contendo o marcador. Em plantas, por exemplo, o gene mar- cador codificará resistência a antibiótico e a herbicida. Isso permite a sele- ção de células transformadas dentre células que não foram transformadas ou transfectadas.

Exemplos de marcadores selecionáveis adequados incluem a - denosina desaminase, diidrofolato redutase, higromicina-B-fosfotransferase, timidina cinase, xantina-guanina fosfotransferase (resistência à canamicina, neomicina e a G148). Esses marcadores podem incluir resistência a G148, higromicina, bleomicina, canamicina e gentamicina. O construto também contém o gene marcador selecionável Bar, que confere resistência aos aná- logos de fosfinotricina herbicida como o glifosinato de amônio. Thompson et al., EMBO J. 6: 2519-23 (1987). Outros marcadores de seleção adequados são bem conhecidos.

Marcadores visíveis, tal como a proteína fluorescente verde (GFP), podem ser utilizados. Métodos para identificar ou selecionar plantas transformadas baseados no controle de divisão celular também têm sido descritos. Vide John e Van Mellaert, WO 2000/052168, e Fabijansk et al., WO 2001/059086.

Seqüências de replicação, de origem bacteriana ou viral, tam- bém podem ser incluídas para permitir que o vetor seja clonado em um hos- pedeiro bacteriano ou de fagos. Preferivelmente, um hospedeiro de amplo espectro de origem procariótica de replicação é utilizado. Um marcador sele- cionável para bactérias pode ser incluído para permitir a seleção de células bacterianas que contêm a construto desejada. Marcadores selecionáveis procarióticos adequados também incluem resistência a antibióticos tal como a canamicina ou a tetraciclina.

Outras seqüências de ácido nucleico que codificam funções adi- cionais também podem estar presentes no vetor, conforme conhecido da técnica. Por exemplo, quando a agrobactéria é a hospedeira, seqüências de T-DNA podem ser incluídas para facilitar a transferência e incorporação sub- sequente aos cromossomos da planta.

De acordo com outro aspecto da invenção, construtos de ácido nucleico são fornecidos que compreendem uma seqüência de DNA de C3HC4, como descrito acima, sob o controle de uma região de iniciação transcricional operativa em plantas, de tal forma que o construto pode gerar RNA em células de plantas. Preferivelmente, a região de iniciação transcri- cional é parte de um promotor de órgão ou tecido específico de planta, con- forme quaisquer dos descritos no WO 2005/096805. Mais preferivelmente, o promotor específico de tecido, quando ligado operavelmente à seqüência de DNA de C3HC4, garante a transcrição em tipos de células, tecidos ou órgãos específicos de modo que a síntese de celulose pode ser especificamente almejada sem se afetar outras funções da planta.

As plantas transgênicas da invenção podem ser caracterizadas pelo aumento do teor de celulose e/ou pela diminuição do teor de lignina. O teor de celulose aumentado na planta geneticamente modificada é preferi- velmente conseguido por um aumento na expressão de C3HC4 em tecidos da planta em que a deposição de celulose ocorre. Assim, em uma modalida- de preferida, as plantas transgênicas da invenção contêm um construto de ácido nucleico que compreende um promotor preferido de câmbio/xilema como aqueles descritos na patente citada acima, operavelmente ligada a um gene que codifica uma proteína C3HC4, levando a um aumento da expres- são no sistema vascular da planta do gene C3HC4, que por sua vez resulta em um aumento da síntese e da deposição de celulose nesses tecidos sem afetar outras funções da planta.

Conforme foi mencionado, o teor de celulose e outras caracterís- ticas relacionadas de partes da planta podem ser modificados geneticamen- te com um construto de ácido nucleico em conformidade com a invenção. A invenção também fornece células de planta que contêm ou que foram gene- ticamente alteradas com tais construtos, plantas derivadas destas que têm expressão do gene C3HC4 modificada, e sementes de tais plantas.

Construtos de ácidos nucleicos de acordo com a invenção po-

dem compreender uma seqüência de bases de comprimento mínimo para gerar mRNA e, consequentemente, um polipeptídeo que retém a função de C3HC4. Por conveniência, geralmente se achará adequado o uso de se- qüências entre 100 e 1.000 bases de comprimento, mas não há limite supe- rior teórico do comprimento de seqüência de bases. A preparação de tais construtos é descrita a seguir em mais detalhes.

As moléculas de ácido nucleico isoladas da invenção podem ser incorporadas em construtos de ácido nucleico, de forma que elas estejam ligadas operavelmente a um promotor. Preferivelmente, o promotor é um que se saiba que opera em células de planta e, mais preferivelmente, operável em células de órgãos ou em tecidos de planta específicos, tais como raízes, brotos, folhas, xilema, etc. As moléculas de ácido nucleico da invenção po- dem ser colocadas em ligação operável com promotores constitutivos ou induzíveis. Alternativamente, as moléculas de ácido nucleico da invenção podem ser postas em ligação operável com promotores, os quais direcionam a expressão do gene a jusante preferivelmente, ou especificamente a um órgão ou tecido da planta, tais como o xilema e o câmbio.

Adicionalmente, promotores específicos do sistema vascular, específicos do xilema ou preferidos do xilema podem ser úteis para promo- ver a expressão de moléculas de ácido nucleico da invenção especificamen- te em tecidos vasculares, especialmente em tecido do xilema. Em geral, o uso de um promotor constitutivo afeta os níveis e funções protéicas em to- das as partes da planta, enquanto o uso de um promotor preferido de um tecido permite que se foque na expressão do gene modificado em partes específicas da planta, o que leva a fenótipos mais controláveis. Assim, na aplicação da invenção, pode se achar conveniente o uso de um promotor que dará a expressão durante o desenvolvimento do xilema, por meio do que as proteínas da invenção somente seriam superproduzidas no(s) ór- gão(s) ou tecido(s) ou tipo(s) celular(es) nos quais sua ação fosse requerida para usos aqui descritos. Promotores específicos de tecido vascular, especí- ficos de xilema, preferidos de tecido vascular e preferidos de xilema que po- deriam ser utilizados incluem, sem limitação, o promotor de gene de cumara- to-4-hidroxilase (C4H) preferido de xilema, promotor do gene de tubulina (TUB) preferido de xilema e o promotor de gene de proteína de transferência lipídica (LTP) preferido de xilema descritos no pedido internacional publicado mencionado acima '805'. O promotor selecionado em particular deve ser ca- paz de provocar expressão suficiente para que resulte em superexpressão da proteína da invenção, para modificar o tamanho do xilema ou para modi- ficar a composição química do xilema de uma planta ou ainda uma combina- ção destes efeitos.

Embora a taxa de expressão dos genes seja modulada princi- palmente pelo promotor, um aperfeiçoamento na expressão também pode ser obtido pela identificação e uso de seqüências de intensificadores, como porções intrônicas de genes, que elevam os níveis de expressão de genes proximamente localizados em uma orientação de maneira independente. Em plantas, a inclusão de alguns íiítrons em uma construção de gene em uma posição entre o promotor e a seqüência que codifica o gene leva a um au- mento da acumulação de mRNA e proteína. Introns conhecidos por elevarem a expressão em plantas foram identificados em genes de milho, por exem- plo, hsp70, tubA1, Adh1, Sh1, UbH (Brown e Santino, Patentes US 5.424.412 e US 5.859.347; Jeon et al., 2000, Plant Physioi 123: 1005-1014; Callis et al., 1987, Genes Dev. 1:1183-1200; Vasil et al., 1989, Plant Physioi 91:1575-1579), e em genes de plantas dicotiledôneas como rbcS de petúnia (Dean et al., 1989, Plant Cell 1: 201-208); ST-LS1 da batata (Leon et al., 1991, Plant Physioi 95:968-972) e UBQ3 (Norris et al., 1993, Plant Moi Bioi 21:895-906) and PAT1 de Arabidopsis thaliana (Rose and Last, 1997, Plant

J. 11:455-464).

Adicionalmente, o vetor de expressão recombinante compreende um promotor funcional em uma célula de planta, uma molécula de ácido nu- cleico que é homóloga das seqüências de nucleotídeos descritas acima, e que codifica um polipeptídeo cuja seqüência de aminoácidos contém regiões que são pelo menos 60% idênticas à seqüência revelada em SEQ ID NO:2, conforme descrição acima. Mais preferivelmente, a molécula de ácido nucle- ico codifica um polipeptídeo cuja seqüência de aminoácidos contém regiões que são pelo menos 70%, 80% ou mesmo 90% idênticas à seqüência acima.

Construtos de acordo com a invenção podem ser usados para modificar geneticamente qualquer planta utilizando-se qualquer técnica ade- quada. Ambas as células de plantas de angiospermas ou gimnospermas de monocotiledôneas e de dicotiledôneas podem ser geneticamente modifica- das de várias maneiras conhecidas na técnica. Klein et al., biotechnology 4:583-90 (1993); Bechtod et al., C. R. Acad. Sei. Paris 316:1194-99 (1993); Bent et al., Mol. Gen. Genet. 204: 383-96 (1986); Paszowski et al., EMBO J. 3:2717-2722 (1984); Sagi et al., Plant Cell Rep. 13:262-66 (1994).

Plantas para Engenharia Genética

A invenção se refere em geral a plantas transgênicas que ex- pressam genes ou segmentos de genes que codificam as composições ori- ginais de polipeptídeos descritas aqui. Como utilizado aqui, o termo "plantas transgênicas" pretende se referir a plantas que incorporaram seqüências de ácidos nucleicos incluindo, sem limitação, genes que talvez não estejam normalmente presentes, seqüências de ácidos nucleicos não normalmente transcritas em RNA ou traduzidas em uma proteína ("expressas"), ou quais- quer outras seqüências de ácidos nucleicos ou genes que se deseje introdu- zir na planta, tais como genes que talvez estejam presentes na planta, mas que se deseja ou modificar geneticamente ou alterar a expressão. Contem- pla-se que em alguns exemplos, o genoma das plantas transgênicas da pre- sente invenção terá sido aumentado pela introdução estável de um transge- ne. Em outros exemplos, entretanto, a seqüência ou gene introduzido vai substituir uma seqüência endógena. Um gene preferido, que pode ser intro- duzido, inclui sem limitação a seqüência de ácidos nucleicos C3HC4 de Po- pulus deltoides.

Plantas que podem ser modificadas de acordo com a presente invenção incluem, mas sem limitação, árvores como as da espécie de euca- lipto (£. alba, E. albens, E. amygdalina, E. aromaphloia, E. baileyana, E. bal- ladoniensis, E. bicostata, E. botryoides, E. brachyandra, E. brassiana, E. hrevistylis, E. brockwayi, E. camaldulensis, E. ceracea, E. cloeziana, E. coc- cifera, E. cordata, E. comuta, E. corticosa, E. crebra, E. croajingolensis, E. curtisii, E. dalrympleana, E. deglupta, E. delegatensis, E. delicata, E. diversi- color, E. diversifolia, E. dives, E. dolichocarpa, E. dundasii, E. dunnii, E. ela- ta, E. erythrocorys, E. erythrophloia, E. eudesmoides, E. falcata, E. gamoph- ylla, E. glaucina, E. globulus, E. globulus subsp. bicostata, E. globulus subsp. globulus, E. gongylocarpa, E. grandis, E. grandis χ urophylla, E. guilfoylei, E. gunnii, E. hallii, E. houseana, E. jacksonii, E. lansdowneana, E. latisinensis, E. leucophloia, E. leucoxylon, E. lockyeri, E. lucasii, E. maidenii, E. margina- ta, E. megacarpa, E. melliodora, E. michaeliana, E. microcorys, E. microthe- ca, E. muelleriana, E. nitens, E. nitida, E. oblíqua, E. obtusiflora, E. occiden- talis, E. optima, E. ovata, E. pachyphylla, E. pauciflora, E. pellita, E. perrinia- na, E. petiolaris, E. pilularis, E. piperita, E. platyphylla, E. polyanthemos, E. populnea, E. preissiana, E. pseudo globulus, E. pulchella, E. radiata, E. radi- ata subsp. radiata, E. regnans, E. risdonii, E. robertsonii, E. rodwayi, E. rubi- da, E. rubiginosa, E. saligna, E. salmonophloia, E. scoparia, E. sieberi, E. spathulata, E. staeri, E. stoatei, E. tenuipes, E. tenuiramis, E. tereticornis, E. tetragona, E. tetrodonta, E. tindaliae, E. torquata, E. umbra, E. urophylla, E. vernicosa, E. viminalis, E. wandoo, E. wetarensis, E. willisii, E. willisii subsp. falciformis, E. willisii subsp. willisii, E. woodwardii), Populus spp. (P. alba, P. alba χ P grandidentata, P alba χ P tremula, P alba χ P tremula var. glandu- losa, P alba χ P tremuloides, P balsamifera, P balsamifera subsp. trichocar- pa, P balsamifera subsp. trichocarpa χ P deltoides, P ciliata, P deltoides, P euphratica, P euramericana, P kitakamiensis, P lasiocarpa, P laurifolia, P maximowiczii, P maximowiczii χ P balsamifera subsp. trichocarpa, P nigra, P sieboldii χ P grandidentata, P. suaveolens, P szechuanica, P tomentosa, P tremula, P tremula χ Ρ. tremuloides, P tremuloides, P wilsonii, P cana- densis, P yunnanensis), coníferas tais como pinheiro teda (Pinus taeda), pinheiro da Flórida (Pinus elliotii), pinheiro ponderosa (Pinus ponderosa), pinheiro Iodgepole (Pinus conforta), e pinheiro Monterey (Pinus radiata)·, Douglas-fir (Pseudotsuga menziesii)·, cicuta do Ocidente (Tsuga canadensis); espruce Sitka (P/cea glauca)·, madeira vermelha (Sequoia sempervirens)·, abetos verdadeiros tais como abeto prata (Abies amabilis) e abeto de bál- samo (Abies balsamea); e cedros tais como cedro vermelho do Oeste (Thuja plicata) e cedro amarelo do Alasca (Chamaecyparis nootkatensis).

A presente invenção também contempla a modificação de plan- tas produtoras de fibras, tais como algodão (Gossipium spp.), Iinho (Linum usitatissimum), urtiga ferrão (Urtica dioica), lúpulo (Humulus lupulus), árvores de limeira (Tilia cordata, T. x. europaea e T. platyphyllus), sorgo espanhol (Spartium junceum), rami (Boehmeria nivea), amoreira de papel (Brousso- netya papyrifera), Iinho da Nova Zelândia (Phormium tenax), apócino (A- pocynum cannabinum), espécie de Iris (/. douglasiana, I. macrosiphon e /. purdyi), asclépias (espécies de Asclépia), abacaxi, banana e outros. São também contempladas colheitas de forragem, tais como alfafa, lólio, festuca e trevo.

Nesta descrição, "planta" indica, de modo amplo, qualquer mate- rial de planta contendo celulose que pode ser geneticamente manipulado, incluindo, mas sem limitação, células de plantas diferenciadas ou indiferen- ciadas, protoplastos, plantas inteiras, tecidos de plantas e órgãos de plantas, bem como qualquer componente de uma planta tais como folha, caule, raiz, broto, tubérculo, fruta, rizoma e similares.

Na presente descrição, "planta transgênica" refere-se a uma planta na qual foi incorporada uma seqüência de ácido nucleico, incluindo, mas sem limitação, genes que não estão normalmente presentes em um genoma de planta hospedeira, seqüências de ácidos nucleicos não normal- mente transcritos em RNA ou traduzidos em uma proteína, ou quaisquer ou- tros genes ou seqüências de ácidos nucleicos que se deseja introduzir na planta tipo selvagem, tais como genes que normalmente podem estar pre- sentes na planta do tipo selvagem, mas que se deseja ou engenheirar gene- ticamente ou ter a expressão alterada. A categoria de "planta transgênica" inclui tanto um transformante primário como uma planta que inclui um trans- formante em sua linhagem, por exemplo, a título de introgressão padrão ou qualquer outro procedimento de multiplicação. Em contraste, uma planta que não é geneticamente manipulada é uma planta de controle e é referida como uma planta "não transgênica" ou de "controle". Planta não transgênica pode ser uma planta cujo genoma não está modificado pela introdução de um construção compreendendo as seqüências de polinucleotídeos ou fragmento destas da presente invenção. Pode ser também uma planta gerada a partir de células ou tecidos cultivados sem modificação anterior pela introdução de um construção que compreende as seqüências de polinucleotídeos da in- venção, ou pode compreender progênie recessiva de homozigoto (isto é, não tem nenhuma cópia do transgene) resultante de autofertilização de uma planta transgênica. Como utilizado aqui, uma "planta híbrida" se refere a uma planta ou a uma parte desta resultante de um cruzamento entre duas plantas parentes, em que um parente é a planta geneticamente alterada da invenção. Isto pode ocorrer naturalmente, por exemplo, por reprodução se- xual, ou artificialmente, por exemplo, por fusão nuclear in vitro.

Uma planta transgênica da presente invenção contém uma se- qüência de ácidos nucleicos, conforme descrição aqui, que é expressa sob o controle de um promotor operativo em plantas, de modo que a planta é ca- racterizada, por exemplo, por um teor reduzido de Iignina e um teor aumen- tado de celulose.

Métodos para Engenharia Genética

Os construtos de acordo com a invenção podem ser introduzidos em qualquer célula da planta, usando técnica de engenharia adequada. Tan- to as células de planta do angiosperma como do gimnosperma de monocoti- ledôneas e dicotiledôneas podem ser geneticamente engenheiradas de vá- rios modos conhecidos da técnica. Por exemplo, vide Klein et al., 1993, Bio- technology 4: 583-590; Bechtold et al., 1993, C. R. Acad. Sei. Paris 316:1194-1199; Koncz e Schell, 1986, Mol. Gen. Genet. 204: 383-396; Pasz- kowski et al., 1984, EMBO J. 3: 2717-2722; Sagi et al., 1994, Plant Cell Rep. 13: 262-266.

Espécies de Agrobactéria tais como A. tumefaciens e A. rhiso- genes podem ser usadas, por exemplo, de acordo com Nagel et al., 1990, Microbiol Lett 67: 325. Em resumo, a Agrobactéria pode ser usada com um vetor de expressão de planta, por exemplo, eletroporação, depois da qual a Agrobactéria é introduzida nas células da planta via, por exemplo, o método bem conhecido de discos foliares.

Os métodos adicionais para obtenção disto incluem, mas sem limitação, a transformação por Rhizobium, Sinorhizobium ou Mesorhizobium (Broothaerts et al., 2005, Nature 433: 629-633), eletroporação, bombardeio com pistola de partículas, precipitação, e fusão de glicõl, transferências nos grãos de pólen germinantes, transformação direta (Lorz et al., 1985, Moi Genet. 199: 179-182), e outros métodos conhecidos da técnica. Se um mar- cador de seleção, tal como resistência à canamicina é empregada, torna mais fácil determinar as células que foram transformadas com êxito.

Os métodos de transformação de Agrobactéria discutidos acima são conhecidos por serem úteis para dicotiledôneas transformadas. Adicio- nalmente, de La Pena et al., 1987, Nature 325: 274-276; Rhodes et al, 1988, Science 240: 204-207; e Shimamoto et al, 1989, Nature 328: 274-276, todos os quais são incorporados a título de referência, têm monocotiledôneas ce- reais transformadas usando Agrobactéria. Vide Bechtold e Pelletier, 1998, Methods Moi Biol. 82: 259-266, mostrando o uso de infiltração a vácuo para transformação mediada por Agrobactéria.

A presença de uma proteína, polipeptídeo, ou molécula de ácido nucleico em uma célula particular pode ser medida para determinar se, por exemplo, uma célula foi transformada ou transfectada com sucesso. A capa- cidade de executar tal ensaio é bem conhecida e não precisa ser reiterada aqui.

Quantificação do Comprimento da Fibra ou Altura da Planta

A frase "teor de celulose aumentado", empregado aqui para des- crever uma planta da invenção, refere-se ao aumento quantitativo de celulo- se na planta quando comparado à quantidade de celulose em uma planta tipo selvagem. Um aumento quantitativo de celulose pode ser ensaiado por diversos métodos, como, por exemplo, por quantificação baseado nos açú- cares totais depois da hidrólise ácida de polissacarídeos em madeira moída de embrião. Chiang e Sarkanen1 Wood Sei. Technol. 17:217-26 (1983); Da- vis, J. Wood Chem. Technol. 18: 235-52 (1988).

O teor de celulose na planta engenheirada da invenção pode ser aumentado até níveis de cerca de 30% a cerca de 50%, mais preferivelmen- te de cerca de 25% a cerca de 45%, ainda mais preferivelmente de cerca de 20% a cerca de 40% do teor de celulose de uma planta tipo selvagem. Uma modalidade mais preferível da planta da invenção possui um teor de celulose de cerca de 10% a cerca de 15% do teor de celulose de uma planta tipo sel- vagem.

As frases "teor de Iignina reduzido" e "teor diminuído", utilizadas aqui para descrever um aspecto de uma planta da presente invenção, se referem respectivamente a uma redução quantitativa da quantidade de Iigni- na em uma planta quando comparada à quantidade de Iignina em uma plan- ta tipo selvagem ou não transformada. Uma redução quantitativa de Iignina pode ser ensaiada por metodologia convencional ilustrada no ensaio de Iig- nina Klason (Kirk et al., Method in Enzymol. 161: 87-101 (1988)) e o ensaio de brometo de acetila de Iignina (liyama et al., Wood Sei. Technol. 22: 271- 80(1988)).

O teor de Iignina em uma planta engenheirada da invenção pode

ser reduzido a níveis de cerca de 5% a cerca de 90%, preferivelmente de cerca de 10% a cerca de 75%, ainda mais preferivelmente de cerca de 15% a cerca de 65% em peso seco do teor de Iignina de uma planta tipo selva- gem. Uma modalidade mais preferível da planta da invenção possui um teor de Iignina de cerca de 20% a cerca de 60% do teor da Iignina tipo selvagem.

Exemplos são fornecidos abaixo sobre a metodologia para a ob- tenção de um gene C3HC4 de Populus deltoides, bem como técnicas para o uso de Agrobactéria na introdução do gene-alvo para produzir as plantas transformantes são dadas abaixo. Eles pretendem ser apenas meros exem- pios e não uma limitação da presente invenção. EXEMPLO 1

Perfil de expressão de genes preferivelmente expressos em madeira de ten- são, madeira de reação e madeira normal

Marcadores de Seqüências Expressas (ESTs) de Eucalyptus grandis χ Eucalyptus urophylla foram aglomerados usando o programa CAP3, conforme descrito por Huang e Madan, Genome Res. 9: 868-77 (1999), que é incorporado a título de referência. Um grupo de 53.522 ESTs foi obtido de bibliotecas representando os seguintes tecidos: madeira de ten- são, madeira de reação, e madeira normal de árvores de eucalipto crescidas no campo (Eucalyptus grandis χ Eucalyptus urophylla), de 6,5 m de altura). O conjunto de aglomeração assim gerados foi investigado quanto a aglome- rações de compostos de pelo menos 90% de leituras de EST de bibliotecas representando tecido de madeira de tensão. Adicionalmente, o conjunto de aglomerações foi investigado quando a aglomerações de compostos de pelo menos três EST de tecido de tensão de madeira e, preferivelmente, menos que duas leituras de outras bibliotecas. Uma algomeração assim selecionada, compostos de 14 leituras

de EST da biblioteca de cDNA de madeira de tensão e 0 leituras de outras bibliotecas (madeira de reação e normal), representa um membro da família de proteína C3HCA (Figura 1).

A aglomeração selecionada usando-se esses parâmetros foi en- tão alinhada usando o algoritmo Blast-X com um valor e-valor de cutoff <= 1e-5, vide Altschul et al., NucIeicAcids Res. 25: 3389-402 (1997), para se- qüências de uma base de dados da espécie Populus curada composta de seqüências obtidas da base de dados v.1 de JGI Populus trichocarpa (http://qenome.iai-psf.org/Poptr1/Poptr1.home.html). Os resultados de com- paração foram armazenados em uma base de dados local de seqüências de Populus. Por esse procedimento, uma codificação de cluster foi corrigida para a proteína C3HC4 que é ortóloga a uma escolhida das bibliotecas de eucalipto. A seqüência da leitura mais longo nessa aglomeração é estabele- cida aqui como a SEQ ID N0:1, que codifica o polipeptídeo descrito aqui sob SEQ ID NO:2. EXEMPLO 2

Isolamento de uma seqüência de DNAde C3HC4 de Populus deltoides (a) Preparação de RNA de câmbio/xilema de PoduIus deltoidesle síntese de cDNA

A casca foi removida a partir de talhos no caule em árvores de Populus deltoides de um ano de idade. A parte interna do caule, contendo câmbio, xilema e medula, foi cortada em pedaços pequenos, congelados em nitrogênio líquido e usados para extração de RNA usando o método de ex- tração com brometo de cetiltrimetil-amônio (CTAB) (Aldrich e Cullis, Plant Mol. Biol. Report., 11;128-141 (1993)). Uma reunião de cDNAfoi usada em experimentos de RT-PCR em que o RNA total isolado foi usado como mode- lo, e transcriptase reversa Superscript Il (Invitrogen) e iniciador oligo (dT) foram usados para sintetizar o cDNA de primeira fita. O cDNA de fita dupla foi obtido pela reação de polimerase subsequente usando-se iniciadores es- pecíficos de gene, conforme descrição abaixo.

(b) Desenho de Iniciadores de PCR e reação de RT-PCR.

Oligômeros com base em SEQ ID N0:1 foram sintetizados como iniciadores para PCR, incluindo tanto a região em torno do primeiro códon ATG como em torno do códon de terminação do principal ORF que codifica o polipeptídeo para amplificar a região de codificação inteira do ORF. As se- qüências dos iniciadores são: C3HC4NDE: Comprimento: 30 Catatgaata cgcggtaccc ctttccaatg (SEQ ID NO: 3) C3HC4XBA: Comprimento: 31 Tctagactat ctctccaatc cttgtttaca g (SEQ ID No:4)

A reunião de cDNA obtida em (a) foi usada como modelo em uma reação de PCR com os iniciadores das SEQ ID NOs: 5, 6, 7, e 8. A PCR envolveu 40 ciclos de 1 minuto a 94°C, 1 minuto a 510C, e 2 minutos a 72°C seguidos por uma etapa extra de alongamento a 72°C, por 7 minutos. Os produtos de PCT foram isolados por eletroforese em gel em agarose a 1,0% seguido por brometo de etídio colorindo o gel submetido à eletroforese e de- tecção de bandas amplificadas em um trans-iluminador de UV. As bandas amplificadas detectadas foram verificadas e cortadas do gel de agarose com um barbeador. Os pedaços de gel foram transferidos para microtubos de 1,5 mL, e os fragmentos de DNA foram isolados e purificados usando-se um kit de limpeza de PCR e de purificação de banda de gel GFX (Amersham). Os fragmentos de DNA recuperados foram subclonados em um vetor de clona- gem comercialmente disponível, transformados em E. coli, e então usados para preparar DNA plasmidial, que foi então sequenciado pelo método de didesóxi (Messing, Methods in Enzymol, 101, 2-78 (1983)) usando métodos padrão, resultando na seqüência de nucleotídeos SEQ ID NO:1, que codifica o polipeptídeo descrito aqui sob SEQ ID N0:2. EXEMPLO 3

Preparação das plantas transqênicas de Nicotiana benthamiana

As moléculas de ácido nucleico da Populus deltoides obtida no Exemplo 2 acima foram introduzidas em um hospedeiro de planta para pro- duzir plantas de tabaco transgênico.

As moléculas de ácido nucleico isoladas da Populus deltoides e obtidas no Exemplo 2 foram clonadas em um vetor de expressão a jusante de um promotor de gene (C4H) de cumarato-4-hidroxalase preferido de xi- Iema (Figura 2). Os contrutos de expressão resultantes foram amplificados em E. coli, e então transformados por transformação química em cepa de A. tumefaciens LBA4404. Transformação mediada por agrobactéria de Nicotiana bentha-

miana foi obtida usando-se o método de disco foliar de Horsch et al., Scien- ce 227: 1229 (1985). Em resumo, a cepa de agrobactéria LBA4404 foi de- senvolvida durante a noite até alcançar o crescimento de fase mid-log. As culturas foram diluídas 1:10 em água estéril e cocultivadas por 20 minutos com discos foliares de plantas jovens Nicotiana benthamiana crescida esté- ril. Esses discos foram incubados em meio de Murashige-Skoog, no escuro. Depois de 48 horas, os discos foliares foram colocados de cabeça para bai- xo em placas frescas do mesmo meio de crescimento suplementado com 0,4 mg/L de ácido indolacético (IAA), 2 mg/L de benzil-aminopurina (hoBAP), 1 mg/L de Finale e 500 mg/L de carbenicilina. Quando os brotos se formaram, eles foram removidos do disco foliar e colocados em meio fresco, suplemen- tado com somente 1 mg/L de Finale. Brotos de transformantes primários de Nicotiana benthamiana, heterozigoto para o transgene, foram deixados enra- izar em meio de Murashige e Skoog, e, subseqüentemente, transferidos para o solo e crescidos na estufa. As condições (~50pM;m2/s de luz branca, 27°C) foram suficientes para identificar aquelas plantas transgênicas, que exibiram estrutura de xilema e/ou composição química do xilema alteradas, ou uma combinação desses efeitos, de acordo com as descrições proporcionadas aqui.

EXEMPLO 4

Inserção de gene estranho de verificação de PCR no genoma da planta hos- pedeira

PCR foi usada para verificar a integração do construto de gene no genoma das plantas transgênicas. Um par de iniciadores foi sintetizado para amplificar uma seqüência de DNA de 400 bp do gene Bar de marcador selecionável. Adicionalmente, um outro par foi sintetizado para amplificar o gene de chalcona sintase (CHS) da Nicotiana benthamiana. Esses conjuntos de iniciadores estão descritos no Pedido Internacional Publicado, WO 2006/096951. Bar 35: Comprimento: 20 tctaccatga gcccagaacg Bar 36: Comprimento: 23 aattcgggg atctggattt tag CHS 150: Comprimento: 24 gccagcccaa atccaagatt actc CHS 151: Comprimento: 23 aatgttagcc caacttcacg gag

Os iniciadores de Bar foram usados para amplificar por PCR par- te da porção de T-DNA do construto de expressão contendo uma molécula de ácido nucleico da invenção, isto é, do DNA genômico de transformantes de Nicotiana benthamiana. A mistura reacional da PCR continha 100 ng de DNA genômico

de planta transformada, preparada usando-se o método de extração com brometo de cetiltrimetil-amônio (CTAB) (Aldrich e Cullis, Plant Mol. Bioi. Re- port 11: 128-41 (1993)), 0,2 μΜ de cada íniciador para o gene de controle CHS endógeno, 100 μΜ de cada trifosfato de desorribonucleotídeo, 1x de tampão de PCR e 2,5 Unidades de AmpIiTaq DNA polimerase (Applied Bi- osystems) em um volume total de 50 μί. Os parâmetros de ciclagem foram como a seguir: 94°C, por 1 minuto, 57°C, por 1 minuto e 72°C por 1 minuto, para 40 ciclos, com 5 minutos a 72°C, na extensão. Os produtos de PCR foram submetidos à eletroforese em um gel de agarose a 1 %. EXEMPLO 5

Determinação dos níveis de expressão de transgene em plantas transgêni- ças

RT-PCR semiquantitativa foi usada para detectar o acúmulo de transcritos C3HC4 de Populus deltoides no tecido do caule das plantas transgênicas. O RNA total foi isolado dos cortes de caule de plantas Nicotia- na TO transgênicas de 4 meses de idade usando o método de CTAB (Aldrich e Cullis, Plant Mol. BioL Report. 11:128-141 (1993)). cDNAfoi sintetizado de 500 ng de RNA total usando RNase H Supercript II-RT (Invitrogen, E.U.A.). Os iniciadores descritos acima foram usados juntamente com iniciadores para o gene constitutivo que codifica a chalcone sintase (CHS) como contro- le interno para normalizar a quantidade de RNA total usado em cada amos- tra. A PCR foi feita com uma diluição de 12,5 vezes do cDNA de primeira fita sob as seguintes condições: 94°C por 3 minutos e 27 ciclos de 94°C por 1 minuto, 510C por 1 minuto, e 72°C por 1 minuto e 30 segundos.

A descrição acima e os exemplos descrevem várias característi- cas da invenção, que essencialmente levam ao isolamento e à clonagem de moléculas de ácido nucleico que codificam um membro da família de proteí- nas C3HC4 e que são úteis na produção de plantas geneticamente enge- nheiradas. As plantas recombinantes que foram transformadas ou transfec- tadas com tal molécula de ácido nucleico isolada podem exibir alteração quantitativa do teor de celulose e/ou do teor de lignina. EXEMPLO 6

Análise histoquímica de plantas transgênicas

Caules de Nicotiana transgênica e plantas não transgênicas de controle foram seccionadas e fixadas em paraformaldeído a 4% por 24 ho- ras. Tecidos fixados foram então seccionados em um micrótomo (Leica RM2255) e subseqüentemente coloridos com azul astra/safranina. As sec- ções coloridas histologicamente foram observadas em um microscópio inver- tido Leica DM11 usando iluminação de campo, clara e escura. EXEMPLO 7

Aumento do teor de celulose em plantas transaênicas que superexpressam C3HC4 em tecidos vasculares

Os caules principais de eventos transgênicos de Nicotiana trans- formada com construções que compreendem o gene de C3HC4 de Popuius deltoides sob o controle do promotor C4H de Populus deltoides preferido do xilema e plantas de controle não transgênicas foram coletados e secados a ar por duas semanas. Os caules secos foram cortados em pedaços e forma- dos em pó em um moinho de facas usando-se uma peneira de 30 malhas. As amostras em pó de caule foram então submetidas a análises químicas para determinar o teor de celulose e de lignina. Em resumo, os teores de celulose e hemicelulose foram determinados com base nos açúcares totais depois da hidrólise ácida destes polissacarídeos extraídos do caule. Os cau- les moídos foram secados sob vácuo a 45°C e hidrolisados com H2SO4. Se- guinte a cromatografia de troca iônica em pH alto, glicana e outros polissaca- rídeos (hemiceluloses) foram quantificados como base na composição do hidrolisado. Chiang e Sarkanen (1983) e Davis (1988), acima. Três dos e- ventos transgênicos de C3HC4, conhecidos por expressarem o transgene de acordo com o procedimento detalhado no Exemplo 5, mostram um aumento estatisticamente significante de teor de celulose (Figura 3). O evento trans- gênico 6B exibe 54,09% de celulose em comparação com 50,00% das plan- tas não transgênicas de controle, representando um aumento significante de 8,18% de teor de celulose (P<0,05, t-teste). O evento transgênico 24B exibe 53,90% de celulose, em comparação com 50,00% nas plantas de controle, representando 7,80% de aumento no teor de celulose (Figura 3. P<0,05, t- teste). O evento transgênico 4B exibe 53,26% de teor de celulose em com- paração com 50,00% em plantas não transgênicas de controle, representan- do 6,52% de aumento do teor de celulose (Figura 3; P<0,05, t-teste).

Depois de crescer até a maturidade, os eventos TO foram auto- polinizadas para geração de linhagens T1. Aqui, são apresentados os resul- tados referentes a três eventos que têm a sua geração T1 analisada.

A análise da população T1 a partir do evento 6B indicou que a

condição dominante do homozigoto para o gene de C3HC4 é letal, já que não foi detectada nenhuma planta homozigótica na população segregante. O desenvolvimento da planta foi provavelmente afetado. No entanto, as plantas que são hemizigóticas para o gene de CrHC4 apresentaram um aumento significante de 8,4% do teor de celulose (P<0,05, t-test), quando compara- das com plantas recessivas homozigóticas (Figura 4). Elas mostraram tam- bém uma redução de 18% de seu teor de Iignina (P<0,05, t-teste), em com- paração com plantas recessivas homozigóticas (Figura 5).

Na população segregante de eventos 24B e 25B, foi possível identificar plantas dominantes homozigóticas. Mas o aumento maior de teor de celulose foi observado no grupo de plantas hemizigóticas, em compara- ção com as plantas recessivas homozigóticas. As plantas homozigóticas do evento 24B mostraram um aumento de 9,7% do teor de celulose e as plan- tas dominantes homozigóticas apresentaram um aumento de 7,5% de teor de celulose em comparação com plantas recessivas homozigóticas (Figura 6; P<0,05, t-teste). As plantas hemizigóticas do evento 25B mostraram um aumento de 10,4%, em comparação com o grupo de plantas recessivas ho- mozigóticas (Figura 7; P<0,05, t-teste). Nenhuma alteração significante do teor de Iignina foi observada nesses dois eventos. LISTAGEM DE SEQÜÊNCIA

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Claims (22)

1. Seqüência de ácido nucleico isolada que compreende uma seqüência selecionada do grupo que consiste em: (a) uma seqüência de ácido nucleico apresentada na SEQ ID NO: 1 ou o filamento complementar da mesma; (b) uma seqüência de ácido nucleico que codifica a seqüência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 2; (c) uma seqüência de ácido nucleico capaz de se hibridizar sob condições estringentes com uma seqüência de ácido nucleico de (a) ou (b), em que a dita seqüência de hibridização codifica um polipeptídeo C3HC4; (d) um ácido nucleico que é uma variação alélica ou uma varia- ção de processamento alternativo da seqüência de ácido nucleico de (a) ou (b);e (e)uma seqüência de ácido nucleico que possui pelo menos 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% ou mais de identidade de seqüência em relação à seqüência de (a) ou (b).

2. Proteína C3HC4 isolada selecionada do grupo que consiste em: (a) um polipeptídeo apresentado na SEQ ID NO 2; 20 (b) um polipeptídeo com uma seqüência de aminoácidos que possui pelo menos 85% ou mais de identidade de seqüência em relação à seqüência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO 2; e (c) uma variação de um polipeptídeo que é definido em (a) ou (b).

3. Construto de ácido nucleico que compreende uma seqüência de polinucleotídeo de C3HC4 isolada ligada de forma operacional a um ou mais promotores adequados que controlam a expressão da seqüência de polinucleotídeo de C3HC4.

4. Construto de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 3, em que o promotor é um promotor preferido pelo xilema.

5. Construto de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 4, em que o dito promotor preferido pelo xilema é selecionado do grupo que consiste no promotor do gene TUB1 do promotor do gene SuSy, do promotor do gene COMT e do promotor do gene C4H.

6. Célula vegetal que compreende o construto de ácido nucleico como definido na reivindicação 3.

7. Planta transgênica gerada partindo da célula vegetal como definida na reivindicação 6, em que a dita planta possui conteúdo alterado de celulose e/ou Iignina comparado com a de uma planta não transgênica da mesma espécie.

8. Célula vegetal de acordo com a reivindicação 6, em que o dito promotor é um promotor preferido pelo xilema.

9. Célula vegetal de acordo com a reivindicação 8, em que o dito promotor preferido pelo xilema é selecionado do grupo que consiste do pro- motor do gene TUB1 do promotor do gene SuSy1 do promotor do gene COMT e do promotor do gene C4H.

10. Planta transgênica de acordo com a reivindicação 7, em que a dita planta é uma planta dicotiledônea.

11. Planta transgênica de acordo com a reivindicação 7, em que a dita planta é uma planta monocotiledônea.

12. Planta transgênica de acordo com a reivindicação 7, em que a dita planta é uma gimnosperma.

13. Planta transgênica de acordo com a reivindicação 7, em que a dita planta é uma árvore de madeira de lei.

14. Planta transgênica de acordo com a reivindicação 13, em que a dita árvore de madeira de lei é uma planta de Eucalyptus.

15. Planta transgênica de acordo com a reivindicação 13, em que a dita árvore de madeira de lei é uma planta de Populus.

16. Planta transgênica de acordo com a reivindicação 11, em que a dita árvore de madeira mole é uma planta de Pinus.

17. Parte da planta transgênica de acordo com a reivindicação 7, selecionada do grupo que consiste em uma folha, um caule, uma flor, um ovário, um fruto, uma semente e um calo.

18. Progênie da planta transgênica como definida na reivindica- ção 7.

19. Progênie de acordo com a reivindicação 18, em que a dita progênie é uma planta híbrida.

20. Processo para alterar o conteúdo de celulose e/ou de Iignina em uma planta, que compreende (a) a introdução em uma célula vegetal isolada de uma construto de ácido nucleico que compreende uma seqüência de polinucleotídeo de C3HC4 isolada, ligada de forma operacional a um ou mais promotores ade- quados que controlam a expressão da seqüência de polinucleotídeo de C3HC4; e (b) o cultivo da dita célula vegetal sob condições que promovem o crescimento de uma planta, em que a dita planta superexpressa a proteína C3HC4 e conteúdo de celulose maior e/ou de Iignina reduzido comparado ao de uma planta não transgênica da mesma espécie.

21. Processo de acordo com a reivindicação 20, em que o pro- motor é um promotor preferido pelo xilema.

22. Processo de acordo com a reivindicação 21, em que o pro- motor preferido pelo xilema é selecionado do grupo que consiste do promo- tor do gene TUB, do promotor do gene SuSy, do promotor do gene COMT e do promotor do gene C4H.