BRPI0720813A2 - vetor de expressço para ser utilizado na produÇço recombinante de um polipeptideo em uma cÉlula de mamÍfero, mÉtodo para a produÇço recombianate de um polipeptÍdeo, mÉtodo para melhorar eficÁcia de um vetor de expressço do gene e mÉtodo para intensificar o desempenho de um vetor de expressço existente - Google Patents

Abstract

VETOR DE EXPRESSçO PARA SER UTILIZADO NA PRODUÇçO RECOMBINANTE DE UM POLIPEPTÍDEO EM UMA CÉLULA DE MAMÍFERO, MÉTODO PARA A PRODUÇçO RECOMBINANTE DE UM POLIPEPTÍDEO, MÉTODO PARA MELHORAR A EFICÁCIA DE UM VETOR DE EXPRESSçO DO GENE E MÉTODO PARA INTENSIFICAR O DESEMPENHO DE UM VETOR DE EXPRESSçO EXISTENTE. Trata-se de um método para utilizar o gene intron-1 de beta actina de pintainho ou um equivalente funcional como um elemento intensificador da expressão de gene ou uma sequência de "pontos quentes" da expressão de gene para construir ou reconstruir um vetor de expressão de mamífero para a expressão extremamente elevada de proteínas recombinantes. A composição de um conjunto de vetores de expressão de gene extremamente forte também é apresentada.

Description

VETOR DE EXPRESSÃO PARA SER UTILIZADO NA PRODUÇÃO RECOMBINANTE DE UM POLIPEPTÍDEO EM UMA CÉLULA DE MAMÍFERO, MÉTODO PARA A PRODUÇÃO RECOMBINANTE DE UM POLIPEPTÍDEO, MÉTODO PARA MELHORAR A EFICÁCIA DE UM VETOR DE EXPRESSÃO DO GENE E MÉTODO PARA INTENSIFICAR O DESEMPENHO DE UM VETOR DE EXPRESSÃO EXISTENTE

CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção relaciona-se ao uso do gene Intron-I de beta actina de pintainhos como intensificador da expressão do gene ou ura "pontos quentes" da expressão do gene na região de flanço 5' - 3' de um promotor de expressão de gene de mamífero para construir ura novo vetor de expressão de mamífero ou reconstruir um vetor de expressão de gene existente para a expressão de nível extremamente elevado de proteínas e a geração de linhagens de células de mamíferos produzindo um nível extremamente elevado de proteínas recombinantes.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO Uma proteína recombinante pode ser preparada primeiramente ao introduzir um vetor de expressão que codifica a proteína recombinante em células hospedeiras e então expressa a proteína recombinante nas células hospedeiras. As célula hospedeiras tradicionais incluem células CHO, NSO e 293 originais não selecionadas para o crescimento robusto ideal em meios de suspensão isentos de soro. Os vetores de expressão tradicionais podem utilizar um promotor à base de SV4 0 ou CMV para controlar a expressão da proteína recombinante. As células hospedeiras empregadas no sistema de expressão convencional crescem relativamente 3 0 lentas com um tempo duplo de aproximadamente 24-36 horas e uma densidade de células era crescimento ideal de 3-5 χ IO6 células/ml.

Para aumentar a velocidade de produção e manter o rendimento elevado da produção de proteínas recombinantes, o autor da presente invenção descobriu que determinadas células hospedeiras robustas com tempo duplo mais curto e densidade mais elevada de células podem ser preferivelmente utilizadas. As linhagens de células robustas são geralmente selecionadas ao selecionar linhagens de células de crescimento rápidas e de alta densidade, ou selecionadas a partir de quaisquer tipos de linhagens de células baseadas no crescimento rápido e na alta densidade. No entanto, os promotores utilizados em vetores de expressão convencionais não são suficientemente fortes nestas linhagens de células em crescimento rápido e de alta densidade para o nível elevado da expressão de gene. Além disso, não muitos vetores podem ser utilizados universalmente para a maior parte dos tipos de linhagens de células.

Portanto, há uma necessidade de se buscar vetores de expressão de gene universais extremamente fortes que sejam apropriados para ser utilizados na maior parte das células hospedeiras em crescimento rápido robustas com tempo duplo mais curto e crescimento de elevada densidade.

É sabido que as regiões reguladoras 5' de genes de plantas contêm freqüentemente um elevado teor rico em GC (ilhas de CpG) . A expressão do gene da planta é freqüentemente constitutiva a um nível mais elevado do que aquele da expressão de mamíferos. Provavelmente, o elevado teor rico em GC com estrutura de DNA forte na região reguladora 51 desempenha um papel chave para toda a expressão de gene como um mecanismo universal. Através da pesquisa da seqüência de DNA de genoma e das experiências precedentes de laboratório no campo, o teor rico em GC extremamente elevado do intron-1 de gene de beta actina de pintainhos foi identificada (fragmento de 1,006 kb, ID SEQ No: 1). Esta seqüência 1.006 pares base contém o teor de GC de 74,8% médio 10

com o teor mais elevado de GC de 90,8% de um fragmento de 130 pares base. Através dessa abordagem experimental, também foi verificado que essa região tem a estrutura secundária de DNA extremamente, o que foi evidenciado pela grande dificuldade em arranjar em seqüência, impossível para a leitura de PCR, e dificuldade de ligação. Portanto, foi suposto que o DNA genômico altamente rico em GC com estrutura de DNA forte pode manter o segredo do elevado nível constitutivo de toda a expressão de gene de mamífero através da regulação da condensação de cromatina, e da formação de nucleosoma, que regula a transcrição do gene.

A presente invenção é baseada em uma descoberta surpreendente, ou seja, uso do Intron-I de gene de beta actina de pintainho altamente rico em GC como intensificador da expressão de gene de 51 e/ou 31-flanço ou sítio do "pontos quentes" da expressão de gene para construir um novo vetor de expressão de mamífero ou modificar um vetor existente para a expressão de elevado nível de proteínas recombinantes. Surpreendentemente, os vetores de expressão de mamífero 2 0 modificados por intron-1 de gene de actina de pintainho geraram níveis extremamente elevados da expressão de gene em uma linhagem de células CHO de crescimento rápido.

Resumidamente, o intron-1 de beta actina de pintainho (fragmento de 1.006 kb, ID SEQ No: 1) foi utilizado como um elemento intensificador ou uma seqüência de "pontos quentes" de expressão e construído em torno de um determinado promotor de gene de mamífero e ilustrado abaixo:

1) . Controle (Promotor de actina-poliligante-poli A) ;

2). pMHl (promotor de Intron-l-actina-poliligante-poli A); 3). pMH2 (promotor de actina-poliligante-poli A-Intron-1);

4). pMH3 (promotor de Intronl-actina- poliligante-poli A;

5). pMH4 (promotor de pCMV-Intronl- poliligante-poli A);

6) . pMH5 (promotor de pCMV-Intron-l-poliligante-poli A- Intron-1);

7). pMH6 (promotor de plntron-I-CMV-Intron-I- ployligante- poli A-Intron-1);

8). pMH7 (promotor de plntron-1-PGK-poliligante-poli A);

9) . pMH8 (fragmento rico em pGC-promotor de actina- poliligante-poli A);

10) . pMH9 (promotor de pActina-poliligante-poli A-fragmento rico em GC).

DESCRIÇÃO RESUMIDA DA INVENÇÃO É apresentado um método para utilizar intron-1 de beta actina de pintainho ou seu equivalente funcional como uma seqüência de "pontos quentes" de elemento intensificador ou expressão para construir um vetor de expressão de mamífero extremamente forte. Também é apresentada a composição de um conjunto de vetores de expressão de gene extremamente fortes.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS Figura I-Um plasmídio de controle de promotor de pActin-poliligante-poli A é um vetor de expressão baseado em promotor de beta actina de pintainho nativo. Ele foi construído ao utilizar um fragmento de kb Xhol/HindIII de 1,272 kb do comprimento total do promotor de gene de beta- actina de pintainho (ID SEQ No: 2) inserido na cadeia principal do vetor pBR322 aberto de SalI/HindIII com o poliligante EcoRI/Notl seguido por um sítio Poli A.

Figura 2 - Um plasmídio modificado por intron-1 de pMHl (Intron-1-promotor de actina-poliligante-poli A) (ID SEQ No: 4) foi construído ao inserir a seqüência de intron-1 de 1,006 kb modificada por adaptador de Psti/HindIII no sítio de PstI/HindlII imediatamente a montante de uma seqüência de sinal de Poli A. Em seguida, um fragmento de espaçador de 0,331 kb (intensif icador de CMV sem promotor de CVM) foi inserido no sítio de PstI entre Intron-1 e promotor de actina na orientação de sentido. Figura 3 - Um plasmídio modificado com intron-1 de pMH2 (promotor de actina-poliligante-poli A-intron-1) (ID SEQ No: 5) foi construído ao inserir a seqüência de intron-1 de 1,006 kb modificada por adaptador de PstI/HindIII imediatamente a jusante do sítio de Pstl/Hind III de uma seqüência de sinal de poli A. Em seguida, um fragmento de espaçador de 0,331 kb (intensificador de CMV sem promotor de CVM) foi inserido no sítio de PstI entre Intron-1 e o promotor de actina na orientação de sentido.

Figura 4 - Um plasmídio modificado com Intron-1 de pMH3 (Intronl-promotor de actina-poliligante-poli A-intron-1) (ID SEQ No: 6) foi construído ao combinar os fragmentos de PvuI/NotI que contêm o promotor de actina de pMHl (ID SEQ No: 5) e os fragmentos de Pvul/Notl que contêm a cadeia principal de pBR322 de pMH2 (ID SEQ No: 4).

Figura 5 - Um plasmídio modificado com Intron-1 de pMH4 (promotor de pCMV-Intronl-poliligante-poli A) (ID SEQ No: 7) foi construído ao combinar uma seqüência de promotor de CMV de 0,82 kb amplificada por PCR com sítios de Sall/PstI e fragmento de intron-1 modificado por PstI/HindIII. Ele foi inserido então no sítio de Sall/Hind III da cadeia principal de pBR322 aberta de SalI/HindIII com o ligante de EcoRl/Notl seguido por um sítio de poli A.

Figura 6 - Um plasmídio modificado com Intron-1 de pMH5 (promotor de pCMV-Intron-l-poliligante-poli A-Intron-1) (ID SEQ No: 8) foi construído ao combinar fragmentos de PvuI/NotI que contêm o promotor de actina de pMH4 (ID SEQ No: 7) e fragmentos de Pvul/Notl que contêm a cadeia principal de pBR322 de pMH2 (ID SEQ No: 5).

Figura 7 - Um plasmídio modificado com Intron-1 de pMH6 (promotor de plntron-l-CMV-Intron-l-poliligante-poli A- Intron-1) (ID SEQ No: 9) foi construído ao inserir a seqüência de intron-1 de 1,006 kb modificada por SaII no sítio de SaII imediatamente a montante de um promotor de CMV de pMH5 (promotor de pCMV-Intron-1-poliligante-poli A-Intron- 1) na orientação de sentido.

Figura 8 - Um plasmídio modificado com Intron-I de pMH7 (promotor de plntron-l-promotor de PGK-poliligante-poli A) (ID SEQ No: 10) foi construído ao inserir a seqüência de promotor de PGK amplificada por PCR de 0,572 kb PGK com os sítios de PstI/HindIII na cadeia principal do vetor pBR322 aberta de PstI/HindIII com o ligante de EcoRl/Notl seguido por um sítio de poli A. Uma seqüência de Intron-I com sítios de Sall/PstI modificados por adaptador foi então inserida nos sítios de Sall/PstI imediatamente a montante do promotor de PGK.

Figura 9 - Um plasmídio modificado com fragmento de DNA rico em GC de pMH8 (fragmento rico em pGC-promotor de actina-poliligante-poli A) (ID SEQ No: 11) foi construído ao inserie um fragmento rico em GC sintético de 1,337 kb (ID SEQ No: 13) com os sítios de SaLl/PstI aos sítios de Sall/PstI imediatamente a montante de uma seqüência de promotor de actina da cadeia principal do vetor de pBR3 22 com o ligante de EcoRI/NotI seguido por um sítio de poli A.

Figura 10 - Um plasmídio modificado com fragmento de DNA rico em GC-rico (promotor de pActina-poliligante-poli A-fragmento rico em GC) (ID SEQ No: 12) foi construído ao inserir o fragmento rico em GC sintético de 1,337 kb modificado por adaptador de PstI/HindIII (ID SEQ No: 13) nos sítios de PstI/HindlII a jusante de uma seqüência de sinal de poli A.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

A presente invenção é baseada na descoberta do uso do gene Intron-I de beta actina de pintainhos como um elemento intensificador ou uma seqüência de "pontos quentes" de expressão para construir o vetor de expressão de mamífero para a expressão de nível extremamente elevado de proteínas recombinantes. Resumidamente, o gene intron-1 de beta actina de pintainho (SEQ No. 1 de fragmentos de 1,006 kb) foi utilizado como uma seqüência intensificadora ou um pontos quentes e construído em torno de um promotor de gene de mamífero e ilustrado abaixo:

1) . controle (Promotor de actina-poliligante-poli

A) ;

poli A) ; Intron-1!

2) . pMHl (Promotor de Intron-l-actina-poliligante-

3). pMH2 (Promotor de actina-poliligante-poli A-

t

4) . pMH3 (Promotor de intron-l-actina-poliligante-

poli A);

5) . pMH4 (Promotor de pCMV-Intron-l-poliligante- poli A);

6) . pMH5 (Promotor de pCMV-Intron-1-poliligante-

poli A-Intron-1);

7). pMH6 (Promotor de plntron-I-CMV-Intron-1-

poliligante-poliA-Intron-1);

8) . pMH7 (Promotor de plntron-l-PGK-poliligante-

poli A);

9). pMH8 (fragmento rico em pGC-promotor de actina- poliligante-poli A-fragmento rico em GC) ;

10) . pMH9 (promotor de pActina-poliligante-poli A-

fragmento rico em GC).

0 comprimento total do elemento regulador de flanco 5' de beta actina de pintainho era do Dr. N Fregien (ATCC 37507) (Fregien N and Davidson N, 1986). Ele foi arranjado em 3 0 seqüência e caracterizado pelo mapeamento da enzima de restrição e combinado com a seqüência publicada (Kost et al., 1983) . Um fragmento do promotor do gene de actina de pintainho de 1,4 94 kb foi digerido por PstI e HindIII e 10

purificado através de SDS de gel. Esse fragmento do promotor de Psti/HindIII de 1,494 kb também foi digerido por HinfI para obter Intron-I de 1,006 kb, e modificado utilizando um adaptador de Pstl/Hinfl fosforilado para obter PstI na extremidade 5' e HindIII na extremidade 3' do intron-1 (SEQ No: 1) .

0 vetor de expressão baseado em promotor de beta actina de pintainho nativo (Figura 1) (ID SEQ No: 3) foi construído ao inserir um fragmento de Xho I/Hind III de 1,272 kb de comprimento completo do elemento regulador de flanço 5' do gene de beta actina de pintainho que contém intron-1 (ID SEQ No: 2) em uma cadeia principal de vetor à base de pBR322 aberta de SaLL/HindIII com os sítios de EcoRI/Notl seguidos por um sítio de poli A para formar o Controle (promotor de actina-poliligante-poli A) (ID SEQ No: 3).

Um plasmídio de controle de promotor de p-Actina- poliligante-poli A (Figura 1) é um vetor de expressão baseado em promotor de beta actina de pintainho nativo. Ele foi construído utilizando um fragmento de Xhol/HindIII de 1,272

2 0 kb do comprimento completo do promotor de gene de beta-actina

de pintainho (ID SEQ No: 2) inserido na cadeia principal do vetor pBR3 22 aberta de SalI/HinlII com o poliligante de EcoRI/NotI seguido por um sítio de poli A.

Um plasmídio modificado com intron-1 de pMHl (promotor de intron-l-actina-poliligante-poli A) (Figura 2) (ID SEQ No: 4) foi construído ao inserir 1,006 kb de Intron-1 modificado por adaptador de SalI/PstI a sítios de Sall/Pstl imediatamente a montante de uma seqüência de promotor de ação. Em seguida, um fragmento de espaçador de 0,331 kb

3 0 (intensificador de CMV sem promotor de CMV) foi inserido no

sítio de PstI entre Intron-1 e o promotor de actina na orientação de sentido.

Um plasmídio modificado com intron-1 de pMH2 10

(promotor de actina-poliligante-poli A-Intron-1) (Figura 3) (ID SEQ No: 5) foi construído ao inserir a seqüência de intron-1 de 1,006 kb modificada por adaptador de Psti/HindIII no sítio de Psti/HindIII imediatamente a jusante de uma seqüência de polisinal de A. Em seguida, um fragmento de espaçador de 0,331 kb (intensificador de CMV sem promotor de CMV) foi inserido no sítio de PstI entre Intron-1 e o promotor de actina na orientação de sentido.

Um plasmídio modificado com Intron-1 de pMH3 (promotor de intron-l-actina-poliligante-poli A-intron-1) (Figura 4) (ID SEQ No: 6) foi construído ao combinar os fragmentos de Pvul/Notl que contêm o promotor de actina de pMHl (ID SEQ No: 5) e os fragmentos de Pvul/Notl que contêm a cadeia principal de pBR322 de pMH2 (ID SEQ No: 4). Um plasmídio modificado com Intron-1 de pMH4

(promotor de pCMV-Intron-l-poliligante-poli A) (Figura 5) ID SEQ No:7) foi construído ao combinar uma seqüência de promotor de CMV de 0,82 kb amplificada por PCR com os sítios de Sall/Pstl e Psti/HindII e o fragmento de intron-1 modificado em conjunto. Ele foi então inserido no sítio de Sall/Hind III da cadeia principal do vetor pBR322 aberta de Sall/HindIII com o ligante de EcoRI/Notl seguido por um sítio de poli A.

Um plasmídio modificado com Intron-1 de pMH5 (promotor de pCMV-Intron-l-poliligante-poli A-Intron-1) (Figura 6) (ID SEQ No: 8) foi construído ao combinar os fragmentos de Pvul/Notl que contêm o promotor de actina de pMH4 (ID SEQ No: 7) e os fragmentos de Pvul/Notl que contêm a cadeia principal de pBR322 de pMH2 (ID SEQ No: 5). 3 0 Um plasmídio modificado com Intron-1 de pMH6

(promotor de pintron-l-CMV-Intron-l-poliligante-poli A- Intron-1) (Figura 7) (ID SEQ No: 9) foi construído ao inserir a seqüência de intron-1 de 1,006 kb modificada por SalI no 10

sítio de SalI imediatamente a montante de um promotor de CMV de pMH5 (promotor de pCMV-Intron-l-poliligante-poli A-Intron- 1) na orientação de sentido.

Um plasmídio modificado com Intron-I de pMH7 (promotor de plntron-l-PGK-poliligante-poli A) (Figura 8) (ID SEQ No: 10) foi construído ao inserir a seqüência de promotor de PGK amplificada por PCR de 0,572kb com os sítios de Psti/HindIII à cadeia principal do vetor pBR322 aberta de PstI/HIndIII seguido por um sítio de poli A. Uma seqüência de Intron-I com os sítios de Sall/PstI modificados por adaptador foi então inserida aos sítios de Sall/PstI imediatamente a montante do promotor de PGK.

Um plasmídio modificado com fragmento de DNA rico em GC (ID SEQ No: 13) de pMH8 (fragmento rico em pGC-promotor de actina-poliligante-poli A) (Figura 9) (ID SEQ No: 11) foi construído ao inserir um fragmento rico em GC sintético de 1,337 kb (ID SEQ No: 13) com os sítios de Sall/PstI aos sítios de Sall/PstI imediatamente a montante de uma seqüência de promotor de actina da cadeia principal do vetor pBR322 com o ligante de EcoRl/Notl seguido por um sítio de poli A.

Um plasmídio modificado com fragmento de DNA rico em GC (ID SEQ No. 13) de pMH9 (promotor de pActina- poliligante-poli Α-fragmento tico em GC) (Figura 10) (ID SEQ No: 12) foi construído ao inserir um fragmento rico em GC de 1,337 kb sintético modificado pelo adaptador de Psti/HindIII (ID SEQ No: 13) aos sítios de PstI/HindIII imediatamente a jusante de uma seqüência de polisinal de A.

Um c DNA que codifica o sítio de EcoRI-sítio de TNFR2-Fc-Not I (ID SEQ No. 14) foi removido de um vetor de plasmídio anterior (na casa) e inserido em sítios de EcoRI/Not I dos vetores de expressão de mamífero construídos acima mostrados nas Figuras 1-10 (ID SEQ No.: 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12) . Esses cDNAs de plasmídio foram linearizzados por Pvul e transfectados estavelmente a uma linhagem hospedeira parental de CHO de crescimento rápido utilizando um instrumento Gene Pulser (Bio-Rad). 0 gene resistente a neomicina ativado por promotor de PGK foi utilizado para a seleção estável de clones de células tanto através da co-transfecção quanto através da inserção do cassete de gene resistente a PGK-Neo-pA no sítio de SalI de cada vetor.

Os clones de células estáveis foram coletados em uma placa de 96 cavidades (NUNC). A transfecção foi repetida. Todas as expressões dos genes foram conduzidas em 0,1 ml de um meio sem soro recentemente adicionado a 37°C em uma incubadora de C02 na placa de 96 cavidades por três horas.

A expressão de TNFR2 -Fc de três horas no meio fresco sem soro foi detectada ao utilizar uma transferência de pontos ou Elisa. Os anticorpos do fragmento de Anti-IgGl Fc conjugados com HRP (PIERCE) foram utilizados para a ligação específica. 0 título da expressão do melhor clone das duas transfecções acima das placas de 2x96 cavidades foi utilizado para comparar o título da expressão de cada um dos construtos.

Resumidamente, os meios condicionais colhidos foram diluídos seriamente 0, 2, 4, 8, 16 e 32 vezes. Os meios condicionais diluídos foram sujeitados ao ensaio semi- quantitativo de transferência de pontos ao utilizar anti- soros anti humanos de Ig Fc conjugados com HRP (PIERCE) . Alternativamente, a microplaca de 96 cavidades para um ensaio Elisa padrão foi revestida ao utilizar 0,1 ml dos meios condicionais diluídos seguidos pela incubação com anti-soros 3 0 anti humanos de Ig Fc conjugados com HRP (PIERCE) , lavagem, desenvolvimento de cor e quantificação por uma leitora de microplacas. TNFR2-Fc disponível comercialmente (Enbrel) foi adicionado ao meio de cultura sem soro e utilizado como um padrão quantitativo.

Tabela 1

Vetor Figura/ID SEQ # de clones selecionados Título de expressão (pg/célula/dia) do melhor clone Controle Fig. 1 (ID SEQ No: 3) 96 χ 2 7 ± 2 pMH 1 Fig. 2 (ID SEQ NO: 4) 96 χ 2 53 ± 4 pMH 2 Fig. 3 (ID SEQ No: 5) 96 χ 2 52 ± 4 pMH 3 Fig. 4 (ID SEQ No: 6) 96 χ 2 67 ± 5 pMH4 Fig. 5 (ID SEQ No: 8) 96 χ 2 56 ± 3 pMH5 Fig. 6 (ID SEQ No: 8) 96 χ 2 60 ± 5 pMH6 Fig. 7 (ID SEQ No: 9) 96 χ 2 69 ± 7 pMH7 Fig. 8 (ID SEQ No: 10) 96 χ 2 45 ± 2 pMH8 Fig. 9 (ID SEQ No: 11) 96 χ 2 41 + 4 pMH9 Fig. 10 (ID SEQ NO: 12) 96 χ 2 39 ± 5 Os resultados na Ta bela 1 indicaram que este gene

intron-1 de beta actina de pintainho de 1.006 kb poderia ser utilizado como um elemento intensificador da expressão de gene comum ou uma seqüência de "pontos quentes" de expressão de gene no f lanço 5' ou 3' de um promotor da expressão de gene de mamífero para construir um novo vetor de expressão de mamífero ou reconstruir um vetor de expressão de gene de mamífero para a expressão de alto nível de proteínas recombinantes e a geração de linhagens de células de mamíferos produzindo um nível elevado de proteínas recombinantes. Os resultados também mostraram que é não somente um elemento intensificador mas também uma seqüência de "pontos quentes", uma vez que trabalha bem em todas as posições diferentes dos vetores de expressão. Além disso, mostrou que um fragmento rico em GC sintético também pode ser utilizado como um elemento intensificador de expressão de gene ou uma seqüência de "pontos quentes" no flanço 5' ou 31 de um promotor de expressão de gene de mamífero. Todos os títulos de expressão alcançaram ou excederam a extremidade elevada dos níveis industriais atuais (15-45 pg/célula/dia) , sugerindo um grande valor comercial destes vetores de expressão. Acredita-se que foi solucionada a expressão de gene de mamífero de uma vez e provavelmente identificado um método ou um mecanismo comum de toda a expressão do gene, ou seja, o uso de DNAs ricos em GC de ocorrência natural ou sintéticos com estrutura secundária forte como intensificadores ou seqüências de "pontos quentes" da expressão para a expressão de gene de mamífero altamente

constitutiva.

Tal como foi discutido anteriormente na presente invenção, as regiões reguladoras 5' de genes de plantas contêm freqüentemente um elevado teor rico em GC denominado ilhas de CpG. A expressão do gene da planta é freqüentemente constitutiva a níveis mais elevados. Os resultados na Tabela 1 indicaram que um intron-1 de ocorrência natural do gene de beta actina de pintainho com um teor rico em GC extremamente elevado e uma possível estrutura de DNA forte desempenhou um papel chave para a expressão do gene das células de CHO. Isto indicou que a procura por íntrons de elevado teor de GC ou intensificador de expressão ou isoladores para a expressão de genes eucarióticos será uma ferramenta universal para construir ou reconstruir vetores de expressão de gene eficazes. A outra opção consiste em sintetizar íntrons ricos em GC artificiais, "pontos quentes", intensificadores, promotores para construir e reconstruir vetores de expressão de gene eficazes ao seguir esse mecanismo comum.

Os resultados na Tabela 1 também indicaram que a integração de fragmentos de DNA sintéticos não específicos cora um elevado teor de GC e uma possível estrutura de DNA forte suportam o nível elevado da expressão de gene constitutivo em células de CHO, sugerindo intensificador da expressão de genes sintética futura ou modificada ou seqüências de "pontos quentes" como uma ferramenta universal para a construção de vetores de expressão de genes. Foi concluído que a seqüência de DNA altamente rico em GC poderia ser utilizada para construir ou para reconstruir vetores de expressão de genes como um método comum para a expressão elevada de genes. Muito provavelmente, o fragmento de DNA de elevado teor de GC com estrutura de DNA forte é um mecanismo universal que regula a condensação de cromatina e a formação de nucleosoma para o nível elevado de transcrição e expressão de genes.

A terminologia "fragmento rico em GC", tal como empregado por toda esta descrição (a menos que esteja especificado de alguma outra maneira) significa um pedaço de DNA (100-2.000 bp de comprimento), natural ou sintetizado, em que não menos de aproximadamente sessenta e oito por cento (68%) pelo número de bases é composto de citosina (C) e/ou guanina (g) , e mais preferivelmente oitenta por cento (80%) ou mais pelo número é composto de citosina e/ou guanina.

EXEMPLO 1: Arranjo em seqüência da região de flanço 5' do gene de beta actina de pintainho

A região de flanço 5' do gene de beta actina de pintainho era do Dr. N Fregien (ATCC 37507) (Fregien N and Davidson N, 1986) e arranjada em seqüência pelo fornecedor de serviço comercial. A seqüência completa é listada abaixo:

CACCGGTGTTATTGCTGCTCGGTGCGTGCATGCACATCAGTGTCGCTGCAGCTCAGTGCAT GCACGCTCATTGCCCATCGCTATCCCTGCCTCTCCTGCTGGCGCTCCCCGGGAGGTGACTT CAAGGGGACCGCAGGACCACCTCGGGGGTGGGGGGAGGGCTGCACACGCGGACCCCGCTCC CCCTCCCCAACAAAGCACTGTGGAATCAAAAAGGGGGGAGGGGGGATGGAGGGGCGCGTCA

30 CACCCCCGCCCCACACCCTCACCTCGAGGTGAGCCCCACGTTCTGCTTCACTCTCCCCATC TCCCCCCCCTCCCCACCCCCAATTTTGTATTTATTTATTTTTTAATTATTTTGTGCAGCGA TGGGGGCGGGGGGGGGGGGGGCGCGCGCCAGGCGGGGCGGGGCGGGGCGAGGGGCGGGGCG GGGCGAGGCGGAGAGGTGCGGCGGCAGCCAATCAGAGCGGCGCGCTCCGAAAGTTTCCTTT TATGGCGAGGCGGCGGCGGCGGCGGCCCTATAAAAAGCGAAGCGCGCGGCGGGCGGGAGTC GCTGCGTTGCCTTCGCCCCGTGCCCCGCTCCGCGCCGCCTCGCGCCGCCCGCCCCGGCTCT GACTGACCGCGTTACTCCCACAGGTGAGCGGGCGGGACGGCCCTTCTCCTCCGGGCTGTAA TTAGCGCTTGGTTTAATGACGGCTCGTTTCTTTTCTGTGGCTGCGTGAAAGCCTTAAAGGG CTCCGGGAGGGCCCTTTGTGCGGGGGGGAGCGGCTCGGGGGGTGCGTGCGTGTGTGTGTGC GTGGGGAGCGCCGCGTGCGGCCCGCGCTGCCCGGCGGCTGTGAGCGCTGCGGGCGCGGCGC GGGGCTTTGTGCGCTCCGCGTGTGCGCGAGGGGAGCGCGGCCGGGGGCGGTGCCCCGCGGT GCGGGGGGGCTGCGAGGGGAACAAAGGCTGCGTGCGGGGTGTGTGCGTGGGGGGGTGAGCA GGGGGTGTGGGCGCGGCGGTCGGGCTGTAACCCCCCCCTGCACCCCCCTCCCCGAGTTGCT GAGCACGGCCCGGCTTCGGGTGCGGGGCTCCGTGCGGGGCGTGGCGCGGGGCTCGCCGTGC CGGGCGGGGGGTGGCGGCAGGTGGGGGTGCCGGGCGGGGCGGGGCCGCCTCGGGCCGGGGA GGGCTCGGGGGAGGGGCGCGGCGGCCCCGGAGCGCCGGCGGCTGTCGAGGCGCGGCGAGCC GCAGCCATTGCCTTTTATGGTAATCGTGCGAGAGGGCGCAGGGACTTCCTTTGTCCCAAAT CTGGCGGAGCCGAAATCTGGGAGGCGCCGCCGCACCCCCTCTAGCGGGCGCGGGCGAAGCG GTGCGGCGCCGGCAGGAAGGAAATGGGCGGGGAGGGCCTTCGTGCGTCGCCGCGCCGCCGT CCCCTTCTCCATCTCCAGCCTCGGGGCTGCCGCAGGGGGACGGCTGCCTTCGGGGGGGACG GGGCAGGGCGGGGTTCGTCGGCGCCGGCGGGGTTTATATCTTCCCTTCTCTGTTCCTCCGC AGCCCCCAAGCTTCATCCTGAGCGCTAATCGGGTATTGTTCGGTTCCATTTAACCGAAGAA TTCATGCTAGCTCTGTTAGCCAATGCGGCCGCATAGATCTTTTTCCCTCTGCCAAAAATTA TGGGGACATCATGAAGCCCCTTGAGCATCTGACTTCTGGCTAATAAAGGAAATTTATTTTC ATTGCAATAGTGTGTTGGAATTTTTTGTGTCTCTCACTCGGAAGGACATATGGGAGGGCAA ATCATTTAAAACATCAGAATGAGTATTTGGTTTAGAGTTTGGCAACATATGCCCATATGCT

GGCTGC CATGAACAAAGGTTGGCTATAAAGAGGT CATCAGTATATGAAACAGCC C CCTGCT

GTCCATTCCTTATTCCATAGAAAAGCCTTGACTTGAGGTTAGATTTTTTTTATATTTTGTT TTGTGTTATTTTTTTCTTTAACATCCCTAAAATTTTCCTTACATGTTTTACTAGCCAGATT TTTCCTCCTCTCCTGACTACTCCCAGTCATAGCTGTCCCTCTTCTCTTATGGAGATCCCTC GACCTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTC CACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTA ACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAG CGGATCCGCATCTCAATTAGTCAGCAACCATAGTCCCGCCCCTAACTCCGCCCATCCCGCC CCTAACTCCGCCCAGTTCCGCCCATTCTCCGCCCCATGGCTGACTAATTTTTTTTATTTAT GCAGAGGCCGAGGCCGCCTCGGCCTCTGAGCTATTCCAGAAGTAGTGAGGAGGCTTTTTTG GAGGCCTAGGCTTTTGCAAAAAGCTAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAA AGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTT TGTCCAAACTCATCAATGTATCTTATCATGTCTGGATCCGCTGCATTAATGAATCGGCCAA CGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGC TGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTT ATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCC AGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGC AT CACAAAAATCGACGCT CAAGT CAGAGGTGGCGAAACC CGACAGGACTAT AAAGAT AC CA

GGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGA TACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGT ATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCA GCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGAC TTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTG CTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGAACAGTATTTGGTAT CTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAA CAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAA AAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAA CTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTA AATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTT ACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGT TGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGT GCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGC CAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTAT TAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTT GCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCG GTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTC CTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATG GCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTG AGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGC GTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAA CGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAAC CCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGC AAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATA CTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCG GATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCG

AAAAGTGCCACCTGG

EXEMPLO 2: Construção de vetores de expressão de

mamífero

0 comprimento completo do elemento regulador do flanço 51 do gene de beta actina de pintainho era do Dr. N Fregien (ATCC 37507) (Fregien N and Davidson N, 1986). Ele foi arranjado em seqüência e caracterizado pelo mapeamento de enzima de restrição e combinado com a seqüência publicada (Kost et al., 1983). Um fragmento do promotor do gene de actina de pintainho de 1,494 kb foi digerido por PstI e HindIII e purificado através de SDS de gel. Este fragmento do promotor de Psti/HindIII de 1,4 94 kb também foi digerido por HinfI para se obter 1,006 kb de Intron-1, e modificado utilizando um adaptador de PstI/Hinfl fosforilado para obter PstI na extremidade 5■ e HindIII na extremidade 3' do intron-

1 (SEQ NO: 1).

0 vetor de expressão à base do promotor de beta actina de pintainho nativo (Figura 1) (ID SEQ No: 3) foi construído ao inserir um fragmento de 1.272 kb de Xho I/Hind III de comprimento completo do elemento regulador do flanco 5' do gene de beta actina de pintainho que contém intron-1 (ID SEQ No: 2) em uma cadeia principal do vetor baseado em pBR3 22 aberta de SalI/HindIII com os sítios de EcoRI/Notl seguidos por um sítio de poli A para formar o Controle (promotor de actina-poliigante-poli A) (ID SEQ No: 3).

Um plasmídio de controle de promotor de pActina- poliligante-poli A (Figura 1) é um vetor de expressão à base de promotor de beta actina de pintainho nativo. Ele foi construído utilizando um fragmento de Xhol/HindIII de 1,272 kb de comprimento completo do promotor do gene de beta-actina de pintainho (ID SEQ No: 2) introduzido na cadeia principal do vetor de pBR322 aberta de SalI/HindIII com o poliligante de EcoRI/NotI seguido por um sítio de poli A.

Um plasmídio modificado por intron-1 de pMHl (promotor de lntron-1-actina-poliligante-poli A) (Figura 2) (ID SEQ No:4) foi construído ao inserir 1,006 kb de Intron-1 modificado por adaptador de Sall/PstI aos sítios de Sall/PstI

imediatamente a montante de uma seqüência de um promotor de ação. Em seguida, um fragmento de espaçador de 0,33Ikb (intensificador de CMV sem promotor de CMV) foi inserido no sítio de PstI entre Intron-1 e o promotor de actina na

orientação de sentido.

Um plasmídio modificado com intron-1 de pMH2

(promotor de actina-poliligante-poli A-Intron-1) (Figura 3) (ID SEQ No: 5) foi construído ao inserir a seqüência de intron-1 de 1,006 kb modificada pelo adaptador de PstI/HindIII ao sítio de Pstl/Hind III imediatamente a

2 0 jusante de uma seqüência de polisinal de A. Em seguida, um

fragmento de espaçador de 0,331 kb (intensificador de CMV sem promotor de CMV) foi inserido no sítio de PstI entre Intron-1 e o promotor de actina na orientação de sentido.

Um plasmídio modificado com Intron-1 de pMH3

(promotor de Intronl-actina-poliligante-poli A-intron-1) (Figura 4) (ID SEQ No: 6) foi construído ao combinar os fragmentos de PvuI/NotI que contêm o promotor de actina de pMHl (ID SEQ No: 5) e os fragmentos de Pvul/Notl que contêm a cadeia principal de pBR322 de pMH2 (ID SEQ No: 4).

3 0 Um plasmídio modificado com Intron-1 de pMH4

(promotor de pCMV-poliligante-poli A) (Figura 5) (ID SEQ No: 7) foi construído ao combinar uma seqüência de promotor de CMV de 0,82 kb amplificada por PCR com os sítios de Sall/PstI e fragmento de intron-1 modificado por PstI/HindII em conjunto. Ele foi então inserido no sítio de Sall/Hind III da cadeia principal do vetor de pBR322 aberta de SalI/HindIII com o ligante de EcoRl/Notl seguido por um sítio de poli A.

Um plasmídio modificado com Intron-1 de pMH5 (promotor de pCMV-Intron-1-poliligante-poli A-Intron-1) (Figura 6) (ID SEQ No: 8) foi construído ao combinar os fragmentos de Pvul/Notl que contêm o promotor de actina de pMH4 (ID SEQ No: 7) e os fragmentos de Pvul/Notl que contêm a cadeia principal de pBR322 de pMH2 (ID SEQ No: 5).

Um plasmídio modificado com Intron-1 de pMH6 (promotor de pintron-l-CMV-Intron-l-poliligante-poli A- Intron-1) (Figura 7) (ID SEQ No: 9) foi construído ao inserir a seqüência de intron-1- de 1,006 kb modificada por SaII no sítio de SaII imediatamente a montante de um promotor CMV de pMH5 (promotor de pCMV-Intron-1-poliligante-poli A-Intron-1)

na orientação de sentido.

Um plasmídio modificado com Intron-1 de pMH7 (promotor de plntron-l-PGK-poliligante-poli A) (Figura 8) (ID SEQ No: 10) foi construído ao inserir a sequênciade promotor de PGK amplificada por PCR de 0,572 kb com os sítios de PstI/HindlII à cadeia principal do vetor de pBR322 aberta de Psti/HIndIII com o ligante de EcoRI/Notl seguido por um sítio de poli A. Uma seqüência de Intron-1 com sítios modificados pelo adaptador de Sall/PstI foi então inserida aos sítios de Sall/Pstl imediatamente a montante do promotor de PGK.

Um plasmídio modificado por fragmento de DNA rico em GC (ID SEQ No: 13) de pMH8 (fragmento rico em GC-promotor de actina-poli ligante-poli A) (Figura 9) (ID SEQ No: 11) foi construído ao inserir um fragmento rico em GC sintético de 1,337 kb (ID SEQ No: 13) com sítios de Sall/Pstl a sítios de Sall/Pstl imediatamente a montante de uma seqüência de promotor de actina da cadeia principal do vetor de pBR322 com o ligante de EcoRI/Notl seguido por um sítio de poli A.

Um plasmídio modificado por fragmento de DNA rico em GC (ID SEQ No. 13) de pMH9 (promotor de pActina- poliligante-poli Α-fragmento rico em GC) (Figura 10) (ID SEQ No: 12) foi construído ao inserir o fragmento rico em GC de 1.337 kb sintético modificado por adaptador de PstI/HindIII (ID SEQ No: 13) nos sítios de PstI/HindIII a jusante de uma seqüência de polisinal de A.

EXEMPLO 3: Análise do teor de GC do gene intron-1

de beta actina de pintainho

0 gene intron-1 de beta actina de pintainho (ID SEQ

No: 1) é listado abaixo:

CTGCAGTGACTCGAGTCGCTGCGTTGCCTTCGCCCCGTGCCCCGCTCCGCGCCGCCTCGCG CCGCCCGCCCCGGCTCTGACTGACCGCGTTACTCCCACAGGTGAGCGGGCGGGACGGCCCT TCTCCTCCGGGCTGTAATTAGCGCTTGGTTTAATGACGGCTCGTTTCTTTTCTGTGGCTGC GTGAAAGCCTTAAAGGGCTCCGGGAGGGCCCTTTGTGCGGGGGGGAGCGGCTCGGGGGGTG CGTGCGTGTGTGTGTGCGTGGGGAGCGCCGCGTGCGGCCCGCGCTGCCCGGCGGCTGTGAG CGCTGCGGGCGCGGCGCGGGGCTTTGTGCGCTCCGCGTGTGCGCGAGGGGAGCGCGGCCGG GGGCGGTGCCCCGCGGTGCGGGGGGGCTGCGAGGGGAACAAAGGCTGCGTGCGGGGTGTGT GCGTGGGGGGGTGAGCAGGGGGTGTGGGCGCGGCGGTCGGGCTGTAACCCCCCCCTGCACC CCCCTCCCCGAGTTGCTGAGCACGGCCCGGCTTCGGGTGCGGGGCTCCGTGCGGGGCGTGG CGCGGGGCTCGCCGTGCCGGGCGGGGGGTGGCGGCAGGTGGGGGTGCCGGGCGGGGCGGGG CCGCCTCGGGCCGGGGAGGGCTCGGGGGAGGGGCGCGGCGGCCCCGGAGCGCCGGCGGCTG TCGAGGCGCGGCGAGCCGCAGCCATTGCCTTTTATGGTAATCGTGCGAGAGGGCGCAGGGA CTTCCTTTGTCCCAAATCTGGCGGAGCCGAAATCTGGGAGGCGCCGCCGCACCCCCTCTAG CGGGCGCGGGCGAAGCGGTGCGGCGCCGGCAGGAAGGAAATGGGCGGGGAGGGCCTTCGTG CGTCGCCGCGCCGCCGTCCCCTTCTCCATCTCCAGCCTCGGGGCTGCCGCAGGGGGACGGC TGCCTTCGGGGGGGACGGGGCAGGGCGGGGTTCGTCGGCGCCGGCGGGGTTTATATCTTCC

CTTCTCTGTTCCTCCGCAGCCCCCAAGCTT

As regiões de elevado teor de GC do gene intron-1 de beta actina de pintainho foram analisadas e resumidas na Tabela 2 abaixo. Tabela 2 Posições 1-100 200-300 330-430 520-650

Teor de GC 78,0% 82,0% 80,0% 90,8%

O teor extremamente elevado de GC até 90,8% foi identificado no intron-1 com um comprimento mínimo do DNA de 100 pares base. Este teor extremamente elevado de GC é incomum no genoma de mamíferos. Como isto tinha ocorrido através da evolução no genoma de pintainhos é desconhecido. Através de abordagem experimental, foi verificado que esta região tem uma estrutura secundária de DNA extremamente forte, o que foi evidenciado pela grande dificuldade de arranjar em seqüência, impossível para a leitura de PCR, e dificuldade de ligação. Foi concluído que o DNA genômico de GC altamente rico com estrutura de DNA forte pode manter o segredo do elevado nível constitutivo de toda a expressão de gene de mamífero através da regulação da condensação de cromatina, e da formação de nucleosoma, que regula a transcrição de gene. Foi então sintetizado um fragmento de DNA de 1337 pares base de elevado teor de GC não específico abaixo (ID SEQ No: 13) para a prova do conceito. Este fragmento de DNA rico em GC contém uma quantidade similar do teor de GC (ID SEQ No: 13) (Tabela 3) . Portanto, é útil testar a atividade do intensificador ou "pontos quentes" quando integrado em vetores de expressão de mamíferos.

Um fragmento de DNA de elevado teor de GC sintetizado é listado abaixo (ID SEQ No: 13):

GGGGGCTGCGGAGGAACAGAGAAGGGAAGATATAAACCCCGCCGGCGCCGACGAACCCCGC CCTGCCCCGTCCCCCCCGAAGGCAGCCGTCCCCCTGCGGCAGCCCCGAGGCTGGAGATGGA GAAGGGGACGGCGGCGCGGCGACGCACGAAGGCCCTCCCCGCCCATTTCCTTCCTGCCGGC GCCGCACCGCTTCGCCCGCGCCCGCTAGAGGGGGTGCGGCGGCGCCTCCCAGATTTCGGCT CCGCCAGATTTGGGACAAAGGAAGTCCCTGCGCCCTCTCGCACGATTACCATAAAAGGCAA TGGCTGCGGCTCGCCGCGCCTCGACAGCCGCCGGCGCTCCGGGGCCGCCGCGCCCCTCCCC CGAGCCCTCCCCGGCCCGAGGCGGCCCCGCCCCGCCCGGCACCCCCACCTGCCGCCACCCC CCGCCCGGCACGGCGAGCCCCGCGCCACGCCCCGCACGGAGCCCCGCACCCGAAGCCGGGC

750-830 80,0% CGTGCTCAGCAACTCGGGGAGGGGGGTGCAGGGGGGGGTTACAGCCCGACCGCCGCGCCCA CACCCCCTGCTCACCCCCCCACGCACACACCCCGCACGCAGCCTTTGTTCCCCTCGCAGCC CCCCCGCACCGCGGGGCACCGCCCCCGGCCGCGCTCCCCTCGCGCACACGCGGAGCGCACA AAGCCCCGCGCCGCGCCCGCAGCGCTCACAGCCGCCGGGCAGCGCGGGCCGCACGCGGCGC TCCCCACGCACACACACACGCACGCACCCCCCGAGCCGCTCCCCCCCGCACAAAGGGCCCT CCCGGAGCCCTTTAAGGCTTTCACGCAGCCACAGAAAAGAAACGAGCCGTCATTAAACCAA GCGCTAATTACAGCCCGGAGGAGAAGGGCCGTCCCGCCCGCTCACCTGTGGGAGTAACGCG GTCAGTCAGAGCCGGGGCGGGCGGCGCGAGGCGGCGCGGAGCGGGGCACGGGGCGAAGGCA ACGCAGCGACGTCGAGCTGCAGCGGCCGATCCCTTCCTGGGACTGGCCATGGCCAACTCAC TTCTGAACCCCATCATCTACACGCTCACCAACCGCGACCTGCGCCACGCGCTCCTGCGCCT GGTCTGCTGCGGACGCCACTCCTGCGGCAGAGACCCGAGTGGCTCCCAGCAGTCGGCGAGC GCGGCTGAGGCTTCCGGGGGCCTGCGCCGCTGCCTGCCCCCGGGCCTTGATGGGAGCTTCA GCGGCTCGGAGCGCTCATCGCCCCAGCGCGACGGGCTGGACACCAGCGGCTCCACAGGCAG CCCCGGTGCACCCACAGCCGCCCGGACTCTGGTATCAGAACCGGCTGCACTGCA

Regiões de elevado teor de GC deste fragmento de DNA rico era GC (ID SEQ No: 13) foram analisadas e resumidas na Tabela 3 abaixo.

Tabela 3

Posições 1-100 351-490 601-730 951-1100 1121-1335

Teor de GC 73,0% 88,6% 85,4% 68,7% 73,0%

Utilizando este fragmento de DNA rico em GC (ID SEQ No: 13), foram construídos pMH8 (fragmento rico em pGC- promotor de actina-poliligante-poli A) (Figura 9) (ID SEQ No: 11) e pMH9 (promotor de pActina-poliligante-poli A) (Figura 10) (ID SEQ No: 12) (vide o Exemplo 2) . Os resultados da expressão foram mostrados no EXEMPLO 4 e indicaram claramente que a sua atividade do intensificador forte ou do "pontos quentes" é similar àquela do gene intron-1 de beta actina de pintainho. Foi concluído que a seqüência de DNA rico em GC poderia ser utilizada para construir ou para reconstruir vetores de expressão de gene como um método comum para a expressão elevada de genes. Possivelmente, é um mecanismo universal que rege toda a expressão de genes eucarióticos. A terminologia "fragmento rico em GC", tal como empregado por toda esta descrição (a menos que esteja especificado de alguma outra maneira), significa uma porção de DNA (100-2.000 bp de comprimento), natural ou sintetizado, em que não menos de aproximadamente sessenta e oito por cento (68%) pelo número de bases é composto de citosina (C) e/ou guanina (G) , e mais preferivelmente oitenta por cento (80%) ou mais pelo número é composto de citosina e/ou guanina.

EXEMPLO 4: Expressão de TNFR2-Fc para comparar a resistência dos vetores de expressão

Um c DNA que codifica o sítio de EcoRI- sítio de TNFR2-Fc-Not I (ID SEQ No. 14) foi removido de um vetor de plasmídio anterior (na casa) e inserido em sítios de EcoRI/Not I dos vetores de expressão de mamíferos acima construídos mostrados nas Figuras 1-10 (ID SEQ No.: 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12) . Estes cDNAs de plasmídio foram linearizados por PvuI e transfectados estavelmente em uma linhagem hospedeira parental de CHO de crescimento rápido ao utilizar um instrumento Gene Pulser (Bio-Rad). 0 gene resistente a neomicina ativado por promotor de PGK foi utilizado para a seleção estável tanto através da co- transfecção quanto através da inserção do cassete de gene resistente a PGK-Neo-pA no sítio de SalI de cada vetor.

Os clones de células estáveis foram coletados em uma placa de 96 cavidades (NUNC). A transfecção foi repetida. Todas as expressões dos genes foram conduzidas em 0,1 ml de um meio sem soro recentemente adicionado a 37°C em uma incubadora de C02 na placa de 96 cavidades por três horas.

A expressão de TNFR2 - Fc de três horas no meio fresco sem soro foi detectada ao utilizar uma transferência de pontos ou Elisa. Os anticorpos do fragmento de Anti-IgGl Fc conjugados com HRP (PIERCE) foram utilizados para a ligação específica. 0 título da expressão do melhor clone das duas transfecções acima das placas de 2x96 cavidades foi utilizado para comparar o título da expressão de cada um dos construtos.

Resumidamente, os meios condicionais colhidos foram diluídos seriamente 0, 2, 4, 8, 16 e 32 vezes. Os meios condicionais diluídos foram sujeitados ao ensaio semi- quantitativo de transferência de pontos ao utilizar antisoros anti humanos de Ig Fc conjugados com HRP (PIERCE) . Alternativamente, a microplaca de 96 cavidades para um ensaio Elisa padrão foi revestida ao utilizar 0,1 ml dos meios condicionais diluídos seguidos pela incubação com antisoros anti humanos de Ig Fc conjugados com HRP (PIERCE) , lavagem, desenvolvimento de cor e quantificação por uma leitora de microplacas. TNFR2-Fc disponível comercialmente (Enbrel) foi adicionado ao meio de cultura sem soro e utilizado como um

padrão quantitativo.

Os resultados abaixo na Tabela 1 indicaram que este gene Intron-I de beta actina de pintainho de 1,006 kb poderia ser utilizado como um elemento intensificador da expressão de

2 0 gene ou uma seqüência de "pontos quentes" da expressão de

gene no f lanço 5' ou 3 · de um promotor de expressão de gene de mamífero para construir um novo vetor de expressão de mamífero ou modificar um vetor de expressão de gene existente para a expressão de nível elevado de proteínas recombinantes e a geração de linhagens de células de mamíferos produzindo um nível elevado de proteínas recombinantes.

Os resultados indicaram claramente que o intron-1 é não somente um elemento intensificador, mas também uma seqüência de "pontos quentes" de expressão de gene, uma vez

3 0 que trabalha bem em todas as posições diferentes dos vetores

de expressão.

Além disso, mostrou que um fragmento rico em GC sintético também pode ser utilizado como um elemento intensificador de expressão de gene ou uma seqüência de pontos quentes" de expressão de gene no flanço 5' ou 31 de um promotor de expressão de gene de mamífero.

Todos os títulos de expressão alcançaram ou excederam a extremidade elevada dos níveis industriais atuais (15-4 5 pg/célula/dia), sugerindo um grande valor comercial destes vetores de expressão. Acredita-se que tinha sido solucionada a expressão de gene de mamífero de uma vez por todas, e provavelmente identificado um mecanismo comum de toda a expressão de gene, ou seja, o uso de DNAs ricos em GC de ocorrência natural ou sintéticos com estrutura forte como intensificadores ou seqüências de "pontos quentes" de expressão para a expressão de gene de mamífero altamente constitutiva.

Tabela 1

Vetor Figura/ID SEQ # de clones selecionados Título de expressão (pg/célula/dia) do melhor clone Controle Fig. 1 (ID SEQ No: 3) 96 χ 2 7 ± 2 pMH 1 Fig. 2 (ID SEQ No: 4) 96 χ 2 53 ± 4 pMH 2 Fig. 3 (ID SEQ No: 5) 96 χ 2 52 ± 4 pMH 3 Fig. 4 (ID SEQ No: 6) 96 χ 2 67 ± 5 pMH4 Fig. 5 (ID SEQ No: 8) 96 χ 2 56 ± 3 pMH5 Fig. 6 (ID SEQ NO: 8) 96 χ 2 60 ± 5 pMH6 Fig. 7 (ID SEQ No: 9) 96 χ 2 69 ± 7 pMH7 Fig. 8 (ID SEQ No: 10) 96 x 2 45 ± 2 pMH8 Fig. 9 (ID SEQ No: 11) 96 x 2 41 ± 4 pMH9 Fig. 10 (ID SEQ No: 12) 96 X 2 39 ± 5

Tal como foi discutido anteriormente na presente invenção, as regiões reguladoras do gene 5' de plantas contêm freqüentemente um elevado teor rico em GC denominado ilhas de CpG. A expressão do gene da planta é freqüentemente constitutiva a níveis mais elevados. Os resultados na Tabela 1 indicaram que um gene intron-1 de gene de beta actina de pintainho de ocorrência natural com um teor rico em GC extremamente elevado e uma possível estrutura de DNA forte desempenhou um papel chave para a expressão do gene das células de CHO. Isto indicou que a procura por íntrons de elevado teor de GC ou intensificador de expressão ou isoladores para a expressão de gene de mamífero será uma ferramenta universal para a construção de vetores de expressão de gene eficazes. A outra opção consiste em sintetizar íntrons ricos em GC artificiais, "pontos quentes", intensificadores, promotores para vetores eficazes para construir e reconstruir a expressão de gene. Os resultados na Tabela 1 também indicaram que a integração de fragmentos de um DNA rico em GC sintético não específico suporta o nível elevado da expressão de gene constitutiva em células de CHO, sugerindo o uso futuro da seqüência de DNA rica em GC para o intensificador sintético da expressão de gene ou "pontos quentes" como uma ferramenta universal para a construção do vetor de expressão de gene. Muito provavelmente, o fragmento de DNA de elevado teor de GC com estrutura de DNA forte é um mecanismo universal que regula a condensação da cromatina e a formação de nucleosoma para o nível elevado da transcrição e

a expressão de genes.

EXEMPLO 5: Análise da resistência do promotor do

vetor de controle e pMH4

0 vetor de expressão baseado no promotor de beta actina de pintainho nativo (Figura 1) (ID SEQ No: 3) não era de algum modo suficientemente forte para satisfazer finalidades comerciais embora contivesse o intron-1 (ID SEQ No: 1). Desse modo, foi analisada a sua seqüência de promotor abaixo:

Seqüência de promotor de beta actina de pintainho

CTCGAGGTGAGCCCCACGTTCTGCTTCACTCTCCCCATCTCCCCCCCCTCCCCACCCCCAA TTTTGTATTTATTTATTTTTTAATTATTTTGTGCAGCGATGGGGGCGGGGGGGGGGGGGGC GCGCGCCAGGCGGGGCGGGGCGGGGCGAGGGGCGGGGCGGGGCGAGGCGGAGAGGTGCGGC GGCAGCCAATCAGAGCGGCGCGCTCCGAAAGTTTCCTTTTATGGCGAGGCGGCGGCGGCGG CGGCCCTATAAAAAGCGAAGCGCGCGGCGGGCGGGAGTCGCTGCGTTGCCTTCGCCCCGTG CCCCGCTCCGCGCCGCCTCGCGCCGCCCGCCCCGGCTCTGACTGACCGCGTTACTCCCACA

G

Ela contém somente uma caixa TATA e duas caixas CAAT do sítio de ligação do fator de transcrição. Claramente, não é um promotor forte típico. Portanto, o promotor de actina foi substituído por um promotor de CMV típico (pMH4) (Figura 5) (ID SEQ No: 7) . A seqüência do promotor de CMV utilizado é listada abaixo para a análise. Seqüência do promotor de CMV

ACGCGTCGACGGATCGGGAGATCTCCCGATCCCCTATGGTGCACTCTCAGTACAATCTGCT CTGATGCCGCATAGTTAAGCCAGTATCTGCTCCCTGCTTGTGTGTTGGAGGTCGCTGAGTA GTGCGCGAGCAAAATTTAAGCTACAACAAGGCAAGGCTTGACCGACAATTGCATGAAGAAT CTGCTTAGGGTTAGGCGTTTTGCGCTGCTTCGCGATGTACGGGCCAGATATACGCGTTGAC ATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATA TATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGAC CCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCC ATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTA TCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTAT GCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCG CTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTC ACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAAT CAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGC GTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCTCTGGCTAACTAGAGAACCCACTGCTTA CTGGCTTATCGAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCCAAGCTGGCTAGCGTTTAAAC TCTGCAGAACCAATGCATTGGAT Duas caixas TATA e dez caixas CAAT são descobertas. Não somente os números das caixas CAAT aumentaram quando comparados com o promotor de actina, mas também aumentou a distância entre essas caixas CAAT e a região de intron-1 rica em GC. A distância aumentada pode tornar a ligação do fator de transcrição mais eficiente evitando a estrutura forte formada por intron-1 rico em GC.

A Tabela 1 mostra o aumento de oito vezes da expressão de gene. Isto sugeriu que o promotor de beta actina de pintainho foi de algum modo mutado até a resistência atual durante o processo da evolução muito embora contivesse o elemento intensificador mais forte, ou seja, intron-1, conhecido até a presente data. 0 uso de intron-1 de beta actina de pintainho isolado de comprimento completo do promotor do gene de beta actina é uma chave para a construção e a reconstrução de vetores de expressão de mamíferos para a produção de proteínas recombinantes.

EXEMPLO 6: Uso do sítio de poli A da região de

flanço 3'

A adição de intron-1 na região de flanço 3" do sítio de poli A (pMH3) (Figura 4) aumentou a expressão do gene significativamente quando comparada com o controle (Tabela 1). Esta localização do intron-1 é muito distante da seqüência do promotor de actina, uma vez que há um gene de codificação TNFR2-Fc recombinante e uma seqüência intermediária. Muito provavelmente, o intron-1 não é somente um elemento intensificador, mas também uma seqüência de "pontos quentes". Ele aumenta o nível da expressão de gene através de sua estrutura de DNA rica em GC, o que abre a estrutura de DNA genômico ou de cromatina para aumentar a acessibilidade de fatores de transcrição nuclear.

Claims (39)

1. VETOR DE EXPRESSÃO PARA SER UTILIZADO NA PRODUÇÃO RECOMBINANTE DE UM POLIPEPTÍDEO EM UMA CÉLULA DE MAMÍFERO, caracterizado pelo fato de compreender (a) uma seqüência de promotor de mamífero, (b) uma seqüência de DNA que codifica um polipeptídeo recombinante, (c) um sítio de poli A, e (d) um fragmento de DNA rico em GC que intensifica a expressão do polipeptídeo.

2. VETOR DE EXPRESSÃO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o fragmento rico em GC é fundido à região de flanqueio 5' da seqüência de promotor de mamífero.

3. VETOR DE EXPRESSÃO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o fragmento rico em GC é fundido à região de flanqueio 3' da seqüência de promotor de mamífero.

4. VETOR DE EXPRESSÃO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o fragmento rico em GC é fundido à região de flanqueio 3' de um sítio de poli A de um vetor de mamífero da expressão.

5 . MÉTODO PARA A PRODUÇÃO RECOMBINANTE DE UM POLIPEPTÍDEO, caracterizado pelo fato de compreender a expressão do polipeptídeo em uma célula de mamífero nas condições de crescimento de células de alta densidade sob o controle de um vetor de expressão que compreende (a) uma seqüência de promotor de mamífero, (b) uma seqüência de DNA que codifica um polipeptídeo recombinante, (c) um sítio de poli A, e (d) um fragmento de DNA rico em GC que intensifica a expressão do polipeptídeo.

6. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o fragmento rico em GC do vetor de expressão é fundido à região de flanqueio 5 1 da seqüência de promotor de mamífero.

7. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o fragmento rico em GC do vetor de expressão é fundido à região de f lanqueio 3 ' da seqüência de promotor de mamífero.

8. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o fragmento rico em GC é fundido à região de f lanqueio 3 ' de um sítio de poli A de um vetor de expressão de mamífero.

9 . MÉTODO PARA MELHORAR A EFICÁCIA DE UM VETOR DE EXPRESSÃO DO GENE, caracterizado pelo fato de compreender a inclusão no vetor de um intron 1 de beta actina de pintainho ou o equivalente funcional do mesmo.

10. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o equivalente funcional do intron 1 de beta actina de pintainho é um fragmento rico em GC.

11. VETOR DE EXPRESSÃO PARA SER UTILIZADO NA PRODUÇÃO RECOMBINANTE DE UM POLIPEPTÍDEO EM UMA CÉLULA DE MAMÍFERO, caracterizado pelo fato de compreender (a) um intron 1 de beta actina de pintainho, ou o equivalente funcional do mesmo, fundido à região de flanqueio de uma seqüência de promotor de mamífero, (b) uma seqüência de gene que codifica um polipeptídeo recombinante, (c) um sítio de poli A, (d) um intron 1 de beta actina de pintainho, ou o equivalente funcional do mesmo, e (e) uma cadeia principal do vetor pBR322.

12. VETOR DE EXPRESSÃO, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que os equivalentes funcionais para os elementos (a) e (d) são fragmentos de DNA ricos em GC.

13. VETOR DE EXPRESSÃO, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o intron 1 de beta actina de pintainho do elemento (a) , ou seu equivalente funcional, é fundido à região de flanqueio 5' de uma seqüência de promotor de mamífero.

14. VETOR DE EXPRESSÃO, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o intron 1 de beta actina de pintainho do elemento (a) , ou seu equivalente funcional, é fundido à região de flanqueio 3' de uma seqüência de promoter de mamífero ou a jusante da seqüência de poli A.

15. VETOR DE EXPRESSÃO, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o intron 1 de beta actina de pintainho do elemento (a) , ou seu equivalente funcional, é fundido à região de flanqueio 3' de um sítio de poli A de um vetor de expressão de mamífero.

16. VETOR DE EXPRESSÃO, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de incluir a seqüência SEQ ID NO: 4.

17. VETOR DE EXPRESSÃO, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de incluir a seqüência SEQ ID NO: 5.

18. VETOR DE EXPRESSÃO, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de incluir a seqüência SEQ ID NO: 6.

19. VETOR DE EXPRESSÃO, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de compreender a seqüência SEQ ID NO: 7.

20. VETOR DE EXPRESSÃO, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de compreender a seqüência SEQ ID NO: 8.

21. VETOR DE EXPRESSÃO, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de compreender a seqüência SEQ ID NO: 9.

22. VETOR DE EXPRESSÃO, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de compreender a seqüência SEQ ID NO: 10.

23. VETOR DE EXPRESSÃO, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de compreender a seqüência SEQ ID NO: 11.

24. VETOR DE EXPRESSÃO, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de compreender a seqüência SEQ ID NO: 12.

25. MÉTODO PARA A PRODUÇÃO RECOMBINANTE DE UM POLIPEPTÍDEO, caracterizado pelo fato de compreender a expressão do polipeptídeo em uma célula de mamífero nas condições de crescimento de células de alta densidade sob o controle de um vetor de expressão que compreende (a) um intron 1 de beta actina de pintainho, ou o equivalente funcional do mesmo, fundido à região de flanqueio de uma seqüência de promotor de mamífero, (b) uma seqüência de gene que codifica um polipeptídeo recombinante, (c) um sítio de poli A, (d) um intron 1 de beta actina de pintainho, ou o equivalente funcional do mesmo, e (e) uma cadeia principal do vetor pBR322.

26. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que os equivalentes funcionais para os elementos (a) e (d) são fragmentos de DNA ricos em GC.

27. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que o intron 1 de beta actina de pintainho do elemento (a) , ou o equivalente funcional do mesmo, é fundido à região de flanqueio 5' da seqüência de promotor de mamífero do vetor de expressão.

28. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que o intron 1 de beta actina de pintainho do elemento (a) , ou o equivalente funcional do mesmo, é fundido à região de flanqueio 3' da seqüência de promotor de mamífero para o vetor de expressão.

29. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que o intron 1 de beta actina de pintainho do elemento (a) , ou o equivalente funcional do mesmo, é fundido à região de flanqueio 3' de um sitio de poli A de um vetor de expressão de mamífero.

30. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que o vetor de expressão inclui a seqüência SEQ ID NO: 4.

31. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que o vetor de expressão inclui a seqüência SEQ ID NO: 5.

32. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que o vetor de expressão inclui a seqüência SEQ ID NO: 6.

33. MÉTODO, de acordo com caracterizado pelo fato de que o compreende a seqüência SEQ ID NO: 7.

34. MÉTODO, de acordo com caracterizado pelo fato de que o compreende a seqüência SEQ ID NO: 8.

35. MÉTODO, de acordo com caracterizado pelo fato de que o compreende a seqüência SEQ ID NO: 9.

36. MÉTODO, de acordo com caracterizado pelo fato de que o compreende a seqüência SEQ ID NO: 10.

37. MÉTODO, de acordo com caracterizado pelo fato de que o compreende a seqüência SEQ ID NO: 11.

38. MÉTODO, de acordo com caracterizado pelo fato de que o compreende a seqüência SEQ ID NO: 12.

39. MÉTODO PARA INTENSIFICAR O DESEMPENHO DE UM a reivindicação 25, vetor de expressão a reivindicação 25, vetor de expressão a reivindicação 25, vetor de expressão a reivindicação 25, vetor de expressão a reivindicação 25, vetor de expressão a reivindicação 25, vetor de expressão VETOR DE EXPRESSÃO EXISTENTE, para ser utilizado na produção recombinante de um polipeptídeo em uma célula de mamífero, caracterizado pelo fato de compreender a introdução no dito vetor do intron 1 de beta actina de pintainho, ou o equivalente funcional do mesmo, na região de flanqueio de um promotor ou sítio de poli A existente.