BRPI0620186A2 - formulação estável ou liofilizada compreendendo uma molécula de ctla4ig ou uma molécula de le104a29yig - Google Patents

Abstract

A presente invenção refere-se, de modo geral, à formulações estáveis compreendendo moléculas de CTLA4Ig, incluindo formulações liofilizadas e líquidas, para administração através de várias vias incluindo, por exemplo, vias tais como intravenosa (IV) e subcutânea (SC) para tratamento de doenças do sistema imune e indução de tolerância.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "FORMULA-ÇÃO ESTÁVEL ADEQUADA PARA ADMINISTRAÇÃO SUBCUTANEA,ARTIGOS DE FABRICAÇÃO, FORMULAÇÃO ESTÁVEL ADEQUADAPARA DILUIÇÃO ANTES DE ADMINISTRAÇÃO INTRAVENOSA, FOR-MULAÇÃO LIOFILIZADA ESTÉRIL PARA DILUIÇÃO ANTES DE ADMI-NISTRAÇÃO INTRAVENOSA E USO DAS MESMAS".

O presente pedido de patente reivindica a prioridade do U.S.No. de Série 60/752.150, depositado em 20 de Dezembro de 2005, o qual éaqui incorporado por referência em sua totalidade.

Todas as patentes, pedidos de patente e publicações citadosaqui são aqui incorporados por referência em sua totalidade. As descriçõesdessas publicações em suas totalidades são incorporadas aqui por referên-cia ao presente pedido de forma a descrever mais completamente o estadoda técnica, conforme conhecido por aqueles versados na mesma, no mo-mento de depósito da invenção descrita e reivindicada aqui.

Campo da Invenção

A presente invenção se refere, em geral, a formulações estáveiscompreendendo moléculas de CTLA4lg, incluindo formulações liofilizadas elíquidas, para administração através de várias vias incluindo, por exemplo,vias tais como intravenosa (IV) e subcutanea (SC).

Antecedentes da Invenção

Durante as duas últimas décadas, a tecnologia de DNA recom-binante levou à comercialização de muitos produtos terapêuticos de proteí-na. A via mais convencional de distribuição para fármacos de proteína temsido administração intravenosa (IV) em virtude da pobre biodisponibilidadepela maioria das outras vias, maior controle durante administração clínica edesenvolvimento farmacêutico mais rápido. Para produtos que requeremadministração freqüente e crônica, a via de distribuição subcutanea (SC)alternativa é mais apelativa. Quando associada à tecnologia de dispositivoauto-injetor e seringa preenchida, a distribuição SC permite a administraçãoem casa e aceitação aperfeiçoada de administração.

Tratamentos com altas doses de mais de 1 mg/kg ou 100 mg pordose freqüentemente requerem o desenvolvimento de formulações em con-centrações excedendo a 100 mg/ml em virtude do pequeno volume (< 1,5ml) que pode ser fornecido pelas vias SC. Para proteínas que têm uma pro-pensão em agregar em maiores concentrações, obtenção de tais formula-ções em alta concentração é um desafio de desenvolvimento. Mesmo para avia de distribuição IV, onde grandes volumes podem ser administrados, con-centrações de proteína de dez miligramas por mililitro podem ser necessá-rias para regimes em alta dosagem e isso pode impor desafios de estabili-dade para algumas proteínas.

Os princípios que orientam a solubilidade de proteína são maiscomplicados do que aqueles para pequenas moléculas sintéticas e, assim,superação do problema de solubilidade da proteína segue diferentes estra-tégias. Operacionalmente, a solubilidade para proteínas poderia ser descritapela quantidade máxima de proteína na presença de co-solutos, pelo que asolução permanece visivelmente transparente (isto é, não mostra precipita-dos, cristais ou géis de proteína). A dependência da solubilidade da proteínada resistência iônica, forma de sal, pH, temperatura e determinados excipi-entes foi mecanisticamente explicada por alterações na tensão de superfícieda água em geral e ligação de proteína aos íons de água versus auto-associação por Arakawa e outros em Theory ofprotein solubility, Methods ofEnzymology, 114: 49-77, 1985; Schein in Solubility as a function of proteinstructure and solvent components, BioTechnology 8 (4): 308-317, 1990; Jen-kins em Three solutions of the protein solubility problem, Protein Science 7(2): 376-382, 1998; e outros. A ligação de proteínas a excipientes ou saisespecíficos influencia a solubilidade através de alterações na conformaçãode proteína ou disfarçando determinados aminoácidos envolvidos em auto-interação. Proteínas também são, de preferência, hidratadas (e estabilizadascomo conformações mais compactas) por determinados sais, aminoácidos eaçúcares, levando à sua solubilidade alterada.

Espera-se que a agregação, a qual requer colisão bi-molecular,seja a via de degradação primária em soluções de proteína. A relação deconcentração para formação de agregado depende do tamanho dos agrega-dos, bem como do mecanismo de associação. Agregação de proteína poderesultar em associação covalente (por exemplo, dissulfeto-ligada) ou nãocovalente (reversível ou irreversível). Agregação irreversível através de as-sociação não covalente geralmente ocorre via regiões hidrofóbicas expostasatravés de processos térmicos, mecânicos ou químicos que alteram a con-formação nativa da proteína. Agregação de proteína pode ter um impactosobre a atividade, farmacocinética e segurança da proteína, por exemplo,em virtude de imunogenicidade.

Uma abordagem típica para minimizar a agregação é restringir amobilidade de proteínas de forma a reduzir o número de colisões. Liofiliza-ção com excipientes apropriados pode melhorar a estabilidade da proteínacontra agregação através de diminuição da mobilidade de proteína e restri-ção de flexibilidade conformacional, com o benefício adicional de minimiza-ção de reações hidrolíticas conseqüentes à remoção de água. A adição deexcipientes apropriados, incluindo lioprotetores, pode prevenir a formação deagregados durante o processo de liofilização, bem como durante armaze-namento do produto final. Um parâmetro chave para proteção eficaz é a pro-porção molar do lioprotetor para proteína. Geralmente, proporções molaresde 300:1 ou maiores são requeridas para proporcionar estabilidade adequa-da, especialmente para armazenamento em temperatura ambiente. Taisproporções também podem, contudo, levar a um aumento indesejável naviscosidade.

Liofilização permite projetar uma formulação com estabilidade etonicidade apropriadas. Embora a isotonicidade não seja necessariamenterequerida para administração SC, ela pode ser desejável para minimizar ador quando de administração. A isotonicidade de um liofilizado é difícil deobter porque a proteína e os excipientes são concentrados durante o pro-cesso de reconstituição. Proporções molares de excipiente:proteína de 500:1resultarão em preparados hipertônicos se a concentração final de proteína éobjetivada a >100 mg/ml. Se o desejo é obter uma formulação isotônica, en-tão, uma escolha de proporção molar menor de excipiente.proteína resultaráem uma formulação potencialmente menos estável.Determinação da maior concentração de proteína obtenível per-manece um exercício empírico em virtude da natureza lábil da conformaçãode proteína e da propensão de interagir consigo mesma, com superfícies ecom solutos específicos.

Exemplos de indivíduos que podem se beneficiar de formulaçõesSC são aqueles que têm condições que requerem administração freqüente ecrônica, tais como indivíduos com a doença do sistema imune artrite reuma-tóide e distúrbios imunes associados ao transplante de enxerto. Produtos defármaco de proteína comercialmente disponíveis para o tratamento de artritereumatóide incluem HUMIRA®, ENBREL® e REMICADE®HUMIRA® (Abbott) é fornecido em seringas de vidro preenchidasde 1 ml de uso único como uma solução estéril isenta de conservante paraadministração subcutânea. A solução de HUMIRA® é transparente e incolor,com um pH de cerca de 5,2. Cada seringa distribui 0,8 ml (40 mg) de produ-to de fármaco. Cada 0,8 ml de HUMIRA® contém 40 mg de adalimumab,4,93 mg de cloreto de sódio, 0,69 mg de dihidrato de fosfato de sódio mono-básico, 1,22 mg de dihidrato de fosfato de sódio dibásico, 0,24 mg de citratode sódio, 1,04 mg de monohidrato de ácido cítrico, 9,6 mg de manitol, 0,8mg de polissorbato 80 e água para injeção, USP. Hidróxido de sódio é adi-cionado, conforme necessário, para ajustar o pH.

ENBREL® (Amgen) é fornecido como uma seringa de 1 ml pre-enchida de uso único como uma solução estéril, isenta de conservante parainjeção subcutânea. A solução de ENBREL® é transparente e incolor e éformulada em um pH de 6,3 ± 0,2. Cada seringa preenchida de único uso deENBREL® contém 0,98 ml de uma solução a 50 mg/ml de etanercept com 10mg/ml de sacarose, 5,8 mg/ml de cloreto de sódio, 5,3 mg/ml de cloridrato deL-arginina, 2,6 mg/ml de monohidrato de fosfato de sódio monobásico e 0,9mg/ml de fosfato de sódio dibásico anídrico. Administração de uma seringapreenchida de 50 mg/ml de ENBREL® proporciona uma dose equivalente adois frascos de 25 mg de ENBREL® liofilizado, quando os frascos são re-constituídos e administrados conforme recomendado. Frascos ENBREL®para uso múltiplo contêm pó liofilizado estéril, branco, isento de conservante.Reconstituição com 1 ml de água para injeção bacteriostática estéril forneci-da (BWFI), USP (contendo álcool benzílico a 0,9%) proporciona uma soluçãotransparente e incolor para uso múltiplo com um pH de 7,4 ± 0,3 contendo25 mg de etanercept, 40 mg de manitol, 10 mg de sacarose e 1,2 mg detrometamina.

REMICADE® (Centocor) é fornecido como um pó estéril, branco,liofilizado para infusão intravenosa. Após reconstituição com 10 ml de águaestéril para injeção, USP, o pH resultante é de aproximadamente 7,2. Cadafrasco para uso único contém 100 mg de infliximab, 500 mg de sacarose, 0,5mg de polissorbato 80, 2,2 mg de fosfato de sódio monobásico, monohidratoe 6,1 mg de fosfato de sódio dibásico, dihidrato. Nenhum conservante estápresente.

Produtos de fármaco de proteína comercialmente disponíveispara o tratamento de distúrbios imunes associados ao transplante de enxertoincluem SIMULECT® e ZENAPAX®.

O produto de fármaco SIMULECT® (Novartis) é um liofilizadoestéril o qual está disponível em frascos de vidro incolores de 6 ml e estádisponível em resistências de 10 mg e 20 mg. Cada frasco de 10 mg contém10 mg de basiliximab, 3,61 mg de fosfato de potássio monobásico, 0,50 mgde hidrogenofosfato de dissódio (anidro), 0,80 mg de cloreto de sódio, 10 mgde sacarose, 40 mg de manitol e 20 mg de glicina, a ser reconstituído em 2,5ml de água estéril para injeção, USP. Cada frasco de 20 mg contém 20 mgde basiliximab, 7,21 mg de fosfato de sódio monobásico, 0,99 mg de hidro-genofosfato de dissódio (anídrico), 1,61 mg de cloreto de sódio, 20 mg desacarose, 80 mg de manitol e 40 mg de glicina, a ser reconstituído em 5 mlde água estéril para injeção, USP. Nenhum conservante é adicionado.

ZENAPAX® (Roche Laboratories), 25 mg/5 ml, é fornecido comoum concentrado incolor transparente, estéril para diluição adicional e admi-nistração intravenosa. Cada mililitro de ZENAPAX® contém 5 mg de daclizu-mab e 3,6 mg de monohidrato de fosfato de sódio monobásico, 11 mg deheptahidrato de fosfato de sódio dibásico, 4,5 mg de cloreto de sódio, 0,2 mgde polissorbato 80 e pode conter ácido clorídrico ou hidróxido de sódio paraajustar o pH para 6,9. Nenhum conservante é adicionado.

Moléculas de CTLA4lg interferem com a co-estimulação de célu-las T através de inibição da interação CD28-B7. Portanto, moléculas de C-TLA4lg podem proporcionar um uso terapêutico para doenças do sistemaimune, tal como artrite reumatóide e distúrbios do sistema imune associadosa transplante de enxerto.

Há uma necessidade por uma formulação estável eficaz, conve-niente compreendendo moléculas de CTLA4lg para tratamento de distúrbiosdo sistema imune.

Sumário da Invenção

A presente invenção proporciona formulações para tratamentode doenças do sistema imune através de administração, a um indivíduo, demoléculas de CTLA4lg, as quais se ligam a moléculas de B7 sobre célulasB7-positivas, desse modo, impedindo as moléculas de B7 endógenas de seligar à CTLA4lg e/ou CD28 sobre células T.

A formulação liofilizada da invenção compreende a molécula deCTLA4lg em uma proporção em peso de proteína para lioprotetor de pelomenos 1:2. O lioprotetor é, de preferência, açúcar, mais preferivelmente dis-sacarídeos, ainda mais preferivelmente sacarose ou maltose. A formulaçãoliofilizada também pode compreender um ou mais dos componentes selecio-nados da lista consistindo em agentes de tamponamento, tensoativos, agen-tes de composição de volume e conservantes.

Em determinadas modalidades, a quantidade de sacarose oumaltose útil para estabilização do produto de fármaco liofilizado está em umaproporção em peso de proteína para sacarose ou maltose de pelo menos1:2, de preferência em uma proporção em peso de proteína para sacaroseou maltose de 1:2 a 1:5, mais preferivelmente em uma proporção em pesode proteína para maltose ou sacarose de cerca de 1:2.

A formulação subcutânea (SC) da invenção compreende a mo-lécula de CTLA4lg em uma concentração de proteína de pelo menos 100mg/ml em combinação com açúcar em níveis de estabilização, de preferên-cia em uma concentração de proteína de pelo menos 125 mg/ml em combi-nação com um açúcar em níveis de estabilização, em um veículo aquoso. Oaçúcar está, de preferência, em uma proporção em peso de proteína paraaçúcar de pelo menos 1:1,1. O estabilizante é, de preferência, empregadoem uma quantidade de não mais do que aquela a qual pode resultar em umaviscosidade indesejada ou inadequada para administração via uma seringaSC. O açúcar é, de preferência, dissacarídeos, mais preferivelmente sacaro-se. A formulação SC pode também compreender um ou mais dos compo-nentes selecionados da lista consistindo em agentes de tamponamento, ten-soativos e conservantes.

Em determinadas modalidades, a quantidade de sacarose útilpara estabilização do produto de fármaco SC de molécula de CTLA4lg estáem uma proporção em peso de proteína para sacarose de pelo menos 1:1,de preferência em uma proporção em peso de proteína para sacarose a1:1,3 a 1:5, mais preferivelmente em uma proporção em peso de proteínapara sacarose de cerca de 1:1,4.

A formulação líquida da invenção compreende a molécula deCTLA4lg em uma concentração de proteína de pelo menos 20 mg/ml emcombinação com um açúcar em níveis de estabilização, de preferência pelomenos 25 mg/ml em combinação com um açúcar em níveis de estabilizaçãoem um veículo aquoso. De preferência, o açúcar está em uma proporção empeso de proteína para açúcar de pelo menos 1:1.0 açúcar é, de preferência,dissacarídeos, mais preferivelmente sacarose. A formulação líquida tambémpode compreender um ou mais dos componentes selecionados da lista con-sistindo em agentes de tamponamento, tensoativos e conservantes.

Em determinadas modalidades, a quantidade de sacarose útilpara estabilização do produto de fármaco líquido está em uma proporção empeso de proteína para sacarose de pelo menos 1:1, de preferência em umaproporção em peso de proteína para sacarose de 1:2 a 1:10, mais preferi-velmente em uma proporção em peso de proteína para sacarose de cercade 1:2.

Em outra modalidade da invenção, um artigo de fabricação éproporcionado, o qual contém o produto de fármaco e, de preferência, pro-porciona instruções para seu uso.

A presente invenção ainda proporciona métodos para tratamentode doenças do sistema imune e indução de tolerância através de administra-ção das formulações de molécula de CTLA4lg da invenção.

Breve Descrição dos Desenhos

A FIG. 1 apresenta a seqüência de nucleotídeo (SEQ ID NO: 1)de uma porção de um cassete de expressão para uma molécula de CTLA4-Ig. Também mostrada é a seqüência de aminoácido (SEQ ID NO: 2) codifi-cada pelo ácido nucleico. Moléculas de CTLA4-lg que podem ser produzidasa partir desse cassete de expressão incluem moléculas tendo a seqüênciade aminoácido com resíduos: (i) 26-383 de SEQ ID NO: 2, (ii) 26-382 deSEQ ID NO: 2, (iii) 27-383 de SEQ ID NO: 2 ou (iv) 26-382 de SEQ ID NO: 2ou opcionalmente (v) 25-382 de SEQ ID NO: 2, ou (vi) 25-383 de SEQ IDNO: 2. O cassete de expressão compreende as seguintes regiões: (a) umaseqüência sinalizadora de Oncostatina M (nucleotídeos 11-88 de SEQ IDNO: 1; aminoácidos 1-26 de SEQ ID NO: 2); (b) um domínio extracelular deCTLA4 humana (nucleotídeos 89-463 de SEQ ID NO: 1; aminoácidos 27-151de SEQ ID NO: 2); (c) uma porção modificada da região constante de lgG1humana (nucleotídeos 464-1159 de SEQ ID NO: 1; aminoácidos 152-383 deSEQ ID NO: 2), incluindo uma região de dobradiça modificada (nucleotídeos464-508 de SEQ ID NO: 1; aminoácidos 152-166 de SEQ ID NO: 2), umdmCH2 de lgG1 humana modificado (nucleotídeos 509-838 de SEQ ID NO:1; aminoácidos 167-276 de SEQ ID NO: 2) e um domínio de CH3 de lgG1humana (nucleotídeos 839-1159 de SEQ ID NO: 1; aminoácidos 277-383 deSEQ ID NO: 2).

A FIG. 2 representa uma seqüência de nucleotídeo (SEQ ID NO:3) e aminoácido (SEQ ID NO: 4) de CTLA4-L104EA29Y-lg (também conhe-cida como "L104EA29Ylg" e "LEA29Y") compreendendo um peptídeo sinali-zador; um domínio extracelular com mutação de CTLA4 começando na me-tionina na posicao -1 e terminando em ácido aspártico na posição +124oucomeçando em alanina na posição -1 e terminando em ácido aspártico naposição +124; e uma região de Ig. SEQ ID NOs: 3 e 4 representam uma se-quência de nucleotídeo e aminoácido, respectivamente, de L104EA29Ylgcompreendendo um peptídeo sinalizador; um domínio extracelular com mu-tação de CTLA4 começando na metionina na posição +27 e terminando emácido aspártico na posição +150 ou começando em alanina na posição +26e terminando em ácido aspártico na posição +150; e uma região de Ig.L104EA29Ylg pode ter a seqüência de aminoácido com resíduos: (i) 26-383de SEQ ID NO: 4, (ii) 26-382 de SEQ ID NO: 4; (iii) 27-383 de SEQ ID NO: 4ou (iv) 27-382 de SEQ ID NO: 4 ou opcionalmente (v) 25-382 de SEQ ID NO:4 ou (vi) 25-383 de SEQ ID NO: 4.

Descrição Detalhada da Invenção

Conforme utilizado aqui:

Uma formulação ou produto de fármaco "estável" é um no qual amolécula de CTLA4lg no mesmo retém essencialmente sua estabilidade físi-ca e química e integridade quando de armazenamento. Estabilidade dasformulações de molécula de CTLA4lg pode ser medida em temperaturasselecionadas após períodos de tempo selecionados. Por exemplo, um au-mento na formação de agregado após liofilização e armazenamento é umindicador para instabilidade de uma formulação de molécula de CTLA4lgliofilizada. Além de formação de agregado, retenção de clareza, cor e odororiginais no decorrer da vida útil são indicadores utilizados para monitorar aestabilidade das soluções da molécula de CTLA4lg. Espécies de HMW sãomultímeros (isto é, tetrâmeros, hexâmeros, etc), os quais têm um peso mo-lecular maior do que os dímeros de molécula de CTLA4lg. Tipicamente, umproduto de fármaco "estável" pode ser um em que o aumento na agregação,conforme medido através de um aumento no percentual de espécies de ele-vado peso molecular (% de HMW), é menor do cerca de 5% e, de preferên-cia, menor do que cerca de 3% quando uma formulação é armazenada a 2-8°C durante um ano. De preferência, o produto de fármaco fabricado com-preende pelo menos cerca de 25% de espécies de HMW, de preferênciamenos de cerca de 15% de espécies de HMW, mais preferivelmente menosde cerca de 10% de espécies de HMW, ainda mais preferivelmente menosde cerca de 5% de espécies de HMW.O monômero, dímero e espécies de HMW de molécula de C-TLA4lg podem ser separados através de cromatografia por exclusão de ta-manho (SEC). SEC separa moléculas baseado no tamanho molecular. Se-paração é obtida através da exclusão ou inclusão molecular diferencial àmedida que as moléculas migram ao longo do comprimento da coluna. As-sim, decomposição aumenta como uma função do comprimento da coluna.

Amostras de molécula de CTLA4lg podem ser separadas usando um 2695Alliance HPLC (Waters, Milford, MA) equipado com colunas TSK Gel®G3000SWXL (300 mm x 7,8 mm) e TSK Gel® G3000SWXL (40 mm x 6,0mm) (Tosoh Bioscience, Montgomery, PA) aleatoriamente. Amostra a 10mg/ml (alíquotas de 20 são separadas usando uma fase móvel consistin-do em KH2P04 a 0,2 M, NaCI a 0,9%, pH de 6,8, em uma taxa de fluxo de1,0 ml/min. As amostras são monitoradas em uma absorbância de 280 nmusando um detector 2487 Dual Wavelength da Water. Usando esse sistema,as espécies de HMW têm um tempo de retenção de 7,5 min ± 1,0 min. Cadapico é integrado com relação à área sob a curva. A % de espécies de HMWé calculada dividindo a área de pico de HMW pela área de pico total.

Uma formulação "reconstituída" é uma a qual foi preparada atra-vés de dissolução de uma formulação liofilizada em um veículo aquoso, demodo que a molécula de CTLA4lg é dissolvida na formulação reconstituída.

A formulação reconstituída é adequada para administração intravenosa (IV)a um paciente que precisa da mesma.

Uma formulação "isotônica" é uma a qual tem essencialmente amesma pressão osmótica que o sangue humano. Formulações isotônicasgeralmente terão uma pressão osmótica de cerca de 250 a 350 mOsmol/Kgde H2O. O termo "hipertônico" é usado para descrever uma formulação comuma pressão osmótica acima daquela do sangue humano. A isotonicidadepode ser medida usando um osmômetro do tipo pressão de vapor ou conge-lamento com gelo, por exemplo.

O termo "agente de tamponamento" se refere a um ou maiscomponentes que, quando adicionados a uma solução aquosa, são capazesde proteger a solução contra variações no pH quando de adição de ácido ouálcali ou quando de diluição com um solvente. Além dos tampões de fosfato,podem ser usados tampões de glicinato, carbonato, citrato e semelhantes,caso no qual íons de sódio, potássio ou amônio podem servir como um con-tra-íon.

Um "ácido" é uma substância que proporciona íons de hidrogê-nio em uma solução aquosa. Um "ácido farmaceuticamente aceitável" incluiácidos orgânicos e inorgânicos os quais são não tóxicos na concentração emaneira pela qual eles são formulados.

Uma "base" é uma substância que proporciona íons de hidroxilaem solução aquosa. "Bases farmaceuticamente aceitáveis" incluem basesorgânicas e inorgânicas as quais são não tóxicas na concentração e maneirapela qual elas são formuladas.

Um "lioprotetor" é uma molécula a qual, quando combinada comuma proteína de interesse, impede ou reduz a instabilidade química da pro-teína quando de liofilização e subsequente armazenamento.

Um "conservante" é um agente que reduz a ação bacteriana epode ser opcionalmente adicionado às formulações aqui. A adição de umconservante pode, por exemplo, facilitar a produção de uma formulação paramúltiplos usos (múltiplas doses). Exemplos de conservantes potenciais in-cluem cloreto de octadecil dimetilbenzil amônio, cloreto de hexametônio, clo-reto de benzalcônio (uma mistura de cloretos de alquilbenzil dimetil amôniona qual os grupos alquila são compostos de cadeia longa) e cloreto de ben-zetônio. Outros tipos de conservantes incluem álcoois aromáticos, tais comofenol, álcool butílico e benzílico, alquil parabenos, tais como metil ou propilparabeno, catecol, resorcinol, ciclohexanol, 3-pentanol e m-cresol.

Um "tensoativo" é uma molécula superfície-ativa contendo umaporção hidrofóbica (por exemplo, cadeia alquila) e uma porção hidrofílica(por exemplo, grupos carboxila e carboxilato). Tensoativo pode ser adiciona-do às formulações da invenção. Tensoativos adequados para uso em formu-lações da presente invenção incluem, mas não estão limitados a, polissorba-tos (por exemplo, polissorbatos 20 ou 80); poloxâmeros (por exemplo, Polo-xamer 80); sorbitan ésteres e derivados; lauril sulfato de sódio; octil glicosí-deo de sódio; lauril-, miristil-, linoleil- ou estearil-sulfobetaína; lauril-, miristil-,linoleil- ou estearil-sarcosina; linoleil-, miristil- ou cetil-betaína; lauramidopro-pil-, cocamidopropil-, linoleamidopropil-, miristamidopropil-, palmidopropil- ouisoestearamido propil-betaína (por exemplo, lauramidopropil); miristamido-propil-, palmidopropil- ou isoestearamido propil-dimetilamina; metil cocoil-taurato de sódio ou metil oleil-taurato dissódico; e a série MONAQUAT™(Mona Industries, Inc., Paterson, N.J.), polietileno glicol, polipropileno glicol ecopolímeros de etileno e propileno glicol (por exemplo, Pluronics, PF68 etc).

Uma "substância de fármaco" se refere ao material de partida utilizado na formulação do produto de fármaco final. A composição típica desubstância de fármaco de CTLA4lg compreende uma concentração de pro-teína de 20 mg/ml a 60 mg/ml, pH de 7 a 8 e % de espécies de HMW de < 5%.

Uma "solução em volume formulada" se refere à formulação finalantes de enchimento do recipiente, tal como a solução formulada antes deenchimento dos frascos para liofilização ou a solução formulada antes deenchimento da seringa para injeção SC.

Um "produto de fármaco" se refere à formulação final embaladaem um recipiente a qual pode ser reconstituída antes de uso, tal como comum produto de fármaco liofilizado; diluída antes de uso adicionalmente, talcomo com produto de fármaco líquido; ou utilizada como está, tal como comum produto de fármaco em solução SC.

Os termos "CTLA4lg" ou "molécula de CTLA4-lg" ou "moléculade CTLA4lg" são usados permutavelmente e se referem a uma molécula deproteína que compreende pelo menos um polipeptídeo tendo um domínioextracelular de CTLA4 ou porção do mesmo e uma região constante de imu-noglobulina ou porção da mesma. O domínio extracelular e a região constan-te de imunoglobulina podem ser do tipo silvestre ou mutantes ou modificadose de mamífero, incluindo de ser humano ou camundongo. O polipeptídeopode ainda compreender domínios de proteína adicionais. Uma molécula deCTLA4-lg também pode se referir à formas multiméricas do polipeptídeo, taiscomo dímeros, tetrâmeros e hexâmeros. Uma molécula de CTLA4-lg tam-bém é capaz de se ligar à CD80 e/ou CD86.

O termo "B7-1" se refere à CD80; o termo "B7-2" se refere àCD86; e o termo "B7" se refere à B7-1 e B7-2 (CD80 e CD86). O termo "B7-1-lg" ou "B7-1lg" se refere à CD80-lg; o termo "B7-2-lg"ou "B7-2lg" se refereà CD86-lg.

Em uma modalidade, "CTLA4lg" se refere a uma molécula deproteína tendo a seqüência de aminoácido com resíduos: (i) 26-383 de SEQID NO: 2, (ii) 26-382 de SEQ ID NO: 2; (iii) 27-383 de SEQ ID NO: 2 ou (iv)27-382 de SEQ ID NO: 2 ou opcionalmente (v) 25-382 de SEQ ID NO: 2 ou(vi) 25-383 de SEQ ID NO: 2. Na forma monomérica, essas proteínas podemser referidas aqui como "monômeros de SEQ ID NO: 2" ou monômeros "ten-do uma seqüência SEQ ID NO: 2". Esses monômeros de SEQ ID NO: 2 po-dem dimerizar, de modo que combinações de dímero podem incluir, por e-xemplo: (i) e (i); (i) e (ii); (i) e (iii); (i) e (iv); (i) e (v); (i) e (vi); (ii) e (ii); (ii) e (iii);(ii) e (iv); (ii) e (v); (ii) e (vi); (iii) e (iii); (iii) e (iv); (iii) e (v); (iii) e (vi); (iv) e (iv);(iv) e (v); (iv) e (vi); (v) e (v); (v) e (vi); e (vi) e (vi). Essas diferentes combina-ções de dímero podem também se associar umas com as outras para formarmoléculas de CTLA4lg tetraméricas. Esses monômeros, dímeros, tetrâmerose outros multímeros podem ser referidos aqui como "proteínas de SEQ IDNO: 2" ou proteínas "tendo uma seqüência SEQ ID NO: 2". (DNA que codifi-ca CTLA4lg, conforme mostrado em SEQ ID NO: 2, foi depositado em 31 deMaio de 1991 com o American Type Culture Collection (ATCC), 10801 Uni-versity Blvd., Manassas, VA 20110-2209 sob as condições do Tratado deBudapeste e receberam o número de acesso à ATCC ATCC 68629; umalinhagem de célula de Ovário de Hâmster Chinês (CHO) expressando C-TLA4lg, conforme mostrado em SEQ ID NO: 2, foi depositada em 31 deMaio de 1991 com o número de identificação na ATCC CRL-10762). Con-forme utilizado aqui, "Abatacept" se refere à proteínas com SEQ ID NO: 2.

Em uma modalidade, CTLA4-L104EA29Y-lg (algumas vezesconhecida como "LEA29Y" ou "L104EA29Y") é uma proteína de fusão gene-ticamente manipulada similar, em estrutura, à molécula de CTAL4-lg, con-forme mostrado em SEQ ID NO: 1. L104EA29Y-lg tem o domínio de ligaçãoextracelular funcional da CTLA4 humana modificada e o domínio Fc da imu-noglobulina humana da classe lgG1. Duas modificações de aminoácido, leu-cina para ácido glutâmico na posição 104 (L104E), a qual é a posição 130 deSEQ ID NO: 2 e alanina para tirosina na posição 29 (A29Y), a qual é a posi-ção 55 de SEQ ID NO: 2, foram feitas na região de ligação B7 do domínio deCTLA4 para gerar L104EA29Y. SEQ ID NOS: 3 e 4 representam uma se-qüência de nucleotídeo e aminoácido, respectivamente, de L104EA29Ylgcompreendendo um peptídeo sinalizador; um domínio extracelular com mu-tação de CTLA4 começando na metionina na posição +27 e terminando emácido aspártico na posição +150 ou começando em alanina na posição +26e terminando em ácido aspártico na posição +150; e uma região de Ig. DNAque codifica L104EA29Y-lg foi depositado em 20 de Junho de 200, com aAmerican Type Culture Collection (ATCC) sob as condições do Tratado deBudapeste. Ela recebeu o número de acesso à ATCC PTA-2104.L104EA29Y-lg é ainda descrita na Patente U.S. 7.094.874, emitida em 22 deAgosto de 2006 e no WO 01/923337 A2, os quais são incorporados por refe-rência em suas totalidades.

Expressão de L104EA29Ylg em células de mamífero pode resul-tar na produção de variantes N- e C-terminais, de modo que as proteínasproduzidas podem ter a seqüência de aminoácido com resíduos: (i) 26-383de SEQ ID NO: 4, (ii) 26-382 de SEQ ID NO: 4; (iii) 27-383 de SEQ ID NO: 4ou (iv) 27-382 de SEQ ID NO: 4 ou opcionalmente (v) 25-382 de SEQ ID NO:4 ou (vi) 25-383 de SEQ ID NO: 4. Na forma monomérica, essas proteínaspodem ser referidas aqui como "monômeros de SEQ ID NO: 4" ou monôme-ros "tendo a seqüência SEQ ID NO: 4". Essas proteínas podem dimerizar, demodo que combinações de dímero podem incluir, por exemplo: (i) e (i); (i) e(ii); (i) e (iii); (i) e (iv); (i) e (v); (i) e (vi); (ii) e (ii); (ii) e (iii); (ii) e (iv); (ii) e (v);(ii) e (vi); (iii) e (iii); (iii) e (iv); (iii) e (v); (iii) e (vi); (iv) e (iv); (iv) e (v); (iv) e(vi); (v) e (v); (v) e (vi); e (vi) e (vi). Essas diferentes combinações de dímeropodem também se associar umas com as outras para formar moléculas deL104EA29Ylg tetraméricas. Esses monômeros, dímeros, tetrâmeros e outrosmultímeros podem ser referidos aqui como "proteínas com SEQ ID NO: 4"ou proteínas "tendo uma seqüência SEQ ID NO: 4". Conforme utilizado aqui,"Belatacept" se refere à proteínas com SEQ ID NO: 4.Monômeros e multímeros de CTLA4-lg

Moléculas de CTLA4-lg podem compreender, por exemplo, pro-teínas de CTLA4-lg na forma de monômero, dímero, trímero, tetrâmero, pen-tâmero, hexâmero ou outras formas multiméricas. Moléculas de CTLA4-lgpodem compreender uma proteína de fusão com pelo menos um domínioextracelular de CTLA4 e uma região constante de imunoglobulina. Moléculasde CTLA4-lg podem ter seqüências do tipo silvestre ou mutantes, por exem-pio, com relação ao domínio extracelular de CTLA4 e seqüências de regiãoconstante de imunoglobulina. Monômeros de CTLA4-lg, sozinhos ou na for-ma de dímero, tetrâmero ou outro multímero, podem ser glicosilados.

Em algumas modalidades, a invenção proporciona populaçõesde moléculas de CTLA4-lg que têm pelo menos um determinado percentualde moléculas de dímero ou outro multímero. Por exemplo, a invenção prcnporciona populações de moléculas de CTLA4-lg que são maiores do que90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 99,5% de dímeros de CTLA4-lg. Emuma modalidade, a invenção proporciona uma população de moléculas deCTLA4-lg que compreende de cerca de 95% a cerca de 99,5% de dímerosde CTLA4-lg e de cerca de 0,5% a cerca de 5% de tetrâmeros de CTLA4-lg.Em outra modalidade, a população de moléculas de CTLA4-lg compreendecerca de 98 % de dímero de CTLA4-lg, cerca de 1,5% de tetrâmero de C-TLA4-lg e cerca de 0,5% de monômero de CTLA4-lg.

Em uma modalidade, a invenção proporciona uma população demoléculas de CTLA4lg em que a população é substancialmente isenta demoléculas de monômero de CTLA4lg. Substancialmente isenta de moléculasde monômero de CTLA4lg pode ser referir a uma população de moléculasde CTLA4lg que têm menos de 1%, 0,5% ou 0,1% de monômeros.

Em uma modalidade, a invenção proporciona uma população demoléculas de CTLA4lg em que a população é substancialmente isenta demultímeros de CTLA4lg que são maiores do que dímeros, tais como tetrâ-meros, hexâmeros, etc. Substancialmente isentas de moléculas de multíme-ros de CTLA4lg maiores do que dímeros pode se referir a uma população demoléculas de CTLA4lg que têm menos de 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0,5%ou 0,1% de multímeros de CTLA4-lg maiores do que a forma dimérica.

Em uma modalidade, uma molécula monomérica de CTLA4lgpode ter, por exemplo, a seqüência de aminoácido de: (i) 26-383 de SEQ IDNO: 2, (ii) 26-382 de SEQ ID NO: 2 (iii) 27-383 de SEQ ID NO: 2 ou (iv) 27-382 de SEQ ID NO: 2 ou opcionalmente (v) 25-382 de SEQ ID NO: 2 ou (vi)25-383 de SEQ ID NO: 2. Quando um cassete de expressão compreenden-do a seqüência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 1 é expressa em célulasCHO, a forma monomérica predominante expressa tem o resíduo de amino-ácido no N-término de metionina (resíduo 27 de SEQ ID NO: 2), o qual cor-responde ao resíduo de aminoácido no N-término das amino da CTLA4 hu-mana do tipo silvestre. Contudo, em virtude do fato de SEQ ID NO: 1 tam-bém incluir a seqüência de codificação para a seqüência sinalizadora de On-costatina M (nucleotídeos 11-88 de SEQ ID NO: 1), a proteína expressa apartir de SEQ ID NO: 1 contém uma seqüência sinalizadora de OncostatinaM. A seqüência sinalizadora é clivada da proteína expressa durante o pro-cesso de exportação de proteína do citoplasma ou secreção da célula. Masclivagem pode resultar em variantes N-terminais, tal como clivagem entre osresíduos de aminoácido 25 e 26 (resultando em um N-término de resíduo 26,isto é, a "variante Ala") ou entre os resíduos de aminoácido 24 e 25 (resul-tando em um N-término de resíduo 2, isto é, a "variante Met-Ala"), em oposi-ção à clivagem entre resíduos de aminoácido 26 e 27 (resultando em um N-término de resíduo 27). Por exemplo, a variante Met-Ala pode estar presenteem uma mistura de moléculas de CTLA4lg em cerca de 1% e a variante Alapode estar presente em uma mistura de moléculas de CTLA4lg em cerca de8-10%. Além disso, a proteína expressa a partir de SEQ ID NO: 1 pode tervariantes C-terminais em virtude de processamento incompleto. O C-términopredominante é a glicina no resíduo 382 de SEQ ID NO: 2. Em uma misturade moléculas de CTLA4!g, monômeros tendo lisina no C-término (resíduo383 de SEQ ID NO: 2) podem estar presentes, por exemplo, em cerca de 4-5%.Uma molécula monomérica de CTLA4lg pode compreender umdomínio extracelular de CTLA4 humana. Em uma modalidade, o domínioextracelular pode compreender a seqüência de nucleotídeo dos nucleotídeos89-463 de SEQ ID NO: 1 que codifica os aminoácidos 27-151 de SEQ IDNO: 2. Em outra modalidade, o domínio extracelular pode compreender se-qüências mutantes da CTLA4 humana. Em outra modalidade, o domínio ex-tracelular pode compreender alterações de nucleotídeo nos nucleotídeos 89-463 de SEQ ID NO: 1, de modo que alterações conservativas de aminoácidosão feitas. Em outra modalidade, o domínio extracelular pode compreenderuma seqüência de nucleotídeo que é pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%,95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica aos nucleotídeos 89-463 de SEQ IDNO:1.

Uma molécula monomérica de CTLA4lg pode compreender umaregião constante de uma imunoglobulina humana. Essa região constantepode ser uma porção de uma região constante; essa região constante podeter uma seqüência do tipo silvestre ou mutante. A região constante pode serde lgG1, lgG2, lgG3, lgG4, IgM, lgA1, lgA2, IgD ou IgE humana. A regiãoconstante pode ser de uma cadeia leve ou uma cadeia pesada de uma imu-noglobulina. Onde a região constante é de uma molécula de IgG, IgD ou IgA,a região constante pode compreender um ou mais dos seguintes domíniosde região constante: CL, CH1, dobradiça, CH2 ou CH3. Onde a região cons-tante é de IgM ou IgE, a região constante pode compreender um ou maisdos seguintes domínios de região constante: CL, CH1, CH2, CH3 ou Ca4.

Em uma modalidade, a região constante pode compreender um ou maisdomínios de região constante de IgG, IgD, IgA, IgM ou IgE.

Em uma modalidade, uma molécula monomérica de CTLA4lgcompreende uma região de dobradiça de lgG1 humana modificada (nucleo-tídeos 464-508 de SEQ ID NO: 1; aminoácidos 152-166 de SEQ ID NO: 2),em que as serinas nos resíduos de aminoácido 156, 162 e 165 de SEQ IDNO: 2 foram manipuladas para cisternas presentes na seqüência do tipo sil-vestre.

Em uma modalidade, uma molécula monomérica de CTLA4lgcompreende uma região CH2 de lgG1 humana modificada e uma regiãoCH3 do tipo silvestre (o domínio CH2 de lgG1 humana modificada tendo nu-cleotídeos 509-838 de SEQ ID NO: 1 e aminoácidos 167-276 de SEQ ID NO:2; o domínio CH3 de lgG1 humana tendo nucleotídeos 839-1159 de SEQ IDNO: 1 e aminoácidos 277-383 de SEQ ID NO: 2).

Em uma modalidade, uma população de moléculas de CTLA4lgcompreende monômeros tendo uma seqüência mostrada em qualquer umaou mais das Figuras 7, 8 ou 9 da patente U.S. No. 7.094.874, emitida em 22de Agosto de 2006 e pedidos de patente U.S. publicados como PublicaçõesNos.US20030083246 e US20040022787, as quais são aqui incorporadaspor referência em sua totalidade.

Em uma modalidade, uma molécula tetrâmera de CTLA4lg com-preende dois pares ou dois dímeros de polipeptídeos de CTLA4lg, em quecada polipeptídeo tem uma das seguintes seqüências de aminoácido: (i) 26-383 de SEQ ID NO: 2, (ii) 26-382 de SEQ ID NO: 2, (iii) 27-383 de SEQ IDNO: 2 ou (iv) 27-382 de SEQ ID NO: 2 ou opcionalmente (v) 25-382 de SEQID NO: 2 ou (vi) 25-383 de SEQ ID NO: 2. Cada membro do par de polipep-tídeos ou dímero é covalentemente ligado ao outro membro e os dois paresde polipeptídeos são não-covalentemente associados um ao outro, dessemodo, formando um tetrâmero. Tais moléculas de tetrâmero são capazes deligação à CD80 ou CD86.

Em outra modalidade, tais moléculas de tetrâmero podem seligar à CD80 ou CD86 com uma avidez que é pelo menos 2 vezes maior doque a avidez de ligação de um dímero de CTLA4lg (cujos monômeros têmuma das seqüências de aminoácido acima) à CD80 ou CD86. Em outra mo-dalidade, tais moléculas de tetrâmero podem se ligar à CD80 ou CD86 comuma avidez que é pelo menos 2 vezes maior do que a afinidade ou avidezde ligação da CTLA4 do tipo silvestre à CD80 ou CD86. Essa maior avidezpode contribuir para maior eficácia no tratamento de distúrbios imunes e ou-tras doenças, conforme descrito abaixo. Além disso, avidez maior ou aper-feiçoada pode produzir o resultado de maior potência de um fármaco. Porexemplo, uma composição terapêutica compreendendo tetrâmero de C-TLA4lg teria uma maior avidez e, portanto maior potência do que a mesmaquantidade de uma composição terapêutica tendo um monômero de C-TLA4lg. Em outra modalidade, tais moléculas de tetrâmero podem ter pelomenos uma inibição 2 vezes maior sobre a proliferação de células T compa-rado com um dímero de CTLA4lg (cujos monômeros têm uma das seqüên-cias de aminoácido acima). Em outra modalidade, tais moléculas de tetrâme-ro podem ter pelo menos uma inibição 2 vezes maior sobre a proliferação decélulas T quando comparado com uma molécula de CTLA4 do tipo silvestre.

A proliferação de células T pode ser medida usando ensaios pa-drão conhecidos na técnica. Por exemplo, uma das formas mais comunspara avaliar a proliferação de células T é estimular células T via antígeno ouanticorpos agonísticos ao TCR e medir, por exemplo, a incorporação de ti-midina titulada (3H-TdR) em células T em proliferação ou a quantidade decitocinas liberadas por células T em proliferação em cultura. O efeito inibitó-rio de moléculas de CTLA4lg sobre a ativação ou proliferação de células Tpode, desse modo, ser medido.

A afinidade de uma molécula de CTLA4lg é a resistência de li-gação da molécula a um único ligante, incluindo CD80, CD86 ou proteínasde fusão CD80lg ou CD86lg. A afinidade da CTLA4lg por ligantes pode sermedida usando, por exemplo, análise de interação de ligação (BIA) baseadana técnica de plasmônio de superfície. Além de medir a resistência de liga-ção, ela permite determinação em tempo real da cinética de ligação, tal co-mo as constantes de taxa de associação e dissociação. Uma peça sensora,consistindo em uma lâmina de vidro revestida com um filme fino de metal, àqual uma matriz na superfície é covalentemente presa, é revestida com umdos agentes de interação, isto é, CTLA4lg ou um dos ligantes. Uma soluçãocontendo o outro agente de interação é deixada fluir sobre sua superfície.Um feixe de luz contínuo é dirigido contra o outro lado da superfície e seuângulo de reflexão é medido. Sobre a ligação de CTLA4lg ao ligante, o ân-guio de ressonância do feixe de luz altera (uma vez que ele depende do ín-dice refrativo do meio próxima o lado reativo do sensor o qual, por sua vez,está diretamente correlacionado à concentração de material dissolvido nomeio). Ele é subseqüentemente analisado com o auxílio de um computador.

Em uma modalidade, experimentos de ligação à CTLA4lg po-dem ser realizados através de ressonância de plasmônio em superfície (S-PR) sobre um instrumento BlAcore (BlAcore AG, Uppsala, Suécia). CTLA4lgpode ser covalentemente acoplada, através de grupos amina primária, auma matriz de dextrana carbóxi-metilada sobre uma peça sensora BlAcore,desse modo, imobilizando a CTLA4lg à peça sensora. Alternativamente, umanticorpo antirregião constante pode ser usado para imobilizar CTLA4lg indi-retamente à superfície sensora via o fragmento de Ig. Após o que, ligantessão adicionados à peça para medir a ligação de CTLA4lg aos ligantes. Me-dições de afinidade podem ser realizadas, por exemplo, conforme descritoem van der Merwe, P. e outros, J. Exp. Med. (1997) 185 (3): 393-404.

A avidez de moléculas de CTLA4lg também pode ser medida. Aavidez pode ser definida como a soma total da resistência de ligação de du-as moléculas ou células uma à outra em múltiplos sítios. A avidez é distintada afinidade, a qual é a resistência de ligação a um sítio sobre uma moléculaa seu ligante. Sem estar preso à teoria, maior avidez de moléculas de C-TLA4lg pode levar a uma potência aumentada de inibição pelas moléculasde CTLA4lg sobre a proliferação e ativação de células T. A avidez pode sermedida, por exemplo, através de duas categorias de ensaios em fase sólida:a) ensaios de inibição competitiva e b) ensaios de eluição. Em ambos, o li-gante é preso a um suporte sólido. No ensaio de inibição competitiva, molé-culas de CTLA4lg são, então, adicionadas em solução em uma concentra-ção fixa, junto com ligante livre em diferentes concentrações e a quantidadede ligante a qual inibe a ligação à fase sólida em 50% é determinada. Quan-to menos ligante necessário, mais forte a avidez. Em ensaios de eluição, oligante é adicionado em solução. Após obtenção de um estado de equilíbrio,um agente caotrópico ou agente de desnaturação (por exemplo, isotiociana-to, uréia ou dietilamina) é adicionado em diferentes concentrações pararomper as interações CTLA4lg/ligante. A quantidade de CTLA4-lg que resis-te à eluição é determinada depois com um ELISA. Quanto maior a avidez,mais agente caotrópico é necessário para eluir uma determinada quantidadede CTLA4lg. A avidez relativa de uma mistura heterogênea de moléculas deCTLA4lg pode ser expressa como o índice de avidez (Al), igual à concentra-ção de agente de eluição necessária para eluir 50% das moléculas de C-TLA4lg ligadas. Análise refinada de dados pode ser realizada determinandoos percentuais de CTLA4lg eluída em diferentes concentrações do agentede eluição.

Métodos para Produção das Moléculas de CTLA4lg da Invenção

Expressão de moléculas de CTLA4lg pode ser em células proca-riotas. Procariotas são, mais freqüentemente, representadas por várias ce-pas de bactérias. As bactérias podem ser gram positivas ou gram negativas.Tipicamente, bactérias gram-negativas, tal como E. coli, são preferidas. Ou-tras cepas microbianas podem também ser usadas.

Seqüências, conforme descrito acima, que codificam moléculasde CTLA4lg, podem ser inseridas em um vetor projetado para expressão deseqüências estranhas em células procariotas, tal como E. coli. Esses vetorespodem incluir seqüências de controle procariotas comumente usadas asquais são definidas aqui para incluir promotores para início de transcrição,opcionalmente com um operador, junto com seqüências de sítio de ligaçãoribossômica, incluem promotores comumente usados, tais como os sistemasde promotor de beta-lactamase (penicilinase) e lactose (lac) (Chang e ou-tros, (1977) Nature 198: 1056), o sistema de promotor de triptofano (trp)(Goeddel e outros, (1980) Nucleic Acids Res. 8: 4057) e o promotor PLlambda-derivado e sítio de ligação ribossômica do N-gene (Shimatake eoutros, (1981) Nature 292: 128).

Tais vetores de expressão também incluirão origens de replica-ção e marcadores selecionáveis, tal como um gene de beta-lactamase oufosfotransferase de neocimina que confere resistência a antibióticos, de mo-do que os vetores possam se replicar em bactérias e células trazendo osplasmídeos podem ser selecionadas para crescimento na presença de anti-bióticos, tais como ampicilina ou canamicina.

O plasmídeo de expressão pode ser introduzido em células pro-cariotas via uma variedade de métodos padrões incluindo, mas não limitadoa, CaCI2-choque (Cohen, (1972) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 69: 2110 e Sam-brook e outros (eds.), "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 2a Edição,Cold Spring Harbor Press, (1989)) e eletroporação.

De acordo com a prática da invenção, células eucariotas sãotambém células hospedeiras adequadas. Exemplos de células eucariotasincluem qualquer célula animal, quer primária ou imortalizada, levedo (porexemplo, Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe e Pichiapastoris) e células de planta. Células de mieloma, COS e CHO são exem-plos de células animais que podem ser usadas como hospedeiros. CélulasCHO particulares incluem, mas não estão limitadas a, DG44 (Chasin e ou-tros, 1986 Som. Cell. Molec. Genet. 12: 555-556; Kolkekar 1997 Biochemis-try 36: 10901-10909), CHO-K1 (ATCC No. CCL-61), a linhagem de célulaCHO-K1 Tet-On (Clontech), CHO designada ECACC 85050302 (CAMR, Sa-lisbury, Wiltshire, Reino Unido), o clone 13 de CHO (GEIMG, Gênova, IT),clone B de CHO (GEIMG, Gênova, IT), CHO-K1/SF designada ECACC93061607 (CAMR, Salisbury, Wiltshire, Reino Unido) e RR-CHOK1 designa-da ECACC 92052129 (CAMR, Salisbury, Wiltshire, Reino Unido). Células deplanta ilustrativas incluem células de tabaco (plantas inteiras, cultura de célu-las ou caule), milho, soja e arroz. Sementes de milho, soja e arroz tambémsão aceitáveis.

Seqüências de ácido nucleico que codificam moléculas de C-TLA4lg descritas acima também podem ser inseridas em um vetor projetadopara expressão de seqüências estranhas em um hospedeiro eucariota. Oselementos regulatórios do vetor podem variar de acordo com o hospedeiroeucariota em particular.

Seqüências de controle eucarióticas comumente usadas em ve-tores de expressão incluem seqüências promotoras e de controle compatí-veis com células de mamífero tais como, por exemplo, promotor de CMV(vetor CDM8) e vírus sarcoma de aves (ASV) (vetor ttLN). Outros promoto-res comumente usados incluem os promotores precoce e tardio de SimianVirus 40 (SV40) (Fiers e outros, (1973) Nature 273: 113) ou outros promoto-res virais, tais como aqueles derivados de polioma, Adenovírus 2 e papilomavírus bovino. Um promotor induzível, tal como hMTII (Karin e outros, (1982)Nature 299: 797-802) também pode ser usado.

Vetores para expressão de moléculas de CTLA4lg em eucario-tas também podem trazer seqüências denominadas regiões intensificadoras.Essas são importantes em otimização de expressão de gene e são encon-tradas a montante ou a jusante da região promotora.

Exemplos de vetores de expressão para células hospedeiraseucariotas incluem, mas não estão limitados a, vetores para células hospe-deiras de mamífero (por exemplo, BPV-1, pHyg, pRSV, pSV2, pTK2 (Mania-tis); pIRES (Clontech); pRc/CMV2, pRc/RSV, pSFV1 (Life Technologies);Vetores pVPakc, vetores pCMV, vetores pSG5 (Stratagene)), vetores retrovi-rais (por exemplo, vetores pFB (Stratagene)), pCDNA-3 (Invitrogen) ou for-mas modificadas dos mesmos, vetores adenovirais; vetores Adenovírus-associados, vetores de baculovírus, vetores de levedo (por exemplo, vetorespESC (Stratagene)).

Seqüências de ácido nucleico que codificam moléculas de C-TLA4lg podem se integrar no genoma da célula hospedeira eucariota e repli-car à medida que o genoma do hospedeiro se reproduz. Alternativamente, ovetor trazendo moléculas de CTLA4lg podem conter origens de replicaçãoque permitem replicação extracromossômica.

Para expressão das seqüências de ácido nucleico em Saccha-romyces cerevisiae, a origem de replicação do plasmídeo de levedo endó-gena, o círculo 2 ^, pode ser usada. (Broach, (1983) Meth. Enz. 101: 307).Alternativamente, seqüências do genoma de levedo capazes de promoverreplicação autônoma podem ser usadas (veja, por exemplo, Stinchcomb eoutros, (1979) Nature 282: 39); Tschemper e outros, (1980) Gene 10: 157; eClarke e outros, (1983) Meth. Enz. 101: 300).

Seqüências de controle transcricional para vetores de levedoincluem promotores para a síntese de enzimas glicolíticas (Hess e outros,(1968) J. Adv. Enzyme Règ. 7: 149; Holland e outros, (1978) Biochemistry17: 4900). Promotores adicionais conhecidos na técnica incluem o promotorde CMV fornecido no vetor CDM8 (Toyama e Okayama, (1990) FEBS 268:217-221); o promotor para quínase de 3-fosfoglicerato (Hitzeman e outros,(1980) J. Biol. Chem. 255: 2073) e aqueles para outras enzimas glicolíticas.

Outros promotores são induzíveis porque eles podem ser regu-lados por estímulos ambientais ou o meio de crescimento das células. Essespromotores induzíveis incluem aqueles dos genes para proteínas de choquetérmico, dehidrogenase 2 de álcool, isocitocroma C, fosfatase ácida, enzi-mas associadas ao catabolismo de nitrogênio e enzimas responsáveis pelautilização de maltose e galactose.

Seqüências regulatórias também podem ser colocadas na ex-tremidade 3' das seqüências de codificação. Essas seqüências podem atuarpara estabilizar o RNA mensageiro. Tais terminadores são encontrados naregião não traduzida 3' após as seqüências de codificação em vários genesderivados de levedo e mamífero.

Vetores ilustrativos para plantas e células de planta incluem,mas não estão limitados a, plasmídeos Ti de Agrobacterium , vírus mosaicoda couve-flor (CaMV) e vírus mosaico dourado de tomate (TGMV).

Células de mamífero podem ser transformadas através de méto-dos incluindo, mas não limitado a, transfecção na presença de fosfato decálcio, microinjeção, eletroporação ou via transdução com vetores virais.

Métodos para introdução de seqüências de DNA estranhas emgenomas de planta e levedo incluem (1) métodos mecânicos, tal como mi-croinjeção de DNA em células simples ou protoplastas, turbilhonamento decélulas com glóbulos de vidro na presença de DNA ou disparo de esferas detungstênio ou ouro revestidas com DNA em células ou protoplastas; (2) in-tradução de DNA tornando as membranas celulares permeáveis à macromo-léculas através de tratamento com polietileno glicol ou sujeição a pulsos elé-tricos de alta voltagem (eletroporação); ou (3) o uso de lipossomas (conten-do cDNA), os quais se fundem às membranas celulares.

A publicação de pedido de Patente US Número 20050019859 ePublicação dê pedido dê patente US número 20050084933 ensinam proces-sos para a produção de proteínas da invenção, especificamente produtos deglicoproteína recombinante, através de culturas de células de animal oumamífero e são aqui incorporadas por referência.

Após a fase de produção de proteína do processo de cultura decélulas, moléculas de CTLA4lg são recuperadas do meio de cultura de célu-la usando métodos compreendidos por aqueles versados na técnica. Emparticular, a molécula de CTLA4lg é recuperada do meio de cultura como umpolipeptídeo secretado.

O meio de cultura é inicialmente centrifugado para remover res-tos celulares e partículas. A proteína desejada é subseqüentemente purifica-da do DNA contaminante, proteínas solúveis e polipeptídeos, com os seguin-tes procedimentos de purificação não limitativos bem estabelecidos na técni-ca: SDS-PAGE; precipitação com sulfato de amônio; precipitação com eta-nol; fracionamento sobre colunas de imunoafinidade ou troca de íons; HPLCde fase reversa; cromatografia sobre sílica ou sobre uma resina de troca deânions, tal como QAE ou DEAE; cromatofocalização; filtração em gel usan-do, por exemplo, uma coluna Sephadex G-75® : e colunas de proteína A se-pharose® para remover contaminante, tal como IgG. A adição de um inibidorde protease, tal como fluoreto de fenil metil sulfonila (PMSF) ou uma misturade coquetel de inibidor de protease, também pode ser útil para inibir degra-dação proteolítica durante purificação. Aqueles versados na técnica reco-nhecerão que métodos de purificação adequados para uma proteína de inte-resse, por exemplo, uma glicoproteína, podem requerer alterações que le-vem em conta mudanças no caráter da proteína quando de expressão emcultura de células recombinantes.

Técnicas e métodos de purificação que selecionam os gruposcarboidrato da glicoproteína também são de utilidade dentro do contexto dapresente invenção. Por exemplo, tais técnicas incluem HPLC ou cromatogra-fia de troca de íons usando resinas de troca de cátions ou ânions, em que afração mais básica ou mais ácida é coletada, dependendo de qual carboidra-to está sendo selecionado. O uso de tais técnicas também pode resultar naconcomitante remoção de contaminantes.

O método de purificação pode ainda compreender etapas adi-cionais que inativam e/ou removem vírus e/ou retrovírus que poderiam estarpotencialmente presentes no meio de cultura de células de linhagens de cé-lulas de mamífero. Um número significativo de etapas de eliminação viralestá disponível incluindo, mas não limitado a, tratamento com agentes cao-trópicos, tais como uréia ou guanidina, detergentes, etapas adicionais deultrafiltração/diafiltração, separação convencional, tal como cromatografia detroca de íons ou por exclusão de tamanho, extremos de pH, calor, proteases,solventes orgânicos ou qualquer combinação dos mesmos.

A molécula de CTLA4lg purificada requer concentração e umatroca de tampão antes de armazenamento ou processamento adicional. Umsistema Pall Filtron TFF pode ser usado para concentrar e trocar o tampãode eluição da coluna de purificação anterior pelo tampão final desejado paraa substância de fármaco.

Em um aspecto, moléculas de CTLA4lg purificadas as quais te-nham sido concentradas e submetidas a uma etapa de diafiltração podemser enchidas em garrafas Biotainer® de 2 L, saco Bioprocess de 50 L ouqualquer outro vaso adequado. As moléculas de CTLA4lg em tais vasos po-dem ser armazenadas durante cerca de 60 dias a 2 a 8°C antes de conge-lamento. Armazenamento prolongado de moléculas de CTLA4lg purificadasa 2 a 8°C pode levar a um aumento da proporção de espécies de HMW. Por-tanto, para armazenamento a longo prazo, as moléculas de CTLA4lg podemser congeladas em torno de -70°C antes de armazenamento e armazenadasem uma temperatura de cerca de -40°C. A temperatura de congelamentopode variar de cerca de -50°C a cerca de -90°C. O tempo de congelamentopode variar e depende grandemente do volume do vaso que contém as mo-léculas de CTLA4lg e do número de vasos que são carregados ao congela-dor. Por exemplo, em uma modalidade, moléculas de CTLA4lg estão emgarrafas Biotainer® de 2L. Carregamento de menos de quatro garrafas Bio-tainer® de 2L no congelador pode requerer um tempo de congelamento decerca de 114 a pelo menos cerca de 18 horas. Carregamento de pelo menosquatro garrafas pode requerer um tempo de congelamento de cerca de 18 apelo menos 24 horas.Vasos com moléculas de CTLA4lg congeladas sãoarmazenados em uma temperatura de cerca de -35°C a cerca de -55°C. Otempo de armazenamento em uma temperatura de cerca de -35°C a cercade -55°C pode variar e pode ser tão curto quanto 18 horas. A substância defármaco congelada pode ser descongelada de uma maneira controlada paraformulação do produto de fármaco.

Os pedidos de patente US co-pendentes No. de Série60/752.267, depositado em 20 de Dezembro de 2005 e 06/849.543, deposi-tado em 5 de Outubro de 2006 e pedido de patente PCT, No. de Documentodo Procurador No. 10734 PCT, intitulado " Cell Lines, Compositions and Me-thods for Producing a Composition" pelo inventor Kirk Leister, depositado em19 de Dezembro de 2006, ensinam processos para a produção de proteínasda invenção, especificamente produtos de glicoproteína recombinantes, a-través de culturas de células de animal ou mamífero, e são aqui incorpora-dos por referência.

Formulação Liofilizada da Invenção

A formulação liofilizada da invenção compreende a molécula deCTLA4lg em uma proporção em peso de proteína para lioprotetor de pelomenos 1:2. O lioprotetor é, de preferência, açúcar, mais preferível mente dis-sacarídeos, ainda mais preferivelmente sacarose ou maltose. A formulaçãoliofilizada pode também compreender um ou mais dos componentes selecio-nados da lista consistindo em agentes de tamponamento, tensoativos, agen-tes de composição de volume e conservantes.

Durante estudos de desenvolvimento de formulação, os efeitosde vários excipientes sobre a estabilidade em estado sólido liofilizada e emsolução da molécula de CTLA4lg, foram avaliados.

A instabilidade da molécula de CTLA4lg liofilizada na ausência deum estabilizante realçou claramente a necessidade de inclusão de um liopro-tetor na formulação. Estudos iniciais de triagem mostraram que o produto defármaco era estável na presença de açúcares, tais como maltose e sacarose,e aminoácidos, tais como arginina e lisina. Polióis, tal como manitol e polissa-carídeos, tal como dextrana 40, foram prejudiciais para sua estabilidade. Oslioprotetores preferidos são os dissacarídeos maltose e sacarose.

O Exemplo VI descreve estudos de estabilidade do produto defármaco liofilizado abatacept na presença de maltose armazenado a 50°C.Um aumento nas espécies de elevado peso molecular (HMW) foi monitoradousando um ensaio de cromatografia por exclusão de tamanho indicando es-tabilidade (SE-HPLC). Os resultados demonstram que a estabilidade da mo-lécula de CTLA4lg em uma forma em estado sólido liofilizada é intensificadana presença de maltose.

A quantidade de sacarose ou maltose útil para estabilização doproduto de fármaco liofilizado está em uma proporção em peso de proteínapara sacarose ou maltose de pelo menos 1:2, de preferência em uma pro-porção de em peso de proteína para sacarose ou maltose de 1:2 a 1:5, maispreferivelmente em uma proporção em peso de proteína para maltose ousacarose de 1:2.

Se necessário, o pH da formulação, antes de liofilização, é ajus-tado através da adição de um ácido e/ou base farmaceuticamente aceitável.

O ácido farmaceuticamente aceitável preferido é ácido clorídrico. A base pre-ferida é hidróxido de sódio.

Durante desenvolvimento de formulação, a estabilidade do pro-duto de fármaco liofilizado foi estudada como uma função do pH. O pH dasolução foi ajustado para entre 6 a 8 antes de liofilização. As amostras foramcolocadas sob estabilidade e os frascos com produto constituído foram moni-torados com relação a um aumento nas espécies de elevado peso molecularem vários pontos de tempo usando um ensaio de cromatografia por exclusãode tamanho indicando estabilidade (SE-HPLC). Sob a condição de uso re-comendada de 2-8°C, nenhuma alteração significativa na taxa de formaçãode espécies de HMW foi observada. Adicionalmente, os dados de estabilida-de em estado de solução gerados durante um desenvolvimento anteriormostraram que o pH para estabilidade máxima deve estar entre 7 e 8. A fai-xa de pH aceitável para o produto de fármaco liofilizado é de 7 a 8, com umpH alvo preferido de 7,5.

Em outro aspecto, os sais ou componentes do tampão podem seradicionados em uma quantidade de pelo menos cerca de 10 mM, de prefe-rência 10-200 mM. Os sais e/ou tampões são farmaceuticamente aceitáveis esão derivados de vários ácidos conhecidos (inorgânicos e orgânicos), commetais ou aminas de "formação de base". Além de tampões de fosfato, podemser usados tampões de glicinato, carbonato, citrato e semelhantes, caso noqual íons de sódio, potássio ou amônio podem servir como um contra-íon.

Um "agente de composição de volume" é um composto o qualadiciona massa a uma mistura liofilizada e contribui para a estrutura física dobolo liofilizado (por exemplo, facilita a produção de um bolo liofilizado essen-cialmente uniforme o qual mantém uma estrutura de poro aberta). Agentesde composição de volume ilustrativos incluem manitol, glicina, polietilenoglicol e sorbitol. As formulações liofilizadas da presente invenção podemconter tais agentes de composição de volume.

Um conservante pode ser opcionalmente adicionado às formula-ções aqui para reduzir a ação bacteriana. A adição de um conservante pode,por exemplo, facilitar a produção de uma formulação para uso múltiplo (múl-tiplas doses).

Aqueles versados na técnica selecionarão a quantidade de pro-duto de fármaco a ser enchido em um frasco dependendo das dosagens eesquema de administração requerido para um tratamento específico. Porexemplo, a concentração de CTLA4lg por frasco pode oscilar de 50 a 300mg/frasco, de preferência 100 a 250 mg/frasco.

Uma composição típica do produto de fármaco abatacept liofili-zado é listada na Tabela 1 abaixo.

Tabela 1

Composição de produto de fármaco abatacept liofilizado (250 mg/frasco)

<table>table see original document page 30</column></row><table>a Inclui um excesso de 5% para perdas no frasco, agulha, seringa

b Esses componentes estão presentes na solução de substância de fármacoabatacept

Uma composição típica do produto de fármaco belatacept liofili-zado é listada na Tabela 2 abaixo.

Tabela 2

Composição de produto de fármaco belatacept liofilizado, 100 mg/frasco

<table>table see original document page 31</column></row><table>

a Cada frasco contém um excesso de 10% para perdas no frasco, agulha eseringa da solução reconstituída.

O produto de fármaco liofilizado é constituído com um veículoaquoso. O veículo aquoso de interesse aqui é um o qual é farmaceuticamen-te aceitável (seguro e não-tóxico para administração a um ser humano) e éútil para o preparo da formulação líquida, após liofilização. Diluentes ilustrati-vos incluem água estéril para injeção (SWFI), água bacteriostática para inje-ção (BWFI), uma solução com pH tamponado (por exemplo, solução salinatamponada com fosfato), solução salina estéril, solução de Ringer ou solu-ção de dextrose.

De preferência, o produto de fármaco liofilizado da presente in-venção é constituído com água estéril para injeção, USP (SWFI) ou cloretode sódio a 0,9% para injeção, USP. Durante constituição, o pó liofilizado dis-solve rapidamente, proporcionando uma solução transparente, incolor.

Tipicamente, o produto de fármaco liofilizado da presente inven-ção é constituído para cerca de 25 mg/ml com 10 ml de água estéril parainjeção, USP (SWFI) ou cloreto de sódio a 0,9% para injeção, USP. A solu-ção constituída é ainda diluída para concentrações de produto de fármacoentre 1 e 10 mg/ml com cloreto de sódio a 0,9% para injeção, USP. O produ-to de fármaco diluído para injeção é isotônico e adequado para administra-ção através de infusão intravenosa.

Durante desenvolvimento clínico anterior, descobriu-se que assoluções constituídas de produto de fármaco liofilizado eram incompatíveiscom seringas siliconizadas descartáveis, as quais são comumente usadaspara o preparo e administração dos produtos parenterais. Especificamente, asolução de produto de fármaco constituída desenvolvia partículas gelatino-sas semelhantes a filamentos quando armazenadas nessas seringas duran-te mais de 10-15 minutos. Outros estudos demonstraram que essa incompa-tibilidade era em virtude da interação do produto de fármaco com óleo desilicone (dimetil-siloxano), o qual é usado como um lubrificante nessas serin-gas. A formação dessas partículas não afeta a potência da solução de pro-duto de fármaco durante seu tempo de uso. Seringas sem silicone são, depreferência, utilizadas para constituição do produto de fármaco e transferên-cia das soluções constituídas do frasco para o saco intravenoso.

Alternativamente, um tensoativo pode ser adicionado à formula-ção para reduzir ou prevenir a interação do produto de fármaco constituídocom a seringa siliconizada, por exemplo, em uma quantidade suficiente domesmo.

A condição de armazenamento recomendada para uma formula-ção liofilizada é de 2-8°C com uma vida útil recomendada de pelo menos 12meses.

Preparação da Formulação Liofilizada

O processo de fabricação do produto de fármaco liofilizado en-volve formação de batelada da solução formulada bruta para liofilização, fil-tração asséptica, enchimento em frascos, congelamento dos frascos emuma câmara de congelamento-secagem, seguido por liofilização, colocaçãode tampas e vedação.

Os Exemplos III e IV descrevem a fabricação dos produtos defármaco abatacept e CTLA4lg liofilizados, respectivamente.A solução em volume formulada é, tipicamente, ajustada emuma concentração fixa de proteína, de modo que o volume desejado de en-chimento do frasco seja mantido constante. Durante a adição de lioprotetor,a velocidade do misturador é controlada a 250 + 50 rpm, de modo a minimi-zar a espumação na solução de formação de batelada e assegurar dissolu-ção completa do lioprotetor dentro de 10 a 20 minutos. A solução em volumeformulada pode ser armazenada sob 2-8°C ou temperatura ambiente e luzambiente durante pelo menos 32 horas antes de liofilização.

A solução em volume formulada não é terminalmente esteriliza-da em virtude da sensibilidade ao calor da molécula de CTLA4lg. A soluçãoem volume formulada pode ser esterilizada usando dois filtros com grau deesterilização Millipore Millipak® de 0,22 (am em série antes de enchimentoem frascos para liofilização.

O ciclo de congelamento-secagem selecionado para esse produ-to é otimizado de forma a ter sublimação e evaporação suficientes duranteas fases primária e secundária de secagem, respectivamente, sem compro-meter a qualidade do produto.

Para auxiliar na dissolução rápida do pó liofilizado e impedir aformação de espuma excessiva durante constituição do produto de fármaco,os frascos liofilizados são tampados sob uma pressão de câmara de 500 ±100 mícrons ao final do ciclo de congelamento-secagem.

Aqueles versados na técnica estarão cientes da necessidade deencher o recipiente em excesso de modo a compensar perdas no frasco,agulha, seringa durante preparo e injeção. Por exemplo, cada frasco de pro-duto de fármaco abatacept, 250 mg/ml, contém um excesso de 5% do produ-to de fármaco para levar em conta perdas quando de reconstituição e extração.

Formulação Subcutânea Líquida

Aqueles versados na técnica reconhecerão a inconveniência deuma formulação IV para o paciente que precisa de terapia crônica freqüente.O paciente tem de fazer visitas freqüentes ao hospital para receber seu fár-maco via uma infusão IV que pode durar tanto quanto uma hora. Conse-quentemente, uma formulação SC que pudesse ser auto-administrada emcasa seria muito benéfica para tal paciente.

Para administração subcutânea, uma forma de dosagem comaltas concentrações de proteína é desejada. Tratamentos com altas dosesde mais de 1 mg/kg (>100 mg por dose) requerem desenvolvimento de for-mulações em concentrações excedendo a 100 mg/ml em virtude do pequenovolume (< 1,5 ml) que pode ser fornecido através de vias SC. De forma aotimizar a estabilidade a longo prazo em alta concentração contra a forma-ção de espécies de elevado peso molecular, estudos de desenvolvimento deformulação foram conduzidos para avaliar o efeito de vários excipientes so-bre a estabilidade em estado de solução das formulações SC líquidas dainvenção.

A formulação SC da invenção compreende a molécula de C-TLA4lg em uma concentração de proteína de pelo menos 100 mg/ml emcombinação com um açúcar em níveis de estabilização, de preferência emuma concentração de proteína de pelo menos 125 mg/ml em combinaçãocom um açúcar em níveis de estabilização, em um veículo aquoso. O açúcarestá, de preferência, em uma proporção em peso de proteína para açúcar depelo menos 1:1,1. O estabilizante é, de preferência, empregado em umaquantidade não maior do que aquela a qual pode resultar em uma viscosida-de indesejável ou inadequada para administração via uma seringa SC. Oaçúcar é, de preferência, dissacarídeos, mais preferivelmente sacarose. Aformulação SC também pode compreender um ou mais dos componentesselecionados da lista consistindo em agentes de tamponamento, tensoativose conservantes.

O perfil de estabilidade da formulação SC foi avaliado na pre-sença de vários estabilizantes, incluindo açúcares, polissacarídeos, aminoá-cidos, tensoativos, polímeros, ciclodextranas, proteínas, etc. Dentre todos osexcipientes avaliados, açúcares tais como sacarose, manitol e trealose, tive-rám um melhor efeito de estabilização contra a formação de espécies deelevado peso molecular.

Os Exemplos V e VIII descrevem estudos de estabilidade doproduto de fármaco belatacept e abatacept SC, respectivamente, na presen-ça de sacarose armazenados em várias temperaturas durante vários perío-dos de tempo. Um aumento nas espécies de elevado peso molecular foi mo-nitorado usando um ensaio de cromatografia por exclusão de tamanho indi-cando estabilidade (SE-HPLC). Os resultados demonstram que a estabilida-de da molécula de CTLA4lg na formulação SC é intensificada na presençade sacarose. Estabilização através de sacarose foi melhor em uma maiorproporção em peso de sacarose:proteína. Baseado nesses estudos, sacaro-se foi selecionada com o estabilizante em uma proporção que fornece esta-bilidade ótima sem resultar em uma solução SC com hipertonicidade exces-siva.

A quantidade de sacarose útil para estabilização do produto defármaco SC está em uma proporção em peso de proteína para sacarose depelo menos 1:1, de preferência em uma proporção em peso de proteína parasacarose de 1:1,3 a 1:5, mais preferivelmente em uma proporção em pesode proteína para sacarose de cerca de 1:1,4.

Se necessário, o pH da formulação é ajustado através da adiçãode um ácido e/ou base farmaceuticamente aceitável. O ácido farmaceutica-mente aceitável preferido é ácido clorídrico. A base preferida é hidróxido desódio.

Durante desenvolvimento de formulação, a estabilidade do pro-duto de fármaco SC foi estudada como uma função do pH. O Exemplo Vdescreve estudos de estabilidade com o produto de fármaco belatacept SCcomo uma função do pH. O pH da formulação SC foi ajustado entre 7 e 8,2,amostras foram colocadas sob estabilidade e o produto de fármaco foi moni-torado com relação a um aumento nas espécies de elevado peso molecularem vários pontos de tempo usando um ensaio de cromatografia por exclusãode tamanho indicando estabilidade (SE-HPLC). Sob a condição de armaze-namento recomendada de 2-8°C, nenhuma alteração significativa na taxa deformação de espécies de HMW foi observada após 3 meses.

Além de agregação, deamidação é uma variante de produto co-mum de peptídeos e proteínas que podem ocorrer durante fermentação, co-leta/clarificação de células, purificação, armazenamento de substância defármaco/produto de fármaco e durante análise de amostra. Deamidação é aperda de NH3 de uma proteína formando um intermediário de succinimidaque pode sofrer hidrólise. O intermediário de succinimida resulta em umadiminuição de 17 u na massa do peptídeo precursor. A subsequente hidróli-se resulta em um aumento de 18 u na massa. Isolamento do intermediáriode succinimida é difícil em virtude da instabilidade sob condições aquosas.Como tal, a deamidação é, tipicamente, detectável como aumento de 1 u namassa. Deamidação de uma asparagina resulta em ácido aspártico ou iso-aspártico. Os parâmetros que afetam a taxa de deamidação incluem pH,temperatura, constante dielétrica do solvente, resistência iônica, seqüênciaprimária, conformação de polipeptídeo local e estrutura terciária. Os resíduosde aminoácido adjacentes à Asn na cadeia peptídica afetam as taxas de de-amidação. Gly e Ser após Asn em seqüências de proteína resultam em umamaior suscetibilidade à deamidação.

Estudos de estabilidade preliminares em escala de laboratóriosugerem que deamidação excederá os níveis de referência do método deteste de mapeamento de peptídeo a 24 meses usando a formulação SC deabatacept em um pH de 7,8. Os dados em seis meses sob 2-8°C e 25°C emumidade de 60% mostraram que a taxa de deamidação era menor em umpH de 7,2 e maior em um pH de 8 quando comparado com a amostra SC deabatacept em um pH de 7,8. Os Exemplos IX e XII descrevem estudos depH em escala de laboratório projetados para avaliar a deamidação de formu-lações de produto de fármaco SC na faixa de pH de 6 a 7,2.

A faixa de pH aceitável para o produto de fármaco SC é de 6 a8, de preferência 6 a 7,8, mais preferivelmente 6 a 7,2.

Em outro aspecto, os sais ou componentes do tampão podemser adicionados em uma quantidade de pelo menos 10 mM, de preferência10-200 mM. Os sais e/ou tampões são farmaceuticamente aceitáveis e sãoderivados de vários ácidos conhecidos (inorgânicos ê orgânicos) com metaisou aminas de "formação de base". Além de tampões de fosfato, podem serusados tampões de glicinato, carbonato, citrato e semelhantes, caso no qualíons de sódio, potássio ou amônio podem servir como contra-íons.

O Exemplo VIII descreve o efeito da resistência do tampão sobreo produto de fármaco SC abatacept. A estabilidade foi melhor em tampão defosfato a 10 mM comparado com tampão de fosfato a 5 mM em um pH de7,5 em uma concentração de 100 mg/mL de produto de fármaco abatacept.Além disso, a melhor capacidade de tamponamento do tampão de fosfato a10 mM ofereceu melhor controle de pH da formulação comparado com tam-pão a 5 mM.

O veículo aquoso de interesse aqui é um o qual é farmaceutica-mente aceitável (seguro e não tóxico para administração a um ser humano)e é útil para o preparo de uma formulação líquida. Veículos ilustrativos inclu-em água estéril para injeção (SWFI), água bacteriostática para injeção (BW-Fl), uma solução com pH tamponado (por exemplo, solução salina tampona-da com tampão), solução salina estéril, solução de Ringer ou solução dedextrose.

Um conservante pode ser opcionalmente adicionado às formula-ções aqui para reduzir a ação bacteriana. A adição de um conservante pode,por exemplo, facilitar a produção de uma formulação para múltiplo uso (dosemúltipla).

Conforme discutido com o produto de fármaco liofilizado, a mo-lécula de CTLA4lg é incompatível com o silicone encontrado em seringaspadrões pelo fato de que ela interage com o silicone para formar partículasvisíveis, desse modo, limitando o paciente a utilizar seringas sem silicone. Aformulação SC pode opcionalmente compreender um tensoativo para preve-nir a formação de partículas visíveis na presença de silicone.

Os Exemplos V e VIII descrevem o efeito de tensoativos, taiscomo Polissorbato 80 e Poloxamer 188, sobre a estabilidade de solução dosprodutos de fármaco belatacept e abatacept, respectivamente, e descobriu-se que tensoativos não têm um efeito sobre a estabilidade da molécula deCTLA4lg em uma formulação SC. Diferentes níveis de Poloxamer 188 foramavaliados e descobriu-se que a concentração de 4 mg/ml a 8 mg/ml, de pre-ferência 8 mg/ml, era adequada para prevenir a formação de partículas rela-cionadas ao silicone na formulação.

Uma composição típica de produto de fármaco SC abataceptSC, 125 mg/ml (100 mg/frasco) é proporcionada na Tabela 3 abaixo.

Tabela 3

Composição de produto de fármaco SC belatacept. 125 mg/ml (100mg/frasco)

<table>table see original document page 38</column></row><table>

Uma composição típica de produto de fármaco SC abataceptSC, 125 mg/ml (125 mg/frasco) é proporcionada na Tabela 4 abaixo.

Tabela 4

<table>table see original document page 38</column></row><table>

Uma composição típica de produto de fármaco SC abataceptSC, 125 mg/ml enchido em uma seringa é proporcionada na Tabela 5 abai-xo.Tabela 5

Composição de produto de fármaco SC abatacept. 125 mg/ml (125mg/seringa)

<table>table see original document page 39</column></row><table>

A condição de armazenamento recomendada para a formulaçãoSC é de 2-8°C com uma vida útil recomendada de pelo menos 12 meses.

A densidade do produto de fármaco SC de abatacept e do pla-cebo equivalente foi determinada em temperatura ambiente usando o densi-tômetro Mettler-Toledo. As medições foram realizadas usando amostras de 5mL em triplicatas. Descobriu-se que a densidade da formulação SC de aba-tacept era de 1,1 g/cc e aquela do produto de placebo era de 1,065 g/cc.Tipicamente, a densidade de uma formulação SC de CTLA4lg é cerca de 1,0g/cc a cerca de 1,2 g/cc, de preferência cerca de 1,0 g/cc a cerca de 1,15g/cc, mais preferivelmente cerca de 1,095 g/cc a cerca de 1,105 g/cc.

A viscosidade da formulação SC de abatacept foi determinadausando o reômetro de Brookfield em temperatura ambiente. Um padrão dereferência de 9,3 cps foi usado para as medições. Descobriu-se que a visco-sidade do produto de fármaco SC em uma concentração de abatacept de125 mg/mL era de 13 ± 2 cps. Tipicamente, a viscosidade de uma formula-ção SC de CTLA4lg a 125 mg/mL é cerca de 9 a cerca de 20 cps, de prefe-rência cerca de 9 a cerca de 15 cps, mais preferivelmente 12 a cerca de 15cps.

A osmolaridade do produto de fármaco SC abatacept e formula-ção de placebo foi medida usando um método de pressão de vapor. Os da-dos mostram que em concentrações de 125 mg/mL, a osmolaridade da for-mulação SC de abatacept SC é de 770 ± 25 mOsm/kgH20. Tipicamente, aosmolaridade da formulação SC de CTLA4lg a 125 mg/mL é cerca de 250 acerca de 800 mOsm/kgH20, de preferência cerca de 700 a cerca de 800mOsm/kgH20, mais preferivelmente cerca de 750 a cerca de 800mOsm/kghbO.

Preparação da Formulação SC

O processo de fabricação desenvolvido para formulações SCenvolve, tipicamente, composição com açúcar e tensoativo, seguido por fil-tração estéril asséptica e enchimento em frascos ou seringas, opcionalmenteprecedido por diafiltração (troca de tampão) e concentração da substânciade fármaco usando uma unidade de ultrafiltração.

Os Exemplos I e II descrevem a fabricação dos produtos de fár-maco SC belatacept e abatacept, respectivamente.

Aqueles versados na técnica estarão cientes da necessidade deencher o recipiente em excesso de modo a compensar perdas no frasco,agulha, seringa durante preparo e injeção. Por exemplo, um excesso de 40%de produto de fármaco é incorporado em cada frasco da fórmula líquida SCpara levar em conta perdas por extração e assegurar que 0,8 ml da soluçãocontendo 100 mg do produto de fármaco belatacept possam ser extraídos dofrasco.

Formulação Líquida

Formulações IV podem ser a via de administração preferida paracasos em particular, tal como quando o paciente está no hospital após otransplante, recebendo todos os fármacos através da via IV. Aqueles versa-dos na técnica reconhecerão as desvantagens e riscos de uma formulaçãoliofilizada para o fabricante e o profissional de saúde, respectivamente. Osriscos e vantagens para o profissional de saúde associados à reconstituiçãopodem incluir contaminação, espumação e perda de produto, bem como otempo requerido do profissional de saúde para preparar a formulação IV.Adicionalmente, os custos para o fabricante em equipamento e tempo dosempregados podem ser diminuídos através de remoção da etapa de liofiliza-ção de um processo de fabricação. Todas essas razões são motivação sufi-ciente para projetar uma formulação líquida para uso IV.A formulação líquida preferida para desenvolver seria uma for-mulação que pudesse imitar o produto de fármaco liofilizado após a primeiraconstituição para uma concentração de proteína de cerca de 25 mg/ml. Aformulação líquida adquirida seria, então, diluída para as concentrações deproduto de fármaco desejadas entre 1 e 10 mg/ml com cloreto de sódio a0,9% para injeção, USP, por um profissional de saúde no momento de uso.O produto de fármaco diluído para injeção é isotônico e adequado para ad-ministração através de infusão intravenosa.

Conforme discutido acima, a estabilidade a longo prazo de for-mulações líquidas é um problema para produtos de fármaco de proteína. Demodo a confirmar a estabilidade a longo prazo de uma solução contra a for-mação de espécies de elevado peso molecular, estudos de desenvolvimentode formulação foram conduzidos para avaliar a estabilidade em estado desolução da formulação líquida da invenção.

A formulação líquida da invenção compreende a molécula de C-TLA4lg em uma concentração de proteína de pelo menos 20 mg/ml em com-binação com um açúcar em níveis de estabilização, de preferência pelo me-nos 25 mg/ml em combinação com um açúcar em um nível de estabilizaçãoem um veículo aquoso. De preferência, o açúcar está em uma proporção empeso de proteína para açúcar de pelo menos 1:1.0 açúcar é, de preferência,dissacarídeos, mais preferivelmente sacarose. A formulação líquida tambémpode compreender um ou mais dos componentes selecionados da lista con-sistindo em agentes de tamponamento, tensoativos e conservantes.

A quantidade de sacarose útil para estabilização do produto defármaco líquido está em uma proporção em peso de proteína para sacarosede pelo menos 1:1, de preferência em uma proporção em peso de proteínapara sacarose de 1:2 a 1:10, mais preferivelmente em uma proporção empeso de proteína para sacarose de 1:2.

Se necessário, o pH da formulação é ajustado através da adiçãode um ácido e/ou base farmaceuticamente aceitável. O ácido farmaeeütica-mente aceitável preferido é ácido clorídrico. A base preferida é hidróxido desódio.Durante o desenvolvimento da formulação, a estabilidade doproduto de fármaco líquido foi estudada em um pH alvo de 7,5. O ExemploVII descreve estudos de estabilidade com o produto de fármaco belataceptlíquido, em um pH de 7,5. O pH da formulação líquida foi ajustado para 7,5.Amostras foram colocadas sob estabilidade e o produto de fármaco foi moni-torado com relação a um aumento nas espécies de elevado peso molecularem vários pontos de tempo usando um ensaio de cromatografia por exclusãode tamanho indicando estabilidade (SE-HPLC). Sob a condição de armaze-namento recomendada de 2-8°C, nenhuma alteração significativa na taxa deformação de espécies de HMW foi observada.

Além disso, agregação, deamidação e fragmentação são varian-tes de produto de peptídeos e proteínas que podem ocorrer durante fermen-tação, coleta/clarificação de células, purificação, armazenamento de subs-tância de fármaco/produto de fármaco e durante análise de amostra. Estu-dos de estabilidade preliminares em escala de laboratório sugerem que adeamidação excederá os níveis de referência do método de teste de mape-amento de peptídeo (se elevará acima do máximo de 5% de T26a ou T26b(%T30)) e que a fragmentação excederá os níveis de referência para o mé-todo de teste por SDS-PAGE (cai abaixo do mínimo da principal banda de96%) em 24 meses usando o belatacept (20 mg/ml em um pH de 7,5) arma-zenado a 2°-8°C. Dados de formulações líquidas (veja dados de SC acima)mostram que a taxa de deamidação encontrada nas formulações da inven-ção diminui à medida que o pH das formulações é diminuído.

A faixa de pH aceitável para o produto de fármaco líquido é de 6a 8, de preferência 6 a 7,8, mais preferivelmente 6 a 7,2.

Em outro aspecto, os sais ou componentes do tampão podemser adicionados em uma quantidade de pelo menos cerca de 10 mM, de pre-ferência 10-200 mM. Os sais e/ou tampões são farmaceuticamente aceitá-veis e são derivados de vários ácidos conhecidos (inorgânicos orgânicos)com metais ou aminas de "formação de base". Além de tampões dê fosfato,podem ser usados tampões de glicinato, carbonato, citrato e semelhantes,caso no qual íons de sódio, potássio ou amônio podem servir como contra-íons.

O veículo aquoso de interesse aqui é um o qual é farmaceutica-mente aceitável (seguro e não tóxico para administração a um ser humano)e é útil para o preparo de uma formulação líquida. Veículos ilustrativos inclu-em água estéril para injeção (SWFI), água bacteriostática para injeção (BW-Fl), uma solução com pH tamponado (por exemplo, solução salina tampona-da com fosfato), solução salina estéril, solução de Ringer ou solução de dex-trose.

Um conservante pode ser opcionalmente adicionado às formula-ções aqui para reduzir a ação bacteriana. A adição de um conservante pode,por exemplo, facilitar a produção de uma formulação para múltiplo uso (múl-tiplas doses).

Conforme discutido com o produto de fármaco liofilizado, a mo-lécula de CTLA4lg é incompatível com o silicone encontrado em seringaspadrões pelo fato de que ela interage com o silicone para formar partículasvisíveis, desse modo, limitando o profissional de saúde a utilizar seringassem silicone. A formulação líquida pode, opcionalmente, compreender umtensoativo para prevenir a formação de partículas visíveis na presença desilicone.

Uma composição típica de produto de fármaco líquido belata-cept, 20 mg/ml (250 mg/frasco), é proporcionada na Tabela 6 abaixo.

Tabela 6

Composição de produto de fármaco líquido belatacept, 20 mg/ml (250mg/frasco)

<table>table see original document page 43</column></row><table>a Inclui um excesso de 4% para perdas no frasco, agulha e seringa

A condição de armazenamento recomendada para a formulaçãolíquida é de 2-8°C, com uma vida útil recomendada de pelo menos 12 me-ses.

Preparo da Formulação Líquida

O processo de fabricação de produto de fármaco líquido envol-ve, tipicamente, composição com anticorpo e opcionalmente tensoativo, se-guido por filtração asséptica e enchimento em frascos, vedação e tampa.

A solução em volume formulada é, tipicamente, colocada emuma concentração fixa de proteína, de modo que o volume de enchimentodesejado do frasco possa ser mantido constante. Durante a adição de açú-car à substância de fármaco, a velocidade do misturador é controlada a 250± 50 rpm de modo a minimizar a espumação na solução de formação de ba-telada e assegurar dissolução completa do açúcar dentro de 10 a 20 minu-tos. A solução em volume formulada pode ser armazenada sob 2-8°C outemperatura ambiente luz ambiente durante pelo menos 24 horas antes deenchimento.

A solução em volume não é terminalmente esterilizada em virtu-de da sensibilidade ao calor da molécula de CTLA4lg. A solução em volumepode ser esterilizada usando dois filtros de grau para esterilização MilliporeMillipak® de 0,22 fxm em série antes de enchimento em frascos.

Aqueles versados na técnica estarão cientes da necessidade deencher o recipiente em excesso de modo a compensar perdas no frasco,agulha, seringa durante preparo e injeção. Por exemplo, cada frasco de pro-duto de fármaco belatacept, 20 mg/mL (250 mg/frasco), contém um excessode 4% do produto de fármaco para levar em conta perdas quando de recons-tituição e extração.

Artigos de Fabricação

Em outra modalidade da invenção, um artigo de fabricação éproporcionado o qual contém o produto de fármaco e, de preferência, pro-porciona instruções para seu uso. O artigo de fabricação compreende umrecipiente. Recipientes adequados incluem, por exemplo, garrafas, frascos,seringas e tubos de ensaio. O recipiente pode ser formado de uma varieda-de de materiais, tais como vidro, plástico ou metais.

O recipiente contém as formulações liofilizadas ou líquidas. Orótulo sobre ou associado ao recipiente pode indicar orientações para re-constituição e/ou uso. Por exemplo, o rótulo pode indicar que 25 mg/ml deproduto de fármaco belatacept têm de ser diluídos para as concentrações deproteína, conforme descrito acima. O rótulo pode ainda indicar que a formu-lação SC é útil ou destinada à administração subcutânea. O recipiente quecontém a formulação pode ser um frasco de uso múltiplo, o qual permiteadministrações repetidas (por exemplo, de 2-6 administrações), por exem-plo, da formulação subcutânea. Alternativamente, o recipiente pode ser umaseringa preenchida contendo, por exemplo, a formulação subcutânea.

O artigo de fabricação pode ainda compreender um segundorecipiente compreendendo, por exemplo, um veículo adequado para a for-mulação liofilizada.

O artigo de fabricação pode ainda incluir outros materiais dese-jáveis do ponto de vista comercial e do usuário, incluindo outros tampões,diluentes, filtros, agulhas, seringas e bulas de embalagem com instruçõespara uso.

Seringas sem silicone são, de preferência, utilizadas para umproduto de fármaco sem tensoativo, tal como quando de reconstituição doproduto de fármaco liofilizado e/ou transferência das soluções do frasco aosaco intravenoso e podem ser co-embaladas com o frasco com produto defármaco.

Métodos de Uso

A presente invenção ainda proporciona métodos para tratamentode doenças do sistema imune ou indução de tolerância compreendendo ad-ministração de uma quantidade eficaz das formulações de molécula de C-TLA4lg da invenção. Em modalidades particulares, as doenças do sistemaimune são mediadas por interações de células CD28- e/ou CTLA4-positivascom células CD80/CD86-positivas. Em uma outra modalidade, interações decélulas T são inibidas. Doenças do sistema imune incluem, mas não estãolimitadas a, doenças autoimunes, doenças imunoproliferativas e distúrbiosenxerto-relacionados. Esses métodos compreendem administração, a umindivíduo, as formulações de molécula de CTLA4lg da invenção para regularinterações de células T com as células CD80- e/ou CD86-positivas. Exem-pios de doenças enxerto-relacionadas incluem doença enxerto versus hos-pedeiro (GVHD) (por exemplo, tal como pode resultar de transplante de me-dula óssea ou na indução de tolerância), distúrbios imunes associados à re-jeição a transplante de enxerto, rejeição crônica e alo- ou xenoenxertos decélulas ou tecido, incluindo órgãos sólidos, pele, ilhotas, músculos, hepatóci-tos, neurônios. Exemplos de doenças imunoproliferativas incluem, mas nãoestão limitados a, psoríase; linfoma de células T; leucemia linfoblástica agu-da de células T; linfoma de células T angiocêntrica testicular; angiite linfocíti-ca benigna; e doenças autoimunes, tais como lúpus (por exemplo, lúpus eri-tematoso, nefrite por lúpus), tiroidite de Hashimoto, mixedema primário, do-ença de Grave, anemia perniciosa, gastrite atrófica autoimune, doença deAddison, diabetes (por exemplo, diabetes mellitus dependente de insulina,diabetes mellitus do tipo I), síndrome de Good Pasture, miastenia gravis,pênfigo, doença de Crohn, oftalmia simpatética, uveíte autoimune, esclerosemúltipla, anemia hemolítica autoimune, trombocitopenia idiopática, cirrosebiliar primária, hepatite de ação crônica, colite ulcerativa, síndrome de Sjo-gren, doenças reumáticas (por exemplo, artrite reumatóide), polimiosite, es-cleroderma e doenças mistas do tecido conectivo.

A presente invenção ainda proporciona um método para inibiçãode rejeições a transplante de tecido e/ou órgão sólido por um indivíduo, oindivíduo sendo um recipiente de um tecido transplantado. Tipicamente, emtransplantes de tecido, rejeição do enxerto é iniciada através de seu reco-nhecimento como estranho por células T, seguido por uma resposta imuneque destrói o enxerto. As formulações de molécula de CTLA4lg da presenteinvenção, através de inibição da proliferação de linfócitos T e/ou secreção decitocina, podem resultar em destruição lècidual reduzida e indução de nãoresponsividade de células T antígeno-específicas pode resultar em aceitaçãodo enxerto a longo prazo sem a necessidade de imunossupressão generali-zada. Além disso, as formulações de molécula de CTLA4lg da invenção po-dem ser administradas com outros produtos farmacêuticos incluindo, masnão limitado a, corticosteróides, ciclosporina, rapamicina, micofenolato mofe-til, azatioprina, tacrolismus, basiliximab e/ou outros produtos biológicos.

A presente invenção também proporciona métodos para inibiçãode doença enxerto versus hospedeiro em um indivíduo. Esse método com-preende administração, ao indivíduo, das formulações da invenção, sozinhasou junto com outros ligantes adicionais, reativas com IL-2, IL-4 ou y-interferon. Por exemplo, a formulação SC de molécula de CTLA4lg da pre-sente invenção pode ser administrada a um recipiente de transplante de me-dula óssea para inibir a alo-reatividade de células T do doador. Alternativa-mente, células T do doador dentro do enxerto de medula óssea podem sertornadas tolerantes aos alo-antígenos do hospedeiro ex vivo antes de trans-plante.

Inibição de respostas de células T pelas formulações de molécu-la de CTLA4lg da invenção pode ser útil para o tratamento de distúrbios au-toimunes. Muitos distúrbios autoimunes resultam de ativação inapropriadade células T que são reativas contra auto-antígenos e as quais promovem aprodução de citocinas e auto-anticorpos que estão envolvidos na patologiada doença. A administração da formulação de molécula de CTLA4lg em umindivíduo sofrendo de ou suscetível a um distúrbio autoimune pode prevenira ativação de células T auto-reativas e pode reduzir ou eliminar sintomas dadoença. Esse método pode também compreender administração, ao indiví-duo, de uma formulação da invenção, sozinha ou junto com outros ligantesadicionais, reativos com IL-2, IL-4 ou y-interferon.

O modo de administração e regime de dosagem mais eficazespara as formulações da invenção dependem da gravidade e curso da doen-ça, da saúde do paciente e resposta ao tratamento e do julgamento do mé-dico que faz o tratamento. De acordo com a prática da invenção, uma quan-tidade eficaz para tratamento de um indivíduo pode estar entre cerca de 0,1e cerca de 10 mg/kg de peso corporal do indivíduo. Também, a quantidadeeficaz pode ser uma quantidade entre cerca de 1 e cerca de 10 mg/kg depeso corporal do indivíduo.

As formulações de molécula de CTLA4lg da invenção podem seradministradas a um indivíduo em uma quantidade e durante um tempo (porexemplo, extensão de tempo e/ou múltiplas vezes) suficientes para impedirque moléculas de B7 endógenas (por exemplo, CD80 e/ou CD86) se liguema seus respectivos ligantes no indivíduo, bloqueio da ligação de B7 endóge-na/ligante, desse modo, inibe as interações entre células B7-positivas (porexemplo, células CD80- e/ou CD86-positivas) com células CD28- e/ou C-TLA4-positivas. A dosagem da molécula de CTLA4lg é dependente de mui-tos fatores incluindo, mas não limitado a, o tipo de tecido afetado, o tipo dadoença que está sendo tratada, a gravidade da doença, a saúde do indiví-duo e a resposta do indivíduo ao tratamento com os agentes. Consequente-mente, as dosagens dos agentes podem variar dependendo do indivíduo edo modo de administração. A Publicação pedido de patente US Número US2003/0083246 e Publicação de pedido de patente US Número US2004/0022787 ensinam a dosagem e esquemas de administração para C-TLA4lg tendo a seqüência de aminoácido mostrada em SEQ ID NO: 2 paratratamento de doenças reumáticas, tal como artrite reumatóide. Todas sãoincorporadas aqui por referência.

Uma quantidade eficaz de molécula de CTLA4lg pode ser admi-nistrada a um indivíduo diariamente, semanalmente, mensalmente e/ou anu-almente, em uma única ou múltiplas vezes por hora/dia/semana/mês/ano,dependendo da necessidade. Por exemplo, em uma modalidade, uma quan-tidade eficaz da molécula de CTLA4lg pode ser inicialmente administradauma vez a cada duas semanas durante um mês e, então, uma vez por mêsdepois.

Uma quantidade eficaz de molécula de CTLA4lg é uma quanti-dade de cerca de 0,1 a 100 mg/kg de peso de um indivíduo. Em outra moda-lidade, a quantidade eficaz é uma quantidade de cerca de 0,1 a 20 mg/kg depeso de um indivíduo. Em uma modalidade específica, a quantidade eficazde CTLA4lg é cerca de 2 mg/kg de peso de um indivíduo. Em outra modali-dade específica, a quantidade eficaz de CTLA4lg é cerca de 10 mg/kg depeso de um indivíduo. Em outra modalidade específica, uma quantidade efi-caz de CTLA4lg é 500 mg para um indivíduo pesando menos de 60 kg, 750mg para um indivíduo pesando entre 60-100 kg e 1000 mg para um indivíduopesando mais de 100 kg.

O pedido de patente US número de série 60/668.774, deposita-do em 6 de Abril de 2005 e o pedido de patente US número de série11/399.666, depositado em 6 de Abril de 2006, ensinam a dosagem e es-quema de administração para LEA29Ylg tendo a seqüência de aminoácidomostrada em SEQ ID NO: 4 para tratamento de distúrbios imunes associa-dos a transplante de enxerto. Todos são incorporados aqui por referência.

Tipicamente, doses da formulação de molécula de CTLA4lg dainvenção são baseadas no.peso corporal e regimes de administração podemser orientados pelos perfis séricos alvo. Tipicamente, uma concentração sé-rica alvo de moléculas de LEA29Ylg da invenção de entre cerca de 3 ug/mLe cerca de 30 ug/mL durante os primeiros 3 a 6 meses pós-transplante serásuficiente para manter a função do aloenxerto, de preferência entre cerca de5 ug/mL e cerca de 20 ug/mL. Tipicamente, a concentração sérica alvo demoléculas de LEA29Ylg da invenção durante a fase de manutenção estáentre cerca de 0,2 ug/mL e cerca de 3 ug/mL, de preferência entre cerca de0,25 ug/mL e cerca de 2,5 ug/mL.

As moléculas de LEA29Ylg da invenção podem ser administra-das em uma quantidade entre cerca de 0,1 a cerca de 20,0 mg/kg de pesodo paciente, tipicamente entre cerca de 1,0 a cerca de 15,0 mg/kg. Por e-xemplo, L104EA29Ylg pode ser administrada a 10 mg/kg de peso do pacien-te durante a fase inicial, o período de alto risco que segue ao transplante, ediminuída para 5 mg/kg de peso do paciente para uma dosagem de manu-tenção.

A administração das moléculas de CTLA4lg da invenção podeser via uma infusão intravenosa de 30 minutos a uma ou mais horas. Alter-nativamente, uma única ou múltiplas injeções subcutâneas podem distribuira dosagem requerida. Tipicamente, uma infusão intravenosa de 30 minutosé a via de administração utilizada durante a fase inicial de tratamento, en-quanto o paciente está no hospital e/ou fazendo visitas esquematizadas aoprofissional de saúde para monitoramento. A injeção subcutânea é o modode administração típico utilizado durante a fase de manutenção, desse mo-do, permitindo que o paciente retorne ao seu esquema normal diminuindo asvisitas ao profissional de saúde para infusões intravenosas.

O Exemplo 10 descreve a farmacocinética da formulação IV liofi-lizada de CTLA4lg em indivíduos saudáveis e pacientes com artrite reuma-tóide (RA). A farmacocinética de abatacept em pacientes com RA e indiví-duos saudáveis parecia ser comparável. Em pacientes com RA, após múlti-pias infusões intravenosas, a farmacocinética do abatacept mostrou aumen-tos proporcionais de Cmax e AUC sobre a faixa de dose de 2 mg/kg a 10mg/kg. A 10 mg/kg, a concentração no soro pareceu atingir um estado uni-forme em torno do dia 60, com uma concentração sérica média (faixa) de 24mcg/mL (de cerca de 1 a cerca de 66 mcg/mL). Nenhum acúmulo de abata-cept ocorreu quando de tratamento repetido contínuo com 10 mg/kg em in-tervalos mensais em pacientes com RA.

A invenção será mais completamente compreendida através dereferência aos exemplos a seguir. Eles não deverão, contudo, ser construí-dos como limitando o escopo da invenção. Todas as citações no decorrer dadivulgação são aqui expressamente incorporadas por referência.

Exemplo I

Produto de fármaco belatacept SC, 125 mg/ml (100 mg/frasco) éformulado em uma solução estéril, não pirogênica, pronta para uso adequa-da para administração subcutânea.

O produto de fármaco SC belatacept, 125 mg/ml (100 mg/frasco)é fabricado em uma escala de 2,2 kg (1500 frascos). A fórmula de batelada éfornecida na Tabela 7 abaixo.Tabela 7

Fórmula de batelada representativa

<table>table see original document page 51</column></row><table>

a Tamanho total da batelada de 2,2 kg (2-L). A densidade da solução é de1,10 g/ml (a 20°-25°C).

b Substância de fármaco belatacept: concentração de proteína de 25 mg/ml,fosfato de sódio a 25 mM, cloreto de sódio a 10 mM, pH de 7,5, <5% de es-pécies de HMW

O processo de fabricação para produto de fármaco SC belatacept,125 mg/ml (100 mg/frasco) envolve troca de tampão da substância de fárma-co bruta de tampão de fosfato de sódio a 25 mM, cloreto de sódio a 10 mMem um pH de 7,5 para tampão de fosfato de sódio a 10 mM, pH de 7,5, segui-do por concentração da proteína de -25 mg/ml para ~150 mg/ml através deremoção do tampão. A troca de tampão é realizada através de diafiltraçãocinco vezes da substância de fármaco bruta contra o novo tampão de fosfatode sódio a 10 mM, pH de 7,5, seguido por concentração de proteína para~150 mg/ml através de remoção do tampão. Um contentor de minifiltro Pelli-con de aço inoxidável (Millipore) é equipado com calibradores de pressão deaço inoxidável e válvulas com membrana sobre os orifícios de alimentação,retentado e permeados. Dois cassetes de filtração usados com o minimóduloPellicon são adaptados com uma membrana de poliéter sulfona Biomax comárea de 0,1 m2 com um limite de corte de peso molecular nominal de 30 kDa.Os cassetes de filtração são instalados de acordo com as recomendações dofabricante. O recipiente de alimentação para a substância de fármaco é umrecipiente de vidro de 4 litros com barra de agitação magnética. Tubulação desilicone de alto desempenho MasterFlex é usada para conectar o recipientede alimentação ao contentor de filtro e para a tubulação de permeado. O fluxode alimentação é proporcionado através de uma bomba peristáltica instaladana tubulação de alimentação. Sacarose e Poloxamer 188 são, então, dissolvi-dos na solução de proteína concentrada e o peso do batelada final é ajustadocom tampão de fosfato de sódio a 10 mM, pH de 7,5. A solução em volume éfiltrada através de um filtro de esterilização de 0,22 mícron e enchida em fras-cos de vidro de sílex do Tipo I de 5 cc despirogenados e esterilizados, tampa-da com rolhas de borracha de 20 mm e vedada com vedações flip-offde alu-mínio de 20 mm. A composição de produto de fármaco SC belatacept, 125mg/ml (100 mg/frasco) é proporcionada na Tabela 8 abaixo.

Tabela 8

Composição de produto de fármaco SC belatacept, 125 mg/ml (100mg/frasco)

<table>table see original document page 52</column></row><table>

Exemplo II

Produto de fármaco abatacept SC, 125 mg/ml (125 mg/frasco) éformulado como uma solução estéril, não pirogênica pronta para uso ade-quada para administração subcutânea. Uma batelada de produto de fármacoabatacept SC, 125 mg/ml (125 mg/frasco) é fabricada em uma escala de 5-L(3.500 frascos). A fórmula da batelada é descrita na Tabela 9 abaixo.Tabela 9

Fórmula de batelada

<table>table see original document page 53</column></row><table>

a Substância de fármaco abatacept: concentração de proteína de 50 mg/ml,fosfato de sódio a 25 mM, cloreto de sódio a 50 mM, pH de 7,5, <5% de es-pécies de HMW

conforme descrito acima no Exemplo I, o processo de fabricaçãopara do produto de fármaco abatacept SC, 125 mg/ml (125 mg/frasco) en-volve troca de tampão da substância de fármaco bruta de fosfato de sódio a25 mM, cloreto de sódio a 50 mM em um pH de 7,5 para tampão de fosfatode sódio a 10 mM, pH de 7,8, seguido por concentração de proteína de ~50mg/ml para -150 mg/ml através de remoção do tampão. Sacarose e Polo-xamer 188 são, então, dissolvidos na solução de proteína concentrada e opeso final da batelada é ajustado com tampão de fosfato de sódio a 10 mM,pH de 7,8. A solução em volume é filtrada através de um filtro de esteriliza-ção a 0,22 mícrom e enchida em frascos de vidro de sílex do Tipo I de 5 ccesterilizado e despirogenado, tampada com rolhas de borracha de 20 mm evedada com vedações flip-offáe alumínio de 20 mm.

A composição do produto de fármaco abatacept, 125 mg/ml (125mg/frasco) é proporcionada na Tabela 10 abaixo.Tabela 10

Composição de produto de fármaco abatacept SC, 125 mg/ml (125mg/frasco)

<table>table see original document page 54</column></row><table>

Exemplo III

Produto de fármaco abatacept, liofilizado (250 mg/frasco) é umliofilizado estéril não pirogênico adequado para administração intravenosa(IV). Cada frasco de uso único contém 250 mg de abatacept, o qual é re-constituído com água estéril para injeção, USP e ainda diluída com cloretode sódio a 0,9% para injeção,USP, no momento de uso.

A fórmula de batelada para um tamanho de batelada de 115 li-tros é descrita na Tabela 11 abaixo.

Tabela 11

Fórmula de batelada

<table>table see original document page 54</column></row><table>

a Substância de fármaco abatacept: concentração de proteína de 50 mg/ml,fosfato de sódio a 25 mM, cloreto de sódio a 50 mM, pH de 7,5, <5% de es-pécies de HMW

b Densidade da solução em volume formulada = aprox. 1,04 g/ml

A quantidade requerida de substância de fármaco abatacept éadicionada a um vaso de composição de aço inoxidável esterilizado e limpoequipado com um misturador. A solução de substância de fármaco é mistu-rada a 250 ± 50 rpm enquanto se mantém a temperatura da solução entre 5-25°C.

A quantidade requerida de pó de monohidrato de maltose é adi-cionada ao vaso de composição. A solução é misturada durante um mínimode 10 minutos a 15-25°C.

O pH da solução é ajustado para 7,3-7,7, se necessário usandoa solução de hidróxido de sódio a 1N previamente preparada ou solução deácido clorídrico a 1N. A batelada é levada para o peso final de batelada (q.s.final) usando água para injeção, USP e misturado durante um mínimo de 8minutos. A solução em volume formulada é coletada para pH.

Solução em volume formulada é pré-filtrada com um filtro de0,45 |am. A solução em volume formulada após o filtro de 0,45 um é coletadapara bio-carga e endotoxina bacteriana (BET).

A solução em volume formulada pré-filtrada é filtrada estéril comdois filtros de 0,22 ^m em série antes de enchimento.

A solução em volume formulada filtrada estéril é enchida e par-cialmente tampada com uma rolha de butila cinza Daikyo de 20 nm atravésde uma máquina de tampar/enchimento totalmente automática. Os frascosde vidro com tubulação de sílex do Tipo I de 15 cc são lavados e esteriliza-dos/despirogenados.

Os frascos com produto de fármaco enchidos e parcialmentetampados são liofilizados. Um resumo do ciclo de secagem por congelamen-to usado durante liofilização do produto de fármaco abatacept é proporcio-nado na Tabela 12 abaixo.

Tabela 12

Ciclo de secagem por congelamento para produto de fármaco abatacept liofi-lizado

<table>table see original document page 55</column></row><table><table>table see original document page 56</column></row><table>

Ao final do ciclo de liofilização, a pressão da câmara é elevadapara 500 mícrons usando nitrogênio filtrado estéril e fechamento do frasco érealizado sob vácuo. Os frascos tampados permanecem dentro do liofilizadordurante pelo menos 4 horas. Os frascos liofilizados e tampados são vedadoscom uma vedação flip-off branca de alumínio de 20 mm sob ar filtrado emHEPA pela máquina de tampar. Os frascos vedados são enxaguados comágua desionizada por um lavador de frasco exterior. Os frascos com produtode fármaco lavados são armazenados a 2 a 8°C.

A composição do produto de fármaco abatacept liofilizado (250mg/frasco) é listada na Tabela 13 abaixo.

Tabela 13

Composição de produto de fármaco abatacept liofilizado (250 mg/frasco)

<table>table see original document page 56</column></row><table><table>table see original document page 57</column></row><table>

a lnclui um excesso de 5% para perda no frasco, agulha e seringa

b Esses componentes estão presentes na solução de substância de fármacoabatacept

Exemplo IV

Produto de fármaco belatacept, liofilizado (100 mg/frasco), é umliofilizado não pirogênico estéril adequado para administração intravenosa(IV). Cada frasco para uso único contém 100 mg de belatacept constituídocom 4,2 ml de água estéril para injeção, USP para proporcionar uma con-centração de 25 mg/ml. Ela pode ser ainda diluída para uma concentraçãotão baixa quanto 1 mg/ml com Dextrose a 5% para injeção, USP ou cloretode sódio a 0,9% para injeção, USP no momento de uso.

O tamanho de batelada para fabricação do produto de fármacopode variar de 20 litros a 120 litro. Uma fórmula de batelada representativapara um tamanho de batelada de 66 litros (12.000 frascos) é proporcionadana Tabela 14 abaixo.

Tabela 14

Fórmula da batelada para um tamanho de batelada de 66 litros (12.000 fras-cos)

<table>table see original document page 57</table

a Substância de fármaco belatacept: concentração de proteína de 25 mg/ml,fosfato de sódio a 25 mM, cloreto de sódio a 10 mM, pH de 7,5, <5% de es-pécies de HMW

O produto de fármaco liofilizado belatacept é fabricado conformedescrito no Exemplo III acima.

A composição do produto de fármaco belatacept liofilizado, 100mg/frasco, é listada na Tabela 15 abaixo.

Tabela 15

Composição de produto de fármaco belatacept liofilizado a 100 mg/frasco

<table>table see original document page 58</column></row><table>

a Cada frasco contém um excesso de 10% para contenção em frasco, agulhae seringa da solução reconstituída

Exemplo V

Estudos de estabilidade da formulação líquida SC de produto defármaco belatacept foram conduzidos colocando as formulações sob estabi-lidade em diferentes temperaturas e durante vários períodos de tempo.

Efeito de Sacarose

Estudos de desenvolvimento de formulação foram conduzidospara avaliar o efeito de vários níveis de sacarose sobre a estabilidade desolução do produto de fármaco belatacept. As amostras foram colocadassob estabilidade em condições de -70°C, 8°C e 25°C/umidade de 60% emonitoradas em vários pontos de tempo. As proporções de proteína parasacarose avaliadas foram de 1:1, 1:1,7 e 1:1,75. A formação de espécies deelevado peso molecular (HMW) de belatacept foi utilizada para determinar aestabilidade de proteína em solução. Os resultados são mostrados na Tabe-la 16 abaixo.

Tabela 16

Efeito de vários níveis de sacarose sobre o produto de fármaco belatacept a100 mg/ml

<table>table see original document page 59</column></row><table>

a Produto de fármaco belatacept em tampão de fosfato de sódio a 10mM,100 mg/ml, pH de 7,5

Os resultados dos estudos mostraram que aumento da propor-ção de sacarose para proteína melhorou a estabilidade da proteína. Umaproporção de proteína para sacarose de 1:1,36 (peso/peso) foi escolhidapara o desenvolvimento da solução SC porque ela proporciona estabilidadeótima sem resultar em produto de fármaco com hipertonicidade excessiva.

Efeito de tensoativos

O efeito de vários tensoativos em produtos comercializados, taiscomo Polissorbato 80 e Poloxamer 188, sobre a estabilidade de solução doproduto de fármaco belatacept foi avaliado. Poloxamer 188 foi avaliado emníveis de 4, 6 e 8 mg/ml e Polissorbato 80 foi avaliado a 1 e 2 mg/ml de con-centração final da formulação. As amostras foram colocadas sob estabilida-de em condições de -70°C , 8°C e 25°C/umidade de 60% e monitoradas emvários pontos de tempo. Os resultados são mostrados na Tabela 17 abaixo.

Tabela 17

Efeito de vários níveis elipos de tensoativo sobre o produto de fármaco be-latacept (100 mg/ml)

<table>table see original document page 60</column></row><table>

a proteína:sacarose (1:1,7), 100 mg/ml, pH de 7,5

Os resultados do efeito de tensoativos sugeriram que o tensoati-vo não tem um efeito significativo sobre a estabilidade da solução de produtode fármaco belatacept. Dentre os níveis de Poloxamer 188 avaliados, des-cobriu-se que a concentração de 8 mg/ml era adequada para prevenir a for-mação de partículas relacionadas ao silicone na formulação.

Efeito do pH

A estabilidade do produto de fármaco Belatacept SC, (125mg/ml, proteína:sacarose a 1:1,36, 8 mg/ml de Pluronic F68) foi avaliadacomo uma função do pHL O pH da solução foi ajustado para entre 7 a 8,2com hidróxido de sódio a 1N ou ácido clorídrico a 1N. As amostras foramcolocadas sob condições «Je estabilidade a 2-8°C e 25°C/RH de 60% e moni-toradas em vários pontos de tempo. Testagem analítica incluía pH e SE-HPLC para monitorar o aumento nas espécies de elevado peso molecular(HMW). Esses resultados são resumidos na Tabela 18 abaixo.

Tabela 18

Efeito do pH sobre o produto de fármaco SC belatacept*

<table>table see original document page 61</column></row><table>

* Proteína:sacarose (1:1,36), 125 mg/ml, + 8 mg/ml de Pluronic F68Nenhuma alteração significativa na taxa de formação de espé-cies de HMW foi observada sob a condição de armazenamento recomenda-da de 2-8°C. Adicionalmente, os dados de estabilidade de solução mostra-ram que opH para estabilidade máxima estava entre 7 e 8. Baseado nisso,uma faixa de pH de 7-8 com um pH alvo de 7,5 foi selecionada para essaformulação.

Osmolaridade

A osmolaridade das soluções de produto de fármaco em váriostampões, em diferentes concentrações de proteína e das etapas distintas doprocesso de formulação foi medida usando um método de pressão de vapor.Esses resultados são resumidos na Tabela 19 abaixo.

Tabela 19

Determinação de osmolaridade da solução de produto de fármaco belataceptem vários tampões e concentrações<table>table see original document page 62</column></row><table>

Efeito de Agitação

O efeito de agitação sobre a estabilidade de solução do produtode fármaco SC belatacept em uma concentração de 100 mg/ml e 125 mg/mlfoi determinado. Alíquotas da solução contendo aproximadamente 1 ml emfrascos com tubulação de 5 cc foram agitadas na velocidade 3 de um agita-dor com braço biônico a 2-8°C. A temperatura do agitador foi mantida a 2-8°C colocando o agitador na sala fria. As amostras foram extraídas em inter-valos de tempo aproximados e ensaiados com relação ao pH e aparênciavisual e, ao mesmo tempo, as amostras também foram avaliadas com rela-ção à bioatividade após 30 dias de agitação.

As amostras agitadas em uma concentração de 100 mg/ml e 125mg/ml durante até 30 dias não mostram alteração no nível de espécies deHMW, em perfil de SDS-PAGE, mapeamento de planta, ensaio B7 Binding,pH, aparência ou concentração de proteína quando agitadas a 2-8°C.

Efeito de múltiplos conqelamentos/descongelamentos

O efeito de múltiplos congelamentos e descongelamentos daformulação de produto do substituição SC belatacept foi investigado em a-mostras com pH oscilando de 7,0 a 8,2. Alíquotas de aproximadamente 10 pJde formulação de produto de fármaco SC belatacept (125 mg/ml) em um pHde 7,0, 7,4, 7,8 e 8,2 foram distribuídas em recipientes de PETG Nalgene de30 ml. Múltiplos congelamentos e descongelamentos foram realizados atra-vés de armazenamento em frascos a -70°C, seguido por descongelamentoem temperatura ambiente (25°C) durante 10 minutos. Esse ciclo foi repetidodurante 5 dias. Os conteúdos dos frascos foram analisados com relação aopH, % de espécies de HMW e aparência após cada ciclo de congelamen-to/descongelamento.

Nenhuma alteração no pH, aparência ou teor % de espécies deelevado peso molecular foi observada em amostras durante cinco ciclos decongelamento/descongelamento.

Condições de armazenamento recomendada

A condição de armazenamento recomendada para o produto defármaco SC belatacept, 100 mg/frasco (125 mg/ml) é 2-8 °C com uma vidaútil recomendada de 12 meses.

Estudo de capacidade de fluxo em seringa

Estudo de capacidade de fluxo em seringa realizados com pro-duto de fármaco SC belatacept (125 mg/ml) em condições de 2-8°C. Váriostamanhos de agulha com seringas de 1 ml e 0,5 mL foram avaliados. O tem-po de enchimento da seringa e força de distribuição são registrados na Ta-bela 20 abaixo.

Tabela 20

Estudo de capacidade de fluxo em uma seringa do produto de fármaco SCbelatacept, 125 mg/ml a 2°-8°C

<table>table see original document page 63</column></row><table>Baseado nos resultados do estudo de capacidade de fluxo emseringa mostrados na Tabela 20, uma agulha hipodérmica estéril de 21 gau-ge x 134 polegada é recomendada para extração desse produto do frasco euma agulha de 27 gauge x VA polegada para subsequente dosagem.

Exemplo VI

Estudos de estabilidade da fórmula liofilizada de produto de fár-maco abatacept foram conduzidos colocando as formulações sob estabilida-de em diferentes temperaturas e durante vários períodos de tempo.

Efeito de Maltose

Estudos de desenvolvimento de formulação foram conduzidospara avaliar o efeito de vários níveis de maltose sobre a estabilidade do pro-duto de fármaco abatacept. As amostras foram colocadas sob estabilidade a50ÜC e monitorada em vários pontos de tempo'. As proporções de proteínapara maltose avaliadas foram de 1:1, 1:2 e 1:5. A formação de espécies deelevado peso molecular (HMW) de abatacept foi utilizada para determinar aestabilidade de proteína em estado sólido. Os resultados são mostrados naTabela 21 abaixo.

Tabela 21

Efeito de maltose sobre a estabilidade em estado sólido liofilizado do produtode fármaco abatacept a 50°C

<table>table see original document page 64</column></row><table>

a Estabilidade de produto de fármaco com uma proporção em peso de 1:5 defármaco para maltose foi avaliada durante desenvolvimento anterior comresistência de 50 mg/frasco. A batelada de substância de fármaco usadanesse estudo era diferente daquele usado para os outros resultados nessatabela. Essa é a razão para os diferentes níveis iniciais de espécies de ele-vado peso molecular nessas amostras.

Os resultados demonstram que a estabilidade do produto defármaco abatacept em uma forma em estado sólido liofilizado é intensificadana presença de maltose. Adicionalmente, a quantidade mínima de maltoseútil para estabilização de abatacept foi determinada como sendo uma pro-porção em peso de proteína para maltose de 1:2.

Efeito do pH

A estabilidade do produto de fármaco abatacept liofilizado (250mg/frasco, proteína:maltose a 1:2) foi avaliada como uma função do pH. OpH da solução foi ajustado entre 6 a 8 com hidróxido de sódio a 1N ou ácidoclorídrico a 1N. As amostras foram colocadas sob estabilidade em condiçõesde 2-8°C e monitoradas em vários pontos de tempo. Testagem analítica in-cluía pH e SE-HPLC para monitorar o aumento nas espécies de elevado pe-so molecular (HMW). Esses resultados são resumidos na Tabela 22 abaixo.

Tabela 22

Efeito do pH sobre a taxa de formação de espécies de elevado peso molecu-lar (HMW)

<table>table see original document page 65</column></row><table>

a A batelada de substância de fármaco usada para amostras com pH de 6,0e 6,5 era diferente daquele usado para amostras com pH 7,0, 7,5 e 8,0. Essaé a razão para os diferentes níveis iniciais de espécies de elevado peso mo-lecular nessas amostras.

Sob a condição de armazenamento recomendada de 2-8°C, ne-nhuma alteração significativa na taxa de formação de espécies HWM foi ob-servada. Adicionalmente, dados de estabilidade em estado de solução gera-dos durante um desenvolvimento anterior mostrou que o pH para estabilida-de máxima estava entre 7 e 8.

Exemplo VII

Estudos de estabilidade da fórmula líquida de produto de fárma-co belatacept (20 mg/ml) foram conduzidos colocando as formulações sobèsíabilidadeem diferentes temperaturas e durante vários períodos de tempo.

Efeito de Sacarose

Estudos de desenvolvimento de formulação foram feitos paraavaliar o efeito de vários níveis de sacarose sobre a estabilidade de soluçãodo produto de fármaco líquido de belatacept a 20 mg/ml. As amostras foramcolocadas sob estabilidade em condições de 8°C/25°C/umidade de 60% e30°C/umidade de 60% e monitoradas em vários pontos de tempo. As pro-porções de proteína para sacarose avaliadas foram uma proporção de prote-ína:sacarose de 1:1, 1:2, 1:5 e 1:10 com 20 mg/mL de belatacept. A forma-ção de espécies de elevado peso molecular (HMW) de belatacept foi utiliza-da para determinar a estabilidade de proteína em solução. Os resultadosdesse estudo são resumidos e mostrados na Tabela 23 abaixo.

Tabela 23

Efeito de vários níveis de sacarose sobre o produto de fármaco belataceptlíquido, 20 mg/ml

<table>table see original document page 66</column></row><table><table>table see original document page 67</column></row><table>

* Amostras não disponíveis para análise em virtude de evaporação

Os resultados dos estudos mostraram que aumento da propor-ção de sacarose para proteína melhorou a estabilidade.de proteína. Umaproporção de proteína para sacarose de 1:2 (peso:peso) foi escolhida para odesenvolvimento da solução líquida porque ela proporcionou estabilidadeótima sem resultar em um produto de fármaco com hipertonicidade excessiva.

Estudo de Estabilidade

Três lotes líquidas de belatacept foram preparadas e colocadassob estabilidade em condições de 2-8°C e 25°C/RH de 60% e monitoradasem vários pontos de tempo. A proporção em peso de proteína para sacarosefoi de 1:2. A formação de espécies de elevado peso molecular (HMW) debelatacept foi utilizada para determinar a estabilidade de proteína emformulação líquida. Dados de estabilidade são resumidos na Tabela 24abaixo.Tabela 24

Estabilidade de produto de fármaco líquido de belatacept

<table>table see original document page 68</column></row><table>

Os dados indicam um aumento de apenas 0,1% nas espécies deelevado peso molecular na formulação líquida comparado com um aumentode 0,2% na substância de fármaco belatacept sem sacarose em 12 meses a2-8°C. Esses resultados também indicam que a adição de sacarose ajuda naredução da formação de espécies de elevado peso molecular.

Exemplo VIII

Estudos de estabilidade da formulação SC de produto de fárma-co abatacept foram conduzidos colocando formulações sob estabilidade emdiferentes temperaturas e durante vários períodos de tempo.

Efeito da resistência do tampão

A estabilidade do produto de fármaco abatacept SC (100 mg/ml)foi avaliada como uma função da resistência do tampão. O sistema de tam-pão foi tampão de fosfato de sódio a 5 ou 10 mM. As amostras foram colo-cadas em estabilidade sob várias condições de 2-8°C e 30°C/RH de 60% emonitoradas em vários pontos de tempo. Testagem analítica incluía pH eSE-HPLC para monitorar o aumento nas espécies de elevado peso molecu-lar (HMW). Esses resultados são resumidos na Tabela 25 abaixo.

Tabela 25

Efeito da resistência do tampão sobre o produto de fármaco abatacept (100mg/ml, pH de 7,5)

<table>table see original document page 69</column></row><table>

A estabilidade do produto de fármaco abatacept SC foi melhorno tampão de fosfato a 10 mM comparado com tampão de fosfato a 5 mMem um pH de 7,5 em uma concentração de 100 mg/mL de abatacept. Alémdisso, a maior capacidade de tamponamento do tampão de fosfato a 10 mMofereceu melhor controle de pH da formulação comparado com tampão a 5mM. Baseado nesses dados, tampão de fosfato a 10 mM foi selecionadopara desenvolvimento de formulação.

Efeito de Açúcares

Estudos de desenvolvimento de formulação foram conduzidospara avaliar o efeito de vários açúcares sobre a estabilidade de solução doproduto de fármaco abatacept SC. As amostras foram colocadas sob condi-ções de estabilidade de 2-8°C e 30°C/umidade de 60% e monitoradas emvários pontos de tempo. Õs açúcares avaliados foram sacarose, trealose emanitol. A formação de espécies de elevado peso molecular (HMW) de aba-tacept foi utilizada para determinar a estabilidade de proteína em solução.Os resultados são mostrados na Tabela 26 abaixo.

Tabela 26

Efeito de vários açúcares sobre o produto de fármaco abatacept SC a 100mg/ml, pH de 7,5

<table>table see original document page 70</column></row><table>

a Produto de fármaco abatacept em tampão de fosfato de sódio a 10 mM,100 mg/ml, pH de 7,5.

b Formulação de manitol em um pH de 7,8

Os resultados dos estudos mostraram que todos os três açúca-res, sacarose, trealose e manitol, ofereceram melhor estabilização ao abata-cept comparado com o controle sem anticorpo. Os resultados dos estudossob condições aceleradas de 30°C mostraram que o manitol ofereceu me-lhor estabilização ao abatacept comparado com sacarose e trealose. Saca-rose foi ligeiramente melhor do que trealose. Sob refrigeração, a estabiliza-ção por todos os três açúcares não foi significativamente diferente. Sacarosefoi escolhido como o açúcar de escolha, uma vez que a formulação de mani-tol tinha duas vezes a tonicidade da formulação de sacarose. Escolher saca-rose para estabilização permite a adição de duas vezes tanto sacarose paraobter a mesma tonicidade que o manitol na mesma proporção, mas estabili-zação muito maior contra agregação. Uma proporção de proteína:sacarosede 1:1,36 (peso:peso) foi escolhida para a divulgação do produto de fármacoSC porque ela proporciona estabilidade ótima sem resultar em um produtode fármaco com hipertonícidade excessiva.

Efeito de Sacarose

Estudos de desenvolvimento de formulação foram conduzidospara avaliar o efeito de vários níveis de sacarose sobre a estabilidade desolução do produto de fármaco abatacept SC. As amostras foram colocadassob condições de estabilidade de 2-8°C e 30°C/umidade de 60% e monito-radas em vários pontos de tempo. As proporções de proteína para sacaroseavaliadas foram 1:1 e 1:2. A formação de espécies de elevado peso molecu-lar (HMW) de abatacept foi utilizada para determinar a estabilidade de prote-ína em solução. Os resultados são mostrados na Tabela 27 abaixo.Tabela 27

Efeito de vários níveis de sacarose sobre o produto de fármaco abataceptSC a 100 mg/ml, pH de 7,5

Condição de armazenamento

<table>table see original document page 71</column></row><table>

a Produto de fármaco abatacept em tampão de fosfato de sódio a 10 mM,100 mg/ml, pH de 7,5

Os resultados dos estudos mostraram que aumento da propor-ção de sacarose para proteína melhorou a estabilidade da proteína. Umaproporção de proteína:sacarose de 1:1,36 (peso:peso) foi escolhida para odesenvolvimento da solução de RTU porque ela proporcionou estabilidadeótima em resultar no produto de fármaco com hipertonícidade excessiva.Efeito de Tensoativos

O efeito de vários tensoativos em produtos comercializados, taiscomo Polissorbato 80 (Tween® 80) e Poloxamer 188 (Pluronic® F68), sobre aestabilidade de solução do produto de fármaco abatacept SC foi avaliado.

Poloxamer 188 foi avaliado em níveis de 4 e 8 mg/ml e Polissorbato 80 foiavaliado a 1 e 2 mg/ml de concentração final da formulação. As amostrasforam colocadas sob condições de estabilidade de -2-8°C e 25°C/umidadede 60% e monitoradas em vários pontos de tempo. Os resultados são mos-trados na Tabela 28 abaixo.

Tabela 28

Efeito de vários níveis e tipos de tensoativo sobre o produto de fármaco aba-tacept SC a 125 mg/ml

<table>table see original document page 72</column></row><table>

a proteína:sacarose (1:1),125 mg/ml, pH de 7,8

Os resultados do efeito de tensoativos sugeriram que o tensoati-vo não tem um efeito negativo significativo sobre a estabilidade do produtode fármaco abatacept SC. Dentre os níveis de Poloxamer 188 avaliados,descobriu-se que a concentração de 8 mg/ml era adequada para prevenir aformação de partículas relacionadas ao silicone na formulação.Osmolaridade

A osmolaridade do abatacept em vários tampões, em diferentesconcentrações de proteína e de etapas distintas do processo de formulaçãofoi medida usando um método de pressão de vapor. Esses resultados sãoresumidos na Tabela 29 abaixo.

Tabela 29

Determinação de osmolaridade de solução SC de abatacept em vários tam-pões e concentração

<table>table see original document page 73</column></row><table>

Efeito de Agitação

O efeito da agitação sobre a estabilidade de solução de produtode fármaco abatacept SC em uma concentração de 100 mg/ml e 125 mg/mlfoi determinado. Alíquotas da solução contendo aproximadamente 1 ml emfrascos com tubulação de 5 cc foram agitadas na velocidade 3 do agitaçãocom braço biônico a 2-8°C. A temperatura do agitador foi mantida a 2-8°Ccolocando o agitador na sala fria. As amostras foram extraídas em intervalosde tempo apropriados e ensaiadas com relação ao pH e aparência visual e,ao mesmo tempo, as amostras também foram avaliadas com relação à bioa-tividade após 30 dias de agitação.As amostras agitadas em uma concentração de 100 mg/ml e 125mg/ml durante até 30 dias não mostram alteração no nível de espécies deHMW, no perfil de SDS-PAGE, mapeamento de peptídeo, ensaio de ligaçãoB7, pH, aparência ou concentração de proteína quando agitadas a 2-8°C.

Condições de armazenamento recomendadas

A condição de armazenamento recomendada para o produto defármaco belatacept SC, 15 mg/seringa (125 mg/ml) é 2-8°C com uma vidaútil recomendada de pelo menos 12 meses.

Exemplo IX

Deamidação e agregação são duas vias de degradação obser-vadas de moléculas de CTLA4lg. Esse protocolo esboça um estudo sobre aestabilidade de pH em escala de laboratório projetado para avaliar a formu-lação de produto de fármaco SC na faixa de pH de 6,3-7,2, especificamenteum pH de 6,3, 6,6, 6,9, 7,2. A finalidade desse estudo é identificar a formula-ção ótima com menor pH que obterá uma vida útil mínima de 18 meses paraas formulações SC de CTLA4lg com relação à deamidação e formação deespécies de elevado peso molecular. A formulação de produto de fármacoSC utilizada nesse estudo é descrita na Tabela 30 abaixo.

Tabela 30

Composição de formulação de produto de fármaco SC em um pH de 6,9

<table>table see original document page 74</column></row><table>

O produto de fármaco abatacept SC será formulado em um pHde 6,3, 6,6, 6,9, 7,2. O produto de fármaco será formulado com sacarose epoloxamer 188 conforme descrito acima e a concentração final da bateladaserá ajustada com tampão de fosfato a 10 mM (pH de 6,9). O pH deverá sertitulado para 6,3 e 6,6, respectivamente, usando HCI a 1N. Alternativamente,o pH será titulado para até 6,9, 7,2 e 7,65 com NaOH a 1N. O produto defármaco será enchido seringas Physiolis™ com capacidade de 1 ml_ (volumede enchimento de 1,0 ml) e colocado sobre estações de estabilidade a 2-8°C, 15°C, 25°C em umidade de 60% e 35°C. As amostras deverão ser pro-tegidas da luz a todo momento cobrindo ou inserindo as mesmas em sacosprotetores de luz marrom.

Produto de fármaco armazenado a 2-8°C será coletado a 0, 2, 4,6, 12 18, 24 meses e opcionalmente 9 meses. Produto de fármaco armaze-nado a 15°C será coletado a 1, 2, 4, 6 meses e opcionalmente 9 meses.Produto de fármaco armazenado a 25°C e umidade de 60% será coletado a1, 2, 4 e 6 meses. Produto de fármaco armazenado a 35°C será coletado a1, 2 e 4 meses. Amostras armazenadas a 2-8°C serão testadas com relaçãoà aparência (amostras inicial e final apenas), pH (amostras inicial, 4 meses efinal apenas), A280 (amostras inicial, 4 meses e final apenas), HPLC porexclusão de tamanho, SDS-PAGE, mapeamento de peptídeo por digestãotríptica (TPM), Biacore B7 Binding (amostras inicial, 4 meses e final apenasou conforme necessário) e focalização isoelétrica (IEF) (amostras inicial efinal apenas). Amostras armazenadas a 15°C e 25°C e umidade de 60% se-rão testadas com relação à A280 (amostras inicial, 4 meses e última ape-nas), HPLC por exclusão de tamanho, SDS-PAGE e mapeamento de peptí-deo por digestão tríptica (TPM). Amostras armazenadas a 35°C serão testa-das com relação à HPLC por exclusão de tamanho, SDA-PAGE e mapea-mento de peptídeo por digestão tríptica (TPM).

Métodos de testagem não rotineiros deverão ser usados paracaracterizar adicionalmente amostras para estabilidade no ponto de tempoinicial, 4 meses, 12 meses e ao final do estudo. Alguns desses métodostambém podem ser usados para testar amostras específicas se uma tendên-cia ou um resultado inesperado é observado. Os métodos não rotineiros in-cluem: cromatografia por exclusão de tamanho empregando dispersão deluz em múltiplos ângulos (SEC-MALS), ligação cinética (SPR), Espectrome-tria de Massa, CD, AUC, Calorimetria por Exploração Diferencial (DSC),FFF, FTIR, HPLC por exclusão de tamanho (desnaturada) e SDS-PAGE (co-loração com prata).

Exemplo X

Um estudo de PK foi incorporado em um estudo na fase 2B, mul-ticentro, aleatório, duplamente cego, placebo-controlado para avaliar a segu-rança e eficácia clínica de duas doses diferentes de abatacept administradasintravenosamente a indivíduos com artrite reumatóide, enquanto recebiammetotrexato. Nesse estudo com design em paralelo, os indivíduos recebe-ram abatacept em 2 doses diferentes (2 e 10 mg/kg) ou placebo em combi-nação com MTX. Abatacept foi fabricado conforme descrito no pedido depatente US co-pendente No. de Série 60/752.267, depositado em 20 de De-zembro de 2005, o qual ensina processos para a produção de proteínas dainvenção, especificamente produtos de glicoproteína recombinantes, atravésde culturas de células ciô animai ou mamíferore-fornecidos na "forma liofiliza-da, conforme descrito aqui, em frascos individuais contendo 200 mg de aba-tacept. Abatacept foi administrado IV a indivíduos nos Dias 1, 15 e 30 e acada 30 dias depois durante um ano. PK para múltiplas doses derivada dedados da concentração no soro vs. tempo obtidos durante o intervalo de do-sagem entre os Dias 60 e 90 de indivíduos que foram arrolados em um sub-estudo de PK local-específico. Para os indivíduos no sub-estudo de PK, a-mostras de sangue foram coletadas antes de dosagem no Dia 60 e para umperfil de PK começando no Dia 60 a 30 minutos (correspondendo ao final dainfusão de abatacept), a 4 horas após o início de infusão e semanalmentedepois até o Dia 90. Um total de 90 indivíduos foi arrolado para participar nosub-estudo de PK. Contudo, perfis de PK completos entre o intervalo de do-sagem dos Dias 60 a 90 foram obtidos de 29 indivíduos (15 indivíduos dosa-dos a 2 mg/kg; 14 indivíduos dosados a 10 mg/kg).

Um sumário dos parâmetros de PK é apresentado na Tabela 31.Os resultados do estudo mostraram que a Cmax e AUC (TAU), onde TAU =30 dias, aumentaram de uma maneira dose-proporcional. Para doses nomi-nais aumentando na proporção de 1:5, as médias geométricas da Cmax au-mentaram na proporção de 1:5,2, enquanto que a média geométrica paraAUC (TAU) aumentou na proporção de 1:5,0. Além disso, os valores de T-HALF, CLT e Vss pareciam ser independentes da dose. Nesses indivíduoscom RA, os valores médios de T-HALF, CLT e Vss estavam em torno de 13dias, 0,2 mL/h/kg e ~ 0,07 L/kg, respectivamente. O pequeno Vss indica queo abatacept está confinado primariamente ao volume de fluido extracelular.

Baseado no esquema de dosagem a 2 e 4 semanas após a primeira infusão,então, uma vez por mês depois, condições em estado uniforme para abata-cept foram atingidas pela terceira dose mensal. Também, como um resul-tado do esquema de dosagem, as concentrações no soro estavam acimadas concentrações em estado uniforme durante os primeiros 2 meses detratamento. Comparação dos valores séricos (Cmin) nos Dias 60, 90 e 180indicou que o abatacept não parece se acumular após dosagem mensal. Osvalores médios de Cmin em estado uniforme para todos os indivíduos quereceberam doses IV mensais de 2 e 10 mg/kg de abatacept oscilavam entre4,4 a 6,7 mcg/mL e 22,0 a 28,7 mcg/mL, respectivamente.

Tabela 31

Sumário de múltiplos estudos de PK em indivíduos com artrite reumatóide(1a parte)

<table>table see original document page 77</column></row><table><table>table see original document page 78</column></row><table>

A farmacocinética do abatacept foi estudada em indivíduos adul-

tos saudáveis após uma única infusão intravenosa de 10 mg/kg e em pacien-tes com RA após múltiplas infusões intravenosas de 10 mg/kg (veja Tabela 32).

Tabela 32

Parâmetros farmacocinéticos (média, faixa) em indivíduos saudáveis e paci-entes com RA após infusão intravenosa de 10 mg/kg (s)

<table>table see original document page 78</column></row><table>

aMúítiplas infusões intravenosas foram administradas nos dias 1, 15, 30 emensalmente depois.

A farmacocinética do abatacept em pacientes com RA e indiví-duos saudáveis parecia ser comparável. Em pacientes com RA, após múlti-plas infusões intravenosas, a farmacocinética do abatacept mostrou aumen-tos proporcionais de Cmax e AUC sobre a faixa de dose de 2 mg/kg a 10mg/kg. A 10 mg/kg, a concentração no soro pareceu atingir um estado uni-forme no dia 60, com uma concentração sérica média (faixa) de 24 (1-66)mcg/mL. Nenhum acúmulo sistêmico de abatacept ocorreu quando de trata-mento repetido contínuo com 10 mg/kg em intervalos mensais em pacientescom RA.

Análises de farmacocinética na população de pacientes com RArevelou que havia uma tendência em maior depuração de abatacept comaumento do peso corporal. A idade e sexo (quando corrigidos para o pesocorporal) não afetam a depuração. Metotrexato (MTX), fármacos anti-inflamatórios não esteroidais (NSAIDs), corticosteróides e agentes de blo-queio de TNF concomitantes não influenciam a depuração de abatacept.

Ensaio no soro para Abatacept

Amostras de soro foram analisadas com relação ao abataceptatravés de um ensaio imunoabsorvente enzima-ligado (ELISA) em um totalde 25 operações analíticas. Todos os resultados analíticos foram de encon-tro aos critérios de aceitação estabelecidos antes de análise de amostra,indicando que o método ELISA era preciso e apurado para a quantificaçãode abatacept nas amostras de estudo. Um sumário dos parâmetros de curvapadrão e dados de QC médios para abatacept no soro são apresentados naTabela 33. A variabilidade entre e dentro da operação das QCs analíticaspara abatacept foram CV de 4,5% e 3,5%, respectivamente. As concentra-ções médias observadas das amostras de QC analítica desviaram em me-nos de 8,9% dos valores nominais (Tabela 33).Tabela 33

Sumário de dados de controle de qualidade para o ensaio de abatacept emsoro humano

<table>table see original document page 80</column></row><table>

Exemplo XI

Os objetivos desse estudo são avaliar a PK de belatacept apósuma única dose SC na faixa de 50 a 150 mg em indivíduos saudáveis; avali-ar os efeitos do volume de injeção e concentração da solução injetada sobrea PK de belatacept subeutaneamente injetado; avaliar a segurança e tolera-bilidade (incluindo a avaliação do local de injeção) de uma única dose SC debelatacept; avaliar a imunogenicidade de belatacept subeutaneamente ad-ministrado.

Esse é um estudo com uma única dose, duplamente cego, alea-tório, placebo-controlado, com grupo paralelo em indivíduos saudáveis. Umtotal de 42 indivíduos será aleatoriamente distribuído a um de 6 grupos detratamento. Dentro de cada grupo de 7 indivíduos, os indivíduos serão alea-toriamente distribuídos em uma proporção de 5:2 no Dia 1 para receber umaúnica injeção SC de belatacept ou placebo. Será requerido que os indivíduostenham um peso < 100 kg. Os 6 grupos de tratamento são descritos na Ta-bela 34.

Tabela 34

Grupos de tratamento<table>table see original document page 81</column></row><table>

Os indivíduos deverão sofrer avaliações de triagem para deter-minar a elegibilidade dentro de 28 dias de dosagem no Dia 1. Os indivíduosserão admitidos na unidade clínica no dia antes de dosagem (Dia 1) paraavaliações de linha de base, incluindo MLR. Os indivíduos deverão perma-necer na unidade clínica até término das avaliações pós-tratamento no Dia 5e retornar para a unidade clínica para cada visita de estudo depois, até libe-rados do estudo.

No Dia 1, os indivíduos serão aleatoriamente distribuídos ao tra-tamento e receberão uma única dose SC de belatacept ou placebo e passa-rão por uma amostra detalhada para PK e imunogenicidade. Todos os indi-víduos receberão injeções SC em na parte anterior de sua coxa. Após admi-nistração do fármaco de estudo, o Investigador avaliará o local de injeçãocom relação a sinais de irritação e inflamação local.

Exames físicos, medições de sinais vitais e avaliações clínicaslaboratoriais deverão ser realizados em momentos selecionados no decorrerdo estudo. Amostras de sangue deverão ser coletadas durante até 56 diasapós a administração do fármaco de estudo para análise de PK e avaliaçãode imunogenicidade. Os indivíduos deverão ser monitorados com relação aAEs no decorrer do estudo. Aproximadamente 256 mL de sangue deverãoser coletados de cada indivíduo durante o estudo.

Dosagem e acompanhamento deverão ocorrer concorrentemen-te para todos os grupos de dose. Nenhum indivíduo deverá receber mais deuma única dose. Indivíduos que não completam o estudo (exceto aquelesque são excluídos por AEs) podem ser substituídos.

Esse é um estudo com uma única dose. Cada indivíduo deverápassar por um período de triagem o qual deverá ser no máximo de 28 diasantes do dia em que o fármaco de estudo é administrado. A última visita doúltimo indivíduo que passou pela triagem deverá ser considerado o final doestudo.

100 mg/frasco de belatacept (125 mg/ml), conforme descrito aquie fabricado conforme descrito no pedido de patente US No. de Série60/849543, depositado em 5 de Outubro de 2006, o qual ensina processospara a produção de proteínas da invenção, especificamente produtos de gli-coproteína recombinantes, através de culturas de células de animal ou ma-mífero, é um produto líquido pronto para uso proporcionado em um frasco devidro para extração e administração usando uma seringa e agulha conven-cionais de tamanho adequado para administração SC. Um excesso suficien-te de belatacept é incorporado em cada frasco para levar em conta perdasquando de extração, de modo que 0,8 ml_ da solução contendo 100 mg pos-sam ser extraídos para administração SC.

Injeção de belatacept, 100 mg/frasco (125 mg/mL) não é desti-nada a uma infusão IV.

Indivíduos saudáveis, conforme determinado pela história médi-ca, exame físico, eletrocardiograma com 12-condutores e avaliações clínicaslaboratoriais serão elegíveis para participar do estudo. Esse estudo incluiráhomens e mulheres. Os indivíduos devem ter pelo menos 18 anos de idadee um peso < 100 kg no momento de distribuição aleatória. Mulheres não de-verão estar amamentando, grávidas e usando um método de contracepçãoaceitável durante pelo menos 1 mês antes de dosagem, durante o estudo edurante até 4 semanas após o final do estudo. Mulheres com potencial paraengravidar devem ter um teste de gravidez negativo no soro dentro de 24horas antes da dose de medicação de estudo. Os indivíduos deverão serorientados quanto aos riscos potenciais para uma gravidez. Homens devemestar usando um método adequado de contracepção durante o estudo e du-rante até 4 semanas após o final de estudo, de modo que o risco de gravidezpara sua parceira seja minimizado. Veja Seção 5 para uma lista detalhadados critérios de inclusão e exclusão.Medicações tomadas dentro de 4 semanas antes de arrolamentodeverão ser registradas no CRF. Nenhuma medicação concomitante (pres-crição, de venda livre ou fitoterápica) deverá ser administrada durante o es-tudo, exceto quanto a contraceptivos orais, a menos que eles sejam prescri-tos pelo Investigador para tratamento de eventos clínicos específicos.

Quaisquer terapias concomitantes deverão ser registradas no CRF.

A PK de belatacept após injeção SC deverá ser derivada dosdados de concentração no soro versus tempo. Os parâmetros de PK parauma única dose a serem avaliados incluem:

<table>table see original document page 83</column></row><table>

Os valores do parâmetro PK individuais serão derivados atravésde métodos não compartimentais através de um programa de análise de PKvalidado, o programa eToolbox Kinetica, Innaphase Corp, Filadélfia, PA. AAUC dose-normalizada também será reportada.

Amostras de soro deverão ser coletadas durante o tempo e en-saiadas com relação à presença de titulações de anticorpo ao belataceptusando dois ensaios ELISA. Um ensaio avalia a resposta à molécula inteirae o outro à porção LEA29Y-T apenas.

Todos os indivíduos que recebem a medicação de estudo deve-rão ser incluídos nos conjuntos de dados de segurança e PD. Indivíduos querecebem placebo em qualquer painel deverão ser agrupados em um únicogrupo de tratamento com placebo para avaliações de PD e avaliações desegurança, exceto quanto à avaliações do local de injeção. Todos os dadosdisponíveis de indivíduos que receberam belatacept deverão ser incluídos noconjunto da dados de PK e incluídos na estatística resumida e análise esta-tística.

A linha de base é considerada o Dia 1. Distribuições de freqüên-cia de sexo e raça deverão ser inseridas na tabela por tratamento (volume edose de injeção). Estatística resumida para idade, peso corporal e altura de-verão ser inseridas na tabela por tratamento.

Todos os AEs registrados deverão ser listados e inseridos natabela pelo termo, classe de órgão de sistema e tratamento preferidos. Si-nais vitais e resultados de testes clínicos de laboratório deverão ser listadose resumidos por tratamento. Quaisquer achados quando de exame físico eresultados clínicos de laboratório significativos deverão ser listados. Avalia-ções do local de injeção (eritema, calor, inchaço, dor e prurido) deverão serinseridos na tabela por tratamento e grau de gravidade. Indivíduos com pla-cebo serão agrupados através dos grupos de dose e analisados indepen-dentemente, também, para a avaliação do local de injeção.

Estatística resumida deverá ser inserida na tabela para os parâ-metros de PK por tratamento. As médias geométricas e coeficientes de vari-ação deverão ser apresentados para Cmax, AUC (0-T) e AUC (INF). As me-dianas, mínima e máxima, deverão ser apresentadas para Tmax. Médias edesvios padrão serão fornecidos para outros parâmetros de PK. Para avaliara dependência da dose após administração SC, plotagens de dispersão deCmax e AUC (INF) versus dose deverão ser proporcionadas. Plotagens dedispersão de AUC (IFN) e Cmax através dos volumes de injeção deverão serconstruídas para avaliar esse efeito sobre a PK do belatacept. Também, plo-tagens de dispersão de Cmax e AUC (INF) versus dose para um volume fixoe Cmax e AUC (INF) versus volume dentro de doses serão proporcionadasonde aplicável.

Estatística resumida deverá ser inserida na tabela por tratamen-to e o dia de estudo para valores de anticorpo anti-belatacept e anti-LEA29Y-T e suas alterações a partir da linha de base (Dia 1-0 hora). Para explorarpossíveis associações entre a imunogenicidade e exposição, plotagens dealterações nas concentrações de anticorpos anti-belatacept e anti-LEA29Y-Tserão proporcionadas.

Os esquemas de amostragem de sangue para PK e imunogenicidadesão esboçados na Tabela 35.

Tabela 35

Esquema de amostragem de sangue para imunogenicidade e farmacocinética

<table>table see original document page 85</column></row><table>

a Amostra de imunogenicidade no Dia 1 (anticorpos anti-belatacept) deveráser coletada antes de administração de fármaco. Amostras nos Dias 28, 35,42 e 56 podem ser coletadas dentro de ± 2 dias.

A Tabela 35 acima lista o esquema de amostragem a ser segui-do para avaliação de PK. Amostras de sangue (~3 ml_ por amostra) deverãoser coletadas em um tubo Vacutainer® pré-rotulado Red and Gray Top (SST)via venipunção direta ou de um "lock" de solução salina. Se um sistema de"lock" de solução salina é usado, aproximadamente 0,5 mL de sangue deve-rão ser coletados através do cateter residente e descartados antes de ob-tenção de cada amostra para PK. Uma vez que o espécime para PK tenhasido obtido, o sangue deverá ser deixado coagular no tubo Vacutainer® emtemperatura ambiente durante 15-30 minutos. Após coagulação, a amostradeverá ser centrifugada durante 15 minutos a 1500 x g em uma centrífugarefrigerada (4°C). Quando a centrifugação está completa, pelo menos 0,5 mLde soro de cada ponto de tempo de amostra para PK deverão ser removidosatravés de uma pipeta e transferidos para um tubo de armazenamento e en-vio para PK de polipropileno, com tampa de rosca, pré-rotulado. O tubo depolipropileno contendo a amostra de soro para PK deverá ser armazenadocongelado a -20°C ou mais frio durante um máximo de um mês e, então, a -70°C após isso. O tempo permitido a partir da coleta de amostra até conge-lamento do soro é de 12 horas. Um método de imunoensaio enzimático (EIA)sensível validado deverá ser usado para medir as concentrações de belata-cept no soro.

A Tabela 35 lista o esquema de amostragem a ser seguido paraa avaliação de imunogenicidade. Amostras de soro serão obtidas em visitasnos Dias 1, 14, 28, 35, 42 e 56. A amostra para imunogenicidade no Dia 1(anti-belatacept) deverá ser tomada antes de administração do fármaco deestudo. As amostras deverão ser ensaiadas com relação à presença de anti-corpos anti-belatacept e anti-LEA29Y-T. Para cada espécime, sangue (~ 3mL por amostra) deverá ser coletado em um tubo Vacutainer® pré-rotuladoRed and Gray Top (SST) via venipunção direta ou de um lock de soluçãosalina (cateter residente). Se um sistema de lock de solução salina é usadopara coleta de sangue, aproximadamente 0,5 mL de sangue deverão sercoletados através do cateter residente e ser descartados antes de obtençãode cada amostra para imunogenicidade. Uma vez que o espécime tenha si-do obtido, o sangue deverá ser deixado coagular no tubo Vacutainer® emtemperatura ambiente durante 15-30 minutos. Após coagulação, a amostradeverá ser centrifugada durante 15 minutos a 1500 x g em uma centrífugarefrigerada (4°C). Quando a centrifugação está completa, pelo menos 1 ml_de soro deverá ser removido através de uma pipeta e transferido para umtubo de armazenamento e envio de amostra de soro de polipropileno, comtampa de rosca, pré-rotulado. O tubo de polipropileno contendo a amostra desoro deverá ser armazenado congelado a -20°C ou mais frio. Dois métodosde ensaio imunoabsorvente enzima-ligado (ELISA) sensíveis validados de-verão ser usados para medir as titulações de anticorpo ao belatacept no so-ro. Um ensaio avalia a titulação de anticorpo à molécula inteira e o outro àporção LEA29Y-T apenas.

Exemplo XII

Deamidação, fragmentação e agregação são vias de degrada-ção observadas de moléculas de LEA29Ylg. Esse protocolo esboça um es-tudo de estabilidade de pH em escala de laboratório adicional projetado paraavaliar a formulação de produto de fármaco SC belatacept na faixa de pH de6,3-7,5. A finalidade desse estudo é identificar a formulação com pH ótimoque obterá uma vida útil mínima de 18 meses para a formulação SC de bela-tacept.

Para esse estudo, produto belatacept SC será formulado em umpH de 6,3, 6,6, 6,9, 7,2 e 7,5. A substância de fármaco belatacept a -25mg/mL será primeiro concentrada para -100 mg/mL, então, diafiltrada emtampão de fosfato a 10 mM em um pH de 6,9, seguido por uma segundaconcentração para obter um intermediário de produto de fármaco (DPI) a>160 mg/mL. O DPI será formulado com sacarose e poloxamer 188 e a con-centração final da batelada será ajustada com tampão de fosfato a 10 mM(pH de 6,9). O bruto formulado deverá ser subdividido em cinco sub-lotes,conforme esboçado no design de estudo. O pH da sub-lotes será tituladopara 6, e 6,6, respectivamente, usando HCI a 1N. O pH das duas sub-lotesadicionais será titulado para até 6,9, 7,2 e 7,5 com NaOH a 1N. As lotes deproduto serão enchidas em Physiolis com capacidade de 1 mL. As amos-tras deverão ser protegidas da luz em a todo momento cobrindo ou inserindoas mesmas em sacos protetores de luz marrons. A formulação de produto defármaco SC utilizada nesse estudo é descrita na Tabela 36 abaixo.

Tabela 36

<table>table see original document page 88</column></row><table>

Produto de fármaco armazenado a 2-8°C será coletado a 0, 2, 4,6, 12 18, 24 meses e opcionalmente 9 meses. Produto de fármaco armaze-nado a 15°C será coletado a 1, 2, 4, 6 meses e opcionalmente 9 meses.

Produto de fármaco armazenado a 25°C e umidade de 60% será coletado a1, 2, 4 e 6 meses. Produto de fármaco armazenado a 35°C será coletado a1, 2 e 4 meses. Amostras armazenadas a 2-8°C serão testadas com relaçãoà aparência (amostras inicial e final apenas), pH (amostras inicial, 4 meses efinal apenas), A280 (amostras inicial, 4 meses e final apenas), HPLC porexclusão de tamanho, SDS-PAGE, mapeamento de peptídeo por digestãotríptica (TPM), Biacore B7 Binding (amostras inicial, 4 meses e final apenasou conforme necessário) e focalização isoelétrica (IEF) (amostras inicial efinal apenas). Amostras armazenadas a 15°C e 25°C com umidade de 60%serão testadas com relação à A280 (amostras inicial, 4 meses e última ape-nas), HPLC por exclusão de tamanho, SDS-PAGE e mapeamento de peptí-deo por digestão tríptica (TPM). Amostras armazenadas a 35°C serão testa-das através de HPLC por exclusão de tamanho, SDA-PAGE e mapeamentode peptídeo por digestão tríptica (TPM).

Métodos de testagem não rotineiros serão usados para caracte-rizar adicionalmente a estabilidade das amostras no ponto de tempo inicial, 4meses, 12 meses e no final do estudo. Alguns desses métodos podem tam-bém ser usados para testar amostras específicas se uma tendência ou umresultado inesperado é observado. Os métodos não rotineiros incluem: cro-matografia por exclusão de tamanho empregando dispersão de luz em múl-tiplos ângulos (SEC-MALS), ligação cinética (SPR), Espectrometria de Mas-sa, CD, AUC, Calorimetria por Exploração Diferencial (DSC), FFF, FTIR,HPLC por exclusão de tamanho (desnaturada) e SDS-PAGE (coloração comprata).Seqüência de Listagem

<110> BRISTOL-MYERS SQUIBB COMPANYDALI, MANISHADAHLHEIM, CHARLES E.BORSADIA, SUNITANARINGREKAR, VIJAY H.GANDHI, RAJESH B.NERURKAR, MANOJ

<120> FORMULAÇÃO ESTÁVEL ADEQUADA PARA ADMINISTRAÇÃO SUBCUTÂNEA,ARTIGOS DE FABRICAÇÃO, FORMULAÇÃO ESTÁVEL ADEQUADA PARA DILUIÇÃOANTES DE ADMINISTRAÇÃO INTRAVENOSA, FORMULAÇÃO LIOFILIZADA ESTÉRILPARA DILUIÇÃO ANTES DE ADMINISTRAÇÃO INTRAVENOSA E USO DAS MESMAS

<130> 10739 WO PCT

<140> PCT/US06/62297

<141> 2006-12-19

<150> 60/752,150

<151> 2005-12-20

<160> 4

<170> Patentln versão 3.3

<210> 1

<211> 1152

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Iniciador-CTLA4Ig Sintético

<400> 1

atgggtgtac tgctcacaca gaggacgctg ctcagtctgg tccttgcact cctgtttcca 60

agcatggcga gcatggcaat gcacgtggcc cagcctgctg tggtactggc cagcagccga 120

ggcatcgcta gctttgtgtg tgagtatgca tctccaggca aagccactga ggtccgggtg 180

acagtgcttc ggcaggctga cagccaggtg actgaagtct gtgcggcaac ctacatgatg 240

gggaatgagt tgaccttcct agatgattcc atctgcacgg gcacctccag tggaaatcaa 300

gtgaacctca ctatccaagg actgagggcc atggacacgg gactctacat ctgcaaggtg 360gagctcatgt acccaccgcc atactacctg ggcataggca acggaaccca gatttatgta 420attgatccag aaccgtgccc agattctgat caggagccca aatcttctga caaaactcac 480acatccccac cgtccccagc acctgaactc ctgggtggat cgtcagtctt cctcttcccc 540ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc cggacccctg aggtcacatg cgtggtggtg 600gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg 660cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag cagtacaaca gcacgtaccg ggtggtcagc 720gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg aatggcaagg agtacaagtg caaggtctcc 780aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa accatctcca aagccaaagg gcagccccga 840gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc cgggatgagc tgaccaagaa ccaggtcagc 900ctgacctgcc tggtcaaagg cttctatccc agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat 960gggcagccgg agaacaacta caagaccacg cctcccgtgc tggactccga cggctccttc 1020ttcctctaca gcaagctcac cgtggacaag agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca 1080tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac cactacacgc agaagagcct ctccctgtct 1140ccgggtaaat ga 1152

<210> 2

<211> 383<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Peptideo-CTLA4Ig Sintético<400> 2

Met Gly Vai Leu Leu Thr Gln Arg Thr Leu Leu Ser Leu Vai Leu Ala

1 5 10 15

Leu Leu Phe Pro Ser Met Ala Ser Met Ala Met His Vai Ala Gln Pro

20 25 30

Ala Vai Vai Leu Ala Ser Ser Arg Gly lie Ala Ser Phe Vai Cys Glu

35 40 45

Tyr Ala Ser Pro Gly Lys Ala Thr Glu Vai Arg Vai Thr Vai Leu Arg50 55 60

Gln Ala Asp Ser Gln Vai Thr Glu Vai Cys Ala Ala Thr Tyr Met Met65 70 75 80

Gly Asn Glu Leu Thr Phe Leu Asp Asp Ser lie Cys Thr Gly Thr SerSer Gly Asn Gln100

Thr Gly Leu Tyr115

Tyr Leu Gly lie130

Pro Cys Pro Asp

145

Thr Ser Pro Pro

Phe Leu Phe Pro180

Pro Glu Vai Thr195

Vai Lys Phe Asn210

Thr Lys Pro Arg225

Vai Leu Thr Vai

Cys Lys Vai Ser260

Ser Lys Ala Lys275

Pro Ser Arg Asp290

Vai Lys Gly Phe305

Gly Gln Pro GluAsp Gly Ser Phe85

Vai Asn Leu Thr

lie Cys Lys Vai120

Gly Asn Gly Thr135

Ser Asp Gln Glu150

Ser Pro Ala Pro165

Pro Lys Pro Lys

Cys Vai Vai Vai200

Trp Tyr Vai Asp215

Glu Glu Gln Tyr230

Leu His Gln Asp245

Asn Lys Ala Leu

Gly Gln Pro Arg280

Glu Leu Thr Lys295

Tyr Pro Ser Asp310

Asn Asn Tyr Lys325

Phe Leu Tyr Ser

91

90

lie Gln Gly Leu105

Glu Leu Met Tyr

Gln lie Tyr Vai140

Pro Lys Ser Ser155

Glu Leu Leu Gly170

Asp Thr Leu Met185

Asp Vai Ser His

Gly Vai Glu Vai220

Asn Ser Thr Tyr235

Trp Leu Asn Gly250

Pro Ala Pro lie265

Glu Pro Gln Vai

Asn Gln Vai Ser300

lie Ala Vai Glu315

Thr Thr Pro Pro330

Lys Leu Thr Vai

95

Arg Ala Met Asp110

Pro Pro Pro Tyr125

lie Asp Pro Glu

Asp Lys Thr His

160

Gly Ser Ser Vai175

lie Ser Arg Thr190

Glu Asp Pro Glu

205

His Asn Ala Lys

Arg Vai Vai Ser240

Lys Glu Tyr Lys255

Glu Lys Thr lie270

Tyr Thr Leu Pro285

Leu Thr Cys Leu

Trp Glu Ser Asn320

Vai Leu Asp Ser335

Asp Lys Ser Arg340 345 350

Trp Gln Gln Gly Asn Vai Phe Ser Cys Ser Vai Met His Glu Ala Leu

355 360 365

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

<210> 3<211> 1152<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Iniciador-L104EA29YIg Sintético<400> 3

atgggtgtac tgctcacaca gaggacgctg ctcagtctgg tccttgcact cctgtttcca 60

agcatggcga gcatggcaat gcacgtggcc cagcctgctg tggtactggc cagcagccga " 120

ggcatcgcta gctttgtgtg tgagtatgca tctccaggca aatatactga ggtccgggtg 180

acagtgcttc ggcaggctga cagccaggtg actgaagtct gtgcggcaac ctacatgatg 240

gggaatgagt tgaccttcct agatgattcc atctgcacgg gcacctccag tggaaatcaa 300

gtgaacctca ctatccaagg actgagggcc atggacacgg gactctacat ctgcaaggtg 360

gagctcatgt acccaccgcc atactacgag ggcataggca acggaaccca gatttatgta 420

attgatccag aaccgtgccc agattctgat caggagccca aatcttctga caaaactcac 480

acatccccac cgtccccagc acctgaactc ctggggggat cgtcagtctt cctcttcccc 540

ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc cggacccctg aggtcacatg cgtggtggtg 600

gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg 660

cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag cagtacaaca gcacgtaccg tgtggtcagc 720

gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg aatggcaagg agtacaagtg caaggtctcc 780

aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa accatctcca aagccaaagg gcagccccga 840

gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc cgggatgagc tgaccaagaa ccaggtcagc 900

ctgacctgcc tggtcaaagg cttctatccc agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat 960

gggcagccgg agaacaacta caagaccacg cctcccgtgc tggactccga cggctccttc 1020

ttcctctaca gcaagctcac cgtggacaag agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca 1080

tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac cactacacgc agaagagcct ctccctgtct 1140

ccgggtaaat ga 1152<210> 4<211> 383<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Peptideo-L104EA29YIg Sintético<400> 4

Met Gly Vai Leu Leu Thr Gln Arg Thr Leu Leu Ser Leu Vai Leu Ala

1 5 10 15

Leu Leu Phe Pro Ser Met Ala Ser Met Ala Met His Vai Ala Gln Pro

20 25 30

Ala Vai Vai Leu Ala Ser Ser Arg Gly lie Ala Ser Phe Vai Cys Glu

35 40 45

Tyr Ala Ser Pro Gly Lys Tyr Thr Glu Vai Arg Vai Thr Vai Leu Arg

50 55 60

Gln Ala Asp Ser Gln Vai Thr Glu Vai Cys Ala Ala Thr Tyr Met Met65 70 75 80

Gly Asn Glu Leu Thr Phe Leu Asp Asp Ser lie Cys Thr Gly Thr Ser

85 90 95

Ser Gly Asn Gln Vai Asn Leu Thr lie Gln Gly Leu Arg Ala Met Asp

100 105 110

Thr Gly Leu Tyr lie Cys Lys Vai Glu Leu Met Tyr Pro Pro Pro Tyr

115 120 125

Tyr Glu Gly lie Gly Asn Gly Thr Gln lie Tyr Vai lie Asp Pro Glu

130 135 140

Pro Cys Pro Asp Ser Asp Gln Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His145 150 155 160

Thr Ser Pro Pro Ser Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Ser Ser Vai

165 170 175

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met lie Ser Arg Thr

180 185 190

Pro Glu Vai Thr Cys Vai Vai Vai Asp Vai Ser His Glu Asp Pro GluVai Lys Phe Asn210

Thr Lys Pro Arg225

Vai Leu Thr Vai

Cys Lys Vai Ser260

Ser Lys Ala Lys275

Pro Ser Arg Asp290

Vai Lys Gly Phe305

Gly Gln Pro Glu

Asp Gly Ser Phe340

Trp Gln Gln Gly355

His Asn His Tyr370

200

Trp Tyr Vai Asp215

Glu Glu Gln Tyr230

Leu His Gln Asp245

Asn Lys Ala Leu

Gly Gln Pro Arg280

Glu Leu Thr Lys295

Tyr Pro Ser Asp310

Asn Asn Tyr Lys325

Phe Leu Tyr Ser

Asn Vai Phe Ser360

Thr Gln Lys Ser375

94

Gly Vai Glu Vai220

Asn Ser Thr Tyr235

Trp Leu Asn Gly250

Pro Ala Pro lie265

Glu Pro Gln Vai

Asn Gln Vai Ser300

lie Ala Vai Glu315

Thr Thr Pro Pro330

Lys Leu Thr Vai345

Cys Ser Vai Met

Leu Ser Leu Ser380

205

His Asn Ala Lys

Arg Vai Vai Ser240

Lys Glu Tyr Lys255

Glu Lys Thr lie270

Tyr Thr Leu Pro285

Leu Thr Cys Leu

Trp Glu Ser Asn320

Vai Leu Asp Ser335

Asp Lys Ser Arg350

His Glu Ala Leu365

Pro Gly Lys<table>table see original document page 96</column></row><table><table>table see original document page 97</column></row><table><table>table see original document page 98</column></row><table>

Claims (77)

1. Formulação estável adequada para administração subcutâneacaracterizada pelo fato de que compreende pelo menos 100 mg/ml de molé-culas de CTLA4lg, um açúcar capaz de estabilização da referida formulaçãoem uma concentração eficaz da mesma, e um veículo aquoso farmaceuti-camente aceitável.

2. Formulação de acordo com a reivindicação 1, caracterizadapelo fato de que o açúcar é selecionado do grupo consistindo em sacarose,lactose, maltose, manitol e trealose e misturas dos mesmos.

3. Formulação de acordo com a reivindicação 1, caracterizadapelo fato de que o açúcar é um dissacarídeo.

4. Formulação de acordo com a reivindicação 3, caracterizadapelo fato de que o dissacarídeo é sacarose.

5. Formulação de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que ainda compreende um tampão farmaceuticamente aceitável.

6. Formulação de acordo com a reivindicação 1, caracterizadapelo fato de que apresenta uma faixa de pH de 6 a 8.

7. Formulação de acordo com a reivindicação 1, caracterizadapelo fato de que a molécula de CTLA4lg tem a seqüência de aminoácidomostrada em SEQ ID NO: 2, começando na metionina na posição 27 ou ala-nina na posição 26 e terminando na lisina na posição 383 ou glicina na posi-ção 382.

8. Formulação de acordo com a reivindicação 1, caracterizadapelo fato de que a molécula de CTLA4lg é L104EA29Ylg tendo a seqüênciade aminoácido mostrada em SEQ ID NO: 4 começando na metionina na po-sição 27 ou alanina na posição 28 e terminando na lisina na posição 383 ouglicina na posição 382.

9. Formulação de acordo com a reivindicação 7 ou 8, caracteri-zada pelo fato de que o açúcar é selecionado do grupo consistindo em saca-rose, lactose, maltose, manitol e trealose e misturas dos mesmos.

10. Formulação de acordo com a reivindicação 7 ou 8, caracteri-zada pelo fato de que o açúcar é um dissacarídeo.

11. Formulação de acordo com a reivindicação 7 ou 8, caracteri-zada pelo fato de que o açúcar é sacarose.

12. Formulação de acordo com a reivindicação 1, 7 ou 8, carac-terizada pelo fato de que a proporção de proteína:açúcar é de pelo menos-1:1,3.

13. Formulação de acordo com a reivindicação 7 ou 8, caracteri-zada pelo fato de que ainda compreende um tampão farmaceuticamenteaceitável.

14. Formulação de acordo com a reivindicação 7 ou 8, caracteri-zada pelo fato de que apresenta uma faixa de pH de 6 a 8.

15. Formulação estável, caracterizada pelo fato de que compre-ende a molécula de CTLA4lg tendo a seqüência de aminoacido mostradaem SEQ ID NO: 2, começando na metionina na posição 27 ou alanina naposição 26 e terminando na lisina na posição 383 ou glicina na posição 382em uma quantidade de cerca de 125 mg/ml, sacarose em uma quantidadede cerca de 170 mg/ml, pelo menos um agente de tamponamento, água es-téril para injeção e opcionalmente um tensoativo.

16. Formulação de acordo com a reivindicação 15, caracterizadapelo fato de que o agente de tamponamento está em uma quantidade depelo menos fosfato de sódio a 10 mM, em que o fosfato de sódio é uma mis-tura dos sais dibásicos e monobásicos do mesmo.

17. Formulação de acordo com a reivindicação 15, caracterizadapelo fato de que o tensoativo é Poloxamer 188 em uma quantidade de cercade 8 mg/ml.

18. Formulação de acordo com a reivindicação 15, caracterizadapelo fato de que apresenta uma faixa de pH de 6 a 8.

19. Formulação estável, caracterizada pelo fato de que compre-ende uma molécula de LE104A29Ylg tendo a seqüência de aminoacidomostrada em SEQ ID NO: 4, começando na metionina na posição 27 ou ala-nina na posição 26 e terminando na lisina na posição 383 ou glicina na posi-ção 382 em uma quantidade de cerca de 125 mg/ml, sacarose em umaquantidade de cerca de 170 mg/ml, pelo menos um agente de tamponamen-to, água estéril para injeção e opcionalmente um tensoativo.

20. Formulação de acordo com a reivindicação 19, caracterizadapelo fato de que o agente de tamponamento está em uma quantidade depelo menos fosfato de sódio a 10 mM, em que o fosfato de sódio é uma mis-tura dos sais dibásicos e monobásicos do mesmo.

21. Formulação de acordo com a reivindicação 19, caracterizadapelo fato de que o tensoativo é Poloxamer 188 em uma quantidade de cercade 8 mg/ml.

22. Formulação de acordo com a reivindicação 19, caracterizadapelo fato de que apresenta uma faixa de pH de 6 a 8.

23. Formulação de acordo com a reivindicação 1, 7, 8, 15 ou 19,caracterizada pelo fato de que a formulação é estável quando armazenada a-2 a 8°C durante pelo menos 12 meses.

24. Artigo de fabricação, caracterizado pelo fato de que compre-ende:a) pelo menos um recipiente o qual contém a formulação comodefinida na reivindicação 1, 7, 8, 15 ou 19 eb) instruções para administração da formulação subcutaneamen-te a um indivíduo que precisa da mesma.

25. Artigo de fabricação de acordo com a reivindicação 24, ca-racterizado pelo fato de que o recipiente é um frasco ou seringa.

26. Formulação estável adequada para diluição antes de admi-nistração intravenosa, caracterizada pelo fato de que compreende pelo me-nos 20 mg/ml de moléculas de CTLA4lg, um açúcar capaz de estabilizar areferida formulação em uma concentração eficaz para tal e um veículo aquo-so farmaceuticamente aceitável.

27. Formulação de acordo com a reivindicação 26, caracterizadapelo fato de que o açúcar é selecionado do grupo consistindo em sacarose,lactose, maltose e trealose e misturas dos mesmos.

28. Formulação de acordo com a reivindicação 26, caracterizadapelo fato de que o açúcar é um dissacarídeo.

29. Formulação de acordo com a reivindicação 26, caracterizadapelo fato de que o dissacarídeo é sacarose.

30. Formulação de acordo com a reivindicação 26, caracterizadapelo fato de que ainda compreende um tampão farmaceuticamente aceitável.

31. Formulação de acordo com a reivindicação 26, caracterizadapelo fato de que apresenta uma faixa de pH de 6 a 8.

32. Formulação de acordo com a reivindicação 26, caracterizadapelo fato de que a molécula de CTLA4lg tem a seqüência de aminoacidomostrada em SEQ ID NO: 2 começando na metionina na posição 27 ou ala-nina na posição 26 e terminando na lisina na posição 383 ou glicina na posi-ção 382.

33. Formulação de acordo com a reivindicação 26, caracterizadapelo fato de que a molécula de CTLA4lg é L104EA29Ylg tendo a seqüênciade aminoacido mostrada em SEQ ID NO: 4 começando na metionina na po-sição 27 ou alanina na posição 26 e terminando na lisina na posição 383 ouglicina na posição 382.

34. Formulação de acordo com a reivindicação 32 ou 33, carac-terizada pelo fato de que o açúcar é selecionado do grupo consistindo emsacarose, lactose, maltose e trealose.

35. Formulação de acordo com a reivindicação 32 ou 33, carac-terizada pelo fato de que o açúcar é sacarose.

36. Formulação de acordo com a reivindicação 26, 32 ou 33, ca-racterizada pelo fato de que a proporção de proteína:açúcar é de pelo me-nos 1:2.

37. Formulação de acordo com a reivindicação 32 ou 33, carac-terizada pelo fato de que ainda compreende um tampão farmaceuticamenteaceitável.

38. Formulação de acordo com a reivindicação 32 ou 33, carac-terizada pelo fato de que apresenta uma faixa de pH de 6 a 8.

39. Formulação estável, caracterizada pelo fato de que compre-ende uma molécula de CTLA4lg tendo a seqüência de aminoacido mostradaem SEQ ID NO: 2 começando na metionina na posição 27 ou alanina na po-sição 26 e terminando na lisina na posição 383 ou glicina na posição 382 emuma quantidade de cerca de 20 mg/ml, sacarose em uma quantidade decerca de 40 mg/ml, pelo menos um agente de tamponamento, água estérilpara injeção e opcionalmente um tensoativo.

40. Formulação de acordo com a reivindicação 39, caracterizadapelo fato de que o agente de tamponamento está em uma quantidade depelo menos fosfato de sódio a 10 mM.

41. Formulação de acordo com a reivindicação 39, caracterizadapelo fato de que o tensoativo é Poloxamer 188 em uma quantidade de cercade 8 mg/ml.

42. Formulação de acordo com a reivindicação 39, caracterizadapelo fato de que apresenta uma faixa de pH de 6 a 8.

43. Formulação estável, caracterizada pelo fato de que compre-ende uma molécula de LE104A29Ylg tendo a seqüência de aminoácidomostrada em SEQ ID NO: 4 começando na metionina na posição 27 ou ala-nina na posição 26 e terminando na lisina na posição 383 ou glicina na posi-ção 382 em uma quantidade de cerca de 20 mg/ml, sacarose em uma quan-tidade de cerca de 40 mg/ml, pelo menos um agente de tamponamento, á-gua estéril para injeção e opcionalmente um tensoativo.

44. Formulação de acordo com a reivindicação 43, caracterizadapelo fato de que o agente de tamponamento está em uma quantidade depelo menos fosfato de sódio a 10 mM.

45. Formulação de acordo com a reivindicação 43, caracterizadapelo fato de que o tensoativo é Poloxamer 188 em uma quantidade de cercade 8 mg/ml.

46. Formulação de acordo com a reivindicação 43, caracterizadapelo fato de que apresenta uma faixa de pH de 6 a 8.

47. Formulação de acordo com a reivindicação 26, 32, 33, 39 ou-43, caracterizada pelo fato de que a formulação é estável quando armaze-nada a 2 a 8°C durante pelo menos 12 meses.

48. Artigo de fabricação, caracterizado pelo fato de que compre-ende:a) pelo menos um recipiente o qual contém a formulação comodefinida na reivindicação 26, 32, 33, 39 ou 43 eb) instruções para diluição da formulação com um veículo aquo-so para uma concentração final de molécula de CTLA4lg de 1 a 10 mg/ml.

49. Artigo de fabricação de acordo com a reivindicação 48, ca-racterizado pelo fato de que ainda compreende uma seringa.

50. Artigo de fabricação de acordo com a reivindicação 48, ca-racterizado pelo fato de que o veículo aquoso é água estéril para injeção,USP ou cloreto de sódio a 0,9% para injeção, USP.

51. Formulação liofilizada estável para diluição antes de adminis-tração intravenosa, caracterizada pelo fato de que compreende a moléculade CTLA4lg solúvel e um lioprotetor selecionado do grupo consistindo emsacarose, lactose, maltose e trealose, em que o lioprotetor está em umaproporção em peso mínima de proteína para lioprotetor de 1:2.

52. Formulação liofilizada de acordo com a reivindicação 51, ca-racterizada pelo fato de que o lioprotetor é sacarose ou maltose e misturasdos mesmos .

53. Formulação liofilizada de acordo com a reivindicação 51, ca-racterizada pelo fato de que ainda compreende um tampão farmaceutica-mente aceitável.

54. Formulação liofilizada de acordo com a reivindicação 51, ca-racterizada pelo fato de que apresenta uma faixa de pH de 7 a 8.

55. Formulação liofilizada de acordo com a reivindicação 51, ca-racterizada pelo fato de que a molécula de CTLA4lg tem a seqüência de a-minoácido mostrada em SEQ ID NO: 2 começando na metionina na posição-27 ou alanina na posição 26 e terminando na lisina na posição 383 ou glicinana posição 382.

56. Formulação liofilizada de acordo com a reivindicação 51, ca-racterizada pelo fato de que a molécula de CTLA4lg é L104EA29Ylg tendo aseqüência de aminoácido mostrada em SEQ ID NO: 4 começando na metio-nina na posição 27 ou alanina na posição 26 e terminando na lisina na posi-ção 383 ou glicina na posição 382.

57. Formulação liofilizada de acordo com a reivindicação 55 ou-56, caracterizada pelo fato de que o lioprotetor é selecionado do grupo con-sistindo em sacarose, lactose, maltose e trealose e misturas dos mesmos.

58. Formulação liofilizada de acordo com a reivindicação 55 ou-56, caracterizada pelo fato de que o lioprotetor é sacarose ou maltose.

59. Formulação liofilizada de acordo com a reivindicação 55 ou-56, caracterizada pelo fato de que ainda compreende um tampão farmaceu-ticamente aceitável.

60. Formulação de acordo com a reivindicação 55 ou 56, carac-terizada pelo fato de que apresenta uma faixa de pH de 7 a 8.

61. Formulação liofilizada estéril, caracterizada pelo fato de quecompreende a molécula de CTLA4lg tendo a seqüência de aminoácido mos-trada em SEQ ID NO: 2 começando na metionina na posição 27 ou alaninana posição 26 e terminando na lisina na posição 383 ou glicina na posição382 em uma quantidade de cerca de 262 mg/frasco, maltose em uma quan-tidade de cerca de 525 mg/frasco, pelo menos um agente de tamponamentoe opcionalmente um tensoativo.

62. Formulação liofilizada de acordo com a reivindicação 61, ca-racterizada pelo fato de que o agente de tamponamento está em uma quan-tidade de pelo menos fosfato de sódio a 10 mM.

63. Formulação liofilizada de acordo com a reivindicação 61, ca-racterizada pelo fato de que o tensoativo é Poloxamer 188 em uma quanti-dade de cerca de 8 mg/ml.

64. Formulação liofilizada de acordo com a reivindicação 61, ca-racterizada pelo fato de que apresenta uma faixa de pH de 7 a 8.

65. Formulação liofilizada estéril, caracterizada pelo fato de quecompreende uma molécula de LE104A29Y tendo a seqüência de aminoáci-do mostrada em SEQ ID NO: 4 começando na metionina na posição 27 oualanina na posição 26 e terminando na lisina na posição 383 ou glicina naposição 382 em uma quantidade de cerca de 110 mg/frasco, sacarose emuma quantidade de cerca de 220 mg/frasco, pelo menos um agente de tam-ponamento e opcionalmente um tensoativo.

66. Formulação liofilizada de acordo com a reivindicação 65, ca-racterizada pelo fato de que o agente de tamponamento está em uma quan-tidade de pelo menos fosfato de sódio a 10 mM.

67. Formulação liofilizada de acordo com a reivindicação 65, ca-racterizada pelo fato de que o tensoativo é Poloxamer 188 em uma quanti-dade de cerca de 8 mg/ml.

68. Formulação liofilizada de acordo com a reivindicação 65, ca-racterizada pelo fato de que apresenta uma faixa de pH de 7 a 8.

69. Formulação liofilizada de acordo com a reivindicação 51, 55,-56, 61 ou 65, caracterizada pelo fato de que a formulação liofilizada é está-vel quando armazenada a 2 a 8°C durante pelo menos 12 meses.

70. Artigo de fabricação, caracterizado pelo fato de que compre-ende:a) pelo menos um recipiente o qual contém a formulação comodefinida na reivindicação 51, 55, 56, 61 ou 65 eb) instruções para diluição da formulação liofilizada para umaconcentração final de molécula de CTLA4lg de 1 a 10 mg/ml.

71. Artigo de fabricação de acordo com a reivindicação 70, ca-racterizado pelo fato de que ainda compreende uma seringa.

72. Artigo de fabricação de acordo com a reivindicação 70, ca-racterizado pelo fato de que o veículo aquoso é água estéril para injeção,USP ou cloreto de sódio a 0,9% para injeção, USP.

73. Uso de uma quantidade eficaz da formulação como definidaem qualquer uma das reivindicações 1, 7, 8, 15, 19, 26, 32, 33, 39, 43, 51,-55, 56, 61 e 65, caracterizado pelo fato de que é na produção de uma com-posição para o tratamento de doenças do sistema imune.

74. Uso de acordo com a reivindicação 73, caracterizado pelofato de que as doenças do sistema imune são selecionadas do grupo con-tendo doenças autoimunes, doenças imunoproliferativas e distúrbios enxer-to-relacionados.

75. Uso de uma quantidade eficaz da formulação como definidaem qualquer uma das reivindicações 1, 7, 8, 15, 19, 26, 32, 33, 39, 43, 51,-55, 56, 61 e 65, caracterizado pelo fato de que é na produção de uma com-posição para o tratamento ou prevenção de doença enxerto versus hospe-deiro.

76. Uso de uma quantidade eficaz da formulação como definidaem qualquer uma das reivindicações 1, 7, 8, 15, 19, 26, 32, 33, 39, 43, 51,-55, 56, 61 e 65, caracterizado pelo fato de que é na produção de uma com-posição para o tratamento de artrite reumatóide.

77. Uso de uma quantidade eficaz da formulação como definidaem qualquer uma das reivindicações 1, 7, 8, 15, 19, 26, 32, 33, 39, 43, 51,-55, 56, 61 e 65, caracterizado pelo fato de que é para a produção de umacomposição para a inibição de rejeições a transplante de tecido e/ou órgãosólido.