BRPI0719273A2 - Formulação selante intramamária para tetas e método de usar tal formulação a fim de reduzir ou eliminar defeitos visuais em queijos envelhecidos - Google Patents

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "FORMULA- ÇÃO SELANTE INTRAMAMÁRIA PARA TETAS E MÉTODO DE USAR TAL FORMULAÇÃO A FIM DE REDUZIR OU ELIMINAR DEFEITOS VI- SUAIS EM QUEIJOS ENVELHECIDOS".

DECLARAÇÃO SOBRE RECURSOS FEDERAIS

A presente invenção foi concebida com o Apoio Financeiro do Governo Norte-americano, concedido pela seguinte agência: US- DA/CSREES 2005-35503-16328. Os Estados Unidos fazem jus a determi- nados direitos sobre a invenção.

REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS

prioridade é reivindicada por meio desse ao pedido provisório N0 de série 60/850.572, depositado em 10 de outubro de 2006, aqui incorpora- do a título de referência.

CAMPO DA INVENÇÃO A invenção refere-se a um selante intramamário de tetas, con-

tendo metal e isento de bismuto para impedir o acometimento de mastite em vacas secas. O selante intramamário de tetas não ocasiona imperfeições visuais nos alimentos laticínios (especialmente o queijo), feitos a partir do leite de animais tratados. A invenção refere-se, adicionalmente, a um méto- 20 do para impedir a ocorrência de imperfeições por marcas pretas "black spot defect" (BSD) em queijos.

ANTECEDENTES

Mastite em rebanhos leiteiros é uma das doenças mais dispen- diosas e difíceis encontradas por produtores de laticínios. Terapias conven- 25 cionais voltadas para a cura de mastite clínica incluem terapia antimicrobia- na intramamária. Apesar da disponibilidade comercial de inúmeros produtos antimicrobianos intramamários, as taxas de cura de mastite clínica permane- cem muito baixas: 46% para Streptococcus spp., 21% para Staphylococcus spp., e apenas 9% para mastite por Staphyloeoceus aureus. Veja, Wilson et 30 al. (1996) National Mastite Couneil Proeeedings 164-165, e Crandall et al.

(2005) NMC Annual Meeting Proeeedings 215- 216. Assim, os produtores de laticínios geralmente controlam a doença simplesmente ao selecionar os animais propensos a desenvolver mastite de seus rebanhos.

Devido à dificuldade em se tratar mastite, a prevenção de novas infecções intramamárias é o foco principal na indústria de laticínios. A taxa de novas infecções é significativamente maior durante o período seco quan- 5 do comparadas com novas infecções durante o período de lactação. (Por exemplo, um estudo mostrou que 61% de todas as novas infecções intra- mamárias por gram-negativos ocorreram durante o período seco. Veja, To- dhunter et al. (1995) J. Dairy ScL 78:2366.). O período de três semanas i- mediatamente após a secagem, e as duas semanas antes do parto, são pe- 10 ríodos particularmente propensos a novas infecções. Assim, nos últimos a- nos os produtores de laticínios concentraram uma quantidade de esforço considerável em "manutenção preventiva" de vacas durante seu período se- co.

Em abril de 2003, um selante interno (ou "intramamário") de te- tas (ITS) para uso em vacas secas foi introduzido no mercado americano. Vendido nos Estados Unidos sob a marca registrada "ORBESEAL" (Registro de Marca Registrada dos EUA Nos. 2.772.198 e 3.120.693), o produto foi desenvolvido na Nova Zelândia. O ITS da marca "ORBESEAL" introduzido no mercado americano contém 65% w/w de subnitrato de bismuto dispersos em uma pasta viscosa. O produto ITS não contém nenhum antibiótico, nem contém nenhum agente antimicrobiano ativo. O ITS é injetado na ponta da teta utilizando uma seringa aplicadora tubular, da mesma maneira que se aplica um antibiótico a uma vaca seca. O produto ITS preenche as fissuras e dobras do canal da teta, criando assim uma barreira física aos patógenos. Veja, Patente N0 U.S. 6.254.881, concedida em 3 de julho de 2001, aqui in- corporada a título de referência.

Estudos iniciais do produto da marca "ORBESEAL" na Nova Ze- lândia concluíram que o produto funcionou também como um antibiótico in- tramamário de ação duradoura de amplo espectro na prevenção de novas 30 infecções intramamárias no parto e na prevenção de características clínicas de mastite durante os primeiros cinco (5) meses de lactação. Veja, Woolford et al. (1998) New Zealand Veterinary Journal 46:1. Um estudo mais recente nos Estados Unidos também concluiu que esse produto ITS melhorou a sa- úde do úbere de vacas já infundidas com cloxacilina benzatina. Veja, God- den et al. (2003) J. Dairy Sei. 86:3899-3911. Assim, o ITS da marca "ORBE- SEAL" provou ser uma ferramenta eficaz na redução do número de novos 5 casos de mastite em vacas leiteiras durante seu período seco. Apesar de sua introdução relativamente recente no mercado americano, o produto da marca "ORBESEAL" aproveitou a ampla aceitação no mercado e é ampla- mente utilizado nos rebanhos leiteiros dos EUA. Em suma, o produto da marca "ORBESEAL" é muito bom em seu propósito pretendido de prevenir 10 mastite.

Subsequente à introdução do produto ITS da marca "ORBESE- AL" nos EUA, imperfeições visuais em laticínios envelhecidos, de forma mais notável queijos tipo cheddar envelhecidos, começam a aparecer. A imperfei- ção visual assume a forma de pequenas marcas pretas (aproximadamente 15 0,5 a 5 mm de diâmetro) que aparecem por todo o queijo envelhecido. As marcas são imperfeições visuais puramente estéticas que reduzem a quali- dade (e consequentemente o valor de mercado) do queijo afetado pelo pro- blema. As marcas não são acompanhadas por nenhuma imperfeição orga- noléptica no queijo. O queijo afetado com as marcas pretas pode ser vendi- 20 do, apesar de em um grau menor que os queijos não afetados. A imperfei- ção foi chamada de "imperfeições por marcas pretas" (BSD).

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Uma primeira versão da invenção se refere a um método para formar uma barreira física no canal da teta de um animal não-humano para 25 tratamento profilático de distúrbios mamários durante o período seco do a- nimal e simultaneamente prevenir BSD em laticínios feitos com o leite do animal. O método compreende infundir a formulação selante para tetas no canal da teta do animal, onde a formulação selante para tetas é isenta de bismuto. A formulação é administrada em uma quantidade suficiente para 30 formar uma barreira física à entrada de microorganismos na teta, porém não causa imperfeições por marcas pretas em laticínios feitos com o leite do a- nimal. A modalidade preferida do método compreende infundir uma formula- ção selante para tetas que compreende um sal de metal pesado não-tóxico isento de bismuto em uma base de gel. De preferência, o selante para tetas é desprovido de agentes antiinfecciosos (ou seja, o selante para tetas não contém, de preferência, antibióticos ou outros agentes ativos antiinfeccio- 5 sos). De preferência, o método compreende infundir uma formulação selante para tetas que compreende pelo menos cerca de 30% por peso do sal de metal pesado não-tóxico isento de bismuto, com mais preferência, cerca de 50% a cerca de 75% por peso do sal de metal pesado não-tóxico isento de bismuto, e com mais preferência ainda, cerca de 65% por peso do sal de 10 metal pesado não-tóxico isento de bismuto. O propósito do sal é basicamen- te conferir densidade suficiente à composição de modo que o ITS "se aco- mode" no canal da teta canal. Em uma versão do método, o sal de metal pesado não-tóxico é selecionado a partir do grupo que consiste em dióxido de titânio, óxido de zinco, sulfato de bário e combinações desses sais.

A base de gel pode ser qualquer formulação de gel adequada,

cujo hospedeiro é conhecido na técnica farmacêutica. A base de gel preferi- da compreende estearato de alumínio e parafina líquida (por exemplo, óleo mineral, petrolato branco, petrolato amarelo, etc.). As bases de gel típicas incluem uma cera ou óleo de algum tipo, e um sal, tal como, estearato de alumínio ou magnésio.

Outra versão da invenção se refere a um selante intramamário para tetas que compreende, em combinação, uma base de gel, e um sal de metal pesado não-tóxico disperso na base de gel, onde o sal de metal pesa- do é desprovido de bismuto. Como observado antes, o selante para tetas 25 compreende, de preferência, pelo menos cerca de 30% por peso, com mais preferência, cerca de 50% a cerca de 75% por peso, e com mais preferência ainda, cerca de 65% por peso do sal de metal pesado. O sal de metal pesa- do é, de preferência, dióxido de titânio, óxido de zinco, sulfato de bário ou uma combinação desses. A base de gel compreende, de preferência, estea- 30 rato de alumínio e parafina líquida. Ainda outra versão da invenção é um aperfeiçoamento de selantes intramamário para tetas. Especificamente, em um método para formar uma barreira física no canal da teta de um animal não-humano para tratamento profilático de distúrbios mamários durante o período seco do animal, onde o método compreende a etapa de infundir uma formulação selante no canal da teta do animal sem um agente antiinfeccioso, o aprimoramento da presente compreende infundir uma formulação selante 5 para tetas que compreende sal(is) de metal pesado não-tóxico(s) isento(s) de bismuto em uma base de gel. O aprimoramento previne a formação de imperfeições por marcas pretas em laticínios feitos a partir do leite de ani- mais tratados.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

As Figuras 1A e 1B são imagens de uma imperfeição por marcas

pretas típica em um bloco de 18 kg de queijo cheddar branco envelhecido. A Figura 1A mostra a superfície do bloco com uma imperfeição por marcas pretas facilmente visível. A Figura 1B é uma vista ampliada (com uma régua sobreposta) que mostra as dimensões da imperfeição. Tais marcas são i- gualmente distribuídas por todo o queijo.

A Figura 2 é uma fotomicrografia eletrônica de uma imperfeição por marcas pretas que exibe estruturas semelhantes a pelo ou bastão carac- terísticas de nanobastões de sulfeto de bismuto (III). Nenhuma tal estrutura apareceu em nenhum queijo não-BSD ou regiões do queijo não-BSD testa- 20 dos. Os bastões mostrados na Figura 2 possuem diâmetros que variam de 37,09 nm a 129,33 nm.

A Figura 3 é uma fotomicrografia eletrônica de uma única estru- tura semelhante a bastão de uma região com imperfeição por marcas pretas. O bastão é mostrado em 130,88 nm de diâmetro e exibe uma linha QUE cor- ta o comprimento do bastão.

As Figuras 4A e 4B são imagens de imperfeições por marcas pretas induzidas em laboratório. Na Figura 4A, os vários componentes de selante intramamário para tetas da marca "ORBESEAL" (ITS) foram mistu- rados com queijo e cada marca foi fotografada imediatamente. A Figura 4B 30 mostra as mesmas marcas fotografadas após a exposição tanto a voláteis de queijo cheddar envelhecido como a gás sulfeto de hidrogênio. Os locais 4 e 5 contêm subnitrato de bismuto e a formulação de ITS intacta da marca "ORBESEAL", respectivamente.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Começando no final de 2003, inúmeras investigações foram fei- tas por fabricantes de queijo na Universidade de Wisconsin-Madison, De- partment of Food Science and Centerfor Dairy Research (CDR), para procu- rar informações sobre a aparência de uma nova "imperfeição por marcas pretas" em queijos envelhecidos, especialmente queijo cheddar envelhecido. Historicamente, descolorações cinzas a pretas em queijos foram o resultado de diversas causas diferentes e distintas, inclusive o crescimento de micro- organismos específicos (por exemplo, algumas propionibactérias ambientais ou bolor) ou a contaminação de queijo com resíduos lubrificantes de grau alimentício. A BSD particular observada pelos fabricantes de queijo, entre- tanto, não se ajustou ao perfil de um contaminante bacteriano ou outro orga- nismo em decomposição, nem pareceu ser o dejetos que acharam caminho no fluxo do leite ou outro resíduo introduzido durante o processo de fabrica- ção de queijo.

Assim, a primeira etapa foi determinar a estrutura química da imperfeição por marcas pretas. Uma grande quantidade de esforço foi inici- almente feita para extrair as regiões afetadas do queijo BSD. As tentativas 20 de extração que utilizam um amplo espectro de solventes orgânicos de pola- ridade variada, hidrofobicidade, etc., se mostraram inúteis como um meio de isolar qualquer tipo de massa de pigmento orgânico da matriz do queijo. Embora a extração da BSD com solventes orgânicos não tenha sido bem sucedida, as tentativas de extração produziram dados úteis. Especialmente, 25 devido ao fato de o pigmento não se dissolver ou difundir em tais solventes, pode ser concluído (com um alto grau de probabilidade) que o pigmento de marcas pretas também não se dissolveu ou difundiu dentro da própria matriz do queijo.

Um exame visual de um número crescente de amostras de quei- jo que apresentam a imperfeição (amostras acumuladas de fabricantes de queijo comerciais) confirmou essa conclusão - o pigmento de marcas pretas está bem contido e não parece se difundir na matriz do queijo. Veja, Figuras 1Α e 1Β, que são fotografias de um bloco típico de 18 kg de queijo cheddar branco envelhecido com a BSD. A Figura 1A é uma fotografia da superfície externa do bloco de queijo. A Figura 1B é uma vista ampliada de uma única marca preta, com uma régua sobreposta à imagem para mostrar as dimen- 5 sões da marca. As marcas, tal como, àquela mostrada nas Figuras 1A e 1B são tipicamente distribuídas de maneira igual por todo o bloco de queijo, que varia em tamanho de < 1 mm a cerca de 5 mm de diâmetro. A frequência das marcas dentro de qualquer determinado bloco de queijo de 18 kg varia bastante, de < 10 por bloco a muito mais de 100.

Houve algumas evidências anedóticas recebidas de fabricantes

de queijo que o envelhecimento específico e estratégias de armazenamento poderiam ajudar a dissolver ou difundir as marcas até o ponto que essas não sejam mais visualmente notáveis. (Devido ao fato de a imperfeição não ser acompanhada por nenhuma deficiência organoléptica, o "esvanecimento" 15 das marcas poderia melhorar a condição). Tal efeito, entretanto, é altamente improvável devido à estabilidade do pigmento aos solventes orgânicos em- pregados nas tentativas de extração. Em suma, os experimentos de extra- ção realizados pelo presente inventor utilizaram solventes que possuem hi- drofobicidades similares à gordura do leite. Se o pigmento das marcas pre- 20 tas se dissolverem ou se difundirem na própria matriz do queijo (através de um protocolo de envelhecimento ou armazenamento), o pigmento também deveria se dissolver ou difundir facilmente em um solvente orgânico que possui características físicas similares à gordura do leite. Esse resultado não ocorreu no laboratório. Ademais, determinado o ambiente pH/acídico típico 25 em queijo, e os períodos de envelhecimento/ vida útil típicos associados com queijos tipo cheddar mais envelhecidos (0,5 a 2 anos), a evidência anedótica que a imperfeição pode ser melhorada por protocolos de envelhecimento ou armazenamento é sem mérito.

Um experimento, entretanto, se mostrou mais esclarecedor: o pigmento das marcas pretas é facilmente dissolvido em ácido nítrico. Isso sugere fortemente que o pigmento era um sal inorgânico. Em conjunto com o momento da primeira característica da imperfeição, uma hipótese de traba- Iho foi formulada, ou seja, que a ITS era tanto um agente causador de (ou pelo menos correlacionado com) BSD. A descoberta que o pigmento das marcas pretas se dissolve facilmente em ácido sustentou uma hipótese adi- cional que o pigmento pode ser compreendido de sulfeto de bismuto III. As- 5 sim, concluiu-se que o produto da marca ORBESEAL", que nos EUA con- tém 65% por peso de um sal contendo bismuto, estava sendo provavelmente introduzido de forma inadvertida no fluxo de leite. Conforme observado aci- ma, o produto da marca "ORBESEAL" foi comercialmente bem sucedido, pois esse forma uma barreira fisicamente rígida à entrada de patógenos no 10 canal da teta. Entretanto, a remoção do produto de um animal tratado requer a remoção da pele das tetas do animal. Parece que alguns dos ITS perma- neceram nas tetas após a remoção da pele e estava encontrando seu cami- nho no fluxo do leite.

A próxima fase da pesquisa operada de acordo com uma hipóte- se que o sulfeto de bismuto Ill era, de fato, o agente causador da BSD. O próprio subnitrato de bismuto é branco e, de forma relativa, quimicamente inerte. Assim, sua presença em leite fluido, queijo mussarela, e iogurte não é facilmente evidente de maneira visual. Entretanto, em queijos envelhecidos com alta intensidade de sabor, a imperfeição por marcas pretas aparece de forma proeminente. Assim, concluiu-se por hipótese que o sulfeto de bismuto Ill (um sal relativamente insolúvel preto) era o produto de uma reação entre subnitrato de bismuto (do ITS) e sulfeto de hidrogênio produzido dentro do queijo envelhecido pelas ações de maturação na microflora, enzimas e al- guns co-fatores que atuam sobre os componentes de proteína/aminoácido de queijo.

Em suma, a hipótese foi que o subnitrato de bismuto h criou seu caminho no fluxo de leite devido à remoção incompleta do ITS antes da or- denha. O subnitrato de bismuto reagiu com sulfeto de hidrogênio para pro- duzir sulfeto de bismuto Ill de acordo com a Equação 1 4BiN03(0H)2Bi0(0H) + H2S -> Bi2S3 (preto insol.) (Eq. 1)

O produto, sulfeto de bismuto Ill (ou simplesmente sulfeto de bismuto) é um sal preto relativamente insolúvel. Além de possuir bismuto de propósito elementar específico, con- cluiu-se por hipótese que, sob as condições ou ambiente químico presente dentro da matriz do queijo, as moléculas Bi2S3 poderiam formar uma estrutu- ra cristalina referida na literatura como nanobastões ou nanowhiskers. Veja, W. Zhang et al. (2001) Sol. State Comm. 119:143-146 e B. Zhang et al.

(2006) J Phys. Chem. 110:8978-8985. Esses nanobastões contendo bismuto poderiam, desse modo, constituir partículas de difração leve capazes de conferir a coloração cinza a preta observada na imperfeição por marcas pre- tas.

Esforços foram então concentrados na confirmação: 1) da pre-

sença elementar de bismuto nas imperfeições por marcas pretas; e 2) con- firmar a presença física de estruturas de nanobastão de sulfeto de bismuto Ill dentro das imperfeições por marcas pretas.

A confirmação da presença de bismuto dentro das marcas pre- tas foi investigada utilizando espectroscopia de massa com plasma induti- vamente acoplado (ICPMS). O método de AOAC International (Association of Analytical Communities) 993.14 foi usado. As primeiras tentativas avalia- ram múltiplas marcas pretas pela presença de diversos elementos que pode- riam contribuir para BSD. Os experimentos iniciais concentrados em sais/óxidos de metal típicos daqueles encontrados em equipamento de ma- nipulação/transporte de leite e queijo, e outros derivados de metal residuais presentes em processamento de grau alimentício. Como uma medida de controle, análises de composição de queijo foram realizadas. Especificamen- te, proteína, cinza, e umidade foram medidas utilizando métodos 2001.14, 935.42, e 926.08, de Official Methods of Analysis, AOAC 17th Edition, res- pectivamente (Copyright 2000, ISBN: 0935584-67-6). A gordura foi medida de acordo com o método descrito em Official Methods of Analysis, AOAC 17th Edition.

Estudos de microscopia eletrônica de transmissão (TEM) foram realizados conforme exposto a seguir: aproximadamente 100 μΙ de água destilada duas vezes foram adicionados às amostras e a mistura foi pulveri- zada em uma suspensão com um bastão de vidro. Alíquotas de aproxima- damente 5 μΙ de amostra suspensa foram depositadas em telas TEM de co- bre de 300 malhas cobertas com formaldeído acetal-álcool polivinílico (Ted Pella, Inc., Redding, CA). O excesso de amostra foi removido com pequenos pedaços de papel filtro e a amostra restante foi seca na superfície da tela em 5 temperatura ambiente. Em alguns casos, a coloração negativa de TEM da marca NANO-W (Nanoprobes, Incorporated, Yaphank, NY) foi aplicada so- bre a amostra seca para aumentar o contraste e visibilidade. Os espécimes foram observados com um microscópio eletrônico Philips CM 120 e as ima- gens foram coletadas com uma câmara MegaView 3 Digital (de SIS, Ringo- 10 es, NJ). As medidas foram tiradas com software de análise da marca SIS (Ringoes, NJ) calibrado com amostras de referência de comprimentos co- nhecidos.

Os resultados de ICPMS demonstraram a presença dos elemen- tos cromo, cobre, ferro, níquel e bismuto na região de BSD. Embora aumen- 15 tos progressivos nos elementos cromo, cobre, ferro, e níquel sejam revela- dos, concentrações de bismuto na região de BSD eram geralmente três or- dens de magnitude maior que o mesmo queijo avaliados em áreas não-BSD. Esses resultados mostram que o bismuto é o único elemento presente em quantidades suficientes a participar em uma reação de geração de pigmento. 20 Centenas de imagens TEM de regiões de BSD de amostras de

queijo foram capturadas com uma única conclusão coerente. Os nanobas- tões típicos daquelas relatadas na literatura citada acima estavam especifi- camente presentes na região de queijo BSD. Um exemplo de tal imagem é apresentado na Figura 2. As estruturas de nanobastão mostradas na Figura 25 2 são muito pequenas para serem facilmente detectadas com um microscó- pio de luz. Os nanobastões mostrados na Figura 2 variam em diâmetro de cerca de 69 nm a cerca de 130 nm. Os nanobastões são muito estáveis às condições potencialmente agressivas de TEM. Os bastões parecem possuir uma superfície levemente manchada e esses exibem uma linha característi- 30 ca que calcula o comprimento do nanobastão. Veja Figura 3, que é uma vis- ta de ampliação aumentada de um único nanobastão. A presença de tais estruturas é compatível com a presença de nanobastões de sulfeto de bis- muto formados sob as condições presentes na matriz do queijo.

Para confirmar a reatividade de subnitrato de bismuto como um reagente na formação de nanobastões de sulfeto de bismuto III, análises adicionais foram realizadas para verificar se BSD poderia ser intencional- mente criada novamente no laboratório. Em suma, os queijos foram fabrica- dos com quantidades conhecidas de componentes de ITS e submetidos tan- to a gases voláteis autênticos produzidos pela maturação de queijos como diretamente expostos ao co-reagente de subnitrato de bismuto com caráter hipotético, gás sulfeto de hidrogênio. Em ambas as situações, as respostas foram invariavelmente iguais: quando as amostras de queijo que contêm subnitrato de bismuto ou a formulação de ITS completa foram expostas a voláteis de queijo autênticos ou a gás H2S de grau "químico padrão", cada uma formou uma pigmentação preta idêntica com a presença associada de estruturas de nanobastão, confirmando ainda que o subnitrato de bismuto é o responsável por BSD. Os resultados são mostrados na Figura 4. Nenhum outro componente ITS formou marcas pretas quando exposto dessa forma. Ademais, os locais suscetíveis formaram pigmentação identicamente preta quando expostos tanto a voláteis de queijo autênticos como a gás sulfeto de hidrogênio, confirmando assim que o gás sulfeto de hidrogênio era o co- reagente suspeito.

A partir de um ponto de vista de fabricação e envelhecimento ou maturação de queijo, não é razoável considerar o objetivo da eliminação de produção de gás sulfeto de hidrogênio como um meio de controlar BSD. O sulfeto de hidrogênio é um composto de aroma altamente ativo, o produto de 25 atividades microbianas, enzimáticas e de co-fator contra aminoácidos con- tendo enxofre, tal como, cisteína. Veja, Arfi et al., (2002) Appi. Microbiol. Bio- technoi 58:503-510. Há uma ampla pesquisa para sustentar a afirmação que o gás sulfeto de hidrogênio é um componente necessário e/ou valioso de sabor de queijo cheddar envelhecido típico. Veja, Burbank & Qian (2005) 30 J. Chrom. 1066:149-157. Mesmo que um esquema seja desenvolvido para eliminar a produção de sulfeto de hidrogênio (ao interromper as várias vias metabólicas complexas) o produto final resultante corre o risco de um caráter de sabor ser inaceitável para avaliadores e consumidores de queijo.

Assim, na presente invenção, a formulação do ITS é alterada para excluir sais contendo bismuto. Como mostrado nos experimentos aci- ma, é o subnitrato de bismuto no ITS comercialmente disponível que causa a 5 BSD. Desse modo, a utilização de um ITS que não contém bismuto, nem qualquer outro sal de metal pesado que reage com sulfeto de hidrogênio pa- ra produzir um pigmento escuro insolúvel, elimina a BSD.

EXEMPLOS

Os seguintes Exemplos estão incluídos exclusivamente para for- necer uma descrição mais completa da invenção descrita e reivindicada a- qui. Os Exemplos não limitam a invenção de forma alguma.

Exemplo 1:

Um ITS de teste de acordo com a presente invenção foi formula- do. O ITS de teste era idêntico à formulação da marca "ORBESEAL", com a exceção que esse não continha bismuto nem sais contendo bismuto. O ITS •de teste compreende óxido de zinco, dióxido de titânio, óleo mineral (30 a 40%), e estearato de alumínio.

Para preparar um lote de ITS, parafina líquida (por exemplo, óleo mineral) é distribuída em um recipiente adequado equipado com um mistu- 20 rador. Estearato de alumínio é adicionado e a mistura é agitada e aquecida a cerca de 160°C até ficar homogênea (cerca de duas horas). O sal não con- tendo bismuto não-tóxico é então adicionado em partes à mistura, com agi- tação, até a quantidade desejada de sal de metal ser adicionada. A mistura é então agitada até ficar homogênea. Os produtos são então transferidos em 25 tubos injetores convencionais para administração intramamária.

Exemplo 2:

O objetivo desse Exemplo é comparar a retenção dentro das tetas de vacas leiteiras não-lactantes de um ITS de acordo com a presente invenção comparado com o produto da marca "ORBESEAL".

O estudo foi realizado em Blaine Dairy da Universidade de Wis-

consin-Madison (UW), em Arlington, Wisconsin. Dezesseis (16) vacas (n = 64 tetas) estavam incluídas no dia de secagem. Foi requerido que todas as vacas incluídas possuíssem quatro quartos funcionais e nenhum sinal visível de mastite. Todas as vacas foram secas e receberam terapia da vaca seca (DCT) com antibiótico intramamário de acordo com protocolos de rebanho leiteiro UW padrão. Paridade e produção de leite (em secagem) foram regis- 5 tradas em cada vaca. Mediante a inclusão inicial, as tetas foram classifica- das por formato, comprimento, diâmetro e grau de hiperceratose na ponta da teta. Dentro de cada vaca, duas tetas foram determinadas para receber o ITS da marca "ORBESEAL" e duas tetas foram determinadas para receber o ITS de teste. O protocolo de administração foi projetado para garantir que 10 cada produto fosse administrado de forma uniforme entre os locais da teta, oito tetas cada por produto administrado em cada local (parte traseira direita, parte frontal direita, parte traseira esquerda, parte frontal esquerda). Os tu- bos selantes foram pesados antes e após a administração para determinar o volume líquido administrado. Antes de receber DCT & o selante interno para 15 tetas, as pontas das tetas foram limpas utilizando um único lenço com 70% de álcool isopropanol e a técnica de inserção parcial foi usada para reduzir a probabilidade de introduzir patógenos à pele da teta. Após a administração do selante interno, as tetas foram banhadas com um desinfetante de tetas externo.

As tetas foram examinadas nos dias 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 14, 28, 42

e no parto para detectar vermelhidão, inchação e/ou vazamento de selante. Nos dias 14, 28, 42 e no parto, o selante foi removido de uma teta (oito tetas para cada selante por dia de remoção) de cada vaca por extrusão manual. O selante removido foi coletado com o primeiro leite em frascos plásticos de 50 25 ml graduados. Os frascos foram centrifugados (3000 rpm x 5-7 minutos), o sobrenadante enxaguados, e o selante recuperado foi pesado. A quantidade de selante recuperado foi comparada em cada período entre as tetas trata- das com ITS de teste e as tetas tratadas com ITS da marca "ORBESEAL". As amostras complementares foram coletadas no 1o dia após o parto utili- 30 zando o mesmo procedimento. Em todos os períodos de amostragem, após a remoção do selante, as tetas foram banhadas com um desinfetante para tetas externo. Após o parto, amostras de leite foram assepticamente coleta- das de todas as partes e cultivadas para identificar infecções intramamárias. Características de Grupo - Comprimento e Volume de Teta:

Um total de 16 vacas estava incluído no estudo para um número total de 64 tetas; 32 tetas receberam o ITS de teste e 32 tetas receberam o ITS da marca "ORBESEAL". O comprimento e volume da teta para da popu- lação de teste são mostrados na Tabela 1:

Tabela 1. Média, Desvio Padrão e Erros Padrão de Comprimen- to e Volume de Teta por Composto

Grupo A (ITS "ORBESEAL") Grupo B (ITS de Teste) N Médio S.D. S.E. N Médio S.D. S.E. P Comprimento 32 5,12 0,88 0,16 32 5,11 0,86 0,15 0,95 Volume 32 23,60 8,61 1,52 32 25,72 9,73 1,73 0,36 Não houve diferença significativa em comprimento ou volume de 10 teta nas tetas do Grupo A ou Grupo B (p > 0,36). O comprimento total da teta era 5,11 cm, variando de 3,3 cm a 7,3 cm. O comprimento médio de teta era 5,12 cm no Grupo A e 5,11 cm no Grupo B, e variou de 3,3 cm a 7,3 cm no Grupo A e de 3,5 cm a 7,10 cm no Grupo B. Um teste-t pareado para du- as amostras foi realizado para testar a hipótese nula de que o comprimento 15 médio da teta nos dois grupos de tratamento não se diferiu. Não houve dife- rença significativa em comprimento de teta entre as tetas randomizadas para receber cada produto (p= 0,95).

O volume total da teta era 24,66 cm, variando de 12,47cm a 54,34 cm (desvio padrão de 9,17 cm3). O volume médio da teta era 23,6 20 cm3, variando de 12,54 cm3 a 54,34 cm3 (desvio padrão -de 8,60 cm) no Gru- po A. No Grupo B, o volume médio da teta era 25,71 cm, variando de 12,47 cm3 a 48,25 cm3 (desvio padrão de 9,73 cm3). Um teste-t pareado para duas amostras foi usado para testar a hipótese nula de que o volume da teta nos dois grupos não se diferiu. Não houve diferença significativa em volume de 25 teta entre as tetas randomizadas para receber cada produto (p = 0,95 e p = 0,35; análise de transformada logarítmica). Hiperceratose: A saúde da ponta da teta foi avaliada para hiper- ceratose utilizando a seguinte escala: Nenhum anel (N)1 Anel Liso (S)1 Áspe- ro (R)1 Muito Áspero (VR). A distribuição de pontuações de teta era: N (n = 21; 32,8%), S (n = 31; 48,4%), R (n = 11; 17,2%) e VR (n = 1; 2%). Um teste 5 X2 confirmou que a distribuição de pontuação de hiperceratose não estava associada com o grupo de tratamento (p = 0,13).

Tabela 2. Estatísticas Descritivas para Hiperceratose

Grupo A (ITS ORBE¬ Group B (ITS Teste) Total SEAL") Pontua- Freq uên- Porcenta- Fre- Porcent¬ Fre- Porcenta¬ çao cia gem quencia agem quencia gem N 13 40.63 8 25,00 21 32,81 S 11 34,38 20 62,50 31 48,88 R 7 12,88 4 12,50 11 17,19 VR 1 3,23 n/a n/a 1 1,56 Quantidade de Selante Administrado, Recuperado e Perdido: As

análises Estatísticas que utilizam um teste-t pareado foram realizadas para determinar se a quantidade de selante administrado, recuperado ou perdido (não recuperado) não se diferiu com base no grupo de tratamento.

Tabela 3. Teste-t Pareado para Duas Amostras para a Média de Selante Administrado, Recuperado e Perdido por Produto

Grupo A Grupo B Total (ITS ORBESEAL") (ITS Teste) N Média S.D. N Média S.D. N Média S.D. P Administrado 32 3,46 0,85 32 3,77 0,96 64 3,62 0,91 0,12 Recuperado 32 0,85 1,42 32 0,79 1,57 64 0,82 1,49 0,89 Perdido 32 2,71 1,37 32 3,04 1,55 64 2,88 1,46 0,40 Dos quatro (4) gramas em cada tubo, a quantidade total de se-

lante administrado era 3,62 gramas. Não houve diferença significativa na quantidade de ITS da marca ORBESEAL" (3,46 gramas) ou ITS de teste (3,62) administrado (P = 0,12).

A quantidade total de selante recuperado foi 0,82 grama e não houve diferenças significativas baseados no tratamento (P = 0,89). A quanti- dade total de selante perdido foi 2,88 gramas e não se diferiu por grupo de 5 tratamento (P = 0,40). A quantidade de selante recuperado teve a tendência de ser associada com a data de recuperação (P = 0,08) com mais selante recuperado no dia 14 como comparado com outros períodos de recuperação (dia 14, recuperação = 1,6 grama; dia 28 recuperação = 0,68 grama; dia 42 recuperação = 0,65 grama; recuperação no parto = 0,33 grama).

Regressão linear simples foi usada para determinar que não

houve relação significativa entre a quantidade de selante administrado e vo- lume de teta (p = 0,59, p = 0,53).

Para o selante recuperado, um teste de regressão linear simples foi realizado para testar a hipótese nula que não houve relação linear signifi- cativa entre a quantidade de selante recuperado e o volume de teta. Apenas 6% do selante recuperado foram considerados pelo volume de teta (P =

0.05).

A proporção de selante administrada não estava significativa- mente associada com o volume da teta, enquanto o selante recuperado es- tava significativamente correlacionado com o volume da teta, porém apenas a uma pequena proporção (6%).

A análise de variância simples (one-way ANOVA) foi usada para determinar as relações univariadas entre a quantidade de selante adminis- trado e recuperado e a posição da teta, do produto, da vaca. Tabela 4. Tabela de Associação Univariada de Volume Adminis- trado e Recuperado (valores P)

Administrado Recuperado (P) (P) Volume da teta 0,53 0,13 Posição da teta 0,56 0,52 Produto 0,19 0,88 Dia --- 0,07 Vaca 0,05 0,17

Claims (22)

1. Método para formar uma barreira física no canal da teta de um animal não-humano para tratamento profilático de distúrbios mamários durante o período seco do animal e impedir simultaneamente a ocorrência de imperfeições por marcas pretas em laticínios feitos com o leite do animal, sendo que o método compreende: infundir uma quantidade de uma formulação selante para tetas no canal da teta do animal, onde a formulação selante para tetas compreen- de um sal de metal pesado não-tóxico isento de bismuto, e onde a quantida- de é suficiente para formar uma barreira física para a entrada de microorga- nismos no canal da teta, e onde a formulação selante para tetas não causa imperfeições por marcas pretas em laticínios feitos com o leite do animal.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, que compreende infundir uma formulação selante para tetas que é desprovida de agentes an- tiinfecciosos.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1, que compreende infundir uma formulação selante para tetas que compreende um sal de metal pesado não-tóxico isento de bismuto em uma base de gel.

4. Método, de acordo com a reivindicação 1, que compreende infundir uma formulação selante para tetas que compreende pelo menos cerca de 30% por peso do sal de metal pesado não-tóxico isento de bismuto.

5. Método, de acordo com a reivindicação 1, que compreende infundir uma formulação selante para tetas que compreende cerca de 50% a cerca de 75% por peso do sal de metal pesado não-tóxico isento de bismuto.

6. Método, de acordo com a reivindicação 1, que compreende infundir uma formulação selante para tetas que compreende cerca de 65% por peso do sal de metal pesado não-tóxico isento de bismuto.

7. Método, de acordo com a reivindicação 1, onde o sal de me- tal pesado não-tóxico é selecionado a partir do grupo que consiste em dióxi- do de titânio, óxido de zinco, sulfato de bário e combinações desses.

8. Método, de acordo com a reivindicação 1, onde a base de gel compreende estearato de alumínio.

9. Método, de acordo com a reivindicação 1, onde a base de gel compreende parafina líquida.

10. Selante intramamário para tetas que compreende, em com- binação: uma base de gel; e um sal de metal pesado não-tóxico disperso na base de gel, on- de o sal de metal pesado é desprovido de bismuto.

11. Selante intramamário para tetas, de acordo com a reivindi- cação 10, onde o selante é desprovido de agentes antiinfecciosos.

12. Selante intramamário para tetas, de acordo com a reivindi- cação 10, que compreende pelo menos cerca de 30% por peso do sal de metal pesado.

13. Selante intramamário para tetas, de acordo com a reivindi- cação 10, que compreende cerca de 50% a cerca de 75% por peso do sal de metal pesado.

14. Selante intramamário para tetas, de acordo com a reivindi- cação 10, que compreende cerca de 65% por peso do sal de metal pesado.

15. Selante intramamário para tetas, de acordo com a reivindi- cação 10, onde o sal de metal pesado é selecionado a partir do grupo que consiste em dióxido de titânio, óxido de zinco, sulfato de bário, e combina- ções desses.

16. Selante intramamário para tetas, de acordo com a reivindi- cação 10, onde a base de gel compreende estearato de alumínio.

17. Selante intramamário para tetas, de acordo com a reivindi- cação 10, onde a base de gel compreende parafina líquida.

18. Em um método para formar uma barreira física no canal da teta de um animal não-humano para tratamento profilático de distúrbios ma- mários durante o período seco do animal, o método compreende a etapa de infundir uma formulação de selante no canal da teta do animal, sendo que um aperfeiçoamento compreende: infundir uma formulação selante para tetas que compreende um sal de metal pesado não-tóxico isento de bismuto em uma base de gel.

19. Aperfeiçoamento, de acordo com a reivindicação 18, que compreende infundir uma formulação selante para tetas que compreende pelo menos cerca de 30% por peso do metal pesado não-tóxico isento de bismuto.

20. Aperfeiçoamento, de acordo com a reivindicação 18, que compreende infundir uma formulação selante para tetas que compreende cerca de 50% a cerca de 75% por peso do metal pesado não-tóxico isento de bismuto.

21. Aperfeiçoamento, de acordo com a reivindicação 18, que compreende infundir uma formulação selante para tetas que compreende cerca de 65% por peso do metal pesado não-tóxico isento de bismuto.

22. Aperfeiçoamento, de acordo com a reivindicação 18, onde o sal de metal pesado é selecionado a partir do grupo que consiste em dióxido de titânio, óxido de zinco, sulfato de bário, e combinações desses.