BRPI0620186B1 - Formulação adequada para administração subcutânea compreendendo uma molécula de ctla4ig - Google Patents

Abstract

FORMULAÇÃO ESTÁVEL OU LIOFILIZADA COMPREENDE UMA MOLÉCULA DE CTLA4IG OU UMA MOLÉCULA DE LE104A29YIG. A presente invenção refere-se, de modo geral, à formulações estáveis compreendendo moléculas de CTLA4Ig, incluindo formulações liofilizadas e líquidas, para administração através de várias vias incluindo, por exemplo, vias tais como intravenosa (IV) e subcutânea (SC) para tratamento de doenças do sistema imune e indução de tolerância.

Description

[0001] O presente pedido de patente reivindica a prioridade do U.S. No. de Série 60/752.150, depositado em 20 de Dezembro de 2005, o qual é aqui incorporado por referência em sua totalidade.

[0002] Todas as patentes, pedidos de patente e publicações citados aqui são aqui incorporados por referência em sua totalidade. As divulgações dessas publicações em suas totalidades são incorporadas aqui por referência ao presente pedido de forma a descrever mais completamente o estado da técnica, conforme conhecido por aqueles habilitados na mesma, no momento de depósito da invenção descrita e reivindicada aqui.

Campo da Invenção

[0003] A presente invenção se refere, em geral, à formulações estáveis compreendendo moléculas de CTLA4Ig, incluindo formulações liofilizadas e líquidas, para administração através de várias vias incluindo, por exemplo, vias tais como intravenosa (IV) e subcutânea (SC).

Antecedentes da Invenção

[0004] Durante as duas últimas décadas, a tecnologia de DNA recombinante levou à comercialização de muitos produtos terapêuticos de proteína. A via mais convencional de distribuição para fármacos de proteína tem sido administração intravenosa (IV) em virtude da pobre biodisponibilidade pela maioria das outras vias, maior controle durante administração clínica e desenvolvimento farmacêutico mais rápido. Para produtos que requerem administração freqüente e crônica, a via de distribuição subcutânea (SC) alternativa é mais apelativa. Quando associada à tecnologia de dispositivo auto-injetor e seringa pré- enchida, a distribuição SC permite a administração em casa e aceitação aperfeiçoada de administração.

[0005] Tratamentos com altas doses de mais de 1 mg/kg ou 100 mg por dose freqüentemente requerem o desenvolvimento de formulações em concentrações excedendo a 100 mg/ml em virtude do pequeno volume (< 1,5 ml) que pode ser fornecido pelas vias SC. Para proteínas que têm uma propensão em agregar em maiores concentrações, obtenção de tais formulações em alta concentração é um desafio de desenvolvimento. Mesmo para a via de distribuição IV, onde grandes volumes podem ser administrados, concentrações de proteína de dez miligramas por mililitro podem ser necessárias para regimes em alta dosagem e isso pode impor desafios de estabilidade para algumas proteínas.

[0006] Os princípios que orientam a solubilidade de proteína são mais complicados do que aqueles para pequenas moléculas sintéticas e, assim, superação do problema de solubilidade da proteína segue diferentes estratégias. Operacionalmente, a solubilidade para proteínas poderia ser descrita pela quantidade máxima de proteína na presença de co-solutos, pelo que a solução permanece visivelmente transparente (isto é, não mostra precipitados, cristais ou géis de proteína). A dependência da solubilidade da proteína da resistência iônica, forma de sal, pH, temperatura e determinados excipientes foi mecanisticamente explicada por alterações na tensão de superfície da água em geral e ligação de proteína aos íons de água versus auto- associação por Arakawa e colaboradores em Theory of protein solubility, Methods of Enzymology, 114: 49-77, 1985; Schein em Solubility as a function of protein structure and solvent components, BioTechnology 8 (4): 308-317, 1990; Jenkins em Three solutions of the protein solubility problem, Protein Science 7 (2): 376-382, 1998; e outros. A ligação de proteínas a excipientes ou sais específicos influencia a solubilidade através de alterações na conformação de proteína ou disfarçando determinados aminoácidos envolvidos em auto-interação. Proteínas também são, de preferência, hidratadas (e estabilizadas como conformações mais compactas) por determinados sais, aminoácidos e açúcares, levando à sua solubilidade alterada.

[0007] Espera-se que a agregação, a qual requer colisão bi- molecular, seja a via de degradação primária em soluções de proteína. A relação de concentração para formação de agregado depende do tamanho dos agregados, bem como do mecanismo de associação. Agregação de proteína pode resultar em associação covalente (por exemplo, dissulfeto-ligada) ou não covalente (reversível ou irreversível). Agregação irreversível através de associação não covalente geralmente ocorre via regiões hidrofóbicas expostas através de processos térmicos, mecânicos ou químicos que alteram a conformação nativa da proteína. Agregação de proteína pode ter um impacto sobre a atividade, farmacocinética e segurança da proteína, por exemplo, em virtude de imunogenicidade.

[0008] Uma abordagem típica para minimizar a agregação é restringir a mobilidade de proteínas de forma a reduzir o número de colisões. Liofilização com excipientes apropriados pode melhorar a estabilidade da proteína contra agregação através de diminuição da mobilidade de proteína e restrição de flexibilidade conformacional, com o benefício adicional de minimização de reações hidrolíticas conseqüentes à remoção de água. A adição de excipientes apropriados, incluindo lioprotetores, pode prevenir a formação de agregados durante o processo de liofilização, bem como durante armazenamento do produto final. Um parâmetro chave para proteção eficaz é a proporção molar do lioprotetor para proteína. Geralmente, proporções molares de 300:1 ou maiores são requeridas para proporcionar estabilidade adequada, especialmente para armazenamento em temperatura ambiente. Tais proporções também podem, contudo, levar a um aumento indesejável na viscosidade.

[0009] Liofilização permite projetar uma formulação com estabilidade e tonicidade apropriadas. Embora a isotonicidade não seja necessariamente requerida para administração SC, ela pode ser desejável para minimizar a dor quando de administração. A isotonicidade de um liofilizado é difícil de obter porque a proteína e os excipientes são concentrados durante o processo de reconstituição. Proporções molares de excipiente:proteína de 500:1 resultarão em preparados hipertônicos se a concentração final de proteína é objetivada a >100 mg/ml. Se o desejo é obter uma formulação isotônica, então, uma escolha de proporção molar menor de excipiente:proteína resultará em uma formulação potencialmente menos estável.

[00010] Determinação da maior concentração de proteína obtenível permanece um exercício empírico em virtude da natureza lábil da conformação de proteína e da propensão de interagir consigo mesma, com superfícies e com solutos específicos.

[00011] Exemplos que indivíduos que podem se beneficiar de formulações SC são aqueles que têm condições que requerem administração freqüente e crônica, tais como indivíduos com a doença do sistema imune artrite reumatóide e distúrbios imunes associados ao transplante de enxerto. Produtos de fármaco de proteína comercialmente disponíveis para o tratamento de artrite reumatóide incluem HUMIRA, ENBREL e REMICADE.

[00012] HUMIRA® (Abbott) é fornecido em seringas de vidro pré- enchidas de 1 ml de uso único como uma solução estéril isenta de conservante para administração subcutânea. A solução de HUMIRA é transparente e incolor, com um pH de cerca de 5,2. Cada seringa distribui 0,8 ml (40 mg) de produto de fármaco. Cada 0,8 ml de HUMIRA® contém 40 mg de adalimumab, 4,93 mg de cloreto de sódio, 0,69 mg de dihidrato de fosfato de sódio monobásico, 1,22 mg de dihidrato de fosfato de sódio dibásico, 0,24 mg de citrato de sódio, 1,04 mg de monohidrato de ácido cítrico, 9,6 mg de manitol, 0,8 mg de polisorbato 80 e água para injeção, USP. Hidróxido de sódio é adicionado, conforme necessário, para ajustar o pH.

[00013] ENBREL (Amgen) é fornecido como uma seringa de 1 ml pré-enchida de uso único como uma solução estéril, isenta de conservante para injeção subcutânea. A solução de ENBREL® é transparente e incolor e é formulada em um pH de 6,3 ± 0,2. Cada seringa pré-enchida de único uso de ENBREL® contém 0,98 ml de uma solução a 50 mg/ml de etanercept com 10 mg/ml de sacarose, 5,8 mg/ml de cloreto de sódio, 5,3 mg/ml de hidrocloreto de L-arginina, 2,6 mg/ml de monohidrato de fosfato de sódio monobásico e 0,9 mg/ml de fosfato de sódio dibásico anídrico. Administração de uma seringa pré- enchida de 50 mg/ml de ENBREL® proporciona uma dose equivalente a dois frascos de 25 mg de ENBREL® liofilizado, quando os frascos são reconstituídos e administrados conforme recomendado. Frascos ENBREL® para uso múltiplo contêm pó liofilizado estéril, branco, isento de conservante. Reconstituição com 1 ml de água para injeção bacteriostática estéril fornecida (BWFI), USP (contendo álcool benzílico a 0,9%) proporciona uma solução transparente e incolor para uso múltiplo com um pH de 7,4 ± 0,3 contendo 25 mg de etanercept, 40 mg de manitol, 10 mg de sacarose e 1,2 mg de trometamina.

[00014] REMICADE® (Centocor) é fornecido como um pó estéril, branco, liofilizado para infusão intravenosa. Após reconstituição com 10 ml de água estéril para injeção, USP, o pH resultante é de aproximadamente 7,2. Cada frasco para uso único contém 100 mg de infliximab, 500 mg de sacarose, 0,5 mg de polisorbato 80, 2,2 mg de fosfato de sódio monobásico, monohidrato e 6,1 mg de fosfato de sódio dibásico, dihidrato. Nenhum conservante está presente.

[00015] Produtos de fármaco de proteína comercialmente disponíveis para o tratamento de distúrbios imunes associados ao transplante de enxerto incluem SIMULECT e ZENAPAX.

[00016] O produto de fármaco SIMULECT® (Novartis) é um liofilizado estéril o qual está disponível em frascos de vidro incolores de 6 ml e está disponível em resistências de 10 mg e 20 mg. Cada frasco de 10 mg contém 10 mg de basiliximab, 3,61 mg de fosfato de potássio monobásico, 0,50 mg de hidrogen fosfato de dissódio (anídrico), 0,80 mg de cloreto de sódio, 10 mg de sacarose, 40 mg de manitol e 20 mg de glicina, a ser reconstituído em 2,5 ml de água estéril para injeção, USP. Cada frasco de 20 mg contém 20 mg de basiliximab, 7,21 mg de fosfato de sódio monobásico, 0,99 mg de hidrogen fosfato de dissódio (anídrico), 1,61 mg de cloreto de sódio, 20 mg de sacarose, 80 mg de manitol e 40 mg de glicina, a ser reconstituído em 5 ml de água estéril para injeção, USP. Nenhum conservante é adicionado.

[00017] ZENAPAX® (Roche Laboratories), 25 mg/5 ml, é fornecido como um concentrado incolor transparente, estéril para diluição adicional e administração intravenosa. Cada mililitro de ZENAPAX® contém 5 mg de daclizumab e 3,6 mg de monohidrato de fosfato de sódio monobásico, 11 mg de heptahidrato de fosfato de sódio dibásico, 4,5 mg de cloreto de sódio, 0,2 mg de polisorbato 80 e pode conter ácido clorídrico ou hidróxido de sódio para ajustar o pH para 6,9. Nenhum conservante é adicionado.

[00018] Moléculas de CTLA4Ig interferem com a co-estimulação de células T através de inibição da interação CD28-B7. Portanto, moléculas de CTLA4Ig podem proporcionar um uso terapêutico para doenças do sistema imune, tal como artrite reumatóide e distúrbios do sistema imune associados a transplante de enxerto.

[00019] Há uma necessidade por uma formulação estável eficaz, conveniente compreendendo moléculas de CTLA4Ig para tratamento de distúrbios do sistema imune.

Sumário da Invenção

[00020] A presente invenção proporciona formulações para tratamento de doenças do sistema imune através de administração, a um indivíduo, de moléculas de CTLA4Ig, as quais se ligam à moléculas de B7 sobre células B7-positivas, desse modo, impedindo as moléculas de B7 endógenas de se ligar à CTLA4Ig e/ou CD28 sobre células T.

[00021] A formulação liofilizada da invenção compreende a molécula de CTLA4Ig em uma proporção em peso de proteína para lioprotetor de pelo menos 1:2. O lioprotetor é, de preferência, açúcar, mais preferivelmente dissacarídeos, ainda mais preferivelmente sacarose ou maltose. A formulação liofilizada também pode compreender um ou mais dos componentes selecionados da lista consistindo de agentes de tamponamento, tensoativos, agentes de composição de volume e conservantes.

[00022] Em determinadas modalidades, a quantidade de sacarose ou maltose útil para estabilização de do produto de fármaco liofilizado está em uma proporção em peso de proteína para sacarose ou maltose de pelo menos 1:2, de preferência em uma proporção em peso de proteína para sacarose ou maltose de 1:2 a 1:5, mais preferivelmente em uma proporção em peso de proteína para maltose ou sacarose de cerca de 1:2.

[00023] A formulação subcutânea (SC) da invenção compreende a molécula de CTLA4Ig em uma concentração de proteína de pelo menos 100 mg/ml em combinação com açúcar em níveis de estabilização, de preferência em uma concentração de proteína de pelo menos 125 mg/ml em combinação com um açúcar em níveis de estabilização, em um veículo aquoso. O açúcar está, de preferência, em uma proporção em peso de proteína para açúcar de pelo menos 1:1,1. O estabilizante é, de preferência, empregado em uma quantidade de não mais do que aquela a qual pode resultar em uma viscosidade indesejada ou inadequada para administração via uma seringa SC. O açúcar é, de preferência, dissacarídeos, mais preferivelmente sacarose. A formulação SC pode também compreender um ou mais dos componentes selecionados da lista consistindo de agentes de tamponamento, tensoativos e conservantes.

[00024] Em determinadas modalidades, a quantidade de sacarose útil para estabilização do produto de fármaco SC de molécula de CTLA4Ig está em uma proporção em peso de proteína para sacarose de pelo menos 1:1, de preferência em uma proporção em peso de proteína para sacarose a 1:1,3 a 1:5, mais preferivelmente em uma proporção em peso de proteína para sacarose de cerca de 1:1,4.

[00025] A formulação líquida da invenção compreende a molécula de CTLA4Ig em uma concentração de proteína de pelo menos 20 mg/ml em combinação com um açúcar em níveis de estabilização, de preferência pelo menos 25 mg/ml em combinação com um açúcar em níveis de estabilização em um veículo aquoso. De preferência, o açúcar está em uma proporção em peso de proteína para açúcar de pelo menos 1:1. O açúcar é, de preferência, dissacarídeos, mais preferivelmente sacarose. A formulação líquida também pode compreender um ou mais dos componentes selecionados da lista consistindo de agentes de tamponamento, tensoativos e conservantes.

[00026] Em determinadas modalidades, a quantidade de sacarose útil para estabilização do produto de fármaco líquido está em uma proporção em peso de proteína para sacarose de pelo menos 1:1, de preferência em uma proporção em peso de proteína para sacarose de 1:2 a 1:10, mais preferivelmente em uma proporção em peso de proteína para sacarose de cerca de 1:2.

[00027] Em outra modalidade da invenção, um artigo de manufatura é proporcionado, o qual contém o produto de fármaco e, de preferência, proporciona instruções para seu uso.

[00028] A presente invenção ainda proporciona métodos para tratamento de doenças do sistema imune e indução de tolerância através de administração das formulações de molécula de CTLA4Ig da invenção.

Breve Descrição dos Desenhos

[00029] A FIG. 1 apresenta a seqüência de nucleotídeo (SEQ ID NO: 1) de uma porção de um cassete de expressão para uma molécula de CTLA4-Ig. Também mostrada é a seqüência de aminoácido (SEQ ID NO: 2) codificada pelo ácido nucleico. Moléculas de CTLA4-Ig que podem ser produzidas a partir desse cassete de expressão incluem moléculas tendo a seqüência de aminoácido com resíduos: (i) 26-383 de SEQ ID NO: 2, (ii) 26-382 de SEQ ID NO: 2, (iii) 27-383 de SEQ ID NO: 2 ou (iv) 26-382 de SEQ ID NO: 2 ou opcionalmente (v) 25-382 de SEQ ID NO: 2, ou (vi) 25-383 de SEQ ID NO: 2. O cassete de expressão compreende as seguintes regiões: (a) uma seqüência sinalizadora de Oncostatina M (nucleotídeos 11-88 de SEQ ID NO: 1; aminoácidos 1-26 de SEQ ID NO: 2); (b) um domínio extracelular de CTLA4 humana (nucleotídeos 89-463 de SEQ ID NO: 1; aminoácidos 27-151 de SEQ ID NO: 2); (c) uma porção modificada da região constante de IgG1 humana (nucleotídeos 464-1159 de SEQ ID NO: 1; aminoácidos 152-383 de SEQ ID NO: 2), incluindo uma região de dobradiça modificada (nucleotídeos 464-508 de SEQ ID NO: 1; aminoácidos 152-166 de SEQ ID NO: 2), um dmCH2 de IgG1 humana modificado (nucleotídeos 509-838 de SEQ ID NO: 1; aminoácidos 167-276 de SEQ ID NO: 2) e um domínio de CH3 de IgG1 humana (nucleotídeos 839-1159 de SEQ ID NO: 1; aminoácidos 277-383 de SEQ ID NO: 2).

[00030] A FIG. 2 representa uma seqüência de nucleotídeo (SEQ ID NO: 3) e aminoácido (SEQ ID NO: 4) de CTLA4-L104EA29Y-Ig (também conhecida como "L104EA29YIg" e "LEA29Y") compreendendo um peptídeo sinalizador; um domínio extracelular com mutação de CTLA4 começando na metionina na posição +1 e terminando em ácido aspártico na posição +124 ou começando em alanina na posição -1 e terminando em ácido aspártico na posição +124; e uma região de Ig. SEQ ID NOs: 3 e 4 representam uma seqüência de nucleotídeo e aminoácido, respectivamente, de L104EA29YIg compreendendo um peptídeo sinalizador; um domínio extracelular com mutação de CTLA4 começando na metionina na posição +27 e terminando em ácido aspártico na posição +150 ou começando em alanina na posição +26 e terminando em ácido aspártico na posição +150; e uma região de Ig. L104EA29YIg pode ter a seqüência de aminoácido com resíduos: (i) 26-383 de SEQ ID NO: 4, (ii) 26-382 de SEQ ID NO: 4; (iii) 27-383 de SEQ ID NO: 4 ou (iv) 27382 de SEQ ID NO: 4 ou opcionalmente (v) 25-382 de SEQ ID NO: 4 ou (vi) 25-383 de SEQ ID NO: 4.

Descrição Detalhada da Invenção

[00031] Conforme utilizado aqui:

[00032] Uma formulação ou produto de fármaco "estável" é um no qual a molécula de CTLA4Ig no mesmo retém essencialmente sua estabilidade física e química e integridade quando de armazenamento. Estabilidade das formulações de molécula de CTLA4Ig pode ser medida em temperaturas selecionadas após períodos de tempo selecionados. Por exemplo, um aumento na formação de agregado após liofilização e armazenamento é um indicador para instabilidade de uma formulação de molécula de CTLA4Ig liofilizada. Além de formação de agregado, retenção de clareza, cor e odor originais no decorrer da vida útil são indicadores utilizados para monitorar a estabilidade das soluções da molécula de CTLA4Ig. Espécies de HMW são multímeros (isto é, tetrâmeros, hexâmeros, etc.), os quais têm um peso molecular maior do que os dímeros de molécula de CTLA4Ig. Tipicamente, um produto de fármaco "estável" pode ser um em que o aumento na agregação, conforme medido através de um aumento no percentual de espécies de elevado peso molecular (% de HMW), é menor do cerca de 5% e, de preferência, menor do que cerca de 3% quando uma formulação é armazenada a 2-8 °C durante um ano. De preferência, o produto de fármaco fabricado compreende pelo menos cerca de 25% de espécies de HMW, de preferência menos de cerca de 15% de espécies de HMW, mais preferivelmente menos de cerca de 10% de espécies de HMW, ainda mais preferivelmente menos de cerca de 5% de espécies de HMW.

[00033] O monômero, dímero e espécies de HMW de molécula de CTLA4Ig podem ser separados através de cromatografia por exclusão de tamanho (SEC). SEC separa moléculas baseado no tamanho molecular. Separação é obtida através da exclusão ou inclusão molecular diferencial à medida que as moléculas migram ao longo do comprimento da coluna. Assim, decomposição aumenta como uma função do comprimento da coluna. Amostras de molécula de CTLA4Ig podem ser separadas usando um 2695 Alliance HPLC (Waters, Milford, MA) equipado com colunas TSK Gel® G3000SWXL (300 mm x 7,8 mm) e TSK Gel® G3000SWXL (40 mm x 6,0 mm) (Tosoh Bioscience, Montgomery, PA) aleatoriamente. Amostra a 10 mg/ml (alíquotas de 20 μl) são separadas usando uma fase móvel consistindo de KH2PO4 a 0,2 M, NaCl a 0,9%, pH de 6,8, em uma taxa de fluxo de 1,0 ml/min. As amostras são monitoradas em uma absorbância de 280 nm usando um detector 2487 Dual Wavelength da Water. Usando esse sistema, as espécies de HMW têm um tempo de retenção de 7,5 min ± 1,0 min. Cada pico é integrado com relação à área sob a curva. O % de espécies de HMW é calculado dividindo a área de pico de HMW pela área de pico total.

[00034] Uma formulação "reconstituída" é uma a qual foi preparada através de dissolução de uma formulação liofilizada em um veículo aquoso, de modo que a molécula de CTLA4Ig é dissolvida na formulação reconstituída. A formulação reconstituída é adequada para administração intravenosa (IV) a um paciente que precisa da mesma.

[00035] Uma formulação "isotônica" é uma a qual tem essencialmente a mesma pressão osmótica que o sangue humano. Formulações isotônicas geralmente terão uma pressão osmótica de cerca de 250 a 350 mOsmol/Kg de H2O. O termo "hipertônico" é usado para descrever uma formulação com uma pressão osmótica acima daquela do sangue humano. A isotonicidade pode ser medida usando um osmômetro do tipo pressão de vapor ou congelamento com gelo, por exemplo.

[00036] O termo "agente de tamponamento" se refere a um ou mais componentes que, quando adicionados a uma solução aquosa, são capazes de proteger a solução contra variações no pH quando de adição de ácido ou álcali ou quando de diluição com um solvente. Além dos tampões de fosfato, podem ser usados tampões de glicinato, carbonato, citrato e semelhantes, caso no qual íons de sódio, potássio ou amônio podem servir como um contra-íon.

[00037] Um "ácido" é uma substância que proporciona íons de hidrogênio em uma solução aquosa. Um "ácido farmaceuticamente aceitável" inclui ácidos orgânicos e inorgânicos os quais são não tóxicos na concentração e maneira pela qual eles são formulados.

[00038] Uma "base" é uma substância que proporciona íons de hidroxila em solução aquosa. "Bases farmaceuticamente aceitáveis" incluem bases orgânicas e inorgânicas as quais são não tóxicas na concentração e maneira pela qual elas são formuladas.

[00039] Um "lioprotetor" é uma molécula a qual, quando combinada com uma proteína de interesse, impede ou reduz a instabilidade química da proteína quando de liofilização e subseqüente armazenamento.

[00040] Um "conservante" é um agente que reduz a ação bacteriana e pode ser opcionalmente adicionado às formulações aqui. A adição de um conservante pode, por exemplo, facilitar a produção de uma formulação para múltiplos usos (múltiplas doses). Exemplos de conservantes potenciais incluem cloreto de octadecil dimetilbenzil amônio, cloreto de hexametônio, cloreto de benzalcônio (uma mistura de cloretos de alquilbenzil dimetil amônio na qual os grupos alquila são compostos de cadeia longa) e cloreto de benzetônio. Outros tipos de conservantes incluem álcoois aromáticos, tais como fenol, álcool butílico e benzílico, alquil parabenos, tais como metil ou propil parabeno, catecol, resorcinol, ciclohexanol, 3-pentanol e m-cresol.

[00041] Um "tensoativo" é uma molécula superfície-ativa contendo uma porção hidrofóbica (por exemplo, cadeia alquila) e uma porção hidrofílica (por exemplo, grupos carboxila e carboxilato). Tensoativo pode ser adicionado às formulações da invenção. Tensoativos adequados para uso em formulações da presente invenção incluem, mas não estão limitados a, polisorbatos (por exemplo, polisorbatos 20 ou 80); poloxâmeros (por exemplo, Poloxamer 80); sorbitan ésteres e derivados; lauril sulfato de sódio; octil glicosídeo de sódio; lauril-, miristil-, linoleil- ou estearil-sulfobetaína; lauril-, miristil-, linoleil- ou estearil-sarcosina; linoleil-, miristil- ou cetil-betaína; lauramidopropil-, cocamidopropil-, linoleamidopropil-, miristamidopropil-, palmidopropil- ou isoestearamido propil-betaína (por exemplo, lauramidopropil); miristamidopropil-, palmidopropil- ou isoestearamido propil- dimetilamina; metil cocoil-taurato de sódio ou metil oleil-taurato dissódico; e a série MONAQUATTM (Mona Industries, Inc., Paterson, N.J.), polietileno glicol, polipropileno glicol e copolímeros de etileno e propileno glicol (por exemplo, Pluronics, PF68 etc.).

[00042] Uma "substância de fármaco" se refere ao material de iniciação utilizado na formulação do produto de fármaco final. A composição típica de substância de fármaco de CTLA4Ig compreende uma concentração de proteína de 20 mg/ml a 60 mg/ml, pH de 7 a 8 e % de espécies de HMW de < 5%.

[00043] Uma "solução bruta formulada" se refere à formulação final antes de enchimento do recipiente, tal como a solução formulada antes de enchimento dos frascos para liofilização ou a solução formulada antes de enchimento da seringa para injeção SC.

[00044] Um "produto de fármaco" se refere à formulação final embalada em um recipiente a qual pode ser reconstituída antes de uso, tal como com um produto de fármaco liofilizado; diluída antes de uso adicionalmente, tal como com produto de fármaco líquido; ou utilizada como está, tal como com um produto de fármaco em solução SC.

[00045] Os termos "CTLA4Ig" ou "molécula de CTLA4-Ig" ou "molécula de CTLA4Ig" são usados permutavelmente e se referem a uma molécula de proteína que compreende pelo menos um polipeptídeo tendo um domínio extracelular de CTLA4 ou porção do mesmo e uma região constante de imunoglobulina ou porção da mesma. O domínio extracelular e a região constante de imunoglobulina podem ser do tipo silvestre ou mutantes ou modificados e de mamífero, incluindo de ser humano ou camundongo. O polipeptídeo pode ainda compreender domínios de proteína adicionais. Uma molécula de CTLA4-Ig também pode se referir à formas multiméricas do polipeptídeo, tais como dímeros, tetrâmeros e hexâmeros. Uma molécula de CTLA4-Ig também é capaz de se ligar à CD80 e/ou CD86.

[00046] O termo "B7-1" se refere à CD80; o termo "B7-2" se refere à CD86; e o termo "B7" se refere à B7-1 e B7-2 (CD80 e CD86). O termo "B7-1-Ig" ou "B7-1Ig" se refere à CD80-Ig; o termo "B7-2-Ig"ou "B7-2Ig" se refere à CD86-Ig.

[00047] Em uma modalidade, "CTLA4Ig" se refere a uma molécula de proteína tendo a seqüência de aminoácido com resíduos: (i) 26-383 de SEQ ID NO: 2, (ii) 26-382 de SEQ ID NO: 2; (iii) 27-383 de SEQ ID NO: 2 ou (iv) 27-382 de SEQ ID NO: 2 ou opcionalmente (v) 25-382 de SEQ ID NO: 2 ou (vi) 25-383 de SEQ ID NO: 2. Na forma monomérica, essas proteínas podem ser referidas aqui como "monômeros de SEQ ID NO: 2" ou monômeros "tendo uma seqüência SEQ ID NO: 2". Esses monômeros de SEQ ID NO: 2 podem dimerizar, de modo que combinações de dímero podem incluir, por exemplo: (i) e (i); (i) e (ii); (i) e (iii); (i) e (iv); (i) e (v); (i) e (vi); (ii) e (ii); (ii) e (iii); (ii) e (iv); (ii) e (v); (ii) e (vi); (iii) e (iii); (iii) e (iv); (iii) e (v); (iii) e (vi); (iv) e (iv); (iv) e (v); (iv) e (vi); (v) e (v); (v) e (vi); e (vi) e (vi). Essas diferentes combinações de dímero podem também se associar umas com as outras para formar moléculas de CTLA4Ig tetraméricas. Esses monômeros, dímeros, tetrâmeros e outros multímeros podem ser referidos aqui como "proteínas de SEQ ID NO: 2" ou proteínas "tendo uma seqüência SEQ ID NO: 2". (DNA que codifica CTLA4Ig, conforme mostrado em SEQ ID NO: 2, foi depositado em 31 de Maio de 1991 com o American Type Culture Collection (ATCC), 10801 University Blvd., Manassas, VA 20110-2209 sob as condições do Tratado de Budapeste e receberam o número de acesso à ATCC ATCC 68629; uma linhagem de célula de Ovário de Hâmster Chinês (CHO) expressando CTLA4Ig, conforme mostrado em SEQ ID NO: 2, foi depositada em 31 de Maio de 1991 com o número de identificação na ATCC CRL-10762). Conforme utilizado aqui, "Abatacept" se refere à proteínas com SEQ ID NO: 2.

[00048] Em uma modalidade, CTLA4-L104EA29Y-Ig (algumas vezes conhecida como "LEA29Y" ou "L104EA29Y") é uma proteína de fusão geneticamente manipulada similar, em estrutura, à molécula de CTAL4-Ig, conforme mostrado em SEQ ID NO: 1. L104EA29Y-Ig tem o domínio de ligação extracelular funcional da CTLA4 humana modificada e o domínio Fc da imunoglobulina humana da classe IgG1. Duas modificações de aminoácido, leucina para ácido glutâmico na posição 104 (L104E), a qual é a posição 130 de SEQ ID NO: 2 e alanina para tirosina na posição 29 (A29Y), a qual é a posição 55 de SEQ ID NO: 2, foram feitas na região de ligação B7 do domínio de CTLA4 para gerar L104EA29Y. SEQ ID NOS: 3 e 4 representam uma seqüência de nucleotídeo e aminoácido, respectivamente, de L104EA29YIg compreendendo um peptídeo sinalizador; um domínio extracelular com mutação de CTLA4 começando na metionina na posição +27 e terminando em ácido aspártico na posição +150 ou começando em alanina na posição +26 e terminando em ácido aspártico na posição +150; e uma região de Ig. DNA que codifica L104EA29Y-Ig foi depositado em 20 de Junho de 200, com a American Type Culture Collection (ATCC) sob as condições do Tratado de Budapeste. Ela recebeu o número de acesso à ATCC PTA-2104. L104EA29Y-Ig é ainda descrita na Patente U.S. 7.094.874, emitida em 22 de Agosto de 2006 e no WO 01/923337 A2, os quais são incorporados por referência em suas totalidades.

[00049] Expressão de L104EA29YIg em células de mamífero pode resultar na produção de variantes N- e C-terminais, de modo que as proteínas produzidas podem ter a seqüência de aminoácido com resíduos: (i) 26-383 de SEQ ID NO: 4, (ii) 26-382 de SEQ ID NO: 4; (iii) 27-383 de SEQ ID NO: 4 ou (iv) 27-382 de SEQ ID NO: 4 ou opcionalmente (v) 25-382 de SEQ ID NO: 4 ou (vi) 25-383 de SEQ ID NO: 4. Na forma monomérica, essas proteínas podem ser referidas aqui como "monômeros de SEQ ID NO: 4" ou monômeros "tendo a seqüência SEQ ID NO: 4". Essas proteínas podem dimerizar, de modo que combinações de dímero podem incluir, por exemplo: (i) e (i); (i) e (ii); (i) e (iii); (i) e (iv); (i) e (v); (i) e (vi); (ii) e (ii); (ii) e (iii); (ii) e (iv); (ii) e (v); (ii) e (vi); (iii) e (iii); (iii) e (iv); (iii) e (v); (iii) e (vi); (iv) e (iv); (iv) e (v); (iv) e (vi); (v) e (v); (v) e (vi); e (vi) e (vi). Essas diferentes combinações de dímero podem também se associar umas com as outras para formar moléculas de L104EA29YIg tetraméricas. Esses monômeros, dímeros, tetrâmeros e outros multímeros podem ser referidos aqui como "proteínas com SEQ ID NO: 4" ou proteínas "tendo uma seqüência SEQ ID NO: 4". Conforme utilizado aqui, "Belatacept" se refere à proteínas com SEQ ID NO: 4.

Monômeros e multímeros de CTLA4-Ig

[00050] Moléculas de CTLA4-Ig podem incluir, por exemplo, proteínas de CTLA4-Ig na forma de monômero, dímero, trímero, tetrâmero, pentâmero, hexâmero ou outras formas multiméricas. Moléculas de CTLA4-Ig podem compreender uma proteína de fusão com pelo menos um domínio extracelular de CTLA4 e uma região constante de imunoglobulina. Moléculas de CTLA4-Ig podem ter seqüências do tipo silvestre ou mutantes, por exemplo, com relação ao domínio extracelular de CTLA4 e seqüências de região constante de imunoglobulina. Monômeros de CTLA4-Ig, sozinhos ou na forma de dímero, tetrâmero ou outro multímero, podem ser glicosilados.

[00051] Em algumas modalidades, a invenção proporciona populações de moléculas de CTLA4-Ig que têm pelo menos um determinado percentual de moléculas de dímero ou outro multímero. Por exemplo, a invenção proporciona populações de moléculas de CTLA4-Ig que são maiores do que 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 99,5% de dímeros de CTLA4-Ig. Em uma modalidade, a invenção proporciona uma população de moléculas de CTLA4-Ig que compreende de cerca de 95% a cerca de 99,5% de dímeros de CTLA4-Ig e de cerca de 0,5% a cerca de 5% de tetrâmeros de CTLA4- Ig. Em outra modalidade, a população de moléculas de CTLA4-Ig compreende cerca de 98 % de dímero de CTLA4-Ig, cerca de 1,5% de tetrâmero de CTLA4-Ig e cerca de 0,5% de monômero de CTLA4-Ig.

[00052] Em uma modalidade, a invenção proporciona uma população de moléculas de CTLA4Ig em que a população é substancialmente isenta de moléculas de monômero de CTLA4Ig. Substancialmente isenta de moléculas de monômero de CTLA4Ig pode ser referir a uma população de moléculas de CTLA4Ig que têm menos de 1%, 0,5% ou 0,1% de monômeros.

[00053] Em uma modalidade, a invenção proporciona uma população de moléculas de CTLA4Ig em que a população é substancialmente isenta de multímeros de CTLA4Ig que são maiores do que dímeros, tais como tetrâmeros, hexâmeros, etc. Substancialmente isentas de moléculas de multímeros de CTLA4Ig maiores do que dímeros pode se referir a uma população de moléculas de CTLA4Ig que têm menos de 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0,5% ou 0,1% de multímeros de CTLA4-Ig maiores do que a forma dimérica.

[00054] Em uma modalidade, uma molécula monomérica de CTLA4Ig pode ter, por exemplo, a seqüência de aminoácido de: (i) 26383 de SEQ ID NO: 2, (ii) 26-382 de SEQ ID NO: 2 (iii) 27-383 de SEQ ID NO: 2 ou (iv) 27-382 de SEQ ID NO: 2 ou opcionalmente (v) 25-382 de SEQ ID NO: 2 ou (vi) 25-383 de SEQ ID NO: 2. Quando um cassete de expressão compreendendo a seqüência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 1 é expressa em células CHO, a forma monomérica predominante expressa tem o resíduo de aminoácido no N-término de metionina (resíduo 27 de SEQ ID NO: 2), o qual corresponde ao resíduo de aminoácido no N-término das amino da CTLA4 humana do tipo silvestre. Contudo, em virtude do fato de SEQ ID NO: 1 também incluir a seqüência de codificação para a seqüência sinalizadora de Oncostatina M (nucleotídeos 11-88 de SEQ ID NO: 1), a proteína expressa a partir de SEQ ID NO: 1 contém uma seqüência sinalizadora de Oncostatina M. A seqüência sinalizadora é clivada da proteína expressa durante o processo de exportação de proteína do citoplasma ou secreção da célula. Mas clivagem pode resultar em variantes N-terminais, tal como clivagem entre os resíduos de aminoácido 25 e 26 (resultando em um N-término de resíduo 26, isto é, a "variante Ala") ou entre os resíduos de aminoácido 24 e 25 (resultando em um N-término de resíduo 2, isto é, a "variante Met- Ala"), em oposição à clivagem entre resíduos de aminoácido 26 e 27 (resultando em um N-término de resíduo 27). Por exemplo, a variante Met-Ala pode estar presente em uma mistura de moléculas de CTLA4Ig em cerca de 1% e a variante Ala pode estar presente em uma mistura de moléculas de CTLA4Ig em cerca de 8-10%. Além disso, a proteína expressa a partir de SEQ ID NO: 1 pode ter variantes C-terminais em virtude de processamento incompleto. O C-término predominante é a glicina no resíduo 382 de SEQ ID NO: 2. Em uma mistura de moléculas de CTLA4Ig, monômeros tendo lisina no C- término (resíduo 383 de SEQ ID NO: 2) podem estar presentes, por exemplo, em cerca de 4-5%.

[00055] Uma molécula monomérica de CTLA4Ig pode compreender um domínio extracelular de CTLA4 humana. Em uma modalidade, o domínio extracelular pode compreender a seqüência de nucleotídeo dos nucleotídeos 89-463 de SEQ ID NO: 1 que codifica os aminoácidos 27-151 de SEQ ID NO: 2. Em outra modalidade, o domínio extracelular pode compreender seqüências mutantes da CTLA4 humana. Em outra modalidade, o domínio extracelular pode compreender alterações de nucleotídeo nos nucleotídeos 89-463 de SEQ ID NO: 1, de modo que alterações conservativas de aminoácido são feitas. Em outra modalidade, o domínio extracelular pode compreender uma seqüência de nucleotídeo que é pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica aos nucleotídeos 89-463 de SEQ ID NO: 1.

[00056] Uma molécula monomérica de CTLA4Ig pode compreender uma região constante de uma imunoglobulina humana. Essa região constante pode ser uma porção de uma região constante; essa região constante pode ter uma seqüência do tipo silvestre ou mutante. A região constante pode ser de IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA1, IgA2, IgD ou IgE humana. A região constante pode ser de uma cadeia leve ou uma cadeia pesada de uma imunoglobulina. Onde a região constante é de uma molécula de IgG, IgD ou IgA, a região constante pode compreender um ou mais dos seguintes domínios de região constante: CL, CH1, dobradiça, CH2 ou CH3. Onde a região constante é de IgM ou IgE, a região constante pode compreender um ou mais dos seguintes domínios de região constante: CL, CH1, CH2, CH3 ou Ca4. Em uma modalidade, a região constante pode compreender um ou mais domínios de região constante de IgG, IgD, IgA, IgM ou IgE.

[00057] Em uma modalidade, uma molécula monomérica de CTLA4Ig compreende uma região de dobradiça de IgG1 humana modificada (nucleotídeos 464-508 de SEQ ID NO: 1; aminoácidos 152166 de SEQ ID NO: 2), em que as serinas nos resíduos de aminoácido 156, 162 e 165 de SEQ ID NO: 2 foram manipuladas para cisteínas presentes na seqüência do tipo silvestre.

[00058] Em uma modalidade, uma molécula monomérica de CTLA4Ig compreende uma região CH2 de IgG1 humana modificada e uma região CH3 do tipo silvestre (o domínio CH2 de IgG1 humana modificada tendo nucleotídeos 509-838 de SEQ ID NO: 1 e aminoácidos 167-276 de SEQ ID NO: 2; o domínio CH3 de IgG1 humana tendo nucleotídeos 839-1159 de SEQ ID NO: 1 e aminoácidos 277-383 de SEQ ID NO: 2).

[00059] Em uma modalidade, uma população de moléculas de CTLA4Ig compreende monômeros tendo uma seqüência mostrada em qualquer uma ou mais das Figuras 7, 8 ou 9 da patente U.S. No. 7.094.874, emitida em 22 de Agosto de 2006 e pedidos de patente U.S. publicados como Publicações Nos.US20030083246 e US20040022787, as quais são aqui incorporadas por referência em sua totalidade.

[00060] Em uma modalidade, uma molécula tetramérica de CTLA4Ig compreende dois pares ou dois dímeros de polipeptídeos de CTLA4Ig, em que cada polipeptídeo tem uma das seguintes seqüências de aminoácido: (i) 26-383 de SEQ ID NO: 2, (ii) 26-382 de SEQ ID NO: 2, (iii) 27-383 de SEQ ID NO: 2 ou (iv) 27-382 de SEQ ID NO: 2 ou opcionalmente (v) 25-382 de SEQ ID NO: 2 ou (vi) 25-383 de SEQ ID NO: 2. Cada membro do par de polipeptídeos ou dímero é covalentemente ligado ao outro membro e os dois pares de polipeptídeos são não-covalentemente associados um ao outro, desse modo, formando um tetrâmero. Tais moléculas de tetrâmero são capazes de ligação à CD80 ou CD86.

[00061] Em outra modalidade, tais moléculas de tetrâmero podem se ligar à CD80 ou CD86 com uma avidez que é pelo menos 2 vezes maior do que a avidez de ligação de um dímero de CTLA4Ig (cujos monômeros têm uma das seqüências de aminoácido acima) à CD80 ou CD86. Em outra modalidade, tais moléculas de tetrâmero podem se ligar à CD80 ou CD86 com uma avidez que é pelo menos 2 vezes maior do que a afinidade ou avidez de ligação da CTLA4 do tipo silvestre à CD80 ou CD86. Essa maior avidez pode contribuir para maior eficácia no tratamento de distúrbios imunes e outras doenças, conforme descrito abaixo. Além disso, avidez maior ou aperfeiçoada pode produzir o resultado de maior potência de um fármaco. Por exemplo, uma composição terapêutica compreendendo tetrâmero de CTLA4Ig teria uma maior avidez e, portanto maior potência do que a mesma quantidade de uma composição terapêutica tendo um monômero de CTLA4Ig. Em outra modalidade, tais moléculas de tetrâmero podem ter pelo menos uma inibição 2 vezes maior sobre a proliferação de células T comparado com um dímero de CTLA4Ig (cujos monômeros têm uma das seqüências de aminoácido acima). Em outra modalidade, tais moléculas de tetrâmero podem ter pelo menos uma inibição 2 vezes maior sobre a proliferação de células T quando comparado com uma molécula de CTLA4 do tipo silvestre.

[00062] A proliferação de células T pode ser medida usando ensaios padrões conhecidos na técnica. Por exemplo, uma das formas mais comuns para avaliar a proliferação de células T é estimular células T via antígeno ou anticorpos agonísticos ao TCR e medir, por exemplo, a incorporação de timidina titulada (3H-TdR) em células T em proliferação ou a quantidade de citocinas liberadas por células T em proliferação em cultura. O efeito inibitório de moléculas de CTLA4Ig sobre a ativação ou proliferação de células T pode, desse modo, ser medido.

[00063] A afinidade de uma molécula de CTLA4Ig é a resistência de ligação da molécula a um único ligante, incluindo CD80, CD86 ou proteínas de fusão CD80Ig ou CD86Ig. A afinidade da CTLA4Ig por ligantes pode ser medida usando, por exemplo, análise de interação de ligação (BIA) baseada na técnica de plasmônio de superfície. Além de medir a resistência de ligação, ela permite determinação em tempo real da cinética de ligação, tal como as constantes de taxa de associação e dissociação. Uma lasca sensora, consistindo de uma lâmina de vidro revestida com um filme fino de metal, à qual uma matriz na superfície é covalentemente presa, é revestida com um dos agentes de interação, isto é, CTLA4Ig ou um dos ligantes. Uma solução contendo o outro agente de interação é deixada fluir sobre sua superfície. Um feixe de luz contínuo é dirigido contra o outro lado da superfície e seu ângulo de reflexão é medido. Quando de ligação de CTLA4Ig ao ligante, o ângulo de ressonância do feixe de luz altera (uma vez que ele depende do índice refrativo do meio próxima o lado reativo do sensor o qual, por sua vez, está diretamente correlacionado à concentração de material dissolvido no meio). Ele é subseqüentemente analisado com o auxílio de um computador.

[00064] Em uma modalidade, experimentos de ligação à CTLA4Ig podem ser realizados através de ressonância de plasmônio em superfície (SPR) sobre um instrumento BIAcore (BIAcore AG, Uppsala, Suécia). CTLA4Ig pode ser covalentemente acoplada, através de grupos amina primária, a uma matriz de dextrana carbóxi-metilada sobre uma lasca sensora BIAcore, desse modo, imobilizando a CTLA4Ig à lasca sensora. Alternativamente, um anticorpo anti-região constante pode ser usado para imobilizar CTLA4Ig indiretamente à superfície sensora via o fragmento de Ig. Após o que, ligantes são adicionados à lasca para medir a ligação de CTLA4Ig aos ligantes. Medições de afinidade podem ser realizadas, por exemplo, conforme descrito em van der Merwe, P. e colaboradores, J. Exp. Med. (1997) 185 (3): 393-404.

[00065] A avidez de moléculas de CTLA4Ig também pode ser medida. A avidez pode ser definida como a soma total da resistência de ligação de duas moléculas ou células uma à outra em múltiplos sítios. A avidez é distinta da afinidade, a qual é a resistência de ligação a um sítio sobre uma molécula a seu ligante. Sem estar preso à teoria, maior avidez de moléculas de CTLA4Ig pode levar a uma potência aumentada de inibição pelas moléculas de CTLA4Ig sobre a proliferação e ativação de células T. A avidez pode ser medida, por exemplo, através de duas categorias de ensaios em fase sólida: a) ensaios de inibição competitiva e b) ensaios de eluição. Em ambos, o ligante é preso a um suporte sólido. No ensaio de inibição competitiva, moléculas de CTLA4Ig são, então, adicionadas em solução em uma concentração fixa, junto com ligante livre em diferentes concentrações e a quantidade de ligante a qual inibe a ligação à fase sólida em 50% é determinada. Quanto menos ligante necessário, mais forte a avidez. Em ensaios de eluição, o ligante é adicionado em solução. Após obtenção de um estado de equilíbrio, um agente caotrópico ou agente de desnaturação (por exemplo, isotiocianato, uréia ou dietilamina) é adicionado em diferentes concentrações para romper as interações CTLA4Ig/ligante. A quantidade de CTLA4Ig que resiste à eluição é determinada depois com um ELISA. Quanto maior a avidez, mais agente caotrópico é necessário para eluir uma determinada quantidade de CTLA4Ig. A avidez relativa de uma mistura heterogênea de moléculas de CTLA4Ig pode ser expressa como o índice de avidez (AI), igual à concentração de agente de eluição necessária para eluir 50% das moléculas de CTLA4Ig ligadas. Análise refinada de dados pode ser realizada determinando os percentuais de CTLA4Ig eluída em diferentes concentrações do agente de eluição.

Métodos para Produção das Moléculas de CTLA4Ig da Invenção

[00066] Expressão de moléculas de CTLA4Ig pode ser em células procariotas. Procariotas são, mais freqüentemente, representadas por várias cepas de bactérias. As bactérias podem ser gram positivas ou gram negativas. Tipicamente, bactérias gram-negativas, tal como E. coli, são preferidas. Outras cepas microbianas podem também ser usadas.

[00067] Seqüências, conforme descrito acima, que codificam moléculas de CTLA4Ig, podem ser inseridas em um vetor projetado para expressão de seqüências estranhas em células procariotas, tal como E. coli. Esses vetores podem incluir seqüências de controle procariotas comumente usadas as quais são definidas aqui para incluir promotores para início de transcrição, opcionalmente com um operador, junto com seqüências de sítio de ligação ribossômica, incluem promotores comumente usados, tais como os sistemas de promotor de beta-lactamase (penicilinase) e lactose (lac) (Chang e colaboradores, (1977) Nature 198: 1056), o sistema de promotor de triptofano (trp) (Goeddel e colaboradores, (1980) Nucleic Acids Res. 8: 4057) e o promotor PL lambda-derivado e sítio de ligação ribossômica do N-gene (Shimatake e colaboradores, (1981) Nature 292: 128).

[00068] Tais vetores de expressão também incluirão origens de replicação e marcadores selecionáveis, tal como um gene de betalactamase ou fosfotransferase de neocimina que confere resistência a antibióticos, de modo que os vetores possam se replicar em bactérias e células trazendo os plasmídeos podem ser selecionadas para crescimento na presença de antibióticos, tais como ampicilina ou canamicina.

[00069] O plasmídeo de expressão pode ser introduzido em células procariotas via uma variedade de métodos padrões incluindo, mas não limitado a, CaCl2-choque (Cohen, (1972) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69: 2110 e Sambrook e colaboradores (eds.), "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 2a Edição, Cold Spring Harbor Press, (1989)) e eletroporação.

[00070] De acordo com a prática da invenção, células eucariotas são também células hospedeiras adequadas. Exemplos de células eucariotas incluem qualquer célula animal, quer primária ou imortalizada, levedo (por exemplo, Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe e Pichia pastoris) e células de planta. Células de mieloma, COS e CHO são exemplos de células animais que podem ser usadas como hospedeiros. Células CHO particulares incluem, mas não estão limitadas a, DG44 (Chasin e colaboradores, 1986 Som. Cell. Molec. Genet. 12: 555-556; Kolkekar 1997 Biochemistry 36: 10901-10909), CHO-K1 (ATCC No. CCL-61), a linhagem de célula CHO-K1 Tet-On (Clontech), CHO designada ECACC 85050302 (CAMR, Salisbury, Wiltshire, Reino Unido), o clone 13 de CHO (GEIMG, Genova, IT), clone B de CHO (GEIMG, Genova, IT), CHO-K1/SF designada ECACC 93061607 (CAMR, Salisbury, Wiltshire, Reino Unido) e RR-CHOK1 designada ECACC 92052129 (CAMR, Salisbury, Wiltshire, Reino Unido). Células de planta ilustrativas incluem células de tabaco (plantas inteiras, cultura de células ou caule), milho, soja e arroz. Sementes de milho, soja e arroz também são aceitáveis.

[00071] Seqüências de ácido nucleico que codificam moléculas de CTLA4Ig descritas acima também podem ser inseridas em um vetor projetado para expressão de seqüências estranhas em um hospedeiro eucariota. Os elementos regulatórios do vetor podem variar de acordo com o hospedeiro eucariota em particular.

[00072] Seqüências de controle eucariotas comumente usadas em vetores de expressão incluem seqüências promotoras e de controle compatíveis com células de mamífero tais como, por exemplo, promotor de CMV (vetor CDM8) e vírus sarcoma de aves (ASV) (vetor πLN). Outros promotores comumente usados incluem os promotores precoce e tardio de Simian Virus 40 (SV40) (Fiers e colaboradores, (1973) Nature 273: 113) ou outros promotores virais, tais como aqueles derivados de polioma, Adenovírus 2 e papiloma vírus bovino. Um promotor induzível, tal como hMTII (Karin e colaboradores, (1982) Nature 299: 797-802) também pode ser usado.

[00073] Vetores para expressão de moléculas de CTLA4Ig em eucariotas também podem trazer seqüências denominadas regiões intensificadoras. Essas são importantes em otimização de expressão de gene e são encontradas a montante ou a jusante da região promotora.

[00074] Exemplos de vetores de expressão para células hospedeiras eucariotas incluem, mas não estão limitados a, vetores para células hospedeiras de mamífero (por exemplo, BPV-1, pHyg, pRSV, pSV2, pTK2 (Maniatis); pIRES (Clontech); pRc/CMV2, pRc/RSV, pSFV1 (Life Technologies); Vetores pVPakc, vetores pCMV, vetores pSG5 (Stratagene)), vetores retrovirais (por exemplo, vetores pFB (Stratagene)), pCDNA-3 (Invitrogen) ou formas modificadas dos mesmos, vetores adenovirais; vetores Adenovírus-associados, vetores de baculovírus, vetores de levedo (por exemplo, vetores pESC (Stratagene)).

[00075] Seqüências de ácido nucleico que codificam moléculas de CTLA4Ig podem se integrar no genoma da célula hospedeira eucariota e replicar à medida que o genoma do hospedeiro se reproduz. Alternativamente, o vetor trazendo moléculas de CTLA4Ig podem conter origens de replicação que permitem replicação extracromossômica.

[00076] Para expressão das seqüências de ácido nucleico em Saccharomyces cerevisiae, a origem de replicação do plasmídeo de levedo endógena, o círculo 2 μ, pode ser usada. (Broach, (1983) Meth. Enz. 101: 307). Alternativamente, seqüências do genoma de levedo capazes de promover replicação autônoma podem ser usadas (veja, por exemplo, Stinchcomb e colaboradores, (1979) Nature 282: 39); Tschemper e colaboradores, (1980) Gene 10: 157; e Clarke e colaboradores, (1983) Meth. Enz. 101: 300).

[00077] Seqüências de controle transcricional para vetores de levedo incluem promotores para a síntese de enzimas glicolíticas (Hess e colaboradores, (1968) J. Adv. Enzyme Reg. 7: 149; Holland e colaboradores, (1978) Biochemistry 17: 4900). Promotores adicionais conhecidos na técnica incluem o promotor de CMV fornecido no vetor CDM8 (Toyama e Okayama, (1990) FEBS 268: 217-221); o promotor para quínase de 3-fosfoglicerato (Hitzeman e colaboradores, (1980) J. Biol. Chem. 255: 2073) e aqueles para outras enzimas glicolíticas.

[00078] Outros promotores são induzíveis porque eles podem ser regulados por estímulos ambientais ou o meio de crescimento das células. Esses promotores induzíveis incluem aqueles dos genes para proteínas de choque térmico, dehidrogenase 2 de álcool, isocitocroma C, fosfatase ácida, enzimas associadas ao catabolismo de nitrogênio e enzimas responsáveis pela utilização de maltose e galactose.

[00079] Seqüências regulatórias também podem ser colocadas na extremidade 3' das seqüências de codificação. Essas seqüências podem atuar para estabilizar o RNA mensageiro. Tais terminadores são encontrados na região não traduzida 3' após as seqüências de codificação em vários genes derivados de levedo e mamífero.

[00080] Vetores ilustrativos para plantas e células de planta incluem, mas não estão limitados a, plasmídeos Ti de Agrobacterium , vírus mosaico da couve-flor (CaMV) e vírus mosaico dourado de tomate (TGMV).

[00081] Células de mamífero podem ser transformadas através de métodos incluindo, mas não limitado a, transfecção na presença de fosfato de cálcio, microinjeção, eletroporação ou via transdução com vetores virais.

[00082] Métodos para introdução de seqüências de DNA estranhas em genomas de planta e levedo incluem (1) métodos mecânicos, tal como microinjeção de DNA em células simples ou protoplastas, turbilhonamento de células com glóbulos de vidro na presença de DNA ou disparo de esferas de tungstênio ou ouro revestidas com DNA em células ou protoplastas; (2) introdução de DNA tornando as membranas celulares permeáveis à macromoléculas através de tratamento com polietileno glicol ou sujeição a pulsos elétricos de alta voltagem (eletroporação); ou (3) o uso de lipossomas (contendo cDNA), os quais se fundem às membranas celulares.

[00083] A publicação de pedido de Patente US Número 20050019859 e Publicação de pedido de patente US número 20050084933 ensinam processos para a produção de proteínas da invenção, especificamente produtos de glicoproteína recombinante, através de culturas de células de animal ou mamífero e são aqui incorporadas por referência.

[00084] Após a fase de produção de proteína do processo de cultura de células, moléculas de CTLA4Ig são recuperadas do meio de cultura de célula usando métodos compreendidos por aqueles habilitados na técnica. Em particular, a molécula de CTLA4Ig é recuperada do meio de cultura como um polipeptídeo secretado.

[00085] O meio de cultura é inicialmente centrifugado para remover restos celulares e partículas. A proteína desejada é subseqüentemente purificada do DNA contaminante, proteínas solúveis e polipeptídeos, com os seguintes procedimentos de purificação não limitativos bem estabelecidos na técnica: SDS-PAGE; precipitação com sulfato de amônio; precipitação com etanol; fracionamento sobre colunas de imunoafinidade ou troca de íons; HPLC de fase reversa; cromatografia sobre sílica ou sobre uma resina de troca de ânions, tal como QAE ou DEAE; cromatofocalização; filtração em gel usando, por exemplo, uma coluna Sephadex G-75TM ; e colunas de proteína A SepharoseTM para remover contaminante, tal como IgG. A adição de um inibidor de protease, tal como fluoreto de fenil metil sulfonila (PMSF) ou uma mistura de coquetel de inibidor de protease, também pode ser útil para inibir degradação proteolítica durante purificação. Aqueles habilitados na técnica reconhecerão que métodos de purificação adequados para uma proteína de interesse, por exemplo, uma glicoproteína, podem requerer alterações que levem em conta mudanças no caráter da proteína quando de expressão em cultura de células recombinantes.

[00086] Técnicas e métodos de purificação que selecionam os grupos carboidrato da glicoproteína também são de utilidade dentro do contexto da presente invenção. Por exemplo, tais técnicas incluem HPLC ou cromatografia de troca de íons usando resinas de troca de cátions ou ânions, em que a fração mais básica ou mais ácida é coletada, dependendo de qual carboidrato está sendo selecionado. O uso de tais técnicas também pode resultar na concomitante remoção de contaminantes.

[00087] O método de purificação pode ainda compreender etapas adicionais que inativam e/ou removem vírus e/ou retrovírus que poderiam estar potencialmente presentes no meio de cultura de células de linhagens de células de mamífero. Um número significativo de etapas de eliminação viral estão disponíveis incluindo, mas não limitado a, tratamento com agentes caotrópicos, tais como uréia ou guanidina, detergentes, etapas adicionais de ultrafiltração/diafiltração, separação convencional, tal como cromatografia de troca de íons ou por exclusão de tamanho, extremos de pH, calor, proteases, solventes orgânicos ou qualquer combinação dos mesmos.

[00088] A molécula de CTLA4Ig purificada requer concentração e uma troca de tampão antes de armazenamento ou processamento adicional. Um sistema Pall Filtron TFF pode ser usado para concentrar e trocar o tampão de eluição da coluna de purificação anterior pelo tampão final desejado para a substância de fármaco.

[00089] Em um aspecto, moléculas de CTLA4Ig purificadas as quais tenham sido concentradas e submetidas a uma etapa de diafiltração podem ser enchidas em garrafas Biotainer® de 2 L, saco Bioprocess de 50 L ou qualquer outro vaso adequado. As moléculas de CTLA4Ig em tais vasos podem ser armazenadas durante cerca de 60 dias a 2 a 8 °C antes de congelamento. Armazenamento prolongado de moléculas de CTLA4Ig purificadas a 2 a 8 °C pode levar a um aumento da proporção de espécies de HMW. Portanto, para armazenamento a longo prazo, as moléculas de CTLA4Ig podem ser congeladas em torno de -70 °C antes de armazenamento e armazenadas em uma temperatura de cerca de -40 °C. A temperatura de congelamento pode variar de cerca de -50 °C a cerca de -90 °C. O tempo de congelamento pode variar e depende grandemente do volume do vaso que contém as moléculas de CTLA4Ig e do número de vasos que são carregados ao congelador. Por exemplo, em uma modalidade, moléculas de CTLA4Ig estão em garrafas Biotainer® de 2L. Carregamento de menos de quatro garrafas Biotainer® de 2L no congelador pode requerer um tempo de congelamento de cerca de 114 a pelo menos cerca de 18 horas. Carregamento de pelo menos quatro garrafas pode requerer um tempo de congelamento de cerca de 18 a pelo menos 24 horas.Vasos com moléculas de CTLA4Ig congeladas são armazenados em uma temperatura de cerca de -35 °C a cerca de -55 °C. O tempo de armazenamento em uma temperatura de cerca de -35 °C a cerca de -55 °C pode variar e pode ser tão curto quanto 18 horas. A substância de fármaco congelada pode ser descongelada de uma maneira controlada para formulação do produto de fármaco.

[00090] Os pedidos de patente US co-pendentes No. de Série 60/752.267, depositado em 20 de Dezembro de 2005 e 06/849.543, depositado em 5 de Outubro de 2006 e pedido de patente PCT, No. de Documento do Procurador No. 10734 PCT, intitulado " Cell Lines, Compositions and Methods for Producing a Composition" pelo inventor Kirk Leister, depositado em 19 de Dezembro de 2006, ensinam processos para a produção de proteínas da invenção, especificamente produtos de glicoproteína recombinantes, através de culturas de células de animal ou mamífero, e são aqui incorporados por referência.

Formulação Liofilizada da Invenção

[00091] A formulação liofilizada da invenção compreende a molécula de CTLA4Ig em uma proporção em peso de proteína para lioprotetor de pelo menos 1:2. O lioprotetor é, de preferência, açúcar, mais preferivelmente dissacarídeos, ainda mais preferivelmente sacarose ou maltose. A formulação liofilizada pode também compreender um ou mais dos componentes selecionados da lista consistindo de agentes de tamponamento, tensoativos, agentes de composição de volume e conservantes.

[00092] Durante estudos de desenvolvimento de formulação, os efeitos de vários excipientes sobre a estabilidade em estado sólido liofilizada e em solução da molécula de CTLA4Ig, foram avaliados.

[00093] A instabilidade da molécula de CTLA4Ig liofilizada na ausência de um estabilizante realçou claramente a necessidade de inclusão de um lioprotetor na formulação. Estudos iniciais de triagem mostraram que o produto de fármaco era estável na presença de açúcares, tais como maltose e sacarose, e aminoácidos, tais como arginina e lisina. Polióis, tal como manitol e polissacarídeos, tal como dextrana 40, foram prejudiciais para sua estabilidade. Os lioprotetores preferidos são os dissacarídeos maltose e sacarose.

[00094] O Exemplo VI descreve estudos de estabilidade do produto de fármaco liofilizado abatacept na presença de maltose armazenado a 50 °C. Um aumento nas espécies de elevado peso molecular (HMW) foi monitorado usando um ensaio de cromatografia por exclusão de tamanho indicando estabilidade (SE-HPLC). Os resultados demonstram que a estabilidade da molécula de CTLA4Ig em uma forma em estado sólido liofilizada é intensificada na presença de maltose.

[00095] A quantidade de sacarose ou maltose útil para estabilização do produto de fármaco liofilizado está em uma proporção em peso de proteína para sacarose ou maltose de pelo menos 1:2, de preferência em uma proporção de em peso de proteína para sacarose ou maltose de 1:2 a 1:5, mais preferivelmente em uma proporção em peso de proteína para maltose ou sacarose de 1:2.

[00096] Se necessário, o pH da formulação, antes de liofilização, é ajustado através da adição de um ácido e/ou base farmaceuticamente aceitável. O ácido farmaceuticamente aceitável preferido é ácido clorídrico. A base preferida é hidróxido de sódio.

[00097] Durante desenvolvimento de formulação, a estabilidade do produto de fármaco liofilizado foi estudada como uma função do pH. O pH da solução foi ajustado para entre 6 a 8 antes de liofilização. As amostras foram colocadas sob estabilidade e os frascos com produto constituído foram monitorados com relação a um aumento nas espécies de elevado peso molecular em vários pontos de tempo usando um ensaio de cromatografia por exclusão de tamanho indicando estabilidade (SE-HPLC). Sob a condição de uso recomendada de 2-8 °C, nenhuma alteração significativa na taxa de formação de espécies de HMW foi observada. Adicionalmente, os dados de estabilidade em estado de solução gerados durante um desenvolvimento anterior mostraram que o pH para estabilidade máxima deve estar entre 7 e 8. A faixa de pH aceitável para o produto de fármaco liofilizado é de 7 a 8, com um pH alvo preferido de 7,5.

[00098] Em outro aspecto, os sais ou componentes do tampão podem ser adicionados em uma quantidade de pelo menos cerca de 10 mM, de preferência 10-200 mM. Os sais e/ou tampões são farmaceuticamente aceitáveis e são derivados de vários ácidos conhecidos (inorgânicos e orgânicos), com metais ou aminas de "formação de base". Além de tampões de fosfato, podem ser usados tampões de glicinato, carbonato, citrato e semelhantes, caso no qual íons de sódio, potássio ou amônio podem servir como um contra-íon.

[00099] Um "agente de composição de volume" é um composto o qual adiciona massa a uma mistura liofilizada e contribui para a estrutura física do bolo liofilizado (por exemplo, facilita a produção de um bolo liofilizado essencialmente uniforme o qual mantém uma estrutura de poro aberta). Agentes de composição de volume ilustrativos incluem manitol, glicina, polietileno glicol e sorbitol. As formulações liofilizadas da presente invenção podem conter tais agentes de composição de volume.

[000100] Um conservante pode ser opcionalmente adicionado às formulações aqui para reduzir a ação bacteriana. A adição de um conservante pode, por exemplo, facilitar a produção de uma formulação para uso múltiplo (múltiplas doses).

[000101] Aqueles habilitados na técnica selecionarão a quantidade de produto de fármaco a ser enchido em um frasco dependendo das dosagens e esquema de administração requerido para um tratamento específico. Por exemplo, a concentração de CTLA4Ig por frasco pode oscilar de 50 a 300 mg/frasco, de preferência 100 a 250 mg/frasco.

[000102] Uma composição típica do produto de fármaco abatacept liofilizado é listada na Tabela 1 abaixo. Tabela 1 Composição de produto de fármaco abatacept liofilizado (250 mg/frasco) Componente Quantidade (mg/frasco) a Inclui um excesso de 5% para perdas no frasco, agulha, seringa b Esses componentes estão presentes na solução de substância de fármaco abatacept

[000103] Uma composição típica do produto de fármaco belatacept liofilizado é listada na Tabela 2 abaixo. Tabela 2 Composição de produto de fármaco belatacept liofilizado, 100 mg/frasco a Cada frasco contém um excesso de 10% para perdas no frasco, agulha e seringa dasolução reconstituída.

[000104] O produto de fármaco liofilizado é constituído com um veículo aquoso. O veículo aquoso de interesse aqui é um o qual é farmaceuticamente aceitável (seguro e não tóxico para administração a um ser humano) e é útil para o preparo da formulação líquida, após liofilização. Diluentes ilustrativos incluem água estéril para injeção (SWFI), água bacteriostática para injeção (BWFI), uma solução com pH tamponado (por exemplo, solução salina tamponada com fosfato), solução salina estéril, solução de Ringer ou solução de dextrose.

[000105] De preferência, o produto de fármaco liofilizado da presente invenção é constituído com água estéril para injeção, USP (SWFI) ou cloreto de sódio a 0,9% para injeção, USP. Durante constituição, o pó liofilizado dissolve rapidamente, proporcionando uma solução transparente, incolor.

[000106] Tipicamente, o produto de fármaco liofilizado da presente invenção é constituído para cerca de 25 mg/ml com 10 ml de água estéril para injeção, USP (SWFI) ou cloreto de sódio a 0,9% para injeção, USP. A solução constituída é ainda diluída para concentrações de produto de fármaco entre 1 e 10 mg/ml com cloreto de sódio a 0,9% para injeção, USP. O produto de fármaco diluído para injeção é isotônico e adequado para administração através de infusão intravenosa.

[000107] Durante desenvolvimento clínico anterior, descobriu-se que as soluções constituídas de produto de fármaco liofilizado eram incompatíveis com seringas siliconizadas descartáveis, as quais são comumente usadas para o preparo e administração dos produtos parenterais. Especificamente, a solução de produto de fármaco constituída desenvolvia partículas gelatinosas semelhantes a filamentos quando armazenadas nessas seringas durante mais de 1015 minutos. Outros estudos demonstraram que essa incompatibilidade era em virtude da interação do produto de fármaco com óleo de silicone (dimetil-siloxano), o qual é usado como um lubrificante nessas seringas. A formação dessas partículas não afeta a potência da solução de produto de fármaco durante seu tempo de uso. Seringas sem silicone são, de preferência, utilizadas para constituição do produto de fármaco e transferência das soluções constituídas do frasco para o saco intravenoso.

[000108] Alternativamente, um tensoativo pode ser adicionado à formulação para reduzir ou prevenir a interação do produto de fármaco constituído com a seringa siliconizada, por exemplo, em uma quantidade suficiente do mesmo.

[000109] A condição de armazenamento recomendada para uma formulação liofilizada é de 2-8 °C com uma vida útil recomendada de pelo menos 12 meses.

Preparação da Formulação Liofilizada

[000110] O processo de fabricação do produto de fármaco liofilizado envolve formação de lote da solução formulada bruta para liofilização, filtração asséptica, enchimento em frascos, congelamento dos frascos em uma câmara de congelamento-secagem, seguido por liofilização, colocação de tampas e vedação.

[000111] Os Exemplos III e IV descrevem a fabricação dos produtos de fármaco abatacept e CTLA4Ig liofilizados, respectivamente.

[000112] A solução bruta formulada é, tipicamente, ajustada em uma concentração fixa de proteína, de modo que o volume desejado de enchimento do frasco seja mantido constante. Durante a adição de lioprotetor, a velocidade do misturador é controlada a 250 ± 50 rpm, de modo a minimizar a espumação na solução de formação de lote e assegurar dissolução completa do lioprotetor dentro de 10 a 20 minutos. A solução bruta formulada pode ser armazenada sob 2-8 °C ou temperatura ambiente e luz ambiente durante pelo menos 32 horas antes de liofilização.

[000113] A solução bruta formulada não é terminalmente esterilizada em virtude da sensibilidade ao calor da molécula de CTLA4Ig. A solução bruta formulada pode ser esterilizada usando dois filtros com grau de esterilização Millipore Millipak® de 0,22 μm em série antes de enchimento em frascos para liofilização.

[000114] O ciclo de congelamento-secagem selecionado para esse produto é otimizado de forma a ter sublimação e evaporação suficientes durante as fases primária e secundária de secagem, respectivamente, sem comprometer a qualidade do produto.

[000115] Para auxiliar na dissolução rápida do pó liofilizado e impedir a formação de espuma excessiva durante constituição do produto de fármaco, os frascos liofilizados são tampados sob uma pressão de câmara de 500 ± 100 mícrons ao final do ciclo de congelamento- secagem.

[000116] Aqueles habilitados na técnica estarão cientes da necessidade de encher o recipiente em excesso de modo a compensar perdas no frasco, agulha, seringa durante preparo e injeção. Por exemplo, cada frasco de produto de fármaco abatacept, 250 mg/ml, contém um excesso de 5% do produto de fármaco para levar em conta perdas quando de reconstituição e extração.

Formulação Subcutânea Líquida

[000117] Aqueles habilitados na técnica reconhecerão a inconveniência de uma formulação IV para o paciente que precisa de terapia crônica freqüente. O paciente tem de fazer visitas freqüentes ao hospital para receber seu fármaco via uma infusão IV que pode durar tanto quanto uma hora. Conseqüentemente, uma formulação SC que pudesse ser auto-administrada em casa seria muito benéfica para tal paciente.

[000118] Para administração subcutânea, uma forma de dosagem com altas concentrações de proteína é desejada. Tratamentos com altas doses de mais de 1 mg/kg (>100 mg por dose) requerem desenvolvimento de formulações em concentrações excedendo a 100 mg/ml em virtude do pequeno volume (< 1,5 ml) que pode ser fornecido através de vias SC. De forma a otimizar a estabilidade a longo prazo em alta concentração contra a formação de espécies de elevado peso molecular, estudos de desenvolvimento de formulação foram conduzidos para avaliar o efeito de vários excipientes sobre a estabilidade em estado de solução das formulações SC líquidas da invenção.

[000119] A formulação SC da invenção compreende a molécula de CTLA4Ig em uma concentração de proteína de pelo menos 100 mg/ml em combinação com um açúcar em níveis de estabilização, de preferência em uma concentração de proteína de pelo menos 125 mg/ml em combinação com um açúcar em níveis de estabilização, em um veículo aquoso. O açúcar está, de preferência, em uma proporção em peso de proteína para açúcar de pelo menos 1:1,1. O estabilizante é, de preferência, empregado em uma quantidade não maior do que aquela a qual pode resultar em uma viscosidade indesejável ou inadequada para administração via uma seringa SC. O açúcar é, de preferência, dissacarídeos, mais preferivelmente sacarose. A formulação SC também pode compreender um ou mais dos componentes selecionados da lista consistindo de agentes de tamponamento, tensoativos e conservantes.

[000120] O perfil de estabilidade da formulação SC foi avaliado na presença de vários estabilizantes, incluindo açúcares, polissacarídeos, aminoácidos, tensoativos, polímeros, ciclodextranas, proteínas, etc. Dentre todos os excipientes avaliados, açúcares tais como sacarose, manitol e trealose, tiveram um melhor efeito de estabilização contra a formação de espécies de elevado peso molecular.

[000121] Os Exemplos V e VIII descrevem estudos de estabilidade do produto de fármaco belatacept e abatacept SC, respectivamente, na presença de sacarose armazenados em várias temperaturas durante vários períodos de tempo. Um aumento nas espécies de elevado peso molecular foi monitorado usando um ensaio de cromatografia por exclusão de tamanho indicando estabilidade (SE- HPLC). Os resultados demonstram que a estabilidade da molécula de CTLA4Ig na formulação SC é intensificada na presença de sacarose. Estabilização através de sacarose foi melhor em uma maior proporção em peso de sacarose:proteína. Baseado nesses estudos, sacarose foi selecionada com o estabilizante em uma proporção que fornece estabilidade ótima sem resultar em uma solução SC com hipertonicidade excessiva.

[000122] A quantidade de sacarose útil para estabilização do produto de fármaco SC está em uma proporção em peso de proteína para sacarose de pelo menos 1:1, de preferência em uma proporção em peso de proteína para sacarose de 1:1,3 a 1:5, mais preferivelmente em uma proporção em peso de proteína para sacarose de cerca de 1:1,4.

[000123] Se necessário, o pH da formulação é ajustado através da adição de um ácido e/ou base farmaceuticamente aceitável. O ácido farmaceuticamente aceitável preferido é ácido clorídrico. A base preferida é hidróxido de sódio.

[000124] Durante desenvolvimento de formulação, a estabilidade do produto de fármaco SC foi estudada como uma função do pH. O Exemplo V descreve estudos de estabilidade com o produto de fármaco belatacept SC como uma função do pH. O pH da formulação SC foi ajustado entre 7 e 8,2, amostras foram colocadas sob estabilidade e o produto de fármaco foi monitorado com relação a um aumento nas espécies de elevado peso molecular em vários pontos de tempo usando um ensaio de cromatografia por exclusão de tamanho indicando estabilidade (SE-HPLC). Sob a condição de armazenamento recomendada de 2-8 °C, nenhuma alteração significativa na taxa de formação de espécies de HMW foi observada após 3 meses.

[000125] Além de agregação, deamidação é uma variante de produto comum de peptídeos e proteínas que podem ocorrer durante fermentação, coleta/clarificação de células, purificação, armazenamento de substância de fármaco/produto de fármaco e durante análise de amostra. Deamidação é a perda de NH3 de uma proteína formando um intermediário de succinimida que pode sofrer hidrólise. O intermediário de succinimida resulta em uma diminuição de 17 u na massa do peptídeo precursor. A subseqüente hidrólise resulta em um aumento de 18 u na massa. Isolamento do intermediário de succinimida é difícil em virtude da instabilidade sob condições aquosas. Como tal, a deamidação é, tipicamente, detectável como aumento de 1 u na massa. Deamidação de uma asparagina resulta em ácido aspártico ou isoaspártico. Os parâmetros que afetam a taxa de deamidação incluem pH, temperatura, constante dielétrica do solvente, resistência iônica, seqüência primária, conformação de polipeptídeo local e estrutura terciária. Os resíduos de aminoácido adjacentes à Asn na cadeia peptídica afetam as taxas de deamidação. Gly e Ser após Asn em seqüências de proteína resultam em uma maior suscetibilidade à deamidação.

[000126] Estudos de estabilidade preliminares em escala de laboratório sugerem que deamidação excederá os níveis de referência do método de teste de mapeamento de peptídeo a 24 meses usando a formulação SC de abatacept em um pH de 7,8. Os dados em seis meses sob 2-8 °C e 25 °C em umidade de 60% mostraram que a taxa de deamidação era menor em um pH de 7,2 e maior em um pH de 8 quando comparado com a amostra SC de abatacept em um pH de 7,8. Os Exemplos IX e XII descrevem estudos de pH em escala de laboratório projetados para avaliar a deamidação de formulações de produto de fármaco SC na faixa de pH de 6 a 7,2.

[000127] A faixa de pH aceitável para o produto de fármaco SC é de 6 a 8, de preferência 6 a 7,8, mais preferivelmente 6 a 7,2.

[000128] Em outro aspecto, os sais ou componentes do tampão podem ser adicionados em uma quantidade de pelo menos 10 mM, de preferência 10-200 mM. Os sais e/ou tampões são farmaceuticamente aceitáveis e são derivados de vários ácidos conhecidos (inorgânicos e orgânicos) com metais ou aminas de "formação de base". Além de tampões de fosfato, podem ser usados tampões de glicinato, carbonato, citrato e semelhantes, caso no qual íons de sódio, potássio ou amônio podem servir como contra-íons.

[000129] O Exemplo VIII descreve o efeito da resistência do tampão sobre o produto de fármaco SC abatacept. A estabilidade foi melhor em tampão de fosfato a 10 mM comparado com tampão de fosfato a 5 mM em um pH de 7,5 em uma concentração de 100 mg/mL de produto de fármaco abatacept. Além disso, a melhor capacidade de tamponamento do tampão de fosfato a 10 mM ofereceu melhor controle de pH da formulação comparado com tampão a 5 mM.

[000130] O veículo aquoso de interesse aqui é um o qual é farmaceuticamente aceitável (seguro e não tóxico para administração a um ser humano) e é útil para o preparo de uma formulação líquida. Veículos ilustrativos incluem água estéril para injeção (SWFI), água bacteriostática para injeção (BWFI), uma solução com pH tamponado (por exemplo, solução salina tamponada com tampão), solução salina estéril, solução de Ringer ou solução de dextrose.

[000131] Um conservante pode ser opcionalmente adicionado às formulações aqui para reduzir a ação bacteriana. A adição de um conservante pode, por exemplo, facilitar a produção de uma formulação para múltiplo uso (dose múltipla).

[000132] Conforme discutido com o produto de fármaco liofilizado, a molécula de CTLA4Ig é incompatível com o silicone encontrado em seringas padrões pelo fato de que ela interage com o silicone para formar partículas visíveis, desse modo, limitando o paciente a utilizar seringas sem silicone. A formulação SC pode opcionalmente compreender um tensoativo para prevenir a formação de partículas visíveis na presença de silicone.

[000133] Os Exemplos V e VIII descrevem o efeito de tensoativos, tais como Polisorbato 80 e Poloxamer 188, sobre a estabilidade de solução dos produtos de fármaco belatacept e abatacept, respectivamente, e descobriu-se que tensoativos não têm um efeito sobre a estabilidade da molécula de CTLA4Ig em uma formulação SC. Diferentes níveis de Poloxamer 188 foram avaliados e descobriu-se que a concentração de 4 mg/ml a 8 mg/ml, de preferência 8 mg/ml, era adequada para prevenir a formação de partículas relacionadas ao silicone na formulação.

[000134] Uma composição típica de produto de fármaco SC abatacept SC, 125 mg/ml (100 mg/frasco) é proporcionada na Tabela 3 abaixo. Tabela 3 Composição de produto de fármaco SC belatacept, 125 mg/ml (100 mg/frasco) Componente Quantidade (mg/frasco)bInclui um excesso de 40% para perdas no frasco, agulha, seringa

[000135] Uma composição típica de produto de fármaco SC abatacept SC, 125 mg/ml (125 mg/frasco) é proporcionada na Tabela 4 abaixo. Tabela 4 Composição de produto de fármaco SC Abatacept, 125 mg/ml (125 mg/frasco) Componente Quantidade (mg/frasco)c cInclui um excesso de 40% para perdas no frasco, agulha, seringa

[000136] Uma composição típica de produto de fármaco SC abatacept SC, 125 mg/ml enchido em uma seringa é proporcionada na Tabela 5 abaixo. Tabela 5 Composição de produto de fármaco SC abatacept, 125 mg/ml (125 mg/seringa) Componente Quantidade (mg/seringa)

[000137] A condição de armazenamento recomendada para a formulação SC é de 2-8 °C com uma vida útil recomendada de pelo menos 12 meses.

[000138] A densidade do produto de fármaco SC de abatacept e do placebo equivalente foi determinada em temperatura ambiente usando o densitômetro Mettler-Toledo. As medições foram realizadas usando amostras de 5 mL em triplicatas. Descobriu-se que a densidade da formulação SC de abatacept era de 1,1 g/cc e aquela do produto de placebo era de 1,065 g/cc. Tipicamente, a densidade de uma formulação SC de CTLA4Ig é cerca de 1,0 g/cc a cerca de 1,2 g/cc, de preferência cerca de 1,0 g/cc a cerca de 1,15 g/cc, mais preferivelmente cerca de 1,095 g/cc a cerca de 1,105 g/cc.

[000139] A viscosidade da formulação SC de abatacept foi determinada usando o reômetro de Brookfield em temperatura ambiente. Um padrão de referência de 9,3 cps foi usado para as medições. Descobriu-se que a viscosidade do produto de fármaco SC em uma concentração de abatacept de 125 mg/mL era de 13 ± 2 cps. Tipicamente, a viscosidade de uma formulação SC de CTLA4Ig a 125 mg/mL é cerca de 9 a cerca de 20 cps, de preferência cerca de 9 a cerca de 15 cps, mais preferivelmente 12 a cerca de 15 cps.

[000140] A osmolaridade do produto de fármaco SC abatacept e formulação de placebo foi medida usando um método de pressão de vapor. Os dados mostram que em concentrações de 125 mg/mL, a osmolaridade da formulação SC de abatacept SC é de 770 ± 25 mOsm/kgH2O. Tipicamente, a osmolaridade da formulação SC de CTLA4Ig a 125 mg/mL é cerca de 250 a cerca de 800 mOsm/kgH2O, de preferência cerca de 700 a cerca de 800 mOsm/kgH2O, mais preferivelmente cerca de 750 a cerca de 800 mOsm/kgH2O.

Preparação da Formulação SC

[000141] O processo de fabricação desenvolvido para formulações SC envolve, tipicamente, composição com açúcar e tensoativo, seguido por filtração estéril asséptica e enchimento em frascos ou seringas, opcionalmente precedido por diafiltração (troca de tampão) e concentração da substância de fármaco usando uma unidade de ultrafiltração.

[000142] Os Exemplos I e II descrevem a fabricação dos produtos de fármaco SC belatacept e abatacept, respectivamente.

[000143] Aqueles habilitados na técnica estarão cientes da necessidade de encher o recipiente em excesso de modo a compensar perdas no frasco, agulha, seringa durante preparo e injeção. Por exemplo, um excesso de 40% de produto de fármaco é incorporado em cada frasco da fórmula líquida SC para levar em conta perdas por extração e assegurar que 0,8 ml da solução contendo 100 mg do produto de fármaco belatacept possam ser extraídos do frasco.

Formulação Líquida

[000144] Formulações IV podem ser a via de administração preferida para casos em particular, tal como quando o paciente está no hospital após o transplante, recebendo todos os fármacos através da via IV. Aqueles habilitados na técnica reconhecerão as desvantagens e riscos de uma formulação liofilizada para o fabricante e o profissional de saúde, respectivamente. Os riscos e vantagens para o profissional de saúde associados à reconstituição podem incluir contaminação, espumação e perda de produto, bem como o tempo requerido do profissional de saúde para preparar a formulação IV. Adicionalmente, os custos para o fabricante em equipamento e tempo dos empregados podem ser diminuídos através de remoção da etapa de liofilização de um processo de fabricação. Todas essas razões são motivação suficiente para projetar uma formulação líquida para uso IV.

[000145] A formulação líquida preferida para desenvolver seria uma formulação que pudesse imitar o produto de fármaco liofilizado após a primeira constituição para uma concentração de proteína de cerca de 25 mg/ml. A formulação líquida adquirida seria, então, diluída para as concentrações de produto de fármaco desejadas entre 1 e 10 mg/ml com cloreto de sódio a 0,9% para injeção, USP, por um profissional de saúde no momento de uso. O produto de fármaco diluído para injeção é isotônico e adequado para administração através de infusão intravenosa.

[000146] Conforme discutido acima, a estabilidade a longo prazo de formulações líquidas é um problema para produtos de fármaco de proteína. De modo a confirmar a estabilidade a longo prazo de uma solução contra a formação de espécies de elevado peso molecular, estudos de desenvolvimento de formulação foram conduzidos para avaliar a estabilidade em estado de solução da formulação líquida da invenção.

[000147] A formulação líquida da invenção compreende a molécula de CTLA4Ig em uma concentração de proteína de pelo menos 20 mg/ml em combinação com um açúcar em níveis de estabilização, de preferência pelo menos 25 mg/ml em combinação com um açúcar em um nível de estabilização em um veículo aquoso. De preferência, o açúcar está em uma proporção em peso de proteína para açúcar de pelo menos 1:1. O açúcar é, de preferência, dissacarídeos, mais preferivelmente sacarose. A formulação líquida também pode compreender um ou mais dos componentes selecionados da lista consistindo de agentes de tamponamento, tensoativos e conservantes.

[000148] A quantidade de sacarose útil para estabilização do produto de fármaco líquido está em uma proporção em peso de proteína para sacarose de pelo menos 1:1, de preferência em uma proporção em peso de proteína para sacarose de 1:2 a 1:10, mais preferivelmente em uma proporção em peso de proteína para sacarose de 1:2.

[000149] Se necessário, o pH da formulação é ajustado através da adição de um ácido e/ou base farmaceuticamente aceitável. O ácido farmaceuticamente aceitável preferido é ácido clorídrico. A base preferida é hidróxido de sódio.

[000150] Durante o desenvolvimento da formulação, a estabilidade do produto de fármaco líquido foi estudada em um pH alvo de 7,5. O Exemplo VII descreve estudos de estabilidade com o produto de fármaco belatacept líquido, em um pH de 7,5. O pH da formulação líquida foi ajustado para 7,5. Amostras foram colocadas sob estabilidade e o produto de fármaco foi monitorado com relação a um aumento nas espécies de elevado peso molecular em vários pontos de tempo usando um ensaio de cromatografia por exclusão de tamanho indicando estabilidade (SE-HPLC). Sob a condição de armazenamento recomendada de 2-8 °C, nenhuma alteração significativa na taxa de formação de espécies de HMW foi observada.

[000151] Além disso, agregação, deamidação e fragmentação são variantes de produto de peptídeos e proteínas que podem ocorrer durante fermentação, coleta/clarificação de células, purificação, armazenamento de substância de fármaco/produto de fármaco e durante análise de amostra. Estudos de estabilidade preliminares em escala de laboratório sugerem que a deamidação excederá os níveis de referência do método de teste de mapeamento de peptídeo (se elevará acima do máximo de 5% de T26a ou T26b (%T30)) e que a fragmentação excederá os níveis de referência para o método de teste por SDS-PAGE (cai abaixo do mínimo da principal banda de 96%) em 24 meses usando o belatacept (20 mg/ml em um pH de 7,5) armazenado a 2°-8°C. Dados de formulações líquidas (veja dados de SC acima) mostram que a taxa de deamidação encontrada nas formulações da invenção diminui à medida que o pH das formulações é diminuído.

[000152] A faixa de pH aceitável para o produto de fármaco líquido é de 6 a 8, de preferência 6 a 7,8, mais preferivelmente 6 a 7,2.

[000153] Em outro aspecto, os sais ou componentes do tampão podem ser adicionados em uma quantidade de pelo menos cerca de 10 mM, de preferência 10-200 mM. Os sais e/ou tampões são farmaceuticamente aceitáveis e são derivados de vários ácidos conhecidos (inorgânicos orgânicos) com metais ou aminas de "formação de base". Além de tampões de fosfato, podem ser usados tampões de glicinato, carbonato, citrato e semelhantes, caso no qual íons de sódio, potássio ou amônio podem servir como contra-íons.

[000154] O veículo aquoso de interesse aqui é um o qual é farmaceuticamente aceitável (seguro e não tóxico para administração a um ser humano) e é útil para o preparo de uma formulação líquida. Veículos ilustrativos incluem água estéril para injeção (SWFI), água bacteriostática para injeção (BWFI), uma solução com pH tamponado (por exemplo, solução salina tamponada com fosfato), solução salina estéril, solução de Ringer ou solução de dextrose.

[000155] Um conservante pode ser opcionalmente adicionado às formulações aqui para reduzir a ação bacteriana. A adição de um conservante pode, por exemplo, facilitar a produção de uma formulação para múltiplo uso (múltiplas doses).

[000156] Conforme discutido com o produto de fármaco liofilizado, a molécula de CTLA4Ig é incompatível com o silicone encontrado em seringas padrões pelo fato de que ela interage com o silicone para formar partículas visíveis, desse modo, limitando o profissional de saúde a utilizar seringas sem silicone. A formulação líquida pode, opcionalmente, compreender um tensoativo para prevenir a formação de partículas visíveis na presença de silicone.

[000157] Uma composição típica de produto de fármaco líquido belatacept, 20 mg/ml (250 mg/frasco), é proporcionada na Tabela 6 abaixo. Tabela 6 Composição de produto de fármaco líquido belatacept, 20 mg/ml (250 mg/frasco) Componente Quantidadea (mg/frasco) a Inclui um excesso de 4% para perdas no frasco, agulha e seringa

[000158] A condição de armazenamento recomendada para a formulação líquida é de 2-8 °C, com uma vida útil recomendada de pelo menos 12 meses.

Preparo da Formulação Líquida

[000159] O processo de fabricação de produto de fármaco líquido envolve, tipicamente, composição com anticorpo e opcionalmente tensoativo, seguido por filtração asséptica e enchimento em frascos, vedação e tampar.

[000160] A solução bruta formulada é, tipicamente, colocada em uma concentração fixa de proteína, de modo que o volume de enchimento desejado do frasco possa ser mantido constante. Durante a adição de açúcar à substância de fármaco, a velocidade do misturador é controlada a 250 ± 50 rpm de modo a minimizar a espumação na solução de formação de lote e assegurar dissolução completa do açúcar dentro de 10 a 20 minutos. A solução bruta formulada pode ser armazenada sob 2-8 °C ou temperatura ambiente luz ambiente durante pelo menos 24 horas antes de enchimento.

[000161] A solução bruta não é terminalmente esterilizada em virtude da sensibilidade ao calor da molécula de CTLA4Ig. A solução bruta pode ser esterilizada usando dois filtros de grau para esterilização Millipore Millipak® de 0,22 μm em série antes de enchimento em frascos.

[000162] Aqueles habilitados na técnica estarão cientes da necessidade de encher o recipiente em excesso de modo a compensar perdas no frasco, agulha, seringa durante preparo e injeção. Por exemplo, cada frasco de produto de fármaco belatacept, 20 mg/mL (250 mg/frasco), contém um excesso de 4% do produto de fármaco para levar em conta perdas quando de reconstituição e extração.

Artigos de Manufatura

[000163] Em outra modalidade d antígeno, um artigo de manufatura é proporcionado o qual contém o produto de fármaco e, de preferência, proporciona instruções para seu uso. O artigo de manufatura compreende um recipiente. Recipientes adequados incluem, por exemplo, garrafas, frascos, seringas e tubos de ensaio. O recipiente pode ser formado de uma variedade de materiais, tais como vidro, plástico ou metais.

[000164] O recipiente contém as formulações liofilizadas ou líquidas. O rótulo sobre ou associado ao recipiente pode indicar orientações para reconstituição e/ou uso. Por exemplo, o rótulo pode indicar que 25 mg/ml de produto de fármaco belatacept têm de ser diluídos para as concentrações de proteína, conforme descrito acima. O rótulo pode ainda indicar que a formulação SC é útil ou destinada à administração subcutânea. O recipiente que contém a formulação pode ser um frasco de uso múltiplo, o qual permite administrações repetidas (por exemplo, de 2-6 administrações), por exemplo, da formulação subcutânea. Alternativamente, o recipiente pode ser uma seringa pré-enchida contendo, por exemplo, a formulação subcutânea.

[000165] O artigo de manufatura pode ainda compreender um segundo recipiente compreendendo, por exemplo, um veículo adequado para a formulação liofilizada.

[000166] O artigo de manufatura pode ainda incluir outros materiais desejáveis do ponto de vista comercial e do usuário, incluindo outros tampões, diluentes, filtros, agulhas, seringas e bulas de embalagem com instruções para uso.

[000167] Seringas sem silicone são, de preferência, utilizadas para um produto de fármaco sem tensoativo, tal como quando de reconstituição do produto de fármaco liofilizado e/ou transferência das soluções do frasco ao saco intravenoso e podem ser co-embaladas com o frasco com produto de fármaco.

Métodos de Uso

[000168] A presente invenção ainda proporciona métodos para tratamento de doenças do sistema imune ou indução de tolerância compreendendo administração de uma quantidade eficaz das formulações de molécula de CTLA4Ig da invenção. Em modalidades particulares, as doenças do sistema imune são mediadas por interações de células CD28- e/ou CTLA4-positivas com células CD80/CD86-positivas. Em uma outra modalidade, interações de células T são inibidas. Doenças do sistema imune incluem, mas não estão limitadas a, doenças autoimunes, doenças imunoproliferativas e distúrbios enxerto-relacionados. Esses métodos compreendem administração, a um indivíduo, as formulações de molécula de CTLA4Ig da invenção para regular interações de células T com as células CD80- e/ou CD86-positivas. Exemplos de doenças enxerto- relacionadas incluem doença enxerto versus hospedeiro (GVHD) (por exemplo, tal como pode resultar de transplante de medula óssea ou na indução de tolerância), distúrbios imunes associados à rejeição a transplante de enxerto, rejeição crônica e alo- ou xenoenxertos de células ou tecido, incluindo órgãos sólidos, pele, ilhotas, músculos, hepatócitos, neurônios. Exemplos de doenças imunoproliferativas incluem, mas não estão limitados a, psoríase; linfoma de células T; leucemia linfoblástica aguda de células T; linfoma de células T angiocêntrica testicular; angiíte linfocítica benigna; e doenças autoimunes, tais como lupus (por exemplo, lupus eritematoso, nefrite por lupus), tiroidite de Hashimoto, mixedema primário, doença de Grave, anemia perniciosa, gastrite atrófica autoimune, doença de Addison, diabetes (por exemplo, diabetes mellitus dependente de insulina, diabetes mellitus do tipo I), síndrome de Good Pasture, miastenia gravis, pênfigo, doença de Crohn, oftalmia simpatética, uveíte autoimune, esclerose múltipla, anemia hemolítica autoimune, trombocitopenia idiopática, cirrose biliar primária, hepatite de ação crônica, colite ulcerativa, síndrome de Sjogren, doenças reumáticas (por exemplo, artrite reumatóide), polimiosite, escleroderma e doenças mistas do tecido conectivo.

[000169] A presente invenção ainda proporciona um método para inibição de rejeições a transplante de tecido e/ou órgão sólido por um indivíduo, o indivíduo sendo um recipiente de um tecido transplantado. Tipicamente, em transplantes de tecido, rejeição do enxerto é iniciada através de seu reconhecimento como estranho por células T, seguido por uma resposta imune que destrói o enxerto. As formulações de molécula de CTLA4Ig da presente invenção, através de inibição da proliferação de linfócitos T e/ou secreção de citocina, podem resultar em destruição tecidual reduzida e indução de não responsividade de células T antígeno-específicas pode resultar em aceitação do enxerto a longo prazo sem a necessidade de imunossupressão generalizada. Além disso, as formulações de molécula de CTLA4Ig da invenção podem ser administradas com outros produtos farmacêuticos incluindo, mas não limitado a, corticosteróides, ciclosporina, rapamicina, micofenolato mofetil, azatioprina, tacrolismus, basiliximab e/ou outros produtos biológicos.

[000170] A presente invenção também proporciona métodos para inibição de doença enxerto versus hospedeiro em um indivíduo. Esse método compreende administração, ao indivíduo, das formulações da invenção, sozinhas ou junto com outros ligantes adicionais, reativas com IL-2, IL-4 ou y-interferon. Por exemplo, a formulação SC de molécula de CTLA4Ig da presente invenção pode ser administrada a um recipiente de transplante de medula óssea para inibir a alo- reatividade de células T do doador. Alternativamente, células T do doador dentro do enxerto de medula óssea podem ser tornadas tolerantes aos alo-antígenos do hospedeiro ex vivo antes de transplante.

[000171] Inibição de respostas de células T pelas formulações de molécula de CTLA4Ig da invenção pode ser útil para o tratamento de distúrbios autoimunes. Muitos distúrbios autoimunes resultam de ativação inapropriada de células T que são reativas contra auto- antígenos e as quais promovem a produção de citocinas e auto- anticorpos que estão envolvidos na patologia da doença. A administração da formulação de molécula de CTLA4Ig em um indivíduo sofrendo de ou suscetível a um distúrbio autoimune pode prevenir a ativação de células T auto-reativas e pode reduzir ou eliminar sintomas da doença. Esse método pode também compreender administração, ao indivíduo, de uma formulação da invenção, sozinha ou junto com outros ligantes adicionais, reativos com IL-2, IL-4 ou y-interferon.

[000172] O modo de administração e regime de dosagem mais eficazes para as formulações da invenção dependem da gravidade e curso da doença, da saúde do paciente e resposta ao tratamento e do julgamento do médico que faz o tratamento. De acordo com a prática da invenção, uma quantidade eficaz para tratamento de um indivíduo pode estar entre cerca de 0,1 e cerca de 10 mg/kg de peso corporal do indivíduo. Também, a quantidade eficaz pode ser uma quantidade entre cerca de 1 e cerca de 10 mg/kg de peso corporal do indivíduo.

[000173] As formulações de molécula de CTLA4Ig da invenção podem ser administradas a um indivíduo em uma quantidade e durante um tempo (por exemplo, extensão de tempo e/ou múltiplas vezes) suficientes para impedir que moléculas de B7 endógenas (por exemplo, CD80 e/ou CD86) se liguem a seus respectivos ligantes no indivíduo. bloqueio da ligação de B7 endógena/ligante, desse modo, inibe as interações entre células B7-positivas (por exemplo, células CD80- e/ou CD86-positivas) com células CD28- e/ou CTLA4-positivas. A dosagem da molécula de CTLA4Ig é dependente de muitos fatores incluindo, mas não limitado a, o tipo de tecido afetado, o tipo da doença que está sendo tratada, a gravidade da doença, a saúde do indivíduo e a resposta do indivíduo ao tratamento com os agentes. Conseqüentemente, as dosagens dos agentes podem variar dependendo do indivíduo e do modo de administração. A Publicação pedido de patente US Número US 2003/0083246 e Publicação de pedido de patente US Número US 2004/0022787 ensinam a dosagem e esquemas de administração para CTLA4Ig tendo a seqüência de aminoácido mostrada em SEQ ID NO: 2 para tratamento de doenças reumáticas, tal como artrite reumatóide. Todas são incorporadas aqui por referência.

[000174] Uma quantidade eficaz de molécula de CTLA4Ig pode ser administrada a um indivíduo diariamente, semanalmente, mensalmente e/ou anualmente, em uma única ou múltiplas vezes por hora/dia/semana/mês/ano, dependendo da necessidade. Por exemplo, em uma modalidade, uma quantidade eficaz da molécula de CTLA4Ig pode ser inicialmente administrada uma vez a cada duas semanas durante um mês e, então, uma vez por mês depois.

[000175] Uma quantidade eficaz de molécula de CTLA4Ig é uma quantidade de cerca de 0,1 a 100 mg/kg de peso de um indivíduo. Em outra modalidade, a quantidade eficaz é uma quantidade de cerca de 0,1 a 20 mg/kg de peso de um indivíduo. Em uma modalidade específica, a quantidade eficaz de CTLA4Ig é cerca de 2 mg/kg de peso de um indivíduo. Em outra modalidade específica, a quantidade eficaz de CTLA4Ig é cerca de 10 mg/kg de peso de um indivíduo. Em outra modalidade específica, uma quantidade eficaz de CTLA4Ig é 500 mg para um indivíduo pesando menos de 60 kg, 750 mg para um indivíduo pesando entre 60-100 kg e 1000 mg para um indivíduo pesando mais de 100 kg.

[000176] O pedido de patente US número de série 60/668.774, depositado em 6 de Abril de 2005 e o pedido de patente US número de série 11/399.666, depositado em 6 de Abril de 2006, ensinam a dosagem e esquema de administração para LEA29YIg tendo a seqüência de aminoácido mostrada em SEQ ID NO: 4 para tratamento de distúrbios imunes associados a transplante de enxerto. Todos são incorporados aqui por referência.

[000177] Tipicamente, doses da formulação de molécula de CTLA4Ig da invenção são baseadas no peso corporal e regimes de administração podem ser orientados pelos perfis séricos alvo. Tipicamente, uma concentração sérica alvo de moléculas de LEA29YIg da invenção de entre cerca de 3 μg/mL e cerca de 30 μg/mL durante os primeiros 3 a 6 meses pós-transplante será suficiente para manter a função do aloenxerto, de preferência entre cerca de 5 μg/mL e cerca de 20 μg/mL. Tipicamente, a concentração sérica alvo de moléculas de LEA29YIg da invenção durante a fase de manutenção está entre cerca de 0,2 μg/mL e cerca de 3 μg/mL, de preferência entre cerca de 0,25 μg/mL e cerca de 2,5 μg/mL.

[000178] As moléculas de LEA29YIg da invenção podem ser administradas em uma quantidade entre cerca de 0,1 a cerca de 20,0 mg/kg de peso do paciente, tipicamente entre cerca de 1,0 a cerca de 15,0 mg/kg. Por exemplo, L104EA29YIg pode ser administrada a 10 mg/kg de peso do paciente durante a fase inicial, o período de alto risco que segue ao transplante, e diminuída para 5 mg/kg de peso do paciente para uma dosagem de manutenção.

[000179] A administração das moléculas de CTLA4Ig da invenção pode ser via uma infusão intravenosa de 30 minutos a uma ou mais horas. Alternativamente, uma única ou múltiplas injeções subcutâneas podem distribuir a dosagem requerida. Tipicamente, uma infusão intravenosa de 30 minutos é a via de administração utilizada durante a fase inicial de tratamento, enquanto o paciente está no hospital e/ou fazendo visitas esquematizadas ao profissional de saúde para monitoramento. A injeção subcutânea é o modo de administração típico utilizado durante a fase de manutenção, desse modo, permitindo que o paciente retorne ao seu esquema normal diminuindo as visitas ao profissional de saúde para infusões intravenosas.

[000180] O Exemplo 10 descreve a farmacocinética da formulação IV liofilizada de CTLA4Ig em indivíduos saudáveis e pacientes com artrite reumatóide (RA). A farmacocinética de abatacept em pacientes com RA e indivíduos saudáveis parecia ser comparável. Em pacientes com RA, após múltiplas infusões intravenosas, a farmacocinética do abatacept mostrou aumentos proporcionais de Cmax e AUC sobre a faixa de dose de 2 mg/kg a 10 mg/kg. A 10 mg/kg, a concentração no soro pareceu atingir um estado uniforme em torno do dia 60, com uma concentração sérica média (faixa) de 24 mcg/mL (de cerca de 1 a cerca de 66 mcg/mL). Nenhum acúmulo de abatacept ocorreu quando de tratamento repetido contínuo com 10 mg/kg em intervalos mensais em pacientes com RA.

[000181] A invenção será mais completamente compreendida através de referência aos exemplos a seguir. Eles não deverão, contudo, ser construídos como limitando o escopo da invenção. Todas as citações no decorrer da divulgação são aqui expressamente incorporadas por referência.

Exemplo I

[000182] Produto de fármaco belatacept SC, 125 mg/ml (100 mg/frasco) é formulado em uma solução estéril, não pirogênica, pronta para uso adequada para administração subcutânea.

[000183] O produto de fármaco SC belatacept, 125 mg/ml (100 mg/frasco) é fabricado em uma escala de 2,2 kg (1500 frascos). A fórmula de lote é fornecida na Tabela 7 abaixo. Tabela 7 Fórmula de lote representative a Tamanho total do lote de 2,2 kg (2-L). A densidade da solução é de 1,10 g/ml (a 20°-25°C). b Substância de fármaco belatacept: concentração de proteína de 25 mg/ml, fosfato de sódio a 25 mM, cloreto de sódio a 10 mM, pH de 7,5, <5% de espécies de HMW

[000184] O processo de fabricação para produto de fármaco SC belatacept, 125 mg/ml (100 mg/frasco) envolve troca de tampão da substância de fármaco bruta de tampão de fosfato de sódio a 25 mM, cloreto de sódio a 10 mM em um pH de 7,5 para tampão de fosfato de sódio a 10 mM, pH de 7,5, seguido por concentração da proteína de ~25 mg/ml para ~150 mg/ml através de remoção do tampão. A troca de tampão é realizada através de diafiltração cinco vezes da substância de fármaco bruta contra o novo tampão de fosfato de sódio a 10 mM, pH de 7,5, seguido por concentração de proteína para ~150 mg/ml através de remoção do tampão. Um contentor de mini filtro Pellicon de aço inoxidável (Millipore) é equipado com calibradores de pressão de aço inoxidável e válvulas com membrana sobre os orifícios de alimentação, retentado e permeados. Dois cassetes de filtração usados com o mini módulo Pellicon são adaptados com uma membrana de poliéter sulfona Biomax com área de 0,1 m2 com um limite de corte de peso molecular nominal de 30 kDa. Os cassetes de filtração são instalados de acordo com as recomendações do fabricante. O recipiente de alimentação para a substância de fármaco é um recipiente de vidro de 4 litros com barra de agitação magnética. Tubulação de silicone de alto desempenho MasterFlex é usada para conectar o recipiente de alimentação ao contentor de filtro e para a tubulação de permeado. O fluxo de alimentação é proporcionado através de uma bomba peristáltica instalada na tubulação de alimentação. Sacarose e Poloxamer 188 são, então, dissolvidos na solução de proteína concentrada e o peso do lote final é ajustado com tampão de fosfato de sódio a 10 mM, pH de 7,5. A solução bruta é filtrada através de um filtro de esterilização de 0,22 mícrons e enchida em frascos de vidro de sílex do Tipo I de 5 cc despirogenados e esterilizados, tampada com rolhas de borracha de 20 mm e vedada com vedações flip-off de alumínio de 20 mm. A composição de produto de fármaco SC belatacept, 125 mg/ml (100 mg/frasco) é proporcionada na Tabela 8 abaixo. Tabela 8 Composição de produto de fármaco SC belatacept, 125 mg/ml (100 mg/frasco) Componente Quantidade (mg/frasco) d Inclui excesso de 40% para perda no frasco, agulha e seringa

Exemplo II

[000185] Produto de fármaco abatacept SC, 125 mg/ml (125 mg/frasco) é formulado como uma solução estéril, não pirogênica pronta para uso adequada para administração subcutânea. Um lote de produto de fármaco abatacept SC, 125 mg/ml (125 mg/frasco) é fabricado em uma escala de 5-L (3.500 frascos). A fórmula do lote é descrita na Tabela 9 abaixo. Tabela 9 Fórmula de lote a Substância de fármaco abatacept: concentração de proteína de 50 mg/ml, fosfato de sódio a 25 mM, cloreto de sódio a 50 mM, pH de 7,5, <5% de espécies de HMW

[000186] conforme descrito acima no Exemplo I, o processo de fabricação para do produto de fármaco abatacept SC, 125 mg/ml (125 mg/frasco) envolve troca de tampão da substância de fármaco bruta de fosfato de sódio a 25 mM, cloreto de sódio a 50 mM em um pH de 7,5 para tampão de fosfato de sódio a 10 mM, pH de 7,8, seguido por concentração de proteína de ~50 mg/ml para ~150 mg/ml através de remoção do tampão. Sacarose e Poloxamer 188 são, então, dissolvidos na solução de proteína concentrada e o peso final do lote é ajustado com tampão de fosfato de sódio a 10 mM, pH de 7,8. A solução bruta é filtrada através de um filtro de esterilização a 0,22 mícrons e enchida em frascos de vidro de sílex do Tipo I de 5 cc esterilizado e despirogenado, tampada com rolhas de borracha de 20 mm e vedada com vedações flip-off de alumínio de 20 mm.

[000187] A composição do produto de fármaco abatacept, 125 mg/ml (125 mg/frasco) é proporcionada na Tabela 10 abaixo. Tabela 10 Composição de produto de fármaco abatacept SC, 125 mg/ml (125 mg/frasco) Componente Quantidade (mg/frasco) d Inclui um excesso de 40% para perda no frasco, agulha, seringa

Exemplo III

[000188] Produto de fármaco abatacept, liofilizado (250 mg/frasco) é um liofilizado estéril não pirogênico adequado para administração intravenosa (IV). Cada frasco de uso único contém 250 mg de abatacept, o qual é reconstituído com água estéril para injeção, USP e ainda diluída com cloreto de sódio a 0,9% para injeção,USP, no momento de uso.

[000189] A fórmula de lote para um tamanho de lote de 115 litros é descrita na Tabela 11 abaixo. Tabela 11 Fórmula de lote a Substância de fármaco abatacept: concentração de proteína de 50 mg/ml, fosfato de sódio a 25 mM, cloreto de sódio a 50 mM, pH de 7,5, <5% de espécies de HMW b Densidade da solução bruta formulada = aprox. 1,04 g/ml

[000190] A quantidade requerida de substância de fármaco abatacept é adicionada a um vaso de composição de aço inoxidável esterilizado e limpo equipado com um misturador. A solução de substância de fármaco é misturada a 250 ± 50 rpm enquanto se mantém a temperatura da solução entre 5-25 °C.

[000191] A quantidade requerida de pó de monohidrato de maltose é adicionada ao vaso de composição. A solução é misturada durante um mínimo de 10 minutos a 15-25 °C.

[000192] O pH da solução é ajustado para 7,3-7,7, se necessário usando a solução de hidróxido de sódio a 1N previamente preparada ou solução de ácido clorídrico a 1N. O lote é levado para o peso final de lote (q.s. final) usando água para injeção, USP e misturado durante um mínimo de 8 minutos. A solução de formulação bruta é coletada para pH.

[000193] Solução bruta formulada é pré-filtrada com um filtro de 0,45 μm. A solução bruta formulada após o filtro de 0,45 μm é coletada para bio-carga e endotoxina bacteriana (BET).

[000194] A solução bruta formulada pré-filtrada é filtrada estéril com dois filtros de 0,22 μm em série antes de enchimento.

[000195] A solução bruta formulada filtrada estéril é enchida e parcialmente tampada com uma rolha de butila cinza Daikyo de 20 nm através de uma máquina de tampar/enchimento totalmente automática. Os frascos de vidro com tubulação de sílex do Tipo I de 15 cc são lavados e esterilizados/despirogenados.

[000196] Os frascos com produto de fármaco enchidos e parcialmente tampados são liofilizados. Um resumo do ciclo de secagem por congelamento usado durante liofilização do produto de fármaco abatacept é proporcionado na Tabela 12 abaixo. Tabela 12 Ciclo de secagem por congelamento para produto de fármaco abatacept liofilizado

[000197] Ao final do ciclo de liofilização, a pressão da câmara é elevada para 500 mícrons usando nitrogênio filtrado estéril e fechamento do frasco é realizado sob vácuo. Os frascos tampados permanecem dentro do liofilizador durante pelo menos 4 horas. Os frascos liofilizados e tampados são vedados com uma vedação flip-off branca de alumínio de 20 mm sob ar filtrado em HEPA pela máquina de tampar. Os frascos vedados são enxaguados com água desionizada por um lavador de frasco exterior. Os frascos com produto de fármaco lavados são armazenados a 2 a 8 °C.

[000198] A composição do produto de fármaco abatacept liofilizado (250 mg/frasco) é listada na Tabela 13 abaixo. Tabela 13 Composição de produto de fármaco abatacept liofilizado (250 mg/frasco) Componente Quantidade (mg/frasco) aInclui um excesso de 5% para perda no frasco, agulha e seringa bEsses componentes estão presentes na solução de substância de fármaco abatacept

Exemplo IV

[000199] Produto de fármaco belatacept, liofilizado (100 mg/frasco), é um liofilizado não pirogênico estéril adequado para administração intravenosa (IV). Cada frasco para uso único contém 100 mg de belatacept constituído com 4,2 ml de água estéril para injeção, USP para proporcionar uma concentração de 25 mg/ml. Ela pode ser ainda diluída para uma concentração tão baixa quanto 1 mg/ml com Dextrose a 5% para injeção, USP ou cloreto de sódio a 0,9% para injeção, USP no momento de uso.

[000200] O tamanho de lote para fabricação do produto de fármaco pode variar de 20 litros a 120 litro. Uma fórmula de lote representativa para um tamanho de lote de 66 litros (12.000 frascos) é proporcionada na Tabela 14 abaixo. Tabela 14 Fórmula do lote para um tamanho de lote de 66 litros (12.000 frascos) água para injeção q.s. até peso do lote a Substância de fármaco belatacept: concentração de proteína de 25 mg/ml, fosfato de sódio a 25 mM, cloreto de sódio a 10 mM, pH de 7,5, <5% de espécies de HMW

[000201] O produto de fármaco liofilizado belatacept é fabricado conforme descrito no Exemplo III acima.

[000202] A composição do produto de fármaco belatacept liofilizado, 100 mg/frasco, é listada na Tabela 15 abaixo. Tabela 15 Composição de produto de fármaco belatacept liofilizado a 100 mg/frasco a Cada frasco contém um excesso de 10% para contenção em frasco, agulha e seringa da solução reconstituída.

Exemplo V

[000203] Estudos de estabilidade da formulação líquida SC de produto de fármaco belatacept foram conduzidos colocando as formulações sob estabilidade em diferentes temperaturas e durante vários períodos de tempo.

Efeito de Sacarose

[000204] Estudos de desenvolvimento de formulação foram conduzidos para avaliar o efeito de vários níveis de sacarose sobre a estabilidade de solução do produto de fármaco belatacept. As amostras foram colocadas sob estabilidade em condições de -70 °C, 8 °C e 25 °C/umidade de 60% e monitoradas em vários pontos de tempo. As proporções de proteína para sacarose avaliadas foram de 1:1, 1:1,7 e 1:1,75. A formação de espécies de elevado peso molecular (HMW) de belatacept foi utilizada para determinar a estabilidade de proteína em solução. Os resultados são mostrados na Tabela 16 abaixo. Tabela 16 Efeito de vários níveis de sacarose sobre o produto de fármaco belatacept a 100 mg/ml a Produto de fármaco belatacept em tampão de fosfato de sódio a 10 mM,100 mg/ml, pH de 7,5

[000205] Os resultados dos estudos mostraram que aumento da proporção de sacarose para proteína melhorou a estabilidade da proteína. Uma proporção de proteína para sacarose de 1:1,36 (peso/peso) foi escolhida para o desenvolvimento da solução SC porque ela proporciona estabilidade ótima sem resultar em produto de fármaco com hipertonicidade excessiva.

Efeito de tensoativos

[000206] O efeito de vários tensoativos em produtos comercializados, tais como Polisorbato 80 e Poloxamer 188, sobre a estabilidade de solução do produto de fármaco belatacept foi avaliado. Poloxamer 188 foi avaliado em níveis de 4, 6 e 8 mg/ml e Polisorbato 80 foi avaliado a 1 e 2 mg/ml de concentração final da formulação. As amostras foram colocadas sob estabilidade em condições de -70°C , 8°C e 25°C/umidade de 60% e monitoradas em vários pontos de tempo. Os resultados são mostrados na Tabela 17 abaixo. Tabela 17 Efeito de vários níveis e tipos de tensoativo sobre o produto de fármaco belatacept (100 mg/ml) a proteína:sacarose (1:1,7), 100 mg/ml, pH de 7,5

[000207] Os resultados do efeito de tensoativos sugeriram que o tensoativo não tem um efeito significativo sobre a estabilidade da solução de produto de fármaco belatacept. Dentre os níveis de Poloxamer 188 avaliados, descobriu-se que a concentração de 8 mg/ml era adequada para prevenir a formação de partículas relacionadas ao silicone na formulação.

Efeito do pH

[000208] A estabilidade do produto de fármaco Belatacept SC, (125 mg/ml, proteína:sacarose a 1:1,36, 8 mg/ml de Pluronic F68) foi avaliada como uma função do pH. O pH da solução foi ajustado para entre 7 a 8,2 com hidróxido de sódio a 1N ou ácido clorídrico a 1N. As amostras foram colocadas sob condições de estabilidade a 2-8 °C e 25 °C/RH de 60% e monitoradas em vários pontos de tempo. Testagem analítica incluía pH e SE-HPLC para monitorar o aumento nas espécies de elevado peso molecular (HMW). Esses resultados são resumidos na Tabela 18 abaixo. Tabela 18 Efeito do pH sobre o produto de fármaco SC belatacept * Proteína:sacarose (1:1,36), 125 mg/ml, + 8 mg/ml de Pluronic F68

[000209] Nenhuma alteração significativa na taxa de formação de espécies de HMW foi observada sob a condição de armazenamento recomendada de 2-8 °C. Adicionalmente, os dados de estabilidade de solução mostraram que o pH para estabilidade máxima estava entre 7 e 8. Baseado nisso, uma faixa de pH de 7-8 com um pH alvo de 7,5 foi selecionada para essa formulação.

Osmolaridade

[000210] A osmolaridade das soluções de produto de fármaco em vários tampões, em diferentes concentrações de proteína e das etapas distintas do processo de formulação foi medida usando um método de pressão de vapor. Esses resultados são resumidos na Tabela 19 abaixo. TABELA 19 Determinação de osmolaridade da solução de produto de fármaco belatacept em vários tampões e concentrações

Efeito de Agitação

[000211] O efeito de agitação sobre a estabilidade de solução do produto de fármaco SC belatacept em uma concentração de 100 mg/ml e 125 mg/ml foi determinado. Alíquotas da solução contendo aproximadamente 1 ml em frascos com tubulação de 5 cc foram agitadas na velocidade 3 de um agitador com braço biônico a 2-8 °C. A temperatura do agitador foi mantida a 2-8 °C colocando o agitador na sala fria. As amostras foram extraídas em intervalos de tempo aproximados e ensaiados com relação ao pH e aparência visual e, ao mesmo tempo, as amostras também foram avaliadas com relação à bioatividade após 30 dias de agitação.

[000212] As amostras agitadas em uma concentração de 100 mg/ml e 125 mg/ml durante até 30 dias não mostram alteração no nível de espécies de HMW, em perfil de SDS-PAGE, mapeamento de planta, ensaio B7 Binding, pH, aparência ou concentração de proteína quando agitadas a 2-8 °C.

Efeito de múltiplos congelamentos/descongelamentos

[000213] O efeito de múltiplos congelamentos e descongelamentos da formulação de produto do substituição SC belatacept foi investigado em amostras com pH oscilando de 7,0 a 8,2. Alíquotas de aproximadamente 10 μl de formulação de produto de fármaco SC belatacept (125 mg/ml) em um pH de 7,0, 7,4, 7,8 e 8,2 foram distribuídas em recipientes de PETG Nalgene de 30 ml. Múltiplos congelamentos e descongelamentos foram realizados através de armazenamento em frascos a -70 °C, seguido por descongelamento em temperatura ambiente (25 °C) durante 10 minutos. Esse ciclo foi repetido durante 5 dias. Os conteúdos dos frascos foram analisados com relação ao pH, % de espécies de HMW e aparência após cada ciclo de congelamento/descongelamento.

[000214] Nenhuma alteração no pH, aparência ou teor % de espécies de elevado peso molecular foi observada em amostras durante cinco ciclos de congelamento/descongelamento.

Condições de armazenamento recomendada

[000215] A condição de armazenamento recomendada para o produto de fármaco SC belatacept, 100 mg/frasco (125 mg/ml) é 2-8 °C com uma vida útil recomendada de 12 meses.

Estudo de capacidade de fluxo em seringa

[000216] Estudo de capacidade de fluxo em seringa realizados com produto de fármaco SC belatacept (125 mg/ml) em condições de 2-8 °C. Vários tamanhos de agulha com seringas de 1 ml e 0,5 mL foram avaliados. O tempo de enchimento da seringa e força de distribuição são registrados na Tabela 20 abaixo. Tabela 20 Estudo de capacidade de fluxo em uma seringa do produto de fármaco SC belatacept, 125 mg/ml a 2°-8°C

[000217] Baseado nos resultados do estudo de capacidade de fluxo em seringa mostrados na Tabela 20, uma agulha hipodérmica estéril de 21 gauge x 1^ polegada é recomendada para extração desse produto do frasco e uma agulha de 27 gauge x 1^ polegada para subseqüente dosagem.

Exemplo VI

[000218] Estudos de estabilidade da fórmula liofilizada de produto de fármaco abatacept foram conduzidos colocando as formulações sob estabilidade em diferentes temperaturas e durante vários períodos de tempo.

Efeito de Maltose

[000219] Estudos de desenvolvimento de formulação foram conduzidos para avaliar o efeito de vários níveis de maltose sobre a estabilidade do produto de fármaco abatacept. As amostras foram colocadas sob estabilidade a 50 °C e monitorada em vários pontos de tempo. As proporções de proteína para maltose avaliadas foram de 1:1, 1:2 e 1:5. A formação de espécies de elevado peso molecular (HMW) de abatacept foi utilizada para determinar a estabilidade de proteína em estado sólido. Os resultados são mostrados na Tabela 21 abaixo. Tabela 21 Efeito de maltose sobre a estabilidade em estado sólido liofilizado do produto de fármaco abatacept a 50 °C a Estabilidade de produto de fármaco com uma proporção em peso de 1:5 de fármaco para maltose foi avaliada durante desenvolvimento anterior com resistência de 50 mg/frasco. O lote de substância de fármaco usado nesse estudo era diferente daquele usado para os outros resultados nessa tabela. Essa é a razão para os diferentes níveis iniciais de espécies de elevado peso molecular nessas amostras.

[000220] Os resultados demonstram que a estabilidade do produto de fármaco abatacept em uma forma em estado sólido liofilizado é intensificada na presença de maltose. Adicionalmente, a quantidade mínima de maltose útil para estabilização de abatacept foi determinada como sendo uma proporção em peso de proteína para maltose de 1:2.

Efeito do pH

[000221] A estabilidade do produto de fármaco abatacept liofilizado (250 mg/frasco, proteína:maltose a 1:2) foi avaliada como uma função do pH. O pH da solução foi ajustado entre 6 e 8 com hidróxido de sódio a 1N ou ácido clorídrico a 1N. As amostras foram colocadas sob estabilidade em condições de 2-8 °C e monitoradas em vários pontos de tempo. Testagem analítica incluía pH e SE-HPLC para monitorar o aumento nas espécies de elevado peso molecular (HMW). Esses resultados são resumidos na Tabela 22 abaixo. Tabela 22 Efeito do pH sobre a taxa de formação de espécies de elevado peso molecular (HMW) a O lote de substância de fármaco usado para amostras com pH de 6,0 e 6,5 era diferente daquele usado para amostras com pH 7,0, 7,5 e 8,0. Essa é a razão para os diferentes níveis iniciais de espécies de elevado peso molecular nessas amostras.

[000222] Sob a condição de armazenamento recomendada de 2-8 °C, nenhuma alteração significativa na taxa de formação de espécies HWM foi observada. Adicionalmente, dados de estabilidade em estado de solução gerados durante um desenvolvimento anterior mostrou que o pH para estabilidade máxima estava entre 7 e 8.

Exemplo VII

[000223] Estudos de estabilidade da fórmula líquida de produto de fármaco belatacept (20 mg/ml) foram conduzidos colocando as formulações sob estabilidade em diferentes temperaturas e durante vários períodos de tempo.

Efeito de Sacarose

[000224] Estudos de desenvolvimento de formulação foram feitos para avaliar o efeito de vários níveis de sacarose sobre a estabilidade de solução do produto de fármaco líquido de belatacept a 20 mg/ml. As amostras foram colocadas sob estabilidade em condições de 8 °C/25 °C/umidade de 60% e 30 °C/umidade de 60% e monitoradas em vários pontos de tempo. As proporções de proteína para sacarose avaliadas foram uma proporção de proteína:sacarose de 1:1, 1:2, 1:5 e 1:10 com 20 mg/mL de belatacept. A formação de espécies de elevado peso molecular (HMW) de belatacept foi utilizada para determinar a estabilidade de proteína em solução. Os resultados desse estudo são resumidos e mostrados na Tabela 23 abaixo. Tabela 23 Efeito de vários níveis de sacarose sobre o produto de fármaco belatacept líquido, 20 mg/ml * Amostras não disponíveis para análise em virtude de evaporação

[000225] Os resultados dos estudos mostraram que aumento da proporção de sacarose para proteína melhorou a estabilidade de proteína. Uma proporção de proteína para sacarose de 1:2 (peso:peso) foi escolhida para o desenvolvimento da solução líquida porque ela proporcionou estabilidade ótima sem resultar em um produto de fármaco com hipertonicidade excessiva.

Estudo de Estabilidade

[000226] Três lotes líquidos de belatacept foram preparados e colocados sob estabilidade em condições de 2-8 °C e 25 °C/RH de 60% e monitorados em vários pontos de tempo. a proporção em peso de proteína para sacarose foi de 1:2. A formação de espécies de elevado peso molecular (HMW) de belatacept foi utilizada para determinar a estabilidade de proteína em formulação líquida. Dados de estabilidade são resumidos na Tabela 24 abaixo. Tabela 24 Estabilidade de produto de fármaco líquido de belatacept

[000227] Os dados indicam um aumento de apenas 0,1% nas espécies de elevado peso molecular na formulação líquida comparado com um aumento de 0,2% na substância de fármaco belatacept sem sacarose em 12 meses a 2-8 °C. Esses resultados também indicam que a adição de sacarose ajuda na redução da formação de espécies de elevado peso molecular.

Exemplo VIII

[000228] Estudos de estabilidade da formulação SC de produto de fármaco abatacept foram conduzidos colocando formulações sob estabilidade em diferentes temperaturas e durante vários períodos de tempo.

Efeito da resistência do tampão

[000229] A estabilidade do produto de fármaco abatacept SC (100 mg/ml) foi avaliada como uma função da resistência do tampão. O sistema de tampão foi tampão de fosfato de sódio a 5 ou 10 mM. As amostras foram colocadas em estabilidade sob várias condições de 28 °C e 30 °C/RH de 60% e monitoradas em vários pontos de tempo. Testagem analítica incluía pH e SE-HPLC para monitorar o aumento nas espécies de elevado peso molecular (HMW). Esses resultados são resumidos na Tabela 25 abaixo. Tabela 25 Efeito da resistência do tampão sobre o produto de fármaco abatacept (100 mg/ml, pH de 7,5

[000230] A estabilidade do produto de fármaco abatacept SC foi melhor no tampão de fosfato a 10 mM comparado com tampão de fosfato a 5 mM em um pH de 7,5 em uma concentração de 100 mg/mL de abatacept. Além disso, a maior capacidade de tamponamento do tampão de fosfato a 10 mM ofereceu melhor controle de pH da formulação comparado com tampão a 5 mM. Baseado nesses dados, tampão de fosfato a 10 mM foi selecionado para desenvolvimento de formulação.

Efeito de Açúcares

[000231] Estudos de desenvolvimento de formulação foram conduzidos para avaliar o efeito de vários açúcares sobre a estabilidade de solução do produto de fármaco abatacept SC. As amostras foram colocadas sob condições de estabilidade de 2-8 °C e 30 °C/umidade de 60% e monitoradas em vários pontos de tempo. Os açúcares avaliados foram sacarose, trealose e manitol. A formação de espécies de elevado peso molecular (HMW) de abatacept foi utilizada para determinar a estabilidade de proteína em solução. Os resultados são mostrados na Tabela 26 abaixo. Tabela 26 Efeito de vários açúcares sobre o produto de fármaco abatacept SC a 100 mg/ml, pH de 7,5 a Produto de fármaco abatacept em tampão de fosfato de sódio a 10 mM, 100 mg/ml, pH de 7,5. b Formulação de manitol em um pH de 7,8

[000232] Os resultados dos estudos mostraram que todos os três açúcares, sacarose, trealose e manitol, ofereceram melhor estabilização ao abatacept comparado com o controle sem anticorpo. Os resultados dos estudos sob condições aceleradas de 30 °C mostraram que o manitol ofereceu melhor estabilização ao abatacept comparado com sacarose e trealose. Sacarose foi ligeiramente melhor do que trealose. Sob refrigeração, a estabilização por todos os três açúcares não foi significativamente diferente. Sacarose foi escolhido como o açúcar de escolha, uma vez que a formulação de manitol tinha duas vezes a tonicidade da formulação de sacarose. Escolher sacarose para estabilização permite a adição de duas vezes tanto sacarose para obter a mesma tonicidade que o manitol na mesma proporção, mas estabilização muito maior contra agregação. Uma proporção de proteína:sacarose de 1:1,36 (peso:peso) foi escolhida para o divulga do produto de fármaco SC porque ela proporciona estabilidade ótima sem resultar em um produto de fármaco com hipertonicidade excessiva.

Efeito de Sacarose

[000233] Estudos de desenvolvimento de formulação foram conduzidos para avaliar o efeito de vários níveis de sacarose sobre a estabilidade de solução do produto de fármaco abatacept SC. As amostras foram colocadas sob condições de estabilidade de 2-8 °C e 30 °C/umidade de 60% e monitoradas em vários pontos de tempo. As proporções de proteína para sacarose avaliadas foram 1:1 e 1:2. A formação de espécies de elevado peso molecular (HMW) de abatacept foi utilizada para determinar a estabilidade de proteína em solução. Os resultados são mostrados na Tabela 27 abaixo. Tabela 27 Efeito de vários níveis de sacarose sobre o produto de fármaco abatacept SC a 100 mg/ml, pH de 7,5 a Produto de fármaco abatacept em tampão de fosfato de sódio a 10 mM, 100 mg/ml, pH de 7,5

[000234] Os resultados dos estudos mostraram que aumento da proporção de sacarose para proteína melhorou a estabilidade da proteína. Uma proporção de proteína:sacarose de 1:1,36 (peso:peso) foi escolhida para o desenvolvimento da solução de RTU porque ela proporcionou estabilidade ótima em resultar no produto de fármaco com hipertonicidade excessiva.

Efeito de Tensoativos

[000235] O efeito de vários tensoativos em produtos comercializados, tais como Polisorbato 80 (Tween® 80) e Poloxamer 188 (Pluronic® F68), sobre a estabilidade de solução do produto de fármaco abatacept SC foi avaliado. Poloxamer 188 foi avaliado em níveis de 4 e 8 mg/ml e Polisorbato 80 foi avaliado a 1 e 2 mg/ml de concentração final da formulação. As amostras foram colocadas sob condições de estabilidade de -2-8 °C e 25 °C/umidade de 60% e monitoradas em vários pontos de tempo. Os resultados são mostrados na Tabela 28 abaixo. Tabela 28 Efeito de vários níveis e tipos de tensoativo sobre o produto de fármaco abatacept SC a 125 mg/ml a proteína:sacarose (1:1),125 mg/ml, pH de 7,8

[000236] Os resultados do efeito de tensoativos sugeriram que o tensoativo não tem um efeito negativo significativo sobre a estabilidade do produto de fármaco abatacept SC. Dentre os níveis de Poloxamer 188 avaliados, descobriu-se que a concentração de 8 mg/ml era adequada para prevenir a formação de partículas relacionadas ao silicone na formulação.

Osmolaridade

[000237] A osmolaridade do abatacept em vários tampões, em diferentes concentrações de proteína e de etapas distintas do processo de formulação foi medida usando um método de pressão de vapor. Esses resultados são resumidos na Tabela 29 abaixo. Tabela 29 Determinação de osmolaridade de solução SC de abatacept em vários tampões e concentração

Efeito de Agitação

[000238] O efeito da agitação sobre a estabilidade de solução de produto de fármaco abatacept SC em uma concentração de 100 mg/ml e 125 mg/ml foi determinado. Alíquotas da solução contendo aproximadamente 1 ml em frascos com tubulação de 5 cc foram agitadas na velocidade 3 do agitação com braço biônico a 2-8 °C. A temperatura do agitador foi mantida a 2-8 °C colocando o agitador na sala fria. As amostras foram extraídas em intervalos de tempo apropriados e ensaiadas com relação ao pH e aparência visual e, ao mesmo tempo, as amostras também foram avaliadas com relação à bioatividade após 30 dias de agitação.

[000239] As amostras agitadas em uma concentração de 100 mg/ml e 125 mg/ml durante até 30 dias não mostram alteração no nível de espécies de HMW, no perfil de SDS-PAGE, mapeamento de peptídeo, ensaio B7 Binding, pH, aparência ou concentração de proteína quando agitadas a 2-8 °C.

Condições de armazenamento recomendadas

[000240] A condição de armazenamento recomendada para o produto de fármaco belatacept SC, 15 mg/seringa (125 mg/ml) é 2-8 °C com uma vida útil recomendada de pelo menos 12 meses.

Exemplo IX

[000241] Deamidação e agregação são duas vias de degradação observadas de moléculas de CTLA4Ig. Esse protocolo esboça a estudo de estabilidade de pH em escala de laboratório projetado para avaliar a formulação de produto de fármaco SC na faixa de pH de 6,37,2, especificamente um pH de 6,3, 6,6, 6,9, 7,2. A finalidade desse estudo é identificar a formulação ótima com menor pH que obterá uma vida útil mínima de 18 meses para as formulações SC de CTLA4Ig com relação à deamidação e formação de espécies de elevado peso molecular. A formulação de produto de fármaco SC utilizada nesse estudo é descrita na Tabela 30 abaixo. Tabela 30 Composição de formulação de produto de fármaco SC em um pH de 6,9

[000242] O produto de fármaco abatacept SC será formulado em um pH de 6,3, 6,6, 6,9, 7,2. O produto de fármaco será formulado com sacarose e poloxamer 188 conforme descrito acima e a concentração final do lote será ajustada com tampão de fosfato a 10 mM (pH de 6,9). O pH deverá ser titulado para 6,3 e 6,6, respectivamente, usando HCl a 1N. Alternativamente, o pH será titulado para até 6,9, 7,2 e 7,65 com NaOH a 1N. O produto de fármaco será enchido seringas PhysiolisTM com capacidade de 1 mL (volume de enchimento de 1,0 ml) e colocado sobre estações de estabilidade a 2-8°C, 15°C, 25°C em umidade de 60% e 35°C. As amostras deverão ser protegidas da luzem a todo momento cobrindo ou inserindo as mesmas em sacos protetores de luz marrons.

[000243] Produto de fármaco armazenado a 2-8°C será coletado a 0, 2, 4, 6, 12 18, 24 meses e opcionalmente 9 meses. Produto de fármaco armazenado a 15°C será coletado a 1, 2, 4, 6 meses e opcionalmente 9 meses. Produto de fármaco armazenado a 25°C e umidade de 60% será coletado a 1, 2, 4 e 6 meses. Produto de fármaco armazenado a 35°C será coletado a 1, 2 e 4 meses. Amostras armazenadas a 2-8°C serão testadas com relação à aparência (amostras inicial e final apenas), pH (amostras inicial, 4 meses e final apenas), A280 (amostras inicial, 4 meses e final apenas), HPLC por exclusão de tamanho, SDS-PAGE, mapeamento de peptídeo por digestão tríptica (TPM), Biacore B7 Binding (amostras inicial, 4 meses e final apenas ou conforme necessário) e focalização isoelétrica (IEF) (amostras inicial e final apenas). Amostras armazenadas a 15°C e 25°C e umidade de 60% serão testadas com relação à A280 (amostras inicial, 4 meses e última apenas), HPLC por exclusão de tamanho, SDS-PAGE e mapeamento de peptídeo por digestão tríptica (TPM). Amostras armazenadas a 35°C serão testadas com relação à HPLC por exclusão de tamanho, SDA-PAGE e mapeamento de peptídeo por digestão tríptica (TPM).

[000244] Métodos de testagem não rotineiros deverão ser usados para caracterizar adicionalmente amostras para estabilidade no ponto de tempo inicial, 4 meses, 12 meses e ao final do estudo. Alguns desses métodos também podem ser usados para testar amostras específicas se uma tendência ou um resultado inesperado é observado. Os métodos não rotineiros incluem: cromatografia por exclusão de tamanho empregando dispersão de luz em múltiplos ângulos (SEC-MALS), ligação cinética (SPR), Espectrometria de Massa, CD, AUC, Calorimetria por Exploração Diferencial (DSC), FFF, FTIR, HPLC por exclusão de tamanho (desnaturada) e SDS-PAGE (coloração com prata).

Exemplo X

[000245] Um estudo de PK foi incorporado em um estudo na fase 2B, multi-centro, aleatório, duplamente cego, placebo-controlado para avaliar a segurança e eficácia clínica de duas doses diferentes de abatacept administradas intravenosamente a indivíduos com artrite reumatóide, enquanto recebiam metotrexato. Nesse estudo com design em paralelo, os indivíduos receberam abatacept em 2 doses diferentes (2 e 10 mg/kg) ou placebo em combinação com MTX. Abatacept foi fabricado conforme descrito no pedido de patente US co- pendente No. de Série 60/752.267, depositado em 20 de Dezembro de 2005, o qual ensina processos para a produção de proteínas da invenção, especificamente produtos de glicoproteína recombinantes, através de culturas de células de animal ou mamífero, e fornecidos na forma liofilizada, conforme descrito aqui, em frascos individuais contendo 200 mg de abatacept. Abatacept foi administrado IV a indivíduos nos Dias 1, 15 e 30 e a cada 30 dias depois durante um ano. PK para múltiplas doses derivada de dados da concentração no soro vs. tempo obtidos durante o intervalo de dosagem entre os Dias 60 e 90 de indivíduos que foram arrolados em um sub-estudo de PK local-específico. Para os indivíduos no sub-estudo de PK, amostras de sangue foram coletadas antes de dosagem no Dia 60 e para um perfil de PK começando no Dia 60 a 30 minutos (correspondendo ao final da infusão de abatacept), a 4 horas após o início de infusão e semanalmente depois até o Dia 90. Um total de 90 indivíduos foi arrolado para participar no sub-estudo de PK. Contudo, perfis de PK completos entre o intervalo de dosagem dos Dias 60 a 90 foram obtidos de 29 indivíduos (15 indivíduos dosados a 2 mg/kg; 14 indivíduos dosados a 10 mg/kg).

[000246] Um sumário dos parâmetros de PK é apresentado na Tabela 31. Os resultados do estudo mostraram que a Cmax e AUC (TAU), onde TAU = 30 dias, aumentaram de uma maneira dose- proporcional. Para doses nominais aumentando na proporção de 1:5, as médias geométricas da Cmax aumentaram na proporção de 1:5,2, enquanto que a média geométrica para AUC (TAU) aumentou na proporção de 1:5,0. Além disso, os valores de T-HALF, CLT e Vss pareciam ser independentes da dose. Nesses indivíduos com RA, os valores médios de T-HALF, CLT e Vss estavam em torno de 13 dias, 0,2 mL/h/kg e ~ 0,07 L/kg, respectivamente. O pequeno Vss indica que o abatacept está confinado primariamente ao volume de fluido extracelular. Baseado no esquema de dosagem a 2 e 4 semanas após a primeira infusão, então, uma vez por mês depois, condições em estado uniforme para abatacept foram atingidas pela terceira dose mensal. Também, como um resultado do esquema de dosagem, as concentrações no soro estavam acima das concentrações em estado uniforme durante os primeiros 2 meses de tratamento. Comparação dos valores séricos (Cmin) nos Dias 60, 90 e 180 indicou que o abatacept não parece se acumular após dosagem mensal. Os valores médios de Cmin em estado uniforme para todos os indivíduos que receberam doses IV mensais de 2 e 10 mg/kg de abatacept oscilavam entre 4,4 a 6,7 mcg/mL e 22,0 a 28,7 mcg/mL, respectivamente. Tabela 31 Sumário de múltiplos estudos de PK em indivíduos com artrite reumatóide (1a parte) (2a parte)

[000247] A farmacocinética do abatacept foi estudada em indivíduos adultos saudáveis após uma única infusão intravenosa de 10 mg/kg e em pacientes com RA após múltiplas infusões intravenosas de 10 mg/kg (veja Tabela 32). Tabela 32 Parâmetros farmacocinéticos (média, faixa) em indivíduos saudáveis e pacientes com RA após infusão intravenosa de 10 mg/kg (s) aMúltiplas infusões intravenosas foram administradas nos dias 1, 15, 30 e mensalmente depois.

[000248] A farmacocinética do abatacept em pacientes com RA e indivíduos saudáveis parecia ser comparável. Em pacientes com RA, após múltiplas infusões intravenosas, a farmacocinética do abatacept mostrou aumentos proporcionais de Cmax e AUC sobre a faixa de dose de 2 mg/kg a 10 mg/kg. A 10 mg/kg, a concentração no soro pareceu atingir um estado uniforme no dia 60, com uma concentração sérica média (faixa) de 24 (1-66) mcg/mL. Nenhum acúmulo sistêmico de abatacept ocorreu quando de tratamento repetido contínuo com 10 mg/kg em intervalos mensais em pacientes com RA.

[000249] Análises de farmacocinética na população de pacientes com RA revelou que havia uma tendência em maior clearance de abatacept com aumento do peso corporal. A idade e sexo (quando corrigidos para o peso corporal) não afetam a clearance. Metotrexato (MTX), fármacos anti-inflamatórios não esteroidais (NSAIDs), corticosteróides e agentes de bloqueio de TNF concomitantes não influenciam a clearance de abatacept.

Ensaio no soro para Abatacept

[000250] Amostras de soro foram analisadas com relação ao abatacept através de um ensaio imunoabsorvente enzima-ligado (ELISA) em um total de 25 operações analíticas. Todos os resultados analíticos foram de encontro aos critérios de aceitação estabelecidos antes de análise de amostra, indicando que o método ELISA era preciso e apurado para a quantificação de abatacept nas amostras de estudo. Um sumário dos parâmetros de curva padrão e dados de QC médios para abatacept no soro são apresentados na Tabela 33. A variabilidade entre e dentro da operação das QCs analíticas para abatacept foram CV de 4,5% e 3,5%, respectivamente. As concentrações médias observadas das amostras de QC analítica desviaram em menos de 8,9% dos valores nominais (Tabela 33). Tabela 33 Sumário de dados de controle de qualidade para o ensaio de abatacept em soro humano

Exemplo XI

[000251] Os objetivos desse estudo são avaliar a PK de belatacept após uma única dose SC na faixa de 50 a 150 mg em indivíduos saudáveis; avaliar os efeitos do volume de injeção e concentração da solução injetada sobre a PK de belatacept subcutaneamente injetado; avaliar a segurança e tolerabilidade (incluindo a avaliação do local de injeção) de uma única dose SC de belatacept; avaliar a imunogenicidade de belatacept subcutaneamente administrado.

[000252] Esse é um estudo com uma única dose, duplamente cego, aleatório, placebo-controlado, com grupo paralelo em indivíduos saudáveis. Um total de 42 indivíduos será aleatoriamente distribuído a um de 6 grupos de tratamento. Dentro de cada grupo de 7 indivíduos, os indivíduos serão aleatoriamente distribuídos em uma proporção de 5:2 no Dia 1 para receber uma única injeção SC de belatacept ou placebo. Será requerido que os indivíduos tenham um peso < 100 kg. Os 6 grupos de tratamento são descritos na Tabela 34. Tabela 34

[000253] Os indivíduos deverão sofrer avaliações de triagem para determinar a elegibilidade dentro de 28 dias de dosagem no Dia 1. Os indivíduos serão admitidos na unidade clínica no dia antes de dosagem (Dia 1) para avaliações de linha de base, incluindo MLR. Os indivíduos deverão permanecer na unidade clínica até término das avaliações pós-tratamento no Dia 5 e retornar para a unidade clínica para cada visita de estudo depois, até liberados do estudo.

[000254] No Dia 1, os indivíduos serão aleatoriamente distribuídos ao tratamento e receberão uma única dose SC de belatacept ou placebo e passarão por uma amostra detalhada para PK e imunogenicidade. Todos os indivíduos receberão injeções SC em na parte anterior de sua coxa. Após administração do fármaco de estudo, o Investigador avaliará o local de injeção com relação a sinais de irritação e inflamação local.

[000255] Exames físicos, medições de sinais vitais e avaliações clínicas laboratoriais deverão ser realizados em momentos selecionados no decorrer do estudo. Amostras de sangue deverão ser coletadas durante ate 56 dias apos a administração do fármaco de estudo para análise de PK e avaliação de imunogenicidade. Os indivíduos deverão ser monitorados com relação a AEs no decorrer do estudo. Aproximadamente 256 mL de sangue deverão ser coletados de cada indivíduo durante o estudo.

[000256] Dosagem e acompanhamento deverão ocorrer concorrentemente para todos os grupos de dose. Nenhum indivíduo deverá receber mais de uma única dose. Indivíduos que não completam o estudo (exceto aqueles que são excluídos por AEs) podem ser substituídos.

[000257] Esse é um estudo com uma única dose. Cada indivíduo deverá passar por um período de triagem o qual deverá ser no máximo de 28 dias antes do dia em que o fármaco de estudo é administrado. A última visita do último indivíduo que passou pela triagem deverá ser considerado o final do estudo.

[000258] 100 mg/frasco de belatacept (125 mg/ml), conforme descrito aqui e fabricado conforme descrito no pedido de patente US No. de Série 60/849543, depositado em 5 de Outubro de 2006, o qual ensina processos para a produção de proteínas da invenção, especificamente produtos de glicoproteína recombinantes, através de culturas de células de animal ou mamífero, é um produto líquido pronto para uso proporcionado em um frasco de vidro para extração e administração usando uma seringa e agulha convencionais de tamanho adequado para administração SC. Um excesso suficiente de belatacept é incorporado em cada frasco para levar em conta perdas quando de extração, de modo que 0,8 mL da solução contendo 100 mg possam ser extraídos para administração SC.

[000259] Injeção de belatacept, 100 mg/frasco (125 mg/mL) não é destinada a uma infusão IV.

[000260] Indivíduos saudáveis, conforme determinado pela história médica, exame físico, eletrocardiograma com 12-condutores e avaliações clínicas laboratoriais serão elegíveis para participar do estudo. Esse estudo incluirá homens e mulheres. Os indivíduos devem ter pelo menos 18 anos de idade e um peso < 100 kg no momento de distribuição aleatória. Mulheres não deverão estar amamentando, grávidas e usando um método de contracepção aceitável durante pelo menos 1 mês antes de dosagem, durante o estudo e durante até 4 semanas após o final do estudo. Mulheres com potencial para engravidar devem ter um teste de gravidez negativo no soro dentro de 24 horas antes da dose de medicação de estudo. Os indivíduos deverão ser orientados quanto aos riscos potenciais para uma gravidez. Homens devem estar usando um método adequado de contracepção durante o estudo e durante até 4 semanas após o final de estudo, de modo que o risco de gravidez para sua parceira seja minimizado. Veja Seção 5 para uma lista detalhada dos critérios de inclusão e exclusão.

[000261] Medicações tomadas dentro de 4 semanas antes de arrolamento deverão ser registradas no CRF. Nenhuma medicação concomitante (prescrição, de venda livre ou fitoterápica) deverá ser administrada durante o estudo, exceto quanto a contraceptivos orais, a menos que eles sejam prescritos pelo Investigador para tratamento de eventos clínicos específicos. Quaisquer terapias concomitantes deverão ser registradas no CRF.

[000262] A PK de belatacept após injeção SC deverá ser derivada dos dados de concentração no soro versus tempo. Os parâmetros de PK para uma única dose a serem avaliados incluem: Cmax Concentração máxima observada no soro Tmax Tempo de concentração máxima observada no soro AUC (0-T) Área sob a curva de concentração no soro-tempo a partir do tempo zero até o momento da última concentração quantificável AUC (IFN) Área sob a curva de concentração no soro-tempo a partir do tempo zero extrapolada para o tempo infinito Meia vida Meia-vida no soro CLT/F Clearance aparente total no corpo VSS/F Volume aparente de distribuição em estado uniforme

[000263] Os valores do parâmetro PK individuais serão derivados através de métodos não compartimentais através de um programa de análise de PK validado, o programa eToolbox Kinetica, Innaphase Corp, Filadélfia, PA. A AUC dose-normalizada também será reportada.

[000264] Amostras de soro deverão ser coletadas durante o tempo e ensaiadas com relação à presença de titulações de anticorpo ao belatacept usando dois ensaios ELISA. Um ensaio avalia a resposta à molécula inteira e o outro à porção LEA29Y-T apenas.

[000265] Todos os indivíduos que recebem a medicação de estudo deverão ser incluídos nos conjuntos de dados de segurança e PD. Indivíduos que recebem placebo em qualquer painel deverão ser agrupados em um único grupo de tratamento com placebo para avaliações de PD e avaliações de segurança, exceto quanto à avaliações do local de injeção. Todos os dados disponíveis de indivíduos que receberam belatacept deverão ser incluídos no conjunto da dados de PK e incluídos na estatística resumida e análise estatística.

[000266] A linha de base é considerada o Dia 1. Distribuições de freqüência de sexo e raça deverão ser inseridas na tabela por tratamento (volume e dose de injeção). Estatística resumida para idade, peso corporal e altura deverão ser inseridas na tabela por tratamento.

[000267] Todos os AEs registrados deverão ser listados e inseridos na tabela pelo termo, classe de órgão de sistema e tratamento preferidos. Sinais vitais e resultados de testes clínicos de laboratório deverão ser listados e resumidos por tratamento. Quaisquer achados quando de exame físico e resultados clínicos de laboratório significativos deverão ser listados. Avaliações do local de injeção (eritema, calor, inchaço, dor e prurido) deverão ser inseridos na tabela por tratamento e grau de gravidade. Indivíduos com placebo serão agrupados através dos grupos de dose e analisados independentemente, também, para a avaliação do local de injeção.

[000268] Estatística resumida deverá ser inserida na tabela para os parâmetros de PK por tratamento. As médias geométricas e coeficientes de variação deverão ser apresentados para Cmax, AUC (0-T) e AUC (INF). As medianas, mínima e máxima, deverão ser apresentadas para Tmax. Médias e desvios padrões serão fornecidos para outros parâmetros de PK. Para avaliar a dependência da dose após administração SC, plotagens de dispersão de Cmax e AUC (INF) versus dose deverão ser proporcionadas. Plotagens de dispersão de AUC (IFN) e Cmax através dos volumes de injeção deverão ser construídas para avaliar esse efeito sobre a PK do belatacept. Também, plotagens de dispersão de Cmax e AUC (INF) versus dose para um volume fixo e Cmax e AUC (INF) versus volume dentro de doses serão proporcionadas onde aplicável.

[000269] Estatística resumida deverá ser inserida na tabela por tratamento e o dia de estudo para valores de anticorpo anti-belatacept e anti-LEA29Y-T e suas alterações a partir da linha de base (Dia 1 - 0 hora). Para explorar possíveis associações entre a imunogenicidade e exposição, plotagens de alterações nas concentrações de anticorpos anti-belatacept e anti-LEA29Y-T serão proporcionadas.

[000270] Os esquemas de amostragem de sangue para PK e imunogenicidade são esboçados na Tabela 35. Tabela 35 Esquema de amostragem de sangue para imunogenicidade e farmacocinética a Amostra de imunogenicidade no Dia 1 (anticorpos anti-belatacept) deverá ser coletada antes de administração de fármaco. Amostras nos Dias 28, 35, 42 e 56 podem ser coletadas dentro de ± 2 dias.

[000271] A Tabela 35 acima lista o esquema de amostragem a ser seguido para avaliação de PK. Amostras de sangue (~3 mL por amostra) deverão ser coletadas em um tubo Vacutainer® pré-rotulado Red and Gray Top (SST) via venipunção direta ou de um lock de solução salina. Se um sistema de lock de solução salina é usado, aproximadamente 0,5 mL de sangue deverão ser coletados através do cateter residente e descartados antes de obtenção de cada amostra para PK. Uma vez que o espécime para PK tenha sido obtido, o sangue deverá ser deixado coagular no tubo Vacutainer® em temperatura ambiente durante 15-30 minutos. Após coagulação, a amostra deverá ser centrifugada durante 15 minutos a 1500 x g em uma centrífuga refrigerada (4 °C). Quando a centrifugação está completa, pelo menos 0,5 mL de soro de cada ponto de tempo de amostra para PK deverão ser removidos através de uma pipeta e transferidos para um tubo de armazenamento e envio para PK de polipropileno, com tampa de rosca, pré-rotulado. O tubo de polipropileno contendo a amostra de soro para PK deverá ser armazenado congelado a -20 °C ou mais frio durante um máximo de um mês e, então, a -70 °C após isso. O tempo permitido a partir da coleta de amostra até congelamento do soro é de 12 horas. Um método de imunoensaio enzimático (EIA) sensível validado deverá ser usado para medir as concentrações de belatacept no soro.

[000272] A Tabela 35 lista o esquema de amostragem a ser seguido para a avaliação de imunogenicidade. Amostras de soro serão obtidas em visitas nos Dias 1, 14, 28, 35, 42 e 56. A amostra para imunogenicidade no Dia 1 (anti-belatacept) deverá ser tomada antes de administração do fármaco de estudo. As amostras deverão ser ensaiadas com relação à presença de anticorpos anti-belatacept e anti-LEA29Y-T. Para cada espécime, sangue (~ 3 mL por amostra) deverá ser coletado em um tubo Vacutainer® pré-rotulado Red and Gray Top (SST) via venipunção direta ou de um lock de solução salina (cateter residente). Se um sistema de lock de solução salina é usado para coleta de sangue, aproximadamente 0,5 mL de sangue deverão ser coletados através do cateter residente e ser descartados antes de obtenção de cada amostra para imunogenicidade. Uma vez que o espécime tenha sido obtido, o sangue deverá ser deixado coagular no tubo Vacutainer® em temperatura ambiente durante 15-30 minutos. Após coagulação, a amostra deverá ser centrifugada durante 15 minutos a 1500 x g em uma centrífuga refrigerada (4 °C). Quando a centrifugação está completa, pelo menos 1 mL de soro deverá ser removido através de uma pipeta e transferido para um tubo de armazenamento e envio de amostra de soro de polipropileno, com tampa de rosca, pré-rotulado. O tubo de polipropileno contendo a amostra de soro deverá ser armazenado congelado a -20 °C ou mais frio. Dois métodos de ensaio imunoabsorvente enzima-ligado (ELISA) sensíveis validados deverão ser usados para medir as titulações de anticorpo ao belatacept no soro. Um ensaio avalia a titulação de anticorpo à molécula inteira e o outro à porção LEA29Y-T apenas.

Exemplo XII

[000273] Deamidação, fragmentação e agregação são vias de degradação observadas de moléculas de LEA29YIg. Esse protocolo esboça um estudo de estabilidade de pH em escala de laboratório adicional projetado para avaliar a formulação de produto de fármaco SC belatacept na faixa de pH de 6,3-7,5. A finalidade desse estudo é identificar a formulação com pH ótimo que obterá uma vida útil mínima de 18 meses para a formulação SC de belatacept.

[000274] Para esse estudo, produto belatacept SC será formulado em um pH de 6,3, 6,6, 6,9, 7,2 e 7,5. A substância de fármaco belatacept a ~25 mg/mL será primeiro concentrada para ~100 mg/mL, então, diafiltrada em tampão de fosfato a 10 mM em um pH de 6,9, seguido por uma segunda concentração para obter um intermediário de produto de fármaco (DPI) a >160 mg/mL. O DPI será formulado com sacarose e poloxamer 188 e a concentração final do lote será ajustada com tampão de fosfato a 10 mM (pH de 6,9). O bruto formulado deverá ser subdividido em cinco sub-lotes, conforme esboçado no design de estudo. O pH do sub-lotes será titulado para 6, e 6,6, respectivamente, usando HCl a 1N. O pH dos dois sub-lotes adicionais será titulado para até 6,9, 7,2 e 7,5 com NaOH a 1N. Os lotes de produto serão enchidos em PhysiolisTM com capacidade de 1 mL. As amostras deverão ser protegidas da luz em a todo momento cobrindo ou inserindo as mesmas em sacos protetores de luz marrons. A formulação de produto de fármaco SC utilizada nesse estudo é descrita na Tabela 36 abaixo. Tabela 36 Composição de formulação de fármaco SC em um pH de 6,9

[000275] Produto de fármaco armazenado a 2-8 °C será coletado a 0, 2, 4, 6, 12 18, 24 meses e opcionalmente 9 meses. Produto de fármaco armazenado a 15°C será coletado a 1, 2, 4, 6 meses e opcionalmente 9 meses. Produto de fármaco armazenado a 25°C e umidade de 60% será coletado a 1, 2, 4 e 6 meses. Produto de fármaco armazenado a 35°C será coletado a 1, 2 e 4 meses. Amostras armazenadas a 2-8°C serão testadas com relação à aparência (amostras inicial e final apenas), pH (amostras inicial, 4 meses e final apenas), A280 (amostras inicial, 4 meses e final apenas), HPLC por exclusão de tamanho, SDS-PAGE, mapeamento de peptídeo por digestão tríptica (TPM), Biacore B7 Binding (amostras inicial, 4 meses e final apenas ou conforme necessário) e focalização isoelétrica (IEF) (amostras inicial e final apenas). Amostras armazenadas a 15°C e 25°C com umidade de 60% serão testadas com relação à A280 (amostras inicial, 4 meses e última apenas), HPLC por exclusão de tamanho, SDS-PAGE e mapeamento de peptídeo por digestão tríptica (TPM). Amostras armazenadas a 35°C serão testadas através de HPLC por exclusão de tamanho, SDA-PAGE e mapeamento de peptídeo por digestão tríptica (TPM).

[000276] Métodos de testagem não rotineiros serão usados para caracterizar adicionalmente a estabilidade das amostras no ponto de tempo inicial, 4 meses, 12 meses e no final do estudo. Alguns desses métodos podem também ser usados para testar amostras específicas se uma tendência ou um resultado inesperado é observado. Os métodos não rotineiros incluem: cromatografia por exclusão de tamanho empregando dispersão de luz em múltiplos ângulos (SEC- MALS), ligação cinética (SPR), Espectrometria de Massa, CD, AUC, Calorimetria por Exploração Diferencial (DSC), FFF, FTIR, HPLC por exclusão de tamanho (desnaturada) e SDS-PAGE (coloração com prata).

Claims (10)

1. Formulação adequada para administração subcutânea, caracterizada pelo fato de que compreende moléculas de CTLA4Ig a 125 mg/ml, um açúcar selecionado do grupo que consiste em sacarose, lactose, maltose, manitol e trealose e suas misturas, e um carreador aquoso farmaceuticamente aceitável, em que a molécula de CTLA4Ig compreende os resíduos de aminoácidos 26-382 de SEQ ID NO: 2, resíduos de aminoácidos 26-383 de SEQ ID NO: 2, resíduos de aminoácidos 27-382 de SEQ ID NO: 2 e/ou resíduos de aminoácidos 27-383 de SEQ ID NO: 2, em que a formulação tem uma faixa de pH de 6 a 8 e uma viscosidade de 9 a 20 mPa.s, e a razão em peso de açúcar: proteína é 1,1: 1 ou maior.

2. Formulação, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o açúcar é sacarose, manitol ou trealose.

3. Formulação, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o açúcar é um dissacarídeo.

4. Formulação, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o açúcar é sacarose.

5. Formulação, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizada pelo fato de que possui uma faixa de pH de 6 a 7,8.

6. Formulação, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizada pelo fato de que compreende ainda um agente tamponante farmaceuticamente aceitável.

7. Formulação, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizada pelo fato de que compreende as moléculas de CTLA4Ig em uma quantidade de 125 mg/ml, sacarose em uma quantidade de 170 mg/ml, pelo menos um agente tamponante, água estéril para injeção e, opcionalmente, um tensoativo, em que a molécula de CTLA4Ig compreende os resíduos de aminoácidos 26-382 de SEQ ID NO: 2, resíduos de aminoácidos 26-383 de SEQ ID NO: 2, resíduos de aminoácidos 27-382 de SEQ ID NO: 2 e/ou resíduos de aminoácidos 27-383 de SEQ ID NO: 2.

8. Formulação, de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de que compreende ainda um tensoativo.

9. Formulação, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizada pelo fato de que a formulação é estável quando armazenada de 2 a 8°C por pelo menos 12 meses.

10. Formulação, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizada pelo fato de que a formulação tem uma osmolalidade de 700 mOsm/kg H2O a 800 mOsm/kg H2O.