BRPI0709602B1

BRPI0709602B1 - RECOMBINANT MONONEGAVIRALES VIRUS VECTOR AND VACCINE AGAINST A MICROBIAL PATHOGEN

Info

Publication number: BRPI0709602B1
Application number: BRPI0709602-0A
Authority: BR
Inventors: Angela Römer-Oberdörfer; Jutta Veits; Teshome Mebatsio
Original assignee: Intervet International B.V.
Priority date: 2006-03-15
Filing date: 2007-03-15
Publication date: 2021-10-19
Also published as: ATE497535T1; DE602007012338D1; RU2435857C2; RU2008140747A; MY146624A; BRPI0709602A2

Abstract

vetor de vírus mononegavirales recombinante, e, vacina contra um patógeno microbiano. a invenção refere-se a um vetor de vírus mononegavirales (mv) recombinante compreendendo um gene estranho que é flanqueado por regiões não-codificadoras de um gene de vírus mv.recombinant mononegaviral virus vector, and vaccine against a microbial pathogen. The invention relates to a recombinant mononegavirales (mv) virus vector comprising a foreign gene that is flanked by non-coding regions of an mv virus gene.

Description

Esta invenção refere-se a um vetor de vírus Mononegavirales recombinante hospedando uma unidade de transcrição adicional compreendendo um gene exógeno operativamente ligado com uma sequência de início de gene (GS) de vírus Mononegavirales a montante e uma sequência de final de gene (GE) de vírus Mononegavirales a jusante bem como a uma vacina compreendendo um tal vetor de vírus Mononegavirales recombinante.This invention relates to a recombinant Mononegavirales virus vector hosting an additional transcription unit comprising an exogenous gene operably linked with an upstream Mononegavirales virus gene start (GS) sequence and a gene end (GE) sequence of downstream Mononegavirales virus as well as a vaccine comprising such a recombinant Mononegavirales virus vector.

Vírus vivos que são capazes de se replicarem em um hospedeiro infectado induzem uma resposta imune forte de duração longa contra seus antígenos expressados. São efetivos na geração de respostas imunes tanto mediadas por células quanto humorais, bem como estimulam rotas de citocina e de quimiocina. Portanto, vírus atenuados, vivos oferecem vantagens distintas sobre composições de vacina baseadas em imunógenos quer de subunidade quer inativos que tipicamente grandemente apenas estimulam o ramo humoral do sistema imune.Live viruses that are capable of replicating in an infected host elicit a strong, long-lasting immune response against their expressed antigens. They are effective in generating both cell-mediated and humoral immune responses, as well as stimulating cytokine and chemokine pathways. Therefore, live, attenuated viruses offer distinct advantages over vaccine compositions based on either subunit or inactive immunogens that typically largely only stimulate the humoral branch of the immune system.

Durante a última década tecnologia de DNA recombinante tem revolucionado o campo de engenharia genética dos genomas de ambos os vírus de DNA e de RNA. Em particular, agora é possível introduzir genes exógenos dentro do genoma de um vírus de tal modo que sob replicação do vírus vetor novo em um animal hospedeiro é expressada uma proteína estranha que pode exercer efeitos biológicos no animal hospedeiro. Como tais, vírus vetores recombinantes têm sido explorados não apenas para o controle e a prevenção de infecções microbianas, mas também para desenvolvimento de terapias alvo para doenças não-microbianas tais como malignidades e em terapia de gene.Over the last decade recombinant DNA technology has revolutionized the field of genetic engineering of the genomes of both DNA and RNA viruses. In particular, it is now possible to introduce exogenous genes into the genome of a virus in such a way that upon replication of the new vector virus in a host animal a foreign protein is expressed which can exert biological effects in the host animal. As such, recombinant vector viruses have been explored not only for the control and prevention of microbial infections, but also for the development of targeted therapies for non-microbial diseases such as malignancies and in gene therapy.

A geração de vírus de RNA de fita negativa, não-segmentada (vírus da ordem Mononegavirales) inteiramente de cDNA clonado por uma técnica designada como “genética reversa”, primeiro relatada em 1994 (Schnell et al., EMBO J 13, 4195-4203, 1994), tem tornado possível o uso também de vírus da ordem Mononegavirales (MV) como vetores. Desde então, têm sido publicados estudos que descrevem o uso de muitos vírus da ordem MV como vetores virais para expressar antígenos exógenos de um 5 patógeno almejando o desenvolvimento de vacinas contra aquele patógeno.The generation of unsegmented, negative-stranded RNA viruses (viruses of the order Mononegavirales) entirely from cloned cDNA by a technique referred to as "reverse genetics", first reported in 1994 (Schnell et al., EMBO J 13, 4195-4203 , 1994), has also made possible the use of viruses of the order Mononegavirales (MV) as vectors. Since then, studies have been published that describe the use of many viruses of the MV order as viral vectors to express exogenous antigens of a pathogen, aiming at the development of vaccines against that pathogen.

A ordem de Mononegavirales é classificada em quatro famílias principais: Paramyxoviridae, Rhabdoviridae, Filoviridae e Bornaviridae. Vírus pertencendo a estas famílias possuem genomas que são representados por uma única molécula de RNA de senso negativo (-), i.e. a polaridade do 10 genoma de RNA é oposta à polaridade de RNA mensageiro (mRNA) que é designado como de senso positivo (+). A classificação dos vírus MV veterinários e de humano principais é apresentada na tabela abaixo: Tabela 1: Classificação de vírus dentro da ordem de Mononegavirales

The order of Mononegavirales is classified into four main families: Paramyxoviridae, Rhabdoviridae, Filoviridae and Bornaviridae. Viruses belonging to these families have genomes that are represented by a single negative sense (-) RNA molecule, ie the polarity of the RNA genome is opposite to the polarity of messenger RNA (mRNA) which is designated as positive sense (+ ). The classification of the major veterinary and human MV viruses is presented in the table below: Table 1: Classification of viruses within the order of Mononegavirales

A organização genômica e os detalhes do ciclo de vida dos vírus da ordem MV estão bem entendidos hoje em dia e são revistos por vários autores (Neumann et al., J. Gen. Virology 83, 2635-2662, 2002; Whelan et al., Curr. Top. Microbiol. Immunol. 203, 63119, 2004; Conzelmann, K., Curr. Top. Microbiol. Immunol. 203, 1-41, 2004). Embora vírus Mononegaviraleses possuam diferentes hospedeiros e distintas propriedades morfológicas e biológicas, possuem muitas características comuns, tais como organização genômica e elementos essenciais para seu típico modo de replicação e de expressão de gene, ilustrando que têm originado de um ancestral comum. São vírus envelopados que se replicam nos citoplasmas da célula e produzem mRNAs que não são editados.The genomic organization and life cycle details of MV order viruses are now well understood and are reviewed by several authors (Neumann et al., J. Gen. Virology 83, 2635-2662, 2002; Whelan et al. , Curr. Top. Microbiol. Immunol. 203, 63119, 2004; Conzelmann, K., Curr. Top. Microbiol. Immunol. 203, 1-41, 2004). Although Mononegaviral viruses have different hosts and distinct morphological and biological properties, they share many common features, such as genomic organization and essential elements for their typical mode of gene replication and expression, illustrating that they have originated from a common ancestor. They are enveloped viruses that replicate in the cell's cytoplasm and produce mRNAs that are not edited.

Um vírus Mononegavirales consiste de duas unidades funcionais maiores, um complexo de ribonucleoproteína (RNP) e um envelope. As sequências de genoma completas para vírus representativos dos gêneros de todas as famílias mencionadas acima têm sido determinadas. Os genomas variam em tamanho de cerca de 9.000 nucleotídeos a cerca de 19.000 e contêm de 5 a 10 genes. A estrutura e a organização dos genomas dos vírus MV são muito similares e são governadas por seu modo particular de expressão de gene. Todos os genomas de vírus MV compreendem três genes de núcleo codificadores: uma nucleoproteína (N ou NP), uma fosfoproteína (P) e uma RNA-polimerase dependente de RNA (L). O envelope viral é composto de uma proteína de matriz (M) e uma ou mais glicoproteínas de transmembrana (e.g. proteínas G, HN e F) que desempenham um papel em montagem/germinação de vírus bem como na fixação do vírus em célula e/ou entrada do vírus na célula. Dependendo do gênero o repertório de proteínas é estendido pelas proteínas acessórias que exibem certas funções regulatórias específicas em transcrição e replicação de vírus ou que estão envolvidas em reações de hospedeiro - vírus (e.g. proteínas C, V e NS). A ordem do gene de vírus MV está elevadamente conservada com os genes de núcleo N e P, na ou próxima da terminação 3’ e com o gene grande (L) na posição distal 5’. O M, os genes de glicoproteína de superfície, bem como os outros genes acessórios, estão localizados entre os genes N, P e L.A Mononegavirales virus consists of two larger functional units, a ribonucleoprotein complex (RNP) and an envelope. The complete genome sequences for viruses representative of the genera of all the families mentioned above have been determined. Genomes range in size from about 9,000 nucleotides to about 19,000 and contain 5 to 10 genes. The structure and organization of MV virus genomes are very similar and are governed by their particular mode of gene expression. All MV virus genomes comprise three coding core genes: a nucleoprotein (N or NP), a phosphoprotein (P) and an RNA-dependent RNA polymerase (L). The viral envelope is composed of a matrix protein (M) and one or more transmembrane glycoproteins (eg G, HN and F proteins) that play a role in virus assembly/germination as well as virus attachment to cell and/or entry of the virus into the cell. Depending on the genus, the protein repertoire is extended by accessory proteins that exhibit certain specific regulatory functions in virus transcription and replication or that are involved in host-virus reactions (e.g. C, V and NS proteins). The MV virus gene order is highly conserved with the N and P core genes at or near the 3' end and with the large (L) gene at the 5' distal position. The M, surface glycoprotein genes, as well as the other accessory genes are located between the N, P, and L genes.

No complexo RNP, o RNA genômico ou antigenômico está firmemente encapsidado com a proteína N e está associado com a RNA- polimerase dependente de RNA que consiste da proteína L e P. Após infecção de uma célula, o complexo RNP, mas não o genoma de RNA nu, serve como um modelo para duas funções de síntese de RNA distintas, i.e., transcrição de mRNAs subgenômicos e replicação de RNA genômico de comprimento total.In the RNP complex, the genomic or antigenomic RNA is tightly encapsidated with the N protein and is associated with the RNA-dependent RNA polymerase consisting of the L and P protein. After infection of a cell, the RNP complex, but not the genome of Naked RNA serves as a template for two distinct RNA synthesis functions, ie, transcription of subgenomic mRNAs and replication of full-length genomic RNA.

Todos os genes serialmente arranjados estão separados por denominadas estruturas “de junção de gene”. Uma junção de gene compreende uma sequência de “final de gene” (GE) conservada, uma “região intergênica” (IGR) não-transcrita e uma sequência de “início de gene” (GS) conservada. Estas sequências são tanto suficientes quanto necessárias para a transcrição de gene. Durante a transcrição cada gene é seqüencialmente transcrito em mRNA pela viral RNA-polimerase dependente de RNA que inicia o processo de transcrição na extremidade 3’ do RNA genômico na primeira sequência GS. Em cada junção de gene transcrição é interrompida como um resultado do desengatamento da RNA polimerase na sequência GE. Reinício da transcrição ocorre na subseqüente sequência GS, embora com uma eficiência reduzida. Como um resultado deste processo interrompido, também chamado de um processo de “interrupção-iniciação”, atenuação da transcrição ocorre em cada junção de gene como um resultado do qual genes proximais 3’ em um genoma de vírus MV são transcritos mais abundantemente do que os genes a jusantes sucessivos. A forma modular de transcrição de genes de vírus MV na qual cada gene é parte de um cistron separado ou de uma unidade de transcrição separada torna estes vírus extremamente adequados para a inserção e a expressão de genes exógenos. Cada unidade de transcrição em um genoma de vírus MV compreende os seguintes elementos: 3’-GS-matriz de leitura aberta (ORF)-GE-5’.All serially arranged genes are separated by so-called "gene splicing" structures. A gene junction comprises a conserved "end of gene" (GE) sequence, an untranscribed "intergenic region" (IGR) and a conserved "start of gene" (GS) sequence. These sequences are both sufficient and necessary for gene transcription. During transcription, each gene is sequentially transcribed into mRNA by the viral RNA-dependent RNA polymerase that initiates the transcription process at the 3' end of the genomic RNA in the first GS sequence. At each junction gene transcription is interrupted as a result of the disengagement of RNA polymerase in the GE sequence. Restart of transcription occurs in the subsequent GS sequence, albeit with reduced efficiency. As a result of this disrupted process, also called a “stop-start” process, attenuation of transcription occurs at each gene junction as a result of which 3' proximal genes in an MV virus genome are transcribed more abundantly than are successive downstream genes. The modular form of MV virus gene transcription in which each gene is part of a separate cistron or separate transcription unit makes these viruses extremely suitable for the insertion and expression of exogenous genes. Each transcription unit in an MV virus genome comprises the following elements: 3'-GS-open reading frame (ORF)-GE-5'.

Nas terminações genômicas -3’- e -5’ todos os genomas de vírus MV possuem uma região não-transcrita curta chamada “líder” (cerca de 40-50 nt) e “reboque” (cerca de 20-600 nt), respectivamente. As sequências líder e reboque são sequências essenciais que controlam a replicação de RNA genômico A, encapsidação e empacotamento virais.At the -3'- and -5' genomic ends all MV virus genomes have a short untranscribed region called "leader" (about 40-50 nt) and "trailer" (about 20-600 nt), respectively. . The leader and trailer sequences are essential sequences that control genomic RNA A replication, viral packaging, and packaging.

Tecnologia de genética reversa e resgate de vírus MV infeccioso têm tornado possível a manipulação de seu genoma de RNA através de sua cópia de cDNA. O complexo de iniciação de replicação mínima requerido para sintetizar RNA viral é o complexo RNP. Vírus MV infeccioso pode ser resgatado por co-expressão intracelular de RNAs (anti)genômicos e as proteínas de suporte apropriadas de plasmídeos acionados por (T7) RNA polimerase. Desde o relatório inicial em 1994 de Schnell et al., 1994 (supra), recuperação confiável de muitas espécies de vírus MV tem sido alcançada baseado no protocolo original (ou suas ligeiras variações).Reverse genetics technology and infectious MV virus rescue have made it possible to manipulate its RNA genome through its cDNA copy. The minimal replication initiation complex required to synthesize viral RNA is the RNP complex. Infectious MV virus can be rescued by intracellular co-expression of (anti)genomic RNAs and the appropriate plasmid support proteins driven by (T7) RNA polymerase. Since the initial 1994 report by Schnell et al., 1994 (supra), reliable recovery of many MV virus species has been achieved based on the original protocol (or its slight variations).

Doença de Newcastle e gripe aviária são doenças importantes de aves domésticas, que podem causar perdas econômicas severas na indústria de aves domésticas em todo o mundo. O vírus da doença de Newcastle é um vírus de RNA de fita negativa, não-segmentada dentro da ordem de MV. O genoma, que é de cerca de 15 kb em comprimento, contém seis genes que codificam a nucleoproteína (NP), fosfoproteína e proteína V (P/V), proteína de matriz (M), proteína de fusão (F), proteína hemaglutinina-neuraminidase (HN) e RNA-polimerase dependente de RNA ou proteína grande (L). Os genes NDV estão arranjados seqüencialmente na ordem 3’-NP-P-M-F-HN-L- 5’, e estão separados por regiões intergênicas de comprimento diferente. Todos os genes são precedidos por uma sequência de início de gene (GS) que é seguida por uma região não-codificadora, a matriz de leitura aberta codificadora das proteínas de NDV, uma segunda região não-codificadora e a sequência de final de gene (GE). O comprimento do genoma de NDV é um múltiplo de seus que tem que ser considerado para a introdução de genes exógenos.Newcastle Disease and Avian Influenza are major poultry diseases that can cause severe economic losses to the poultry industry worldwide. Newcastle disease virus is a negative-stranded, unsegmented RNA virus within the order of MV. The genome, which is about 15 kb in length, contains six genes that encode nucleoprotein (NP), phosphoprotein and protein V (P/V), matrix protein (M), fusion protein (F), hemagglutinin protein -neuraminidase (HN) and RNA- or large protein-dependent RNA polymerase (L). The NDV genes are sequentially arranged in the order 3'-NP-P-M-F-HN-L-5', and are separated by intergenic regions of different length. All genes are preceded by a gene start sequence (GS) which is followed by a non-coding region, the open reading frame encoding the NDV proteins, a second non-coding region and the gene end sequence ( GE). The length of the NDV genome is a multiple of its ones that have to be considered for the introduction of exogenous genes.

Gripe aviária (AI) é uma doença de ave doméstica caracterizada por sinais respiratórios suaves a doença severa com mortalidade alta. O agente causador é um vírus de gripe aviária A (AIV) pertencendo à família Orthomyxoviridae. AIV contém oito segmentos de RNA genômico de polaridade negativa que codificam 10 proteínas. Baseado na antigenicidade das glicoproteínas de superfície hemaglutinina (HA) e neuraminidase (N), vírus AI são de subtipo. Até agora, são conhecidos 16 subtipos de hemaglutinina (H1 - H16) e nove subtipos de neuraminidase (N1 - N9). Anticorpos para H e N são importantes na resposta imune humoral e inibem infecção ou previnem doença.Avian Influenza (AI) is a poultry disease characterized by mild respiratory signs to severe disease with high mortality. The causative agent is an avian influenza A (AIV) virus belonging to the Orthomyxoviridae family. AIV contains eight negative polarity genomic RNA segments that encode 10 proteins. Based on the antigenicity of the surface glycoproteins hemagglutinin (HA) and neuraminidase (N), AI viruses are subtype. So far, 16 hemagglutinin subtypes (H1 - H16) and nine neuraminidase subtypes (N1 - N9) are known. Antibodies to H and N are important in the humoral immune response and inhibit infection or prevent disease.

Vírus da doença de Newcastle e da gripe aviária podem ser agrupados em dois patótipos distintos de acordo com sua virulência. Sintomas causados por AIV patogênico baixo AIV (LPAI) ou NDV lentogênico são considerados de relevância menor. Em contraste, gripe aviária elevadamente patogênica (HPAI) e doença de Newcastle causada por vírus virulentos elevados (NDV: cepas mesogênicas e velogênicas) são doenças notificáveis.Newcastle disease and avian influenza viruses can be grouped into two distinct pathotypes according to their virulence. Symptoms caused by pathogenic low AIV AIV (LPAI) or slowogenic NDV are considered to be of minor relevance. In contrast, highly pathogenic avian influenza (HPAI) and Newcastle disease caused by highly virulent viruses (NDV: mesogenic and velogenic strains) are notifiable diseases.

Embora vacinação rotineira contra NDV com cepas de NDV lentogênicas seja realizada para proteger galinha contra cepas de NDV elevadamente virulentas, vacinação contra HPAI não é realizada na maioria dos países, porque HPAI é controlada por uma estratégia de erradicação. Contudo, vacinação pode ser usada como uma estratégia para minimizar perdas e reduzir a incidência de doença. Imunidade induzida por vacinas é específica para subtipo, o que significa que uma vacina de subtipo H5 pode proteger contra AIV H5 mas não contra outros subtipos H. Normalmente, replicação do vírus da gripe é restrita aos pulmões porque hemaglutinina de vírus de LPAI pode ser clivada apenas por triptase Clara, a serina protease restrita aos pulmões. Até agora, todos os vírus de HPAI têm sido dos subtipos H5 e H7. Estes vírus de HPAI contêm múltiplos aminoácidos básicos no sítio de clivagem H de modo que ela pode ser clivada por enzimas semelhantes à subtilisina e furina ubíquas nas subunidades HA1 e HA2. Tais vírus portanto podem crescer em outros órgãos.Although routine NDV vaccination with lentegenic NDV strains is performed to protect chickens against highly virulent NDV strains, vaccination against HPAI is not performed in most countries because HPAI is controlled by an eradication strategy. However, vaccination can be used as a strategy to minimize losses and reduce the incidence of disease. Vaccine-induced immunity is subtype-specific, meaning that an H5 subtype vaccine can protect against AIV H5 but not against other H subtypes. Normally, influenza virus replication is restricted to the lungs because LPAI virus hemagglutinin can be cleaved only by Clara tryptase, the lung-restricted serine protease. Until now, all HPAI viruses have been of the H5 and H7 subtypes. These HPAI viruses contain multiple basic amino acids at the H cleavage site so that it can be cleaved by subtilisin and furin-like enzymes ubiquitous in the HA1 and HA2 subunits. Such viruses can therefore grow in other organs.

Vacinas de subtipos H5 e H7 podem proporcionar proteção de galinhas e perus contra sinais clínicos e morte após infecção com HPAI. Em adição às vacinas de AIV inteiro baseadas em óleo convencionais, tem sido mostrado experimentalmente que as vacinas de vírus vetor, proteína de subunidade e DNA são efetivas para imunização contra AI. Desde o advento de genética reversa para vírus diferentes a geração de vírus recombinantes para uso como vetores de vacina é uma aplicação importante. Vírus de RNA de fita negativa recombinantes diferentes expressando proteínas estranhas têm sido construídos. Também, a hemaglutinina de AIV foi inserida em vírus vetores diferentes como o vírus da laringotraqueite infecciosa (ILTV) (Luschow et al., Vaccine 19, 4249-59, 2001), vírus da Peste Bovina (Walsh et al., J. Virol. 74, 10165-75, 2000) e vírus da estomatite vesicular (VSV) (Roberts et al., J. Virol. 247, 4704-11, 1998).Subtype H5 and H7 vaccines may protect chickens and turkeys against clinical signs and death following HPAI infection. In addition to conventional oil-based whole AIV vaccines, vector virus, subunit protein and DNA vaccines have been experimentally shown to be effective for immunization against AI. Since the advent of reverse genetics for different viruses the generation of recombinant viruses for use as vaccine vectors is an important application. Different recombinant negative strand RNA viruses expressing foreign proteins have been constructed. Also, AIV hemagglutinin has been inserted into different vector viruses such as infectious laryngotracheitis virus (ILTV) (Luschow et al., Vaccine 19, 4249-59, 2001), Rinderpest virus (Walsh et al., J. Virol. 74, 10165-75, 2000) and vesicular stomatitis virus (VSV) (Roberts et al., J. Virol. 247, 4704-11, 1998).

Vírus da Peste Bovina também foi usado como um vírus vetor para a expressão da proteína do capsídeo VP1 do vírus da doença da boca-e- pata (Baron et al., 1999, J. of Gen. Virol., vol. 80, p. 2031-2039).Rinderpest Virus has also been used as a vector virus for the expression of the VP1 capsid protein of the mouth and foot disease virus (Baron et al., 1999, J. of Gen. Virol., vol. 80, p. 2031-2039).

Tao et al. (1998, J. of Viral., vol. 72, p. 2955-2961) descrevem a construção de um vírus da parainfluenza de humano (hPIV) quimérico de tipo 3, no qual os genes HN e F de hPIV tipo 1 foram usados para uma substituição de (não uma adição em) genes HN e F de hPIV tipo 3 endógenos.Tao et al. (1998, J. of Viral., vol. 72, p. 2955-2961) describe the construction of a chimeric human parainfluenza virus (hPIV) type 3, in which the HN and F genes of hPIV type 1 were used for a replacement of (not an addition in) endogenous hPIV type 3 HN and F genes.

Também NDV foi usado para a expressão de hemaglutinina de AIV. O gene de hemaglutinina de gripe A/WSN/33 foi inserido entre os genes P e M da cepa NDV Hitchner B1. Este recombinante protegeu camundongos contra infecção letal embora houvesse uma perda de peso detectável em camundongos que se recuperaram totalmente dentro de 10 dias Nakaya et al. (J. Virol. 75, 11868-73, 2001). Um outro NDV recombinante com o mesmo sítio de inserção para o gene exógeno expressou a H7 de um LPAI mas apenas 40 % das galinhas vacinadas foram protegidas de ambos HPAI e NDV velogênicos (Swayne et al., Avian Dis. 47, 104750, 2003).Also NDV was used for the expression of AIV hemagglutinin. The influenza A/WSN/33 hemagglutinin gene was inserted between the P and M genes of the NDV Hitchner B1 strain. This recombinant protected mice against lethal infection although there was detectable weight loss in mice that fully recovered within 10 days Nakaya et al. (J. Virol. 75, 11868-73, 2001). Another recombinant NDV with the same exogenous gene insertion site expressed the H7 of an LPAI but only 40% of the vaccinated chickens were protected from both HPAI and velogenic NDV (Swayne et al., Avian Dis. 47, 104750, 2003) .

Estas publicações contudo não descrevem quaisquer efeitos vantajosos das denominadas regiões não-codificadoras de genes de MV endógenos sobre a expressão de genes exógenos adicionais no genoma de um vetor de MV.These publications however do not describe any beneficial effects of so-called non-coding regions of endogenous MV genes on the expression of additional exogenous genes in the genome of a MV vector.

Um objetivo desta invenção é proporcionar um vetor de vírus MV recombinante que exibe um nível de expressão mais alto de uma proteína codificada por um gene exógeno inserido no genoma do vírus vetor e/ou que mostra uma imunogenicidade mais forte do que a de vetores de vírus MV existentes.An object of this invention is to provide a recombinant MV virus vector that exhibits a higher level of expression of a protein encoded by an exogenous gene inserted into the vector virus genome and/or that shows stronger immunogenicity than that of virus vectors existing MVs.

Os presentes inventores têm verificado que este objetivo pode ser alcançado por um vetor de vírus Mononegavirales recombinante de acordo com a invenção. Portanto, a presente invenção proporciona um vetor de vírus Mononegavirales recombinante hospedando uma unidade de transcrição adicional compreendendo um gene exógeno operativamente ligado com uma sequência de início de gene (GS) de vírus Mononegavirales a montante e uma sequência de final de gene (GE) de vírus Mononegavirales a jusante, caracterizado pelo fato de que entre a sequência GS e um códon de iniciação do gene exógeno e entre um códon de terminação do gene exógeno e a sequência GE, uma região não-codificadora 3’ e uma região não-codificadora 5’ (senso de genoma) de um gene de vírus Mononegavirales estão localizadas, respectivamente.The present inventors have found that this objective can be achieved by a recombinant Mononegavirales virus vector according to the invention. Therefore, the present invention provides a recombinant Mononegavirales virus vector hosting an additional transcription unit comprising an exogenous gene operably linked with an upstream Mononegavirales virus gene start (GS) sequence and a gene end (GE) sequence of Downstream Mononegavirales virus, characterized by the fact that between the GS sequence and an exogenous gene start codon and between an exogenous gene stop codon and the GE sequence, a 3' non-coding region and a 5' non-coding region ' (genome sense) of a Mononegavirales virus gene are located, respectively.

É notado que as indicações aqui da polaridade das fitas de ácido nucleico e no restante do texto são dadas no senso de genoma (-), exceto no contexto de sequências de cDNA e mRNA.It is noted that the indications here of the polarity of the nucleic acid strands and elsewhere in the text are given in the genome sense (-), except in the context of cDNA and mRNA sequences.

Tem sido verificado que a presença das regiões não- codificadoras 3’ e 5’ de um gene de vírus MV em uma unidade de transcrição compreendendo um gene exógeno inserido no genoma de um vírus MV possui um efeito positivo sobre a transcrição e/ou expressão do gene exógeno. É mostrado na Figura 3 que engenharia das regiões não-codificadoras de um gene de vírus MV entre uma sequência GS e um gene de hemaglutinina (HA) de vírus da gripe aviária (AIV) e entre o gene AIV HA e uma sequência GE aumenta a quantidade de HA mRNA sintetizado por um vetor de vírus MV hospedando aquele gene AIV HA. Um efeito positivo também é conservado em nível de expressão de proteína: comparação dos vetores de vírus MV apenas mostrou uma coloração imunológica intensa com anti-soro específico para AIV HA no caso do vetor de vírus MV hospedando o gene exógeno AIV HA foi flanqueado pelas regiões não-codificadoras (Figura 4). Portanto, tem sido verificado que, embora os inventores não desejem se ligar a qualquer teoria ou modelo que pode explicar estas observações, a presença de regiões não-codificadoras de vírus MV flanqueando um gene exógeno, possui um efeito positivo sobre o desempenho do vetor de vírus MV resultante.It has been shown that the presence of the 3' and 5' non-coding regions of an MV virus gene in a transcription unit comprising an exogenous gene inserted into the genome of an MV virus has a positive effect on transcription and/or expression of the exogenous gene. It is shown in Figure 3 that engineering the non-coding regions of a MV virus gene between a GS sequence and an avian influenza virus (AIV) hemagglutinin (HA) gene and between the AIV HA gene and a GE sequence increases amount of HA mRNA synthesized by an MV virus vector harboring that AIV HA gene. A positive effect is also conserved at protein expression level: comparison of MV virus vectors only showed intense immunostaining with AIV HA specific antiserum in case the MV virus vector harboring the exogenous AIV HA gene was flanked by regions non-coding (Figure 4). Therefore, it has been found that, although the inventors do not wish to be bound by any theory or model that might explain these observations, the presence of non-coding regions of MV viruses flanking an exogenous gene has a positive effect on the performance of the MV vector. resulting MV virus.

Um gene exógeno é uma molécula de polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo ou uma proteína e que não está presente em natureza no genoma do vírus MV recipiente.An exogenous gene is a polynucleotide molecule that encodes a polypeptide or a protein and is not present in nature in the genome of the recipient MV virus.

Como já descrito em detalhe acima, uma característica comum da organização genômica de vírus MV é sua forma modular de transcrição na qual unidades de transcrição serialmente arranjadas são sucessivamente transcritas. Em um vírus MV de tipo selvagem os genes transcritos são flanqueados (i) em sua extremidade 3’ com uma sequência GS e (ii) em sua extremidade 5’ com uma sequência de nucleotídeos também designada na arte como “região não-codificadora” e uma sequência GE. Portanto, o termo “região não-codificadora” (3’ ou 5’) como aqui usado define uma sequência de nucleotídeos que está localizada a montante (3’) ou a jusante (5’) de um gene natural de um vírus MV e que abarca a região entre a sequência GS e o códon de iniciação (ATG) do vírus MV e a região entre o códon de terminação (TAA, TAG ou TGA) do gene do vírus MV e a sequência GE, respectivamente. As regiões não-codificadoras aqui usadas são derivadas de um gene do mesmo vírus como o vírus vetor (i.e. as regiões não-codificadoras são homólogas ao vetor de vírus MV).As already described in detail above, a common feature of the genomic organization of MV viruses is their modular form of transcription in which serially arranged transcription units are successively transcribed. In a wild-type MV virus the transcribed genes are flanked (i) at their 3' end with a GS sequence and (ii) at their 5' end with a nucleotide sequence also designated in the art as "non-coding region" and a GE sequence. Therefore, the term "non-coding region" (3' or 5') as used herein defines a nucleotide sequence that is located upstream (3') or downstream (5') of a natural gene of a MV virus and which spans the region between the GS sequence and the start codon (ATG) of the MV virus and the region between the stop codon (TAA, TAG or TGA) of the MV virus gene and the GE sequence, respectively. The non-coding regions used herein are derived from a gene from the same virus as the vector virus (i.e. the non-coding regions are homologous to the MV virus vector).

Informação detalhada da organização genômica de vírus MV é conhecida na arte, incluindo as sequências de nucleotídeos dos vários genes de vírus MV e suas sequências de controle de transcrição (GS e GE) e as sequências não-codificadoras que flanqueiam os genes. Tal formação está, por exemplo, disponível no banco de dados do National Center for Biotechnology Information (NCBI), e.g. via sua página da web na internet; veja Tabelas 2 e 3).Detailed information on the genomic organization of MV viruses is known in the art, including the nucleotide sequences of the various MV virus genes and their transcription control sequences (GS and GE) and the non-coding sequences flanking the genes. Such training is, for example, available in the National Center for Biotechnology Information (NCBI) database, e.g. via its internet web page; see Tables 2 and 3).

As sequências não-codificadoras que são preferivelmente usadas nesta invenção são derivadas de genes de vírus MV naturais, mas substituição de um ou mais nucleotídeos em uma região não-codificadora natural também é considerada para estar dentro da invenção Em particular, são contempladas substituições de nucleotídeo que estão localizadas imediatamente a montante ou a jusante do códon de iniciação / terminação do gene exógeno, respectivamente, e resultam da introdução de sítios de clivagem de enzima de restrição artificiais que permitem a manipulação genética destas regiões.The non-coding sequences that are preferably used in this invention are derived from natural MV virus genes, but substitution of one or more nucleotides in a natural non-coding region is also considered to be within the invention. which are located immediately upstream or downstream of the exogenous gene start/stop codon, respectively, and result from the introduction of artificial restriction enzyme cleavage sites that allow genetic manipulation of these regions.

Em um vetor de vírus MV recombinante preferido de acordo com a presente invenção as regiões não-codificadoras de um gene codificador de uma proteína de envelope de vírus MV, em particular uma proteína M, G, F ou HN, ou uma proteína RNP, em particular, uma proteína N, P ou L.In a preferred recombinant MV virus vector according to the present invention the non-coding regions of a gene encoding an MV virus envelope protein, in particular an M, G, F or HN protein, or an RNP protein, in in particular, an N, P or L protein.

Em um vírus MV recombinante particularmente preferido de acordo com a invenção as regiões não-codificadoras são de um gene codificador de uma proteína F ou HN.In a particularly preferred recombinant MV virus according to the invention the non-coding regions are from a gene encoding an F or HN protein.

Sequências de nucleotídeos específicas de regiões não- codificadoras a serem usadas em um vetor de vírus MV recombinante de acordo com a invenção são apresentadas na Tabela 3. Tabela 2: Informação de genoma e de vetor em vírus Mononegavirales

Specific nucleotide sequences of non-coding regions to be used in a recombinant MV virus vector according to the invention are presented in Table 3. Table 2: Genome and vector information in Mononegavirales viruses

As sequências GS e GE a serem usadas nesta invenção como as sequências de controle de transcrição são preferivelmente aquelas derivadas dos genes naturais dos vírus MV. Acredita-se que estas sequências modulam a atividade da RNA polimerase durante o processo de transcrição, em particular no processo de iniciação de transcrição e modificação de extremidade 5’ de mRNA e no controle de terminação e poliadenilação de extremidade 3’ de transcrição. Para cada um dos vírus MV, o início de cada gene é marcado por uma sequência de cerca de 10 nucleotídeos. Enquanto que em algumas espécies de vírus MV as sequências GS são as mesmas para cada gene, as sequências GS no genoma de outras espécies de vírus MV podem exibir diferenças sutis.The GS and GE sequences to be used in this invention as the transcription control sequences are preferably those derived from the natural genes of the MV viruses. These sequences are believed to modulate RNA polymerase activity during the transcription process, in particular in the process of transcription initiation and modification of the 5' end of mRNA and in the control of transcription termination and polyadenylation of the 3' end. For each of the MV viruses, the beginning of each gene is marked by a sequence of about 10 nucleotides. While in some MV virus species the GS sequences are the same for each gene, the GS sequences in the genome of other MV virus species can exhibit subtle differences.

Em vista de sua função comum em terminação de transcrição e formação de cauda poli-A de extremidade 3’ de mRNA, as sequências GE em vírus MV compartilham características de sequência comuns. Uma sequência GE típica compreende uma região-U de entre 4 e 8 nucleotídeos em comprimento. Ademais, há uma conservação forte de um resíduo-C diretamente a montante da região-U e que é precedida por um segmento de nucleotídeos que é rico em A/U. Em várias sequências GE os 4 nucleotídeos diretamente a montante da região-U são compostos de 3’-AUUC-5’.In view of their common role in transcription termination and mRNA 3'-end poly-A tail formation, GE sequences in MV viruses share common sequence characteristics. A typical GE sequence comprises a U-region of between 4 and 8 nucleotides in length. Furthermore, there is a strong conservation of a C-residue directly upstream of the U-region and which is preceded by a nucleotide segment that is rich in A/U. In several GE sequences the 4 nucleotides directly upstream of the U-region are composed of 3'-AUUC-5'.

As sequências de controle de transcrição que definem as bordas de gene ou junções de gene dos genes de vírus MV têm sido identificadas para muitos genes de vírus MV por comparação das sequências de nucleotídeos no modelo genômico e as sequências de nucleotídeos presentes nas terminações de mRNA. Em adição muitos estudos têm identificado as sequências de consenso GS e GE que são requeridas para expressão de gene eficiente. Características gerais e exemplos específicos de sequências GS e GE podem ser derivadas da informação do banco de dados de sequências de NCBI (veja Tabela 2 para números de acesso em NCBI) e também são revistas por Neumann et al.(J. Virol. 83, 2635-2662, 2002), e Whelan et al. (Current Topics Microbiol. Immunol. 203, 63-119, 2004).Transcription control sequences that define the gene borders or gene junctions of MV virus genes have been identified for many MV virus genes by comparing the nucleotide sequences in the genomic model and the nucleotide sequences present at the mRNA ends. In addition many studies have identified the GS and GE consensus sequences that are required for efficient gene expression. General features and specific examples of GS and GE sequences can be derived from information from the NCBI sequence database (see Table 2 for NCBI accession numbers) and are also reviewed by Neumann et al. (J. Virol. 83, 2635-2662, 2002), and Whelan et al. (Current Topics Microbiol. Immunol. 203, 63-119, 2004).

Sequências GS e GE especificamente preferidas a serem usadas em um vetor de vírus MV recombinante de acordo com a invenção são listadas em Tabela 3, embora seja reconhecido que uma borda mais precisa entre as sequências GS, NCR e GE nem sempre pode ser determinada. Esta informação de sequências é descrita no banco de dados NCBI (veja no. de acesso em Tabela 2). Para NDV, referência é feita ao número de acesso em EMBL de Y18898, para RV ao número de acesso em GenBank de M31046. Tabela 3: Informação de sequência de junção de gene de vários genes de MV (senso +)

Specifically preferred GS and GE sequences to be used in a recombinant MV virus vector according to the invention are listed in Table 3, although it is recognized that a more precise border between the GS, NCR and GE sequences cannot always be determined. This string information is described in the NCBI database (see accession no. in Table 2). For NDV, reference is made to the EMBL accession number of Y18898, for RV to the GenBank accession number of M31046. Table 3: Gene Junction Sequence Information of Various MV Genes (sense +)

Em um vetor de vírus MV recombinante preferido da invenção as sequências GS, GE e as regiões não-codificadoras derivadas do mesmo gene de vírus MV.In a preferred recombinant MV virus vector of the invention the GS, GE and non-coding regions are derived from the same MV virus gene.

Métodos para a preparação de um vetor de vírus MV recombinante hospedando uma unidade de transcrição adicional compreendendo um gene exógeno são bem conhecidos na arte. Por exemplo, Tabela 2 refere-se aos documentos que descrevem a preparação de tais vírus vetores recombinantes para várias espécies de vírus MV. Em princípio, o método usado na presente invenção é o mesmo que aquele na arte anterior, exceto que o gene exógeno a ser inserido no genoma de vírus MV é flanqueado pelas regiões não-codificadoras 3’ e 5’ apropriadas, como definido acima.Methods for preparing a recombinant MV virus vector hosting an additional transcription unit comprising an exogenous gene are well known in the art. For example, Table 2 refers to documents describing the preparation of such recombinant vector viruses for various MV virus species. In principle, the method used in the present invention is the same as that in the prior art, except that the exogenous gene to be inserted into the MV virus genome is flanked by the appropriate 3' and 5' non-coding regions, as defined above.

Em um método geral de acordo com a invenção o vetor de vírus MV recombinante é preparado pela inserção de uma molécula de ácido nucleico isolada compreendendo (i) um gene exógeno flanqueado pelas regiões não-codificadoras 3’ e 5’ como definidas acima e (ii) as sequências de controle de transcrição apropriadas, no genoma do vírus MV, de tal modo que no vetor de vírus MV resultante o gene exógeno seja tanto precedido quanto seguido por uma junção de gene de vírus MV, em particular por um fragmento de sequência de nucleotídeos genômica compreendendo os elementos GE-GR-GS. A presença de elementos a montante e a jusante garante a tradução apropriada não apenas dos genes exógenos inseridos, mas também dos genes de vírus MV homólogos que estão localizados a montante e a jusante do gene exógeno inserido.In a general method according to the invention the recombinant MV virus vector is prepared by inserting an isolated nucleic acid molecule comprising (i) an exogenous gene flanked by the 3' and 5' non-coding regions as defined above and (ii) ) the appropriate transcription control sequences, in the MV virus genome, such that in the resulting MV virus vector the exogenous gene is both preceded and followed by a MV virus gene junction, in particular by a sequence fragment of genomic nucleotides comprising the GE-GR-GS elements. The presence of upstream and downstream elements ensures proper translation not only of the inserted exogenous genes, but also of the homologous MV virus genes that are located upstream and downstream of the inserted exogenous gene.

Mais em particular, neste método a molécula de ácido nucleico isolada e o genoma do vírus MV são usados em sua forma de cDNA (senso +). Isto permite as fáceis manipulação e inserção das moléculas de ácido nucleico desejadas no genoma viral.More particularly, in this method the isolated nucleic acid molecule and the MV virus genome are used in its cDNA form (sense +). This allows for easy manipulation and insertion of the desired nucleic acid molecules into the viral genome.

Em geral, várias partes do genoma poderiam ser usadas para a inserção do gene exógeno, entre dois genes, i.e. em regiões intergênicas (IGR), regiões não-codificadoras 3’ ou 5’de um gene bem como extremidades proximal-promotor 3’ (antes dos genes N/NP) ou distal 5’ (após os genes L) de um genoma.In general, various parts of the genome could be used for exogenous gene insertion, between two genes, ie into intergenic regions (IGR), 3' or 5' non-coding regions of a gene as well as 3' proximal-promoter ends ( before the N/NP genes) or distal 5' (after the L genes) of a genome.

O gene exógeno poderia ser vantajosamente inserido antes do gene N/NP, entre NP-P, P-M, M-G/F, G/F-HN, HN-L e após o gene L.The exogenous gene could be advantageously inserted before the N/NP gene, between NP-P, P-M, M-G/F, G/F-HN, HN-L and after the L gene.

O modo mais simples é o uso de uma sequência de reconhecimento de enzima de restrição (RE) existente em um destes sítios pelo corte com a enzima e introdução de um cassete de transcrição apropriado. Visto que sequências de reconhecimento de enzima de restrição naturalmente existentes nem sempre estão localizadas na localização desejada, os sítios de reconhecimento de RE poderiam ser introduzidos no genoma convencionalmente por mutagênese sítio-direcionada ou por PCR. Exemplos de IGRs adequadas para inserção do gene exógeno podem ser encontrados em Tabela 3.The simplest way is to use a restriction enzyme recognition (RE) sequence existing at one of these sites by cutting with the enzyme and introducing an appropriate transcription cassette. Since naturally existing restriction enzyme recognition sequences are not always located in the desired location, ER recognition sites could be introduced into the genome conventionally by site-directed mutagenesis or by PCR. Examples of suitable IGRs for exogenous gene insertion can be found in Table 3.

A composição do cassete de transcrição a ser inserido depende do sítio de inserção. Por exemplo, no caso de um cassete de transcrição ser inserido em uma IGR o cassete pode compreender os seguintes elementos: 3’- sítio de reconhecimento de RE-GS-região não-codificadora-ORF (de gene exógeno)-região não-codificadora-GE-sítio de reconhecimento de RE - 5’.The composition of the transcription cassette to be inserted depends on the insertion site. For example, in case a transcription cassette is inserted into an IGR the cassette may comprise the following elements: 3'- RE recognition site-GS-non-coding region-ORF (from exogenous gene)-non-coding region -GE-RE recognition site - 5'.

Alternativamente, no caso de um cassete de transcrição ser introduzido em uma região não-codificadora 5’ de um gene de vírus MV natural o cassete pode ser composto de: 3’ - sítio de reconhecimento de RE- GE-IGR-GS-região não-codificadora-ORF (de gene exógeno)-região de não codificação-sítio de reconhecimento de RE - 5’.Alternatively, in case a transcription cassette is introduced into a 5' non-coding region of a natural MV virus gene the cassette may be composed of: 3' - recognition site of RE-GE-IGR-GS-non region -coding-ORF (from exogenous gene)-noncoding region-RE recognition site - 5'.

Similarmente, no caso de um cassete de transcrição ser introduzido em uma região não-codificadora 3’ de um gene de vírus MV natural o cassete de expressão pode ser composto de: 3’ - sítio de reconhecimento de RE-região não-codificadora-ORF (de gene exógeno)- região não-codificadora-GE-IGR-GS-sítio de reconhecimento de RE - 5’.Similarly, in case a transcription cassette is introduced into a 3' non-coding region of a natural MV virus gene the expression cassette may be composed of: 3' - RE recognition site-non-coding region-ORF (from exogenous gene)- non-coding region-GE-IGR-GS-ER recognition site - 5'.

A preparação de tais cassetes de transcrição e a sua inserção em um genoma de vírus MV apenas envolvem técnicas de biologia molecular rotineiras, tais como exemplificadas nas referências de literatura listadas em Tabela 2, e nos presentes Exemplos. Em particular, técnicas de tais mutagêneses sítio-direcionada e por PCR podem ser usadas para este propósito (Peeters et al., 1999, supra; Current Protocols in Molecular Biology, eds.: F. M. Ausubel et al., Wiley N.Y., 1995 edition, páginas 8.5.1.-8.5.9; e Kunkel et al., Methods in Enzymology Vol. 154, 376-382, 1987).The preparation of such transcription cassettes and their insertion into an MV virus genome only involves routine molecular biology techniques, as exemplified in the literature references listed in Table 2, and in the Examples herein. In particular, such site-directed and PCR mutagenesis techniques can be used for this purpose (Peeters et al., 1999, supra; Current Protocols in Molecular Biology, eds.: FM Ausubel et al., Wiley NY, 1995 edition, pages 8.5.1.-8.5.9; and Kunkel et al., Methods in Enzymology Vol. 154, 376-382, 1987).

Mais em particular, um vetor de vírus MV recombinante de acordo com a presente invenção pode ser preparado por meio do método de “genética reversa” bem estabelecido que permite a modificação genética de vírus de RNA de fita negativa, não-segmentada da ordem MV (revisto por exemplo por Conzelmann, K.K., Current Topics Microbiol. Immunol. 203, 141, 2004; e Walpita et al., FEMS Microbiol. Letters 244, 9-18, 2005).More in particular, a recombinant MV virus vector according to the present invention can be prepared by means of the well-established "reverse genetics" method which allows for the genetic modification of non-segmented, negative-stranded RNA viruses of the order MV ( reviewed for example by Conzelmann, KK, Current Topics Microbiol. Immunol. 203, 141, 2004; and Walpita et al., FEMS Microbiol. Letters 244, 9-18, 2005).

Neste método, uma célula apropriada é co-transfectada por um vetor compreendendo uma molécula de cDNA compreendendo uma sequência de nucleotídeos que codifica um genoma de comprimento total, ou, preferivelmente, um antigenoma (senso positivo) de um vírus MV, e um ou mais vetores compreendendo as moléculas de cDNA compreendendo sequências de nucleotídeos que codificam as proteínas de suporte requeridas, sob condições suficientes para permitir a transcrição e a co-expressão do (anti)genoma de MV e proteínas de suporte e a produção de um vetor MV recombinante. Neste método, a citada molécula de ácido nucleico codificadora de (anti)genoma de vírus MV de comprimento total compreende uma unidade de transcrição adicional como definida acima.In this method, an appropriate cell is co-transfected by a vector comprising a cDNA molecule comprising a nucleotide sequence encoding a full-length genome, or, preferably, an antigenome (positive sense) of an MV virus, and one or more vectors comprising cDNA molecules comprising nucleotide sequences encoding the required support proteins, under conditions sufficient to allow for the transcription and co-expression of the MV (anti)genome and support proteins and the production of a recombinant MV vector. In this method, said full length MV virus (anti)genome encoding nucleic acid molecule comprises an additional transcription unit as defined above.

Com vetor quer-se dar um significado de um replicon, tal como plasmídeo, fago ou cosmídeo, no qual outro segmento de DNA pode ser ligado de modo a realizar a replicação do segmento de DNA ligado e suas transcrição e/ou expressão em uma célula transfectada com este vetor.By vector is meant to give the meaning of a replicon, such as plasmid, phage or cosmid, in which another DNA segment can be ligated in order to carry out the replication of the linked DNA segment and its transcription and/or expression in a cell transfected with this vector.

Preferivelmente, o vetor para a transcrição do genoma de comprimento total é um plasmídeo que compreende uma sequência de cDNA codificadora do (anti)genoma do vírus MV, flanqueada pelo promotor de T7 polimerase em sua extremidade 5’ e uma sequência de ribozima (hepatite delta) em sua extremidade 3’, embora um promotor de T3 ou SP6 RNA polimerase também possa ser usado.Preferably, the vector for transcription of the full-length genome is a plasmid comprising a cDNA sequence encoding the (anti)genome of the MV virus, flanked by the T7 polymerase promoter at its 5' end and a ribozyme sequence (delta hepatitis ) at its 3' end, although a T3 or SP6 RNA polymerase promoter can also be used.

Para a expressão intracelular das proteínas de suporte apropriadas é feito uso, preferivelmente, de plasmídeos compreendendo a sequência de cDNA codificadora destas proteínas, sob o controle de sequências de controle de expressão apropriadas, e.g. um promotor de T7 polimerase.For the intracellular expression of the appropriate support proteins use is preferably made of plasmids comprising the cDNA sequence encoding these proteins, under the control of appropriate expression control sequences, e.g. a T7 polymerase promoter.

Em um método particularmente preferido a preparação de um vetor de vírus MV recombinante de acordo com a presente invenção, são usados plasmídeos de expressão que codificam as proteínas N (ou NP), P e L do vírus MV.In a particularly preferred method of preparing a recombinant MV virus vector according to the present invention, expression plasmids encoding the N (or NP), P and L proteins of the MV virus are used.

As quantidades ou razões de plasmídeos de suporte transfectados a serem usados nesta tecnologia genética reversa cobrem uma faixa ampla. Razões para os plasmídeos de suporte N:P:L podem variar de cerca de 20:10:1 a 1:1:2 e protocolos de transfecção eficientes para cada vírus são conhecidos na arte.The amounts or ratios of transfected support plasmids to be used in this reverse genetics technology cover a wide range. Ratios for the N:P:L support plasmids can range from about 20:10:1 to 1:1:2 and efficient transfection protocols for each virus are known in the art.

Uma cópia exata do RNA genômico é preparada em uma célula transfectada pela ação combinada do promotor de T7 RNA polimerase e da sequência de ribozima, e este RNA é subseqüentemente empacotado e replicado pelas proteínas de suporte virais fornecidas pelos plasmídeos de expressão co-transfectados.An exact copy of the genomic RNA is prepared in a transfected cell by the combined action of the T7 RNA polymerase promoter and the ribozyme sequence, and this RNA is subsequently packaged and replicated by the viral support proteins provided by the co-transfected expression plasmids.

É preferido que uma enzima T7 polimerase seja proporcionada por um vírus de vacínia recombinante que infecta a célula transfectada, em particular pelo vírus de vacínia vTF73, ainda também outros vetores de varíola recombinantes, tal como o vírus de epitelioma contagioso, e.g. fpEFLT7pol, ou outros vetores virais podem ser usados para a expressão de T7 RNA polimerase.It is preferred that a T7 polymerase enzyme is provided by a recombinant vaccinia virus which infects the transfected cell, in particular by vaccinia virus vTF73, yet also other recombinant smallpox vectors such as contagious epithelioma virus, eg fpEFLT7pol, or others Viral vectors can be used for the expression of T7 RNA polymerase.

Separação do vírus resgatado do vírus da vacínia pode ser facilmente realizada por técnicas físicas simples, tal como filtração. Para resgate do vírus Sendai ou NDV, o resgate pode ser realizado por inoculação do sobrenadante de células transfectadas em ovos embrionados.Separation of the rescued virus from the vaccinia virus can be easily accomplished by simple physical techniques such as filtration. To rescue Sendai virus or NDV, rescue can be performed by inoculating the supernatant of transfected cells into embryonated eggs.

Em uma modalidade ainda mais preferida linhagens de célula recombinante são usadas para a transfecção dos vetores de transcrição e expressão que constitutivamente expressam a (T7) RNA polimerase e/ou uma ou mais das proteínas de suporte requeridas.In an even more preferred embodiment recombinant cell lines are used for the transfection of transcription and expression vectors which constitutively express the (T7) RNA polymerase and/or one or more of the required support proteins.

Por exemplo, resgate do vírus do Sarampo pode ser realizado em uma linhagem de célula de rim de embrião humano, 293-3-46, que expressa ambos a T7 RNA polimerase e as proteínas de suporte N e P do vírus do Sarampo (Radecke et al., EMBO J. 14, 5773-5784, 1995). Outra linhagem de célula muito útil que pode ser usada vantajosamente na presente invenção é baseada nas células BSR expressando a T7 RNA polimerase, i.e. linhagem celular BSR-T7/5 (Buchholz et al., J. Virol. 73, 251-259, 1999).For example, measles virus rescue can be performed in a human embryonic kidney cell line, 293-3-46, which expresses both the T7 RNA polymerase and the N and P support proteins of the Measles virus (Radecke et al. al., EMBO J. 14, 5773-5784, 1995). Another very useful cell line which can be used to advantage in the present invention is based on BSR cells expressing T7 RNA polymerase, ie BSR-T7/5 cell line (Buchholz et al., J. Virol. 73, 251-259, 1999) ).

Ademais, informação mais detalhada referente à tecnologia de genética reversa a ser usada para a preparação de um vírus MV de acordo com a presente invenção é descrita na revisão por Conzelmann, K.K. (supra) e Exemplo 1.Furthermore, more detailed information regarding the reverse genetics technology to be used for the preparation of an MV virus in accordance with the present invention is described in the review by Conzelmann, K.K. (supra) and Example 1.

A capacidade de vetores de vírus MV recombinantes de estavelmente expressarem genes exógenos tem resultado no desenvolvimento de vetores para ambas as aplicações profiláticas e terapêuticas.The ability of recombinant MV virus vectors to stably express exogenous genes has resulted in the development of vectors for both prophylactic and therapeutic applications.

Em um vetor de vírus MV recombinante de acordo com a presente invenção o gene exógeno pode variar dependendo da espécie de vetor de vírus MV específica e da aplicação do vírus vetor.In a recombinant MV virus vector according to the present invention the exogenous gene may vary depending on the specific MV virus vector species and the application of the vector virus.

O gene exógeno pode codificar um antígeno de um (outro) patógeno microbiano (e.g., um vírus, uma bactéria de parasita), especialmente o gene exógeno codifica um antígeno de um patógeno que é capaz de produzir uma resposta imune protetora.The exogenous gene can encode an antigen from (another) microbial pathogen (e.g., a virus, a parasitic bacterium), especially the exogenous gene encodes an antigen from a pathogen that is capable of producing a protective immune response.

Por exemplo, sequências de gene heterólogas que podem ser inseridas nos vetores de vírus da invenção incluem, mas não são limitadas aos genes de glicoproteína de vírus da gripe, em particular, genes de hemaglutininas H5 e H7 do vírus da gripa aviária, genes derivados de Vírus da Doença Bursal Infecciosa (IBDV), especificamente VP2 de (IBDV), genes derivados de Vírus da Bronquite Infecciosa (IBV), vírus da leucemia felina, vírus da cinomose canina, vírus da anemia infecciosa eqüina, vírus da raiva, organismo ehrlichia, em particular Ehrlichia canis, vírus sinciciais respiratórios, vírus da parainfluenza, vírus do sarampo e metapneumovírus de humano.For example, heterologous gene sequences that can be inserted into the virus vectors of the invention include, but are not limited to, influenza virus glycoprotein genes, in particular, avian influenza virus H5 and H7 hemagglutinin genes, genes derived from Infectious Bursal Disease Virus (IBDV), specifically VP2 of (IBDV), Infectious Bronchitis Virus (IBV) derived genes, feline leukemia virus, canine distemper virus, equine infectious anemia virus, rabies virus, ehrlichia organism, in particular Ehrlichia canis, respiratory syncytial virus, parainfluenza virus, measles virus and human metapneumovirus.

Alternativamente, o gene exógeno pode codificar um imune- modulador polipeptídeo que é capaz de intensificar ou modular a resposta imune à infecção de vírus, por exemplo por co-expressão de uma citocina tal como uma interleucina (e.g. IL-2, IL-12, lFN-y, TNF-α ou GM-CSF).Alternatively, the exogenous gene may encode an immune-modulating polypeptide that is capable of enhancing or modulating the immune response to virus infection, for example by co-expression of a cytokine such as an interleukin (eg IL-2, IL-12, IFN-y, TNF-α or GM-CSF).

A ordem dos vírus MV inclui ambos os vírus que são capazes de se replicarem em humanos e animais, ou em ambos (e.g. vírus da raiva e vírus da doença de Newcastle). Portanto, o gene exógeno pode ser selecionado de uma ampla variedade de patógenos microbianos veterinários e humanos.The order of MV viruses includes both viruses that are capable of replicating in humans and animals, or both (e.g. rabies virus and Newcastle disease virus). Therefore, the exogenous gene can be selected from a wide variety of veterinary and human microbial pathogens.

Embora todos os vírus possam ser usados como um vírus vetor na presente invenção, em uma modalidade preferida da invenção o vetor de vírus MV recombinante é um vírus da família Rhabdoviridae, preferivelmente do gênero Lyssavirus ou Novirhabdovirus, mais preferivelmente da espécie do vírus da raiva ou IHNV, respectivamente.Although all viruses can be used as a vector virus in the present invention, in a preferred embodiment of the invention the recombinant MV virus vector is a virus of the Rhabdoviridae family, preferably of the genus Lyssavirus or Novirhabdovirus, more preferably of the rabies virus species or IHNV, respectively.

Em uma modalidade também preferida o vírus MV recombinante é um vírus da família Paramyxoviridae, preferivelmente do gênero Respovirus, em particular a espécie hPIV3 ou bPIV3; Morbillivirus, em particular a espécie CDV; Pneumovirus, em particular a espécie RV; e Avulavirus, em particular a espécie NDV.In a further preferred embodiment the recombinant MV virus is a virus of the Paramyxoviridae family, preferably of the Respovirus genus, in particular the hPIV3 or bPIV3 species; Morbilliviruses, in particular the CDV species; Pneumoviruses, in particular the RV species; and Avulavirus, in particular the NDV species.

Em uma maneira particularmente preferida da presente invenção é proporcionado um vetor de vírus MV recombinante no qual o vírus é Vírus da doença de Newcastle (NDV). Como NDV é capaz de se replicar em ambos humanos e animais, em particular aves domésticas, mais em particular, galinhas, um vetor NDV recombinante de acordo com a invenção pode compreender um gene exógeno que codifica um antígeno de um patógeno, em particular de um patógeno respiratório, ou um imune- modulador que é capaz de produzir uma resposta imune em humanos ou qualquer um destes animais.In a particularly preferred embodiment of the present invention there is provided a recombinant MV virus vector in which the virus is Newcastle Disease Virus (NDV). As NDV is capable of replicating in both humans and animals, in particular poultry, more in particular chickens, a recombinant NDV vector according to the invention may comprise an exogenous gene encoding an antigen of a pathogen, in particular of a respiratory pathogen, or an immune-modulator that is capable of producing an immune response in humans or any of these animals.

Métodos de genética reversa para a manipulação genética de NDV têm sido descritos para NDV por Peeters et al. (J. Virology 73, 50015009, 1999), Rõmer-Oberdõrfer et al. (J. Gen. Virol. 80, 2987-2995, 1999), e na revisão por Conzelmann, K.K. (supra). Ademais, também é sabido que NDV pode ser usado como um vetor para a expressão de genes exógenos, por exemplo, para a produção de uma resposta imune em animais infectados com o vetor NDV (Nakaya et al., 2001, supra) e Swayne et al., Avian Dis. 47, 1047-50, 2003).Reverse genetic methods for the genetic manipulation of NDV have been described for NDV by Peeters et al. (J. Virology 73, 50015009, 1999), Römer-Oberdörfer et al. (J. Gen. Virol. 80, 2987-2995, 1999), and in the review by Conzelmann, K.K. (supra). Furthermore, it is also known that NDV can be used as a vector for the expression of exogenous genes, for example, for the production of an immune response in animals infected with the NDV vector (Nakaya et al., 2001, supra) and Swayne et al., Avian Dis. 47, 1047-50, 2003).

Um gene exógeno pode ser vantajosamente introduzido em um genoma de NDV em várias posições como descrito em geral para os vírus MV acima. Em particular, em um vetor NDV recombinante de acordo com a invenção, um gene exógeno (como parte de uma unidade de transcrição apropriada) pode ser inserido entre os seguintes genes NDV: NP-P, P-M, MF, F-HN, HN-L e no locus proximal 3’ e distal 5’ (Zhao et al., 2003, supra; Nakaya et al., 2001, supra), preferivelmente nas regiões proximal 3’, P-M, MF e F-HN, a região F-HN sendo mais preferida.An exogenous gene can be advantageously introduced into an NDV genome at various positions as described in general for MV viruses above. In particular, in a recombinant NDV vector according to the invention, an exogenous gene (as part of an appropriate transcription unit) can be inserted between the following NDV genes: NP-P, PM, MF, F-HN, HN- L e at the 3' proximal and 5' distal locus (Zhao et al., 2003, supra; Nakaya et al., 2001, supra), preferably in the 3' proximal, PM, MF and F-HN regions, the F- region HN being most preferred.

Ademais, em um vetor NDV recombinante de acordo com a presente invenção as regiões não-codificadoras que flanqueiam o gene exógeno podem ser derivadas de todos os genes de NDV naturalmente ocorrentes, em particular dos genes N, P, M, F ou HN, o gene HN sendo preferido.Furthermore, in a recombinant NDV vector according to the present invention the non-coding regions flanking the exogenous gene can be derived from all naturally occurring NDV genes, in particular from the N, P, M, F or HN genes, the HN gene being preferred.

Em uma modalidade particular da invenção um vetor NDV recombinante é aqui proporcionado no qual a unidade de transcrição adicional está localizada entre os genes F-HN e o gene exógeno inserido é flanqueado pelas regiões não-codificadoras do gene NDV HN.In a particular embodiment of the invention a recombinant NDV vector is provided herein in which the additional transcription unit is located between the F-HN genes and the inserted exogenous gene is flanked by the non-coding regions of the NDV HN gene.

Mais especificamente, um vetor NDV é proporcionado no qual a 3’- e 5’-NCR (e opcionalmente as sequências GS e GE) possuem uma sequência de nucleotídeos como mostrada nas SEQ ID NO: 1 e 2 ou 3 e 4.More specifically, an NDV vector is provided in which the 3'- and 5'-NCR (and optionally the GS and GE sequences) have a nucleotide sequence as shown in SEQ ID NO: 1 and 2 or 3 and 4.

Um vetor NDV recombinante de acordo com a presente invenção pode ser vantajosamente usado para induzir uma resposta imune em ave doméstica, em particular galinhas, contra outros patógenos. Portanto, o vetor NDV recombinante, preferivelmente compreende um gene exógeno que codifica um antígeno protetor de um patógeno aviário, em particular de vírus da gripe, vírus da doença de Marek (MDV), vírus da laringotraqueíte infecciosa (ILTV), vírus da bronquite infecciosa (IBV), vírus da doença bursal infecciosa (IBDV), vírus da anemia de galinha (CAV), reovírus, retrovírus aviário, adenovírus de ave, vírus da rinotraqueíte de peru (TRTV), E. coli, espécie Eimeria, Cryptosporidia, Mycoplasms tais como M. gallinarum, M. synoviae e M. meleagridis, Salmonella, Campylobacter, Ornithobacterium (ORT) ou Pasteurella sp.A recombinant NDV vector according to the present invention can be advantageously used to induce an immune response in poultry, in particular chickens, against other pathogens. Therefore, the recombinant NDV vector preferably comprises an exogenous gene encoding a protective antigen from an avian pathogen, in particular from influenza virus, Marek's disease virus (MDV), infectious laryngotracheitis virus (ILTV), infectious bronchitis virus (IBV), infectious bursal disease virus (IBDV), chicken anemia virus (CAV), reovirus, avian retrovirus, bird adenovirus, turkey rhinotracheitis virus (TRTV), E. coli, Eimeria species, Cryptosporidia, Mycoplasms such as M. gallinarum, M. synoviae and M. meleagridis, Salmonella, Campylobacter, Ornithobacterium (ORT) or Pasteurella sp.

Mais preferivelmente, o vetor NDV recombinante compreende um gene exógeno que codifica um antígeno de AIV, MDV, ILTV, IBV, TRTV, E. coli, ORT ou Mycoplasma.More preferably, the recombinant NDV vector comprises an exogenous gene encoding an AIV, MDV, ILTV, IBV, TRTV, E. coli, ORT or Mycoplasma antigen.

Em particular, o vetor NDV recombinante mutante compreende um gene de hemaglutinina (HA) de um vírus da gripe, preferivelmente de um vírus da gripe aviária (AIV), mais preferivelmente de um AVI elevadamente patogênico, em particular de AIV H5 ou H7.In particular, the mutant recombinant NDV vector comprises a hemagglutinin (HA) gene from an influenza virus, preferably from an avian influenza virus (AIV), more preferably from a highly pathogenic AVI, in particular from AIV H5 or H7.

Em princípio, o gene HA de todas as cepas de gripe (aviária) pode ser usado nesta invenção. As sequências de nucleotídeos de muitos genes HA têm sido descritas na arte e os genes HA relevantes podem ser resgatados de bancos de dados de sequências de ácido nucleico, tais como os bancos de dados GenBank ou EMBL.In principle, the HA gene from all strains of influenza (avian) can be used in this invention. The nucleotide sequences of many HA genes have been described in the art and the relevant HA genes can be retrieved from nucleic acid sequence databases such as the GenBank or EMBL databases.

O gene de hemaglutinina (HA) do subtipo H5N2 de AIV A/chicken/Italy/8/98 elevadamente patogênico pode ser vantajosamente usado como um gene exógeno na presente invenção como descrito acima. O gene é reversamente transcrito, clonado no vetor de expressão eucariótico pcDNA3 (Invitrogen), e seqüenciado (Lüschow et al., Vaccine, vol. 19, p. 4249-4259, 2001, e No. de Acesso no GenBank de AJ305306). Do plasmídeo de expressão obtido pCD-HA5 o gene HA pode ser obtido por amplificação pelo uso de iniciadores específicos que geram sítio de reconhecimento de REs artificial que permite a inserção do gene HA nas sequências genômicas de NDV.The highly pathogenic hemagglutinin (HA) gene of the highly pathogenic AIV A/chicken/Italy/8/98 subtype H5N2 can be advantageously used as an exogenous gene in the present invention as described above. The gene is reverse transcribed, cloned into the eukaryotic expression vector pcDNA3 (Invitrogen), and sequenced (Lüschow et al., Vaccine, vol. 19, p. 4249-4259, 2001, and GenBank Accession No. AJ305306). From the expression plasmid obtained from pCD-HA5, the HA gene can be obtained by amplification through the use of specific primers that generate an artificial ER recognition site that allows the insertion of the HA gene in the NDV genomic sequences.

Em uma outra modalidade o gene HA do subtipo H7N1 de AIV A/chicken/Italy/445/99 elevadamente patogênico pode ser usado como um gene exógeno na presente invenção como descrito acima. O gene HA é reversamente transcrito, e amplificado por PCR. O produto de 1711 pb é clonado no vetor pUC18 digerido por SmaI (Amersham) e seqüenciado (Veits et al., J. Gen. Virol. 84, 3343-3352, 2003; e No. de Acesso no GenBank de AJ580353).In another embodiment the HA gene of the highly pathogenic AIV A/chicken/Italy/445/99 subtype H7N1 can be used as an exogenous gene in the present invention as described above. The HA gene is reverse transcribed, and amplified by PCR. The 1711 bp product is cloned into pUC18 vector digested by SmaI (Amersham) and sequenced (Veits et al., J. Gen. Virol. 84, 3343-3352, 2003; and GenBank Accession No. AJ580353).

Em um vetor de vírus MV recombinante particularmente vantajoso de acordo com a presente invenção o vírus vetor MV é atenuado, isto é, o vírus vetor não é patogênico para o animal alvo ou exibe uma redução substancial de virulência comparado com o vírus de tipo selvagem. Muitos vírus MV aqui usados como vetores de vírus possuem um registro de segurança longo como vacinas atenuadas vivas tais como o vírus do sarampo e NDV, enquanto que outros vírus, tais como SeV e VSV são considerados não-patogênicos para humanos. Em adição, existem técnicas comerciais para obter e triar vírus atenuados que mostram um potencial limitado de infectividade ou replicação. Tais técnicas incluem passagem serial (fria) do vírus em um substrato heterólogo e mutagênese química.In a particularly advantageous recombinant MV virus vector according to the present invention the MV vector virus is attenuated, i.e. the vector virus is not pathogenic to the target animal or exhibits a substantial reduction in virulence compared to wild-type virus. Many MV viruses used here as virus vectors have a long safety record as live attenuated vaccines such as measles virus and NDV, while other viruses such as SeV and VSV are considered non-pathogenic to humans. In addition, commercial techniques exist to obtain and screen for attenuated viruses that show limited potential for infectivity or replication. Such techniques include serial (cold) passage of the virus into a heterologous substrate and chemical mutagenesis.

Um vetor NDV recombinante de acordo com a invenção pode ser derivado de qualquer cepa de vacina ND convencional. Exemplos de tais cepas de NDV adequadas presentes em vacinas ND comercialmente disponíveis são: Clone-30®, La Sota, Hitchner B1, NDW, C2 e AV4; Clone- 30® a cepa preferida.A recombinant NDV vector according to the invention can be derived from any conventional ND vaccine strain. Examples of such suitable NDV strains present in commercially available ND vaccines are: Clone-30®, La Sota, Hitchner B1, NDW, C2 and AV4; Clone-30® is the preferred strain.

Também tem sido verificado pelos presentes inventores que um vetor de vírus MV recombinante de acordo com a presente invenção é capaz de induzir uma resposta imune protetora em animais. Portanto, em outra modalidade desta invenção é proporcionada uma vacina contra um patógeno microbiano que compreende um a vetor de vírus MV recombinante como definido acima em uma forma viva ou inativada, e um diluente ou veículo farmaceuticamente aceitável.It has also been found by the present inventors that a recombinant MV virus vector according to the present invention is capable of inducing a protective immune response in animals. Therefore, in another embodiment of this invention there is provided a vaccine against a microbial pathogen which comprises a recombinant MV virus vector as defined above in a live or inactivated form, and a pharmaceutically acceptable diluent or carrier.

Uma vacina de acordo com a invenção pode ser preparada por métodos convencionais tais como aqueles comumente usados para vacinas de vírus MV inativado ou vivo comercialmente disponíveis. Resumidamente, um substrato suscetível é inoculado com o vetor de vírus MV recombinante e propagado até que o vírus replicado tenha o título desejado após o qual o material contendo o vírus é colhido. Subseqüentemente, o material colhido é formulado em uma preparação farmacêutica com propriedades imunizantes.A vaccine according to the invention can be prepared by conventional methods such as those commonly used for commercially available live or inactivated MV virus vaccines. Briefly, a susceptible substrate is inoculated with the recombinant MV virus vector and propagated until the replicated virus has the desired titer after which virus-containing material is harvested. Subsequently, the collected material is formulated into a pharmaceutical preparation with immunizing properties.

Cada substrato que é capaz de suportar a replicação do vetor de vírus MV recombinante pode ser usado na presente invenção. Como um substrato células hospedeiras podem ser utilizadas de ambas as origens procariótica e eucariótica, dependendo do vírus MV. Células hospedeiras apropriadas podem ser células de vertebrado, e.g. de primata. Exemplos apropriados são as linhagens de células humanas HEK, WI-38, MRC-5 ou H- 239, a linhagem de célula simiana Vero, a linhagem de célula de roedor CHO, BHK, a linhagem de célula canina MDCK ou as linhagens de células aviárias CEF ou CEK.Each substrate that is capable of supporting replication of the recombinant MV virus vector can be used in the present invention. As a substrate host cells can be used from both prokaryotic and eukaryotic sources, depending on the MV virus. Appropriate host cells can be vertebrate, e.g. primate, cells. Appropriate examples are the human cell lines HEK, WI-38, MRC-5 or H-239, the simian cell line Vero, the rodent cell line CHO, BHK, the canine cell line MDCK or the cell lines avian CEF or CEK.

Um substrato particularmente adequado sobre o qual um vetor NDV recombinante de acordo com a presente invenção pode ser propagado refere-se ao ovos embrionados SPF. Ovos embrionados podem ser inoculados com, por exemplo, 0,2 mL de fluido alantóico contendo NDV compreendendo pelo menos 102,0 EID50 por ovo. Preferivelmente, ovos embrionados de 9- a 11-dias de idade são inoculados com cerca de 105,0 EID50 e subseqüentemente incubados a 37°C por 2-4 dias. Após 2-4 dias o produto de vírus ND pode ser colhido preferivelmente por coleta do fluido alantóico. O fluido pode ser depois centrifugado a 2,500 g seguido por filtração do sobrenadante através de um filtro (100 μm).A particularly suitable substrate on which a recombinant NDV vector according to the present invention can be propagated refers to SPF embryonated eggs. Embryonic eggs can be inoculated with, for example, 0.2 ml of allantoic fluid containing NDV comprising at least 102.0 EID50 per egg. Preferably, 9- to 11-day-old embryonated eggs are inoculated with about 105.0 EID50 and subsequently incubated at 37°C for 2-4 days. After 2-4 days the ND virus product can preferably be collected by collecting the allantoic fluid. The fluid can then be centrifuged at 2,500 g followed by filtration of the supernatant through a filter (100 µm).

A vacina de acordo com a invenção compreende o vetor de vírus MV recombinante juntamente com um diluente ou veículo farmaceuticamente aceitável costumeiramente usado para tais composições.The vaccine according to the invention comprises the recombinant MV virus vector together with a pharmaceutically acceptable diluent or carrier customarily used for such compositions.

A vacina contendo o vírus vivo pode ser preparada e comercializada na forma de uma suspensão ou em uma forma liofilizada.The vaccine containing the live virus can be prepared and marketed in the form of a suspension or in a lyophilized form.

Veículos incluem estabilizadores, conservantes, e tampões. Diluentes incluem água, tampão aquoso e polióis.Vehicles include stabilizers, preservatives, and tampons. Diluents include water, aqueous buffer and polyols.

Em outro aspecto da presente invenção é proporcionada uma vacina compreendendo o vetor de vírus MV recombinante em uma forma inativada. As vantagens maiores de uma vacina inativada são sua segurança e os níveis altos de anticorpos protetores de duração longa que podem ser induzidos.In another aspect of the present invention there is provided a vaccine comprising the recombinant MV virus vector in an inactivated form. The biggest advantages of an inactivated vaccine are its safety and the high levels of long-lasting protective antibodies that can be induced.

O objetivo da inativação dos vírus colhidos após a etapa de propagação é a eliminação da reprodução dos vírus. Em geral, isto pode ser alcançado por meios físicos ou químicos bem conhecidos.The objective of inactivating the viruses collected after the propagation step is to eliminate virus reproduction. In general, this can be achieved by well-known physical or chemical means.

Se desejado, a vacina de acordo com a invenção pode conter um adjuvante. Exemplos de compostos e composições adequados com atividade adjuvante para este propósito são hidróxido de alumínio, fosfato de alumínio ou óxido de alumínio, emulsão de óleo-em-água ou de água-em-óleo baseada em, por exemplo um óleo mineral, tal como Bayol F® ou Marcol 52® ou óleo vegetal tal como acetato de vitamina E, e saponinas. A administração de uma vacina de acordo com a invenção pode ser por qualquer uma das formas bem conhecidas e pode depender do tipo de vetor de vírus. Modos de administração adequados incluem vacinação parenteral, intranasal, oral e por borrifo.If desired, the vaccine according to the invention can contain an adjuvant. Examples of suitable compounds and compositions with adjuvant activity for this purpose are aluminum hydroxide, aluminum phosphate or aluminum oxide, oil-in-water or water-in-oil emulsion based on, for example a mineral oil such as Bayol F® or Marcol 52® or vegetable oil such as vitamin E acetate, and saponins. Administration of a vaccine according to the invention can be in any of the well-known ways and can depend on the type of virus vector. Suitable modes of administration include parenteral, intranasal, oral and spray vaccination.

Uma vacina de vetor NDV de acordo com a invenção é preferivelmente administrada por técnicas de aplicação em massa baratas comumente usadas para vacinação contra NDV. Para vacinação contra NDV estas técnicas incluem vacinação por borrifo e água potável.An NDV vector vaccine according to the invention is preferably administered by inexpensive mass application techniques commonly used for vaccination against NDV. For NDV vaccination these techniques include spray and drinking water vaccination.

A vacina de acordo com a invenção compreende uma dosagem efetiva do vetor de vírus MV recombinante com o componente ativo, i.e. uma quantidade de material de vírus MV imunizante que induzirá imunidade nas aves vacinadas contra desafio por um organismo microbiano virulento. Imunidade é aqui definida como a indução de um nível mais alto significativo de proteção em uma população de humanos ou de animais contra mortalidade e sintomas clínicos após vacinação comparada com um grupo não-vacinado. Em particular, a vacina de acordo com a invenção protege uma proporção grande de animais ou humanos vacinados contra a ocorrência de sintomas clínicos da doença e mortalidade. Tipicamente, a vacina viva pode ser administrada em uma dose de 102,0-108,0 cultura de tecido/dose infecciosa para embrião (TC/EID50), preferivelmente em uma dose variando de 104,0-107,0 TC/EID50. Vacinas inativadas podem conter o equivalente antigênico de 104,0-109,0 TC/EID50.The vaccine according to the invention comprises an effective dosage of the recombinant MV virus vector with the active component, i.e. an amount of immunizing MV virus material that will induce immunity in the vaccinated birds against challenge by a virulent microbial organism. Immunity is defined here as the induction of a significantly higher level of protection in a population of humans or animals against mortality and clinical symptoms after vaccination compared to an unvaccinated group. In particular, the vaccine according to the invention protects a large proportion of vaccinated animals or humans against the occurrence of clinical symptoms of disease and mortality. Typically, the live vaccine can be administered at a dose of 102.0-108.0 tissue culture/embryo infectious dose (TC/EID50), preferably at a dose ranging from 104.0-107.0 TC/EID50. Inactivated vaccines may contain the antigen equivalent of 104.0-109.0 TC/EID50.

A invenção também inclui vacinas de combinação compreendendo, em adição ao vetor de vírus MV recombinante de acordo com a invenção, uma cepa de vacina capaz de induzir proteção contra um outro patógeno.The invention also includes combination vaccines comprising, in addition to the recombinant MV virus vector according to the invention, a vaccine strain capable of inducing protection against another pathogen.

EXAMPLES Example 1: Generation of a recombinant MV virus vector expressing an avian influenza virus HA gene (NDV/AIVH5) B Virus and cells

NDV recombinante resgatado e o isolado de vírus da gripe A/chicken/Italy/8/98 foram propagados em ovos de galinha embrionados de 10 dias de idade livres de patógeno (SPF). A cepa de NDV velogênica Herts 33/56 e a vacina de NDV Clone 30 (Nobilis®) foram usados.Rescued recombinant NDV and influenza virus isolate A/chicken/Italy/8/98 were propagated in pathogen free (SPF) 10 day old embryonated hens eggs. The velogenic NDV strain Herts 33/56 and the NDV Clone 30 vaccine (Nobilis®) were used.

Células BSR-T7/5 estavelmente expressando a fago T7 RNA polimerase foram usadas para recuperar NDV infeccioso de cDNA.BSR-T7/5 cells stably expressing phage T7 RNA polymerase were used to rescue infectious NDV from cDNA.

B Construction of cDNA encoding NDV antigenomic RNA containing the AIV H5 gene

A numeração entre parênteses como aqui usada para identificar as posições de nucleotídeos no genoma de NDV e os resíduos de aminoácido nas proteínas de NDV é como descrita por Romer Oberdorfer et al.(J. Gen. Virol. 80, 2987-2995, 1999, número de acesso em EMBL de Y18898). O plasmídeo pfINDV, expressando o RNA antigenômico de comprimento total de Clone 30 (Romer Oberdorfer et al., supra) foi usado para introduzir o gene AIV H5 que havia sido amplificado do plasmídeo pCD-HA5 (Luschow et al., supra) por iniciadores específicos com sítios de restrição MluI artificiais (PH5F1: 5’- cta aac gcg taa aat gga gaa aat agt gc -3’ (SEQ ID NO: 5) e PH5R1: 5’- tcg gac gcg ttt aaa tgc aaa ttc tgc act g -3’ (SEQ ID NO: 6), sítios MluI estão sublinhados) para rNDV/AIVH5-A e com sítios NcoI ou AflII (PH5F2: 5’-cct tcc atg gag aaa ata gtg ctt c -3’ (SEQ ID NO: 7) e PH5R2: 5’- cct cct taa gta taa ttg act caa tta aat gca aat tct gca ctg caa tga tcc -3’ (SEQ ID NO: 8), sítios de restrição estão sublinhados) para rNDV/AIVH5-B. A introdução de H5 no antigenoma de Clone 30 (Fig. 1 A) foi feita usando os sítios MluI como previamente descrito para a inserção de GFP (Engel-Herbert et al., J. Virol. Methods 108, 19-28, 2003). Resumidamente, para construção do plasmídeo de comprimento total pfINDV/AIVH5-A a H5 ORF foi amplificada com iniciadores contendo sítios MluI artificiais (veja acima) que foram usados para inserir a H5 ORF no cassete de gene mínimo entre os genes F e HN de NDV (Fig. 1 A). Construção do plasmídeo de comprimento total contendo o gene AIV H5 para geração de rNDV/AIVH5-B é dado em Figura 1B. Reações de mutagênese foram feitas usando o kit de mutagênese sítio-direcionada Quik Change® II XL (Stratagene). Para este fim, um plasmídeo pUC 18 (pUCNDVI) contendo o fragmento the NotI/BsiWI (nt 4953 - 8852) de genoma de Clone 30 e os seguintes iniciadores foram usados: MP1 (5’- gac aac agt cct caa cca tgg acc gcg ccg -3’) (SEQ ID NO: 9) e MP2 (5’- ctg gct agt tga gtc aat tct taa gga gtt gga aag atg gc -3’) (SEQ ID NO: 10) para mutagênese A (Fig. 1B) resultando no plasmídeo pUCNDV1a com sítios NcoI e AflII recém-criados (sítios de restrição em iniciadores estão sublinhados). Após digestão com NcoI e AflII a HN ORF de Clone 30 foi substituída pela AIV H5 ORF amplificada. Para mutagênese B para criar sítios SgfI e SnaBI na região intergênica do gene L de pUCNDVH5 resultando em pUCNDV/AIVH5_1b (Fig. 1 B) iniciadores MP3 (5’- caa aac agc tca tgg tac gta ata cgg gta gga cat gg -3’) (SEQ ID NO: 11) e MP4 (5’- gta agt ggc aat gcg atc gca ggc aaa aca gct cat gg -3’) (SEQ ID NO: 12) foram usados. Mutagênese C foi feita com MP3 e MP5 (5’- gaa aaa act acc ggc gat cgc tga cca aag gac gat ata cgg g -3’) (SEQ ID NO: 13) resultando em plasmídeo pUCNDV_1c para obter sítios SgfI e SnaBI que foram usados para a introdução do gene Clone 30 HN na região intergênica na frente do gene L no plasmídeo pUCNDVH5_1b. Finalmente, o fragmento NotI/BsiWI de pflNDV-1 foi substituído pelo fragmento NotI/BsiWI de pUCNDVH5_1c (Fig. 1 B). Os comprimentos dos genomas de comprimento total gerados novos representam um múltiplo de seis (16938 nt para rNDV/AIVH5-A e 17196 nt para rNDV/AIVH5-B).Numbering in parentheses as used herein to identify nucleotide positions in the NDV genome and amino acid residues in NDV proteins is as described by Romer Oberdorfer et al. (J. Gen. Virol. 80, 2987-2995, 1999, 1999, EMBL accession number of Y18898). Plasmid pfINDV, expressing the full-length antigenomic RNA of Clone 30 (Romer Oberdorfer et al., supra) was used to introduce the AIV H5 gene that had been amplified from plasmid pCD-HA5 (Luschow et al., supra) by primers specific with artificial MluI restriction sites (PH5F1: 5'- cta aac gcg taa aat gga gaa aat agt gc -3' (SEQ ID NO: 5) and PH5R1: 5'- tcg gac gcg ttt aaa tgc aaa ttc tgc act g -3' (SEQ ID NO: 6), MluI sites are underlined) for rNDV/AIVH5-A and with NcoI or AflII sites (PH5F2: 5'-cct tcc atg gag aaa ata gtg ctt c -3' (SEQ ID NO : 7) and PH5R2: 5'- cct cct taa gta taa ttg act caa tta aat gca aat tct gca ctg caa tga tcc -3' (SEQ ID NO: 8), restriction sites are underlined) for rNDV/AIVH5-B . Introduction of H5 into Clone 30 antigenome (Fig. 1A) was done using the MluI sites as previously described for GFP insertion (Engel-Herbert et al., J. Virol. Methods 108, 19-28, 2003) . Briefly, for construction of the full-length plasmid pfINDV/AIVH5-A the H5 ORF was amplified with primers containing artificial MluI sites (see above) which were used to insert the H5 ORF into the minimal gene cassette between the F and HN genes of NDV (Fig. 1A). Construction of the full-length plasmid containing the AIV H5 gene for rNDV/AIVH5-B generation is given in Figure 1B. Mutagenesis reactions were performed using the Quik Change® II XL site-directed mutagenesis kit (Stratagene). To this end, a plasmid pUC 18 (pUCNDVI) containing the NotI/BsiWI fragment (nt 4953 - 8852) of Clone 30 genome and the following primers were used: MP1 (5'-gac aac agt cct caa cca tgg acc gcg ccg -3') (SEQ ID NO: 9) and MP2 (5'-ctg gct agt tga gtc aat tct taa gga gtt gga aag atg gc -3') (SEQ ID NO: 10) for mutagenesis A (Fig. 1B ) resulting in plasmid pUCNDV1a with newly created NcoI and AflII sites (restriction sites in primers are underlined). After digestion with NcoI and AflII the HN ORF of Clone 30 was replaced by the amplified AIV H5 ORF. For mutagenesis B to create SgfI and SnaBI sites in the intergenic region of the L gene of pUCNDVH5 resulting in pUCNDV/AIVH5_1b (Fig. 1B) MP3 primers (5'- caa aac agc tca tgg tac gta ata cgg gta gga cat gg -3' ) (SEQ ID NO: 11) and MP4 (5'- gta agt ggc aat gcg atc gca ggc aaa aca gct cat gg -3') (SEQ ID NO: 12) were used. Mutagenesis C was done with MP3 and MP5 (5'- gaa aaa act acc ggc gat cgc tga cca aag gac gat ata cgg g -3') (SEQ ID NO: 13) resulting in plasmid pUCNDV_1c to obtain SgfI and SnaBI sites that were used for the introduction of the Clone 30 HN gene into the intergenic region in front of the L gene in plasmid pUCNDVH5_1b. Finally, the NotI/BsiWI fragment from pflNDV-1 was replaced by the NotI/BsiWI fragment from pUCNDVH5_1c (Fig. 1B). The lengths of the new generated full-length genomes represent a multiple of six (16938 nt for rNDV/AIVH5-A and 17196 nt for rNDV/AIVH5-B).

B Virus Transfection and Spread

Experimentos de transfecção, propagação de vírus e confirmação da recuperação de vírus infeccioso foram realizados como descrito previamente (Rõmer-Oberdõrfer et al., supra; Engel-Herbert et al., supra). A única diferença foi que uma quantidade total de DNA de 20 μg (10 μg de genoma de comprimento total contendo plasmídeo, 6 μg de pCiteNP, 2 μg de pCiteP e 2 μg de pCiteL) foi usada para transfecção.Transfection, virus propagation, and confirmation of infectious virus recovery experiments were performed as described previously (Römer-Oberdörfer et al., supra; Engel-Herbert et al., supra). The only difference was that a total amount of DNA of 20 µg (10 µg of full length genome containing plasmid, 6 µg of pCiteNP, 2 µg of pCiteP and 2 µg of pCiteL) was used for transfection.

B Results

A matriz de leitura aberta de AIV H5 foi inserida entre os genes F e HN do plasmídeo previamente descrito pflNDV (Rõmer-Oberdõrfer et al., supra). Para este fim, a AIV H5 ORF do islolado de AIV A/chicken/Italy/8/98 (H5N2) foi amplificada do plasmídeo pCD-HA5 (Luschow et al., supra) por iniciadores específicos com sítios de restrição MluI que foram usados para inserção da AIV H5 ORF no sítio de restrição MluI singular de pflNDVoligol; (Engel-Herbert et al., supra) resultando em plasmídeo pflNDV/AIVH5-A (Fig. 1 A). Neste construto a AIV H5 ORF foi flanqueada pelas sequências de final de gene (GE) e de início de gene (GS) artificiais na região intergênica entre os genes F e HN de NDV. Para construção de plasmídeo de comprimento total pfNDV/AIVH5-B a HN ORF de plasmídeo pUCNDVIa foi substituída pela H5 ORF amplificada como um fragmento NcoI/AflII- (Fig. 1B). No plasmídeo resultante pUCNDVH5 sítios de restrição SgfI e SnaBI foram criados na região intergênica do gene H5 resultando em plasmídeo pUCNDVH5_1b (Fig. 1 B). Os sítios de restrição criados SgfI e SnaBI foram usados para introduzir o gene HN do plasmídeo pUCNDV1c, no qual o gene HN também estava flanqueado pelos sítios de restrição SgfI e SnaBI (Fig. 1 B). Finalmente, o plasmídeo resultante pUCNDVH5_1c foi usado para substituir o fragmento NotI/BsWI de pflNDV (Fig. 1 B). O pflNDV/AIVH5-B construído difere do plasmídeo pflNDV/AIVH5-A porque as regiões não-codificadoras de NDV HN foram adicionalmente inseridas entre os elementos de controle de transcrição (GS, GE) e a H5 ORF.The AIV H5 open reading frame was inserted between the F and HN genes of the previously described plasmid pflNDV (Römer-Oberdörfer et al., supra). To this end, the AIV H5 ORF of the AIV isolate A/chicken/Italy/8/98 (H5N2) was amplified from plasmid pCD-HA5 (Luschow et al., supra) by specific primers with MluI restriction sites which were used for insertion of the AIV H5 ORF into the unique MluI restriction site of pflNDVoligol; (Engel-Herbert et al., supra) resulting in plasmid pflNDV/AIVH5-A (Fig. 1A). In this construct the AIV H5 ORF was flanked by artificial end-of-gene (GE) and start-of-gene (GS) sequences in the intergenic region between the F and HN genes of NDV. For construction of full-length plasmid pfNDV/AIVH5-B the HN ORF of plasmid pUCNDVIa was replaced by the H5 ORF amplified as an NcoI/AflII- fragment (Fig. 1B). In the resulting plasmid pUCNDVH5 SgfI and SnaBI restriction sites were created in the intergenic region of the H5 gene resulting in plasmid pUCNDVH5_1b (Fig. 1B). The created SgfI and SnaBI restriction sites were used to introduce the HN gene from plasmid pUCNDV1c, in which the HN gene was also flanked by the SgfI and SnaBI restriction sites (Fig. 1B). Finally, the resulting plasmid pUCNDVH5_1c was used to replace the NotI/BsWI fragment of pflNDV (Fig. 1B). The constructed pflNDV/AIVH5-B differs from plasmid pflNDV/AIVH5-A in that the non-coding regions of NDV HN were further inserted between the transcription control elements (GS, GE) and the H5 ORF.

NDV recombinantes rNDV/AIVH5-A e rNDV/AIVH5-B foram recuperados de células BSR-T7/5 transfectadas com o respectivos cDNA de comprimento total e os plasmídeos de suporte como previamente descrito (Rõmer-Oberdõrfer et al., supra; Engel-Herbert et al., supra). Para recuperação de vírus os sobrenadantes de transcrição foram injetados nas cavidades alantóicas de ovos de galinha embrionados de 10 dias de idade e incubados por 5 dias. O fluido alantóico foi colhido e analisado para a presença de vírus pelo teste de hemaglutininação ou de imunofluorescência indireta (IF). Fluidos alantóicos contendo vírus foram usados para uma segunda passagem em ovo para propagação de vírus adicional. A presença do gene H5 inserido nos genomas virais de rNDV/AIVH5-A e rNDV/AIVH5-B foi confirmada por PCR de transcrição reversa e seqüenciamento (dados não mostrados). Figuras 2A e 2B mostram a sequência de nucleotídeos de regiões flanqueando a HN ORF em NDV e da H5 ORF no vetor NDV.Recombinant NDV rNDV/AIVH5-A and rNDV/AIVH5-B were recovered from BSR-T7/5 cells transfected with the respective full-length cDNA and support plasmids as previously described (Römer-Oberdörfer et al., supra; Engel- Herbert et al., supra). For virus recovery, transcription supernatants were injected into the allantoic cavities of 10-day-old embryonated hen's eggs and incubated for 5 days. Allantoic fluid was collected and analyzed for the presence of virus by the hemagglutination or indirect immunofluorescence (IF) test. Allantoic fluids containing virus were used for a second egg passage for further virus propagation. The presence of the H5 gene inserted in the viral genomes of rNDV/AIVH5-A and rNDV/AIVH5-B was confirmed by reverse transcription PCR and sequencing (data not shown). Figures 2A and 2B show the nucleotide sequence of regions flanking the HN ORF in NDV and the H5 ORF in the NDV vector.

Example 2: In vitro characterization of the NDV/AIVH5 vector B RNA analysis

Células CEF foram infectadas com NDV Clone 30, rNDV/AIVH5-A, rNDV/AIVH5-B e AIV A/chicken/Italy/8/98 (H5N2) em uma multiplicidade de infecção (MOI) de 10 por célula e incubadas por 8 h a 37°C. RNA total de células infectadas e não-infectadas foi preparado, separado em géis de agarose desnaturantes e hibridizado com cRNA’s radiomarcados. Os plasmídeos pCD-HA5 e pCD-NDVHN que contêm a matriz de leitura aberta de AIV A/chicken/Italy/8/98 (H5N2) H5 e NDV Clone 30 HN, respectivamente, foram usados para transcrição in vitro de tRNA marcado com 32P (SP6/T7 Transcription kit, Roche).CEF cells were infected with NDV Clone 30, rNDV/AIVH5-A, rNDV/AIVH5-B and AIV A/chicken/Italy/8/98 (H5N2) at a multiplicity of infection (MOI) of 10 per cell and incubated by 8 at 37°C. Total RNA from infected and uninfected cells was prepared, separated on denaturing agarose gels and hybridized with radiolabeled cRNA's. Plasmids pCD-HA5 and pCD-NDVHN containing the AIV A/chicken/Italy/8/98 (H5N2) H5 and NDV Clone 30 HN open reading frame, respectively, were used for in vitro transcription of 32 P-labeled tRNA (SP6/T7 Transcription kit, Roche).

Para verificar a transcrição do gene AIV H5 inserido em rNDV/AIVH5-A e -B análises de Northern blot foram realizadas com RNA total de fibroblastos de embrião de galinha primários infectados com NDV/AIVH5 recombinante. Preparação de RNA de células infectadas com NDV Clone 30 e AIV A/chicken/Italy/8/98 (H5N2) foi usada como controle. Transcrição do gene AIV H5 inserido foi detectada para rNDV/AIVH5-A bem como para NDV/AIVH5-B com tRNA de anti-senso específico para gene (Fig. 3). Pode ser observado que o transcrito AIV-H5B é estendido por cerca de 81 nt e está mais abundantemente presente do que o transcrito AIV H5A. B Análises de Western blotTo verify the transcription of the inserted AIV H5 gene into rNDV/AIVH5-A and -B Northern blot analyzes were performed with total RNA from primary chick embryo fibroblasts infected with recombinant NDV/AIVH5. RNA preparation from cells infected with NDV Clone 30 and AIV A/chicken/Italy/8/98 (H5N2) was used as a control. Transcription of the inserted AIV H5 gene was detected for rNDV/AIVH5-A as well as for NDV/AIVH5-B with gene-specific antisense tRNA (Fig. 3). It can be seen that the AIV-H5B transcript is extended by about 81 nt and is more abundantly present than the AIV H5A transcript. B Western blot analysis

Células CEK foram infectadas com NDV Clone 30, rNDV/AIVH5-A, rNDV/AIVH5-B e AIV A/chicken/Italy/8/98 (H5N2) e incubadas por 20 h a 37°C. Lisados de células infectadas e de células de controle não-infectadas foram separados por SDS-PAGE (ca. 104 células por pista), e transferidos para filtros de nitrocelulose (Trans-Blot® SD cell, BioRad). Blots foram incubados com um anti-soro policlonal de coelho contra NDV, ou um anti-soro policlonal de galinha contra AIV do subtipo H5 em diluições de 1: 200.00 e 1: 2.500, respectivamente. Ligação de anticorpos secundários específicos para espécie conjugados com peroxidase foi detectada por quimioluminescência usando SuperSignal® West Pico Chemiluminescent Substrate (Pierce) sobre filmes de raios-X (Hyperfilm® MP, Amersham).CEK cells were infected with NDV Clone 30, rNDV/AIVH5-A, rNDV/AIVH5-B and AIV A/chicken/Italy/8/98 (H5N2) and incubated for 20 h at 37°C. Lysates from infected cells and uninfected control cells were separated by SDS-PAGE (ca. 104 cells per lane), and transferred to nitrocellulose filters (Trans-Blot® SD cell, BioRad). Blots were incubated with a polyclonal rabbit antiserum against NDV, or a polyclonal chicken antiserum against AIV subtype H5 at 1:200.00 and 1:2500 dilutions, respectively. Binding of peroxidase-conjugated species-specific secondary antibodies was detected by chemiluminescence using SuperSignal® West Pico Chemiluminescent Substrate (Pierce) over X-ray films (Hyperfilm® MP, Amersham).

Nas análises de Western blot a proteína H5 foi detectável apenas em células infectadas com rNDV/AIVH5-B. O anti-soro específico para AIV subtipo H5 detectou duas proteínas proeminentes de aproximadamente 70 e 50 kDa e uma proteína dificilmente visível de ca. 25 kDa, que não foram encontradas em células infectadas com NDV Clone 30 (Fig. 4).In Western blot analysis the H5 protein was detectable only in cells infected with rNDV/AIVH5-B. Antiserum specific for AIV subtype H5 detected two prominent proteins of approximately 70 and 50 kDa and a barely visible protein of ca. 25 kDa, which were not found in cells infected with NDV Clone 30 (Fig. 4).

B Indirect immunofluorescence (IF) tests

Para testes de IF indireta as células CEF foram infectadas em MOI baixo com NDV Clone 30, rNDV/AIVH5-A, rNDV/AlVH5-B e AIV A/chicken/Italy/8/98 (H5N2) por 20 h. Após fixação com metanol e acetona (1:1) as células foram subseqüentemente incubadas quer com um anti-soro policlonal de coelho contra NDV quer com um anti-soro policlonal de galinha contra AIV de subtipo H5 em diluições de 1: 3.000 e 1: 100 respectivamente. Após incubação com fragmento F(ab)2 de anticorpos IgG anti-coelho e IgG anti-galinha conjugado com fluoresceína amostras foram analisadas por microscopia de fluorescência convencional.For indirect IF tests, CEF cells were infected at low MOI with NDV Clone 30, rNDV/AIVH5-A, rNDV/AlVH5-B and AIV A/chicken/Italy/8/98 (H5N2) for 20 h. After fixation with methanol and acetone (1:1) the cells were subsequently incubated with either a rabbit polyclonal antiserum against NDV or a chicken polyclonal antiserum against AIV subtype H5 at 1:3,000 and 1:1 dilutions. 100 respectively. After incubation with F(ab)2 fragment of anti-rabbit IgG antibodies and anti-chicken IgG conjugated with fluorescein, samples were analyzed by conventional fluorescence microscopy.

Expressão de H5 foi examinada por teste de IF indireta das células CEF infectadas. Após incubação com um anti-soro específico para NDV fluorescência pronunciada foi detectável em células infectadas com NDV Clone 30, rNDV/AIVH5-A e rNDV/AIVH5-B, mas não em células infectadas com AIV A/chicken/Italy/8/98 (H5N2) ou em células não- infectadas (Fig. 5, painel direito). Incubação com um anti-soro específico para AIV subtipo H5 mostrou uma fluorescente marcante em células infectadas com AIV. Comparando com dois recombinantes, rNDV/AIVH5-B mostrou uma fluorescência específica para H5 mais intensa do que rNDV/AIVH5-A indicando um nível de expressão mais alto da proteína H5 (Fig. 5, painel esquerdo).H5 expression was examined by indirect IF testing from infected CEF cells. After incubation with an antiserum specific for NDV pronounced fluorescence was detectable in cells infected with NDV Clone 30, rNDV/AIVH5-A and rNDV/AIVH5-B, but not in cells infected with AIV A/chicken/Italy/8/98 (H5N2) or in uninfected cells (Fig. 5, right panel). Incubation with an antiserum specific for AIV subtype H5 showed a marked fluorescent in AIV infected cells. Comparing with two recombinants, rNDV/AIVH5-B showed a more intense H5-specific fluorescence than rNDV/AIVH5-A indicating a higher level of expression of the H5 protein (Fig. 5, left panel).

B Immunoelectron microscopy

As partículas virais foram adsorvidas para formarem grades de cobre revestidas por 7 min. As grades foram lavadas quatro vezes com PBS contendo 0,5% de albumina de soro bovino e subseqüentemente incubadas com um anti-soro específico para AIV subtipo H5 ou específico para NDV por 45 min. Após várias lavagens com PB, as grades foram incubadas por mais 45 min com proteína A - ouro (10 nm, PAG 10, Biocell International) ou coelho anti-galinha - ouro (10 nm, RCHL 10, Biocell International). Após lavagens finais com PB as partículas de vírus foram contrastadas com ácido fosfotúngstico (PTA, pH 7,2) e examinadas com microscópio eletrônico.Viral particles were adsorbed to form coated copper grids for 7 min. The grids were washed four times with PBS containing 0.5% bovine serum albumin and subsequently incubated with an antiserum specific for AIV subtype H5 or specific for NDV for 45 min. After several washes with CP, the grids were incubated for a further 45 min with protein A - gold (10 nm, PAG 10, Biocell International) or rabbit anti-chicken - gold (10 nm, RCHL 10, Biocell International). After final washes with PB the virus particles were counterstained with phosphotungstic acid (PTA, pH 7.2) and examined with an electron microscope.

Quando vírions de NDV Clone 30 ou rNDV/AIVH5-A foram examinados, coloração foi observada apenas com anti-soro específico para NDV. Em contraste, para rNDV/AIVH5-B coloração foi observada usando anti-soros contra NDV e também pelo uso de anti-soros contra AIV, demonstrando que vírions de rNDV/AIVH5-B contêm hemaglutinina H5. Partículas de ouro foram verificadas predominantemente ao longo da superfície de vírions rNDV/AIVHS-B, indicando que a hemaglutinina foi ancorada na membrana viral.When NDV Clone 30 or rNDV/AIVH5-A virions were examined, staining was observed only with NDV-specific antiserum. In contrast, for rNDV/AIVH5-B staining was observed using antisera against NDV and also by using antisera against AIV, demonstrating that rNDV/AIVH5-B virions contain hemagglutinin H5. Gold particles were found predominantly along the surface of rNDV/AIVHS-B virions, indicating that hemagglutinin was anchored in the viral membrane.

Example 3: In vivo characterization of the NDV/AIVH5 vector B Evaluation of protection by recombinant rNDV/AIVH5-A and rNDV/AIVH5-B:

Galinhas de um dia de idade foram aleatoriamente designadas para dois grupos e vacinadas oculonasalmente com 106 EID50 de rNDV/AIVH5-A ou com vacina comercial NDV Clone 30 (Nobilis®, Intervet, NL) via borrifo. Aos 28 dias de idade uma segunda imunização foi administrada na mesma maneira. No dia 12 após a segunda imunização sanue foi coletado para avaliar a presença de anticorpos para NDV e AIVH5 pelo teste HI. Duas semanas após a segunda vacinação os grupos imunizados foram divididos e uma parte de cada grupo foi desafiada oculonasalmente com 108 EID50 de isolado de AIV elevadamente patogênico A/chicken/Italy/8/98 (H5N2). As galinhas restantes foram usadas para avaliar a eficácia protetora das vacinas contra NDV velogênico. Portanto as aves e os animais de controle adicionais receberam 105,3 EID50 de NDV cepa Herts 33/56 intramuscularmente.One-day-old chickens were randomly assigned to two groups and vaccinated oculonasally with either 106 EID50 of rNDV/AIVH5-A or with commercial vaccine NDV Clone 30 (Nobilis®, Intervet, NL) via spray. At 28 days of age a second immunization was administered in the same manner. On day 12 after the second immunization blood was collected to assess the presence of antibodies to NDV and AIVH5 by the HI test. Two weeks after the second vaccination the immunized groups were divided and a part of each group was challenged oculonasally with 108 EID50 of highly pathogenic AIV isolate A/chicken/Italy/8/98 (H5N2). The remaining chickens were used to assess the protective efficacy of vaccines against velogenic NDV. Therefore, additional control birds and animals received 105.3 EID50 of NDV strain Herts 33/56 intramuscularly.

Após imunização e infecção de desafio todas as aves foram observadas diariamente por um período de 10 dias para sinais clínicos e classificadas como saudáveis (0), doentes (1; um dos seguintes sinais: sinais respiratórios, depressão, diarréia, cianose, edema, sinais nervosos), severamente doentes (2; mais do que um dos seguintes sinais: sinais respiratórios, depressão, diarréia, cianose, edema, sinais nervosos), ou mortas (3). Foi calculado um escore clínico que representa o valor médio de todas as galinhas por grupo por este período. Finalmente, três semanas após o desafio amostras de sangue foram tiradas de todos os animais sobreviventes com o objetivo de avaliar títulos de anticorpo contra AIV e NDV.After immunization and challenge infection all birds were observed daily for a period of 10 days for clinical signs and classified as healthy (0), sick (1; one of the following signs: respiratory signs, depression, diarrhea, cyanosis, edema, signs severely ill (2; more than one of the following signs: respiratory signs, depression, diarrhea, cyanosis, edema, nervous signs), or dead (3). A clinical score representing the mean value of all chickens per group for this period was calculated. Finally, three weeks after the challenge, blood samples were taken from all surviving animals in order to assess antibody titers against AIV and NDV.

O NDV recombinante rNDV/AIVH5-B foi testado em um teste animal separado de planejamento experimental quase idêntico. As únicas diferenças foram que imunizações com 106 EID50 quer de vacina rNDV/AIVH5-B quer de vacina NDV Clone 30 foram administradas em ambos os grupos oculonasalmente e não foi realizada infecção de desafio de NDV.Recombinant NDV rNDV/AIVH5-B was tested in a separate animal trial of nearly identical experimental design. The only differences were that immunizations with 106 EID50 of either the rNDV/AIVH5-B vaccine or the NDV Clone 30 vaccine were administered in both groups oculonasally and no NDV challenge infection was performed.

Todos os dados destes experimentos estão sumariados na Tabela 4 e na Figura 8. Soros das galinhas imunizadas foram analisados por teste HI três semanas após a vacinação, mas anticorpos de soro específicos para HA não puderam ser detectados em ambos os casos. Todos os animais de ambos os grupos desenvolveram anticorpos específicos para NDV em níveis altos já após a primeira imunização (títulos-HI médios de 26-27) os animais foram totalmente protegidos contra uma infecção com NDV velogênico, enquanto que todos os animais de controle morreram dentro de 4 dias exibindo sinais típicos de ND. Como esperado, a infecção de desafio de AIV causou doença severa em galinhas imunizadas com NDV Clone 30 com uma taxa de mortalidade de 90 %. Animais do grupo imunizado com rNDV/AIVH5-A sobreviveram com uma dose leta de AIV elevadamente patogênico, mas todas as galinhas exibiram sinais variados de gripe aviária com um escore clínico de 0,64 indicando proteção significativa ainda parcial. Contudo, galinhas imunizadas com rNDV/AIVH5-B foram completamente protegidas contra quaisquer sinais de doença após infecção com um vírus A de gripe aviária elevadamente patogênico. Tabela. 4: Sumário de experimentos animais com rNDV/AIVH5-A e rNDV/AIVH5-B

All data from these experiments are summarized in Table 4 and Figure 8. Sera from the immunized chickens were analyzed by HI testing three weeks after vaccination, but HA-specific serum antibodies could not be detected in both cases. All animals in both groups developed NDV-specific antibodies at high levels already after the first immunization (mean HI-titers 26-27) the animals were fully protected against an infection with velogenic NDV, whereas all control animals died within 4 days exhibiting typical signs of ND. As expected, AIV challenge infection caused severe disease in chickens immunized with NDV Clone 30 with a 90% mortality rate. Animals in the rNDV/AIVH5-A immunized group survived on a lethal dose of highly pathogenic AIV, but all chickens exhibited varying signs of avian influenza with a clinical score of 0.64 indicating significant still partial protection. However, chickens immunized with rNDV/AIVH5-B were completely protected against any signs of disease after infection with a highly pathogenic avian influenza A virus. Table. 4: Summary of animal experiments with rNDV/AIVH5-A and rNDV/AIVH5-B

Example 4: Construction of an NDV/AIV-H5 vector with ncr flanking the NDV F-gene gene.

Usando essencialmente os mesmos métodos e materiais como descritos acima (Engel-Herbert et al, supra), um construto de vetor NDV foi preparado trazendo o gene H5 AIV gene entre os genes F e HN do plasmídeo pfINDV previamente descrito (Rõmer-Oberdõrfer et al., supra), mas agora o inserto H5 foi flanqueado com regiões não-codificadoras do gene NDV F.Using essentially the same methods and materials as described above (Engel-Herbert et al, supra), an NDV vector construct was prepared by bringing the H5 AIV gene between the F and HN genes of the plasmid pfINDV previously described (Römer-Oberdörfer et al. ., supra), but now the H5 insert has been flanked with non-coding regions of the NDV F gene.

Resumidamente as várias etapas e materiais usados foram:Briefly, the various steps and materials used were:

Um plasmídeo pUC com o fragmento NotI-PstI de 1,6 kb de NDVH5 (pUCIRA) foi mutado para criar um sítio de enzima de restrição MluI, usando iniciadores de mutagênese: pMPMLUIGRFHNF (5’- ggt tgt aga tga cca aag gac gcgtta cgg gta gaa cgg taa gag agg -3’; SEQ ID NO: 14) aned pMPMLUIGRFHNR (5’- cct ctc tta ccg ttc tac ccg taa cgc gtc ctt tgg tca tct aca acc -3’; SEQ ID NO: 15) (sítio MluI sublinhado, com sequência GS em negrito), resultando em plasmídeo pUCIRAMLU.A pUC plasmid with the 1.6 kb NotI-PstI fragment of NDVH5 (pUCIRA) was mutated to create an MluI restriction enzyme site, using mutagenesis primers: pMPMLUIGRFHNF (5'-ggt tgt aga tga cca aag gac gcgtta cgg gta gaa cgg taa gag agg -3'; SEQ ID NO: 14) aned pMPMLUIGRFHNR (5'- cct ctc tta ccg ttc tac ccg taa cgc gtc ctt tgg tca tct aca acc -3'; SEQ ID NO: 15) (site MluI underlined, with GS sequence in bold), resulting in plasmid pUCIRAMLU.

Dois oligo’s foram anelados: OFVOF: 5’- agg acg cgt tac ggg tag aag att ctg gat ccc ggt tgg cgc cct cca ggt gca gca cca tgg ag -3’ (SEQ ID NO: 16, sítio MluI sublinhado) e OFVOR: 5’- ctc cat ggt get gca cct gga ggg cgc caa ccg gga tcc aga atc ttc tac ccg taa cac gtc ct -3’ (SEQ ID NO: 17, sítio MluI sublinhado). A seguir estes foram digeridos com MluI e NcoI.Two oligo's were annealed: OFVOF: 5'- agg acg cgt tac ggg tag aag att ctg gat ccc ggt tgg cgc cct cca ggt gca gca cca tgg ag -3' (SEQ ID NO: 16, MluI site underlined) and OFVOR: 5 '- ctc cat ggt get gca cct gga ggg cgc caa ccg gga tcc aga atc ttc tac ccg taa cac gtc ct -3' (SEQ ID NO: 17, MluI site underlined). These were then digested with MluI and NcoI.

Digestão do plasmídeo pUCIRAMLU com MluI e NcoI.Digestion of plasmid pUCIRAMLU with MluI and NcoI.

Ligação de fragmento MluI-NcoI de aproximadamente 4,3 kb de pUCIRAMLU com o oligo-híbrido OFVOF/OFVOR digerido por MluI- NcoI. O plasmídeo resultante foi chamado de pUCIRA2.Ligation of approximately 4.3 kb MluI-NcoI fragment of pUCIRAMLU with the oligohybrid OFVOF/OFVOR digested by MluI-NcoI. The resulting plasmid was called pUCIRA2.

Um plasmídeo pUC (pUCAROK) com o fragmento NotI- BsiWI de NDV com a H5 em vez de a HN orf e pUCIRA2 foi digerido com NcoI e SgfI e o fragmento NotI-NcoI de pUCAROK foi substituído por aquele de pUCIRA2, resultando no plasmídeo pUCAROK2. HF-PCR (Roche) foi realizada para amplificar a ncr do gene NDV F atrás do gene F inserido, usando os iniciadores: PNCRFHIF: 5’- ata ctt aag ttc cct aat agt aat ttg tgt -3’ (SEQ ID NO: 18, sítio AflII sublinhado), e PNCRFHIR: 5,- cac gcg atc gca ttg cca ctg tac att ttt tct taa ctc tct gaa ctg aca gac tac c -3’ (SEQ ID NO: 19, sítio SgfI sublinhado), e plasmídeo pUCAROA (pUC com fragmento NotI-SpeI de NDV). O fragmento de ~ 100 pb resultante foi ligado em vetor pGEMTeasy para dar o plasmídeo pGEMFncrhi.A plasmid pUC (pUCAROK) with the NotI-BsiWI fragment of NDV with the H5 instead of the HN orf and pUCIRA2 was digested with NcoI and SgfI and the NotI-NcoI fragment of pUCAROK was replaced with that of pUCIRA2, resulting in the plasmid pUCAROK2 . HF-PCR (Roche) was performed to amplify the ncr from the NDV F gene behind the inserted F gene, using the primers: PNCRFHIF: 5'- ata ctt aag ttc cct aat agt aat ttg tgt -3' (SEQ ID NO: 18 , AflII site underlined), and PNCRFHIR: 5,- cac gcg atc gca ttg cca ctg tac att ttt tct taa ctc tct gaa ctg aca gac tac c -3' (SEQ ID NO: 19, SgfI site underlined), and pUCAROA plasmid (pUC with NotI-SpeI NDV fragment). The resulting ~100 bp fragment was ligated into pGEMTeasy vector to give plasmid pGEMFncrhi.

Plasmídeos pUCAROK2 e pGEMFncrhi foram digeridos com AflII e SgfI para substituir a HN ncr atrás de H5 de plasmídeo pUCAROK2 por aquela de pGEMFncrhi. O plasmídeo resultante foi chamado de pUCAROK4.Plasmids pUCAROK2 and pGEMFncrhi were digested with AflII and SgfI to replace the HN ncr behind H5 of plasmid pUCAROK2 with that of pGEMFncrhi. The resulting plasmid was called pUCAROK4.

Na última etapa o fragmento NotI-SgfI do plasmídeo NDVH5 foi substituído por aquele de pUCAROK4 resultando no plasmídeo novo de comprimento total E18C, compreendendo o gene AIV H5 inserido no vetor NDV entre F e HN, e flanqueado pelas ncr’s de gene F.In the last step the NotI-SgfI fragment of plasmid NDVH5 was replaced by that of pUCAROK4 resulting in the new full-length plasmid E18C, comprising the AIV H5 gene inserted in the NDV vector between F and HN, and flanked by the F gene ncr's.

Com os experimentos de transfecção de construtos novos, propagação de vírus rec e confirmação da recuperação de vírus infeccioso foram realizadas como descrito acima. A seguir o vírus foi caracterizado bioquimicamente e biologicamente.With the new construct transfection experiments, rec virus propagation and confirmation of infectious virus recovery were performed as described above. The virus was then characterized biochemically and biologically.

Example 5: Generation of other NDV vector constructs and rec viruses:

Usando técnicas similares vários outros insertos foram preparados no vetor NDV, utilizando genes inseridos diferentes, e sítios de inserção diferentes.Using similar techniques several other inserts were prepared in the NDV vector, using different inserted genes, and different insertion sites.

Com os detalhes já aqui proporcionados todos estão dentro da pesquisa fácil das capacidades da pessoa experiente, portanto é suficiente apresentar estes na forma de tabela: Tabela 5: Outros construtos de vetor NDV de acordo com a invenção:

With the details already provided here all are within easy search of the skills of the experienced person, so it is sufficient to present these in table form: Table 5: Other NDV vector constructs according to the invention:

Example 6: Generation of a recombinant rabies virus vector expressing an EIAV envelope gene

Para demonstrar que os efeitos vantajosos da invenção (o uso de regiões não-codificadoras de gene MV para aumentar a expressão e/ou apresentação de genes exógenos nos vírions rec MV) se expandem para além da família Paramyxoviridae, vírus da raiva - um membro da família Rhabdoviridae - foi usado como um vetor para expressar uma proteína de envelope derivada de um vírus não relacionado, vírus da anemia infecciosa eqüina (EIAV).To demonstrate that the beneficial effects of the invention (the use of non-coding regions of the MV gene to increase expression and/or presentation of exogenous genes in rec MV virions) extend beyond the family Paramyxoviridae, rabies virus - a member of Rhabdoviridae family - was used as a vector to express an envelope protein derived from an unrelated virus, equine infectious anemia virus (EIAV).

Neste exemplo a construção é descrita de um vírus da raiva rec compreendendo a proteína de envelope de EIAV, inserido entre os genes G e L de raiva, onde o gene env é flanqueado pelas ncr’s do gene de proteína-G da raiva.In this example the construction is described of a rabies rec virus comprising the EIAV envelope protein, inserted between the rabies G and L genes, where the env gene is flanked by the rabies G-protein gene ncr’s.

Subclones de vírus da raiva foram preparados em fagomídeo pBluescript® SK+ usando o clone de comprimento total SAD-D29 (Mebatsion, 2001, J. Virol., vol. 75, p. 11496-11502), que é aqui referido como ORA-D. Para preparar um vetor de clonagem, um vetor pSK foi primeiro digerido com SacI, cegado com enzima Klenow, seguido por digestão com HindIII e purificação em gel do fragmento de ~3 kb. O inserto foi preparado por digestão de ORA-D com StuI e HindIII, purificando o fragmento de 1,3 kb resultante, e ligando no vetor pSK preparado para gerar o plasmídeo pNCR-b.Rabies virus subclones were prepared in pBluescript® SK+ phagemid using the full-length clone SAD-D29 (Mebatsion, 2001, J. Virol., vol. 75, p. 11496-11502), which is referred to herein as ORA-D . To prepare a cloning vector, a pSK vector was first digested with SacI, blinded with Klenow enzyme, followed by digestion with HindIII and gel purification of the ~3 kb fragment. The insert was prepared by digesting ORA-D with StuI and HindIII, purifying the resulting 1.3 kb fragment, and ligating into the prepared pSK vector to generate plasmid pNCR-b.

O plasmídeo pNCR-b foi digerido com BstXI e HindIII e o 5 fragmento de ~4,0 kb foi purificado e usado para ligação com os oligo’s BSSNH+ e BSSNH- (veja Tabela 6) para criar o plasmídeo pSSNsc contendo um cassete de transcrição mínimo e ligação com oligos RABGNCRI-4 (Tabela 6) para gerar o construto GNCR-b, contendo regiões não- codificadoras em adição à unidade de transcrição mínima (Figura 7).Plasmid pNCR-b was digested with BstXI and HindIII and the ~4.0 kb fragment was purified and used for ligation with oligos BSSNH+ and BSSNH- (see Table 6) to create plasmid pSSNsc containing a minimal transcription cassette and ligation with RABGNCRI-4 oligos (Table 6) to generate the GNCR-b construct, containing non-coding regions in addition to the minimal transcription unit (Figure 7).

O gene env de EIAV cepa Wyoming foi obtido por amplificação de um gene sintético de 2052 nt que havia sido códon- otimizado, sítios de editoração de RNA removidos (Cook, et al. 2005, Vet. Micro., vol. 108, p. 23-37), e trincado por 134 aminoácidos na região codificadora 3’ do gene original. Tabela 6: Sequências de oligo usadas durante a construção de vírus da raiva rec

3 nt mudados de ORAD original: GGAAAG GGACTGG, para: GGATAC GTACTGGThe Wyoming strain EIAV env gene was obtained by amplification of a 2052 nt synthetic gene that had been codon-optimized, RNA editing sites removed (Cook, et al. 2005, Vet. Micro., vol. 108, p. 23-37), and cracked by 134 amino acids in the 3' coding region of the original gene. Table 6: Oligo sequences used during construction of rec rabies virus

3 nt changed from original ORAD: GGAAAG GGACTGG, to: GGATAC GTACTGG

O gene env amplificado foi cinasado e inserido em subclones como segue: um amplicon de ~2,0 kb, engenhado para representar a proteína de envelope de EIAV truncada inteira, foi gerado usando o conjunto de iniciadores EIAsynCDF + EIAsynCDstopR (veja Tabela 6). O amplicon foi inserido no subclone GNCR-b que havia sido digerido com SnaBI e desfosforilado para gerar o plasmídeo recombinante pGNCR-b:envG. O fragmento de ~2,0 kb também foi inserido no subclone SSNsc que havia sido pré-digerido com NheI, extremidade cegada e desfosforilado para gerar o plasmídeo recombinante pSSNsc:env.The amplified env gene was kinased and inserted into subclones as follows: A ~2.0 kb amplicon, engineered to represent the full-length truncated EIAV envelope protein, was generated using the EIAsynCDF + EIAsynCDstopR primer set (see Table 6). The amplicon was inserted into the GNCR-b subclone that had been digested with SnaBI and dephosphorylated to generate the recombinant plasmid pGNCR-b:envG. The ~2.0 kb fragment was also inserted into the SSNsc subclone which had been pre-digested with NheI, blunt-ended and dephosphorylated to generate the recombinant plasmid pSSNsc:env.

Cada construto recombinante foi digerido com SphI e HindIII e ligado no subclone SSNsc, que foi pré-digerido por SphI/HindIII e desfosforilado com CTAP. Após retorno para o subcclone SSNsc, os insertos modificados foram retornados para o suporte principal ORAD por digestão com SphI e MluI para gerar os vírus da raiva recombinantes RV-env e RV- envG (Figura 8). As extremidades 5’ e 3’ dos construtos foram verificadas por análise de sequência usando a Big-Dye® Terminator Cycle Sequencing chemistry (Applied Biosystems) e analisados usando um Applied Biosystems 3100-Avant Capillary Electrophoresis Sequencer.Each recombinant construct was digested with SphI and HindIII and ligated into the SSNsc subclone, which was pre-digested by SphI/HindIII and dephosphorylated with CTAP. After returning to the SSNsc subcclone, the modified inserts were returned to the ORAD mainframe by digestion with SphI and MluI to generate recombinant rabies viruses RV-env and RV-envG (Figure 8). The 5' and 3' ends of the constructs were verified by sequence analysis using the Big-Dye® Terminator Cycle Sequencing chemistry (Applied Biosystems) and analyzed using an Applied Biosystems 3100-Avant Capillary Electrophoresis Sequencer.

A construção de um clone de cDNA de comprimento total baseado na cepa ORAD de raiva SAD modificada e geração de um vírus da raiva recombinante têm sido descritas (Schnell et al., 1994, EMBO J., vol. 13, p. 4195-4203; Mebatsion, 2001, supra). Cada vírus da raiva recombinante foi transferido para células BSR como previamente descrito (Schnell, et aL, 1994, supra) usando Mirus Trans-IT-LT1. Três dias após a transfecção, células e sobrenadante foram colhidos e passados. Passagens subseqüentes foram apenas por sobrenadante, usando um moi estimado de 0,5. Cada vírus recombinante foi passado um mínimo de cinco vezes para verificar estabilidade.Construction of a full-length cDNA clone based on the modified SAD rabies ORAD strain and generation of a recombinant rabies virus has been described (Schnell et al., 1994, EMBO J., vol. 13, p. 4195-4203 ; Mebatsion, 2001, supra). Each recombinant rabies virus was transferred into BSR cells as previously described (Schnell, et al, 1994, supra) using Mirus Trans-IT-LT1. Three days after transfection, cells and supernatant were harvested and passaged. Subsequent passes were per supernatant only, using an estimated moi of 0.5. Each recombinant virus was passaged a minimum of five times to verify stability.

Células BSR infectadas com raiva recombinante foram fixadas ~40 horas após a infecção. Estas foram analisadas por imunofluorescência indireta usando FITC Anti-Rabies Monoclonal Globulin (FDI Diagnostics Inc.) ou empregando soros policlonais de cavalo anti-EIAV. Em diluições seriais de 10 vezes, a razão de células infectadas produtoras de vírus da raiva também foi comparada com as células infectadas expressando EIAV env para monitorar a estabilidade de vírus e a expressão de antígeno recombinante.Recombinant rabies infected BSR cells were fixed ~40 hours post infection. These were analyzed by indirect immunofluorescence using FITC Anti-Rabies Monoclonal Globulin (FDI Diagnostics Inc.) or using anti-EIAV polyclonal horse sera. At 10-fold serial dilutions, the ratio of infected rabies virus producing cells was also compared to infected cells expressing EIAV env to monitor virus stability and recombinant antigen expression.

Vírus da raiva recombinantes de cinco passagens foram inoculados em frascos T-75 com células BSR frescas em um moi de 0,01. 24 Horas após infecção, o meio foi mudado para livre de soro. Sobrenadante foi coletado e clarificado por centrifugação (10.000 x g) a 72 horas após infecção. Sobrenadantes virais foram purificados por gradientes de sacarose para anlisar vírions purificados.Five-pass recombinant rabies viruses were inoculated into T-75 flasks with fresh BSR cells at a moi of 0.01. 24 hours after infection, the medium was changed to serum free. Supernatant was collected and clarified by centrifugation (10,000 x g) at 72 hours post infection. Viral supernatants were purified by sucrose gradients to analyze purified virions.

Vírions purificados e proteína celular infectada total foram combinadas com tampão de amostra redutor 2x Laemmli e posicionados em água fervente por 5-10 minutos. Amostras foram carregadas para um gel de acrilamida 10% Tris-HCl (Bio-Rad) em Tampão de Corrida 1x SDS-PAGE. Géis SOS-PAGE foram corridos a 20 mA até que a frente de corante ficasse perto do ou no fundo do gel. As proteínas separadas foram transferidas para cima de membrana Immobilon-P (PVDF) (IPVH10100, Immobilon) por blotting a 225 mA por 45 minutos. Blots foram incubados em tampão de bloqueio (PBS-Tween 20 + 1% de leito desnatado em pó) por uma hora na temperatura ambiente e então lavados 3 vezes por 5 minutos em PBS-Tween 20. Expressão de raiva foi detectada usando soros policlonais de coelho anti- raiva direcionados contra glicoproteína e nucleoproteína de raiva diluídas 1:20.000 e 1:2.000, respectivamente, em tampão de bloqueio.Purified virions and total infected cell protein were combined with 2x Laemmli reducing sample buffer and placed in boiling water for 5-10 minutes. Samples were loaded onto a 10% Tris-HCl acrylamide gel (Bio-Rad) in 1x SDS-PAGE Running Buffer. SOS-PAGE gels were run at 20 mA until the dye front was close to or at the bottom of the gel. Separated proteins were transferred onto Immobilon-P (PVDF) membrane (IPVH10100, Immobilon) by blotting at 225 mA for 45 minutes. Blots were incubated in blocking buffer (PBS-Tween 20 + 1% skim bed powder) for one hour at room temperature and then washed 3 times for 5 minutes in PBS-Tween 20. Rabies expression was detected using polyclonal sera from rabbit anti-rabies directed against rabies glycoprotein and nucleoprotein diluted 1:20,000 and 1:2,000, respectively, in blocking buffer.

Simultaneamente, expressão de EIAV env foi detectada usando soros policlonais de cavalo anti-EIAV diluídos 1:500 em tampão de bloqueio. Blots foram incubados por uma hora na temperatura ambiente e então lavados 3 vezes por 5 minutos em PBS-Tween 20. Blots foram postos em IgG (H+L) de cabra anti-coelho conjugada com HRP (KPL) e IgG (H+L) de cabra anti-cavalo conjugada com HRP (Bethyl Labs), cada uma diluída 1:2.000 em tampão de bloqueio e incubados por uma hora na temperatura ambiente. Blots foram então lavados 3 x 5 minutos em PBS-Tween 20. Blots foram incubados em substrato de peroxidase de membrana TMB (KPL) até desenvolvimento se completar, aproximadamente 1-3 minutos. Blots foram postos em água destilada para interromper a reação.Simultaneously, EIAV env expression was detected using anti-EIAV polyclonal horse sera diluted 1:500 in blocking buffer. Blots were incubated for one hour at room temperature and then washed 3 times for 5 minutes in PBS-Tween 20. Blots were placed in HRP-conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L) and IgG (H+L) ) of HRP-conjugated goat anti-horse (Bethyl Labs), each diluted 1:2,000 in blocking buffer and incubated for one hour at room temperature. Blots were then washed 3 x 5 minutes in PBS-Tween 20. Blots were incubated in TMB membrane peroxidase substrate (KPL) until development was complete, approximately 1-3 minutes. Blots were placed in distilled water to stop the reaction.

Um resultado típico de um tal experimento de Western blot é mostrado em Figura 9, e demonstra a composição de proteína de vírus da raiva recombinante expressando proteína de envelope de EIAV. Pista 1: Escada de PM de faixa ampla (Bio-Rad); Pista 2: Vírus suporte principal ORAD; Pista 3: RV-env, compreendendo o gene EIAV-env, inserido entre os genes G e L de raiva, sem ncr’s flanqueadoras; Pista 4: RV-envG, compreendendo o gene EIAV-env, flanqueado pelas regiões ncr da proteína G do vírus da raiva.A typical result of such a Western blot experiment is shown in Figure 9, and demonstrates the composition of recombinant rabies virus protein expressing EIAV envelope protein. Lane 1: Wide Range PM Ladder (Bio-Rad); Lane 2: Main support ORAD virus; Lane 3: RV-env, comprising the EIAV-env gene, inserted between the rabies G and L genes, without flanking nuclei; Lane 4: RV-envG, comprising the EIAV-env gene, flanked by rabies virus G protein ncr regions.

Ambos os vírus da raiva recombinantes deram título de infecção comparáveis e estavelmente expressaram inserto de gene EIAV-env após passagens múltiplas in vitro.Both recombinant rabies viruses gave comparable infection titer and stably expressed EIAV-env gene insert after multiple passages in vitro.

Contudo, apesar da sujeição de quantidades comparáveis de vírions a Western blot, RV-env recombinante, construído no modo costumeiro (portanto sem ncr’s flanqueadoras) exibiu apenas uma banda muito fraca correspondendo à proteína EIAV-env; enquanto que o vírus recombinante RV-envG, que tinha as regiões não-codificadoras de proteína-G flanqueando a proteína EIAV-env inserida, foi expressado em uma taxa muito mais alta: Figura 9, comparar a banda para proteína env em pistas 3 - 4.However, despite subjecting comparable amounts of virions to Western blot, recombinant RV-env, constructed in the customary fashion (thus no flanking ncr’s) exhibited only a very weak band corresponding to the EIAV-env protein; whereas the RV-envG recombinant virus, which had the non-G-protein coding regions flanking the inserted EIAV-env protein, was expressed at a much higher rate: Figure 9, compare band for env protein in lanes 3 - 4.

Como os construtos e insertos de RV-envG e RV-env são sob outros aspectos idênticos, isto é uma prova forte de que as regiões não- codificadoras possuem um efeito positivo na promoção do nível alto de apresentação imune e produção de proteína estranha.As the RV-envG and RV-env constructs and inserts are otherwise identical, this is strong evidence that non-coding regions have a positive effect in promoting high level immune presentation and foreign protein production.

Claims

1. Recombinant Mononegavirales virus vector hosting an additional transcription unit comprising an exogenous gene operably linked with an upstream Mononegavirales virus gene start (GS) sequence and a downstream Mononegavirales virus gene (GE) ending sequence, characterized by the fact that between the GS sequence and an exogenous gene start codon and between an exogenous gene stop codon and the GE sequence, a 3' non-coding region (NCR) and a 5' non-coding region (sense of genome) of a Mononegavirales virus gene are located, respectively, in which the vector of Mononegavirales virus is a Newcastle disease virus, and in which the 3'-5' NCR has a nucleotide sequence as shown in SEQ ID NO : 1 and 2 or 3 and 4.

2. Recombinant Mononegavirales virus vector according to claim 1, characterized by the fact that the exogenous gene encodes an antigen of a pathogen.

3. Recombinant Mononegavirales virus vector according to claim 1, characterized by the fact that the exogenous gene encodes an immune modulator.

4. Recombinant Mononegavirales virus vector according to any one of claims 1 to 3, characterized in that the additional transcription unit is located in a 3' proximal position or between genes P and M, M and F, F and NH or NH and L.

5. Recombinant Mononegavirales virus vector according to claim 4, characterized by the fact that the additional transcription unit is located between the F and HN genes.

6. Recombinant Mononegavirales virus vector according to any one of claims 1 to 5, characterized by the fact that the exogenous gene encodes an antigen of an avian pathogen.

7. Recombinant Mononegavirales virus vector according to any one of claims 1 to 6, characterized by the fact that the exogenous gene encodes a hemagglutinin (HA) of an influenza virus, preferably an H5 or H7 hemagglutinin.

8. Recombinant Mononegavirales virus vector according to any one of claims 1 to 7, characterized by the fact that the Mononegaviales virus vector is an attenuated virus.

9. Vaccine against a microbial pathogen, characterized in that it comprises a recombinant Mononegavirales virus vector as defined in claims 1 to 8 in a live or inactivated form, and a pharmaceutically acceptable diluent or carrier.

10. Vaccine according to claim 9, characterized in that it additionally comprises an adjuvant.