BRPI0710767A2 - compostos de dialquilfenil possuindo atividade agonista de receptor b2-adrenérgico e antagonista de receptor muscarìnico - Google Patents

Abstract

COMPOSTOS DE DIALQUILFENIL POSSUINDO ATIVIDADE AGONISTA DE REPECTOR <225>2-ADRENéRGICO E ANTAGONISTA DE RECEPTOR MUSCARINICO Esta invenção está relacionada a compostos da fórmula (I), onde R^ 1^ e R^ 2^ estão conforme definido na especificação, ou um sal farmaceuticamente aceitável ou um solvato ou estereoisómero deste. A invenção também está relacionada a composições farmacêuticas e combinações compreendendo tais compostos, processos e intermediários para preparação de tais compostos, e métodos para utilização de tais compostos para, por exemplo, tratar disfunções pulmonares, como doença pulmonar obstrutiva crónica e asma.

Description

COMPOSTOS DE DIALQUILFENIL POSSUINDO ATIVIDADE AGONISTA DEREPECTOR S2-ADRENÉRGICO E ANTAGONISTA DE RECEPTORMUSCARÍNICO

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

Campo da Invenção

A presente invenção relaciona-se aos novos compostosde dialquilfenil possuindo atividade agonista de receptorp2-adrenérgico e antagonista de receptor muscarínico. Estainvenção também se relaciona a composições farmacêuticascompreendendo tais compostos de bifenil, processos eintermediários para preparar tais compostos e métodos deuso de tais compostos, por exemplo, para tratar disfunçõespulmonares.

Estado da Técnica

As disfunções pulmonares, tais como asma e doençapulmonar obstrutiva crônica (COPD), são comumente tratadascom broncodilatadores. Um tipo de broncodilatador usadopara tratar disfunções pulmonares consiste dos agonistas dereceptor p2-adrenérgico (adrenoreceptor) , tal comoalbuterol, formoterol e salmeterol. Estes compostos sãogeralmente administrados por inalação. Um outro tipo debroncodilatador consiste de antagonistas do receptormuscarínico (compostos anticolinérgicos) , tais comoipratrópio e tiotrópio. Estes compostos são tambémtipicamente administrados por inalação.

As composições farmacêuticas contendo uma combinaçãode um agonista de receptor J32-adrenérgico e um antagonistade receptor muscarínico são conhecidas na técnica para usono tratamento de disfunções pulmonares. Por exemplo, aPatente U. S. de número 6.433.027, emitida em 13 de agostode 2002, divulga composições de medicamento contendo umantagonista de receptor muscarínico, tal como brometo detiotrópio e um agonista de receptor p2-adrenérgico, talcomo fumarato de formoterol.

Adicionalmente, os compostos que possuem tanto aatividade do agonista de receptor 02-adrenérgico quanto aatividade do antagonista de receptor muscarínico sãoconhecidos na técnica. Por exemplo, a Patente U. S. denúmero 7.141.671, emitida em 28 de novembro de 2006,divulga compostos de bifenila possuindo atividade doagonista de receptor J32-adrenérgico e atividade doantagonista de receptor muscarínico. Os compostos quepossueim ambas as atividades, do agonista de receptor β2~adrenérgico e do antagonista de receptor muscarínico, sãoaltamente desejáveis uma vez que tai's compostos fornecembroncodilatação através de dois modos de açãoindependentes, enquanto possuem farmacocinética de moléculaúnica.

Quanto se trata as disfunções pulmonares, éparticularmente útil fornecer agentes terapêuticos quepossuam uma ação de longa duração, isto é, uma duração depelo menos cerca de 24 horas, quando administrados porinalação de forma que os pacientes apenas necessitemadministrar o agente terapêutico uma vez ao dia ou menos.Nem todos os compostos de ação dupla divulgados previamentena técnica possuem esta propriedade desejável.

Conseqüentemente, existe uma necessidade por novoscompostos que possam ambas as atividades, do agonista dereceptor p2-adrenérgico e do antagonista de receptormuscarínico, que possuem uma ação de longa duração quandoadministrados a um paciente por inalação.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

A presente invenção fornece novos compostos dedialquilfenil possuindo atividade agonista de receptor β2-adrenérgico e atividade antagonista de receptormuscarínico. Entre outras propriedades, descobriu-se que umcomposto desta invenção possui uma ação de longa duração,isto é, uma duração de pelo menos cerca de 24 horas, quandoadministrado a um mamífero por inalação. Conseqüentemente,espera-se que os compostos desta invenção sejam úteis evantajosos como agentes terapêuticos para tratar disfunçõespulmonares.

Conseqüentemente, em um dos aspectos da composição, apresente invenção relaciona-se a um composto de Fórmula I:

<formula>formula see original document page 4</formula>

onde:

R1 é metil ou etil, R2 é metil ou etil; ou um salfarmaceuticamente aceitáveis ou solvato ou estereoisômerodeste.

Em um aspecto particular desta invenção, o composto defórmula I é um composto possuindo a fórmula II:

<formula>formula see original document page 4</formula>R1 e R2 são conforme definido aqui (incluindoquaisquer modalidades específicas ou preferidas); ou um salfarmaceuticamente aceitável ou solvato deste.

Em outro de seus aspectos de composição, esta invençãorelaciona-se a uma composição farmacêutica compreendendo umveículo farmaceuticamente aceitável e um composto defórmula I.

Se desejado, os compostos da presente invenção podemser administrados em combinação com outros agentesterapêuticos, tal como um agente antiinflamatórioesteroidal. Conseqüentemente, em outro de seus aspectos decomposição, esta invenção relaciona-se a uma composiçãofarmacêutica compreendendo (a) um composto de fórmula I;(b) um segundo agente terapêutico. Em ainda um outro deseus aspectos de composição, esta invenção relaciona-se auma composição farmacêutica compreendendo (a) um compostode fórmula I; (b) um segundo agente terapêutico; (c) umveículo farmaceuticamente aceitável.

Em ainda um outro de seus aspectos de composição, estainvenção relaciona-se a uma combinação de agentesterapêuticos compreendendo (a) um composto de fórmula I;(b) um segundo agente terapêutico. Em outros aspectos desua composição, esta invenção relaciona-se a uma combinaçãode composições farmacêuticas, a combinação compreendendo(a) uma primeira composição farmacêutica compreendendo umcomposto de fórmula I e um primeiro veículofarmaceuticamente aceitável; e (b) uma segunda composiçãofarmacêutica compreendendo um segundo agente terapêutico eum segundo veículo farmaceuticamente aceitável. Estainvenção também se relaciona a um kit contendo taiscomposições farmacêuticas.

Os compostos desta invenção possuem ambas asatividades, do agonista de receptor p2-adrenérgico e doantagonista de receptor muscarínico. Conseqüentemente,espera-se que os compostos de Fórmula I sejam úteis comoagentes terapêuticos para tratar disfunções pulmonares, talcomo asma e doença pulmonar obstrutiva crônica.

Conseqüentemente, em um dos aspectos do método, estainvenção relaciona-se a um método para tratar uma disfunçãopulmonar, o método compreendendo administrar a um pacienteem necessidade de tratamento uma quantidadeterapeuticamente efetiva de um composto da fórmula I. Estainvenção também se relaciona a um método compreendendoadministrar a um paciente uma quantidade terapeuticamenteefetiva de um composto de fórmula I. Adicionalmente, emoutros aspectos do método, esta invenção relaciona-se a ummétodo de produção de broncodilatação em um mamífero, ométodo compreendendo administrar a um mamífero umaquantidade produtora de broncodilatação de um composto defórmula I. Esta invenção também se relaciona ao método deantagonizar um receptor muscarínico e agonizar um receptorp2-adrenérgico em um mamífero, o método compreendendoadministrar ao mamífero um composto de fórmula I.

Uma vez que os compostos desta invenção possuematividade agonista de receptor j32-adrenérgico e atividadeantagonista do receptor muscarínico, tais compostos sãotambém úteis como ferramentas de pesquisa.Conseqüentemente, em ainda outros aspectos do método, estainvenção relaciona-se a um método de uso de um composto defórmula I como uma ferramenta da pesquisa, o métodocompreendendo conduzir um ensaio biológico usando umcomposto de fórmula I.

Os compostos desta invenção podem também ser usadospara avaliar novos compostos químicos. Conseqüentemente, emoutros aspectos do método, esta invenção relaciona-se a ummétodo de avaliação de um composto de teste em um ensaiobiológico, o método compreendendo:

(a) conduzir um ensaio biológico com um composto deteste para fornecer um primeiro valor de ensaio;

(b) conduzir o ensaio biológico com um composto defórmula I para fornecer um segundo valor de ensaio; ondeetapa (a) é conduzida ou antes, ou após ouconcomitantemente com a etapa (b); e (c) comparar oprimeiro valor de ensaio da etapa (a) com o segundo valorde ensaio da etapa (b).

Esta invenção também se relaciona a processos e novosintermediários úteis para preparar os compostos de fórmulaI. Conseqüentemente, em outros aspectos dos métodos, estainvenção relaciona-se a um processo de preparação de umcomposto de fórmula I, o processo compreendendo desprotegerum composto de fórmula 6 (conforme definido aqui) parafornecer um composto de fórmula I.

Em outros aspectos do método, esta invenção relaciona-se a um processo de preparação de um composto de Fórmula I,o processo compreendendo: (a) reagir um composto de fórmula4 com um composto de fórmula 5 na presença de um agenteredutor para fornecer um composto de fórmula 6; e (b)desproteger o composto de fórmula 6 para fornecer umcomposto de fórmula I; onde os compostos 4, 5 e 6 sãoconforme aqui definido.Em uma modalidade particular desta invenção, oscompostos de fórmula I são preparados por desproteção de umcomposto de fórmula 6, onde o grupo de proteção de hidroxilé um grupo silil. Conseqüentemente, em ainda outrosaspectos do método, esta invenção relaciona-se a umprocesso de preparação de um composto de Fórmula I, oprocesso compreendendo desproteger um composto de fórmula

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onde Ra, Rb e Rc são independentemente selecionados apartir de alquil de Ci-4, fenil, -alquil de Ci-4-(fenil) , ouum entre Rla, Rlb e Rlc é -O-(alquil de Ci-4) ; para fornecerum composto da fórmula I.

Em outras modalidades, os processos descritos aquitambém compreendem a etapa de formação de um salfarmaceuticamente aceitável de um composto de fórmula I. Emoutras modalidades, esta invenção relaciona-se aos outrosprocessos descritos aqui, e ao produto preparado porqualquer um dos processos aqui descritos.

Em uma modalidade particular, esta invenção relaciona-se a um composto de fórmula III:

<formula>formula see original document page 8</formula>ou um sal ou estereoisômero deste, onde Yl éselecionado a partir de -CHOi -CN, -CH2OH, -CH(OR3a)OR3b, -C(O)OH, -C(O)OR3c, bromo e iodo, onde R3a e R3b sãoselecionados independentemente a partir de alquil de Ci-6,ou R3a e R3b são unidos à forma alquileno C2-6, R3c éselecionado a partir de alquil de C1-6, e R1 e R2 sãoconforme definido aqui (incluindo quaisquer modalidadesespecíficas ou preferidas), estes compostos são úteis comointermediários na preparação de compostos de fórmula I. Emuma modalidade particular da fórmula III, R1 e R2 sãometil. Em uma outra modalidade particular da fórmula III,Y1 é -CHO. Em ainda uma outra modalidade particular dafórmula III, R1 e R2 são metil e Y1 é -CHO.

Esta invenção também se relaciona ao uso de umcomposto de fórmula I para terapia. Adicionalmente, ainvenção relaciona-se ao uso de um composto de fórmula Ipara a produção de um medicamento para o tratamento de umadisfunção pulmonar, e ao uso de um composto de fórmula Icomo uma ferramenta de pesquisa. Outros aspectos emodalidades desta invenção estão aqui divulgados.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Em um de seus aspectos de composição, esta invençãorelaciona-se a novos compostos de fórmula I. Os compostosda fórmula I contêm um ou mais centros quirais e portanto,esta invenção está direcionada às misturas racêmicas;estereoisômeros puros (isto é, enanciômeros oudiastereômeros); misturas enriquecidas com estereoisômero eetc., a menos que de outra forma indicado. Quando umestereoisômero particular é mostrado ou aqui mencionado,será compreendido por aqueles habilitados na técnica, quemenores quantidades de outros estereoisômeros podem estarpresentes nas composições desta invenção a menos que deoutra forma indicado, desde que a utilidade da composiçãocomo um todo não seja eliminada pela presença de taisoutros isômeros.

Particularmente, os compostos de fórmula I contêm umcentro quiral no átomo de carbono indicado pelo símbolo *na seguinte fórmula parcial:

<formula>formula see original document page 10</formula>

Em uma modalidade particular desta invenção, o átomode carbono identificado pelo símbolo * possui aconfiguração (R). Nesta modalidade, os compostos de fórmulaI possuem a configuração (R) no átomo de carbonoidentificado pelo símbolo * ou são enriquecidos em umaforma estereoisômera possuindo a configuração (R) nesteátomo de carbono.

Os compostos de fórmula I também contêm vários gruposbásicos (por exemplo, grupos amino) e, portanto, oscompostos de fórmula I podem existir como base livre ou naforma de vários sais. Todas as tais formas estão incluídasno escopo desta invenção. Além disso, os solvatos doscompostos de fórmula I ou os sais destes são incluídos noescopo desta invenção.

Conseqüentemente, aqueles habilitados na técnica irãoreconhecer que a referência a um composto aqui, porexemplo, referência a um composto de fórmula I ou composto6, inclui referência aos sais e estereoisômeros e solvatosdaquele composto, a menos que outra forma indicado.Adicionalmente, conforme aqui usado, as formas nosingular "um", "uma" e "o/a" incluem as formas no pluralcorrespondentes a menos que o contexto de uso dite de outraforma claramente.

A nomenclatura usada aqui para nomear os compostosdesta invenção e intermediários destes foi de maneira geralderivada usando-se o software AutoNom comercialmentedisponível (MDL, San Leandro, Califórnia). Tipicamente, oscompostos de fórmula I foram nomeados como derivados doéster piperidin-4-ílico do ácido bifenil-2-ílico carbâmico.

Modalidades Representativas

Os seguintes substituintes e valores são objetivadospara fornecerem exemplos representativos de vários aspectose modalidades desta invenção. Estes valores representativossão objetivados para também definir e ilustrar taisaspectos e modalidades e não são objetivados para excluiroutras modalidades ou para limitar o escopo desta invenção.Com relação a isto, a representação que um valor ousubstituinte particular é preferida, não pretende dequalquer forma excluir outros valores ou substituintesdesta invenção a menos que especificamente indicado.

Em uma modalidade, R1 é metil e R2 é metil.

Em uma outra modalidade, R1 é etil e R2 é etil.

Em uma outra modalidade, R1 é metil e R2 é etil.

Em uma outra modalidade, R1 é etil e R2 é metil.

Assim, em um dos aspectos da composição, a presenteinvenção relaciona-se a compostos de Fórmula I selecionadosa partir de:

éster 1- [2- (4- { [ (i?) -2- (3-formilamino-4-hidroxifenil) -2-hidroxietilamino]metil}-2,5-dimetilfenil-carbamoil) etil]piperidin-4-ílico do ácido bifenil-2-ilcarbâmico (compostoHa) ;

éster 1-[2-(4-{[(R)-2-(3-formilamino-4-hidroxifenil)-2-hidroxietilamino] metil}-2,5-dietilfenilcarbamoil) etil]piperidin-4-ílico do ácido bifenil-2-ilcarbâmico (compostoIIb) ;

éster 1-[2-(4-{[(R)-2-(3-formilamino-4-hidroxifenil)-2-hidroxietil]amino]metil} -2-metil-5-etilfenilcarbamoi1)etil]piperidin-4-ílico do ácido bifenil-2-ilcarbâmico(composto IIc);

éster 1- [2- (4- { [ (i?) -2- (3-formilamino-4-hidroxifenil) -2-hidroxietilamino]metil} -2-etil-5-metilfenilcarbamoil)etil]piperidin-4-ilico do ácido bifenil-2-ilcarbâmico(composto IId);

ou um sal farmaceuticamente aceitável deste.

Definições

Quando se descreve os compostos, composições, métodose processos desta invenção, os seguintes termos possuem ossignificados a seguir, a menos que de outra forma indicado.

O termo "alquil" significa um grupo hidrocarbonetosaturado monovalente que pode ser linear ou ramificado. Amenos que de outra forma definido, tais grupos alquilcontêm tipicamente de 1 a 10 átomos de carbono. Gruposalquil representativos incluem, por meio de exemplo, metil,etil, n-propil, isopropil, n-butil, sec-butil, isobutil,terc-butil, n-pentil, n-hexil, n-heptil, n-octil, n-nonil,n-decil e etc.

Quando um número específico de átomos de carbono éobjetivado para um termo particular aqui usado, o número deátomos de carbono é mostrado depois do termo. Por exemplo,o termo "alquil de C1-3" significa um grupo alquil possuindode 1 a 3 átomos de carbono onde os átomos de carbono estãoem qualquer configuração aceitável quimicamente.

O termo "alquileno" significa um grupo hidrocarbonetosaturado divalente que pode ser linear ou ramificado. Amenos que de outra forma definido, tais grupos alquilenocontêm tipicamente de 1 a 10 átomos de carbono. Gruposalquileno representativos incluem, por meio de exemplo,metileno, etano-1,2-diil ("etileno"), propano-1,2-diil,propano-1,3-diil, butano-1,4-diil, pentano-1,5-diil e etc.

O termo "grupo de proteção de amino" significa umgrupo de proteção adequado para impedir reações indesejadasem um grupo amino. Grupos de proteção de aminorepresentativos incluem, mas não estão limitados a, terc-butoxicarbonil (BOC), tritil (Tr), benziloxicarbonil (Cbz),9-fluorenilmetoxicarbonil(Fmoc), benzil, formil,trimetilsilil (TMS), terc-butildimetilsilil (TBS), e etc.

O termo "grupo de proteção de carboxi" significa umgrupo de proteção adequado para impedir reações indesejadasem um grupo carboxi. Grupos de proteção de carboxirepresentativos incluem, mas não estão limitados a,ésteres, tais como metil, etil, terc-butil, benzil (Bn), p-metoxibenzil (PMB), 9-fluroenilmetil (Fm), trimetilsilil(TMS), terc-butildimetilsilil (TBS), difenilmetil (benzidril, DPM, e etc.

O termo "composto da invenção" ou "composto da fórmulaI" ou "composto da fórmula II" conforme usado aquisignifica o(s) composto(s) específico(s) ou salfarmaceuticamente aceitável ou solvato ou estereoisômerodeste, a menos que de outra forma indicado.O termo "halo" significa fluoro, cloro, bromo ou iodo.

O termo "grupo de proteção de hidroxil" significa umgrupo de proteção adequado para impedir reações indesejadasem um grupo hidroxil. Grupos de proteção de hidroxilrepresentativos incluem, mas não estão limitados a, grupossilil incluindo grupos trialquilsilil de C1-6, tais comotrimetilsilil (TMS), trietilsilil (TES), terc-butildimetilsilil (TBS) e etc.; ésteres (grupos acil)incluindo grupos alcanoil de C1-6, tais como formil, acetile etc.; grupos arilmetil, tais como benzil (Bn), p-metoxibenzil (PMB), 9-fluorenilmetil (Fm), difenilmetil(benzidril, D PM) e etc. Adicionalmente, dois gruposhidroxil podem também ser protegidos como um grupoalquilideno, tal como prop-2-ilidino, formado, por exemplo,pela reação com uma cetona, tal como acetona.

O termo "grupo de saída" significa um grupo funcionalou átomo que pode ser deslocado por um outro grupofuncional ou átomo em uma reação de substituição, tal comouma reação de substituição nucleofílica. Por meio deexemplo, grupos de saída representativos incluem, mas nãoestão limitados a, grupos cloro, bromo e iodo; grupos éstersulfônico, tais como mesilato, tosilato, brosilato,nosilato, e etc; e grupos aciloxi, tais como acetoxi,trifluoroacetoxi e etc.

O termo "diâmetro de massa mediana" ou "MMD" quandousado para se referir a partículas significa o diâmetro deforma que metade da massa das partículas está contida naspartículas com diâmetro maior e metade está contida naspartículas com diâmetro menor.

O termo "micronizado" ou "na forma micronizada"significa partículas em que pelo menos cerca de 90% daspartículas possuem um diâmetro de menos de cerca de 10 μτη amenos que de outra forma indicado.

O termo "ou um sal farmaceuticamente aceitável ousolvato ou estereoisômeros destes", conforme aqui usado, éobjetivado para incluir todas as permutações de sais,solvatos e estereoisômeros, tal como um solvato de um salfarmaceuticamente aceitável de um estereoisômero de umcomposto de fórmula I.

O termo "sal farmaceuticamente aceitável" significa umsal que é aceitável para a administração a um paciente, talcomo um mamífero (por exemplo, sais que oferecem segurançapara o mamífero para um dado regime de dosagem) . Salsfarmaceuticamente aceitáveis representativos incluem saisde ácido acético, ascórbico, benzenossulfônico, benzóico,canfossulfônico, cítrico, etanossulfônico, edisílico,fumárico, gentísico, glucônico, glucorônico, glutâmico,hipúrico, hidrobrômico, hidroclórico, isetiônico, láctico,lactobiônico, maléico, málico, mandélico, metanossulfônico,múcico, naftalenossulfônico, naftaleno-1,5-dissulfônico,naftaleno-2,6-dissulfônico, nicotínico, nítrico, orótico,pamóico, pantotênico, fosfórico, succínico, sulfúrico,tartárico, p-toluenossulfônico, xinafóico e etc.

O termo "derivados protegidos deste" significa umderivado do composto específico em que um ou mais gruposfuncionais do composto são protegidos bloqueados de reaçõesnão desejadas que ocorrem com um grupo protetor ou debloqueio. Grupos funcionais que podem ser protegidosincluem, por meio de exemplo, grupos carboxi, grupos amino,grupo hidroxil, grupos tiol, grupo carbonil e etc. Gruposde proteção adequados para tais grupos funcionais são bemconhecidos daqueles habilitados na técnica, conformeexemplificado pelos ensinamentos em T. W. Greene e G. M.Wuts, Protecting Groups in Organic Synthesis, 3a edição,Wiley, New York, 1999, e referências citadas nesta.

O termo "sal deste" significa um composto formadoquando o hidrogênio de um ácido é substituído por umcátion, tal como um cátion metálico ou um cátion orgânico eetc. Na presente invenção, o cátion tipicamente compreendeuma forma protonada de um composto de fórmula I, isto é,onde um ou mais grupos amino foram protonados por um ácido.

Preferivelmente, o sal é um sal farmaceuticamenteaceitável, embora isto não seja exigido para os sais decompostos intermediários que não são objetivados paraadministração a um paciente.

O termo "solvato" significa um complexo ou agregadoformado por uma ou mais moléculas de um soluto, isto é, umcomposto da Fórmula I ou um sal farmaceuticamente aceitáveldeste, e uma ou mais moléculas de um solvente. Taissolvatos são tipicamente sólidos cristalinos possuindo umaproporção molar substancialmente fixa de soluto e solvente.Solventes representativos incluem por meio de exemplo,água, metanol, etanol, isopropanol, ácido acético, e etc.Quando o solvente é água, o solvato formado é um hidrato.

O termo "quantidade terapeuticamente efetiva"significa uma quantidade suficiente para efetuar otratamento quando administrada a um paciente em necessidadede tratamento.

O termo "tratar" ou "tratamento" conforme usado aquisignifica tratar ou o tratamento de uma doença ou condiçãomédica (tal como COPD ou asma) em um paciente, tal como ummamífero (particularmente um humano) que inclui:

(a) impedir que a doença ou condição médica ocorra,isto é, tratamento profilático de um paciente;

(b) melhorar a doença ou condição médica, isto é,eliminar ou causar a regressão da doença ou condição médicaem um paciente;

(c) suprimir a doença ou condição médica, isto é,retardar ou interromper o desenvolvimento da doença oucondição médica em um paciente; ou

(d) aliviar os sintomas da doença ou condição médicaem um paciente.

Todos os outros termos aqui usados são objetivadospara terem seu significado usual conforme compreendido poraqueles habilitados na técnica a qual eles pertencem.

PROCEDIMENTOS SINTÉTICOS GERAIS

Os compostos desta invenção podem ser preparados apartir de materiais iniciais facilmente disponíveis usando-se os seguintes métodos e procedimentos gerais ouutilizando-se outra informação facilmente disponível ouconhecidos por aqueles habilitados na técnica. Embora osseguintes procedimentos possam ilustrar uma modalidadeparticular ou aspecto da presente invenção, aqueleshabilitados na técnica irão reconhecer que outrasmodalidades ou aspectos da presente invenção podem serpreparados usando-se os mesmo métodos ou métodos similaresou utilizando-se outros métodos, reagentes e materiaisiniciais conhecidos daqueles habilitados na técnica. Serátambém avaliado que onde são fornecidas condições deprocesso típicas ou preferidas (isto é, temperaturas dereação, tempos, proporções molares dos reagentes,solventes, pressões, etc.), outras condições de processotambém podem ser usadas a menos que de outra formadeclarado. Embora as condições de reação ideais irãotipicamente variar dependendo dos vários parâmetros dereação tais como os reagentes, solventes e quantidadesusadas, aqueles habilitados na técnica podem determinarfacilmente as condições de reação adequadas usando-seprocedimentos de otimização de rotina.

Adicionalmente, como será aparente àqueles habilitadosna técnica, os grupos de proteção convencionais podem sernecessários ou desejados para impedir que certos gruposfuncionais passem por reações indesejadas. A escolha de umgrupo de proteção adequado para um grupo funcionalparticular, assim como as condições e reagentes adequadospara a proteção e desproteção de tais grupos funcionais,são bem conhecidos na técnica. Grupos de proteção que nãoaqueles ilustrados nos procedimentos aqui descritos podemser usados, se desejado.

Em uma modalidade, os compostos de fórmula I sãosintetizados conforme ilustrado no Esquema I:Composto da Fórmula I

<formula>formula see original document page 19</formula>

onde P1 é um grupo de proteção de hidroxil, e R3a e R3bsão selecionados independentemente de alquil de C1-6, ou R""e R3b são unidos para formar alquileno de C2-6.

Conforme mostrado no Esquema I, o composto 1 pode serreagido com cerca de 0,95 a cerca de 1,05 equivalente molardo composto 2 para fornecer o composto 3. Esta reação deMichael é tipicamente conduzida a uma temperatura variandode cerca de 0°C a cerca de 15°C, tipicamente cerca de 40°Ca cerca de 45°C, por cerca de 8 horas a cerca de 24 horasou até que a reação esteja substancialmente completa.

Geralmente, esta reação é conduzida em um diluenteadequado, tal como diclorometano ou misturas dediclorometano e metanol ou etanol, e etc. Sob finalizaçãoda reação, o produto é tipicamente isolado usando-seprocedimentos convencionais, tal como extração,recristalização, cromatografia e etc. Alternativamente, amistura reacional contendo o composto 3 pode ser usada napróxima etapa da síntese.

O composto 3 é então reagido com ácido aquoso parahidrolisar o grupo acetal e fornecer o composto aldeido 4.Qualquer ácido adequado pode ser empregado nesta reaçãoincluindo, por meio de exemplo, ácido hidroclórico, ácidosulfúrico, ácido metanossulfônico, ácido p-toluenossulfônico e etc. A reação de hidrólise étipicamente conduzida a uma temperatura variando de cercade 0°C a cerca de 30°C, tipicamente de cerca de 20°C acerca de 25°C, por cerca de 1 hora a cerca de 6 horas, ouaté que a reação esteja substancialmente completa.

Geralmente, esta reação é conduzida em um diluenteadequado, tal como metanol etanol, isopropanol,diclorometano/etanol, acetonitrila e etc. Sob finalizaçãoda reação, o produto é tipicamente isolado usando-seprocedimentos convencionais, tal como extracao,recristalização, cromatografia e etc.

O composto 4 é então reagido com cerca de 0,95 a cercade 1,5 equivalente molar do composto 5 na presença de umagente redutor para fornecer o composto 6. Qualquer agenteredutor adequado pode ser usado nesta reação incluindo, pormeio de ilustração, um reagente de hidreto metálico, talcomo borohidreto de sódio, triacetoxiborohidreto de sódio,cianoborohidreto de sódio e etc., ou hidrogênio e umcatalisador metálico, tal como paládio em carbono, e etc.

Esta reação de alquilação redutiva é tipicamente conduzidaa uma temperatura variando de cerca de -20°C a cerca de30°C, tipicamente de cerca de 0°C a cerca de 5°C, por cercade 1 hora a cerca de 6 horas, ou até que a reação estejasubstancialmente completa. Geralmente, esta reação éconduzida em um diluente adequado e um solvente prótico,tal como dicloroetano e metanol, e etc. Sob finalização dareação, o produto é tipicamente isolado usando-seprocedimentos convencionais, tal como extração,recristalização, cromatografia e etc.

O composto 6 é então desprotegido para fornecer umcomposto de fórmula I. As condições particulares usadaspara desproteger o composto 6 dependerão do grupo deproteção empregado. Por exemplo, quando P1 é um grupo deproteção de silil (isto é, um composto de fórmula 6aconforme aqui definido), tal como terc-butildimetilsilil,terc-butildifenilsilil, difenilmetilsilil, di-terc-buyillmetilsilil, terc-butoxidifenilsilil e etc., estareação de desproteção é tipicamente conduzida contatando-seo composto 6a com uma fonte de íon f luoreto. Em umamodalidade particular, a fonte de íon fluoreto étrihidrofluoreto de trietilamina. Outras fontes adequadasde íon fluoreto incluem fluoreto de tetrabutilamônio,fluoreto de potássio com 18-coroa-6, fluoreto dehidrogênio, hidrofluoreto de piridina, e etc. Esta reação étipicamente conduzida a uma temperatura variando de cercade 0°C a cerca de 50°C, tipicamente de cerca de 10°C acerca de 25°C, por cerca de 24 a cerca de 72 horas, ou atéque a reação esteja substancialmente completa. Geralmente,esta reação é conduzida em um diluente adequado, tal comodicloroetano e etc. Sob finalização da reação, o produto étipicamente isolado usando-se procedimentos convencionais,tal como extração, recristalização, cromatografia e etc.

O composto 1 é conhecido na técnica ou pode serpreparado a partir de materiais iniciais e reagentescomercialmente disponíveis usando-se procedimentosconhecidos. Veja, por exemplo, a Publicação do Pedido dePatente U. S. de número 2004/0167167, Al e R. Naito eoutros, Chem. Pharm. Bull, 46(8) 1286-1294 (1998). Pormeiode exemplo, o composto 1 pode ser preparado conformeilustrado no Esquema II:

Esquema II

<formula>formula see original document page 22</formula>

Conforme mostrado no Esquema II, bifenil-2-isocianato7 é reagido com 4-hidroxipiperidina N-protegida 8, onde P2é um grupo de proteção de amino tal como benzil, parafornecer o intermediário carbamato 9. Esta reação étipicamente conduzida a uma temperatura variando de cercade 20°C a cerca de 100°C, tipicamente de cerca de 60°C acerca de 80°C, por cerca de 6 a cerca de 24 horas ou atéque a reação esteja substancialmente completa. Se desejado,esta reação pode ser conduzida em um diluente adequado, talcomo diclorometano, tolueno e etc. Alternativamente, estareação pode ser conduzida na ausência de um diluente. Sobfinalização da reação, o produto 9 é tipicamente isoladousando-se procedimentos convencionais, tal como extração,recristalização, cromatografia e etc. Alternativamente, amistura reacional contendo o composto 9 é usada diretamentena próxima etapa da síntese.

O grupo de proteção de amino, P2, é então removido docomposto 9 usando-se procedimentos convencionais parafornecer o composto 1. Por exemplo, quando P2 é um grupobenzil, o composto 9 pode ser desprotegido usando-sehidrogênio ou formato de amônio, na presença de umcatalisador, tal como um catalisador de paládio.Catalisadores representativos incluem, por meio deilustração, paládio em carbono, hidróxido de paládio emcarbono e etc. Esta reação é tipicamente conduzida a umatemperatura variando de cerca de 20°C a cerca de 50 °C,tipicamente de cerca de 40°C, por cerca de 6 horas a cercade 24 horas, ou até que a reação esteja substancialmentecompleta. Geralmente, esta reação é conduzida em umdiluente adequado, tal como metanol, etanol, isopropanol eetc. Sob finalização da reação, o composto 1 é tipicamenteisolado usando-se procedimentos convencionais, tal comoextração, recristalização, cromatografia e etc.

Compostos de fórmula 2 são conhecidos na técnica oupodem ser preparados a partir de materiais iniciais ereagentes comercialmente disponíveis usando-seprocedimentos conhecidos. Por meio de ilustração, oscompostos de fórmula 2 podem ser preparados conformemostrado no Esquema III:

Esquema III

<formula>formula see original document page 23</formula>

Conforme mostrado no Esquema III, um composto deanilina de fórmula 10, onde X1 é bromo ou iodo, éprimeiramente protegido no grupo amino para fornecer umcomposto de fórmula 11, onde P3a é um grupo de proteção deamino e P3b é hidrogênio ou um grupo de proteção de amino.

Qualquer grupo de proteção de amino pode ser usado, talcomo benzil, 4-metoxibenzil, trifluoroacetil e etc. Porexemplo, um composto de fórmula 10 pode ser reagido comcerca de 2 ou mais equivalentes molares, preferivelmentecerca de 2,5 a cerca de 3,0 equivalentes molares, de umhaleto de benzila, tal como cloreto, brometo ou iodeto debenzila, para fornecer o composto 11, onde P3a e P3b sãoambos benzil. Esta reação é tipicamente conduzida a umatemperatura variando de cerca de 0°C a cerca de 50 °C,tipicamente de cerca de 30°C, por cerca de 18 noras a cercade 24 horas, ou até que a reação esteja substancialmentecompleta. Geralmente, esta reação é conduzida em umdiluente adequado, tal como metanol, etanol, isopropanol eetc. Tipicamente, esta reação é também conduzida napresença de uma base adequada, tal como carbonato depotássio, carbonato de sódio e etc. Sob finalização dareação, o composto 11 é tipicamente isolado usando-seprocedimentos convencionais, tal como extração,recristalização, cromatografia e etc.

Compostos representativos da fórmula 10 que podem serempregados nesta reação incluem 2,5-dimetil-4-iodoanilina,2, 5- dietil-4-iodoanilina, 2-etil-4-iodo-5-metilanilina, 5-etil-4-iodo-2-metilanilina, 4-bromo-2,5-dimetilanilina, 4-bromo-2,5-dietilanilina, 4-bromo-2-etil-5-metilanilina, 4-bromo-5-etil-2-metilanilina e etc. Tais compostos estãocomercialmente disponíveis (por exemplo, a partir deSpectra Group Limited, Inc., Millbury, OH) ou podem serpreparados a partir de materiais iniciais e reagentescomercialmente disponíveis usando-se procedimentosconvencionais.

O composto 11 é então contatado com cerca de 1 a cercade 2 equivalentes molares de um reagente de alquil lítio,tal como n-butil-lítio ou terc-butil-lítio, para formar oânion correspondente em que o grupo X1 foi trocado porlítio. Esta reação é tipicamente conduzida a umatemperatura variando de cerca de -70°C a cerca de 0°C,tipicamente de cerca de -20°C, por cerca de 0,25 hora acerca de 1 hora, ou até que a reação estejasubstancialmente completa. Geralmente, esta reação éconduzida em um diluente adequado, tal como tolueno,xileno, tetrahidrofurano e etc.

O ânion de lítio resultante não está isolado, mas éreagido in situ com um excesso molar de N,N-dimetilformamida para fornecer o composto 12. Geralmente,cerca de 2 a cerca de 4 equivalentes molares de N,N-dimetilformamida são usados. Esta reação é tipicamenteconduzida a uma temperatura variando de cerca de -70°C acerca de 0°C, tipicamente de cerca de -20°C a cerca de 0°C,por cerca de 0,5 a cerca de 2 horas, ou até que a reaçãoesteja substancialmente completa. Sob finalização dareação, o composto 12 é tipicamente isolado usando-seprocedimentos convencionais, tal como extração,recristalização, cromatografia e etc.

O grupo aldeído do composto 12, é então protegido comoum acetal reagindo-se composto 12 com um álcool ou um diolna presença de um catalisador ácido. Qualquer álcool oudiol adequado pode ser usado nesta reação. Por exemplo,álcoois e dióis representativos incluem metanol, etanol, n-propanol, etileno glicol, propileno glicol, e etc.Geralmente, um excesso molar do álcool ou diol é empregadonesta reação, preferivelmente cerca de 2 a cerca de 4equivalentes molares.

Qualquer catalisador ácido adequado pode ser usadonesta reação para facilitar a formação do acetal.Catalisadores ácidos representativos incluem, por meio deexemplo, ácido p-toluenossulfônico, ácidobenzenossulfônico, ácido hidroclórico e etc.

A reação é tipicamente conduzida a uma temperaturavariando de cerca de 50°C a cerca de 100°C, tipicamente decerca de 60°C a cerca de 80°C, por cerca de 12 a cerca de24 horas, ou até que a reação esteja substancialmentecompleta. Geralmente, esta reação é conduzida em umdiluente adequado, tal como tolueno, xileno e etc.Tipicamente, a reação é conduzida de uma maneira quepermita que a água produzida seja removida, tal como pordestilação azeotrópica ou pelo uso de peneiras moleculares.Sob finalização da reação, o composto 13 é tipicamenteisolado usando-se procedimentos convencionais, tal comoextração, recristalização, cromatografia e etc.Alternativamente, a mistura reacional contendo o composto13 pode ser usada diretamente na próxima etapa da síntese.

Após a formação do acetal, o grupo amino do composto13 é desprotegido usando-se reagentes e condições padrõespara formar o composto 14. Por exemplo, se P3a e P3b sãogrupos benzil, o composto 13 pode ser desprotegido usando-se hidrogênio e um catalisador, tal como um catalisador depaládio. Catalisadores representativos incluem, por meio deexemplo, paládio em carbono, hidróxido de paládio emcarbono e etc. Esta reação é tipicamente conduzida a umatemperatura variando de cerca de 20°C a cerca de 50 °C,tipicamente de cerca de 25°C a cerca de 30°C, por cerca de4a cerca de 12 horas, ou até que a reação estejasubstancialmente completa. Geralmente, esta reação éconduzida em um diluente adequado, tal como metanol etanol,misturas de etanol/acetato de etila e etc. Sob finalizaçãoda reação, o composto 14 é tipicamente isolado usando-seprocedimentos convencionais, tal como extração,recristalização, cromatografia e etc.

O composto 14 é então reagido com haleto de acriloíla15, onde X2 é cloro, bromo ou iodo, para tormar o composto2. Esta reação é tipicamente conduzida a uma temperaturavariando de cerca de -20°C a cerca de 25°C, tipicamente decerca de 0°C a cerca de 5°C, por cerca de 0,5 a cerca de 6horas, ou até que a reação esteja substancialmentecompleta. Geralmente, esta reação é conduzida em umdiluente adequado, tal como diclorometano e etc., napresença de um a base adequada, tal comodiisopropiletilamina, trietilamina e etc. Geralmente, decerca de 1 a cerca de 1,2 equivalente molar do haleto deacriloíla e cerca de 1 a cerca de 2 equivalente(s)molar(es) da base é/são usado(s) nesta reação. Sobfinalização da reação, o composto 2 é tipicamente isoladousando-se procedimentos convencionais, tal como extração,recristalização, cromatografia e etc.

Compostos de fórmula 5 são conhecidos na técnica oupodem ser preparados a partir de materiais iniciais ereagentes comercialmente disponíveis usando-seprocedimentos conhecidos. Por meio de ilustração, oscompostos de fórmula 5 podem ser preparados conformemostrado no Esquema IV:

Esquema IV

<formula>formula see original document page 28</formula>

Conforme ilustrado no Esquema IV, os compostos ciefórmula 5 podem ser preparados a partir dos compostos defórmula 16, onde P4 é um grupo de proteção de hidroxil, talcomo benzil, e X3 é um grupo de saída, tal como cloro,bromo ou iodo. Compostos de fórmula 16 são conhecidos natécnica. Por exemplo, Patente U. S. de número 6.268.533 BI,emitida em 31 de julho de 2001; e R. Hett e outros, OrganicProcess Research & Development 1998, 2, 96-99; descrevem apreparação de N- [2-benziloxi-5-((R)-2-bromo-l-hidroxietil)fenil]formamida (isto é, o enanciômero (R) docomposto 16, onde P4 é benzil e X3 é bromo) começando de 2-bromo-4'-benziloxi-3'-nitroacetofenona, a síntese da qualestá descrita em K. Murase e outros, Chem. Pharm. Buli,25(6) 1368-1377 (1977). Se desejado, a forma racêmica docomposto 16 pode ser preparada usando-se um agente redutornão quiral, tal como o complexo borano-dimetilsulfeto, parareduzir a 2-bromo-4'-benziloxi-3'-nitroacetofenona.

O grupo hidroxil do composto 16 é protegido usando-seprocedimentos convencionais e reagentes para fornecer ocomposto 17, onde P1 é um grupo de proteção de hidroxil. Emuma modalidade particular, o grupo de proteção de hidroxilé um grupo de proteção de silil, tal comodimetilisopropilsilil, dietilisopropilsilil,dimetilhexilsilil, terc-butildimetilsilil, terc-butildifenilsilil, difenilmetilsilil e etc. Por exemplo, ocomposto 16 pode ser reagido com cerca de 0,95 a cerca de1,2 equivalente molar de cloreto de terc-butildimetilsililana presença de cerca de 1,1 a cerca de 1,3 equivalentemolar de imidazol para fornecer o composto 17, onde P1 éterc-butildimetilsilil. Esta reação é tipicamenteconduzida a uma temperatura variando ae cerca de acerca de 50°C, tipicamente à temperatura ambiente, porcerca de 24 horas a cerca de 4 8 horas, ou até que a reaçãoesteja substancialmente completa. Geralmente, esta reação éconduzida em um diluente adequado, tal como N,N-dimetilformamida e etc. Sob finalização da reação, ocomposto 17 é tipicamente isolado usando-se procedimentosconvencionais, tal como extração, cromatografia e etc. Pormeio de ilustração adicional, a síntese de N- {2-benziloxi-5-[(R)-2-bromo-l-(terc-butildimetilsilaniloxi)etil] fenilJformamida está descrita na Publicação da PatenteU. S. de número 2004/0248985 Al, publicada em 9 de dezembrode 2004.

O composto 17 é então reagido com uma benzilamina(isto é, Bn1-NH2) para fornecer o composto 18, onde Bn1 é umgrupo benzil não substituído ou um grupo benzil substituídopossuindo de 1 a 3 substituintes no anel fenil no grupobenzil independentemente selecionado de alquil de Ci-4 oualcoxi de Ci-4. Benzilaminas representativas incluem,benzilamina, 3,4-dimetoxibenzilamina, 4-metoxibenzilamina,4-metilbenzilamina e etc. Esta reação é tipicamenteconduzida contatando-se o composto 17 com cerca de 2 acerca de 4 equivalentes molares da benzilamina a umatemperatura variando de cerca de 400C a cerca de 100°C,tipicamente de cerca de 800C a cerca de 90°C, por cerca de5 a cerca de 24 horas ou até que a reação estejasubstancialmente completa. Geralmente, esta reação éconduzida em um diluente adequado, tal como N-metil-2-pirrolidona (NMP) e etc. Sob finalização da reação, ocomposto 18 é tipicamente isolado usando-se procedimentosconvencionais, tal como extração, cromatografia,recristalização e etc.

A remoção do grupo benzil, Bn1 e P4 usando-seprocedimentos e reagentes convencionais fornece então ocomposto 5. Em uma modalidade, tanto Bn1 quanto P4 sãogrupos benzil que são removidos na mesma mistura reacional.

Tipicamente, esta reação é conduzida contatando-se ocomposto 5 com hidrogênio na presença de um catalisador,tal como um catalisador de paládio. Catalisadoresrepresentativos incluem hidróxido de paládio em carbono,paládio em carbono e etc. Geralmente, esta reação dedesbenzilação é conduzida na presença de um ácido, tal comoácido acético, ácido fórmico e etc. Esta reação étipicamente conduzida a uma temperatura variando de cercade 10°C a cerca de 50°C, tipicamente à temperaturaambiente, por cerca de 6 horas a cerca de 24 horas, ou atéque a reação esteja substancialmente completa. Geralmente,esta reação é conduzida em um diluente adequado, tal comometanol, etanol e etc. Sob finalização da reação, ocomposto 5 é tipicamente isolado usando-se procedimentosconvencionais, tal como extração, cromatografia e etc. Emuma modalidade particular, o composto 5 é isolado como osal do ácido acético.

Aqueles habilitados na técnica irão reconhecer que oscompostos da fórmula I podem também ser preparados poroutros procedimentos sintéticos. Por exemplo, a ordemparticular na qual as etapas sintéticas são conduzidas podeser mudada ou intermediários diferentes podem serempregados. Por meio de ilustração, compostos de fórmula III:

<formula>formula see original document page 31</formula>

onde Y1 é -CN, -C(O)OH ou -C(O)OR3c podem ser reduzidosusando-se procedimentos e reagentes convencionais parafornecer o aldeído 4 (isto é, onde Y1 é -CHO) .

Adicionalmente, tais compostos podem ser reduzidos aoálcool, isto é, onde Y1 é -CH2OH, e o álcool pode então seroxidado usando-se os procedimentos e reagentes padrões parafornecer o aldeído 4 (isto é, onde Y1 é -CHO).

Se desejado, os sais farmaceuticamente aceitáveis doscompostos de fórmula I podem ser preparados contatando-se aforma de base livre de um composto de fórmula I com umácido farmaceuticamente aceitável.

Detalhes adicionais relacionados às condições dereação específicas e outros procedimentos para preparaçãodos compostos representativos desta invenção ouintermediários destes estão descritos nos Exemplos expostosabaixo.

Composições, Combinações e Formulações Farmacêuticas

Os compostos desta invenção são tipicamenteadministrados a um paciente na forma de uma composição ouformulação farmacêutica. Tais composições farmacêuticaspodem ser administradas ao paciente por qualquer rota deadministração aceitável incluindo, mas não limitada a,modos de administração por inalação, oral, nasal, tópica(incluindo transdermal) e parenteral. Será compreendido quequalquer forma de um composto desta invenção, (isto é, baselivre, sal farmaceuticamente aceitável, solvato, etc.) queseja adequado para um modo particular de administração,pode ser usado nas composições farmacêuticas discutidasaqui.

Conseqüentemente, em um de seus aspectos dascomposições, esta invenção relaciona-se a uma composiçãofarmacêutica compreendendo um veículo ou excipientefarmaceuticamente aceitável e um composto de fórmula I.

Opcionalmente, tais composições farmacêuticas podem conteroutros agentes terapêuticos e/ou de formulação, sedesejado.

As composições farmacêuticas desta invençãotipicamente contêm uma quantidade terapeuticamente efetivade um composto de fórmula I. Aqueles habilitados na técnicairão reconhecer, entretanto, que uma composiçãofarmacêutica pode conter mais de uma quantidadeterapeuticamente efetiva, isto é, composições volumosas, oumenos de uma quantidade terapeuticamente efetiva, isto é,doses unitárias individuais projetadas para administraçãomúltipla para alcançar uma quantidade terapeuticamenteefetiva.

Tipicamente, tais composições farmacêuticas irãoconter de cerca de 0,01 a cerca de 95% em peso do agenteterapêutico; incluindo, de cerca de 0,01 a cerca de 30% empeso; tal como de cerca de 0,01 a cerca de 10% em peso doagente terapêutico.

Qualquer veículo ou excipiente convencional pode serusado nas composições farmacêuticas desta invenção. Aescolha de um veículo ou excipiente particular, oucombinações de veículos ou excipientes, irá depender domodo de administração que está sendo usado para tratar umpaciente particular ou tipo de condição médica ou estado dadoença. Sob este aspecto, a preparação de uma composiçãofarmacêutica adequada para um modo particular deadministração está bem inserida no escopo daqueleshabilitados na técnica farmacêutica.

Os veículos ou excipientes usados nas composiçõesfarmacêuticas desta invenção estão comercialmentedisponíveis. Por exemplo, tais materiais podem seradquiridos de Sigma (St. Louis, MO). Por meio de ilustraçãoadicional, as técnicas de formulação convencionais são bemconhecidas daqueles habilitados na técnica conformeexemplificado pelos ensinamentos em Remington: The Scienceand Practice of Pharmacy, 20a edição, Lippincott Williams &White, Baltimore, Maryland (2000); e H.C. Ansel e outros,Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, 7 aedição, Lippincott Williams & White, Baltimore, Maryland (1999).Exemplos representativos de materiais que podem servircomo veículos farmaceuticamente aceitáveis incluem, mas nãoestão limitados aos seguintes: (1) açúcares, tais comolactose, glicose e sacarose; (2) amidos, tais como amido demilho e amido de batata; (3) celulose, e seus derivados,tais com carboximetil celulose de sódio, etil celulose eacetato de celulose; (4) tragacanto em pó; (5) malte; (6)gelatina; (7) talco; (8) excipientes, tais como manteiga decacau e ceras para supositórios; (9) óleos, tais como óleode amendoim, óleo de semente de algodão, óleo de açafrão,óleo de gergelim, óleo de oliva, óleo de milho e óleo desoja; (10) glicóis, tal como propileno glicol; (11)poliõis, tais como glicêrina, soroitoi, manitol epolietileno glicol; (12) ésteres, tais como oleato de etilae laurato de etila; (13) Agar; (14) agentes detamponamento, tais como hidróxido de magnésio e hidróxidode alumínio; (15) ácido algínico; (16) água livre depirógeno; (17) solução salina isotônica; (18) solução deRinger; (19) álcool etíIico; (20) soluções de tampãofosfato; (21) gases propelentes comprimidos, tais comoclorofluorocarbonos e hidrofluorocarbonos; e (22) outrassubstâncias compatíveis atóxicas empregadas em composiçõesfarmacêuticas.

As composições farmacêuticas desta invenção sãotipicamente preparadas misturando-se ou combinando-secompletamente e intimamente um composto da invenção com umveículo farmaceuticamente aceitável e quaisqueringredientes opcionais. Se necessário ou desejado, amistura combinada uniformemente resultante pode então sermoldada ou carregada em comprimidos, cápsulas, pílulas,tubos, cartuchos, dispensadores e etc., usando-seprocedimentos e equipamentos convencionais.

Em uma modalidade, as composições farmacêuticas destainvenção são adequadas para a administração por inalação.

Composições farmacêuticas adequadas para administração porinalação estarão tipicamente na forma de um aerossol ou umpó. Tais composições são geralmente administradas usando-sedispositivos bem conhecidos, tais como um inaladornebulizador, um inalador com dose medida (MDI), um inaladorde pó seco (DPI) ou um dispositivo de entrega similar.

Em uma modalidade específica desta invenção, acomposição farmacêutica compreendendo o agente terapêuticoé administrado por inalação usando-se um inaladornebulizador. Tais dispositivos nebulizadores tipicamenteproduzem uma corrente de ar de alta velocidade que faz comque a composição farmacêutica compreendendo o agenteterapêutico pulverize-se como uma névoa que é transportadapara dentro do trato respiratório do paciente.Conseqüentemente, quando formulado para uso em um inaladornebulizador, o agente terapêutico é tipicamente dissolvidoem um veículo adequado para formar uma solução.Alternativamente, o agente terapêutico pode ser micronizadoe combinado com um veículo adequado para formar umasuspensão de partículas micronizadas. Dispositivosnebulizadores adequados para administrar os agentesterapêuticos por inalação são bem conhecidos daqueleshabilitados na técnica ou tais dispositivos estãocomercialmente disponíveis. Por exemplo, dispositivosnebulizadores representativos incluem o Respimat SoftmistInhalaler (Boehringer Ingelheim); o AERx Pulmonary DeliverySystem (Aradigm Corp.); o PARI LC Plus Reusable Nebulizer(Pari GmbH); e etc.

Uma composição farmacêutica representativa para uso emum inalador nebulizador compreende uma solução aquosaisotônica compreendendo de cerca de 0,05 pg/mL a cerca de10 mg/mL de um composto de Fórmula I. Em uma modalidade,tal solução possui um pH de cerca de 4 a cerca de 6.

Em uma outra modalidade específica desta invenção, acomposição farmacêutica compreendendo o agente terapêuticoé administrada por inalação usando-se um inalador de póseco. Tais inaladores de pó seco tipicamente administram oagente terapêutico como um pó não aglomerado que é dispersoem uma corrente de ar do paciente durante a inspiração. Afim de alcançar um pó não aglomerado, o agente terapêuticoé tipicamente formulado com um excipiente adequado, talcomo lactose, amido, manitol. Dextrose, ácido poliláctico(PLA) polilactídeo-co-glicolídeo (PLGA) ou combinaçõesdestes. Tipicamente, o agente terapêutico é micronizado ecombinado com um veículo adequado para formar umacombinação adequada para inalação. Conseqüentemente, em umamodalidade da invenção, o composto de fórmula I está naforma micronizada.

Uma composição farmacêutica representativa para uso emum inalador de pó seco compreende lactose moída seca epartículas micronizadas de um composto de fórmula I.

Tal formulação de pó seco pode ser feita, por exemplo,combinando-se a lactose com o agente terapêutico e então secombinando a seco os componentes. Alternativamente, sedesejado o agente terapêutico pode ser formulado sem umexcipiente. A composição farmacêutica é então tipicamentecolocada em um distribuidor de pó seco, ou dentro decartuchos ou cápsulas de inalação para uso com umdispositivo de entrega de pó seco.

Dispositivos de entrega do tipo inalador de pó secoadequados para administrar os agentes terapêuticos porinalação são bem conhecidos daqueles habilitados na técnicaou tais dispositivos estão comercialmente disponíveis. Porexemplo, os dispositivos de entrega do tipo inalador de póseco representativos ou produtos incluem Aeolizer(Novartis); Airmax (IVAX); ClickHaler (Innovata Biomed);Diskhaler (GlaxoSmithKline); Diskus/Accuhaler(GlaxoSmithKline); Easyhaler (Orion Pharma); Eclipse(Aventis); FlowCaps (Hovione); Handihaler (BoehringerIngelheim) ; Pulvinal (Chiesi); Rotahaler (GlaxoSmithKline) ;SkyeHaler/Certihaler (SkyePharma); Twisthaler (Schering-Plough) ; Turbuhaler (AstraZeneca) ; Ultrahaler (Aventis) ; e etc.

Em ainda uma outra modalidade específica destainvenção, a composição farmacêutica compreendendo o agenteterapêutico é administrada por inalação usando-se uminalador de dose medida. Tais inaladores de dose medidatipicamente descarregam uma quantidade medida do agenteterapêutico usando-se gás propelente comprimido.

Conseqüentemente, as composições farmacêuticasadministradas usando-se um inalador de dose medidatipicamente compreendem uma solução ou suspensão do agenteterapêutico em um propelente liqüefeito. Qualquerpropelente liqüefeito adequado pode ser empregado incluindoclorof luorocarbonos, tal como CCl3F, e hidrof luoroalcanos(HFAs), tal como 1,1,1,2-tetrafluoroetano (HFA 134a) e1,1,1,2,3,3,3-heptafluoro-n-propano (HFA 227). Devido àspreocupações com a destruição da camada de ozônio pelosclorofluorocarbonos, as formulações que contêm HFAs sãogeralmente preferidas. Componentes opcionais adicionais deformulações de HFA incluem co-solventes, tais como etanolou pentano, e tensoativos, tais como trioleato desorbitano, ácido oléico, lecitina e glicerina.

Uma composição farmacêutica representativa para uso emum inalador de dose medida compreende de cerca de 0,01% acerca de 5% em peso de um composto de fórmula I, de cercade 0% a cerca de 20% em peso de etanol, e de cerca de 0 % acerca de 5% em peso de tensoativo, com o restante sendo umpropelente do tipo HFA.

Tais composições são tipicamente preparadas pelaadição de hidrofluoroalcano resfriado ou pressurizado a umrecipiente adequado contendo o agente terapêutico, etanol(se presente) e o tensoativo (se presente). Para prepararuma suspensão, o agente terapêutico é micronizado e entãocombinado com o propelente. A formulação é então carregadadentro de um tubo de aerossol, que forma uma parte de umdispositivo inalador de dose medida.

Dispositivos inaladores de dose medida adequados paraadministrar os agentes terapêuticos por inalação são bemconhecidos daqueles habilitados na técnica ou taisdispositivos estão comercialmente disponíveis. Por exemplo,dispositivos inaladores de dose medida representativos ouprodutos incluem AeroBid Inhaler System (ForestPharmaceuticals); Atrovent Inhalation Aerosol (BoehringerIngelheim); Flovent (GlaxoSmithKline); Maxair Inhaler (3M);Proventil Inhaler (Schering); Serevent Inhalation Aerosol(GlaxoSmithKline); e etc.

Em uma outra modalidade, as composições farmacêuticasdesta invenção são adequadas para a administração oral.Composições farmacêuticas adequadas para administração oralpodem estar na forma de cápsulas, comprimidos, pílulas,lozangos, pastilhas, drágeas, pós, grânulos; ou como umasolução ou uma suspensão em um líquido aquoso ou nãoaquoso; ou como uma emulsão líquida de óleo em água ou águaem óleo; ou como um elixir ou xarope; e etc.; cada umacontendo uma quantidade predeterminada de um composto da prcomo um ingrediente ativo.

Quando objetivadas para administração oral em umaforma de dosagem sólida (isto é, como cápsulas,comprimidos, pílulas e etc.), as composições farmacêuticasdesta invenção irão compreender tipicamente um composto dapresente invenção como o ingrediente ativo e um ou maisveículo(s) farmaceuticamente aceitável(eis) , tais comocitrato de sódio ou fosfato de dicálcio. Opcionalmente oualternativamente, tais formas de dosagem sólidas podemtambém compreender: (1) cargas ou diluentes, tais comoamidos, lactose, sacarose, glicose, manitol e/ou ácidosilícico; (2) ligantes, tais como carboximetilcelulose,alginatos, gelatinas, polivinil pirrolidona, sacarose e/ouacácia; (3) umectantes, tal como glicerol; (4) agentesdesintegrantes, tal como Agar-agar, carbonato de cálcio,amido de batata e de tapioca, ácido algínico, algunssilicatos e/ou carbonato de sódio; (5) agentes retardantesem solução, tal como parafina; (6) aceleradores deabsorção, tais como compostos de quaternário de amônio; (7)agentes umectantes, tal como álcool cetílico e/oumonoestearato de glicerol; (8) absorventes, tais comocaulim e/ou argila bentonita; (9) lubrificantes, tais comotalco, estearato de cálcio, estearato de magnésio,polietileno glicóis sólidos, lauril sulfato de sódio e/oumisturas destes; (10) agentes corantes; e (11) agentes detamponamento.

Agentes de liberação, agentes umectantes, agentes decobertura, adoçantes, agentes flavorizantes earomatizantes, preservativos e antioxidantes podem tambémestar presentes nas composições farmacêuticas destainvenção. Exemplos de antioxidantes farmaceuticamenteaceitáveis incluem: (1) antioxidantes solúveis em água,tais como ácido ascõrbico, hidrocloreto de cisteina,bissulfato de sódio, metabissulfato de sódio, sulfito desódio e etc.; (2) antioxidantes solúveis em óleos, taiscomo palmitato de ascorbil, hidroxianisol butilado (BHA),hidroxitolueno butilado (BHT), lecitina, gaiato de propila,alfa-tocoferol, e etc., e (3) agentes quelantes metálicos,tais como ácido cítricô, ácido etilenodiaminotetraacético(EDTA), sorbitol, ácido tartárico, ácido fosfórico e etc.Agentes de revestimento para comprimidos, cápsulas, pílulase etc., incluem aqueles usados para revestimentosentéricos, tais como ftalato de acetato de celulose (CAP),ftalato de acetato de polivinila (PVAP), ftalato dehidroxipropil metilcelulose, copolímeros de ácidometacrílico-éster de ácido metacrílico, trimetilato deacetato de celulose (CAT), carboximetil etil celulose(CMEC), succinato de acetato de hidroxipropil metilcelulose (HPMCAs) e etc.

Se desejado, as composições farmacêuticas da presenteinvenção podem também ser formuladas para fornecerliberação lenta ou controlada do ingrediente ativo usando-se, por meio de exemplo, hidroxipropil metil celulose emproporções variadas; ou outras matrizes poliméricas,lipossomos e/ou microesferas.

Além disso, as composições farmacêuticas da presenteinvenção podem opcionalmente conter agentes opacificantes epodem também ser formuladas de forma que elas liberem oingrediente ativo apenas, ou preferivelmente, em uma certaparte do trato gastrointestinal, opcionalmente, de umamaneira retardada. Exemplos de composições que podem serusadas incluem substâncias poliméricas e ceras. 0ingrediente ativo pode também estar na formamicroencapsulada, se apropriado, com um ou mais do(s)excipiente(s) acima descrito(s).

As formas de dosagem líquidas adequadas paraadministração oral incluem, por meio de ilustração,emulsões farmaceuticamente aceitáveis, microemulsões,soluções, suspensões, xaropes e elixires. Tais formas dedosagem líquidas tipicamente compreendem o ingredienteativo e um diluente inerte, tais como, por exemplo, água ououtros solventes, agentes de solubilização eemulsificantes, tais como álcool etílico, álcoolisopropílico, carbonato de etila, acetato de etila álcoolbenzílico, benzoato de benzila, propileno glicol, 1,3-butileno glicol, óleos (especialmente, óleos de semente dealgodão, noz moída, milho, germe de trigo, oliva, rícino, egergelim), glicerol, álcool tetrahidrofurílico, polietilenoglicóis e ésteres de ácido graxo de sorbitano, e misturasdestes. Suspensões, além dos ingredientes ativos, podemconter agentes de suspensão tais como, por exemplo, álcooisisoestearílico etoxilado, polioxietileno sorbitol e ésteresde sorbitano, celulose microcristalina, metahidróxido dealumínio, bentonita, Agar-agar e tragacanto, e misturas destes.

Quando objetivadas para administração oral, ascomposições farmacêuticas desta invenção podem serpreferivelmente embaladas em uma forma de dosagem unitária.O termo "forma de dosagem unitária" significa uma unidadefisicamente separada adequada para medicamentar por dose umpaciente, isto é, cada unidade contendo uma quantidadepredeterminada de agente ativo calculada para produzir oefeito terapêutico desejado ou sozinho ou em combinação comuma ou mais unidades adicionais. Por exemplo, tais formasde dosagem unitárias podem ser cápsulas, comprimidos,pílulas e etc.

Os compostos desta invenção podem também seradministrados de forma transdérmica usando-se sistemas deentrega transdérmica e excipientes. Por exemplo, umcomposto desta invenção pode ser misturado com melhoradoresde permeação, tais como propileno glicol, monolaurato depolietileno glicol, azacicloalcan-2-onas e etc., eincorporado em um adesivo ou sistema de entrega similar.Excipientes adicionais incluindo agentes de gelificação,emulsificantes e tampões, podem ser usados em taiscomposições transdérmicas se desejado.

Adicionalmente, os compostos desta invenção podem seradministrados parenteralmente, isto é, de formaintravenosa, subcutânea ou intramuscular. Para aadministração parenteral, um composto de fórmula I étipicamente dissolvido em um veículo aceitável paraadministração parenteral, tal como água estéril, soluçãosalina, óleo vegetal e etc. Por meio de ilustração, umacomposição intravenosa tipicamente compreende uma soluçãoaquosa estéril de um composto de fórmula I, onde a soluçãopossui um pH na faixa de cerca de 4 a cerca de 7.

Se desejado, os compostos desta invenção podem seradministrados em combinação com um ou mais outros agentesterapêuticos. Nesta modalidade, um composto desta invençãoou é fisicamente misturado com o outro agente terapêuticopara formar uma composição contendo ambos os agentes, oucada agente está presente em composições separadas edistintas que são administradas ao paciente simultaneamenteou seqüencialmente.

Por exemplo, um composto da fórmula I pode sercombinado com o segundo agente terapêutico usandoprocedimentos convencionais e equipamento para formar umacomposição compreendendo um composto de fórmula I e umsegundo agente terapêutico. Adicionalmente, os agentesterapêuticos podem ser combinados com um veículofarmaceuticamente aceitável para formar uma composiçãofarmacêutica compreendendo um composto da fórmula I, umsegundo agente terapêutico e um veículo farmaceuticamenteaceitável. Nesta modalidade, os componentes da composiçãosão tipicamente misturados ou combinados para criar umamistura física. A mistura física é então administrada emuma quantidade terapeuticamente efetiva usando-se qualqueruma das rotas descritas aqui.

Alternativamente, os agentes terapêuticos podempermanecer separados e distintos antes da administração aopaciente. Nesta modalidade, os agentes terapêuticos não sãofisicamente misturados juntos antes da administração, massão administrados simultaneamente ou seqüencialmente comocomposições separadas. Por exemplo, um composto de fórmulaI pode ser administrado por inalação simultaneamente ouseqüencialmente com outro agente terapêutico usando-se umdispositivo de entrega de inalação que empregacompartimentos separados (por exemplo, carteia tipoblíster) para cada agente terapêutico. Alternativamente, acombinação pode ser administrada através de dispositivos deentrega separados, isto é, um dispositivo de entrega paracada agente terapêutico. Adicionalmente, os agentesterapêuticos podem ser entregues por diferentes rotas deadministração, isto é, um pode inalação e o outro poradministração oral.

Qualquer agente terapêutico compatível com oscompostos da presente invenção podem ser usados emcombinação com tais compostos. Em uma modalidadeparticular, o segundo agente terapêutico é um que sejaefetivamente administrado por inalação. Por meio deilustração, os tipos representativos dos agentesterapêuticos que podem ser usados com os compostos destainvenção incluem, mas não estão limitados a agentesantiinflamatórios, tais como agentes antiinflamatóriosesteroidais (incluindo corticosteróides eglucocorticóides), agentes antiinflamatórios nãoesteroidais (NSAEDs) e inibidores de PDE4;broncodilatadores, tais como inibidores de PDE3,moduladores de adenosina 2b e agonista de receptor j32-adrenérgico; agentes antiinfectivos, tais como antibióticosgram-positivos e gram-negativos, e agentes antivirais;antihistamínicos; inibidores da protease,; bloqueadoresaferentes, tal como agonistas D2 e moduladores daneuroquinina; e antagonistas de receptor muscarínico(agentes anticolinérgicos). Numerosos exemplos de taisagentes terapêuticos são bem conhecidos na técnica. Dosesadequadas para os outros agentes terapêuticos administradosem combinação com um composto da invenção estão tipicamentena faixa de cerca de 0,05 pg/dia a cerca de 500 mg/dia.

Em uma modalidade particular desta invenção, umcomposto de fórmula I é administrado em combinação com umagente antiinflamatório esteroidal. Exemplosrepresentativos de agentes antiinf lamatõnos estereoidaisque podem ser usados em combinação com os compostos destainvenção incluem, mas não estão limitados a dipropionato debeclometasona; budesonida; propionato de butixocort; 2 Oi?-16a, 17a-butilidenobis (oxi) ] -6a, 9a-difluoro-llJ3-hidroxi-17J3-(metiltio)androsta-4-en-3-ona (RPR-106541) ; ciclesonida;dexametasona; éster S-fluorometilico do ácido 6α,9a-difluoro-17a- [(2-furanilcarbonil) oxi] -11B-hidroxi-16a-metil-3 - oxoandrosta-1, 4 -dieno- 17B-carbotióico; éster S-fluorometilico do ácido 6a, 9a-dif luoro-11B-hidroxi-16a-metil-17a-[(4-metil-l,3-tiazol-5-carbonil)oxi] -3-oxoandrosta-1, 4-dieno-17]3-carbotióico; éster (S) - (2-oxotetrahidrofuran-3S-ílico) do ácido 6a, 9a-difluoro-ΙΙβ-hidroxi-16a-metil-3-oxo-17a-propioniloxiandrosta-l, 4-dieno-17p-carbotióico; flunisolida; propionato de fluticasona;metil prednisolona; fluroato de mometasona; prednisolona;prednisona; rofleponida; ST-126; triamcinolona acetonida; eetc., ou os sais farmaceuticamente aceitáveis destes. Taisagentes antiinflamatórios esteroidais estão comercialmentedisponíveis ou podem ser preparados usando-se procedimentose reagentes convencionais. Por exemplo, a preparação e usode agentes antiinflamatórios esteroidais estão descritos naPatente U. S. de número 6.750.210 B2, emitida em 15 dejunho de 2004; Patente U. S. de número 6.759.398 B2,emitida em 6 de julho de 2004; Patente U. S. de número6.537.983, emitida em 25 de março de 2003; Publicação dePedido de Patente U. S. de número US 2002/0019378 Al,publicada em 14 de fevereiro de 2002; e referências aquicitadas.

Quando empregado, o agente antiinflamatório esteroidalé tipicamente administrado em uma quantidade que produz umefeito terapeuticamente benéfico quando co-administrado comum composto da invenção. Tipicamente, o agenteantiinflamatório esteroidal será administrado em umaquantidade suficiente para fornecer de cerca de 0,05 pg acerca de 500 pg por dose.

Os seguintes exemplos ilustram composiçõesfarmacêuticas representativas da presente invenção:

Exemplo A

Composição de Pó Seco

Um composto micronizado da invenção (100 mg) écombinado com Iactose moída (25 g) (por exemplo, lactose emque não mais que cerca de 85% das partículas tenham um MMDde cerca de 60 μπι a cerca de 90 μπι e não menos de 15% daspartículas possuem um MMD de menos de 15 μm). Esta misturacombinada é então carregada em blísteres individuais de umpacote de blíster "descascável", em uma quantidadesuficiente para fornecer cerca de 10 μg a cerca de 500 μgdo composto da invenção por dose. Os conteúdos dosblísteres são administrados usando-se um inalador de pó.

Exemplo B

Composição de Pó Seco

Um composto micronizado da invenção (1 g) é combinadocom lactose moída (200 g) para formar uma composiçãovolumosa possuindo uma relação de peso entre o composto e alactose moída de 1:200. A composição combinada é embaladaem um dispositivo de inalação de pó seco capaz de entregarentre cerca de 10 μg a cerca de 500 μg do composto dainvenção por dose.

Exemplo C

Composição de Pó Seco

Um composto micronizado da invenção (100 mg) e umagente antiinflamatório esteroidal micronizado (500 mg) sãocombinados com lactose moída (30 g). Esta mistura combinadaé então carregada em blísteres individuais de um pacote deblíster "descascável", em uma quantidade suficiente parafornecer cerca de 10 μg a cerca de 500 μg do composto dainvenção por dose. Os conteúdos dos blísteres sãoadministrados usando-se um inalador de pó.

Exemplo D

Composição de Inalador de Dose Medida

Um composto micronizado da invenção (10 g) é dispersoem uma solução preparada dissolvendo-se lecitina (0,2 g) emágua desmineralizada (200 mL). A suspensão resultante éseca por pulverização e então é micronizada para formar umacomposição micronizada compreendendo partículas possuindoum diâmetro médio menor que 1,5 μm. A composiçãomicronizada é então carregada em cartuchos inaladores dedose medida contendo 1,1,1,2-tetrafluoroetano pressurizadoem uma quantidade suficiente para fornecer cerca de 10 μg acerca de 500 μ9 do composto da invenção por dose quandoadministrado pelo inalador de dose medida.

Composição Nebulizadora

Um composto da invenção (25 mg) é dissolvido emsolução salina isotônica tamponada com citrato (pH =5) (125mL). A mistura é agitada e sonicada até que o composto sejadissolvido. 0 pH da solução é verificado e ajustado, senecessário, ao pH 5 adicionando-se lentamente hidróxido desódio IN aquoso. A solução é administrada usando-se umdispositivo nebulizador que fornece cerca de 10 μg a cercade 500 μg do composto da invenção por dose.

Exemplo F

Cápsulas de Gelatina Rígidas

Um composto da invenção (50 g) , lactose seca porpulverização (440 g) e estearto de magnésio (10 g) sãocompletamente misturados. A composição resultante écarregada em uma cápsula de gelatina dura (500 mg dacomposição por cápsula) que são administradas oralmente.

Exemplo E

Exemplo 6

Suspensão Oral

Os ingredientes seguintes são completamente misturadospara formar uma suspensão para administração oral:

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A suspensão resultante contém 100 mg de ingredienteativo por 10 mL de suspensão. A suspensão é administradaoralmente.

Exemplo H

Composição Injetável

Um composto da invenção (0,2 g) é combinado com umasolução tampão de acetato de sódio 0,4 M (2,0 mL). O pH dasolução resultante é ajustado a pH 4 usando-se ácidohidroclórico 0,5N ou hidróxido de sódio 0,5N, conformenecessário, e então água suficiente para injeção éadicionada para fornecer um volume total de 20 mL. Amistura é então filtrada através de um filtro estéril (0,22mícron) para fornecer uma solução estéril adequada paraadministração por injeção.

UTILIDADE

Os compostos desta invenção possuem tanto atividadeagonista de receptor p2-adrenérgico quanto atividadeantagonista do receptor muscarínico e portanto, espera-seque tais compostos sejam úteis como agente terapêuticospara tratar condições médicas mediadas pelos receptores β2-adrenérgicos ou receptores muscarínicos, isto é, condiçõesmédicas que são melhoradas pelo tratamento com o agonistado receptor p2-adrenérgico ou um antagonista do receptormuscarínico. Tais condições médicas são bem conhecidasdaqueles habilitados na técnica conforme exemplificadopelos ensinamentos de Eglen e outros, Muscarinic ReceptorSubtypes: Pharmacology and Therapuetie Potential, DN&P10(8), 462-469 (1997); Emilien e outros, CurrentTherapeutie Uses and Potential of beta-AdrenoeeptorAgonists and Antagonists, European J. Clinicai Pharm.,53(6), 389-404 (1998); e referências citadas neste. Taiscondições médicas incluem, por meio de exemplo, disfunçõesou doenças pulmonares associadas com obstrução das viasaéreas reversível, tais como doença pulmonar obstrutivacrônica (por exemplo, bronquite crônica e respiraçãodifícil e enfisema), asma, fibrose pulmonar, e etc. Outrascondições incluem parto prematuro, depressão, falhacongestiva do coração, doenças de pele (por exemplo,doenças inflamatórias, alérgicas, psoriáticas e doenças depele proliferativas, condições onde a diminuição da acidezpéptica é desejável (por exemplo, ulceração péptica egástrica) e doença de enfraquecimento muscular).

Conseqüentemente, em uma modalidade, esta invençãorelaciona-se a um método para tratar uma disfunçãopulmonar, o método compreendendo administrar a um pacienteem necessidade de tratamento uma quantidadeterapeuticamente efetiva de um composto de fórmula I.

Quando usado para tratar uma disfunção pulmonar, oscompostos desta invenção serão tipicamente administradospor inalação em múltiplas doses por dia, em uma única dosepor dia ou em uma única dose por semana. Geralmente, a dosepara tratar uma disfunção pulmonar irá variar de cerca de10 ug/dia a cerca de 500 pg/dia.

Em um dos aspectos dos métodos, esta invençãorelaciona-se a um método de tratamento de doença pulmonarobstrutiva crônica ou asma, o método compreendendoadministrar a um paciente uma quantidade terapeuticamenteefetiva de um composto de fórmula I. Geralmente, a dosepara tratar COPD ou asma irá variar de cerca de 10 μg/dia acerca de 500 μg/dia. 0 termo "COPD" é compreendido poraqueles habilitados na técnica como incluindo uma variedadede condições respiratórias, incluindo bronquite obstrutivacrônica e enfisema, conforme exemplificado pelosensinamentos de Barnes, Chronic Obstructive PulmonaryDisease, N. Engl. J. Med., 2000: 343:269-78, e referênciasaqui citadas.

Quando administrados por inalação, os compostos destainvenção tipicamente possuem o efeito de produzirbroncodilatação. Conseqüentemente, em outros aspectos dosmétodos, esta invenção relaciona-se a um método de produçãode broncodilatação em um mamífero, o método compreendendoadministrar a um mamífero uma quantidade produtora debroncodilatação de um composto de fórmula I. Geralmente, adose para produzir broncodilatação irá variar de cerca de10 μg/dia a cerca de 500 μg/dia.

Quando usados como agente terapêutico, os compostosdesta invenção são opcionalmente administrados emcombinação com outros agentes terapêuticos.

Particularmente, administrando-se os compostos destainvenção com um agente antiinflamatório esteroidal, terapiatripla, isto é, atividade agonista de receptor β2-adrenérgico, atividade antagonista de receptor muscarínicoe atividade antiinflamatória, pode ser alcançada usando-seapenas dois agentes terapêuticos. Uma vez que ascomposições farmacêuticas (e combinações) contendo doisagentes terapêuticos são tipicamente mais fáceis deformular e/ou administrar comparadas às composições quecontêm três agentes terapêuticos, tais composições de doiscomponentes fornecem uma vantagem significante sobre ascomposições que contêm três agentes terapêuticos.

Conseqüentemente, em uma modalidade particular, ascomposições farmacêuticas, combinações e métodos destainvenção também compreendem um agente antiinflamatórioesteroidal.

Uma vez que os compostos desta invenção possuamatividade agonista de receptor |32-adrenérgico e atividadeantagonista do receptor muscarínico, tais compostos sãotambém úteis como ferramentas de pesquisa para investigaçãoou estudo de sistemas biológicos ou amostras possuindo osreceptores p2-adrenérgicos ou muscarínicos. Adicionalmente,tais compostos são úteis em ensaios de seleção paradescobrir, por exemplo, novos compostos possuindo atividadeagonista de receptor p2-adrenérgico e atividade antagonistado receptor muscarínico. Tais sistemas biológicos ouamostras podem compreender receptores p2-adrenérgicos e/oureceptores muscarínicos. Qualquer sistema biológico ouamostra adequados que possuem receptores p2-adrenérgicose/ou receptores muscarínicos pode ser empregado em taisestudos, os quais podem ser conduzidos ou in vifcro ou invivo. Sistemas biológicos ou amostras representativosadequados para tais estudos incluem, mas não estãolimitados a células, extratos celulares, membranas deplasma, amostras de tecido, mamíferos (tais comocamundongos, ratos, porquinho da índia, coelhos, cachorros,porcos, etc.) e etc.

Quando usando como uma ferramenta de pesquisa, umsistema biológico ou amostra compreendendo um receptor β2-adrenérgico e/ou receptores muscarínico é tipicamentecontatado com uma quantidade agonizante do receptor β2~adrenérgico ou antagonizante do receptor muscarínico de umcomposto desta invenção. Os efeitos no sistema biológico ouamostras causados pelo composto são então determinados oumedidos usando-se procedimentos convencionais eequipamentos, tal como medindo-se a ligação em um ensaio deligação de radioligante ou mudanças mediadas por ligante emum ensaio funcional ou determinando-se a quantidade debroncoproteção fornecida pelo composto em um ensaio debroncoproteção em um mamífero. Mudanças mediadas porligante representativas em um ensaio funcional incluemmudanças mediadas por ligante em monofosfato de adenosinacíclica intracelular (cAMP), mudanças mediadas por ligantena atividade da enzima adenilil ciclase (que sintetiza ocAMP), mudanças mediadas por ligante na incorporação de 5'-0-(tio) trifosfato de guanosina ( [35S] GTP S) em membranasisoladas através da troca catalisada por receptor de( [35S] GTP S) por GDP, mudanças mediadas por ligante em íonscálcio intracelular livres (medida, por exemplo, com umleitor de placa de imagem ligado a fluorescência ou FLIPR®a partir de Molecular Devices, Inc.) e etc. Espera-se quecompostos desta invenção agonizem ou causam a ativação deum receptor p2-adrenérgico e antagonizem ou diminuam aativação dos receptores muscarínicos nos ensaios funcionaislistados aqui ou em ensaios de uma natureza similar. Oscompostos desta invenção serão tipicamente usados nestesestudos a uma concentração variando de cerca de 0,1nanomolar a cerca de 100 nanomolar.

Adicionalmente, os compostos desta invenção podem serusados como ferramentas de pesquisa para avaliar outroscompostos químicos. Neste aspecto da invenção, um compostode fórmula I é usado como um padrão em um ensaio parapermitir a comparação dos resultados obtidos com umcomposto de teste e o composto de fórmula I. Por exemplo,os dados de ligação do receptor £2-adrenérgico e/ou doreceptor muscarínico (conforme determinado, por exemplo,por ensaios de deslocamento de radioligante in vitro) paraum composto de teste ou um grupo de compostos de teste écomparado aos dados de ligação do receptor j32-adrenérgicoe/ou do receptor muscarínico para um composto de fórmula Ipara identificar aqueles compostos de teste que possuemligação desejável, isto é, compostos de teste possuindoligação quase igual ou superior a um composto de fórmula I,se houver. Alternativamente, por exemplo, os efeitosbroncoprotetores podem ser determinados para os compostosde teste e um composto de fórmula I em um ensaio debroncoproteção em um mamífero e estes dados comparados paraidentificar os compostos de teste que fornecem efeitosbroncoprotetores quase iguais ou superires. Este aspecto dainvenção inclui, como modalidades separadas, tanto (i) ageração dos dados de comparação (usando-se os ensaiosapropriados) quanto (ii) a análise dos dados de teste paraidentificar os compostos de teste de interesse.

As propriedades e utilidades dos compostos destainvenção podem ser demonstradas usando-se vários ensaios invitro e in vivo bem conhecidos daqueles habilitados natécnica.

Por exemplo, ensaios representativos são descritos emmaiores detalhes nos seguintes Exemplos.

EXEMPLOS

As Preparações e Exemplos a seguir são fornecidos parailustrar modalidades específicas e aspectos desta invenção.A ilustração das modalidades específicas e aspectos,entretanto, não é objetivada para limitar o escopo destainvenção de qualquer forma a menos que especificamenteindicado.

Todos os reagentes, materiais iniciais e solventesusados nos seguintes exemplos foram adquiridos a partir defornecedores comerciais (tal como Aldrich, Fluka, Sigma esimilares) e foram utilizados sem purificação adicional amenos que de outra forma indicado.

Nos exemplos descritos a seguir, a análise por HPLCfoi tipicamente conduzida utilizando-se um instrumentoAgilent (Paio Alto, CA) série 1100 equipado com colunasZorbax Bonus RP 2,1 χ 50 mm fornecida por Agilent, (umacoluna C14) possuindo um tamanho de partícula de 3,5 micra.A detecção foi feita por absorbância UV a 214 nm. A fasemóvel "A" era 2% de acetonitrila, 97,9% de água, e 0,1% deácido trifluoroacético (v/v/v) ; e a fase móvel "B" era89,9% de acetonitrila 89,9%, 10% de água, e 0,1% de ácidotrif luoroacético (v/v/v) . Os dados de HPLC (10-70) foramobtidos com uma taxa de fluxo de 0,5 mL/minuto de gradientede fase móvel B de 10% a 70% durante um período de 6minutos; os dados de HPLC (5-35) foram obtidos com uma taxade fluxo de 0,5 mL/minuto de gradiente de fase móvel B de5% a 35% durante um período de 5 minutos; e os dados deHPLC (10-90) foram obtidos com uma taxa de fluxo de 0,5mL/minuto de gradiente de fase móvel B de 10% a 90% duranteum período de 5 minutos.

Os dados de cromatografia líquida associada àespectrometria de massa (LCMS) foram tipicamente obtidoscom um instrumento da Applied Biosystems (Foster City, CA)Modelo API-15OEX. Os dados de LCMS 10-90 foram obtidos comum gradiente de fase móvel B de 10% - 90% durante períodode 5 minutos.

Purificações em pequena escala foram conduzidasutilizando-se um sistema de estação de preparação/PrepWorkstation API 150EX da Applied Biosystems. A fase móvel"A" era água contendo 0,05% de ácido trifluoroacético(v/v); e a fase móvel "B" era acetonitrila contendo 0,05%de ácido trifluoroacético (v/v). Para pequenas amostras(cerca de 3 a 50 mg de tamanho de amostra recuperada), asseguintes condições foram tipicamente utilizadas: taxa defluxo de 20 mL/min; gradientes de 15 minutos e uma colunaPrism RP de 20 mm χ 50 mm com partículas de 5 micra (ThennoHypersil-Keystone, Bellefonte, PA) . Para amostras maiores(isto é, maiores que cerca de 100 mg de amostra bruta) , asseguintes condições foram utilizadas: taxa de fluxo de 60mL/min; gradientes de 30 minutos e uma coluna Microsorb BDSde 41,4 mm χ 250 mm com partículas de 10 micra (Varian,Palo Alto, CA).

Exemplo 1

Ester Piperidin-4-ílico do Ácido Bifenil-2-ilcarbâmico

Bifenil-2-isocianato (97,5 g, 521 mmol) e 4-hidroxi-l-benzilpiperidina (105 g, 549 mmol), ambos disponíveiscomercialmente a partir de Aldrich, Milwaukeei WI, foramaquecidos juntos a 700C por 12 horas, durante este tempo aformação do éster l-benzilpiperidin-4-ílico do ácidobifenil-2-ilcarbâmico foi monitorada por LCMS. A mistura dereação foi então resfriada a 500C e foi adicionado etanol(1L) e depois foi adicionado ácido hidroclórico 6M (191mL) lentamente. A mistura reacional foi então resfriada àtemperatura ambiente e formato de amônio (98,5 g, 1,56 mol)foi adicionado e gás nitrogênio foi borbulhado através dasolução vigorosamente por 20 minutos. Paládio (10% em peso(base seca) em carvão ativo) (20 g) foi então adicionado. Amistura reacional foi aquecida a 400C por 12 horas e entãofiltrada através de um absorvente de Celite. O solvente foientão removido sob pressão reduzida e ácido hidroclórico IM(40 mL) foi adicionado ao resíduo bruto. Hidróxido de sódio(10 N) foi então adicionada para ajustar o pH a 12. Acamada aquosa foi extraída com acetato de etila (2 χ 150mL) e seca (sulfato de magnésio) , e então o solvente foiremovido sob pressão reduzida para fornecer o ésterpiperidin-4-ílico do ácido bifenil-2-ilcarbâmico (155 g,100%). HPLC (10-70) Rt = 2,52; MS m/z: [M + H+] calculadopara Ci8H20N2O2 = 2 97,15; encontrado, 2 97,3.

Exemplo 2

Ácido 3-[4-(bifenil-2-ilcarbamoiloxi)piperidin-1-il]propiônico

A uma solução do éster piperidin-4-ílico do ácidobifenil-2-ilcarbâmico (50 g, 67,6 mmol) em diclorometano(500 mL) foi adicionado ácido acrílico (15,05 mL, 100mmol). A mistura resultante foi aquecida a 500C sob refluxopor 18 horas e então o solvente foi removido. Metanol (600mL) foi adicionado e esta mistura foi aquecida a 750C por 2horas e então resfriada à temperatura ambiente para formaruma mistura semifluida espessa. 0 sólido foi coletado porfiltração, lavado com metanol (50 mL) e seco a ar parafornecer o ácido 3-[4-(bifenil-2-ilcarbamoiloxi)piperidin-1-il]propiônico (61g, 96% de pureza) como um sólido branco.

Exemplo 3

Sal do ácido acético de N-{5-[(R)-2-amino-l-(terc-butildimetilsilaniloxi) etil] -2-hidroxifenil}-formamida

Etapa A - N-{5-[(R)-2-benzilamino-l-(terc-butildimetilsilaniloxi) etil] -2-benziloxifenil}formamida

A um frasco de fundo redondo de três gargalos de 500mL foram adicionados N- {2-benziloxi-5-[ (R)-2-bromo-l-(terc-butildimetilsilaniloxi) etil] f enil} formamida (100 g, 215mmol) e W-metil-2-pirrolidona (300 mL) . A benzilamina (69,4mmol, 648 mol) foi adicionada e a mistura reacional foiinundada com nitrogênio. A mistura reacional foi entãoaquecida a 900C e agitada por cerca de 8 horas. A misturareacional foi então resfriada à temperatura ambiente e água(1,5 L) e acetato de etila (1,5 L) foi adicionado. Ascamadas foram separadas e a camada orgânica foi lavada comágua (500 mL), uma mistura de 1:1 de água e salmourasaturada (5 00 mL total) e então novamente com água (500mL). A camada orgânica foi então seca sobre sulfato demagnésio anidro, filtrada e concentrada sob pressãoreduzida para fornecer a N-{5-[(R)-2-benzilamino-l-(terc-butildimetilsilaniloxi)etil]-2-benziloxifenil} formamida(100 g, 90% de rendimento, 75-80% de pureza) bruta como umóleo espesso laranja-amarronzado.Etapa B - Sal do ácido acético de N-{5- [ (i?) -2-amino-l-(terc-butildimetilsilaniloxi)etil] -2-hidroxifenil}-formamida

N-{5-[(R)-2-benzilamino-l-(terc-butildimetilsilaniloxi) etil] -2-benziloxifenil}formamidabruta (100 g,194 mmol) foi dissolvida em metanol (IL) eácido acético (25 mL, 291 mmol) . A mistura resultante foipurgada com nitrogênio seco e então hidróxido de paládio emcarbono (20 g, 20% em peso, cerca de 50% de água) foilavado. Hidrogênio foi bombeado através da misturareacional com agitação à temperatura ambiente por cerca de10 horas. A mistura foi então purgada com nitrogênio seco ea mistura foi filtrada através de Celite. 0 filtrado toiconcentrado em um evaporador rotativo e acetato de etila(600 mL) foi adicionado ao resíduo. Esta mistura foiagitada por cerca de 2 horas em cujo tempo uma misturasemifluida amarela espessa foi desenvolvida: A misturasemifluida foi filtrada e o precipitado foi seco a ar parafornecer o sal do ácido acético de N- {5-[ {R)-2-amino-l-(terc-butildimetilsilaniloxi)etil]-2-hidroxifenil}formamidacomo um sólido amarelo-esbranquiçado. LCMS (10-70)Rt= 3,62;[M + H+] encontrado 311,3.

Exemplo 4

Ester 1-[2-(4-{[(R)-2-(3-formilamino-4-hidroxifenil)-2-hidroxietilamino]metil}-2/5-dimetilfenilcarbamoil) etil]piperidin-4-ílico do ácido bifenil-2-ilcarbâmico

Etapa A - 2,5-dimetil-4-nitrobenzoato de metila

A uma solução agitada de ácido 2,5-dimetil-4-nitrobenzóico (4 8 0 mg, 2,4 mmol) em metanol (8,2 mL) a 0°Csob nitrogênio seco foi adicionado cloreto de tionila(0,538 mL, 7,38 mmol). A mistura resultante foi deixada aaquecer até temperatura ambiente e agitada por cerca de 7horas. Cloreto de tionila adicional (0,300 mL) foiadicionado e a agitação foi continuada à temperaturaambiente durante a noite. O solvente foi removido sobpressão reduzida e o resíduo foi dissolvido em acetato deetila (30 mL). Esta solução foi lavada com bicarbonato desódio aquoso saturado, seca sob sulfato de sódio anidro econcentrada sob pressão reduzida para fornecer 2,5-dimetil-4-nitrobenzoato de metila (578 mg) como um sólido amareloclaro. HPLC (10-70) Rt = 4,61; 1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ2,57 (3H, s), 2,61 (3H, s), 3,94 (3H, s), 7,82 (1H, s),7,87 (1H, s).

Etapa B - 4-amino-2#5-dimetilbenzoato de metila

A uma solução agitada de 2,5-dimetil-4-nitrobenzoatode metila (523 mg, 2,5 mmol) em uma mistura 9:1 de metanole água (25 mL no total) a 0°C foi adicionado cloreto deamônio (401 mg, 7,5 mmol). Zinco (1,63 g, 25 mmol) foiadicionado em porções e a mistura resultante foi agitada àtemperatura ambiente durante a noite. A mistura reacionalfoi então filtrada através de Celite, e o absorvente deCelite foi lavado com metanol. 0 filtrado foi concentradosob pressão reduzida e o resíduo resultante foi dissolvidoem acetato de etila. Esta solução foi lavada combicarbonato de sódio aquoso saturado, seca sob sulfato desódio anidro e concentrada sob pressão reduzida parafornecer 4-amino-2,5-dimetilbenzoato de metila (450 mg)como um óleo amarelo. 1H NMR (300 MHzi CDCl3) δ 2,14 (3H,s), 2,53 (3H, s), 3,83 (3H, s), 3,85 (2H, br s), 6,48 (1H,s), 7,72 (1H, s).Etapa C - 4-{3-[4-(bifenil-2-ilcarbamoiloxi)piperidin-l-il] propionilamino}2, 5-dimetilbenzoato de metila

A uma solução agitada de ácido 3-[4-(bifenil-2-ilcarbamoiIoxi)piperidin-l-il]propiônico (670 mg, 1,82mmol) e 4-amino-2,5-dimetilbenzoato de metila (390 mg, 2,18mmol) em dichlorometano (3,6 mL) e diisopropiletilamina(0,413 mL) foi adicionado hexafluorofosfato de o-(7-azabenzotriazol-l-il)-1,1,3,3-tetrametilurônio (HATU) (829mg, 2,18 mmol). A mistura resultante foi agitada àtemperatura ambiente durante a noite. A mistura foi entãolavada com solução saturada aquosa de bicarbonato de sódio,seca sobre sulfato de sódio anidro e concentrada sobpressão reduzida. 0 resíduo foi purificado porcromatografia de sílica gel eluindo-se com diclorometanocontendo de 3% a 5% de metanol para fornecer 4-{3-[4-(bifenil-2-ilcarbamoiloxi)piperidin-l-il] propionilamino}-2,5-dimetilbenzoato de metila (568 mg, 59% de rendimento).LCMS (10-70) Rt= 4,55; [M + H+] encontrado 530,4.

Etapa D - Ester l-{2-[(4-hidroximetil-2,5-dimetilfenilcarbamoil)etil]piperidin-4-ílico do ácidobifenil-2-ilcarbâmico

A uma solução agitada de hidreto de lítio e alumínioIM em THF (1,52 mL, 1,52 mmol) a 0°C foi adicionado 4-{3-[4- (bifenil-2-ilcarbamoiloxi) piperidin-l-il] propionilamino}-2,5-dimetilbenzoato de metila (400 mg, 0,76 mmol). Amistura resultante foi agitada a 0°C por 30 minutos e entãouma mistura 1:1 de hidróxido de sódio aquoso IM (5 mL) eágua (5 mL) foi adicionada e a agitação foi continuada por2 horas. Diclorometano foi adicionado e a camada orgânicafoi separada, seca sobre sulfato de sódio e o solventeremovido sob pressão reduzida. O resíduo foi purificado porcromatografia em sílica gel eluindo-se com diclorometanocontendo 5% de metanol para fornecer o éster l-{2-[(4-hidroximetil-2,5-dimetilfenilcarbamoil) etil] piperidin-4-ílico do ácido bifenil-2-ilcarbâmico. LCMS (10-70)Rt= 3,94;

[M + H+] encontrado 502,5.

Etapa E - Éster 1-[2-(4-formil-2,5-dimetilfenilcarbamoil)etil]piperidin-4-ílico do ácidobifenil-2-ilcarbâmico

A uma solução de éster 1-[2-(4-hidroximetil-2,5-dimetilfenilcarbamoil)etil]piperidin-4-ílico do ac bifenil-2-ilcarmâmico (151 mg, 0,3 mmol) em diclorometano (3 mL) a0°C foi adicionado dimetil sulfõxido (128 μΙ,, 1,8 mmol) ediisopropiletilamina (157 μΐ., 0,9 mmol). Após 15 minutos, ocomplexo trióxido de enxofre-piridina (143 mg, 0,9 mmol)foi adicionado e a agitação a 0°C foi continuada por 1hora. Água foi adicionada para temperar a reação e ascamadas foram separadas. A camada orgânica foi seca sobresulfato de sódio anidro, filtrada e o solvente removido sobpressão reduzida para fornecer o éster 1-[2-(4-formil-2,5-dimetilfenilcarbamoil)etil]piperidin-4-ílico do ácidobifenil-2-ilcarbâmico (150 mg, 100% de rendimento) , que foiusado sem purificação adicional. [M + H+] encontrado 500,4.

Etapa F - Éster 1- [2- (4-{[(R)-2-(terc-butildimetilsilaniloxi) -2-(3-formilamino-4-hidroxifenil)etilamino]metil}-2, 5-dimetilf enilcarbamoil) etil]piperidin-4-ílico do ácido bifenil-2-ilcarbâmico

Uma solução de éster 1- [2-(4-formil-2,5-dimetilfenilcarbamoil)etil]piperidin-4-ílico do ácidobifenil-2-ilcarbâmico (150 mg, 0,30 mmol) e N- {5-[(R)-2-amino-1-(terc-butildimetilsilaniloxi)etil] -2-hidroxifenil}formamida (112 mg, 0,36 mmol) em uma mistura 1:1 de mistura1:1 de diclorometano e metanol (3,0 mL total) foi agitada àtemperatura ambiente por 3 0 minutos. Triacetoxiborohidretode sódio (191 mg, 0,9 mmol) foi adicionado e a misturaresultante foi agitada à temperatura ambiente durante anoite. Ácido acético foi adicionado para temperar a reaçãoe a mistura foi concentrada sob pressão reduzida parafornecer o éster 1-[2-(4 - { [ (J?)-2-(terc-butildimetilsilaniloxi) -2-(3-formilamino-4-hidroxifenil)etilamino]metil} -2,5-dimetilfenilcarbamoil)etil] piperidin-4-llico do ácido bifenil-2-ilcarbâmico, quefoi usados sem purificação adicional. LCMS (iü-'/o)Kt= 4,bb;[M + H+] encontrado 794,6.

Etapa G - Éster 1-[2-(4-{[(R)-2-(3-formilamino-4-hidroxifenil)-2-hidroxietilamino] metil}-2,5-dimetilfenilcarbamoil)etil]piperidin-4-ílico do ácidobifeni1-2 -i1carbâmico

A uma suspensão do éster 1-[2-(4-{ [ (i?)-2-(terc-butildimetilsilaniloxi) -2-(3-formilamino-4-hidroxifenil)etilamino]metil}-2,5-dimetilfenilcarbamoil)etil] piperidin-4-ílico do ácido bifenil-2-ilcarbâmico (238 mg, 0,30 mmol)em diclorometano (3,0 mL) foi adicionado trihidrofluoretode trietilamina (147 μL> 0,90 mmol). Esta mistura foiagitada à temperatura ambiente durante a noite e então amistura foi concentrada sob pressão reduzida. 0 resíduo foipurificado por prep-RP-HPLC (gradiente: 2 a 50% deacetonitrila em água com 0,05% de TFA) . As fraçõesapropriadas foram coletadas, combinadas e liofilizadas parafornecer éster 1- [2-(4-{ [ (R)-2-(3-formilamino-4-hidroxifenil)-2-hidroxietilamino]metil}-2,5-dimetilfenilcarbamoil)etil]piperidin-4-ílico do ácidobifenil-2-ilcarbâmico como o sal ditrifluoroacetato (50 mg,97% de pureza). LPLC (2-90)Rt= 2,76; [M + H+] encontrado680,8.

Exemplo 5

Ester 1-[2-(4-{[(R)-2-(3-formilamino-4-hidroxifenil)-2-hidroxietilamino] metil} -2, 5-dimetilfenilcarbamoil)etil]piperidin-4-ílico do ácido bifenil-2-ilcarbâmico

Etapa A - dibenzil-(4-iodo-2,5-dimetilfenil)amina

A um frasco de fundo redondo de 2 litros equipado comum agitador suspenso, controle de temperatura e um funil deadição, foi adicionada 4-iodo-2,5-dimetilanilina (100,0 g,0,405 mol) (a partir de Spectra Group Limited, Inc.,Millbury, OH) . Etanol (IL) e carbonato de potássio sólido(160 g, 1,159 mol) foram adicionados e então brometo debenzila puro (140 mL, 1,179 mol) foi adicionado em umaporção. A mistura resultante foi agitada a 300C por cercade 18 horas em cujo tempo o HPLC apresentou mais de 98% deconversão. A mistura foi então resfriada até temperaturaambiente e os hexanos (IL) foram adicionados. Esta misturafoi agitada por 15 minutos e então filtrada através de umpapel de filtro para remover sólidos e o bolo do filtro foilavado com hexanos (200 mL) . Usando-se um rotoevaporador, ovolume do filtrado foi reduzido a cerca de 500 mL e ácidohidroclórico concentrado (30 mL) foi adicionado. 0 solventerestante foi então removido usando-se um rotoevaporador. Aoresíduo resultante foram adicionados hexanos (500 mL) eesta mistura foi agitada por cerca de 3 0 minutos em cujotempo uma mistura semifluida não aglomerada foi formada. Amistura semifluida foi filtrada e o bolo do filtro foilavado com hexanos (200 mL) e seco para fornecerhidrocloreto de dibenzil-(4-iodo-2,5-dimetilfenil)amina(115 g, 62% de rendimento, 97,5% de pureza) como um sólidode cor esverdeada.

O hidrocloreto de dibenzil-(4-iodo-2,5-dimetilfenil)amina foi transferido a um frasco de 3L etolueno (IL) e hidróxido de sódio aquoso IM (IL) foramadicionados. A mistura resultante foi agitada por 1 hora eentão as camadas foram separadas. A camada orgânica foilavada com salmoura diluída (500 mL) e o solvente foiremovido por rotoevaporação para fornecer dibenzil-(4-iodo-2,5-dimetilfenil) amina (80 g) como um óleo espesso semi-sólido. (Alternativamente, diclorometano pode ser usado nolugar de tolueno nesta etapa). 1H NMR (3 00 MHz, DMSO-d6) δ2,05 (3H, s), 2,19 (3H, s) , 3,90 (4H, s) , 6,91 (1H, s),7,05-7,20 (10H, m), 7,42 (1H, s); MS [M H+] encontrado 428.

Etapa B - Hidrocloreto de 4-dibenzilamino-2,5-dimetilbenzaldeído

A um frasco de fundo redondo de 3 gargalos de 1 litroequipado com um agitador suspenso, controle de temperaturae um funil de adição, foi adicionada dibenzil-(4-iodo-2,5-dimetilfenil) amina (15 g, 35 mmol). Tolueno (300 mL) foiadicionado e a mistura resultante foi agitada por cerca de15 minutos. O frasco de reação foi purgado com nitrogênioseco resfriado a cerca de -20°C e rz-butil-lítio 1,6 M emhexanos (33 mL, 53 mmol) foi adicionado gota a gota atravésdo funil de adição. Durante a adição, a temperatura internada mistura reacional foi mantida abaixo de -10°C. Quando aadição estava completa, a mistura resultante foi agitada acerca de -15°C por 15 minutos. N,N-dimetilformamida (10 mL,139 mmol) foi então adicionada gota a gota enquanto semantinha a temperatura interna da reação abaixo de 0°C. Amistura resultante foi então agitada entre -20°C e 0°C porcerca de 1 hora. Ácido hidroclórico IM aquoso (200 mL) foientão adicionado durante um período de 5 minutos e amistura resultante foi agitada por 15 minutos. As camadasforam então separadas e a camada orgânica foi lavada comsalmoura diluída (100 mL). A camada orgânica foi então secasobre sulfato de sódio anidro, filtrada e o solventeremovido sob pressão reduzida para fornecer hidrocloreto de4-dibenzilamino-2,5-dimetilbenzaldeído (11,5 g, 90% derendimento, 95% de pureza) como um óleo espesso que sesolidificou sob repouso. O produto continha cerca de 3 a 5%do subproduto desiodado. 1H NMR (3 00 MHz, DMSO-d6) δ 2.42(3H, s) , 2.50 (3H, s) , 4.25 (4H, s) , 6.82 (1H, s) , 7.10-7.30 (10H, m) , 7.62 (1H, s) , 10.15 (1H, s) ; MS [M + H+]encontrado 33 0,3.

Etapa C - 4-[1#3]dioxolan-2-il-2,5-dimetilfenilamina

A um frasco de fundo redondo de 500 mL foi adicionadohidrocloreto de 4-dibenzilamino-2,5-dimetilbenzaldeído(11,5 g, 31,4 mmol) e tolueno (150 mL) e a misturaresultante foi agitada até que o sal estivessecompletamente dissolvido. O frasco de reação foi entãopurgado com nitrogênio seco por 5 minutos. Etileno glicol(5,25 mL, 94,2 mmol) e ácido p-toluenossulfônico (760 mg,6,2 mmol) foram adicionados e a mistura resultante foiaquecida a uma temperatura entre 60°C e 80°C por cerca de20 horas. O solvente foi então removido lentamente (durantecerca de 4 0 minutos) a 40 0C era um evaporador rotativo.Tolueno (100 mL) foi adicionado ao resíduo e o solvente foinovamente removido lentamente a 40 °C em um evaporadorrotativo. Este processo foi repetido usando-se uma outraalíquota de tolueno (100 mL) e a mistura foi evaporada àsecura. Acetato de etila (150 mL) e bicarbonato de sódioaquoso saturado (100 mL) foram adicionados ao resíduo e ascamadas foram separadas. A camada orgânica foi lavada comsalmoura (50 mL) e então seca sobre sulfato de sódioanidro, filtrada e concentrada sob pressão reduzida parafornecer dibenzil-(4- [1,3]dioxolan-2-il-2,5-dimetil-fenil)amina bruta (11,4 g).

A dibenzil-(4-[1,3]dioxolan-2-il-2,5-dimetil-fenil)amina bruta foi dissolvida em uma mistura 2:1 deetanol e água (total de 150 mL) e a mistura resultante foipurgada com nitrogênio seco por 5 minutos. Paládio emcarbono (2,3 g, 10% em peso contendo cerca de 50% de água)e bicarbonato de sódio sólido (1,0 g) foram adicionados e amistura resultante foi hidrogenada a cerca de 101,33 kPa dehidrogênio a uma temperatura entre 250C e 3 00C por cerca de8 horas. A mistura foi então filtrada através de Celite e ofiltrado foi concentrado em um evaporador rotativo parafornecer a 4-[1,3]dioxolan-2-il-2,5-dimetilfenilamina bruta(5,6 g, 92% de rendimento) como um óleo espesso. 1H NMR(300 MHz, DMSO- dç) δ 2,05 (3H, s) , 2,22 (3H, s) , 3,7-3,9(4H, m) , 3,95 (4H, s) , 5,59 (1H, s) , 6,72 (1H, s) , 7,0-7,25(11H, m).

Etapa D - N-(4-[1,3]dioxolan-2-il-2,5-dimetilfenil)acrilamida

A um frasco de fundo redondo de 500 mL foramadicionados 4-[1,3]dioxolan-2-il-2,5-dimetilfenilaminabruta (5,6 g, 29 mmol) , diclorometano (100 mL) ediisopropiletilamina (7,6 mL, 43,5 mmol). A misturaresultante foi agitada à temperatura ambiente até que osingredientes estivessem dissolvidos e então a mistura foiresfriada a 0°C. Cloreto de acriloíla (2,35 mL, 29 mmol)foi então adicionado gota a gota durante um período de 5minutos. A mistura reacional foi agitada entre 0°C e 50Cpor 1 hora e então água (50 mL) foi adicionada e a agitaçãofoi continuada por cerca de 30 minutos em cujo tempo ossólidos finos foram formados. A mistura foi filtrada paracoletar os sólidos. As camadas do filtrado foram entãoseparadas e a camada orgânica foi concentrada sob pressãoreduzida à secura. Diclorometano (50 mL) foi adicionado aoresíduo e esta mistura foi agitada até que uma misturasemifluida não aglomerada fosse desenvolvida. A misturasemifluida foi filtrada (usando-se o mesmo funil usado paracoletar os sólidos finos acima) e o bolo do filtro foilavado com diclorometano (10 mL) e seco para fornecer N- (4-[1,3]dioxolan-2-il-2,5-dimetilfenil)acrilamida (3,1 g, 97%de pureza) como um sólido de branco gelo a branco.

0 filtrado acima foi então concentrado à secura emetanol (10 mL) foi adicionado ao resíduo. Esta mistura foiagitada por 15 minutos e então o precipitado foi coletadopor filtração, lavado com metanol (5 mL) e seco para daruma "safra" de N- (4-[1,3]dioxolan-2-il-2,5-dimetilfenil)acrilamida (0,8 g, 95% de pureza). 1H NMR (300MHz, CD3OD) δ 2,10 (3H, s) , 2,23 (3H, s) , 3,85-4,10 (4H,m) , 5,60-6,40 (3H, m) , 5,59 (1H, s) , 7,18 (1H, s) , 7,23(1H, s) .Etapa E - Hidrocloreto do éster 1-[2-(4-formil-2,5-dimetilfenilcarbamoil)etil]piperidin-4-ílico do ácidobifenil-2-ilcarbâmico

A um frasco de fundo redondo de 50 mL foi adicionado oéster piperidin-4-ílico do ácido bifenil-2-ilcarbâmico (1,2g, 4,04 mmol) e N- (4-[1,3]dioxolan-2-il-2,5-dimetilfenil)acrilamida (1,0 g, 4,04 mmol). Etanol (10 mL)e diclorometano (10 mL) foram adicionados para formar umamistura semifluida. A mistura reacional foi aquecida entre45°C e 50°C por cerca de 18 horas e então resfriada atétemperatura ambiente. Ácido hidroclórico aquoso IM (10 mL)foi adicionado e a mistura resultante foi agitadavigorosamente por cerca de 3 horas. Diclorometano (10 mL)foi adicionado e a mistura resultante foi agitada por cercade 5 minutos. As camadas foram então separadas e a camadaorgânica foi seca sobre sulfato de sódio anidro, filtrada econcentrada em um evaporador rotativo para fornecer ohidrocloreto do éster 1-[2-(4-formil-2,5-dimetilfenilcarbamoil)etil]piperidin-4-ílico do ácidobifenil-2-ilcarbâmico bruto (1,9 g) . 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 1,2-1,4 (2H, m) , 1,58-1,75 (2H, m) , 2,0-2,17 (2H, m) ,2,19 (3H, s) , 2,38 (3H, s) , 2,41-2,50 (4H, m) , 2,5-2,75(2H, m) , 4,31-4,42 (1H, m) , 7,10-7,35 (9H, m) , 7,55 (1H,S) , 7,75 (1H, S) , 8,59 (1H, s) , 9,82 (1H, s) , 9,98 (1H, s) ;MS [M + H+] encontrado 500,2.

Etapa F - Éster 1-[2-(4-{ [ (JZ)-2-(terc-butildimetilsilaniloxi)-2- (3-formilamino-4-hidroxifenil)etilamino]]metil}-2, 5-dimetilfenilcarbamoil)etil]piperidin-4-ílico do ácidobifenil-2-ilcarbâmicoA um frasco de fundo redondo de três gargalos de 2Lforam adicionados hidrocloreto do éster 1-[2-(4-formil-2,5-dimetilfenilcarbamoil)etil]piperidin-4-ílico do ácidobifenil-2-ilcarbâmico (38 g, 70 mmol) e o sal do ácidoacético de N-{5-[(R)-2-amino-1-(terc-butildimetilsilaniloxi) etil] -2-hidroxifenil}formamida (33,6g, 91 mmol). Diclorometano (500 mL) e metanol (500 mL)foram adicionados e a mistura resultante foi agitada àtemperatura ambiente sob nitrogênio seco por cerca de 3horas. A mistura reacional foi então resfriada entre 0°C e5°C e triacetoxiborohidreto de sódio sólido (44,5 g, 381mmol) foi adicionado em porções por um período de 10minutos. A mistura reacional foi aquecida lentamente a 0°Caté temperatura ambiente durante um período de cerca de 2horas e então resfriada a 0°C. Bicarbonato de sódio aquososaturado (500 mL) e diclorometano (500 mL) foramadicionados. Esta mistura foi agitada completamente e entãoas camadas foram separadas. A camada orgânica foi lavadacom salmoura (500 mL), seca sobre sulfato de sódio anidro,filtrada e concentrada sob pressão reduzida para fornecer oéster 1- [2- (4-{ [ (R)-2-(terc-butildimetilsilaniloxi)-2-(3-formilamino-4-hidroxifenil)etilamino] metil}-2,5-dimetilfenilcarbamoil)etil]piperidin-4-ílico do ácidobifenil-2-ilcarbâmico bruto (55 g, 86% de pureza) como umsólido amarelo.

O produto bruto (30 g) foi dissolvido em diclorometanocontendo 2% de metanol (total de 150 mL) e carregado sobrecoluna de sílica gel (300 g) que foi empacotada eequilibrada com diclorometano contendo 2% de metanol e 0,5%de hidróxido de amônio. O produto foi eluído da colunausando diclorometano contendo 2% de metanol e 0,5% dehidróxido de amônio (IL), diclorometano contendo 4% demetanol e 0,5% de hidróxido de amônio (IL) e diclorometanocontendo 5% de metanol e 0,5% de hidróxido de amônio (cercade 3L) . Frações (200 mL) foram coletadas e aquelas fraçõesque possuíam pureza maior que 90% foram combinadas econcentradas sob pressão reduzida para fornecer o éster 1-[2- (4- { [ (R) -2- (terc-butildimetilsilaniloxi) -2- (3-formilamino-4-hidroxifenil)etilamino] metil}-2, 5-dimetilfenilcarbamoil)etil]piperidin-4-ílico do ácidobifenil-2-ilcarbâmico bruto (21,6 g, 96,5% de pureza) comoum sólido amarelo. MS [M + H+] encontrado 794,6.

Etapa G - Sal hidrofluoreto do éster 1- [2-(4-{ [ (R) -2-(3 - formi lamino - 4 - hidroxi f eni 1) - 2 - hidroxie ti lamino] me t i 1} -2, 5-dimetilfenilcarbamoil) etil] piperidin-4-ílico do ácidobifenil-2-ilcarbâmico

A um frasco de fundo redondo de IL foi adicionado oéster 1- [2- (4- { [(R)-2-(terc-butildimetilsilaniloxi)-2-(3-formilamino-4-hidroxifenil)etilamino] metil}-2, 5-dimetilfenilcarbamoil)etil]piperidin-4-ílico do ácidobifenil-2-ilcarbâmico (21,5 g, 27,1 mmol) e diclorometano(200 mL) . A mistura resultante foi agitada à temperaturaambiente até que os ingredientes estivessem dissolvidos eentão trihidrofluoreto de trietilamina (8,85 mL, 54,2 mmol)foi adicionado e a mistura resultante foi agitada a 25°Cpor cerca de 48 horas. 0 solvente foi removido em umevaporador rotativo para fornecer uma pasta espessa.Diclorometano (100 mL) e acetato de etila (200 mL) foramadicionados à pasta e a mistura resultante foi agitada por30 minutos. A mistura semifluida resultante foi lentamentefiltrada sob nitrogênio seco e o bolo do filtro foi lavadocom uma mistura 1:2 de diclorometano e acetato de etila(total de 100 mL), seca sob nitrogênio por 2 horas e entãoseca a vácuo durante a noite para fornecer o éster l-[2-(4-{[(R)-2-(3 -formilamino-4-hidroxifenil) -2-hidroxietilamino]metil}-2,5-dimetilfenilcarbamoil)etil] piperidin-4-ílico doácido bifenil-2-ilcarbâmico como um sal hidrofluoreto (25g, 96,9% de pureza) que era um sólido tipo argila duro. MS[M + H+] encontrado 680,8.

Etapa H - Ester 1-[2-(4-{ [ (R)-2-(3-formilamino-4-hidroxifenil)-2-hidroxietilamino]metil}-2, 5-dimetilfenilcarbamoil)etil]piperidin-4-ílico do ácidobifenil-2 -ilcarbâmico

O sal hidrofluoreto do éster 1- [2-(4-{ [(R)-2-(3-formilamino-4-hidroxifenil) -2-hidroxietilamino] metil}-2, 5-dimetilfenilcarbamoil)etil]piperidin-4-ílico do ácidobifenil-2-ilcarbâmico (25 g) foi purificado em uma colunade fase reversa de 15,24 cm (fase sólida de Microsorb) emtrês lotes iguais usando-se uma mistura de 10% a 50% deacetonitrila em água contendo ácido trifluoroacético 1%como a fase móvel. As frações com pureza maior que 99%foram combinadas e então diluídas com um volume de água. Amistura resultante foi resfriada a O0C e bicarbonato desódio sólido foi adicionado até que o pH da mistura fossede cerca de 7,5 a 8,0. Dentro de cerca de 5 minutos,desenvolveu-se uma mistura semifluida branca. A misturasemifluida foi agitada por 30 minutos, filtrada. 0 bolo dofiltro foi lavado com água (500 mL) , seco a ar por cerca de4 horas e então seco a vácuo durante a noite para fornecero éster 1- [2-(4-{ [(R)-2-(3-formilamino-4-hidroxifenil)-2-hidroxietilamino]metil}-2,5-dimetilfenilcarbamoil) etil]piperidin-4-ílico do ácido bifenil-2-ilcarbâmico (12 g,99+% de pureza) como uma base livre semi-cristalina.Exemplo 6

Ester 1-[2-(4-{[(R)-2-(3-formilamino-4-hidroxifenil) -2-hidroxietilamino]metil}-2,5-dimetilfenilcarbamoil) etil]piperidin-4-xlico do ácido bifenil-2-ilcarbâmico

Etapa A - Ester 1- [2-(4-[1,3]dioxolan-2-il-2,5-dimetilfenilcarbamoil]etil}piperidin-4-ílico do ácidobifenil-2-ilcarbâmico

A um frasco de fundo redondo de 500 mL foi adicionadoo éster piperidin-4-ílico do ácido bifenil-2-ilcarbâmico(17,0 g, 58 mmol) e N- (4-[1,3]dioxolan-2-il-2,5-dimetilfenil)acrilamida (13,1 g, 52,9 mmol). Etanol (150mL) e diclorometano (150 mL) foram adicionados para formaruma mistura semifluida. A mistura reacional foi aquecidaentre 500C e 550C por cerca de 24 horas e então resfriadaaté temperatura ambiente. A maior parte do solvente foiremovida em um evaporador rotativo, resultando em umamistura semifluida espessa. Etanol (grau reagente) foiadicionado para formar um volume total de cerca de 200 mL ea mistura resultante foi aquecida a 8 00C e então resfriadalentamente até temperatura ambiente. A mistura semifluidaespessa resultante foi filtrada, lavada com etanol (20 mL)e seca a vácuo para fornecer o éster 1-[2-(4-[1,3]dioxolan-2-il-2, 5-dimetilfenilcarbamoil]etil}piperidin-4-ílico doácido bifenil-2-ilcarbâmico (23,8 g, cerca de 98% depureza) como um sólido branco.

Etapa B - Éster l-{2-[ (4-formil-2,5-dimetilfenilcarbamoil)etil]piperidin-4-ílico do ácidobifenil-2-ilcarbâmico

A um frasco de fundo redondo de 500 mL foramadicionados o éster 1-[2-(4-[1,3]dioxolan-2-il-2,5-dimetilfenilcarbamoil]etil}piperidin-4-ílico do ácidobifenil-2-ilcarbâmico (15 g, 27,6 mmol) e acetonitrila (150mL) para formar uma mistura semifluida. Ácido hidroclóricoaquoso 2M (75 mL) foi adicionado e a mistura resultante foiagitada a 300C por 1 hora. A mistura foi então resfriadaaté temperatura ambiente e acetato de etila (150 mL) foiadicionado. Ácido hidroclórico aquoso 2M (75 mL) foiadicionado, o pH foi verificado e então hidróxido de sódio2M adicional foi adicionado até que o pH da soluçãoestivesse na faixa de 9 a 10. As camadas foram separadas ea camada orgânica foi lavada com salmoura diluída (75 mL;1:1 salmoura/água). Seca sobre sulfato de sódio anidro e osolvente removido em um evaporador rotativo para fornecer oéster 1-{2-[(4-formil-2,5-dimetilfenilcarbamoi1) etil]piperidin-4-ílico do ácido bifenil-2-ilcarbâmico (12,5 g,cerca de 98% de pureza) . Se desejado, a pureza desteintermediário pode ser aumentada formando-se uma misturasemifluida com etanol (3 volumes de etanol), aquecendo-se amistura semifluida a 80°C, e então resfriando-se lentamenteaté temperatura ambiente e isolando-se por filtração.Etapa C-Éster 1- [2-(4-{ [ (R)-2-(terc-butildimetilsilaniloxi) -2-(3-formilamino-4-hidroxifenil)etilamino] metil}-2, 5-dimetilfenilcarbamoil) etil] piperidin-4-ílico do ácido bifenil-2-ilcarbâmico

A um frasco de fundo redondo de 250 mL foramadicionados éster 1-[2-(4-formil-2,5-dimetilfenilcarbamoil)etil]piperidin-4-ílico do ácidobifenil-2-ilcarbâmico (7,1 g, 14,2 mmol) e o sal do ácidoacético de N-{5-[(R)-2-amino-l-(terc-butildimetilsilaniloxi) etil] -2-hidroxifenil}formamida (5,8g, 15,6 mmol). Metanol (100 mL) foi adicionado para formaruma mistura semifluida e esta mistura foi agitada entre45°C e 50°C sob nitrogênio por 1 hora. A mistura foi entãoresfriada até temperatura ambiente e tolueno (50 mL) foiadicionado e o solvente foi removido em um evaporadorrotativo a uma temperatura variando de 35°C a 45°C. Tolueno(50 mL) foi adicionado ao resíduo e o solvente foi removidopara fornecer éster 1-[2-(4-{ [ (R)-2-(terc-butildimetilsilaniloxi) -2- (3-formilamino-4-hidroxifenil)etilamino]] metil} -2, 5-dimetilfenilcarbamoil) etil] piperidin-4-ílico do ácido bifenil-2-ilcarbâmico (12 g) como umsólido amarelo-laranja.

Etapa D - Éster 1- [2 -(4-{[(R)-2 -(terc-butildimetilsilaniloxi) -2- (3-formilamino-4-hidroxifenil)etilamino] metil}-2,5-dimetilfenilcarbamoil)etil]piperidin-4-ílico do ácido bifenil-2-ilcarbâmico

A um frasco de hidrogenação foi adicionado o éster 1-[2-(4-{[(R)-2-(terc-butildimetilsilaniloxi) -2- (3-formilamino-4-hidroxifenil)etilamino] metil}-2,5-dimetilfenilcarbamoil)etil]piperidin-4-ílico do ácidobifenil-2-ilcarbâmico (4,6 g) e 2-metiltetrahidrofurano (50mL). A mistura resultante foi agitada até que o sólidoestivesse dissolvido (cerca de 5 minutos) e então a misturafoi purgada com nitrogênio. Platina em carbono (920 mg, 5%em peso, carbono em suporte ativado) foi adicionada e amistura foi hidrogenada a 0,344 MPa (agitador Parr) por 6horas. A mistura foi então filtrada através de Celite, e oCelite foi lavado com 2-metiltetrahidrofurano (10 mL) . Aofiltrado foi adicionada uma sílica gel modificada comtiopropil (20% de peso de solução, Silicycle) e estamistura foi agitada a uma temperatura entre 250C e 30°C por3 horas. A mistura foi então filtrada através de Celite econcentrada para remover o solvente. 0 resíduo foidissolvido em metanol (5 mL por grama de resíduo) e então asolução resultante foi adicionada lentamente a uma mistura1:1 vigorosamente agitada de bicarbonato de sódio aquoso eágua (4 0 mL por grama de resíduo) . A mistura semifluidabranco gelo resultante foi agitada por 20 minutos e entãofiltrada. 0 bolo do filtro foi lavado com água (20volumes) , seco a ar por cerca de 3 horas e então seco avácuo à temperatura ambiente durante a noite para fornecero éster 1- [2-(4-{ [ (i?) -2-(terc-butildimetilsilaniloxi)-2-(3-formilamino-4-hidroxifenil)etilamino] metil}-2,5-

dimetilfenilcarbamoil) etil]piperidin-4-ílico do ácidobifenil-2-ilcarbâmico (80% de recuperação, 96% de pureza) .

Etapa E - Sal L-tartrato do éster 1- [2-(4-{ [ (JS) -2-(3-formilamino-4-hidroxifenil) -2-hidroxietilamino]metil}-2, 5-dimetilfenilcarbamoil)etil]piperidin-4-ílico do ácidobifenil-2-ilcarbâmico

A um frasco de fundo redondo de 200 mL foi adicionadoo éster 1-[2-(4-{[ (J?)-2-(terc-butildimetilsilaniloxi)-2-(3-formilamino-4-hidroxifenil)etilamino] metil}-2,5-dimetilfenilcarbamoil)etil]piperidin-4-ílico do ácidobif enil - 2 - ilcarbâmico (3,8 g, 4,8 mmol) e 2-metiltetrahidrofurano (40 mL) . A mistura resultante foiagitada à temperatura ambiente até que os ingredientesestivessem dissolvidos (cerca de 15 minutos) e entãotrihidrofluoreto de trietilamina (0,94 mL, 5,76 mmol) foiadicionado e a mistura resultante foi agitada a 250C porcerca de 24 horas. A esta mistura foi adicionada umamistura 1:1 de bicarbonato de sódio aquoso saturado e água(40 mL) e 2-metiltetrahidrofurano e a mistura resultantefoi agitada até que o sólido estivesse dissolvido (soluçãode pH de cerca de 8) . As camadas foram separadas e a camadaorgânica foi lavada com salmoura (30 mL) , seca sobresulfato de sódio anidro, filtrada e concentrada em umevaporador rotativo. O resíduo foi dissolvido em 2-metiltetrahidrofurano (50 mL) e o ácido L-tartárico sólido(650 mg) foi adicionado. A mistura resultante foi agitada auma temperatura entre 25°C e 30°C por 18 horas e entãofiltrada através de filtro de papel. 0 bolo do filtro foilavado com 2-metiltetrahidrofurano (10 mL) , isopropanol (10mL) e imediatamente colocado sob vácuo para fornecer o saldo ácido L-tartárico do éster 1-[2-(4-{ [ (J?)-2-(3-formilamino-4-hidroxifenil)-2-hidroxietilamino]metil}-2, 5-dimetilfenilcarbamoil)etil]piperidin-4-ílico do ácidobifenil-2-ilcarbâmico (3,7 g, >97% de pureza).

Etapa F - Éster 1-[2-(4-{ [ (Λ)-2-(3-formilamino-4-hidroxifenil)-2-hidroxietilamino] metil}-2,5-dimetilfenilcarbamoil)etil]piperidin-4-ílico do ácidobifenil-2-ilcarbâmico

A um frasco de fundo redondo de 250 mL foi adicionadoo sal do ácido L-tartárico do éster 1-[2-(4-{ [ (J2)-2-(3-formilamino-4-hidroxifenil) - 2-hidroxietilamino] metil} - 2 , 5-dimetilfenilcarbamoil)etil]piperidin-4-ílico do ácidobifenil-2-ilcarbâmico (3,5 g) e metanol (35 mL) e a misturaresultante foi agitada por 15 minutos. Uma mistura 1:1 debicarbonato de sólido aquoso saturado e água (70 mL) foiadicionada por um período de 5 minutos e a agitação foicontinuada por 2 horas. A mistura semifluida branco geloresultante foi filtrada e o bolo do filtro foi lavado comágua (20 mL) , seco a ar por cerca de 2 horas e então seco avácuo durante a noite para fornecer o éster 1-[2-(4-{ [ (J?)-2- (3-formilamino-4-hidroxifenil) -2-hidroxietilamino]metil}-2, 5- dimetilfenilcarbamoil)etil]piperidin-4-íIico do ácidobif enil-2-ilcarbâmico (2,3 g) como uma base livre semi-cristalina.

Espectros 1H e 13C NMR foram obtidos para uma amostrado éster 1-[2-(4-{ [ (i?)-2-(3-formilamino-4-hidroxifenil)-2-hidroxietilamino]metil}-2,5-dimetilfenilcarbamoil) etil]piperidin-4-ílico do ácido bifenil-2-ilcarbâmico (22,2 mgem cerca de 0,75 mL de DMS0-d6) à temperatura ambienteusando-se o espectrômetro JEOL ECX-4 00 NMR:

1H NMR (4 00 MHz, DMSO-d6) , isômero principal, δ 9,64(br, 1H) , 9,54 (br s, 1H) , 9,43 (s, 1H), 8,67 (s, 1H) , 8,26(s, 1H) , 8,03 (d, J = 1,9, 1H) , 7,25-7,45 (m, 9H) , -7,3(nd, 1H) , 7,07 (s, 1H) , 6,88 (dd, J = 8,2, 1,9, 1H) , 6,79(d, J = 8,2, 1H), 5,15 (br, 1H), 4,53 (dd, J = 7,3,4,7,1H),4,47 (m, 1H) , -3,65 e -3,60 (par AB, 2H) , 2,68 (br m, 2H) ,-2,59 (nd, 4H) , 2,44 (br t, J = 6,5,2H), 2,20 (s, 3H) , -2,17 (br m, 2H) , 2,14 (s, 3H) , 1,73 (br, 2H) , l,44(brq,J=-9,0,2H).

1H NMR (4 00 MHz, DMSO-d6) , isômero em menorquantidade, δ 9,64 (br, 1H), 9,43 (s 1H), 9,26 (br d, J =-7,0,1H), 8,67 (s, 1H), 8,50 (br d, J = -7,0,1H), 7,25-7,45(m, 9H) , -7,3 (nd, 1H) , 7,07 (s, 1H), -7,07 (nd, 1H), 6,95(dd, J = 8,3,1,8,1H), 6,83 (d, J =8,3,1H), 5,15 (br, 1H),4,47 (m, 1Η), -3,65 e -3,60 (AB pair, 2Η), 2,68 (br m, 2Η),-2,59 (nd, 2Η), 2,44 (br t, J = 6,5, 2H), 2,20 (s, 3H),-2,17 (br m, 2H), 2,14 (s, 3H), 1,73 (br, 2H), 1,44 (brq,J = -9,0, 2H).

13C NMR (100 MHz, DMSO-de), isômero principal, δ 170,0,159,9, 153,9, 145,5, 139,3, 137,6, 135,2, 135,0, 134,8,133,4, 133,4, 130,2, 130,2, 128,6, 128,2, 127,8, 127,4,127,2, 127,0, 126,1, 125,7, 125,6, 121,7, 118,6, 114,5,71,4, 70,0, 57,4, 53,9, 50,3, 50,1, 33,7, 30,7, 18,2, 17,5.

13C NMR (100 MHz, DMSO-dJ, isômero em menorquantidade, δ 170,0, 163,4, 153,9, 147,8, 139,3, 137,6,135,7, 135,2, 135,0, 134,8, 133,4, 133,4, 130,2, 130,2,128,6, 128,2, 127,8, 127,4, 127,2, 127,0, 126,1, 125,7,123,0, 119,6, 115,6, 71,0, 70,0, 57,3, 53,9, 50,3, 50,1,33,7, 30,7, 18,2, 17,5.

Os espectros de 1H e 13C NMR mostraram a presença de umisômero principal (cerca de 82% em mol) e um isômero emmenor quantidade (cerca de 18% em mol) que se acredita quesejam isômeros rotacionais resultantes de rotação impedidana ligação -NH-C(O)H. Acredita-se que o grupo fenil sejasyn em relação ao oxigênio do grupo carbonil no isômeroprincipal e anti no isômero presente em menor quantidade.

Exemplo 7

Cristais de semente da forma II do Ester l-[2-(4-{[(R)-2-(3-formilamino-4-hidroxifenil) -2-hidroxietilamino]metil}-2,5-dimetilfenilcarbamoil)etil]piperidin-4-ílico doácido bifenil-2-ilcarbâmico

Ester 1- [2- (4-{ [ (R) -2-(3-formilamino-4-hidroxifenil) -2-hidroxietilamino]metil}-2,5-dimetilfenil-carbamoil)etil]30 piperidin-4-ílico do ácido bifenil-2-ilcarbâmico semi-cristalino (500 mg) foi dissolvido em metanol (50 mL) eágua foi adicionada até que o ponto de névoa fossealcançado. A mistura resultante foi agitada a 250C por 3horas e o material cristalino resultante foi isolado pelafiltração para fornecer o éster 1- [2-(4-{[(R)-2-(3-formilamino-4-hidroxifenil) -2-hidroxietilamino] metil} -2, 5-dimetilfenilcarbamoil)etil]piperidin-4-ílico do ácidobifenil-2-ilcarbâmico cristalino (420 mg). Esta base livrecristalina foi determinada para ter um traço decalorimetria de escaneamento diferencial (DSC) que exibe umpico em fluxo de calor endotérmica entre cerca de 1420C acerca de 150°C; e um padrão de difração de raio X em pó(PXRD) possuindo picos de difração significantes, entreoutros picos, em 20 valores de cerca de 20,7 ± 0,3, 21,6 ±0,3, 22,5 ± 0,3 e 23,2 ± 0,3. Esta forma de base livrecristalina é projetada como a Forma II. Informaçãoadicional da Forma II e outras formas de base livrecristalina deste composto estão divulgadas no Pedido U. S.comumente cedido de número _, depositado na mesmadata desta (Procuração n° P-222-US1) e Pedido Provisório U.S. de número 60/794.709, depositado em 25 de abril de 2006,as divulgações destas estão aqui incorporadas parareferência integralmente.

Exemplo 8

Cristalização da forma II do Éster 1- [2 - (4-{[(R)-2-(3-formilamino-4-hidroxifenil) -2-hidroxietilamino] metil}-2, 5-dimetilfenilcarbamoil)etil]piperidin-4-ílico do ácidobifenil-2-ilcarbâmico

A um frasco de fundo redondo de três gargalos de 3Lequipado com um agitador suspenso, controle de temperaturae funil de adição foram adicionados o éster 1-[2-(4-{ [ (J?)-2- (3-formilamino-4-hidroxifenil) -2-hidroxietilamino] metil} -2, 5-dimetilfenilcarbamoil)etil]piperidin-4-llico do ácidobifenil-2-ilcarbâmico semi-cristalino (14 g) e metanol (1,4L) . Água (500 mL) foi adicionada em uma porção e então águaadicional (200 mL) foi adicionada lentamente até que oponto de névoa fosse alcançado. Cristais de semente daforma II do éster 1- [2-(4-{ [ (i?)-2-(3-formilamino-4-hidroxifenil) -2-hidroxietilamino] metil} -2, 5-dimetilfenil-carbamoil)etil]piperidin-4-ílico do ácido bifenil-2-ilcarbâmico (50 mg) foram adicionados e a misturaresultante foi agitada a 250C por 3 horas em cujo tempo umamistura semifluida não aglomerada foi desenvolvida. Água(3 00 mL) foi adicionada por um período de 15 minutos e amistura resultante foi agitada a 250C durante a noite. Amistura foi então filtrada e o bolo do filtro foi lavadocom água (100 mL) , seco a ar por cerca de 2 horas e entãoseco a vácuo à temperatura ambiente durante 4 8 horas parafornecer o éster 1-[2-(4-{[{R)-2-(3-formilamino-4-hidroxifenil)-2-hidroxietilamino] metil}-2,5-dimetilfenilcarbamoil)etil]piperidin-4-ílico do ácidobifenil-2-ilcarbâmico (12,5 g, 99,6% de pureza). Este salcristalino foi determinado para ser a Forma II.

Exemplo 9

Éster 1-[2-(4-formil-2,5-dimetilfenilcarbamoil)etil]piperidin-4-ílico de ácido bifenil-2-ilcarbâmico

Etapa A - 4-iodo-2,5-dimetilfenilamina

A uma solução de 2,5-dimetilanilina (20 g, 165 mmol)em uma mistura 1:1 de diclorometano e metanol (400 mL) foiadicionado bicarbonato de sódio (20,8 g, 250 mmol) edicloroiodato tetrametilamônio (I) (44,7 g, 165 mmol). Amistura resultante foi agitada à temperatura ambiente por 1hora e então água foi adicionada (500 mL). A camadaorgânica foi removida e lavada com 5% de tiossulfato desódio aquoso (.500 mL) e salmoura (500 mL). A camadaorgânica foi então seca sobre sulfato de magnésio anidro,filtrada e concentrada a vácuo para fornecer 4-iodo-2,5-dimetilfenilamina (39,6 g, 98% de rendimento). 0 produtofoi usado sem purificação adicional.

Etapa B - N-(4-iodo-2#5-dimetilfenil)acrilamida

A uma solução de 4-iodo-dimetilfenilamina (37,2 g, 151mmol) em diclorometano (500 mL) foi adicionado bicarbonatode sódio (25,4 g, 302 mmol). A mistura resultante foiresfriada a 0°C e cloreto de acriloíla (12,3 mL, 151 mmol)foi adicionado lentamente por um período de 25 minutos. Amistura resultante foi agitada à temperatura ambientedurante a noite e então filtrada. 0 volume do filtrado foireduzido a cerca de 100 mL e o precipitado foi formado. 0precipitado foi filtrado, seco, lavado com água (IL) eentão seco novamente para fornecer a N- (4-iodo-2,5-dimetilfenil)acrilamida (42,98g, 95% de pureza, 90% derendimento). 0 produto foi usado sem purificação adicional.

Etapa C - Ester 1-[2-(4-iodo-2,5-dimetilfenilcarbamoil)etil]piperidin-4-ílico do ácidobifenil-2-ilcarbâmico

A uma solução de N-(4-iodo-2,5-dimetilfenil)acrilamida(32,2 g, 107 mmol) em uma mistura 6:1 v/v N-dimetilformamida e isopropanol (700 mL) foi adicionado oéster piperidin-4-ílico do ácido bifenil-2-ilcarbâmico(36,3 g, 123 mmol). A mistura resultante foi aquecida a500C por 24 horas e então a 800C por 24 horas. A misturareacional foi então resfriada à temperatura ambiente econcentrada a vácuo. O resíduo foi dissolvido emdiclorometano (IL) e esta solução foi lavada com ácidohidroclórico aquoso IN (500 mL) e água (500 mL), salmoura(500 mL) e solução de bicarbonato de sódio aquoso saturada(500 mL). A camada orgânica foi então seca sobre sulfato demagnésio anidro e filtrada. Etanol (400 mL) foi adicionadoe a mistura resultante foi concentrada a vácuo a um volumede cerca de 400 mL, em cujo tempo um precipitado foiformado. O precipitado foi filtrado e seco para fornecer oéster 1-[2-(4-iodo-2,5-dimetilfenilcarbamoil)etil]piperidin-4-ílico do ácido bifenil-2-ilcarbâmico (59,6g,84% de pureza, 79% de rendimento), m/z: [M + H+] calculadopara C29H32INSOS = 598,49; encontrado = 598,5.

Etapa D - Éster metílico do ácido 4-{3-[4-(bifenil-2-ilcarbamoiloxi)piperidin-l-il]propionilamino}-2, 5-dimetilbenzóico

A uma solução do éster 1- [2-(4-iodo-2,5-dimetilfenilcarbamoil)etil]piperidin-4-ílico do ácidobifenil-2-ilcarbâmico (56 g, 94 mmol) em uma mistura 5:1v/v de NfN- dimetilf ormamida e metanol (600 mL) foramadicionados diispropiletilamina (49 mL, 281 mmol), 1,3-bis(difenilfosfino)propano (3,9 g, 9,4 mmol) e acetato depaládio II (2,1 g, 9,4 mmol). A mistura resultante foipurgada com monóxido de carbono e então agitada durante anoite entre 70°C e 80°C sob atmosfera de monóxido decarbono (pressão de balão). A mistura reacional foiconcentrada a vácuo e o resíduo foi dissolvido emdiclorometano (500 mL). Esta mistura foi lavada com ácidohidroclórico aquoso IN (500 mL) , água (500 mL) e entãosalmoura (500 mL). A camada orgânica foi então seca sobresulfato de magnésio anidro, filtrada e então concentrada avácuo. O resíduo foi misturado com etanol (cerca de 5:1 v/pentre etanol e resíduo) e a mistura foi aquecida até quetodos material sólido estivesse dissolvido. Esta soluçãofoi deixada a resfriar lentamente até temperatura ambientee o precipitado resultante foi isolado por filtração parafornecer o éster metílico do ácido 4-{3-[4-(bifenil-2-ilcarbamoiloxi)piperidin-1-il]propionilamino}-2, 5-dimetilbenzóico (47,3 g, 97% de pureza, 92% de rendimento),m/z: [M + H+] calculado para C3IH35N3O5 = 530,63; encontrado= 530,4.

Etapa E - Éster 1-[2-(4-hidroximetil-2,5-dimetilfenilcarbamoil)etil]piperidin-4-ílico de ácidobifenil-2-ilcarbâmico

A uma solução do éster metílico do ácido 4-{3-[4-(bifenil-2-ilcarbamoiloxi) piperidin-1-il] propioni lamino} -2,5-dimetilbenzóico (49,8 g, 93,9 mmol) em tetrahidrofurano(200 mL) foi resfriado a 0°C e hidreto de lítio e alumínio(10,7 g, 281,7 mmol) foi adicionado em porções (10 χ 1,07g). A mistura resultante foi agitada por 3 horas e entãoágua (10,7 mL) foi adicionada, seguida por hidróxido desódio aquoso IN (10,7 mL) e água adicional (32,1 mL). Estamistura foi agitada durante a noite e então filtrada. Acamada orgânica foi concentrada a vácuo e o resíduo foimisturado com acetato de etila (cerca de 5:1 v/p de acetatode etila e resíduo). Esta mistura foi aquecida até que omaterial sólido estivesse dissolvido e então a solução foideixada a resfriar até temperatura ambiente. O precipitadoresultante foi filtrado e seco para fornecer o éster 1-[2-(4 -hidroximetil-2, 5-dimetilf enilcarbamoil) etil] piperidin-4-ílico do ácido bifenil-2-ilcarbâmico (24,6 g, 95% depureza, 47,5% de rendimento). Este material foi usado sempurificação adicional. m/z·. [M + H+] calculado paraC30H35N3O4 = 502,62; encontrado = 502,5.

Etapa F-Éster 1-[2-(4-formil-2,5-dimetilfenilcarbamoil)etil]piperidin-4-ílico do ácidobifenil-2-ilcarbâmico

A uma solução de éster 1-[2-(4-hidroximetil-2, 5-dimetilfenilcarbamoil)etil]piperidin-4-ílico do ac bifenil-2-ilcarmâmico (5,0 g, 10 mmol) em diclorometano (200 mL) a0°C foi adicionado diisopropiletilamina (8,7 mL, 50 mmol) edimetilsulfóxido (5,6 mL, 100 mmol). A mistura resultantefoi resfriada a 0°C e o complexo de trióxido de enxofre-piridina (8,0 g, 50 mmol) foi adicionado. A misturareacional foi agitada por 1 hora a 0°C e então água (300mL) foi adicionada. A camada orgânica foi removida e lavadacom ácido hidroclórico aquoso (300 mL) e salmoura (300 mL) .A camada orgânica foi então seca sobre sulfato de magnésioanidro e filtrada. A solução resultante contendo o éster 1-[2-(4-formil-2,5-dimetilfenilcarbamoil) etil]piperidin-4-ílico do ácido bifenil-2-ilcarbâmico foi usada sempurificação adicional, m/z·. [M + H+] calculado paraC30H33N3O4 = 500,60; encontrado = 500,4.

Exemplo 10

Cultura de célula e preparação de membrana a partir decélulas que expressam os receptores muscarínicos Mi, M2, M3e M4 humanos

Linhas de célula CHO que expressam de forma estável ossubtipos do receptor muscarínico hMi, hM2, hM3 e hM4 humanoclonado, respectivamente, foram desenvolvidas até quaseconfluência em meio de HAM's F-12 suplementado com FBS 10%e 250 pg/mL de Geneticin. As células foram desenvolvidas em5% de CO2, incubador a 370C e suspensas com 2 mM de EDTA emdPBS. As células foram coletadas por 5 minutos decentrifugação a 650 χ g, e as pelotas de célula foramarmazenadas congeladas a -800C ou as membranas forampreparadas imediatamente para uso. Para a preparação damembrana, as pelotas de célula foram ressuspensas em tampãode Iise e homogeneizadas com um disruptor de tecidoPolytron PT-2100 (Kinematica AG; 20 segundos χ 2 rupturas).

As membranas brutas foram centrifugadas a 40.000 χ g por 15minutos a 4°C. A pelota de membrana foi então ressuspensacom tampão de ressuspensão e homogeneizada novamente com odisruptor de tecido Polytron. A concentração da proteína dasuspensão da membrana foi determinada pelo método descritoem Lowry e outros, 1951# Journal of Biochemistry, 193, 265.

Todas as membranas foram armazenadas congeladas emalíquotas de -800C ou usadas imediatamente. Alíquotas dereceptor hM5 preparadas foram adquiridas diretamente dePerkin Elmer (Wellesley, MA) e armazenadas a -800C até ouso.

Exemplo 11

Ensaio de Ligação de Radioligante para ReceptoresMuscarínicos

Os ensaios de ligação de radioligante para receptoresmuscarínicos clonados foram executados em placas demicrotitulação de 96 cavidades em um volume de ensaio totalde 100 pL. Membranas de célula CHO que expressam de formaestável o subtipo do receptor muscarínico hMi, hM2, hM3/ hM4ou hM5 foram diluídas em tampão de ensaio às seguintesconcentrações de proteína alvo especificadas ^g/cavidade):10 μg para hMi, 10-15 μg para hM2/ 10-20 μg para hM3í 10-20μg para hM4/ e 10-12 μg para IiM5 para obtenção de sinalsimilares (cpm). As membranas foram rapidamentehomogeneizadas usando-se um disruptor de tecido Polytron(10 segundos) antes da adição da placa de ensaio. Osestudos de ligação de saturação para determinar os valoresde Kd do radioligante foram executados usando-se cloreto deL- [N-metil-3H] scopolamina metil ( [3H]-NMS) (TRK666, 84,0Ci/mmol, Amersham Pharmacia Biotech, Buckinghamshire,England) a concentrações variando de 0,001 nM a 20 nM. Osensaios de deslocamento para determinação dos valores de Kidos compostos de teste foram executados com [3H] -NMS a 1 nMe onze diferentes concentrações de composto de teste. Oscompostos de teste foram inicialmente dissolvidos a umaconcentração de 400 μΜ em tampão de diluição e entãodiluído serialmente 5 vezes com tampão de diluição aconcentrações finais variando de 10 pM a 100 μΜ. A ordem deadição e os volumes para as placas de ensaio foram comosegue: 25 μΐ^ de radioligante, 25 μΐί de composto de testediluído e 5 0 μΐι de membranas. As placas de ensaio foramincubadas por 60 minutos à 37°C. As reações de ligaçãoforam finalizadas por rápida filtração sobre placas defiltro de fibra de vidro GF/B (PerkinElmer Inc.) pré-tratadas com BSA 1%. As placas de filtro foram lavadas trêsvezes com tampão de lavagem (HEPES 10 mM) para remover aradioatividade não ligada. As placas foram então secas aoar e 50 μΐ^ de fluido de cintilação líquido Microscint-20(PerkinElmer Inc.) foram adicionados a cada cavidade. Asplacas foram então contadas em um contador de cintilaçãolíquida PerkinElmer Topcount (PerkinElmer Inc.). Os dadosde ligação foram analisados por análise de regressão nãolinear com o pacote de software GraphPad Prism Software(GraphPad Software, Inc., San Diego, CA) usando-se o modelode competição de sítio único. Os valores de Ki para oscompostos de teste foram recalculados a partir de valoresde IC50 observados e o valor de Kd do radioligante, usando-se a equação de Cheng-Prusoff (Cheng Y; Prusoff W. H.(1973) Biochemical Pharmacology, 22 (23) :3099-108) . Osvalores de Ki foram convertidos a valores de pKi paradeterminar a média geométrica e intervalos de 95% desegurança. Esta estatística concisa foi então convertida devolta a valores de Ki para relatório de dados.

Neste ensaio, um valor de Ki menor indica que ocomposto de teste possui uma afinidade de ligação maiorpara o receptor testado. Descobriu-se que o éster 1- [2- (4-{ [ (i?) -2- (3-formilamino-4-hidroxifenil) -2-hidroxietilamino]metil} - 2, 5-dimetilf enil-carbamoil) etil] piperidin-4 -ílico doácido bifenil-2-ilcarbâmico (composto lia) possui um valorde Ki menor que 10 nM para os subtipos do receptormuscarínico Mi, M2, M3, M4 e M5.

Exemplo 12

Cultura de célula e preparação de membrana a partir decélulas que expressam os receptores βι-, P2- P3-adrenérgicoshumanos

Linhas de células de rim embriônicas humanas (HEK-293)que expressam de forma estável os receptores βχ- e β2~adrenérgicos humanos clonados ou linhas de célula ovarianade hamster Chinês (CHO) que expressam de forma estável osreceptores J33-adrenérgicos humanos clonados foramdesenvolvidas até quase confluência em meio DMEM ou Hams F-12 com FBS 10% na presença de 500 μ9/πι1ι de Geneticin. Amonocamada de célula foi suspensa com EDTA 2mM em PBS. Ascélulas foram peletizadas por centrifugação a 1.000 rpm, eas pelotas de célula foram ou armazenadas congeladas a -800C ou as membranas foram preparadas imediatamente parauso. Para preparação das membranas que expressam osreceptores βι e β2/ as pelotas de célula foram ressuspensasem tampão de Iise (10 mM HEPES/HC1, 10 mM EDTA, pH 7,4 a 4°C) e homogeneizadas usando-se um homogeneizador de vidroDounce (30 golpes) de encaixe firme em gelo. Para asmembranas que expressam o receptor β3 mais sensíveis àprotease, as pelotas de célula foram homogeneizadas emtampão de Iise (10 mM HEPES/HC1, 10 mM EDTA, pH 7,4)suplementado com um comprimento de "Complete ProteaseInhibitor Cocktail Tablets with 2 mM EDTA" para cada 50 mLde tampão (Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, IN).

0 homogenato foi centrifugado a 20.000 χ g, a pelotaresultante foi lavada uma vez com tampão de Iise porressuspensão e centrifugação conforme acima. A pelota finalfoi então ressuspensa em tampão de ensaio de ligação gelado(75 mM Tris/HCl pH 7,4, 12,5 mM MgCl2, 1 mM EDTA) . Aconcentração da proteína da suspensão da membrana foideterminada pelos métodos descritos em Lowry e outros,1951, Journal of Biochemistry, 193, 265; e Bradford,Analytical Biochemistry, 1976, 72, 248-54. Todas asmembranas foram armazenadas congeladas em alíquotas a -80°Cou usadas imediatamente.Exemplo 13

Ensaio de Ligação de Radioligante para Receptores βι-,β2- P3-adrenérgicos Hiamanos

Os ensaios de ligação foram executados em placas demicrotitulação de 96 cavidades em um volume de ensaio totalde 100 μΐι com 10-15 μg de proteína de membrana contendo osreceptores βι-, 02" ^-adrenérgicos humanos em tampão deensaio (75 mM Tris/HCl pH 7,4 a 25 °C, 12,5 mM MgCl2, 1 mMEDTA, 0,2% BSA). Estudos de ligação de saturação paradeterminação dos valores de Kd do radioligante foram feitosusando-se [3H]-dihidroalprenolol (NET-720,100 Ci/mmol,PerkinElmer Life Sciences Inc., Boston, MA) para osreceptores Ç>x e β2 e [125I] - (-)-iodocianopindolol (NEX-189,220 Ci/mmol, PerkinElmer Life Sciences Inc., Boston,MA) em 10 ou 11 concentrações diferentes variando de 0,01nM a 2 0 nM. Os ensaios de deslocamento para determinaçãodos valores de Ki dos compostos de teste foram feitos com[3H]-dihidroalprenolol a 1 nM e [125I]-(-)-iodocianopindolola 0,5 nM para 10 ou 11 concentrações diferentes variando de10 pM a 10 μΜ. A ligação não específica foi determinada napresença de propanolol 10 μΜ. Os ensaios foram incubadospor 1 hora à 37 °C, e então as reações de ligação foramfinalizadas por rápida filtração sobre GF/B para osreceptores J3i e p2 ou placas de filtro de fibra de vidroGF/C para os receptores β3 (Packard BioScience Co.,Meriden, CT) pré-umedecidos em polietilenoimina 0,3%. Asplacas de filtro foram lavadas três vezes com tampão defiltração (Tris/HCl 75 mM, pH = 7,4 a 4°C, MgCl2 12,5 mM,EDTA 1 mM) para remover radioatividade não ligada. Asplacas foram secas e 50 μL de fluido de cintilação líquidosMicroscint-20 (Paekard BioScience Co. , Meriden, CT) foramadicionados e as placas foram contadas em um contador decintilação Packard Topcount (Paekard BioScience Co.,Meriden, CT). Os dados de ligação foram analisados poranálise de regressão não linear com o pacote de softwareGraphPad Prism Software (GraphPad Software, Inc., SanDiego, CA) usando-se o modelo de 3 parâmetros paracompetição de sítio único. 0 mínimo da curva foi fixado aovalor para ligação não específica, conforme determinado napresença de propanolol 10 μΜ. Os valores de Ki para oscompostos de teste foram calculados a partir de valores deIC50 observados e o valor de K0 do radioligante, usando-se aequação de Cheng-Prusoff (Cheng Y; Prusoff W. H.Biochemical Pharmacology, 1973 22, 23, 3099-108).

Neste ensaio, um valor de Ki menor indica que umcomposto de teste possui uma afinidade de ligação maiorpara o receptor testado. Descobriu-se que o éster l-[2-(4-{ [(R)-2-(3 -formilamino-4-hidroxifenil) -2-hidroxietilamino]metil}-2, 5-dimetilfenilcarbamoil)etil] piperidin-4-ílico doácido bifenil-2-ilcarbâmico (composto lia) possui um valorde K1 menor que 10 nM o receptor j32-adrenérgico e valoresde kl maiores que 1000 nM para os receptores βχ- e J33-adrenérgicos.

Exemplo 14

Ensaios funcionais de Antagonismo para os Subtipos doReceptor Muscarínico

Ensaio A. Bloqueio da Inibição Mediada por Agonista doAcúmulo de cAMP

Neste ensaio, a potência funcional de um composto deteste como um antagonista para o receptor hM2 foideterminada por medições da capacidade do composto de testede bloquear a inibição de oxotremorina do acúmulo cAMPmedida por forscolina em células CHO-Kl que expressão oreceptor hM2. Os ensaios de cAMP foram executados em umformato de radioimunoensaio usando-se Flashplate AdenylylCyclase Activation Assay System com 125I-CAMP (NEN SMP004B,PerkinElmer Life Sciences Inc., Boston, MA) de acordo comas instruções do fabricante. As células foram rinsadas comdPBS e suspensas com solução Tripsina-EDTA (tripsina0,05%/EDTA 0,53 mM) conforme descrito na seção de Culturade Célula e Preparação de Membrana acima. As célulasseparadas forma lavadas duas vezes por centrifugação a 650χ g por 5 minutos em dPBS 50 mL. A pelota de célula foientão ressuspensa em 10 mL de dPBS, e as células formacontadas com um Coulter Zl Dual Particle Counter (BeckmanCoulter, Fullerton, CaMV 35S) . As células foramcentrifugadas novamente a 650 χ g por 5 minutos eressuspensas em tampão de estimulação a uma concentração deensaio de 1,6 χ IO6 a 2,8 χ IO6 células/mL.

0 composto de teste foi inicialmente dissolvido a umaconcentração de 400 μΜ em tampão de diluição (dPBSsuplementado com 1 mg/mL de BSA (0,1%)), e então diluídoserialmente com tampão de diluição a concentrações finaisvariando de 100 μΜ a 0,1 nM. Oxotremorina foi diluída deuma maneira similar.

Para medir a inibição da atividade da adenilil ciclasepela oxotremorina, 25 μL de forscolina (concentração finalde 25 μΜ diluída em dPBS) , 25 μL de oxotremorina diluída e50 μL de células foram adicionados às cavidades de ensaiodo agonista. Para medir a capacidade de um composto deteste de bloquear a atividade da adenilil ciclase inibidapor oxotremorina, 25 pL de forscolina e oxotremorina(concentrações finais de 25 μΜ e 5 μΜ, respectivamente,diluídas em dPBS), 25 pL do composto de teste diluído e 50μm de células foram adicionados às cavidades de ensaiorestantes.

As reações foram incubadas por 10 minutos a 37 0C einterrompidas por adição de 100 pL de tampão de detecçãogelado. As placas foram seladas, incubadas durante a noiteã temperatura ambiente e contadas na manhã seguinte em umcontador de cintilação líquida PerkinElmer TopCount(PerkinElmer Inc., Wellesley, MA). A quantidade de cAMPproduzida (pmol/cavidade) foi calculada com base nascontagens observadas para as amostras e padrões de cAMP,conforme descrito no manual do usuário do fabricante. Osdados foram analisados por análise de regressão não linearcom o pacote de software GraphPad Prism Software (GraphPadSoftware, Inc., San Diego, CA) usando-se o modelo deregressão não linear, equação de competição de sítio único.

A equação de Cheng-Prusoff foi usada para calcular o Kob3/usando-se o EC50 da curva de resposta de concentração deoxotremorina e a concentração do ensaio de oxotremorinacomo o Kd e [L] , respectivamente.

Neste ensaio, um valor de Kobs menor indica que ocomposto de teste possui uma atividade funcional maior noreceptor testado. Descobriu-se que o éster 1-[2-(4-{[(R)-2-(3-formilamino-4-hidroxifenil) -2-hidroxietilamino] metil} -2, 5-dimetilfenil-carbamoil)etil]piperidin-4-ílico do ácidobifenil-2-ilcarbâmico (composto lia) possui um valor de Kobgmenor que 10 nM para bloqueio da inibição de oxotremorinado acúmulo de cAMP mediado por forscolina em células CHO-Klexpressando os receptor hM2.

Ensaio B - Bloqueio de Ligação [35S] GTPyS Mediada porAgonista

Neste ensaio funcional, a potência funcional de umcomposto de teste como um antagonista do receptor hM2 foideterminada medindo-se a capacidade do composto de teste debloquear a ligação [35S]GTPyS estimulada por oxotremorinaem em células CHO-Kl expressando o receptor hM2.

No momento do uso, membranas congeladas foramdescongeladas e então diluídas em tampão de ensaio como umaconcentração de tecido final de 5-10 pg de proteína porcavidade. As membranas foram rapidamente homogeneizadasusando-se um disruptor de tecido Polytron PT-2100 e entãoadicionadas às placas de ensaio.

0 valor de EC90 (concentração efetiva para respostamáxima de 90%) para estímulo de ligação de [35S] GTPyS pelaoxotremorina agonista foi determinado em cada experimento.

Para determinar a capacidade de um composto de testeem inibir a ligação de [35S] GTPyS estimulada poroxotremorina, o seguinte foi adicionado a cada cavidade dasplacas de 96 cavidades: 25 pL de tampão de ensaio com[35S] GTPyS (0,4 nM) , 25 pL de oxotremorina (EC90) e GDP (3μΜ) , 25 pL de composto de teste diluído e 25 pL demembranas de célula CHO expressando o receptor hM2. Asplacas de ensaio foram então incubadas a 37 0C por 60minutos. As placas de ensaio foram filtradas sobre filtrosGF/B pré-tratados com 1% de BSA usando-se um coletor de 96cavidades PerkinElmer. As placas foram rinsadas com tampãode lavagem resfriado com gelo por 3 vezes durante 3segundos e então foram secas a ar ou a vácuo. Líquido decintilação Microscint-20 (50 pL) foi adicionados a cadacavidade, e cada placa foi selada e a radioatividade foicontada em um Topcounter (PerkinElmer). Os dados foramanalisados por análise de regressão não linear com o pacotede software GraphPad Prism Software (GraphPad Software,Inc., San Diego, CA) usando-se o modelo de regressão nãolinear, a equação de competição de sítio único. A equaçãode Cheng-Prusoff foi usada para calcular o Koi3s, usando-seos valores de IC50 da curva de resposta de concentraçãopara o composto de teste e a concentração de oxotremorinano ensaio como o Kd e [L], concentração de ligante,respectivamente.

Neste ensaio, um valor de Kobs menor indica que ocomposto de teste possui uma atividade funcional maior noreceptor testado. Descobriu-se que o éster 1- [2-(4-{[(R)-2-(3-formilamino-4-hidroxifenil)-2-hidroxietilamino] metil}-2, 5-dimetilfenil-carbamoil)etil]piperidin-4-ílico do ácidobifenil-2-ilcarbâmico (composto lia) possui um valor de Kobgmenor que 10 nM para bloqueio da ligação [35S] GTPySestimulada por oxotremorina em células CH0-K1 expressandoos receptor hM2.

Ensaio C - Bloqueio de Liberação de Cálcio Mediada porAgonista através de Ensaios de FLIPR

Neste ensaio funcional, a potência funcional de umcomposto de teste como um antagonista de receptores hMi,hM3 e CM5 foi determinada medindo-se a capacidade docomposto de teste para inibir os aumentos mediados poragonista no cálcio intracelular.

Células CHO expressando estavelmente os receptoresforam semeadas em placas FLIPR de 96 cavidades na noiteantes que o ensaio foi feito. As células semeadas sãolavadas duas vezes com tampão FLIPR (10 mm HEPES, pH = 7,4,cloreto de cálcio 2 mM, probenecid 2,5 mN em solução salinatamponada de Hank (HBSS) sem cálcio e magnésio) usando-seCellwash (MTX Labsystems, Inc.) para remover o meio decrescimento. Após lavagem, cada cavidade continha 50 μΐ detampão FLIPR. As células foram então incubadas com 50pL/cavidade de 4 μΜ FLUO-4AM (uma solução 2X foi feita) por40 minutos a 31°C, 5% de dióxido de carbono. Seguindo-se operíodo de incubação do corante, as células foram lavadasduas vezes com tampão FLIPR, deixando um volume final de 50pL em cada cavidade.

O estímulo dependente de dose da liberação Ca2+intracelular para oxotremorina foi determinado de forma queo composto de teste poderia ser medido contra o estímulo deoxotremorina a uma concentração de EC90. As células foramprimeiro incubadas com tampão de diluição de composto por20 minutos e então oxotremorina foi adicionada. Um valor deEC90 para oxotremorina foi gerada de acordo com o métododetalhado na medição com FLIPR e a seção de redução dosdados abaixo, em conjunto com a Fórmula ECf = ( (F/100-F)a1/H) * EC50. Uma concentração de oxotremorina de 3 χ ECffoi preparada em placas de estímulo de forma que umaconcentração de EC90 de oxotremorina foi adicionada a cadacavidade nas placas de ensaio de teste.

Os parâmetros usados para FLIPR foram: duração deexposição de 0,4 segundo, força do laser de 0,5 watts,comprimento de onde da excitação de 488 nm, e comprimentode onda de emissão de 550 nm. A linha base foi determinadamedindo-se a mudança na florescência por 10 segundos antesa adição de oxotremorina. Depois da estimulação dooxotremorina, o FLIPR mediu continuamente a mudança defluorescência a cada 0,5 a 1 segundo por 1,5 minuto paracapturar a mudança de fluorescência máxima.

A mudança de fluorescência foi expressa comofluorescência máxima menos a fluorescência da linha de basepara cada cavidade. Os dados brutos foram analisados contrao logaritmo da concentração do composto de teste porregressão não linear com GraphPad Prism (GraphPad Software,Inc., San Diego, CA) usando-se o modelo construído pararesposta de dose sigmoidal. Os valores de Kois doantagonista foram determinados por Prism usando-se o valorEC50 de oxotremorina como o Kd e EC90 de oxotremorina para aconcentração de ligante de acordo com a equação de Cheng-Prusoff (Cheng & Prusoff, 1973).

Neste ensaio, um valor de Kobs menor indica que ocomposto de teste possui uma atividade funcional maior noreceptor testado. Descobriu-se que o éster 1-[2-(4-{[(R)-2-(3-formilamino-4-hidroxifenil)-2-hidroxietilamino] metil}-2, 5-dimetilfenil-carbamoil)etil]piperidin-4-íIico do ácidobifenil-2-ilcarbâmico (composto lia) possui um valor de Kobsmenor que 10 nM para bloqueio da liberação de cálciomediada por agonista em células CHO expressando de formaestável os receptores hMi, hM3, CM5.

Exemplo 15

Ensaio Flashplate de cAMP de célula integral em linhasde célula CHO expressando de forma heteróloga os receptoresPi, β2 e P3-adrenêrgicos humanos

Os ensaios de cAMP foram executados em um formado deradioimunoensaio usando-se o "Flashplate Adenylyl CyclaseActivation Assay System" com [125I] -cAMP (NEN SMP004,PerkinElmer Life Sciences Inc., Boston, MA), de acordo comas instruções dos fabricantes. Para determinação dapotência agonista do receptor βι e β2 (EC50) , linhas decélula HEK-293 expressando de forma estável os receptoresβι e β2 foram desenvolvidos até quase confluência em DMEMsuplementado com 10% FBS e Geneticin (500 μ9/πΛ) . Para adeterminação da potência do agonista do receptor β3 (EC50) ,linhas de célula CHO-Kl expressando estavelmente osreceptores J33-adrenérgicos humanos clonados foramdesenvolvidas até quase confluência em meio F-12 de Hamssuplementado com FBS 10% e Geneticin (250 pg/mL) . Ascélulas foram rinsadas com PBS e separadas em dPBS (soluçãosalina tamponada com fosfato de Dulbecco, sem CaCl2 eMgCl2) contendo EDTA 2 mM ou solução de Tripsina-EDTA(tripsina 0,05%/EDTA 0,53 mM). Após contagem das células emum contador de célula Coulter, as células foram peletizadaspor centrifugação a 1.000 rpm e ressuspensas em tampão deestimulação contendo IBMX (PerkinElmer Kit) pré-aquecido àtemperatura ambiente a uma concentração de 1,6 χ IO6 a 2,8χ IO6 células/mL. Cerca de 40.000 a 80.000 células porcavidade foram usados deste ensaio. Os compostos de teste(10 mM em DMSO) foram diluídos em PBS contendo BSA 0,1% emBeckman Biomek-2000 e testados em 11 diferentesconcentrações variando de 100 μΜ a 1 pM. As reações foramincubadas por 10 minutos a 37 0C e interrompidasadicionando-se 100 pL de tampão de detecção frio contendo[125I]-cAMP (NEN SMP004, PerkinElmer Life Sciences, Boston,MA) . A quantidade de cAMP produzida (pmol/cavidade) foicalculada com base nas contagens observadas para asamostras e padrões de cAMP, conforme descrito no manual dousuário do fabricante. Os dados foram analisados poranálise de regressão não linear com o pacote de softwareGraphPad Prism Software (GraphPad Software, Inc., SanDiego, CA) com a equação sigmoidal. A equação de Cheng-Prusoff (Cheng Y, e Prusoff WH., Biochemical Pharmacology,1973, 22, 23, 3099-108) foi usada para calcular os valoresde EC50.

Neste ensaio, um valor de EC50 menor indica que ocomposto de teste possui uma atividade funcional maior noreceptor testado. Descobriu-se que o éster 1- [2-(4-{[(R)-2-(3-formilamino-4-hidroxifenil)-2-hidroxietilamino] metil}-2, 5-dimetilfenilcarbamoil)etil]piperidin-4-íIico do ácidobifenil-2-ilcarbâmico (composto lia) possui um valor deEC50 menor que 10 nM o receptor J32-adrenérgico, um valor deEC50 de cerca de 3 0 nM para o receptor βι-adrenérgico; e umvalor de EC50 maior que 700 nM para os receptores β3-adrenérgico.

Exemplo 16

Ensaio Flashplate de cAMP de célula integral com umaLinha de Célula Epitelial de Pulmão Expressando de FormaEndõgena o Receptor p2-Adrenérgico Humano

Neste ensaio, a potência do agonista e atividadeintrínseca de um composto de teste foram determinadosusando-se uma linha de célula expressando níveis endógenosdo receptor p2-adrenérgico. As células de uma linha decélula epitelial de pulmão humano (BEAS-2B) (ATCC CRL-9609,American Type Culture Collection, Manassas, VA) (January B,e outros British Journal of Pharmacology, 1998,223, 4, 701-11) foram desenvolvido a 75-905 de confluência em meiocompleto livre de soro (meio LHC-9 contendo epinefrina eácido retinóico, Biosource International, Camarillo, CA) .No dia antes do ensaio, o meio foi trocado para LHC-8(nenhuma epinefrina ou ácido retinóico, BiosourceInternational, Camarillo, CA). Os ensaios de cAMP foramexecutados em um formado de radioimunoensaio usando-se o"Flashplate Adenylyl Cyclase Activation Assay System" com[125I] -cAMP (NEN SMP004, PerkinElmer Life Sciences Inc.,Boston, MA), de acordo com as instruções dos fabricantes.

No dia do ensaio, as células foram rinsadas com PBS,suspensas através de raspagem com EDTA 5 mM em PBS, econtadas. As células foram peletizadas por centrifugação a1000 rpm e ressuspensas em tampão de estimulação pré-aquecido a 370C a uma concentração final de 600.000células/mL. As células foram usadas a uma concentraçãofinal de 100.000 células/cavidade neste ensaio. Oscompostos de teste foram serialmente diluídos em tampão deensaio (75 mM Tris/HCl pH 7,4 a 25 °C, MgCl2 12,5 mM, EDTA1 mM, BSA 0,2%) em Beckman Biomek-2000. Os compostos foramtestados no ensaio com 11 diferentes concentrações,variando de 10 μΜ a 10 pM. As reações foram incubadas por10 minutos a 370C e interrompidas por adição de 100 pL detampão de detecção gelado. As placas foram seladas,incubadas durante a noite a 4 0C e contadas na manhãseguinte em um contador de cintilação Topcount (PackardBioScience Co., Meriden, CT). A quantidade de cAMPproduzida por mL de reação foi calculada com base nascontagens observadas para as amostras e padrões de cAMP,conforme descrito no manual do usuário do fabricante. Osdados foram analisados por análise de regressão não linearcom o pacote de software GraphPad Prism Software (GraphPadSoftware, Inc., San Diego, CA) usando-se o modelo de 4parâmetros para resposta de dose sigmoidal com inclinaçãovariável.

Neste ensaio, um valor de EC50 menor indica que ocomposto de teste possui uma atividade funcional maior noreceptor testado. Descobriu-se que o éster 1- [2-(4-{[{R)-2-(3-formilamino-4-hidroxifenil) -2-hidroxietilamino] metil}-2, 5-dimetilfenil-carbamoil) etil] piperidin-4-ílico do ácidobifenil-2-ilcarbâmico (composto lia) possui um valor deEC50 menor que 10 nM com valor de atividade intrínsecomaior 0,3 comparado com um isoproterenol agonista J32completo (1,0).

Exemplo 17

Ensaio de Einthoven para determinação de eficácia eduração broncoprotetora

Neste ensaio, a eficácia broncoprotetora e a duraçãodos compostos de teste foram determinadas usando-seporquinhos da índia. Este ensaio foi derivado dosprocedimentos descritos em Einthoven (1892) Pfugers Arch.51: 367 - 44 5; e Mohammed e outros. (2000) Pulm PharmacolTher. 13(6):287-92. Neste ensaio, as mudanças na pressão deventilação servem como uma medida substituta de resistênciadas vias aéreas. Seguindo-se o pré-tratamento com umcomposto de teste, a potência do antagonista muscarínicofoi determinada usando-se curvas de resposta à dosebroncoconstritora para metacolina intravenosa na presençade propanolol. Similarmente, a potência broncoprotetora doagonista Ç>2 foi determinada usando-se histamina. A potênciabroncoprotetora combinada foi determinada usando-semetacolina na ausência de propanolol.

O ensaio foi conduzido usando-se porquinhos da índiamachos Duncan-Hartley (Harlan, Indianapolis, IN), pesandoentre 250 e 400 g. Um composto de teste ou veículo (isto é,água estéril) foi doseado por inalação (IH) durante umperíodo de tempo de 10 minutos em uma câmara de dosagem deexposição corporal total (R+S Molds, San Carlos, CA),usando-se 5 mL de solução de dosagem. Os animais foramexpostos a um aerossol gerado a partir de um ConjuntoNebulizador LC Star (Modelo 22F51, PARI RespiratoryEquipment, Inc. Midlothian, VA) acionado por Bioblend (umamistura de CO2 = 5%, O2 = 21% e N2 = 74%) a uma pressão de0,152 MPa. A função pulmonar foi avaliada em vários pontosde tempo após a dosagem da inalação.

Setenta e cinco minutos antes do início do ensaio, osporquinhos-da-índia foram anestesiado com uma injeçãointramuscular de uma mistura de cetamina (43,7 mg/kg),xilazina (3,5 mg/kg) e acepromazina (1,05 mg/kg). Uma dosesuplementar desta mistura (50% da dose inicial) foiadministrada conforme necessário. A veia jugular e aartéria carótida foram isoladas e entubadas com cateteresde polietileno cheios com solução salina (micro-renathane ePE-50, respectivamente, Beckton Dickinson, Sparks, MD) . Aartéria carótida foi conectada a um transdutor de pressãopara permitir a medição da pressão sangüínea e a cânula daveia jugular foi usada para injeção IV da metacolina ouhistamina. A traquéia foi então dissecada livremente eentubada com uma agulha 14G (#NE-014, Small Parts, MiamiLakes, FL) . Uma vez que a entubação estava completa, osporquinhos da índia foram ventilados usando-se umrespirador (Modelo 683, Harvard Apparatus, Inc., MA)ajustado a um volume de golpe de 1 mL/100 g de pesocorporal mas não excedendo o volume 2,5 mL, e a uma taxa de100 golpes por minuto. A pressão de ventilação (VP) foimedida na cânula traqueal usando-se um transdutor Biopacconectado a um pré-amplificador Biopac (TSD 137C). Atemperatura corporal foi mantida a 37°C usando-se uma placade aquecimento. Antes de iniciar a coleta de dados,pentobarbital (25 mg/kg) foi administrado de formaintraperitoneal (IP) para suprimir respiração espontânea eobter uma linha de base estável. As mudanças em VP foramregistradas em uma interface de coleta de dados BiopacWindows. Os valores da linha de base foram coletados porpelo menos 5 minutos, após cujo tempo os porquinhos daíndia foram atacados IV de forma não cumulativa com dosesdo broncoconstritor incrementais de 2 vezes (metacolina ouhistamina). Quando a metacolina foi usada como o agentebroncoconstritor, os animais foram pré-tratados compropanolol (5mg/kg IV) para isolar os efeitosantimuscarínicos do composto de teste. 0 propanolol foiadministrado 3 0 minutos antes da construção da curva deresposta de dose para metacolina ou histamina. Mudanças emVP foram registradas usando-se Acknowledge Data CollectionSoftware (Santa Barbara, CA). Após a finalização do estudo,os animais foram eutanizados.

Mudança em VP foi medida em cm de água. Mudança em VP(cm H20) = pressão máxima (após ataque broncoconstritor) -pressão de linha de base máxima. As curvas de resposta dadose para metacolina ou histamina foram ajustadas com umaequação logística de quatro parâmetros usando-se GraphPadPrism, versão 3.00 para Windows (GraphPad Software, SanDiego, Califórnia). A seguinte formulação foi usada:

Y = Min + (Max - Min) / (1 +10((1°9 ID50"X) * i-iinação de híid }onde X é o logaritmo da dose, Y é a resposta. Y iniciano Min e aproxima-se assintóticamente de Max com uma formasigmoidal.

O percentual de inibição da resposta broncoconstritoraa uma dose submáxima de metacolina ou histamina foicalculado em cada dose do composto de teste usando-se aseguinte equação: % inibição de resposta = 100 -((pressãode pico (após ataque broncoconstritor, tratado) - pressãode linha de base de pico (tratada) χ 100% / (pressão depico (após ataque broncoconstritor, água) - pressão delinha de base de pico (água) χ 100). As curvas de inibiçãoforam ajustadas à equação logística de quatro parâmetros dosoftware GraphPad. ID50 (dose exigida para produzir 50% deinibição da resposta broncoconstritora) e Emax (inibiçãomáxima) foram também estimados sempre que apropriado.

A magnitude da broncoproteção em diferentes pontos detempo após inalação do composto de teste foi usada paraestimar a meia-vida farmacodinâmica (PD Tl/2) . PD Tm foideterminada usando-se um ajuste de regressão não linearusando-se uma equação de declínio exponencial de uma fase(GraphPad Prism, Versão 4.00): Y = Duração * exp(-K*X) +Platô; Começa em "Duração+Platô" e declina ao Platô com umaconstante Κ. A PD Tl/2 = 0,69/K. Platô foi forçado a 0.

Em 1,5 hora após a dose, descobriu-se que o éster 1-[2- (4- { [(R)-2-(3-formilamino-4- hidroxifenil)-2-hidroxietilamino]metil}-2,5-dimetilfenilcarbamoil) etil]piperidin-4-ílico do ácido bifenil-2-ilcarbâmico (lia)possui um valor ID50 menor que cerca de 50 μg/mL tanto parabroncoconstrição induzida por metacolina quanto parabroncoconstrição induzida por histamina.

Adicionalmente, este composto produziu broncoproteçãosignificante por até 72 horas quando administrada como umadose subseqüentemente-máxima única (100 μg/mL . Nesteensaio, salmeterol (3 μg/mL (um agonista de receptor B2-adrenérgico) exibiu broncoproteção significante por 6 a 14horas; e tioprópio (10 μg/mL) (um antagonista de receptormuscarínico) exibiu significante broncoproteção por mais de72 horas.

Exemplo 18

Ensaio de porquinho da índia por pletismografia paradeterminação de eficácia e duração broncoprotetora

Neste ensaio, a eficácia broncoprotetora e a duraçãodos compostos de teste foram determinadas usando-se umensaio de porquinho da índia.

Grupos de seis porquinhos da índia machos (Duncan-Hartley (HsdPoc:DH) Harlan, Madison, WI) pesando entre 250e 350 gramas foram individualmente identificados porcartões de gaiola. Por todo o estudo os animais foramdeixados acessar comida e água ad libitum. Os compostos deteste foram administrados através de inalação Durante 10minutos em uma câmara de dosagem de exposição de corpointeiro (R & S Molds, San Carlos, CA) . As câmaras dedosagem foram dispostas de forma que um aerossol fossesimultaneamente entregue a 6 câmaras individuais a partirde um distribuidor central. Os porquinhos da índia foramexpostos a um aerossol de um composto de teste ou veículo(WFI).

Os aerossóis foram gerados a partir de soluçõesaquosas usando=se um Conjunto Nebulizador LC Star (Modelo22F51, PARI Respiratory Equipment, Inc. Midlothian, VA)acionado por uma mistura de gases (CO2 = 5%, O2 = 21% e N2 =74%) a uma pressão de 0,152 MPa. 0 fluxo de gás através donebulizador nesta pressão de operação era deaproximadamente 3 L/minuto. Os aerossóis gerados foramdirecionados para dentro das câmaras por pressão positiva.

Nenhum ar de diluição foi usado durante a entrega dassoluções aerossolizadas. Durante os 10 minutos denebulização, aproximadamente 1,8 mL de solução foramnebulizados. Este valor foi medido gravimetricamentecomparando-se os pesos antes e depois da nebulização donebulizador carregado.

Os efeitos broncoprotetores dos compostosadministrados através de inalação foram avaliados usando-sepletismografia de corpo inteiro a 1,5, 24, 48 e 72 horasapós a dose. Quarenta e cinco minutos antes do início daavaliação pulmonar, cada porquinho-da-índia foi anestesiadocom uma injeção intramuscular de cetamina (43,75 mg/kg),xilazina (3,50 mg/kg) e acepromazina (1,05 mg/kg). 0 localda cirurgia foi raspado e limpo com álcool 70%, uma incisãode linha central de 2 a 3 cm do aspecto ventral do pescoçofoi feita. A veia jugular foi isolada e canulada com umcateter de polietileno cheio de solução salina (PE-50,Becton Dickinson, Sparks, MD) para permitir as infusõesintravenosas de acetilcolina (Ach) ou histamina em soluçãosalina. A traquéia foi então dissecada livremente ecanulada com um tubo de teflon 14G (#NE-014, Small Parts,Miami Lakes, FL) . Se exigido, a anestesia foi mantida porinjeções adicionais intramusculares da mistura anestésica.A profundidade da anestesia foi monitorada e ajustada se oanimal respondesse ao aperto de suas patas ou se a taxa derespiração fosse maior que 100 respirações/minuto.

Uma vez que as canulações estavam completas, o animalfoi colocado dentro de um pletismógrafo (#PLY3114, BuxcoElectronics, Inc., Sharon, CT) e uma cânula de pressãoesofageal (PE-160, Becton Dickinson, Sparks, MD) foiinserida para medir a pressão pulmonar. 0 tubo traqueal deteflon foi fixado à abertura do pletismógrafo para permitirque o porquinho-da-índia respirasse ar do ambiente de forada câmara. A câmara foi então selada. Uma lâmpada deaquecimento foi usada para manter a temperatura corporal eos pulmões do porquinho-da-índia foram inflados 3 vezes com4 mL de ar usando-se uma seringa de calibração de 10 mL(Série #5520 Hans Rudolph, Kansas City, MO)'para assegurarque as vias aéreas inferiores não tinham sofrido colapso eque o animal não sofria de hiperventilação.

A avaliação pulmonar foi iniciada depois de determinarque os valores de linha de base estavam dentro da faixa de0,3 a 0,9 mL por cm de H2O para conformidade e dentro dafaixa de 0,1 a 0,199 cm H2O por segundo para resistência.Um programa de computador de medição pulmonar Buxco foiusado para a coleta e derivação dos valores pulmonares.Iniciando-se o programa, iniciou-se o protocoloexperimental e a coleta de dados. As mudanças em volumedurante o tempo que ocorreram dentro do pletismógrafo comcada respiração foram medidas através de um transdutor depressão Buxco. Integrando-se este sinal over time, umamedição de fluxo foi calculada para cada respiração. Estesinal, junto com as mudanças de pressão pulmonar, que foramcoletadas usando-se um transdutor de pressão Sensym(#TRD4100), foram conectados através de um pré-amplificadorBuxco (MAX 2270) a uma interface de coleta de dados(#SFT3400 e SFT3 813). Todos os outros parâmetros pulmonaresforam derivados a partir destas duas entradas.

Os valores de referência foram coletados por 5minutos, após este tempo os porquinhos-da-índia foramatacados com acetilcolina ou histamina. Quando se avalia osefeitos do antagonista muscarínico, propanolol (5 mg/kg,iv) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) foi administrado 15minutos antes de serem atacados com acetilcolina. Aacetilcolina (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) (0,1 mg/mL) foiinfundida de forma intravenosa por 1 minuto a partir de umaseringa (sp210iw, World Precision Instruments, Inc.,Sarasota, FL) nas seguintes doses e tempos de prescrição apartir do início do experimento: 1,9 pg/minuto em 5minutos, 3,8 pg/minuto em 10 minutos, 7,5 pg/minuto em 15minutos, 15,0 pg/minuto em 20 minutos, 30 pg/minuto em 25minutos e 60 pg/minuto em 30 minutos. Alternativamente, abroncoproteção dos compostos de teste foi avaliada nomodelo de ataque de acetilcolina sem pré-tratamento com umcomposto beta-bloqueador.

Quando se avalia os efeitos do receptor p2-adrenérgicodos compostos de teste, a histamina (25 pg/mL) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) foi infundida de forma intravenosapor 1 minuto de uma seringa nas seguintes doses e temposprescritos a partir do início do experimento: 0,5 pg/minutoem 5 minutos, 0,9 pg/minuto em 10 minutos, 1,9 pg/minuto em15 minutos, 3,8 pg/minuto em 20 minutos, 7,5 pg/minuto em25 minutos e 15 pg/minuto em 30 minutos. Se a resistênciaou compatibilidade não retornaram aos valores de referênciaem 3 minutos após cada dose de acetilcolina ou histamina,os pulmões dos porquinhos da índia foram inflados 3 vezescom 4 mL de ar a partir de uma seringa de calibração deIOmL. Os parâmetros pulmonares registrados incluíam afreqüência de . respiração (respirações/minuto),compatibilidade (mL/cm H2O) e resistência pulmonar (mL porcm H2O por segundo) . Uma vez que as medições da funçãopulmonar foram completadas em 3 5 minutos deste protocolo, oporquinho-da-índia foi removido do pletismógrafo e sofrerameutanásia por asfixia com dióxido de carbono.

Os dados foram avaliados de uma das duas maneiras:

(a) a resistência pulmonar (RL, cm H20/mL por segundo)foi calculada a partir da relação entre mudança de pressãoe mudança no fluxo. A resposta Rl à acetilcolina (60pg/minuto, IH) foi computada para o veículo e o composto deteste. A resposta à acetilcolina média em animais tratadoscom veículo, em cada momento de pré-tratamento, foicalculada e usada para computar o % de inibição da respostaà acetilcolina, no momento do pré-tratamentocorrespondente, em cada dose do composto de teste. Ascurvas de resposta à dose de inibição para "RL" foramajustadas a uma equação logística de 4 parâmetros usando-seGraphPad Prism, versão 3.00 para Windows (GraphPadSoftware, San Diego, Califórnia) para estimar a ID50broncoprotetora (dose exigida para inibir a respostabroncoconstritora da acetilcolina (60 pg/minuto) em 50%) . Aseguinte formulação foi usada:Y = Min + (Max - Min) / (1 + 10 (log ID50-X) * inclinacao de Hill)onde X é o logaritmo da dose, Y é a resposta (% deinibição de aumento induzido por acetilcolina em Rl). Yinicia no Min e aproxima-se assintóticamente de Max com umaforma sigmoidal.

(b) A quantidade de PD2, que é definida como aquantidade de acetilcolina ou histamina necessária paradobrar a resistência pulmonar de referencia, foi calculadausando-se os valores de resistência pulmonar derivados dofluxo e da pressão sobre uma faixa de ataques comacetilcolina ou histamina usando-se a seguinte equação (queé derivada de uma equação usada para calcular os valores dePC2O descritos em American Thoracic Society. Guidelines formethacholine and exercise challenge testing 1999. Am J.Respir. Crit. Care Med. 161: 309-329):

PD2 = antilog{IogC1 + [[ (logC2-logC1) (2R0-R1) ]/R2-R1] }onde:

C1 = concentração de acetilcolina ou histaminaprecedendp C2

C2 = Concentração de acetilcolina ou histaminaresultando em um aumento de pelo menos 2 vezes naresistência pulmonar (Rl)

R0 = Valor de Rl de referência

R1 = valor de Rl após C1

R2 = valor de Rl após C2

Análise estatística dos dados foi executada usando-seum two-tailed Students T-test. Um valor de P < 0,05 foiconsiderado significante.

O composto 50 descrito na Publicação de Patente U. S.de número US 2004/0167167A1, publicada em 24 de agosto de2004, foi testada neste ensaio. A estrutura química docomposto 50 é como segue:

<formula>formula see original document page 111</formula>

Composto Comparativo 50

Este composto carece de grupos alquil's presentes noanel fenil dos compostos da presente invenção. Nesteensaio, o composto 50 não apresentou nenhuma broncoproteçãosignificante em 24 horas após a dose para doses variando de3 μg/mL a 3 00 ^ig/mL. Os valores de PD2χ para o composto 50em 24 horas eram similares ao grupo do veículo (água).

Neste ensaio, salmeterol (100 μg/mL) (um agonista dereceptor p2-adrenérgico) exibiu broncoproteção significantepor pelo menos 24 horas; e tioprópio (10 μg/mL) (umantagonista de receptor muscarínico) exibiu significantebroncoproteção por pelo menos 24 horas.

Embora a presente invenção tenha sido descrita comreferência aos aspectos específicos ou modalidades desta,deve ser compreendido por aqueles habilitados na técnicaque várias mudanças podem ser feitas ou equivalentes podemser substituídos sem se afastar do verdadeiro espírito eescopo da invenção. Adicionalmente, à extensão permitidapor estatutos e regulamentações de patente aplicáveis,todas as publicações, patentes e pedidos de patente aquicitados estão desta forma incorporados por referencia emsua totalidade à extensão como se cada documento estivesseindividualmente aqui incorporado por referência.

Claims (27)

1. Composto caracterizado por ter a fórmula I:<formula>formula see original document page 112</formula>onde:R1 é metil ou etil;R2 é metil ou etil;ou um sal ou solvatofarmaceuticamente aceitável destes.

2. Composto, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado por possuir a fórmula II:<formula>formula see original document page 112</formula>ouonde:R1 é metil ou etil;R2 é metil ou etil;ou um sal farmaceuticamente aceitável deste.

3. Composto, de acordo com a reivindicaçãocaracterizado por possuir a fórmula IIa:<formula>formula see original document page 112</formula>

4. Composto, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que o composto é um salfarmaceuticamente aceitável de um composto da fórmula IIa:<formula>formula see original document page 113</formula>

5. Composição farmacêutica caracterizada pelo fato decompreender um veiculo farmaceuticamente aceitável e umcomposto de qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3 ou 4.

6. Composição farmacêutica caracterizada pelo fato decompreender:(a) um composto de qualquer uma das reivindicações 1,-2, 3 ou 4;(b) um agente anti-inflamatório esteroidal; e(c) um veículo farmaceuticamente aceitável.

7. Combinação de agentes terapêuticos, caracterizadapelo fato de compreender:(a) um composto de qualquer uma das reivindicações 1,-2, 3 ou 4; e(b) um agente anti-inflamatório esteroidal.

8. Kit caracterizado pelo fato de compreender:(a) uma primeira composição farmacêutica compreendendoum composto de qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3 ou 4e um primeiro veículo farmaceuticamente aceitável; e(b) uma segunda composição farmacêutica compreendendoum agente anti-inflamatório esteroidal e um segundo veículofarmaceuticamente aceitável;onde a primeira e segunda composições farmacêuticassão composições farmacêuticas distintas.

9. Método de tratamento de uma disfunção pulmonar, ométodo caracterizado por compreender a administração a umpaciente em necessidade de tratamento de uma quantidadeterapeuticamente efetiva de um composto de qualquer uma dasreivindicações 1, 2, 3 ou 4.

10. Método para tratar uma doença pulmonar obstrutivacrônica ou asma, o método caracterizado por compreender aadministração a um paciente uma quantidade terapeuticamenteefetiva de um composto de qualquer uma das reivindicações1, 2, 3 ou 4.

11. Método de produção de broncodilatação em ummamífero, o método caracterizado por compreenderadministrar a um mamífero uma quantidade produtora debroncodilatação de um composto de qualquer uma dasreivindicações 1, 2, 3 ou 4.

12. Método de antagonizar um receptor muscarínico eagonizar um receptor p2-adrenérgico em um mamífero, ométodo caracterizado por compreender administrar nomamífero um composto de qualquer uma das reivindicações 1,2, 3 ou 4.

13. Método para utilizar um composto de qualquer umadas reivindicações 1, 2, 3 ou 4 como uma ferramenta depesquisa, o método caracterizado por compreender conduzirum ensaio biológico utilizando um composto de qualquer umadas reivindicações 1, 2, 3 ou 4.

14. Método de avaliação de um composto teste em umensaio biológico, o método caracterizado pelo fato decompreender:(a) conduzir um ensaio biológico com um composto deteste para fornecer um primeiro valor de ensaio;(b) conduzir o ensaio biológico com um composto dequalquer uma das reivindicações 1, 2, 3 ou 4 para fornecerum segundo valor de ensaio; onde a etapa (a) é conduzidaantes, após ou simultaneamente à etapa (b); e(c) comparar o primeiro valor de ensaio da etapa (a)com o segundo valor de ensaio da etapa (b).

15. Método, de acordo com a reivindicação 14,caracterizado pelo fato de que o ensaio biológico é umensaio de ligação de receptor muscarínico ou um ensaio deligação de um receptor p2-adrenérgico.

16. Método, de acordo com a reivindicação 14,caracterizado pelo fato de que o ensaio biológico é umensaio de broncoproteção em um mamífero.

17. Processo de preparação do composto dareivindicação 1, o processo caracterizado por compreender adesproteção de uma composição da fórmula 6:<formula>formula see original document page 115</formula>onde P1 é um grupo de proteção de hidroxil, parafornecer um composto de fórmula I.

18. Processo de preparação do composto dareivindicação 1, o processo caracterizado por compreender adesproteção de uma composição da fórmula 6a:<formula>formula see original document page 116</formula>onde Ra, Rb e Rc são independentemente selecionados apartir de alquil de Ci-4, fenil, -alquil de Ci-4-(fenil) , ouum entre Rlai Rlb e Rlc é -O-(alquil de C1-J; para fornecerum composto da fórmula I.

19. Processo para preparar um composto dareivindicação 1, o processo caracterizado por compreender:(a) reagir um composto da fórmula 4:<formula>formula see original document page 116</formula>com um composto da fórmula 5:<formula>formula see original document page 116</formula>onde P1 é um grupo de proteção de hidroxil, napresença de um agente de redução para fornecer um compostoda fórmula 6:<formula>formula see original document page 116</formula>(b). desproteger o composto da fórmula 6 para fornecerum composto da fórmula I.

20. Processo para preparação de um salfarmaceuticamente aceitável do composto da reivindicação 1,o processo caracterizado por compreender contatar umcomposto da fórmula I em base livre com um ácidofarmaceuticamente aceitável.

21. Intermediário para a preparação de um composto dequalquer uma das reivindicações 1, 2, 3 ou 4, caracterizadopelo fato de que o intermediário é um composto da fórmulaIII,<formula>formula see original document page 117</formula>onde:Y1 é selecionado a partir de -CHO, -CN, -CH2OH, -CH(OR3a)OR3b, -C(O)OH, -C(O)OR3c, bromo e iodo, onde R3a e R3bsão selecionados independentemente a partir de alquil C1^1ou R3a e R3b são unidos para formar alquileno C2-6, R3c éselecionado a partir de alquil Ci-6;R1 é metil ou etil;R2 é metil ou etil;ou um sal ou estereoisômero deste.

22. Intermediário, de acordo com a reivindicação 21,caracterizado pelo fato de que R1 e R2 são metil.

23. Intermediário, de acordo com a reivindicação 21,caracterizado pelo fato de que Y1 é -CHO.

24. Intermediário, de acordo com a reivindicação 21,caracterizado pelo fato de que R1 e R2 são metil.

25. Composto, de acordo com a reivindicação 4,caracterizado pelo fato de que o composto é sal do ácido L-tartárico do éster 1- [2-(4-{ [ {R)-2-(3-formilamino-4-hidroxif enil) -2-hidroxietilamino] metil}-2 , 5-dimetilfenil-carbamoil)etil]piperidin-4-ilico do ácido bifenil-2-ilcarbâmico.

26. Composto, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1, 2, 3 ou 4, caracterizado pelo fato de serpara uso em terapia.

27. Uso de um composto de qualquer uma dasreivindicações 1, 2, 3 ou 4, caracterizado pelo fato de serpara a produção de um medicamento para tratamento de umadisfunção pulmonar.