BRPI0719323A2 - Anticorpos antiproliferação - Google Patents

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "ANTICOR- POS ANTIPROLIFERAÇÃO".

A presente invenção refere-se a novos anticorpos, em particular, anticorpos monoclonais murinos, quiméricos e humanizados, capazes de inibir o crescimento tumoral, bem como as seqüências de aminoácido e áci- dos nucleicos para codificação de tais anticorpos. A partir de um aspecto, a invenção refere-se a novos anticorpos, compostos derivados ou fragmentos funcionais, capazes de inibir a proliferação de células tumorais. A invenção também compreende o uso de tais anticorpos como um fármaco para trata- mento preventivo e/ou terapêutico de cânceres, bem como nos procedimen- tos ou conjuntos relacionados ao diagnóstico de câncer. Finalmente, a in- venção compreende composições compreendendo tais anticorpos em com- binação com outros compostos anticâncer, tais como anticorpos, ou conju- gadas com toxinas, e uso das mesmas para o tratamento e/ou prevenção de certos cânceres.

Geralmente, o critério de escolha para a produção de anticorpos monoclonais é o reconhecimento do imunógeno identificado como um alvo potencial de um tratamento. Na prática, camundongos são imunizados com uma proteína recombinante que corresponde ao imunógeno e, após os anti- corpos monoclonais produzidos pelo camundongo são recuperados, são primeiro selecionados pela sua capacidade de reconhecer o imunógeno de uma maneira específica. Em uma segunda etapa, os anticorpos seleciona- dos dessa forma são testados in vivo e in vitro a fim de determinar sua ativi- dade bem como suas propriedades e/ou mecanismos de ação.

Esta abordagem "tradicional", mesmo que se torne possível sa- ber o alvo funcional desde o início, muitas vezes gera um grande número de anticorpos que são certamente capazes de reconhecer especificamente um dado alvo, mas que in vivo não exibe atividade biológica significante. No campo de câncer, de fato conhece-se que, mesmo se um anticorpo produzir bons resultados in vitro, este não significa inevitavelmente que tal anticorpo mostrará posteriormente atividade antitumoral autêntica in vivo.

A presente invenção diferencia-se desta forma de procedimento, e até vai contra o mencionado acima, uma vez que é baseado em uma a- bordagem "funcional", e mais particularmente na seleção primária baseada na função procurada no anticorpo e não no antígeno reconhecido.

Mais particularmente, os inventores selecionaram uma dada fun- ção, ou seja, a inibição da proliferação basal, não-induzida, da célula, como um parâmetro de seleção de anticorpo.

O método de produção usado será descrito mais detalhadamen- te nos exemplos abaixo.

De um modo surpreendente, através desta abordagem funcional, os inventores produziram e selecionaram um anticorpo capaz de inibir in vi- tro e/ou in vivo, de uma maneira significante, a proliferação de células tumo- rais.

De acordo com um primeiro aspecto, a invenção relaciona-se a um anticorpo isolado, ou um composto derivado ou fragmento funcional do mesmo, capaz de inibir a proliferação de células tumorais in vitro e/ou in vi- vo; o dito anticorpo, ou um composto derivado ou fragmento funcional do mesmo, compreendendo pelo menos uma CDR escolhida entre as regiões determinantes de complementaridade (CDRs) de seqüências SEQ ID N0 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 ou pelo menos uma CDR cuja seqüência tem identidade de pelo menos 80%, preferencialmente 85%, 90%, 95% e 98% após o alinha- mento ótimo com as seqüências SEQ ID N0 1, 2, 3, 4, 5 ou 6.

Um "fragmento funcional" de um anticorpo significa, em particu- lar, um fragmento de anticorpo, tal como fragmentos Fv1 scFv (sc=cadeia simples), Fab, F(ab')2, Fab', scFv-Fc ou diacorpos, ou qualquer fragmento cuja meia-vida foi aumentada. Tais fragmentos funcionais serão descritos detalhadamente após o presente relatório descritivo.

Um "composto derivado" de um anticorpo significa, em particu- lar, uma proteína de ligação composta de uma estrutura peptídica e pelo menos uma das CDRs do anticorpo original para preservar sua capacidade de ser reconhecido. Tais compostos derivados, bem-conhecidos para uma pessoa versada na técnica, serão descritos mais detalhadamente após o presente relatório descritivo. Mais preferencialmente, a invenção compreende os anticorpos, seus compostos derivados ou seus fragmentos funcionais, de acordo com a presente invenção, especialmente quiméricos ou humanizados, obtidos atra- vés de recombinação genética ou síntese química.

De acordo com uma modalidade preferencial, o anticorpo de a- cordo com a invenção, ou seus compostos derivados ou fragmentos funcio- nais, é caracterizado pelo fato de que consiste em um anticorpo monoclonal.

Por "anticorpo monoclonal" entende-se que resulta de uma po- pulação de anticorpo quase homogênea. Mais particularmente, os anticorpos individuais de uma população são idênticos exceto por um número reduzido de mutações que ocorrem naturalmente possíveis que podem ser encontra- das em proporções mínimas. Em outras palavras, um anticorpo monoclonal consiste em um anticorpo homogêneo que resulta do crescimento de um clone de célula única (por exemplo, um hibridoma, uma célula hospedeira eucariótica transfectada com uma molécula de DNA de codificação do anti- corpo homogêneo, uma célula hospedeira procariótica transfectada com uma molécula de DNA de codificação do anticorpo homogêneo, etc.) e é ge- ralmente caracterizado por cadeias pesadas de uma e só uma classe e sub- classe, e cadeias leves de só um tipo. Anticorpos monoclonais são altamen- te específicos e são direcionados contra um antígeno único. Além disso, em contraste com preparações de anticorpos policlonais que tipicamente inclu- em vários anticorpos direcionados contra vários determinantes, ou epitopos, cada anticorpo monoclonal é direcionado contra um epitopo único do antíge- no.

Deve ser entendido aqui que a invenção não se relaciona a anti- corpos na forma natural, isto é, não são tomados a partir do seu ambiente naturai mas são isolados ou obtidos pela purificação de fontes naturais ou obtidos por recombinação genética ou síntese química e dessa forma podem transportar aminoácidos não-naturais como será descrito abaixo.

Mais particularmente, de acordo com uma modalidade preferen- cial da invenção, o anticorpo, ou seus compostos derivados ou fragmentos funcionais, é caracterizado pelo fato de que compreende uma cadeia leve compreendendo pelo menos uma CDR escolhida entre as CDRs de seqüên- cias de aminoácido SEQ ID N0 1, 3 ou 5, ou pelo menos uma CDR cuja se- qüência tenha identidade de pelo menos 80%, preferencialmente 85%, 90%, 95% e 98% após o alinhamento ótimo com as seqüências SEQ ID N0 1, 3 ou 5; ou compreende uma cadeia pesada compreendendo pelo menos uma CDR escolhida entre as CDRs de seqüências de aminoácido SEQ ID N0 2, 4 ou 6, ou pelo menos uma CDR cuja seqüência tenha identidade de pelo me- nos 80%, preferencialmente 85%, 90%, 95% e 98% após o alinhamento óti- mo com as seqüências SEQ ID N0 2, 4 ou 6.

Mais particularmente, os anticorpos da invenção, ou um de seus compostos derivados ou fragmentos funcionais, são caracterizados pelo fato de que compreendem uma cadeia pesada compreendendo pelo menos uma das três CDRs das seqüências SEQ ID N0 2, 4 e 6, ou pelo menos uma se- qüência com identidade de pelo menos 80%, preferencialmente 85%, 90%, 95% e 98% após o alinhamento ótimo com as seqüências SEQ ID N0 2, 4 ou 6.

Ainda mais preferencialmente, os anticorpos da invenção, ou um de seus compostos derivados ou fragmentos funcionais, são caracterizados pelo fato que compreendem uma cadeia pesada compreendendo as três CDRs seguintes, respectivamente CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3, em que:

- CDR-H1 compreende a seqüência SEQ ID N0 2, 7 ou 9, ou uma seqüência com identidade de pelo menos 80% após o alinhamento óti- mo com a seqüência SEQ ID N0 2, 7 ou 9;

- CDR-H2 compreende as seqüências SEQ ID N0 4 ou 11, ou uma seqüência com identidade de pelo menos 80% após o alinhamento óti- mo com a seqüência SEQ ID N0 4 ou 11; e

- CDR-H3 compreende as seqüências SEQ ID N0 6 ou 12, ou uma seqüência com identidade de pelo menos 80% após o alinhamento óti- mo com a seqüência SEQ ID N0 6 ou 12.

De acordo com uma modalidade particular, anticorpos, ou um dos seus compostos derivados ou fragmentos funcionais, são caracterizados pelo fato de que compreendem uma cadeia pesada compreendendo a CDR- H1 da seqüência SEQ ID N0 7, a CDR-H2 da seqüência SEQ ID N0 4 e a CDR-H3 da seqüência SEQ ID N0 12.

De acordo com outra modalidade particular, anticorpos, ou um dos seus compostos derivados ou fragmentos funcionais, são caracterizados pelo fato de que compreendem uma cadeia pesada compreendendo a CDR- H1 da seqüência SEQ ID N0 9, a CDR-H2 da seqüência SEQ ID N0 11 e a CDR-H3 da seqüência SEQ ID N0 6.

De acordo com outra modalidade, os anticorpos da invenção, ou um de seus compostos derivados ou fragmentos funcionais, são caracteriza- dos pelo fato de que compreendem uma cadeia leve compreendendo pelo menos uma das três CDRs das seqüências SEQ ID Nos. 1, 3 e 5, ou pelo menos uma seqüência com identidade de pelo menos 80%, preferencial- mente 85%, 90%, 95% e 98% após o alinhamento ótimo com seqüências SEQ ID N0 1,3 ou 5.

De uma maneira preferencial, os anticorpos da invenção, ou um de seus compostos derivados ou fragmentos funcionais, são caracterizados pelo fato de que compreendem uma cadeia leve compreendendo as três CDRs seguintes, respectivamente, CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3, em que:

- CDR-L1 compreende a seqüência SEQ ID N0 1 ou 8, ou uma seqüência com identidade de pelo menos 80% após o alinhamento ótimo com a seqüência SEQ ID N0 1 ou 8;

- CDR-L2 compreende as seqüências SEQ ID N0 3 ou 10, ou uma seqüência com identidade de pelo menos 80% após o alinhamento óti- mo com a seqüência SEQ ID N0 3 ou 10; e

- CDR-L3 compreende a seqüência SEQ ID N0 5, ou uma se- qüência com identidade de pelo menos 80% após o alinhamento ótimo com a seqüência SEQ ID N0 5.

De acordo com uma modalidade particular, anticorpos, ou um de seus compostos derivados ou fragmentos funcionais, são caracterizados pelo fato de que compreendem uma cadeia leve compreendendo a CDR-L1 da seqüência SEQ ID N0 1, a CDR-L2 da seqüência SEQ ID N0 3 e a CDR- L3 da seqüência SEQ ID N0 5. De acordo com outra modalidade particular, anticorpos, ou um de seus compostos derivados ou fragmentos funcionais, são caracterizados pelo fato de que compreendem uma cadeia leve compreendendo a CDR-L1 da seqüência SEQ ID N0 8, a CDR-L2 da seqüência SEQ ID N0 10 e a CDR- L3 da seqüência SEQ ID N0 5. No presente relatório descritivo, os termos "polipeptídeos", "seqüências polipeptídicas", "peptídeos" e "proteína ligadas a compostos de anticorpo ou às suas seqüências" são intercambiáveis.

Deve ser entendido aqui que a invenção não se relaciona a anti- corpos na forma natural, isto é, não são tomados a partir do seu ambiente natural, mas são isolados ou obtidos através da purificação de fontes natu- rais ou obtidos por recombinação genética ou síntese química e dessa forma podem transportar aminoácidos não-naturais como será descrito abaixo.

Em uma primeira modalidade, região determinante de comple- mentaridade, ou CDR, significa as regiões hipervariáveis das cadeias pesa- das e leves de imunoglobulinas como definido por Kabat et al. (Kabat et ai, Sequences of proteins of immunological interest, 5th Ed., U.S. Department of Health and Human Services, NIH, 1991, and Iater editions). Há três cadeias pesadas CDRs e três cadeias leves CDRs. Aqui, os termos "CDR" e "CDRs" são usados para indicar, dependendo do caso, um ou mais, ou mesmo todas as regiões que contêm a maioria dos resíduos de aminoácido responsáveis pela afinidade de ligação do anticorpo ao antígeno ou epitopo que reconhe- ce.

Em uma segunda modalidade, através de regiões CDR ou C- DR(s), destina-se a indicar as regiões hipervariáveis das cadeias pesadas e leves das imunoglobulinas como definido por IMGT.

A numeração única IMGT foi definida para comparar os domí- nios variáveis quaisquer que sejam o receptor de antígeno, o tipo de cadeia, ou as espécies [Lefranc M.-P., Immunology Today 18, 509 (1997) / Lefranc M.-P., The Immunologist, 7, 132-136 (1999) / Lefranc, M.-P., Pommie, C, Ruiz, M., Giudicelli, V., Foulquier, E., Truong, L., Thouvenin-Contet, V. e Le- franc, Dev. Comp. Imunol, 27, 55-77 (2003)]. Na numeração única IMGT, os aminoácidos conservados sempre têm a mesma posição, por exemplo, ciste- ína 23 (1a CYS), aminoácido triptofano 41 (TRP-CONSERVADO), aminoáci- do hidrofóbico 89, cisteína 104 (2a CYS), fenilalanina ou triptofano 118 (J- PHE ou J-TRP). A numeração única IMGT fornece uma delimitação padroni- zada de regiões de estrutura conservada (FR1-IMGT: posições 1 a 26, FR2- IMGT: 39 a 55, FR3-IMGT: 66 a 104 e FR4-IMGT: 118 a 128) e das regiões determinantes de complementaridade: CDR1-IMGT: 27 a 38, CDR2-IMGT: 56 a 65 e CDR3-IMGT: 105 a 117. Como as lacunas representam posições desocupadas, os tamanhos CDR-IMGT (mostrado entre colchetes e separa- do por pontos, por exemplo, [8.8.13]) tornam-se a informação crucial. A nu- meração única IMGT é usada em representações gráficas 2D, indicadas como IMGT Colliers de Perles [Ruiz, M. e Lefranc, M.-P., Imumunogenetics, 53, 857-883 (2002) / Kaas, Q. e Lefranc, M.-P., Current Bioinformatics, 2, 21- (2007)], e em estruturas 3D em IMGT/3Dstructure-DB [Kaas, Q., Ruiz, M. and Lefranc, M.-P., T cell receptor and MHC structural data. Nucl. Acids. Res., 32, D208-D210 (2004)].

Três cadeias pesadas CDRs e 3 cadeias leves CDRs existem. O terma CDR ou CDRs é usado aqui a fim de indicar, de acordo com o caso, uma ou mais destas regiões, ou até o total destas regiões que contêm a maioria dos resíduos de aminoácido responsáveis pela ligação por afinidade do anticorpo a um antígeno ou epitopo que reconhece.

Para mais clareza, deve ser entendido que no relatório descritivo seguinte, e mais particularmente na tabela 2 e 3, as CDRs serão definidas pela numeração IMGT, numeração kabat e pela numeração comum.

A numeração comum reagrupa a parte de resíduos de cada CDR que são comuns as CDRs como definidas pelos sistemas de numera- ção IMGT e Kabat.

O sistema de numeração IMGT define as CDRs de acordo com o sistema IMGT como acima definido ao passo que o sistema de numeração Kabat define as CDRs de acordo com o sistema kabat como acima definido. Mais particularmente, CDR-L1 consiste na SEQ ID N0 1

(QDINNY) nos sistemas de numeração comum e IMGT e de SEQ ID N0 8 (KASQDINNYIA) no sistema de numeração kabat. Com relação a CDR-L2, consiste na SEQ ID N0 3 (YTS) nos sis- temas de numeração comum e IMGT e de SEQ ID N0 10 (YTSTLQA) no sis- tema de numeração kabat.

A CDR-L3 consiste na SEQ ID N0 5 (LQYDNLWT) para cada um dos três sistemas de numeração.

Para a cadeia pesada, a CDR-H1 consiste na SEQ ID N0 2 (TDYS) no sistema de numeração comum, de SEQ ID N0 7 (GYSFTDYS) no sistema de numeração IMGT e de SEQ ID N0 9 (TDYSMY) no sistema de numeração kabat.

1O A CDR-H2 consiste em SEQ ID N0 4 (IDPYNGGT) nos sistemas

de numeração comum e IMGT e de SEQ ID N0 11 (YIDPYNGG- TRYNQKFKG) no sistema de numeração kabat.

Finalmente, a CDR-H3 consiste na SEQ ID N0 6 (QTDYFDY) nos sistemas de numeração comum e kabat ao passo que consiste em SEQ ID N0 12 (ARQTDYFDY) no sistema de numeração IMGT.

No sentido da presente invenção, "porcentagem de identidade" entre duas seqüências de ácidos nucleicos ou aminoácidos significa a por- centagem de nucleotídeos ou resíduos de aminoácido idênticos entre as du- as seqüências a serem comparadas, obtida após o alinhamento ótimo, esta porcentagem que é puramente estatística e as diferenças entre as duas se- qüências que são distribuídas randomicamente ao longo do seu tamanho. A comparação de duas seqüências de ácidos nucleicos ou aminoácidos é tra- dicionalmente realizada através da comparação das seqüências após tê-las alinhado mais eficientemente, a dita comparação que é capaz de ser condu- zida pelo segmento ou pelo uso de uma "janela de alinhamento". O alinha- mento ótimo das seqüências para comparação pode ser realizado, além da comparação a mão, por meio do algoritmo de homologia locai de Smith e Waterman (1981) [Add. App. Math. 2:482], por meio do algoritmo de homo- logia local de Neddleman e Wunsch (1970) [J. Mol. Biol. 48:443], por meio do método de busca de similaridade de Pearson e Lipman (1988) [Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85:2444] ou por meio de programa de computador usando estes algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA e TFASTA em Wiscosin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison1 Wl, ou pelo programa de comparação BLAST NR ou BLAST P).

A porcentagem de identidade entre duas seqüências de ácidos nucleicos ou aminoácidos é determinada pela comparação de duas sequên- cias mais eficientemente alinhadas nas quais a seqüência de ácido nucleico ou aminoácidos para comparação podem ter adições ou deleções compara- das à seqüência de referência do alinhamento ótimo entre as duas seqüên- cias. Porcentagem de identidade é calculada através da determinação do número de posições nas quais o resíduo de aminoácido ou nucleotídeo é idêntico entre as duas seqüências, dividindo o número de posições idênticas pelo número total de posições na janela de alinhamento e multiplicando o resultado por 100 para obter a porcentagem de identidade entre as duas se- qüências.

Por exemplo, o programa BLAST1 "BLAST 2 sequences" (Tatu- sova et ai, "Blast 2 sequences - a new tool for comparing protein and nucle- otide sequences", FEMS Microbiol, 1999, Lett. 174:247-250) disponível no sítio http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/bl2.html, pode ser usado com os parâ- metros padrão (especialmente para os parâmetros "penalidade de abertura de lacuna ": 5, e "penalidade de extensão de lacuna ": 2; a matriz seleciona- da que é por exemplo a matriz "BLOSUM 62" proposta pelo programa); a porcentagem de identidade entre as duas seqüências para comparação é calculada diretamente pelo programa.

Para a seqüência de aminoácidos exibindo pelo menos identida- de de 80%, preferencialmente 85%, 90%, 95% e 98% com uma seqüência de aminoácidos de referência, exemplos preferenciais incluem aqueles con- tendo a seqüência de referência, certas modificações, especialmente uma deleção, adição ou substituição de peio menos um aminoácido, truncamento ou extensão. No caso da substituição de um ou mais aminoácidos consecu- tivos ou não-consecutivos, substituições são preferenciais nas quais os ami- noácidos substituídos são trocados por aminoácidos "equivalentes". Aqui, a expressão "aminoácidos equivalentes" está destinada a indicar qualquer a- minoácido que possa ser substituído por um dos aminoácidos estruturais, entretanto sem modificação das atividades biológicas dos anticorpos corres- pondentes e daqueles exemplos específicos definidos abaixo.

Aminoácidos equivalentes podem ser determinados na sua ho- mologia estrutural com os aminoácidos para os quais são substituídos ou nos resultados de testes comparativos da atividade biológica entre os vários anticorpos que possam ser gerados.

Como um exemplo não-restritivo, a tabela 1 abaixo resume as substituições possíveis que possam ser realizadas sem resultar em uma modificação significante da atividade biológica do anticorpo modificado cor- respondente; as substituições inversas são naturalmente possíveis sob as mesmas condições.

Tabela 1

Resíduo Original Substituição(ões) Ala (A) Val1 Gly, Pro Arg (R) Lys1 His Asn (N) Gln Asp (D) Glu Cys (C) Ser Gln (Q) Asn Glu (G) Asp Gly (G) Ala His (H) Arg Ile (I) Leu Leu (L) lie, Vai, Met Lys (K) Arg Met (M) Leu Phe (F) Tyr Pro (P Ala Ser (S) Th r, Cys Thr (T) Ser Trp (W) Tyr Tyr (Y) Phe, Trp Val (V) Leu, Ala

É conhecido pelos versados na técnica que no atual estado da técnica a maior variabilidade (tamanho e composição) entre as seis CDRs é encontrada nas três CDRs da cadeia pesada e, mais particularmente, em CDR-H3 desta cadeia pesada.

Consequentemente, será evidente que as CDRs características preferenciais dos anticorpos da invenção, ou de um de seus compostos deri- vados ou fragmentos funcionais, serão as três CDRs da cadeia pesada, isto é, CDRs codificadas por seqüências SEQ ID N0 2, 4 e 6, respectivamente, e ainda mais preferencialmente, CDR correspondente à CDR-H3 codificada pela seqüência SEQ ID N0 6.

Em uma modalidade específica, a presente invenção relaciona- se a um anticorpo de murino, ou compostos derivados ou fragmentos funcio- nais do mesmo.

Outra modalidade da invenção revela um anticorpo, ou seus compostos derivados ou fragmentos funcionais, compreendendo uma cadeia leve compreendendo as três CDRs seguintes:

- CDR-L1 da seqüência SEQ ID N0 1 ou de uma seqüência com identidade de pelo menos 80%, preferencialmente 85%, 90%, 95% e 98% após o alinhamento ótimo com seqüência SEQ ID N0 1;

- CDR-L2 da seqüência SEQ ID N0 3 ou de uma seqüência com identidade de pelo menos 80%, preferencialmente 85%, 90%, 95% e 98% após o alinhamento ótimo com seqüência SEQ ID N0 3; e

- CDR-L3 da seqüência SEQ ID N0 5 ou de uma seqüência com identidade de pelo menos 80%, preferencialmente 85%, 90%, 95% e 98% após o alinhamento ótimo com seqüência SEQ ID N0 5, e

uma cadeia pesada compreendendo as três CDRs seguintes:

- CDR-H1 da seqüência SEQ ID N0 7 ou de uma seqüência com identidade de pelo menos 80%, preferencialmente 85%, 90%, 95% e 98% após o alinhamento ótimo com seqüência SEQ ID N0 7;

- CDR-H2 da seqüência SEQ ID N0 4 ou de uma seqüência com identidade de pelo menos 80%, preferencialmente 85%, 90%, 95% e 98% após o alinhamento ótimo com seqüência SEQ ID N0 4; e

- CDR-H3 da seqüência SEQ ID N0 12 ou de uma seqüência com identidade de pelo menos 80%, preferencialmente 85%, 90%, 95% e 98% após o alinhamento ótimo com seqüência SEQ ID No. 12.

Ainda outra modalidade da invenção revela um anticorpo, ou um composto derivado ou fragmento funcional do mesmo, compreendendo uma cadeia leve compreendendo as três CDRs seguintes:

- CDR-L1 da seqüência SEQ ID N0 8 ou de uma seqüência com identidade de pelo menos 80% após o alinhamento ótimo com seqüência SEQ ID N0 8;

- CDR-L2 da seqüência SEQ ID N0 10 ou de uma seqüência com identidade de pelo menos 80% após o alinhamento ótimo com seqüência SEQ ID N0 10; e

- CDR-L3 da seqüência SEQ ID N0 5 ou de uma seqüência com identidade de pelo menos 80% após o alinhamento ótimo com seqüência SEQ ID N0 5, e

uma cadeia pesada compreendendo as três CDRs seguintes:

- CDR-H1 da seqüência SEQ ID N0 9 ou de uma seqüência com identidade de pelo menos 80% após o alinhamento ótimo com seqüência SEQ ID N0 9;

- CDR-H2 da seqüência SEQ ID N0 11 ou de uma seqüência com identidade de pelo menos 80% após o alinhamento ótimo com seqüên- cia SEQ ID N0 11; e

- CDR-H3 da seqüência SEQ ID N0 6 ou de uma seqüência com identidade de pelo menos 80% após o alinhamento ótimo com seqüência SEQ ID N0 6.

Ainda de acordo com outra modalidade, o anticorpo da invenção, ou seus compostos derivados ou fragmentos funcionais, é caracterizado pelo fato de que compreende uma seqüência de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos SEQ ID N0 13 ou uma seqüência com identidade de pelo menos 80%, preferencialmente 85%, 90%, 95% e 98% após o ali- nhamento ótimo com a seqüência SEQ ID N0 13; e pelo fato de que compre- ende uma seqüência de cadeia pesada compreendendo a seqüência de a- minoácidos SEQ ID N0 14 ou uma seqüência com identidade de pelo menos 80%, preferencialmente 85%, 90%, 95% e 98% após o alinhamento ótimo com a seqüência SEQ ID N0 14.

Também é revelado um anticorpo humanizado, ou um composto derivado ou fragmento funcional do mesmo, que é caracterizado pelo fato de que compreende uma seqüência de cadeia leve compreendendo a seqüên- cia de aminoácidos SEQ ID N0 17 ou uma seqüência com a identidade de pelo menos 80% após o alinhamento ótimo com a seqüência SEQ ID N0 17, e pelo fato de que compreende uma seqüência de cadeia pesada compre- endendo a seqüência de aminoácidos SEQ ID N0 18 ou 19 ou uma seqüên- cia com a identidade de pelo menos 80% após o alinhamento ótimo com a seqüência SEQ ID N0 18 ou 19.

Como visto acima, a invenção também se relaciona a qualquer composto derivado de um anticorpo como descrito na invenção. Mais parti- cularmente, o anticorpo da invenção, ou seus compostos derivados ou frag- mentos funcionais, é caracterizado pelo fato de que o dito composto deriva- do consiste em uma proteína de ligação compreendendo um estrutura peptí- dica no qual é enxertada pelo menos uma CDR de tal modo a conservar to- das ou parte das propriedades de reconhecimento de parátopo do anticorpo inicial.

Uma ou várias seqüências entre as seis seqüências CDR descri- tas na presente invenção também podem estar presentes em vários siste- mas de estruturas de proteína de imunoglobulina. Neste caso, a seqüência proteica permite recriar um esqueleto peptídico favorável para o enovela- mento das CDRs enxertadas, permitindo a elas conservar suas propriedades de reconhecimento do antígeno pelo parátopo.

Geralmente, uma pessoa versada na técnica sabe como deter- minar o tipo de estrutura proteica sobre a qual enxertar pelo menos uma das CDRs que resultam do anticorpo original.

Mais particularmente, é conhecido que para ser selecionadas tais estruturas devem encontrar o maior número de critérios como se segue (Skerra A., J. Mol. Recogn., 2000, 13:167-187):

- boa conservação filogenética; - estrutura tridimensional conhecida (como, por exemplo, por cristalografia, espectroscopia de RMN ou qualquer outra técnica conhecida por uma pessoa versada na técnica );

- pequeno tamanho;

- nenhuma ou poucas modificações pós-transcricionais; e/ou

- de fácil produção, expressão e purificação.

A origem de tais estruturas proteicas pode ser, mas não é limita- da a, as estruturas selecionadas entre: fibronectina e preferencialmente do- mínio 10 da fibronectina tipo III, lipocalina, anticalina (Skerra A., J. Biotech- nol., 2001, 74 (4):257-75), proteína Z resultante do domínio B da proteína A do Staphylococccus aureus, tioredoxina A ou proteína com um motivo repe- tido tal como "repetição anquirina" (Kohl et ai, PNAS, 2003, volume 100, N. 4, 1700 - 1705), a "repetição armadillo", a "repetição rica em leucina" e a "repetição tetratricopeptídica".

Estruturas derivadas a partir de toxinas tais como, por exemplo, toxinas de escorpiões, insetos, plantas, moluscos, etc., e proteína inibidora do NO sintase neuronal (PIN) também deveriam ser mencionadas.

Um exemplo, em nada limitante, de tais construções híbridas, é a inserção da CDR-H1 (cadeia pesada) de um anticorpo antiCD4, ou seja, 13B8.2, em uma das alças na PIN, a nova proteína de ligação dessa forma obteve a conservação das mesmas propriedades de ligação que o anticorpo original (Bes et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 2006, 343 (1), 334- 344). Em uma base meramente ilustrativa, enxertando a CDR-H3 (cadeia pesada) de um anticorpo anti-lisozima VHH em uma das alças de neocarzi- nostatina (Nicaise et ai, Protein Science, 2004, 13 (7): 1882-1891) também pode ser mencionado.

Por fim, como descrito acima, tais estruturas peptídicas podem compreender de uma a seis CDRs resultantes do anticorpo original. Prefe- rencialmente, mas não sendo uma exigência, uma pessoa versada na técni- ca selecionará pelo menos uma CDR da cadeia pesada, a última sendo co- nhecida por ser principalmente responsável pela especificidade do anticorpo. A seleção de uma ou mais CDRs relevantes é óbvia para uma pessoa ver- sada na técnica, que então escolherá técnicas conhecidas adequadas (Bes et ai, FEBS Ietters 508, 2001, 67-74).

Um aspecto específico da presente invenção relaciona-se a um método para seleção de um composto derivado a partir de um anticorpo de acordo com a invenção, o dito composto derivado sendo capaz da inibição in vitro e/ou in vivo do crescimento de células tumorais e o dito composto deri- vado compreendendo uma estrutura peptídica na qual é enxertada pelo me- nos uma CDR de anticorpo, caracterizado pelo fato de que compreende as seguintes etapas:

a) a colocação em contato in vitro de um composto constituído de uma estrutura peptídica na qual é enxertada pelo menos uma CDR de anticorpo com uma amostra biológica contendo células tumorais capazes de crescer e sob condições permitindo que estas células cresçam; e

b) seleção do dito composto se o dito composto é capaz de inibi- ção do crescimento destas células tumorais,

e caracterizado pelo fato de que pelo menos uma dita CDR en- xertada é selecionada entre as CDRs seguintes:

- a CDR de seqüência SEQ ID N0 1, 8 ou uma seqüência com identidade de pelo menos 80%, preferencialmente 85%, 90%, 95% e 98% após o alinhamento ótimo com seqüência SEQ ID N0 1, 8;

- a CDR de seqüência SEQ ID N0 3, 10 ou uma seqüência com identidade de pelo menos 80%, preferencialmente 85%, 90%, 95% e 98% após o alinhamento ótimo com seqüência SEQ ID N0 3, 10;

- a CDR de seqüência SEQ ID N0 5 ou uma seqüência com iden- tidade de pelo menos 80%, preferencialmente 85%, 90%, 95% e 98% após o alinhamento ótimo com seqüência SEQ ID N0 5;

- a CDR de seqüência SEQ iD N0 2, 7, 9 ou uma seqüência com identidade de pelo menos 80%, preferencialmente 85%, 90%, 95% e 98% após o alinhamento ótimo com seqüência SEQ ID N0 2, 7, 9;

- a CDR de seqüência SEQ ID N0 4, 11 ou uma seqüência com identidade de pelo menos 80%, preferencialmente 85%, 90%, 95% e 98% após o alinhamento ótimo com seqüência SEQ ID N0 4, 11; e - a CDR de seqüência SEQ ID N0 6, 12 ou uma seqüência com identidade de pelo menos 80%, preferencialmente 85%, 90%, 95% e 98% após o alinhamento ótimo com seqüência SEQ ID N0 6, 12.

De acordo com um modo preferencial, o método pode incluir na etapa a) a colocação em contato in vitro de um composto compreendendo uma estrutura peptídica na qual é enxertada pelo menos duas ou três CDRs de anticorpo.

De acordo com um modo ainda mais preferencial deste método, a estrutura peptídica é selecionada entre as estruturas ou proteínas de liga- ção cujas estruturas foram acima mencionadas.

Obviamente, estes exemplos são em nada limitantes, e qualquer outra estrutura conhecida ou óbvia para uma pessoa versada na técnica se- ria considerada como sendo coberta pela proteção conferida pelo presente pedido de patente.

A presente invenção dessa forma relaciona-se a um anticorpo, ou seus compostos derivados ou fragmentos funcionais, caracterizado pelo fato de que a estrutura peptídica é selecionada entre proteínas que são a) filogeneticamente bem conservadas, b) de arquitetura robusta, c) com uma organização molecular 3-D bem-conhecida, d) de pequeno tamanho e/ou e) compreendendo regiões que podem ser modificadas pela deleção e/ou in- serção sem modificação das propriedades de estabilidade.

De acordo com uma modalidade preferencial, o anticorpo da in- venção, ou seus compostos derivados ou fragmentos funcionais, é caracteri- zado pelo fato de que a dita estrutura peptídica é selecionada entre i) estru- turas resultantes da fibronectina, preferencialmente domínio 10 da fibronec- tina tipo 3, lipocalina, anticalina, proteína Z resultante do domínio B da prote- ína A de Staphyiococcus aureus, tioredoxina A ou proteínas com um motivo repetido tal como "repetição anquirina" (Kohl et ai, PNAS, 2003, vol. 100, N0 4, 1700-1705), a "repetição armadillo", a "repetição rica em leucina" e a "re- petição tetratricopeptídica" ou iii) proteína inibidora de NO sintase neuronal (PIN).

Outro aspecto da invenção relaciona-se aos fragmentos funcio- nais do anticorpo descrito acima.

Mais particularmente, a invenção visa um anticorpo, ou seus compostos derivados ou fragmentos funcionais, caracterizados pelo fato de que o dito fragmento funcional é selecionado entre os fragmentos Fv1 Fab1 (Fab')2l Fab', scFv, scFv-Fc e diacorpos, ou qualquer fragmento cuja meia- vida foi aumentada, tais como fragmentos PEGilados.

Tais fragmentos funcionais do anticorpo de acordo com a inven- ção consistem, por exemplo, nos fragmentos Fv, scFv (sc=cadeia simples), Fab, F(ab')2, Fab', scFv-Fc ou diacorpos, ou qualquer fragmento cuja meia- vida foi aumentada pela modificação química, tal como a adição de polialqui- Ieno glicol, tal como polietileno glicol (PEGilação) (fragmentos PEGilados são mencionados como Fc-PEG, scFv-PEG, Fab-PEG, F(ab')2-PEG e Fab'- PEG), ou pela incorporação em um lipossoma, microesferas ou PLGA, os ditos fragmentos que possuem pelo menos uma das CDRs características da invenção que é especialmente capaz de exercer em uma atividade de maneira geral, mesmo que parcial, do anticorpo do qual resulta.

Preferencialmente, os ditos fragmentos funcionais compreende- rão ou incluirão uma seqüência parcial da cadeia variável pesada ou leve do anticorpo a partir do qual são derivados, a dita seqüência parcial que é sufi- ciente para conservar a mesma especificidade de ligação que o anticorpo a partir do qual resulta e afinidade suficiente, preferencialmente pelo menos igual a 1/100, mais preferencialmente pelo menos 1/10 daquele anticorpo do qual resulta.

Tal fragmento funcional conterá pelo menos cinco aminoácidos, preferencialmente 6, 7, 8, 10, 15, 25, 50 ou 100 aminoácidos consecutivos da seqüência do anticorpo da qual resulta.

Preferencialmente, estes fragmentos funcionais serão dos tipos Fv, scFv, Fab, F(ab')2, F(ab'), scFv-Fc ou diacorpos, que geralmente têm a mesma especificidade de ligação que o anticorpo do qual resultam. De acor- do com a presente invenção, fragmentos do anticorpo da invenção podem ser obtidos a partir dos anticorpos descritos acima, por métodos, tais como digestão enzimática, incluindo pepsina ou papaína, e/ou pela clivagem das pontes dissulfeto por redução química. Os fragmentos de anticorpo também podem ser obtidos por técnicas genéticas recombinantes também conheci- das por uma pessoa versada na técnica ou pela síntese peptídica por meios, por exemplo, de sintetizadores de peptídeo automáticos, tais como os vendi- dos por Applied BioSystems1 etc.

A invenção também visa o anticorpo de murino original, ou seja, um anticorpo de acordo com a invenção, ou seus compostos derivados ou fragmentos funcionais, caracterizado pelo fato de que o dito anticorpo é um anticorpo de murino e pelo fato de que compreende uma seqüência de ami- noácidos da cadeia leve SEQ ID N0 15, ou uma seqüência com identidade de pelo menos 80%, preferencialmente 85%, 90%, 95% e 98% após o ali- nhamento ótimo com a seqüência SEQ ID N0 15, e uma cadeia pesada da seqüência de aminoácidos SEQ ID N0 16, ou uma seqüência com identidade de pelo menos 80%, preferencialmente 85%, 90%, 95% e 98% após o ali- nhamento ótimo com a seqüência SEQ ID N0 16.

Para mais clareza, a tabela 2 abaixo resume várias seqüências de aminoácidos correspondentes ao anticorpo da invenção. Tabela 2 (em que Mu. = murino e Hu. = humanizado)

Anticorpo Numeração CDR Cadeia pesada Cadeia leve SEQ ID NO. CDR-L1 1 CDR-L2 3 Commom CDR-L3 5 CDR-H1 2 CDR-H2 4 CDR-H3 6 CDR-L1 1 CDR-L2 3 IMGT CDR-L3 5 CDR-H1 7 CDR-H2 4 CDR-H3 12 CDR-L1 8 CDR-L2 10 6F4 Kabat CDR-L3 5 CDR-H1 9 CDR-H2 11 CDR-H3 6 domínio variá- 13 vel Mu. domínio variá- 14 vel Mu. totalmente Mu. 15 totalmente Mu. 16 domínio variá- 17 vel Hu. domínio variá- 18 vel Hu. (V1) domínio variá- 19 vel Hu. (V2)

Outro aspecto específico da presente invenção refere-se a um

anticorpo quimérico, ou seus compostos derivados ou fragmentos funcionais, caracterizados pelo fato de que o dito anticorpo também compreende regi- ões constantes da cadeia leve e da cadeia pesada derivadas de um anticor- po de uma espécie heteróloga com o camundongo, especialmente homem.

Ainda outro aspecto específico da presente invenção refere-se a um anticorpo humanizado, ou seus compostos derivados ou fragmentos fun- cionais, caracterizadas pelo fato de que as regiões constantes da cadeia leve e da cadeia pesada derivadas do anticorpo humano são, respectiva- mente, a região Iambda ou kappa e região gama-1, gama-2 ou gama-4.

De acordo com outro aspecto, a invenção refere-se a um hibri- doma murino capaz de secretar um anticorpo monoclonal de acordo com a invenção, especialmente o hibridoma de origem murina depositado no centro francês de culturas de micro-organismos (CNCM, Pasteur Institute, Paris, France) em 6 de julho de 2006, sob o número I-3646. O dito hibridoma foi obtido pela fusão de esplenócitos de camundongos Balb/C imunizados e células das linhagens de mieloma Sp 2/O-Ag 14.

O anticorpo monoclonal, aqui mencionado como 6F4, ou seus compostos derivados ou fragmentos funcionais, caracterizado pelo fato de que o dito anticorpo é secretado pelo hibridoma arquivado no CNCM em 4 de julho de 2006, sob o número I-3646, obviamente é parte da presente in- venção.

O anticorpo da invenção também compreende anticorpos quimé- ricos ou humanizados. Um anticorpo quimérico é aquele que contém uma região variável natural (cadeia leve e cadeia pesada) derivada de um anti- corpo de uma dada espécie em combinação com regiões constantes da ca- deia leve e da cadeia pesada de um anticorpo de uma espécie heteróloga as ditas espécies fornecidas.

Os anticorpos, ou fragmentos quiméricos dos mesmos, podem ser preparados pelo uso das técnicas genéticas recombinantes. Por exem- plo, o anticorpo quimérico pode ser produzido através de clonagem de DNA recombinante contendo um promotor e uma seqüência de codificação da região variável de um anticorpo monoclonal não-humano da invenção, espe- cialmente de murino, e uma seqüência de codificação da região constante do anticorpo humano. Um anticorpo quimérico de acordo com a invenção codificada por tal gene recombinante poderia ser, por exemplo, uma quimera humano-camundongo, a especificidade deste anticorpo que é determinada pela região variável derivada do DNA murino e seu isotipo determinado pela região constante derivada do DNA humano. Recorrer a Verhoeyn et ai (Bio- Essays, 8:74, 1988) para métodos para preparação de anticorpos quiméri- cos.

"Anticorpos humanizados" significam um anticorpo que contém regiões CDR derivadas de um anticorpo de origem não-humana, as outras partes da molécula de anticorpo sendo derivada de um (ou vários) anticor- pos humanos. Além disso, alguns dos resíduos de segmento de esqueleto (chamado FR) podem ser modificados para conservar a afinidade de ligação (Jones et ai, Nature, 321:522-525, 1986; Verhoeyen et ai, Science, 239:1534-1536, 1988; Riechmann et ai, Nature, 332:323-327, 1988). 0s anticorpos humanizados da invenção ou fragmentos dos

mesmos podem ser preparados por técnicas conhecidas por uma pessoa versada na técnica (tal como, por exemplo, aquelas descritas nos documen- tos Singer et ai, J. Immun., 150:2844-2857, 1992; Mountain et ai, Biotech- nol. Genet. Eng. Rev., 10:1-142, 1992; e Bebbington et ai, BiofTechnology, 10:169-175, 1992). Tais anticorpos humanizados são preferenciais para seu uso em métodos envolvendo diagnóstico in vitro ou tratamento preventivo e/ou terapêutico in vivo. Outras técnicas de humanização, também conheci- das por uma pessoa versada na técnica , tal como, por exemplo, "enxerto de CDR" técnica descrita por PDL nas patentes EP O 451 261, EP O 682 040, EP 0 939 127, EP 0 566 647 ou US 5.530.101, US 6.180.370, US 5.585.089 e US 5.693.761. US Patents 5.639.641 ou 6.054.297, 5.886.152 e 5.877.293 também podem ser citadas.

Além disso, a invenção também refere-se a anticorpos humani- zados resultantes dos anticorpos de murinos descritos acima. Mais particularmente, o método de humanização para o anticor-

po 6F4 é descrito detalhadamente nos exemplos 2 e 3 para as cadeias leves e pesadas, respectivamente.

Em uma maneira preferencial, as regiões constantes da cadeia leve e da cadeia pesada derivadas do anticorpo humano são, respectiva- mente, a região Iambda ou kappa e a gama-1, gama-2 ou gama-4.

Em modalidade correspondente ao IgGI isotipo IgGI, uma ca- racterística adicional do anticorpo é exibir funções efetoras, tais como citoto- xicidade celular dependente de anticorpo (ADCC) e/ou citotoxicidade depen- dente do complemento (CDC). Em outro aspecto da invenção, o requerente também identificou o antígeno reconhecido pelo anticorpo de acordo com a invenção.

O método usado para realizar isto é descrito detalhadamente no

exemplo 4 abaixo.

JAM-A é uma proteína de membrana que pertence à superfamí- Iia de imunoglobulina (IgSF)1 na qual pertence à família de molécula de ade- são juncional (JAM). No homem, a família JAM compreende vários mem- bros, incluindo as proteínas JAM-A, JAM-B1 JAM-C1 A33 e A34. Entre os membros da família JAM1 JAM-A tem a homologia mais alta com JAM-B e JAM-C1 identidade de seqüência de aproximadamente 35% em aminoácidos e semelhança de 45% com estas duas proteínas. A proteína JAM-A também é chamada de JAM A1 F11R, receptor F11, JAM-1, JAM 1, PAM-1 ou CD321. Duas isoformas do precursor de JAM-A que se diferencia pelo ta- manho da região extracelular foram identificadas:

- isoforma a: 299 aminoácidos (SEQ ID N0 61)

- isoforma b: 259 aminoácidos (SEQ ID N0 63).

As seqüências nucleotídicas das duas isoformas são represen- tadas com SEQ ID N0 62 para isoforma a e SEQ ID N0 64 para isoforma b.

A proteína expressa na superfície das células humanas tem uma cadeia polipeptídica única com um domínio de C-terminal intracelular, um domínio transmembrana único (21 aminoácidos) e uma região extracelular N-terminal contendo dois domínios "similares a Ig". JAM-A tem um sítio de N-glicosilação, um resíduo Asn na posi-

ção 185 da isoforma a e 145 da isoforma b, e duas pontes dissulfeto, uma entre os resíduos Cys 50 e 109 no domínio N-terminal da Ig e uma entre os resíduos Cys 153 e 212 no segundo domínio da Ig.

A presença de dois domínios extracelulares similares a Ig foi confirmada por cristalografia (Kostrewa et ai, 2001, EMBO J. 16:4391-4398; Prota et ai, 2003, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 100:5366-5371). Estes dois domínios são unidos por um tripeptídeo Iigador (seqüência VLV [127-129], isoforma A). Estes estudos estruturais também confirmaram a implicação do JAM-A em interações homofílicas na superfície celular envolvendo a região extracelular; esta região, produzida em forma recombinante e capaz de for- mação de homodímeros em solução (Bazzoni et al., 2000, J. Biol. Chem.

275:30970-30976) também permitiu identificar aminoácidos envolvidos nes- tas interações: Arg 59, Glu 61, Lys 63, Leu 72, Tyr 75, Met 110, Glu 114, Tyr 119 e Glu 121. O tripeptídeo RVE [59-61] é relativamente conservado dentro da família JAM (RLE para JAM-B, RIE para JAM-C) e constitui o motivo mí- nimo para formação de homodímero (Kostrewa et al., 2001, EMBO J. 16:4391-4398).

Em células epiteliais e endoteliais, JAM-A é principalmente en- contrada nas junções oclusivas (Liu et aí., 2000, J. Cell Sci., 113:2363-2374). A região citoplasmática contém um domínio PDZ tipo Il na posição C- terminal (seqüência FLV [298-300], isoforma a, que é responsável pela inte- ração de JAM-A com várias proteínas citossólicas associadas com a junção oclusiva, também contendo um domínio PDZ, tal como ZO-1, AF-6, MUPP-1 e PAR-3 (Ebnet et al., 2000, J. Biol. Chem., 275:27979-27988; Itoh et al., 2001, J. Cell Biol, 154:491-498; Hamazaki et al., 2002, J. Biol. Chem., 277:455-461). Anticorpos de murinos direcionados contra a região [111-123] envolvidos na formação de dímero, chamados anticorpos J3F.1 e J 10.4, são capazes de inibir a homodimerização de JAM-A e a reconstrução da barreira epitelial in vitro (Mandell et al., 2004, J. Biol. Chem., 279:16254-16262).

JAM-A interage com integrina ανβ3 e está envolvida na migração de células endoteliais em vitronectina, Iigante da integrina ανβ3 (Naik and Naik, 2005, J. Cell Sei. 119:490-499). O anticorpo antiJAM-A J3F.1, da mesma maneira que um anticorpoDantkxvP3, inibe a migração de células endoteliais e a angiogênese induzida por bFGF in vitro (Naik et al., 2003, Blood, 102:2108-2114). Várias vias de sinalização foram demonstradas em células endoteliais: MAP quinases, PI3-quinase e PKC (Naik and Naik, 2005, J. Cell Sci., 119:490-499; Naik et al., 2003, Blood, 102:2108-2114; Naik et al., 2003, Artherioscler. Thromb. Vasc. Biol, 23:2165-2171).

JAM-A também está expressa em monócitos, linfócitos, neutrófi- Ios e plaquetas (Williams et ai, 1999, Mol. Imunol, 36:1175-1188). A proteína JAM-A foi, entretanto, inicialmente identificada como um receptor do anticor- po F11, um anticorpo capaz de ativar plaquetas e induzir sua agregação (Naik et ai, 1995, Biochem. J., 310:155-162; Sobocka ef ai, 2000, Blood, 95:2600-2609). Os peptídeos [28 a 60] e [97 a 109] pertencem ao epitopo do anticorpo F11 e estão envolvidos nos fenômenos de ativação e agregação plaquetária e em homodimerização (Babinska et ai, 2002, Thromb. Hae- most., 87:712-721).

O anticorpo de rato BV11, direcionado contra a forma de murino de JAM-A, inibe a migração transendotelial de monócitos in vitro e in vivo (Del Maschio et ai, 1999, J. Exp. Med., 190:1351-1356). Ostermann e cola- boradores (2002, Nature Imunol., 3:151-158) mostraram que JAM-A era um Iigante de integrina aLp2 ou LFA-1 (antígeno 1 associado a função linfocitá- ria), que é superexpressa em resposta a certas quimiocinas durante o de- senvolvimento de uma resposta anti-inflamatória e é necessária para a dia- pedese ou migração de leucócitos para o sítio de inflamação. JAM-A, atra- vés do segundo domínio similar a Ig, contribui para a adesão e a migração transendotelial de linfócitos T e neutrófilos (Ostermann et ai, 2002, Nature Imunol, 3:151-158), e dessa forma desempenha um papel importante no re- crutamento de leucócitos para o sítio de inflamação.

A proteína JAM-A também está envolvida em fenômenos de in- fecção viral. JAM-A é de fato um receptor de reovirus, vírus responsáveis por certos tipos de encefalite por meio da interação com a proteína de fixação σ1 (Barton et ai, 2001, Cell 104:441-451).

Anticorpo antiJAM-A J10.4 inibe a ligação do reovirus a JAM-A (Forrest et ai, 2003, J. Biol. Chem., 278:48434-48444).

Até agora, nenhum dos anticorpos acima mencionados direcio- nados contra a forma humana de JAM-A exibe atividade in vivo, muito me- nos atividade antitumoral. Tais anticorpos são usados somente como instru- mentos de pesquisa. Dessa forma, na técnica anterior, há uma falta genuína de um anticorpo antitumoral ativo in vitro e in vivo.

De acordo com um aspecto específico, o anticorpo da invenção, ou seus compostos derivados ou fragmentos funcionais, é caracterizado pelo fato de que é capaz de ligar especificamente a proteína JAM-A (de acordo com a nomenclatura inglesa "Moléculas de Adesão Juncional").

Ainda de acordo com outro aspecto, o anticorpo da invenção, ou seus compostos derivados ou fragmentos funcionais, é caracterizado pelo fato de que exibe um K0 para JAM-A entre aproximadamente 1 nMe apro- ximadamente 1 pM. Mais preferencialmente, o dito K0 para JAM-A está entre aproximadamente 10 pM e aproximadamente 40 pM.

A expressão "Kd" refere-se à constante de dissociação de um dado complexo de anticorpo-antígeno. KD=K0ff/K0n com K0ff consistindo na constante de "dissociação" para a dissociação do anticorpo do complexo de anticorpo-antígeno e Kon consistindo no nível ao qual o anticorpo se liga ao antígeno (Chen Y. et ai, 1999, J.Mol. Biol, 293:865-881).

Um aspecto original da presente invenção relaciona-se a um á- cido nucleico isolado caracterizado pelo fato de que é selecionado entre os seguintes ácidos nucleicos (incluindo qualquer código genético degenerado):

a) um ácido nucleico, DNA ou RNA, que codifica um anticorpo de acordo com a invenção, ou um dos seus compostos derivados ou frag- mentos funcionais;

b) um ácido nucleico complementar a um ácido nucleico como definido em a);

c) um ácido nucleico de pelo menos 18 nucleotídeos capaz de hibridização sob condições altamente estringentes com pelo menos uma das CDRs de seqüências de ácidos nucleicos SEQ ID Nos. 20 a 31 ou com uma seqüência com identidade de pelo menos 80%, preferencialmente 85%, 90%, 95% e 98%, após o alinhamento ótimo com seqüência SEQ ID N0 20 a 31; e

d) um ácido nucleico de pelo menos 18 nucleotídeos capaz de hibridização sob condições altamente estringentes com pelo menos a se- qüência de ácido nucleico da cadeia leve de SEQ ID N0 32 ou 36 e/ou a se- qüência de ácido nucleico da cadeia pesada de SEQ ID N0 33, 37 ou 38, ou com uma seqüência com identidade de pelo menos 80% após o alinhamento ótimo com seqüência SEQ ID N0 32 ou 36 e/ou 33, 37 ou 38.

A Tabela 3 abaixo resume as várias seqüências nucleotídicas acerca do anticorpo da invenção.

Tabela 3

Anticorpo Numeração CDR Cadeia Pesada Cadeia Leve SEQ ID NO. 6F4 Commom CDR-L1 20 CDR-L2 22 CDR-L3 24 CDR-H1 21 CDR-H2 23 CDR-H3 25 IMGT CDR-L1 20 CDR-L2 22 CDR-L3 24 CDR-H1 26 CDR-H2 23 CDR-H3 27 Kabat CDR-L1 28 CDR-L2 29 CDR-L3 24 CDR-H1 30 CDR-H2 31 CDR-H3 25 domínio variável Mu. 32 domínio variável Mu. 33 totalmente Mu. 34 totalmente Mu. 35 domínio variável Hu. 36 domínio variável Hu. (V1) 37 domínio variável Hu. (V2) 38

Os termos "ácido nucleico", "seqüência nucleica", "seqüência de

ácido nucleico", "polinucleotídeo", "oligonucleotídeo", "seqüência de polinu- cleotídeo" e "seqüência nucleotídica", usados intercambiavelmente no pre- sente relatório descritivo, significam uma seqüência exata de nucleotídeos, modificada ou não, definindo um fragmento ou uma região de um ácido nu- cleico, contendo ou não nucleotídeos não-naturais, e sendo um DNA de fita dupla, um DNA de fita simples ou produtos de transcrição dos ditos DNAs.

Também deve ser incluído aqui que a presente invenção não se relaciona a seqüências nucleotídicas em seu ambiente cromossômico natu- ral, isto é, em um estado natural. As seqüências da presente invenção foram isoladas e/ou purificadas, isto é, foram escolhidas diretamente ou indireta- mente, por exemplo por uma cópia, seu ambiente tendo sido pelo menos parcialmente modificado. Ácidos nucleicos isolados obtidos pela genéticas recombinaníes, por meio, por exemplo, de células hospedeiras, ou obtido pela síntese química também deveriam ser mencionados aqui.

"Seqüências nucleicas exibindo uma porcentagem de identidade de pelo menos 80%, preferencialmente 85%, 90%, 95% e 98%, após o ali- nhamento ótimo com uma seqüência preferencial" significa seqüências nu- cléicas exibindo, com relação à seqüência nucléica de referência, certas modificações tais como, em particular, uma deleção, um truncamento, uma extensão, uma fusão quimérica e/ou uma substituição, especialmente pontu- al. Preferencialmente, estas são seqüências que codificam as mesmas se- qüências de aminoácido que a seqüência de referência, isto que está rela- cionado à degeneração do código genético, ou seqüências de complementa- ridade que são suscetíveis a hibridizar especificamente com as seqüências de referência, preferencialmente sob condições altamente estringentes, es- pecialmente aquelas definidos abaixo.

Hibridização sob condições altamente estringentes significa que as condições relacionadas à temperatura e força iônica são selecionadas de tal modo que permitem a hibridização ser mantida entre dois fragmentos de DNA de complementaridade. Em uma base meramente ilustrativa, as condi- ções altamente estringentes da etapa de hibridização para o objetivo de de- finir os fragmentos de polinucleotídeo descritos acima são vantajosamente como se segue.

Hibridização DNA-DNA ou DNA-RNA é realizada em duas eta- pas: (1) pré-hibridização a 42°C durante três horas em tampão fosfato (20 mM, pH 7,5) contendo SSC 5X (SSC 1X eqüivale a uma solução de NaCI 0,15 M + citrato de sódio 0,015 M), formamida 50%, dodecil sulfato de sódio (SDS) 7%, solução de Denhardt 10X, sulfato de dextrana 5% e DNA de es- perma de salmão 1%; (2) hibridização primária durante 20 horas a uma tem- peratura dependendo do tamanho da sonda (isto é: 42°C para uma sonda >100 nucleotídeos em tamanho) seguido por duas lavagens de 20 minutos a 20°C em SSC 2X + SDS 2%, uma lavagem de 20 minutos a 20°C em SSC 0,1 X + SDS 0,1%. A última lavagem é realizada em SSC 0,1 X + SDS 0,1% durante 30 minutos a 60°C para uma sonda >100 nucleotídeos em tamanho. As condições de hibridização altamente estringentes descritas acima para um polinucleotídeo de tamanho definido podem ser adaptadas por uma pes- soa versada na técnica de oligonucleotídeos mais longos ou mais curtos, de acordo com os procedimentos descritos em Sambrook, et al. (Molecular cloning: a Iaboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory; 3rd edition, 2001).

A invenção também refere-se a um vetor compreendendo um ácido nucleico como descrito na invenção.

A invenção visa especialmente vetores de clonagem e/ou ex- pressão que contêm tal seqüência nucleotídica.

Os vetores da invenção preferencialmente contêm elementos que permitem a expressão e/ou a secreção de seqüências nucleotídicas em uma dada célula hospedeira. O vetor dessa forma deve conter um promotor, sinais de iniciação e terminação da tradução, bem como regiões adequadas de regulação de transcrição. Deve ser capaz de ser mantido de uma maneira estável na célula hospedeira e pode ter opcionalmente sinais específicos que especificam a secreção da proteína traduzida. Estes vários elementos são selecionados e otimizados por uma pessoa versada na técnica de acor- do com a célula hospedeira usada. Para esse objetivo, as seqüências nucle- otídicas podem ser inseridas em vetores autoreplicativos dentro do hospe- deiro escolhido ou serem vetores integrativos do hospedeiro escolhido.

Tais vetores são preparados por métodos tipicamente usados por uma pessoa versada na técnica e os clones resultantes podem ser intro- duzidos em um hospedeiro adequado por métodos padrão, tais como Iipo- fecção, eletroporação, choque de calor ou métodos químicos.

Os vetores são, por exemplo, vetores de origem plasmidial ou viral. São usados para transformar células hospedeiras a fim de clonar ou expressar as seqüências nucleotídicas da invenção.

A invenção também compreende células hospedeiras transfor- madas ou compreendendo um vetor como descrito na presente invenção.

A célula hospedeira pode ser selecionada entre sistemas proca- rióticos ou eucarióticos, tais como células bacterianas, por exemplo, mas também células de levedura ou células animais, especialmente células de mamífero. Células de inseto ou células de planta também podem ser usa- das.

A invenção também refere-se a animais, outros além do homem, que têm uma célula transformada de acordo com a invenção. Outro aspecto da invenção refere-se a um método para produ-

ção de um anticorpo de acordo com a invenção, ou um dos seus fragmentos funcionais, caracterizado pelo fato de que o dito método compreende as se- guintes etapas:

a) a cultura em um meio e condições de cultura adequadas a uma célula hospedeira de acordo com a invenção; e

b) a recuperação do dito anticorpo, ou um dos seus fragmentos funcionais, dessa forma produzidos a partir do meio de cultura ou a partir das ditas células cultivadas.

As células transformadas de acordo com a invenção são de uso em métodos para preparação de polipeptídeos recombinantes de acordo com a invenção. Métodos para preparação do polipeptídeo de acordo com a invenção em forma recombinante, caracterizados peio de que os ditos méto- dos usam um vetor e/ou uma célula transformada por um vetor de acordo com a invenção, são também compreendidos na presente invenção. Prefe- rencialmente, uma célula transformada por um vetor de acordo com a inven- ção é cultivada sob condições que permitem a expressão do polipeptídeo supracitado e a recuperação do dito peptídeo recombinante. Como já mencionado, a célula hospedeira pode ser selecionada entre sistemas procarióticos ou eucarióticos. Em particular, é possível identi- ficar as seqüências nucleotídicas da invenção que facilitam a secreção em tal sistema procariótico ou eucariótico. Um vetor de acordo com a invenção que transporta tal seqüência pode ser dessa forma usado vantajosamente para a produção das proteínas recombinantes a serem secretadas. De fato, a purificação destas proteínas recombinantes de interesse será facilitada pelo fato que estão presentes no sobrenadante da cultura celular em vez de no interior das células hospedeiras. Os polipeptídeos da invenção também podem ser preparados

pela síntese química. Tal método de preparação é também um objeto da invenção. Uma pessoa versada na técnica conhece métodos para síntese química, tais como técnicas de fase sólida (ver especialmente, Steward et al., 1984, Solid phase peptides synthesis, Pierce Chem. Company, Rockford, 111, 2nd Ed.) ou técnicas de fase sólida parcial, por condensação de frag- mentos ou por síntese convencional em solução. Polipeptídeos obtidos pela síntese química e capazes de conter aminoácidos não-naturais correspon- dentes também são compreendidos na invenção.

Os anticorpos, ou compostos derivados ou fragmentos funcio- nais dos mesmos, suscetíveis de ser obtidos pelo método da invenção tam- bém são compreendidos na presente invenção.

Ainda de acordo com outro aspecto, a presente invenção refere- se a um anticorpo como descrito acima, caracterizado pelo fato de que é, além disso, capaz de se ligar especificamente a um receptor da família tiro- sina quinase humana e/ou capaz de especificamente de inibir a atividade de tirosina quinase de tal receptor.

De acordo com uma modalidade adicional, a invenção refere-se a um anticorpo, ou seus compostos derivados ou fragmentos funcionais, consistindo em um anticorpo que é bispecífico no sentido que compreende um segundo motivo capaz de interação com qualquer receptor envolvido no desenvolvimento de tumores, tal como, por exemplo, VEGFR, VEGF, EGFR, IGF-IR, HER2neu, HGF, cMET, FGF, tetraspaninas, integrinas, CXCR4 ou CXCR2.

De acordo com uma primeira modalidade, tal anticorpo consiste em um anticorpo bispecífico e compreende um segundo motivo que especifi- camente inibe a ligação de EGF com o receptor de fator de crescimento epi- dérmico humano (EGFR) e/ou que especificamente inibe a atividade de tiro- sina quinase do dito EGFR. De acordo com um aspecto ainda mais prefe- rencial da invenção, o dito segundo motivo antiEGFR resulta do anticorpo monoclonal cetuximabe (C225 ou erbitux), matuzumabe, huR3, HuMax- EGFR ou panitumabe. De acordo com uma segunda modalidade, o anticorpo de acordo

com a invenção consiste em um anticorpo bispecífico e compreende um se- gundo motivo que inibe especificamente a atividade modulada por um recep- tor de HER2/neu e/ou que inibe especificamente a atividade de tirosina qui- nase do dito receptor de HER2/neu. Mais particularmente, o dito segundo motivo antiHER2/neu resultante do anticorpo de camundongo monoclonal 4D5 ou 2C4 ou do anticorpo humanizado trastuzumabe ou pertuzumabe.

De acordo com uma terceira modalidade, o anticorpo de acordo com a invenção consiste em um anticorpo bispecífico e compreende um se- gundo motivo que inibe especificamente a ligação do fator de crescimento de hepatócito (HGF) com de receptor de cMET e/ou que inibe especificamente a atividade de tirosina quinase do dito receptor de cMET.

De acordo com uma quarta modalidade, o anticorpo de acordo com a invenção consiste em um anticorpo bispecífico e compreende um se- gundo motivo que especificamente inibe a atividade modulada pelo receptor de IGF-1R e/ou que inibe especificamente a atividade de tirosina quinase do dito receptor de IGF-1R. Mais particularmente, o dito segundo motivo an- tilGF-1 R resultante do anticorpo de camundongo monocionai 7C10, a partir do anticorpo humanizado correspondente h7C10 (Goetsch et ai, Internatio- nal patent application WO 03/059951), a partir dos anticorpos hEM164 (Ma- Ioney et ai, Câncer Res., 2003, 63 (16):5073-5083), a partir dos anticorpos antilGF-1R desenvolvidos por Abgenix (ver US patent application 2005/281812) ou partir de Mab 39, 1H7 (Li et ai, Câncer Imunol. Imunother., 2000, 49 (4-5):243-252) ou 4G11 (Jackson-Booth et ai, Horm. Metab. Res., 2003, 35 (11-12):850-856).

Por fim, de acordo com uma modalidade final, o anticorpo da invenção consiste em um anticorpo bispecífico e compreende um segundo motivo capaz da interação com qualquer tipo de receptor envolvido no de- senvolvimento tumoral, tais como, conforme exemplos não-limitantes de, VEGFR, VEGF, FGF (fator de crescimento de fibroblastos) ou qualquer membro da família do CXCR (receptor de quimiocina), tais como CXCR2 ou CXCR4.

Também adequados para menção são anticorpos antiCD20, tais como um rituximabe, ibritumomabe ou tositumomabe; anticorpos antiCD33, tais como gemtuzumabe ou lintuzumabe; anticorpos antiCD22, tais como epratuzumabe; anticorpos antiCD52, tal como alemtuzumabe; anticorpos antiEpCAM, tal como edrecolomabe, Ch 17-1A ou IGN-101; anticorpos an- tiCTP21 ou 16, tal como Xactina; anticorpos antiDNA-Ag, tal como 131I- Cotara TNT-1; anticorpos antiMUCI, tais como pemtumomabe ou R1150; anticorpos antiMUCI8, tal como ABX-MA1; anticorpos antiGD3, tal como mitumomabe; anticorpos antiECA, tais como CeaVac ou labetuzumabe; anti- corpos antiCA125, tal como OvaRex; anticorpos anti-HLA-DR, tal como apo- lizumabe; anticorpos antiCTLA4, tal como MDX-010; anticorpos antiPSMA, tal como MDX-070, 111In & 90Y-J591, 177Lu J591, J591-DM1; anticorpos anti- Lewis Y, tal como IGN311; anticorpos antiangiogênese tais como AS1405 e 90YmuBCI; anticorpos antiTrail-R1, tais como TRAIL RImAb ou TRAIL R2mAb.

Os anticorpos bispecíficos ou bifuncionais constituem uma se- gunda geração de anticorpos monoclonais em que duas regiões variáveis diferentes são combinadas na mesma molécula (Hollinger and Bohlen, 1999, Câncer and metastasis, rev. 18:411-419). Sua utilidade foi demonstrada tan- to em domínios diagnósticos como terapêuticos em relação à sua capacida- de de alcançar novas funções efetoras ou visar várias moléculas na superfí- cie de células tumorais; tais anticorpos podem ser obtidos por métodos quí- micos (Glennie MJ et ai, 1987, J. Imunol. 139, 2367-2375; Repp R. et ai, 1995, J. Hemat., 377-382) ou métodos somáticos (Staerz U.D. and Bevan M.J., 1986, PNAS 83, 1453-1457; Suresh M.R. et ai, 1986, Method Enzy- mol, 121:210-228) mas também, preferencialmente, por técnicas de enge- nharia genética que permitem forçar a heterodimerização e dessa forma faci- Iitar a purificação do anticorpo buscado (Merchand et ai, 1998, Nature Bio- tech., 16:677-681).

Estes anticorpos bispecíficos podem ser construídos como IgG inteiro, Fab'2 bispecífico, Fab1PEG, diacorpos ou scFv bispecífico, mas tam- bém como um anticorpo bispecífico tetravalente no qual dois sítios de Iiga- IG ção «stão presentes para cada antígeno visado (Park et al., 2000, Mol. Im- munol, 37 (18): 1123-30) ou os fragmentos do mesmo como descrito acima.

Além de uma dada vantagem econômica que a produção e a administração de um anticorpo bispecífico são mais econômicas do que a produção de dois anticorpos específicos, o uso de tais anticorpos bispecífi- cos tem a vantagem de reduzir a toxicidade do tratamento. De fato, o uso de um anticorpo bispecífico permite reduzir a quantidade total de anticorpos circulantes e, consequentemente, toxicidade possível.

Em uma modalidade preferencial da invenção, o anticorpo bis- pecífico é um anticorpo bivalente ou tetravalente. Por fim, a presente invenção refere-se ao anticorpo descrito a-

cima, ou seus compostos derivados ou fragmentos funcionais, para uso co- mo um fármaco.

A invenção refere-se também a uma composição farmacêutica compreendendo como um ingrediente ativo um composto consistindo em um anticorpo da invenção, ou um dos seus compostos derivados ou fragmentos funcionais. Preferencialmente, o dito anticorpo é suplementado por um exci- piente e/ou um veículo farmaceuticamente aceitável·

Ainda de acordo com outra modalidade, a presente invenção refere-se também a uma composição farmacêutica como descrita acima que compreende pelo menos um segundo composto antitumoral selecionado entre os compostos capazes de inibir especificamente a atividade de tirosina quinase de receptores, tais como IGF-IR, EGFR, HER2/neu, cMET, VEGFR ou VEGF, ou qualquer outro composto antitumoral conhecido por uma pes- soa versada na técnica . Em um segundo aspecto preferencial da invenção, o dito segundo composto pode ser selecionado entre os anticorpos antiEG- FR1 antilGF-IR, antiHER2/neu, anticMET, VEGFR, VEGF, etc., isolado, ou seus fragmentos funcionais e compostos derivados, capazes de inibir a ativi- dade proliferativa e/ou antiapoptótica e/ou angiogênica e/ou indutiva da dis- seminação metastática promovida pelos ditos receptores.

Ainda de acordo com outra modalidade da invenção, a composi- ção compreende, além disso, como um produto de combinação para uso de urna maneiia simultânea, separada ou extensa, pelo menos um inibidor de atividade tirosina quinase de receptores, tais como IGF-IR, EGFR, HER2/neu, cMET e VEGFR.

Em outra modalidade preferencial, o dito inibidor da atividade tirosina quinase destes receptores é selecionado a partir do grupo compre- endendo agentes naturais derivados, dianilinoftalimidas, pirazolo- ou pirrolo- piridopirimidinas ou quinazolinas. Tais agentes de inibição, bem-conhecidos por uma pessoa versada na técnica, estão descritos na literatura (Ciardiello F., Drugs 2000, Suppl. 1, 25-32).

Outra modalidade complementar à invenção consiste em uma composição como descrita acima compreendida, além disso, como um pro- duto de combinação para uso simultâneo, separado ou estendido, um agen- te citotóxico/citostático.

"Uso simultâneo" significa a administração de ambos os com- postos da composição compreendida em uma forma de dosagem única.

"Uso separado" significa a administração, ao mesmo tempo, de ambos os compostos da composição, compreendida em formas de dosagem distintas.

"Uso estendido" significa a administração sucessiva de ambos os compostos da composição, cada um compreendido em uma forma de dosagem distinta.

Geralmente, a composição de acordo com a invenção aumenta consideravelmente a eficácia de tratamento de câncer. Em outras palavras, o efeito terapêutico do anticorpo da invenção é aumentado de um modo i- nesperado pela administração de um agente citotóxico. Outra vantagem subsequente principal produzida por uma composição da invenção refere-se à possibilidade de usar doses mais baixas eficazes do ingrediente ativo, dessa forma permitindo evitar ou reduzir os riscos do aparecimento de efei- tos colaterais, em particular o efeito do agente citotóxico. Além disso, esta composição permite atingir o efeito terapêutico esperado mais rapidamente.

"Agente anticâncer terapêutico" ou "agente citotóxico" quer dizer uma substância que, quando é administrada a um paciente, trata ou previne o desenvolvimento de câncer no paciente. Exemplos não-limitantes de tais agentes incluem agentes "alquiiantes", antimetabolitos, antibióticos antitumo- rais, inibidores mitóticos, inibidores de funcionamento de cromatina, antian- giogênicos, antiestrógenos, antiandrógenos e imunomoduladores.

Tais agentes, por exemplo, são citados em VlDAL, na página dedicada a compostos relacionados à oncologia e hematologia sob o título "Cytotoxic"; os compostos citotóxicos citados por referência a este documen- to são citados neste pedido como agentes citotóxicos preferenciais.

"Agente alquilante" refere-se a qualquer substância que pode se ligar covalentemente com ou pode alquilar qualquer molécula, preferencial- mente um ácido nucleico (por exemplo, DNA), dentro de uma célula. Exem- plos de tais agentes alquiiantes incluem mostardas nitrogenadas, tais como mecloretamina, clorambucil, melfalan, cloridrato, pipobroman, prednimustina, fosfato dissódico ou estramustina; oxazafosforinas, tal como ciclofosfamida, altretamina, trofosfamida, sulfofosfamida ou ifosfamida; aziridinas ou etileno- iminas, tais como tiotepa, trietilenoamina ou altetramina; nitrosouréias, tais como carmustina, estreptozocina, fotemustina ou lomustina; alquil sulfona- tos, tais como bussulfano, treossulfano ou improssulfano; triazenos, tal como dacarbazina; ou complexos de platina, tais como cisplatina, oxaliplatina ou carboplatina.

"Antimetabolito" refere-se a uma substância que bloqueia o

crescimento e/ou metabolismo celular pela interferência com certas ativida- des, geralmente síntese de DNA. Exemplos de antimetabolitos incluem me- totrexato, 5-fluorouracila, floxuridina, 5-fluorodeoxiuridina, capecitabina, cita- rabina, fludarabina, citosina arabinosídeo, 6-mercaptopurina (6-MP), 6- tioguanina (6-TG), clorodesoxiadenosina, 5-azacitidina, gencitabina, cladribi- na, deoxicoformicina e pentostatina.

"Antibiótico antitumoral" refere-se a um composto que pode pre- venir ou inibir a síntese do DNA, RNA e/ou proteínas. Exemplos de tais anti- bióticos antitumorais incluem doxorrubicina, daunorrubicina, idarrubicina, valrubicina, mitoxantrona, dactinomicina, mitramicina, plicamicina, mitomici- na C, bleomicina e procarbazina.

"Inibidores mitóticos" previnem a progressão normal do ciclo ce- lular e mitose.

Em geral, inibidores de microtúbulo ou "taxoides", tais como pa- clitaxel e docetaxel são capazes de inibir mitose. Os alcalóides da vinca, tais como vinblastina, vincristina, vindesina e vinorrelbina, são também capazes de inibir mitose.

"Inibidores de cromatina" ou "inibidores de topoisomerase" são substâncias que inibem o funcionamento normal de proteínas que formam cromatina, tais como topoisomerases I e II. Exemplos de tais inibidores in- cluem, para topoisomerase I, camptotecina e seus derivados, tais como iri- notecano ou topotecano; para topoisomerase II, etoposídeo, fosfato de eti- posídeo e teniposídeo.

Um "antiangiogênico" é qualquer fármaco, composto, substância ou agente que inibe o crescimento dos vasos sangüíneos. Exemplos de an- tiangiogênicos incluem, sem ser limitativos, razoxina, marimastato, batimas- tato, prinomastato, tanomastato, ilomastato, CGS-27023A, halofuginona, COL-3, neovastato, BMS-275291, talidomida, CDC 501, DMXAA, L-651582, esqualamina, endostatina, SU5416, SU6668, interferon-alfa, EMD 121974, interleucina-12, IM862, angiostatina e vitaxina.

"Antiestrógeno" ou "antagonista de estrogênio" refere-se a qual- quer substância que reduz, antagoniza ou inibe a ação de estrogênio. E- xemplos de tais agentes são tamoxifeno, toremifeno, raloxifeno, droloxifeno, iodoxifeno, anastrozol, Ietrozol e exemestano. "Antiandrógeno" ou "antagonista de andrógeno " refere-se a qualquer substância que reduz, antagoniza ou inibe a ação de andrógeno. Exemplos de antiandrógenos incluem flutamida, nilutamida, bicalutamida, espironolactona, acetato de ciproterona, finasterida e cimitidina.

Imunomoduladores são substâncias que estimulam o sistema imune. Exemplos de imunomoduladores incluem o interferon, interleucinas, tais como aldesleucina, OCT-43, denileucina diftitox ou interleucina-2, fato- res de necrose tumoral, tais como tasonermina, ou outros tipos de imuno- moduladores, tais como lentinano, sizofirano, roquinimex, pidotimode, pega- demase, timopentina, poli l:C ou Ievamisol em combinação com 5- fluorouracila.

Para detalhes adicionais, uma pessoa versada na técnica pode referir-se ao manual publicado pela French Association of Therapeutic Che- mistry Teachers intitulado "Therapeutic chemistry, vol. 6, Antitumor drugs and perspectives in the treatment of câncer, TEC and DOC Edition, 2003 [em francês]".

Em uma modalidade particularmente preferencial, a dita compo- sição da invenção como um produto de combinação é caracterizada pelo fato de que o dito agente citotóxico está ligado quimicamente ao dito anticor- po para uso simultaneamente.

Em uma modalidade particularmente preferencial, a dita compo- sição é caracterizada pelo fato de que o dito agente citotóxico/citostático é selecionado entre os inibidores ou estabilizadores de fuso, preferencialmente vinorrelbina e/ou vinflunina e/ou vincristina.

A fim de facilitar a ligação entre o dito agente citotóxico e o anti- corpo de acordo com a invenção, moléculas espaçadoras podem ser intro- duzidas entre os dois compostos para ligar, tais como o poli(alquileno)glicol polietilenoglicol ou os aminoácidos; ou, em outra modalidade, os ditos deri- vados ativos dos agentes citotóxicos, nos quais foram introduzidas funções capazes de reação com o dito anticorpo, podem ser usados. Estas técnicas de ligação são bem-conhecidas para uma pessoa versada na técnica e não serão discutidas mais detalhadamente no presente relatório descritivo. Outros inibidores de EGFR incluem, sem ser Iimitativos1 anticor- pos monoclonais C225 e antiEGFR 22Mab (ImCIone Systems Incorporated), ABX-EGF (Abgenix/Cell Genesys), EMD-7200 (Merck KgaA) ou compostos ZD-1834, ZD-1838 e ZD-1839 (AstraZeneca)1 PKI-166 (Novartis)1 PKI- 166/CGP-75166 (Novartis)1 PTK 787 (Novartis)1 CP 701 (CephaIon)1 fluno- mida (Pharmacia/Sugen), CI-1033 (Warner Lambert Parke Davis), Cl- 1033/PD 183, 805 (Warner Lambert Parke Davis), CL-387, 785 (Wyeth- Ayerst), BBR-1611 (Boehringer Mannheim GMBH/Roche), Naamidina A (Bristol-board Myers Squibb), RC-3940-II (Pharmacia), BIBX-1382 (Boehrin- ger Ingelheim), OLX-103 (Merck & Co), VRCTC-310 (Ventech Research), toxina de fusão de EGF (Seragen Inc) DAB-389 (Seragen/Lilgand), ZM- 252808 (Imperial Câncer Research Fund), RG-50864 (INSERM), LFM-A12 (Parker Hughes Center Câncer), WHI-P97 (Parker Hughes Center Câncer), GW-282974 (Glaxo), KT-8391 (Kyowa Hakko) ou "vacina de EGFR" (York Medicai/Centro of Immunologia Molecular).

Outro aspecto da invenção refere-se a uma composição caracte- rizada pelo fato de que pelo menos um dos ditos anticorpos, ou dos compos- tos derivados ou fragmentos funcionais dos mesmos, é conjugado com uma toxina celular e/ou um radioisótopo.

Preferencialmente, a dita toxina ou o dito radioisótopo é capaz de prevenir o crescimento ou proliferação da célula tumoral, especialmente inativando completamente a dita célula tumoral.

Também preferencialmente, a dita toxina é uma toxina entero- bacteriana, especialmente exotoxina A de Pseudomonas.

Os radioisótopos preferencialmente combinados com anticorpos terapêuticos são radioisótopos que emitem raios gama, preferencialmente iodo131, ítrio90, ouro199, paládio100, cobre67, bismuto217 e antimônio211. Os ra- dioisótopos que emitem raios alfa e beta também podem ser usados na te- rapia.

"Toxina ou radioisótopo combinado com pelo menos um anticor- po da invenção, ou fragmento funcional do mesmo" refere-se a qualquer meio que permite ligar a dita toxina ou o dito radioisótopo a pelo menos um anticorpo, especialmente por ligação covalente entre os dois compostos, com ou sem a introdução da molécula de ligação.

Exemplos de agentes que permitem ligação química (covalente), eletrostática, ou não-covalente de todo ou parte dos elementos do conjugado incluem, especialmente, benzoquinona, carbodi-imida e mais particularmente EDC (1-etil-3-[3-dimetil-aminopropil]- carbodi-imida-cloridrato), dimaleimida, ácido ditiobis-nitrobenzoico (DTNB), N-succinimidil S-acetil tio-acetato (SA- TA), agentes que formam pontes com um ou mais grupos, com um ou mais grupos fenilasida, reagindo com raios ultravioleta (UV), o mais preferencial- mente N-[-4(azidossalicilamino)butil]-3,-(2'-piridilditio)-propionamida (APDP), N-succinimid-il 3 (2-piridilditio) propionato (SPDP) e 6-hidrazino-nicotinamida (HYNIC).

Outra forma de ligação, especialmente para radioisótopos, pode consistir no uso de agentes quelantes de íon bifuncionais.

Exemplos de tais quelantes incluem quelantes derivados de ED- TA (ácido etilenodiaminotetra-acético) ou DTPA (ácido dietilenotriaminopen- ta-acético) que foram desenvolvidos para ligar metais, particularmente me- tais radioativos, com imunoglobulinas.

Dessa forma, DTPA e seus derivados podem ser substituídos na cadeia de carbono por vários grupos de tal modo para aumentar a estabili- dade e a inflexibilidade do complexo metálico pelo Iigante (Krejcarek et ai, 1977; Brechbiel et ai, 1991; Gansow, 1991; patente US 4.831.175).

Por exemplo, DTPA (ácido dietilenotriaminopenta-acético) e seus derivados, que foram amplamente usados em fármacos e biologia em sua forma livre ou em um complexo com um íon metálico, exibe a caracterís- tica notável de formar quelatos estáveis com íons metálicos que podem ser ligados com a proteínas de interesse terapêutico ou diagnóstico, tais como anticorpos, para o desenvolvimento de conjugados radioimuno para a terapia de câncer (Meases et ai, 1984; Gansow et ai, 1990).

Também preferencialmente, pelo menos um dito anticorpo da invenção formando o dito conjugado é selecionado entre seus fragmentos funcionais, especialmente fragmentos que perderam seu componente Fc, tal como fragmentos de scFv.

A presente invenção também compreende o uso da composição para a preparação de um fármaco destinado para a prevenção ou tratamento de câncer.

A presente invenção também refere-se ao uso de um anticorpo,

ou um composto derivado ou fragmento funcional do mesmo, preferencial- mente humanizado, e/ou de uma composição de acordo com a invenção para a preparação de um fármaco para inibição do crescimento de células tumorais. Geralmente, a presente invenção refere-se ao uso de um anticor- po, ou um composto derivado ou fragmento funcional do mesmo, preferenci- almente humanizado, e/ou de uma composição, para a preparação de um fármaco para prevenção ou tratamento de câncer.

Cânceres preferenciais que podem ser prevenidos e/ou tratados incluem câncer de próstata, osteossarcoma, câncer de pulmão, câncer de mama, câncer endometrial, câncer de cólon, mieloma múltiplo, câncer ovari- ano, câncer pancreático ou qualquer outro câncer.

Em uma maneira preferencial, o dito câncer é um câncer esco- lhido entre câncer de mama relacionado ao estrogênio, câncer de pulmão de células não-pequenas, câncer de cólon e/ou câncer pancreático.

Outro aspecto da presente invenção refere-se ao uso do anticor- po como descrito em um método diagnóstico, preferencialmente in vitro, de doenças relacionadas ao nível de expressão de JAM-A. Preferencialmente, a dita proteína JAM-A relacionada a doenças no dito método diagnóstico serão cânceres.

Dessa forma, os anticorpos da invenção, ou os compostos deri- vados ou fragmentos funcionais dos mesmos, podem ser empregados em um método para a detecção e/ou quantificação da proteína JAM-A em uma amostra biológica in vitro, especialmente para o diagnóstico de doenças as- sociadas com uma expressão anormal com esta proteína, tais como cânce- res, em que o dito método compreende as seguintes etapas:

a) colocação da amostra biológica em contato com um anticorpo de acordo com a invenção, ou um composto derivado ou fragmento funcional do mesmo;

b) demonstração do complexo de anticorpo-antígeno possivel- mente formado.

Dessa forma, a presente invenção também compreende os con- juntos ou acessórios para a implementação de um método como descrito (para detecção da expressão de um gene de Legionella pneumophila Paris ou de um organismo associado, ou para detecção e/ou identificação de bac- térias Legionella pneumophila Paris ou micro-organismos associados), com- preendendo os seguintes elementos:

a) um anticorpo policlonal ou monoclonal da invenção;

b) opcionalmente, reagentes para constituição do meio favorável a reações imunológicas;

c) opcionalmente, reagentes que revelam os complexos antíge- no-anticorpos produzidos pela reação imunológica.

Vantajosamente, os anticorpos ou fragmentos funcionais dos mesmos podem ser imobilizados em um suporte, especialmente um pedaço proteico. Tal pedaço proteico é um objeto da invenção.

Vantajosamente, os pedaços proteicos podem ser usados nos conjuntos ou acessórios necessários para detecção e/ou quantificação da proteína JAM-A em uma amostra biológica.

Deve ser afirmado que o termo "amostra biológica" refere-se neste pedido a amostras tomadas de um organismo vivo (especialmente sangue, tecido, órgão ou outras amostras tomadas de um mamífero, especi- almente homem) ou qualquer amostra suscetível para conter tal proteína JAM-A (tal como uma amostra de células, transformadas se necessário).

O dito anticorpo, ou um fragmento funcional do mesmo, pode estar na forma de um imunoconjugado ou de um anticorpo marcado a fim de obter um sinal detectável e/ou quantificável.

Os anticorpos marcados da invenção, ou funcionais ou fragmen- tos dos mesmos, incluem, por exemplo, conjugados de anticorpo (imunocon- jugados), que podem ser combinados, por exemplo, com enzimas, tais como peroxidase, fosfatase alcalina, α-D-galactosidase, glicose oxidase, glicose amilase, anidrase carbônica, acetilcolinesterase, lisozima, malato desidroge- nase ou glicose 6 fosfato desidrogenase ou por uma molécula, tal como bio- tina, digoxigenina ou 5-bromo-desoxiuridina. Marcadores fluorescentes tam- bém podem ser combinados com os anticorpos da invenção ou fragmentos funcionais dos mesmos, incluindo especialmente fluoresceína e seus deriva- dos, fluorocromo, rodamina e seus derivados, proteína fluorescente verde (GFP), dansil, umbeliferona, etc. Em tais conjugados, os anticorpos da in- venção ou fragmentos funcionais dos mesmos, podem ser preparados por métodos conhecidos a uma pessoa versada na técnica. Podem estar ligados com enzimas ou marcadores fluorescentes diretamente; através de um gru- po espaçador ou um grupo de ligação, tal como polialdeído, glutaraldeído, ácido etilenodiaminotetra-acético (EDTA) ou ácido dietilenotriaminopenta- acético (DPTA); ou na presença de agentes de ligação, tais como os men- cionados acima para conjugados terapêuticos. Conjugados que transportam marcadores fluoresceína podem ser preparados pela reação com um isotio- cianato.

Outros conjugados também podem incluir marcadores quimiolu- minescentes, tais como Iuminol e dioxetano, marcadores bioluminescentes, tais como Iuciferase e luciferina, ou marcadores radioativos tais como io- do123, iodo125, iodo126, iodo133, bromo77, tecnécio99m, índio111, índio113m, gá- Iio67, gálio68· rutênio95, rutênio97, rutênio103, rutênio105, mercúrio107, mercú- rio203, rênio99m, rênio101, rênio105, escândio47, telúrio121m, telúrio122m, telú- no125m, túlio165, túlio167, túlio168, flúor18, ítrio199 e iodo131. Métodos existentes conhecidos por uma pessoa versada na técnica para ligação de radioisóto- pos com anticorpos, diretamente ou através de um agente quelante, tais co- mo o EDTA ou DTPA acima mencionados, podem ser usados como diag- nósticos com radioisótopos. Dessa forma deveria ser mencionado marcação com [I125JNa pela técnica cloramina-T [Hunter W.M and Greenwood F.C. (1962) Nature 194:495]; marcação com tecnécio99m como descrito por Crock- ford et al. (Patente U.S. 4.424.200) ou ligado através DTPA como descrito por Hnatowich (Patente U.S. 4.479.930).

A invenção refere-se também ao uso de um anticorpo de acordo com a invenção para preparação de um fármaco para alvo específico de um composto que é biologicamente ativo em direção a células que expressam ou superexpressam proteína JAM-A.

No sentido do presente relatório descritivo, um "composto biolo- gicamente ativo" é qualquer composto capaz de modulação, especialmente inibição, atividade celular, especialmente crescimento, proliferação, transcri- ção e tradução gênica.

A invenção refere -se também a um reagente diagnóstico in vivo composto de um anticorpo de acordo com a invenção, ou fragmento Οποίο- ι O nal do mesmo, preferencialmente marcado, especialmente radiomarcado, e seu uso em imagem médica, especialmente para a detecção de câncer rela- cionado à expressão ou superexpressão celular da proteína JAM-A.

A invenção refere-se também a uma composição como um pro- duto de combinação ou a um conjugado anti-JAM-A/toxina ou radioisótopo, de acordo com a invenção, usada como fármaco.

Preferencialmente, a dita composição como um produto de com- binação ou o dito conjugado será complementado por um excipiente e/ou um veículo farmacêutico.

No presente relatório descritivo, "veículo farmacêutico" significa um composto, ou uma combinação de compostos, introduzindo uma compo- sição farmacêutica que não causa reações secundárias e que, por exemplo, facilita a administração dos compostos ativos, aumentando a biodisponibili- dade e/ou eficácia no organismo, aumentando sua solubilidade na solução ou melhorando seu armazenamento. Tais veículos farmacêuticos são bem- conhecidos e serão adaptados por uma pessoa versada na técnica de acor- do com a natureza e a via de administração dos compostos ativos selecio- nados.

Preferencialmente, tais compostos serão administrados por via sistêmica, especialmente por via intravenosa, intramuscular, intradérmica, intraperitoneal, subcutânea ou oral. Mais preferencialmente, a composição composta do anticorpo de acordo com a invenção será administrada em vá- rias doses espaçadas igualmente ao longo do tempo. Suas vias de administração, doses agendadas e formas galêni- cas ótimas podem ser determinadas de acordo com os critérios geralmente considerados quando estabelecido um tratamento ajustado a um paciente tal como, por exemplo, a idade do paciente ou peso corporal, a gravidade do seu estado geral, sua tolerância ao tratamento e os efeitos colaterais expe- rimentados. Dessa forma, a invenção refere-se ao uso de um anticorpo, ou um de seus fragmentos funcionais, para a preparação de um fármaco para o alvo específico de um composto que é biologicamente ativo em relação a células que expressam ou superexpressam JAM-A.

Outras características e vantagens da invenção aparecem, além disso, no relatório descritivo com os exemplos e figuras cujas legendas são apresentadas abaixo. LEGENDAS DAS FIGURAS

A figura 1 mostra as seqüências respectivas das cadeias pesa- das e leves do anticorpo de murino 6F4. CDRs estão sublinhadas e em ne- grito (de acordo com a numeração Kabat). As figuras 2A e 2B representam os respectivos alinhamentos das regiões V (figura 2A) e J (figura 2B) de an- ticorpo de murino 6F4 e as linhagens celulares murinas selecionadas, ou seja, IGKV19-93*01 (SEQ ID N0 39) para a região V e IGKJ1*01 (SEQ ID N0 40) para a região J.

As figuras 3A e 3B representam os alinhamentos respectivos das regiões V (figura 3A) e J (figura 3B) de anticorpo de murino 6F4 e as linhagens celulares humanas selecionadas, ou seja, IGKV1-33*01 (SEQ ID N0 41) para a região Ve IGKJ1*01 (SEQ ID N0 42) para a região J.

A figura 4 representa a seqüência proteica da cadeia leve do anticorpo 6F4 com referência aos respectivos sistemas de numeração KA- BAT e iMGT. As figuras 5A, 5B e 5C representam os alinhamentos respecti- vos das regiões V (figura 5A), D (figura 5B) e J (figura 5C) do anticorpo de murino 6F4 e as linhagens celulares murinas selecionadas, ou seja, I- GHV1S135*01 (SEQ ID N0 43) para a região V, lgHD-ST4*01 (SEQ ID N0 44) para a região D e lgHJ2*01 (SEQ ID N0 45) para a região J.

As figuras 6A, 6B e 6C representam os alinhamentos respectivos das regiões V (figura 6A), D (figura 6B) e J (figura 6C) do anticorpo de muri- no 6F4 e as linhagens celulares humanas selecionadas, ou seja, IGHV1-f*01 (SEQ ID N0 46) para a região V, IGHD1-1*01 (SEQ ID N0 47) para a região D e IGHJ4*01 (SEQ ID N0 48) para a região J.

A figura 7 representa a seqüência proteica da cadeia pesada do anticorpo 6F4 com referência aos respectivos sistemas de numeração KA- BAT e IMGT.

As figuras 8A e 8B representam a imunopurificação em 6F4- sefarose de antígeno 6F4 de membranas celulares HT-29. As análises de frações coletadas por eletroforese em SDS-PAGE (figura 8A) e western blot (figura 8B) são também apresentadas.

As figuras 9A e 9B apresentam uma análise por eletroforese em SDS-PAGE (figura 9A) e western blot (figura 9B) da proteína imunopurifica- da. Duas purificações (#1 e #2) foram realizadas e analisadas sob condições redutoras e não-redutoras.

A figura 10 apresenta uma análise por espectrofotometria de massa MALDI-TOF da mistura de peptídeos extraídos após hidrólise tríptica.

As figuras 11A e 11B consistem na confirmação de uma proteína identificada pelo western blot (condições não-redutoras): revelada usando anticorpo 6F4 (figura 11A) e anticorpo policlonal anti-humano JAM-A (figura 11B).

A figura 12 mostra a especificidade do anticorpo 6F4 para a pro- teína JAM-A humana. As quantidades depositadas para cada proteína são 250 ng, 25 ng e 10 ng.

A figura 13 representa sensorgramas obtidos após 2 minutos de injeção (flecha dupla) do anticorpo 6F4 em 100 nm de tampão HBS-EP em proteína Fc JAMI murina (Céiuia de fiuxo #1, gráfico inferior) e em proteína Fc JAM1 murina (Célula de fluxo #2, gráfico superior) com um tempo de dis- sociação a 25°C por 5 minutos e velocidade de fluxo de 30 pL/min (CM4: m- JAMI-Fc 501,6 RU(FcI) e 511,5 RU(Fc2)).

A figura 14 representa sensorgramas obtidos com uma referên- cia dupla, (Fc2-Fc1)6F4(Fc2-Fc1)HBS-EP. A curva é ajustada usando um modelo de ligação Langmuir A+B. Os parâmetros cinéticos calculados (curva preta) são como se segue: ka = (1,38 ± 0,001) *105 M'1s"1; kd = (0,25 ± 1,58) *10'6 s"1; Rmax (ajuste global) = 371 RU; D2= 0,853.

A figura 15 ilustra a atividade antitumoral do anticorpo 6F4 em um modelo xenoenxerto de células MCF-7 no camundongo Swiss nus. O anticorpo 6F4 foi testado por via IP na forma não-purificada (fluido de cavi- dade peritoneal), na dose teórica de 250 pg/camundongo, duas vezes por semana. O anticorpo 9G4 é um anticorpo do mesmo isotipo (IgGI)1 não- relevante com respeito à atividade medida.

A figura 16 ilustra a expressão de proteína JAM-A reconhecida por Mab 6F4 na superfície de várias linhagens tumorais.

A figura 17 representa a seqüência do domínio VL 6F4 humani- zado em que:

* corresponde a aminoácidos modificados de facto das suas con- trapartes humanas, 1 corresponde a aminoácidos analisados por suas capa- cidades de serem humanizados, o resíduo humano que é indicado abaixo do sinal, e 2 corresponde a aminoácidos que permanecem murinos no domínio VL 6F4 humanizado.

A figura 18 representa a seqüência do domínio VH 6F4 humani- zado em que:

* corresponde a aminoácidos modificados de facto das suas con- trapartes humanas, 1 corresponde a aminoácidos analisados por suas capa- cidades de serem humanizados, o resíduo humano que é indicado abaixo do sinal, e 2 corresponde a aminoácidos que permanecem murinos no domínio VH 6F4 humanizado.

A figura 19 ilustra a regulação para baixo in vitro de JAM-A pelo

6F4 Mab.

A figura 20 ilustra a inibição in vivo da proliferação de célula tu- moral induzida pelo 6F4 MAb.

A figura 21 representa a regulação para baixo in vivo de JAM-A pelo 6F4 Mab.

A figura 22 representa curvas da comparação 6F4 e seu frag- mento F(ab')2 no modelo MCF-7 in vivo.

A figura 23 ilustra a comparação da expressão normal contra tumoral de JAM-A em tecidos de tireóide.

A figura 24 ilustra a comparação da expressão normal contra tumoral de JAM-A em tecidos de pulmão.

A figura 25 ilustra a comparação da expressão normal contra tumoral do JAM-A em tecidos de mama.

A figura 26 representa curvas ilustrando a atividade in vivo de 6F4 em carcinoma epidermoide xenoenxerto A431em camundongos nus. A figura 27 ilustra o efeito do anticorpo 6F4 em A. Iinfoprolifera-

ção não-específica induzida com PHA e B. processo de apresentação de antígeno. Primeiro experimento com 2 doadores independentes.

A figura 28 ilustra o efeito do anticorpo 6F4 em A. Iinfoprolifera- ção não-específica induzida com PHA e B. processo de apresentação de antígeno. Segundo experimento com 2 doadores independentes.

A figura 29 ilustra a agregação plaquetária em 10 doadores nor- mais humanos. Resultados são esperados como média ± dp.

A figura 30 representa a liberação de serotonina em 10 doadores normais humanos. Resultados são esperados como média ± dp.

A figura 31 representa o alinhamento do domínio VH 6F4 e gene da linhagem germinativa IGHV1-03*01 (SEQ ID N0 49). EXEMPLOS

Exemplo 1: Geração do anticorpo 6F4

Para gerar o anticorpo monoclonal murino (Mab)1 camundongos BALB/C foram imunizados usando 5x106 células MCF-7 a partir do ATCC. Após uma injeção de reforço final de 107 células MCF-7, células de Iinfono- dos de camundongos são fundidas com células de mieloma Sp2/0-Ag14 usando as técnicas classicamente descritas por Kohler e Milstein. Os sobre- nadantes hibridomas resultantes da fusão então foram selecionados para atividade funcional, ou seja, a inibição da proliferação de células MCF-7 in vitro.

Para esta seleção, as células MCF-7 são cultivadas em discos de cultura de 96 poços em 5x103 células/poço em 100 μΙ_ do meio de hibri- doma sem soro fetal de bezerro. As placas são incubadas durante 24 horas a 37°C sob uma atmosfera de CO2 a 5%. Após 24 horas, 50 μΙ_ do sobrena- dante dos hibridomas a serem selecionados são adicionados a cada poço. A última linha na placa é reservada para os controles:

- três poços são suplementados por 50 μΙ_ de sobrenadante de hibridoma que é não-relevante com respeito à atividade buscada e que é cultivado no mesmo meio de cultura como aquele usado para as células fu- sionadas. Estes poços serão usados para calibrar o impacto do sobrenadan-

te inativo na incorporação de timidina tritiada;

- três poços receberão 50 μΐ_ do meio de cultura de hibridoma.

Após aproximadamente 52 horas de cultura, cada poço é suple- mentado por 0,25 μΟΐ de [3H]timidina e incubado novamente durante 20 ho- ras a 37°C. A incorporação de [3H]timidina no DNA1 indicando proliferação

celular, é quantificada pela medida da cintilação líquida. O ruído de fundo e os limiares são determinados para cada placa como uma função dos poços de controle contendo o meio sozinho e sobrenadante do hibridoma não- relevante.

Por este método, 43 hibridomas secretando anticorpos inibindo o crescimento de células MCF-7 foram selecionados após uma primeira sele- ção. Onze destes 43 hibridomas tiveram fraco crescimento ou não-existente e foram abandonados. Durante os testes de proliferação realizados após a expansão e a clonagem dos hibridomas, somente os hibridomas cujo sobre- nadante tinha uma atividade de inibição >20% sobre a proliferação de célu- Ias MCF-7 foram selecionados. No fim do processo de clonagem/seleção, somente um clone mostrou ter as propriedades necessárias, o clone 6F4. Exemplo 2: Processo de humanizacão por enxerto da CDR da região variá- vel da cadeia leve do anticorpo 6F4 (6F4 VL)

a) Comparação da seqüência nucleotídica de 6F4 VL com todas as sequên- cias de linhagens celulares murinas conhecidas

Como uma etapa preliminar na humanização pelo enxerto da CDR, a seqüência nucleotídica de 6F4 VL inicialmente foi comparada com todas as seqüências de linhagens celulares murinas presentes no banco de dados IMGT (endereço de Internet: http://imgt.cines.fr).

As regiões VeJ das linhagens celulares de camundongo que têm uma identidade de seqüência de 98,56% da região V e 100% da região J foram identificadas, respectivamente IGKV19-93*01 (SEQ ID N0 39, no- menclatura EMBL: AJ235935) e IGKJ1*01 (SEQ ID N0 40, nomenclatura EMBL: V00777).

Considerando estas porcentagens de identidade, decidiu-se usar a seqüência de 6F4 VL diretamente. Estes alinhamentos são representados na figura 2A para região

V e na figura 2B para região J.

b) Comparação da seqüência nucleotídica de 6F4 VL com todas as seqüên- cias de linhagens celulares humanas conhecidas.

A fim de identificar o melhor candidato humano para o enxerto da CDR, a linhagem germinativa de origem humana tem a identidade maior possível com 6F4 VL foi buscada. Para esta finalidade, a seqüência nucleo- tídica de camundongo 6F4 VL foi comparada com todas as seqüências de linhagens celulares humanas presentes na base de dados IMGT.

As regiões V e J de linhagens celulares de origem humana fo- ram identificadas com uma identidade de seqüência de 81,36% da região V, ou seja, IGKV1-33*01 (SEQ ID N0 41, nomenclatura EMBL: M64856) e 86,84% da região J, ou seja, IGKJ1*01 (SEQ ID N0 42, nomenclatura EMBL: J00242).

As linhagens celulares IGKV1-33*01 para a região V e IGKJ 1*01 para a região J foram dessa forma selecionadas como seqüências do recep- tor humano para CDRs de 6F4 VL de camundongo.

Estes alinhamentos são apresentados na figura 3A para a região

V e na figura 3B para a região J.

c) Versões humanizadas de 6F4 VL

A etapa seguinte no processo de humanização consiste na jun-

ção em conjunto das seqüências das linhagens celulares IGKV1-33*01 e IGKJ1*01 e então a junção das CDRs de 6F4 VL de camundongo às regiões de estrutura destas mesmas linhagens germinativas.

Este estágio do processo, o modelo molecular das regiões Fv de 6F4 de camundongo serão particularmente úteis na escolha dos resíduos de camundongo para conservar porque podem desempenhar um papel qual- quer na manutenção da estrutura tridimensional da molécula (estrutura ca- nônica de CDRs1 interfaces de VH/VL, etc.) ou na ligação do antígeno. Nas regiões de estrutura, cada diferença entre os nucleotídeos de camundongo (6F4 VL) e humano (IGKV1-33*01/IGKJ1*01) serão examinados muito cui- dadosamente.

Para mais clareza a seguir, a figura 4 apresenta a seqüência 6F4VL com referência a classificações KABAT e IMGT. Três resíduos muri- nos foram identificados os quais devem ser conservados.

Resíduo 33 (IIe) toma parte em CDR1 ancorando de acordo com IMGT e é parte de CDR1 de acordo com Kabat.

O resíduo 49 (His) toma parte em CDR2 ancorando de acordo com IMGT, toma parte na interface VH/VL e pertence à zona Vernier.

O resíduo 53 (Thr) toma parte em CDR2 ancorando de acordo com IMGT e é parte de CDR2 de acordo com Kabat.

Inicialmente, três modificações nas regiões de estrutura de IGKV1-33*01 e IGKJ 1*01 serão estudadas. Estas modificações relacionam- se aos resíduos 24, 69 e 71 (nomenclatura IMGT). Deveria ser entendido, naturalmente, que estas três modificações serão estudadas uma indepen- dentemente da outra e também em várias combinações. O objetivo é ter dis- ponível todos os mutantes possíveis a fim de testá-los e selecionar o mutan- te que conservou as melhores propriedades de ligação. Testes de ligação ELISA/Biacore serão dessa forma realizados em cada mutante.

O resíduo 24 (Lys/Gln) está próximo da CDR1 e seria como um resultado crítico para manter uma conformação que permita a propriedade de apresentação da própria CDR1. Mais particularmente, este resíduo é suscetível a interagir com resíduos 69 a 70 dentro da zona Vernier. Lys so- mente é pouco representada em VLs humanas mas é parte da CDR1 de a- cordo com Kabat. Embora o resíduo 69 (Arg/Thr) esteja na zona Vernier e dessa forma diretamente tome parte na estrutura canônica das CDR1's, este resí- duo é sempre Thr na VL humana.

Embora o resíduo 71 (Tyr/Phe) diretamente tome parte na estru- tura canônica das CDR1's, é sistematicamente Phe na VL humana.

Em segundo lugar, uma modificação do resíduo 56 (Ala) em Thr pode ser considerada. Este resíduo, embora fora das CDRs de acordo com IMGT, pertence a CDR2 de acordo com Kabat.

Terceira e última, duas modificações adicionais podem ser feitas nos resíduos 34 e 55 (nomenclatura IMGT). Os dois resíduos, fora das C- DRs definidas por IMGT, estão incluídas nas CDRs definidas por Kabat.

O resíduo 34 (Ala/Asn) pertence a CDR1 de acordo com Kabat e toma parte na interface VH/VL. Tal mutação permanece relevante apesar da representação forte de Ala no homem. O resíduo 55 (Gln/GIu) é parte de CDR2 de acordo com Kabat e

também toma parte na interface VH/VL. Tal mutação também permanece relevante apesar da representação forte do Gln no homem.

Como foi descrito acima, estas três mutações poderiam ser tes- tadas independentemente ou em várias combinações. Exemplo 3: Processo de humanizacão por enxerto da CDR da região variá- vel da cadeia pesada do anticorpo 6F4 (6F4 VH)

a) Comparação da seqüência nucleotídica de 6F4 VH com todas as seqüên- cias das linhagens celulares murinas conhecidas

Como uma etapa preliminar na humanização pelo enxerto de CDR, a seqüência nucleotídica de 6F4 VH inicialmente foi comparada com todas as seqüências de linhagens celulares murinas presentes no banco de dados IMGT (endereço de Internet: http://lmgt.cines.fr).

Regiões V, D e J de linhagens celulares murinas que têm uma identidade de seqüência de 99,30% da região V (IGHV1S135*01; SEQ ID N0 43; nomenclatura EMBL: AF304556), de 80% da região D (lgHD-ST4*01; SEQ ID N0 44; nomenclatura EMBL: M23243) e de 100% da região J (I- gHJ2*01; SEQ ID N0 45; nomenclatura EMBL: V00770). Estes alinhamentos são representados na figura 5A para a regi- ão V, figura 5B para a região D e figura 5 C para a região J.

Considerando estas porcentagens de identidade, decidiu-se usar a seqüência de 6F4 VH diretamente, como foi o caso de 6F4 VL.

b) Comparação da seqüência nucleotídica de 6F4 VH com todas as seqüên- cias de linhagens celulares humanas conhecidas

A fim de identificar o melhor candidato humano para enxerto de CDR, a linhagem germinativa de origem humana tem a identidade maior possível com cada uma das três regiões V, D e J de 6F4 VH que foi busca- da. Para esta finalidade, a seqüência nucleotídica do camundongo 6F4 VH foi comparada com todas as seqüências de linhagens celulares humanas presentes na base de dados IMGT.

Linhagens germinativas de origem humana foram identificadas tendo uma identidade de seqüência de 75,34% da região V (IGHV1- f*antígeno; SEQ ID N0 46; nomenclatura EMBL: Z12305), Nas regiões de estrutura, cada diferença entre de 71,42% da região D (IGHD1-1*01; SEQ ID N0 47; nomenclatura EMBL: X97051) e de 87,51% da região J (IGHJ4*01; SEQ ID N0 48; nomenclatura EMBL: J00256).

Para cada uma das regiões V, D e J, as linhagens germinativas acima foram selecionadas e reajustadas entre elas.

Estes alinhamentos são apresentados na figura 6A para a região V, figura 6B para a região D e figura 6C para a região J. c) Versões humanizadas de 6F4 VH

A etapa seguinte no processo de humanização consiste na jun- ção das seqüências de linhagens celulares IGHV1-f*01, IGHD1-1*01 e I- GHJ4*01 e então junção das CDRs de camundongo 6F4 VH às regiões de estrutura destas mesmas linhagens germinativas.

Esta etapa do processo do modelo molecular das regiões Fv 6F4 de camundongo serão particularmente úteis na escolha dos resíduos de ca- mundongo para conservar porque podem desempenhar um papel qualquer na manutenção da estrutura tridimensional da molécula (a estrutura canôni- ca de CDRs, interfaces de VH/VL, etc.) ou na ligação ao antígeno. Nas regi- ões de estrutura, cada diferença entre nucleotídeos de camundongo (6F4 VH) e humano (IGHV1-f*01, IGHD1-1*01 e IGHJ4*01) serão examinadas muito cuidadosamente.

Para mais clareza a seguir, a figura 7 apresenta a seqüência 6F4 VH com referência a classificações KABAT e IMGT.

Como foi o caso com a cadeia leve, quatro resíduos que devem permanecer inalterados foram identificados.

Resíduo 2 (IIe) é parte da zona Vernier e toma parte na estrutu- ração de CDR3.

O resíduo 35 (Tyr) toma parte em CDR1 ancorando de acordo

com IMGT, é parte de CDR1 de acordo com Kabat, e também toma parte na interface VH/VL e interage com CDR3.

O resíduo 50 (Tyr) toma parte na CDR2 ancorando de acordo com IMGT, é parte de CDR2 de acordo com Kabat, é também parte da zona Vernier e também toma parte na interface VH/VL.

O resíduo 59 (Arg) toma parte na CDR2 ancorando de acordo com IMGT, é parte de CDR2 de acordo com Kabat e toma parte na interface VH/VL.

Uma primeira versão humanizada será capaz de incluir três mu- tações em resíduos 61, 62 e 65, respectivamente (classificação IMGT).

Estes três resíduos são localizados em CDR2 de acordo com Kabat e tomam parte na interface VH/VL.

O resíduo 61 (Asn/Ala) não está diretamente envolvido no reco- nhecimento de antígeno. Sua mutação pode ser considerada dessa forma. O resíduo 62 (Gln/GIu) e resíduo 65 (Lys/Gln).

Em segundo lugar, duas modificações adicionais serão avalia- das. As duas modificações relacionam-se aos resíduos 48 e 74 (nomenclatu- ra IMGT).

O resíduo 48 (Ile/Met), pertencendo à região de estrutura, toma parte na interface VH/VL.

O resíduo 74 (Lys/Thr) é parte da zona Vernier e pode estar en- volvido na estruturação de CDR2. Terceiro e último, uma terceira série de mutações seria conside- rada, ou seja, uma modificação de resíduos 9 (Pro/Ala) e 41 (His/Pro). O objetivo é dessa forma, em um caminho similar às mutações planejadas quanto a 6F4 VL, para abordar a linhagem germinativa humana tão estreita- 5 mente quanto possível sem modificar a CDR ancorada.

Com objetivo de resumir somente, as tabelas 4 e 5 abaixo listam linhagens celulares usadas bem como, respectivamente, seus números de seqüência de aminoácidos e nucleotídeos.

Tabela 4

Linhagens Germinativas (ref. EMBL) SEQ ID No. IGKV19-93*01 (AJ235935) 39 IGKJ 1*01 (V00777) 40 IGKV1-33*01 (M64856) 41 IGKJ*01 (J00242) 42 IGHV1S135*01 (AF304556) 43 IGHD-ST4*01 (M23243) 44 IGHJ2*01 (V00770) 45 IGHV1-F*01 (Z12305) 46 IGHD1-1*01 (X97051) 47 IGHJ4*01 (J00256) 48 IGHV1-03*01 (X62109) 49 Tabela 5

Linhagens Germinativas (ref. EMBL) SEQ ID No. IGKV19-93*01 (AJ235935) 50 IGKJ 1*01 (V00777) 51 IGKV1-33*01 (M64856) 52 IGKJ*01 (J00242) 53 IGHV1S135*01 (AF304556) 54 IGHD-ST4*01 (M23243) 55 IGHJ2*01 (V00770) 56 IGHV1-F*01 (Z12305) 57 IGHD1-1*01 (X97051) 58 IGHJ4*01 (J00256) 59 IGHV1-03*01 (X62109) 60 Exemplo 4: Purificação e identificação do antíqeno-alvo do anticorpo 6F4 Purificação por imunoafinidade

O antígeno-alvo do anticorpo 6F4 é purificado a partir de uma fração de membrana enriquecida por células HT-29. Após solubilização em 5 um tampão Tris/HCI 50 mM, pH 7,4, contendo NaCI 150 mM, Triton X-100 e IGEPAL, proteínas da membrana são incubadas na presença do anticorpo 6F4 imobilizado em pérolas de sefarose durante a noite a +4°C sob suave agitação. O complexo 6F4-Ag formado nas pérolas é então lavado com vá- rias soluções que contêm detergentes a fim de eliminar proteínas adsorvidas 10 não-especificamente. O antígeno-alvo de 6F4 é eluído a partir do suporte de sefarose-6F4 usando um tampão Gly/HCI 0,1 M, pH 2,7. As frações coleta- das são analisadas por eletroforese em SDS-PAGE (gel a 10%, condições não-redutoras) e western blot após transferência para a membrana de nitro- celulose (anticorpo primário 6F4 usado em 0,5 pg/ml, detecção por quimio- 15 luminescência) a fim de selecionar as frações enriquecidas no antígeno de interesse (figuras 8A e 8B). A análise por Western blot confirma a ausência da proteína de interesse nas frações não-selecionadas e lavagens, e uma eluição específica da última em pH ácido.

As frações enriquecidas resultantes de duas purificações então 20 foram analisadas por eletroforese em SDS-PAGE (gel a 10%) e western blot sob as condições descritas anteriormente. O antígeno reconhecido pelo anti- corpo 6F4 no western blot tinha um peso molecular aparente de 35 kDa após análise em condições redutoras (figuras 9A e 9B). Uma diferença no peso molecular aparente pode ser observada quando a eletroforese é realizada 25 em condições não-redutoras: sob estas condições, o peso molecular aparen- te é de fato ligeiramente menor do que observado em condições redutoras. Identificação do antíqeno-alvo

Após eletroforese em SDS-PAGE (gel a 10%), as proteínas são coradas azul coloidal usando um método compatível com a análise de es- pectrometria de massa (figura 10). A banda de interesse correspondente à proteína detectada pelo western blot é recortada usando um bisturi e então descorada pela incubação em uma solução de bicarbonato de amônio a 25 mM. Após redução (DTT)/alquilação (iodoacetamida) e hidrólise "em gel" (durante a noite a 37°C) da proteína pela tripsina (Promega), uma enzima proteolítica que hidrolisa proteína em resíduos Lisina e Arginina e dessa forma libera peptídeos que têm um resíduo Lisina ou Arginina na posição C- 5 terminal, os peptídeos gerados são extraídos usando uma mistura de aceto- nitrila/água (70/30, v/v) na presença de ácido fórmico. Estes então são de- positados no alvo MALDI em uma mistura com uma matriz (ácido alfa-ciano- 4-hidroxicinâmico, Bruker Daltonics) e na presença de ATFA, e então anali- sados pela espectrometria de massa MALDI-TOF (Autoflex, Bruker Dalto- 10 nics). O espectro de massa obtido é apresentado na figura 10. A lista dos peptídeos deduzidos a partir desta análise é usada para identificar a proteína pela procura nos bancos de dados usando o motor de busca Mascot (Matrix Sciences).

Os resultados da pesquisa no banco de dados NCBInr, restritos a proteínas de origem humana, indicam que três proteínas têm uma pontua- ção significante (pontuação> 64):

1. Estrutura cristalina da molécula de adesão juncional humana

tipo 1

Pontuação =116

Esta proteína eqüivale ao domínio extracelular da proteína

F11R/JAM-A usada para estudos estruturais.

2. Receptor F11 (Homo sapiens)

Pontuação = 116

Esta proteína corresponde ao precursor da proteína F11 R/isoforma a.

3. Receptor F11 isoforma b (Homo sapiens)

Pontuação = 65

Este é o precursor da isoforma b da proteína F11R, com duas deleções de 20 aminoácidos em relação à isoforma a.

A proteína identificada, por esta abordagem, é dessa forma

chamada F11R ou receptor F11. Esta é de fato a designação oficial da prote- ína adotada quando foi primeiro descrita como um receptor de um anticorpo chamado F11 (Naik et ai, 1995, Biochem. J., 310, 155-162). Esta proteína é melhor conhecida hoje sob o nome de JAM-A ou "molécula de adesão jun- cional A", e também é chamada JAM1, PAM-1, CD321 ou antígeno 106.

Entre os peptídeos liberados pela hidrólise tríptica e analisados 5 pela espectrometria de massa, nove peptídeos têm um peso molecular expe- rimental correspondente, dentro de 0,1 Da, àqueles de peptídeos resultantes da hidrólise teórica da forma humana de JAM-A/isoforma a. Estes nove pep- tídeos cobrem 37% da seqüência primária da proteína. Além disso, o peso molecular teórico do precursor de JAM-A (-32,9 kDa) está de acordo com o 10 peso molecular aparente determinado experimentalmente por SDS-PAGE. Confirmação do alvo identificado por western blot

A identificação de JAM-A por uma abordagem proteômica então foi confirmada por western blot (SDS-PAGE gel a 10% em condições não- redutoras, anticorpo 6F4 em 0,5 pg/ml, detecção por quimioluminescência). Como mostrado na figura 11A, o anticorpo 6F4 reconhece a pro-

teína JAM-A natural no extrato de membrana HT-29 e na fração enriquecida por imunopurificação (PM aparente = 35 kDa), bem como a proteína recom- binante dimérica JAM-A/Fc (R&D Systems ref. 1103-JM, PM aparente ~120 kDa). Este reconhecimento é equivalente àquela de um anticorpo policlonal 20 de cabra JAM-A anti-humano comercial (R&D Systems, ref. AF1103) diluído a 1/1000 (figura 11B).

Exemplo 5: Especificidade do anticorpo 6F4 para JAM-A humano

A especificidade do anticorpo 6F4 foi determinada por western blot sob as condições descritas acima.

A figura 12 mostra que o anticorpo 6F4 é específico para a forma

humana de JAM-A uma vez que reconhece a proteína recombinante hJAM- A/Fc (R&D Systems ref. 1103-JM), mas não reconhece as formas humanas de JAM-B e JAM-C (proteína recombinante hJAM-B/Fc e hJAM-C/Fc, R&D Systems ref. 1074-VJ e 1189-J3) nem a forma murina de JAM-A (proteína recombinante mJAM-A/Fc, R&D Systems ref. 1077-JM).

Exemplo 6: Medição da afinidade do anticorpo 6F4 através de BIAcore (res- sonância de plasmon de superfície) Princípio

Usando BIAcore1 a constante de afinidade Kd (M) do anticorpo 6F4 para a proteína solúvel JAM-1-Fc (domínio extracelular fusionado com um fragmento Fc do anticorpo e produzido na forma recombinante em célu- 5 Ias NSO) pode ser calculado a partir da determinação da cinética de associa- ção (ka) (1/m.s) e a cinética de dissociação (kj) (1/s) de acordo com a fórmula Ko=kd/ka (Rich and Myszka, J. Mol. Recog., 2005, 18, 431).

Materiais e métodos Instrumento usado:

BIAcore X e programa BIAevaIuation 3.1 X (Uppsala, SW)

Reaqentes:

- Anticorpo monoclonal murino 6F4: 1,3 mg/ml

- JAM-1-Fc humano (ref. 1103-JM R&D Systems): 50 pg sem

veículo)

- JAM-1-Fc de camundongo (ref. 1077-JM R&D Systems): 50 pg

sem veículo

- Tampão de corrida: HBS-EP (BIAcore)

- Conjunto de ligação: "Amine" (BIAcore)

- Tampão de ligação: acetato pH 5,0 (BIAcore)

- Anticorpo de captura: IgG Fc de cabra anti-humana (= GAH,

anti-humana de cabra) (Bioscience)

- Tampão de regeneração: Glicina, HCI pH 1,5 por 30 segundos

(BIAcore).

Discussão e conclusões Os dados na figura 13 mostram que o anticorpo de murino 6F4

está ligado à parte extracelular da proteína JAM-1 humana mas não à parte extracelular da proteína JAM-1 murina.

Os dados na figura 14 permitem calcular um Kd de 22 pM do anticorpo 6F4 para a proteína JAM-1 humana sob estas condições experi-

mentais.

A cinética de dissociação lenta indica o envolvimento de um fe- nômeno de avidez do anticorpo pelo antígeno (modelo analítico divalente). Exemplo 7: Atividade in vivo do anticorpo 6F4 no modelo xenoqráfico MCF-7 Um teste do anticorpo 6F4, não-purificado e injetado pela via IP em uma dose de 250pg/camundongo, demonstra que este anticorpo inibe significativamente o crescimento de células MCF-7 in vivo com porcentagens 5 de inibição que alcançam 56% em comparação com camundongos injetados com PBS (figura 15). O anticorpo 9G4 não-relevante usado como um isotipo de controle de IgGI é, como esperado, sem atividade antitumoral.

Exemplo 8: Estudo da distribuição do antígeno reconhecido por 6F4 em um painel de células tumorais A fim de determinar as indicações potenciais para o anticorpo

6F4, quatro tipos de tumores foram estudados por citometria de fluxo quanto a um perfil de expressão de membrana. As linhagens celulares selecionadas são MCF-7 (câncer de mama relacionado ao estrogênio), A549 (câncer de pulmão de não-pequenas células), HT29 e Colo 205 (câncer de cólon) e 15 BxPC3 (câncer pancreático). Para marcação das células, uma faixa de do- ses (10 pg/ml, 5 pg/ml, 1 pg/ml, 0,5 pg/ml, 0,25 pg/ml e 0,125 pg/ml) foi tes- tada.

Os resultados apresentados na figura 16 mostram que o anticor- po 6F4 reconhece um antígeno significativamente expresso na superfície de 20 todas as células testadas. A marcação obtida é saturável, que certifica sua especificidade. A saturação dos sítios é obtida a partir de uma concentração de 1 pg/ml do anticorpo, que evidência de que a afinidade de anticorpo 6F4 para o antígeno JAM-A é alta.

Exemplo 9: Humanizacão por enxerto da CDR da região variável da cadeia leve do anticorpo 6F4 (6F4 VL)

- Resumo da análise imunogenética

Resumo do resultado Seqüência rearranjada IGK produtiva (sem códon de parada e na junção da estrutura) GENEVeaIeIo IGKV1- pontuação = identidade = 81,36% 33*01 922 (227/229 nt) GENE J e alelo IGKJ1*01 pontuação = identidade = 86,49% 140 (32/37 nt) Tamanhos CDR-IMGT [6,3,8] CLQYDN LWTF e JUNÇÃO DE AA - Dados detalhados para identificação muito próxima do gene de

V humano.

REGIÕES V muito próximas: (avaliadas a partir do primeiro nu- cleotídeo da REGIÃO V ao 2°códon CYS mais 15 nt da CDR3-IMGT)

Pontuação Identidade M64856 IGKV1-33*01 922 81,36% (227/279 nt) M64855 IGKV1D-33*01 922 81,36% (227/279 nt) X63398 IGKV1-27*01 868 79,21% (221/279 nt) Y14865 IGKVI-NL1*01 841 78,14% (218/279 nt) X72817 IGKV1D-43*01 841 78,14% (218/279 nt) - Dados detalhados para identificação muito próxima do gene de

J humano

REGIÕES J muito próximas:

Pontuação Identidade J00242 IGKJ 1*01 140 86,49% (32/37 nt) AF103571 IGKJ4*02 122 81,08% (30/37 nt) J00242 IGKJ4*01 113 78,38% (29/37 nt) Z70260 IGKJ2*02 104 75,68% (28/37 nt) Z46620 IGKJ2*04 95 72,97% (27/37 nt) - Identificação de resíduos críticos

Vários critérios estão envolvidos na definição e classificação

10 dos resíduos críticos exteriores CDR. Estes incluem pelo menos, a participa- ção conhecida do resíduo na interface VH/VL, na ligação ao antígeno ou na estrutura CDR, as modificações de classe de aminoácido entre resíduos mu- rinos e humanos, localização do resíduo na estrutura 3D de um domínio va- riável etc...

' 15 21 aminoácidos diferentes são encontrados entre o domínio 6F4

VL e o gene V da linhagem germinativa humana muito próxima IGKV1- 33*01, todos sendo resíduos exteriores CDR. Destes 21 resíduos, a análise dos parâmetros acima citados leva à identificação de 9 resíduos o mais po- tencialmente contribuintes. Estes resíduos murinos são K24, I39, A40, H55, 20 T66, Q68, A69, R85 e Y87. Destes 9 resíduos, supõe-se que 3 deles sejam ainda mais importantes para que guardem sua origem murina na forma hu- 10

15

manizada. Estes são resíduos I39 e H55 e T66, localizados nas ancoragens CDR1 e CDR2, respectivamente. Finalmente, 6 aminoácidos serão analisa- dos individualmente e/ou em combinação para determinar se podem ser humanizados ou se mantém sua origem murina. Olhando para o não- envolvimento da região J na ligação de antígeno e estruturação da região V, decidiu-se usar o gene da linhagem germinativa IGKJ1*01 nativo humano. Na seqüência projetada do domínio 6F4 VL humanizado representado na figura 17:

*, corresponde a aminoácidos modificados de fato por suas con- trapartes humanas;

1, corresponde a aminoácidos analisados por suas capacidades de serem humanizados, o resíduo humano que é indicado abaixo do sinal;

2, corresponde a aminoácidos que permanecem murinos no do- mínio 6F4 VH humanizado.

Exemplo 10: Primeira versão de humanizacão por enxerto de CDR da região variável da cadeia pesada do anticorpo 6F4 (6F4 VH)

- Resumo da análise imunogenética

Sumário do resultado Seqüência rearranjada IGK produtiva (sem códon de parada e na junção de estrutura) GENEVeaIeIo IGHV1- pontuação identidade = 75,35% f*01 = 796 (217/288 nt) GENE J e alelo IGHJ4*01 pontuação identidade = 87,23% = 181 (41/47 nt) Tamanhos CDR-IMGT [8,8,9] CARQTDYFDYW e JUNÇÃO DE AA 20

25

O gene D pertence estritamente à região CDR3 no domínio VH. O processo de humanização é baseado em uma abordagem de "enxerto de CDR". A análise dos genes D humanos muito próximos não é útil nesta es- tratégia.

- Dados detalhados de identificação muito próximos do gene de

V humano;

REGIÕES V muito próximas: (avaliado do primeiro nucleotídeo da REGIÃO V ao 2o códon CYS) Pontuação Identidade Z12305 IGHV1-f*01 796 75,35% (217/288 nt) X62106 IGHV1-2*02 787 75,00% (216/288 nt) X92208 IGHV1-2*03 782 74,65% (215/288 nt) Z12310 IGHV1-2*04 778 74,65% (215/288 nt) M99642 IGHV1-24*01 760 73,96% (213/288 nt) - Dados detalhados de identificação muito próximos do gene de

J humano

Pontuação Identidade J00256 IGHJ4*01 181 87,23% (41/47 nt) X86355 IGHJ4*02 172 85,11% (40/47 nt) M25625 IGHJ4*03 172 85,11% (40/47 nt) J00256 IGHJI*01 138 74,51% (38/51 nt) J00256 IGHJ5*01 133 74,00% (37/50 nt) - Identificação de resíduos críticos

5 Vários critérios estão envolvidos na definição e classificação dos

resíduos críticos exteriores CDR. Estes incluem pelo menos, a participação conhecida do resíduo na interface VH/VL, na ligação ao antígeno ou na es- trutura CDR, as modificações de classe de aminoácido entre resíduos muri- nos e humanos, localização do resíduo na estrutura 3D de um domínio vari- ável etc...

31 aminoácidos diferentes são encontrados entre o domínio 6F4 VH e o gene V da linhagem germinativa humana muito próxima IGHV1-f*01, todos sendo resíduos exteriores CDR. Destes 31 resíduos, a análise dos parâmetros acima citados leva à identificação de 9 resíduos o mais potenci- 15 almente contribuintes. Estes resíduos murinos são I2Y40, I53, Y55, R66, N68, Q69, K72 E K82. Destes 9 resíduos, supõe-se que 2 deles sejam ainda mais importantes para que guardem sua origem murina na forma humaniza- da. Estes são resíduos Y55 e R66, localizados nas ancoragens CDR2, res- pectivamente. Finalmente, 7 aminoácidos serão analisados individualmente 20 e/ou em combinação para determinar se podem ser humanizados ou se mantém sua origem murina. Olhando para o não-envolvimento da região J na ligação de an- tígeno e estruturação da região V, decidiu-se usar o gene da linhagem ger- minativa IGHJ4*01 nativo humano. Na seqüência projetada do domínio 6F4 VH humanizado representado na figura 18:

*, corresponde a aminoácidos modificados de fato por suas con-

trapartes humanas;

1, corresponde a aminoácidos analisados por suas capacidades de serem humanizados, o resíduo humano que é indicado abaixo do sinal;

2, corresponde a aminoácidos que permanecem murinos no do- mínio 6F4 VH humanizado.

Exemplo 11: Segunda versão de humanizacão por enxerto de CDR da reqi-

ão variável da cadeia pesada do anticorpo 6F4 Í6F4 VH) Outro modo de identificar gene V candidatos humanos para en¬ xerto de CDR foi procurar homologias humanas em termos de aminoácido usando instrumento de IMGT/DomainGapAlign. Os resultados da análise imunogenética de IMGT/DomainGapAlign são resumidos a seguir: Alelo Espécie Domínio Pontuação Porcenta- Sobreposi¬ Smith- gem de ção Waterman identidade IGHV1- HomoSa- 1 451 64,3 98 3*01 piens - Identificação de resíduos críticos em gene da linhagem germi- nativa IGHV1-03*01 (SEQ ID N0 49, nomenclatura EMBL: X62109).

O alinhamento das seqüências proteicas de domínio 6F4 VH e IGHV1-3*01 é representado na figura 31.

A seleção e a classificação daqueles resíduos é baseada no cri- tério diferencial baseado na importância relativa de cada posição única de 25 acordo com sua relevância estrutural, sua relação de função da estrutura conhecida, a relevância da modificação de classe de aminoácido se isso a- contece e também tira proveito dos resultados obtidos durante o primeiro processo de humanização. Em uma primeira intenção, todos os diferentes aminoácidos "C- DRs exteriores" foram modificações das suas contrapartes humanas, exceto resíduos Y55 e R66 que se supõem fortemente que ambos estejam envolvi- dos na ligação como os resíduos determinados de ancoragem CDR2. Hu- 5 manizabilidade daqueles dois resíduos será explorar no fim do processo, quando todas as outras análises descritas após serão realizadas. De fato, recuperação da atividade total do anticorpo parental, o domínio VH do 6F4 Hz2 re-humanizado teria de ser melhorado como segue; um processo de "desumanização" iria se compor na mutação anterior, se necessário, estes 10 aminoácidos na sua cópia murina:

Os primeiros resíduos do grupo, ou seja, E1Q, K43R e K75R apresentam uma combinação forte de critérios e eqüivalem às primeiras po- sições que a "desumanização" será avaliada se procurando um benefício.

Então, resíduos do grupo 2, ou seja, K48Q, S49R, F88Y e H90R, são mutações quimicamente relevantes mas estruturalmente supostas um pouco menos resíduos-chave e serão testadas em um segundo ciclo do ex- perimento.

Os seis resíduos do terceiro grupo estão presumivelmente mais envolvidos em resíduos totais e/ou orientados ao núcleo e dessa forma su- postos aestarem menos envolvidos na ligação e dessa forma serem explo- rados em um terceiro ciclo de melhoramento, sempre que necessário.

Resíduos do grupo 4, são supostos a serem os menos estrutu- ralmente e/ou classe de aminoácidos de modificação relevante para quem a "desumanização" seria explorada por último.

Finalmente, os seis seguintes resíduos, I2V, Y40H, I53M, N68S,

K72Q e K82T, correspondem a aminoácidos que a humanização não fez, pelo menos nesta combinação inicial, alteração na atividade de ligação do domínio VH primeiramente humanizado. A "desumanização" destes resíduos será realizada em um último ciclo de melhoramento.

O gene de D pertence estritamente à região CDR3 no domínio

VH. O processo de humanização é baseado em uma abordagem de "enxerto de CDR". A análise dos genes de D humanos muito próximos não é útil nes- ta estratégia.

Olhando para o não-envolvimento da região J na ligação ao an- tígeno e estruturação da região V, decidiu-se usar o gene IGHJ4*01 da li- nhagem germinativa humano nativa.

5 - Dados experimentais obtidos para o anticorpo re-humanizado

6F4.

Nos experimentos seguintes, a re-humanização só concerne à cadeia pesada, a cadeia leve sempre correspondente ao domínio 6F4 VL humanizado QTY/AET como exemplificado no exemplo 9 este finalmente 10 selecionou domínios VL humanizados que exibem uma atividade de ligação anti-JAM-a similar àquela do recombinante quimérico anticorpo 6F4. Simi- larmente, os ensaios de melhoramento da versão re-humanizada foram rea- lizados com referência à atividade de ligação ao anticorpo 6F4 anti-JAM-a recombinante quimérico como definido por um ensaio de ELISA (dado não- 15 mostrado).

Exemplo 12: Regulação para baixo in vitro da expressão de JAM-A pelo 6F4 MAb

Linhagens celulares MCF-7, HT29 e A549 foram selecionadas para determinar o efeito de 6F4 MAb na expressão de JAMA. Resumida- mente, as células foram plaqueadas em frascos de 75 cm2 e incubadas a 37°C, em atmosfera de CO2 5%, durante 24 horas, em meio suplementado com o Soro de Bezerro Fetal 10% (FCS). Então as células foram lavadas 3 vezes com PBS e incubadas por um dia adicional em meio livre de soro. A- pós esta segunda incubação, o meio livre de soro foi removido e substituído por meio sem soro fresco sozinho ou meio livre de soro fresco contendo 6F4 ou um controle isotípico de IgGI descrito como 9G4. Após 5 ou 16 horas de incubação, tampão de Iise gelado (tampão Tris HCI 10 mM, pH 7,5, NaCI 1 M 15% (Sigma Chemical Co), mistura de detergente 10% (Tris-HCI 10 mM, 10% tampão de Iise Igepal) (Sigma Chemical Co), deoxicolato de sódio 5% (Sigma Chemical Co.), 1 pastilha de coquetel inibidor de protease completo TM (Roche) e coquetel inibidor de fosfatase Set Il 1% (Calbiochem), pH 7,5) foi adicionado e as células foram Iisadas em gelo. Os Iisados foram clarifica- dos por centrifugação a 4°C. Proteína foi quantificada pelo ensaio de proteí- na BCA e 25 pg de proteína foram carregados em cada coluna de um gel Biorad Bis-Tris 4 a 12%. As amostras foram aquecidas durante 5 minutos a 100°C e conservadas a -20°C ou carregadas diretamente em géis SDS- 5 PAGE 4 a 12% e transferidas para a membrana de nitrocelulose. Blots foram primeiro bloqueados com BSA 5% para todos os anticorpos. A incubação do anticorpo primário anti-JAMA específico foi realizada durante 2 horas a tem- peratura ambiente. Os filtros foram lavados em TBST e incubados com anti- corpos secundários ligados a HRP apropriados durante 1 hora à temperatura 10 ambiente. As membranas foram lavadas em TBST antes da visualização das proteínas com ECL (Amersham).

Como mostrado na figura 19, uma regulação para baixo signifi- cante de JAM-A foi observada para as 3 linhagens celulares tratadas com o 6F4 MAb. MCF-7 pareceu ser o mais sensível com uma regulação para bai- 15 xo completa e estável observada o mais cedo 5 horas após a incubação com 6F4. Para células HT29 uma regulação para baixo parcial mas sustentada de JAM-A foi também notada. A cinética de regulação para baixo foi diferen- te para células A549 quando nenhum efeito significante foi observado no primeiro tempo de incubação enquanto uma inibição completa ocorreu após 20 16 horas de incubação com o 6F4 MAb. Como esperado, diferenças signifi- cantes não foram observadas entre células não tratadas e células incubadas com o controle isotípico 9G4.

Exemplo 13: Efeito de uma injeção única de 6F4 na proliferação tumoral in vivo

Para determinar o mecanismo de ação in vivo do 6F4 MAb1 as

fêmeas de camundongos com 7 semanas recebendo comprimidos de estro- gênio foram injetadas com células MCF-7. Quando os tumores alcançaram um volume de 80 a 100 mm3, 3 grupos de camundongos com tumores com- paráveis foram gerados. Antes de qualquer injeção, os tumores foram remo- 30 vidos de um destes grupos para verificar a proliferação basal de células tu- morais dentro de um tumor não tratado. Camundongos dos 2 outros grupos foram injetados com 1 mg de 6F4 ou com a mesma dose de um controle iso- típico IgGI descrito como 9G4.

Seis horas após a injeção, os tumores foram removidos, fixados em formalina, introduzidos em parafina, cortados em seções de 5 μηι e co- rados com um anticorpo anti-Ki67 para determinar o nível da proliferação 5 nos tumores tratados contra os controles.

Como mostrado na figura 20, nenhuma diferença foi observada entre tumores removidos antes da injeção (descrito como TO para o tempo 0) e tumores tratados com o controle isotípico 9G4. Por outro lado, uma inibi- ção significante da proliferação celular tumoral foi observada após uma inje- ção única, 6F4.

Exemplo 14: Efeito de uma iniecão única de 6F4 na expressão de JAM-A in vivo

Para este estudo, o protocolo in vivo é o mesmo como aquele descrito em experimentos de proliferação in vivo exceto que os tumores re- movidos foram rapidamente congelados em nitrogênio líquido para análise de Western blot. O Western blot foi realizado como descrito no Exemplo 13 acima.

A figura 21 demonstra que nenhuma diferença na expressão de JAM-A foi observada entre camundongos não tratados (descrito como TO 20 para o tempo 0) e camundongos injetados uma vez com o controle isotípico 9G4. Uma regulação para baixo significante foi notada quando os camun- dongos foram tratados com o 6F4 MAb indicando que um mecanismo poten- cial da ação envolvida na atividade antitumoral in vivo deste anticorpo pode- ria ser a regulação para baixo do receptor. Estes resultados estavam de a- 25 cordo com aquele observado in vitro e descrito abaixo no exemplo 13.

Exemplo 15: Comparação da atividade antitumoral de 6F4 e seu fragmento F(ab')2

Como o JAM-A é altamente expresso por células MCF-7 e ape- sar do fato que 6F4 ser uma IgGI (isotipo conhecido por estar fracamente envolvido em funções efetoras em camundongos), uma comparação in vivo entre 6F4 e seu fragmento F(ab')2 foi estabelecido no modelo MCF-7 para determinar um potencial envolvimento de funções efetoras na atividade in vivo.

Para esse efeito, Cinco milhões de células MCF7 foram enxerta- dos em fêmeas de camundongos femininos com 7 semanas recebendo comprimidos de estrogênio. Cinco dias após implantação das células, os 5 camundongos foram tratados com 300 pg de 6F4 ou com 200 pg de 6F4 F(ab')2 três vezes por semana. Para a primeira injeção, 600 pg do anticorpo e 400 pg de 6F4 F(ab')2 foram injetados. O volume tumoral foi medido duas vezes por semana durante 4 semanas.

A figura 22 mostrou que o crescimento tumoral em camundon- 10 gos tratados com 6F4 e 6F4 F(ab')2 foi significativamente diferente do cres- cimento tumoral de camundongos controle de D3 a D27 (p<0,03 para 6F4 e p<0,015 para 6F4 F(ab')2). Nenhuma diferença foi observada entre grupos de camundongos 6F4 e 6F4 F(ab')2 mostrando que as funções efetoras não estão envolvidas na atividade 6F4.

Exemplo 16: Avaliação da expressão de JAM-A em tecido humano

Uma comparação da expressão de JAM-A em tecidos tumorais contra normais de pacientes foi realizada para selecionar os tipos de tumor que superexpressam JAMA. Os pares dos tecidos normais contra tumorais do mesmo paciente foram selecionados para este estudo. Nestes pacientes, 20 tecidos normais foram tomados perto do tumor. A expressão de JAM-A foi determinada por imuno-histoquímica (IHC) usando ensaios de tecido de Su- perships. Resumidamente, lâminas foram desparafinadas e a recuperação de antígeno foi realizada usando a solução Dakocytomation S1699, a 98°C durante 20 minutos. Após bloqueio da peroxidase endógena (solução de 25 H2O2 0,3% durante 5 minutos) e extinção de sítios não-específicos (Ultra-V- Block; Labvision, ref. TA-125-UB), o anticorpo primário (anti-hJAM-A, AF1103 de sistema R&D ou controle isotípico IgG de cabra de Zymed) foi incubado durante 1 hora à temperatura ambiente. Após lavagens em TBS- tween, a ligação do anti-hJAM-A foi revelada usando o conjunto LSAB+ de 30 dacocitomação. A visualização do complexo primário Ab e LSAB+ foi reali- zada pela reação cromogênica HRP-DAB. Lâminas foram então contracora- das por hematoxilina. Amostras de câncer de tireóide, pulmão e mama foram analisa- das. Para amostras de tireóide (figura 23), nenhuma expressão foi observa- da em tecido de tireóide normal enquanto o JAM-A pareceu ser fortemente expresso em seções tumorais (marcação da membrana) do mesmo pacien- 5 te. No pulmão, JAM-A de tecido normal foi expressa por pneumócitos. Entre- tanto, uma forte expressão na membrana foi observada em todas as amos- tras tumorais (figura 24). Para câncer de mama, uma expressão de JAM-A fraca, localizada em dutos lobulares, foi observada no tecido de mama nor- mal. Em seções de câncer, os 3 exemplos de carcinoma mostrados na Figu- 10 ra 25 (duto infiltrante, medular atipicamente e papilar infiltrante) demonstram que JAM-A está superexpressa em tecidos de câncer de mama.

Estes dados sugeriram que cânceres de tireóide, mama e pul- mão podem ser bons alvos de uma terapia JAMA.

Exemplo 17: Atividade de 6F4 in vivo em carcinoma epidermoide xenoqráfico A431 em camundongos nus

Células A-431 foram costumeiramente cultivadas em DMEM (Lonza) suplementado com Soro Fetal de Bezerro a 10% inativado por calor (Sigma). As células foram repicadas dois dias antes do enxerto para que estivessem na fase exponencial do crescimento. Dez milhões de células A- 20 431 foram enxertados em camundongos Nus Atímicos de 7 semanas. Cinco dias após o enxerto (D5) camundongos foram randomizados e tratados i.p. com os seguintes esquemas: o grupo de controle recebeu duas vezes por semana injeções de PBS e o grupo tratado 6F4 foi injetado i.p. com uma do- se de carga de 2 mg seguidas por injeções da dose de 1 mg do anticorpo 25 duas vezes por semana. O tumor foi medido duas vezes por semana e os volumes tumorais foram calculados usando a fórmula: π/6.comprimento.largura.altura. Análises estatísticas foram realizadas para cada ponto de tempo usando um Teste de Mann-Whitney e programa Sig- maStat. A figura 26 mostrou que o 6F4 MAb é capaz de inibir significativa- 30 mente o crescimento in vivo da linhagem celular A431 (p <0,009 do dia 38 ao dia 56).

Exemplo 18: Avaliação da atividade de 6F4 sobre a apresentação de antíge- no por células apresentadoras de antígeno (APC)

Proteínas JAM são expressas em uma variedade de tecidos em todas as partes do corpo humano bem como na superfície de plaquetas, Ieu- cócitos, e eritrócitos [Naik 1995; Malergue 1998; Korneki 1990; Williams 5 1999; Gupta 2000], JAM-A parece estar expressa em plaquetas, neutrófilos, monócitos, linfócitos, e eritrócitos [para revisão, ver Mandell 2005].

Para determinar se um tratamento com 6F4 poderia prejudicar a apresentação de antígeno em pacientes, uma avaliação de uma interferência potencial com Células Apresentandoras de Antígeno (APC) incluindo macró- 10 fagos e células dendríticas foi realizada. No processo de apresentação, APC incorpora antígenos e os degradam para gerar peptídeos que são associa- dos dentro do citoplasma com moléculas MHC classe II. Então, o complexo é expresso nas membranas de APC e apresentado a linfócitos T específicos respondendo àquela estimulação pela proliferação.

No estudo apresentado abaixo, o efeito potencial de 6F4 na a-

presentação do Toxoide Tetanus por PBMC humana foi avaliada. Para esse objetivo, PBMC foram isoladas pelo gradiente de centrifugação Ficoll do sangue. Células foram lavadas em PBS, contadas e suspensas no meio RPMI 1640 suplementado com soro fetal de bezerro a 10% inativado por 20 calor (FCS), glutamina e antibióticos na concentração de 0,25.106 células/ml. 100 μΙ de PBMC foram semeados em cada um dos poços de uma placa de 96 poços anteriormente preenchida com antígeno e o anticorpo a ser testado na concentração final de 10 pg/ml). 9G4 Mab foi usado como um controle isotípico IgGI e fito-hemaglutinina PHA (concentração final 2,5 pg/ml), um 25 ativador policlonal de linfócitos, foi introduzida como um controle positivo.

O ativador de antígeno específico Toxoide Tetanus (TT) foi sele- cionado e adicionado a PBMC em uma concentração final de 100 Mg/ml. As placas então foram incubadas a 37°C em uma atmosfera contendo CO2 a 5% durante 96 h. Então, 0,25 pCi [3H]-Timidina é adicionada aos poços e 30 incubada durante 24 h. Após incubação, as células foram colhidas, a mem- brana de filtro foi seca e a quantidade de radioatividade foi contada em um contador de cintilação. Quanto aos números 27A e 28A que mostram os valores de dois experimentos independentes, o ativador policlonal, PHA usado como um controle positivo da preparação PBMC é um indutor potente de Iinfoprolifera- ção, com índices variando entre 30 e 70 dependendo dos doadores e do ex- 5 perimento. Nestas condições, o índice de linfoproliferação não foi modificado qualquer que seja o anticorpo incubado, e 6F4 não mostrou nenhuma ativi- dade agonista ou antagonista significante. As figuras 27B e 28B que mos- tram os valores de dois experimentos independentes, mostraram que varia- ções significantes poderiam ocorrer entre doadores em direção à ativação 10 por TT da linfoproliferação. Nestes experimentos, os índices variaram entre 2 e 5 dependendo dos doadores e do experimento. Entretanto, nenhuma inter- ferência na apresentação de antígeno foi observada na presença de 6F4.

Finalmente, apesar da expressão significante do JAM-A em APC e linfócito, o uso de um anticorpo direcionado contra este alvo não prejudica nem a proliferação não-específica de linfócito nem o processo de apresenta- ção de antígeno.

Exemplo 19: Avaliação de agregação plaquetária e ativação após incubação de 6F4

A fim de investigar se 6F4, que se liga a plaquetas humanas, pode ter função biológica, dois parâmetros foram medidos: agregação pla- quetária e liberação de serotonina.

Com esta finalidade, plaquetas humanas de 10 doadores nor- mais foram incubadas com 5 pg/ml de vários anticorpos a serem testados.

PM6/248 (um anti-anbp3) foi relatado induzir a agregação pla- quetária. 9G4 foi usado como controle isotípico negativo.

Como esperado, quando testado em plaquetas humanas, trom- bina e ADP induziram agregação. PM6/248 também induziu agregação pla- quetária.

Nenhuma agregação plaquetária foi medida após incubação com 6F4. O efeito foi comparável com aquele observado com 9G4, usado como controle positivo (figura 29). De um modo similar, 6F4 não foi capaz de indu- zir liberação de serotonina (figura 30) ao passo que trombina induziu, como esperado, liberação de 5-HT.

Todos em conjunto, estes resultados indicam que ao passo que JAM-A é expressa, nenhuma função biológica é provocada na plaqueta hu- mana após ativação por 6F4. LISTAGEM DE SEQÜÊNCIA

<110> Pierre Fabre Médicament

<120> Novos anticorpos antiproliferação

<130> D24958

<140> PCT/EP2007/0627 60

<141> 2007-11-23

<150> FR 06/10329

<151> 2006-11-24

<160> 64

<170> PatentIn version 3.3

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25

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<213> mus musculus

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Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly 15 10 15

Gly Lys Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Asn Tyr 20 25 30

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<213> mus musculus

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Glu Ile Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 15 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asp Tyr 20 25 30

Ser Met Tyr Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile 35 40 45

Gly Tyr Ile Asp Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Arg Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Phe 65 70 75 80

Met His Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

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<213> mus musculus

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1 5 10 15

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Ser Gly Ser Gly Arg Asp Tyr Ser Phe Ser Ile Ser Asn Leu Glu Pro 65 70 75 80

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Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro 100 105 110

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Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile Asn 130 135 140

Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu Asn 145 150 155 160

Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser 165 170 175

Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr Thr 180 185 190

Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser Phe 195 200 205

Asn Arg Asn Glu Cys Asn His 210 215

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<212> PRT

<213> mus musculus

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Glu Ile Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 15 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asp Tyr 20 25 30

Ser Met Tyr Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile 35 40 45

Gly Tyr Ile Asp Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Arg Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60

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Met His Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

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115 120 125

Pro Gly Ser Ala Ala Gln Thr Asn Ser Met Val Thr Leu Gly Cys Leu 130 135 140 Val Lys Gly Tyr 145

Ser Leu Ser Ser

Leu Tyr Thr Leu 180

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Lys Asp Val Leu

Val Asp Ile Ser 260

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Phe Asn Ser Thr

290

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Asp Ile Thr Val

370

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Ser Ser Ser Val Thr Val 185

Thr Cys Asn Val Ala His 200

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Lys Asp Asp Pro Glu Val 265

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Phe Arg Ser Val Ser Glu 295

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375

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Pro Ala Ser Ser Thr Lys 205

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Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys 435 440

<210> 17

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<213> mus musculus

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20

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<212> DNA

5 <213> mus musculus

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<212> DNA

<213> mus musculus

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<212> DNA

<213> mus musculus

<4 00> 27

gcaagacaga cggactactt tgactac 27

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<212> DNA

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<212> DNA

<213> mus musculus

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atcacttgca aggcaagcca agacattaac aattatatag cttggtacca acacaagcct 120 ggaaaaggtc ctaggctgct catacattac acatctacat tacaagcagg catcccatca 180 aggttcagtg gaagtgggtc tgggagagat tattccttca gcatcagcaa cctggagcct 240 gaagatattg gaacttatta ttgtctacag tatgataatc tgtggacgtt cggtggaggc 300 accaagctgg aaatcaaa 318

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<212> DNA

<213> mus musculus

<400> 33

gagatccagc tgcagcagtc tggacctgag ctggtgaagc ctggggcttc agtgaaggta 60

tcctgcaagg cttctggtta ctcattcact gactacagca tgtactgggt gaagcagagc 120 catggaaaga gccttgagtg gattggatat attgatcctt acaatggtgg tactaggtac 180 aaccagaagt tcaagggcaa ggccacattg actgttgaca agtcctccag cacagccttc 240 atgcatctca acagcctgac atctgaggac tctgcagtct attactgtgc aagacagacg 300 gactactttg actactgggg ccaaggcacc actctcacag tctcctca 348

<210> 34

<211> 639

<212> DNA

<213> mus musculus

<400> 34

gacatccaga tgacacagtc tccatcctca atcacttgca aggcaagcca agacattaac ggaaaaggtc ctaggctgct catacattac 10 aggttcagtg gaagtgggtc tgggagagat gaagatattg gaacttatta ttgtctacag accaagctgg aaatcaaacg ggctgatgct agtgagcagt taacatctgg aggtgcctca aaagacatca atgtcaagtg gaagattgat 15 agttggactg atcaggacag caaagacagc accaaggacg agtatgaacg acataacagc acttcaccca ttgtcaagag cttcaacagg <210> 35

<211> 1320

<212> DNA

<213> mus musculus

<400> 35

gagatccagc tgcagcagtc tggacctgag tcctgcaagg cttctggtta ctcattcact 25 catggaaaga gccttgagtg gattggatat aaccagaagt tcaagggcaa ggccacattg atgcatctca acagcctgac atctgaggac gactactttg actactgggg ccaaggcacc gccccatcgg tctatccact ggcccctgga 30 ctgggatgcc tggtcaaggg ctatttccct tccctgtcca gcggtgtgca caccttccca agcagctcag tgactgtccc ctccagcacc

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<212> DNA

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<212> DNA

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<400> 37

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<212> PRT

<213> homo sapiens

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85 90 95

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<210> 42

<211> 12 <212> PRT

<213> homo sapiens

<400> 42

Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

1 5 10

<210> 43

<211> 98

<212> PRT

<213> mus musculus

<400> 43

Glu Ile Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 15 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asp Tyr 20 25 30

Asn Met Tyr Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile 35 40 45

Gly Tyr Ile Asp Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Phe 65 70 75 80

Met His Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg

<210> 44

<211> 2

<212> PRT

<213> mus musculus

<4 00> 44

Gln Thr 1

<210> 45 <211> 16 <212> PRT

<213> mus musculus

<4 00> 45

Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 15 10 15

<210> 46

<211> 98

<212> PRT

<213> homo sapiens

<4 00> 46

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 15 10 15

Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Tyr Met His Trp Val Gln Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45

Gly Leu Val Asp Pro Glu Asp Gly Glu Thr Ile Tyr Ala Glu Lys Phe 50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr 65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Thr

25

<210> 47

<211> 121 <212> PRT

<213> homo sapiens

<400> 47

Met Ser Val Ser Phe Leu Ile Phe Leu Pro Val Leu Gly Leu Pro Trp 15 10 15 Gly Val Leu Ser Gln Val Gln Leu- Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val 20 25 30

Lys Pro Ser Gln Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ile Ser Gly Asp Ser 35 40 45

Val Ser Ser Asn Ser Ala Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Ser Pro Ser 50 55 60

Arg Gly Leu Glu Trp Leu Gly Arg Thr Tyr Tyr Arg Ser Lys Trp Tyr 65 70 75 80

Asn Asp Tyr Ala Val Ser Val Lys Ser Arg Ile Thr Ile Asn Pro Asp 85 90 95

Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu 100 105 110

Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg 115 120

<210> 48

<211> 15

<212> PRT

<213> homo sapiens

<400> 48

Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 15 10 15

<210> 49

<211> 97

<212> PRT

<213> homo sapiens

<4 00> ■ 4 9

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 .10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Ala Gly Asn Gly Asn Thr Lys Tyr Ser Gln Lys Phe 50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80

5 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala

<210> 50

<211> 643

<212> DNA

<213> mus musculus

<400> 50

cagatgaagc tgatttgcat gtgctgagat catattctac tgccccagag atttaataat 60 ctgatcatac acactccaac agtcattctt ggtcaggaga cgttgtagaa atgagaccgt 120 ctattcagtt cctggggctc ttgttgttct ggcttcatgg taaggagttt aacattgaat 180 atgctaaaaa gagtatgtga tcaggaattt ctggtccttc agaaaaatct tctttgaata 240 taattaattt catagggatt tgtgttcttt ttaattatag gtgctcagtg tgacatccag 300 atgacacagt ctccatcctc actgtctgca tctctgggag gcaaagtcac catcacttgc 360 aaggcaagcc aagacattaa caagtatata gcttggtacc aacacaagcc tggaaaaggt 420 cctaggctgc tcatacatta cacatctaca ttacagccag gcatcccatc aaggttcagt 480 ggaagtgggt ctgggagaga ttattccttc agcatcagca acctggagcc tgaagatatt 540 gcaacttatt attgtctaca gtatgataat cttctaccca cagtgataca aatcataaca 600 aaaaccaccc agggaagcag aagtgagagg ctaggttgcc cac 643 <210> 51 <211> 39 <212> DNA <213> mus musculus <400> 51 tggacgttcg gtggaggcac caagctggaa atcaaacgt 39 <210> 52 <211> 667 <212> DNA

<213> homo sapiens

<4 00> 52

ctgcagctgt gcccagcctg ccctatcccc ccctgccctg aagacttatt aataggctgg aggacacagc atggacatga gggtccctgc ctcaggtaag gaaggataac actaggaatt ctcttgatgg aagccttcct ataatatgac taatcgcagg tgccagatgt gacatccaga ctgtaggaga cagagtcacc atcacttgcc attggtatca gcagaaacca gggaaagccc tggaaacagg ggtcccatca aggttcagtg ccatcagcag cctgcagcct gaagatattg tccctcccac agtgtaacaa gtcataacat tcagctg

<210> 53

<211> 37

<212> DNA

<213> homo sapiens

<4 00> 53

tggacgttcg gccaagggac caaggtggaa <210> 54

<211> 294

<212> DNA

<213> mus musculus

<4 00> 54

gagatccagc tgcagcagtc tggacctgag tcctgcaagg cttctggtta ctcattcact catggaaaga gccttgagtg gattggatat 30 aaccagaagt tcaagggcaa ggccacattg atgcatctca acagcctgac atctgaggac <210> 55

tgctgatttg catgttcgca gagcacagcc 60 tcgcaccctg tgcaggagtc agtcccaacc 120 tcagctcctg gggctcctgc agctctggct 180 ttctcagcca gtgtgctcag tacagcctgg 240 taatagtatg aatatttgtg tttatgtttc 300 tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat 360 aggcgagtca ggacattagc aactatttaa 420 ctaagctcct gatctacgat gcatccaatt 480 gaagtggatc tgggacagat tttactttca 540 caacatatta ctgtcaacag tatgataatc 600 aaatcaccca ggggagcaga tgcgtgaggc 660 667 atcaaac 37 ctggtgaagc ctggggcttc agtgaaggta 60 gactacaaca tgtactgggt gaagcagagc 120 attgatcctt acaatggtgg tactagctac 180 actgttgaca agtcctccag cacagccttc 240 tctgcagtct attactgtgc aaga 294 <211> 163

<212> DNA

<213> mus musculus

<400> 55

aagcttgccc aggaaccact agtgctcaca cagctctgcc cacaggggaa acctaaccat 60 gcctgccccc tactcagcag gaaggctctg aagctctgag aggattttga acaagttact 120 gtcacagtga gacagctcgg gctaccatgt aagaaaagct caa 163 <210> 56 <211> 45 <212> DNA <213> mus musculus <4 00> 56 tactttgact actggggcca aggcaccact ctcacagtct cctca 45 <210> 57 <211> 294 <212> DNA <213> homo sapiens <4 00> 57 gaggtccagc tggtacagtc tggggctgag gtgaagaagc ctggggctac agtgaaaatc 60 tcctgcaagg tttctggata caccttcacc gactactaca tgcactgggt gcaacaggcc 120 cctggaaaag ggcttgagtg gatgggactt gttgatcctg aagatggtga aacaatatac 180 gcagagaagt tccagggcag agtcaccata accgcggaca cgtctacaga cacagcctac 240 atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc aaca 294 <210> 58

<211> 17

<212> DNA

<213> homo sapiens

<400> 58

ggtacaactg gaacgac 17

<210> 59

<211> 46

<212> DNA <213> homo sapiens

<4 00> 59

tactttgact actggggcca aggaaccctg gtcaccgtct cctcag 4 6

<210> 60

<211> 291

<212> DNA

<213> homo sapiens

<4 00> 60

ggggcctcag tgaaggtttc ctgcaaggct tctggataca ccttccaggt ccagcttgtg 60 cagtctgggg ctgaggtgaa gaagcctact agctatgcta tgcattgggt gcgccaggcc 120 cccggacaaa ggcttgagtg gatgggatgg atcaacgctg gcaatggtaa cacaaaatat 180 tcacagaagt tccagggcag agtcaccatt accagggaca catccgcgag cacagcctac 240 atggagctga gcagcctgag atctgaagac acggctgtgt attactgtgc g 291 <210> 61 <211> 299

<212> PRT

<213> homo sapiens

<4 00> 61

Met Gly Thr Lys Ala Gln Val Glu Arg Lys Leu Leu Cys Leu Phe Ile

1 5 10 15

Leu Ala Ile Leu Leu Cys Ser Leu Ala Leu Gly Ser Val Thr Val His 20 25 30

Ser Ser Glu Pro Glu Val Arg Ile Pro Glu Asn Asn Pro Val Lys Leu 35 40 45

Ser Cys Ala Tyr Ser Gly Phe Ser Ser Pro Arg Val Glu Trp Lys Phe 50 55 60

Asp Gln Gly Asp Thr Thr Arg Leu Val Cys Tyr Asn Asn Lys Ile Thr 65 70 75 80

Ala Ser Tyr Glu Asp Arg Val Thr Phe Leu Pro Thr Gly Ile Thr Phe 85 90 95

Lys Ser Val Thr Arg Glu Asp Thr Gly Thr Tyr Thr Cys Met Val Ser 100 105 110 Glu Glu Gly Gly Asn Ser Tyr Gly Glu Val Lys Val Lys Leu Ile Val 115 120 125

Leu Val Pro Pro Ser Lys Pro Thr Val Asn Ile Pro Ser Ser Ala Thr 130 135 140

Ile Gly Asn Arg Ala Val Leu Thr Cys Ser Glu Gln Asp Gly Ser Pro 145 150 155 160

Pro Ser Glu Tyr Thr Trp Phe Lys Asp Gly Ile Val Met Pro Thr Asn 165 170 175

Pro Lys Ser Thr Arg Ala Phe Ser Asn Ser Ser Tyr Val Leu Asn Pro 180 185 190

Thr Thr Gly Glu Leu Val Phe Asp Pro Leu Ser Ala Ser Asp Thr Gly 195 200 205

Glu Tyr Ser Cys Glu Ala Arg Asn Gly Tyr Gly Thr Pro Met Thr Ser 210 215 220

Asn Ala Val Arg Met Glu Ala Val Glu Arg Asn Val Gly Val Ile Val 225 230 235 240

Ala Ala Val Leu Val Thr Leu Ile Leu Leu Gly Ile Leu Val Phe Gly 245 250 255

Ile Trp Phe Ala Tyr Ser Arg Gly His Phe Asp Arg Thr Lys Lys Gly 260 265 270

Thr Ser Ser Lys Lys Val Ile Tyr Ser Gln Pro Ser Ala Arg Ser Glu 275 280 285

Gly Glu Phe Lys Gln Thr Ser Ser Phe Leu Val 290 295

<210> 62

<211> 897

<212> DNA

<213> homo sapiens

<400> 62

atggggacaa aggcgcaagt cgagaggaaa ctgttgtgcc tcttcatatt ggcgatcctg ttgtgctccc tggcattggg cagtgttaca gtgcactctt ctgaacctga agtcagaatt cctgagaata atcctgtgaa gttgtcctgt gcctactcgg gcttttcttc tccccgtgtg

60

120

180 gagtggaagt ttgaccaagg agacaccacc agactcgttt gctataataa caagatcaca 240

gcttcctatg aggaccgggt gaccttcttg ccaactggta tcaccttcaa gtccgtgaca 300

cgggaagaca ctgggacata cacttgtatg gtctctgagg aaggcggcaa cagctatggg 360

gaggtcaagg tcaagctcat cgtgcttgtg cctccatcca agcctacagt taacatcccc 420

tcctctgcca ccattgggaa ccgggcagtg ctgacatgct cagaacaaga tggttcccca 480

ccttctgaat acacctggtt caaagatggg atagtgatgc ctacgaatcc caaaagcacc 540

cgtgccttca gcaactcttc ctatgtcctg aatcccacaa caggagagct ggtctttgat 600

cccctgtcag cctctgatac tggagaatac agctgtgagg cacggaatgg gtatgggaca 660

cccatgactt caaatgctgt gcgcatggaa gctgtggagc ggaatgtggg ggtcatcgtg 720

gcagccgtcc ttgtaaccct gattctcctg ggaatcttgg tttttggcat ctggtttgcc 780

tatagccgag gccactttga cagaacaaag aaagggactt cgagtaagaa ggtgatttac 840

agccagccta gtgcccgaag tgaaggagaa ttcaaacaga cctcgtcatt cctggtg 897 <210> 63 <211> 259 <212> PRT

<213> homo sapiens

<400> 63

Met Gly Thr Lys Ala Gln Val Glu Arg Lys Leu Leu Cys Leu Phe Ile

Cys Ser Glu Gln Asp Gly Ser Pro Pro Ser Glu Tyr Thr Trp Phe Lys

Val Asn Ile Pro Ser Ser Ala Thr Ile Gly Asn Arg Ala Val Leu Thr

Leu Ala Ile Leu Pro Glu Asn Asn Pro Val Lys Leu Ser Cys Ala Tyr 20 25 30

Ser Gly Phe Ser Ser Pro Arg Ala Ala Ser Tyr Glu Asp Arg Val Thr 35 40 45

Phe Leu Pro Thr Gly Ile Thr Phe Lys Ser Val Thr Arg Glu Asp Thr 50 55 60

Gly Thr Tyr Thr Cys Met Val Ser Glu Glu Gly Gly Asn Ser Tyr Gly 65 70 75 80

Glu Val Lys Val Lys Leu Ile Val Leu Val Pro Pro Ser Lys Pro Thr 115 120 125

Asp Gly Ile Val Met Pro Thr Asn Pro Lys Ser Thr Arg Ala Phe Ser 130 135 140

Asn Ser Ser Tyr Val Leu Asn Pro Thr Thr Gly Glu Leu Val Phe Asp 145 150 155 160

Pro Leu Ser Ala Ser Asp Thr Gly Glu Tyr Ser Cys Glu Ala Arg Asn 165 170 175

Gly Tyr Gly Thr Pro Met Thr Ser Asn Ala Val Arg Met Glu Ala Val 180 185 190

Glu Arg Asn Val Gly Val Ile Val Ala Ala Val Leu Val Thr Leu Ile 195 200 205

Leu Leu Gly Ile Leu Val Phe Gly Ile Trp Phe Ala Tyr Ser Arg Gly 210 215 220

His Phe Asp Arg Thr Lys Lys Gly Thr Ser Ser Lys Lys Val Ile Tyr 225 230 235 240

Ser Gln Pro Ser Ala Arg Ser Glu Gly Glu Phe Lys Gln Thr Ser Ser 245 250 255

Phe Leu Val

20

25

30

<210> 64 <211> 777 <212> DNA <213> homo sapiens <4 00> 64 atggggacaa aggcgcaagt cgagaggaaa ctgttgtgcc tcttcatatt ggcgatcctt 60 cctgagaata atcctgtgaa gttgtcctgt gcctactcgg gcttttcttc tccccgtgca 120 gcttcctatg aggaccgggt gaccttcttg ccaactggta tcaccttcaa gtccgtgaca 180 cgggaagaca ctgggacata cacttgtatg gtctctgagg aaggcggcaa cagctatggg 240 gaggtcaagg tcaagctcat cgtgcttgtg cctccatcca agcctacagt taacatcccc 300 tcctctgcca ccattgggaa ccgggcagtg ctgacatgct cagaacaaga tggttcccca 360 ccttctgaat acacctggtt caaagatggg atagtgatgc ctacgaatcc caaaagcacc 420 cgtgccttca gcaactcttc ctatgtcctg aatcccacaa caggagagct ggtctttgat 480 cccctgtcag cctctgatac tggagaatac agctgtgagg cacggaatgg gtatgggaca 54 0

cccatgactt caaatgctgt gcgcatggaa gctgtggagc ggaatgtggg ggtcatcgtg 600

gcagccgtcc ttgtaaccct gattctcctg ggaatcttgg tttttggcat ctggtttgcc 660

tatagccgag gccactttga cagaacaaag aaagggactt cgagtaagaa ggtgatttac 720

agccagccta gtgcccgaag tgaaggagaa ttcaaacaga cctcgtcatt cctggtg 777

Claims (43)

1. Anticorpo isolado, ou composto derivado ou fragmento funcio- nal do mesmo capaz de inibir a proliferação de células tumorais in vitro e/ou in vivo, caracterizado pelo fato de que compreende pelo menos uma CDR escolhida entre as CDRs das seqüências compreendendo pelo menos SEQ ID N0 1, 2, 3, 4, 5 ou 6.

2. Anticorpo, ou composto derivado ou fragmento funcional do mesmo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado tal que consista em um anticorpo monoclonal.

3. Anticorpo, ou composto derivado ou fragmento funcional do mesmo, de acordo com as reivindicações 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que compreende uma cadeia pesada compreendendo pelo menos uma das três CDRs das seqüências SEQ ID Nos: 2, 4 e 6.

4. Anticorpo, ou composto derivado ou fragmento funcional do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, ca- racterizado pelo fato de que compreende uma cadeia pesada compreenden- do as três CDRs seguintes, respectivamente CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3, em que: - CDR-H1 compreende a seqüência SEQ ID N0 2, 7 ou 9; - CDR-H2 compreende as seqüências SEQ ID N0 4 ou 11; e - CDR-H3 compreende as seqüências SEQ ID N0 6 ou 12.

5. Anticorpo, ou composto derivado ou fragmento funcional do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, ca- racterizado pelo fato de que compreende uma cadeia pesada que compre- ende a CDR-H1 da seqüência SEQ ID N0 7, a CDR-H2 da seqüência SEQ ID N0 4 e a CDR-H3 da seqüência SEQ ID N0 12.

6. Anticorpo, ou composto derivado ou fragmento funcional do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracteriza- do pelo fato de que compreende uma cadeia pesada compreendendo a CDR-H1 da seqüência SEQ ID N0 9, a CDR-H2 da seqüência SEQ ID N0 11 e a CDR-H3 da seqüência SEQ ID N0 6.

7. Anticorpo, ou composto derivado ou fragmento funcional do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, ca- racterizado pelo fato de que compreende uma cadeia leve compreendendo pelo menos uma das três CDRs das seqüências SEQ ID Nos: 1, 3 e 5.

8. Anticorpo, ou composto derivado ou fragmento funcional do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, ca- racterizado pelo fato de que compreende uma cadeia leve compreendendo as três CDRs seguintes, respectivamente CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3, em que: - CDR-L1 compreende a seqüência SEQ ID N0 1 ou 8; - CDR-L2 compreende a seqüência SEQ ID N0 3 ou 10; e - CDR-L3 compreende a seqüência SEQ ID N0 5.

9. Anticorpo, ou composto derivado ou fragmento funcional do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, ca- racterizado pelo fato de que compreende uma cadeia leve compreendendo a CDR-L1 da seqüência SEQ ID N0 1, a CDR-L2 da seqüência SEQ ID N0 3 e a CDR-L3 da seqüência SEQ ID N0 5.

10. Anticorpo, ou composto derivado ou fragmento funcional do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracteriza- do pelo fato de que compreende uma cadeia leve compreendendo a CDR-L1 da seqüência SEQ ID N0 8, a CDR-L2 da seqüência SEQ ID N0 10 e a CDR- L3 da seqüência SEQ ID N0 5.

11. Anticorpo, ou composto derivado ou fragmento funcional do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, ca- racterizado pelo fato de que compreende uma cadeia leve compreendendo as três CDRs seguintes: - CDR-L1 da seqüência SEQ ID N0 1; - CDR-L2 da seqüência SEQ ID N0 3; e - CDR-L3 da seqüência SEQ ID N0 5, e uma cadeia pesada que compreende três CDRs seguintes: - CDR-H1 da seqüência SEQ ID N0 7; - CDR-H2 da seqüência SEQ ID N0 4; e - CDR-H3 da seqüência SEQ ID N0 12.

12. Anticorpo, ou composto derivado ou fragmento funcional do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracteri- zado pelo fato de que compreende uma cadeia leve compreendendo três CDRs eguintes: - CDR-L1 da seqüência SEQ ID N0 8; - CDR-L2 da seqüência SEQ ID N0 10; e - CDR-L3 da seqüência SEQ ID N0 5, e uma cadeia pesada que compreende as três CDRs seguintes: - CDR-H1 da seqüência SEQ ID N0 9; - CDR-H2 da seqüência SEQ ID N0 11; e - CDR-H3 da seqüência SEQ ID N0 6.

13. Anticorpo, ou composto derivado ou fragmento funcional do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, ca- racterizado pelo fato de que compreende uma seqüência de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos SEQ ID N0 13, e em que com- preende uma seqüência de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos SEQ ID N0 14.

14. Anticorpo humanizado, ou composto derivado ou fragmento funcionai do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a12, caracterizado pelo fato de que compreende uma seqüência de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos SEQ ID N0 17, e em que compreende uma seqüência de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos SEQ ID N0 18 ou 19.

15. Anticorpo, ou composto derivado ou fragmento funcional do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, ca- racterizado pelo fato de que o dito composto derivado consiste em uma pro- teína de ligação que compreende uma estrutura peptídica na qual pelo me- nos uma CDR é enxertada de tal modo para conservar todas ou parte das propriedades de reconhecimento paratópico do anticorpo inicial.

16. Anticorpo, ou composto derivado ou fragmento funcional do mesmo, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que a estrutura peptídica é selecionada entre a proteína que é a) filogeneticamente bem conservada, b) de arquitetura robusta, c) com uma organização molecu- lar 3-D bem-conhecida, d) de pequeno de tamanho e/ou e) compreende re- giões que podem ser modificadas pela inserção e/ou deleção sem modificar propriedades de estabilidade.

17. Anticorpo, ou composto derivado ou fragmento funcional do mesmo, de acordo com as reivindicações 15 ou 16, caracterizado pelo fato de que a dita estrutura peptídica é selecionada entre estruturas i) que resul- tam de fibronectina, preferencialmente de fibronectina tipo 3 domínio 10, Ii- pocalina, anticalina, proteína Z resultante do domínio B de proteína A do 10 Staphylococcus aureus, tioredoxina A ou proteína com um motivo repetido tal como a "repetição anquirina ", "a repetição armadillo", a "repetição rica em leucina" e a "repetição tetratricopeptídica" ou iii) proteínas inibidoras de NO sintase neuronal (PIN).

18. Anticorpo, ou composto derivado ou fragmento funcional do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, ca- racterizado pelo fato de que o dito fragmento funcional é selecionado entre os fragmentos Fv, Fab, (Fab1)2, Fab', scFv, scFv-Fc e diacorpos, ou qualquer fragmento cuja meia-vida foi aumentada, tais como fragmentos pegilados.

19. Anticorpo, ou composto derivado ou fragmento funcional do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, ca- racterizado pelo fato de que o dito anticorpo é um anticorpo de murino e que compreende uma cadeia leve da seqüência de aminoácidos SEQ ID N0 15, e uma cadeia pesada de seqüência de aminoácidos SEQ ID N0 16.

20. Anticorpo, ou composto derivado ou fragmento funcional do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, ca- racterizado pelo fato de que o dito anticorpo é um anticorpo quimérico que também compreende regiões constantes da cadeia leve e a cadeia pesada derivada de um anticorpo de uma espécie heteróloga ao camundongo.

21. Anticorpo quimérico, ou composto derivado ou fragmento funcional do mesmo, de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que a dita espécie heteróloga é homem.

22. Anticorpo humanizado, ou composto derivado ou fragmento funcional do mesmo, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que as regiões constantes da cadeia leve e a cadeia pesada deriva- da do anticorpo humano são as regiões Iambda ou kappa e a gama-1, gama- 2 ou gama-4, respectivamente.

23. Hibridoma murino arquivado no CNCM1 Instituto Pasteur1 Paris, em 6 de julho de 2006, sob o número I-3646.

24. Anticorpo secretado pelo hibridoma como definido na reivin- dicação 23.

25. Anticorpo, ou composto derivado ou fragmento funcional do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, ca- racterizado pelo fato de que é capaz de ligar especificamente JAM-A (molé- cula de adesão de ligação A) a proteína.

26. Anticorpo, ou composto derivado ou fragmento funcional do mesmo, de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que tem um Kd da proteína JAM-A entre aproximadamente 1 nM e 1 pM, mais preferencialmente entre 10 pM e 40 pM.

27. Ácido nucleico isolado caracterizado pelo fato de que é sele- cionado entre os seguintes ácidos nucleicos: a) um ácido nucleico, DNA ou RNA, que codifica para um anti- corpo, ou para um composto derivado ou fragmento funcional do mesmo, como definido nas reivindicações 1 a 22 e 24 a 26; b) um ácido nucleico complementar a um ácido nucleico como definido em a); c) um ácido nucleico de pelo menos 18 nucleotídeos capazes de hibridização sob condições altamente estringentes com pelo menos uma das CDRs das seqüências ácidas nucleicas SEQ ID N0 20 a 31; e d) um ácido nucleico de pelo menos 18 nucleotídeos capazes de hibridização sob condições altamente estringentes com pelo menos a cadeia leve de seqüência de ácidos nucleicos SEQ ID N0 32 ou 36 de e/ou a cadeia pesada de seqüência de ácidos nucleicos SEQ ID N0 33, 37 ou 38.

28. Vetor composto de um ácido nucleico como definido na rei- vindicação 27.

29. Célula hospedeira que compreende um vetor como definido na reivindicação 28.

30. Animal transgênico, exceto o homem, compreendendo uma célula transformada por um vetor como definido na reivindicação 29.

31. Método para produzir um anticorpo, ou composto derivado ou fragmento funcional do mesmo, como definido nas uma das reivindica- ções 1 a 22 e 24 a 26, caracterizado pelo fato de que o dito método compre- ende seguintes etapas: a) cultura em um meio e as condições de cultura adequadas de uma célula hospedeira como definido na reivindicação 29; e b) recuperação do dito anticorpo, ou um dos seus fragmentos funcionais, dessa forma produzidos no meio de cultura ou das ditas células cultivadas.

32. Anticorpo, ou composto derivado ou fragmento funcional do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 22 e 24 a 26, caracterizado pelo fato de que consiste em um anticorpo biespecífico e tal que compreenda um segundo motivo capaz de interação com um receptor envolvido no desenvolvimento de tumor, selecionado entre os receptores VEGFR, VEGF, EGFR, IGF-IR, HER2neu, HGF, cMET, FGF, CXCR4 e CX- CR2.

33. Anticorpo, ou composto derivado ou fragmento funcional do mesmo, de acordo com uma das reivindicações 1 a 22, 24 a 26 e 32, para uso como um fármaco.

34. Composição compreendendo como um ingrediente ativo um composto consistindo em um anticorpo, ou composto derivado ou fragmento funcional do mesmo, como definido nas reivindicações 1 a 22, 24 a 26, 32 e 33.

35. Composição de acordo com a reivindicação 34, caracteriza- da pelo fato de que compreende, além disso, como um produto de combina- ção para uso de uma maneira simultânea, separada ou estendida, um anti- corpo antitumoral outro daquele um anticorpo direcionado contra a proteína JAM-A.

36. Composição de acordo com a reivindicação 34 ou 35, carac- terizada pelo fato de que compreende, além disso, como um produto de combinação para uso de uma maneira simultânea, separada ou estendida, agente citotóxico/citostático.

37. Composição de acordo com a reivindicação 36, caracteriza- da pelo fato de que o dito agente citotóxico/citostático está quimicamente ligado com pelo menos um dos elementos da dita composição do uso simul- tâneo.

38. Composição de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 34 a 37, caracterizada pelo fato de que pelo menos um dos ditos anti- corpos, ou compostos derivados ou fragmentos funcionais dos mesmos, é conjugado com toxina celular e/ou um radioisótopo.

39. Composição de acordo com uma das reivindicações 34 a 38, para uso como um fármaco.

40. Uso de um anticorpo, ou composto derivado ou fragmento funcional do mesmo, como definido nas reivindicações 1 a 22, 24 a 26, 32 e 34, e/ou de uma composição como definido nas reivindicações 33 a 38, para a preparação de um fármaco para prevenção ou tratamento de uma doença relacionada à proliferação celular tumoral.

41. Uso de acordo com a reivindicação 40, para a preparação de um fármaco para prevenção ou tratamento de câncer.

42. Uso de acordo com a reivindicação 41, caracterizado pelo fato de que o dito câncer é câncer selecionado entre câncer de próstata, os- teossarcoma, câncer de pulmão, câncer de mama, câncer endometrial, mie- Ioma múltiplo, câncer ovariano, câncer pancreático e câncer de cólon.

43. Uso de acordo com a reivindicação 42, caracterizado pelo fato de que o dito câncer é câncer selecionado entre câncer de mama rela- cionado ao estrogênio, câncer de pulmão de não-pequenas células, câncer de cólon e câncer pancreático.