BRPI0716219A2 - Composições e métodos para produção aperfeiçoada de proteína. - Google Patents

Abstract

COMPOSIÇÕES E MÉTODOS PARA PRODUÇÃO APERFEIÇOADA DE PROTEÍNA. A presente invenção se refere a identificação de novas sequências de ácido nucléico, designadas aqui como 7p, 9k, 7E, 9G, 8Q e 203, em uma célula hospedeira que efetua produção de proteína. A presente invenção também proporciona células hospedeiras tendo uma mutação ou anulação de parte ou todo do gene que codifica 7p, 8k, 7E, 9G, 8Q e 203, que são apresentedas na figura 1, e são SEQ ID NOS: 1-6, respectivamente. A presente invenção também proporciona células hospedeiras compreendendo adicionalmente um ácido nucléico que codifica uma proteína heteróloga desejada, tal como uma enzima.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "COMPOSI- ÇÕES E MÉTODOS PARA PRODUÇÃO APERFEIÇOADA DE PROTEÍ- NA".

Reivindicação de Prioridade Este pedido reivindica prioridade ao pedido provisório

60/840.750, depositado em 29 de agosto de 2006, os conteúdos do qual são aqui incorporados por referência em sua totalidade. Suporte Governamental

Partes deste trabalho foram fundamentadas pelo Subcontrato N0 ZCO-30017-1 com o Laboratório de Energia Renovável Nacional sob Contra- to Principal N0 DE-AC36-99G010337 com o Departamento de Energia dos Estados Unidos. Consequentemente, o Governo dos Estados Unidos pode ter certos direitos nesta invenção. Campo

A invenção refere-se a novas células hospedeiras com produção

aperfeiçoada de proteína, métodos de produção de tais células hospedeiras, e usos das mesmas. Introdução

A lavagem de enzima é comumente usada como uma técnica de processo úmido para aperfeiçoar o manuseio, aparência e outras caracterís- ticas de superfície de têxtil de, por exemplo, algodões e misturas de algodão na indústria. Um exemplo da aplicação bem-sucedida de tecnologia de en- zima na indústria têxtil é a substituição de lavagem em pedra tradicional (que consome muito tempo e trabalho intensivo) em processamento de tecido forte de algodão por lavagem de celulase. A hidrólise de celulase, um com- ponente maior do algodão, com celulase é útil para o biopolimento de teci- dos de algodão, que aumenta seu desempenho estético por clivagem de ligações glicosídicas em moléculas de celulose. As celulases são enzimas industriais importantes usadas, por exemplo, no processamento de têxteis e em detergentes. As celulases são enzimas que hidrolisam celulose (por e- xemplo, ligações a-1,4-D-glucan), e produzem como produtos principais gli- cose, celobiose e celooligossacarídeos. As celulases usadas na indústria têxtil são produzidas por vários microorganismos diferentes, e compreendem várias classificações diferentes de enzima incluindo aquelas identificadas como exo-celobiohidrolase (CBH), endoglucanases (EG)1 e β-glucosidases (BG). (M. Schulein, Methods in Enzynology, vol. 160, pp, 235-242 (1988)).

Portanto, celulase, e componentes da mesma, ou individualmen-

te ou em combinação, são úteis no tratamento de têxtil. Benefícios adicionais em usar celulases para tratar tecidos contendo algodão incluem remoção de engomadura do tecido (engomadura é uma composição usada para enrijecer o tecido de modo a facilitar o manuseio na fabricação de, por exemplo, arti- gos de vestuário), removendo-se flocos e pelotas da superfície do tecido, e dando uma aparência de pedra lavada e tato ao tecido. Ainda, aperfeiçoa- mentos na eficácia e eficiência de tratamento de celulase serão benéficos à indústria de artigo de vestuário e têxtil, bem como outras indústrias, tais co- mo na fabricação de detergentes e no fabricaçãomento de etanol combustí- vel de biomassa.

Apesar da pesquisa intensiva relacionada ao uso de celulases nos processos industriais, celulases conhecidas e usadas na técnica têm mostrado problemas significantes. Por exemplo, muitas celulases foram pro- blemáticas devido à baixa atividade, estabilidade ácida e alcalina pobre, es- tabilidade de temperatura pobre, e estabilidade oxidativa pobre. Mais impor- tantemente, a produção de celulase por microorganismos é freqüentemente baixa e, portanto, ineficiente de um ponto de vista comercial. Portanto, o que é necessário são novas cepas de microorganismos e novas seqüências de nucleotídeo que aperfeiçoem a eficiência da produção de celulase. Sumário

As requerentes descobriram que o rompimento de seqüências de nucleotídeo específicas em uma célula hospedeira resulta em produção aperfeiçoada ou uma proteína desejada por tais células hospedeiras modifi- cadas. As requerentes também identificaram bases moleculares responsá- veis pela produção de proteína aperfeiçoada. Consequentemente, a inven- ção caracteriza novas células hospedeiras adequadas para a produção au- mentada de um polipeptídeo desejado comparada à cepa original, métodos de produção de um polipeptídeo desejado a partir das referidas células hos- pedeiras, e a seqüências de nucleotídeo rompidas específicas (SEQ ID NOS: 1-6) responsáveis pelos aperfeiçoamentos na produção de um poli- peptídeo desejado.

Em uma primeira concretização é provida uma célula hospedeira

modificada. A célula hospedeira modificada pode ser um fungo ou um bacte- rium. A célula hospedeira modificada compreende anulação ou rompimento de seqüências de nucleotídeo específicas que resultam na expressão e/ou secreção selecionada de um polipeptídeo desejado. A seqüência de nucleo- tídeo específica que pode ser rompida é selecionada de 7p, 8k, 7E, 9G, 8Q e 203, que são apresentadas na figura 1, e são SEQ ID NOS: 1-6, respectiva- mente, ou seqüências tendo 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de seqüência para qualquer uma de SEQ ID NOS: 1-6, ou se- qüências que foram otimizadas por códon para a célula hospedeira específi- ca. Em um aspecto, o fungo é um fungo filamentoso. Em um aspecto adicio- nal, o fungo filamentoso é selecionado de Trichoderma, por exemplo, Tri- choderma reesei, Trichoderma viride, Trichoderma koningii, Trichoderma harzianum; Penicillium sp; Humicola sp, incluindo Humicola insolens] Chry- sosporium sp; incluindo C. luknowense\ Gliocladium sp; Aspergillus sp: Fu- sarium sp; Neurospara sp; Hypocrea sp: e Emerieella sp. Em outro aspecto, é provida uma célula hospedeira que tenha tido os genes endógenos rompi- dos ou genes correspondentes aos nucleotídeos providos para proporcionar produção aperfeiçoada de proteína sobre a cepa de célula hospedeira origi- nal (isto é, uma célula hospedeira não-modificada). Em uma concretização é provida uma célula hospedeira tendo

uma mutação ou anulação de parte ou todo de um gene tendo a seqüência selecionada de pelo menos uma seqüência colocada em qualquer uma de SEQ ID NOs:1-6, e referida mutação ou anulação resulta na produção au- mentada de um polipeptídeo desejado comparada a célula hospedeira origi- nal.

Em um aspecto, a célula hospedeira é um fungo filamentoso. Em outro aspecto, a proteína desejada pode ser um homólogo ou heterólogo à célula hospedeira. Em um aspecto adicional, as proteínas heterólogas po- dem ser selecionadas a partir do grupo consistindo em hormônios, enzimas, fatores de crescimento, e citocinas. Em um ainda outro aspecto adicional, a enzima é selecionada a partir do grupo consistindo em protreases, carbohi- drases, lipases, isomarases, racemases, epimerases, tautomerases, muta- ses, transferases, quinases e fosfatases.

Em uma segunda concretização, é provido um método para a produção de uma proteína heteróloga em uma célula hospedeira de fundo filamentoso transformada compreendendo as etapas de: (a) obtenção de uma célula hospedeira de fungo filamentoso

compreendendo um ácido nucléico que codifica referida proteína heteróloga na qual referida célula hospedeira contém uma mutação ou anulação em pelo menos uma seqüência de ácido nucléico tendo a seqüência colocada em qualquer uma de SEQ ID Nos: 1-6, no qual referida mutação ou anulação resulta na produção aumentada da proteína heteróloga comparada a um fungo filamentoso original; e

(b) crescimento de referida célula hospedeira de fungo filamen- toso sob condições adequadas para a expressão de referida proteína heteró- loga.

Em certos aspectos, o ácido nucléico que sofre mutação ou que

é anulado é pelo menos SEQ ID NO:1 ou SEQID NO:2. Em uma terceira concretização é provida uma seqüência de nucleotídeo isolada selecionada a partir de um grupo consistindo em SEQ ID Nos: 1-6. Em um aspecto a se- qüência de nucleotídeo foi modificada. A modificação pode ser selecionada a partir de mutilação, anulação, mutação ou outros meios de inativação. Tam- bém providos aqui são vetores compreendendo pelo menos uma seqüência de nucleotídeo selecionada a partir de um grupo consistindo em SEQ ID Nos: 1-6, no qual a seqüência de nucleotídeo tenha sido modificada.

Em uma quarta concretização é provido um método de produção de uma célula hospedeira modificada, referido método compreendendo

(a) obtenção de uma cepa de célula hospedeira original;

(b) transformação de referida cepa de célula original com o vetor compreendendo pelo menos uma seqüência de nucleotídeo isolada selecio- nada a partir de um grupo consistindo em SEQ ID Nos: 1-6, no qual a se- qüência de nucleotídeo tinha sido isolada;

(c) seleção de células hospedeiras modificadas;

no qual referidas células hospedeiras modificadas produzem

proteína mais homóloga do que a célula hospedeira original.

Em uma quinta concretização, é provido um método de produ- ção de um polipeptídeo desejado heterólogo, referido método compreenden- do:

(a) obtenção de uma cepa de célula hospedeira original;

(b) transformação de referida cepa de célula original comum ve- tor que codifica um polipeptídeo desejado;

(c) transformação de referida cepa de célula original com um ve- tor compreendendo pelo menos uma seqüência de nucleotídeo isolada sele-

cionada a partir de um grupo consistindo em SEQ ID Nos: 1-6, no qual a se- qüência de nucleotídeo tinha sido isolada para produzir uma célula hospe- deira modificada;

(d) seleção de células hospedeiras modificadas que produzem referido peptídeo desejado heterólogo, no qual as etapas (b) e (c) podem ser

feitas em qualquer ordem, ou simultaneamente. O meio decrescimento esté- ril adequado compreende adicionalmente um induzidor de produção de celu- Iase selecionado a partir de uma ou mais de celulose, Iactose1 soforose e glicose/soforose. O método pode compreender adicionalmente a pelo menos purificação parcial de celulases produzidas por referida cultura.

Em uma sexta concretização é provido um método para a pro-

dução de uma nova cepa de T. reesei usando mutagênese insercional no qual referida nova cepa de T. reesei tem produção total superior de proteína ou celulase conforme comparada à cepa original de T. reesei, compreen- dendo:

(a) preparação de uma população de células de Agrobacterium

sp. competentes por eletroporação nas células de Agrobacterium sp. compe- tentes de um vetor de expressão compreendendo, em condição operável, regiões de borda de T-DNA da esquerda para a direita, origens de plasmídio pV15 para replicação em Agrobacterium sp. e marcadores bacteriais para conferir resistência a cloranfenicol para criar uma população compreendendo células de Agrobacterium sp. transformadas.

(b) seleção de Agrobacterium de referida população da etapa

(a);

(c) inoculação de uma cultura de esporos de T. reesei com trans- formantes de Agrobacterium sp. da etapa (b) para criar um cultura de indu- ção;

(d) cultura de referida cultura de indução da etapa (c) a cerca de

18°C e por cerca de 24 horas para criar uma população compreendendo:

(e) transferência de amostras de referida população de T. reesei transformado da etapa (d) para meio seletivo, e isolamento de colônias de T. reesei efetivas na degradação de celulose; e (f) comparação da eficiência de degradação de celulose entre o

T. reesei das colônias da etapa (e) e a cepa original não-transformada, no qual referido T. reesei das colônias isoladas da etapa (e) são aumentados em uma degradação de celulose quando comparado à cepa original não- transformada. As células de Agrobacterium sp. são selecionadas de Agro- baeterium tumefaeiens e Agrobaeterium rhizogenes. Desenhos

A figura 1 mostra as seqüências de ácido nucléico de SEQ ID NO:1 de T. reesei 8k e SEQ ID NO: 2 de T. reesei 7p e SEQ ID NO:3 de T. reesei 7E, SEQ ID NO:4 de T. reesei 9G, SEQ ID NO:5 de T. reesei 8Q e SEQ ID NO:6 de T. reesei 203.

A figura 2 (a) mostra um vetor de expressão usado para a trans- fecção de regiões de borda de T-DNA em Agrobaeterium. A figura 2(b) mos- tra o rompimento pyr4 dentro do vetor de expressão da figura 2(a).

A figura 3 é um esquema para o vetor pPZP100/pyr4. A figura 4 mostra uma representação de crescimento de esporo

na tela de Toyama. Descrição das Várias Concretizações Deve ser notado que, conforme usado neste relatório descritivo e reivindicações em anexo, as formas singulares "um", "uma" e "o" incluem referentes plurais, a menos que o conteúdo indique claramente de outro mo- do. Desse modo, por exemplo, referência a uma composição contendo "um composto" inclui uma mistura de dois ou mais compostos. Deve ser também notado que o termo "ou" é geralmente empregado em seu sentido incluindo "e/ou", a menos que o conteúdo indique claramente de outro modo.

Um "polipeptídeo de interesse", "proteína de interesse", "polipep- tídeo desejado" e "proteína desejada" são usados permutavelmente aqui. Os termos "proteína(s)" e "polipeptídeo(s)" são usados permuta-

velmente aqui. O código convencional de uma letra ou três letras para resí- duo de aminoácido é usado aqui.

Um "promotor heterólogo", conforme aqui usado, é um promotor que não está naturalmente associado com um gene, porção de gene, ou um ácido nucléico purificado.

No presente contexto, o termo "polipeptídeo substancialmente puro" significa uma preparação de polipeptídeo que contém no máximo 10% por peso de outro material de polipeptídeo com o qual ele está nativamente associado (percentagens inferiores de outro material de polipeptídeo são preferidas, por exemplo, no máximo 8% por peso, no máximo 6% por peso, no máximo 5% por peso, no máximo 4% por peso, no máximo 3% por peso, no máximo 2% por peso, no máximo 1% por peso, e no máximo 1/2% por peso). Desse modo, é preferido que o polipeptídeo substancialmente puro seja pelo menos 92% puro, isto é, que o polipeptídeo constitua pelo menos 92% por peso do material de polipeptídeo total presente na preparação, e percentagens mais altas são preferidas, tais como pelo menos 94% puro, pelo menos 95% puro, pelo menos 96% puro, pelo menos 97% puro, pelo menos 98% puro, pelo menos 99% puro, e pelo menos 99,5% puro. Os poli- peptídeos aqui revelados estão preferivelmente em uma forma substancial- mente pura. Em particular, é preferido que os polipeptídeos aqui revelados estejam na "forma substancialmente pura", isto é, que a preparação de poli- peptídeo esteja essencialmente livre de outro material de polipeptídeo com o qual ele está nativamente associado. Isto pode ser efetuado, por exemplo, pela preparação do polipeptídeo por meio de métodos recombinantes bem conhecidos. Aqui, o termo "polipeptídeo substancialmente puro" é sinônimo dos termos "polipeptídeo isolado" e "polipeptídeo na forma isolada".

Uma "preparação purificada de células", conforme aqui usada,

se refere a, no caso de células de planta ou animal, uma preparação in vitro de células e não uma planta ou animal intactos. No caso de células cultiva- das ou células microbiais, ela consiste em uma preparação de pelo menos 10% e, mais preferivelmente, 50% das células objeto como uma porção do número total de células.

No contexto da presente invenção, o termo "biologicamente pu- ro" é definido como tendo substancialmente, por exemplo, as cepas de T. reesei acima mencionadas como o único organismo vivo na cultura, ou o organismo vivo predominante na cultura, e que a cultura está substancial- mente livre de outros organismos vivos. A cultura não necessita ser 100% livre de outros organismos fazendo com que os outros organismos não inter- firam substancialmente com o crescimento das cepas de T. reesei da pre- sente invenção.

A capacidade de cultivar T. reesei para a produção de enzimas celulase é conhecida na técnica, conforme é exemplificada na seção de E- xemplos, infra, e nas Patentes dos Estados Unidos N-4.797.361, 4.762.788 e 4.472.504.

Um "ácido nucléico substancialmente puro", por exemplo, um DNA, RNA, etc, substancialmente puro, é um ácido nucléico que é um ou ambos de: 1) não imediatamente contíguo com ou uma ou ambas das se- qüências, por exemplo, seqüências de codificação, com a qual é imediata- mente contígua (isto é, um na extremidade 5' e um na extremidade 3') no genoma que ocorre naturalmente do organismo do qual o ácido nucléico é derivado; ou 2) que é substancialmente livre de uma seqüência de ácido nu- cléico com a qual ele ocorre no organismo do qual o ácido nucléico é deriva- do. O termo inclui, por exemplo, um DNA recombinante que é incorporado em um vetor, por exemplo, em um plasmídeo de replicação autônoma ou vírus, ou no DNA genômico de uma procariota ou eucariota, ou que existe como uma molécula separada (por exemplo, um cDNA ou um fragmento de DNA genômico produzido por PCR ou tratamento de endonuclease de restri- ção), independente de outras seqüências de DNA.

O termo "heterólogo" com referência a um polinucleotídeo ou

proteína se refere a um polinucleotídeo ou proteína que não ocorre natural- mente em uma célula hospedeira. Em algumas concretizações, a proteína é uma proteína industrial comercialmente importante. É pretendido que o ter- mo envolva proteínas que são codificadas por genes que ocorrem natural- mente, genes que sofreram mutação, e/ou genes sintéticos. O termo "homó- logo" com referência a um polinucleotídeo ou proteína se refere a um polinu- cleotídeo ou proteína que ocorre naturalmente na célula hospedeira.

"Celulase", "enzimas celulolíticas", ou "enzimas celulase" signifi- cam exoglucanases ou exocelobiohidrolases e/ou endoglucanases bacteriais ou fungais, e/ou β-glicosidases. Estes três tipos diferentes de enzimas celu- lase agem sinergisticamente para converter celulose e seus derivados em glicose.

Muitos micróbios produzem enzimas que hidrolisam celulose, in- cluindo os fungos enraizados de madeira Trichoderma, a bactéria composta Thermomonospora, Bacillus, e Cellulomonas; Streptomyces] e o fungo Tri- choderma, Humicola, Aspergillus e Fusarium. As enzimas produzidas por estes micróbios são misturas de proteínas com três tipos de ações úteis na conversão de celulose em glicose: endoglucanases (EG), celobiohidrolases (CBH), e beta-glucosidase. O termo "genéticas reversas", conforme aqui definido, se refere

a uma estratégia para determinar uma função de gene particular pelo estudo de fenótipos com alterações no gene de interesse. Em outras palavras, após obtenção da cepa com um fenótipo desejado, por exemplo, morfologia alte- rada, uma investigação para determinar a mudança genética responsável pelo fenótipo é experimentada. Várias técnicas podem ser usadas para ge- néticas reversas, incluindo o uso de transposons e REMI (Integração media- da por enzima de restrição). Isto difere do clássico no qual se tenta determi- nar o fenótipo resultante da mudança genética. Para aprender a influência que uma seqüência tem no fenótipo, ou descobrir sua função biológica, os pesquisadores podem projetar uma mudança ou rompimento no DNA. Após esta mudança ter sido feita, um pesquisador pode observar o efeito de tais alterações no organismo total. Na presente invenção, mutagênese insercio- nal foi feita por transformação no gene pry4 em T. reesei. Em alguns casos, uma cópia simples do gene pyr4 se integra aleatoriamente no genoma de T. reesei rompendo o(s) gene(s) que estão presente naquele local. Desde que a seqüência do gene pyr4 é conhecida, ela age como uma etiqueta, e pode ser usada para detectar quaisquer mudanças genéticas que foram feitas. Neste caso, pyr4 é também usado como um marcador homólogo selecioná- vel para a transformação de T. reesei (Smith, et al, Seqüência do gene pyr4 clonado de Trichoderma reesei e seu uso como o marcador selecionável homólogo, Curr. Gen, 19:27-33, 1991). Outros métodos podem ser usados para criar rompimentos no DNA para classificadores de genéticas reversas incluindo anulações, inserções e mutações de ponto, anulações direciona- das e mutações de ponto, genes que silenciam e interferem usando transge- nes.

O termo "T-DNA", conforme aqui definido, se refere a sequên- cias de DNA comum a Agrobacterium que facilita a transferência de DNA nos genomas de planta. T-DNA é usado por biologistas moleculares para permitir a transferência de DNA selecionado em um genoma de planta para a proposta de, por exemplo, criar mutantes insercionais para a proposta de realizar genéticas reversas. Na natureza, o T-DNA de Agrobacterium facilita a transferência de DNA em um hospedeiro de planta causando doença de coroa. Para a proposta de transformação, somente as regiões de borda das seqüências de T-DNA são usadas, permitindo, desse modo, a inserção de seqüências de DNA desejadas. Na presente invenção, genes de pyr4 foram inseridos no genoma de T. reesei usando-se seqüências de borda de T- DNA.

Conforme aqui usado, "microorganismo" se refere a uma bacté- ria, um fungo, um vírus, um protozoário e outros micróbios ou organismos microscópicos.

Conforme aqui usado, "derivado" significa uma proteína que é derivada de uma proteína precursora (por exemplo, a proteína nativa) pela adição de um ou mais aminoácidos para qualquer ou ambas das extremida- des terminais CeN1 substituição de um ou mais aminoácidos em um ou um número de locais diferentes na seqüência de amino ácido, anulação de um ou mais aminoácidos em qualquer ou ambas as extremidades da proteína ou em um ou mais locais da seqüência de amino ácido, ou inserção de um ou mais aminoácidos em um ou mais locais na seqüência de amino ácido. Por exemplo, as seqüências de nucleotídeo da presente invenção (SEQ ID NOS: 1-6) são as seqüências genômicas de T. reesei que são limitadoras do ponto insercional do gene pyr4, e representam o(s) gene(s) que foram rom- pidos no genoma de T. reesei.

Conforme aqui usado, "percentagem (%) de identidade de se- qüência" com relação ao amino ácido ou seqüências de nucleotídeos aqui identificadas é definida como a percentagem de resíduos de amino ácido ou nucleotídeos em uma seqüência candidata que são idênticas aos resíduos de amino ácido ou nucleotídeos em uma seqüência, após alinhamento das seqüências e introdução de folgas, se necessário, para alcançar a identidade de seqüência de percentagem máxima, e não considerando-se quaisquer substituições conservativas como parte da identidade de seqüência. Méto- dos para realizar alinhamento de seqüência e determinar identidade de se- qüência são conhecidos aos técnicos no assunto, podendo ser realizados sem experimento indevido, e cálculos de identificar valores podem ser obti- dos com limitação. Ver, por exemplo, Ausubel, et ai, eds. (1995) Current Protocols in Molecular Biology, Chapter 19 (Greene Publishing and Wiley- lnterscience, New York); e o programa ALIGN (Dayhoff (1978) em Atlas of Protein Sequence and Structure 5: Suppl. 3 (National Biomedical Research Foundation, Washington, D.C.). Um número de algoritmos é disponível para alinhamento de seqüências e determinação de identidade de seqüência e incluem, por exemplo, o algoritmo de alinhamento de homologia de Needle- mann et al (1970) J. Mol. Biol. 48:443; o algoritmo de homologia local de Smith, et ai, (1981) Adv. Appl. Math. 2:482; a pesquisa para método de simi- laridade de Pearson et al (1988) Proc. Natl. Acad. Sei. 85:2444; o algoritmo de Smith-Waterman (Meth. Mol. Biol. 70:173-187 (1997); e algoritmos BLASTP1 BLASTIN e BLASTX (ver, Altschul1 et ai (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410). Programas computadorizados usando estes algoritmos são também disponíveis, e incluem, mas não estão limitados a: software ALIGN ou Megalign (DNASTAR), ou WU-BLAST-2 (Altschul1 et ai, Math. Enzym., 266:460-480 (1986)); ou GAP, BESTFIT, BLAST (Altschul, et al), supra, FASTA, e TFASTA, disponíveis no pacote Genetics Computing Group (GCG), Versão 8, Madison, Wis., USA; e CLUSTAL no programa PC/Gene por Intelligenetics, Mountain View, Calif. Aqueles técnicos no assunto podem determinar parâmetros apropriados para medição do alinhamento, incluindo algoritmos necessários para alcançar alinhamento máximo sobre o compri- mento das seqüências sendo comparadas. Preferivelmente, a identidade de seqüência é determinada usando-se os parâmetros de falta determinados pelo programa. Especificamente, a identidade de seqüência pode ser deter- minada pelo algoritmo de pesquisa de homologia de Smith-Waterman (Meth. Mol. Biol. 70:173-187 (1997)), conforme implementado no programa MSPR- CH (Oxford Molecular) usando-se a pesquisa de folga não-parente com os seguintes parâmetros de pesquisa: penalidade de abertura de folga de 12, penalidade de extensão de folga de 1. Preferivelmente, comparações de a- mino ácido emparelhados podem ser efetuadas usando-se o programa GAP do pacote de sofware de análise de seqüência de GCG de Genetics Compu- ter Group, Inc., Madison, Wis., empregando a matriz de substituição de blo- sum62amino ácido, com um peso de folga de 12 e um peso de comprimento de 2. Com relação ao alinhamento ótimo de duas seqüências de aminoácido, o segmento contíguo da seqüências de amino ácido variante pode ter resí- duos de amino ácido adicionais ou resíduos de amino ácido retirados com relação a seqüências de amino-ácido de referência. O segmento contíguo usado para comparação à seqüências de amino ácido de referência incluirá pelo menos 20 resíduos de amino ácido contíguos, e pode ser 30, 40, 50 ou mais resíduos de amino ácido. As correções para identidade de seqüência aumentada associada com inclusão de folgas na seqüências de amino ácido de derivado podem ser produzidas por designação de penalidades de folga.

O termo "% de homologia" é usado permutavelmente aqui com o termo"% de identidade".

Programas de computador exemplares que podem ser usados para determinar identidade entre duas seqüências incluem, mas não estão limitados a, o conjunto de programas BLAST, por exemplo, BLASTIN, BLASTX e TBLASTX, BLASTP e TBLASTN, e estão disponíveis ao público na Internet (ver, por exemplo, a página BLAST no National Center for Biote- chnology Information website). Ver, também, Altschul, et al., 1990, e Alts- chul, etal, 1997.

Pesquisas de seqüência são tipicamente efetuadas usando-se o programa BLASTIN quando se avalia uma dada seqüência de ácido nucléico relativa às Seqüências de DNA do Banco de Gene que foram traduzidas em todas as estruturas de leitura contra seqüências de amino ácido nas Se- qüências de Proteína do Banco de Gene, e outras bases de dados públicas. Ambos BLASTIN e BLASTX são operados usando-se parâmetros de falta de uma penalidade de folga aberta de 11,0, e uma penalidade de folga estendi- da de 1,0, e utilizam a matriz BLOSUM-62 (ver, por exemplo, Altchul, et al., 1997).

Um alinhamento preferido de seqüências selecionadas de modo a determinar"% de identidade" entre duas ou mais seqüências, é realizado usando-se, por exemplo, o programa CLUSTAL-W na versão MacVector 6,5, operado com parâmetros de falta, incluindo uma penalidade de folga aberta de 10,0, uma penalidade de folga estendida de 0,1, e uma similaridade de matriz de BLOSUM 30.

Conforme aqui usado, "vetor de expressão" significa um constru- to de DNA incluindo uma seqüência de DNA que é operavelmente ligada a uma seqüência de controle adequada capaz de afetar a replicação, rompi- mento ou expressão do DNA em um hospedeiro adequado. Tais seqüências de controle podem incluir origens de replicação ou um promotor para afetar transcrição, uma seqüência operadora ótima para controlar transcrição, uma seqüência que codifica locais de ligação de ribossomo adequados no mRNA, e seqüências que controlam a terminação de transcrição e translação. Tipos de células diferentes são preferivelmente usados com vetores de expressão diferentes. Um promotor preferido para vetores usados em Bacillus subtilis é o promotor AprE, um promotor preferido usado em E. coli é o promotor Lac1 um promotor preferido usado em Saccharomyces eerevisiae é PGK1, um promotor preferido usado em Aspergillus niger é glaA, e um promotores pre- feridos para Triehoderma reesei são promotores de cbhl, cbh2, eg1, eg2, eg3, eg4, eg5, xln1 e xln2. O vetor pode ser um plasmídeo, uma partícula de fago, ou simplesmente um inserto genômico potencial. Uma vez transforma- da (ou transfectada) em um hospedeiro adequado, o vetor pode replicar e funcionar independentemente do genoma hospedeiro, ou pode, sob condi- ções adequadas, integrar-se no próprio genoma. No presente relatório des- critivo, plasmídeo e vetor são, as vezes, usados permutavelmente. Contudo, a invenção é pretendida para incluir outras formas de vetores de expressão que apresentam funções equivalentes, e que são, ou tornam-se, conhecidos na técnica. Desse modo, uma ampla variedade de combinações de hospe- deiro/vetor de expressão pode ser empregada na expressão ou replicação de seqüências de DNA desta invenção. Vetores de expressão úteis, por e- xemplo, podem consistir de segmentos de seqüências cromossomais, não- cromossomais e de DNA sintético, tais como vários derivados conhecidos de SV40 e plasmídeos bacteriais conhecidos, por exemplo, plasmídeos de E. coli incluindo col E1, pCR1, pBR322, pMb9, pUC 19 e seus derivados, plas- mídeos de faixa de hospedeiro mais ampla, por exemplo, RP4, DNAs de fa- go, por exemplo, os numerosos derivados de fago λ, por exemplo, NM989, e outros fagos de DNA, por exemplo, M13 e fagos de DNA de trançado sim- ples filamentoso, plasmídeos de levedura, tais como o plasmídeo 2μ, ou de- rivado deste, vetores úteis em células eucarióticas, tais como vetores úteis em células de animal e vetores derivados de combinações de plasmídeos, e DNAs de fago, tais como plasmídeos que foram modificados para empregar DNA de fago ou outras seqüências de controle de expressão.

Técnicas de expressão usando os vetores de expressão da pre- sente invenção são conhecidas na técnica, e são descritas geralmente em, por exemplo, Sambrook, et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, SECOND EDITION, Cold Spring Harbor Press (1989). Freqüen- temente, tais vetores de expressão, incluindo seqüências de DNA da inven- ção, são transformados em um hospedeiro unicelular por inserção direta no genoma de uma espécie particular através de um evento de integração (ver, por exemplo, Bennet & Lasure, MORE GENE MANIPULATIONS IN FUNGI, Academic Press, San Diego, pp. 70-76 (1991), e artigos citados no mesmo descrevendo inserção genômica alvo em hospedeiros de fungo).

"pPZPIOO", conforme aqui usado, se refere a 1) um vetor de ex- pressão que pode ser transformado em T. reesei, e também 2) um vetor de lançamento que pode ser amplificado em E. coli e Agrobacterium. Ver, por exemplo, Hajdukiewiez et a/(1994) Plant Mol. Biol. 25:989-994.

Conforme aqui usado, "cepa hospedeira", ou "célula hospedeira" significa um hospedeiro adequado para um vetor de expressão incluindo DNA de acordo com a presente invenção. Células hospedeiras úteis na pre- sente invenção são geralmente hospedeiros procarióticos ou eucarióticos, incluindo qualquer microorganismo transformável em que expressão pode ser efetuada. Especificamente, cepas hospedeiras podem ser Bacillus subti- lis, Escherichia coli, Triehoderma reeesei, Saccharomyees eerevisiae ou As- pergillus niger. As células hospedeiras são transformadas ou transfectadas com vetores construídos usando-se técnicas de DNA recombinante.

Uma "célula modificada" ou "cepa modificada" significa uma cé- lula ou cepa que foi modificada por ter uma das seqüências de ácido nucléi- co aqui descritas anuladas ou inativadas (por exemplo, rompidas).

Um "gene inativado" significa local de um genoma que, antes de sua inativação, foi capaz de produzir uma proteína, isto é, capaz de ser transcrita em um RNA que pode ser traduzido para produzir um polipeptídeo de comprimento total. Um gene é inativado quando ele não é transcrito e traduzido na proteína cataliticamente ativa de comprimento total. Um gene pode ser inativado pela alteração de uma seqüência requerida para sua transcrição, pela alteração de uma seqüência requerida para processamento de RNA, por exemplo, adição de cauda poli-A pela alteração de uma se- qüência requerida para translação, por exemplo. Um gene anulado, um gene contendo uma região anulada, um gene contendo uma região rearranjada, um gene tendo uma mutação de ponto de inativação, ou alteração de estru- tura, e um gene contendo uma inserção são tipos de genes inativados. Um gene pode também ser inativado usando-se antissenso ou qualquer outro método que abole expressão daquele gene.

Conforme aqui usado, "funcionalmente fixado" ou "operavelmen- te ligado" significa que uma região regulatória, tal como um promotor, termi- nador, sinal de secreção ou região intensificadora, é fixada a, ou ligada a um gene estrutural, e controla a expressão daquele gene.

Conforme aqui usado, uma substância (por exemplo, um poli- peptídeo ou proteína) "derivada de" um microorganismo significa que a subs- tância é nativa ao microorganismo.

Fungos filamentosos incluem todas as formas filamentosas da subdivisão Eumycota e Oomycota. Os fungos filamentosos são caracteriza- dos por micélios vegetativos tendo uma parede de célula composta de quiti- na, manano, e outros polissacarídeos complexos, com crescimento vegetati- vo por alongamento hifal e catabolismo de carbono que é obrigatoriamente aeróbica.

Na presente invenção, a célula original de fungo filamentoso po- de ser uma célula de uma espécie de, mas não limitada a, Trichoderma, por exemplo, Trichoderma reesei, Trichoderma viride, Trichoderma koningii, Tri- ehoderma harzianum; Penicillium sp; Humieola sp, incluindo Humieola inso- Iens; Chrysosporium sp\ incluindo C. Iuknowense; Glioeladium sp; Aspergil- Ius sp, Fusarium sp; Neurospara sp; Hypoerea sp; e Emerieella sp. Confor- me aqui usado, o termo "Trichoderma" ou "Triehoderma sp." se refere a quaisquer cepas fungais que foram anteriormente classificadas como Tri- choderma, ou são atualmente classificadas como Trichoderma.

Em uma concretização preferida, a célula original fungai filamen- tosa é uma célula de Aspergillus niger, Aspergillus awamori, Aspergillus acu- Ieatus, ou Aspergillus nidulans. Em outra concretização preferida, a célula original fungai fila- mentosa é uma célula de Trichoderma reesei.

"Trichoderma" ou "Trichoderma sp" se refere a quaisquer cepas de fungo que foram anteriormente classificadas como Trichoderma, ou que são atualmente classificadas como Trichoderma. Preferivelmente as espé- cies são Trichoderma reesei ou Trichoderma viride.

O termo "equivalente" se refere a seqüências de nucleotídeo que codificam funcionalmente polipeptídeos equivalentes, ou polipeptídeos fun- cionalmente equivalentes. Seqüências de nucleotídeo equivalentes incluirão seqüências que diferem por uma ou mais substituições, adições ou anula- ções de nucleotídeo, tais como variantes alélicas, e incluem seqüências que diferem de um nucleotídeo nativo ou natural devido a degeneração do códi- go genético.

O termo "introduzido" no contexto de inserção de uma seqüência de ácido nucléico em uma célula significa "transfecção", ou "transformação" ou "transdução", e inclui referência à incorporação de uma seqüência de á- cido nucléico em uma célula eucariótica ou procariótica no qual a seqüência de ácido nucléico pode ser incorporada no genoma da célula (por exemplo, cromossomo, plasmídeo, plastídeo, ou DNA mitocondrial), convertida em um replicon autônomo, ou transientemente expressa (por exemplo, mRNA trans- fectado).

A prática da presente invenção empregará, a menos que de ou- tro modo indicado, técnicas convencionais de biologia de célula, cultura de célula, biologia molecular, biologia transgênica, microbiologia, DNA recombi- nante, e imunologia, que estão dentro da técnica do assunto. Tais técnicas são descritas na literatura. Ver, por exemplo, Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2a edição, ed. por Sambrook, Fritsch e Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory Press: 1989); DNA Cloning, Volumes I e Il (D.N. Glover ed., 1985); Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait ed., 1984); Mullis et al., Patente dos Estados Unidos N0 4.683.195; Nucleic Acid Hybridization (B. D. Hames & S. J. Higgins eds. 1984); Transcription And Translation (B. D. Hames & S. J. Higgins eds. 1984); Culture of Animal Cells (R. I. Freshney, Alan R. Liss, Inc., 1987); Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press, 1986);B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); o treatise, Methods In Enzymo- Iogy (Academic Press, Inc., N. Y); Gene Transfer Vectors For Mamalian Cells (J. H.Millere Μ. P. Carlos eds., 1987, Cold Spring Harbor Laboratory); Me- thods In Enzymology, Vols. 154 e 155 (Wu, et al., eds). Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Mayer e Walker, eds., Academic Press, London, 1987); Handbook Of Experimental Immunology, Volumes I-IV (D.M. Weir e C.C. Blackwell, eds., 1986); Manipulating the Mouse Embryo, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y., 1986)). Também, informação relacionada a métodos de preparação, expressão, iso- lamento e uso de proteases pode ser obtida pela revisão da Patente dos Es- tados Unidos N0 6.768.001. Os termos não definidos dentro deste documen- to ou especificamente, por referência, ou pelo contexto, são para terem defi- nições comuns na técnica na época do depósito. Outras características e vantagens da invenção tornar-se-ão a-

parentes a partir da seguinte descrição detalhada, e das reivindicações.

A invenção será agora descrita em detalhe por meio de referên- cia somente usando-se as seguintes definições e exemplos. Todas as paten- tes e publicações, incluindo todas as seqüências reveladas dentro de tais patentes e publicações referidas aqui são expressamente incorporadas por referência.

A menos que de outro modo definido aqui, todos os termos téc- nicos e científicos usados aqui têm o mesmo significado conforme comu- mente compreendido por um técnico no assunto ao qual esta invenção per- tence. Singleton, et al., DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECU- LAR BIOLOGY, 2D ED1 John Wiley and Sons, New York (1994), e Hale & Marhan, THE HARPER COLLINGS DICTIONARY OF BIOLOGY, Harper Perennial, NY (1991) proporciona um técnico no assunto com um dicionário geral de muitos dos termos usados nesta invenção. Embora quaisquer mé- todos e materiais similares ou equivalentes àqueles descritos aqui podem ser usados na prática ou teste da presente invenção, os métodos e materiais preferidos são descritos. Faixas numéricas são inclusive dos números que definem a faixa. A menos que de outro modo indicado, ácidos nucléicos são escritos da esquerda para a direita na orientação 5' a 3'; seqüências de ami- no ácido são escritas da esquerda para a direita na orientação de amino pa- ra carbóxi, respectivamente. Os praticantes são particularmente dirigidos para Sambrook et al, 1989, e Ausubel FM et al, 1993, para definições e ter- mos da técnica. É para ser compreendido que esta invenção não é limitada a metodologia, protocolos e reagentes particulares descritos, visto que estes podem variar.

Faixas numéricas são inclusive dos números que definem a fai- xa. A menos que de outro modo indicado, ácidos nucléicos são escritos da esquerda para a direita na orientação 5' a 3'; seqüências de amino ácido são escritas da esquerda para a direita na orientação de amino para carbóxi, respectivamente.

Os títulos aqui providos não são limitações dos vários aspectos ou concretizações da invenção que podem ser tidos por referência ao relató- rio descritivo como um todo. Consequentemente, os termos definidos ime- diatamente abaixo são totalmente definidos por referência ao relatório des- critivo como um todo.

As requerentes identificaram as seqüências de nucleotídeo rom- pidas responsáveis pela produção aumentada de proteínas, incluindo, mas não limitadas à, celulose. As seqüências de nucleotídeo são referidas como 7p, 8k, 7E, 9G, 8Q e 203 de T. reesei, que são apresentadas na figura 1, e são SEQ ID NOS: 1-6, respectivamente. Do mesmo modo, é contemplado que as seqüências de nucleotídeo da presente invenção são usadas em en- saios de classificação para a detecção de, por exemplo, outras cepas de T. reesei, ou outros microorganismos efetivos na produção de proteína, ou para homólogos e variantes de seqüência da seqüência da presente invenção.

É uma concretização preferida da presente invenção que as no- vas cepas de T. reesei da presente invenção sejam usadas nos métodos para a produção de proteínas no qual as proteínas podem ser heterólogas ou homólogas à célula hospedeira. Por exemplo, um método é contemplado no qual um meio de crescimento estéril adequado é inoculado com uma ou mais cepas de T. reesei selecionadas a partir do grupo consistindo em cepas de T. reesei que tinham tido pelo menos uma seqüência de nucleotídeo se- lecionada de 7p, 8k, 7E, 9G, 8Q e 203 anulada ou inativada, e o meio de crescimento inoculado é incubado sob condições que permitirão o cresci- mento de referida cepa de T. reesei. A presente invenção não é limitada a qualquer meio de crescimento/cultura particular. Qualquer meio complexo ou definido que suporta crescimento e é condutivo de produção de proteína e, em particular, produção de celulase, é adequado. Exemplos incluem meios revelados no WO 2005/118795, ou meios revelados em llmen, M., Salohei- mo, A., e Pennttila, M.E., 1997, App Environ Microbiol 63, 1298-1306. Em uma concretização preferida, 100 mM de PIPPS (CaIbiochem) foi incluído para manter o pH em 5,5. Também, a presente invenção não é limitada a qualquer método de cultura (por exemplo, cultura em batelada, cultura de fluxo contínuo, etc). É adicionalmente contemplado que o meio de cresci- mento estéril possa compreender adicionalmente um induzidor de produção de celulase. Exemplos não-limitativos de induzidores adequados são celulo- se, lactose, soforose e glicose/soforose. Em uma concretização, o induzidor de produção de celulase é glicose/soforose, conforme descrito na Publica- ção dos Estados Unidos Número 2004-0121446. É também uma concretização da presente invenção que a celu-

lase (na forma de "celulases totais") produzida pelas cepas de T. reesei da presente invenção seja purificada a partir do meio de cultura. Genéticas Reversas

Um dos objetivos de muitas das pesquisas genéticas é identificar os genes responsáveis pelos traços fenótipos selecionados. Enquanto muito esforço está sendo experimentado em desenvolver informação genômica de um grande número de organismos, freqüentemente a informação sobre a função de um gene é mais importante do que a informação para a seqüência do próprio gene. Um modo no qual a função de genes individuais é estudada é observar as versões mutantes do gene de interesse. Às vezes a pesquisa de versões que sofreram mutação de um gene e o estudo dos genes que sofreram mutação é referida como "genéticas reversas". Se encontra-se um gene que tenha sofrido mutação de modo a tornar o gene mudado inoperan- te, pode-se discernir qual mudança de fenótipo foi produzida ao organismo que o torna diferente dos organismos que não conduzem a versão mudada do gene.

Várias estratégias têm sido desenvolvidas para uso de genéticas

reversas para estudar o funcionamento de genes. Por exemplo, um laborató- rio na Universidade de Wisconsin criou uma grande população de linhas de planta de Arabidopsis, cada uma da qual tendo sido transformada usando-se o DNA-transferido (T-DNA) a partir da bactéria Agrobacteruim tumefaciens, que tem a capacidade nativa para transferir T-DNA no genoma da célula de planta.

Na presente invenção, uma grande população de linhas fungais de T. reesei foi criada para classificar cepas mutantes com produção aumen- tada de celulase. As técnicas usadas foram baseadas no trabalho por Ses- sions, et al., (Um sistema de genéticas reversas de Arabidopsis de alta pro- dução, The Plant Cell1 14:2985-2994(2002)). Na presente invenção, o gene pry4 foi transfectado em T. reesei usando seqüências de borda de T-DNA de Agrobacterium para causar rompimento do DNA genômico. Os transforman- tes foram então classificados para cepas que mostram produção aumentada de celulase conforme comparada à cepa original de T. reesei, e conforme exemplificado abaixo. Biologia Molecular

As técnicas de biologia molecular são usadas na presente in- venção para a proposta de identificar e isolar cepas mutantes de T. reesei que têm eficiência aumentada na produção de celulases sobre a cepa origi- nal.

Em uma concretização esta invenção proporciona a identificação e genes e mutações de gene de Trichoderma reesei que conferem um au- mento na produtividade de celulases para T. reesei. Portanto, esta invenção ocorre em técnicas de rotina no campo de genéticas recombinantes e gené- ticas reversas (discutido acima e na seção de Exemplos). Textos básicos que revelam os métodos gerais de uso nesta invenção incluem Sambrook, et al., Molecular Cloning1 A Laboratory Manual (2a edição, 1989); Kriegler, Ge- ne Transfer and Expression: A Laboratory Manual (1990); e Ausubel, et al, eds., Current Protocols in Molecular Biology (1994)).

Em uma concretização da presente invenção, bibliotecas de rompimento de T. reesei foram preparadas pela transformação no gene de pyr4 usando-se transformação mediada por Agrobacterium tumefaciens. Em outra concretização, Agrobacterium rhizogenes é usado para protocolos de transformação. Em ainda outra concretização, o bacterium usado para os protocolos de transformação é quaisquer espécies de Agrobacterium (Agro- bacterium sp.) adequadas para a proposta. Outras cepas bacteriais úteis para mutagênese insercional são conhecidas àqueles técnicos no assunto. Ver, por exemplo, Constans, A. (2005) The Scientist 19(5):32; Broothaerts et al (2005) Nature 433:629-633; e Gelvin, SB (2005) Nature 433:583-584. A figura 2 exemplifica um vetor de expressão adequado. Em uma concretiza- ção, o vetor de expressão usado apresenta uma função dupla em que é ca- paz de ser replicado em E. coli e em Agrobacterium usando origens de plasmídeo de CoIEI e pVS1 para replicação, respectivamente. O vetor de expressão usado na presente invenção foi pPCPIOO, mas um prático na técnica compreenderá que outros vetores e outras origens de plasmídeo de replicação são conhecidos na técnica, e são também efetivos para estas propostas. Aqueles técnicos no assunto também estão atentos que um plasmídeo natural de origem de replicação pode ser modificado por reposi- ção, substituição, adição ou eliminação de um ou mais nucleotídeos sem mudar sua função, ou pode ser substituído com outras origens de plasmí- deos efetivas de replicação. A prática da invenção envolve e não é restrita a ou substituição das origens de plasmídeo de replicação, ou pelo uso de ou- tros plasmídeos, origens de replicação, ou métodos de transfecção conheci- dos na técnica na época desta invenção, ou por seus equivalentes.

O vetor/construção de expressão tipicamente contém uma uni- dade de transcrição ou cassete de expressão que contém todos os elemen- tos adicionais requeridos para a expressão da seqüência heteróloga. Um cassete de expressão típico desse modo contém um promotor operavelmen- te ligado a seqüência de ácido nucléico heteróloga e sinais requeridos para polialdenilação eficiente do transcrito, locais de ligação de ribossomo, e ter- minação de translação. Elementos adicionais do cassete podem incluir in- tensificadores e, se DNA genômico é usado como o gene estrutural, íntrons com doador de união funcional e locais aceptores.

A prática da invenção não está restrita pela escolha de promotor na construção genética. Contudo, promotores exemplares são os promoto- res de Trichoderma reesei cbhl, cbh2, eg1, eg2, eg3, eg5, xln1 e xln2.

Em adição a uma seqüência promotora, o cassete de expressão deve também conter uma região de terminação de transcrição a jusante do gene estrutural para proporcionar terminação eficiente. A região de termina- ção pode ser obtida a partir do mesmo gene como a seqüência promotora, ou pode ser obtida de genes diferentes.

Embora qualquer terminador de fungo seja similarmente para ser funcional na presente invenção, terminadores preferidos incluem: o termina- dor de gene de Aspergillus nidulans trpC (Yelton, M. et ai (1984) PNAS USA 81: 1470-1474, Mullaney, E.J. et al (1985) MGG 199-37-45), os genes /As- pergillus awamori ou Aspergillus niger glucoamilase (Nenberg, J. H. et al. (1984) Mol. Cell Biol. 4:2306, Boel, E. et al (1984) EMBO J. 3:1581-1585) e o gene Mucor miehei carbóxil protease (EPO Publicação N0 0 215 594).

O vetor de expressão particular usado para transportar a infor- mação genética na célula não é particularmente crítico. Qualquer um dos vetores convencionais para expressão de transformação de Agrobacterium pode ser usado. Vetores adequados incluem, mas não estão limitados a, a família pPZP de vetores binários de Agrobacterium (conforme descrito em Hjdukiewiez et al 1994. Plant Molecular biology 25: 989-994), pCAMBIA (conforme descrito em Mullins, E.D. et al 2001. Phytopathology 91:173-180), pUR5755 (conforme descrito em Gouka, R. K. et al 1999. Nature biotechno- Iogy 17: 598-601 e M13, bem como plasmídeos, tais como plasmídeos ba- seados em pBR322, pSKF, pET23D, e sistemas de expressão de fusão, tais como MBP, GST e LacZ. Etiquetas de epítopo podem também serem adi- cionadas às proteínas recombinantes para proporcionar métodos convenien- tes de isolamento, por exemplo, c-myc.

Os elementos que são tipicamente incluídos nos vetores de ex- pressão também incluem um replicon, um gene que codifica resistência à antibiótico para permitir seleção de bactéria que abriga plasmídeos recombi- nantes, e locais de restrição únicos em regiões não-essenciais do plasmídeo para permitir inserção de seqüências heterólogas. O gene de resistência à antibiótico particular escolhido não é crítico, qualquer um dos muitos de gene de resistência conhecido na técnica são adequados. As seqüências procarió- ticas são preferivelmente escolhidas tal que elas não interferem com a repli- cação ou integração do DNA em Trichoderma reesei. Para transformação de Agrobacterium1 é necessário usar seqüências que permitem replicação em ambos E. Coli e Agrobacterium, bem como as bordas esquerda e direita do plasmídeo Agrobacterium Ti. Exemplos não-limitativos de seqüências ade- quadas são dados na seção de Exemplos, infra. Os métodos de transformação da presente invenção podem re-

sultar na integração estável de toda ou parte do vetor de transformação no genoma do fungo filamentoso. Contudo, a transformação resultante na ma- nutenção de um vetor de transformação extracromossomal de auto- replicação é também contemplada. Muitos métodos de transfecção padrão podem ser usados para

produzir linhas de célula de Triehoderma reesei que expressam grandes quantidades da proteína heteróloga. Alguns dos métodos para a introdução de construções de DNA em cepas de produção de celulase de Triehoderma incluem Lorito, Hayes, DiPietro and Harman, 1993, Curr. Genet. 24: 349-356; Goldman, VanMontagu and Herrera-Estrella, 1990, Curr. Genet. 17-169-174; Penttila, Nevalainen, Ratto, Salminen and Knowles, 1987, Gene 6: 155-164, para Aspergillus, Yelton, Hamerand Timberlake, 1984, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 81: 1470-1474, para Fusarium Bajar, Podila and Kolottukudy, 1991, Proc. Natl. Sei. USA 88: 8202-8212, para Streptomyces Hopwood et al, 1985, The John Innes Foundation, Norwich, UK, e para Bacillus Brigidi, De- Rossi, Bertarini, Riccardi and Matteuzzi, 1990, FEMS Microbiol. Lett. 55: 135-138). Contudo, qualquer um dos procedimentos bem conhecidos para introdução de seqüências de nucleotídeo estranhas em células hospedeiras pode ser usado. Estes incluem o uso de transfecção de fosfato de cálcio, polibreno, fusão de protoplasto, eletroporação, biolísticos, lipossomas, micro- injeção, vetores de plasma, vetores virais, e qualquer dos outros métodos conhecidos para introdução de DNA genômico clonado, cDNA, DNA sintéti- co, ou outro material genético estranho em uma célula hospedeira (ver, por exemplo, Sambrook et al, supra). Também de uso é o método de transfec- ção mediado por Agrobacterium descrito na Patente dos Estados Unidos N0 6.255.115. É somente necessário que o procedimento de projeto genético particular usado seja capaz de introduzir com sucesso pelo menos um gene na célula hospedeira capaz de expressar o gene heterólogo.

Genes heterólogos compreendendo as seqüências promotoras de gene de celulase de fungos filamentosos são tipicamente clonados em vetores intermediários antes da transformação em células de Trichoderma reesei para replicação e/ou expressão. Estes vetores intermediários são tipi- camente vetores procarióticos, por exemplo, plasmídeos, ou vetores de trá- fego.

Para obter expressão de alto nível de um gene clonado, o gene heterólogo é preferivelmente posicionado sobre a mesma distância a partir do promotor como no gene de celulase que ocorre naturalmente. Conforme é conhecido na técnica, contudo, alguma variação nesta distância pode ser acomodada sem perda de função promotora.

Aqueles técnicos no assunto estão cientes que um promotor na- tural pode ser modificado por reposição, substituição, adição ou eliminação de um ou mais nucleotídeos sem mudança de sua função. A prática desta invenção envolve, e não é restrita a tais alterações no promotor.

O vetor de expressão/construção contém tipicamente uma uni- dade de transcrição ou cassete de expressão que contém todos os elemen- tos adicionais requeridos para a expressão da seqüência heteróloga. Um cassete de expressão típico desse modo contém um promotor operavelmen- te ligado a seqüência de ácido nucléico heteróloga e sinais requeridos para polialdenilação eficiente do transcrito, locais de ligação de ribossomo, e ter- minação de translação. Elementos adicionais do cassete podem incluir in- tensificadores e, se DNA genômico é usado como o gene estrutural, introns com doador de união funcional e locais aceitantes.

A prática da invenção não está restrita pela escolha de promotor

na construção genética. Contudo, promotores exemplares são os promoto- res de Trichoderma reesei cbhl, cbh2, eg1, eg2, eg3, eg5, xln1 e xln2.

Em adição a uma seqüência promotora, o cassete de expressão deve conter uma região de terminação de transcrição à jusante do gene es- trutural para proporcionar terminação eficiente. A região de terminação pode ser obtida a partir do mesmo gene como a seqüência promotora, ou pode ser obtida de genes diferentes.

Embora qualquer terminador de fungo seja similarmente para ser funcional na presente invenção, terminadores preferidos incluem: o termina- dor de gene de Aspergillus nidulans trpC (Yelton, M. et al. (1984) PNAS USA 81: 1470-1474, Mullaney, E.J. et al (1985) MGG 199-37-45), os genes ,As- pergillus awamoriou Aspergillus niger glucoamilase (Nenberg, J. H. et al. (1984) Mol. Cell Biol. 4:2306, Boel, E. et aI (1984) EMBO J. 3:1581-1585) e o gene Mucor miehei carbóxil protease (EPO Publicação N0 0 215 594). O vetor de expressão particular usado para transportar a infor-

mação genética na célula não é particularmente crítico. Qualquer dos veto- res convencionais para expressão em células eucarióticas ou procarióticas pode ser usado. Vetores de expressão bacterial padrão incluem bacteriófa- gos λ e M13, bem como plasmídeos, tais como plasmídeos baseados em pBR322, pSKF, pET23D, e sistemas de expressão de fusão, tais como MBP, GST e LacZ. Etiquetas de epítope podem também serem adicionadas às proteínas recombinantes para proporcionar métodos convenientes de isola- mento, por exemplo, c-myc.

Os elementos que são tipicamente incluídos nos vetores de ex- pressão também incluem um replicon, um gene que codifica resistência à antibiótico para permitir seleção de bactéria que abriga plasmídeos recombi- nantes, e locais de restrição únicos em regiões não-essenciais do plasmídeo para permitir inserção de seqüências heterólogas. O gene de resistência à antibiótico particular escolhido não é crítico, qualquer dos muitos de gene de resistência conhecido na técnica são adequados. As seqüências procarióti- cas são preferivelmente escolhidas tal que elas não interferem com a repli- cação ou integração do DNA em Trichoderma reesei.

Os métodos de transformação da presente invenção podem re- sultar na integração estável de toda ou parte do vetor de transformação no genoma do fungo filamentoso. Contudo, a transformação resultante na ma- nutenção de um vetor de transformação extracromossomal de auto- replicação é também contemplada.

Muitos métodos de transfecção padrão podem ser usados para produzir linhas de célula de Trichoderma reesei que expressam grandes quantidades da proteína heteróloga. Alguns dos métodos para a introdução de construtos de DNA em cepas de produção de celulase de Trichoderma incluem Lorito, Hayes, DiPietro and Harman, 1993, Curr. Genet. 24: 349-356; Goldman, VanMontagu and Herrera-Estrella, 1990, Curr. Genet. 17-169-174; Penttila, Nevalainen, Ratto, Salminen and Knowles, 1987, Gene 6: 155-164, para Aspergillus, Yelton, Hamerand Timberlake, 1984, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 81: 1470-1474, para Fusarium Bajar, Podila and Kolottukudy, 1991, Proc. Natl. Sei. USA 88: 8202-8212, para Streptomyces Hopwood et al, 1985, The John Innes Foundation, Norwich, UK, e para Bacillus Brigidi, De- Rossi, Bertarini1 Riccardi and Matteuzzi, 1990, FEMS Microbiol. Lett. 55: 135-138).

Contudo, qualquer dos procedimentos bem conhecidos para in- trodução de seqüências de nucleotídeo estranhas em células hospedeiras pode ser usado. Estes incluem o uso de transfecção de fosfato de cálcio, polibreno, fusão de protoplasto, eletroporação, biolísticos, lipossomas, micro- injeção, vetores de plasma, vetores virais, e qualquer um dos outros méto- dos conhecidos para introdução de DNA genômico clonado, cDNA, DNA sin- tético, ou outro material genético estranho em uma célula hospedeira (ver, por exemplo, Sambrook et al, supra). Também de uso é o método de trans- fecção mediado por Agrobacterium descrito na Patente dos Estados Unidos N0 6.255.115. É somente necessário que o procedimento de projeto genético particular usado seja capaz de introduzir com sucesso pelo menos um gene na célula hospedeira capaz de expressar o gene heterólogo.

Após o vetor de expressão ser introduzido nas células, as célu- Ias transfectadas são cultivadas sob condições que favorecem expressão de genes sob controle de seqüências promotoras de gene de protease. Gran- des bateladas de células transformadas podem ser cultivadas conforme des- crito nos Exemplo 2, infra. Finalmente, o produto é recuperado a partir da cultura usando-se técnicas padrão. Desse modo, a invenção aqui proporciona a expressão e secre-

ção aumentada de polipeptídeos desejados cuja expressão está sob controle de seqüências promotoras de gene, incluindo genes de protease ou celulase que ocorrem naturalmente, seqüências de DNA de fusão, e várias constru- ções heterólogas. A invenção também proporciona processos para expres- são e secreção de altos níveis de tais polipeptídeos desejados. Células Hospedeiras

Em certas concretizações, a célula é uma célula fungai filamen- tosa tendo um genoma compreendendo um gene inativado, onde o gene inativado que compreende uma seqüência de nucleotídeo que é pelo menos 95% idêntica a qualquer de SEQ ID Nos: 1-6.

Os genes podem ser inativados em uma célula de fungo usando- se um número de métodos, incluindo métodos que empregam moléculas de antissenso, interferência de RNA, ou ribossomos, por exemplo. Em certas concretizações, contudo, a expressão dos genes pode ser reduzida por ina- tivação de gene.

Uma célula de fungo objeto pode ser construída usando-se qualquer método conveniente, por exemplo, pela alteração da seqüência de um gene da célula por produção de uma inserção, anulação, substituição ou re-arranjo no gene, por exemplo. A porção do gene a ser alterada pode ser, por exemplo, a região de codificação ou um elemento regulatório requerido para expressão da região de codificação. Um exemplo de tal seqüência re- gulatória ou de controle de um gene pode ser uma seqüência promotora ou uma parte funcional desta, isto é, uma parte que é necessária para expres- são do gene.

Em uma concretização, a célula de fungo objeto pode ser cons- truída por métodos de anulação de gene. As técnicas de anulação de gene capacitam a remoção parcial ou completa do gene, desse modo, eliminando sua expressão. Em tais métodos, a anulação do gene pode ser acompanha- da por recombinação homóloga usando-se um plasmídeo que foi construído para conter contiguamente as regiões 5' e 3' flanqueando o gene.

Em outra concretização, a célula de fungo objeto pode ser cons- truída pela introdução, substituição e/ou remoção de um ou mais nucleotí- deos no gene, ou um elemento regulatório deste requerido para a transcri- ção ou tradução deste. Por exemplo, nucleotídeos podem ser inseridos ou removidos de modo a resultar na introdução de um códon de parada, a re- moção do códon de parada, remoção de um local de união, ou uma estrutura de alteração da estrutura de leitura aberta. Tal modificação pode ser acom- panhada por mutagênese de local dirigido, ou mutagênese gerada por PCR de acordo com métodos conhecidos na técnica. Ver, por exemplo, Botstein and Shortle, 1985, Science 229: 4719; Lo et al., 1985, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 81:2285; Higuchi et al., 1988, Nucleic Acids Research 16: 7351; Shimada, 1996, Meth. Mol. Biol. 57: 157; Ho et al.,

1989, Gene 77: 61; Horton etal., 1989, Gene 77: 61; e Sarkar and Sommer,

1990, Bio Techniques 8: 404.

Em outra concretização, a célula de fungo objeto pode ser cons- truída por técnicas de rompimento de gene pela inserção no gene de inte- resse de um plasmídeo integrativo contendo um fragmento de ácido nucléico homólogo ao gene, que criará uma duplicação da região de homologia e in- corpora vetor de DNA entre as regiões duplicadas. Tal rompimento de gene pode eliminar expressão de gene se o vetor inserido separa o promotor do gene da região de codificação, ou interrompe a seqüência de codificação tal que um produto de gene não-funcional resulta. Um construto de rompimento pode ser simplesmente um gene marcador selecionável acompanhado pelas regiões 5' e 3' homólogas ao gene. O marcador selecionável capacita a iden- tificação de transformantes contendo o gene rompido.

Em outra concretização, a célula de fungo objeto pode ser cons- truída pelo processo de conversão de gene (ver, por exemplo, Iglesias e Trautner, 1983, Molecular General Genetics 189: 73-76). Por exemplo, no método de conversão de gene, uma seqüência de nucleotídeo correspon- dente ao(s) gene(s) mutagenizado(s) in vitro para produzir uma seqüência de nucleotídeo defectiva que é, então, transformada na cepa original para produzir um gene defectivo. Por recombinação homóloga, a seqüência de nucleotídeo defectiva substitui o gene endógeno. Em uma concretização alternativa, a célula de fungo objeto pode

ser construída usando-se mutagênese aleatória ou específica usando-se métodos que incluem, mas não estão limitados a, mutagênese química (ver, por exemplo, Hopwood, The Isolation of Mutants in Methods in Microbiology (J.R. Norris and D. W. Ribbons, eds.) pp. 363-433, Academic Press, New York, 1970) e mutagênese insercional, tal como transposição (ver, por e- xemplo, Youngman et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 80: 2305-2309). A modificação do gene pode ser realizada pela sujeição da cepa original à mutagênese e classificação das cepas mutantes em que expressão do gene foi reduzida ou eliminada. A mutagênese, que pode ser específica ou aleató- ria, pode ser realizada, por exemplo, pelo uso de um agente de mutageniza- ção físico ou químico adequado, por exemplo.

Exemplos de um agente de mutagenização físico ou químico adequado para a presente proposta incluem irradiação ultravioleta (UV)1 hi- droxilamina, N-metil-N'-nitro-N-nitrosogaunidina (MNNG), N-metil-N'- nitrosogaunidina (NTG) O-metil hidroxilamina, ácido nitroso, metano sulfona- to de etila (EMS)1 bissulfito de sódio, ácido fórmico, e análogos nucléicos. Quando tais agentes são usados, a mutagênese é tipicamente realizada pela incubação da cepa original a ser mutagenizada na presença do agente de mutagenização de escolha sob condições adequadas, e seleção de mutan- tes exibindo reduzida ou não expressão de um gene.

Conforme notado acima, a célula de fungo objeto pode ser uma célula de fungo filamentosa. Em certas concretizações, a célula pode ser não-patogênica, isto é, não-patogênica aos humanos. Em concretizações particulares, as células podem ser células de fungo filamentosas de uma cepa que é uma história de uso para produção de proteínas que tem status de GRAS1 isto é, uma Geralmente Reconhecida como Segura, pela FDA.

Em concretizações particulares, a célula de fungo objeto pode

ser uma célula das seguintes espécies: Trichoderma, (por exemplo, Tricho- derma reesei (anteriormente classificada como T. Iongibrachiatum e atual- mente conhecida como Hypocrea jecorina), Trichoderma viride, Thichoderma koningii, e Trichoderma harzianum)); Penicillium sp., Humicola sp. (por e- xemplo, Humicola insoles e Humicola grisea); Chrysosporium sp. (por exem- plo, C. lucknowense), Gliocladium sp, Aspergillus sp. (por exemplo, Aspergil- Ius oryzae, Aspergillus niger, Aspergillus nidulans, Aspergillus kawachi, As- pergillus aculeatus, Aspergillus japonicus, Aspergillus sojae, e Aspergillus awamori), Fusarium sp., Neurospora sp., Hypocrea sp., ou Emericella sl. (Ver, também, Innis et al., (1985) Sei. 228:21-26), entre outros. Em algumas concretizações, as células de fungo objetos podem ser cepas de Aspergillus niger que incluem ATCC 22342, ATCC 44733, ATCC 14331 e cepas deriva- das destas. Em algumas concretizações, uma célula hospedeira pode ser uma na qual genes nativos foram anulados ou inativados. Por exemplo, ge- nes correspondentes a genes de protease ou genes correspondentes a ge- nes de celulase podem ser inativados.

Em uma concretização, a célula de fungo objeto pode conter um ácido nucléico recombinante para expressão de uma proteína na célula. A proteína pode não ser não nativa à célula (isto é, heteróloga), ou nativa à célula (isto é, endógena à célula). A proteína pode ser expressa usando-se um número de protocolos diferentes, por exemplo, pelo uso de um cassete de expressão da proteína, por ligação operavelmente de um ácido nucléico que codifica a proteína a um promotor que é parte do genoma da célula com outro promotor, ou pela substituição do promotor que é parte do genoma da célula, por exemplo.

As seqüências de DNA de vários genes de fungo e as proteínas codificadas por aqueles genes foram determinadas e depositadas na base de dados do Banco de Gene NCBI1 incluindo os genomas completos de As- pergillus fumigatus, Candida glabrata, Cryptococcus neoformans, debarymy- ees hansenii, Encephalitozoon cuniculi, Eremotheeium gossypii, Gibberella zeae, Kluyceromyces laetis, Magnaporthe grisea, Neurospora crassa, Pichia stipitis, Saccaharomyces cerevisiae (levedura de baker), Schizosaccharomy- ces pombe (levedura de fendimento), Ustilago maydis e Yarrowia lipolítica. Seqüências adicionais podem ser encontradas na base de dados do US De- partment of Energy Joint Genome lnstitute's de genoma de Trichoderma re- esei e Aspergillus niger (conforme encontrado na website mundial de jgi.doe.gov).

Em certas concretizações, um gene objeto pode compreender uma seqüência de nucleotídeo que é pelo menos 70% (por exemplo, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, pelo me- nos 98%, ou pelo menos 98% de identidade de seqüência) para qualquer de SEQ ID NOS: 1-6; ou b) pode hibridizar sob condições estringentes para qualquer de SEQ ID NOS: 1-6. Proteína de Interesse ou Proteína Desejada

Os termos proteína de interesse e proteína desejada podem ser usados permutavelmente aqui. A presente invenção é particularmente útil na intensificação da produção intracelular e/ou extracelular de proteínas. A pro- teína pode ser homóloga ou heteróloga. As proteínas que podem ser produ- zidas pela presente invenção incluem, mas não estão limitadas a, hormô- nios, enzimas, fatores de crescimento, citocinas, anticorpos, e similares.

Os hormônios incluem, mas não estão limitados a, hormônio de estimulação de folículo, hormônio de luteinização, fator de liberação de corti- cotropina, somatostatin, hormônio de gonadotropina, vasopressin, oxitocin, eritropoietin, insulina, e similares.

Fatores de crescimento são proteínas que se ligam a receptores na superfície da célula, com o resultado primário de ativar proliferação celu- lar e/ou diferenciação. Fatores de crescimento incluem, mas não estão limi- tados a, fator de crescimento derivado de plaqueta, fator de crescimento e- pidermal, fator de crescimento de nervo, fatores de crescimento de fibroblas- to, fatores de crescimento similares a insulina, fatores de crescimento de transformação, e similares.

As citocinas são uma família única de fatores de crescimento. Principalmente secretadas de leucócitos, as citocinas estimulam ambas as respostas imunes humoral e celular, bem como a ativação de células fagocí- ticas. As citocinas incluem, mas não estão limitadas a, fatores de estimula- ção de colônia, as interleukins (IL-1 (a e β), IL-2 a IL-13) e as interferons (a, ββγ).

A interleukin-3 (IL-3) humana é uma proteína de 15kDa contendo 133 resíduos de amino ácido. IL-3 é uma espécie de colônia específica que estimula fator que estimula a formatação de colônia de megacariocitos, neu- trófilos, e macrófagos de culturas de tutano de osso.

Os anticorpos incluem, mas não estão limitados a, imunoglobuli- nas de qualquer espécie da qual é desejável produzir grandes quantidades. É especialmente preferido que os anticorpos são anticorpos humanos. Imu- noglobulinas podem ser de qualquer classe, isto é, G, A, Μ, E ou D.

Adicionalmente, uma "proteína de interesse" ou "polipeptídeo de interesse" se referem à proteína a ser expressa e secretada pela célula hos- pedeira. A proteína de interesse pode ser qualquer proteína que até agora foi considerada para expressão em procariotes. Em uma concretização, a proteína de interesse que é expressa e secretada inclui proteínas compre- endendo um peptídeo de sinal. A proteína de interesse pode ser ou homólo- ga ou heteróloga ao hospedeiro. Desse modo, uma proteína de interesse pode ser um polipeptídeo secretado, particularmente uma enzima que é se- lecionada de enzimas amilolíticas, enzimas proteolíticas, enzimas celulolíti- cas, enzimas oxidorreductase e enzimas de degradação de parede de plan- ta. Exemplos destas enzimas incluem amilases, proteases, xilanases, Iipa- ses, laccases, fenol oxidases, cutinases, celulases, hemicelulases, estera- ses, perioxidases, catalases, glicose oxidase, fitases, pectinases, glicosida- ses, isomerases, transferases, galactosidases e chitinases. O polipeptídeo secretado pode também ser um hormônio, um fator de crescimento, um re- ceptor, vacina, anticorpo ou similares. Em uma concretização, o polipeptídeo secretado é uma enzima celulolítica. Aplicação Industrial da Invenção

A presente invenção tem muitas aplicações práticas na indústria; conforme é contemplado aqui, esta descrição é pretendida para ser exem- plar, e não inclusiva. As cepas de T. reesei da presente invenção são mais efetivas na produção celular sobre a cepa original e, como tal, são úteis na produção eficiente de celulase que são úteis em várias indústrias, conforme exemplificado abaixo.

Em várias concretizações, a celulase produzida pelas cepas de T. reesei da presente invenção contempla uso na produção de etanol, coze- dura, produção de suco de fruta, preparação de bebida fermentada, destila- ção, produção de vinho, couro, óleos e gorduras, papel e polpa, e a produ- ção de alimento de animal.

Em outras concretizações, a presente invenção contempla uso como o componente "biológico" ativo de detergentes e produtos de limpeza. Aqui, celulases são usadas para quebrar várias manchas e outros contami- nantes adquiridos. Concretizações da invenção incluem teste da compatibili- dade de enzimas com ingredientes detergentes por se efetuar estudos de estabilidade e testá-los em uma variedade de formulações.

Em outra concretização, as celulases produzidas pelas cepas de T. reesei da presente invenção contempla uso na indústria têxtil, principal- mente no acabamento de tecidos e artigos de vestuário. Aplicações maiores incluem: Classificação de tamanho, remoção de tamanho (isto é, remoção de elementos rijos de fibra), de fios em tecido após tecedura. Por exemplo, as celulases produzidas pela presente invenção podem ser usadas em bio- polimento, um processo para reduzir ou eliminar tendência de empilhamento, e dar aos tecidos uma aparência mais lisa e mais brilhante. Processo de tra- tamento com pedras, um processo que pode substituir pedras-pomes tradi- cionais usadas em lavagem por pedra de tecido forte de algodão para alcan- çar aparência de desgaste.

Em ainda outra concretização, a presente invenção contempla usos enzimáticos para a liquefação e sacarificação de amido em glicose e isomerização em frutose. As celulases produzidas pela presente invenção podem ser usadas para converter grandes volumes de milho e outros grãos em adoçantes, similares a xarope de milho de frutose e xarope de maltose.

Será aparente àqueles técnicos no assunto ao qual esta inven- ção pertence que outras concretizações da presente invenção podem ser realizadas baseado nos ensinamentos contidos aqui. É pretendido que tais concretizações sejam contempladas para serem incluídas dentro do escopo da presente invenção. Exemplos

A presente invenção é descrita em maiores detalhes nos exem-

plos seguintes que não são, de qualquer modo, pretendidos para limitar o escopo da invenção conforme reivindicada de qualquer modo. As Figuras em anexo são significativas para serem consideradas como partes integrais do relatório descritivo e descrição da invenção. Todas as referências citadas são aqui especificamente incorporadas por referência para tudo que é aqui descrito. Os seguintes exemplos são oferecidos para ilustrar, mas não limitar a invenção reivindicada.

Na descrição experimental que se segue, as seguintes abrevia- ções se aplicam: eq (equivalentes); U (unidades); M (Molar); μΜ (micromo- lar); N (normal); mol (moles); mmol (milimoles); pmol (micromoles); nmol (nanomoles); pmole (pico moles); g (gramas); mg (miligramas); kg (kilogra- mas); pg (microgramas); L (litros); ml (mililitros); μΙ (microlitros); cm (centíme- tros); mm (milímetros); μηη (micrômetros); nm (nanômetros); 0C (grau Centí- grado); h (horas); min (minutos); s (segundos); ms (milissegundos); MM (Média Mínima). Exemplo 1

Procedimentos de Transformação Mediada por Aqrobacterium

Este exemplo mostra como mutagênese insercional foi realizada usando-se transformação mediada por Agrobacterium tumefeciens. Do mes- mo modo, Agrobacterium rhizogenes é igualmente efetivo para uso no pro- cedimento de transformação. Este procedimento permite a produção de bi- bliotecas mutantes de Trichoderma reesei que continha cepas com eventos de rompimento simples no DNA genômico. Estes eventos de rompimento foram aleatoriamente distribuídos através de todo genoma. Desde que o rompimento foi feito usando-se uma seqüência de DNA conhecida, foi possí- vel traçar o local exato de rompimento e identificar o(s) gene(s) que foi (fo- ram) afetado(s). Neste caso, as bibliotecas foram classificadas para produto- res de celulase aperfeiçoadas (ver, Exemplo 2). Nas cepas 7p, 8k, 7E, 9G, 8Q e 203, as seqüências de DNA genômico rompido específico responsável pelo aperfeiçoamento na produção de celulase foram identificadas.

Bibliotecas de rompimento de Trichiderma reesei foram prepara- das por transformação no gene pyr4 usando transformação mediada por A- grobacterium tumefaciens. A biblioteca de rompimento continha 30.000 transformantes. A biblioteca de rompimento foi classificada usando-se o mé- todo de Toyama (ver, Exemplo 2). Este método seleciona mutante que é ca- paz de utilizar e/ou crescer mais eficientemente em Avicel (celulose). No passado, este método tinha resultado no isolamento de cepas com rendi- mento e produtividade aperfeiçoados. Mutantes isolados da classificação de Toyama foram examinados em frascos agitados para produção de proteína total. Mutantes mostrando produção de proteína aumentada de mais do que 10% em experimentos múltiplos foram considerados para serem aperfeiçoa- dos. Um mutante 8k foi encontrado para ter produção de proteína total aper- feiçoada comparada ao controle original. A análise de Southern mostrou que esta cepa continha somente uma cópia do gene pyr4 indicando que nenhum evento de rompimento tinha ocorrido. A seqüência da seqüência de T. reesei em 8k que foi rompida pelo gene pyr4 foi determinada por entrelaçamento assimétrico térmico (tail) PCR. Os resultados de BLAST foram obtidos de bases de dados públicas, bem como a base de dados de genoma de T. ree- sei. Para 8k, a seqüência rompida imediatamente após as bases equipara- das de borda esquerda 1263431-1253276 em esqueleto-4 na base de dados de genoma de T. reesei. Para 7p, a seqüência rompida imediatamente após as bases equiparadas de borda esquerda 229978-229764 em esqueleto-4 quando BLSASTado na biblioteca de genoma de T. reesei. A seqüência para as outras quatro cepas da presente invenção foram identificadas similarmen- te.

A cepa de Agrobacterium tumefaciens usada para esta operação foi cepa EHA 105. EHA 105 é considerada para ser uma cepa hipervirulenta (Hook, et ai, 1993). Outras cepas que são também compatíveis com o se- guinte procedimento são, por exemplo, A136 e EHA 101. As freqüências de transformação para estas três cepas são similares quando transformando T. reesei. Em adição, A. rhizogenes (ATCC 43057) ou quaisquer outras cepas de rhizogenes podem ser usadas aqui.

O vetor de expressão baseado em PZP foi produzido conforme se segue. O vetor contém as regiões de borda de T-DNA esquerda e direita, um local pBR322 bam para mobilização de E. coli para Agrobacterium, ori- gens de plasmídeo CaIEI e pVS1 para replicação em E. coli e Agrobacteri- um, respectivamente. Marcadores bacteriais conferem resistência a amp (Hajdukiewiez, O, et al, 1994). Uma representação do vetor é mostrada na figura 2.

O vetor E. coli foi produzido conforme segue. O cassete de ex- pressão foi preparado por técnicas de biologia molecular padrão, e ligado em um vetor de PZP. Cepas preferidas de E. coli são células de outro XL (Invi- trogen, Carlsbad, CA) e DH5a, que é conhecido na técnica. LA mais 25 ppm de placas cmp foram usados para selecionar transformantes de E. coli. Tipi- camente, cerca de 1-10% dos transformantes de E. coli têm o vetor deseja- do. LB mais 25 ppm de cpm foi usado para crescer o vetor de DNA contendo E. coli. O vetor de DNA foi isolado usando-se protocolos padrões conhecidos na técnica.

O vetor de DNA foi eletroporado em células de Agrobacterium

conforme segue. Primeiro, células de Agrobacterium competentes foram preparadas. As células de Agrobacterium foram renovadas de crioconserva- ção pelo crescimento em meio LA a 28°C por cerca de três dias. As colônias foram selecionadas e crescidas em caldo de cultura Luria-Bertani (LB; Invi- trogen) mais 0,1% de glicose em 250 ml de frascos de fundo dentados con- tendo 50 ml de meio. As culturas foram incubadas a 28°C até que cresci- mento ocorresse (cerca de dois dias). Um procedimento alternado é iniciar a cultura em um tubo de cultura de 5 ml ao frasco de 250 ml quando cresci- mento é notado. Cerca de 10% do volume (v/v) de acima do frasco foi então transferido em um frasco fresco com o mesmo meio. Este frasco foi incuba- do até que um Diâmetro Externo (a 600 nm) de cerca de 0,4-0,8 foi obtido (cerca de 5-6 horas de crescimento). Em seguida, no frio, as células foram giradas em uma centrífuga a 10.000 rpm por 10 minutos. As células foram então lavadas 3X em 1M de HEPES frio, pH 7,0. Em seguida, as células fo- ram lavadas uma vez em 1 mM de HEPES frio com 10% de glicerol. Alíquo- tas de 50-100 ml foram congeladas a 70°C. A viabilidade da célula foi deter- minada (tipicamente cerca de 1 χ O9 de CFU/ml após congelamento). As cé- lulas competentes são boas por um ano ou mais tempo quando armazena- das a -70°C.

Após a geração de células de Agrobacterium competentes, as células foram transfectadas por eletroporação. As células de Agrobacterium competentes foram descongeladas em gelo. Cerca de 40 μΙ das células fo- ram misturados com cerca de 1 pg de DNA em uma célula de eletroporação de 2 cm (em gelo). As células foram eletroporadas a 200 Omnhs, a 25 pF, 2,5 volts com um eletroporador Buchler 3-150. Meio SOC (Invitrogen) foi adi- cionado imediatamente após eletroporação no tubo de eletroporação. (Em outra concretização, as células de Agrobacterium são eletroporadas com a mistura de ligação desse modo saltando a etapa de E. coli. Com este méto- do alternado, 1 μΙ da mistura de ligação é usado na etapa de eletroporação). Após a adição de SOC à mistura de eletroporação, diluições da mistura fo- ram colocadas em meio LA mais 250 ppm de placas de cultura de cpm e incubadas a 28°C por quatro dias. (Em outra concretização, 25 ppm de cpm pode ser usado para obter colônias em uma estrutura de tempo mais curto, mas um grande número de colônias com a necessidade de ser classificada para encontrar uma contendo o vetor. Isto é porque algumas cepas de Agro- bacterium têm alguma resistência natural a cpm). Após eletroporação, 1 χ 107 de CFU/ml de transformantes de Agrobacterium foram obtidos, e cerca de 90-100% tinha o vetor conforme determinado por PCR.

Agrobaeterium tumefaeiens EHA 105 (Hajdukiewiez, P. Svab, Z, e Maliga, Ρ. (1994) The small versatile, família de pZPZ de vetores binários de Agrobacterium para transformação de planta. Plant Molecular Biology 25, 989-994) contendo o vetor de rompimento PZP-pyr4 foi crescido em 50 ml_ de meio MM a 28°C, 200 rpm, por 24 horas. Após 24 horas de incubação, uma alíquota de 5 mL foi transferida para meio de Indução de 50 mL, e incu- bada a 28°C, 200 rpm, até que absorvância a 600 λ alcançou 0,8 abs. Cerca de 10 ml desta cultura foram adicionados a 20 ml de meio de indução fresco, junto com 10 ml de uma cepa P-37py4 que tinha sido crescida por 24 horas a 28°C, 200 rpm em YEG (g por litro: extrato de levedura -5, glicose- 20, uri- dina -2 mg). A contagem viável desta cultura foi cerca de 1 χ 106 de CFU/ml. A mistura foi incubada estaticamente a 28°C, e amostrada a 48, 72 e 144 horas. As amostras foram lavadas 3x em água estéril, e colocadas em Vo- gels. As colônias que cresceram foram transferidas para uma segunda placa de Vogel para confirmação. Os resultados são mostrados na tabela abaixo: Tabela 1

Incubação tempo (hora) # transformantes isolados em vogels 0 0 48 2 72 5 96 7 144 4

Estes resultados indicam que transformação de Agrobacterium pode ser feita em um meio líquido quando o período de incubação está entre 48-144 horas. A incubação ótima está entre 72-96 horas.

Tabela 2

Meio de Indução de Aqrobacterium

Produzir para um litro:

K3HPO4 2,05 g

KH2PO4 1,45 g

NaCI 0,15 g

MgS04*7H20 0,5 g

CaCI2*6H20 0,1 g FeSO4VH2O 0,0025 g

(NH4)2SO4 0,5 g

Glicose 1,8 g

Glicerol 5,0 g Preparar em 40 mM de tampão de MES (2-(N-Morfolino) ácido etanossulfônico) pH 5,3

Após esterilização adicionar:

1 M de acetosiringone 200 ml Meio de Placa Indutivo de Agrobacterium Produzir para um litro

K3HPO4 2,05 g

KH2PO4 1,45 g

NaCI 0,15 g

MgSO4VH2O 0,5 g

CaCI2*6H20 0,1 g

FeSO4VH2O 0,0025 g

(NH4)2SO4 0,5 g

Glicose 1,8 g

Glicerol 5,0 g

Ágar 15g

Preparar em 40 mM de MES pH 5,3 Após esterilização adicionar

1 M de acetosiringone 200 ml

100 mg/ml de uridina 2,5 ml Resfriar.

Meio Mínimo de Agrobacterium (MM) Produzir para um litro:

K3HPO4 2,05 g

KH2PO4 1,45 g

NaCI 0,15 g

MgSO4VH2O 0,5 g

CaCI2*6H20 0,1 g 5

FeSO4VH2O

(NH4)2SO4

Glicose

Após esterilização adicionar Cloranfenicol

25,0

0,0025 g 0,5 g 1,8 g

Exemplo 2 TaiI-PCR

Após classificação de cepas de T. reesei para produção de celu-

Iase aperfeiçoada, cepas aperfeiçoadas foram analisadas para mudanças genéticas usando-se mTAIL-PCR (reação de cadeia de polimerase entrela- çada assimétrica térmica modificada). TAIL-PCR foi realizado usando-se protocolos modificados de Sessions, et al, (The Plant Cell, 14:2985-2994, 2002) e Liu, et al (Plant J., 8:457-463, 1995) e Liu e Whittler (Genomics, 25:674-661, 1995) usando-se iniciadores para o vetor PZP e o genoma de interesse. Adicionalmente, Southern blotting foi realizado para demonstrar que caca um dos novos clones tinha somente uma cópia do gene modifica-

tro iniciadores degenerados arbitrários foram usados para arredondar a cicli- zação de TAIL-PCR. Os iniciadores de T-DNA usados foram conforme se- do.

Brevemente, iniciador específico de pyr4 e um conjunto de qua-

gue:

Iniciadores aleatórios de TAIL-PCT que foram usados:

Nome: adi

Síntese: 50 nmoles

Purificação: Livre de Sal

Seqüência: NGTCGASWGANAWGAA [SEQ ID NO: 7]

Nome: ad2

Síntese: 50 nmoles

Purificação: Livre de Sal

Seqüência: TGWGNAGSANCASAGA [SEQ ID NO: 8]

Nome: ad3

Síntese: 50 nmole

Purificação: Livre de Sal Seqüência: AGWGNAGWANCAWAGG [SEQ ID NO: 9] Nome: ad4

Síntese: 50 nmoles

Purificação: Livre de Sal Seqüência: WGTGNAGWANCANAGA [SEQ ID NO: 10]

A concentração final dos iniciadores reunidos foram AD1 3.0 μΜ, AD2 3,0 μΜ, AD3 3,0 μΜ e AD4 3,0 μΜ. Iniciador de pyr4 específico Reverso

4rip 5'AGCCGCGGCCTCCTGAT-'3 [SEQ ID NO: 11]

5rip 5'GTCGGCGCTCAGGCACAGGTTGG-'3 [SEQ ID NO> 12] 6rip 5'CGTCGCCGTCTCGCTCCTG-'3 [SEQ ID NO: 13] IniciadorAninhado Reverso

8rip 5TGCGGGAGGAAGAGGAGTAGGAAC3 [SEQ ID NO: 14]

O procedimento de tail-PCR foi realizado conforme segue, (ver, Sessions, e/a/., 2002, The Plant Cell, vol. 14, pp. 2985-2994).

Em tubos de partida de hospedeiro usando-se pontas de pipeta com obturadores de algodão: Etapa 1

H20 destilada 34 uL

Tampão 10X 5 uL

IOmMdedNTP 2 uL

iniciador pyr4 específico 1 uL (50 pmoles) iniciador adi 2 uL

iniciador ad2 2 uL

iniciador ad3 2 uL

iniciador ad4 2 uL

Calor 95,90 segundos, resfriar a 4°C.

Etapa 2

H20 destilada 43 uL

Tampão 10X 5 uL DNA genômico 1 uL (diluir nosso DNA 1/5 com H2O

polimerase Hércules 1 uL

Operar o primeiro Programa PCR1 arredondar 1 (T1). Parâme- tros de ciclização são dados abaixo.

Etapa 3

H20 destilada 34 uL

Tampão 10X 5 uL

IOmMdedNTP 2 uL

iniciador pyr4 específico 1 uL (50 pmoles) iniciador adi 2 uL

iniciador ad2 2 uL

iniciador ad3 2 uL

iniciador ad4 2 uL

Calor 95,90 segundos, resfriar a 4°C.

Etapa 4

H20 destilada 39 uL

Tampão 10X 5 uL

DNA genômico 5 uL (da etapa 2, após operação T1)

polimerase Hércule 1 uL Operar um segundo estágio de PCR (T2). Parâmetros de cicli-

zação são dados abaixo.

Dois estágios de ciclização de mTAIL-PCR foram realizados. Os parâmetros de ciclização para o primeiro estágio (T1) foram (1) 94°C para 2 minutos e 95°C para 1 minuto; (2) 5 ciclos de 94°C para 30 segundos, 62°C para 1 minuto, e 72°C para 2,5 minutos, (3) 2 ciclos de 94°C para 30 segun- dos, 25°C para 3 minutos (50% de rampa), e 72°C para 2,5 minutos (32% de rampa); (4) 15 ciclos de 94°C para 10 segundos, 68°C para 1 minuto, 72°C para 2,5 minutos, 94°C para 10 segundos, 68°C para 1 minuto, 72°C para 2,5 minutos, 94°C para 10 segundos, 44°C para 1 minuto, e 72°C para 2,5 minutos; e (5) 72°C para 7 minutos.

Os parâmetros de ciclização para o segundo estágio (T2) con- tendo 8 rip como o iniciador aninhado, bem como a reunião Ad, foram con- forme segue: (1) 94°C para 3 minutos, (2) 5 ciclos de 94°C para 10 segun- dos, 64°C para 1 minuto, e 72°C para 2,5 minutos, (3) 15 ciclos de 94°C pa- ra 10 segundos, 64°C para 1 minuto, e 72°C para 2,5 minutos, 94°C para 10 segundos, 64°C para 1 minuto, 72°C para 2,5 minutos, 44°C para 1 minuto, e 72°C para 2,5 minutos, (4) 5 ciclos de 94°C para 10 segundos, 44°C para 1 minuto, e 72°C para 3 minutos; e (5) 72°C para 7 minutos. Os produtos de TAIL-PCR foram purificados e sequenciados por tratamento com exonuclea- se 1 (2.5 U; Amersham) e fosfatase alcalina de camarão (0.5 U; Amersham; Piscataway1NJ) por 20 minutos a 37°C, seguido por 15 minutos a 80°C. As reações de sequenciamento foram realizadas em um formato de 384 cavi- dades usando-se iniciador 8rip e um-oitavo da quantidade sugerida de ter- minadores BigDye (Applied Biosystem; Foster City, CA), e operadas em um sequenciador padrão. As reações de sequenciamento foram passadas atra- vés de uma matriz Sepdadex G-50 para remover sais e não-incorporados devido aos terminadores. As seqüências resultantes foram BLASTadas con- tra seqüências genômicas de T. reeseiem JGI Trichoderma reesei v.1.0. Exemplo 3 Procedimentos de Transformação de Fungo

Inoculado de Agrobacterium foi preparado conforme segue. Vin- te e cinco ml de Meio Mínimo (MM) em frascos de 250 ml foram inoculados com, ou estoque congelado de vetor transformado de Agrobacterium, ou i- noculado diretamente de uma cultura de placa de LA fresca. A cultura foi, em seguida, incubada a 28°C com agitação até que a cultura tornou-se turva (durante a noite por vários dias). Em seguida, 10 ml foram transformados em 50 ml de Meio de Indução (IM) em frascos de 250 ml. O DE de partida foi cerca de 0,1 a 600 nm, e as células foram cultivadas até que o DE fosse en- tre 0,4-0,8. Uma placa de fungo fresco (por exemplo, T. reesei) foi preparada por ressuspensão de esporos em 10 ml de água estéril.

A transformação de fungo (por exemplo, T. reesei e Aspergillus niger) foi realizada conforme segue. Cerca de 100 μΙ de caldo total de Agro- bacterium (DE 0,4-0,8 a 600 nm) foi misturado com cerca de 100 μΙ de espo- ros fungais (107sfu/ml). Um técnico no assunto compreenderá que outras proporções de Agrobacterium para esporos fungais também produzirão re- sultados satisfatórios. Em1 seguida, 0,1 a 1,0 ml da mistura foi colocada nas placas de incubação contendo filtros de nitrocelulose. Placas de indução fo- ram suplementadas com nutrientes pelos fungos conforme necessário para corrigir qualquer auxotropia presente nos fungos. As placas foram incubadas a cerca de 18-28°C por cerca de 24-48 horas para T. reesei. Para Aspergil- Ius niger, as culturas foram incubadas a cerca de 20-24°C por cerca de 20- 24 horas. Em seguida, os filtros foram transferidos para meio seletivo (meio de Vogels para T. reesei e meio mínimo para A. niger). O meio foi suplemen- tado com 250 ppm de carb para matar/inibir crescimento de Agrobacterium. As culturas foram então incubadas a 28°C até que crescimento fosse eviden- te no filtro. Isto leva cerca de uma semana. Os transformantes foram transfe- ridos para meio seletivo quando eles estavam prontos para análise adicional. Exemplo 4 Penetra de Toyama

A peneira de Toyama foi desenvolvida por Drs. Hideo and Nobuo Toyama de Miniamikyashu University no Japão. Toyama, H. e N., Successi- ve construction of celulase hyperproceducers of Trichoderma using hyper- polyploids. Appl. Biochem. Biotechnol. Spring 84-86:419-429, 2000. O méto- do aqui descrito foi modificado a partir do procedimento original para ser mais efetivo no aperfeiçoamento de cepas de produção de celulase de Tri- choderma reesei e para ser uma peneira de alto rendimento. Esta peneira foi usada com sucesso para isolar cepas com aperfeiçoamentos em ambos rendimento e produtividade. Aqui, nós usamos a peneira para isolar cepas 7p, 8k, 7E, 9G, 8Q e 203 a partir da cepa original. Estas cepas mostram pro- dução de celulase aperfeiçoada sobre a cepa original de T. reesei. Esporos mutagenizados foram preparados usando-se mutagê-

nese insercional (conforme detalhado no Exemplo 2). Uma alíquota das bi- bliotecas mutacionais foram congeladas a -70°C. Uma contagem de esporo viável foi determinada e a biblioteca remanescente foi dividida de modo que cada alíquota continha cerca de 106 esporos. O meio de classificação de Toyama foi preparado e resfriado a

55°C em um banho de água. Em um prato de Petri de 82 mm foi dispensado em um círculo cerca de Vz fora do centro das placas e das borda. Em segui- da, 10 ml de meio de classificação de Toyama foi cuidadosamente adiciona- do às placas de cultura, e a placa foi redemoinhada de modo que os esporos foram dispersos na parte intermediária da placa, mas não dispersada no caminho das bordas da placa (ver figura 3). Alternativamente, os esporos podem ser difundidos com uma volta estéril antes da adição do meio de To- yama. O meio foi deixado endurecer por 5-10 minutos. Outros 25 ml de meio foi adicionado às placas e deixado endurecer. Em seguida, outros 10 ml de meio foi adicionado às placas e deixado endurecer. As placas foram incuba- das durante toda a noite. O próximo dia de crescimento dos esporos foi examinado usan-

do-se um microscópio de dissecação. As placas foram verificadas por 4 ho- ras. Os isolados foram coletados conforme segue. Somente os primeiros 1-3 isolados que alcançaram a superfície do agar foram coletados. Quaisquer colônias que vêm ao redor das bordas da placa (cheaters) foram ignoradas. Os isolados foram coletados usando-se uma lâmina de navalha estéril sob o microscópio, tendo-se o cuidado de não escavar a superfície de agar. As amostras coletadas foram colocadas em placas de PDA (batata-dextrose- ágar, Difco, Gaithersburg, MD) e incubadas a 28°C. Uma vez crescidos, os isolados foram avaliados em placas de celulase intumescidas ácidas, ou fo- ram postas diretamente em frascos osciladores.

Tabela 3 Meio de Peneira de Toyama Produzir para um litro:

Solução de Estoque de 50X Vogels 30 ml

Avicel 0,5 g

Ágar 20g

Soluções de Estoque de 50X Vogels

Usando-se três recipientes de vidro separadamente, adicionar: Na3Citrato*2H20 150g

MgS04*7H20 10 g

CaCI2*2H20 5 g

Dissolver em diH20 a 300 ml KH2PO4 250 ml

Dissolver em DiH2O a 500 ml

NH4NO3 100 g

Dissolver em DiH2O a 200 ml

Permitir que todos os componentes fiquem claros em diH20.

Combinar todas as soluções e adicionar com mistura: Solução de Elemento de Traço de Vogels 5 ml Solução Biotin de Vogels 2,5 ml

Soluções de Biotin de Vogels Produzir para um litro:

d-biotin 0,1 g

Dissolver em diH20 a 1,0 L

Soluções de Elemento de Traço de Vogels

Produzir para um litro: Ácido Cítrico 50 g ZnS04*7H20 50 g Fe(NH4)2S04*6H20 10 g CuS04*5H20 2,5 g MnSO4MH2O 0,5 g H3BO3 0,5 g NaMo04*2H20 0,5 g É compreendido que os exemplos e concretizações aqui

tos são para proposta ilustrativa somente, e que várias modificações ou mu- danças à luz destes serão sugeridas aos técnicos no assunto, e são para serem incluídas dentro do espírito e campo de ação deste pedido, e escopo das reivindicações em anexo. Todas as publicações, patentes e pedidos de patente aqui citados são, desse modo, incorporados por referência em sua totalidade para todas as propostas.

Claims (19)

1. Fungo filamentoso tendo uma mutação ou anulação de parte ou todo de um gene tendo a seqüência selecionada de pelo menos uma se- qüência colocada em qualquer uma de SEQ ID NOs:1-6, e referida mutação ou anulação resulta na produção aumentada de um polipeptídeo desejado comparada ao fungo filamentoso original.

2. Fungo filamentoso, de acordo com a reivindicação 1, no qual referido fungo filamentoso é capaz de expressar uma proteína heteróloga.

3. Fungo filamentoso, de acordo com a reivindicação 1, no qual referida proteína heteróloga é selecionada a partir do grupo consistindo em hormônios, enzimas, fatores de crescimento, e citocinas.

4. Fungo filamentoso, de acordo com a reivindicação 3, no qual referida proteína heteróloga é uma enzima.

5. Fungo filamentoso, de acordo com a reivindicação 4, no qual referida enzima é selecionada a partir do grupo consistindo em protreases, carbohidrases, lipases, isomarases, racemases, epimerases, tautomerases, mutases, transferases, quinases e fosfatases.

6. Método para a produção de uma proteína heteróloga em uma célula hospedeira de fundo filamentoso transformada compreendendo as etapas de: (a) obtenção de uma célula hospedeira de fungo filamentoso compreendendo um ácido nucléico que codifica referida proteína heteróloga na qual referida célula hospedeira contém uma mutação ou anulação em pelo menos uma seqüência de ácido nucléico tendo a seqüência colocada em qualquer uma de SEQ ID Nos: 1-6, no qual referida mutação ou anulação resulta na produção aumentada da proteína heteróloga comparada a um fungo filamentoso original; e (b) crescimento de referida célula hospedeira de fungo filamen- toso sob condições adequadas para a expressão de referida proteína heteró- loga.

7. Método, de acordo com a reivindicação 6, no qual referido ge- ne compreende a seqüência de ácido nucléico colocada em SEQ ID NO:1.

8. Seqüência de nucleotídeo isolada selecionada a partir de um grupo consistindo em SEQ ID Nos: 1-6.

9. Seqüência de nucleotídeo isolada, de acordo com a reivindi- cação 8, no qual referida seqüência foi modificada.

10. Seqüência de nucleotídeo isolada, de acordo com a reivindi- cação 9, no qual referida modificação é selecionada a partir de mutilação, anulação, mutação ou outros meios de inativação.

11. Vetor compreendendo pelo menos uma das seqüências de nucleotídeo de acordo com a reivindicação 9.

12. Célula hospedeira transformada com um vetor de acordo com a reivindicação 11.

13. Método de produção de uma célula hospedeira modificada, referido método compreendendo (a) obtenção de uma cepa de célula hospedeira original; (b) transformação de referida cepa de célula original com o vetor de acordo com a reivindicação 11. (c) seleção das células hospedeiras modificadas; no qual referidas células hospedeiras modificadas produzem mais proteína homóloga do que a célula hospedeira original.

14. Método de produção de um polipeptídeo desejado heterólo- go, referido método compreendendo (a) obtenção de uma cepa de célula hospedeira original; (b) transformação de referida cepa de célula original com um vetor que codifica um polipeptídeo desejado; (c) transformação de referida cepa de célula original com um vetor como definido na reivindicação 11 para produzir uma célula hospedeira modificada; (d) seleção de células hospedeiras modificadas que produzem referido polipeptídeo desejado heterólogo; e (e) cultura de referida célula hospedeira modificada em um meio de crescimento adequado para produção de referido polipeptídeo desejado heterólogo no qual as etapas (b) e (c) podem ser feitas em qualquer ordem, ou simultaneamente.

15. Método, de acordo com a reivindicação 14, no qual referido meio de crescimento adequado compreende adicionalmente um induzidor de produção de celulase.

16. Método, de acordo com a reivindicação 15, no qual referido induzidor de produção de celulase é selecionado a partir de uma ou mais de celulose, lactose, soforose e glicose/soforose.

17. Método, de acordo com a reivindicação 14, no qual o método compreende adicionalmente a pelo menos purificação parcial de celulases produzidas por referida cultura.

18. Método para a produção de uma nova cepa de T. reesei u- sando mutagênese insercional no qual referida nova cepa de T. reesei tem produção aumentada de celulase conforme comparada a cepa original de T. reesei, compreendendo: (a) preparação de uma população de células de Agrobacterium sp. competentes por eletroporação nas células de Agrobacterium sp. compe- tentes de um vetor de expressão compreendendo, em condição operável, regiões de borda de T-DNAda da esquerda para a direita, origens de plas- mídio pV15 para replicação em Agrobacterium sp. e marcadores bacteriais para conferir resistência a cloranfenicol para criar uma população compre- endendo células de Agrobaeterium sp. Transformadas; (b) seleção de Agrobaeterium de referida população da etapa (a); (c) inoculação de uma cultura de esporos de T. reesei com trans- formantes de Agrobaeterium sp. da etapa (b) para criar uma cultura de indu- ção; (d) cultura de referida cultura de indução da etapa (c) a cerca de 18°C e por cerca de 24 horas para criar uma população compreendendo: (e) transferência de amostras da referida população de T. reesei transformado da etapa (d) para meio seletivo, e isolamento de colônias de T. reesei efetivas na degradação de celulose; e (T) comparação da eficiência de degradação de celulose entre o Τ. reesei das colônias isoladas da etapa (e), e a cepa original não- transformada, no qual o referido T. reesei das colônias isoladas da etapa (e) são aumentados em uma degradação de celulose quando comparado a ce- pa original não-transformada.

19. Método, de acordo com a reivindicação 18, no qual referidas células de Agrobacterium sp. são selecionadas de Agrobacterium tumefaci- ens e Agrobacterium rhizogenes.