CN108486218B - 基于结核分枝杆菌类泛素连接酶PafA的药物靶点及其应用 - Google Patents

基于结核分枝杆菌类泛素连接酶PafA的药物靶点及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种基于结核分枝杆菌类泛素连接酶PafA的药物靶点及其应用，属于生物医药技术领域。具体而言，是涉及一种类泛素连接酶PafA的119位丝氨酸作为抗结核药物靶点，该蛋白119位丝氨酸位点能特异性结合小分子抑制剂4‑(2‑氨乙基)苯磺酰氟盐酸盐，从而抑制结核分枝杆菌类泛素连接酶PafA的活性。

Description

基于结核分枝杆菌类泛素连接酶PafA的药物靶点及其应用
技术领域
本发明属于生物医药领域，涉及一种新的基于结核分枝杆菌类泛素连接酶PafA的药物靶点及其应用，具体而言，涉及类泛素连接酶PafA的119位丝氨酸作为抗结核药物靶点，还涉及针对该蛋白119位丝氨酸位点特异性结合的抑制剂4-(2-氨乙基)苯磺酰氟盐酸盐(AEBSF)。
背景技术
遏制结核病刻不容缓：结核病是由结核分枝杆菌感染所致，有7000年侵扰人类的历史。卡介苗和抗生素的出现使结核病一度得到控制。但耐药结核菌分枝杆菌的出现及与HIV共感染等问题使结核病在世界范围内又死灰复燃。WHO于1993年史无前例地宣布“全球结核病紧急状态”，1998年又重申了“遏制结核病刻不容缓”。目前全球约有17亿人感染了结核分枝 杆菌，在2016年约有170万人死于肺结核，结核病已成为传染病中的头号杀手（WHO，2016）我国为全球30个结核病高负担国家之一，每年新发结核病患者约为90万例，位居全球第3位。然而，耐药的出现使得结核病问题更是雪上加霜。全球已有50多个国家报告发生了广泛耐药结核病例。中国是耐多药和广泛耐药结核病疫情最严重的三个国家之一。再加上全球的城市化进程加快、交通日益发达以及人口老龄化等又为结核病的流行创造了有利条件，其结果导致结核病的流行正在全球复活。
结核病新药研发迫在眉睫：60年来仅有两种结核新药贝达喹啉和德拉马尼上市，严重滞后的抗结核新药研发使得我们在对付耐药性结核病时严重缺乏有效的治疗方案。针对结核病的治疗在世界范围内推广使用的DOTS策略。这是一种标准化疗程，即前期4种药物联用（异烟肼+利福平+吡嗪酰胺+乙胺丁醇）加后期的两种药物联用（异烟肼+利福平）。这种策略虽然在结核病治疗方面起着非常重要的作用，但治疗周期长达6-9个月，有药物不良反应，病人依从性差，容易用药不规范，甚至提前终止用药，最终导致结核分枝杆菌耐药性增强。因此迫切需要发展针对新靶标及具有新的作用机制的结核病药物。
结核分枝杆菌类泛素连接酶是一个理想的抗结核靶标：结核分枝杆菌是一种含有类泛素选择降解途径Pupylation的病原菌。多项研究表明结核分枝杆菌的类泛素选择蛋白降解途径对于结核分枝杆菌抵御巨噬细胞杀菌试剂一氧化氮和在小鼠体内的生存是不可或缺的。因此该通路被认为是极具潜力的抗结核药物设计靶点。在该通路中，PafA作为目前已知的唯一一种类泛素连接酶，催化类泛素蛋白Pup与底物之间的连接反应。已有研究表明该蛋白功能的缺失或突变能降低结核分枝杆菌在巨噬细胞杀菌试剂一氧化氮或者在小鼠体内的生存。序列比对研究发现类泛素连接酶PafA在人体里面没有任何同源蛋白，并且类泛素选择蛋白降解途径Pupylation在绝大多数肠道菌株中也不存在。若针对类泛素连接酶PafA设计特异性的抑制剂，预期可获得较高的特异性和较小的副作用。综上所述，结核分枝杆菌类泛素连接酶PafA是一个理想的抗结核药物靶标。然而，到目前为止尚缺乏关于结核分枝杆菌类泛素连接酶PafA的抑制剂及相关抑制机制的研究。
发明内容
本发明要解决的技术问题是，针对现有技术不足，提供一种基于结核分枝杆菌类泛素连接酶PafA的药物靶点及其应用。基于PafA的 119位丝氨酸作为药物靶点设计抗结核药物的策略和一种特异性结合该位点的抑制剂4-(2-氨乙基)苯磺酰氟盐酸盐(AEBSF)。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
本发明提供了一种基于结核分枝杆菌类泛素连接酶PafA的药物靶点，所述药物靶点为结核分枝杆菌类泛素连接酶PafA的119位丝氨酸。
优选地，所述结核分枝杆菌类泛素连接酶PafA的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。
本发明还提供了一种基于结核分枝杆菌类泛素连接酶PafA的药物靶点在抑制PafA的活性的应用，通过靶向扰动结核分枝杆菌类泛素连接酶PafA的119位丝氨酸位点来抑制PafA的活性。
优选地，所述抑制PafA的活性的方法具体为：通过小分子化合物共价或非共价结合到结核分枝杆菌类泛素连接酶PafA的119位丝氨酸位点，即可抑制其活性；所述小分子化合物包括4-(2-氨乙基) 苯磺酰氟盐酸盐。
本发明还提供了一种抑制结核分枝杆菌类泛素连接酶PafA活性的方法，通过小分子化合物共价或非共价结合到结核分枝杆菌类泛素连接酶PafA的119位丝氨酸位点，即可抑制其活性；所述小分子化合物包括4-(2-氨乙基) 苯磺酰氟盐酸盐。
优选地，所述小分子化合物共价或非共价结合到结核分枝杆菌类泛素连接酶PafA的119位丝氨酸位点的具体步骤如下：将结核分枝杆菌的类泛素连接酶PafA在25℃下与小分子化合物共孵育0.5h，即可。
优选地，所述结核分枝杆菌的类泛素连接酶PafA与小分子化合物的浓度比为0.5：10-2000。
本发明还提供了一种前述的药物靶点在制备抗结核药物中的应用。
与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：
与现有结病治疗药物要比，本发明涉及的结核分枝杆菌类泛素连接酶PafA是一个较好的药物设计靶点，因为其在人体和绝大多数的肠道菌群中都没有同源序列，并且对于结核分枝杆菌是一个必需基因，所以针对PafA作为药物设计靶标蛋白预期可获得较高的特异性和较小的副作用。本发明提供类泛素连接酶PafA的 119位丝氨酸作为药物设计靶点，并揭示了一种新的结核药物作用机制，可获得高效的抑制类泛素连接酶的活性，并抑制结核分枝杆菌的生长，提高药物设计的成功率。
附图说明
通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：
图1是筛选针对结核分枝杆菌PafA蛋白类泛素连接反应的抑制剂；
图2是实施例1中步骤4的SDS-PAGE凝胶电泳考马斯亮蓝及免疫印迹检测结果；其中：1为敲除了类泛素连接酶的耻垢分枝 杆菌裂解液；2为在敲除了类泛素连接酶的耻垢分枝 杆菌裂解液中加入了结核杆菌的类泛素连接酶反应产物；3为在2体系的基础上加入了0.5mM 小分子抑制剂AEBSF；4为在2体系的基础上加入了2mM 小分子抑制剂AEBSF；
图3是实施例2将类泛素连接酶PafA与小分子AEBSF共孵育后的质谱鉴定结果；
图4是实施例2中丝氨酸119位突变后与AEBSF结合的效果；图4A为SDS-PAGE凝胶电泳考马斯亮蓝及免疫印迹检测结果；图4B为根据类泛素连接的底物PanB量考染条带定量分析的实验结果；其中，1为没有加入ATP的类泛素连接酶PafA催化PanB类泛素连接反应体系；2为加入ATP的类泛素连接酶PafA催化PanB类泛素连接反应体；3为加入ATP的类泛素连接酶PafA S119F催化PanB类泛素连接反应体系；4为加入ATP的类泛素连接酶PafA S119A催化PanB类泛素连接反应体系；5为加入ATP的类泛素连接酶PafA D57N催化PanB类泛素连接反应体系；
图5是实施例2中以敲除了类泛素连接酶的耻垢分枝 杆菌裂解液作为反应底物的SDS-PAGE凝胶电泳考马斯亮蓝及免疫印迹检测结果；其中，1为没有加入ATP的类泛素连接酶PafA催化敲除了类泛素连接酶的耻垢分枝 杆菌裂解液类泛素连接反应体系；2为加入ATP的类泛素连接酶PafA催化敲除了类泛素连接酶的耻垢分枝 杆菌裂解液类泛素连接反应体系；3为加入ATP的类泛素连接酶PafA S119F催化催化敲除了类泛素连接酶的耻垢分枝杆菌裂解液类泛素连接反应体系；4为加入ATP的类泛素连接酶PafA S119A催化催化敲除了类泛素连接酶的耻垢分枝 杆菌裂解液类泛素连接反应体系；5为加入ATP的类泛素连接酶PafA D57N催化催化敲除了类泛素连接酶的耻垢分枝 杆菌裂解液类泛素连接反应体系；
图6是结核分枝杆菌类泛素连接酶和谷氨酸棒状杆菌的类泛素连接酶PafA的 119位丝氨酸区域局部的序列比对；
图7是筛选到的3个抑制剂针对结核分枝杆菌PafA蛋白类泛素连接反应的酶活影响结果；其中1为小分子1；2为小分子2；3为小分子3；
图8是筛选到的3个抑制剂针对结核分枝杆菌H37Ra的生长抑制情况；其中1为小分子1；2为小分子2；3为小分子3。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变化和改进。这些都属于本发明的保护范围。
实施例1、筛选针对结核分枝杆菌类泛素连接酶的类泛素连接反应的抑制剂
为了筛选得到针对结核分枝杆菌类泛素连接酶类泛素连接反应的抑制剂，在体外构建了类泛素连接反应体系便于筛选，具体实施如下：
1）构建酶学反应所需的结核分枝杆菌类泛素连接酶PafA（氨基酸序列如SEQ IDNo.1所示），底物蛋白PanB，类泛素蛋白PupE。即从结核分枝杆菌H37Rv菌株基因组（由中国科学院武汉病毒研究所馈赠）PCR得到相应片段，克隆连接到PET28a，其中底物蛋白PanB C末端引入Flag标签便于后续检测。
2）分别培养1L的相应菌液，OD600=0.6，加入0.1 mM IPTG，16℃过夜诱导收菌。分别采用镍柱纯化结核分枝杆菌类泛素连接酶PafA，底物蛋白PanB和类泛素蛋白PupE。
3）提前将结核分枝杆菌的类泛素连接酶PafA在25℃与不同的小分子抑制剂孵育0.5h。提前让抑制剂和酶孵育结合，使抑制效果更为明显。
4）配置10μL反应体系，蛋白浓度比例如下：PanB-Flag (8 μM)，PupE (10 μM)，PafA (0.5 μM)（为步骤3中预孵育的蛋白和小分子混合物），ATP (5 mM)。体积不足用类泛素连接酶反应buffer（50 mMTris-HCl, pH7.5, 100 mMNaCl, 20 mM MgCl2 and 10% (v/v) glycerol）补齐。25℃反应6h。
5）SDS-PAGE凝胶电泳考马斯亮蓝及免疫印迹检测。
结果如图1所示。该反应体系采取类泛素连接反应文献中已知的底物蛋白PanB，一旦发生类泛素连接反应，底物蛋白PanB会被共价连接上类泛素蛋白PupE，此时蛋白分子量会变大，与原蛋白大小相比形成一个向上的迁移，结果如图1的第二列所示。进一步，我们分别将不同的小分子抑制剂加入到该反应体系中，发现只有加入小分子AEBSF的反应体系中，与对照相比，底物蛋白PanB被类泛素蛋白PupE连接水平受到抑制，结果如图1的第八列所示。
为了证明我们筛选得到的小分子抑制剂AEBSF对类泛素连接酶PafA的酶活影响是广谱效果，我们使用敲除了类泛素连接酶的耻垢分枝 杆菌裂解液作为反应底物，具体实施如下：
1）培养敲除类泛素连接酶的耻垢分枝 杆菌，OD600=2的时候收菌，离心去上清，用类泛素连接酶反应buffer重悬菌液，超声破碎10 min，离心收集上清。
2）提前将结核分枝杆菌的类泛素连接酶PafA在25℃与小分子抑制剂AEBSF孵育0.5h。
3）配置10μL反应体系，蛋白浓度比例如下：敲除类泛素连接酶的耻垢分枝 杆菌裂解液 (10 μg)，PupE (10 μM)，PafA (0.5 μM)，ATP (5 mM)。体积不足用类泛素连接酶反应buffer（50 mMTris-HCl, pH7.5, 100 mMNaCl, 20 mM MgCl2 and 10% (v/v) glycerol）补齐。25℃反应0.5 h。
4）SDS-PAGE凝胶电泳考马斯亮蓝及免疫印迹检测。
结果显示，当敲除类泛素连接酶的耻垢分枝 杆菌裂解液用类泛素蛋白Pup的抗体检测不到任何条带，当加入类泛素连接酶反应体系后，我们可以检测到广谱的类泛素化条带，结果如图2的第一、二列所示。进一步我们发现当在反应中加入小分子抑制剂AEBSF, 该小分子抑制剂可以广谱影响蛋白PafA的类泛素连接反应，结果如图2的三、四所示。
实施例2、小分子抑制剂AEBSF的抑制类泛素连接酶PafA的酶活机制
为了解析小分子抑制剂AEBSF的抑制类泛素连接酶PafA的酶活机制，结合考虑到AEBSF作为一种丝氨酸蛋白酶抑制剂，可以共价连接到酶的丝氨酸上从而抑制酶活，我们将类泛素连接酶PafA (0.5 μM) 与小分子AEBSF (1 mM)共孵育，之后进行了质谱鉴定发现类泛素连接酶丝氨酸119位被连接上了AEBSF，结果如图3所示。
为了证明丝氨酸119位参与小分子抑制剂AEBSF抑制类泛素连接酶PafA的酶活机制，我们将丝氨酸119突变为了丙氨酸和苯环家族氨基酸，其中突变为丙氨酸是为了解析该位点对酶活本身的影响，而突变为苯环家族氨基酸则是为了模仿AEBSF结合的效果，将表达纯化得到的突变型PafA采用上述实施例1所描述方法进行类泛素连接实验，我们发现以底物蛋白PanB为底物时，当类泛素连接酶PafA的119位丝氨酸突变为丙氨酸，该酶活损失了50%的活性，而当突变为苯环家族氨基酸时，该酶损失了几乎100%的活性。结果如图4第三列所示。当我们以敲除了类泛素连接酶的耻垢分枝 杆菌裂解液作为反应底物时，我们观察到了类似的现象，结果如图5所示。结果显示，丝氨酸119位参与小分子抑制剂AEBSF抑制类泛素连接酶PafA的酶活机制。
实施例3、筛选非共价结合到PafA的 119位丝氨酸区域的小分子抑制剂
为了筛选非共价结合到PafA的 119位丝氨酸区域的小分子抑制剂，我们首先对结核分枝杆菌类泛素连接酶和谷氨酸棒状杆菌的类泛素连接酶进行了局部序列的比对，结果如图6所示。我们发现丝氨酸119位所在的序列在两个菌株中高度保守，而该区域恰好位于类泛素连接酶结合类泛素蛋白Pup的口袋附近。因为目前已知可用的类泛素连接酶结构只有谷氨酸棒状杆菌的，而其又与结核分枝杆菌的类泛素连接酶在该区域的高度保守，我们采取利用谷氨酸棒状杆菌的类泛素连接酶PafA进行了小分子化合物对接，通过筛选我们获取了3个计算机模拟亲和力最优的小分子。将获得的3个小分子如同上述实施例1所描述方法进行类泛素连接实验，结果如图7所示。所得到的结果与对照相比，底物蛋白PanB被催化与类泛素蛋白Pup的连接水平在50 μM抑制剂处理下受到强烈抑制。
为了获得这3个小分子对结核分枝杆菌的抑制效果，我们检测了不同抑制剂（小分子1-3）对结核分枝杆菌H37Ra在0.5 mM NO（一氧化氮，Lin G et al：J AM CHEM SOC 2013135: 9968-9971）情况下的生存情况，具体实施如下：
1）在7H9培养基（BD Biosciences）中培养结核分枝杆菌H37Ra到对数期OD600=0.6。
2）将生长到对数期OD600=0.6的菌株用PH5.5的7H9培养基稀释到0.01，加入0.5mM NO处理过夜。
3）将预处理的结核分枝 杆菌H37Ra分别分装到含有20 μΜ的三个抑制剂的微孔板中。
4）在37℃培养11天后，将菌液用7H9培养基稀释3个10倍梯度，然后涂布7H10 （BDBiosciences）平板，37 ℃倒置培养观察，21天后读取菌落数。
结果如图8所示, 针对PafA筛选的这3种抑制剂对菌株生长均有影响，其中3号抑制剂（小分子3）对菌株生长抑制最为显著，抑制2个数量级以上。
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变化或修改，这并不影响本发明的实质内容。在不冲突的情况下，本申请的实施例和实施例中的特征可以任意相互组合。
序列表
<110> 上海交通大学
<120> 基于结核分枝杆菌类泛素连接酶PafA的药物靶点及其应用
<130> DAG35740
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 452
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Met Gln Arg Arg Ile Met Gly Ile Glu Thr Glu Phe Gly Val Thr Cys
1 5 10 15
Thr Phe His Gly His Arg Arg Leu Ser Pro Asp Glu Val Ala Arg Tyr
20 25 30
Leu Phe Arg Arg Val Val Ser Trp Gly Arg Ser Ser Asn Val Phe Leu
35 40 45
Arg Asn Gly Ala Arg Leu Tyr Leu Asp Val Gly Ser His Pro Glu Tyr
50 55 60
Ala Thr Ala Glu Cys Asp Ser Leu Val Gln Leu Val Thr His Asp Arg
65 70 75 80
Ala Gly Glu Trp Val Leu Glu Asp Leu Leu Val Asp Ala Glu Gln Arg
85 90 95
Leu Ala Asp Glu Gly Ile Gly Gly Asp Ile Tyr Leu Phe Lys Asn Asn
100 105 110
Thr Asp Ser Ala Gly Asn Ser Tyr Gly Cys His Glu Asn Tyr Leu Ile
115 120 125
Val Arg Ala Gly Glu Phe Ser Arg Ile Ser Asp Val Leu Leu Pro Phe
130 135 140
Leu Val Thr Arg Gln Leu Ile Cys Gly Ala Gly Lys Val Leu Gln Thr
145 150 155 160
Pro Lys Ala Ala Thr Tyr Cys Leu Ser Gln Arg Ala Glu His Ile Trp
165 170 175
Glu Gly Val Ser Ser Ala Thr Thr Arg Ser Arg Pro Ile Ile Asn Thr
180 185 190
Arg Asp Glu Pro His Ala Asp Ala Glu Lys Tyr Arg Arg Leu His Val
195 200 205
Ile Val Gly Asp Ser Asn Met Ser Glu Thr Thr Thr Met Leu Lys Val
210 215 220
Gly Thr Ala Ala Leu Val Leu Glu Met Ile Glu Ser Gly Val Ala Phe
225 230 235 240
Arg Asp Phe Ser Leu Asp Asn Pro Ile Arg Ala Ile Arg Glu Val Ser
245 250 255
His Asp Val Thr Gly Arg Arg Pro Val Arg Leu Ala Gly Gly Arg Gln
260 265 270
Ala Ser Ala Leu Asp Ile Gln Arg Glu Tyr Tyr Thr Arg Ala Val Glu
275 280 285
His Leu Gln Thr Arg Glu Pro Asn Ala Gln Ile Glu Gln Val Val Asp
290 295 300
Leu Trp Gly Arg Gln Leu Asp Ala Val Glu Ser Gln Asp Phe Ala Lys
305 310 315 320
Val Asp Thr Glu Ile Asp Trp Val Ile Lys Arg Lys Leu Phe Gln Arg
325 330 335
Tyr Gln Asp Arg Tyr Asp Met Glu Leu Ser His Pro Lys Ile Ala Gln
340 345 350
Leu Asp Leu Ala Tyr His Asp Ile Lys Arg Gly Arg Gly Ile Phe Asp
355 360 365
Leu Leu Gln Arg Lys Gly Leu Ala Ala Arg Val Thr Thr Asp Glu Glu
370 375 380
Ile Ala Glu Ala Val Asp Gln Pro Pro Gln Thr Thr Arg Ala Arg Leu
385 390 395 400
Arg Gly Glu Phe Ile Ser Ala Ala Gln Glu Ala Gly Arg Asp Phe Thr
405 410 415
Val Asp Trp Val His Leu Lys Leu Asn Asp Gln Ala Gln Arg Thr Val
420 425 430
Leu Cys Lys Asp Pro Phe Arg Ala Val Asp Glu Arg Val Lys Arg Leu
435 440 445
Ile Ala Ser Met
450

Claims (4)

1.一种小分子化合物在制备抑制结核分枝杆菌类泛素连接酶PafA活性的试剂中的应用，其特征在于，所述小分子化合物通过靶向扰动结核分枝杆菌类泛素连接酶PafA的119位丝氨酸位点来抑制PafA的活性；所述结核分枝杆菌类泛素连接酶PafA的氨基酸序列如SEQID No.1所示；
抑制所述结核分枝杆菌类泛素连接酶PafA活性的方法具体为：通过小分子化合物共价结合到结核分枝杆菌类泛素连接酶PafA的119位丝氨酸位点，即可抑制其活性；所述小分子化合物为4-(2-氨乙基) 苯磺酰氟盐酸盐。
2.一种小分子化合物抑制结核分枝杆菌类泛素连接酶PafA活性非治疗目的的方法，其特征在于，通过小分子化合物共价结合到结核分枝杆菌类泛素连接酶PafA的119位丝氨酸位点，即可抑制其活性；所述小分子化合物为4-(2-氨乙基) 苯磺酰氟盐酸盐；所述结核分枝杆菌类泛素连接酶PafA的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。
3.根据权利要求2所述的小分子化合物抑制结核分枝杆菌类泛素连接酶PafA活性非治疗目的的方法，其特征在于，所述小分子化合物共价结合到结核分枝杆菌类泛素连接酶PafA的119位丝氨酸位点的具体步骤如下：将结核分枝杆菌的类泛素连接酶PafA在25℃下与小分子化合物共孵育0.5h，即可。
4.根据权利要求2所述的小分子化合物抑制结核分枝杆菌类泛素连接酶PafA活性非治疗目的的方法，其特征在于，所述结核分枝杆菌的类泛素连接酶PafA与小分子化合物的摩尔浓度比为1： 20-4000。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112143792A (zh) * 2020-09-30 2020-12-29 中国医学科学院病原生物学研究所 Rnf181作为结核病诊断分子标识的用途
CN112904017B (zh) * 2021-01-19 2022-04-08 上海交通大学 一种基于共价连接的已知分子与蛋白质相互作用检测系统及其鉴定或验证方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101443353A (zh) * 2006-03-15 2009-05-27 Csir公司 谷氨酰胺合成酶活性的调节
CN102058575A (zh) * 2009-11-13 2011-05-18 上海市计划生育科学研究所 丝氨酸蛋白酶抑制剂在抗胚胎着床和抗肿瘤方面的应用

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9206241B2 (en) * 2012-05-02 2015-12-08 New York University Modified prokaryotic ubiquitin-like protein and methods of use thereof

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101443353A (zh) * 2006-03-15 2009-05-27 Csir公司 谷氨酰胺合成酶活性的调节
CN102058575A (zh) * 2009-11-13 2011-05-18 上海市计划生育科学研究所 丝氨酸蛋白酶抑制剂在抗胚胎着床和抗肿瘤方面的应用

Non-Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Christa Schiesswohl.Investigations of the pup-proteasome system in mycobacterium tuberculosis.《Doctoral dissertation of the University of Washington》.2016,摘要，正文第8页第2段、第10页第1段、第22页第3段. *
Investigations of the pup-proteasome system in mycobacterium tuberculosis;Christa Schiesswohl;《Doctoral dissertation of the University of Washington》;20161231;摘要，正文第8页第2段、第10页第1段、第22页第3段 *
Molecular analysis of the prokaryotic ubiquitin-like protein (Pup) conjugation pathway in Mycobacterium tuberculosis;Francisca A.Cerda-Maira et al;《Molecular Microbiology》;20100715;第77卷(第05期);第1123页右栏最后1段 *
Proteases in Mycobacterium tuberculosis pathogenesis: potential as drug targets;David M Roberts et al;《Future Microbiology》;20130503;第08卷(第05期);第621-631页 *
Structures of Pup Ligase PafA and Depupylase Dop of the Prokaryotic Ubiquitin-like Modification Pathway;Dennis Özcelik1 et al;《Nature communications》;20150306;第03卷(第01期);第1-23页 *
Synthesis and Evaluation of a Selective Fluorogenic Pup Derived Assay Reagent for Dop, a Potential Drug Target in Mycobacterium tuberculosis;Remco Merkx et al;《ChemBioChem》;20120824;第12卷(第14期);第2056-2060页 *
Targeting proteasomes in infectious organisms to combat disease;Betsaida Bibo-Verdugo et al;《The FEBS Journal》;20170125;第284卷(第10期);第1503-1517页 *

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