BRPI0621476A2 - método assistido por computador de gerar um composto que iniba a atividade de glutamina sintetase, método de gerar um composto de teste, método de triagem de um composto inibidor de protease, método in vitro para inibir crescimento de uma bactéria e uso de um inibidor de serina protease - Google Patents

Abstract

MéTODO ASSISTIDO POR COMPUTADOR DE GERAR UM COMPOSTO QUE INIBA A ATIVIDADE DE GLUTAMINA SINTETASE, MéTODO DE GERAR UM COMPOSTO DE TESTE, MéTODO DE TRIAGEM DE UM COMPOSTO INIBIDOR DE PROTEASE, MéTODO IN VITRO PARA INIBIR CRESCIMENTO DE UMA BACTéRIA E USO DE UM INIBIDOR DE SERINA PROTEASE. Métodos de triar e modelar compostos como inibidores de glutamina sintetase são fornecidos aqui. Compostos, por exemplo, inibidores de serina protease, e composições compreendendo os mesmos, que são úteis para o tratamento, prevenção, e/ou melhora de infecções bacterianas, incluindo Mycobactenum tuberculosis, são também fornecidos.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MÉTODO ASSISTIDO POR COMPUTADOR DE GERAR UM COMPOSTO QUE INIBA A ATIVIDADE DE GLUTAMINA SlNTETASE, MÉTODO DE GERAR UM COMPOSTO DE TESTE, MÉTODO DE TRIAGEM DE UM COMPOSTO INI- BIDOR DE PROTEASE, MÉTODO IN VITRO PARA INIBIR CRESCIMENTO DE UMA BACTÉRIA E USO DE UM INIBIDOR DE SERINA PROTEASE". CAMPO TÉCNICO

Esta invenção refere-se a materiais e métodos para inibir atividade de glutamina sintetase, e mais particularmente a materiais e métodos para inibir a segunda reação catalisada de glutamina sintetase, a formação de glutamina, a- través de um mecanismo postulado que envolve o ataque nucleofílico de amônia em um intermediário de acila de enzima de γ-glutamila, e a materiais e métodos para projetar e usar tais inibidores.

ANTECEDENTES

A enzima glutamina sintetase (GS, EC 6.3.1.2) é uma enzima central envolvida no metabolismo de nitrogênio e catalisa a conversão reversível de L- glutamato, ATP e amônia em L-glutamina, ADP, e fosfato inorgânico. A reação é mediada por meio de um intermediário de fosfato de γ-glutamila. A enzima requer pelo menos dois íons de metal divalente (Me2+) por subunidade; os sítios de Ii- gação dos íons de metal divalente são referidos como n1 e n2 aqui. GS catalisa a biossíntese de glutamina a partir de glutamato como segue:

Me2+

Glutamato + NH4+ + ATP Glutamina + ADP + Pi + H2O onde Me2+ representa um cátion de metal divalente selecionado de magnésio ou manganês. Esta reação é freqüentemente referida como a reação 'biossintética' ou 'direta', e é considerada a reação mais fisiologicamente relevante que a glu- tamina sintetase catalisa.

Formação do fosfato de γ-glutamila ocorre pela transferência do γ-fosfato de ATP para o grupo de γ-carboxilato de glutamato. Transferência de fosforila eficiente entre estes dois grupos negativamente carregados é coor- denada pelo metal de n2. O mecanismo correntemente aceito pressupõe-se que é seguido através de deslocamento de fosfato através de amônia para dar fosfato inorgânico e glutamina:

ATP + Glutamato —► ADP + γ-glutamato-P ADP + γ-G Iutamato-P + NH4 -» ADP + Glutamina + Pi. Estruturalmente, a enzima de GS de Escherichia colié uma metalo- enzima grande (-600.000 Mr) com 12 subunídades idênticas dispostas em dois anéis hexagonais de face-a-face, com dois sítios ativos formados entre dois mo- nômeros, para um total de doze sítios ativos. Cada sítio ativo pode ser descrito como um "bifunil" em que ATP e glutamato ligam-se nas extremidades opostas. O sítio de ligação de ATP é referido como o topo do bifunil, porque se abre para superfície externa de seis vezes da molécula de glutamina sintetase. Os dois sítios de ligação de cátion divalentes, n1 e n2, são encontrados na junta do bifunil. O íon de n2 está envolvido na transferência de fosforila, enquanto o íon de n1 estabiliza glutamina sintetase em sua forma ativa e representa um papel na liga- ção de glutamato. A afinidade para íons de metal no sítio n1 é 50 vezes maior que no sítio n2, causada pela carga negativa maior em direção à metade do fun- do do bifunil na redondeza de n1. O íon de metal de n1 tem três cadeias laterais de resíduo de glutamato -131, 212 e 220 - como ligantes, enquanto o íon de me- tal de n2 tem dois ligantes de resíduo de glutamato, 129 e 357, como também histidina 269 (Abell, L M, J Schineller, P J Keck e J Villafranca (1995) Biochmes- try 34:16695-16702). Os aminoácidos que servem como ligantes de íon de metal são altamente conservados em glutamina sintetases de várias fontes (Pesole G, M P Bozzetti, C Lanave, G Preparata e C Saccone (1991) Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 88: 522-526). (A menos que especificamen- te do contrário indicado, todos os números de resíduo de aminoácido de GS i- dentificados aqui se referem aos resíduos de GS de E. coli. Dada a homologia entre as seqüências bacterianas de polipeptídeo de GS, alguém tendo habilidade na técnica poderia determinar os resíduos correspondentes de interesse de GS em outras espécies usando métodos tais como alinhamentos de homologia ou modelagem molecular).

Alterações conformacionais e movimentos de cadeia lateral foram descritos para cristais de glutamina sintetase intumescidos em soluções com vá- rios ligantes (Liaw S-H, J J Villafranca e D Eisenberg (1993b) Biochemistry 33:7999-8003; Liaw S-H e DEisenberg (1994) Biochemistry 33: 675-681; Liaw S- H, G Jun e D Eisenberg (1994) Biochemistry 33: 11184-11188). Estes resíduos são absolutamente conservados entre glutamina sintetase em organismos meno- res e maiores, e parece representar papéis fundamentais no mecanismo da rea- ção biossintética (Eisenberg D, H S Gill, GMU Pfluegl e S H Rotstem (2000) Biochemica et Biophysica Acta 1477:122-145).

A estrutura do dodecâmero de glutamina sintetase, como descrita por Eisenberg (2000), é acreditada conter várias alças de importância funcional (Eisenberg D, H S Gill, GMU Rluegl e S H Rotstein (2000) Biochemica et Bio- physica Acta 1477: 122-145). Estas alças, com números de resíduo que corres- pondem aos resíduos de E. coli, são como segue:

Uma alça que consiste nos resíduos hidrófilos 156-173, que se pro- traem no canal central do dodecâmero e é um sítio para proteólise e ribosilação de ADP.

Uma segunda alça, conhecida como a alça de adenililação, contém tirosina 397, que é covalentemente modificada pela adição de AMP. Esta alça fica bem externa à entrada do fundo para o bifunil.

A ponta de glutamato 327, consistindo em resíduos 323 a 330, que guarda a entrada de glutamato para o sítio ativo. Esta 'ponta' fecha o sítio ativo, protegendo o intermediário de fosfato de γ-glutamila de hidrólise. Quando a ponta está fechada, o carboxilato de glutamato 327 faz parte do sítio de amônio. Aspar- tato 50' desprotona o íon de amônio, formando amônia. Amônia depois ataca o intermediário de fosfato de γ-glutamila assim formando um intermediário tetraé- drico no estado de transição. A ponta de glutamato 327 aceita um próton do gru- po δ-amino do intermediário tetraédrico, rendendo glutamina.

Uma alça que contém aspartato 50' está localizada no domínio N- terminal (resíduos 1-100). Cada sítio ativo é formado na interface entre o domínio C-terminal de uma subunidade e o domínio N-terminal de uma subunidade adja- cente dentro de um anel dodecamérico, resultando na maioria do sítio ativo sen- do formado por resíduos do domínio C-terminal. Aspartato 50' está na porção N- terminal do sítio ativo, e é acreditado ligar o substrato de amônio e depois aceitar um próton de amônio, resultando na formação de amônia que pode depois ata- car o intermediário de glutamila fosforilada. A posição do aspartato 50' é contro- lada pela ligação de nucleotídeo. Tanto ADP como ATP entram no sítio ativo do topo do bifunil, com a cadeia de fosfato do topo do bifunil. ADP induz interação de arginina 359 com aspartato 50' e estimula a interação de arginina 344 com aspartato 64', provendo contatos adicionais para estabilização de inter- subunidade dentro de um anel. O movimento do aspartato 50' ajuda na formação do sítio de ligação de amônio, e o movimento da arginina 339 possivelmente aju- da a transferência de fosforila e ligação de fosfato. É crido que ligação de ADP também aumente a afinidade por glutamato induzindo o movimento da arginina 359 para um dos oxigênios de γ-carboxilato do glutamato. Por fim, o β-fosfato de ADP desloca o glutamato 129 para o íon de n2, histidina 269 e histidina 271.

Estudos em que o ligando de íon de metal, histidina 269, foi substitu- ído por outros resíduos de aminoácido, a saber aspartato, asparagina, glutamato e glutamina, através de mutagênese dirigida, foram realizados. Todas as enzi- mas mutantes mostraram pequena alteração conformacional, e ainda foram ca- pazes de ligar dois íons de metal. A substituição de histidina 269 com ligantes neutros tais como asparagina e glutamina alterou ligeiramente as constantes de dissociação (3 - 4 vezes), enquanto a substituição com glutamato diminuiu ligei- ramente a constante de dissociação. As mutações tiveram pouco efeito nas Km' do substrato exceto no caso de H269E, cuja km exibiu um aumento de 1000 ve- zes que do tipo selvagem (Abell, L M, J Schineller, P J Keck e J Villafranca (1995) Biochemistry 34:16695 -16702).

Asparagina 264 é encontrada em uma alça flexível {resíduos 255- 266) próxima da entrada de glutamato na extremidade inferior do bifunil e está adjacente à ponta de glutamato 327. Quando glutamato se liga, a cadeia lateral oscila para fora em direção ao grupo ε-amino da lisina 176, e foi descoberto tam- bém ser verdade quando alanina, glicina e glutamina se complexam com gluta- mina sintetase.

Como resultado da elucidação destas alças descritas acima, é pos- sível descrever o mecanismo de reação enzimática de glutamina sintetase como uma série de movimentos de alça e cadeia lateral. No mecanismo de reação proposto, ATP liga ao topo do bifunil, de forma que seu grupo fosfato terminal liga adjacente ao íon de n2. Esta ligação de ATP resulta no movimento da alça de aspartato 50' para o sítio ao qual um íon de amônio subseqüentemente irá se ligar. Arginina 359 depois se move para o sítio ao qual o grupo γ-carboxilato do glutamato subseqüentemente irá se ligar. Ambos estes movimentos aumentam a afinidade para ligação de glutamato e amônio. Seguindo isso, glutamato entra do fundo do bifunil e liga-se acima da ponta de glutamato 327, com seu grupo γ- carboxilato ligando adjacente ao íon de n1. O grupo amino do glutamato desloca a alça de asparagina 264, ajudando a serina 52' na alça de aspartato 50', para estabilizar a ponta. O sítio ativo é agora fechado e está protegido contra água, e ligação de amônio está completa. O γ-fosfato da ATP é transferido para o γ- carboxilato do glutamato, assim formando o intermediário. Os dois íons de metal carregados positivos e arginina 359 participam na transferência de fosforila pola- rizando o grupo γ-fosfato da ATP que torna γ-fosforoso mais positivo. Um íon de amônio entra no bifunil e liga na bolsa negativamente carregada criada pelo glu- tamato 327, aspartato 50', tirosina 19, glutamato 212 e sérina 53'. A cadeia lateral do aspartato 50' desprotona o íon de amônio, formando amônia, que depois ata- ca o carbono do intermediário de fosfato de γ-glutamila, que resulta na liberação de um grupo fosfato. Uma ponte de sal é agora formada entre o aduto tetraédrico e o glutamato 327, que depois aceita um próton do aduto, assim neutralizando a ponte de sal e formando glutamina. Por fim, a ponta de glutamato 327 abre-se e glutamina é liberada.

Três formas distintas de glutamina sintetase ocorrem: GSI, GSII, e GSIII. A forma de GSI é encontrada apenas em bactérias (eubacteria) e archaea (archaebacteria). GSII ocorre em eucariotas e certas bactérias do solo, enquanto genes de GSIII foram apenas encontrados em algumas espécies bacterianas. Há duas subdivisões de GSI significativas: GSI-α e GSI-β. Os genes de GSI-a são encontrados em bactérias termofílicas, bactérias gram-positivas G+C baixas, e Euryarchaeota (incluindo metanógenos, halífilos e alguns termófilos), enquanto os genes de GSI-β são encontrados em todas as outras bactérias. A enzima de GSI-β é regulada por meio de uma cascata de adenililação/desadenililação, e também contém uma seqüência de inserção de 25 aminoácidos que não ocorre na forma de GSI-α. Bactérias que têm um gene de GSI-β incluem Corynebacteri- um diphtheriae, Neisseria gonorrhoeae, Escherichia coli, Salmonella typhinurium, Salmonella typhi, Klebsiella pneumoniae, Serratia marcescens, Proteus vulgaris, Shigella dysenteriae, Vibrio cholerae, Pseudomonas aeruginosa, Alcaligenes fa- eealis, Helieobacter pylori, Haemophilus influenzae, Bordetella pertussis, Bordella bronehiseptia, Neisseria meningitides, Brueella melitensis, Mycobaeterium tuber- eulosis, Mycobaeterium leprae, Treponema pallidum, Leptospira interrogans, Aeetinomyees israelii, Noeardia esteroides, Thiobacillus ferrooxidans, Azospiril- Ium brazilensis, Anabaena sp., Fremyella diplosiphon, e Streptormyees coelicolor. Exemplos de organismos na subdivisão de GSI-α incluem Baeillus cereus, Bacil- Ius subtilis, Baeillus anthracis, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyoge- nes, Staphylococcus aereus, Clostridium botulinum, Clostridium tetani e Clostridi- um perfringens.

Em E. coli e outras bactérias que têm o gene de GSI-β, a atividade de GS é regulada através de adenililação de entre 1 e 12 subunidades de GS. O sítio de adenililação (equivalente a Tyr397 em E. coli) parece ser altamente con- servado ao longo de todas as bactérias procarióticas, enquanto a extensão de adenililação é uma função da disponibilidade de nitrogênio e fonte de energia de carbono nos meios de cultura. Glutamina sintetase com 10 a 12 subunidades adenililadas ocorre em células crescidas na presença de um excesso de nitrogê- nio e limitação de carbono. A adenililação de GS também altera a especificidade da enzima para íon de metal divalente de Mg2+ para Mn2+.

O desenvolvimento e uso terapêutico dos inibidores de serina prote- ase ocorreram em doenças incluindo vírus da hepatite C (HCV) e doenças rela- cionadas aos distúrbios da cascata de coagulação sangüínea, tais como infarta- ção do miocárdio, acidente vascular cerebral e trombose de veia profunda. Inibi- dores de trombina, Fator Xa e o complexo de fator Vllla foram desenvolvidos para o uso como anticoagulantes oralmente biodisponíveis em distúrbios trom- boembólicos e na prevenção de trombose venosa e arterial. Estas enzimas têm sítios ativos estruturalmente similares, visto que todas elas pertencem à família de tripsina das serina proteases.

Várias classes de inibidores foram especificamente projetadas para alvejar estas enzimas de serina protease. Incluídos nestas estão os derivados de aldeído de peptidil-arginina (Bajusz, S., et al (1997) WO 97/46576), derivados de pirrolopirrrolideno (Cooke, S.H. et al (1998), WO 99/12935), quinolinonas (Dudley, D. A. e J. J. Edmunds (1999), WO 99/50263) e Pastor R. M., Artis, D. R. e A. G. Olivera (2002), WO 02/22575). Inibidores duais para trombina e Fator Xa incluem compostos que contêm metades de 1-benzimidazol de metil usando 4-(1-metil- bènzimidazol-z-il)-metilamino-benzoamidina como o andaime básico (Nar, H., et al. (2001) Structure1 9: 29-37).

SUMÁRIO

Esta descrição é com base, em parte, na descoberta que glutamina sintetase emprega um das duas tríades catalíticas semelhantes à serina protea- se, dependendo de seu estado de adenililação, para catalisar a reação de amô- nia com o fosfato de γ-glutamila formado na primeira etapa enzimática. Como aqui usado, o sítio ativo em GS onde glutamina é formada é referido aqui como o sítio de formação de glutamina. Embora não estando preso a qualquer teoria, os inventores acreditam que um mecanismo pelo qual os estados adenililados ou desadenililados da enzima afetam a especificidade enzimática para MgATP/NH4+ ou Mn2ATP/NH3 esteja induzindo um comutador entre as duas tríades catalíticas putativas. Dependendo do estado de adenililação da enzima, um das duas tría- des é envolvida em um ataque nucleofílico por uma serina ativada no intermediá- rio de anidrido de ácido carboxílico-fosfórico da primeira reação, o fosfato de γ- glutamila, para formar um intermediário de enzima de acila. O intermediário de acila de glutamila depois sofre ataque nucleofílico por NH3, liberando a glutamina da superfície da enzima.

A presença de duas tríades catalíticas é consistente com o fato que a glutamina sintetase de E coli tem duas constantes de afinidade para amônia (Meek TDeJJ Villafranca (1980) Biochemistry 19: 5513-5519). A química de solução do NH4VNH3 também afeta a regulação de GS, com a enzima adenilila- da sendo produzida sob condições de excesso de nitrogênio e limitação de car- bono, e a enzima desadenililada sob condições de limitação de nitrogênio e ex- cesso de carbono. Em baixas concentrações de sal de amônio, o NH4+ dissocia- se de NH3 + H+. O NH3 é um nucleófilo forte e capaz de realizar o ataque nucleo- fílico no intermediário da enzima de γ-glutamil acila proposto. Além disso, experi- mentos de mutagênese dirigida e inibição da atividade de GS pelos inibidores de serina protease conhecidos AEBSF e PMSF, como mostrados abaixo, também demonstraram que a etapa final da reação de glutamina sintetase pode ser me- diada pela presença das duas tríades catalíticas semelhantes à serina protease.

Conhecimento dos mecanismos químicos e de reação da tríade ca- talítica de serina protease pode desse modo ser acoplado com o conhecimento da estrutura de GS, incluindo a estrutura do sítio ativo de formação de GS gluta- mina, no projeto de inibidores específico para glutamina sintetase adenililada e/ou desadenililada. Conseqüentemente, métodos assistidos por computador são fornecidos aqui para projetar compostos de inibidor de teste, como também mé- todos para triagem in vitroe in v/Vo da atividade inibidora dos compostos de teste. Compostos assim projetados ou triados podem ser usados para inibir atividade de GS adenililada ou desadenililada e por conseguinte tratar, impedir, ou melho- rar infecções bacterianas em mamíferos. Como as enzimas de GSI-β bacterianas são reguladas por meio de uma cascata de adenililação/desadenililação, mas as enzimas de GSII mamíferas não são, os compostos que têm um efeito inibidor em GS adenililada, mas não tendo nenhum efeito inibidor ou apenas um mínimo em GS desadenililada, podem também ser usados seletivamente para inibir crescimento de célula bacteriana de GSI-β enquanto minimamente impactando de forma negativa as células mamíferas. Compostos e composições para inibir atividade de GS, incluindo atividade de GS adenililada e desadenililada; para ini- bir ou impedir crescimento bacteriano in vitro e in vivo; e para tratar, impedir, ou melhorar infecções bacterianas em mamíferos são também fornecidos aqui.

Conseqüentemente, em uma modalidade, um método assistido por computador de gerar um inibidor de teste da atividade do sítio ativo de formação de glutamina de um polipeptídeo de glutamina sintetase é fornecido. O método usa um computador programado compreendendo um processador e um disposi- tivo de entrada, e inclui:

{a) introduzir no dispositivo de entrada dados compreendendo uma estrutura de um sítio ativo de formação de glutamina;

(b) ancorar no sítio ativo de formação de glutamina uma molécula de inibidor de teste usando o processador; e (c) determinar, com base na ancoragem, se a molécula de inibidor de teste inibiria a atividade do sítio ativo de formação de glutamina. O método pode também compreender ancorar no sítio ativo uma metade de fosfato de y- glutamila, e/ou produzir um inibidor de teste determinado pela etapa (c) para inibir a atividade do sítio ativo de formação de glutamina e avaliar a atividade inibidora do inibidor de teste em um polipeptídeo de glutamina sintetase in vitro. Avaliação in vitro compreende o uso de um ensaio capaz de medir hidrólise de ATP, forma- ção de ADP, formação de AMP1 utilização de glutamato, ou formação de gluta- mina. Em algumas modalidades, o método pode também incluir avaliar a ativida- de inibidora diferencial do inibidor de teste em um polipeptídeo de glutamina sin- tetase adenililada com relação a um polipeptídeo de glutamina sintetase desade- nililada in vitro, e/ou produzir o inibidor de teste e avaliar a atividade inibidora do inibidor de teste no crescimento de uma bactéria compreendendo um gene de glutamina sintetase GSI-α ou GSI-β. Uma bactéria de GSI-β pode ser seleciona- da do grupo que consiste em Corynebacterium diphtheriae, Neisseria gonorrhoe- ae, Escherichia coii, Salmonella typhinurium, Salmonella typhi, Klebsiella pneu- moniae, Serratia marcescens, Proteus vulgaris, Shigella dysenteriae, Vibrio cho- lerae, Pseudomonas aeruginosa, Alcaligenes faecalis, Helicobacter pylori, Hae- mophilus influenzae, Bordetella pertussis, Bordella bronchiseptia, Neisseria me- ningitides, Brueella melitensis, Myeobaeterium tubereulosis, Myeobaeterium Ie- prae, Treponema pallidum, Leptospira interrogans, Aeetinomyees israelii, Noear- dia esteroides, Thiobacillus ferrooxidans, Azospirillum brazilensis, Anabaena sp., Fremyella diplosiphon, e Streptormyees eoelieolor, e uma bactéria de GSI-α pode ser selecionada do ^rupo que consiste em Bacillus cereus, Bacillus subtilis, Bacil- lus anthracis, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes, Staphylo- coccus aereus, Clostridium botulinum, Clostridium tetani e Clostridium perfringens.

Em algumas modalidades, o método pode incluir avaliar a atividade inibidora do inibidor de teste no crescimento de uma célula eucariótica, tal como uma célula mamífera (por exemplo, humana).

Em outro aspecto, fornecido aqui é um método de gerar um com- posto que inibe a atividade do sítio ativo de formação de glutamina de um poli- peptídeo de glutamina sintetase, o método compreendendo: (a) fornecer uma estrutura tridimensional de um sítio ativo de forma- ção de glutamina de um polipeptídeo de glutamina sintetase; e

(b) projetar, com base na estrutura tridimensional, um composto de teste capaz de inibir a interação entre o sítio ativo de formação de glutamina e um intermediário de fosfato de γ-glutamila. Em algumas modalidades, o compos- to de teste é capaz de inibir a interação entre um sítio da tríade cataiítica adenili- lada do sítio ativo de formação de glutamina e um intermediário de fosfato de γ- glutamila, ou de inibir a interação entre um sítio da tríade catalítica desadenililada do sítio ativo de formação de glutamina e um intermediário de fosfato de γ- glutamila. Em algumas modalidades, o composto de teste é capaz de inibir a formação de um intermediário de enzima de acila no sítio da tríade catalítica a- denililada do sítio ativo de formação de glutamina, ou de inibir a formação do in- termediário de enzima de acila no sítio da tríade catalítica desadenililada do sítio ativo de formação de glutamina. O método pode também incluir produzir o com- posto de teste da etapa (b) e avaliar a atividade inibidora do composto de teste em um polipeptídeo de glutamina sintetase in vitro, e/ou avaliar a atividade inibi- dora do composto de teste no crescimento de uma bactéria que compreende um gene de glutamina sintetase de GSI-α ou GSI-β. Em alguns casos, o método po- de incluir avaliar a atividade inibidora do composto de teste no crescimento de uma célula eucariótica, tal como uma célula mamífera (por exemplo, humana).

Em outro aspecto, fornecido aqui é um método de gerar um com- posto de teste que inibe uma atividade de sítio da tríade catalítica de um sítio ati- vo de formação de glutamina de um polipeptídeo de glutamina sintetase. O mé- todo pode incluir (a) fornecer uma estrutura tridimensional que compreende um sítio da tríade catalítica de um sítio ativo de formação de glutamina; e (b) projetar, com base na estrutura tridimensional, um composto de teste capaz de formar um intermediário de enzima de acila com um resíduo do sítio da tríade catalítica. Em algumas modalidades, o composto de teste é capaz de formar um intermediário de enzima de acila com um resíduo na estrutura que corresponde a Ser52 ou Ser53 do polipeptídeo de glutamina sintetase de E. coli. Em outra modalidade, um método de triar um composto de inibidor de teste de protease in vitro para determinar se ou não inibe a atividade do sítio ativo de formação de glutamina de um polipeptídeo de glutamina sintetase é fornecido, onde o método inclui:

(a) contatar um polipeptídeo de glutamina sintetase com um com- posto de inibidor de teste de protease; e

(b) determinar se ou não a atividade do sítio ativo de formação de glutamina do polipeptídeo de glutamina sintetase está reduzida com relação à atividade de um polipeptídeo de glutamina sintetase que não foi contatado com o composto de inibidor de teste de serina protease. A atividade do sítio de forma- ção de glutamina pode ser medida usando um ensaio capaz de medir hidrólise de ATP, formação de ADP1 formação de AMP1 utilização de glutamato, ou forma- ção de glutamina. O composto de inibidor de teste de protease pode ser um composto de inibidor de teste de serina protease. Em algumas modalidades, uma biblioteca de inibidores de protease de teste (por exemplo, uma biblioteca de inibidores de teste de serina protease) são contatados, individualmente, com o polipeptídeo de glutamina sintetase.

Em outra modalidade, um método in vitro para inibir a atividade do sítio ativo de formação de glutamina de um polipeptídeo de GS é fornecido, onde o método inclui contatar um polipeptídeo de GS com uma composição que com- preende um inibidor de serina protease. O inibidor de serina protease pode ser um derivado de aldeído de peptidil-arginina, um derivado de pirrolopirrrolideno, um derivado de quinolinona, ou um derivado de 1 -benzimidazol de metila.

Um método in vitro para inibir crescimento de uma bactéria compre- endendo um gene de GSI-α ou GSI-β é também fornecido, onde o método inclui contatar a bactéria com uma composição que compreende um inibidor de serina protease. Em ainda outra modalidade, é fornecido um método para tratar, impedir, ou melhorar um ou mais sintomas ou distúrbios associados a uma infecção bac- teriana em um mamífero, onde a infecção bacteriana é de uma bactéria compre- endendo um gene de GSI-α ou GSI-β. O método pode incluir administrar ao mamífero uma composição compreendendo um inibidor de serina protease.

Além disso, um método in vivo para inibir a atividade do sítio de for- mação de glutamina de um polipeptídeo de glutamina sintetase é também forne- cido, onde o método inclui administrar uma composição compreendendo um ini- bidor de serina protease a um mamífero que é suspeito de sofrer ou estar so- frendo de uma infecção bacteriana onde a infecção bacteriana é de uma bactéria compreendendo um gene de GSI-α ou GSI-β.

A menos que do contrário definido, todos técnicos e científicos aqui usados têm o mesmo significado que comumente entendido por algüém de habi- lidade usual na técnica ao qual esta invenção refere-se. No caso de conflito, o documento presente, incluindo definições, regerá. Os métodos e materiais prefe- ridos são descritos abaixo, embora métodos e materiais similares ou equivalen- tes àqueles descritos aqui possam também ser usados na prática ou teste da invenção presente. Todas as publicações, pedidos de patente, patentes e outras referências mencionadas aqui são incorporadas por referência em sua totalidade. Os materiais, métodos, e exemplos revelados aqui são ilustrativos apenas e não intencionados serem limitativos.

Outras características e vantagens da invenção, por exemplo, ativi- dade inibidora de GS adenililada e desse modo métodos para tratamento de in- fecções bacterianas, serão evidentes da descrição a seguir, dos desenhos e das reivindicações.

DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

Figura 1 mostra um mecanismo de reação postulado de glutamina sintetase adenililada no sítio ativo de formação de glutamina em concentrações altas de amônia, requerendo a desprotonação do NH4+. O mecanismo inicia em cima à esquerda com um complexo de Michaelis não-covalente. Subseqüente- mente, a formação do primeiro estado de transição tetraédrico ocorre, seguido pela formação do intermediário da enzima de acila, liberação de fosfato, e des- protonação em amônio por Asp50' ou pelo intermediário de acila. Ataque nucleo- fílico do intermediário de acila por amônia e a formação do segundo estado de transição tetraédrico depois ocorre, seguido por liberação da glutamina e volta ao complexo de Michaelis não-covalente.

Figura 2 mostra um mecanismo de reação postulado de glutamina sintetase desadenililada no sítio ativo de formação de glutamina em concentra- ções baixas de amônia. O mecanismo inicia em cima à esquerda com um com- plexo de Michaelis não-covalente. Subseqüentemente, a formação do primeiro estado de transição tetraédrico ocorre, seguido por formação do intermediário de enzima de acila e a liberação de fosfato. Ataque nucleofílico do íon de carbônio por amônia e a formação do segundo estado de transição tetraédrica depois o- corre, seguido por liberação da glutamina e volta ao complexo de Michaelis não- covalente.

DESCRIÇÃO DETALHADA

DEFINIÇÕES

Os termos "polipeptídeo de GS" e "polipeptídeo de glutamina sinte- tase" são usados alternadamente aqui, e a menos que do contrário indicado, re- ferem-se a um polipeptídeo de GSI bacteriano, por exemplo, de uma bactéria de GSI-α ou GSI-β. A menos que do contrário indicado, o termo abrange o polipep- tídeo de comprimento total e fragmentos dos mesmos. Além disso, como será reconhecido por aqueles tendo habilidade na técnica, funções de GS como um dodecâmero in vivo e sítios ativos de GS podem ser compostos de aminoácidos de mais de um monômero. Conseqüentemente, o termo também abrange multí- meros (por exemplo, dímeros, trímeros, tetrâmeros, pentâmeros, hexâmeros, heptâmeros, octâmeros, nonâmeros, decâmeros, undecâmeros, e dodecâmeros) de GS de comprimento total, multímeros de fragmentos de GS, um ou mais resí- duos fazendo parte de um ou mais dos sítios ativos de GS (por exemplo, uma coletânea de resíduos que podem não ser contíguos na seqüência primária de GS e/ou que são de monômeros distintos, mas que compõem pelo menos uma parte de um sítio ativo de GS), e multímeros de tais coletâneas.

"Polipeptídeo" e "proteína" são usados alternadamente e significam qualquer cadeia de aminoácidos ligada a peptídeo, independente de modificação de comprimento ou pós-translacional.

O termo "isolado" pode referir-se a um polipeptídeo que ou não tem nenhuma contraparte de ocorrência natural ou foi separado ou purificado dos componentes que podem acompanhá-lo naturalmente, por exemplo, em tecidos tais como pâncreas, fígado, baço, ovário, testículos, músculo, tecido da junta, tecido neural, tecido gastrointestinal ou tecido tumoral (por exemplo, tecido de câncer de mama ou câncer de cólon); ou fluidos do corpo tais como sangue, soro, ou urina, ou de cultura bacteriana ou fúngica. Tipicamente, um polipeptídeo é considerado "isolado" quando é pelo menos 70%, em peso seco, livre das prote- ínas e outras moléculas orgânicas de ocorrência natural com as quais se asso- ciou naturalmente.

Preferivelmente, uma preparação de um polipeptídeo é pelo menos 80%, mais preferivelmente pelo menos 90%, e o mais preferivelmente pelo me- nos 99%, em peso seco, do polipeptídeo. Uma vez que um polipeptídeo que é sintetizado quimicamente é, por sua natureza, separado dos componentes que naturalmente o acompanham, é um polipeptídeo sintético "isolado".

Um polipeptídeo isolado pode ser obtido, por exemplo, por extração de uma fonte natural (por exemplo, de tecidos); por expressão de um ácido nu- cléico recombinante que codifica o polipeptídeo; ou através de síntese química. Um polipeptídeo que é produzido em um sistema celular diferente da fonte da qual naturalmente origina é "isolado", porque ele necessariamente estará livre de componentes que naturalmente o acompanham. O grau de isolamento ou pureza pode ser medido por qualquer método apropriado, por exemplo, cromatografia de coluna, eletroforese em gel de poliacrilamida, ou análise de HPLC.

Antes de testar, qualquer polipeptídeo pode sofrer modificação, por exemplo, adenililação, fosforilação ou glicosilação, por métodos conhecidos na técnica e como descritos aqui.

Como aqui usado, "derivados farmaceuticamente aceitáveis" de um composto incluem sais, ésteres, éteres de enol, ésteres de enol, acetais, cetais, ortoésteres, hemiacetais, hemicetais, ácidos, bases, solvatos, hidratos ou pró- medicamentos dos mesmos. Tais derivados podem ser facilmente preparados por aqueles de habilidade nesta técnica usando métodos conhecidos para tal derivatização. Os compostos produzidos podem ser administrados a animais ou humanos sem efeitos tóxicos substanciais e ou são farmaceuticamente ativos ou são pró-medicamentos.

Sais farmaceuticamente aceitáveis incluem, mas não são limitados a, sais de amina, tais como mas não limitados a Ν,Ν'-dibenziletilenodiamina, cloro- procaína, colina, amônia, dietanolamina e outras hidroxialquilaminas, etilenodia- mina, N-metilglucamina, procaína, N-benzilfenetilamina, 1-para-clorobenzil-2- pirrolidin-1'-ilmetil-benzimidazol, dietilamina e outras alquilaminas, piperazina e tris(hidroximetil)aminometano; sais de metal alcalino, tais como mas não limita- dos a lítio, potássio e sódio; sais de metal alcalino-terroso, tais como mas não limitados a bário, cálcio e magnésio; sais de metal de transição, tais como mas não limitados a zinco; e outros sais de metal, tais como mas não limitados a fos- fato de hidrogênio de sódio e fosfato de dissódio; e também incluindo, mas não limitado, nitrato, borato, metanossulfonatos, benzenossulfonatos, toluenossulfo- natos, sais de ácidos minerais, tais como mas não limitados a cloridratos, bromi- dratos, iodratos e sulfatos; e sais de ácidos orgânicos, tais como mas não limita- dos a acetatos, trifluoroacetatos, maleatos, oxalatos, lactatos, malatos, tartaratos, citratos, benzoatos, salicilatos, ascorbatos, succinatos, butiratos, valeratos e fu- maratos. Esteres farmaceuticamente aceitáveis incluem, mas não são limitados a, ésteres de alquila, alquenila, alquinila, arila, heteroarila, aralquila, heteroaralquila, cicloalquila e heterociclila de grupos acídicos, incluindo, mas não limitados a, áci- dos carboxílicos, ácidos fosfóricos, ácidos fosfínicos, ácidos sulfônicos, ácidos sulfínicos e ácidos borônicos. Éteres de enol farmaceuticamente aceitáveis inclu- em, mas não são limitados a, derivados da fórmula C=C(OR) onde R é hidrogê- nio, alquila, alquenila, alquinila, arila, heteroarila, aralquila, heteroaralquila, ciclo- alquila ou heterociclila. Ésteres de enol farmaceuticamente aceitáveis incluem, mas não são limitados a, derivados da fórmula C=C(OC(O)R) onde R é hidrogê- nio, alquila, alquenila, alquinila, arila, heteroarila, aralquila, heteroaralquila, ciclo- alquila ou heterociclila. Solvatos e hidratos farmaceuticamente aceitáveis são complexos de um composto com uma ou mais moléculas de solvente ou de água, ou 1 a cerca de 100, ou 1 a cerca de 10, ou uma a cerca de 2, 3 ou 4, moléculas de solvente ou de água.

Como aqui usado, tratamento significa qualquer maneira em que um ou mais dos sintomas de uma infecção bacteriana, por exemplo, infecção de tu- berculose de micobactéria, são melhorados ou do contrário vantajosamente alte- rados. Tratamento também abrange qualquer uso farmacêutico das composições aqui, tais como usos para tratar doenças, distúrbios, ou doenças em que uma infecção bacteriana está implicada.

Como aqui usado, melhora dos sintomas de um distúrbio particular por administração de um composto particular ou composição farmacêutica refe- re-se a qualquer diminuição, permanente ou temporária, duradoura ou transiente que pode ser atribuída ou associada à administração da composição.

Como aqui usado, IC5O refere-se a uma quantidade, concentração ou dosagem de um composto de teste particular que alcança uma inibição de 50% de uma resposta máxima em um ensaio que mede tal resposta.

Como aqui usado, o termo Ki representa a constante de dissociação de um complexo de enzima/inibidor. É teoricamente independente do substrato contra o qual o inibidor é testado. Ki pode ser calculada de um IC5o usando a e- quação: Ki = IC50*Km/(S+Km), onde S é a concentração de substrato, e Km é a concentração de substrato (na ausência de inibidor) na qual a velocidade da rea- ção é meia-máxima. A K, de um inibidor para inibição de um substrato particular (Km fixa) é constante. Como aqui usado, EC5O refere-se a uma concentração de fármaco que produz 50% de inibição, e CC5o refere-se a uma concentração de fármaco que produz 50% de toxicidade.

Como aqui usado, um pró-medicamento é um composto que, sob administração in vivo, é metabolizado por uma ou mais etapas ou processos ou do contrário convertido na forma biológica, farmacêutica ou terapeuticamente ativa do composto. Para produzir um pró-medicamento, o composto farmaceuti- camente ativo é modificado de modo que o composto ativo será regenerado a- través de processos metabólicos. O pró-medicamento pode ser projetado para alterar a estabilidade metabólica ou as características de transporte de um fár- maco, para mascarar os efeitos colaterais ou toxicidade, para melhorar o sabor de um fármaco ou alterar outras características ou propriedades de um fármaco. Em virtude do conhecimento dos processos farmacodinâmicos e metabolismo de fármaco in vivo, aqueles de habilidade nesta técnica, uma vez que um composto farmaceuticamente ativo é conhecido, pode projetar pró-medicamentos do com- posto (vide, por exemplo, Nogrady (1985) Medicinal Chemistry A Biochemical Approach, Oxford University Press, Nova Iorque, páginas 388-392).

Como aqui usado, "substancialmente puro" com respeito a um com- posto significa suficientemente homogêneo para parecer livre de impurezas fa- cilmente detectáveis quando determinado por métodos padrão de análise, tal como cromatografia de camada fina (TLC), eletroforese em gel, cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC) e/ou espectrometria de massa (MS), usadas por aqueles de habilidade na técnica para avaliar tal pureza, ou suficientemente puro de modo que purificação também não detectavelmente alteraria as proprie- dades físicas e químicas, tais como atividades enzimáticas e biológicas, da subs- tância. Métodos para purificação dos compostos para produzir compostos de modo substancial quimicamente puros são conhecidos àqueles de habilidade na técnica. Um composto de modo substancial quimicamente puro pode, porém, ser uma mistura de estereoisômeros. Em tais circunstâncias, purificação também poderia aumentar a atividade específica do composto.

Como aqui usado, as abreviações para quaisquer grupos protetores, aminoácidos e outros compostos, estão, a menos que do contrário indicado, de acordo com sua prática geral, abreviações reconhecidas, ou a Comissão em Nomenclatura de Bioquímica IUPAC-IUB (vide, (1972) Biochem. 11:942-944). MÉTODOS DE PROJETAR INIBIDORES PARA O SÍTIO ATIVO DE GS

Fornecidos aqui são métodos, incluindo métodos com base em computador, para projetar compostos que ligam e/ou inibem o sítio ativo de for- mação de glutamina de GS, particularmente um polipeptídeo de GS de uma bac- téria de GSI. Como descrito também aqui, o sítio ativo de formação de glutamina de GS é proposto catalisar um ataque nucleofílico através de amônia em um in- termediário de enzima de acila de γ-glutamila para formar glutamina. Um tal sítio ativo de formação de glutamina pode incluir uma ou mais tríades catalíticas se- melhantes à serina, tais como as tríades catalíticas adenililadas e/ou desadenili- Iadas de GS descritas aqui. Os inventores postularam que glutamina sintetase emprega uma de duas tríades catalíticas semelhantes à serina protease, depen- dendo do estado de adenililação, para catalisar a reação de amônia com o fosfa- to de ^glutamila formado na primeira etapa enzimática de GS. Dependendo do estado de adenililação da enzima, uma das duas tríades é envolvida em um ata- que nucleofílico por uma serina ativada no intermediário de anidridro de ácido carboxílico-fosfórico da primeira reação, o fosfato de γ-glutamila, para formar um intermediário de enzima de acila. O intermediário de acila de glutamila depois sofre ataque nucleofílico por NH3, liberando a glutamina da superfície da enzima.

Conseqüentemente, analisando uma ou ambas das tríades catalíti- cas, alguém de habilidade na técnica saberia usar modelagem molecular padrão ou outras técnicas para identificar os peptídeos, peptidomiméticos, e moléculas pequenas que ligariam e/ou inibiriam o sítio ativo de formação de glutamina de GS, tal como inibindo a ligação e/ou a atividade de uma ou ambos das tríades catalíticas neles contidas, para inibir a atividade de ataque nucleofílico. Por e- xemplo, uma molécula pequena poderia interagir diretamente com certos amino- ácidos no sítio (por exemplo, os aminoácidos da tríade catalítica) para inibir o mecanismo de reação postulado, ou poderia interagir em um sítio alostérico, isto é, uma região da molécula não diretamente envolvida na atividade catalítica, mas à qual ligação de um composto resulta (por exemplo, pela indução em uma alte- ração conformacional na molécula) na inibição da atividade.

Por "modelagem molecular" é significado análise quantitativa e/ou qualitativa da estrutura e função de interações físicas com base em modelos de informação e de interação estrutural tridimensional. Estes incluem modelos de minimização de energia e dinâmicos com base numérica convencionais, modelos gráficos de computador interativos, modelos de mecânicas moleculares modifi- cadas, geometria de distância e outros modelos de restrição baseados em estru- tura.

Modelagem molecular tipicamente é executada usando um compu- tador e pode ser também otimizada usando métodos conhecidos.

Métodos de projetar compostos que especificamente ligam (por e- xemplo, com afinidade alta) ao sítio ativo de formação de glutamina, incluindo uma ou ambas das tríades catalíticas, são tipicamente também com base em computador, e envolvem o uso de um computador tendo um programa capaz de gerar um modelo atômico. Programas de computação que usam dados de crista- lografia de raio X são particularmente úteis para projetar tais compostos. Progra- mas tais como RasMoI, por exemplo, podem ser usados para gerar um modelo tridimensional, por exemplo, de GS desadenililada ou adenililada, um fragmento de GS desadenililada ou adenililada, ou uma coletânea de resíduos que com- põem todo ou parte do sítio ativo de formação de glutamina de GS desadenililada ou adenililada, tal como resíduos que compõem um sítio ativo da tríade catalítica de GS desadenililada ou adenililada. Programas de computação tais como INSI- GHT (Accelrys, Burlington, MA), Auto-Dock (Accelrys), e Discovery Studio 1.5 (AcceIrys) permitem manipulação adicional e a habilidade para introduzir estrutu- ras novas.

Os compostos podem ser projetados usando, por exemplo, hardwa- re ou software, ou uma combinação de ambos. Porém, projeto é preferivelmente implementado em um ou mais programas de computação que executam em um ou mais computadores programáveis, cada um contendo um processador e pelo menos um dispositivo de entrada. 0(s) computador(es) preferivelmente também contém(êm) um sistema de armazenamento de dados (incluindo memória volátil e não-volátil e/ou elementos de armazenamento) e pelo menos um dispositivo de saída. Código de programa é aplicado para introduzir dados para executar as funções descritas acima e gerar informação de saída. A informação de saída é aplicada a um ou mais dispositivos de saída em uma maneira conhecida. O computador pode ser, por exemplo, um computador pessoal, microcomputador, ou posto de trabalho de modelo convencional.

Cada programa é preferivelmente implementado em um nível alto processual ou linguagem de programação orientada para objeto para comunicar- se com um sistema de computador. Porém, os programas podem ser implemen- tados em conjunto ou linguagem de máquina, se desejado. Em qualquer caso, a linguagem pode ser uma linguagem compilada ou interpretada.

Cada programa de computação é preferivelmente armazenado em um meio ou dispositivo de armazenamento (por exemplo, ROM ou disquete magnético) legível por um computador programável de propósito geral ou espe- cial. O programa de computação serve para configurar e operar o computador para executar os procedimentos descritos aqui quando o programa for lido pelo computador. O método da invenção pode também ser implementado por meio de um meio de armazenamento legível por computador, configurado com um pro- grama de computação onde o meio de armazenamento assim configurado leva um computador a operar em uma maneira específica e predefinida para executar as funções descritas aqui.

Por exemplo, as etapas requerente de computador em um método de projetar um composto de teste podem envolver:

(a) introduzir em um dispositivo de entrada, por exemplo, através de um teclado, um disquete, ou uma fita, dados (por exemplo, coordenadas atômi- cas) que definem a estrutura tridimensional (3-D) de uma primeira molécula ou complexo (por exemplo, GS adenililada, GS desadenililada; uma porção GS de GS desadenililada ou adenililada (por exemplo, uma coletânea de resíduos que compõem parte ou todo do sítio ativo de formação de glutamina, tais como resí- duos que compõem uma ou ambas as tríades catalíticas) qualquer um destes poderia incluir uma ou mais moléculas de ATP, ADP, glutamina, ou de glutamato ligadas) que liga a uma segunda molécula ou complexo (por exemplo, ATP, ADP, glutamina, glutamato, fosfato de γ-glutamila); e

(b) determinar, usando um processador, a estrutura 3-D (por exem- plo, um modelo atômico) do sítio na primeira molécula ou complexo envolvido ligando à segunda molécula ou complexo.

Deveria ser observado que embora a estrutura 3-D de GS original seja tirada de uma espécie, alguém de habilidade na técnica poderia, através de métodos padrão, por exemplo, alinhamentos de homologia ou modelagem mole- cular, estabelecer os resíduos correspondentes de interesse de GS em outras espécies. Da informação obtida desse modo, alguém versado na técnica poderá projetar e fazer compostos inibidores (por exemplo, peptídeos, moléculas peque- nas de não-peptídeo, peptidomiméticos, e aptâmeros (por exemplo, aptâmeros de ácido nucléico)) com a estrutura 3-D apropriada. Por exemplo, alguém de ha- bilidade na técnica poderia projetar compostos inibidores que poderiam interagir com certos resíduos da primeira molécula ou complexo. Desse modo, após a etapa (b), poderia-se projetar, com base na estrutura tridimensional, um compos- to de teste capaz de inibir a interação, por exemplo, entre o sítio ativo de forma- ção de glutamina e um intermediário de fosfato de γ-glutamila, tal como um com- posto de teste capaz de inibir a interação entre um sítio da tríade catalítica adeni- lilada do sítio ativo de formação de glutamina e um intermediário de fosfato de γ- glutamila, ou de inibir a interação entre um sítio da tríade catalítica desadenililada do sítio ativo de formação de glutamina e um intermediário de fosfato de γ- glutamila. Em algumas modalidades, um composto de teste pode ser projetado que é capaz de inibir a formação de um intermediário da enzima de acila no sítio da tríade catalítica adenililada do sítio ativo de formação de glutamina, ou de ini- bir a formação do intermediário da enzima de acila no sítio da tríade catalítica desadenililada do sítio ativo de formação de glutamina. Além disso, se dados 3-D utilizáveis por computador (por exemplo, dados cristalográficos de raio X) para um composto candidato estiverem disponíveis, uma ou mais das etapas com base computador a seguir podem ser executadas juntamente com as etapas com base em computador (a) e (b) descritas acima:

(c) introduzir em um dispositivo de entrada, por exemplo, através de um teclado, um disquete, ou uma fita, dados (por exemplo coordenadas atômicas) que definem a estrutura tridimensional (3-D) de um composto candidato;

(d) determinar, usando um processador, a estrutura 3-D (por exem- plo, um modelo atômico) do composto candidato;

(e) determinar, usando o processador, se o composto candidato liga ao sítio na primeira molécula ou complexo; e

(f) identificar o composto candidato como um composto que inibe a interação entre as primeira e segunda moléculas ou complexos.

O método pode envolver uma etapa adicional de produzir em um dispositivo de saída um modelo da estrutura 3-D do composto. Além disso, os dados 3-D dos compostos candidatos podem ser comparados a uma base de dados de computador, por exemplo, estruturas 3-D armazenadas em um sistema de armazenamento de dados.

Em algumas modalidades, um método assistido por computador de gerar um inibidor de teste do sítio ativo de formação de glutamina (por exemplo, atividade da tríade catalítica) de um polipeptídeo de glutamina sintetase, pode incluir:

(a) introduzir no dispositivo de entrada os dados compreendendo uma estrutura ou subestrutura (por exemplo, uma tríade catalítica) do sítio ativo de formação de glutamina de GS;

(b) ancorar na estrutura uma molécula de inibidor de teste usando o processador; e

(c) determinar, com base na ancoragem, se a molécula de inibidor de teste inibiria atividade do sítio ativo de formação de glutamina (por exemplo, tríade catalítica). Compostos da invenção também podem ser interativamente proje- tados da informação estrutural dos compostos descritos aqui usando outras téc- nicas de projeto/modelagem com base em estrutura (vide, por exemplo, Jackson (1997) Seminars in Oncology 24:L164-172; e Jones et al. (1996) J. Med. Chem. 39:904-917). Compostos e polipeptídeos da invenção também podem ser identi- ficados, por exemplo, identificando os compostos candidatos através de modela- gem de computador encaixando-se espacial e preferencialmente (isto é, com afinidade alta) no sítio ativo de formação de glutamina.

Compostos candidatos identificados como descritos acima podem depois ser testados em ensaios de inibição enzimática celular ou enzimática livre de célula padrão familiares àqueles versados na técnica. Ensaios exemplares são descritos aqui. A estrutura 3-D de macromoléculas biológicas (por exemplo, GS, GS adenililada, ácidos nucléicos, carboidratos, e lipídios) pode ser determi- nada de dados obtidos por uma variedade de metodologias. Estas metodologias que foram eficazmente aplicadas à avaliação da estrutura 3-D de proteínas inclu- em: (a) cristalografia de raio X; (b) espectroscopia por ressonância magnética nuclear (RMN); (c) análise de restrições de distância física formada entre os sítios definidos em uma macromolécula, por exemplo, reticulações químicas intramole- culares entre os resíduos em uma proteína (por exemplo, Pedido de Patente In- ternacional N° PCT/USOO/14667, a descrição deste é aqui incorporada por refe- rência em sua totalidade), e (d) métodos de modelagem molecular com base em um conhecimento da estrutura primária de uma proteína de interesse, por exem- plo, técnicas de modelagem de homologia, algoritmos de encadeamento, ou es- trutura de modelagem ab initio usando programas de computação tais como MONSSTER (Modeling Of New Structures from Secondary and Tertiary Restra- ints) (vide, por exemplo, Pedido de Patente Internacional N° PCT/US99/11913, a revelação deste é aqui incorporada por referência em sua totalidade). Outras técnicas de modelagem molecular podem também ser empregadas de acordo com esta invenção [por exemplo, Cohen et al. (1990) J. Med. Chem. 33: 883-894; Navia et al (1992) Current Opinions in Structural Biology, 2, páginas 202-210, as descrições desta são incorporadas aqui por referência em sua totalidade]. Todos estes métodos produzem dados que são acessíveis por análise de computador. Outros métodos espectroscópicos que podem também ser úteis no método da invenção, mas que não correntemente fornecem detalhe estrutural de nível atô- mico acerca das biomoléculas, incluem dicroismo circular e fluorescência e es- pectroscopia absorbância de luz ultravioleta/visível. Um método preferido de aná- lise é cristalografia de raio X. Descrições deste procedimento e de espectrosco- pia por RMN são fornecidas abaixo.

CRISTALOGRAFIA DE RAIO X

Cristalografia de raio X é com base na difração de radiação χ de um comprimento de onda característico através de nuvens de elétrons circundando os núcleos atômicos em um cristal da região de interesse. A técnica usa cristais de macromoléculas biológicas purificadas (mas estas freqüentemente incluem componentes de solvente, co-fatores, substratos, ou outros ligantes) para deter- minar próximo da resolução atômica dos átomos que compõem a macromolécula biológica particular. Uma condição prévia para solucionar a estrutura 3-D da ma- cromolécula através de cristalografia de raio X é um cristal bem regulado que irá difratar raios X fortemente. O método direciona um feixe de raios X sobre um ar- ranjo de repetição habitual de muitas moléculas idênticas de forma que os raios X são difratados do arranjo em um padrão do qual a estrutura de uma molécula individual possa ser recuperada. Cristais bem regulados, por exemplo, de molé- cuias de proteínas globulares são objetos grandes, esféricos ou elipsoidais com superfícies irregulares. Os cristais contêm canais grandes entre as moléculas individuais. Estes canais, que normalmente ocupam mais que uma metade do volume do cristal, são enchidos com moléculas de solvente desordenadas, e as moléculas de proteína estão em contato entre si em apenas algumas regiões pequenas. Este é uma razão pela qual as estruturas de proteínas nos cristais são em geral iguais àquelas de proteínas na solução.

GS foi cristalizada muitas vezes, por exemplo, de Salmonella typhi- muríum, Almassy, R. J. et. al. (1986) Nature (Londres) 323: 304-309, Liaw, S-H., et al. ( 1993) Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 90: 4996-5000; com glicina, alanina e serina no sítio ativo, Liaw, S-H e D. Eisenberg (1994) J. Biol. Chem. 33: 675-681; com AMPPNP, glutamato, L-metionina-S-sulfoximina, glutamina e ADP no sítio ativo das 5 estruturas, Liaw, S-H., Jun, G. e D. Eisenberg (1993) Protein Science, 2: 470-471; e com ATP no sítio ativo, Liaw, S-H., Jun, G. e D. Eisenberg (1994) Biochemistry 33: 11184-11188. Métodos de obter GS ou fragmentos de GS1 in- cluindo GS adenililada, são descritos abaixo ou são bem conhecidos àqueles tendo habilidade usual na técnica. A formação de cristais é dependente de vários parâmetros diferentes, incluindo pH, temperatura, a concentração da macromo- lécula biológica, a natureza do solvente e precipitante, como também a presença de íons adicionados ou Iigantes da proteína. Muitos experimentos de cristaliza- ção rotineiros podem ser necessários para triar todos estes parâmetros para as combinações que dão um cristal adequado para análise de difração de raio X. Robôs de cristalização podem automatizar e acelerar o trabalho de reprodutibili- dade montando um número grande de experimentos de cristalização (vide, por exemplo, Patente U. S. 1^5.790.421).

Cristalização de polipeptídeo ocorre nas soluções em que a concen- tração de polipeptídeo excede sua solubilidade máxima (isto é, a solução de poli- peptídeo é supersaturada). Tais soluções podem ser restabelecidas ao equilíbrio reduzindo a concentração de polipeptídeo, preferivelmente através de precipita- ção dos cristais de polipeptídeo. Freqüentemente, os polipeptídeos podem ser induzidos para cristalizar de soluções supersaturadas adicionando agentes que alteram as cargas de superfície dos polipeptídeos ou perturbam a interação entre o polipeptídeo e água de volume para promover associações que levam à crista- lização.

Cristalizações são em geral realizadas entre 4°C e 20°C. Substân- cias conhecidas como "precipitantes" são freqüentemente usadas para diminuir a solubilidade do polipeptídeo em uma solução concentrada formando uma cama- da vazia de precipitação energicamente desfavorável ao redor das moléculas de polipeptídeo [Weber (1991) Advances in Protein Chemistry, 41: 1-36]. Além dos precipitantes, outros materiais são às vezes adicionados à solução de cristaliza- ção de polipeptídeo. Estes incluem tampões para ajustar o pH da solução e sais para reduzir a solubilidade do polipeptídeo. Vários precipitantes são conhecidos na técnica e incluem os seguintes: etanol, 3-etil-2-4 pentanodiol, e muitos dos poliglicóis, tais como polietileno glicol (PEG). As soluções de precipitação podem incluir, por exemplo, 13-24% PEG 4000, 5-41% sulfato de amônio, e 1,0-1,5 M cloreto de sódio, e um pH que varia de 5 - 7,5. Outros aditivos podem incluir 0,1 M Hepes, 2-4% butanol, 0,1 M ou 20 mM acetato de sódio, 50-70 mM ácido cítri- co, 120-130 mM fosfato de sódio, 1 mM ácido etileno diamino tetracético (EDTA), e 1 mM ditiotritol (DTT). Estes agentes são preparados em tampões e são adi- cionados em gotas em várias combinações ao tampão de cristalização.

Métodos de cristalização de polipeptídeo comumente usados inclu- em as técnicas a seguir: batelada, gota suspensa, iniciação de semente, e diálise. Em cada uma destes métodos, é importante promover cristalização continuada após nucleação mantendo uma solução supersaturada. No método por batelada, o polipeptídeo é misturado com precipitantes para alcançar supersaturação, e o vaso é vedado e colocado aparte até que os cristais apareçam. No método de diálise, o polipeptídeo é retido em uma membrana de diálise vedada que é colo- cada em uma solução contendo precipitante. Equilibração ao longo da membra- na aumenta as concentrações de polipeptídeo e de precipitante, assim fazendo o polipeptídeo alcançar níveis de supersaturação.

Na técnica de gota suspensa preferida [McPherson (1976) J. Biol. Chem., 251:6300-6306], uma mistura de polipeptídeo inicial é criada acrescen- tando um precipitante a uma solução de polipeptídeo concentrada. As concentra- ções do polipeptídeo e precipitantes são de modo que nesta forma inicial, o poli- peptídeo não cristaliza. Uma gota pequena desta mistura é colocada em uma lâmina de vidro que é invertida e suspensa em um reservatório de uma segunda solução. O sistema é depois vedado. Tipicamente, a segunda solução contém uma concentração mais alta de precipitante ou outro agente desidratante. A dife- rença nas concentrações faz com que o precipitante na solução de proteína te- nha uma pressão de vapor mais alta que a segunda solução. Considerando que o sistema que contém as duas soluções é vedado, um equilíbrio é estabelecido, e água da mistura de polipeptídeo transfere para a segunda solução. Este equilí- brio aumenta a concentração de polipeptídeo e de precipitante na solução de polipeptídeo. Na concentração crítica de polipeptídeo e precipitante, um cristal do polipeptídeo pode formar.

Outro método de cristalização introduz um sítio de nucleação em uma solução de polipeptídeo concentrada. Em geral, uma solução de polipeptí- deo concentrada é preparada e um cristal de semente do polipeptídeo é introdu- zido nesta solução. Se as concentrações do polipeptídeo e quaisquer precipitan- tes estiverem corretas, o cristal de semente fornecerá um sítio de nucleação ao redor do qual um cristal maior se forma.

Ainda outro método de cristalização é um método de eletrocristaliza- ção em que uso é feito dos momentos de dipolo de macromoléculas de proteína que se auto-alinham na camada de Helmholtz adjacente a um eletrodo (vide Pa- tente U. S. N2 5.597.457).

Algumas proteínas podem ser recalcitrantes à cristalização. Porém, várias técnicas estão disponíveis ao artesão versado para induzir cristalização. Por exemplo, a remoção dos segmentos de polipeptídeo flexíveis na extremidade terminal de amino ou carboxila da proteína pode facilitar a produção de amostras de proteínas cristalinas. Remoção de tais segmentos pode ser feita usando téc- nicas de biologia molecular ou tratamento da proteína com proteases tais como tripsina, quimiotripsina, ou subtilisina.

Em experimentos de difração, um feixe estreito e paralelo de raios X é tirado da fonte de raio X e direcionado sobre o cristal para produzir feixes difra- tados. Os feixes primários incidentes causam dano à macromolécula e moléculas de solvente. Portanto, o cristal é esfriado (por exemplo, para -220SC a -50SC) pa- ra prolongar sua vida. O feixe primário tem que incidir o cristal de muitas direções para produzir todos pontos de difração possíveis, assim o cristal é girado no feixe durante o experimento. Os pontos difratados são registrados em um filme ou por um detector eletrônico. Filme exposto tem que ser digitalizado e quantificado em um dispositivo de varredura, enquanto que os detectores eletrônicos alimentam os sinais que eles detectam diretamente em um computador. Detectores de área eletrônicos reduzem significativamente o tempo requerido para colher e medir os dados de difração. Cada feixe de difração que é registrado como um ponto no filme é definido através de três propriedades: a amplitude que é medida da inten- sidade do ponto; o comprimento de onda que é fixado pela fonte de raio x; e a fase que é perdida nos experimentos de raio X. Todas as três propriedades são necessárias para todos os feixes difratados para determinar as posições dos á- tomos que dão origem aos feixes difratados. Um modo de determinar as fases é chamado Substituição Isomorfa Múltipla (MIR) que requer a introdução de difratores de raio X exógenos (por exemplo, átomos pesados tais átomos de metal) na célula de unidade do cristal. Para uma descrição mais detalhada de MIR, vide patente U. S. N°6.093.573, coluna 15.

Coordenadas atômicas referem-se às coordenadas cartesianas (po- sições x, y, e z) derivadas de equações matemáticas que envolvem a síntese de Fourier de dados derivados de padrões obtidos por meio de difração de um feixe monocromático de raios X pelos átomos (centros de difração) de macromolécula biológica de interesse na forma de cristal. Os dados de difração são usados para calcular os mapas de densidade de elétron de unidades de repetição no cristal (célula de unidade). Os mapas de densidade de elétron são usados para estabe- lecer as posições (coordenadas atômicas) dos átomos individuais dentro da célu- la de unidade de um cristal. Os valores absolutos das coordenadas atômicas car- regam relações espaciais entre os átomos porque os valores absolutos designa- dos para as coordenadas atômicas podem ser alterados por movimento rotacio- nal e/ou translacional ao longo dos eixos x, y, e/ou z, junto ou separadamente, ao mesmo tempo mantendo as mesmas relações espaciais com relação entre os átomos. Desse modo, uma macromolécula biológica (por exemplo, uma proteína), cujo conjunto de valores de coordenadas atômicas absolutas pode ser rotativa ou transacionalmente ajustado para coincidir com um conjunto de determinados valores anteriores de uma análise de outra amostra, é considerada ter as mes- mas coordenadas atômicas que aquelas obtidas da outra amostra.

Mais detalhes sobre cristalografia de raio X podem ser obtidos na patente U. S. N°6.093.573 e Pedidos de Patente Internacionais Nss PCT/USOO/ 18441, PCT/US99/11913, e PCT/USOO/03745.

ESPECTROSCOPIA DE RMN

Embora cristalografia de raio X requeira cristais simples de uma ma- cromolécula de interesse, as medições de RMN são realizadas na solução sob condições quase fisiológicas. Porém, estruturas derivadas de RMN não são tão detalhadas quanto as estruturas derivadas de cristal.

Embora o uso de espectroscopia de RMN fosse até de modo relati- vo recentemente limitado à elucidação da estrutura 3-D de moléculas relativa- mente pequenas (por exemplo, proteínas de 100-150 resíduos de aminoácido), recentes avanços incluindo marcação isotópica da molécula de interesse e es- pectroscopia otimizada de relaxamento transversal (TROSY) permitiram estender a metodologia para a análise de muitas moléculas maiores, por exemplo, proteí- nas com um peso molecular de 110 kDa [Wilder (2000) BioTechniques, 29:1278- 1294],

RMN usa radiação de radiofreqüência para examinar o ambiente de núcleos atômicos magnéticos em um campo magnético homogêneo pulsado com uma radiofreqüência específica. Os pulsos perturbam a magnetização nu- clear daqueles átomos com núcleos de giro de não-zero. Os sinais de domínio de tempo transientes são detectados à medida que o sistema ao equilíbrio. Trans- formação de Fourier do sinal transiente em um domínio de freqüência rende um espectro de RMN unidimensional. Picos nestes espectros representam desloca- mentos químicos dos vários núcleos ativos. O deslocamento químico de um á- tomo é determinado por seu ambiente eletrônico local. Experimentos de RMN bidimensionais podem fornecer informação acerca da proximidade de vários á- tomos na estrutura e em espaço tridimensional. Estruturas de proteína podem ser determinadas executando vários experimentos de RMN bidimensionais (e às vezes 3 ou 4) e usando a informação resultante como restrições em uma série de simulações de dobramento de proteína.

Mais informação sobre espectroscopia de RMN1 incluindo descri- ções detalhadas de como os dados brutos obtidos de um experimento de RMN podem ser usados para determinar a estrutura 3-D de uma macromolécula, pode ser encontrada em: Protein NMR Spectroscopy, Principies and Practice, J. Cava- nagh et al, Academic Press, San Diego, 1996; Gronenborn et al. (1990) Anal. Chem. 62(1):2-15; e Wider (2000), supra.

Qualquer método disponível pode ser usado para a construção de um modelo 3-D de uma região de GS de interesse dos dados cristolográficos de raio X e/ou de RMN usando um computador como descrito acima. Um tal modelo pode ser construído de pontos de dados analíticos introduzidos no computador por um dispositivo de entrada e por meio de um processador usando pacotes de software conhecidos, por exemplo, CATALYST (Accelrys), INSIGHT (AcceIrys) e Ceriusll, HKL, MOSFILM, XDS, CCP4, SHARP, PHASES, HEAVY, XPLOR1 TNT, NMRCOMPASS, NMRPIPE, DIANA, NMRDRAW, FELIX, VNMR, MADIGRAS, QUANTA, BUSTER, SOLVE, O, FRODO, ou CHAIN. O modelo construído des- tes dados pode ser visualizado por meio de um dispositivo de saída de um com- putador, usando sistemas disponíveis, por exemplo, Silicon Graphics, Evans e Sutherland, SUN, Hewlett Packard, Apple Macintosh, DEC, BBM, ou Compaq.

PROJETANDO COMPOSTOS DA INVENÇÃO

Uma vez a estrutura 3-D de um composto que liga e/ou inibe uma região de GS de interesse (por exemplo, um sítio ativo de formação de glutamina de GS adenililada ou desadenililada, incluindo um sítio da tríade catalítica adenili- Iada ou desadenililada) foi estabelecida usando qualquer um dos métodos acima, um composto tendo substancialmente a mesma estrutura 3-D (ou contém um domínio tendo substancialmente a mesma estrutura) que o composto identificado, pode ser feito. Neste contexto, "ter substancialmente a mesma estrutura 3-D" significa que o composto possui uma região de ligação de hidrogênio e caráter hidrofóbico que é similar ao composto identificado. Em alguns casos, um com- posto tendo substancialmente a mesma estrutura 3-D que o composto identifica- do pode possuir uma zona de ligação de hidrogênio que é similar em estrutura e distribuição de carga de fosfato de γ-glutamila, ou capaz de formar um intermedi- ário de enzima de acila com Ser 52 ou Ser 53 (ou os resíduos correspondentes em GS de uma espécie diferente de E. colí).

Com os dados estruturais 3-D acima descritos em mão e conhecen- do a estrutura química (por exemplo, seqüência de aminoácido no caso de uma proteína) da região de interesse, aqueles de habilidade na técnica saberiam fazer compostos com as propriedades acima descritas. Tais métodos incluem métodos sintéticos químicos e, no caso de proteínas, métodos recombinantes (vide acima). Por exemplo, resíduos de cisteína apropriadamente colocados em um composto para formar ligações de dissulfeto podem ser usados para restringir o composto ou um domínio do composto em uma estrutura 3-D apropriada. Além disso, em um composto que é um polipeptídeo ou inclui um domínio que é um polipeptídeo, alguém de habilidade na técnica saberia que aminoácidos incluir e em que se- qüência os incluir para gerar, por exemplo, hélices a, estruturas β, ou voltas ou curvas agudas na cadeia principal do polipeptídeo.

Embora não essencial, os métodos com base em computador po- dem ser usados para projetar os compostos da invenção. Programas de compu- tação apropriados incluem: Insightll (Accelrys), CATALYST (AcceIrys)1 LUDI (Ac- celrys., San Diego1 CA), Aladdin (Daylight Chemical Information Systems, Irvine, CA); e LEGEND [Nishibata et al. (1985) J. Med. Chem. 36(20):2921-2928].

Compostos da invenção que são peptídeos também incluem aque- les descritos acima, mas modificados para o uso in vivo pela adição, nas extre- midades amino- e/ou carboxila-terminais, de um agente de bloqueio para facilitar a sobrevivência do polipeptídeo relevante in vivo. Isto pode ser útil naquelas situ- ações em que os términos de peptídeo tendem ser degradados através de pro- teases antes da absorção celular. Tais agentes de bloqueio podem incluir, sem limitação, seqüências de peptídeo relacionadas ou não relacionadas adicionais que podem ser ligadas aos resíduos terminais de amino e/ou carboxila do peptí- deo sendo administrado. Isto pode ser feito quimicamente durante a síntese do peptídeo ou por tecnologia de DNA recombinante através de métodos familiares aos artesãos de habilidade comum.

Alternativamente, agentes de bloqueio tais como ácido piroglutâmico ou outras moléculas conhecidas na técnica podem ser ligados aos resíduos de amino e/ou carboxila-terminais, ou o grupo amino no término de amino ou grupo carboxila no término de carboxila pode ser substituído com uma metade diferente. Igualmente, os compostos de peptídeo podem ser covalente ou não- covalentemente acoplados às proteínas farmaceuticamente aceitáveis "veículo" antes da administração.

Também de interesse são os compostos peptidomiméticos que são projetados com base nas seqüências de aminoácido dos compostos da invenção que são peptídeos. Compostos peptidomiméticos são compostos sintéticos que têm uma conformação tridimensional (isto é, um "motivo de peptídeo") que é substancialmente igual à conformação tridimensional de um peptídeo seleciona- do. Compostos peptidomiméticos podem ter características adicionais que inten- sificam sua utilidade in vivo, tais como permeabilidade celular aumentada e meia- vida biológica prolongada. Os peptidomiméticos tipicamente têm uma cadeia principal que é parcial ou completamente não-peptídeo, mas com grupos laterais que são idênti- cos aos grupos laterais dos resíduos de aminoácido que ocorrem no peptídeo no qual o peptidomimético é com base. Vários tipos de ligações químicas, por e- xemplo, ligações de éster, tioéster, tiomida, retroamida, carbonila reduzida, dime- tileno e cetometileno, são conhecidas na técnica ser em geral substitutos úteis para ligações de peptídeo na construção de peptidomiméticos resistentes à pro- tease.

Dada a troca proposta entre as tríades catai íticas dependendo do estado de adenililação de GS1 molécula pequena, compostos peptídicos ou pep- tidomiméticos que são conhecidos ou postulados ser inibidores de protease, par- ticularmente inibidores de serina protease, ou análogos de tais inibidores de pro- tease, são de interesse particular. Tais moléculas podem ser usadas nos méto- dos baseados em computador descritos aqui, por exemplo, como moléculas para ancorar, por exemplo, em um sítio ativo de formação de glutamina ou sítio da tríade catalítica para projetar outras moléculas de inibidor de teste, ou podem ser usadas nos métodos terapêuticos ou de inibição in vivo ou in vitro descritos abai- xo. Compostos exemplares incluem aqueles revelados nos WO 99/12935; WO 02/22575; WO 97/46576; WO 99/50263; e WO 99/50257. Inibidores de serina protease conhecidos incluem derivados de aldeído de peptidil-arginina, derivados de pirrolopirrrolideno, derivados de quinolinona, e derivados de benzimidazol de 1-metila.

ENSAIOS DE TRIAGEM

Fornecidos aqui são métodos in vivo para identificar compostos que inibem a atividade de GS, tal como inibindo um sítio ativo de formação de gluta- mina de GS de adenililada e/ou desadenililada, e/ou inibindo qualquer uma ou ambas as atividades das tríades catalíticas adenililada ou desadenililada.

A especificidade de inibição de GS adenililada pode diferir da GS desadenililada por causa das diferenças nas estruturas das tríades catalíticas ativas. Em métodos de triagem para compostos que inibem o sítio ativo de for- mação de glutamina de GS, incluindo compostos que inibem qualquer uma ou ambas as tríades catalíticas, ensaios podem ser projetados para triar compostos que inibem ataque nucleofílico através de amônia no intermediário de fosfato de γ-glutamila produzido na primeira etapa do mecanismo de reação enzimática de GS; que inibem o ataque de uma serina ativada de uma tríade catalítica no fosfa- to de γ-glutamila na formação de um intermediário da enzima de acila de glutami- la; ou que inibem ataque nucleofílico através de amônia no intermediário de glu- tamila-acila. Por exemplo, um polipeptídeo de GS pode ser contatado com um composto de teste sob condições de ensaio específicas eficazes para a forma- ção de glutamina em um ensaio ocorrer. Tipicamente, o polipeptídeo de glutami- na sintetase é testado com o inibidor sob condições para a forma adenililada da enzima em concentrações de 0,6 mM ATP, 1,8 mM MnCl2, 7,2 mM NaHCO3, 4 mM ácido glutâmico, e 4 mM NH4CI em 10 mM tampão de Imidazol.HCl (pH 6,3); e para a forma desadenililada do ensaio 0,6 mM ATP, 0,6 mM MgCI2, 4 mM áci- do glutâmico, 4 NH4Cl e 10 mM tampão de Imidazol.HCl (pH 7,2). Todos os en- saios foram operados a 37° C.

Ensaios para GS adenililada podem ser diferente daqueles para GS desadenililada. O ensaio de GS adenililada pode ser operado em pH 6,3 e uma razão de concentração de HCO3- para Mn2+ para ATP de 12:3:1, enquanto o en- saio de GS desadenililada pode ser operado a pH 7,2 e uma razão de concen- tração de Mg2+ para ATP de 1:1. Condições de ensaio típicas para a GS adenili- lada são 20 mM tampão de Imidazol (pH 6,3), 1 mM ATP, 3 mM MnCl2, 12 mM NaHCO3 e 2 mM glutamato de sódio; condições de ensaio típicas para GS desa- denililada têm 20 mM tampão de Imidazol (pH 7,2), 1 mM ATP, 1 mM MgCl2, 12 mM NaCl e 2 mM glutamato de sódio. Os ensaios podem ser operados a 37°C.

Hidrólise de ATP, produção de ADP e/ou utilização de glutamato e produção de glutamina podem ser medidas na presença e ausência do compos- to de teste. Por exemplo, em uma modalidade, um método de triar um composto de teste in vitro para determinar se ou não inibe a atividade do sítio ativo de for- mação de glutamina de um polipeptídeo de glutamina sintetase inclui:

(a) contatar um polipeptídeo de glutamina sintetase (por exemplo, uma GS adenililada ou uma GS desadenililada), com um composto de teste sob condições eficazes para atividade do sítio ativo de formação de glutamina ocorrer; e (b) determinar se ou não a atividade do sítio ativo de formação de glutamina do polipeptídeo de glutamina sintetase está reduzida com relação à atividade de um polipeptídeo de glutamina sintetase que não foi contatado com o composto de teste.

A atividade do sítio ativo de formação de glutamina pode ser media- da por um intermediário de enzima de acila de glutamila, como descrito aqui. Se um polipeptídeo de GS adenililada for usado, qualquer atividade inibidora pode ser comparada com a inibição obtida para o composto de teste em uma glutami- na desadenililada sintetase, e vice-versa.

COMPOSTOS E COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS

Fornecidos aqui também são os compostos, por exemplo, os com- postos para inclusão em composições farmacêuticas e/ou para o uso nos méto- dos descritos aqui. Com base na informação estrutural e mecanística sobre o sítio ativo de formação de glutamina de GS, como demonstrado aqui e nos E- xemplos abaixo, os inibidores de protease conhecidos, incluindo inibidores de serina protease conhecidos, podem ser triados para sua atividade inibidora de GS, como descrita acima. Em algumas modalidades, os compostos a ser avalia- dos para atividade de inibição de protease, também referidos como inibidores de protease de "teste" aqui, podem ser triados similarmente. Por exemplo, uma bi- blioteca de inibidores de protease de teste pode ser tríada, tal como uma bibliote- ca de inibidores de teste de serina protease. Compostos tendo atividade inibidora apropriada podem depois ser usados para tratar, impedir, ou melhorar um ou mais sintomas associados a infecções bacterianas em mamíferos. Inibidores de serina protease úteis são descritos nos WO 99/12935; WO 02/22575; WO 97/46576; WO 99/50263; e WO 99/50257.

FORMULAÇÃO DE COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS

Uma composição farmacêutica fornecida aqui contém quantidades terapeuticamente eficazes de um ou mais compostos, por exemplo, inibidores de serina protease que são úteis no tratamento, prevenção, ou melhora de um ou mais dos sintomas associados a uma infecção bacteriana (por exemplo, uma bactéria contendo o gene de GSI-β, tal como Mycobacterium tuberculosis, ou uma bactéria contendo o gene de GSI-α, tal como Bacillus anthracis), ou um dis- túrbio, condição, ou doença em que uma tal infecção bacteriana está implicada, e um veículo farmaceuticamente aceitável. Veículos farmacêuticos adequados pa- ra administração dos compostos fornecidos aqui incluem quaisquer tais veículos conhecidos àqueles versados na técnica serem adequados para o modo particu- lar de administração.

Além disso, os compostos podem ser formulados como o único componente farmaceuticamente ativo na composição ou podem ser combinados com outros componentes ativos. Por exemplo, os compostos podem ser formu- lados ou combinados com os compostos antibacterianos conhecidos, compostos antiinflamatórios, esteróides, e/ou antivirais.

Os compostos são, em uma modalidade, formulados nas prepara- ções farmacêuticas adequadas tais como soluções, suspensões, comprimidos, comprimidos dispersáveis, pílulas, cápsulas, pós, formulações de liberação con- tínuas ou elixires, para administração oral ou em soluções ou suspensões esté- reis para administração parenteral, como também preparação de emplasto transdérmico e inaladores de pó seco. Em uma modalidade, os compostos des- critos acima são formulados em composições farmacêuticas usando técnicas e procedimentos bem conhecidos na técnica (vide, por exemplo, Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms, Quarta Edição 1985,126).

Nas composições, concentrações eficazes de um ou mais compos- tos ou derivados farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos são misturadas com um veículo farmacêutico adequado. Os compostos podem ser derivatizados co- mo os sais correspondentes, ésteres, éteres de enol ou ésteres, acetais, cetais, ortoésteres, hemiacetais, hemicetais, ácidos, bases, solvatos, hidratos ou pró- medicamentos antes da formulação, como descrito acima. As concentrações dos compostos nas composições são eficazes para liberação de uma quantidade, sob administração, que trata, impede, ou melhora um ou mais dos sintomas de uma infecção bacteriana.

Em uma modalidade, as composições são formuladas para adminis- tração de dosagem simples. Para formular uma composição, a fração em peso do composto é dissolvida, suspensa, dispersa ou do contrário misturada em um veículo selecionado em uma concentração eficaz de modo que a condição trata- da seja aliviada ou um ou mais sintomas sejam melhorados.

O composto ativo é incluído no veículo farmaceuticamente aceitável em uma quantidade suficiente para exercer um efeito terapeuticamente útil na ausência de efeitos colaterais indesejáveis no paciente tratado. A concentração terapeuticamente eficaz pode ser determinada empiricamente testando os com- postos em sistemas in vitro, ex vivo e in vivo, e depois extrapolados dele para dosagens para seres humanos.

A concentração do composto ativo na composição farmacêutica de- penderá das taxas de absorção, inativação e excreção do composto ativo, as características fisicoquímicas do composto, o horário de dosagem, e a quantida- de administrada como também outros fatores conhecidos àqueles de habilidade na técnica.

Formas de unidade de dosagem farmacêuticas são preparadas para fornecer de cerca de 0,01 mg, 0,1 mg ou 1 mg a cerca de 500 mg, 1000 mg ou 2000 mg, e em uma modalidade de cerca de 10 mg a cerca de 500 mg do com- ponente ativo ou uma combinação de componentes essenciais para a forma de unidade de dosagem.

O componente ativo pode ser administrado imediatamente, ou pode ser dividido em várias doses menores a ser administradas em intervalos de tem- po. É entendido que a dosagem precisa e a duração do tratamento são uma fun- ção do distúrbio sendo tratado e podem ser determinadas empiricamente usando protocolos de testagem conhecidos ou através de extrapolação de dados de tes- te in vivo ou in vitro. É para ser observado que as concentrações e os valores de dosagem podem também variar com a severidade da condição a ser aliviada. É também para ser entendido que para qualquer sujeito particular, os regimes de dosagem específicos deveriam ser ajustados com o passar do tempo de acordo com a necessidade individual e o julgamento profissional da pessoa administran- do ou supervisionando a administração das composições, e que a faixa de con- centração exposta aqui é exemplar apenas e não é intencionada limitar o escopo ou prática das composições reivindicadas.

Em circunstâncias em que os compostos exibem solubilidade insufi- ciente, métodos podem ser usados para solubilizar os compostos. Tais métodos são conhecidos àqueles de habilidade nesta técnica, e incluem, mas não são limitados a, usar cosolventes, tais como dimetilsulfóxido (DMSO), usando tensoa- tivos, tais como TWEEN®, ou dissolução em bicarbonato de sódio aquoso. Deri- vados dos compostos, tais como pró-medicamentos dos compostos, podem também ser usados na formulação de composições farmacêuticas eficazes.

Sob mistura ou adição do(s) composto(s), a mistura resultante pode ser uma solução, suspensão, emulsão ou outros. A forma da mistura resultante depende de vários fatores, incluindo o modo intencionado de administração e a solubilidade do composto no veículo ou veículo selecionado. A concentração efi- caz é suficiente para melhorar os sintomas da doença, distúrbio ou condição tra- tada e pode ser determinada empiricamente.

As composições farmacêuticas são providas para administração em seres humanos e animais em formas de dosagem de unidade, tais como com- primidos, cápsulas, pílulas, pós, grânulos, soluções ou suspensões parenterais estéreis, e soluções ou suspensões orais, e emulsões de óleo-água contendo quantidades adequadas dos compostos ou derivados farmaceuticamente aceitá- veis dos mesmos. Os compostos de modo farmacêutico terapeuticamente ativos e derivados dos mesmos são, em uma modalidade, formulados e administrados em formas de dosagem de unidade ou formas de dosagem múltiplas. Forma de dose de unidade como aqui usada refere-se às unidades fisicamente distintas adequadas para sujeitos humanos e animais e embalados individualmente como é conhecido na técnica. Cada dose de unidade contém uma quantidade prede- terminada do composto terapeuticamente ativo suficiente para produzir o efeito terapêutico desejado, em associação com o veículo, veículo ou diluente farma- cêutico requerido. Exemplos de formas de dose de unidade incluem ampolas e seringas e comprimidos ou cápsulas individualmente embalados. Formas de do- se de unidade podem ser administradas em frações ou múltiplos das mesmas. Uma forma de dose múltipla é uma pluralidade de formas de dosagem de unida- de idênticas embaladas em um recipiente simples a ser administrado na forma de dose de unidade segregada. Exemplos de formas de dose múltipla incluem frascos, comprimidos, garrafas ou cápsulas ou garrafas de quartilhos ou galões. Conseqüentemente, a forma de dose múltipla é um múltiplo de doses de unidade que não são segregadas na embalagem.

Composições líquidas farmaceuticamente administráveis podem, por exemplo, ser preparadas dissolvendo, dispersando, ou do contrário mistu- rando um composto ativo como definido acima e adjuvantes farmacêuticos op- cionais em um veículo, tais como, por exemplo, água, dextrose salina, aquosa, glicerol, glicóis, etanol, e similares, para assim formar uma solução ou suspensão. Se desejado, a composição farmacêutica a ser administrada pode também con- ter quantidades secundárias de substâncias auxiliares não-tóxicas tais como a- gentes umectantes, agentes emulsificantes, agentes solubilizantes, agentes tam- ponantes de pH e outros, por exemplo, acetato, citrato de sódio, derivados de ciclodextrina, monolaurato de sorbitan, acetato de sódio de trietanolamina, oleato de trietanolamina, e outros tais agentes.

Métodos atuais de preparar tais formas de dosagem são conhecidos, ou serão evidentes, àqueles versados nesta técnica; por exemplo, vide Reming- ton's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pa., 15- Edi- ção, 1975.

Formas e composições de dosagem contendo componente ativo na faixa de 0,005% a 100% com o equilíbrio composto de veículo não-tóxico pode ser preparado. Métodos para preparação destas composições são conhecidos àqueles versados na técnica. As composições contempladas podem conter 0,001 %-100% de componente ativo, ou em uma modalidade 0,1-95%. ARTIGOS DE FABRICAÇÃO

Um composto ou derivado farmaceuticamente aceitável pode ser embalado como um artigo de fabricação (por exemplo, kit) contendo material de embalagem, um composto ou derivado farmaceuticamente aceitável do mesmo fornecido aqui dentro do material de embalagem, e uma rótulo indicando que o composto ou composição, ou derivado farmaceuticamente aceitável do mesmo, é útil para tratamento, prevenção, ou melhora de um ou mais sintomas ou distúr- bios em que uma infecção bacteriana, incluindo uma infecção de Mycobacterium tuberculosis, está implicada.

Os artigos de fabricação fornecidos aqui contêm materiais de emba- lagem. Materiais de embalagem para o uso em produtos de embalagem farma- cêuticos são bem conhecidos àqueles de habilidade na técnica. Vide, por exem- plo, Patentes U. S. N° 5.323.907, 5.052.558 e 5.033.252. Exemplos de materiais de embalagem farmacêuticos incluem, mas não são limitados a, pacotes de bo- lha, garrafas, tubos, inaladores, bombas, sacos, frascos, recipientes, seringas, garrafas, e qualquer material de embalagem adequado para uma formulação selecionada e modo intencionado de administração e tratamento.

AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE DOS COMPOSTOS

A atividade dos compostos fornecidos aqui como inibidores de ativi- dade de GS, por exemplo, atividade de GS adenililada, atividade de GS desade- nililada, atividade do sítio ativo de formação de glutamina, ou uma ou mais ativi- dades da tríade cataiítica; e/ou como compostos para tratar, impedir, ou melhorar um ou mais sintomas, condições, ou distúrbios associados a uma infecção bacte- riana (por exemplo, infecção de Mycobacterium tuberculosis), podem ser medi- das ou avaliadas em ensaios padrões. Ensaios de inibição enzimática (por e- xemplo, ensaios de γ-glutamil transferase, ensaios de ATP hidrólise, produção de ADP, e utilização de glutamato e ensaios de formação de glutamina), inibição de crescimento de uma bactéria tal como M. tuberculosis, e ensaios de citoproteção, viabilidade, e citotoxicidade celulares, todos dos quais são bem conhecidos à- queles tendo habilidade usual na técnica e/ou são descritos abaixo.

MÉTODOS DE USO DOS COMPOSTOS E COMPOSIÇÕES

Ambos métodos in vitro ou in vivo podem ser executados com os compostos e composições descritos aqui. Aplicação in vitro dos compostos da invenção pode ser útil, por exemplo, em estudos científicos básicos de mecanis- mos de reação de GS, ou para métodos in vitro de tratar, impedir, reduzir, ou ini- bir uma contaminação ou infecção bacteriana, ou para inibir um sítio ativo de formação de glutamina de GS. Os compostos podem também ser usados in vivo como agentes terapêuticos contra infecções bacterianas, incluindo bactérias pa- togênicas ou oportunísticas. Em particular, os compostos podem ser usados co- mo agentes terapêuticos contra infecções de bactérias de GSI-β tais como Cory- nebacterium diphtheriae, Neisseria gonorrhoeae, Escherichia coii, Salmonella typhinurium, Salmonella typhi, Klebsiella pneumoniae, Serratia marcescens, Pro- teus vulgarís, Shigella dysenteriae, Vibrio cholerae, Pseudomonas aeruginosa, Alcaligenes faecalis, Helicobacter pylori, Haemophilus influenzae, Bordetella per- tussis, Bordella bronchiseptia, Neisseria meningitides, Brucella melitensis, Myeo- baeterium tubereulosis, Myeobaeterium leprae, Treponema pallidum, Leptospira interrogans, Aeetinomyees israelii, Noeardia esteroides, Thiobaeillus ferrooxidans, Azospirillum brazilensis, Anabaena sp., Fremyella diplosiphon, e Streptormyces eoelieolor, ou infecções de bactérias de GSI-α tais como Bacillus eereus, Bacillus subtilis, Bacillus anthraeis, Streptoeoeeus pneumoniae, Streptoeoeeus pyogenes, Staphyloeoeeus aereus, Clostridium botulinum, Clostridium tetani e Clostridium perfringens (isto é, agentes infecciosos que replicam dentro de uma célula), por exemplo, bactérias intracelulares tais como M. tubereulosis.

Os métodos da invenção podem ser aplicados a uma gama extensi- va de espécies, por exemplo, mamíferos tais como seres humanos, primatas não-humanos (por exemplo, macacos), cavalos, gado, porcos, ovelhas, cabras, cães, gatos, coelhos, cobaias, hamsters, ratos, e camundongos. Visto que as enzimas de GSI-β bacterianas são reguladas por meio da cascata de adenilila- ção/desadenililação, mas as enzimas de GSII mamíferas não são, e como certos dos inibidores aqui são postulados seletivamente marcar GS adenililada, os compostos e composições podem ser usadas para seletivamente inibir o cresci- mento de célula bacteriana enquanto minimamente impactando de forma negati- va as células mamíferas.

Em um método in vivo, um composto ou composição farmacêutica aqui descritos podem ser administrados ao sujeito, por exemplo, um mamífero, tal como um mamífero suspeito de sofrimento de uma infecção bacteriana ou sofrendo de uma infecção bacteriana. Em geral, os compostos da invenção se- rão suspensos em um veículo farmaceuticamente aceitável (por exemplo, solu- ção salina fisiológica) e administrados oral ou transdermicamente ou injetados (ou infusos) intravenosa, subeutânea, intramuscular, intraperitoneal, intrarretal, intravaginal, intranasalmente, intragástrica, intratraqueana, ou intrapulmonarmen- te. Eles podem ser liberados diretamente em um tecido afetado apropriado.

As dosagens dos compostos inibidores e agentes adicionais a se- rem usados dependem da escolha da rota de administração; da natureza da for- mulação; da natureza da enfermidade do paciente; do tamanho do sujeito, peso, área de superfície, idade, e sexo; outros fármacos que são administrados; e do julgamento do médico responsável. Dosagens adequadas são em geral na faixa de 0,0001-100,0 mg/kg. Amplas variações na dosagem necessária serão espe- radas em vista da variedade de compostos e agentes adicionais disponíveis e as eficiências divergentes de várias rotas de administração. Por exemplo, adminis- tração oral seria esperada requerer dosagens mais altas que administração por injeção i.v. Variações nestes níveis de dosagem podem ser ajustadas usando rotinas empíricas padrões para otimização como é bem entendido na técnica. Administrações de compostos e/ou agentes adicionais podem ser simples ou múltiplas (por exemplo, 2-, 3-, 4-, 6-, 8-, 10-, 20-, 50-, 100-, 150-, ou mais vezes).

EXEMPLOS

EXEMPLO 1 - IDENTIFICAÇÃO DE TRÍADES CATALÍTICAS DE ESTUDOS DE DINÂMICAS ESTRUTURAIS E MOLECULARES

Análise de dinâmica estrutural e molecular do sítio ativo da glutami- na sintetase de E. coli-levou à identificação de duas tríades catalíticas semelhan- tes à protease. Um alinhamento de seqüência de DNAMAN das seqüências de GS de espécies GSI-α e GSI-β indicou que os resíduos de aminoácidos putativos que compõem a tríade catalítica são conservados ao longo de todas as espécies. Minimizações de energia usando DISCOVER_3 do conjunto de software INSI- GHTII foram depois usadas para tentar agrupar os aminoácidos que compõem cado sítio ativo e confirmar as descobertas de mutagênese loco-direcionada. As minimizações de energia foram realizadas em moléculas de GS que tinham sido reduzidas para um dímero para assegurar que um sítio ativo total fosse obtido, mas para reduzir o número total de átomos para facilitar a computação.

O grau alto de conservação nas seqüências de proteína de GS dos microorganismos procarióticos facilitou um exercício de modelagem molecular da glutamina sintetase de E. coli. O modelo de estrutura de cristal usado foi 1f52.pdb (Gill HSeD Eisenberg (2001) Biochemistry 7: 1903-1912) que foi obtido da Bro- okhaven Protein Database. O dímero foi também manualmente adenililado.

Dentro do sítio ativo de glutamina sintetase, que ocorre na interface de duas subunidades, um agrupamento de resíduos de serina e histidina foi en- contrado. Estes resíduos são Ser52, Ser53, His210 e His211 (usando a numera- ção de resíduo de E coli). Vários resíduos de ácido, Asp50, Glul29, Glu327 e Glu357, requeridos completar as tríades catalíticas putativas, foram também lo- calizados no sítio ativo.

Desse modo, é acreditado que as tríades catalíticas propostas inclu- am os resíduos a seguir de duas subunidades separadas (designadas A e B): GS adenililada: Ser52 (Subunidade B) His211 (Subunidade A) Glul29 (Subunidade A)

GS desadenililada: Ser53 (Subunidade B) His210 (Subunidade A) Glu357 (Subunidade A)

Como alguém de habilidade na técnica reconhecerá, os resíduos correspondentes de GS de outras espécies que E coli poderiam ser determina- dos usando várias técnicas conhecidas, por exemplo, modelagem molecular e/ou alinhamentos de homologia, como também conhecimento do mecanismo da tría- de catai ítica proposta.

EXEMPLO 2: MUTAGÊNESE LOCO-DIRIGIDA E EXPRESSÃO DE GENE MUTANTE

Modelagem molecular do sítio ativo da glutamina sintetase de E coli conduziu à identificação de duas tríades catalíticas semelhantes à protease. A fim de investigar o papel que estes resíduos representaram com respeito à regu- lação da glutamina sintetase de E coli, mutagênese dirigida (SDM) foi usada pa- ra especificamente alvejar estes resíduos e depois avaliar o efeito que a altera- ção destes resíduos tinham usando as atividades catalíticas de glutamina sinte- tase.

Dois sistemas diferentes foram usados para SDM. O primeiro foi o Sistema de Mutagênese in vitro de Altered Sites® de Promega, e o segundo foi o Sistema de Mutagênese Loco-Dirigida QuikChange® XL de Stratagene. A O mai- or parte das mutações foi realizada usando o Sistema de Altered Sites®, como provê um procedimento de alta eficiência para a geração e seleção de mutantes oligonucleotídeo-direcionados. O sistema permite a mutagênese de DNA modelo bifilamentar, como também ciclos seqüenciais de mutagênese sem qualquer ne- cessidade de subclonagem. O procedimento usa seleção antibiótica como um meio para obter uma freqüência alta de mutantes. O vetor contém dois marcado- res de resistência antibiótica: um marcador de resistência à tetraciclina sendo ativo e um marcador de resistência à ampicilina sendo inativo. Os oligonucleotí- deos que restabelecem e geneticamente modificam os dois marcadores são for- necidos no kit. Durante o primeiro ciclo de mutagênese, o gene de resistência à tetraciclina é inativado e a resistência à ampicilina é restabelecida. Um segundo ciclo de mutagênese necessita ser realizado no mutante gerado no primeiro ciclo de mutagênese, depois o gene de resistência à ampicilina é inativado novamente e a resistência à tetraciclina restabelecida. Desse modo, ciclos múltiplos de mu- tagênese são muito facilmente realizados, e o rendimento de mutantes é aumen- tado.

Porque algumas mutações não poderiam ser alcançadas usando este sistema, o Sistema de QuikChange® de Stratagene foi usado, que é um procedimento com base em reação da cadeia de polimerase que pode ser usado para introduzir mutações em virtualmente qualquer vetor. O procedimento básico utiliza um vetor bifilamentar superenrolado que contém a inserção de interesse e dois preparadores de oligonucleotídeo complementares sintéticos que contêm a mutação desejada. Os preparadores, cada um complementar aos filamentos o- postos do vetor, são estendidos durante o ciclismo de temperatura usando DNA polimerase de PfuTurbo. Incorporação dos preparadores de oligonucleotídeo gera um plasmídeo mutado contendo cortes escalonados. Seguindo o ciclismo de temperatura, o produto é tratado com Dpnl. Esta endonuclease de restrição é específica para DNA metilado e hemi-metilado e digere o modelo de DNA paren- tal, assim DNA sintetizado contendo mutação. O DNA de vetor cortado incorpo- rando as mutações desejadas é depois transformado em uma cepa hospedeira de E. coli, seguindo estas colônias individuais podem ser tríadas para a mutação.

Mutações silenciosas foram criadas em todos os preparadores de oligonucleotídeo projetados, permitindo a incorporação de um sítio de endonu- clease de restrição para facilitar a triagem para genes mutantes. Esta triagem rápida, capacitada simples de várias colônias obtidas para cada reação de muta- gênese sem a necessidade por seqüenciação de cada uma. Uma vez a mutagê- nese foi concluída, cada gene mutante foi expresso em um auxotrofo de glutami- na sintetase de E. coli.

Como a atividade catalítica de glutamina sintetase é regulada pela adição covalente de um grupo de AMP para um resíduo de tirosina em cada su- bunidade da enzima, foi proposto primeiro alterar o resíduo de tirosina 397 (o sítio de adenililação) para valina 397 para criar uma forma artificialmente desadenilila- da da enzima. Cada mutação poderia depois ser examinada na forma adenililada e desadenililada da enzima. Um sumário dos outros resíduos alvejados, com as alterações, é mostrado na Tabela 1.

TABELA 1. SUMÁRIO DAS ALTERAÇÕES DE AMINOÁCIDO PRODUZIDAS PARA DEMONSTRAR A PRESENÇA DA TRÍADE CATALÍTICA.

<table>table see original document page 44</column></row><table>

MATERIAIS E MÉTODOS

Todas as culturas de £ coli foram mantidas em meio de LM (5 g/l de NaCI, 10 g/l de extrato de levedura, 10 g/l de triptona; pH 7,2) a menos que do contrário declarado. Ágar foi adicionado a uma concentração de 15 g/l quando requerido. O meio foi suplementado com 50 pg/ml de ampicilina ou 12,5 pg/ml de tetraciclina para pAlter-1, e com 100 pg/ml de ampicilina para pBluescript Il SK+.

As cepas e plasmídeos usados neste estudo estão listados na Tabe- la 2. TABELA 2. CEPAS BACTERIANAS E PLASMÍDEOS USADOS

<table>table see original document page 45</column></row><table>

DNA foi isolado em uma escala pequena usando o kit QiaPrep Spin

Miniprep (Qiagen) ou através de Iise alcalina (Sambrook, J., Fritsch, E. F. e T. Maniatis (1989) Em: Molecular Cloning: A Laboratory Manual., 2- ed. Cold Spring Habor Laboratory Press). Isolamentos de DNA de escala grande foram executa- dos usando o kit de Isolamento de DNA Qiagen Midi (Qiagen). Digestão de DNA foi realizada usando enzimas de restrição compradas de Amersham Biosciences e usadas de acordo com as instruções do fabricante. Fosfatase alcalina foi obtida de Amersham Biosciences. T4 DNA Ligase foi obtida de Promega e usada como o protocolo provido com a enzima. Agarose usada para eletroforese de DNA foi do tipo de biologia molecular.

Taq Polimerase (rTaq) foi obtida de TaKaRa Bio Inc. e foi usada pa- ra propósitos gerais de triagem. Taq polimerase de alta fidelidade (ExTaq) foi também obtida de TaKaRa Bio e foi usada para amplificar genes para clonagem.

Digestão de restrição e eletroforese em gel de agarose foram reali- zada usando procedimentos padrão (Sambrook, J., Fritsch, E., F. e T. Maniatis (1989) Em: Molecular Cloning: A Laboratory Manual., 2- ed. Cold Spring Habor Laboratory Press 1989). Uma escada de DNA de 1 kb foi usada para toda eletro- forese.

Mutagênese loco-dirigida foi realizada usando o kit de Mutagênese in vitro Altered Sites® de Promega Corporation, ou o kit de Mutagênese Loco- dirigida QuikChange® XL de Stratagene, como os protocolos fornecidos com cada kit.

Todas as químicas foram do tipo de biologia analítica ou molecular e foram usadas sem outra purificação. Todas as químicas foram obtidas de Merck ou Sigma a menos que do contrário declarado.

CLONAGEM DO GENE DE GLUTAMINA SINTETASE DE E coli

Os preparadores foram projetados para a seqüência do gene de glnA de E. coli obtida de Genbank {Número de Acesso X05173). Os preparado- res foram projetados com sítios de restrição de Nsil (mostrados em negrito) nas terminações 5'. Os preparadores são mostrados abaixo: preparador de 5': 5'-GATATGCATCCGTCAAATGCG-3' (SEQ ID NO: 1) preparador de 3': õ^GCGATGCATAAAGTTTCCACGG-S' (SEQ ID NO: 2)

PCR foi executada usando DNA de pGLn6 como o modelo e os preparadores acima. A mistura de PCR continha 1 μΙ de DNA de plasmídeo (50 ng), 5 μΙ de cada preparador<2,5 pmol/μΙ), 4 μΙ de 2,5 mM de dNTP, 5 μΙ de 10X tampão contendo 20 mM de MgCb e 0,5 μΙ de Taq polimerase de alta fidelidade (2,5 unidades).

PCR foi conduzida com a desnaturação inicial do DNA modelo a 959C durante 5 minutos, seguido por 30 ciclos de desnaturação a 95°C durante 5 minutos, anelando a 559C durante 1 minuto e alongamento a 72-C durante 2 mi- nutos. Uma etapa de alongamento final de 72°C durante 10 minutos foi também incorporada no perfil. Eletroforese em gel de agarose foi realizada para verificar o tamanho de fragmento produzido por PCR. O produto de PCR foi purificado u- sando o Kit de Purificação de PCR HighPure (Roche Diagnostics), e submetido à digestão com Nsil.

Para construção o modelo para SDM com o Sistema de Altered Si- tes, pAlter-1 foi Iinearizado com Pstl e desfosforilado antes da ligação. Inserção e vetor foram ligados a uma razão de inserção:vector de 3:1.

A reação de ligação foi transformada em JM109 de E. coli através de eletroporação usando um Pulsador de Gene Bio-Rad, conforme instruções do fabricante. Os transformantes foram selecionados em LM Agar suplementado com 12,5 Mg/ml de tetraciclina, 80 pg/ml de X-Gal e 1 mM de IPTG.

Várias colônias brancas obtidas nas placas de transformação foram depois tríadas isolando o DNA usando Iise alcalina, seguido por digestão e eletro- forese em gel de agarose. Seqüenciação foi realizada para confirmar a presença e seqüência do gene de glnA de E. coli. Além do uso dos preparadores univer- sais M13/F e M13/R, os preparadores internos gene-específicos foram projeta- dos da seqüência conhecida do gene. Estes são mostrados na Tabela 3.

TABELA 3. PREPARADORES SEQÜÊNCIA-ESPECÍFICOS USADOS PARA SEQÜENCIAÇÃO DO GENE DE glnA DE E coliCLONADO

<table>table see original document page 47</column></row><table>

Para construção do modelo para SDM com o Sistema de Quik- Change®, o gene de glutamina sintetase foi subclonado da construção de pAlter como um fragmento de Sad-HiruM. A banda contendo o gene de glnA foi exci- sada do gel usando uma lâmina de escalpelo, e empurrada através de uma se- ringa de 2 ml em um tubo Eppendorf, para esmagar a agarose. 1 ml de fenol (e- quilibrado em pH 8,0) foi adicionado ao tubo e a suspensão foi depois submetida a vórtice durante 1 minuto. A amostra foi congelada a -70QC durante pelo menos 30 minutos. Uma vez a amostra tinha descongelada, foi centrifugada a 13 000 rpm em uma microcentrífuga Eppendorf durante 15 minutos. A fase aquosa foi removida para um tubo limpo e depois extraída uma vez com fenohclorofórmio: álcool isoamílico (25:24:1), e depois uma vez com clorofórmio:álcool isoamílico (24:1). O DNA foi precipitado em etanol e ressuspenso em tampão de TE. Este fragmento foi depois ligado em pBluescript Il SK+, também digerido com Sad e H/ndlll, em uma razão de inserção para vetor de 3: 1. A reação de ligação foi transformada em XL1 -BIue de E coli através de eletroporação, e banhada em 1M de placas de ágar contendo 100 pg/ml de ampicilina. Colônias de transfor- mante simples foram tríadas isolando o DNA de plasmídeo usando Iise alcalina, digerindo o DNA com BamVW e subseqüentemente analisando os fragmentos através de eletroforese em gel de agarose.

MUTAGÊNESE LOCO-DIRIGIDA (SDM)

DNA do gene de glnA do tipo selvagem em pAlter-1 foi isolado de JM109 de E. coli usando o Kit de Qiagen Midi Prep. Os oligonucleotídeos proje- tados para realizar a mutagênese do gene de glnA usando este sistema estão listados na Tabela 4. Mutações silenciosas incorporando um sítio de restrição para facilitar a triagem primária para a mutação foram embutidas para os oligo- nucleotídeos de SDM. Estes são também mostrados na Tabela 4.

TABELA 4. MUTAÇÕES REALIZADAS NO GENE DE glnA DE E. coli USANDO O SISTEMA DE ALTERED SITES®. AS MUTAÇÕES PARA ALTERAR OS RE- SÍDUOS DE AMINOÁCIDO ESTÃO MOSTRADAS EM NEGRITO E OS SÍTIOS DE RESTRIÇÃO ESTÃO SUBLINHADOS.

<table>table see original document page 48</column></row><table> <table>table see original document page 49</column></row><table>

Seguindo mutagênese, colônias simples foram tríadas para a muta- ção de escolha isolando o DNA de uma cultura durante a noite, e executando análise de restrição com a enzima para a mutação particular sendo tríada.

EXPRESSÃO DE GENE MUTANTE

Genes mutantes foram isolados dos clones de pAlter-1 através de digestão com Sad e HincAW. Os digestos foram depois submetidos à eletroforese em gel de agarose para separar o vetor e inserir as bandas. A banda contendo os genes foi excisada do gel e o DNA extraído usando fenol como descrito acima.

pBluescript II SK+ foi digerido com Sacl e HindIII, e cada gene mu- tante foi depois ligado neste vetor em uma razão de inserção:vetor de 3:1. A rea- ção de ligação foi transformada na cepa auxotrófica de glutamina sintetase YMC11 de E coli por eletroporação e os transformantes foram selecionados em LM Ágar suplementado com 50 pg/ml de ampicilina.

As colônias simples obtidas nas placas de transformação foram submetidas a um procedimento de triagem usando PCR usando os preparadores universais M13/F e M13/R. Neste procedimento, as colônias simples foram res- suspensas em 20 μl de água destilada. 1 μl desta suspensão de colônia foi adi- cionado a uma reação de PCR contendo 2,5 μl de cada preparador (2,5 pmol/μl), 2 μl de 2,5 mM de dNTP, 2,5 μl de 10X tampão, 2 μl de 25 mM de MgCI2 e 0,1 μl de Taq polimerase (0,5 u). Ciclos de PCR foram realizados como descritos acima. Os produtos de PCR foram subseqüentemente separados através de eletrofore- se em gel de agarose, e os transformantes positivos selecionados em base do tamanho de banda correto. Um controle positivo e um controle negativo foram incorporados no processo para verificar os resultados obtidos.

CONFIRMAÇÃO DE MUTAÇÃO

Seqüenciação para confirmar cada mutação foi terceirizada. Prepa- radores gene-específicos diretos e reversos da seqüência conhecida do gene foram projetados para este propósito. Estes estão mostrados na Tabela 5.

TABELA 5 - PREPARADORES SEQÜÊNCIA-ESPECÍFICOS USADOS PARA CONFIRMAR A PRESENÇA DAS VÁRIAS MUTAÇÕES NO GENE DE glnA de E.coli

<table>table see original document page 50</column></row><table> MUTAGÊNESE DE QuikChange®

DNA dos modelos selecionados (construções de pBluescript) foram isolados de XL1 -BIue de E. coli usando o kit Qiagen MidiPrep. Os oligonucleotí- deos projetados para realizar a SDM usando este sistema estão listados na Ta- bela 6. Como este é um sistema com base em PCR1 dois oligonucleotídeos (sense e antissense) são requeridos para cada reação. TABELA 6. MUTAÇÕES REALIZADAS NO GENE DE glnA DE E. coli USANDO O SISTEMA DE QuikChange®. AS MUTAÇÕES PARA ALTERAR OS RESÍ- DUOS DE AMINOÁCIDO ESTÃO MOSTRADAS EM NEGRITO E OS SÍTIOS DE RESTRIÇÃO ESTÃO SUBLINHADOS.

<table>table see original document page 51</column></row><table>

Seguindo mutagênese, colônias simples foram triadas para a muta- ção de escolha isolando o DNA de uma cultura durante a noite, e executando análise de restrição com a enzima para a mutação particular sendo tríada. Os mutantes positivos obtidos com o Sistema de QuikChange foram transformados em YMC11 de E coli para propósitos de expressão. Seqüenciação para confir- mar cada mutação foi terceirizada. D50A e E129A foram seqüenciadas usando GInSeq 5 e GInSeq 6. E357A foi seqüenciado usando GInSeq 9 e GInSeq 10.

RESULTADOS

CLONAGEM DO GENE DE GLUTAMINA SINTETASE DE E coli

O gene de glnA do tipo selvagem de E coli foi amplificado como um fragmento de 2,1 kb, codificando uma proteína de 471 aminoácidos em compri- mento. O gene de glnA amplificado de PCR de 2124 pb contendo os sítios de restrição de flanqueamento de Nsil foi ligado no vetor de SDM pAlter-1 de digeri- do com Psfl em uma razão de inserção:vetor de 3:1. O DNA foi isolado de vários transformantes e submetido à análise de restrição usando BamYW e EcoRI. De acordo com a seqüência conhecida do gene e do vetor, restrição de uma cons- trução (com o gene de glnA na orientação correta de 5' para 3' requerida) com BamH\, deveria produzir fragmentos de 6012 pb e 1797 pb. Uma construção cor- reta foi identificada desse modo, e foi nomeada pGln12.

Para construção do modelo do tipo selvagem para a mutagênese usando o Sistema de QuikChange, o gene de glnA foi excisado de pGlnl2 como um fragmento de Sac\-HindiU, e ligado em pBluescript Il SK+ similarmente digeri- do em uma razão de inserção:vetor de 3:1. A reação de ligação foi transformada em XLI-BIue de E coli e banhada em ágar de LM suplementada com 100 pg/ml < de ampicilina, 80 pg/ml de X-Gal e 1 mM de IPTG. O DNA foi isolado de várias colônias brancas e submetidas à análise de restrição com Sacl e HincAW e BamW para identificar um subclone positivo. Um construto correto foi identificado desse modo e nomeado pBSK-ECgln. Análise de seqüência foi executada em ambos os clones para verificar a integridade do gene do tipo selvagem antes de qual- quer SDM fosse realizada. MUTAGÊNESE LOCO-DIRIGIDA (SDM) Sistema de Altered Sites®

A mutagênese dirigida foi realizada de acordo com o protocolo des- crito acima. DNA isolado dos mutantes foi digerido usando a enzima específica para a mutação, e fracionada em tamanho para confirmar a presença da muta- ção. A presença da mutação em geral resultou em fragmentos extras, enquanto os sítios de restrição eram adicionados. Em todos os casos, o construto do tipo selvagem (pGlnl2) foi digerido com a mesma enzima que um controle comparati- vo. As mutações com seus respectivos sítios de restrição introduzidos e tama- nhos de fragmento esperados são esboçadas na Tabela 7.

TABELA 7. LISTA DE MUTAÇÕES INTRODUZIDAS EM pGlnl2 COM O SIS- TEMA DE ALTERED SITES®, MOSTRANDO OS FRAGMENTOS DE RESTRI- ÇÃO ESPERADOS.

<table>table see original document page 53</column></row><table> <table>table see original document page 54</column></row><table>

Eletroforese em gel de agarose confirmou a presença das mutações, como esperado. Tamanhos de fragmento de DNA foram obtidos.

Uma vez que estas nove mutações simples tinham sido confirmadas, os mutantes duplos foram produzidos. Em cada caso, a mutação de Y397V foi adicionada cada um de S52A, S53A, S52A S53A, H210V e H211V para produzir S52A Y397V, S53A Y397V, S52A S53A Y397V, H210V Y397V e H211V Y397V, respectivamente. As mutações com seus respectivos sítios de restrição introdu- zidos e os tamanhos de fragmento esperados são esboçados na Tabela 8.

Tabela 8. Lista de mutações introduzidas em Y397V com o Sistema de Altered Sites, mostrando os fragmentos de restrição esperados.

<table>table see original document page 54</column></row><table> <table>table see original document page 55</column></row><table>

Eletroforese em gel de agarose confirmou a presença das mutações, como os tamanhos de fragmento de DNA esperados foram obtidos.

EXPRESSÃO DE GENE MUTANTE

Genes mutantes (de pAlter) foram subclonados em pBluescript II SK+ e transformados em YMC11 de E. coli, para facilitar purificação de proteína e estudos de enzima. A presença dos genes subclonados no vetor foi confirmada através de triagem de PCR. Colônias de transformante contendo os genes de glnA mutante foram detectadas como uma banda de 2170 pb em um gel de aga- rose. Um controle negativo que consiste no vetor transformado em YMC11 de E coli foi incluído nas triagens de PCR, e apareceu no gel como uma banda no ta- manho do vetor sítio de clonagem múltiplo. Um controle positivo de DNA de pBSK-ECgln, também em YMC11 de E coli, foi incluído. Este apareceu no gel como uma banda no mesmo tamanho como quaisquer subclones positivos mu- tantes. O DNA de um subclone simples de cada mutante desse modo identifica- do foi depois digerido com a enzima de restrição específica para a mutação para confirmar a presença da mutação específica.

Tabela 9. Esboço dos fragmentos de restrição esperados dos subclones de glnA mutantes.

<table>table see original document page 56</column></row><table> <table>table see original document page 57</column></row><table> <table>table see original document page 58</column></row><table>

Eletroforese em gel de agarose confirmou a presença das mutações nos subclones, como os tamanhos de fragmento de DNA esperados.

MUTAGÊNESE DE QuikChange®

SDM usando o Sistema de QuikChange® foi realizada acima con- forme o protocolo exposto. DNA foi isolado dos possíveis mutantes, digeridos usando a enzima específica para a mutação, e fracionado em tamanho para con- firmar a presença da mutação. Um controle que consiste no modelo de origem foi digerido com a mesma enzima que um controle comparativo. As mutações com seus respectivos sítios de restrição e tamanhos de fragmento esperados são es- boçados na Tabela 10. pBSK-ECgln foi usado como o modelo para as mutações de D50A, E129A e E357A. Os mutantes duplos D50A Y397V, E129A Y397V, E327V Y397V e E357A Y397V foram produzidos em pBSK-Y397V.

Tabela 10. Lista de mutações introduzidas em vários modelos com o Sistema de QuikChange, mostrando os fragmentos de restrição esperados.

<table>table see original document page 59</column></row><table> <table>table see original document page 60</column></row><table>

Eletroforese em gel de Agarose confirmou a presença das mutações, como os tamanhos de fragmento de DNA esperados foram obtidos. CONCLUSÃO

Todas as mutações desejadas foram de forma bem-sucedida pro- duzidas usando os sistemas de mutagênese dirigida selecionados. Mutações silenciosas que codificam sítios de restrição foram incluídas nos oligonucleotí- deos projetados para a mutagênese. Isto permitiu triagem primária sem a neces- sidade de seqüenciar todo mutante potencial.

As mutações a seguir foram produzidas no gene de glutamina sinte- tase de £ colr. Y397V, S52A, S52A Y397V, S53A, S53A Y397V, S52A S53A, S52A S53A Y397V, H210V, H210V Y397V, H211V, H211V Y397V, D50A, D50A Y397V, E129A, E129A Y397V, E327V, E327V Y397V, E357A e E357A Y397V.

Exemplo 3 - Estudos de Complementação e Purificação das Enzimas Glutamina Sintetase

Mutantes foram construídos para alterar os resíduos acreditados estar envolvidos nas tríades catalíticas proteolíticas descritas acima. Estes foram os resíduos de serina S52 e S53, os resíduos de histidina H210 e H211, como também D50, E129, E327 e E357. Todos os mutantes construídos foram testa- dos por complementação da auxotrofia de glutamina sintetase em YMC11 de E coli.

As várias enzimas de glutamina sintetase mutantes recombinantes foram purificadas usando uma combinação de precipitação de sulfato de estrep- tomicina, alteração de pH e precipitação de sulfato de amônio, até que uma pre- paração de enzima pura fosse alcançada. Um método de cromatografia de colu- na de afinidade foi também desenvolvido e usado para purificar certas enzimas.

Dois ensaios de enzima foram utilizados para avaliar a atividade de glutamina sintetase. O primeiro ensaio usado, denominado o ensaio de γ-glutamil transferase, é uma variação do contrário da reação que glutamina sintetase cata- lisa:

Glutamato + NH4+ + ATP glutamina + ADP + Pi + H2O

Nesta reação reversa, hidroxilamina e glutamina reagem para formar ɣ-glutamilidroxamato e amônia livre na presença de ADP, arsenato e manganês ou magnésio (Shapiro BMe Stadtman E R (1970) Methods in Enzymol. 17A: 910-922). Esta forma a base de um ensaio para atividade de glutamina sintetase. No pH correto, que é derivado de determinar o ponto isoelétrico da enzima, as atividades de transferase das formas adenililada e desadenililada de glutamina sintetase são as mesmas. Porém, as duas formas podem ser distinguidas por- que no ponto isoelétrico, glutamina sintetase completamente adenililada é com- pletamente inibida por 60 mM Mg2+, enquanto que a enzima desadenililada não é afetada.

Além disso, a taxa de conversão de ATP, glutamato e amônia para glutamina e ADP foi avaliada usando HPLC. O é denominado a reação 'direta' e 'biossintética' e é ensaiada em dois ensaios diferentes; um que mede a habilida- de de glutamina sintetase para converter glutamato em glutamina na presença de ATP, e o segundo determina a conversão de ATP em ADP e AMP na mesma mistura de ensaio. MÉTODOS E MATERIAIS

Todas as químicas foram do tipo de biologia analítica ou molecular e foram usadas sem outra purificação. Todas as químicas foram obtidas de Merck ou Sigma a menos que do contrário declarado. Mn(HCOa)ATP foi preparada em casa de Na2ATP (obtida de Roche) que foi dissolvida ém água a uma concentra- ção de aproximadamente 80 mm. Os íons de Na+ foram depois removidos da ATP passando a solução em uma resina de permuta de cátion forte Dowex 50 WX2. Todas as amostras contendo o ácido-ATP foram agrupadas e reagidas com uma concentração molar equivalente de Mn(HCOs). A solução foi agitada até que todo o MnCO3 tivesse dissolvido. O pH da solução de Mn(HCO3)-ATP foi depois ajustado em pH 7,0 com NaHCO3.

SDS-eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) foi realizada de acordo com os protocolos padrão (Laemmli U K (1970) Nature 227: 680-685).

Acrilamida foi comprada de Sigma como uma mistura de 40 % de Acrilamida:bis-acrilamida (razão de 19:1). O marcador de peso molecular de pro- teína de faixa ampla de Sigma foi usado para todos os géis de PAGE. COMPLEMENTAÇÃO DA AUXOTROFIA DE GLUTAMINA EM YMC11 DE E coli

Colônias simples de cada uma das construções de glutamina sinte- tase recombinante mutante em pBluescript Il SK na cepa auxotrófica de E coli YMC11 foram colocadas em placa em Meio Mínimo de M9 (Sambrook, J., Fritsch, E. F. e T. Maniatis (1989) Em: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2- ed. Cold Spring Habor Laboratory Press), para avaliar sua habilidade para comple- mentar a auxotrofia de YMC11 de E coli. Glutamina, a uma concentração de 250 mg/l, foi adicionada a uma placa, e uma placa duplicada não continha nenhuma glutamina. Ampicilina foi adicionada a ambas as placas a uma concentração de 100 Mg/ml. YMC11 de E coli transformado com pBluescript Il SK+ não- recombinante foi usado como um controle negativo. A construção do tipo selva- gem recombinante, pBSK-ECgln foi usada como o controle positivo. As placas foram incubadas a 37°C e observadas em um período de 48 horas para a pre- sença ou ausência de crescimento.

PURIFICAÇÃO DA GLUTAMINA SINTETASE DE E. coli Todas as construções recombinantes usadas para o isolamento de GS foram cultivadas em 2 L de um meio de M9 modificado (6 g/l de Na2 HPO4, 3 g/l de KH2PO4, 0,5 g/l de NaCl) suplementado com 70 mM de L-glutamato, 5 mM de L-glutamina e 100 pg/ml de ampicilina. Todas as culturas foram incubadas a 37°C durante 48 horas com agitação a 220 rpm. As células foram colhidas do meio de cultura através de centrifugação a 10 000 rpm a 4°C. A biomassa foi depois usada fresca ou armazenada a -20°C até ser usada.

Além disso, a glutamina sintetase do tipo selvagem (de pBSK-ECgln) foi purificada nas formas adenililada e desadenililada, da biomassa obtida da cul- tura contínua sendo realizada como parte de outra investigação. Enzima adenili- lada foi produzida sob condições de limitação de nitrogênio e excesso de carbo- no, enquanto enzima desadenililada foi produzida sob condições de excesso de nitrogênio e limitação de carbono (Sênior P J (1975) Journal of Bacteriology 123: 407-418). As células obtidas foram colhidas através de centrifugação a 10 000 rpm durante 10 minutos a 4°C, e armazenadas a -20°C até requerido. O método usado para a purificação de glutamina sintetase foi desenvolvido do método de Shapiro BMe Stadtman E R (1970) Methods Enzymol. 17A: 910-922.

A biomassa foi ressuspensa em 10 ml de Tampão de Ressuspen- são A ou RBA (10 mM de Imidazol-HCl, 2 mM de β-mercaptoetanol, 10 mM de MnCl2.4H20; pH 7,0). As células foram sonicadas durante 10 minutos em um ciclo de trabalho de 50%. Esta solução sonicada foi centrifugada durante 10 mi- nutos a 10 000 rpm, e o sobrenadante foi retido. Sulfato de estreptomicina foi adicionado (10% de uns 10% p/v), e a suspensão foi agitada a 45C durante 10 minutos. Centrifugação foi depois realizada a 10 000 por 10 minutos e o subre- nadante foi retido. O pH do sobrenadante foi ajustado em 5,15 com ácido sulfúri- co. Esta mistura foi agitada a 4eC durante 15 minutos, e depois centrifugada a 13 000 rpm durante 10 minutos. Novamente, o sobrenadante foi retido. Sulfato de amônio saturado (30% de volume) foi adicionado e o pH foi ajustado em 4,6 com ácido sulfúrico. A suspensão foi agitada a 4°C durante 15 minutos, e depois cen- trifugada a 13 000 rpm durante 10 minutos. O precipitado obtido foi ressuspenso em 2-5 mi de RBA e o pH ajustado em 5,7 com ácido sulfúrico. Esta suspensão foi agitada durante a noite a 4°C para permitir a glutamina sintetase ressuspen- der-se, e depois centrifugada a 13 000 rpm durante 10 minutos. O sobrenadante foi retido e o pH das suspensões foi ajustado em 7,0.

Purificação adicional das enzimas do tipo selvagem e de Y397V foi alcançada através do uso de cromatografia de afinidade usando um AKTAExplo- rer (Amersham Biosciences). Separação foi alcançada com resina de 5ΆΜΡ Se- pharose com uma coluna de HR10/10 tendo um comprimento de 10 cm e um diâmetro interno de 10 mm. A preparação da enzima de glutamina sintetase (a- proximadamente 2 min) foi carregada sobre a coluna preparada que foi equilibra- da com 10 mM de Imidazol (pH 7,0), 150 mM de NaCI e 10 mM de MnCI2.4H20. A glutamina sintetase ligada foi eluído da coluna com 2,5 mM de ADP ao longo de uns 40 ml de gradiente linear 150 a 500 mM de NaCI, e 1 ml de frações foi colhido. As frações contendo glutamina sintetase pura foram depois agrupadas e dialisadas durante a noite junto de RBA.

Uma alíquota de cada suspensão de proteína foi submetida à eletro- forese em um gel de SDS PAGE a 7,5% de acordo com os protocolos padrão. Concentração da proteína foi determinada usando o método de determinação de proteína Lowry.

ANÁLISE DE MALDI-TOF DAS PROTEÍNAS PURIFICADAS

Cada proteína mutante foi analisada usando espectroscopia de massa de MALDI-TOF. A banda de proteína desejada foi excisada de um gel a 7,5% de SDS PAGE (vias múltiplas foram operadas da mesma proteína para se obter proteína suficiente). As bandas desejadas foram excisadas do gel e colo- cadas em um tubo Eppendorf. Sessenta μl de uma solução de 75 mM de NH4(HCO)3 em 40% de etanol foram adicionados ao tampão de gel e submetidos à vórtice durante 30 minutos. O líquido foi removido e descartado. Este procedi- mento de destingi mento foi repetido até nenhum Coomassie blue permanecesse no tampão de gel. O tampão de gel foi depois coberto com acetonitrila, e incuba- do em temperatura ambiente por 15 min, seguindo isso todo o líquido foi removi- do do tubo deixando o tampão de gel. Volume suficiente de uma solução de 5 mM de ditiotreitol em 50 mM de bicarbonato de amônio foi depois acrescentado ao tubo para cobrir o tampão de gel e este foi incubado a 60°C durante 30 min. A suspensão foi depois centrifugada a 13 000 rpm durante 5 min em um microcen- trífuga Eppendorf, e o sobrenadante foi removido e descartado.

Dez μl de uma solução de 55 mM de Iodoacetamida em 50 mM de bicarbonato de amônio foram adicionados ao tampão de gel e incubados em temperatura ambiente por 60 min na escuridão. Seguindo incubação, a suspen- são foi centrifugada a 13 000 rpm durante 5 min e o sobrenadante foi removido e descartado. O tampão de gel foi coberto com 60 μl de acetonitrila, e esta suspen- são foi deixada repousar 10 min. Seguindo 5 min de centrifugação a 13 000 rpm, o sobrenadante foi descartado, e o tampão de gel foi secado em um Speedvac por 10 min.

Tripsina bovina recentemente preparada (5-20 μl) foi depois adicio- nada a uma concentração de 0,01 Mg/μl em 50 mM deNH4HC03. A quantidade adicionada é dependente da quantidade de gel no tubo Eppendorf. Este é incu- bado em gelo por 60 min. Após centrifugação breve, o sobrenadante foi removido e 10 μl de 50 mM de NH4HCO3 foram adicionados ao tampão de gel. Este foi incubado a 37-C durante a noite.

A amostra foi depois sonicada por 10 min em um banho de sonica- ção e o sobrenadante restabelecido após centrifugação em uma microcentrífuga Eppendorf durante 5 min. Dez μl de um ácido tri-fluoroacético (TFA) / solução de acetonitrila (50% de 2% TFA e 50% de acetonitrila) foram adicionados e a amos- tra foi sonicada novamente por 10 min. Após centrifugação, sobrenadante se restabeleceu. Acetonitrila (10 μl) foi adicionada e a amostra submetida a vórtice por 10 min. A amostra foi centrifugada a 13 000 rpm durante 5 min e o sobrena- dante retido. Volumes iguais da amostra de proteína preparada e uma solução a 10 mg/ml de ácido cinâmico de alfa-ciano hidroxila em 01% de TFA em acetoni- trila foram depois combinados. Estes foram vigorosamente misturados, e 1 μl da solução aplicada à placa de amostra. As proteínas foram depois analisadas por MALDI TOF MS.

DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE DE GLUTAMINA SINTETASE USANDO O ENSAIO DE GLUTAMIL TRANSFERASE

O ensaio de γ-glutamil transferase foi usado para medir a quantidade total de glutamina sintetase presente, uma vez que as formas adenililadas e de- sadenililadas da enzima são ativas neste ensaio na presença de Mn2+. Quando o mesmo ensaio é suplementado com 60 mM de Mg2+ apenas a atividade da en- zima desadenililada é determinada. As atividades das duas formas da enzima podem portanto ser diferenciadas em base da diferença na atividade na presen- ça de Mn2+ ou Mg2+. A mistura de ensaio foi adaptada de Shapiro Β. M. e Stadt- man E. R. (1970) Annual Reviews in Microbiology 24:501 -524.

Atividade de glutamina sintetase é medida em duas misturas de en- saio diferentes: uma contendo apenas Mn e uma segunda contendo Mn e Mg. Todos os reagentes foram preparados em Tampão de Imidazol (pH 7,0). Ambos os ensaios foram operados em um volume total de 600 μΙ. O ensaio de Mn foi estabelecido como mostrado na Tabela 11 abaixo.

TABELA 11. MISTURA DE ENSAIO PARA O ENSAIO DE G LUTAM IL TRANS- FERASE COM BASE EM Mn

<table>table see original document page 66</column></row><table>

O ensaio de combinação (Mn e Mg) foi estabelecido como mostrado na Tabela 12.

TABELA 12. MISTURA DE ENSAIO PARA O ENSAIO DE GLUTAMIL TRANS- FERASE COM BASE EM Mn E Mg

<table>table see original document page 66</column></row><table>

Uma reação em branco foi preparada da mesma maneira que a rea- ção de Mn1 mas substituindo as soluções de ADP e de arsenato com água. A mistura de ensaio foi equilibrada durante 5 min a 37QC, e depois iniciada pela adição de 50 μl de preparação de enzima. A reação foi deixada prosseguir duran- te 30 min, e depois terminada pela adição de 900 μΙ de mistura de tampão (1M de FeCI3.6H20, 0,2M de ácido tricloroacético e 7,1% v/v de HCI). As amostras foram depois centrifugadas a 13000 rpm durante 2 min em uma microcentrígua Eppendorf para remover qualquer precipitado que possa ter formado, e a absor- bância medida a 540 nm. Todas as leituras de absorbância foram entradas em uma planilha eletrônica, e os resultados apresentados como atividade específica em termos de μιτιοίε de enzima/min/mg de proteína. O grau de adenililação foi calculado da razão da atividade de γ-glutamil transferase desadenililada para a atividade de γ-glutamil transferase total (reação de Mn2+), levando em conta o número de subunidades.

DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE DE GLUTAMINA SINTETASE POR HPLC

Este ensaio foi fixado estabelecido para medir atividade de glutami- na sintetase de acordo com a reação direta, e mede a quantidade de glutamina formada de 4 milimols de L-glutamato na presença de MnHCO3-ATP (a base de uma reação) e MgATP (a base de uma segunda reação). Além disso, a quanti- dade de ADP formada é também medida em um ensaio separado, usando os mesmos reagentes. O ensaio de estabelecimento é mostrado na Tabela 13.

TABELA 13. COMPONENTES DE ENSAIO PARA O ENSAIO DE HPLC PARA DETERMINAR A TAXA DE CONVERSÃO DE GLUTAMATO E ATP PARA GLUTAMINA E ADP.

<table>table see original document page 67</column></row><table>

Todas as preparações da enzima foram estabelecida na mesma concentração de proteína, e adicionadas à mistura de ensaio em um volume de 50 μl. A adição da enzima iniciou a reação que foi depois deixada prosseguir du- rante 1 hora. A reação foi parada pela adição de 6 μΙ de uma solução a 50% de ácido tricloroacético. Cada ensaio foi depois aliquotado em 4 frascos de HPLC (150 μl por frasco) dois destes foram ensaiados para glutamato e glutamina u- sando uma Coluna de C18 de Phenomenex Luna de 5 μ em um instrumento de HPLC de Agilent 100. Os ensaios de ATP/ADP foram operados em uma coluna de Chromolith Performance RP-18c também usando um instrumento de HPLC de Agilent 100.

Como é acreditado que duas tríades catalíticas putativas, similares àquelas nas serina proteases, estejam envolvidas no mecanismo de reação de glutamina sintetase, certos mutantes foram também ensaiados por HPLC na pre- sença dos inibidores de serina protease, AEBSF e PMSF para avaliar o efeito que estes inibidores tiveram usando a enzima. As enzimas avaliadas foram a enzima de WT adenililada, a enzima de WT desadenililada, e as enzimas mutan- tes S52A, S52A Y397V, S53A, S53A Y397V, S52A S53A e S52A S53A Y397V. As enzimas foram pré-incubadas durante 60 minutos na presença de 1 mM de PMSF ou 1 mM de AEBSF. Uma reação de controle foi estabelecida para cada enzima que não continha nenhum inibidor. Cada enzima foi depois adicionada aos ensaios estabelecidos como descrito acima. O ensaio foi deixado prosseguir durante 60 minutos, depois parado pela adição de 6 ml de 50% de TCA após os quais eles foram analisados por HPLC. Ensaios de AU foram operados em tripli- cata.

RESULTADOS

ESTUDOS DE COMPLEMENTAÇÃO

Os constructos de gene de glutamina sintetase mutante foram cres- cidos em ágar de meio mínimo de M9 na presença e ausência de glutamina, e avaliados por sua habilidade para complementar a mutação de glnA de YMC11 de E. coli. Após 48 horas de incubação a 37°C, foi observado que enquanto o controle negativo (pBluescript II SK em YMC11) não pôde crescer na ausência de glutamina, o controle positivo (pBSK-ECgln) foi capaz de complementar a au- xotrofia em YMC1. Um problema que foi freqüentemente experimentado foi que 250 mg/l de glutamina parecem ser insuficientes para suportar o crescimento da cepa de YMC11, e portanto o vetor sozinho em YMC11 relutou em crescer. A presença de um gene funcional de glutamina sintetase de multicópia, como no controle positivo, ECgln, parece superar este problema. pBSK-Y397V, o cons- tructo desadenililado recombinante, foi também capaz de complementar a auxo- trofia de YMC11. A enzima de WT e a enzima de Y397V são portanto funcionais.

Os mutantes S52A e S53A como também os mutantes duplos, S52A Y397V e S53A Y397V, foram todos capazes de complementar a auxotrofia de YMC11 de E. coli, desse modo indicando funcionalidade. O mesmo foi encon- trado ser verdade para o mutante duplo de serina, S52A S53A, e sua contraparte, S52A S53A Y397V. Os dois mutantes de histidina, H210V e H211V, cresceram bem na placa mínima suplementada com glutamina, mas cresceram muito mal na placa que não continha nenhuma glutamina, desse modo indicando enzimas com pouca funcionalidade. Os mutantes de histidina duplos, H210V Y397V e H211V Y397V, por outro lado, cresceram muito mal até mesmo na placa suple- mentada com glutamina, e não nas placas que não continha nenhuma glutamina. Foi assumido, portanto, que estas duas enzimas não tiveram virtualmente ne- nhuma funcionalidade e que estas mutações criaram auxotrofia, com o resultado que elas têm um requerimento absoluto para glutamina.

Mutantes D50A e D50A Y397V exibiram crescimento bom em am- bas as placas, e são ambos funcionais. Porém, E129A e E357A não foram capa- zes de complementar a auxotrofia de YMC11, e ambos apresentaram crescimen- to muito fraco até mesmo na placa suplementada com glutamina. O mesmo apli- cou-se aos mutantes duplos, E129A Y397V e E357A Y397V. E327V e E327V Y397V exibiram crescimento bom em ambas as placas, e ambos têm enzimas de glutamina sintetase funcionais.

PURIFICAÇÃO DA GS DE E. coli

Para a purificação das proteínas mutantes, cada mutante foi cresci- do em um meio mínimo de M9 modificado suplementado com glutamato como a fonte de nitrogênio exclusiva. Uma quantidade pequena de glutamina foi adicio- nada para facilitar o crescimento celular, como a cepa de YMC11 é um auxotrofo de glutamina.

Todas as culturas foram crescidas durante 48 horas a 37SC, e de- pois verificadas para contaminação. Integridade de plasmídeo recombinante foi verificada isolando o DNA de plasmídeo, submetendo-o à análise de restrição, seguido por eletroforese em gel de agarose.

Foi descoberto que algum dos mutantes duplos, a saber H210V Y397V, H211V Y397V e E357A Y397V requereram a adição de 10 nM de gluta- mina ao meio mínimo para adquirir biomassa suficiente para permitir purificação da enzima, como o crescimento foi tão fraco. Enzima de glutamina sintetase foi de forma bem-sucedida purificada em pelo menos 90% homogeneidade de todos os mutantes. Em todas as circunstâncias, a presença de glutamina sintetase puri- ficada foi demonstrada como a presença de uma banda simples em aproxima- damente 55 kDa.

VERIFICAÇÃO DE GLUTAMINA SINTETASE PURIFICADA

Todas as enzimas de glutamina sintetase mutantes purificadas fo- ram submetidas à análise de MALDI TOF para verificar que as enzimas eram glutamina sintetase. Cada enzima foi operada em um gel a 7,5% de SDS-PAGE e as bandas esperadas ser glutamina sintetase foram cortadas e a proteína foi purificada como descrito. Amostras de proteínas purificadas foram pipetadas so- bre uma placa de amostra, e submetidas à análise por espectroscopia de massa de MALDI TOF. As proteínas foram depois identificadas usando proteômicos e ferramentas de análise de seqüência e entrando os valores obtidos na base de dados do servidor ExPASy Proteomics do Swiss Institute of Bioinformatics. To- das as proteínas isoladas foram identificadas como glutamina sintetase desta maneira.

ENSAIOS DE GLUTAMIL TRANSFERASE

Cada mutante foi avaliado para atividade usando a reação de γ- glutamil transferase ou "reversa". Isto determina a presença de um complexo férrico-hidroxamato em um ensaio colorimétrico em que a absorbância é lida a 540 nm. O ensaio determina a atividade da enzima total em uma reação conten- do Mn2+. Além disso, o grau de adenililação da enzima de glutamina sintetase sendo triada é também determinado em uma reação contendo Mn2+ e Mg2+, co- mo a forma adenililada da enzima é inibida na presença de Mg2+ (Shapiro BMe Stadtman E R (1970) Annual Reviews in Microbiology 24: 501-524; Bender R A, K A Janssen, A D Resnick, M Blumberg, F Foor e B Magasanik (1977) Journal of Bacteriology 129:1001-1009). Desse modo, o grau de adenililação da enzima de glutamina sintetase pode ser determinado. Os resultados dos ensaios estão mos- trados na Tabela 14, com as atividades da enzima mostradas em pmols por mi- nuto por mg de proteína.

TABELA 14. RESULTADOS DO ENSAIO DE GLUTAMIL TRANSFERASE DOS MUTANTES WT DE E. coli E CONSTRUÍDOS. A ENZIMA DE WT REFERE-SE À CEPA CRESCIDA NO MEIO DE M9 MODIFICADO, E A WT (AD) E WT (DD) REFEREM-SE ÀS ENZIMAS ADENILILADAS E DESADENILILADAS, RES- PECTIVAMENTE, PRODUZIDAS EM CULTURA CONTÍNUA. OS VALORES APRESENTADOS REPRESENTAM A MÉDIA DE PELO MENOS TRÊS EN- SAIOS ONDE A VARIAÇÃO NA ATIVIDADE FOI MENOS QUE 10%.

<table>table see original document page 71</column></row><table> <table>table see original document page 72</column></row><table>

A enzima de WT crescida da mesma maneira como os mutantes em um meio de M9 modificado (WT na tabela), é em grande parte na forma adenili- lada como a maioria da atividade é inibida aproximadamente 4 vezes de 91 a 20 pmols/min/mg de proteína, na presença de Mg2+, dando uma porcentagem de adenililação de 78%. A mesma porcentagem de adenililação é vista na cepa de WT crescida sob condições de cultura contínuas de excesso de N e limitação de C onde a glutamina sintetase seria predominantemente adenililada (WT (AD) na Tabela). A enzima de WT, crescida em cultura contínua com limitação de N e excesso de C, deveria ser na forma desadenililada (WT (DD) na Tabela) e esta é refletida nos resultados de ensaio. As atividades específicas para esta cepa par- ticular são quase idênticas no ensaio operando na presença de Mn2+ apenas (55,8), que na presença de Mn2+ e Mg2+ (56,1), dando, como seria esperado, uma porcentagem de adenililação de 0.

A enzima mutante, Y397V, foi esperada estar na forma desadenilila- da, visto que o Tyr397 foi substituído por um resíduo de valina. O mutante mos- trou uma atividade total muito alta de 64,5 pmols/min/mg de proteína, mas não parece ser desadenililada; a porcentagem de adenililação apareceu de fato ser mais alta, visto que a atividade na presença de Mn2+ e Mg2+ (5,1) é muito inferior que aquela detectada na presença de Mn2+ apenas (64,5), resultando em uma porcentagem de adenililação de 92%. Isto poderia ser devido ao fato que a ade- niltransferase é incapaz de adenililar ou desadenililar o resíduo de valina, resul- tando em uma enzima de glutamina sintetase que é impropriamente dobrada. É postulado que, os eventos de adenililação e desadenililação realizados pela ade- niltransferase requerem dobramento específico da alça de glutamina sintetase, pela adeniltransferase, em uma qualquer uma das duas conformações requeri- das para cada estado da enzima, com o efeito estérico dos grupos adenina que facilitam o dobramento da enzima na conformação correta. A enzima mutante Y397V pode, portanto, ter uma conformação de alça similar para a forma adenili- lada da enzima, visto que a adeniltransferase não teria dobrado a alça de Y397 na conformação "correta" requerida para desadenililação. A forma adenililada desta enzima, portanto, pode tender a ser a estrutura predefinida.

Os dois resíduos de serina, 52 e 53, foram alterados isoladamente em duas cepas mutantes e ambas destas mutações resultaram em uma redução da atividade de γ-glutamil transferase total, para 35,5 e 47,8 pmols/min/mg de proteína, respectivamente, indicando que estes resíduos são essenciais para atividade catalítica. Isto foi reforçado pela mutagênese que alterou ambos os re- síduos de serina a alanina, resultando em um dobramento mutante, S52A S53A. Neste mutante, a atividade de γ-glutamil transferase foi reduzida severamente para 7,2 μιτιοΙβ/Γηίη/π^ de proteína. Alterando os resíduos de serina cada um separadamente, juntamente com a mutação de Y397V, para produzir S52A Y397V e S53A Y397V, resultou em um aumento na atividade de Mn2+ sobre a- quela vista nos dois mutantes de serina individual, para níveis comparáveis com a enzima de WT (78,6 e 86,2 pmols/min/mg de proteína). A porcentagem de a- denililação em S52A e S52A Y397V é similar à obtida para o WT (toda na região de 75-80%). Alterando os resultados de S53 em uma redução da porcentagem de adenililação para 60-65% em ambos os mutantes (S53A e S53A Y397V), in- dicando possivelmente que S53 é um resíduo importante para desadenililação. Alterando ambos os resíduos de serina simultaneamente, resultando em S52A S53A, resultando em uma redução grande em atividade de γ-glutamil transferase para 7,2 pmols/min/mg de proteína. Quando o mutante triplo, S52A S53A Y397V foi ensaiado, alguma atividade de γ-glutamil transferase foi restabelecida (29,9 pmols/min/mg de proteína), mas esta atividade ainda foi menor que aquela obtida nas cepas de WT. Este pareceria indicar que, como suspeitado, estes resíduos de serina representam um papel importante na enzima de glutamina sintetase.

Se estes resíduos de serina representassem um papel catalítico si- milar aos resíduos de serina que compõem a tríade catalítica em serina protease, esperaria-se que a mutação de serina dupla (S52A S53A) criasse uma enzima não-funcional, a menos que outro mecanismo de reação esteja disponível para esta enzima ou o papel que elas representassem na "reação reversa" ou reação de γ-glutamil transferase pudesse ser puramente estrutural e não catalítico, isto é, a reação de glutamil transferase não fosse por meio de um intermediário de acila nos resíduos de serina.

Os dois resíduos de histidina identificados como potencialmente for- mando parte de uma tríade catalítica, provado ser crucial para a atividade catalíti- ca da enzima. H210V exibiu uma quantidade muito pequena de atividade depen- dente de Mn2+ de glutamil transferase (2,8 pmols/min/mg de proteína) que não diminuiu em nada no mutante duplo H210V Y397V. Nenhum mutante de H211V apresentou qualquer atividade. H210V foi completamente adenililada (porcenta- gem de adenililação de 100%). Quando à habilidade para adenililarou desadeni- lilar esta enzima foi removida no mutante duplo H210V Y397V, nenhuma ativida- de foi obtida.

Os quatro resíduos identificados como sendo potencialmente o resí- duo de ácido da tríade catalítica, isto é, D50A, E129A, E328V e E357A, todos mostraram quantidades variadas de atividade. D50A e D50A Y397V mostram uma quantidade pequena de atividade de γ-glutamil transferase total (1,28 e 1,78 pmols/min/mg de proteína, respectivamente), mas mostram graus diferentes de adenililação. E129A mostra uma quantidade pequena de atividade (2,38 pmols/min/mg de proteína) que aumenta para 12,06 pmles/min/mg de proteína no mutante duplo E129A Y397V. Nenhum dos mutantes E328V, E328V Y397V, E357A e E357A Y397V exibem muita atividade de γ-glutamil transferase, a quan- tidade mais alta sendo 3,3 pmols/min/mg de proteína mostrada por E357A. Am- bos os mutantes de E357A mostraram 0% de adenililação, embora esta esteja fora de uma base de atividade muito baixa. Como observado na literatura, estes quatro resíduos são importantes para atividade catalítica visto que a introdução das mutações resultou em uma redução na atividade em todas as circunstâncias (Liaw S-H, C Pan e D Eisenberg (1993a) Proceedings of the National Academy of Sciences 90: 4996-5000; Liaw S-H e D Eisenberg (1994a) Biochemistry 33: 675-681; Alibhai MeJJ Villafranca (1994) Biochemistry 33: 682-686,) ENSAIOS DE HPLC

Além dos ensaios de γ-glutamil transferase, os ensaios foram tam- bém desenvolvidos para medir a taxa de conversão de ATP e glutamato para ADP e glutamina por HPLC. Estes foram estabelecidos como ensaios simples, mas analisados separadamente para glutamato e glutamina e ATP e ADP. As taxas de conversão para glutamato para glutamina, tanto na presença de Mn2+ como Mg2+ através de glutamina sintetase, são referidas como a atividade espe- cífica com base em glutamina com base em glutamina e são apresentadas em pmols/min/mg de proteína. As taxas de conversão para ATP para ADP, tanto na presença de Mn2+ como Mg2+ através de glutamina sintetase, são referidas como a atividade específica com base em ADP e são apresentadas em pmols/min/mg de proteína. A porcentagem de conversão foi também calculada dividindo a ativi- dade específica baseada em glutamina pela atividade específica baseada em ADP, e este valor é interpretado como a habilidade da enzima para completar ambas as etapas da reação, isto é, glutamato para glutamina e ATP para ADP, em um nível equivalente de eficiência.

A enzima de WT crescida no meio mínimo mostra atividades especí- ficas com base em glutamina e ADP similares (1,3058 e 1,3651 pmols/min/mg de proteína, respectivamente) e uma taxa de conversão de 100%.

A enzima de WT crescida sob condições de limitação de nitrogênio e excesso de carbono para adenililada mostra níveis toem parecidos de atividade nos ensaios de Mn e Mg e tem uma taxa de conversão de 100%. A enzima de WT crescida sob condições de excesso de nitrogênio e limitação de carbono pa- ra ser desadenililada foi mais ativa nos ensaios de Mg (0,4412 pmols/min/mg de proteína no ensaio de glutamina e 0,4537 pmols/min/mg de proteína no ensaio de ADP) que nos ensaios de Mn (0,1425 pmols/min/mg de proteína no ensaio de glutamina e 0,1409 pmols/min/mg de proteína no ensaio de ADP). Os ensaios de Mn e Mg mostraram uma porcentagem de conversão perto de 100%. Como a enzima desadenililada deveria exibir mais atividade de Mg que a enzima adenili- lada, este resultado seria esperado.

A enzima de Y397V é mais ativa nos ensaios de Mn2+ que nos en- saios de Mg2+, com taxas de conversão de apenas 50%. Esta eficiência de con- versão baixa é possivelmente devido ao dobramento incorreto da alça flexível de Tyr397 que produz um sítio ativo que contém água não-ligada. Este água pode depois atuar como o nucleófilo, reagindo com o intermediário de fosfato de glu- tamila altamente instável que o converte de volta para glutamato e PO4, criando a ineficiência. Além disso, como postulado que a adenililação da enzima pela ade- niltransferase requer a adenililação do alça flexível de Tyr397, e a conformação específica desta alça é induzida pelos efeitos estéricos dos grupos adenina, facili- tando o dobramento da enzima na conformação correta.

S52A e S52A Y397V são ambos muito ativos e mostram mais ativi- dade de glutamina sintetase que as enzimas de WT triadas. S52A produziu ní- veis de atividade similares em ambos os ensaios de Mn e Mg com base em glu- tamina e ADP (na região de 2,0 a 2,8 pmols/min/mg de proteína), com uma por- centagem de conversão de 91% para os ensaios de Mn e 85% para os ensaios de Mg. S52A Y397V, por outro lado foi mais ativo que S52A produzindo uma ati- vidade específica de Mn baseada em glutamina de 5,366 pmols/min/mg de prote- ína e uma atividade específica de Mn baseada em ADP de 6,2410 Mmols/min/mg de proteína. Esta foi equivalente a uma taxa de conversão de 91%. Os ensaios de Mg deram uma atividade específica de Mg baseada em glutamina de 5,3063 pmols/min/mg de proteína e um atividade específica de Mg baseada em ADP de 7,6781 pmols/min/mg de proteína, representando uma conversão de porcenta- gem de €9%.

S53A produziu níveis de atividade ligeiramente mais altos que aque- les produzidos nas cepas de WT - 5,80 pmols/min/mg de proteína para o ensaio com base em glutamina de Mn2+, 6,36 pmols/min/mg de proteína para o ensaio com base em ADP de Mn2+, 4,88 pmols/min/mg de proteína para o ensaio com base em glutamina de Mg2+ e 6,96 pmols/min/mg de proteína para o ensaio com base em ADP de Mg2+. Estas representaram taxas de conversão de 91% e 70%, respectivamente. Os níveis de atividade encontrados para S53A Y397V foram significativamente mais altos que aqueles encontrados nas cepas de WT. As ati- vidades de Mn2+ aumentaram para 15,45 para o ensaio baseado em glutamina e 21,32 pmols/min/mg de proteína para o ensaio baseado em ADP. As atividades de Mg2+ foram 10,66 pmols/min/mg de proteína para o ensaio baseado em glu- tamina e 15,42 pmols/min/mg de proteína para o ensaio baseado em ADP.

S52A S53A não foi tão ativo quanto os dois mutantes de S53A. Ele produziu atividades de Mn de 2,2873 pmols/min/mg de proteína para o ensaio de glutamina e 2,5904 pmols/min/mg de proteína para o ensaio de ADP, com uma porcentagem de conversão de 88%. A enzima, porém, não exibiu a habilidade para converter ATP diretamente em AMP na presença de Mn, com uma ativida- de específica de 0,3858 pmols/min/mg de proteína sendo obtida para a conver- são de ADP a AMP. S52A S53A exibiu níveis de atividade de Mg muito inferiores — 0,9094 pmols/min/mg de proteína para o ensaio de glutamina e 1,2676 pmols/min/mg de proteína para o ensaio de ADP. Esta atividade inferior pode estar ocorrendo no sítio ativo atribuído à forma adenililada da enzima. As enzi- mas capazes de converter ATP a AMP puderam sintetizar glutamina de ADP (dados não mostrados).

Quando a mutação de S52A S53A foi combinada com a mutação de Y397V, os níveis de atividade de Mn aumentaram comparados ao mutante de S52A S53A (para 3,095 pmols/min/mg de proteína para o ensaio de glutamina e 4,5381 pmols/min/mg de proteína para o ensaio de ADP). As atividades específi- cas de Mg com base em glutamina e ADP para este mutante triplo, porém, dimi- nuiu bastante significativamente para 0,1075 e 0,2986 pmols/min/mg de proteína. Novamente, esta enzima exibiu a habilidade para produzir AMP no ensaio, mos- trando uma atividade específica de 0,3583 pmols/min/mg de proteína. Estes re- sultados mostram que os dois resíduos de serina são muito importantes para a atividade catalítica da enzima. A mutação dupla, S52A S53A, não criou auxotrofia na cepa, como seria esperado. Isto porém pode ser explicado pelo fato que estas enzimas são capazes de produzir glutamina de ADP como também ATP. Como a eficiência de conversão destas enzimas é comprometida severamente, poderia parecer que a reação pode estar ocorrendo diretamente do fosfato de γ-glutamila e não do intermediário da enzima de acila, como o anidrido de ácido fosfórico seria instável na presença de H2O permitindo a hidrólise do fosfato de γ-glutamila e criando a ineficiência de conversão.

Os dois resíduos de histidina acreditados formar parte da tríade ca- talítica, em geral, mostraram níveis de atividade muito baixos. H210V foi o único mutante a mostrar níveis de atividade comparável para as enzimas de WT1 e de- pois apenas no ensaio de Mn (0,1525 pmols/min/mg de proteína para o ensaio baseado em glutamina e 0,1355 pmols/min/mg de proteína para o ensaio basea- do em ADP). Os níveis de atividade produzidos no ensaio de Mg foram muito baixos e foram considerados ser equivalentes a nenhuma atividade (0,0348 pmols/min/mg de proteína para o ensaio baseado em glutamina e 0,0173 pmols/min/mg de proteína para o ensaio baseado em ADP). O mutante duplo H210V Y397V mostrou muito pouca atividade em qualquer ensaio - 0,0074 pmols/min/mg de proteína no ensaio de Mn com base em glutamina, 0,0025 pmols/min/mg de proteína no ensaio de Mn com base em ADP1 0,0036 pmols/min/mg de proteína no ensaio de Mg com base em glutamina e 0,0073 pmols/min/mg de proteína no ensaio de Mg com base em ADP. Nem H211V nem H211V Y397V não exibiram muita atividade em qualquer ensaio, indicando sua importância no sítio ativo de glutamina sintetase. Todos os quatro mutantes tiveram atividades específicas em todos os ensaios de menos de 0,1 pmols/min/mg de proteína. Porém, foi interessante observar que todos os quatro destes mutantes poderiam converter ATP de todo o modo para AMP, embora um nível inferior de AMP fosse produzido que para os mutantes duplos de serina.

Dos resíduos identificados como o resíduo de ácido potencial na tríade catalítica putativa, vi'z D50A E129A, E327V e E357A, todos mostraram níveis reduzidos de atividade, e taxas variadas de conversão. D50A mostrou ati- vidade reduzida -comparada aos clones de WT. Esta mutação, quando combina- da com a mutação de Y397V, resultou em um aumento na atividade em todos os ensaios, comparado a D50A. A atividade específica do ensaio de Mn2+ com base em glutamina e a atividade específica do ensaio de Mn2+ com base em ADP au- mentaram de 0,62 pmols/min/mg de proteína e 0,92 pmols/min/mg de proteína, respectivamente, em D50A para 2,82 pmols/ min/mg de proteína e 4,90 pmols/min/mg de proteína, respectivamente, em D50A Y397V. As atividades de Mg2+ mostraram uma tendência similar, aumentando de 0,29 pmols/min/mg de proteína e 0,85 pmols/min/ mg de proteína, respectivamente, em D50A para 1,98 pmols/min/mg de proteína e 4,19 pmols/min/mg de proteína, respectivamente, em D50A Y397V. As taxas de conversão em ambos os mutantes foram baixas, indicando que a enzima não era completamente funcional. E129A não exibiu ne- nhuma atividade em qualquer ensaio. Alguma atividade tornou-se detectável no mutante duplo, E129A Y397V. E327V mostrou baixas atividades específicas no ensaio de Mn2+ (0,32 pmols/min/mg de proteína no ensaio baseado em glutami- na e 0,42 pmols/min/mg de proteína no ensaio baseado em ADP, mas estes ní- veis caíram no ensaio de Mg2+). Por outro lado, E327V Y397V teve atividades específicas de Mn2+ com base em glutamina e com base em ADP específicas àquelas obtidas em E327V, mas as atividades de Mg2+ foram significativamente mais altas que as atividades de Mg2+ de E327V. Isto poderia ser uma indicação que este resíduo é importante na forma adenililada da enzima. E357A produziu atividades específicas no ensaio de Mn2+ de atividade com base em glutamina de 0,36 pmols/min/mg de proteína e atividade com base em ADP de 0,21 pmols/min/mg de proteína. Nenhuma atividade foi detectada em ambos ensaios de Mg2+. Quando E357A foi combinado com Y397V, o mutante duplo mostrou atividades de Mn2+ inferiores que E357A, mas atividade de Mg2+ foi restabelecida (atividade com base em glutamina de 0,04 pmols/min/mg de proteína e atividade com base em ADP de 0,01 pmols/min/mg de proteína). tabela 15

<table>table see original document page 80</column></row><table> TABELA 15. -continuacao-

<table>table see original document page 81</column></row><table> <table>table see original document page 82</column></row><table> TABELA 15

<table>table see original document page 83</column></row><table> Os resultados dos experimentos de inibidor de serina protease na

Tabela 16.

TABELA 16. DADOS DE HPLC OBTIDOS NOS EXPERIMENTOS USANDO OS INIBIDORES DE SERINA PROTEASE PMSF E AEBSF. DADOS SÃO APRE- SENTADOS COMO UMA REDUÇÃO DE PORCENTAGEM EM ATIVIDADE ESPECÍFICA A REAÇÃO DE CONTROLE OPERADA NA AUSÊNCIA DO INI- BIDOR E A REAÇÃO OPERADA NA PRESENÇA DO INIBIDOR. % DE REDU- ÇÃO POSITIVA INDICA QUE A ATIVIDADE AUMENTOU COM RELAÇÃO À ATIVIDADE NA AUSÊNCIA DE INIBIDOR.

<table>table see original document page 84</column></row><table> <table>table see original document page 85</column></row><table>

ND = não realizado

Dl = Dados Inexatos; Níveis de atividade extremamente baixos obtidos, tornando a interpretação dos resultados inexata

Os valores são apresentados como uma porcentagem na redução de atividade entre o resultado obtido na ausência de inibidor e o resultado obtido na presença de inibidor. A porcentagem de conversão, refletindo a eficiência de conversão das enzimas, é também mostrada. Valores de % de redução positivos obtidos indicam um aumento em atividade na presença do inibidor, acima do ní- vel obtido no controle. Isto foi especialmente evidente nas reações de hidrólise de ATP, indicando que a primeira etapa da reação ocorre possivelmente a uma taxa aumentada na presença do inibidor como resultado da hidrólise do fosfato de γ- glutamila como em todos os casos onde a taxa de hidrólise de ATP aumentada houve uma redução concomitante na eficiência de conversão. Uma porcentagem de redução de ± 15% foi interpretada como uma reflexão da variabilidade no en- saio, e, portanto, foi assumido que o inibidor de protease estava tendo pequeno ou nenhum efeito.

PMSF foi descoberto inibir a enzima de WT adenililada, como tam- bém os mutantes Y397V, S52A, S52A Y397V, e S53A em ambos os ensaios com base em Mn2+ e Mg2+. AEBSF pareceu causar inibição na enzima de WT adenililada, como também os mutantes Y397V, S52A, S52A Y397V, S53A, S53A Y397V, S52A S53A e S52A S53A Y397V, com o nível de inibição sendo signifi- cativamente mais alto na reação de hidrólise de ATP. Onde AEBSF não causou uma redução significativa na atividade específica baseada em glutamina, sua presença no sítio ativo pareceu aumentar a atividade específica com base em ADP. PMSF não inibiu a atividade de S52A S53A ou S52A S53A Y397V signifi- cativamente. Isto seria esperado, visto que ambas as serinas foram removidas do sítio ativo. O mecanismo de ação de AEBSF, portanto, parece ser diferente como inibiu ambas destas enzimas mutantes.

PMSF e AEBSF foram descobertos ligar ao sítio ativo enquanto ain- da permitindo hidrólise de ATP ocorrer. Isto pode ser interpretado como ligação competitiva do inibidor de serina protease ao sítio de glutamato, enquanto ainda permitindo hidrólise de ATP ocorrer. É importante observar que em todos os ca- sos, embora a inibição tenha sido observada ocorrer, houve uma redução con- comitante na eficiência da conversão.

Os aminoácidos que foram identificados dos dados de SDM que compõem as respectivas tríades catalíticas são S52, H211 e E327 para a forma adenililada da enzima e S53, H210 e D50 para a forma desadenililada da enzima. Para analisar como a enzima poderia trocar entre as tríades catalíticas sob adeni- lilação, o modelo de estrutura de cristal 1f52.pdb (Gill HSeD Eisenberg (2001) Biochemistry 7: 1903-1912) obtido da Base de Dados de Proteína de Brookha- ven foi reduzido em 4 subunidades, designadas A, B, G, e H, para analisar as interações das subunidades no mecanismo de reação baseada em tríade catalí- tica putativa. O Tyr397 adenililado da subunidade H é oposto a um Trp57' na su- bunidade B que está na alça flexível de serina. É acreditado que sob adenililação, uma interação é criada entre as cadeias laterais aromáticas do Tyr397 e o Trp57' adenililados, como também uma interação entre os resíduos de adenila entre Tyr397 (Subunidade H) e Tyr397 (Subunidade A) que faz com que a enzima "troque" a tríade catai ítica.

É proposto que na adenililação de Tyr397 do resíduo A Trp57 na subunidade G entre os anéis aromáticos do grupo adenila da ADP e do resíduo de triptofano permitindo a serina contendo alça flexível na subunidade G gire tra- zendo Ser52 em proximidade mais íntima a Glu327 na subunidade H. Se Tyr397 na subunidade H for também adenililado, ele também interage com o anel de adenila no Tyr 397 da subunidade A trazendo Glu327 na subunidade H em pro- ximidade mais íntima no sítio ativo. Esta alteração resultante na configuração entre os resíduos de sítios ativos que existem entre as subunidades HeG como também a adenililação do Tyr 397 na subunidade A depois permite alteração suficiente na estrutura interna do sítio ativo que permite His211 mover-se para a posição.

CONCLUSÕES

Análises dinâmicas estruturais e moleculares de glutamina sintetase sugeriram que um possível mecanismo pelo qual o estado de adenilila- ção/desadenililação da enzima afeta a especificidade da enzima para MgATP ou Mn2ATP e NH4+ ou NH3 está causando uma troca entre as duas tríades catalíti- cas putativas. Se umas tríades catalíticas representar um papel na catálise, a reação deveria passar através de um intermediário de enzima de acila de γ- glutamila.

Mutagênese loco-dirigida de vários resíduos identificados como re- presentando um papel nestas tríades catalíticas levou às observações a seguir. Ser52 e Ser53 foram importantes para a atividade catalítica da enzima. Foi de- terminado que Ser52 pareceu ter funcionalidade adenililada e Ser53 funcionali- dade desadenililada. Porém, é possível que como estes resíduos de serina ficam adjacentes um ao outro, são capazes de funcionar na forma adenililada e desa- denililada da enzima. Quando ambos os resíduos de serina foram removidos, resultando em atividade de glutamina sintetase diminuída, a importância destes resíduos no sítio ativo foi reforçada. Avaliação estas enzimas mutantes de serina na presença dos inibidores de serina protease, AEBSF e PMSF, levou à conclu- são que Ser52 e Ser53 parecem formar parte de uma tríade catalítica de fato, como a atividade das enzimas foi inibida na presença dos inibidores. A serina mutante dupla não foi inibida significativamente ou por PMSF ou AEBSF. AEBSF e PMSF pareceram causar um aumento na taxa de hidrólise da ATP com uma redução concomitante na formação de glutamina e a eficiência de conversão. Isto pode ser interpretado como ligação competitiva do inibidor de serina protea- se ao sítio de glutamato, ainda permitindo hidrólise de ATP ocorrer. É importante observar que em todos os casos, embora inibição tenha sido observada ocorrer, houve uma redução concomitante na eficiência de conversão. His210 e His211 foram observados ser igualmente importantes à funcionalidade da enzima, e os resultados, em consulta com o modelo, levaram à conclusão que His210 teve atividade desadenililada e His211 teve atividade adenililada. Todos os resíduos de ácido potenciais, quando removidos, tiveram um efeito na atividade. Nova- mente, consulta do modelo levou à conclusão que os dois resíduos de ácido que encheram a função do resíduo de ácido em cada tríade catalítica, foram Glul29 para a forma adenililada da enzima, e Glu357 para a forma desadenililada da enzima. As duas tríades catalíticas putativas são encontradas na interface entre as duas subunidades (designadas A e B) de glutamina sintetase e são acredita- das ser compreendidas dos resíduos a seguir (onde o número de resíduo de E colié dado)

GS adenililada: Ser52 (Subunidade B) His211 (Subunidade A) Glul29 (Subunidade A)

GS desadenililada: Ser53 (Subunidade B) His210 (Subunidade A) Glu357 (Subunidade A).

A GS desadenililada é produzida sob condições de limitação de ni- trogênio e em baixas concentrações de NH3; a enzima é desadenililada, enquan- to trocando para o resíduo contendo a tríade catalítica Ser53 (Subunidade B); em concentrações de NH3 altas, a enzima é adenililada, trocando para o resíduo contendo a tríade catalítica Ser52. O sítio catalítico usando Ser52 deva desproto- nar o NH4+ para criar o nucleófilo de amônia. Foi proposto que a desprotonação do NH4+ possa ocorrer por meio de Asp50 (Liaw S-H, eu Kuo e D Eisenberg (1995) Science Protein 4: 2358-2365). Esta desprotonação do NH4+ poderia, po- rém, também ocorrer por meio de um íon de carbônio uma vez o intermediário de enzima de acila foi formado. Os dois mecanismos de reação propostos, por meio do qual o ataque nucleofílico por amônia de um intermediário de enzima de γ- glutamila-acila é facilitado por um mecanismo de tríade catalítica, é debatido a - baixo. Um intermediário da enzima de acila foi postulado antes no trabalho reali- zado em glutamina sintetase isolada de cérebro de ovelha, onde ligação de 14C- glutamato à glutamina sintetase na ausência de NH3 foi demonstrada (Krishnas- wamy P R, V Pamiljans e A Meister (1962) Journal of Biological Chemistry 237: 2932 - 2940).

Como indicado acima, as cinéticas de reação do ataque nucleofílico através de amônia mostram dois conjuntos de constantes cinéticas. Um meca- nismo proposto para a reação da tríade catalítica é que um dos γ-oxigênios do Ser52 ou Ser53 forma uma ligação covalente para o glutamato, por meio de ata- que nucleofílico no carbono de carbonila da ligação de éster do anidrido de ácido carboxílico-fosfórico do fosfato de glutamila formado na primeira etapa da reação.

His210 e His211 atuam como catalisadores de base gerais remo- vendo o próton do respectivo Ser Ογ. Este próton forma ligações de hidrogênio Νε ligadas para o Ser O7 e para o oxigênio de fosfato de substrato. O intermediário de oxiânion tetraédrico resultante é estabilizado possivelmente por Arg339. Na próxima etapa, o próton de Νε de His210 e His211 é transferido para o substrato de oxigênio de ligação, liberando o fosfato de ácido, com a formação concomitan- te de um intermediário de enzima de acila. É após a formação do primeiro inter- mediário de enzima de acila ou em Ser52 ou em Ser53, que parece haver uma diferença fundamental nos mecanismos de reação do ataque nucleofílico por amônia e a desacilação subseqüente da enzima e a formação de glutamina. É acreditado que a "escolha" da serina seja mediada pelo estado de adenililação do sítio ativo e o uso de Mg2+ ou Mn2+ na transferência de fosfato de ATP para glutamato. Esta transferência de fosfato para glutamato pode ocorrer por meio de transferência de fosforila mediada por His269 que foi identificado como um ligan- do do íon de metal de n2 (Abell, L M, J Schineller, P J Keck e J Villafranca (1995) Biochemistry 34: 16695-16702). O papel de His269 na transferência de fosforila foi também demonstrado em uma reação de transferase de fosforila nova por meio de His 269 (Kenyon, C. P., et al. (2006), pedido de patente de PCT intitula- do "MODULATION OF PHOSPHORYL TRANSFEREASE ACTIVITY", Número de Documento 19690-004W01, depositado simultaneamente com ele).

Outro fator que pode representar um papel no mecanismo de troca é que Mn2ATP tem uma estrutura diferente de MgATP, como a ATP dobra-se ao redor dos íons de Mn2+ em um complexo binário com a possibilidade mais próxi- ma do anel de adenina sendo feito por N7. O Mn2ATP e o MgATP podem levar diferentes oxigênios do grupo Glu δ carbonila serem fosforilados. Em solução aquosa, estes normalmente seriam equivalentes. Porém, dentro do sítio ativo, como o intermediário de acila, o Glu Oe1 e Glu Oe2 são assimétricos em natureza, mantendo sua estereoquímica. Esta assimetria pode ser importante na decisão da natureza do ataque nucleofílico. É portanto concebível que ataque nucleofílico de Sn1 ou Sn2 possa ocorrer como resultado da orientação criada pela fosforila- ção de Glu 0ε1 ou Glu Oe2.

Desse modo, um mecanismo modelo possível para a forma adenili- Iada da enzima sendo que é formada nas células crescidas sob condições de excesso de nitrogênio e limitação de carbono, usando a tríade catalítica Ser52'/His211/Glul29 é esboçado na figura. 1. O grupo γ-carboxila no intermediá- rio de acila de glutamato pode representar um papel na desprotonação do NH41". O primeiro estado de transição tetraédrico ocorre durante a desfosforilação do fosfato de γ-glutamila. Este próton, na ativação desta forma zwitteriônica do grupo carboxila, aumenta sua suscetibilidade a ataque nucleofílico. A atividade geral da enzima adenililada, na presença de Mn2ATP1 foi observada ser em geral inferior que a enzima desadenililada. A energia de ativação alta na enzima adenililada, porém, pode ser ligada à enzima tendo que desprotonar o NH4+ para NH3 + H+ em concentrações de NH4+ altas, para criar o nucleófilo.

Um possível mecanismo modelo para a forma desadenililada da enzima que é formada nas células crescidas sob condições de limitação de nitro- gênio e excesso de carbono, usando a tríade catalítica de Ser53'/His210/E357 é esboçado na figura. 2. Após a formação do primeiro estado de transição tetraé- drica, e após o próton NEde His210 ter sido transferido para o substrato, assim liberando o fosfato de ácido, o intermediário de enzima de acila é formado. Este complexo de enzima de acila pode ser estabilizado pelo Arg339 em um orifício de oxiânion. O ataque nucleofílico pela amônia depois ocorre. Como a forma de- sadenililada da enzima é produzida pelas células sob condições limitadas de ni- trogênio, é acreditado que o NH4+ seja dissociado completamente de NH3 + H+, com NH3 sendo trazido para o sítio ativo e não NH4+.

Foi mostrado que uma solução aquosa de (NH4)2SO4 dissocia-se em 2NH4+ e SO4". Porém, em soluções dilutas, como a concentração tende para diluição infinita, é acreditado que o 2NH4+ também se dissocia em 2NH3 e 2H+. Portanto, um possível terceiro mecanismo envolvido em facilitar o ataque nucleo- fílico da enzima de acila pela amônia pode ocorrer. Esta é uma reação de "fase gasosa" ou "livre de solvente". As taxas de reações de substituição nucleofílica bimolecular envolvendo ânions e moléculas polares variam mais de 20 ordens de magnitude alterando da fase gasosa para meios polares (solvente) (Olmstead, W. N. e J. I. Brauman (1977) J. Am. Chem. Soe. 99: 4219-4228; Pellerite1 M. J. e J. I.

Brauman (1980) J. Am. Chem. Soe. 102: 5993-5999; Shaik, S. S. e A. Pross (1982) J. Am. Chem. Soe. 104: 2708-2719; Chandrasekhar, J., Smith1 S. F. e W. L. Jorgensen (1984) J. Am. Chem. Soe. 106: 3049-3050; Chandrasekhar, J., Smith1 S. F. e W. L. Jorgensen (1985) J. Am. Chem. Soe. 107: 154-163; Chan- drasekhar, J. e W. L. Jorgensen (1985) J. Am. Chem. Soe. 107: 2974-2975). Isto é acreditado ser devido ao aumento na energia de ativação através de hidrata- ção como resultado da redução na resistência das ligações de hidrogênio. A a- tração de íon-dipolo é anulada pela energia requerida para dessolvatar o íon (nu- cleófilo). O estado de transição que tem uma distribuição de carga dispersa como resultado da hidratação forma ligações de hidrogênio mais fracas para o solvente. Isto resulta em um perfil de energia unimodal com uma barreira de energia cen- tral grande, estreita que é significativamente maior que na fase gasosa. É postu- lado portanto, que em concentrações de amônia muito baixas o sítio ativo seja "fechado", assim reduzindo ou eliminando a área acessível a solvente no sítio ativo, permitindo uma reação de tipo de fase gasosa ocorrer. Isto ocorreria possi- velmente quando a enzima fosse desadenililada e funcionando na forma de Mg2+. Também conta com Km muito baixa que a enzima tem para amônia em baixas concentrações de substrato. O efeito adverso de H2O foi evidente nas reações de enzima das enzimas mutantes Y397V, S52A S53A Y397V, H210V Y397V e H211V Y397V como a eficiência de conversão de ATP hidrolisada para glutami- na formada foi tão baixo quanto 36%.

No geral, os dados mostram que o mecanismo de reação emprega- do através de glutamina sintetase na formação de glutamina do fosfato de γ- glutamila sintetizado na primeira etapa da reação ocorre por meio de duas tría- des catalíticas similares àquelas empregadas por serina proteases. Estas tríades catalíticas incluem Ser52', His211 e Glul29 para a forma adenililada da enzima de E. coli, e Ser53', His210 e Glu357 para a forma desadenililada da enzima de E. coli.

As várias modalidades da invenção foram descritas. Não obstante, será entendido que várias modificações podem ser feitas sem divergir do espírito e escopo da invenção. Conseqüentemente, outras modalidades estão dentro do escopo das reivindicações a seguir.

Claims (21)

1. Método assistido por computador de gerar um composto que iniba a atividade do sítio ativo de formação de glutamina de um polipeptídeo de gluta- mina sintetase, em que o dito composto de teste é capaz de inibir a interação entre um sítio da tríade catalítica adenililada do sítio ativo de formação de gluta- mina e um intermediário de fosfato de ^glutamila1 ou de inibir a interação entre um sítio da tríade catalítica desadenililada do sítio ativo de formação de glutamina e um intermediário de fosfato de γ-glutamila, caracterizado pelo fato de que com- preende: (a) fornecer uma estrutura tridimensional de um sítio ativo de formação de glutamina de um polipeptídeo de glutamina sintetase; e (b) projetar, com base na estrutura tridimensional, um composto de teste capaz de inibir a interação entre o sítio ativo de formação de gluta- mina e um intermediário de fosfato de γ-glutamila.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o dito composto de teste é capaz de inibir a formação de um in- termediário de enzima de acila no sítio da tríade catalítica adenililada do sítio ativo de formação de glutamina, ou de inibir a formação do intermediário de enzima de acila no sítio da tríade catalítica desadenililada do sítio ativo de formação de glutamina.

3. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que também compreende produzir o composto de teste da etapa (b) e avaliar a atividade inibidora do composto de teste em um polipeptídeo de glutamina sintetase in vitro.

4. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que também compreende produzir o composto de teste da etapa (b) e avaliar a atividade inibidora do composto de teste no crescimento de uma bactéria compreendendo um gene de glutamina sintetase de GSI-α ou GSI-β.

5. Método de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a dita bactéria compreendendo um gene de GSI-β é selecionada do grupo que consiste em Corynebacterium diphtheriae, Neisseria gonorrhoeae, Escherichia coli, Salmonella typhinurium, Salmonella typhi, Klebsiella pneu- moniae, Serratia marcescens, Proteus vulgaris, Shigella dysenteriae, Vibrio cholerae, Pseudomonas aeruginosa, Alcaligenes faeealis, Helicobaeter pylori, Haemophilus influenzae, Bordetella pertussis, Bordella bronehiseptia, Neis- seria meningitides, Brueella melitensis, Mycobaeterium tubereulosis, Myeo- baeterium leprae, Treponema pallidum, Leptospira interrogans, Aeetinomy- ees israelii, Noeardia esteroides, Thiobacillus ferrooxidans, Azospirillum bra- zilensis, Anabaena sp., Fremyella diplosiphon, e Streptormyees eoelieolor, e em que a dita bactéria compreendendo um gene de GSI-α é selecionada do grupo que consiste em Baeillus eereus, Bacillus subtilis, Bacillus anthraeis, Streptoeoceus pneumoniae, Streptoeoceus pyogenes, Staphyloeoeeus ae- reus, Clostridium botulinum, Clostridium tetani e Clostridium perfringens.

6. Método de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que também compreende avaliar a atividade inibidora do composto de teste no crescimento de uma célula eucariótica.

7. Método de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que a dita célula eucariótica é uma célula mamífera.

8. Método de gerar um composto de teste que inibe uma ativida- de do sítio da tríade catalítica de um sítio ativo de formação de glutamina de um polipeptídeo de glutamina sintetase, caracterizado pelo fato de que com- preende: (a) fornecer uma estrutura tridimensional compreendendo um sítio da tríade catalítica de um sítio ativo de formação de glutamina; e (b) projetar, com base na estrutura tridimensional, um composto de teste capaz de formar um intermediário de enzima de acila com um resí- duo do sítio da tríade catalítica.

9. Método de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o dito composto de teste é capaz de formar um intermediário de enzima de acila com um resíduo na dita estrutura que corresponde a Ser52 ou Ser53 do polipeptídeo de glutamina sintetase de E. coli.

10. Método de triagem de um composto de inibidor de teste de protease in vitro para determinar se ou não inibe a atividade do sítio ativo de formação de glutamina de um polipeptídeo de glutamina sintetase, caracteri- zado pelo fato de que compreende: (a) contatar um polipeptídeo de glutamina sintetase com um composto de inibidor de teste de protease; e (b) determinar se ou não a atividade do sítio ativo de formação de glutamina do polipeptídeo de glutamina sintetase é reduzida com relação à atividade de um polipeptídeo de glutamina sintetase que não foi contatado com o composto de inibidor de teste de serina protease.

11. Método de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pe- lo fato de que a dita atividade do sítio de formação de glutamina é medida usando um ensaio capaz de medir hidrólise de ATP, formação de PAD1 for- mação de AMP, utilização de glutamato, ou formação de glutamina.

12. Método de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pe- lo fato de que o dito composto de inibidor de teste de protease é um com- posto de inibidor de teste de serina protease.

13. Método de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pe- lo fato de que na etapa (a), uma biblioteca de compostos de inibidor de pro- tease de teste é contatada com, individualmente, com o polipeptídeo de glu- tamina sintetase.

14. Método de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pe- lo fato de que a biblioteca é uma biblioteca de compostos de inibidor de teste de protease serina.

15. Método in vitro para inibir a atividade do sítio ativo de forma- ção de glutamina de um polipeptídeo de GS, caracterizado pelo fato de que compreende contatar um polipeptídeo de GS com uma composição compre- endendo um inibidor de serina protease.

16. Método de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pe- lo fato de que o dito inibidor de serina protease é um derivado de aldeído de peptidil-arginina, um derivado de pirrolopirrrolideno, um derivado de quinoli- nona, ou um derivado de benzimidazol de 1-metila.

17. Método in vitro para inibir crescimento de uma bactéria com- preendendo um gene de GSI-α ou um de GSI-β, caracterizado pelo fato de que compreende contatar a bactéria com uma composição compreendendo um inibidor de serina protease.

18. Uso de um inibidor de serina protease, caracterizado pelo fato de que é na preparação de uma composição para tratar, impedir, ou me- lhorar um ou mais sintomas ou distúrbios associados a uma infecção bacte- riana em um mamífero, em que a infecção bacteriana é de uma bactéria compreendendo um gene de GSI-α ou um de GSI-β.

19. Uso de um inibidor de serina protease, caracterizado pelo fato de que é na preparação de uma composição para inibir a atividade do sítio de formação de glutamina de um polipeptídeo de glutamina sintetase através da administração do mesmo a um mamífero que é suspeito de sofrer ou está sofrendo de uma infecção bacteriana, em que a infecção bacteriana é de uma bactéria compreendendo um gene de GSI-α ou de GSI-β.

20. Uso de acordo com a reivindicação 18 ou 19, caracterizado pelo fato de que a dita bactéria compreendendo um gene de GSI-β é sele- cionada do grupo que consiste em Corynebacterium diphtheriae, Neisseria gonorrhoeae, Escherichia coli, Salmonella typhinurium, Salmonella typhi, Klebsiella pneumoniae, Serratia marcescens, Proteus vulgaris, Shigella dy- senteriae, Vibrio cholerae, Pseudomonas aeruginosa, Alcaligenes faeealis, Helieobacter pylori, Haemophilus influenzae, Bordetella pertussis, Bordella bronehiseptia, Neisseria meningitides, Brucellá melitensis, Myeobaeterium tubereulosis, Myeobacterium leprae, Treponema pallidum, Leptospira inter- rogans, Aeetinomyees israelii, Noeardia esteroides, Thiobacillus ferrooxidans, Azospirillum brazilensis, Anabaena sp., Fremyella diplosiphon, e Streptormy- ees eoelieolor.

21. Uso de acordo com a reivindicação 18 ou 19, caracterizado pelo fato de que o dito mamífero é um humano.