BRPI0713899A2 - preservação e liberação controlada de espermatozóides - Google Patents

Abstract

PRESERVAçãO E LIBERAçãO CONTROLADA DE ESPERMATOZóIDES. A presente invenção descreve partículas de biopolímero para a preservação de espermatozóides, onde os espermatozóldes são incorporados na partícula de biopolímero. A presente invenção diz respeito também a um método para a preservação, armazenamento e liberação controlada de espermatozóide, e ao uso das partículas de biopolímero de acordo com a presente invenção em criação de animais.

Description

PRESERVAÇÃO E LIBERAÇÃO CONTROLADA DE ESPERMATOZÓIDES

Campo da Invenção

A presente invenção refere-se a partículas biopoliméricas para a preservação de espermatozóides. A presente invenção refere-se também a um método para a preservação, armazenamento e liberação controlada de espermatozóides, e ao uso das partículas de biopolímero de acordo com a presente invenção em criação de animais.

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Antecedentes da Invenção

A inseminação artificial (AI) é uma técnica em que espermatozóides são colocados no útero ou cerviz de um animal por meio artificial substituindo a cópula natural. É amplamente utilizada como um método para acasalamento, e na criação de animais para propagar características desejáveis, particularmente no caso de animais de fazenda como gado, suínos, ovelhas, aves e cavalos, mas também no caso de animais de estimação como cães de raça, animais aquáticos ou espécies ameaçadas de extinção.

Usualmente, o espermatozóide é coletado, amplificado e então preservado, por exemplo, por criopreservação. A utilização de técnicas de criopreservação pré-supõe que o espermatozóide de uma espécie específica de animal tolere tal tratamento sem resultar em uma deterioração muito alta da qualidade, viabilidade e capacidade de fertilização do espermatozóide. Os espermatozóides são então transportados para o local da fêmea ou criopreservados ou armazenados frescos, o que for mais adequado. É vital que os espermatozóides sejam mantidos viáveis até o momento da inseminação e por um período de tempo suficiente no interior da fêmea após a inseminação até que o(s) óvulo (s) alcance(m) o local de fertilização.

A inseminação artificial de animais de fazenda tem sido utilizada desde os anos de 1940 e é hoje amplamente utilizada na agroindústria, especialmente para a criação de gado de leite e suínos. Uma visão geral do desenvolvimento da AI moderna e dos desafios dos criadores no que diz respeito à utilização de inseminação artificial e io preservação de espermatozóides é mostrada em R.H. Foote (2002), American Society of Animal Science (http://www.asas.org/symposia/esupp2/Footehist.pdf) e em "Reproduction in farm animais", editado por B. Hafez, E.S.E. Hefez - 7a ed. , Philadelphia, Lippincott Williams & Wilkins, 2000 - XIII, ISBN 0-683-30577-8 (ib.). A inseminação artificial se tornou um meio econômico importante para a criação de animais na agroindústria, tanto no que diz respeito à criação de animais com características genéticas específicas preferidas quanto na produção animal em geral.

Entretanto, existem algumas limitações no que diz respeito à obtenção de prenhez nas fêmeas por inseminação artificial. Por exemplo, a vida de prateleira e

viabilidade dos espermatozóides coletados, tanto durante o armazenamento, após descongelamento no caso espermatozóides criopreservados, quanto após a inseminação, são essenciais para um resultado de criação positivo. 0 fato de se técnicas de preservação adequadas estão disponíveis para as espécies específicas de animais varia. Para gado, técnicas de criopreservação são amplamente utilizadas. Por outro lado, espermatozóides de outras espécies tais como suínos são menos tolerantes a técnicas de criopreservação, resultando em menor flexibilidade no que diz respeito às possibilidades de processamento e armazenamento de sêmen.

Além disto, para se obter espermatozóides com

capacidade de fertilização adequada, é desejável que o método de preservação utilizado proveja a manutenção da capacidade de fertilização após a inseminação. Tem havido bastante foco e pesquisa para métodos de preservação que objetivam a provisão de métodos e meios de armazenamento que assegurem que o espermatozóide mantenha a capacidade de fertilização por um tempo mais longo após a coleta e até o ponto de inseminação.

Se a vida de prateleira é curta no que diz respeito à manutenção da capacidade de fertilização após a inseminação, fica mais difícil se atingir o ponto preferido para a inseminação no que diz respeito à ovulação. No caso de uma característica de vida de prateleira curta, boas técnicas de preservação de espermatozóide que causem uma vida de prateleira mais longa e, desta forma, uma capacidade de fertilização mais longa, são vitais. Ainda não existe um método de preservação disponível que proveja vida de prateleira suficiente e viabilidade do espermatozóide por um período suficiente após a inseminação para atender as necessidades dos criadores quanto a flexibilidade, especialmente quando ocorre uma distância longa e demorada entre o local do macho e, desta forma, do local em que o sêmen é coletado, e a fêmea receptora.

Além disto, um método de preservação que proveja uma disponibilidade mais controlada e duradoura do espermatozóide, reduziria a necessidade de ovulação artificialmente provocada por tratamento com hormônio. Isto seria benéfico tanto economicamente, de acordo com as exigências do consumo, quanto no que diz respeito à saúde do animal.

Desta forma, existe uma necessidade por métodos que assegurem que o espermatozóide mantenha a capacidade de fertilização por um período de tempo mais longo após a inseminação, por exemplo, mantendo a capacidade de fertilização por um período de tempo mais longo quando colocado no interior da fêmea receptora.

No momento, a inseminação artificial (AI) em gado é amplamente realizada utilizando-se espermatozóides criopreservados. Os espermatozóides criopreservados podem ser armazenados em nitrogênio líquido por décadas até a utilização. Entretanto, quando os espermatozóides são descongelados, a AI precisa ser realizada em poucas horas. Após a inseminação os espermatozóides criopreservados têm um potencial de fertilização por aproximadamente 12-24 horas, e a AI deve ser realizada em aproximadamente 12-24 horas antes da ovulação. Desta forma, existe uma

necessidade por técnicas de preservação para a criação de gado que produzam espermatozóides que apresentam características de vida de prateleira suficiente e que seja preferivelmente mantida a capacidade de fertilização por vários dias.

Em alguns países, espermatozóides de touro armazenados em líquido são utilizados de maneira a reduzir o número de células de esperma por dose de AI. Os espermatozóides apresentam capacidade de fertilização por aproximadamente 24-3 6 horas depois da inseminação. A AI deve ser realizada em aproximadamente 24 horas após a coleta do espermatozóide. Entretanto, os espermatozóides de touro preservados em liquido são comprometidos por várias desvantagens tais como vida de prateleira encurtada/reduzida e escopo reduzido de distribuição.

Em suínos, espermatozóides criopreservados são utilizados apenas para propósitos especiais tais como exportação, transporte de longa distância e para o controle de doenças contagiosas. A AI em suínos é usualmente realizada com sêmen preservado em líquido. O tempo de armazenamento para sêmen (espermatozóide) preservado em líquido irá depender do extensor utilizado. Espermatozóides diluídos com extensores de curto prazo preservam a capacidade de fertilização por aproximadamente 2-3 dias, enquanto que espermatozóides diluídos com extensores de longo prazo podem preservar a capacidade de fertilização por até 5-6 dias. Após a inseminação, a capacidade de fertilização dura por aproximadamente 12-24 horas. A maioria das porcas é inseminada duas vezes durante no calor com intervalo de aproximadamente 24 horas. Com um sistema mais flexível provendo um tempo de armazenamento mais longo antes da inseminação (por exemplo, uma semana) e/ou armazenamento e liberação prolongados dos espermatozóides após a inseminação (por exemplo, mais de 2 4 horas), a indústria da criação apresentaria uma produção e distribuição mais eficientes, e os criadores teriam menor necessidade de precisão no tempo de inseminação em relação à ovulação. Na criação de cavalos, o criador é principalmente dependente de espermatozóide fresco devido à falta de técnicas de preservação aplicáveis em espermatozóide de eqüinos. Este é um grande problema na criação de cavalos e na industria de melhoramento de cavalos uma vez que o garanhão preferido para uma égua de linhagem freqüentemente está localizado em um país diferente, requerendo um tempo de transporte longo. Adicionalmente, devido à falta de métodos de preservação adequados para espermatozóide de eqüinos, a AI de espermatozóide de cavalo fresco deve ser realizada em 24 horas após a coleta dos espermatozóides. A criação de cavalos é, desta forma, submetida a uma pressão de tempo indesejada a qual freqüentemente resulta em qualidade reduzida do esperma ou impregnação reduzida devida à inseminação incorreta no que diz respeito à ovulação.

Desta forma, existe uma necessidade por métodos de preservação que assegurem tanto uma vida de prateleira mais longa no que diz respeito à necessidade de tempo de transporte para a entrega, quanto a uma vida de prateleira mais longa após a inseminação. Um método de preservação aplicável para sêmen de eqüino seria de grande valor econômico e prático, e possivelmente revolucionaria a indústria de criação de cavalos. Um sistema de preservação de espermatozóide que

produza viabilidade suficiente durante o armazenamento, antes e após a inseminação, seria benéfico para a indústria de criação em geral. Um sistema de preservação mais flexível tornaria mais fácil o trabalho de criação para todas as espécies animais e resultaria em um aumento no sucesso da impregnação. Um sistema em que o criador seja menos dependente de alcançar o ponto de inseminação no tempo mais preferido no que diz respeito à ovulação, prove uma maior flexibilidade.

De maneira a estender a capacidade de fertilização de

espermatozóides ejaculados, foram investigados vários métodos de preservação incluindo criopreservação e preservação em líquido.

Vários estudos de armazenamento de espermatozóide em cápsulas foram publicados. Estes estudos utilizaram

métodos de encapsulamento que resultam em uma partícula em que os espermatozóides são colocados em um núcleo líquido circundado por uma membrana semi-permeável.

Nebel et al. (1985), "Microencapsulation of bovine spermatozoa", J. Anim. Sei. 1985 60(6): 1631-39, descreve um método para o encapsulamento de espermatozóide bovino em cápsulas feitas de alginato em combinação com polilisina. Este método é baseado em um método previamente publicado de Lim e Sun (1980), wMicroencapsulated islets as bioartificial endocrine pancreas", Science 1980 210(4472):908-10, que estavam trabalhando com a produção de insulina encapsulada a partir do encapsulamento de células de Langerhan. Nebel et al. (1985), reportaram resultados para armazenamento a 37SC e 335 inseminações, e os resultados para espermatozóide encapsulado foram comparados com amostras de controle não encapsuladas. Nenhuma diferença importante entre as amostras encapsuladas e as de controle foi reportada neste estudo. Outros estudos publicados também demonstraram que espermatozóides podem ser encapsulados em cápsulas com métodos similares, e manter sua funcionalidade in vivo (Munkittrick et al. (1992) "Accessory sperm numbers for cattle inseminated with protamine sulfate microcapsules", J. Dairy Sci., 75(3):725- 31 (Bovine), Vishwanath et al. (1997) wSeleeted times of insemination with microencapsulated bovine spermatozoa affect pregnancy rates of synehronized heifers", Theriogenology, 48:369-76 (Bovine) e Maxwell et al. (1996) "Survival and fertility of micro-encapsulated ram spermatozoa stored at 5aC", Reprod. Dom. Anim., 31:665- 73 (Sheep) ) . Munkittrick et al. (1992) e Vishwanath et al. (1997) reportaram, entretanto, que espermatozóides encapsulados não são tão eficientes quanto espermatozóides não tratados inseminados ao mesmo tempo. Isto foi explicado pelo fato dos espermatozóides encapsulados necessitarem algum tempo para serem liberados das cápsulas antes que a fertilização possa ocorrer.

Conte et al. (1998), na patente EP 0922 451 Bl concedida à Universita di Pavia e à Universita Degli Studi Di Milano e Torre et al. (2002), nBoar semen controlled delivery system: storage and in vitro spermatozoa release", J. Contol. Release, 85:83-89, desenvolveram um método alternativo para o encapsulamento de espermatozóide de varrão. Neste método, os espermatozóides são adicionados a uma solução contendo cálcio ou bário, e esta suspensão é gotejada em uma solução contendo alginato. Uma cápsula de alginato de cálcio ou bário é formada espontaneamente em torno da gota conforme esta atinge a solução de alginato. Este método é dito como sendo mais suave às células em comparação com o método descrito por Nebel et al. (1985). Uma outra vantagem é que este método implica em uma diluição muito pequena da solução de espermatozóide, o que é dito ser benéfico para a viabilidade das células.

Faustini et al. (2004), "Boar spermatozoa encapsulated in barium alginate membranes: a microdensitometric evaluation of some enzymatic activities during storage at 182C", Theriogenology, 61(1):173-184, reportam uma fração significativamente maior de espermatozóides com acrossomos intactos, e menos perda de enzimas dos espermatozóides armazenados encapsulados com este método em comparação com espermatozóides não tratados armazenados sob as mesmas condições.

Em um artigo recente Weber et al (2006), "Design of high-throughput-compatible protocols for microencapsula- tion, cryopreservation and release of bovine spermatozoa", Journ. Biotechnol., 123:155-163, também descrevem um novo sistema para o encapsulamento de espermatozóide bovino. Este sistema é projetado para fabricação de alto rendimento de espermatozóide encapsulado utilizando cápsulas de Ca- alginato ou sulfato de celulose/cloreto de poli- dialildimetilamônio (pDADMAC).

Finalmente, Chou et al., na patente US 6.596.310 Bl (2003) descrevem um método de inseminação artificial por liberação regulada no tempo de esperma a partir de cápsulas ou pérolas sólidas, em que o esperma é mantido em um estágio não capacitado devido à utilização de uma fonte de energia que não suporta capacitação.

Sumário da Invenção

A presente invenção se baseia na descoberta surpreendente de que a incorporação de espermatozóide em matrizes biopoliméricas, em que a matriz do biopolímero consiste em alginato rico em ácido gulurônico, resulta em espermatozóides com características de preservação superiores em relação à vida de prateleira, viabilidade e fertilização. As partículas de biopolímero e seus espermatozóides podem ser, desta forma, utilizados em inseminação artificial de animais.

Uma vantagem não limitante do presente sistema biopolimérico de preservação de espermatozóide é que provê benefícios por conferir capacidade de fertilização aos espermatozóides por um período de tempo mais longo após a inseminação, e, desta forma, torna o tempo de inseminação em relação à ovulação menos crítico.

As partículas de biopolímero de acordo com a presente invenção podem ser utilizadas em criação e produção de animais na agroindústria. As partículas de biopolímero são assim utilizadas quando o objetivo é prover animais com características especificamente desejáveis. As partículas de biopolímero são também utilizáveis quando o objetivo é produzir animais em geral, por exemplo, para a produção de gado de corte.

De acordo com a presente invenção, as partículas de biopolímero podem ser utilizadas diretamente e inseminadas como tal no animal receptor se a partícula de biopolímero, tal como partículas de alginato, se dissolver sob condições fisiológicas no interior do animal receptor (isto é, no interior do útero ou cerviz). As partículas de biopolímero de acordo com a presente invenção provêem, desta forma, uma liberação controlada do espermatozóide. O espermatozóide pode ser também dissolvido a partir da partícula de biopolímero antes da inseminação do espermatozóide.

Conforme discutido acima, o estado da técnica sugere principalmente o encapsulamento de espermatozóides em cápsulas biopoliméricas onde os espermatozóides são contidos em um núcleo líquido de uma cápsula biopolimérica. Apenas uma referência (Chou et ai. , patente US 6.596.310 Bl) menciona a possibilidade de incorporação de espermatozóides em uma matriz polimérica sólida, embora io nenhum exemplo seja mostrado das pérolas sólidas descritas.

Os presentes inventores, por outro lado, encontraram uma abordagem diferente para imobilizar espermatozóides. De acordo com a presente invenção, os espermatozóides são incorporados no interior de uma rede de gel sólido feita de géis de alginato, onde o alginato utilizado é rico em ácido gulurônico. Os presentes inventores descobriram que a imobilização dentro de uma rede de gel sólido apresenta várias vantagens em comparação com o encapsulamento em cápsulas e pérolas descrito no estado da técnica. Sem se prender a uma teoria específica, assume-se que

pela utilização das partículas de biopolímero e métodos de acordo com a presente invenção, a incorporação resulta em uma imobilização, por exemplo, os movimentos naturais dos espermatozóides são restritos devido aos impedimentos da rede em gel. Uma limitação física do movimento devida a altas concentrações de células e à presença de polímeros de alta viscosidade pode ser um dos fatores que influenciam na sobrevivência e manutenção da funcionalidade dos espermatozóides na cauda do epidídimo (Watson 1993). Os espermatozóides são armazenados por longos períodos de tempo (mais de uma semana) na cauda do epidídimo (Watson 1993) . A utilização de alginato rico em ácido gulurônico torna possível o provimento de partículas de biopolímero compreendendo espermatozóide incorporado que são utilizáveis na prática como um sistema de conservação e que podem ser utilizados em inseminação artificial, por exemplo, na criação de animais.

Desta forma, de acordo com um aspecto, a invenção prove partículas de biopolímero para a preservação de espermatozóide, onde os espermatozóides são incorporados em uma rede de gel de biopolímero, e onde a partícula de biopolímero incorporando os espermatozóides compreende alginato rico em ácido gulurônico.

De acordo com um outro aspecto da presente invenção, o biopolímero que incorpora os espermatozóides compreende alginato de cálcio.

De acordo com um outro aspecto, o dito biopolímero compreende alginato com baixa viscosidade.

De acordo com ainda um outro aspecto da invenção, a concentração de alginato nas partículas de biopolímero da invenção é de pelo menos 0,1%.

De acordo com ainda um outro aspecto da invenção, a concentração de alginato nas partículas de biopolímero da invenção fica entre pelo menos 0,1% e 6% de alginato. De acordo com ainda um outro aspecto da invenção, a

concentração de alginato nas partículas de biopolímero da invenção é de pelo menos 1%.

Além disto, de acordo com um aspecto da invenção, a concentração de espermatozóide nas partículas de biopolímero é de pelo menos 0,1 χ IO6 espermatozóides/ml, tal como, por exemplo, pelo menos 100 χ IO6 espermatozóides/ml, tal como até pelo menos 2,5 χ IO9 espermatozóides/ml.

De acordo com ainda um outro aspecto, as partículas de acordo com a presente invenção são armazenadas em uma solução, por exemplo, onde a proporção solução de armazenamento:partícula de biopolímero é de pelo menos entre 1:1 e 1:100.

De acordo com ainda um outro aspecto, os espermatozóides podem ser co-incorporados com compostos ou agentes que são benéficos no que diz respeito à capacidade de fertilização e/ou saúde animal como, por exemplo, um ou mais compostos ou agentes selecionados do grupo não limitante consistindo em extensores, crioprotetores, antibióticos, anticorpos, antioxidantes, proteínas e hormônios.

De acordo com um outro aspecto da invenção, os espermatozóides são co-incorporados com um ou mais antioxidantes selecionados do grupo consistindo em piruvato, 2 , 2 , 6,6-tetrametilpiperidin-l-oxi, 4-hidroxi- 2,2,6, 6-tetra-metil-piperidin-l-oxi, superóxido-dismutase, catalase, glutationperoxidase, hodroxitolueno butilado, hidroxianisol butilado.

De acordo com um aspecto, as partículas de biopolímero são revestidas. O revestimento pode ser selecionado do grupo não limitante consistindo em polilisina, quitosana, sulfato de celulose, hidroxipropil- metilcelulose e cloreto de polidialilmetilamônio.

As partículas de biopolímero de acordo com a presente invenção compreendem espermatozóides coletados de um animal selecionado do grupo não limitante consistindo em suíno, gado, cavalos, ovelhas, cabras, coelhos, aves, animais de estimação como cães de raça, animais aquáticos e espécies animais em extinção, preferivelmente suínos, gado, animais para peles e cavalos. A partícula de biopolímero da presente invenção pode, desta forma, ser utilizada na obtenção de prenhez em um animal fêmea incidente por métodos comuns de fertilização artificial como AI, IVF e ICSI.

De acordo com um aspecto da invenção, os

espermatozóides utilizados para formar a dita partícula estão contidos em fluido seminal.

Opcionalmente, a partícula de biopolímero pode ser adicionalmente tratada por desidratação, criopreservação ou Iiofilização.

A invenção provê também um processo para a preparação das partículas de acordo com a invenção, onde uma mistura de alginato rico em ácido gulurônico e espermatozóides é adicionada gota-a-gota a uma solução gelificante. A solução gelificante compreende de acordo com a um aspecto da invenção um ou mais dos seguintes íons selecionados do grupo não limitante consistindo em cálcio, sódio, bário e magnésio, preferivelmente, íons cálcio e sódio.

Além disto, as partículas de biopolímero podem ser opcionalmente formadas diretamente em um recipiente de sêmen.

De acordo com um aspecto do processo da invenção, as partículas são adicionalmente tratadas por desidratação, criopreservação ou Iiofilização. A presente invenção provê também o uso das partículas de biopolímero de acordo com a presente invenção na criação de animais, tais como suínos, gado, cavalos, ovelhas, cabras, coelhos, aves, animais de estimação como cães de raça, animais para pelo, animais aquáticos e espécies animais em extinção. De acordo com um aspecto da invenção, as partículas de biopolímero são utilizadas na criação de suínos, gado ou cavalos. De acordo com um aspecto, as partículas são inseminadas diretamente. De acordo com ainda um outro aspecto, as partículas são dissolvidas antes da inseminação. De acordo com ainda um outro aspecto, as partículas da invenção são utilizadas juntamente espermatozóides livres imobilizados.

Finalmente, a presente invenção provê um processo para a fertilização de um animal, onde espermatozóides preservados nas partículas de acordo com a presente invenção, são introduzidos em um animal fêmea receptor.

Breve descrição âos desenhos A Figura 1 mostra o armazenamento in vitro de

espermatozóides de bovino (Placa A) e de varrão (Placa B) a temperatura ambiente (bovino 2O2C, varrão 18aC). Os valores de mobilidade são fornecidos como funções do tempo de armazenamento em amostras de referência e em amostras com espermatozóides imobilizados.

Figura 2: mostra o armazenamento in vitro de espermatozóides bovinos (Placa A) e de varrão (Placa B) a 37sC. Os valores de mobilidade são fornecidos como funções do tempo de armazenamento em amostras de referência e em amostras com espermatozóides imobilizados. Figura 3: mostra o armazenamento in vitro de espermatozóide de varrão a temperatura ambiente (18fiC). Os valores de mobilidade são fornecidos como funções do tempo de armazenamento em amostras de referência e em amostras com espermatozóides imobilizados. Diferentes quantidades de meio de armazenamento em relação à quantidade de pérolas foram utilizadas nos experimentos de armazenamento, como indicado no nome das séries. Os espermatozóides são imobilizados em pérolas com um diâmetro de 1 mm a uma concentração de 1 χ IO9 espermatozóides/ml.

Figura 4: armazenamento in vitro de espermatozóides de varrão a temperatura ambiente (182C). Os valores de mobilidade são fornecidos como funções do tempo de armazenamento em amostras com espermatozóides imobilizados. Pérolas com diferentes concentrações de espermatozóides imobilizados são utilizadas nos experimentos de armazenamento, como indicado no nome das séries. Os espermatozóides são imobilizados em pérolas com um diâmetro de 3 mm.

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Descrição detalhada da invenção

Conforme previamente descrito, o foco principal da pesquisa foi previamente direcionado para o encapsulamento de espermatozóide de maneira a facilitar a fertilização in vitro e a inseminação artificial. Os presentes inventores assumiram uma abordagem fundamentalmente diferente para a imobilização de espermatozóide, onde o espermatozóide é incorporado em uma rede de gel ou de biopolímero dentro de uma partícula gel sólida e onde a rede de biopolímero consiste em alginato rico em ácido gulurônico. Esta abordagem é fundamentalmente diferente do encapsulamento de espermatozóide previamente descrito no estado da técnica, onde o espermatozóide é contido em uma cápsula com um núcleo liquido onde o espermatozóide pode se movimentar ao redor como em seu meio natural. As partículas de biopolímero que incorporam o espermatozóide de acordo com a presente invenção não são dependentes da utilização de soluções assegurando que o espermatozóide seja mantido em um estado não capacitado. 0 termo "incorporado" ou "incorporando", conforme

utilizado aqui deve ser entendido como espermatozóide imobilizado resultando no fato dos espermatozóides serem impedidos de sua possibilidade natural de movimento. O grau de imobilização irá variar dependendo das características da partícula de biopolímero, tais como, por exemplo, resistência mecânica, e tipo de polímero utilizado. Entretanto, deve ser entendido que os

espermatozóides incorporados nas partículas de biopolímero de acordo com a presente invenção são impedidos de sua possibilidade natural de movimento que teriam se fossem armazenados em líquido, tal como em um núcleo líquido de uma cápsula.

0 termo "partícula de biopolímero", conforme utilizado aqui, significa uma partícula que quando compreendendo espermatozóides, provê uma possibilidade reduzida de movimento. As partículas de biopolímero de acordo com a presente invenção são feitas de um material que forma uma rede consistindo em um gel de alginato rico em ácido gulurônico. A função da partícula de biopolímero em relação à preservação de espermatozóide é independente do formato tridimensional da partícula de biopolímero de acordo com a presente invenção. Desta forma, as partículas de biopolímero de acordo com a presente invenção podem apresentar diferentes formatos tais como, por exemplo, um formato esférico ou cilíndrico.

Alginato é um polímero que consiste em ácido gulurônico (G) e ácido manurônico (M) . Alginato é um constituinte comum da parede celular em todas as espécies de algas marinhas marrons (Phaeophyceae) e é comumente extraído por solução alcalina. As proporções de ácido manurônico para ácido gulurônico (M/G) em alginato variam amplamente dependendo dos alginófitos específicos (algas marinhas produtoras de alginato) e através de várias estações.

0 alginato é também sintetizado por bactérias

Pseudomonas e Azobacter (Svanem et al., (2001), The Journal of Biological Chemistry, vol. 276:34, 31542-31550, Jain et al., (2003), Molecular Microbiology, 47(4), 1123-1133, Scott e Quatrano (1982), Applied and Environmental Microbiology, 44:3, 754-756).

Os alginatos são amplamente utilizados, por exemplo, na indústria alimentícia, por exemplo, como estabilizantes e para controle da viscosidade, na indústria farmacêutica e cosmética como, por exemplo, desintegrante. Para os vários propósitos, estão disponíveis tanto alginatos ricos em ácido gulurônico quanto alginatos ricos em ácido manurônico (Mancini et al. , (1999), Journal of Food Engineering 39, 369-378) e vários métodos para a produção de alginatos ricos em ácido gulurônico são conhecidos, (cf. documento WO 86/03781, patente US 4.990.601, US 5.639.467). O termo "alginato rico em ácido gulurônico" ou "alginato G-rico", conforme utilizados aqui, significam alginato compreendendo quantidades de ácido gulurônico maiores que de ácido manurônico nas cadeias poliméricas compreendendo o polissacarideo. Exemplos de do

entendimento do termo "G-rico", como comumente utilizado pelos especialistas na técnica, são evidentes a partir do estado da técnica nos dois parágrafos precedentes.

Géis de alginato são formados devido às interações entre íons divalentes tais como Ca2+ e estruturas em bloco do ácido gulurônico na cadeia polimérica do alginato. Por esta razão, a formação de géis de alginato pode ser obtida em condições muito brandas, e é adequada para a imobilização de uma célula. Géis de alginato têm sido, desta forma, amplamente utilizados para a imobilização de vários tipos de células. Entretanto, a imobilização em alginato é mais comumente utilizada como ponto de partida para a formação posterior de vários tipos de cápsulas com um núcleo líquido. Doravante quando da referência a alginato, gel de

alginato, rede de alginato ou partícula de biopolímero de acordo com a presente invenção, deve ser entendido que o dito alginato, gel de alginato, partícula de alginato ou rede biopolimérica ou partícula de biopolímero de acordo com a presente invenção é rico em ácido gulurônico.

Exemplos não limitantes de tipos de alginato adequados são FMC LF 10/40, FMC LF 10/60 e FMC LF 20/60 disponibilizados pela FMC Biopolymer AS, Drammen, Noruega ou A2 03 3 da Sigma, Oslo, Noruega. O termo "vida de prateleira", conforme utilizado aqui, significa o tempo que o espermatozóide mantém a capacidade de fertilização, em relação ao armazenamento tanto in vitro antes da inseminação quanto in vivo após a inseminação no animal receptor. A vida de prateleira especifica de espermatozóide de diferentes origens pode variar. Todavia, o presente sistema de preservação, onde o espermatozóide é incorporado em partículas de biopolímero de acordo com a presente invenção, prove uma vida de prateleira mais longa após a inseminação em comparação com espermatozóides que são inseminados após métodos de armazenamento convencionais após a coleta do sêmen. De acordo com um exemplo da invenção, espermatozóides de suíno mantêm excelente capacidade de fertilização por mais de 12 horas após a inseminação, mais preferivelmente mais de 24 horas após a inseminação. De acordo com ainda um outro exemplo da invenção, espermatozóide de touro mantém excelente capacidade de fertilização por mais de 12 horas após a inseminação, mais pref erivelmente mais de 24 horas após a inseminação.

O termo "criação", conforme utilizado aqui, significa qualquer método para se obter prenhez em um animal fêmea. Uma lista não limitante de tais métodos inclui IVF, inseminação artificial e ICSI. Além disto, a criação engloba tanto criação no que diz respeito ao provimento de animais apresentando características especificamente desejáveis quanto no que diz respeito à produção comercial.

O termo "espermatozóide", conforme utilizado aqui, inclui espermatozóide como tal e também espermatozóide contido em fluido seminal, isto é, o sêmen pode ser utilizado diretamente quando da formação dos biopolimeros de acordo com a presente invenção. Entretanto, também espermatozóide isolado do fluido seminal, opcionalmente contido em outras soluções de armazenamento adequadas, pode ser também utilizado para a formação das partículas de biopolímero de acordo com a presente invenção.

0 termo "recipiente de sêmen", conforme utilizado aqui, inclui todos os tipos de embalagem adequados para a manutenção e armazenamento de espermatozóide. Os métodos de encapsulamento prévios descritos no

estado da técnica e conforme discutidos acima, são laboriosos e os procedimentos de imobilização contêm várias etapas. Entretanto, a preparação das partículas de biopolímero de acordo com a presente invenção pode ser realizada em um procedimento de uma etapa. Mais

exatamente, partículas de alginato de cálcio contendo espermatozóide são facilmente formadas com um mínimo de estresse fisiológico e químico das células imobilizadas. As partículas de alginato podem ser obtidas em vários tamanhos e formatos, e com vários tipos de alginato, concentrações de alginato e concentrações de espermatozóides imobilizados.

Para o propósito de incorporar espermatozóides de acordo com a presente invenção, a utilização de alginato como material biopolimérico é particularmente adequada devido ao fato de que i) pode-se formar géis em condições brandas, ii) o alginato não é tóxico em relação tanto aos espermatozóides quanto ao animal receptor, e iii) o alginato se dissolve sob condições fisiológicas e, desta forma, é capaz de liberar os espermatozóides no útero ou cerviz.

De acordo com um aspecto da presente invenção, partículas de alginato são preparadas por adição de uma solução compreendendo alginato e espermatozóide gota-a-gota a uma solução gelificante resultando na formação de pérolas de alginato com espermatozóides incorporados.

A preparação de pérolas de alginato é conhecida do especialista na técnica, por exemplo, como descrito em Smidsrtfd, 0. e Skják-Brask, G. (1990) "Alginate as immobilization matrix for cells", Trends in Biotechnology 8, 71-78 and US 6,497,902.

Várias soluções de gel podem ser aplicadas para formar partículas de biopolímero tais como pérolas de alginato. As várias soluções que são adequadas para a formação de várias partículas de biopolímero estão dentro do conhecimento de um especialista na técnica. De acordo com a presente invenção, íons bivalentes (também chamados aqui de íons gelificantes) tais como cálcio e bário podem ser utilizados para formar as partículas de alginato, por exemplo, para se obter a gelificação do alginato. O alginato forma géis na presença de vários íons bivalentes e íons multivalentes. 0 uso de cálcio resulta em uma gelificação mais rápida e em partículas relativamente resistentes. Por outro lado, o uso de íons bário resulta em partículas ainda mais resistentes que são mais estáveis sob condições fisiológicas. Deve ser entendido que o tipo e quantidade de íon gelificante a ser utilizado para formar as partículas de biopolímero de acordo com a presente invenção podem variar, inter alia, de acordo com a resistência desejada do gel formado, com o tipo e concentração do alginato utilizado, com o teor de ácido gulurônico e com o comprimento do bloco G do alginato, com o tipo e fonte de espermatozóides utilizados, tipo de agentes adicionais a serem incorporados nas partículas (tais como antibióticos, extensores, antioxidantes, etc.)/ e que tais modificações estão dentro do escopo da presente invenção. Com base no estado da técnica e orientação do presente relatório, o especialista na técnica pode identificar e determinar, sem a necessidade de trabalho excessivo, vários componentes que podem ser co-incorporados com os espermatozóides nas partículas de biopolímero de acordo com a presente invenção.

De acordo com um aspecto da presente invenção, íons cálcio e íons sódio são utilizados para formar as partículas de biopolímero. Desta forma, variando-se a concentração de alginato e grau de ligação cruzada, pode-se obter partículas com várias características de liberação de espermatozóide e que, por exemplo, sejam adaptadas para espécies específicas de animais ou condições específicas de ovulação em vários animais.

Adicionalmente, a concentração do alginato influencia as características mecânicas das partículas de biopolímero, e, desta forma, também as características de solubilidade das partículas. A concentração de alginato pode, desta forma, variar dependendo das características de solubilidade necessárias em cada caso dependendo, por exemplo, do animal receptor. 0 especialista na técnica, com base em seu conhecimento geral e com base na orientação fornecida aqui e sem trabalho excessivo, irá determinar as várias concentrações aplicáveis do alginato G-rico a ser utilizado quando da preparação das partículas de biopolímero de acordo com a presente invenção. De acordo com um aspecto da invenção, a concentração de alginato nas partículas de biopolímero de acordo com a presente invenção fica entre pelo menos 0,1 e 6%.

A concentração de espermatozóides incorporados nas partículas de biopolímero de acordo com a presente invenção pode variar dependendo, por exemplo, do tipo/fonte de espermatozóide, criação, animal receptor, técnica ou sistema de inseminação, técnicas ou sistemas de fertilização, presença de outros agentes incluídos nas partículas (antibióticos, antioxidantes, extensores, proteínas, etc.). Em princípio não existe um limite inferior para a concentração de espermatozóides, e a concentração pode variar dependendo, por exemplo, do método de fertilização, da origem dos espermatozóides, do animal receptor, das características de solubilidade das partículas de biopolímero, etc. Com a orientação do presente relatório e conhecimento geral, o especialista na técnica pode, sem trabalho de experimentação excessivo, determinar a concentração de espermatozóides adequada a ser utilizada em cada caso, com base no método de fertilização desejado, origem do espermatozóide, animal receptor, etc. Deve ser reconhecido que quantidades mais baixas de espermatozóides podem ser utilizadas quando é utilizado ICSI como método de fertilização desejado em comparação com, por exemplo, inseminação artificial. De acordo com um aspecto da invenção, a concentração de espermatozóides é, desta forma, de pelo menos 0,1 χ IO6 espermatozóides/ml.

As descobertas da presente invenção mostram que para alguns animais, a sobrevivência do espermatozóide é altamente aumentada com concentrações crescentes de espermatozóide. Desta forma, de acordo com um exemplo da presente invenção, pelo menos 2,5 χ IO9 espermatozóides de suíno/ml são incorporados na partícula de biopolímero (cf. figura 4) . Entretanto, 100 χ IO6 espermatozóides de suíno/ml também resultam em prenhez no animal fêmea. Para espermatozóide de touro, a mesma faixa de concentração que para espermatozóide de suíno é aplicável.

A concentração de espermatozóides nas partículas de biopolímero pode, além disto, ser modificada alterando-se a quantidade de espermatozóide em relação à quantidade de alginato antes da gelificação, ou por concentração ou por diluição da solução de espermatozóide antes da mistura da solução de alginato com a solução contendo espermatozóide. Entretanto, uma vez que a modificação da quantidade de espermatozóide resulta finalmente em uma modificação da concentração de alginato nas partículas obtidas, a concentração de alginato na solução de alginato de partida deve ser ajustada se a concentração do alginato nas partículas de biopolímero deve ser mantida. Devido à alta viscosidade do alginato em solução, pode ser difícil na prática se utilizar solução de alginato com mais de 4-6% de alginato. Desta forma, de acordo com um aspecto da invenção, as partículas de biopolímero são compostas de alginato com baixa viscosidade. Adicionalmente, os espermatozóides incorporados nas partículas de biopolímero de acordo com a presente invenção são de alguma forma isolados do ambiente circunvizinho, e não são liberados até que a rede em gel de alginato de cálcio seja dissolvida. Além disto, a rede em gel de alginato de cálcio se dissolve lentamente sob condições fisiológicas, o que provoca uma liberação lenta dos espermatozóides da matriz de imobilização. Devido a este efeito, espermatozóides com capacidade de fertilização podem estar presentes por períodos de tempo mais longos. As taxas de solubilização podem ser controladas utilizando- se diferentes tipos de revestimento na matriz de imobilização. Vários revestimentos úteis são conhecidos, incluindo, mas não se limitando a, polilisina, quitosana, sulfato de celulose, hidroxipropilmetilcelulose ou cloreto de polidialildimetilamônio.

De maneira a aumentar ainda mais a qualidade do espermatozóide, o espermatozóide pode ser co-incorporado com várias soluções de importância para a sobrevivência e vitalidade do espermatozóide. De acordo com uma realização da invenção, um extensor é incluído na partícula de biopolímero da presente invenção.

Extensores de espermatozóide são comumente utilizados para vários propósitos:

— para aumentar o volume,

— para padronizar a quantidade de esperma na dose de AI,

— para conferir uma capacidade de tampão,

— para prover um meio fisiológico no que diz respeito à osmolaridade, — para suportar a nutrição das células de esperma,

— para controlar contaminação microbiológica (antibióticos), ou no caso de criopreservação:

— para proteger as células de esperma de lesões provocadas pelo congelamento e descongelamento.

É do conhecimento do especialista na técnica selecionar um extensor adequado que possa ser utilizado nas partículas de biopolímero de acordo com a presente invenção, com base, por exemplo, no tipo de espermatozóide (origem), na espécie, no método de preservação, na temperatura de armazenamento, no método de inseminação, nas exigências zoossanitárias, e na legislação internacional. Extensores para leite e TRIS são apenas uns poucos exemplos não limitantes de extensores entre um enorme número de extensores de espermatozóide aplicáveis comercialmente disponíveis. Um outro extensor útil é o extensor reportado em Aalbers, J.G., Rademaker, J.H.M., Grooten, H.J.G. e Johnson, L.A., 1983: "Fecundity of boar semen stored in BTS5 Kiev, Zorlesco and Modena extenders under field conditions", J. Anim. Sei. 75 (Supl. 1), 314-315 e em Aalbers J.G., Johnson, L.A., Rademaker,J.H.M. e Grooten H.J.G. , 1984: "Use of boar spermatozoa for AI: fertility and morphology of semen diluted in BTS and used for insemination within 24 hrs or 25 to 48 hrs after collection", Proc. IOth Int. Congr. Anim. Reprod. and Artif. Insemin. Urbana IL, Vol. II, na 180, pgs. 1-3, comumente conhecido como BTS. BTS é disponibilizado comercialmente por Minitüb i Tyskland (Minitub Abfull - und Labortechnik GmbH & Co.KG, Hauptstrasse 41, DE-84184 Tiefenbach, Alemanha. Ainda um outro extensor útil é o extensor Tri X-Cell™ da IMV (Instrument de Medecine Veterinaire, 10, rue Georges Clemenceau, B.P. 81, FR-61302 L1AIGLECedex, França).

Os vários extensores diferem em composição, pH, capacidade de tamponamento, osmolaridade e antibióticos. Muitos estão publicados enquanto outros são segredos comerciais. Os extensores mais simples são compostos apenas de diferentes soluções de açúcar, como, por exemplo, lactose e glicose. Com base no conhecimento geral do especialista na

técnica no campo da preservação de esperma, será entendido que vários extensores podem ser utilizados de acordo com a presente invenção. 0 tipo de extensor utilizado de acordo com a presente invenção pode variar dependendo da origem do esperma, do tipo de polímero utilizado, do método de preservação, da temperatura de armazenamento, etc. É do conhecimento dos especialistas na técnica determinar e escolher o tipo e quantidade adequada de extensor utilizado sem se afastar do escopo da invenção descrita no relatório e reivindicações anexas.

As partículas de biopolímero de acordo com a presente invenção podem ser formadas em vários tamanhos de acordo com métodos conhecidos no estado da técnica. Qual tamanho é adequado depende de vários fatores, tais como fonte do espermatozóide, tipo e tamanho do dispositivo de fertilização utilizado, tamanho e formato do recipiente de sêmen utilizado, etc. As partículas de biopolímero de acordo com a presente invenção podem ser formadas com um diâmetro adequado para todas as técnicas de inseminação do estado da técnica, de maneira a possibilitar uma manipulação, manuseio, transporte e preservação fáceis.

De acordo com ainda um outro aspecto da invenção, as partículas de biopolímero são formadas no interior de um recipiente, tal como, por exemplo, um tubo de inseminação, resultando em partículas perfeitamente ajustadas ao tamanho do recipiente. Desta forma, no caso da formação das partículas de biopolímero dentro de um recipiente, não é necessária qualquer solução de armazenamento adicional. xo De acordo com um aspecto da invenção, as partículas

de biopolímero compreendem espermatozóide coletado de gado. De acordo com ainda um outro aspecto da invenção, as partículas de biopolímero compreendem espermatozóide coletado de suíno. Embora a presente invenção seja ilustrada por

partículas de alginato compreendendo espermatozóide coletado de gado e suíno, respectivamente, as partículas de biopolímero podem também incorporar espermatozóides de outras espécies animais. Sem limitação, as partículas de biopolímero podem incorporar também espermatozóides coletados de, por exemplo, eqüinos, ovinos, caprinos, coelhos, aves, animais de estimação como cães de raça, animais aquáticos e várias espécies ameaçadas de extinção.

Em adição, não há qualquer indicação que seja de que as presentes partículas de biopolímero possam não ser úteis na preservação de espermatozóide humano e, desta forma, úteis no tratamento de falta de gravidez. Desta forma, deve ser entendido que o termo "animal", conforme utilizado aqui, cobre também seres humanos. Em adição, técnicas de preservação de espermatozóide são amplamente requeridas na indústria de aqüicultura. Desta forma, também espermatozóides originários de animais aquáticos podem ser incorporados nas partículas de biopolímero de acordo com a presente invenção e são, desta forma, também cobertos pelo termo "animal" conforme utilizado aqui.

A imobilização de espermatozóide em uma rede em gel de biopolímero pode ser também utilizada para criar um micro-ambiente que seja benéfico para o armazenamento de espermatozóide, mesmo no interior dos órgãos reprodutivos femininos. Isto pode ser feito com a co-incorporação adicional de soluções que sejam benéficas no que diz respeito ao espermatozóide, ao grau de fertilização, saúde animal, etc. Por exemplo, exemplos não limitantes de substâncias que aumentam a viabilidade durante o armazenamento são antioxidantes ou proteínas, hormônios, etc. Os espermatozóides podem ser também co-incorporados com outros agentes ou compostos que sejam benéficos à luz da capacidade de fertilização ou saúde animal. Tais agentes ou compostos podem ser, por exemplo, antibióticos, tais como, por exemplo, estreptomicina, neomicina, gentamicina, penicilina, lincomicina, espectinomicina, amoxicilina, etc., que podem ser utilizados para controlar ou prevenir doenças venéreas, crioprotetores, anticorpos, hormônios, ou compostos que aumentam a eficiência reprodutiva, por exemplo, tais como os compostos conhecidos da patente US 5.972.592.

Desta forma, de acordo com ainda um outro aspecto da invenção, as partículas de biopolímero compreendem em adição aos espermatozóides, compostos que são benéficos no que diz respeito à capacidade de fertilização ou saúde animal, tais como antioxidantes, antibióticos, anticorpos, hormônios ou agentes amplificadores da eficiência reprodutiva ou combinações destes. De acordo com uma realização preferida da presente invenção, as partículas de biopolímero compreendem antioxidantes, por exemplo, piruvato.

As partículas de biopolímero de acordo com a presente invenção podem ser opcionalmente armazenadas em soluções de armazenamento de espermatozóide bem conhecidas, tais como, por exemplo, extensores de leite, PBS (solução salina de tampão fosfato), BTS, Tri X-Cell™, extensores de EDTA, extensores de Kiev, Modena, MR-A, Androhep, Acromax, Trilady1®, Biladyl®, Bioxcell, Biociphos plus, etc., com ou sem antioxidantes tais como, por exemplo, piruvato, 2,2,6,6-tetrametilpiperidin-l-oxi (comumente abreviado como Tempo), 4-hidroxi-2 ,2,6,6-tetra-metil-piperidin-l-oxi

(Tempol), superóxido-dismutase, catalase, glutation- peroxidase, hidroxitolueno butilado (comumente abreviado como BHT), hidroxianisol butilado (comumente abreviado como BHA) . A escolha da solução de armazenamento não é crítica desde que a solução de armazenamento não contenha compostos que possam afetar negativamente as características das partículas de biopolímero. Por exemplo, no caso de partículas de alginato, a solução de armazenamento não deve conter muito quelante resultando na retirada dos íons bivalentes e, desta forma, a dissolução do gel.

Durante o armazenamento, a proporção de partículas de biopolímero em relação à solução de armazenamento pode variar dependendo do tipo e concentração do alginato G- rico, da fonte de espermatozóide, do método de fertilização utilizado, etc. De acordo com os exemplos da presente invenção, a proporção de solução de armazenamento:partícula de biopolímero é de pelo menos 1:1, tal como, por exemplo, pelo menos 1:2, pelo menos 1:3, pelo menos 1:4, pelo menos 1:5, pelo menos 1:6, pelo menos 1:7, pelo menos 1:8, pelo menos 1:9 ou pelo menos 1:10. Uma proporção de solução de armazenamento:partícula de biopolímero de até pelo menos 1:100 pode ser utilizada de acordo com a presente invenção.

Além disto, as partículas de biopolímero de acordo com a presente invenção podem ser opcionalmente armazenadas tanto à temperatura ambiente, por exemplo, a 18aC ou 202C, à temperatura fisiológica (37SC), quanto em condições resfriadas, por exemplo, 5 aC. Adicionalmente, as

partículas de biopolímero podem ser também tratadas por desidratação, criopreservação ou Iiofilização. As

partículas de biopolímero são então noção de criopreservação descongeladas antes da inseminação. Espermatozóides que são usualmente preservados em

líquido podem ser armazenados por um período de tempo mais longo quando incorporados em uma partícula de biopolímero de acordo com a presente invenção. De acordo com uma outra realização da invenção, as partículas de biopolímero são utilizadas diretamente para inseminar um animal receptor. Opcionalmente, as partículas de biopolímero podem ser dissolvidas para liberar os espermatozóides antes da inseminação. Entretanto, as partículas de biopolímero podem também de acordo com ainda uma outra realização serem utilizadas em conjunto e em combinação com espermatozóides livres.

Embora esta invenção tenha sido descrita em conexão com suas realizações específicas, deve ser entendido que é capaz de modificações adicionais. Este pedido de patente destina-se a cobrir quaisquer variações, usos ou adoções da invenção seguindo, em geral, os princípios da invenção e incluindo qualquer derivação do presente relatório que recaia na prática conhecida e costumeira da técnica à qual a invenção pertence e que possam ser aplicadas às características essenciais descritas acima e de acordo com o escopo das reivindicações anexas.

A descrição precedente dos vários aspectos da presente invenção revela a natureza genérica da invenção e o especialista na técnica irá pela aplicação do conhecimento geral na área de inseminação artificial e tecnologia de criação (incluindo o conteúdo das referências citadas aqui), prontamente modificar e/ou adaptar as presentes partículas de biopolímero e a preparação e as utilizar para várias aplicações, sem experimentação indevida, sem se afastar do conceito geral da presente invenção e escopo das reivindicações anexas. Tais

adaptações ou modificações destinam-se então recaírem no significado de uma faixa de equivalentes das realizações descritas, com base nos ensinamentos e orientação apresentados aqui. Deve ser entendido que a terminologia utilizada aqui tem o propósito de descrição e não de limitação. Desta forma, a terminologia do presente relatório deve ser interpretada pelo especialista na técnica à luz dos ensinamentos e orientações apresentados aqui, em combinação com o conhecimento do especialista na técnica.

Os exemplos não limitantes a seguir ilustram adicionalmente a presente invenção.

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Exemplos

Exemplo 1: Imobilização de espermatozóides em alginato

MATERIAIS E MÉTODOS Materiais

Os seguintes produtos químicos foram utilizados: CaCl2-H2O, K2HPO4, NaH2PO4, NaCl, e ci trato de sódio da Riedel de Haen (Seelze, Alemanha); glicose monohidrato da Norsk Medisinaldepot (Oslo, Noruega); alginato de sódio (PROTANAL LF 10/60) fornecido pela FMC Biopolymer A/S (Drammen, Noruega) .

Fonte de espermatozóide

Espermatozóides bovinos foram coletados nas instalações da Geno em Hallsteingârd em Trodheim, Noruega. Os espermatozóides de varrão foram coletados nas instalações da Norsvin em Hamar, Noruega. Os

espermatozóides bovinos foram diluídos 1+2 em extensor de leite pouco depois da ejaculação. Os espermatozóides de varrão foram diluídos 1+4 em TRI X-CELL™ (IMV Technologies, L'Aigle Cedex, França). Esta diluição nem a escolha a dos tampões de diluição são críticos para o procedimento de imobilização ou para a sobrevivência de longo prazo dos espermatozóides após a imobilização, mas são meramente feitas de maneira a facilitar o armazenamento até que os espermatozóides pudessem ser processados posteriormente. Soluções tampão

Foram utilizados os seguintes meios de cultura. IVT modificado: 3 g l"1 de glicose, 20 g l"1 citrato de sódio, 2,1 g l"1 de NaHCO3, 1,16 g l"1 de NaCl, 3 g l"1 de EDTA, pH 7,35. BTS (com 3 mM de Ca): 37 g l"1 de glicose, 0,44 g l"1 de CaCl2, 4,5 g l"1 de citrato de sódio, 1,25 g l"1 de NaHCO3, 1,25 g l"1 de EDTA, 0,74 g l"1 de KCl, 1 g l"1 de neomicina, pH 7,2. Solução de gelificação de pérolas: 7,3 g l"1 de CaCl2, 5,96 g l"1 de NaCl. Extensor de leite: 110 g l"1 de leite desnatado Molico, 120 ml l"1 gema de ovo, 6,25 g 1_1 de estreptomicina, 1,5 mill I.E l"1 de penicilina.

Imobilização de célula

As células de espermatozóide foram colhidas nas instalações da Geno e da Norsvin e diluídas como descrito acima. Antes da !mobilização, os espermatozóides foram concentrados por centrifugação (80o g, 20 minutos, 20aC) . A quantidade de sobrenadante a ser removida em cada batelada depende da concentração desejada de espermatozóide nas pérolas acabadas. Após a remoção do excesso de sobrenadante, o pélete celular é gentilmente re-suspenso por agitação branda. A suspensão celular é então misturada gentilmente com uma solução estéril de alginato de sódio a 6% (p/v) . A solução de alginato é adicionada em proporção volumétrica de 2 partes de suspensão celular para 1 parte de solução de alginato (um grande número de diferentes combinações de concentração de alginato, proporções volumétricas de solução de alginato e suspensão celular foi investigado. Os valores e procedimentos típicos são fornecidos aqui). A mistura de alginato e células é adicionada gota-a- gota na solução de gelificação de pérolas (ver acima) . De maneira a produzir pérolas com um diâmetro de 3 mm, a solução é adicionada através de ponteiras de seringa com um diâmetro interno de 0,5 mm. De maneira a produzir pérolas com diâmetros menores (menos de 1 mm de diâmetro), é utilizado um sistema baseado na utilização de fluxo de ar de maneira a limitar o tamanho da gotícula que se forma nas agulhas. É utilizado cloreto de sódio na solução de gelificação de maneira a assegurar uma concentração de polissacarídeo homogênea por todas as pérolas (Smidsr0d, O. e Skják-Brask, G. (1990) "Alginate as immobilization matrix for cells", Trends in Biotechnology 8, 71-78). De maneira a limitar a quantidade de Ca2+ nas pérolas, as pérolas são postas sob agitação não mais do que durante 8 minutos na solução de gelificação de pérolas. 0 procedimento de imobilização total é realizado à temperatura ambiente.

Armazenamento dos espermatozóides imobilizados in vitro à temperatura ambiente

Um objetivo do procedimento de imobilização é o de aumentar o tempo em que os espermatozóides podem ser armazenados antes da inseminação. Desta forma, foram conduzidos experimentos nos quais os espermatozóides são armazenados in vitro a temperatura ambiente em soluções tampão. Amostras de referência com espermatozóides não imobilizados do mesmo ejaculado são incluídas em todos os experimentos. A qualidade do espermatozóide é avaliada por determinações da mobilidade em diferentes pontos no tempo durante o período de armazenamento. A cada ponto no tempo, as amostras são analisadas e a mobilidade do espermatozóide imobilizado e a mobilidade das amostras de controle são registradas. Um número de combinações de volumes de armazenamento e densidades celulares foi investigado de maneira a se otimizar o sistema experimental (dados não mostrados). As condições experimentais descritas acima são típicas, e foram utilizadas nos experimentos reportados abaixo.

Nos experimentos com espermatozóide bovino, aproximadamente 2 ml de pérolas com espermatozóide imobilizado foram transferidos para tubos de centrífuga de 13 ml e foi adicionada uma solução de extensor de leite a uma proporção volumétrica de 1+2. Amostras de controle com espermatozóides suspensos livremente foram obtidas com uma diluição total de 1+15 em tubos de centrífuga de 13 ml (um volume de aproximadamente 6 ml é utilizado em todos os tubos). Esta diluição mostrou-se em experimentos prévios como sendo próxima à ideal para a sustentação da mobilidade durante o armazenamento nas amostras de referência (dados não mostrados).

Em experimentos com espermatozóide de varrão, os espermatozóides foram armazenados a 18 2C em BTS (com 3 mM de Ca), Nos experimentos reportados abaixo, as amostras de controle foram diluídas 1+10 em todos os experimentos, dando um volume total de 2 0 em tubos de centrífuga de 50 ml (esta diluição mostrou-se previamente como sendo ideal para a sustentação da mobilidade durante os armazenamentos) . As pérolas contendo espermatozóides imobilizados foram transferidas para tubos de centrífuga de 50 ml e foi adicionado BTS (com 3 mM de CaCl2) em uma proporção de 1 + 3. As pérolas contendo espermatozóides imobilizados foram enxaguadas com solução de armazenamento antes de serem transferidas para a solução de armazenamento.

Armazenamento de espermatozóides imobilizados a 372C

De maneira a se acessar a sobrevivência dos espermatozóides em temperaturas fisiológicas, a mobilidade dos espermatozóides foi registrada durante o armazenamento dos espermatozóides a 37fiC. Os espermatozóides bovinos foram transferidos para uma solução tampão antes dos experimentos de armazenamento a 37aC. Conforme descrito acima, amostras de referência do mesmo ejaculado foram incluídas em cada experimento. Os testes foram realizados em tubos de centrífuga de 13 ml com um volume total de 8 ml em cada tubo. As amostras de referência foram diluídas 1+4 na solução de armazenamento. Para os espermatozóides imobilizados, 3 ml de pérolas contendo espermatozóide foram adicionadas a 6 ml de solução tampão e armazenadas em um tubo de centrífuga de 13 ml. Os espermatozóides de varrão foram tratados de maneira similar, exceto que foi utilizada um BTS normal (com 3 mM de Ca).

Verificação da mobilidade

A mobilidade dos espermatozóides foi acessada através de uma avaliação microscópica. As amostras (tipicamente de 1 ml) foram retiradas dos recipientes de armazenamento e transferidas para tubos Eppendorf de 1,5 ml. Os tubos foram pré-aquecidos por pelo menos 15 minutos em um bloco de aquecimento a 37aC antes da verificação. No momento da determinação, 2,5 μΐ de amostra foram adicionados a uma lamínula de microscópio pré-aquecida e imediatamente inspecionados utilizando-se um microscópio iluminado. 0 número de espermatozóides móveis em cada amostra foi estimado para o intervalo de 5% mais próximo. Se possível na prática, o operador foi mantido desconhecedor da identidade da amostra durante a verificação.

Os espermatozóides imobilizados devem ser liberados das pérolas antes da avaliação da mobilidade. De maneira a dissolver as pérolas de alginato, 1 parte de pérolas foi adicionada a 3 partes de solução de IVT em um tubo de centrífuga de 13 ml. Os tubos foram então colocados em um agitador de tubo e deixados por aproximadamente 3 0 minutos antes da verificação.

Resultados e discussão

Sobrevivência dos espermatozóides imobilizados

Os dados dos experimentos com armazenamento de espermatozóide nas amostras de referência (com espermatozóides não imobilizados) e nas amostras com espermatozóides imobilizados são mostrados na figura 1 tanto para espermatozóide bovino quanto para espermatozóide de varrão. Para espermatozóide de varrão são mostrados os dados de dois diferentes tamanhos de pérola. A razão par isto é que o tamanho de pérola deve ser abaixo de 1 mm de maneira a se utilizar pérolas para inseminação intra- uterina com o equipamento existente disponível.

Como pode ser observado a partir dos dados apresentados na figura 1, os espermatozóides imobilizados parecem apresentar uma mobilidade algo mais baixa que os espermatozóides nas amostras de referência imediatamente após a imobilização. Esta diferença em mobilidade pode ser causada tanto pelo procedimento de imobilização quanto pelo procedimento de solubilização, na medida em que as pérolas contendo espermatozóides imobilizados devem ser dissolvidas antes da verificação da mobilidade. Não há, no entanto, necessidade de se dissolver as pérolas antes da inseminação, na medida em que as pérolas irão se dissolver lentamente nas condições fisiológicas (dados não mostrados).

A diferença em mobilidade entre as amostras de

referência e os espermatozóides imobilizados é reduzida durante o período de armazenamento, na medida em que a mobilidade nas amostras de referência parece cair mais rápido que nas amostras imobilizadas, especialmente para espermatozóide de varrão. Para espermatozóides

imobilizados de varrão, uma mobilidade de aproximadamente 0% foi registrada após 5 dias de armazenamento em pérolas com 3 mm de diâmetro neste experimento particular. Neste tempo, uma mobilidade de 10% foi registrada nas amostras de referência. Estes resultados indicam que a imobilização influencia as células ou o meio ambiente local das células de uma forma que é benéfica para sua capacidade em tolerar o armazenamento in vitro a 182C.

Para espermatozóide bovino não há diferença significativa na mobilidade entre as amostras de referência e os espermatozóides imobilizados no último período de experimento mostrado.

Uma otimização adicional das condições de armazenamento e do procedimento de imobilização pode, entretanto, aumentar os tempos de armazenamento dos espermatozóides bovinos imobilizados. As determinações do consumo de glicose e produção de lactato dos espermatozóides bovinos imobilizados nas amostras de referência indicam que os espermatozóides armazenados dentro da rede em gel de alginato de cálcio apresentam uma taxa reduzida de metabolismo (c.f. Exemplo 2).

De maneira a se avaliar se os espermatozóides imobilizados irão sobreviver em condições fisiológicas, isto é, condições em que a atividade dos espermatozóides deveria ser máxima, experimentos de armazenamento foram conduzidos a uma temperatura de 37 eC. Os dados dos experimentos com armazenamento in vitro de espermatozóides bovinos e de varrão durante armazenamento a 372C são mostrados na figura 2. Conforme observado nos experimentos com armazenamento

in vitro a temperatura ambiente, ocorre uma diferença na mobilidade entre as amostras de referência e as amostras com espermatozóides imobilizados em alginato depois da preparação das amostras. Entretanto, tanto para

espermatozóide bovino quanto para espermatozóide de varrão a mobilidade cai rapidamente de forma razoável nas amostras de referência com espermatozóides não imobilizados durante o armazenamento a 372C. Nas amostras com espermatozóides imobilizados, a mobilidade cai significativamente mais lentamente. Após 15 horas de armazenamento in vitro a 37aC, as mobilidades dos espermatozóides de varrão em ambos os tamanhos de pérola são ainda acima de 50%. De fato, a mobilidade é ainda de aproximadamente 3 0% após 60 horas de armazenamento a 372C nas pérolas de 3 mm de diâmetro. Para espermatozóide bovino a mobilidade parece cair mais rapidamente que para o espermatozóide de varrão neste sistema experimental. Entretanto, tal como para

espermatozóide de varrão ocorre uma diferença significativa entre as taxas de queda de mobilidade durante o armazenamento neste experimento para os espermatozóides bovinos. Após 24 horas de armazenamento, os

espermatozóides bovinos imobilizados ainda apresentam uma mobilidade de 45%, enquanto não existe qualquer mobilidade registrada nas amostras de referência.

Deve-se ter em mente que os dados apresentados na figura 2 são obtidos utilizando-se um sistema experimental artificial, o qual não é representativo para a situação in vivo dentro do animal fêmea. Os dados apresentados na figura 2, entretanto, indicam que tanto os espermatozóides bovinos quanto os espermatozóides de varrão sobrevivem e podem manter a mobilidade por períodos consideravelmente longos quando imobilizados em uma rede em gel de alginato de cálcio, mesmo a temperaturas fisiológicas. Os dados indicam também que a imobilização com redes em gel de alginato de cálcio pode ser utilizada de maneira a sustentar a mobilidade dos espermatozóides durante armazenamento a temperaturas fisiológicas. Isto pode ser especialmente importante na medida em que o tempo de inseminação é crítico para se obter bons resultados de fertilização. 0 tempo de inseminação é crítico porque os espermatozóides têm um tempo limitado de sobrevivência após a inseminação. Os resultados podem, desta forma, indicar que a imobilização de espermatozóide combinada com uma liberação controlada após a inseminação pode ser utilizada de maneira a se estender o período de tempo da inseminação até a fertilização.

Ensaios de inseminação

Ensaios de inseminação foram realizados em um total

de 9 porcas em um rebanho. As porcas deveriam ser apartadas diretamente a partir do desmame da ninhada prévia de leitões, mas o aparte foi adiado até aproximadamente 4 semanas após a inseminação. No abatedouro, os órgãos reprodutivos foram coletados

diretamente após a evisceração e examinados dentro de 15 minutos. 0 número de corpora lútea nos ovários o número de embriões (se algum) nas trompas uterinas foram contados e registrados. Pela interferência neste estágio precoce da prenhez, a possibilidade de se observar todos os embriões presentes (mesmo degenerados) é relativamente alta. Pela observação do número de leitões nascidos normalmente corre- se o risco de perda de uma alta percentagem de embriões, uma vez que qualquer concepto e embrião mortos antes da ossificação serão reabsorvidos pelo sistema materno e nenhum remanescente será visível no momento. Até 3 0% dos óvulos suínos fertilizados morrem e desaparecem desde a concepção até a ossificação. Em nossos ensaios, uma boa estimativa de taxa de fertilização pode ser calculada para cada porca pela contagem do número de embriões e do número de corpora lútea em 4 semanas.

0 momento da inseminação variou de normal a um dia antes do normal, e foram realizadas tanto inseminações simples quanto duplas. Os resultados destes testes de inseminação são mostrados na tabela 1. Tabela Is Número de porcas inseminadas, taxa de prenhez e taxa de fertilização (nos animais prenhes) com os ensaios de inseminação.

Método # porcas Prenhez (%) Taxa fértil. (%) Espz. imob., dia l1+2 5 4 (80%) 57% Espz. imob. re- dissolvido, dia 1+2 4 2 (50%) 66%

1 Dia 1 = dia da coleta dos espermatozóides

Os ensaios de inseminação foram realizados com espermatozóides bovinos. Estes ensaios são menos fáceis de quantificar uma vez que não estão disponíveis grandes rebanhos de ensaio. Estes ensaios foram conduzidos em um rebanho com 20 novilhas disponíveis. As novilhas foram sincronizadas quanto ao cio antes da inseminação. Boas taxas de fertilização foram alcançadas utilizando-se espermatozóide bovino imobilizado. No estudo, 6 de 12 novilhas inseminadas com espermatozóide imobilizado armazenado por 24 horas foram fertilizadas, confirmadas pelo controle de prenhez.

Os espermatozóides foram imobilizados em alginato, armazenados imobilizados à temperatura ambiente por períodos diferentes, inseminados dissolvidos ou não dissolvidos. 0 momento das inseminações variou de normal a um dia antes do normal, e apenas inseminações únicas foram realizadas. Os animais prenhes foram confirmados por exame retal 5-7 semanas depois da inseminação. Os resultados destes ensaios são mostrados na tabela 2.

Tabela 2: Ensaios de inseminação em gado: Método utilizado, número de novilhas inseminadas e taxa de prenhez.

Ens. Insem. Método #novilhas Prenhez (%) 1 Espz. imob., armaz. 24 h a 182C, dissolvido imediatamente antes da inseminação. 12 6 (50%) 2 Espz. imob., armaz. 24 h a 18aC, insem. não dissolvido um dia antes do normal em relação ao cio. 3 1 (33,3%) 3 Espz. imob., armaz. 48 h a 18 2C, dissolvido imediatamente antes da inseminação. 5 4 (80%)

Estes dados mostram que espermatozóide imobilizado em pérolas de alginato de cálcio não apenas mantêm a mobilidade, mas também mantêm todas as propriedades funcionais necessárias para a fertilização. Desta forma, Geno e Norsvin demonstraram que espermatozóide imobilizado em gel de alginato de cálcio pode ser utilizado para inseminação, e que podem provocar fertilização tanto em gado quanto em suínos. Exemplo 2: Consumo de energia dos espermatozóides imobi1izados

Sem se restringir a uma teoria específica, acredita- se que a imobilização de espermatozóide resulte em consumo reduzido de energia pelo espermatozóide, e que isto é benéfico no que diz respeito à vida de prateleira e à capacidade de fertilização.

Desta forma, para investigar esta teoria, espermatozóides bovinos foram imobilizados em pérolas de alginato a uma concentração de aproximadamente 150 χ IO6 espermatozóides/ml e adicionados a tampão de diluição de leite a duas vezes o volume de pérolas. Amostras de referência com espermatozóides suspensos livremente foram preparadas do mesmo ejaculado contendo a mesma concentração total de espermatozóide por volume total de tampão de diluição de leite. As amostras foram tornadas anaeróbicas pela introdução de N2 antes do armazenamento a 20aC. As amostras do tampão de diluição de leite foram tomadas durante o período de armazenamento e as produções de lactato pelos espermatozóides nas amostras foram determinadas por HPLC. Os resultados são apresentados na tabela 3.

Tabela 3: Produção de lactato pelos espermatozóides imobilizados e suspensos livres durante o armazenamento a temperatura ambiente. Os valores são fornecidos em nanomoles de lactato produzido por 350 milhões de espermatozóides. Tempo de armaz. (dias) Espermatozóides imobilizados Amostras de referência 1 4,21 16,1 2 6, 00 20,6 3 6,90 22,1

Exemplo 3: Imobilização de sêmen de raposa prateada (Vulpes vulpes) .

Sêmen misto de boa qualidade de três raposas prateadas machos adultos (Vulper vulpes) foi diluído em extensor de EDTA para 228 χ IO6 células de esperma por ml e transportado para o laboratório. Três horas após a coleta e diluição, uma alíquota do sêmen foi centrifugada a 2000 rpm por 10 minutos. 0 sedimento foi misturado com alginato (LF 10/60) e foram formadas pérolas como descrito neste pedido de patente. As pérolas foram armazenadas em Biladyl modificado a 182C. 0 sêmen remanescente foi armazenado em EDTA a 182C como controle.

As pérolas foram dissolvidas após 48 horas. Tanto o sêmen dissolvido quanto o sêmen de controle foram aquecidos a 352C por 2 0 minutos antes da avaliação da mobilidade como esperma móvel por cento ser realizada por microscópio de fase com aumento de IOx e 25x em uma placa de aquecimento a 352C.

Tabela 4: Mobilidade de sêmen de raposa prateada armazenado imobilizado e armazenado não imobilizado (controle)

25 Mobilidade na chegada Mobilidade após armaζ. Por 48 horas Sêmen de controle 75% 45-50% Sêmen imobilizado (após dissolvido) 55-60%

Exemplo 4: Leitões nascidos por gestação em tempo normal após inseminação intra-uterina única com sêmen de varrão imobilizado em alginato.

Sêmen misto de 3 varrões adultos foi tratado de

acordo com a presente invenção e as pérolas foram utilizadas para inseminação intra-uterina de uma porca que posteriormente pariu após prenhez de tempo normal. A porca foi afastada da amamentação da ninhada prévia em 8 de fevereiro de 2007 e foi inseminada com sêmen imobilizado em pérolas de alginato uma vez em 12 de fevereiro de 2007. A porca deu cria a 12 leitões vivos em 10 de junho de 2007. Não houve qualquer leitão natimorto na ninhada e todos os leitões se mostravam normais à inspeção clínica. Exemplo 5: Imobilização de sêmen de carneiro em

alginato.

Sêmen de dois carneiros AI foi coletado com uma vagina artificial e levado para o laboratório dentro de dez minutos. O sêmen foi diluído 1+3 em um extensor a base de leite desnatado (Curtis P.G., Forteath A.D., Polge C. "Survival of buli sperm frozen in milk diluents containing varying concentrations of glycerol and fructose", Proc. IVth Int. Congr. Anim. Reprod. 1961; 3:952-956), antes da adição de alginato, e formação das pérolas como descrito no pedido de patente 0613288.0, exemplo 1. As pérolas foram armazenadas em extensor a base de leite desnatado a 5sC ou à temperatura ambiente. Os espermatozóides imobilizados foram liberados das pérolas antes da avaliação microscópica da mobilidade como células de esperma móveis por cento 24 e 48 horas depois da imobilização. Devido a razões práticas, não foram incluídos controles neste estudo. Entretanto, os parâmetros de viabilidade incluindo mobilidade serão prejudicados durante o armazenamento de sêmen em líquido a 5aC ou 202C por 30 horas (Paulenz H., Soderquist L., Perez- Pe R. , Berg K.A., "Effect of different extenders and storage temperatures on sperm viability of liquid ram sêmen", Theriogenology 2002:57(2):823-36).

Tabela 5s Mobilidade de sêmen imobilizado de carneiro imobilizado a diferentes temperaturas por 24 horas e 48 horas.

Temp. armaζ. Mobilidade após 24 h armazenamento Mobilidade após 48 h armazenamento Carneiro 1 5 2C 75-85% 70-80% 202C 70-80% 65-75% Carneiro 2 5 2C 75-85% 70-80% 2 0 2C 70-80% 65-75%

20

Claims (33)

1. Partículas de biopolímero para a preservação de espermatozóides, caracterizadas pelo fato dos espermatozóides serem incorporados em uma rede em gel biopolimérica, e pelo fato do biopolímero incorporando os espermatozóides compreender alginato rico em ácido gulurônico.

2. Partículas de acordo com a reivindicação 1, caracterizadas pelo fato do biopolímero incorporando os espermatozóides compreender alginato de cálcio.

3. Partículas de acordo com as reivindicações 1 a 2, caracterizadas pelo fato da concentração de alginato ser de pelo menos 0,1%.

4. Partículas de acordo com a reivindicação 3, caracterizadas pelo fato da concentração de alginato ser de entre pelo menos 0,1% e 6%.

5. Partículas de acordo com a reivindicação 4, caracterizadas pelo fato da concentração de alginato ser de pelo menos 1%.

6. Partículas de acordo com a reivindicação 5, caracterizadas pelo fato da concentração de alginato ser de pelo menos 2%.

7. Partículas de acordo com a reivindicação 3, caracterizadas pelo fato pelo fato da concentração de alginato ser de 6%.

8. Partículas de acordo com as reivindicações 1-7, caracterizadas pelo fato de apresentar uma concentração de espermatozóides de pelo menos 0,1 χ IO6 espermatozóides/ml.

9. Partículas de acordo com a reivindicação 8, caracterizadas pelo fato apresentar uma concentração de espermatozóides de pelo menos 100 χ IO6 espermatozóides/ml.

10. Partículas de acordo com a reivindicação 8, caracterizadas pelo fato uma concentração de espermatozóides de pelo menos 2,5 χ IO9 espermatozóides/ml.

11. Partículas de acordo com as reivindicações 1-10, caracterizadas pelo fato de serem armazenadas em uma solução.

12. Partículas de acordo com a reivindicação 11, caracterizadas pelo fato da proporção de solução de armazenamento: partícula de biopolímero ser de pelo menos entre 1:1 e 1:100.

13. Partículas de acordo com as reivindicações 11-12, caracterizadas pelo fato dos espermatozóides serem co- incorporados com um ou mais antioxidantes.

14. Partículas de acordo com a reivindicação 13, caracterizadas pelo fato do antioxidante ser selecionado do grupo consistindo em piruvato, 2,2,6,6-tetrametilpiperidin- 1-oxi, 4-hidroxi-2,2,6,6-tetrametilpiperidin-l-oxi, super- óxido-dismutase, catalase, glutationperoxidase, hidroxi- tolueno butilado, e hidroxianisol butilado.

15. Partículas de acordo com as reivindicações 1-14, caracterizadas pelo fato de ser revestida.

16. Partículas de acordo com a reivindicação 15, caracterizadas pelo fato do revestimento ser selecionado do grupo consistindo em polilisina, quitosana, sulfato de celulose, hidroxipropilmetilcelulose ou cloreto de poli- dialildimetilamônio.

17. Partículas de acordo com as reivindicações 1-16, caracterizadas pelo fato dos espermatozóides adicionalmente serem co-incorporados com compostos ou agentes que são benéficos para a capacidade de fertilização e/ou saúde animal.

18. Partículas de acordo com a reivindicação 17, caracterizadas pelo fato do espermatozóide ser co- incorporado com um ou mais dos compostos ou agentes selecionados do grupo consistindo em extensores, crioprotetores, antibióticos, anticorpos, antioxidantes, proteínas, e hormônios.

19. Partículas de acordo com as reivindicações 1-18, caracterizadas pelo fato do espermatozóide ser originário de um animal selecionado do grupo consistindo em suíno, gado, cavalos, ovelhas, cabras, coelhos, aves, animais de estimação como cães de raça, animais para pele, animais aquáticos, e espécies animais em extinção.

20. Partículas de acordo com a reivindicação 19, caracterizadas pelo fato dos espermatozóides serem coletados de um animal selecionado do grupo consistindo em suíno, gado, animais para pele e cavalo.

21. Partículas de acordo com as reivindicações 1-20, caracterizadas pelo fato do espermatozóide estar contido em fluido seminal.

22. Partículas de acordo com as reivindicações 1-21, caracterizadas pelo fato de serem tratadas adicionalmente por desidratação, criopreservação ou Iiofilização.

23. Partículas de acordo com as reivindicações 1-23, caracterizadas pelo fato de serem formadas diretamente em um recipiente de sêmen.

24. Processo para a preparação das partículas de biopolímero conforme definidas em qualquer uma das reivindicações 1-23, caracterizado pelo fato de uma mistura de alginato e espermatozóides ser adicionada a uma solução de gelificação.

25. Processo de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato da solução de gelificação compreender um ou mais dos seguintes íons selecionados do grupo consistindo em cálcio, sódio, bário, magnésio.

26. Processo de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato da solução de gelificação compreender íons de cálcio e sódio.

27. Processo de acordo com as reivindicações 24-2 6, caracterizado pel o fato de serem tratadas adicionalmente por desidratação, criopreservação ou Iiofilização.

28. Uso das partículas de biopolímero conforme definidas em qualquer uma das reivindicações 1-23, caracterizado pelo fato de ser na criação de animais.

29. Uso de acordo com a reivindicação 28, caracterizado pelo fato das partículas serem utilizadas na criação de animais selecionados do grupo consistindo em suíno, gado, cavalos, ovelhas, cabras, coelhos, aves, animais de estimação como cães de raça, animais para pele, animais aquáticos, e espécies animais em extinção.

30. Uso de acordo com as reivindicações 28 ou 29, caracterizado pelo fato das partículas serem inseminadas diretamente.

31. Uso de acordo com as reivindicações 28 ou 29, caracterizado pelo fato das partículas serem dissolvidas antes da inseminação.

32. Uso de acordo com as reivindicações 2 8 ou 29, caracterizado pelo fato das partículas serem utilizadas juntamente com espermatozóides livres.

33. Processo para a fertilização de um animal, caracterizado pelo fato de espermatozóide preservado em partículas conforme definidas nas reivindicações 1-2 3 ser introduzido em um animal receptor fêmea.