BRPI0619443A2

BRPI0619443A2 - polinucleàtidos isolados, proteÍna da parede de cÉlula de planta, construÇço de dna, cÉlulas de planta, plantas transgÊnicas, seqÜÊncias isoladas de nucleàtidos, mÉtodos de produÇço de planta transgÊnica, de correlaÇço de expressço de polinucleàtido em duas amostras diferentes e de posse de um fenàtipo de planta com o nÍvel de expressço de polinucleàtido na planta de um ou mais polinucleàtidos, de detecÇço de um ou mais polinucleàtidos numa amostra e de uma ou mais seqÜÊncias de Ácido nuclÉico codificadas por um ou mais polinucleàtidos numa amostra, polpa de madeira, combinaÇÕes para detectar a expressço de um ou mais polinucleàtidos, microarranjo e kit para detectar a expressço de gene

Info

Publication number: BRPI0619443A2
Application number: BRPI0619443-5A
Authority: BR
Inventors: Leonard N Bloksberg; Michael J Frost; Richard L Forster; Colleen Higgins; William H Rottmann; Kim Norris-Caneda
Original assignee: Arborgen Llc
Priority date: 2005-12-06
Filing date: 2006-12-06
Publication date: 2013-01-22
Also published as: JP2009519015A; AU2006321986A1; NZ569413A; AU2006321986B2; US20090038033A1; WO2007067525A2; JP5155875B2; US8455630B2; US20120284870A1; US8017833B2; EP1963353A2; NZ595626A; EP1963353A4; WO2007067525A3

Abstract

Polinucleótidos Isolados, Proteína da Parede de Célula de Planta, Construção de DNA, Células de Planta, Plantas Transgênicas, Sequêncis isoladas de Nucleotídos, Métodos de Produção de Planta Transgênica, de Correlação de Expressão de Polinucleótido em Duas Amostras Diferentes e da Posse de um Fenôtipo de Planta com o Nível de Expressão de Polinucleôtido na Planta de um ou Mais Polinucleôtidos, de Detecção de um ou Mais Polinucleôtidos Numa Amostra e de uma oua Mais Sequências de ácido Nuclêico Codificadas por um ou Mais Polinucleôtidos numa Amostra, Polpa de Madeira, Combinações Para Detectar a Expressão de um ou Mis Polinucleôtidos, Microarranjo e Kit Para Detectar a Expressão de Gene. A invenção proporciona sequências isoladas de polinucleôtidos e polipeptídeos a partir de P. radiata e E. Grandis são envolvidas na biossíntese da parede de madeira e célula. São proporcionados também métodos de uso das seqüências, em conjunto com construções e plantas transgênicas.

Description

"Polinucleótidos Isolados, Proteína da Parede da Célula de Planta, Construção de DNA, Células de Planta, Plantas Transgênicas, Seqüências Isoladas de Nucleótidos, Métodos de Produção de Planta Transgênica, de Correlação da Expressão de Polinucleótido em Duas Amostras Diferentes e da Posse de um Fenótipo de Planta com o Nível de Expressão de Polinucleótido na Planta de um ou Mais Polinucleótidos, de Detecção de um ou Mais Polinucleótidos

Numa Amostra e de uma ou Mais Seqüências de Ácido Nucléico Codificadas por um ou Mais Polinucleótidos numa Amostra, Polpa de Madeira, Combinações Para Detectar a Expressão de um ou Mais Polinucleótidos, Microarranjo e Kit Para Detectar a Expressão de

Gene"

Relatório Descritivo

Campo da Invenção

A presente invenção refere-se a seqüências de polinucleotí-

deo isolada de plantas, que codificam proteínas de madeira e parede celular. Em particular, esta invenção refere-se a seqüências de polinu- cleotídeo e polipeptídeo isoladas de Eucalyptus e Pinus, e à utilização de tais seqüências para a regulação da biossíntese de parede celular e desenvolvimento de madeira.

Antecedentes da Invenção

As células vegetais, diferentemente das células animais, são circundadas por uma parede celular relativamente fina, mas mecani- camente forte. A parede celular vegetal é essencial para muitos proces- sos na fisiologia vegetal e desenvolvimento vegetal. Tendo em vista seu revestimento externo duro, a parede celular vegetal provê um exoesque- Ieto celular que controla o formato celular e permite uma alta pressão de turgor. As paredes celulares vegetais são compostas de uma mistu- ra complexa de polissacarídeos e outros polímeros que são organizados em uma rede ligada por ligações covalentes e não covalentes. As paredes celulares vegetais contêm também proteínas estruturais, enzimas, compostos fenólicos, e outros materiais que podem modificar a estrutura química e física da parede. Embora a aparência e arquitetura das paredes celulares variem grandemente entre diferentes tipos de células, as paredes celulares são comumente classificadas em dois tipos principais: paredes primárias e paredes secundárias.

As paredes celulares primárias são formadas por células em crescimento e são em geral não especializadas. As paredes celulares primárias apresentam uma estrutura e uma composição similares que estão presentes em diversos tipos de células; em geral, paredes primá- rias são compostas aproximadamente de 25% de celulose, 25% de hemicelulose, 35% de pectina, e cerca de 10% de proteína estrutural. Na parede celular primária, microfibrilas de celulose, as quais contribu- em para a resistência da parede, são encerradas em uma matriz. As cadeias individuais de celulose que compreendem as microfibrilas são alinhadas proximamente e formam uma estrutura cristalina que é relativamente inacessível à digestão enzimática. Desta forma, a celulose é muito estável e apenas se degrada durante estágios de desenvolvimen- to específicos, tais como queda e senescência. A matriz de parede celular é composta de dois tipos de polissacarídeo, hemicelulose e pectina, juntamente com uma pequena concentração de proteínas estruturais. A matriz é em geral bem hidratada, e o estado de hidrata- ção da matriz determina as propriedades físicas da parede.

As paredes celulares secundárias se formam após o término do crescimento e aumento celular. Diferentemente das paredes celula- res primárias, as paredes celulares secundárias podem adotar estrutu- ras e composições altamente especializadas. Por exemplo, células de xilema, tais como as encontradas em madeira, apresentam paredes secundárias espessadas que são reforçadas por lignina.

Recentemente, várias proteínas da parede celular vegetal fo- ram identificadas. Por exemplo, seqüências de polinucleotídeo que codificam as seguintes proteínas da parede celular vegetal foram identificadas: α-amilase, arabinogalactana, precursor de proteína regulada por brassinosteróide, P-l,3-endoglucanase, p-l,3-glucanase, β-D-glucano exohidrolase, β-glucosidase, β-xilosidase, calnexina, calreticulina, celulase, celulose sintase, quitinase, proteína dirigente, expansina, extensina, galacturan 1,4-a-galacturonidase, glicose-1- fosfato adeniltransferase, glicosil transferase, glicosil hidrolase, glicosí- deo hidrolase, hexose pirofosforilase, proteínas ricas em hidroxiprolina, manose-6-fosfato isomerase, manose-1 -fosfato guanililtransferase, nucleotidil transferase, pectinas, pectina metilesterase, fosfomanomuta- se, proteína de resposta de resistência a doença, poligalacturonase, expansina alergênica de pólen, enzima de ramificação de amido, amido sintase, sacarose-fosfato sintase, sacarose sintase, proteína induzida por siringolídeo, UTP-glicose-1 -fosfato uridililtransferase, xiloglucano endotransglicosilase, xiloglucano sintase, xiloglucano :xiloglicosil transferase e Yieldin.

Embora muito seja conhecido sobre a estrutura e regulação metabólica de várias proteínas de parede celular, muito pouco é conhe- cido sobre suas funções e interações intracelulares. Além disso, o controle multigênico de um fenótipo vegetal apresenta dificuldades na determinação dos genes responsáveis por um dado fenótipo. Um obstáculo importante para se identificar genes e diferenças na expres- são genética que contribuem para o fenótipo em plantas é a dificuldade de se poder estudar concorrentemente a expressão de mais de um punhado de genes. Uma outra dificuldade na identificação e compreen- são da expressão genética e na interrelação entre os genes que contri- buem para o fenótipo vegetal é o alto grau de sensibilidade a fatores ambientais que demonstram as plantas. Houve avanços recentes utilizando o perfil de expressão de genoma total. Em particular, a utilização de micro-arranjos de DNA tem sido útil no exame da expressão de um grande número de genes em um único experimento. Vários estudos de respostas de gene vegetal a estímulos de desenvolvimento e ambientais foram conduzidos utilizando o perfil de expressão. Por exemplo, análise de micro-arranjo foi empre- gada para se estudar a expressão genética durante o amadurecimento de fruto em morangos, Aharoni e colaboradores, Plant Physiol 129:1019-1031 (2002), resposta a ferimento em Arabidopsis, Cheong e colaboradores, Plant Physiol. 129:661-7 (2002), resposta a patógeno em Arabidopsis, Schenk e colaboradores, Proc. Nat'l Acad. Sci 97:11655-60 (2000), e resposta a auxina em soja, Thibaud-Nissen e colaboradores, Plant Physiol. 132:118. Whetten e colaboradores, Plant Mol. Biol 47:275-91 (2001) descrevem o estabelecimento de perfil dos genes da biossíntese de parede celular em Pinus taeda L. utilizando sondas de cDNA. Whetten e colaboradores, examinaram genes que são expressos diferencialmente entre xilema juvenil em diferenciação e xilema secun- dário maduro. Além disso, para se determinar o efeito de alguns estímulos ambientais sobre a expressão genética, a expressão genética em madeira de compressão foi comparada com madeira normal. Um total de 156 de 2300 elementos examinados mostrou expressão diferen- cial. Whetten supra, em 285. A comparação de madeira jovem com madeira madura mostrou 188 elementos como expressos diferencial- mente. Id. em 286.

Embora o perfil de expressão e em particular, micro-

arranjos de DNA, constitua uma ferramenta conveniente para a análise de expressão de genoma total, sua utilização tem sido limitada a organismos para os quais a seqüência completa do genoma ou uma grande coleção de cDNA estão disponíveis. Ver Hertzberg e colaborado- res, Proc. Natl Acad. Sei. 98:14732-7 (2001a), Hertzberg e colaborado- res, Plant J., 25:585 (2001b). Por exemplo, Whetten, supra, afirmam que "uma análise mais completa desta questão interessante espera o término de um grande conjunto de ESTs tanto de pinheiro quanto de álamo". Whetten e colaboradores, em 286. Além disto, micro-arranjos compreendendo sondas de cDNA ou EST podem não ser capazes de distinguir genes da mesma família tendo em vista similaridades de seqüência entre os genes. Isto é, cDNAs ou ESTs, quando utilizados como sondas de micro-arranjo, podem se ligar a mais de um gene da mesma família.

Os métodos para a manipulação da expressão genética para produzir uma planta com um fenótipo mais desejável seriam facilitados por uma melhor compreensão da expressão genética do gene de parede celular em vários tipos de tecido vegetal, em diferentes estágios do desenvolvimento vegetal, e pelo estímulo por diferentes fatores ambien- tais. A capacidade de controlar a arquitetura e traços agronomicamente importantes seria melhorada por uma melhor compreensão de como o desenvolvimento da parede celular afeta o desenvolvimento e morfologia da célula vegetal.

Da mesma forma, há a necessidade de se identificar eficien- temente genes que regulam a síntese e desenvolvimento da parede celular.

Sumário da Invenção

Numa realização, a presente invenção está relacionada com um polinucleotídeo isolado compreendendo uma seqüência de ácidos nucléicos que codifica um polipeptídeo que regula o desenvolvimento da parede celular. Em outras realizações, o polinucleotídeo funciona em uma célula vegetal ou o polinucleotídeo isolado compreende uma seqüência de ácidos nucléicos selecionada do grupo consistindo nas SEQ ID Nos.: 1-230. Para as SEQ ID Nos.: 1-230, o polinucleotídeo é normalmente expresso em uma espécie de Eucalyptus ou Pinus. Em outras realizações, o eucalipto é Eucalyptus grandis e o pinheiro é Pinus radiata.

Em outras realizações, o polinucleotídeo da presente inven- ção é normalmente expresso em uma espécie de conífera. Em outras realizações, a conífera pode ser selecionada do grupo consistindo em pinheiro branco do leste, branco do oeste, pinheiro "sugar pine", pinheiro vermelho, pinheiro Pitch, pinheiro Jack, pinheiro de folha longa, pinheiro de folha curta, pinheiro Loblolly, pinheiro Slash, pinhei- ro da Virgínia, pinheiro Ponderosa, pinheiro Jeffrey e pinheiro Lodgepo- le, pinheiro radiata e cruzamentos híbridos destes. Em outras realiza- ções, a conífera é selecionada do grupo consistindo em Abies firma, Cedrus deodara, Cedrus deodara 'Albospica', Cedrus deodara iAurea', Cedrus deodara eKashmif, Cedrus deodara iShalimaf, Cedrus deodara iSilver Mist', Cedrus deodara 'White Imp', Cedrus libani (ssp. atlantica) glauca, Cedrus libani (ssp. atlantica) glauca pêndula, Cedrus libani 'Nana', Cedrus libani pêndula, Cedrus libani brevifolia, Cedrus libani var. stenacoma, Chamaecyparis lawsoniana, Chamaecyparis nootkatensis 'Pêndula', Chamaecyparis obtusa 'Crippsii, Chamaecyparis pisifera 'Boulevard', Chamaecyparis pisifera 'Filifera Aurea', Chamaecyparis thyoides 'Blue Sport', Cryptomeria japonica 'Sekkan Sugi', Cryptomeria japonica 'Vilmoriniana', Cunninghamia lanceolata 'Glauca', Cuppressus arizonica var. glabra 'Blue Ice', Cuppressus arizonica 'Blue Sapphire', Ginkgo biloba, Ginkgo biloba 'Autumn Gold', Glyptostrobus pensilis, Juniperus chinensis 'Torulosa', Juniperus scopulorum 'Tollesons', Junipe- rus virginiana, Larix kaempfeú, Metasequoia glyptostroboides, Picea abies, Picea abies 'Pêndula', Picea abies 'Remontii', Picea glauca 'San- ders Blue', Pinus χ hakkodensis, Pinus nigra var. nigra, Picea omorika, Pinus densiflora iUmbraeulifera', Pinus elliottii, Pinus flexüis 'Vanderwolf Pyramid', Pinus pinea, Pinus massoniana, Pinus strobus, Pinus strobus iPendula', Pinus sylvestris iFreneh Blue', Pinus sylvestris iMitsch Wee- ping', Pinus taeda, Pinus radiata, Pinus Pinascer, Pinus thunbergiana, Pinus virgíniana, Pseudotsuga menziesii, Pseudolarix amabilis, Sequoia sempervirens, Taxodium ascendens, Taxodium distichum, Thuja occiden- talis 'Filiformis', Tsuga Canadensis 'Golden Splendorj, χ Cuppressocypa- ris leylandii, χ Cuppressocyparis leylandii 'Post SentinaV, χ Cuppres- socyparis leylandii 'Caslewellan', χ Cuppressocyparis leylandii 'Naylors Blue', e cruzamentos híbridos destes.

Noutra realização da presente invenção, a conífera é um pi- nheiro amarelo do sul. Em realizações adicionais, o pinheiro amarelo do sul é selecionado do grupo consistindo em Pinus taeda, Pinus serotina, Pinus palustris, e Pinus elliottii e híbridos.

Noutras realizações, o polinucleotídeo isolado da presente invenção é normalmente expresso em uma árvore selecionada do grupo consistindo em castanheira, freixo, faia, ráfia lenhosa, bétula, cerejeira preta, nogueira preta, castanheira anã, choupo, olmo, eucalipto, olmo "hackberry", nogueira "hickory", azevinho, alfarrobeira, magnólia, bordo, carvalho, álamo, acácia, álamo tremedor, teca, amieiro vermelho, paulownia real, sassafrás, liquidambar, plátano, tupelo, salgueiro, e álamo amarelo, e cruzamentos híbridos intra e inter espécies destas.

Noutras realizações, o polinucleotídeo isolado da presente invenção é normalmente expresso em uma gimnosperma ou em uma angiosperma.

Noutras realizações, o polinucleotídeo isolado da presente invenção expressa um polipeptídeo que é capaz de regular a síntese da parede celular em uma planta monocotiledônea. Em realizações adicionais, a planta monocotiledônea é selecionada do grupo consistin- do em gramados, trigo, milho, arroz, aveia, cevada, orquídea, íris, lírio, cebola, cana-de-açúcar, e sorgo. Em outras realizações, o gramado é selecionado do grupo consistindo em Agrostis spp., Poapratensis, Lolium spp., gramínea do Kentucky e azevém perene misto; Festuca arundina- cea, Festuca rubra commutata, Cynodon dactylon, Pennisetum clandesti- num, Stenotaphrum secundatum, Zoysia japonica, e Dichondra micran- tha.

Em outras realizações, o polinucleotídeo isolado da presente invenção expressa um polipeptídeo que é capaz de regular a síntese de parede celular em uma planta dicotiledônea. Em realizações adicionais, a planta dicotiledônea é selecionada do grupo consistindo em algodão, tabaco, Arabidopsis, tomate, batata, álamo tremedor, eucalipto, liqui- dambar, acácia, álamo, salgueiro, teca, mogno, castanheira, olmo, beterraba, brócolis, mandioca, batata doce, pimenta, poinsétia, legu- mes, alfafa, soja, cenoura, morango, alface, carvalho, bordo, nogueira, rosa, menta, abobrinha, margarida, gerânio e cactos.

Em outras realizações, o polinucleotídeo isolado da presente invenção é capaz de super-regular ou sub-regular a biossíntese de parede celular em uma planta. Em realizações adicionais, o polinucleo- tídeo é proveniente de um gene que é endógeno ao genoma vegetal. Em outras realizações, o fenótipo de uma planta que expressa o polinucleo- tídeo isolado em pelo menos uma célula, é diferente do fenótipo de uma planta da mesma espécie que não expressa o polinucleotídeo isolado em qualquer de suas células. Em outras realizações, o fenótipo da planta que expressa o polinucleotídeo isolado compreende uma diferença na qualidade da lignina em comparação com uma planta da mesma espécie que não expressa o polinucleotídeo isolado. Em outras realiza- ções, a diferença na qualidade da lignina é caracterizada pela alteração na estrutura da molécula de lignina. Em outras realizações, o fenótipo da planta que expressa o polinucleotídeo isolado compreende uma diferença na composição da madeira em comparação com uma planta da mesma espécie que não expressa o polinucleotídeo isolado. Em outras realizações, o fenótipo de uma planta que expressa o polinucleo- tídeo isolado compreende uma diferença na composição de fibra em comparação com uma planta da mesma espécie que não expressa o polinucleotídeo isolado. Em outras realizações, o fenótipo da planta que expressa o polinucleotídeo isolado compreende uma diferença na divisão celular vegetal em comparação com uma planta da mesma espécie que não expressa o polinucleotídeo isolado. Em outras realiza- ções, o fenótipo da planta que expressa o polinucleotídeo isolado compreende uma diferença no desenvolvimento celular vegetal em comparação com uma planta da mesma espécie que não expressa o polinucleotídeo isolado. Em outras realizações, o fenótipo da planta que expressa o polinucleotídeo isolado compreende uma diferença na altura, volume ou rendimento em comparação com uma planta da mesma espécie que não expressa o polinucleotídeo isolado.

Em outras modalidades, o polinucleotídeo isolado da pre- sente invenção compreende a seqüência de qualquer uma das SEQ ID Nos.: 1-230, ou variantes destas. Em outras realizações, a variante codifica um polipeptídeo que é capaz de regular o desenvolvimento da parede celular em uma planta. Em outras modalidades, a variante apresenta uma identidade de seqüência que é maior ou igual a 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86%, 85%, 84%, 83%, 82%, 81%, 80%, 79%, 78%, 77%, 76%, 75%, 74%, 73%, 72%, 71%, 70%, 69%, 68%, 67%, 66%, 65%, 64%, 63%, 62%, 61%, ou 60% na seqüência de qualquer uma das SEQ ID Nos.: 1- 230.

Em outras modalidades, a proteína da parede celular vege- tal da presente invenção compreende a seqüência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID Nos.: 1-230, ou variantes destas, onde a dita proteína de parede celular é capaz de regular o desenvolvimento da parede celular em uma planta. Em outras realizações, a variante apresenta uma identidade de seqüência que é maior ou igual a 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86%, 85%, 84%, 83%, 82%, 81%, 80%, 79%, 78%, 77%, 76%, 75%, 74%, 73%, 72%, 71%, 70%, 69%, 68%, 67%, 66%, 65%, 64%, 63%, 62%, 61%, ou 60% na seqüência de qualquer uma das SEQ ID Nos.: 1- 230.

Em outras modalidades, uma construção de DNA da pre- sente invenção compreende (i) pelo menos um polinucleotídeo que apresenta a seqüência de qualquer uma das SEQ ID Nos.: 1-230, e (ii) um promotor, onde o dito promotor e o dito polinucleotídeo são ligados operativamente. Em outras realizações, o promotor é selecionado do grupo consistindo em um promotor constitutivo, um promotor forte, ou um promotor induzível. Em outras modalidades, o promotor induzível é regulado por qualquer um de ferimento, jasmonato de metila ou ácido salicílico. Em outras realizações, o polinucleotídeo produz um transcri- to de RNA. Em outras modalidades, o transcrito de RNA apresenta uma seqüência anti-senso de um gene que é endógeno à célula vegetal ou o transcrito de RNA induz interferência de RNA de um gene que é nor- malmente expresso em uma célula vegetal.

Noutra realização, uma célula vegetal da presente invenção compreende uma construção de DNA que compreende (i) pelo menos um polinucleotídeo que apresenta uma seqüência de qualquer uma das SEQ ID Nos.: 1-230 e (ii) um promotor, onde o dito polinucleotídeo codifica uma proteína que regula o desenvolvimento de parede celular, e onde o dito promotor e o dito polinucleotídeo estão ligados operativa- mente. Noutra modalidade, a presente invenção refere-se s uma planta transgênica compreende tal célula vegetal.

Em outras realizações, uma célula vegetal da presente in- venção compreende uma construção de DNA que compreende (i) pelo menos um polinucleotídeo que apresenta a seqüência de qualquer uma das SEQ ID Nos.: 1-230 e (i) um promotor, em que o referido polinucleo- tídeo codifica uma proteína que regula o desenvolvimento de madeira, e onde o dito promotor e o dito polinucleotídeo estão ligados operativa- mente. Noutra modalidade, a presente invenção refere-se a uma planta transgênica compreendendo tal célula vegetal.

Noutras realizações, a presente invenção refere-se a um mé- todo para produzir uma planta transgênica, compreendendo (a) trans- formação de uma célula vegetal com uma construção de DNA que compreende (i) pelo menos um polinucleotídeo que apresenta a seqüên- cia de qualquer uma das SEQ ID Nos.: 1-230 e (ii) um promotor, em que o referido polinucleotídeo codifica uma proteína que regula o desenvol- vimento de parede celular; (b) cultivo da citada célula vegetal transfor- mada sob condições que promovem o crescimento de uma planta e (c) seleção de uma planta transgênica que exibe um fenótipo que é diferen- te de uma planta da mesma espécie que não contém a dita construção de DNA. Em outras realizações, o fenótipo da planta que expressa o polinucleotídeo e o ácido nucléico desejado, é caracterizada por uma diferença na qualidade de lignina em comparação com uma planta da mesma espécie que não contém a construção de DNA. Em outras realizações, a diferença na qualidade da lignina é caracterizada por uma alteração na tr da molécula de lignina. Em outras realizações do presente método, o fenótipo da planta que expressa o polinucleotídeo e o ácido nucléico desejado, é caracterizado por uma diferença na compo- sição de madeira em comparação com uma planta da mesma espécie que não contém a construção de DNA. Em outras modalidades do presente método, o fenótipo da planta que expressa o polinucleotídeo e o ácido nucléico desejado, é caracterizado por uma diferença no rendi- mento de fibra em comparação com uma planta da mesma espécie que não contém a construção de DNA. Em outras realizações do presente método, o método da reivindicação 44, o fenótipo da planta que expres- sa o polinucleotídeo e o ácido nucléico desejado, é caracterizada por uma diferença na divisão celular em comparação com uma planta da mesma espécie que não contém a construção de DNA. Em outras modalidades do presente método, o fenótipo da planta que expressa o polinucleotídeo e o ácido nucléico desejado, é caracterizado por uma diferença no desenvolvimento de célula vegetal em comparação com uma planta da mesma espécie que não contém a construção de DNA. Em outras modalidades do presente método, o fenótipo da planta que expressa o polinucleotídeo e o ácido nucléico desejado, é caracterizado por uma diferença na síntese de amido em comparação com uma planta da mesma espécie que não contém a construção de DNA. Em outras realizações do presente método, o fenótipo da planta que expressa o polinucleotídeo e o ácido nucléico desejado, é caracterizado por uma diferença na altura, volume ou rendimento em comparação com uma planta da mesma espécie que não contém a construção de DNA.

Noutra modalidade, a presente invenção refere-se a uma pasta de madeira obtida a partir de uma árvore transgênica que expres- sa um polipeptídeo compreendendo uma seqüência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID Nos.: 1-230.

Noutra modalidade, a planta transgênica da presente in-

venção expressa um polipeptídeo compreendendo uma seqüência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID Nos.: 1-230, em que o referido aminoácido confere um traço à planta selecionada consistindo em tolerância aumentada à seca, altura reduzida ou aumentada, volume reduzido ou aumentado, ramificação reduzida ou aumentada, tolerância aumentada ao frio e geada, vigor aumentado, cor aperfeiçoa- da, características de saúde e nutricionais aumentadas, armazenagem aumentada, rendimento aumentado, tolerância a condições salinas aumentada, tolerância a metais pesados aumentada, tolerância a doenças aumentada, tolerância a insetos aumentada, tolerância a estresse hídrico aumentada, teor em açúcares aumentado, gosto aperfeiçoado, textura aperfeiçoada, teor em fosfato reduzido, germina- ção aumentada, absorção de micro-nutrientes aumentada, composição em amido aumentada, longevidade floral aumentada e produção de novas proteínas ou peptídeos. Em outras modalidades, a presente invenção refere-se a uma planta transgênica que expressa um polipeptídeo compreendendo a seqüência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID Nos.: 1-230, onde a dita planta apresenta um período juvenil reduzido ou aumenta- do em comparação com uma planta do tipo selvagem da mesma espécie.

Em outras realizações, a presente invenção refere-se a uma planta transgênica que expressa um polipeptídeo compreendendo a seqüência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID Nos.: 1-230, onde a dita planta apresenta ramos com poder de auto-poda.

Em outras modalidades, a presente invenção refere-se a

uma seqüência de nucleotídeos isolada apresentando a seqüência de nucleotídeos de qualquer uma das SEQ ID Nos.: 1-230, e as seqüências de nucleotídeos apresentando 60% de identidade de seqüência com a seqüência de nucleotídeos das SEQ ID Nos.: 1-230 e que são capazes de regular o desenvolvimento de parede celular em plantas.

Em outras realizações, a presente invenção refere-se a uma seqüência de nucleotídeos isolada apresentando a seqüência de nucleo- tídeos de qualquer uma das SEQ ID Nos.: 1-230, e as seqüências de nucleotídeos apresentando 65% de identidade de seqüência com a seqüência de nucleotídeos das SEQ ID Nos.: 1-230 e que estão envolvi- das no desenvolvimento de madeira.

Em outras modalidades, a presente invenção refere-se a uma seqüência de nucleotídeos isolada apresentando a seqüência de nucleotídeos de qualquer uma das SEQ ID Nos.: 1-230, e as seqüências de nucleotídeos apresentando 70% de identidade de seqüência com a seqüência de nucleotídeos das SEQ ID Nos.: 1-230 e que regulam a biogênese de parede celular.

Em outras realizações, a presente invenção refere-se a um método para correlacionar a expressão de polinucleotídeo em duas amostras diferentes, compreendendo:

- a detecção de um nível de expressão de um ou mais po- linucleotídeos que codificam um produto codificado por uma seqüência de ácidos nucléicos selecionada do grupo consistindo nas SEQ ID Nos.:

1-230 e variantes conservativas destas, em uma primeira amostra;

- a detecção de um nível de expressão de um ou mais po- linucleotídeos em uma segunda amostra;

- a comparação do nível de expressão de um ou mais po- linucleotídeos na primeira amostra com o nível de expressão dos um ou

mais polinucleotídeos na segunda amostra; e

- a correlação de uma diferença no nível de expressão dos um ou mais polinucleotídeos entre a primeira amostra e a segunda amostra. Em outras modalidades, a primeira amostra e a segunda amostra são cada uma de um tipo diferente de tecido vegetal. Em

outras realizações, a primeira amostra e a segunda amostra são do mesmo tecido, e onde a primeira amostra e a segunda amostra são cada uma coletada durante uma estão diferente do ano. Em outras modali- dades, a primeira amostra e a segunda amostra são obtidas de plantas em estágios diferentes de desenvolvimento.

Em outras realizações, a presente invenção refere-se a um

método para correlacionar existência de um fenótipo vegetal com o nível de expressão do polinucleotídeo na planta com um ou mais polinucleo- tídeos compreendendo:

- a detecção de um nível de expressão de um ou mais po-

linucleotídeos que codificam um produto codificado por uma seqüência

de ácidos nucléicos selecionada do grupo consistindo nas SEQ ID Nos.: 1-230 e variantes conservativas destas, em uma primeira planta possuindo um fenótipo; - a detecção de um nível de expressão de um ou mais po- linucleotídeos em uma segunda planta que não possui o fenótipo;

- a comparação do nível de expressão de um ou mais po- linucleotídeos na primeira planta com o nível de expressão dos um ou mais polinucleotídeos na segunda planta; e

- a correlação de uma diferença no nível de expressão dos um ou mais polinucleotídeos entre a primeira planta e a segunda planta quando a existência do fenótipo. Em outras modalidades, a primeira amostra e a segunda amostra são ambas obtidas de um tecido vegetal selecionado do grupo consistindo em tecido vascular, meristema apical, câmbio vascular, xilema, floema, raiz, flor, cone, fruto, e semente. Em outras realizações, o tecido vegetal da primeira amostra e da segunda amostra são ambos obtidos de um tecido de tipo diferente. Em outras modalidades, a primeira amostra e a segunda amostra são, cada uma, obtidas a partir de um tecido vegetal em um estágio diferente de desenvolvimento. Em outras realizações, tanto a primeira quanto a segunda planta ou células vegetais são da mesma espécie selecionada de Eucalyptus e Pinus. Em outras modalidades, a primeira planta e a segunda planta ou células vegetais são de uma espécie selecionada de Eucalyptus grandis e Pinus radiata. Em outras realizações, a etapa de detecção é realizada utilizando-se um ou mais polinucleotídeos capazes de se hibridizarem a uma seqüência de ácidos nucléicos selecionada do grupo consistindo nas SEQ ID Nos.: 1-230 sob condições padrão de hibridização. Em outras modalidades, a etapa de detecção é realizada utilizando-se um ou mais polinucleotídeos capazes de se hibridizarem a um produto de expressão de polinucleotídeo codificado por uma se- qüência de ácidos nucléicos selecionada do grupo consistindo nas SEQ ID Nos.: 1-230 sob condições padrão de hibridização. Em outras modalidades, a etapa de detecção é realizada por hibridização a um ácido nucléico rotulado. Em outras realizações, os um ou mais polinu- cleotídeos são rotulados com um rótulo detectável. Em outras modali- dades, pelo menos um dos um ou mais polinucleotídeos se hibridiza a uma região 3' não traduzida de um dos um ou mais polinucleotídeos. Em outras realizações, pelo menos um dos um ou mais polinucleotídeos se hibridiza a uma região 3' não traduzida de um dos um ou mais polinucleotídeos. Em outras modalidades, os um ou mais polinucleotí- deos compreendem uma seqüência de ácidos nucléicos selecionada do grupo consistindo nas SEQ ID Nos.: 1-230. Em outras realizações, os um ou mais polinucleotídeos compreendem uma seqüência de ácidos nucléicos selecionada do grupo consistindo nas SEQ ID Nos.: 1-230. Em outras realizações, os um ou mais polinucleotídeos são selecionados do grupo consistindo em DNA e RNA. Em outras modalidades, antes das etapas de detecção, é provida a etapa de amplificação dos um ou mais polinucleotídeos na primeira planta e na segunda planta ou células vegetais. Em outras realizações, antes das etapas de detecção, é provida a etapa de rotulagem dos um ou mais polinucleotídeos na primeira planta e na segunda planta ou células vegetais com um rótulo detectável.

Em outras modalidades, a presente invenção refere-se a uma combinação para a detecção da expressão de um ou mais polinu- cleotídeos, compreendendo dois ou mais oligonucleotídeos, onde cada oligonucleotídeo é capaz de se hibridizar a uma seqüência de ácidos nucléicos selecionada do grupo consistindo nas SEQ ID Nos.: 461-690. Em outras realizações, os dois ou mais oligonucleotídeos se hibridizam a uma seqüência de ácidos nucléicos diferente selecionada do grupo consistindo nas SEQ ID Nos.: 1-230. Em outras realizações, pelo menos um dos dois ou mais oligonucleotídeos se hibridiza a uma região 3' não traduzida de uma seqüência de ácidos nucléicos selecionada do grupo consistindo nas SEQ ID Nos.: 1-230. Em outras modalidades, cada um dos dois ou mais oligonucleotídeos são compreendidos de pouco mais de cerca de 100 bases nucleotídicas. Em outras realiza- ções, pelo menos um dos dois ou mais oligonucleotídeos compreende uma seqüência de ácidos nucléicos selecionada do grupo consistindo nas SEQ ID Nos.: 461-690. Em outras modalidades, cada um dos dois ou mais oligonucleotídeos se hibridiza a um gene que codifica uma proteína selecionada do grupo consistindo em α-amilase, arabinogalac- tana, calnexina, calreticulina, celulose sintase, proteína dirigente, expansina, extensina, galacturan l,4-p-galacturonidase, glicose-1- fosfato adeniltransferase, glicosil transferase, glicosil hidrolase, glicosí- deo hidrolase, proteínas ricas em hidroxiprolina, manose-6-fosfato isomerase, manose-1-fosfato guanililtransferase, nucleotidil transferase, pectinas, pectina metilesterase, fosfomanomutase, proteína de resposta de resistência a doença, poligalacturonase, expansina alergênica de pólen, enzima de ramificação de amido, amido sintase, sacarose-fosfato sintase, sacarose sintase, UTP-glicose-1 -fosfato uridililtransferase, xiloglucano sintase, xiloglucano.-xiloglicosil transferase, e Yieldin. Em outras realizações, cada um dos dois ou mais oligonucleotídeos se hibridiza a um gene que codifica uma proteína diferente das citadas. Em outras realizações, cada um dos dois ou mais oligonucleotídeos se hibridiza a um gene diferente. Em outras realizações, a combinação compreende de cerca de 2 a cerca de 5000 dos dois ou mais oligonucle- otídeos. Em outras realizações, cada um dos dois ou mais oligonucleo- tídeos é rotulado com um rótulo detectável.

Em outras realizações, a presente invenção refere-se a uma combinação para a detecção da expressão de um ou mais polinucleotí- deos, compreendendo dois ou mais oligonucleotídeos, em que cada oligonucleotídeo é capaz de se hibridizar a um produto de expressão de polinucleotídeo codificado por uma seqüência de ácidos nucléicos selecionada do grupo consistindo nas SEQ ID Nos.: 1-230. Em outras modalidades, os dois ou mais oligonucleotídeos se hibridiza a uma seqüência de nucleotídeos codificada por uma seqüência de ácidos nucléicos diferente selecionada do grupo consistindo nas SEQ ID Nos.: 1-230. Em outras realizações, pelo menos um dos dois ou mais oligo- nucleotídeos se hibridiza a uma seqüência de ácidos nucléicos que é complementar a uma região 3' não traduzida de uma seqüência de ácidos nucléicos selecionada do grupo consistindo nas SEQ ID Nos.: 1- 230. Em outras modalidades, cada um dos dois ou mais oligonucleotí- deos são compreendidas por pouco mais de cerca de 100 bases nucleo- tídicas. Em outras realizações, pelo menos um dos dois ou mais oligonucleotídeos compreende uma seqüência de ácidos nucléicos selecionada do grupo consistindo nas SEQ ID Nos.: 461-690. Em outras modalidades, cada um dos dois ou mais oligonucleotídeos se hibridiza a uma seqüência de ácidos nucléicos codificada por um gene que codifica uma proteína selecionada do grupo consistindo em a- amilase, arabinogalactana, calnexina, calreticulina, celulose sintase, proteína dirigente, expansina, extensina, galacturan 1,4-β- galacturonidase, glicose-1-fosfato adeniltransferase, glicosil transferase, glicosil hidrolase, glicosídeo hidrolase, proteínas ricas em hidroxiproli- na, manose-6-fosfato isomerase, manose-1 -fosfato guanililtransferase, nucleotidil transferase, pectinas, pectina metilesterase, fosfomanomuta- se, proteína de resposta de resistência a doença, poligalacturonase, expansina alergênica de pólen, enzima de ramificação de amido, amido sintase, sacarose-fosfato sintase, sacarose sintase, UTP-glicose-1- fosfato uridililtransferase, xiloglucano sintase, xiloglucano:xiloglicosil transferase, e Yieldin. Em outras modalidades, cada um dos dois ou mais oligonucleotídeos se hibridiza a uma seqüência de ácidos nucléi- cos codificada por um gene que codifica uma proteína diferente das citadas. Em outras realizações, cada um dos dois ou mais oligonucleo- tídeos se hibridiza a uma seqüência de ácidos nucléicos codificada por um gene diferente. Em outras modalidades, a combinação compreende de cerca de 2 a cerca de 5000 dos dois ou mais oligonucleotídeos. Em outras realizações, cada um dos dois ou mais oligonucleotídeos é rotulado com um rótulo detectável.

Em outras modalidades, a presente invenção refere-se a um micro-arranjo compreendendo a combinação acima provida em um suporte sólido, onde cada um dos ditos dois ou mais oligonucleotídeos ocupa um local único no dito suporte. Em outras realizações, a presen- te invenção refere-se a um kit para a detecção de expressão genética compreendendo o micro-arranjo acima juntamente com um ou mais tampões ou reagentes para uma reação de hibridização de nucleotídeo.

Em outras modalidades, a presente invenção refere-se a um método para detectar um ou mais polinucleotídeos em uma amostra, compreendendo:

- o contato da amostra com dois ou mais oligonucleotí-

deos, onde cada oligonucleotídeo é capaz de se hibridizar a um gene compreendendo uma seqüência de ácidos nucléicos selecionada do grupo consistindo nas SEQ ID Nos.: 1-230 sob condições padrão de hibridização; e

- a detecção de um ou mais polinucleotídeos de interesse

que estão hibridizados a um ou mais oligonucleotídeos. Em outras modalidades, cada um dos dois ou mais oligonucleotídeos se hibridiza a um gene compreendendo uma seqüência de ácidos nucléicos diferente selecionada do grupo consistindo nas SEQ ID Nos.: 1-230. Em outras realizações, pelo menos um dos dois ou mais oligonucleotídeos se hibridiza a uma região 3' não traduzida de um gene compreendendo uma seqüência de ácidos nucléicos selecionada do grupo consistindo nas SEQ ID Nos.: 1-230. Em outras modalidades, cada um dos dois ou mais oligonucleotídeos é compreendido por pouco mais de cerca de 100 bases nucleotídicas. Em outras realizações, pelo menos um dos dois ou mais oligonucleotídeos compreende uma seqüência de ácidos nucléicos selecionada do grupo consistindo nas SEQ ID Nos.: 461-690. Em outras modalidades, cada um dos dois ou mais oligonucleotídeos se hibridiza a um gene que codifica uma proteína selecionada do grupo consistindo em α-amilase, arabinogalactana, calnexina, calreticulina, celulose sintase, proteína dirigente, expansina, extensina, galacturan Μ-β-galacturonidase, glicose-1-fosfato adeniltransferase, glicosil transferase, glicosil hidrolase, glicosídeo hidrolase, proteínas ricas em hidroxiprolina, manose-6-fosfato isomerase, manose-1-fosfato guanilil- transferase, nucleotidil transferase, pectinas, pectina metilesterase, fosfomanomutase, proteína de resposta de resistência a doença, poliga- lacturonase, expansina alergênica de pólen, enzima de ramificação de amido, amido sintase, sacarose-fosfato sintase, sacarose sintase, UTP- glicose-1 -fosfato uridililtransferase, xiloglucano sintase, xilogluca- no:xiloglicosil transferase, e Yieldin. Em outras modalidades, cada um dos dois ou mais oligonucleotídeos se hibridiza a um gene que codifica uma proteína diferente entre as proteínas acima. Em outras realiza- ções, os dois ou mais oligonucleotídeos são providos sobre um suporte sólido, onde cada um dos dois ou mais oligonucleotídeos ocupa um local único no suporte sólido. Em outras modalidades, o suporte sólido compreende de cerca de 2 a cerca de 5000 dos dois ou mais oligonucle- otídeos. Em outras realizações, o presente método compreende Além disso, antes da etapa de contato, a etapa de amplificação de um ou mais polinucleotídeos ou seqüências de ácidos nucléicos. Em outras modalidades, o presente método compreende, além disso, antes da etapa de contato, a etapa de rotulagem dos um ou mais polinucleotí- deos ou seqüências de ácidos nucléicos na amostra com um rótulo detectável.

Em outras modalidades, a presente invenção refere-se a um método para detectar um ou mais seqüências de ácidos nucléicos codificadas por um ou polinucleotídeos em uma amostra, compreen- dendo:

- contato da amostra com dois ou mais oligonucleotídeos, onde cada oligonucleotídeo é capaz de se hibridizar a uma seqüência de ácidos nucléicos codificada por um gene compreendendo uma seqüên- cia de ácidos nucléicos selecionada do grupo consistindo nas SEQ ID Nos.: 1-230 sob condições padrão de hibridização; e

- a detecção de uma ou mais seqüências de ácidos nu- cléicos que estão hibridizadas a um ou mais oligonucleotídeos. Em outras realizações, cada um dos dois ou mais oligonucleotídeos se hibridiza a uma seqüência de ácidos nucléicos codificada por um gene compreendendo uma seqüência de ácidos nucléicos diferente seleciona- da do grupo consistindo nas SEQ ID Nos.: 1-230. Em outras modalida- des, pelo menos um dos dois ou mais oligonucleotídeos se hibridiza a uma região 3' não traduzida de um gene compreendendo uma seqüên- cia de ácidos nucléicos selecionada do grupo consistindo nas SEQ ID Nos.: 1-230. Em outras realizações, cada um dos dois ou mais oligonu- cleotídeos é compreendido por pouco mais de cerca de 100 bases nucleotídicas. Em outras modalidades, pelo menos um dos dois ou mais oligonucleotídeos compreende uma seqüência de ácidos nucléicos selecionada do grupo consistindo nas SEQ ID Nos.: 461-690. Em outras realizações, cada um dos dois ou mais oligonucleotídeos se hibridiza a uma seqüência de ácidos nucléicos codificada por um gene que codifica uma proteína selecionada do grupo consistindo em a- amilase, arabinogalactana, calnexina, calreticulina, celulose sintase, proteína dirigente, expansina, extensina, galacturan l,4-p-galacturo- nidase, glicose-1-fosfato adeniltransferase, glicosil transferase, glicosil hidrolase, glicosídeo hidrolase, proteínas ricas em hidroxiprolina, manose-6-fosfato isomerase, manose-1 -fosfato guanililtransferase, nucleotidil transferase, pectinas, pectina metilesterase, fosfomanomuta- se, proteína de resposta de resistência a doença, poligalacturonase, expansina alergênica de pólen, enzima de ramificação de amido, amido sintase, sacarose-fosfato sintase, sacarose sintase, UTP-glicose-1- fosfato uridililtransferase, xiloglucano sintase, xiloglucano:xiloglicosil transferase, e Yieldin. Em outras modalidades, cada um dos dois ou mais oligonucleotídeos se hibridiza a uma seqüência de ácidos nucléi- cos codificada por um gene que codifica uma proteína diferente entre as proteínas acima. Em outras realizações, os dois ou mais oligonucleotí- deos são providos sobre um suporte sólido, onde cada um dos dois ou mais oligonucleotídeos ocupa um local único no suporte sólido. Em outras modalidades, o suporte sólido compreende de cerca de 2 a cerca de 5000 dos dois ou mais oligonucleotídeos. Em outras realizações, o presente método compreende Além disso, antes da etapa de contato, a etapa de amplificação dos um ou mais polinucleotídeos ou seqüências de ácidos nucléicos. Em outras modalidades, o presente método compreende Além disso, antes da etapa de contato, a etapa de rotula- gem dos um ou mais polinucleotídeos ou seqüências de ácidos nucléi- cos na amostra com um rótulo detectável.

Breve Descrição das Figuras

A Figura 1 mostra a seqüência de aminoácidos específica da SEQ ID No.: 231.

A Figura 2mostra a seqüência de aminoácidos específica da SEQ ID No.: 232.

A Figura 3mostra a seqüência de aminoácidos específica da SEQ ID No.: 234.

A Figura 4mostra a seqüência de aminoácidos específica da SEQ ID No.: 235.

A Figura 5mostra a seqüência de aminoácidos específica da SEQ ID No.: 236.

A Figura 6mostra a seqüência de aminoácidos específica da SEQ ID No.: 237.

A Figura 7mostra a seqüência de aminoácidos específica da SEQ ID No.: 238.

A Figura 8mostra a seqüência de aminoácidos específica da SEQ ID No.: 239.

A Figura 9mostra a seqüência de aminoácidos específica da SEQ ID No.: 240.

A Figura 10 mostra a seqüência de aminoácidos especí- fica da SEQ ID No.: 241. A Figura 11 fica da SEQ ID No.: 242.

A Figura 12 fica da SEQ ID No.: 243.

A Figura 13 fica da SEQ ID No.: 244.

A Figura 14 fica da SEQ ID No.: 245.

A Figura 15 fica da SEQ ID No.: 246.

A Figura 16 fica da SEQ ID No.: 248.

A Figura 17 fica da SEQ ID No.: 249.

A Figura 18 fica da SEQ ID No.: 250.

A Figura 19 fica da SEQ ID No.: 251.

A Figura 20 fica da SEQ ID No.: 252.

A Figura 21 fica da SEQ ID No.: 253.

A Figura 22 fica da SEQ ID No.: 254.

A Figura 23 fica da SEQ ID No.: 255.

A Figura 24 fica da SEQ ID No.: 256.

A Figura 25 fica da SEQ ID No.: 257.

A Figura 26

23/185

mostra a seqüência de aminoácidos especí mostra a seqüência de aminoácidos especí mostra a seqüência de aminoácidos especí- mostra a seqüência de aminoácidos especí- mostra a seqüência de aminoácidos especí- mostra a seqüência de aminoácidos especí- mostra a seqüência de aminoácidos especí- mostra a seqüência de aminoácidos especí- mostra a seqüência de aminoácidos especí- mostra a seqüência de aminoácidos especí- mostra a seqüência de aminoácidos especí- mostra a seqüência de aminoácidos especí- mostra a seqüência de aminoácidos especí- mostra a seqüência de aminoácidos especí- mostra a seqüência de aminoácidos especí- mostra a seqüência de aminoácidos especí- fica da SEQ ID No.: 259. A Figura 27 fica da SEQ ID No.: 260.

A Figura 28 fica da SEQ ID No.: 261.

A Figura 29 fica da SEQ ID No.: 262.

A Figura 30 fica da SEQ ID No.: 263. A Figura 31

fica da SEQ ID No.: 264.

A Figura 32 fica da SEQ ID No.: 265.

A Figura 33 fica da SEQ ID No.: 266.

A Figura 34 fica da SEQ ID No.: 267.

A Figura 35 fica da SEQ ID No.: 268. A Figura 36

fica da SEQ ID No.: 269.

A Figura 37 fica da SEQ ID No.: 270.

A Figura 38 fica da SEQ ID No.: 271.

A Figura 39 fica da SEQ ID No.: 272.

A Figura 40 fica da SEQ ID No.: 273. A Figura 41

fica da SEQ ID No.: 274.

A Figura 42

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mostra a seqüência de aminoácidos especí- mostra a seqüência de aminoácidos especí- mostra a seqüência de aminoácidos especí- mostra a seqüência de aminoácidos especí- mostra a seqüência de aminoácidos especí- mostra a seqüência de aminoácidos especí- mostra a seqüência de aminoácidos especí- mostra a seqüência de aminoácidos especí- mostra a seqüência de aminoácidos especí- mostra a seqüência de aminoácidos especí-

mostra a seqüência de aminoácidos especí- mostra a seqüência de aminoácidos especí- mostra a seqüência de aminoácidos especí- mostra a seqüência de aminoácidos especí- mostra a seqüência de aminoácidos especí- mostra a seqüência de aminoácidos especí- fica da SEQ ID No.: 275. A Figura 43 fica da SEQ ID No.: 276.

A Figura 44 fica da SEQ ID No.: 277.

A Figura 45 fica da SEQ ID No.: 278.

A Figura 46 fica da SEQ ID No.: 279.

A Figura 47 fica da SEQ ID No.: 280.

A Figura 48 fica da SEQ ID No.: 281.

A Figura 49 fica da SEQ ID No.: 282.

A Figura 50 fica da SEQ ID No.: 283.

A Figura 51 fica da SEQ ID No.: 284.

A Figura 52 fica da SEQ ID No.: 285.

A Figura 53 fica da SEQ ID No.: 286.

A Figura 54 fica da SEQ ID No.: 287.

A Figura 55 fica da SEQ ID No.: 288.

A Figura 56 fica da SEQ ID No.: 289.

A Figura 57 fica da SEQ ID No.: 290.

A Figura 58

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mostra a seqüência de aminoácidos especí mostra a seqüência de aminoácidos especí mostra a seqüência de aminoácidos especí- mostra a seqüência de aminoácidos especí- mostra a seqüência de aminoácidos especí- mostra a seqüência de aminoácidos especí- mostra a seqüência de aminoácidos especí- mostra a seqüência de aminoácidos especí- mostra a seqüência de aminoácidos especí- mostra a seqüência de aminoácidos especí- mostra a seqüência de aminoácidos especí- mostra a seqüência de aminoácidos especí- mostra a seqüência de aminoácidos especí- mostra a seqüência de aminoácidos especí- mostra a seqüência de aminoácidos especí- mostra a seqüência de aminoácidos especí- fica da SEQ ID No.: 291. A Figura 59 fica da SEQ ID No.: 292.

A Figura 60 fica da SEQ ID No.: 293.

A Figura 61 fica da SEQ ID No.: 294.

A Figura 62 fica da SEQ ID No.: 295.

A Figura 63 fica da SEQ ID No.: 296.

A Figura 64 fica da SEQ ID No.: 297.

A Figura 65 fica da SEQ ID No.: 298.

A Figura 66 fica da SEQ ID No.: 299.

A Figura 67 fica da SEQ ID No.: 300.

A Figura 68 fica da SEQ ID No.: 301.

A Figura 69 fica da SEQ ID No.: 302.

A Figura 70 fica da SEQ ID No.: 303.

A Figura 71 fica da SEQ ID No.: 304.

A Figura 72 fica da SEQ ID No.: 305.

A Figura 73 fica da SEQ ID No.: 306.

A Figura 74

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mostra a seqüência de aminoácidos especí mostra a seqüência de aminoácidos especí- mostra a seqüência de aminoácidos especí- mostra a seqüência de aminoácidos especí- mostra a seqüência de aminoácidos especí- mostra a seqüência de aminoácidos especí- mostra a seqüência de aminoácidos especí- mostra a seqüência de aminoácidos especí- mostra a seqüência de aminoácidos especí- mostra a seqüência de aminoácidos especí- mostra a seqüência de aminoácidos especí- mostra a seqüência de aminoácidos especí- mostra a seqüência de aminoácidos especí- mostra a seqüência de aminoácidos especí- mostra a seqüência de aminoácidos especí- mostra a seqüência de aminoácidos especí- fica da SEQ ID No.: 307. A Figura 75 fica da SEQ ID No.: 308.

A Figura 76 fica da SEQ ID No.: 309.

A Figura 77 fica da SEQ ID No.: 310.

A Figura 78 fica da SEQ ID No.: 311.

A Figura 79 fica da SEQ ID No.: 312.

A Figura 80 fica da SEQ ID No.: 313.

A Figura 81 fica da SEQ ID No.: 314.

A Figura 82 fica da SEQ ID No.: 315.

A Figura 83 fica da SEQ ID No.: 316.

A Figura 84 fica da SEQ ID No.: 317.

A Figura 85 fica da SEQ ID No.: 318.

A Figura 86 fica da SEQ ID No.: 319.

A Figura 87 fica da SEQ ID No.: 320.

A Figura 88 fica da SEQ ID No.: 321.

A Figura 89 fica da SEQ ID No.: 322.

A Figura 90

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mostra a seqüência de aminoácidos especí mostra a seqüência de aminoácidos especí mostra a seqüência de aminoácidos especí- mostra a seqüência de aminoácidos especí- mostra a seqüência de aminoácidos especí- mostra a seqüência de aminoácidos especí- mostra a seqüência de aminoácidos especí- mostra a seqüência de aminoácidos especí- mostra a seqüência de aminoácidos especí- mostra a seqüência de aminoácidos especí- mostra a seqüência de aminoácidos especí- mostra a seqüência de aminoácidos especí- mostra a seqüência de aminoácidos especí- mostra a seqüência de aminoácidos especí- mostra a seqüência de aminoácidos especí- mostra a seqüência de aminoácidos especí- fica da SEQ ID No.: 323. A Figura 91 fica da SEQ ID No.: 324.

A Figura 92 fica da SEQ ID No.: 325.

A Figura 93 fica da SEQ ID No.: 326.

A Figura 94 fica da SEQ ID No.: 327.

A Figura 95 fica da SEQ ID No.: 328.

A Figura 96 fica da SEQ ID No.: 329.

A Figura 97 fica da SEQ ID No.: 330.

A Figura 98 fica da SEQ ID No.: 331.

A Figura 99 fica da SEQ ID No.: 332.

A Figura 100 fica da SEQ ID No.: 333.

A Figura 101 fica da SEQ ID No.: 334.

A Figura 102 fica da SEQ ID No.: 335.

A Figura 103 fica da SEQ ID No.: 336.

A Figura 104 fica da SEQ ID No.: 337.

A Figura 105 fica da SEQ ID No.: 338.

A Figura 106

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mostra a seqüência de aminoácidos especí mostra a seqüência de aminoácidos especí mostra a seqüência de aminoácidos especí- mostra a seqüência de aminoácidos especí- mostra a seqüência de aminoácidos especí- mostra a seqüência de aminoácidos especí- mostra a seqüência de aminoácidos especí- mostra a seqüência de aminoácidos especí- mostra a seqüência de aminoácidos especí- mostra a seqüência de aminoácidos especí- mostra a seqüência de aminoácidos especí- mostra a seqüência de aminoácidos especí- mostra a seqüência de aminoácidos especí- mostra a seqüência de aminoácidos especí- mostra a seqüência de aminoácidos especí- mostra a seqüência de aminoácidos especí- fica da SEQ ID No.: 339.

A Figura 107 fica da SEQ ID No.: 340.

A Figura 108 fica da SEQ ID No.: 341.

A Figura 109 fica da SEQ ID No.: 342.

A Figura 110 fica da SEQ ID No.: 343. A Figura 111

fica da SEQ ID No.: 344.

A Figura 112 fica da SEQ ID No.: 345.

A Figura 113 fica da SEQ ID No.: 346.

A Figura 114 fica da SEQ ID No.: 347.

A Figura 115 fica da SEQ ID No.: 348. AFiguralló

fica da SEQ ID No.: 349.

A Figura 117 fica da SEQ ID No.: 350.

A Figura 118 ficada SEQ ID No.: 351.

A Figura 119 fica da SEQ ID No.: 352.

A Figura 120 fica da SEQ ID No.: 353. A Figura 121

fica da SEQ ID No.: 354.

A Figura 122

mostra a seqüência de aminoácidos especí-

mostra a seqüência de aminoácidos especí- fica da SEQ ID No.: 355. A Figura 123 fica da SEQ ID No.: 356.

A Figura 124 fica da SEQ ID No.: 357.

A Figura 125 fica da SEQ ID No.: 358.

A Figura 126 fica da SEQ ID No.: 359.

A Figura 127 fica da SEQ ID No.: 360.

A Figura 128 fica da SEQ ID No.: 361.

A Figura 129 fica da SEQ ID No.: 362.

A Figura 130 fica da SEQ ID No.: 363.

A Figura 131 fica da SEQ ID No.: 364.

A Figura 132 fica da SEQ ID No.: 365.

A Figura 133 fica da SEQ ID No.: 366.

A Figura 134 fica da SEQ ID No.: 367.

A Figura 135 fica da SEQ ID No.: 368.

A Figura 136 fica da SEQ ID No.: 369.

A Figura 137 fica da SEQ ID No.: 370.

A Figura 138

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mostra a seqüência de aminoácidos especí mostra a seqüência de aminoácidos especí- mostra a seqüência de aminoácidos especí- mostra a seqüência de aminoácidos especí- mostra a seqüência de aminoácidos especí- mostra a seqüência de aminoácidos especí- mostra a seqüência de aminoácidos especí- mostra a seqüência de aminoácidos especí- mostra a seqüência de aminoácidos especí- mostra a seqüência de aminoácidos especí- mostra a seqüência de aminoácidos especí- mostra a seqüência de aminoácidos especí- mostra a seqüência de aminoácidos especí- mostra a seqüência de aminoácidos especí- mostra a seqüência de aminoácidos especí- mostra a seqüência de aminoácidos especí- fica da SEQ ID No.: 371.

A Figura 139 mostra a seqüência de aminoácidos especí fica da SEQ ID No.: 372.

A Figura 140 mostra a seqüência de aminoácidos especí fica da SEQ ID No.: 373.

A Figura 141 mostra a seqüência de aminoácidos especí- fica da SEQ ID No.: 374.

A Figura 142 mostra a seqüência de aminoácidos especí- fica da SEQ ID No.: 375.

A Figura 143 mostra a seqüência de aminoácidos especí- fica da SEQ ID No.: 376.

A Figura 144 mostra a seqüência de aminoácidos especí- fica da SEQ ID No.: 377.

A Figura 145 mostra a seqüência de aminoácidos especí- fica da SEQ ID No.: 378.

A Figura 146 mostra a seqüência de aminoácidos especí- fica da SEQ ID No.: 380. A assinatura da família 17 está em negrito.

A Figura 147 mostra a seqüência de aminoácidos especí- fica da SEQ ID No.: 381.

A Figura 148 mostra a seqüência de aminoácidos especí- fica da SEQ ID No.: 382.

A Figura 149 mostra a seqüência de aminoácidos especí- fica da SEQ ID No.: 383.

A Figura 150 mostra a seqüência de aminoácidos especí- fica da SEQ ID No.: 384.

A Figura 151 mostra a seqüência de aminoácidos especí- fica da SEQ ID No.: 385.

A Figura 152 mostra a seqüência de aminoácidos especí- fica da SEQ ID No.: 386.

A Figura 153 mostra a seqüência de aminoácidos especí- fica da SEQ ID No.: 387.

A Figura 154 mostra a seqüência de aminoácidos especí- fica da SEQ ID No.: 388. A Figura 155 fica da SEQ ID No.: 389.

A Figura 156 fica da SEQ ID No.: 390.

A Figura 157 fica da SEQ ID No.: 391.

A Figura 158 fica da SEQ ID No.: 392.

A Figura 159 fica da SEQ ID No.: 393.

A Figura 160 fica da SEQ ID No.: 394.

A Figura 161 fica da SEQ ID No.: 395.

A Figura 162 fica da SEQ ID No.: 396.

A Figura 163 fica da SEQ ID No.: 397.

A Figura 164 fica da SEQ ID No.: 398.

A Figura 165 fica da SEQ ID No.: 399.

A Figura 166 fica da SEQ ID No.: 400.

A Figura 167 fica da SEQ ID No.: 401.

A Figura 168 fica da SEQ ID No.: 402.

A Figura 169 fica da SEQ ID No.: 403.

A Figura 170

32/185

mostra a seqüência de aminoácidos especí mostra a seqüência de aminoácidos especí mostra a seqüência de aminoácidos especí mostra a seqüência de aminoácidos especí- mostra a seqüência de aminoácidos especí- mostra a seqüência de aminoácidos especí- mostra a seqüência de aminoácidos especí- mostra a seqüência de aminoácidos especí- mostra a seqüência de aminoácidos especí- mostra a seqüência de aminoácidos especí- mostra a seqüência de aminoácidos especí- mostra a seqüência de aminoácidos especí- mostra a seqüência de aminoácidos especí- mostra a seqüência de aminoácidos especí- mostra a seqüência de aminoácidos especí- mostra a seqüência de aminoácidos especí- fica da SEQ ID No.: 404. A Figura 171 fica da SEQ ID No.: 405.

A Figura 172 fica da SEQ ID No.: 406.

A Figura 173 fica da SEQ ID No.: 407.

A Figura 174 fica da SEQ ID No.: 408.

A Figura 175 fica da SEQ ID No.: 409.

A Figura 176 fica da SEQ ID No.: 410.

A Figura 177 fica da SEQ ID No.: 411.

A Figura 178 fica da SEQ ID No.: 412.

A Figura 179 fica da SEQ ID No.: 413.

A Figura 180 fica da SEQ ID No.: 414.

A Figura 181 fica da SEQ ID No.: 415.

A Figura 182 fica da SEQ ID No.: 416.

A Figura 183 fica da SEQ ID No.: 417.

A Figura 184 fica da SEQ ID No.: 418.

A Figura 185 fica da SEQ ID No.: 419.

A Figura 186

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mostra a seqüência de aminoácidos especí mostra a seqüência de aminoácidos especí mostra a seqüência de aminoácidos especí- mostra a seqüência de aminoácidos especí- mostra a seqüência de aminoácidos especí- mostra a seqüência de aminoácidos especí- mostra a seqüência de aminoácidos especí- mostra a seqüência de aminoácidos especí- mostra a seqüência de aminoácidos especí- mostra a seqüência de aminoácidos especí- mostra a seqüência de aminoácidos especí- mostra a seqüência de aminoácidos especí- mostra a seqüência de aminoácidos especí- mostra a seqüência de aminoácidos especí- mostra a seqüência de aminoácidos especí- mostra a seqüência de aminoácidos especí- fica da SEQ ID No.: 420. A Figura 187 fica da SEQ ID No.: 421.

A Figura 188 fica da SEQ ID No.: 422.

A Figura 189 fica da SEQ ID No.: 423.

A Figura 190 fica da SEQ ID No.: 424. A Figura 191

fica da SEQ ID No.: 425.

A Figura 192 fica da SEQ ID No.: 426.

A Figura 193 fica da SEQ ID No.: 427.

A Figura 194 fica da SEQ ID No.: 428.

A Figura 195 fica da SEQ ID No.: 429. A Figura 196

fica da SEQ ID No.: 430.

A Figura 197 fica da SEQ ID No.: 431.

A Figura 198 fica da SEQ ID No.: 432.

A Figura 199 fica da SEQ ID No.: 433.

A Figura 200 fica da SEQ ID No.: 434. A Figura 201

fica da SEQ ID No.: 435.

A Figura 202

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mostra a seqüência de aminoácidos especí- mostra a seqüência de aminoácidos especí- mostra a seqüência de aminoácidos especí- mostra a seqüência de aminoácidos especí- mostra a seqüência de aminoácidos especí- mostra a seqüência de aminoácidos especí- mostra a seqüência de aminoácidos especí- mostra a seqüência de aminoácidos especí- mostra a seqüência de aminoácidos especí- mostra a seqüência de aminoácidos especí- mostra a seqüência de aminoácidos especí- mostra a seqüência de aminoácidos especí- mostra a seqüência de aminoácidos especí- mostra a seqüência de aminoácidos especí- mostra a seqüência de aminoácidos especí- mostra a seqüência de aminoácidos especí- fica da SEQ ID No.: 436. A Figura 203 fica da SEQ ID No.: 437.

A Figura 204 fica da SEQ ID No.: 438.

A Figura 205 fica da SEQ ID No.: 439.

A Figura 206 fica da SEQ ID No.: 440.

A Figura 207 fica da SEQ ID No.: 441.

A Figura 208 fica da SEQ ID No.: 442.

A Figura 209 fica da SEQ ID No.: 443.

A Figura 210 fica da SEQ ID No.: 444.

A Figura 211 fica da SEQ ID No.: 445.

A Figura 212 fica da SEQ ID No.: 446.

A Figura 213 fica da SEQ ID No.: 447.

A Figura 214 fica da SEQ ID No.: 448.

A Figura 215 fica da SEQ ID No.: 449.

A Figura 216 fica da SEQ ID No.: 450.

A Figura 217 fica da SEQ ID No.: 451.

A Figura 218

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mostra a seqüência de aminoácidos especí- mostra a seqüência de aminoácidos especí- mostra a seqüência de aminoácidos especí- mostra a seqüência de aminoácidos especí- mostra a seqüência de aminoácidos especí- mostra a seqüência de aminoácidos especí- mostra a seqüência de aminoácidos especí- mostra a seqüência de aminoácidos especí- mostra a seqüência de aminoácidos especí- mostra a seqüência de aminoácidos especí- mostra a seqüência de aminoácidos especí- mostra a seqüência de aminoácidos especí- mostra a seqüência de aminoácidos especí- mostra a seqüência de aminoácidos especí- mostra a seqüência de aminoácidos especí- mostra a seqüência de aminoácidos especí- 10

fica da SEQ ID No.: 452.

A Figura 219 fica da SEQ ID No.: 453.

A Figura 220 fica da SEQ ID No.: 454.

A Figura 221 fica da SEQ ID No.: 455.

A Figura 222 fica da SEQ ID No.: 458.

A Figura 223 fica da SEQ ID No.: 459.

A Figura 224 fica da SEQ ID No.: 460.

A Figura 225

pWVK223.

A Figura 226

pOXl.

A Figura 227

pOX16.

A Figura 228

pOX2.

20

mostra a seqüência de aminoácidos especí- mostra a seqüência de aminoácidos especí- mostra a seqüência de aminoácidos especí- mostra a seqüência de aminoácidos especí- mostra a seqüência de aminoácidos especí- mostra a seqüência de aminoácidos especí- mostra a representação esquemática do mostra a representação esquemática do mostra a representação esquemática do mostra a representação esquemática do

Descrição Detalhada da Invenção

A presente invenção provê polinucleotídeos isolados que dificam madeira e proteínas da parede celular.

co-

A transformação de uma planta com uma seqüência de po-

linucleotídeo que codifica uma proteína envolvida no desenvolvimento de madeira e/ou parede celular pode ser empregada para modificar propriedades tais como síntese de celulose, depósito de lignina, aspec- tos do desenvolvimento de madeira, desenvolvimento floral, desenvolvi- mento radicular, ramificação, respostas sazonais tais como controle à luz e ao frio na identidade do meristema, e resistência a doenças. A este propósito, a presente invenção provê uma seqüência de polinucleo- tídeo que codifica uma seqüência de polipeptídeo apresentando uma função na síntese e/ou desenvolvimento da parede celular. A presente invenção provê também uma construção de DNA contendo um promotor operativamente ligado a uma seqüência de polinucleotídeo, onde a dita seqüência de polinucleotídeo codifica uma proteína envolvida no desenvolvimento da parede celular vegetal. Além disso, a invenção provê métodos para ensaio da expressão de uma proteína envolvida no desenvolvimento de parede celular vegetal, métodos para utilização de uma proteína de parede celular vegetal para modificar o crescimento, desenvolvimento de madeira e/ou composição de fibra em uma planta.

A presente invenção utiliza termos e frases que são bem co- nhecidos dos praticantes da técnica. A não ser que definidos de outra forma, todos os termos técnicos e científicos utilizados aqui apresentam o mesmo significado que comumente utilizado por um especialista na técnica à qual a invenção pertence. Em geral, a nomenclatura utilizada aqui e os procedimentos de laboratório em cultura celular, genética molecular, e química e hibridização do ácido nucléico descritos aqui são aqueles bem conhecidos e comumente empregados na técnica. Técni- cas padrão são utilizadas para métodos de recombinação de ácido nucléico, síntese de polinucleotídeo, cultura microbiana, cultura celular, cultura de tecidos, transformação, transfecção, química analíti- ca, química sintética orgânica, síntese química, análise química, e formulação e administração farmacêuticas. Em geral, reações enzimá- ticas e etapas de purificação e/ou isolamento são realizadas de acordo com as especificações dos fabricantes. As técnicas e procedimentos são geralmente realizados de acordo com metodologia convencional (Molecu- lar Cloning, A Laboratory Manual, 3a edição, editado por Sambrook &

Russel Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 2001). A - Genes e Proteínas Vegetais de Madeira e Genes e Proteínas de Parede Celular

Alfa-amilase: A alfa-amilase funciona como uma hidrolase de amido importante e hidrolisa ligações alfa-l,4-glucano. A transcri- ção de alfa-amilase ocorre em resposta a uma variedade de sinais hormonais, metabólicos e ambientais. A análise de seqüência de alfa- amilases clonadas revela que estas recaem em duas classes principais e três famílias, revisado por Mitsui e Itoh, Trends in Plant Science 2 (7), 255-261 (1997), são importantes na mobilização de compostos de armazenagem de endospermas durante a germinação para suprimento do embrião com nutrientes.

Agrobactéria: como bem conhecido na técnica, as Agrobac- teria que são utilizadas para a transformação de células vegetais são derivados desativados e virulentos, usualmente, de Agrobacterium tumefaciens ou Agrobacterium rhizogenes que contêm um vetor. O vetor tipicamente contém um polinucleotídeo desejado que é localizado entre as bordas de um t-DNA.

Angiosperma: plantas vasculares apresentando sementes encerradas em um ovário. As angiospermas são plantas de sementes que produzem flores que geram frutos. As angiospermas são divididas em plantas dicotiledôneas e monocotiledôneas.

Arabinogalactana: proteínas de arabinogalactana (AGPs) são uma família de proteínas da parede celular que são glicoproteínas ricas em hidroxiprolina glicosiladas e acredita-se que desempenhem papéis importantes em vários aspectos do crescimento e desenvolvimen- to vegetal. Revisado por Showalter, A.M. Cell Mol Life Sei. 58(10): 1399- 417 (2001). Especificamente, as AGPs estão envolvidas durante o desenvolvimento vegetativo, reprodutivo e crescimento celular, bem como na morte celular programada e sinalização celular. Proteína regulada por Brassinosteróide: brassinosteróides são uma classe de hormônios esteroidais que regulam o crescimento e desenvolvimento vegetais. Uma proteína regulada por brassinosteróide (BRU) é uma proteína induzida por brassinosteróide que funciona como uma xiloglucana endotransferase (XET). Zurek, D.M., e Clouse, S.D. Plant Physiol. 104 (1) 161-170 (1994). Subseqüentemente, XETs induzidas por brassinolídeo similares foram caracterizadas em Arabi- dopsis (Xu e colaboradores, Plant J. 9, 879-889 (1996)), arroz (Uozu e colaboradores, Plant Physiol. 122, 853-859 (2000)), e tomate (Kokae colaboradores, Plant Physiol. 122, 85-98 (2000)), demonstrando que a indução de XETs se correlaciona com o afrouxamento da parede celular durante o crescimento induzido por brassinolídeo.

P-l,3-Bndoglucanase: as P~l,3-endoglucanases são carac- terizadas como proteínas relacionadas à patogênese (PR), por que sua expressão em uma planta é freqüentemente induzida pro ataque de patógeno. Elas desempenham um papel importante da defesa da planta, seja diretamente através da degradação de β-1,3/ 1,6-glucanas na parede celular do patógeno, seja indiretamente pela liberação de produtores de oligossacarídeos que induzem defesas vegetais adicionais (Kauffmann e colaboradores, (1987) TheEmbo Journal 6(11) 3209-3212, Bowles e colaboradores, (1990) Annu. Rev. Biochem. 59, 873-907, Rose e colaboradores, (2002) The Plant Cell 14, 1329-1345)). A super- expressão de β-l,3-endoglucanases mostrou-se útil na proteção de plantas contra patógenos, conforme demonstrado pela transformação de uma p-l,3-endoglucanase de soja em tabaco (Borkowska M e colaboradores, Z. Naturforsch [C]. (1998) 53(11-12):1012-10166). Embora o interesse principal em p-l,3-endoglucanases derive em seu papel na defesa vegetal, elas foram também implicadas em um número de processos fisiológicos e de desenvolvimento na planta não infectada incluindo divisão celular, microsporogênese, germinação de pólen e crescimento de túbulo, fertilização, embriogênese, amadurecimento de fruto, germinação de semente, mobilização de reservas armazenadas no endosperma de grãos de cereais, dormência de botão floral e resposta a ferimento, frio, ozônio e UV B (para revisão ver Leubner-Metzer e Meins em Pathogensis-related proteins in plants. Datta e Muthukrishnan (eds.) CRC Press LLC, Boco Raton, Florida, pp. 49-76 (1999)).

β-1 >3-glucanase: um outro nome para P-l,3-endoglucanase (EC 3.2.1.39).

β-D-glucano exohidrolase: são amplamente distribuídas entre leveduras e fungos filamentosos. Tal como as 1,3-endoglucana- ses, as exo-l,3-p-glucanases (EC 3.2.1.58) hidrolizam as ligações O- glicosídicas de glucanas ligadas em 1,3-β. Enquanto que as β-1,3- endoglucanases clivam ligações 1,3-β internas em locais randômicos ao longo da cadeia polissacarídica, liberando oligossacarídeos curtos, as exo-l,3^-glucanases liberam seqüencialmente resíduos de alfa-glicose a partir do terminal não redutor de l,3^-D-glucanas. Em Saeeharomy- ces cerevisiae existe a evidência que sugere que participam em modifi- cações da parede celular ou na esporulação (Muthukumar e colabora- dores, (1993) JournalofBacteriology 175(2) 386-396).

β-glicosidase: (EC 3.2.1.21) é responsável pela hidrólise de terminal de resíduos de β-D-glicose não redutores com a liberação de β- D-glicose. A enzima foi encontrada em plantas, animais, bactérias e fungos. Em plantas, β-glicosidades são reportadas como funcionando no metabolismo de fito-hormônio (Smith e van Staden (1978) J. Exp. Bot. 29:1067-1073), na defesa contra patógenos e herbívoros (Poulton (1990) PlantPhysiol 94:401-405 (1990), Li e colaboradores, (2005) Aeta Bioehim. Biophys. Sin (Shanghai). Jun; 37(6):363-70), e na lignificação (Hahlbrock e Grsebach (1979) Ann. Rev. PlantPhyiol 30:105-130).

β-xilosidase: (EC 3.2.1.37) também conhecida como xilano l,4^-xilosidase catalisa a hidrólise de l,4^-D-xilanos, para remover sucessivos resíduos de D-xilose a partir de terminais não redutores. Reportou-se que ocorrem amplamente em microrganismos, fungos, animais e recentemente em plantas. Em Arabidopsis foi proposto que β-xilosidase desempenha um papel no metabolismo de parede celular secundária e no desenvolvimento vegetal (Goujon e colaboradores, (2003) Plant J. 33:677-690, Minic e colaboradores, (2005) Plant Physio- Iogy 135:867-878).

Calnexina: a calnexina é uma molécula endoplasmática de retículo ligada a membrana. A calnexina se liga especificamente a glucanas N-Iigadas monoglicosiladas e acredita-se que desempenhem um papel na biossíntese da parede celular. Foi demonstrado em levedura que a calnexina é requerida para a biossíntese e desenvolvi- mento da parede celular. Por exemplo, uma cepa de S. cerevisiae com calnexina (designada CNE l·) mostrou um desenvolvimento de parede celular anormal. Desta forma, foi sugerido que a calnexina desempe- nha um papel tanto na secreção de proteína quanto na síntese de parede celular.

Calreticulina: a calreticulina é uma proteína multifuncio- nal de ligação a cálcio encontrada no retículo endoplasmático da maioria das células eucarióticas. Em células de mamífero, a quebra de glicoses está conectada a um ciclo molecular de chaperona envolvendo duas chaperonas semelhantes a lecitina, calnexina e calreticulina. Semelhante à calnexina, acredita-se que a calreticulina desempenhe um papel na biossíntese da parede celular.

Celulase: celulase refere-se a qualquer e todas as enzimas que catalisam a clivagem de materiais celulósicos ou lignocelulósicos. Vários genes que codificam endoglucanases do fungo Trichoderma reesi são conhecidos e têm sido sucessivamente incorporados e expressos em levedura. Pentilla e colaboradores, Yeast 3:115-185 (1987). Ascelula- ses são classificadas em dois grandes subgrupos com base no fato de se catalisam a clivagem a partir das extremidades da cadeia de celulose (exocelulases) ou se catalisam a clivagem no meio da cadeia de celulose (endocelulases).

Celulose sintase: acredita-se que a celulose sintase se en- contre na membrana plasmática como um complexo multi-subunidade chamado de uma roseta, e libere p-l,4-glucana na matriz extracelular. Uma maior proximidade de subunidades no complexo roseta possivel- mente facilita a ligação de hidrogênio de cadeias de glucana individuais em feixes cerrados de diâmetro característico de microfibrilas de celulose.

As plantas superiores contêm um grande número de genes proximamente relacionados, a família CesA, que codifica um componen- te catalítico da celulose sintase. Não se sabe se outros polipeptídeos são requeridos para formar uma celulose sintase ativa e pouco se sabe a propósito da regulação de sua atividade. Entretanto, porque o depósito de microfibrilas de celulose é tipicamente orientado em relação ao eixo da expansão celular, foi proposta uma interação entre a celulose sintase e o citoesqueleto cortical. Uma mutação sensível à temperatura em um dos genes CesA, rswl, leva a um fenótipo mutante caracterizado por células intumescidas que acredita-se refletem a incapacidade das células em resistir ou direcionar a expansão mediada pelo turgor. Sugimoto K., Williamson R.E., Wasteneys G.O. Protoplasma. 215(1- 4): 172-83 (2001). Fenótipos semelhantes foram gerados com inibidores químicos da biossíntese de celulose, indicando que a celulose na parede celular primária é necessária para o crescimento normal. (Delmer, D.P., e Amor, Y. (1995). Plant Cell 7, 987-1000; Scheible, W.R., Eshed, R., Richmond, T., Delmer. D., e Somerville, C.R. (2001). Proc. Natl Acad. Sei. USA 98, 10079-10084).

Quitinase: as quitinases catalisam a hidrólise de ligações 1,4-β de iV-acetil-β-D-glicosamida em quitina. Embora a quitina não seja um constituinte de plantas, muitas plantas sintetizam quitinases. Estas quitinases desempenham um papel na resistência da planta contra patógenos hidrolizando a quitina que é um componente comum das paredes celulares de fungos. Isto é suportado também por pesquisa que mostra que a expressão de quitinase em plantas leva a uma redução no dano causado por patógenos (Broglie e colaboradores, (1991) Science 254:1194-1197). Foi também sugerido que as quitinases desempenham um papel no desenvolvimento e crescimento vegetais, para uma revisão ver Kasprzewska, A. (2003) (Cellular & Molecular Biology Letters 8:809-824).

Polinucleotídeo pretendido: um polinucleotídeo desejado da presente invenção é um elemento genético, tal como um promotor, amplificador, ou terminador, ou gene ou polinucleotídeo, que deve ser transcrito e/ou traduzido em uma célula transformada que compreende o polinucleotídeo desejado em seu genoma. Se o polinucleotídeo desejado compreende uma seqüência que codifica um produto de proteína, a região de codificação pode ser operativamente ligada a elementos reguladores, tais como um promotor e um terminador, que possibilitam a expressão de um transcrito de RNA mensageiro associado e/ou um produto de proteína codificado pelo polinucleotídeo desejado. Desta forma, um "polinucleotídeo desejado" pode compreender um gene que é operativamente ligado na orientação 5' a 3', um promotor, um gene que codifica uma proteína, e um terminador. Alternativamente, o polinucleotídeo desejado pode compreender um gene ou fragmento deste, em uma orientação "senso" ou "anti-senso", a transcrição do qual produz ácidos nucléicos que podem afetar a expressão de um gene endógeno na célula vegetal. Um polinucleotídeo desejado pode também produzir por transcrição um produto de RNA de fita dupla iniciando a interferência de RNA de um gene ao qual o polinucleotídeo desejado está associado. Um polinucleotídeo desejado da presente invenção pode estar posicionado dentro de um t-DNA, de tal forma que as seqüências de borda esquerda e direita do t-DNA flanqueiam ou estão em cada lado do polinucleotídeo desejado. A presente invenção está voltada para a integração estável de um ou mais polinucleotídeos desejados no genoma de pelo menos uma célula vegetal. Um polinucleotídeo desejado pode ser mutado ou uma variante de sua seqüência do tipo selvagem. Entende-se que o todo ou parte do polinucleotídeo desejado pode ser integrado no genoma de uma planta. Entende-se também que o termo "polinucleotídeo desejado" engloba um ou mais de tais polinucleotídeos. Desta forma, um t-DNA da presente invenção pode compreender um, dois, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez, ou mais polinucleotí- deos desejados.

Planta dicotiledônea (dicot): uma planta florífera cujos embriões apresentam duas metades ou cotilédones, veios foliares ramificados, e partes florais em múltiplos de quatro ou cinco. Exemplos de dicotiledôneas incluem, mas sem limitação, Eucalyptus, Pupulus, Liquidamber, Acacia, teça, mogno, algodão, tabaco, Arabidopsis, tomate, batata, beterraba, brócolis, mandioca, batata doce, pimenta, poinsétia, feijão, alfafa, soja, cenoura, morango, alface, carvalho, bordo, casta- nheira, rosa, menta, abobrinha, margarida, gerânio, abacate e cactos.

Dirigente: proteínas dirigentes são uma classe única de proteínas vegetais que controlam o acoplamento de radicais livres durante a formação de lignina e lignificação. Gang, D.R. e colaborado- res, Chem. Biol 6(3): 143-51 (1999). a lignificação é um processo muito preciso e se movimenta a partir da parede externa da célula para dentro na direção da membrana plasmática, e mostrou-se que os locais de lignificação na parede externa abriga proteínas dirigentes. Davin, N.B. e N.G. Lewis. Plant Physiol 123(2):453-62 (2000). Estudos de imuno- localização de dirigente revelam reatividade cruzada com regiões particulares das paredes celulares lignificadas, estas sendo coincidentes com os locais conhecidos de início de deposição de lignina. Burlat, V. e colaboradores, Phytochemistry 57(6): 883-97 (2001). Endógeno refere-se a um gene que é nativo em um genoma

vegetal.

Expansina: as expansinas são uma classe de proteínas que regula a extensão da parede celular durante o crescimento. McQueen- Mason e colaboradores, Plant Cell 4:1425-1433 (1992). Em adição ao seu papel durante o afrouxamento da parede, acredita-se que as expansinas desempenhem papéis na extensão da parede celular, polinização e amadurecimento de fruto. Cosgrove, D.J. Proe Natl Acad Sci USA. 27:94(11):5504-5 (1997). As expansinas são comumente codificadas por várias famílias genéticas e foram classificadas divididas em duas subfamílias expansinas alfa e beta. As alfa-expansinas são um grupo altamente conservado de proteínas que hipoteticamente controlam o aumento da parede celular e outros processos de desenvol- vimento incluindo desmontagem da parede celular e separação celular. As beta-expansinas, previamente conhecidas como alergênicos de pólen de gramínea do grupo 1, são secretadas por pólen de gramínea e produzem efeitos de afrouxamento de parede nas paredes celulares de gramínea. As beta-expansinas são encontradas em tecidos não de pólen e podem desempenhar um papel de desenvolvimento no afrouxa- mento de parede.

Extensinas: extensinas são uma classe de glicoproteíns ricas em hidroxiprolina encontradas nas paredes celulares de plantas superiores. Acredita-se que as extensinas reforcem a parede celular por interações inter e intramolecular. Merkouropoulos, G. e colaboradores, Planta 208(2):212-9 (1999). As extensinas são normalmente expressas na raiz e são silenciosas na folha; entretanto, ferimentos revertem este padrão, ativando o gene na folha e reprimindo na raiz. Id. Tendo em vista que as extensinas são ativadas por vários sinais indutores de estresse, incluindo ferimento, jasmonato de metila, ácido salicílico e ácido abscísico, acredita-se que as extensinas desempenhem um papel de defesa pelo reforço e fortalecimento da parede celular. Composição de fibra: conforme utilizada aqui, composição de fibra refere-se ao traço que pode ser modificado para alterar a estrutura, aparência ou uso da fibra. Embora não limitante, traços que determinam a composição de fibra incluem comprimento de fibra, rugosidade, resistência, cor, seção transversal, e densidade de fibra. Por exemplo, sabe-se que o comprimento de fibra confere resistência, enquanto a rugosidade da fibra determina a textura e flexibilidade.

Exógeno: "exógeno" com relação a um ácido nucléico, signi- fica que este ácido nucléico é derivado de organismos não vegetais, ou derivados de uma planta que não é da mesma espécie que a planta a ser transformada ou não é derivado de uma planta que é fértil com a planta a ser transformada, não pertence à espécie da planta alvo. De acordo com a presente invenção, DNA ou RNA exógenos representam ácidos nucléicos que são de ocorrência natural na composição de fungos, bactérias, vírus, mamíferos, peixes ou pássaros, mas não são de ocorrência natural na planta a ser transformada. Desta forma, um ácido nucléico exógeno é um que codifica, por exemplo, um polipeptídeo que não é naturalmente produzido pela planta transformada. Um ácido nucléico exógeno não necessita codificar um proteína de proteína.

Galacturan 1,4-a-galacturonidase: galacturan 1,4-a-

galacturonidase (também chamada de exopoligalactouronase ou ExoPG) é uma enzima que degrada pectina. A ExpP degrada pectina removendo monômeros de galacturonato da cadeia de poligalacturonato componente de pectina. Pela utilização de imunoquímica e hibridização in situ, foi mostrado que em adição à sua presença no pólen, a ExoP está presente também em tecidos esporofíticos, tais como a camada celular e células mesofílicas. Dubald, M. e colaboradores, Plant J. 4(5):781-91 (1993). Acredita-se também que a ExoP exerça um papel durante a patogênese fúngica; por exemplo, uma nova ExoP foi identifi- cada como agente causa responsável pela "foot crown" e doença da podridão radicular em plantas de tomate. De Ias Heras, A. J. Appl Microbiol 94(5):856-64 (2003). Estes resultados sugerem uma função genérica para a ExoP na degradação da parede celular.

Gene: um gene é um segmento de uma molécula de DNA que contém todas as informações requeridas para a síntese de um produto, cadeia polipeptídica ou molécula de RNA que inclui tanto seqüências de codificação quanto seqüência não codificadoras.

Elemento genético: um "elemento genético" é qualquer se- qüência de nucleotídeos discreta tal como, mas, sem limitação, um promotor, gene, terminador, intron, amplificador, espaçador, região 5' não traduzida, região 3' não traduzida, ou sítio de reconhecimento de recombinase.

Modificação genética: introdução estável de DNA no ge- noma de certos organismos pela aplicação de métodos de biologia molecular e biologia celular.

Glicose-I-fosfato adeniltransferase: a glicose-1-fosfato adeniltransferase (AGP) catalisa uma das primeiras etapas comprometi- das na rota da biossíntese de amido, a produção de ADP-glicose a partir de glicose-1-fosfato e ATP. A AGP regula o acúmulo de amido, uma vez que AGP mutantes reduziram o acúmulo de amido. Wang S-M, Chu B., Lue W-L, Yu T-S, Eimert K, Chen J. (1997). Plant J. 11:1121-1126.

Glicosídeo hidrolase: glicosídeo hidrolases são uma das classes principais de enzimas ativas em carboidrato, glicosídeo hidrola- ses e glicosiltransferases. Freqüentemente demonstram uma estrutura modular: um domínio catalítico, responsável por uma reação de hidróli- se que quebra um glicosídeo, e um módulo de ligação a celulose, desprovido de atividade catalítica, mas que promove a adsorção da enzima em celulose cristalina insolúvel. Estão relacionadas em estru- tura às quitinases e à concanavalina A. Bernard Henrissat e Gideon J. Davies. " Glycoside Hydrolases and GlycosyItransferases. Families, Modules, and Implications for Genomics." Plant Physiol, dezembro 2000, Vol. 124, pp. 1515-1519.

Glicosil hidrolase: glicosil hidrolases são uma classe geral de enzimas que quebram ligações entre radicais sacarídeos. Esta classe inclui alfa-amilase, alfa-galactosidase, endo e exo-p-glucanases, etc.

Glicosil transferase: glicosil transferases são uma de duas classes importantes de enzimas ativas em carboidrato, glicosídeo hidrolases e glicosiltransferases. Freqüentemente mostram uma estrutura modular: um domínio catalítico, responsável por uma reação que adiciona radical glicosídeo, e um módulo de ligação a celulose, destituído de atividade catalítica, mas que promove a adsorção da enzima sobre celulose cristalina insolúvel. Estão relacionadas em estrutura às quitina sintases. Bernard Henrissat e Gideon J. Davies. aGlycoside Hydrolases and Glycosyltransferases. Famüies., Modules, and Implieations for Genomics." Plant Physiol, December 2000, Vol. 124, pp. 1515-1519.

Gimnosperma: conforme utilizada aqui, refere-se a uma planta de semente que carrega sementes sem ovários. Exemplos de gimnospermas incluem coníferas, cicadáceas, ginkgos, e efedras.

Hexose pirofosforilase: hexose pirofosforilases (EC 2.7.7.28) são uma classe de enzimas que apresentam atividade de transferase transferindo grupos contendo fósforo. Catalisam a reação: hexose-1-fosfato + nucleosídeo trifosfato = NDP-hexose + difosfato (Verachtert e colaboradores, (1966) Journal Biol. Chem. 241(9) 2007- 2013).

Proteínas ricas em hidroxiprolina: proteínas ricas em hi- droxiprolina (HRGPs) são uma grande classe de proteínas de parede celular vegetal e são as proteínas de parede celular melhor estudadas. Embora a função precisa das HRGPs permaneça desconhecida, as HRGPs são induzidas por ferimento e infecção com patógeno sugerindo um papel no reforço e fortalecimento da parede celular. Além disso, as HRGPs podem também prover sítios de nucleação para lignificação durante a formação de parede secundária. Vignols, F. Plant Mol Biol 39(5):945-52 (1999).

Introdução: conforme utilizado aqui, refere-se à inserção de uma seqüência de ácidos nucléicos em uma célula, por métodos incluindo infecção, transfecção, transformação ou transdução.

Juventude: descreve uma diferença fisiológica entre uma árvore jovem e uma árvore madura. Na presente invenção, juventude refere-se a diferenças no ângulo de microfibrila, densidade de madeira, rendimento em celulose, capacidade regenerativa, e capacidade repro- dutiva, entre uma árvore jovem e uma árvore madura. Por exemplo, foi mostrado que conforme um tecido vegetal amadurece, o tecido perde sua capacidade em regenerar.

Lignina: conforme utilizado aqui, refere-se a uma composi- ção polimérica composta de unidades fenilpropanóides, incluindo derivados polimerizados de monolignóis de álcool coniferílico, cumaríli- co, e sinapílico. Qualidade da lignina refere-se à capacidade de uma composição de lignina em conferir resistência a matrizes de parede celular, auxiliar no transporte de água, e/ou impedir a degradação dos polissacarídeos da parede celular. A composição de lignina ou a estrutura da lignina podem ser alteradas alterando-se as quantidades relativas de cada um dos monolignóis ou alterando-se o tipo de lignina. Por exemplo, guaiacil ligninas (derivadas principalmente de ácido ferúlico) são proeminentes em espécies de madeira macia, enquanto guaiacil-siringil ligninas (derivadas tanto de ácido ferúlico quanto de ácido sinápico) são características de espécies de madeira dura. A degradação de lignina de madeiras macias, tais como pinho, requer substancialmente mais álcalis e incubações mais prolongadas, em comparação com a remoção de lignina de madeiras duras. Além disso, a composição de lignina pode ser regulada ou pela super-regulação ou pela sub-regulação de enzimas envolvidas na biossíntese de lignina. Por exemplo, as enzimas chave na biossíntese de lignina incluem ácido 4-cumárico: coenzima A ligase (4CL), álcool cinamílico desidrogenase (CAD), e álcool sinapílico desidrogenase (SAD).

Manose-6-fosfato isomerase: a manose-6-fosfato isomera- se catalisa a interconversão de manose-6-fosfato para frutose-6-fosfato. Há falta distinta de literatura voltada para manose-6-fosfato isomerases vegetais, na medida em que não foi identificada em muitas plantas.

Manose-I-fosfato guanililtransferase: manose-1 -fosfato guanililtransferase catalisa a biossíntese de GDP-manose a partir de manose-6-fosfato e desempenha um papel na biossíntese da parede celular. Especificamente, acredita-se que a manose-1-fosfato guanilil- transferase represente a primeira etapa comprometida na formação de todos os nucleotídeos sacarídeos contendo guanosina vegetais, os quais são precursores da biossíntese da parede celular. Por exemplo, Arabi- dopsis cytl mutantes são deficientes em manose-1-fosfato guanilil- transferase e mostram um defeito grave na biogênese da parede celular. Lukowitz, N. e colaboradores, Proc Natl Acad Sci USA., 98(5):2262-7 (2001). Notavelmente, mutantes cytl mostram acúmulo de calose ectópica, paredes celulares incompletas, e uma redução de 5 vezes no teor de celulose. Id.

Planta monocotiledônea (monocot): uma planta florífera apresentando embriões com um cotilédone ou folha de semente, veias foliares paralelas, e partes florais em múltiplos de três. Exemplos de monocotiledôneas incluem, mas sem limitação, gramas, milho, arroz, aveia, trigo, cavada, sorgo, orquídeas, íris, lírio, cebola e palmeiras. Exemplos de gramas incluem, mas sem limitação, Agrostis spp. (espé- cies de "bentgrass" incluindo bentgrass colonial e bentgrasses rastei- ras), Poapratensis (grama azul do Kentucky), Lolium spp. (espécies de azevém incluindo azevém anual e azevém perene), Festuca arundinacea (festuca alta) Festuca rubra commutata (festuca fina), Cynodon dactylon (variedades da grama de bermuda comum incluindo Tifgreen, Tifway II, e Santa Ana, bem como híbridos destas); Pennisetum clandestinum (feno quicuio), Stenotaphrum secundatum (grana-santo-agostinho), Zoysia japonica (grama esmeralda), e Dichondra micrantha.

Nucleotidil transferase: [EC 2.7.7] qualquer membro de uma sub-classe de enzimas da classe das transferases que catalisa a transferência de um grupo nucleotidil de um grupo doador de nucleosí- deo di ou trifosfato para um grupo receptor. As nucleotidil transferases estão envolvidas em uma variedade de processos biológicos incluindo replicação e reparo, transcrição, processamento de RNA e replicação viral (Aravind e Koonin (1999) Nucleic Acid Research 27(7) 1609-1618).

Operativamente ligado: combinação de duas ou mais mo- léculas de uma maneira tal que em combinação funcionam apropria- damente em uma célula vegetal. Por exemplo, um promotor é ligado operativamente a um gene estrutural quando o promotor controla a transcrição do gene estrutural.

Pectinas: pectinas são polímeros complexos e acredita-se que realizem muitas funções, tais como determinação da porosidade da parede celular e provimento de superfícies carregadas para a modulação do pH da parede celular e equilíbrio iônico. Além disso, as pectinas podem desempenhar um papel na sinalização celular pelo reconheci- mento de compostos e então acionando uma resposta em uma cascata de desenvolvimento.

Pectina metilesterase: a pectina metilesterase catalisa a hidrólise de pectina em pectato e metanol, e desempenha um papel importante no metabolismo da parede celular. Além disso, vários patógenos de plantas utilizam pectinesterases para macerar e amolecer tecidos vegetais. O genoma de Arabidopsis contém pelo menos 12 genes relacionados à pectina metilesterase. Micheli e colaboradores, Gene 5:220(1-2): 13-20 (1998).

Fenótipo: fenótipo é uma característica distintiva de uma planta, o qual pode ser alterado de acordo com a presente invenção pela integração de um ou mais "polinucleotídeos desejados" e/ou marcado- res detectáveis no genoma de pelo menos uma célula vegetal de uma planta transformada. O(s) "polinucleotídeo(s) desejado(s)" e/ou marca- dores podem conferir uma alteração no fenótipo de uma planta trans- formada, pela modificação de qualquer um de um número de caracterís- ticas ou propriedades genéticas, moleculares, bioquímicas, fisiológicas, morfológicas, ou agronômicas da célula vegetal ou planta transformada como um todo. Desta forma, a expressão de um ou mais polinucleotí- deos integrados de forma estável em um genoma vegetal, pode produzir um fenótipo selecionado do grupo consistindo em, mas, sem limitação, aumento da tolerância à seca, aumento da tolerância ao frio ou à geada, vigor aumentado, cor aperfeiçoada, saúde e características nutricionais aperfeiçoadas, armazenagem aumentada, rendimento aumentado, tolerância a condições salinas aumentada, tolerância a metais pesados aumentada, tolerância a doenças aumentada, tolerância a insetos aumentada, tolerância a estresse hídrico aumentada, teor em açúcares aumentado, vigor aumentado, gosto aperfeiçoado, textura aperfeiçoada, teor em fosfato reduzido, germinação aumentada, absorção de micro- nutrientes aumentada, composição em amido aumentada, e longevida- de floral aumentada.

Fosfomanomutase: a fosfomanomutase 2 catalisa a isome- rização de manose-6-fosfato a manose-1-fosfato. Popova T.N., Matasova L-V., Lapofko A.A. "Purification, separation and characterization of phosphoglucomutase and phosphomannomutase from maize leaves". Biochem. Mol. Biol. Int. 1998 outubro; 46(3):461-70. Proteína de resposta de resistência a doença: genes vege- tais de resistência a doença têm sido exaustivamente investigados em termos de sua organização estrutural, evolução de seqüência e distribu- ição de genoma. Isto foi revisado em Lehmann P. J. Appl Genet.; 43(4):403-14(2002). A maioria das proteínas vegetais de resistência (R) a doença contém uma série de repetições ricas em leucina (LRRs), um sítio de ligação a nucleotídeo (NBS) e um domínio putativo de sinaliza- ção amino-terminal. São chamadas de proteínas NBS-LRR. os LRRs de uma grande variedade de proteínas de muitos organismos servem como plataforma de interação protéica, e como módulos reguladores da ativação de proteína. Geneticamente, os LRRs de proteínas R vegetais são determinantes da especificidade de resposta, e sua ação pode levar à morte celular na planta na forma da resposta hipersensível familiar (HR). Os parceiros ou proteínas R permanecem obscuros, no entanto o conhecimento corrente é revisto em Belkhadir Y. e colaboradores, Curr. Opin. PlantBiol 7(4):391-9 (2004).

Tecido vegetal: uma "planta" é qualquer de vários orga- nismos fotossintéticos, eucarióticos, multicelulares do reino Plantae caracteristicamente produtores de embriões, contendo cloroplastos, e apresentando paredes celulares celulósicas. Uma parte de uma planta, isto é, um "tecido vegetal" pode ser tratado de acordo com os métodos da presente invenção para produzir uma planta transgênica. Vários tecidos vegetais adequados podem ser transformados de acordo com a presente invenção e incluem, mas sem limitação, embriões somáticos, pólen, folhas, troncos, calos, estolões, microtubérculos e brotações. Desta forma, a presente invenção está voltada para a transformação de plantas angiospermas e gimnospermas tais como gramados, trigo, milho, arroz, aveia, cevada, beterraba, batata, tomate, tabaco, alfafa, alface, cenoura, morango, mandioca, batata doce, gerânio, soja, carva- lho, pinheiro, abeto, acácia, eucalipto, castanheira, e palmeira. De acordo com a presente invenção "tecido vegetal" engloba também células vegetais. Células vegetais incluem culturas em suspensão, calos, embriões, regiões meristemáticas, tecido de calo, folhas, raízes, brotações, gametófitos, esporófitos, pólen, sementes e micrósporos. Os tecidos vegetais podem estar em vários estágios de maturidade e podem ser crescidos em cultura líquida ou sólida, ou em solo ou meio adequa- do em vasos, estufas ou campos. Um tecido vegetal refere-se também a qualquer clone de tal planta, semente, progênie, propágulo, gerados sexualmente ou assexuadamente e descendentes de qualquer um destes, tais como plântulas ou sementes. De particular interesse são as coníferas tais como pinheiro, abeto, e abeto vermelho, monocotiledôneas tais como grama azul do Kentucky, bentgrass rasteira, milho, e trigo, e dicotiledôneas tais como algodão, tomate, alface, Arabidopsis, tabaco e gerânio.

Transformação de plantas e cultura de células: de forma genérica refere-se ao processo pelo qual células vegetais são modifica- das geneticamente e transferidas para um meio de cultura vegetal apropriado para manutenção, crescimento adicional, e/ou desenvolvi- mento adicional. Tais métodos são bem conhecidos de um especialista na técnica.

Poligalacturonase: poligalacturonase (pectina despolime-

rase, pectinase, PG) degrada a parede celular vegetal pela despolimeri- zação de pectina. A poligalacturonase despolimeriza a pectina durante uma variedade de processos de desenvolvimento, incluindo polinização e amadurecimento de fruto. Além disso, muitos patógenos de plantas secretam poligalacturonase durante a infestação do hospedeiro, degra- dando desta forma a parede celular do hospedeiro.

Progênie: uma "progênie" da presente invenção, tal como a progênie de uma planta transgênica, é uma que é nascida de, procriada por, ou derivada de uma planta ou planta transgênica. Desta forma, uma planta "progênie", isto é, uma geração "Fl" é uma prole ou descen- dente da planta transgênica produzida pelos métodos da invenção. Uma progênie de uma planta transgênica pode conter em pelo menos uma, algumas, ou todas as suas células genomas, o polinucleotídeo desejado, que foi integrado em uma célula da planta transgênica parental pelos métodos descritos aqui. Desta forma, o polinucleotídeo desejado é "transmitido" ou "herdado" pela planta progênie. O polinu- cleotídeo desejado que é assim herdado na planta progênie pode sem encontrar no interior de uma construção de t-DNA, o qual é também herdado pela planta progênie de seu parental. O termo "progênie" conforme utilizado aqui, pode ser considerado também como sendo a prole ou descendente de um grupo de plantas.

Promotor: por promotor pretende-se significar um ácido nucléico, preferivelmente DNA, que liga RNA polimerase e/ou outros elementos reguladores de transcrição. Como com qualquer promotor, os promotores da presente invenção irão facilitar ou controlar a trans- crição de DNA ou RNA para gerar uma molécula de mRNA a partir de uma molécula de ácido nucléico que é operativamente ligada ao promo- tor. Conforme afirmando anteriormente, o RNA gerado pode codificar uma proteína ou polipeptídeo ou pode codificar um RNA de interferên- cia, ou molécula anti-senso.

Um promotor vegetal é um promotor capaz de ativar a transcrição em células vegetais sendo sua origem uma célula vegetal ou não. Promotores vegetais típicos incluem, mas sem limitação, aqueles que são obtidos a partir de plantas, vírus de plantas, e bactérias tais como Agrobacterium ou Rhizobium que compreendem genes expressos em células vegetais. Exemplos de promotores sob controle de desenvol- vimento incluem promotores que preferencialmente ativam a transcri- ção em certos tecidos, tais como xilema, folhas, raízes, ou sementes. Tais promotores são chamados de promotores preferidos de tecidos. Os promotores que ativam a transcrição apenas em alguns tecidos são chamados de promotores específicos de tecidos. Um promotor tecido específico de célula aciona a expressão primariamente em alguns tipos de células em um ou mais órgãos, por exemplo, células vasculares em raízes ou folhas. Um promotor induzível ou repressível é um promotor que está sob controle ambiental. Exemplos de condições ambientais que podem afetar a transcrição por promotores induzíveis incluem condições anaeróbicas ou a presença de luz. Promotores tecido especí- ficos, preferidos de tecidos, específicos do tipo de célula, e induzíveis constituem a classe de promotores não constitutivos. Um promotor constitutivo é um promotor que é ativo sob a maioria das condições ambientais, e na maioria das partes de plantas.

Bxpansina alergênica de pólen: alergênicos do Grupo I são os principais alergênicos de pólen de gramínea e mostrou-se que são estruturalmente relacionados à expansina (Cosgrove D.J. e colaborado- res, ProcNatlAcad Sci USA. 1997 Jun 10;94(12):6559-64). As expansi- nas são agora genericamente aceitas como sendo reguladoras chave da expansão de parede durante o crescimento. Seu modo exato de funcio- namento não é claro, mas em plantas, as expansinas provavelmente aumentam a solubilização dos polímeros da parede durante a quebra da parede. Existe evidencia de que as expansinas aumentam o crescimen- to mediando o afrouxamento da parede celular (Choi D., Lee Y., Cho H.T., Kende H. Plant Cell 2003 Jun; 15(6): 1386-98), representam um papel na morfogênese vegetal (Pien S., Wyrzykowska J., McQueen- Mason S., Smart C., Fleming A. Proe NatlAead Sei USA. 2001 Sep. 25; 98(20):1 1812-7) e são importantes na quebra ou amolecimento da parede celular em processos tais como amadurecimento de fruto, polinização, germinação e auto-poda (Li Y., Jones L., McQueen-Mason S., Curr. Opin. PlantBiol 2003 Dez.;6(6):603-10).

Polinucleotídeo é uma seqüência de nucleotídeos, compre- endendo uma seqüência genética de codificação ou um fragmento desta (compreendendo pelo menos 15 nucleotídeos consecutivos; preferivel- mente pelo menos 30 nucleotídeos consecutivos, e com maior preferên- cia pelo menos 50 nucleotídeos consecutivos), um promotor, um íntron, uma região de amplificação, um sítio de poliadenilação, um sítio de início de tradução, regiões 5' ou 3' não traduzidas, um gene repórter, um marcador selecionável ou semelhante. O polinucleotídeo pode compreender DNA ou RNA de fita única ou dupla. O polinucleotídeo pode compreender bases modificadas ou um esqueleto modificado. O polinucleotídeo pode ser genômico, um transcrito de RNA (tal como um mRNA) ou uma seqüência de nucleotídeos processada (tal como um cDNA). O polinucleotídeo pode compreender uma seqüência tanto na orientação senso quanto na orientação anti-senso.

Um polinucleotídeo isolado é uma seqüência de polinucle- otídeo que não está em seu estado nativo, por exemplo, o polinucleotí- deo é compreendido de uma seqüência de nucleotídeos não encontrada na natureza ou o polinucleotídeo é separado das seqüências de nucleo- tídeos com as quais tipicamente está em proximidade ou é próxima a seqüências de nucleotídeos com as quais tipicamente não está em proximidade.

Capacidade regenerativa: conforme utilizada aqui, refere- se à capacidade de uma planta em se re-diferenciar a partir de um tecido não diferenciado.

Semente: uma "semente" pode ser encarada como um óvu- lo vegetal maduro contendo um embrião, e uma parte de propagação de uma planta, como um tubérculo ou um esporo. Sementes podem ser incubadas antes da transformação mediada com Agrobacterium, por exemplo, no escuro para facilitar a germinação. As sementes podem também ser esterilizadas antes da incubação, tal como com breve tratamento com lixívia. A plântula resultante pode então ser exposta a uma cepa desejada de Agrobacterium.

Marcador detectável: um gene quem se expresso em plan- tas ou tecidos vegetais, torna possível distingui-los de outras plantas ou tecidos vegetais que não expressam este gene. Os procedimentos de pesquisa podem requerer ensaios para a expressão de proteínas codifi- cadas pelo gene marcador detectável. Exemplos de tais marcadores incluem o gene da beta-glucuronidase (GUS) e o gene da luciferase (LUX). Exemplos de marcadores selecionáveis incluem o gene da neomicina fosfotransferase (NPTIl) que codifica resistência a kanamicina e geneticina, o gene da higromicina fosfotransferase (HPT ou APHTV) que codifica resistência a higromicina, os genes da acetolactato sintase (ais) que codificam resistência a herbicidas do tipo sulfoniluréia, genes (BAR e/ou PAT) que codificam resistência a herbicidas que agem no sentido a inibir a ação da glutamina sintase tal como fosfmotricina (Liberty ou Basta), ou outros genes similares conhecidos na técnica.

Identidade de seqüência: conforme utilizada aqui, "identi- dade de seqüência" ou "identidade" no contexto de duas seqüências de ácidos nucléicos ou de polipeptídeo incluem referências aos resíduos nas duas seqüências que são os mesmos quando alinhados para correspondência máxima em uma região especificada. Quando a percentagem da identidade de seqüência é utilizada com referência a proteínas, é reconhecido que as posições dos resíduos que não são idênticos freqüentemente diferem por substituições conservativas de aminoácido, em que os resíduos de aminoácidos são substituídos por outros resíduos de aminoácidos com propriedades químicas similares (por exemplo, carga ou hidrofobicidade) e, por esta razão, não alteram as propriedades funcionais da molécula. Quando as seqüências diferem em substituições conservativas, o percentual da identidade de seqüên- cia pode ser ajustado para cima para corrigir a natureza conservativa da substituição. Seqüências que diferem em tais substituições conser- vativas são ditas apresentarem "similaridade de seqüência" ou "simila- ridade". Os meios para se obter este ajuste são bem conhecidos dos especialistas na técnica. Tipicamente isto envolve a classificação de uma substituição conservativa como um desencontro parcial em vez de total, aumentando desta forma a percentagem da identidade de seqüên- cia. Desta forma, por exemplo, onde a um aminoácido idêntico é dada um escore de 1 e a uma substituição não conservativa é dado um escore de zero, a uma substituição conservativa é dado um escore entre zero e 1. A classificação de substituições conservativas é calculada, por exemplo, de acordo com o algoritmo de Meyers e Miller, Computer Applic. Biol. Sci., 4:11-17 (1988), por exemplo, como implementado no programa PC/GENE (Intelligenetics, Mountain View, Califórnia, EUA).

Conforme utilizado aqui, a percentagem de identidade de seqüência significa o valor determinado pela comparação de duas seqüências alinhadas idealmente em uma janela de comparação, onde a parte da seqüência de polinucleotídeo na janela de comparação pode compreender adições ou deleções (isto é, espaços) em comparação com a seqüência de referência (que não compreende adições ou deleções) para alinhamento ideal das duas seqüências. A percentagem é calcula- da pela determinação do número de posições nas quais ocorrem bases de ácidos nucléicos ou resíduos de aminoácidos idênticos em ambas as seqüências para produzir o número de posições pareadas, dividindo o número de posições pareadas pelo número total de posições na janela de comparação e multiplicando o resultado por 100 para produzir a percentagem de identidade de seqüência.

"Identidade de seqüência" tem um significado reconhecido na técnica e pode ser calculada utilizando-se técnicas publicadas. Ver "COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY', Lesk, ed. (Oxford University Press, 1988), "BIOCOMPUTING: INFORMATICS AND GENOME PRO- JECTS', Smith, ed. (Academic Press, 1993), "COMPUTER ANALYSIS OF SEQUENCE DATA, PART F, Griffin 85 Griffin, eds., (Humana Press, 1994), "SEQUENCE ANALYSIS IN MOLECULAR BIOLOGY', Von Heinje ed., Academic Press (1987), "SEQUENCE ANALYSIS PRIMER', Gribskov & Devereux, eds. (Macmillan Stockton Press, 1991), and Carillo & Lipton, SIAMJ. Applied Math. 48: 1073 (1988). Os métodos comumente empregados para se determinar a identidade ou similaridade entre duas seqüências incluem, mas sem limitação, aqueles descritos no "GUIDE TOHUGE COMPUTERS', Bishop, ed. (Academic Press5 1994) e Carillo & Lipton, supra. Os métodos para se determinar a identidade ou similari- dade são codificados em programas de computador. Métodos de programas de computador preferidos para se determinar a identidade e similaridade entre duas seqüências incluem, mas sem limitação, o pacote de programas GCG (Devereux e colaboradores, Nucleic Aeids Research 12:387 (1984)), BLASTP, BLASTN, FASTA (Atschul e colabora- dores, J. Mol Biol 215:403 (1990)), e FASTDB (Brutlag e colaboradores, Comp. App. Biosei. 6:237 (1990)).

Amido: amido é uma reserva de carboidrato estável insolú- vel presente na maioria das plantas. O amido é sintetizado a partir de triose fosfato gerado a partir do ciclo de Calvin e a síntese do amido ocorre nos cloroplastos. Os polímeros de amido são compostos de dois tipos diferentes de polímeros de glucana, amilase e amilopectina.

Enzima de ramificação de amido: a enzima de ramificação de amido (SBE) é uma das enzimas chave envolvidas na síntese de amido. A SBE introduz ramificações alfa-l,6-glucanas e acredita-se influencie na estrutura da amilopectina. Todas as plantas superiores apresentam duas classes de SBE, chamadas de BEI e BEII em milho, arroz, e cevada; e como tipo B e tipo A em ervilha, feijão e batata. A análise bioquímica com milho revelou que a BEI preferencialmente ramifica do tipo amilose poucas poliglucanas ramificadas, enquanto a BEII apresenta uma capacidade maior para ramificação do tipo amilo- pectina alfa-glucanas altamente ramificadas. Guan, H.P e Preiss, J. Plant Physiol 102:1269-1273 (1993). Estes dados sugerem fortemente que a BEI e a BEII desempenham papéis distintos na síntese de amilo- pectina. Nakamura, Y. Plant Cell Physiol 43:718-725 (2002). Amido sintase: acredita-se que a amido sintase alongue tanto a amilase quanto os polímeros de amilopectina pela adição de uma molécula de ADP-glicose ao polímero em formação. A amido sintase ocorre de duas formas diferentes: amido sintase solúvel e amido sintase granulada. As proteínas amido sintases compartilham um motivo KXGG comum, que se acredita prover um sítio de ligação para ADP-glicose. Knight, M.E. e colaboradores, Plant J. 14(5):613-22 (1998).

Sacarose sintase: a sacarose sintase desempenha um pa- pel importante na partição de sacarose entre a biossíntese da parede celular e a glicólise. Vários relatórios demonstram que a sacarose sintase atua como um canal metabólico para a transferência de glicose, derivada de sacarose, para um crescimento da cadeia celulósica. Por exemplo, nas raízes de trigo (Tríticum aestivum L., cv. Alcedoroot), um teor elevado de açúcar é utilizado para a síntese de celulose para o espessamento da parede secundária. Albrecht, G. e Mustoph, A. Planta 217(2):252-60 (2003). Além disso, a supressão do gene da sacarose sintase (Sus) na epiderme de óvulo de algodão levou a um fenótipo sem fibras. Ruan e colaboradores, Plant Cell 15(4):952-64 (2003). O nível de supressão do Sus se correlacionou fortemente com o grau de inibição do início da formação e alongamento de fibra. Ruan e colaboradores Plant Cell 15(4):952-64 (2003). Além disto, foi mostrado que a repres- são anti-senso da sacarose sintase (Daucus carota L.) afeta mais o crescimento que a partição de sacarose. Tang G.Q. e Sturm A. Plant Mol Biol. 41(4):465-79 (1999).

Saearose-fosfato sintase (SPS) catalisa uma reação irre- versível na rota da síntese de sacarose, a formação de sacarose-6- fosfato a partir de frutose-6-fosfato (FruóP) e UDP-glicose (UDPGlc), e é a principal enzima limitante para a síntese de sacarose. Além disso, a saearose-fosfato sintase desempenha um papel durante o crescimento celular. Por exemplo, um gene contendo um local para traço quantitati- νο (QTL) controlando a altura de planta em arroz (Oriza sativa L.) sugere que um gene putativo da sacarose-fosfato sintase controla a altura da planta pela permissão de que quantidades maiores de sacarose sejam translocadas em folhas. Ishimaru e colaboradores, Planta 218(3):388- 95 (2004). As plantas de arroz transgênicas com um gene SPS de milho que apresentaram cerca de 3 vezes a atividade SPS em relação às plantas de controle foram significativamente mais altas que as plantas de controle. Id.

Vários estudos demonstraram que o SPS regula a partição fotossintética na planta. Por exemplo, as plantas de tomate que expressam um SPS de milho mostraram aumentos de 2-3 vezes na atividade de SPS, partição aumentada de fotoassimilação para sacarose, e até 58% acima das taxas máximas de fotossíntese. Lunn, J. E. e colaboradores, J. Exp. Bot. 54(381):223-37 (2003). A expressão aumen- tada de SPS foi correlacionada com a razão em peso seco brotação:raiz, favorecendo a brotação. Galtier, N. Plant Physiol 101(2):535-543 (1993). Da mesma forma, a regulação da expressão de SPS pode possibilitar taxas de fotossíntese aumentadas durante condições desfavoráveis. Id.

Proteína induzida por siringolídeo: o siringolídeo é produ- zido pelo patógeno bacteriano de planta Pseudomonas syringae e acredita-se que entre na planta por meio de difusão passiva (Ji e colaboradores, (1998) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 95:3306-3311). Em tecido foliar de soja, induz morte celular hipersensível específica de Rpg4, no entanto muito pouco se sabe àcerca da sinalização no sistema siringolídeo / soja.

Fator de transcrição: fator de transcrição refere-se a uma seqüência de polipeptídeo que regula a expressão de um gene ou genes ou por ligação direta a uma ou mais seqüências de nucleotídeos associ- adas com um gene que codifica seqüência ou indiretamente afetando a atividade de um outro polipeptídeo ou outros polipeptídeos que se ligam diretamente a uma ou mais seqüências de nucleotídeos associadas com um gene de codificação de seqüência. Um fator de transcrição pode ativar (super-regulado) ou reprimir (sub-regular) a expressão de um gene ou genes. Um fator de transcrição pode conter um domínio de ligação a D NA, um domínio de ativação, ou um domínio para interações proteína-proteína. Na presente invenção, um fator de transcrição é capaz de pelo menos (1) se ligar a uma seqüência de ácidos nucléicos ou (2) regular a expressão de um gene em uma planta. Além disso, as seqüências de polinucleotídeo da invenção e as correspondentes seqüências de polipeptídeo funcionam como fatores de transcrição em quaisquer espécies vegetais, incluindo angiospermas e gimnospermas.

Terminadores de transcrição e tradução: a expressão das construções de DNA da presente invenção tipicamente contém uma região de terminação transcricional na extremidade oposta da região reguladora do início da transcrição. A região de terminação de transcri- ção pode ser selecionada, para estabilidade do mRNA para aumentar a expressão e/ou para a adição de caudas de poliadenilação adicionadas ao produto de transcrição genética. A tradução de um polipeptídeo em formação é submetida à terminação quando qualquer um dos três códons de terminação de cadeia entra no sítio A no ribossomo. Os códons de terminação de tradução são UAA, UAG e UGA.

DNA de transferência (t-DNA): um t-DNA de Agrobacterium é um elemento genético que é bem conhecido como elemento capaz de integrar uma seqüência de nucleotídeos contida em suas bordas em um outro genoma. A este respeito, um t-DNA é flanqueado, tipicamente, por duas seqüências de "borda". Um polinucleotídeo desejado da presente invenção e um marcador selecionável podem ser posicionados entre a seqüência de borda esquerda e a seqüência de borda direita de um t-DNA. O polinucleotídeo desejado e o marcador selecionável contidos no t-DNA podem ser ligados operativamente a uma variedade de ácidos nucléicos diferentes, específicos de planta (isto é, nativos) ou exógenos, tais como promotores e elementos reguladores de terminação que facilitam sua expressão, isto é, transcrição e/ou tradução de uma seqüência de RNA codificada pelo polinucleotídeo desejado ou marcador selecionável.

Transformação de células vegetais: um processo pelo qual um ácido nucléico é inserido de forma estável no genoma de uma célula vegetal. A transformação pode ocorrer sob condições naturais ou artificiais utilizando-se vários métodos bem conhecidos na técnica. A transformação pode ser baseada em qualquer método conhecido para inserção de seqüências de ácidos nucléicos em uma célula hospedeira procariótica ou eucariótica, incluindo protocolos de transformação mediada por Agrobacteríum, infecção viral, "whiskers", eletroporação, microinjeção, tratamento com polietilenoglicol, choque térmico, lipofec- ção e bombardeamento de partícula.

Planta transgênica: uma planta transgênica da presente invenção é uma que compreende pelo menos um genoma celular no qual um ácido nucléico exógeno foi integrado de forma estável. De acordo com a presente invenção, uma planta transgênica é uma planta que compreende apenas uma célula e um genoma celular modificados geneticamente, ou é uma planta que compreende algumas células geneticamente modificadas, ou é uma planta em que todas as células são geneticamente modificadas. Uma planta transgênica da presente invenção pode ser uma que compreende a expressão do polinucleotídeo desejado, isto é, o ácido nucléico exógeno, em apenas algumas partes da planta. Desta forma, uma planta transgênica pode conter apenas células geneticamente modificadas em algumas partes de sua estrutura.

UTP-glicose-l-fosfato uridililtransferase: UTP-glicose-1- fosfato uridililtransferase (UGP) catalisa a conversão de alfa-D-glicose-1- fosfato e UTP para UDP-glicose. A UDP-glicose é um componente chave da biossíntese de polissacarídeos e pode ser combinada com D-frutose para a síntese de sacarose.

Variante: uma "variante", conforme utilizada aqui, entende- se por uma seqüência de nucleotídeos ou aminoácidos que se desvia da seqüência de nucleotídeos ou aminoácidos padrão de um gene ou proteína particular. Os termos "isoforma", "isotipo" e "análogo" referem- se também a formas "variantes" de uma seqüência de nucleotídeos ou aminoácidos. Uma seqüência de aminoácidos que é alterada pela adição, remoção ou substituição de um ou mais aminoácidos, ou uma alteração na seqüência de nucleotídeos, pode ser considerada como uma seqüência "variante". A variante pode ser "conservativa", onde um aminoácido substituinte apresenta propriedades estruturais ou quími- cas similares, por exemplo, substituição de leucina por isoleucina. Uma variante pode apresentar alterações "não conservativas", por exemplo, substituição de uma glicina por um triptofano. Variações menos importantes análogas podem incluir deleções ou inserções de aminoáci- dos, ou ambas. A orientação na determinação de quais resíduos de aminoácidos podem ser substituídos, inseridos ou deletados pode ser encontrada utilizando-se programas de computador bem conhecidos na técnica tais como o programa Vector NTI Suíte (InforMax, MD). "Varian- te" pode referir-se também a um gene "shuffled" tal como os descritos nas patentes da Maxygen. Por exemplo, uma variante da presente invenção pode incluir variantes de seqüências e polinucleotídeos desejados que são modificados de acordo com os métodos e procedi- mentos descritos no documento US 6.132.970, o qual é incorporado aqui como referência.

Composição de madeira, conforme utilizado aqui, refere-se ao traço que pode ser modificado para se alterar a estrutura, aparência ou utilização da madeira. Embora não limitante, traços que determi- nam a composição da madeira incluem espessura da parede celular, comprimento celular, densidade celular, ângulo de microfibrila, resis- tência à tensão, resistência ao rasgo, cor da madeira, e duração e freqüência da divisão celular.

Pasta de madeira refere-se à fibra gerada a partir da ma- deira apresentando graus variáveis de purificação. A pasta de madeira pode ser utilizada para a produção de papel, papelão e produtos químicos.

A invenção provê métodos para a obtenção de madeira, pas- ta de madeira, papel, e óleo a partir de uma planta transformada com uma construção da presente invenção. Métodos para a transformação e seleção de uma planta transgênica são bem conhecidos na técnica. Por exemplo, pinheiro pode ser cultivado e crescido como descrito na publicação de Pedido de Patente US n° 2002/0100083. Eucalipto pode ser cultivado e crescido como, por exemplo, descrito em Rydelius, e colaboradores, uGrowing Eucalyptus for Pulp and Energy", apresentado na Conferência "Mechanization in Short Rotation, Intensive Culture Forestrif, Mobile, AL, 1994. Madeira, pasta de madeira, papel e óleo podem ser obtidos a partir de planta por quaisquer meios conhecidos na técnica.

Conforme apontado acima, a madeira e pasta de madeira obtidas de acordo com esta invenção podem demonstrar características melhoradas incluindo, mas, sem limitação, qualquer um ou mais de composição de lignina, estrutura da lignina, composição da madeira, polimerização de celulose, dimensões de fibra, razão de fibras para outros componentes da planta, divisão de célula vegetal, número de células por unidade de área, tamanho de célula, formato de célula, composição da parede celular, taxa de formação de madeira, aparência estética da madeira, formação de tronco defeituoso, taxa de crescimen- to, taxa de formação de raiz, proporção do desenvolvimento vegetativo de raiz em relação à ramificação, índice de área foliar, e formato de folha, incluindo teor de lignina aumentado ou reduzido, acessibilidade aumentada da lignina a tratamentos químicos, reatividade aumentada da lignina, teor de celulose aumentado ou reduzido, estabilidade dimensional aumentada, resistência à tensão aumentada, resistência ao rasgo aumentada, resistência à compressão aumentada, resistência aumentada ao choque, rigidez aumentada, dureza aumentada ou reduzida, espiralidade reduzida, encolhimento reduzido, e diferenças em peso, densidade, e gravidade específica.

O fenótipo pode ser acessado por qualquer meio adequado. As plantas podem ser avaliadas com base em sua morfologia geral. Plantas transgênicas podem ser observadas a olho nu, podem ser pesadas e sua altura medida. A planta pode ser examinada por isola- mento de camadas individuais de tecido vegetal, a saber, íloema e câmbio, que é, além disso, secionado em células meristemáticas, expansão inicial, expansão posterior, formação de parede secundária e maturação celular tardia. Ver, por exemplo, Hertzberg, supra. As plantas podem ser também acessadas utilizando-se análise microscópi- ca ou análise química.

A análise microscópica inclui o exame de tipos celulares, es- tágio de desenvolvimento, e absorção de marcação pelos tecidos e células. A morfologia celular, tal como espessura da parede de fibra e ângulo de microfibrila de fibras de pasta de madeira, pode ser observa- da utilizando-se, por exemplo, elipsometria de transmissão microscópi- ca. VerYe e Sundstrõm, TappiJ., 80:181 (1997). Resistência, densi- dade e declive de grão de madeira em madeira fresca e árvores vivas podem ser determinados medindo-se os dados espectrais visíveis e próximos ao infravermelho em conjunto com análise multivariada. Ver, publicações de Pedido de Patente US 2002/0107644 e 2002/0113212. O tamanho de lúmen pode ser medido por microscopia de varredura de elétron. A estrutura e propriedades da lignina podem ser observadas utilizando-se espectroscopia de ressonância magnética nuclear como descrito em Marita e colaboradores, J. Chem. Soe. Perkin Trans. 12939 (2001).

As características bioquímicas da lignina, celulose, carboi- dratos e outros extratos vegetais podem ser avaliadas por qualquer método analítico padrão conhecido, incluindo espectrofotometria, espectroscopia de fluorescência, HPLC, espectroscopia de massa e métodos de marcação de tecido.

Xiloglucano endotransglicosilase: xiloglucano endotrans- glicosilase (XET) pode cortar e reunir cadeias de xiloglucana (XG) e, desta forma, foi implicada em muitos aspectos da biossíntese da parede celular. É considerada como uma agente chave na regulação da expansão celular (Darley e colaboradores (2001) PlantMoL Biol 47:179- 195, Wu e colaboradores, (2005) Planta 220(4):593-601), foi implicada na degradação de parede necessária ao amadurecimento de fruto, aerênquima lisógeno, corte e fortalecimento de parede que ocorrem durante o movimento de uma planta (revisto por Nishitani (1997) Int. Rev. Cytol 173:157-206 e Campbell & Braam (1999) Trends Plant Sei. 4:361-366).

Vários estudos demonstraram papéis para a XET durante a formação da parede celular. Por exemplo, a atividade de XET foi mostrada na formação de parede celular em um conjunto diverso de plantas vasculares, incluindo musgos, samambaias, gimnospermas, monocotiledôneas e dicotiledôneas. Vissenberg, K. e colaboradores, J. Exp Bot 54 (381):335-44 (2003). Em adição a seu papel durante a formação da parede celular primária, em um ensaios da atividade de XET in situ em troncos de álamo demonstrou-se a atividade de XET em fibras de xilema e floema durante a formação da parede secundária. Borquin, N. Plant Cell 14(12):3073-88 (2002).

Xiloglucano sintase: xiloglucano sintase é um sistema de enzimático de xiloglucana 4-glicosiltransferase e xiloglucanan 6- xilosiltransferase. A xiloglucano sintase catalisa a formação de xiloglu- cana a partir de UDP-xilose e UDP-glicose, a transferência simultânea de glicose e xilose é necessária para esta síntese.

A xiloglucana 6-xilosiltransferase transfere um resíduo a-D- xilosil de UDP-D-xilose para um resíduo de glicose em xiloglucana formando uma ligação a-l,6-D-xilosil-D-glicose. A xiloglucana 4- glicosiltransferase transfere um resíduo β-D-glicosil de UDP-glicose para um resíduo de glicose em xiloglucana formando uma ligação β-1,4- glicosil-D-glicose (Hayashi, T. e Matsuda, K. J. Biol. Chem. 256 (1981) 11117-11122, Hayashi, T. e Matsuda, K. Plant Cell Physiol 22 (1981) 517-523).

Yieldin é uma proteína de parede celular que regula o limi- te do rendimento da parede celular. Okamoto-Nakazato A. Plant Res. 115(4):309-13 (2002). Acredita-se que a yieldin desempenhe um papel na regulação da produção da parede celular durante o crescimento de alongamento. Por exemplo, foi mostrado que a yieldin é expressa diferencialmente durante o alongamento celular em plântulas etioladas de feijão-caupi; a yieldin se localiza em áreas de alongamento e desapa- rece com o fim do alongamento celular. Okamoto-Nakazato A e colabo- radores, Plant Cell Physiol 42(9):952-8 (2001).

Entende-se que a presente invenção não se limita a metodo- logias, protocolos, vetores e reagentes, etc, descritos aqui, na medida em que estes podem variar. Entende-se também que a terminologia utilizada aqui é utilizada para o propósito de descrever realizações particulares apenas, não se pretende limitar o escopo da presente invenção. Deve ser observado que, conforme utilizadas aqui e nas reivindicações anexas, as formas singulares "um", "uma", "o" e "a" incluem os plurais a não ser que o contexto claramente indique o contrário. Desta forma, por exemplo, uma referência a "um gene" é uma referência a um ou mais genes e inclui equivalentes destes conhe- cidos dos especialistas na técnica e assim em diante. De fato, um especialista na técnica pode utilizar os métodos descritos aqui para expressar qualquer gene nativo (conhecido atualmente ou subseqüen- temente) em sistemas de hospedeiros vegetais.

Seqüências de Polinucle otí de o

A presente invenção refere-se a uma molécula de ácido nu- cléico isolada compreendendo uma polinucleotídeo apresentando uma seqüência selecionada do grupo consistindo em qualquer uma das seqüências de polinucleotídeo das SEQ ID Nos.: 1-230. A invenção provê também fragmentos funcionais das seqüências de polinucleotídeo das SEQ ID Nos.: 1-230. A invenção provê além disso ácidos nucléicos complementares, ou fragmentos destes, a qualquer uma das seqüências de polinucleotídeo das SEQ ID Nos.: 1-230, bem como um ácido nucléi- co compreendendo pelo menos 15 bases contíguas, as quais se hibridi- zam a qualquer uma das seqüências de polinucleotídeo das SEQ ID Nos.: 1-230.

A presente invenção refere-se também a uma seqüência de polipeptídeo isolada compreendendo um polipeptídeo apresentando uma seqüência selecionada do grupo consistindo em qualquer uma das SEQ ID Nos.: 231-460. A invenção provê também fragmentos funcio- nais das seqüências de polipeptídeo das SEQ ID Nos.: 231-460.

Por molécula(s) "isolada(s)" de ácido(s) nucléico(s) pretende- se uma molécula de ácido nucléico, DNA ou RNA, a qual foi removida de seu ambiente nativo. Por exemplo, moléculas de DNA recombinante contidas em uma construção de DNA são consideradas isoladas para os propósitos da presente invenção. Exemplos adicionais de moléculas isoladas de DNA incluem moléculas de DNA recombinante mantidas em células hospedeiras heterólogas ou moléculas de DNA purificadas (parcialmente ou substancialmente) em solução. Moléculas de RNA isoladas incluem transcritos de RNA in vitro das moléculas de DNA da

presente invenção. Moléculas de ácidos nucléicos isoladas, de acordo

com a presente invenção, incluem ainda tais moléculas produzidas sinteticamente.

As moléculas de ácido nucléico da presente invenção podem estar na forma de RNA, tal como mRNA, ou na forma de DNA, incluindo, por exemplo, cDNA e DNA genômico obtidos por clonagem ou produzi- dos sinteticamente. Os DNA e RNA podem ser de fita dupla ou de fita simples. DNA de fita simples pode ser a fita de codificação, também conhecida como fita senso, ou pode ser uma fita não codificadora, também chamada de fita anti-senso.

A não ser que indicado diferentemente, todas as seqüências de nucleotídeos determinadas por seqüenciamento de uma molécula de DNA foram determinadas utilizando-se um seqüenciador de DNA automatizado (tal como o modelo 373 da Applied Biosystems, Inc.) e todas as seqüências de aminoácidos dos polipeptídeos codificados pelas moléculas de DNA determinadas aqui foram produzidas pela tradução de uma seqüência de DNA determinada como acima. Desta forma, como conhecido na técnica para qualquer seqüência de DNA determi- nada por esta abordagem automatizada, qualquer seqüência de nucleo- tídeos determinada aqui pode conter alguns erros. Seqüências de nucleotídeos determinadas por automação são tipicamente pelo menos 95% idênticas, mais tipicamente pelo menos cerca de 96% a pelo menos cerca de 99,9% idênticas à seqüência de nucleotídeos real da molécula de DNA seqüenciada. A seqüência real pode ser mais precisamente determinada por outras abordagens incluindo métodos de seqüencia- mento de DNA manuais bem conhecidos na técnica. Como também conhecido na técnica, uma inserção ou deleção únicas em uma deter- minada seqüência de nucleotídeos em comparação com a seqüência real irá causar uma troca de quadro na tradução da seqüência de nucleotí- deos de tal forma que a seqüência de aminoácidos prevista codificada por uma seqüência de nucleotídeos determinada pode ser completa- mente diferente da seqüência de aminoácidos realmente codificada pela

molécula de DNA seqüenciada, partindo-se do ponto de tal inserção ou tal deleção.

Cada "seqüência de nucleotídeos" apresentada aqui é apre- sentada como uma seqüência de desoxirribonucleotídeos (abreviado A, G, C e T). Entretanto, por "seqüência de nucleotídeos" de uma molécula de ácido nucléico ou polinucleotídeo pretende-se, para uma molécula de DNA ou polinucleotídeo, uma seqüência de desoxirribonucleotídeos, e para uma molécula de RNA ou polinucleotídeo, a seqüência correspon- dente de ribonucleotídeos (A, G, C e U) onde cada desoxinucleotídeo timidina (T) na seqüência de desoxinucleotídeo especificada é substituí- do pelo ribonucleotídeo uridina (U).

A presente invenção é direcionada também para fragmentos das moléculas de ácidos nucléicos isoladas descritas aqui. Por um fragmento de uma molécula de ácido nucléico isolada apresentando as seqüências de polinucleotídeo mostradas nas SEQ ID Nos.: 461-690 pretende-se fragmentos de DNA de pelo menos 15 nucleotídeos, e com maior preferência pelo menos 20 nucleotídeos, ainda com maior prefe- rência pelo menos 30 nucleotídeos em comprimento, que são úteis como sondas de diagnóstico, e iniciadores são discutidos com mais detalhes abaixo. De certo fragmentos maiores de ácido nucléico de até o comprimento total das moléculas de ácidos nucléicos da presente invenção são também úteis como sondas de diagnóstico, de acordo com técnicas de hibridização convencionais, ou como iniciadores para a ampliíicação de uma seqüência alvo pela reação em cadeia de polimera- se (PCR), conforme descrito, por exemplo, em "Molecular Cloning, A Laboratory ManuaF, 3a edição, editado por Sambrook & Russel, (2001), Cold Spring Harbor Laboratory Press, a descrição completa do qual é aqui incorporara por referência. Por um fragmento de pelo menos 20 nucleotídeos de comprimento, por exemplo, pretende-se fragmentos que incluem 20 ou mais bases contíguas da seqüência de nucleotídeos das SEQ ID Nos.: 1-230. Os ácidos nucléicos contidos nas seqüências de nucleotídeos listadas nas SEQ ID Nos.: 1-230 podem ser gerados utilizando-se métodos convencionais de síntese de DNA que são rotinei- ros a um especialista na técnica. Por exemplo, clivagem com endonu- clease de restrição ou corte por sonicação podem ser utilizadas facil- mente para gerar fragmentos de vários tamanhos. Alternativamente, os fragmentos de DNA da presente invenção podem ser gerados sintetica- mente de acordo com técnicas conhecidas.

Noutro aspecto, a invenção provê uma molécula de ácido nucléico isolada compreendendo um polinucleotídeo que se hibridiza sob condições estringentes de hibridização para uma parte do polinu- cleotídeo em uma molécula de ácido nucléico da invenção descrita acima. Por um polinucleotídeo que se hibridiza a uma "parte" de um polinucleotídeo pretende-se um polinucleotídeo (DNA ou RNA) que se hibridiza em pelo menos cerca de 15 nucleotídeos e com maior prefe- rência pelo menos cerca de 20 nucleotídeos, e ainda com maior prefe- rência pelo menos cerca de 30 nucleotídeos, e mesmo com maior preferência mais de 30 nucleotídeos do polinucleotídeo de referência. Estes fragmentos que se hibridizam aos fragmentos de referência são úteis como sondas de diagnóstico e iniciadores. Uma sonda, conforme utilizada aqui, é definida como pelo menos cerca de 100 bases contí- guas de uma das seqüências de ácidos nucléicos apresentadas nas SEQ ID Nos.: 1-230. Para o propósito da invenção, duas seqüências se hibridizam quando formam um complexo de fita dupla em uma solução de hibridização de 6X SSC, 0,5% SDS, 5X solução de Denhardt e 100 ]ig de veículo não específico de DNA. Ver Ausubel e colaboradores, seção 2.9, suplemento 27 (1994). As seqüências podem hibridizar em "estringência moderada", que é definida como uma temperatura de 60°C em uma solução de hibridização de 6X SSC, 0,5% SDS, 5X solução de Denhardt e 100 pg de veículo de DNA não específico. Para hibridização de "estringência alta", a temperatura é aumentada para 68°C. Seguin- do a reação de hibridização de estringência moderada, os nucleotídeos são lavados em uma solução de 2X SSC mais 0,05% SDS por cinco vezes à temperatura ambiente, com lavagens subseqüentes com 0,1X SSC mais 0,1% SDS a 60°C por 1 h. Para estringência alta, a tempera- tura é aumentada para 68°C. Para o propósito da invenção, nucleotí- deos hibridizados são aqueles que são detectados utilizando-se 1 ng de uma sonda rádio-rotulada apresentando uma radioatividade específica de 10000 cpm/ng, onde os nucleotídeos hibridizados são claramente visíveis após exposição a filme de raio-X a -70°C por não mais que 72 horas.

O presente pedido é direcionado a tais moléculas de ácidos nucléicos que são pelo menos 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idênticas a uma seqüência de ácidos nucléicos descrita nas SEQ ID Nos.: 1-230. Preferidas, no entanto, são moléculas de ácidos nucléicos que são pelo menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idênticas à seqüência de ácidos nucléi- cos mostrada nas SEQ ID Nos.: 1-230. As diferenças entre duas seqüências de ácidos nucléicos pode ocorrer nas posições terminais 5' ou 3' da seqüência de nucleotídeos de referência ou em qualquer parte entre estas posições terminais, inter-dispersas ou individualmente entre os nucleotídeos na seqüência de referência ou em um ou mais grupos contíguos dentro da seqüência de referência.

Por uma questão prática, quando qualquer molécula de á- cido nucléico particular é pelo menos 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica a uma seqüência de nucleotídeos de referência isto refere-se a uma comparação feita entre duas moléculas utilizando-se algoritmos padrão bem conhecidos na técnica que pode ser determinada conven- cionalmente utilizando-se programas de computador publicamente disponíveis tais como o algoritmo BLASTN. Ver Altschul e colaborado- res, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402 (1997). Os polinucleotídeos podem ser analisados utilizando-se o algoritmo BLASTX que compara os produtos da tradução conceituai de seis quadros de uma seqüência de nucleotídeos pesquisada (ambas as fitas) contra uma base de dados de seqüência de proteína. A similari- dade das seqüências de polipeptídeo pode ser examinada utilizando-se o algoritmo BLASTP. Os programas BLASTN, BLASTX e BLASTP estão disponíveis da National Center for Biotechnology Information (NCBI) National Libraiy of Medicine, Conjunto 38 A, Sala 8N805, Bethesda, MD 20894, EUA. O algoritmo BLASTN versão 2.0.4 [Feb-24-1998] e a versão 2.0.6 [Set-16-1998], ajustados para os parâmetros iniciais descritos na documentação e distribuídos com os algoritmos, são preferidos para utilização na determinação de variantes de polinucleotí- deo de acordo com a presente invenção. O algoritmo BLASTP é preferi- do para utilização na determinação de variantes de polipeptídeo de acordo com a presente invenção. O algoritmo FASTA está disponível da Universidade de Virgínia por contato com David Hudson, Assistance Provost for Research, University of Virgínia, PO Box 9025, Charlottesvil- le, VA. versão 2.0u4 [fevereiro 1996]; ajustado para os parâmetros iniciais descritos na documentação e distribuídos com o algoritmo, pode ser utilizado na determinação de variantes de acordo com a presente invenção. A utilização do algoritmo FASTA é descrito em Pearson e Lipman, Proc. Natl Acad. Sei. USA 85:2444-2448, 1988; e Pearson, MethodsinEnzymol 183:63-98, 1990.

Os seguintes parâmetros de aplicação são preferidos para a determinação de alinhamentos e similaridades utilizando-se o BLASTN que contribuem para os valores E e identidade percentual para seqüên- cias de polinucleotídeo: comando Unix: blastall - ρ blastn -d embldb -e -GO -EO -r 1 -v 30 -b 30 -i queryseq -o resultados; os parâmetros são: -p Program Name [String]; -d Database [String]; -e Expectation value (E) [Real]; -G Cost to open a gap (zero invoca comportamento padrão) [Integer]; -E Cost to extend a gap (zero invoca comportamento de padrão) [Integer]; -r Reward for a nucleotide match (blastn apenas) [Integer]; -v Number of one-line descriptions (V) [Integer]; -b Number of alignments to show (B) [Integer]; -i Query File [File In]; and -o BLAST report Output File [File Out] Opcional.

Os seguintes parâmetros são preferidos para a determina- ção de alinhamentos e similaridades utilizando-se o BLASTP que contribuem para os valores E e identidade percentual de seqüências de polipeptídeo: blastall - ρ blastp -d swissprotdb -e 10 -G O -E O -v 30 - b - i queryseq -o resultados; onde os parâmetros são: -p Program Name [String]; -d Database [String]; -e Expectation value (E) [Real]; -G Cost to open a gap (zero invoca comportamento padrão) [Integer]; -E Cost to extend a gap (zero invoca comportamento padrão) [Integer]; -v Number of one-line descriptions (v) [Integer]; -b Number of alignments to show (b) [Integer]; -I Query File [File In]; -o BLAST report Output File [File Out] Opcional.

Os "hits" para uma ou mais bases de dados de seqüências por uma seqüência investigada produzidos por BLASTN, FASTA, BLASTP ou um algoritmo similar, alinham e identificam partes similares de seqüências. Os hits são dispostos em ordem de grau de similaridade e o comprimento da sobreposição de seqüência. Os hits para uma base de dados de seqüências em geral representam uma sobreposição por apenas uma fração do comprimento da seqüência da seqüência investi- gada.

Os algoritmos BLASN, FASTA e BLASTP produzem também valores "Expect" (esperados) para os alinhamentos. O valor Expect (E) indica o número de hits que se pode "esperar" ver por um certo número de seqüências contíguas ao acaso quando se pesquisa em uma base de dados de um certo tamanho. O valor Expect é utilizado como um limite de significância para a determinação de se o hit em uma base de dados, tal como a base de dados EMBL preferida, indica uma similaridade verdadeira. Por exemplo, um valor E de 0,1 associado a um hit de polinucleotídeo é interpretado como sendo aquele em uma base de dados do tamanho da base de dados EMBL, poder-se-ia esperar ver combinações 0:1 na parte alinhada da seqüência com uma classificação similar simplesmente ao acaso. Por este critério, as partes alinhadas e combinadas das seqüências de polinucleotídeos então apresentam uma probabilidade de 90% de serem as mesmas. Para seqüências apresen- tando um valor E de 0,01 ou menos nas partes alinhadas e combina- das, a probabilidade de se encontrar uma combinação ao acaso na base de dados EMBL é de 1% ou menos utilizando-se os algoritmos BLASTN ou FASTA.

De acordo com uma modalidade, os polinucleotídeos e poli- peptídeos "variantes" em relação a cada um dos polinucleotídeos e polipeptídeos da presente invenção, preferivelmente compreendem seqüências apresentando o mesmo número ou menos ácidos nucléicos ou aminoácidos do que cada um dos polinucleotídeos ou polipeptídeos da presente invenção e produzindo um valor E de 0,01 ou menor quando em comparação com o polinucleotídeo ou polipeptídeo da presente invenção. Isto é, um polinucleotídeo ou polipeptídeo variante é qualquer seqüência que apresente pelo menos uma probabilidade de 99% de ser o mesmo de 0,01 ou menor utilizando-se os algoritmos BLASTN, FASTA ou BLASTP ajustados nos parâmetros descritos acima.

Alternativamente, polinucleotídeos variantes da presente invenção se hibridizam a seqüências de polinucleotídeos apresentadas nas SEQ ID Nos.: 1-230, ou complementos, seqüências reversas ou complementos reversos a estas seqüências, sob condições de estringên- cia.

A presente invenção engloba polinucleotídeos que diferem das seqüências descritas, mas que, como conseqüência, da degeneração do código genético, codificam um polipeptídeo que é o mesmo que é codificado por um polinucleotídeo da presente invenção. Desta forma, poiinucleotídeos compreendendo seqüências que diferem das seqüên- cias de polinucleotídeo apresentadas nas SEQ ID Nos.: 1-230, ou complementos, seqüências reversas, ou complementos reversos destas, como resultado de substituições conservativas são contempladas e englobadas pela presente invenção. Além disso, poiinucleotídeos compreendendo seqüências que diferem das seqüências de polinucleotí- deo apresentadas nas SEQ ID Nos.: 1-230, ou complementos, comple- mentos reversos ou seqüências reversas destas, como resultado de deleções e/ou inserções totalizando menos de 10% do comprimento total da seqüência são também contemplados e englobados pela presen- te invenção. De modo semelhante, polipeptídeos compreendendo seqüências que diferem das seqüências de polipeptídeo apresentadas nas SEQ ID Nos.: 231-460, como resultado de substituições, inserções e/ou deleções de aminoácidos totalizando menos de 10% do compri- mento total da seqüência são contemplados e englobados pela presente invenção. Em algumas realizações, as variantes dos polipeptídeos da invenção possuem atividades biológicas que são as mesmas ou simila- res às dos polipeptídeos da invenção. Esses polipeptídeos variantes funcionam durante a biossíntese e desenvolvimento da parede celular e/ou desenvolvimento de madeira.

Em adição ao fato de apresentar uma identidade percentual especificada para um polinucleotídeo ou polipeptídeo da invenção, os poiinucleotídeos e polipeptídeos variantes preferivelmente apresentam características estruturais e/ou funcionais adicionais em comum com polinucleotídeo ou polipeptídeo da invenção. Os polipeptídeos apresen- tando um grau especificado de identidade com um polipeptídeo da presente invenção compartilham um alto grau de similaridade em suas estruturas primárias a apresentam propriedades funcionais substanci- almente similares. Em adição ao compartilhamento de um alto grau de similaridade em suas estruturas primárias com poiinucleotídeos da presente invenção, polinucleotídeos apresentando um grau especificado de identidade ou capazes de hibridização, com um polinucleotídeo da invenção preferivelmente apresentam pelo menos uma das seguintes características: (i) contêm uma quadro de leitura aberto ou quadro de leitura aberto parcial que codifica um polipeptídeo apresentando substancialmente as mesmas propriedades funcionais que o polipeptí- deo codificado pelo polinucleotídeo da invenção; ou (ii) apresentam domínios em comum.

Promotores

Os polinucleotídeos da presente invenção podem ser utili- zados para direcionar especificamente a expressão de polipeptídeos ou proteínas nos tecidos de plantas. Os ácidos nucléicos da presente invenção podem ser também utilizados para direcionar especificamente a expressão de RNA anti-senso, ou RNA envolvido na interferência de RNA (RNAi) tal como RNA de interferência pequeno (siRNA), nos tecidos de plantas, o que pode ser útil para a inibição ou bloqueio total da expressão de genes alvo. Conforme utilizado aqui, tecido vascular vegetal refere-se a tecido de xilema, floema ou câmbio vascular. Preferi- velmente, os promotores da invenção são ou "preferidos de xilema", "preferidos de câmbio" ou "preferidos de floema" e direcionam a expres- são de um segmento de ácido nucléico ligado operativamente no xilema, câmbio ou floema, respectivamente. Conforme utilizado aqui, "produto de codificação" quer dizer um produto final do ácido nucléico que está ligado operativamente aos promotores. Por exemplo, uma proteína ou um polipeptídeo é um produto de codificação, bem como RNA anti- senso ou siRNA que são produtos finais da codificação do ácido nucléico para o RNA anti-senso. O produto de codificação pode ser também mRNA não traduzido. Os termos polipeptídeo e proteína são utilizados aqui indiferentemente entre si. Por preferido de xilema, por exemplo, quer-se dizer que as moléculas de ácidos nucléicos da presente inven- ção são mais ativos no xilema que em qualquer outro tecido vegetal. Com maior preferência, os ácidos nucléicos da presente invenção são promotores que são ativos especificamente no xilema, câmbio ou floema, significando que os promotores são ativos apenas no tecido de xilema, câmbio ou floema de plantas, respectivamente. Em outras palavras, um promotor "específico de xilema", por exemplo, aciona a expressão de um produto de codificação de tal forma que níveis detectá- veis do produto de codificação são expressos apenas em tecido de xilema da uma planta. Entretanto, tendo em vista o transporte de solutos em plantas, o produto de codificação que é especificamente expresso no xilema, floema, ou câmbio pode ser encontrado em qual- quer parte na planta e, desta forma, sua presença não está necessaria- mente confinada ao tecido de xilema. Um promotor vascular preferido, por outro lado, pode ser preferencialmente ativo em qualquer um dos tecidos de xilema, floema ou câmbio, ou em pelo menos dois dos três tipos de tecido. Um promotor vascular específico é especificamente ativo em qualquer um de xilema, floema ou câmbio, ou pelo menos em dois dos três.

Conforme utilizado aqui, promotor quer dizer um ácido nu- cléico, preferivelmente DNA que liga RNA polimerase e/ou outros elementos reguladores de transcrição. Tal como com qualquer promo- tor, os promotores da presente invenção irão facilitar ou controlar a transcrição do DNA ou RNA para gerar uma molécula de mRNA a partir de uma molécula de ácido nucléico que está operativamente ligada ao promotor. O RNA pode codificar uma proteína ou polipeptídeo ou pode codificar um RNA de interferência, ou molécula anti-senso. Conforme utilizado aqui, o termo "ligado operativamente" refere-se à fusão, à ligação ou à síntese químicas de DNA de tal forma que uma combinação promotor-seqüência de ácidos nucléicos é formada em uma orientação apropriada para que a seqüência de ácidos nucléicos seja transcrita em um segmento de RNA. Os promotores da presente invenção podem conter também algumas ou todas as regiões 5' não traduzidas (5' UTR) do transcrito de mRNA resultante. Por outro lado, os promotores da presente invenção não necessariamente necessitam possuir qualquer uma das 5' UTR.

Um promotor, conforme utilizado aqui, pode incluir também elementos reguladores. Contrariamente, um elemento regulador pode ser também separado de um promotor. Elementos reguladores confe- rem uma variedade de características importantes à região promotora. Alguns elementos ligam fatores de transcrição que amplificam a taxa de transcrição do ácido nucléico operativamente ligado. Outros elementos ligam repressores que inibem a atividade de transcrição. O efeito dos fatores de transcrição sobre a atividade promotora pode determinar se a atividade promotora é alta ou baixa, isto é, se o promotor é "forte" ou "fraco".

Noutra modalidade, um promotor constitutivo pode ser uti- lizado para a expressão das seqüências de polinucleotídeo da invenção. Exemplos de promotores constitutivos que podem ser úteis para a expressão de um gene de parede celular ou biossíntese de madeira são: promotor do vírus do mosaico da couve-flor 35S (CaMV), que confere um alto nível de expressão constitutiva (Odel e colaboradores, Nature 313:810(1985)); o promotor da nopalina sintase (An e colaboradores, PlantPhysiol 88:547 (1988)); e o promotor da octopina sintase (Fromm e colaboradores, Plant Cell 1:977 (1989)).

Noutra modalidade, uma variedade de promotores de gene vegetal induzíveis pode ser utilizada para a expressão das seqüências de polinucleotídeo da invenção. Promotores induzíveis regulam a expres- são genética em resposta a sinais ambientais, hormonais ou químicos. Exemplos de promotores induzidos por hormônio incluem promotores induzidos por auxina (Baumann e colaboradores, Plant Cell 11:323- 334(1999)), promotor induzido por citoquinina (Guevara-Garcia Plant Mol Biol 38:743-753(1998)), e promotores responsivos a giberelina (Shi e colaboradores, Plant Mol Biol 38:1053-1060(1998)). Além disso, promotores responsivos à luz, calor, ferimento, a patógeno e produtos químicos tais como jasmonato de metila ou ácido salicílico, podem ser utilizados para a expressão das seqüências de polinucleotídeo da invenção.

Construções de DNA

A presente invenção provê construções de DNA compreen- dendo as moléculas de ácidos nucléicos isoladas e seqüências de polipeptídeo da presente invenção. Em uma realização, as construções de DNA da presente invenção são plasmídeos Ti derivados de A. tumefa- ciens.

No desenvolvimento de construções de ácido nucléico desta invenção, os vários componentes da construção ou fragmentos desta serão normalmente inseridos em um vetor de clonagem conveniente, por exemplo, um plasmídeo que seja capaz de replicação em um hospedeiro bacteriano, por exemplo, E. coli. Numerosos vetores existem que foram descritos na literatura, muitos dos quais são comercialmente disponíveis. Após cada clonagem, o vetor de clonagem com a inserção desejada pode ser isolado e submetido a manipulação adicional, tal como digestão de restrição, inserção de novos fragmentos ou nucleotí- deos, ligação, deleção, mutação, recorte, etc. para se construir os componentes da seqüência desejada. Uma vez completa a construção, pode então ser transferida para um vetor apropriado para manipulação adicional de acordo com a maneira de transformação da célula hospe- deira.

Uma molécula de DNA recombinante da invenção tipica- mente inclui um marcador selecionável de tal forma que as células transformadas podem ser facilmente identificadas e selecionadas das células não transformadas. Exemplos de tais marcadores incluem, mas sem limitação, um gene da neomicina fosfotransferase (nptll) (Potiykus e colaboradores, Mol Gen. Genet. 199:183-188 (1985)), que confere resistência à kanamicina. Células expressando o gene nptll podem ser selecionadas utilizando-se um antibiótico apropriado tal como kanami- cina ou G418. Outros marcadores selecionáveis comumente utilizados incluem o gene bar, que confere resistência ao bialafos; um gene mutante da EPSP sintase (Hinchee e colaboradores, Bio/Technology 6:915-922 (1988)), que confere resistência ao glifosato; e um gene mutante da acetolactato sintase (ALS), que confere resistência à imida- zolinona ou à sulfoniluréia (Pedido de Patente europeu 154.204, 1985).

Além disso, os vetores podem incluir uma origem de repli- cação (replicons) para uma célula hospedeira particular. Vários repli- cons procarióticos são conhecidos dos especialistas na técnica, e funcionam no sentido a dirigir a replicação e manutenção de uma molécula recombinante em uma célula hospedeira procariótica.

Os vetores conterão preferivelmente marcadores selecioná- veis para a seleção em células vegetais. Numerosos marcadores sele- cionáveis para uso na seleção de células vegetais transfectadas incluem, mas, sem limitação, genes de resistência à kanamicina, glifosato e resistência à tetraciclina ou ampicilina para cultivo em E. coli, A, tumefaciens e outras bactérias.

Para a secreção da proteína traduzida no lúmen do retículo endoplasmático, espaço periplasmático ou no ambiente extracelular, sinais de secreção apropriados podem ser incorporados no polipeptídeo expresso. Os sinais podem ser sinais endógenos ao polipeptídeo ou podem ser heterólogos.

Em uma realização, uma construção de DNA da presente invenção é desenhada de tal forma que uma seqüência de polinucleotí- deo descrita aqui é ligada operativamente a um promotor específico para tecido. Preferivelmente, o polinucleotídeo codifica um polipeptídeo envolvido na biossíntese de madeira ou de parede celular. Polinucleotí- deos que codificam muitas das enzimas envolvidas na biossíntese de madeira ou de parede celular incluem, mas sem limitação, álcool cinamílico desidrogenase (CAD), cinamato 4-hidroxilase (C4H), cumara- to 3-hidroxilase (C3H), fenolase (PNL), O-metil transferase (OMT), cinamoil-CoA redutase (CCR), fenilalanina amônia liase (PAL), 4- cumarato:CoA ligase (4CL) e peroxidase (POX) de pinheiro. Patente US 6.204.434. Outras enzimas incluem coniferina β-glicosidase (CBG), e ácido caféico 3-O-metil transferase (COMP). Patente US 5.451.514, WO 94/23044 e Dharmawardhana e colaboradores, PlantMol Biol 40: 365- 72 (1999).

Noutra modalidade, a seqüência de codificação operativa- mente ligada ao promotor pode codificar um produto genético que inibe a expressão ou atividade de enzimas envolvidas na biossíntese de madeira ou de parede celular. Por exemplo, de particular interesse para o controle da biossíntese de lignina é um gene anti-senso que codifica 4CL, CAD, LIM, TED2 ou COMT.

Numa realização adicional, as construções de DNA da pre- sente invenção são desenhadas de tal forma que as seqüências de polinucleotídeo da presente invenção são operativamente ligadas a DNA ou RNA que codificam RNA anti-senso ou RNA de interferência, que correspondem aos genes que codificam polipeptídeos de interesse, resultando em uma expressão reduzida dos produtos genéticos alvos. Preferivelmente, os produtos genéticos alvo para supressão são enzimas envolvidas na biossíntese de lignina. A utilização de inibição por RNAi da expressão genética é descrita na Patente US 6.506.559, e a utilização de RNAi para inibir a expressão genética em plantas é especificamente descrita no documento WO 99/61631, ambos incorporados aqui como referência. A utilização de tecnologia anti-senso para reduzir ou inibir a expressão de genes vegetais específicos foi descrita, por exemplo, na Publicação de Patente européia n° 271988. A redução da expressão genética levou a uma alteração no fenótipo da planta, ou ao nível de uma diferença fenotípica visível grosseira, por exemplo, uma ausência de síntese de licopeno no fruto to tomateiro levando à produção de frutos amarelos em vez de vermelhos, ou a um nível bioquímico mais sutil, por exemplo, uma alteração na quantidade de poligalacturonase e redução na despolimerização de pectinas durante o amadurecimento de frutos de tomate (Smith e colaboradores, Nature, 334:724-726 (1988); Smith e colaboradores, Plant Mol Biol, 14:369-379 (1990)). Desta forma, demonstrou-se que RNA anti-senso é útil para se obter a redu- ção da expressão genética em plantas.

Numa modalidade, uma seqüência de polinucleotídeo da in- venção é capaz de ser transcrita em uma planta para produzir um transcrito de RNA anti-senso que é introduzido na planta, por exemplo, em uma célula vegetal. O polinucleotídeo da invenção pode ser prepa- rado, por exemplo, por reversão da orientação de uma seqüência genética em relação ao seu promotor. A transcrição de DNA exógeno na célula vegetal gera um transcrito de RNA intracelular que é "anti-senso" em relação a este gene.

A invenção prove também células hospedeiras que compre- endem as construções de DNA da presente invenção. Conforme utiliza- do aqui, o termo "célula hospedeira" refere-se à célula em que o produto de codificação é de fato expresso. Da mesma forma, uma célula hospe- deira pode ser uma célula individual, uma cultura de célula ou células como parte de um organismo. A célula hospedeira pode ser também uma parte de um embrião, endosperma, esperma ou célula ovo ou um ovo fertilizado.

Da mesma forma, a presente invenção provê também plan- tas OU células vegetais compreendendo as construções de DNA da presente invenção. Preferivelmente, as plantas são angiospermas ou gimnospermas. A construção de expressão da presente invenção pode ser utilizada para transformar uma variedade de plantas, tanto monoco- tiledôneas (por exemplo, gramíneas, milho, grãos, aveia, trigo e cevada), dicotiledôneas (por exemplo, Arabídopsis, tabaco, legumes, alfafa, carvalhos, eucalipto, bordo), e gimnospermas (por exemplo, pinheiro escocês; ver Aronen, Finnish Forest Res. Papers, vol. 595, 1996), abeto branco (Ellis e colaboradores, Biotechnology 11:84-89, 1993), e lariço (Huang e colaboradores, In Vitro Cell 27:201-207, 1991).

Preferivelmente, a planta alvo é selecionada do grupo con- sistindo em espécies de eucalipto e pinheiro, com maior preferência do grupo consistindo em Eucalyptus grandis e seus híbridos, e Pinus taeda. Também preferivelmente, a planta alvo é selecionada do grupo consis- tindo em Pinus banksiana, Pinus brutia, Pinus caribaea, Pinus clasusa, Pinus contorta, Pinus coulteri, Pinus echinata, Pinus eldarica, Pinus ellioti, Pinus jeffreyi, Pinus lambertiana, Pinus massoniana, Pinus monticola, Pinus nigra, Pinus palustrus, pinus pinaster, Pinus ponderosa, Pinus radiata, Pinus resinosa, Pinus rígida, Pinus serotina, Pinus stro- bus, Pinus sylvestrís, Pinus taeda, Pinus virginiana, Abies amabilis, Abies balsamea, Abies concolor, Abies grandis, Abies lasiocarpa, Abies magniflca, Abies procera, Chamaecyparis lawsoniona, Chamaecyparis nootkatensis, Chamaecyparis thyoides, Juniperus virginiana, Larix decidua, Larix larieina, Larix leptolepis, Larbc oceidentalis, Larix siberiea, Libocedrus decurrens, Pieea abies, Pieea engelmanni, Pieea glauca, Pieea mariana, Picea pungens, Pieea rubens, Pieea sitehensis, Pseudotsuga menziesii, Sequoia gigantea, Sequoia sempervirens, Taxodium distiehum, Tsuga eanadensis, Tsuga heterophylla, Tsuga mertensiana, Thuja oceidentalis, Thuja plicata, Eucalyptus alba, Eucalyptus bancroftii, Eucalyptus botryoides, Eucalyptus bridgesiana, Eucalyptus ealophylla, Eucalyptus camaldulensis, Eucalyptus eitriodora, Eucalyptus eladoealyx, Eucalyptus coccifera, Eucalyptus eurtisii, Eucalyptus dalrympleana, Eucalyptus deglupta, Eucalyptus delagatensis, Eucalyptus diversieolor, Eucalyptus dunnii, Eucalyptus fieifolia, Eucalyptus globulus, Eucalyptus gomphoeephala, Eucalyptus gunnii, Eucalyptus henryi, Eucalyptus laevopinea, Eucalyptus maearthurii, Eucalyptus maerorhyneha, Eucalyp- tus maculata, Eucalyptus marginata, Eucalyptus megaearpa, Eucalyptus melliodora, Eucalyptus nicholii, Eucalyptus nitens, Eucalyptus nova- angeliea, Eucalyptus oblíqua, Eucalyptus oceidentalis, Eucalyptus obtusiflora, Eucalyptus oreades, Eucalyptus paueiflora, Eucalyptus polybraetea, Eucalyptus regnans, Eucalyptus resinifera, Eucalyptus robusta, Eucalyptus rudis, Eucalyptus saligna, Eucalyptus sideroxylon, Eucalyptus stuartíana, Eucalyptus teretieomis, Eucalyptus torelliana, Eucalyptus urnigera, Eucalyptus urophylla, Eucalyptus viminalis, Eucalyptus viridis, Eucalyptus wandoo, e Eucalyptus youmanni.

Em particular, a planta transgênica pode ser da espécie Eu- eályptus grandis ou seus híbridos, Pinus radiata, Pinus taeda L (pinhei- ro loblolly), Populus nigra, Populus deltoides, Populus alba, ou Populus híbridos, Aeaeia mangium, ou Liquidamber styraeiflua. Além do signifi- cado normal de planta, pelo termo "planta" pretende-se significar também fruto, sementes, flor, estróbilo, etc. A planta da presente invenção pode ser um transfectante direto, significando que a constru- ção de DNA foi introduzida diretamente na planta, tal como através de Agrobaeterium, ou a planta pode ser a progênie de uma planta transfec- tada. A segunda geração e gerações subseqüentes da planta podem ser ou não produzidas por reprodução sexual, isto ê, por fertilização. Além disto, a planta pode ser uma gametófita (estágio haplóide) ou uma esporófita (estágio diplóide).

Numa modalidade, a presente invenção provê polinucleotí- deos isolados que codificam, ou codificam parcialmente, proteínas de madeira ou de parede celular que estão envolvidas na biossíntese de parede celular. Os polinucleotídeos da presente invenção foram isola- dos de Eucalyptus grandis e de Pinus radiata, mas podem ser isolados de qualquer espécie vegetal ou sintetizados utilizando-se técnicas de síntese convencionais.

Em realizações específicas, os polinucleotídeos isolados da presente invenção compreendem uma seqüência selecionada do grupo consistindo nas seqüências identificadas como SEQ ID Nos.: 1-230, complementos das seqüências identificadas como SEQ ID Nos.: 1-230, complementos reversos das seqüências identificadas como SEQ ID Nos.: 1-230, seqüências reversas das seqüências identificadas como SEQ ID Nos.: 1-230, seqüências compreendendo pelo menos um número específico de resíduos contíguos (x-meros) de qualquer um dos polinu- cleotídeos mencionados acima, seqüências estendidas correspondendo a qualquer um dos polinucleotídeos acima, seqüências anti-senso correspondendo a qualquer um dos polinucleotídeos acima, e variantes de qualquer um dos polinucleotídeos acima, já que este termo é descrito neste relatório.

Noutro aspecto, a presente invenção provê polipeptídeos isolados codificados pelos polinucleotídeos das SEQ ID Nos.: 231-460.

Foram preparadas bibliotecas de expressão de cDNA de Eu- calyptus grandis e de Pinus radiata a partir de botões florais maduros, floema de madeira jovem, tecido floral, tecido foliar, raiz de alimentação, raízes estruturais, xilema ou xilema de madeira jovem. A seqüência de cDNA de clones positivos contendo inserções foi obtida utilizando-se métodos conhecidos na técnica. As seqüências de cDNA determinadas foram comparadas com seqüências conhecidas das bases de dados públicas (EMBL) utilizando-se os algoritmos FASTA e/ou BLASTN. Alinhamentos múltiplos de seqüências redundantes foram utilizados para construir seqüências consenso confiáveis. As seqüências de cDNA determinadas são providas nas SEQ ID Nos.: 1-230. As seqüências de polipeptídeo previstas são providas nas SEQ ID Nos.: 231-460. Com base na similaridade com seqüências conhecidas de outras espécies vegetais, as seqüências de polinucleotídeo isoladas foram identificadas como codificadoras de proteínas de madeira e parede celular, conforme detalhado nas Tabelas 1 e 2. As seqüências de polipeptídeo foram analisadas com um programa de computador de anotação disponível publicamente. A "InterPro Scan" disponível publi- camente da EMBL foi utilizada para a identificação de motivos e domí- nios nas presentes seqüências de polipeptídeo. A InterPro é uma base de dados de famílias, dominós e sítios funcionais de proteínas, na qual características identificáveis encontradas em proteínas conhecidas podem ser aplicadas a seqüências de proteína desconhecidas. Mulder, N. J. e colaboradores, 2003, Nucl AcidRes. 31: 315-318.

Conforme mostrado nas Tabelas 1 e 2, os polinucleotídeos da invenção codificam proteínas de madeira e de parede celular. Estes polinucleotídeos podem ser utilizados para a regulação da biossíntese e desenvolvimento de parede celular. Tabela 1

Proteínas de Paredes Celulars Isoladas

de P. radiata

Polinucleotídeo Polipeptxdeo Família da Proteína SEQ ID No.: SEQ ID No.: 1,3-p-D-glucanase 3-29 233-259 a-Expansina 111-130 341-360 Calnexina 1-2 231-232 Dirigente 91-110 321-340 Endo-1,4~p-xilanase 30 260 Exo-1,4-p-xilanase 31-37 261-267 Glucana l,3-p-glicosidase 39-44 268-274 Liqueninase 45-52 275-282 Manose-6-fosfato isomerase 58 288 Manose-1 -fosfato guanililtransfe- rase 53-57 283-287 Sacarose-fosfato sintase 59-60 289-290 Xiloglucana:xiloglicosil transfera- se 61-90 291-320 Yeldin 131 361 Tabela 2

Proteínas de Madeira e de Paredes Celulares Isoladas

de E. grandis

Família da Proteína Polinucleotídeo Polipeptídeo SEQ ID No.: SEQ ID No.: 1,3-3-D-glucanase 142-158 372-388 a-Expansina 217-228 447-458 Calnexina 132-136 362-366 Dirigente 208-216 438-446 Endo-1,4-p-xilanase 159-161 389-391 Exo-l,4-P-xilanase 162-165 392-395 Glucana l,3-3-glicosidase 166-172 396-402 Liqueninase 173-179 403-409 Manose-6-fosfato isomerase 183 413 Manose-1 -fosfato guanililtransfe- rase 180-182 410-412 Sacarose-fosfato sintase 184-186 414-416 Sacarose sintase 137-141 367-371 Xiloglucana.-xiloglicosil transfera- se 187-207 417-437 Yeldin 229-230 459-460

Os polipeptídeos codificados pelos polinucleotídeos da pre- sente invenção podem ser expressos e utilizados em vários ensaios para se determinar sua atividade biológica. Esses polipeptídeos podem ser utilizados para produzir anticorpos, para isolar proteínas interativas correspondentes ou outros compostos e para se determinar quantitati- vamente os níveis de proteínas interativas ou outros compostos. Transformação e Regeneração Vegetal

Os presentes polinucleotídeos e polipeptídeos podem ser in- troduzidos em uma célula vegetal hospedeira por procedimentos padrão conhecidos na técnica para a introdução de seqüências recombinantes em uma célula hospedeira alvo. Tais procedimentos incluem, mas sem limitação, transfecção, infecção, transformação, absorção natural, eletroporação, biolística e Agrobacterium. Métodos para a introdução de genes exógenos em plantas são conhecidos na técnica e podem ser utilizados para inserir uma construção da invenção em uma planta hospedeira, incluindo protocolos de transformação vegetal biológica e física. Ver, por exemplo, Miki e colaboradores, 1993, "Procedure for Introducing Foreign DNA into FlantsT, In: "Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnologx/', Glick & Thompson, eds., CRC Press, Inc., Boca Raton, páginas 67-88. Os métodos escolhidos variam com a planta hospedeira e incluem métodos de transfecção química tais como fosfato de cálcio, transferência genética mediada com microrganismo tal como Agrobacterium (Horsch e colaboradores, Science 227:1229-31, 1985), eletroporação, micro-injeção e bombardeamento biolístico.

Da mesma forma, a presente invenção provê também plan- tas e células vegetais compreendendo os polinucleotídeos ou polipeptí- deos da presente invenção. Em uma realização, as plantas são angios- permas ou gimnospermas. Noutra modalidade, as plantas são selecio- nadas de espécies de Eucalyptus e Pinus. Em particular, a planta transgênica pode ser das espécies Eucalyptus grandis e híbridos, Pinus radiata, Pinus taeda L (pinheiro loblolly), Populus nigra, Populus deltoi- des, ou Liquidamber styraciflua. Além do significado normal de planta, pelo termo "plantas" pretende-se significar também fruto, sementes, flor, estróbilo, etc. A planta da presente invenção pode ser um transfec- tante direto, significando que o vetor foi introduzido diretamente na planta, tal como através de Agrobacterium, ou a planta pode ser a progênie de uma planta transfectada. A progênie pode ser obtida também por reprodução assexuada de uma planta transfectada. A segunda geração e gerações subseqüentes da planta podem ser ou não produzidas por reprodução sexual, isto é, por fertilização. Além disto, a planta pode ser uma gametófita (estágio haplóide) ou uma esporófita (estágio diplóide).

Métodos para a transformação de espécies arbóreas são bem conhecidos na técnica. Não sendo limitante, explante refere-se a tecido vegetal que é um alvo para a transformação e pode incluir tecidos foliares, pecíolo, florais e internodais coletados de plantas crescidas in vivo e/ou in vitro. Por exemplo, uma árvore pode ser transformada como se segue. Para eficiência de transformação aumentada, um explante de árvore pode ser coletado e cultivado em um meio de pré- cultura antes da transformação. Um meio de pré-cultura, como mostrado na Tabela 3, é um meio nutriente sobre o qual são cultivados explantes vegetais antes da transformação com Agrobacterium e é necessário para o aumento da eficiência de transformação e regenera- ção da planta. O meio de pré-cultura compreende um indutor de Agrobacterium, tal como acetosiringona. O meio de pré-cultura pode opcionalmente compreender reguladores de crescimento vegetal, incluindo auxina e citoquinina. Alternativamente, outros meios de pré- cultura e períodos de tempo de cultura podem ser utilizados. Tabela 3

Meio de Pré-Cultura Vegetal

Meio Quantidade por Litro Sais WPM 1 pacote (Sigma) Ca(N03)2.4H20 3,7 g MgSO4.4H20 0,37 g Acido Nicotínico 0,5 mg Tiamina HCl 0,5 mg Piridoxina HCl 0,5 mg Ácido D-Pantotênico 1,0 mg Mioinositol 0,1 g BA 0,1 - 1 mg Bacto-agar 5 - 8 g Acetosiringona 5 - 200 mg NAA 0,2 - 3 mg Zeatina 1-6 mg

Na presente invenção, os explantes vegetais foram pré- cultivados por quatro dias no escuro no meio de pré-cultura mostrado na Tabela 3. Sais de meio para planta lenhosa (WPM - Woody Plant Médium) (Loyd e McCown, 1980) foram utilizados no presente meio de pré-cultura, entretanto, outros meios salinos, tais como meio MS (Murashige e Skoog 1962) ou o meio de Lepoivre, podem ser utilizados.

Embora o presente meio de pré-cultura compreenda acetosiringona, outros indutores de Agrobactedum podem ser utilizados. Opcionalmen- te, o presente meio de pré-cultura continha tanto auxina quanto citoquinina. Outros meios de pré-cultura e outros períodos de tempo de cultura podem ser utilizados. A cultura de Agrobacterium induzida foi preparada por mé- todos conhecidos na técnica. A cultura induzida foi gotejada sobre cada explante por pipeta. Suficiente cultura de Agrobacterium foi gotejada para se assegurar que todas as bordas fossem cobertas com a solução bacteriana. Alternativamente, os explantes podem ser transformados por infiltração a vácuo, imersão floral e outros métodos de transforma- ção mediada por Agrobacterium. Após a transformação, os explantes cobertos com a cultura de Agrobacterium foram colocados no escuro por quatro dias de co-cultivo. Alternativamente, os explantes podem ser co- cultivados com Agrobacterium sob condições de luz. Além disso, os explantes podem ser co-cultivados com Agrobacterium sob condições de luz ou escuro por de 2-10 dias, preferivelmente 4 dias. Após o co- cultivo, os explantes foram transferidos para meio de regeneração (Tabela 4) com 400 mg/l de timentina. Não há necessidade de se lavar os explantes. Os explantes foram cultivados neste meio por quatro dias antes de serem transferidos para um meio de seleção. No presente exemplo, o meio de seleção é o meio de regeneração suplementado tanto com timentina quanto com um agente de seleção herbicida. Tabela 4 Meio de Regeneração

Componentes por litro de meio Gramas

KNO3 1

NH4H2PO4 0,25

MgSO4.7H20 0,25

CaCl2.2H20 0,10

FeSO4.7H20 0,0139

Na2EDTA.2H20 0,01865

MES (Duchefa ml501) 600,0 MS Micro (1/2 potência)

MnSO4-H2O 0,00845

ZnSO4.7H20 0,0043

CuSO4.5H20 0,0000125

CoCl2.6H20 0,0000125

KI 0,000415

H3BO3 0,0031

Na2MoO4.2H20 0,000125

Zeatina NAA (ácido naftalenoacético)

Glicose/sacarose 20,0

Mioinositol 0,100

Ácido Nicotínico 0,010

Tiamina 0,010

Pantotenato de cálcio 0,001

Piridoxina 0,001

Biotina 0,00001

Ácido Ascórbico 0,050 L-glutamina Arginina Glicina Lisina Metionina Fenilalanina Serina Treonina Triptofano Tirosina Gelrite

0,1 0,0258 0,00199 0,0508 0,0132 0,0257 0,00904 0,00852 0,0122 0,0127 3^0

Os grupos de brotações que sobreviveram à seleção são mantidos em meio de regeneração contendo herbicida e timentina, e são transferidos a cada 3 semanas até a proliferação das brotações e início do alongamento. Para os experimentos de transformação com um gene repórter, tal como GUS, tecidos foliares e de caule das brotações regeneradas foram marcados para a expressão de GUS assim que os brotos se desenvolveram. Embora qualquer gene repórter possa ser utilizado, tal como GFP ou luciferase, a expressão de GUS foi ensaiada na presente invenção pelos métodos conhecidos na técnica.

A marcação com GUS foi realizada para se monitorar a fre- qüência da infecção com Agrobacterium a para se assegurar que as brotações selecionadas não são desvios ou quimeras. Tecidos foliares e de caule de brotações regeneradas foram marcados para a expressão de GUS imediatamente quando do desenvolvimento da brotação. De maneira a se determinar a atividade de GUS, os explantes foram incubados em um substrato compreendendo tampão fosfato 100 mM (pH 7,0), dimetil sulfóxido 0,05%, Triton X-IOO 0,05%, EDTA 10 mM, ferrocianeto de potássio 0,5 mM, e 1,5 mg/ml de 5-bromo-4-cloro-3- indolil-p-D-glucuronídeo (X-gluc). Os explantes foram submetidos a 10 minutos de vácuo antes de uma incubação por uma noite a 37°C. Após a incubação por uma noite, foram contados os focos de GUS.

B - Perfil de Expressão de Polinucleotídeos de Parede Celular Vegetal

A presente invenção provê também métodos e ferramentas para a realização da formação de perfil de expressão dos polinucleotí- deos de parede celular vegetal. A formação de perfil de expressão é útil na determinação de se os polinucleotídeos são transcritos ou traduzi- dos, se comparando os níveis de transcritos para um polinucleotídeo particular em diferentes tecidos, genotipagem, estimativa do número de cópias de DNA, determinação da identidade de descendentes, determi- nação das taxas de decaimento de mRNA, identificação dos sítios de ligação de proteína, determinação da localização sub-celular dos produtos genéticos, correlação da expressão de polinucleotídeo a um fenótipo ou outro fenômeno, e determinação do efeito sobre outros polinucleotídeos da manipulação de um gene particular. A formação do perfil de expressão é particularmente útil para a identificação da expressão de polinucleotídeo em um complexo, eventos multigênicos. Por esta razão, a formação do perfil de expressão é útil na correlação da expressão de um polinucleotídeo com o fenótipo vegetal e formação da planta.

Apenas uma pequena fração dos genes do genoma de uma planta é expressa em um dado momento em uma dada amostra de tecido e todos os genes expressos podem não afetar o fenótipo vegetal. De maneira a se identificar polinucleotídeos capazes de afetar um fenótipo de interesse, a presente invenção provê métodos e ferramentas para a determinação, por exemplo, do perfil de expressão de um polinu- cleotídeo a um dado ponto no desenvolvimento vegetal e o perfil de expressão de um gene em uma dada amostra de tecido. A invenção provê também métodos e ferramentas para os polinucleotídeos da invenção cuja expressão pode ser manipulada para se alterar um fenótipo vegetal ou se alterar a atividade biológica de outros produtos de transcrição ou tradução. Em suporte a estes métodos, a invenção provê também métodos e ferramentas que distinguem a expressão de diferen- tes polinucleotídeos da mesma família.

Conforme utilizado aqui, o termo "expressão de polinucleo- tídeo" refere-se ao processo de transcrição de uma seqüência de DNA em uma seqüência de RNA, seguida de tradução do RNA em uma proteína, que pode ou não ser submetida a um processamento de pós- tradução. Desta forma, a relação entre o fenótipo e/ou estágio de desenvolvimento e a expressão do polinucleotídeo pode ser observada pela detecção, quantitativa ou qualitativa, das alterações ao nível de um RNA ou de uma proteína. Conforme utilizado aqui, o termo "atividade biológica" inclui, mas sem limitação a, a atividade de um produto genético de proteína, incluindo atividade enzimática.

A presente invenção provê oligonucleotídeos que são úteis nestes métodos de formação de perfil de expressão. Cada oligonucleotí- deo é capaz de se hibridizar sob um dado conjunto de condições a um polinucleotídeo de madeira ou parede celular ou produto de polinucleo- tídeo. Em um aspecto da invenção, uma pluralidade de oligonucleotí- deos é provida, onde cada oligonucleotídeo se hibridiza sob um dado conjunto de condições a um produto genético do ciclo celular diferente. Exemplos de oligonucleotídeos da presente invenção incluem as SEQ ID Nos.: 461-690. Cada um dos oligonucleotídeos das SEQ ID Nos.: 461- 690 se hibridiza sob condições padrão a um produto genético diferente de uma das SEQ ID Nos.: 1-230. Os oligonucleotídeos da invenção são úteis na determinação da expressão de um ou mais genes do ciclo celular em qualquer um dos métodos descritos acima. 1 - Amostras de Célula, Tecido, Ácido Nucléico e Proteína

As amostras para uso nos métodos da presente invenção podem ser derivadas de tecido vegetal. Tecidos vegetais adequados incluem, mas sem limitação, embriões somáticos, pólen, folhas, caules, calos, estolões, micro-tubérculos, brotações, xilema, estróbilo masculi- no, cones de pólen, tecido vascular, meristema apical, câmbio vascular, xilema, raízes, flores, e sementes.

De acordo com a presente invenção, "tecido vegetal" é utili- zado como descrito previamente. O tecido vegetal pode ser obtido de quaisquer das plantas ou espécies vegetais descritas acima.

De acordo com um aspecto da invenção, as amostras po- dem ser obtidas de tecidos vegetais em diferentes estágios de desenvol- vimento, de tecido vegetal em várias estações do ano (por exemplo, primavera versus verão), de tecido vegetal submetido e diferentes condições ambientais (por exemplo, variações de luz e temperatura) e/ou de diferentes tipos de tecido vegetal e células. De acordo com uma realização, o tecido vegetal é obtido durante vários estágios de maturi- dade e durante diferentes estações do ano. Por exemplo, o tecido vegetal pode ser coletado de células de caule em divisão, xilema em diferenciação, células de madeira jovem em desenvolvimento, células de madeira jovem diferenciada, e células de madeira madura diferenciada. Como um outro exemplo, a expressão de polinucleotídeo em uma amostra obtida de uma planta com madeira em desenvolvimento pode ser comparada com a expressão genética em uma amostra obtida de uma planta que não apresenta madeira em desenvolvimento.

Xilema em diferenciação inclui amostras obtidas de madeira de compressão, madeira lateral, e xilema vertical normal. Os métodos para a obtenção de amostras para a formação do perfil de expressão de pinheiro e eucalipto são conhecidos. Ver, por exemplo, Allona e colabo- radores, Proc. NaflAcad. Sei. 95:9693-8 (1998) e Whetton e colaborado- res, Plant Mol Biol 47:2.75-91, e Kirst e colaboradores, uINTL UNION OF FORESTRY RESEARCH ORGANIZA TIONS BIENNIAL CONFERENCE', S6.8 (junho 2003, Umea, Suécia).

Em uma modalidadeda invenção, a expressão de polinucle- otídeo em um tipo de tecido é comparada com a expressão de polinucle- otídeo em um tipo diferente de tecido ou à expressão de polinucleotídeo no mesmo tipo de tecido em um estágio diferente de desenvolvimento. A expressão de polinucleotídeo pode ser também comparada em um tipo de tecido que é amostrado em vários momentos durante o ano (diferen- tes estações). Por exemplo, a expressão de polinucleotídeo em xilema secundário jovem pode ser comparada com a expressão de polinucleotí- deo em xilema secundário maduro. De modo semelhante, a expressão de polinucleotídeo no câmbio pode ser comparada com a expressão de polinucleotídeo em xilema. Além disto, a expressão genética em meris- tema apical pode ser comparada com a expressão genética no câmbio.

Noutra modalidade da invenção, uma amostra é obtida de uma planta apresentando um fenótipo e uma expressão de polinucleotí- deo específicos e esta amostra é comparada com uma amostra obtida de uma planta da mesma espécie que não apresenta este fenótipo. Por exemplo, uma amostra pode ser obtida de uma planta exibindo uma taxa de crescimento rápida e a expressão genética pode ser comparada com a de uma amostra obtida de uma planta que exibe uma taxa normal ou lenta de crescimento. Polinucleotídeos expressos diferenci- almente identificados a partir de tal comparação podem ser correlacio- nados com a taxa de crescimento e, desta forma, serem úteis para a manipulação da taxa de crescimento.

Em uma realização adicional, uma amostra é obtida de plantas propagadas por clonagem. Em uma modalidade, as plantas propagadas por clonagem são das espécies de Pinus ou Eucalyptus. Rametes individuais do mesmo genótipo podem ser sacrificados em diferentes momentos do ano. Desta forma, para qualquer genótipo pode haver pelo menos duas árvores geneticamente idênticas sacrificadas, no início da estação e no final da estação. Cada uma destas árvores pode ser dividida em amostras jovens (topo) e maduras (base). Além disto, as amostras de tecido podem ser divididas em, por exemplo, floema a xilema, em pelo menos 5 camadas de descascamento. Cada uma destas amostras pode ser avaliada para fenótipo e expressão de polinucleotí- deo.

Nos casos em que os componentes celulares podem interfe- rir com a técnica analítica, tal como um ensaio de hibridização, um ensaio enzimático, um ensaio de ligação a ligante, ou um ensaio de atividade biológica, pode ser desejável se isolar os produtos de expres- são do polinucleotídeo de tais componentes celulares. Os produtos de expressão de polinucleotídeo, incluindo ácido nucléico e produtos genéticos de aminoácido, podem ser isolados de fragmentos ou lisados celulares por qualquer método conhecido na técnica.

Os ácidos nucléicos utilizados de acordo com a invenção podem ser preparados por qualquer método ou processo disponível, ou por outros processos que venham a ser conhecidos na técnica. Técni- cas convencionais para o isolamento de ácidos nucléicos são detalha- das, por exemplo, em Tijssen, "LABORATORY TECHNIQUES IN BIO- CHEMISTRY AND MOLECULAR BIOLOGY: HYBRIDIZA TIO N WITH NUCLEIC ACID PROBEScapítulo 3 (Elsevier Press, 1993), Berger e Kimmel, Methods Enzymol 152:1 (1987), e GiBCO BRL & LIFE TECH- NOLOGIES TRIZOL RNA ISOLATION PROTOCOL, formulário n° 3786 (2000). Técnicas para a preparação de amostras de ácido nucléico, e seqüenciamento de polinucleotídeos de pinheiro e eucalipto são conhe- cidas. Ver, por exemplo, Allona e colaboradores, supra e Whetton e colaboradores, supra, e Pedido de Patente US n° 60/476.222. Uma amostra de ácido nucléico pode conter qualquer tipo de ácido nucléico derivado do transcrito de um gene ou polipeptídeo de parede celular ou madeira, isto é, RNA ou uma sub-seqüência deste ou um ácido nucléico para o qual um mRNA transcrito de um gene de parede celular ou madeira serviu como molde. Ácidos nucléicos adequados incluem cDNA reverso transcrito a partir de um transcrito, RNA transcrito a partir deste cDNA, DNA amplificado a partir de cDNA, e RNA transcrito a partir do DNA amplificado. A detecção de tais produtos ou produtos derivados é indicativa da presença e/ou abun- dância do transcrito na amostra. Desta forma, amostras adequadas incluem, mas sem limitação, transcritos de um gene ou de um polinu- cleotídeo, cDNA reverso transcrito a partir de transcrito, cRNA transcri- to a partir do cDNA, DNA amplificado a partir de genes, e RNA transcri- to a partir do DNA amplificado. Conforme utilizada aqui, a categoria de "transcritos" inclui, mas sem limitação, transcritos nascentes pré- mRNA, intermediários de processamento de transcrito e mRNAs madu- ros e produtos da degradação destes.

Não é necessário monitorar todos os tipos de transcritos pa- ra se praticar a invenção. Por exemplo, os métodos de formação de perfil de expressão da invenção podem ser conduzidos pela detecção de apenas um tipo de transcrito, tal como os níveis de mRNA maduro apenas.

Em um aspecto da invenção, uma biblioteca de DNA cro- mossômico ou cDNA (compreendendo, por exemplo, cDNA rotulado por fluorescência sintetizado a partir de mRNA celular total) é preparada para utilização em métodos de hibridização de acordo com métodos reconhecidos na técnica. Ver Sambrook e colaboradores, supra.

Noutro aspecto da invenção, o mRNA é amplificado utili- zando-se, por exemplo, o kit MessageAmp (Ambion). Em um aspecto adicional, o mRNA é rotulado com um rótulo detectável. Por exemplo, mRNA pode ser rotulado com um cromóforo fluorescente, tal como CyDye (Amersham Biosciences).

Em algumas aplicações, pode ser desejável se inibir ou des- truir a RNase que freqüentemente está presente em homogenados e lisados, antes da utilização em técnicas de hibridização. Métodos para inibir ou destruir nucleases são bem conhecidos. Em uma modalidade da invenção, células ou tecidos são homogeneizados na presença de agentes caotrópicos para inibir nuclease. Noutra modalidade, a RNase é inibida ou destruída por tratamento térmico, seguido de tratamento com proteinase.

As amostras de proteína podem ser obtidas por qualquer meio conhecido na técnica. As amostras de proteína úteis nos métodos da invenção incluem lisados brutos de célula e homogenados brutos de tecido. Alternativamente, as amostras de proteína podem ser purifica- das. Vários métodos de purificação de proteína são conhecidos na técnica e podem ser encontrados em Marshak e colaboradores, "STRA- TEGIES FOR PROTEIN PURIFICATION AND CHARACTERIZATION: A LABORATORY COURSE MANUAL" (Cold Spring Harbor Laboratoiy Press (1996)).

2 - Detecção do Nível de Expressão

de Polinucleotídeo

Para os métodos da invenção que compreendem a detecção de um nível de expressão de polinucleotídeo, qualquer método de observação da expressão de polinucleotídeo pode ser utilizado, sem limitação. Esses métodos incluem técnicas de hibridização de ácido nucléico tradicionais, métodos baseados na reação em cadeia de polimerase (PCR), e determinação de proteína. A invenção inclui métodos de detecção que utilizam formatos de ensaio a base de suporte sólido, bem como aqueles que utilizam formatos de ensaio a base de solução.

Medidas absolutas dos níveis de expressão não necessitam ser realizadas, embora possam ser realizadas. A invenção inclui métodos compreendendo comparações de diferenças em níveis de expressão entra amostras. A comparação dos níveis de expressão pode ser realizada visualmente ou manualmente, ou pode ser automatizada e realizada por uma máquina, utilizando-se, por exemplo, meios de detecção óticos. Subrahmanyam e colaboradores, Blood. 97:2457 (2001); Prashar e colaboradores, Methods Enzymol. 303:258 (1999). Estão disponíveis hardware e software para a análise diferencial da expressão de genes, e podem ser utilizados na prática da presente invenção. Ver, por exemplo, GenStat Software e GeneExpress® GX Explorer™ "Training Manual", supra; Baxevanis & Francis-Ouellette, supra.

De acordo com uma realização da invenção, técnicas de hi- bridização de ácido nucléico são utilizadas para se observar a expressão de polinucleotídeo. Técnicas de hibridização típicas incluem Northern blotting, Southern blotting, solução de hibridização, e ensaios de proteção de nuclease SI.

A hibridização de ácido nucléico tipicamente envolve o con- tato de uma sonda de oligonucleotídeo com uma amostra compreen- dendo ácidos nucléicos sob condições em que a sonda pode formar duplexes híbridos estáveis com seu ácido nucléico complementar através de pareamento de base complementar. Por exemplo, ver pedido de patente PCT WO 99/32660; Berger 85 Kimmel, Methods Enzymol 152:1 (1987). Os ácidos nucléicos que não formam duplexes híbridos são então retirados por lavagem deixando os ácidos nucléicos hibridiza- dos para serem detectados, tipicamente através de detecção de um rótulo detectável ligado. O rótulo detectável pode estar presente na sonda, ou na amostra de ácido nucléico. Em uma realização, os ácidos nucléicos da amostra são polinucleotídeos rotulados detectáveis repre- sentando os transcritos de mRNa presentes em um tecido vegetal (por exemplo, biblioteca de cDNA). Rótulos detectáveis são comumente rótulos radioativos ou fluorescentes, no entanto qualquer rótulo capaz de ser detectado pode ser utilizado. Os rótulos podem ser incorporados por várias abordagens descritas, por exemplo, no documento WO 99/32660, supra. Num aspecto, o RNA pode ser amplificado utilizando- se o kit MessageAmp (Ambion) com a adição de aminoalil-UTP bem como UTP livre. Os grupos aminoalil incorporados no RNA amplificado podem ser reagidos com um cromóforo fluorescente, tal como CyDye (Amersham Biosciences).

Duplexes de ácidos nucléicos são desestabilizados pelo au- mento da temperatura ou redução da concentração salina do tampão contendo os ácidos nucléicos. Sob condições de estringência baixa (por exemplo, temperatura baixa e/ou salinidade alta) duplexes híbridos (por exemplo, DNA:DNA, RNA:RNA ou RNA:DNA) serão formados mesmo onde as seqüências aneladas não são perfeitamente complementares. Desta forma, a especificidade da hibridização é reduzida em estringên- cia baixa. Ao contrário, em estringência mais alta (por exemplo, temperatura mais alta e/ou salinidade mais baixa e/ou na presença de reagentes de desestabilização) a hibridização tolera poucos desparea- mentos.

Tipicamente, condições estringentes para sondas curtas (por exemplo, de 10 a 50 nucleotídeos) serão aquelas em que a concen- tração salina é de pelo menos cerca de 0,01 a 0,1 M a pH 7,0 a 8,3 e a temperatura é de pelo menos cerca de 30°C. Condições estringentes podem ser também obtidas com a adição de agentes de desestabilização tais como formamida.

Em algumas circunstancias, pode ser desejável se realizar a hibridização em condições de baixa estringência, por exemplo, 6 χ SSPE-T (NaCl 0,9 Μ, NaH2PO4 60 mM, ρΗ 7,6, EDTA 6 mM, Triton 0,005%) a 37°C, para se assegurar a hibridização. Lavagens subse- qüentes podem ser então realizadas em estringência mais alta (por exemplo, 1 χ SSPE-T a 37°C) para eliminar duplexes híbridos não pareados. Lavagens subseqüentes podem ser realizadas a estringências gradativamente mais altas (por exemplo, de menos de 0,25 χ SSPE-T a

37°C a 50°C) até que o nível desejado de especificidade de hibridização seja alcançado.

Em geral, condições padrão de hibridização são um com- prometimento entre estringência (especificidade de hibridização) e intensidade de sinal. Desta forma, em uma realização da invenção, os ácidos nucléicos hibridizados são lavados sucessivamente em condições de estringência mais alta e lidos a cada lavagem. A análise dos conjun- tos de dados produzidos desta maneira irá revelar uma estringência de lavagem acima da qual o padrão de hibridização não é apreciavelmente alterado e que provê um sinal adequado para as sondas de oligonucleo- tídeo particulares de interesse. Por exemplo, a lavagem final pode ser selecionada como aquela da estringência mais alta que produz resulta- dos e que provê uma intensidade de sinal acima de aproximadamente 10% da intensidade de fundo.

A - Sondas de Oligonucleotídeos

As sondas de oligonucleotídeos úteis em técnicas de hibridi- zação de ácido nucléico empregadas na presente invenção são capazes de se ligarem a um ácido nucléico de seqüência complementar por meio de um ou mais tipos de ligações químicas, usualmente por meio de pareamento de bases complementares via formação de ligação de hidrogênio. Uma sonda pode incluir bases naturais (isto é, A, G, U, C ou T) ou bases modificadas (7-desazaguanosina, inosina, etc.). Além disso, as bases nucleotídicas nas sondas podem ser unidas por uma ligação outra que não uma ligação fosfodiéster, desde que não interfira com a hibridização. Desta forma, as sondas podem ser ácidos nucléicos peptídicos nos quais as bases constituintes são unidas por ligações peptídicas em vez de ligações fosfodiéster.

As sondas de oligonucleotídeos podem ser preparadas por qualquer meio conhecido na técnica. Sondas úteis na presente inven- ção são capazes de se hibridizarem a um produto nucleotídico dos genes da biossíntese da parede celular, tais como uma das SEQ ID Nos.: 1-230. As sondas úteis na invenção podem ser geradas utilizan- do-se seqüências de nucleotídeos descritas nas SEQ ID Nos.: 1-230. A invenção inclui sondas de oligonucleotídeos apresentando pelo menos um fragmento de 2, 10, 15, 20, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, ou 100 nucleotídeos de uma seqüência contígua corresponden- do a qualquer uma das SEQ ID Nos.: 1-230. A invenção inclui oligonu- cleotídeos de menos de 2, 1, 0,5, 0,1 ou 0,05 kb de comprimento. Em uma realização, o oligonucleotídeo contém 60 nucleotídeos de compri- mento.

As sondas de oligonucleotídeos podem ser projetadas por qualquer meio conhecido na técnica. Ver, por exemplo, Li e Stormo, Bioinformatics 17:1067-76 (2001). O desenho das sondas de oligonu- cleotídeos pode ser efetuado utilizando-se um programa de computador. Programas típicos incluem ArrayDesigner, GeneScan, e ProbeSelect. Sondas complementares para uma seqüência de ácidos nucléicos definida podem ser sintetizadas quimicamente, geradas a partir de nucleotídeos mais longos utilizando-se enzimas de restrição, ou podem ser obtidas utilizando-se técnicas tais como a reação em cadeia de polimerase (PCR). Os métodos de PCR são bem conhecidos e são descritos, por exemplo, em Innis e colaboradores, eds., iiPCR PROTO- COLS: A GUIDE TO METHODS AND APPLICATIONS', Academic Press Inc. San Diego, Calif. (1990). As sondas podem ser rotuladas, por exemplo, com uma etiqueta radioativa, biotinilada ou fluorescente. Idealmente, os ácidos nucléicos na amostra são rotulados e as sondas não são rotuladas. As sondas de oligonucleotídeos geradas pelos métodos acima podem ser utilizadas em métodos em solução ou baseados em suporte sólido.

A invenção inclui sondas de oligonucleotídeos que se hibri- dizam a um produto da região de codificação ou de uma região 3' não traduzida (3' UTR) de um polinucleotídeo de madeira ou de parede celular. Em uma realização, a sonda de oligonucleotídeo se hibridiza à 3UTR de qualquer uma das SEQ ID Nos.: 1-230. A 3'UTR é geralmente uma região sem igual do gene, mesmo entre membros da mesma família. Por esta razão, as sondas capazes de se hibridizarem a um produto de 3'UTR podem ser úteis para a diferenciação da expressão de genes individuais dentro de uma família onde as regiões de codificação dos genes provavelmente são altamente homólogas. Isto permite o desenho de sondas de oligonucleotídeos para serem utilizadas como membros de uma pluralidade de oligonucleotídeos, cada um capaz de se ligar unicamente a um único gene. Noutra modalidade, a sonda de oligonucleotídeo compreende qualquer uma das SEQ ID Nos.: 461-591. Noutra modalidade, a sonda de oligonucleotídeo consiste em qualquer uma das SEQ ID Nos.: 592-690.

B - Métodos de Arranjo de Oligonucleotídeos

Uma realização da invenção emprega duas ou mais sondas de oligonucleotídeos em combinação para detectar um nível de expres- são de um ou mais polinucleotídeos de madeira ou parede celular, tais como os genes das SEQ ID Nos.: 1-230. Em um aspecto desta realiza- ção, é detectado o nível de expressão de dois ou mais polinucleotídeos diferentes. Os dois ou mais polinucleotídeos podem ser da mesma família de genes de madeira ou parede celular ou de famílias diferentes discutidas acima. Cada um dos dois ou mais oligonucleotídeos pode se hibridizar a um diferente dos polinucleotídeos. Uma realização da invenção emprega duas ou mais sondas de oligonucleotídeos, cada uma das quais se hibridiza especificamente a um polinucleotídeo derivado do transcrito de um polinucleotídeo provido pelas SEQ ID Nos.: 1-230. Uma outra realização emprega duas ou mais sondas de oligonucleotídeos, pelo menos uma das quais compreende uma seqüência de ácidos nucléicos das SEQ ID Nos.: 461- 690. Uma outra realização emprega duas ou mais sondas de oligonu- cleotídeos, pelo menos uma das quais consiste em uma das SEQ ID Nos.: 461-690.

As sondas de oligonucleotídeos podem compreender de cer- ca de 5 a cerca de 60, ou de cerca de 5 a cerca de 500, bases nucleotí- dicas, tal como de cerca de 60 a cerca de 100 bases nucleotídicas, incluindo de cerca de 15 a cerca de 60 bases nucleotídicas.

Uma realização da invenção utiliza métodos de hibridização de oligonucleotídeo baseados em suporte sólido para detectar a expres- são genética. Métodos de suporte sólido adequados para a prática da presente invenção são amplamente conhecidos e são descritos, por exemplo, no pedido PCT WO 95/11755; Huber e colaboradores, Anal. Biochem. 299:24 (2001); Meiyanto e colaboradores, Biotechniques. 31:406 (2001); Relogio e colaboradores, Nucleic Acids Res. 30:e51 (2002). Qualquer superfície sólida à qual oligonucleotídeos possam ser ligados, covalentemente ou não covalentemente, pode ser utilizada. Tais suportes sólidos incluem filtros, placas de cloreto de polivinila, pastilhas ("chips") a base de silício ou vidro, etc.

Uma realização utiliza arranjos de oligonucleotídeo, isto é, micro-arranjos, que podem ser utilizados para se observar simultanea- mente a expressão de um número de polinucleotídeos, genes ou produ- tos genéticos. Os arranjos de oligonucleotídeo compreendem duas ou mais sondas de oligonucleotídeos providas em um suporte sólido, onde cada sonda ocupa um local único no suporte. O local de cada sonda pode ser predeterminado, de tal forma que a detecção de um sinal detectável em um dado local é indicativo de hibridização a uma sonda de oligonucleotídeo de uma identidade conhecida. Cada local predeter- minado pode conter mais de uma molécula de uma sonda, no entanto cada molécula no local predeterminado contém uma seqüência idêntica. Esses locais predeterminados são chamados de características. Pode haver, por exemplo, de 2, 10, 100, 1000, 2000 ou 5000 ou mais de tais características em um único suporte sólido. Numa realização, cada oligonucleotídeo é localizado em uma posição única em um arranjo pelo menos 2, pelo menos 3, pelo menos 4, pelo menos 5, pelo menos 6 ou pelo menos 10 vezes.

Os arranjos de sonda de oligonucleotídeo para a detecção da expressão genética podem ser feitos e utilizados de acordo com técnicas convencionais descritas, por exemplo, em Lockhart e colabora- dores, Nat'l Biotech. 14:1675 (1996), McGall e colaboradores, Proc. Nat'1. Acad. Sei. USA 93:13555 (1996), e Hughes e colaboradores, Nature Biotechnol 19:342 (2001). Uma variedade de projetos de arranjo de oligonucleotídeo é adequada para a prática desta invenção.

Numa realização, os um ou mais oligonucleotídeos incluem uma pluralidade de oligonucleotídeos que se hibridizam a um polinu- cleotídeo diferente expresso em um tipo de tecido particular. Por exemplo, o tecido pode ser madeira em desenvolvimento.

Numa realização, uma amostra de ácido nucléico obtida de uma planta pode ser amplificada e, opcionalmente, rotulada com um rótulo detectável. Qualquer método de amplificação de ácido nucléico e qualquer rótulo detectável adequados para tal propósito podem ser utilizados. Por exemplo, reações de amplificação podem ser realizadas utilizando-se, por exemplo, o kit MessageAmp da ambion, que cria RNA "anti-senso" ou "aRNA" (complementar na seqüência de ácidos nucléi- cos ao RNA extraído da amostra de tecido). O RNA pode opcionalmente ser rotulado utilizando-se rótulos fluorescentes CyDye. Durante a etapa de amplificação, aaUTP é incorporada no aRNA resultante. Os rótulos fluorescentes CyDye são acoplados às aaUTPs em uma reação não enzimática. Subseqüente às etapa de amplificação e rotulagem, os RNAs anti-senso amplificados rotulados são precipitados e lavados com um tampão apropriado, e então ensaiados para pureza. Por exemplo, a pureza pode ser ensaiada utilizando-se um espectrofotômetro Nano- Drop. A amostra de ácido nucléico é então posta em contato com um arranjo de oligonucleotídeo contendo, ligadas a um substrato sólido (uma "lâmina de micro-arranjo"), sondas amostras de oligonucleotídeos capazes de se hibridizarem a ácidos nucléicos de interesse que possam estar presentes na amostra. A etapa de contato é realizada sob condi- ções em que a hibridização pode ocorrer entre os ácidos nucléicos de interesse e as sondas de oligonucleotídeos presentes no arranjo. O arranjo é então lavado para remover ácidos nucléicos não especifica- mente ligados e os sinais das moléculas rotuladas que permanecem hibridizadas às sondas de oligonucleotídeos no substrato sólido são detectadas. A etapa de detecção pode ser realizada utilizando-se qualquer método apropriado ao tipo de rótulo utilizado. Por exemplo, a etapa de detecção pode ser realizada utilizando-se um scanner e detector a laser. Por exemplo, pode-se utilizar um scanner Axon que utiliza opcionalmente o programa GenePix Pro para analisar a posição do sinal na lâmina de micro-arranjo.

Os dados de uma ou mais lâminas de micro-arranjo podem ser analisados por qualquer método apropriado conhecido na técnica.

As sondas de oligonucleotídeos utilizadas nos métodos da presente invenção, incluindo técnicas de micro-arranjo, podem ser geradas utilizando-se PCR. Os iniciadores de PCR utilizados na geração das sondas são escolhidos, por exemplo, com base nas seqüências das SEQ ID Nos.: 1-230, para resultar na amplificação de fragmentos únicos dos polinucleotídeos de madeira ou parede celular (isto é, fragmentos que se hibridizam a apenas um polinucleotídeo de qualquer uma das SEQ ID Nos.: 1-230 sob condições de hibridização padrão). Programas de computador são úteis no desenho de iniciadores com a especificidade requerida e as propriedades de hibridização ideais. Por exemplo, Li e Stormo, supra em 1075, discutem um método de seleção de sonda utilizando o ProbeSelect que seleciona uma sonda de oligonu- cleotídeo ideal com base na seqüência genética completa, bem como outras seqüências genéticas a serem sondadas ao mesmo tempo.

Numa modalidade, podem ser utilizadas sondas de oligonu- cleotídeos de controle. Sondas de controle típicas recaem em pelo menos uma de três categorias referidas aqui como (1) controles de normalização, (2) controles de nível de expressão e (3) controles negati- vos. Em métodos de micro-arranjos, uma ou mais destas sondas de controle podem ser providas no arranjo com os oligonucleotídeos relacionados com madeira ou parece celular da invenção.

Os controles de normalização corrigem desvios devidos a corante, desvios devidos aos tecidos, poeira, irregularidades da lâmina, pontos malformados na lâmina, etc. Controles de normalização são sondas de oligonucleotídeos ou de outro ácido nucléico que são com- plementares a oligonucleotídeos ou outras seqüências de ácidos nucléi- cos de referência rotulados que são adicionados à amostra de ácido nucléico a ser analisada. Os sinais obtidos a partir dos controles de normalização, depois da hibridização, fornecem um controle para variações nas condições de hibridização, intensidade do rótulo, eficiên- cia de leitura e outros fatores que podem fazer com que o sinal de uma hibridização perfeita varie entre os arranjos. Em uma realização, os sinais (por exemplo, intensidade de fluorescência e radioatividade) lidos a partir de todas as outras sondas utilizadas no método são divididos pelo sinal das sondas de controle, desta forma normalizando as deter- minações. Virtualmente qualquer sonda pode servir como controle de normalização. A eficiência de hibridização varia, entretanto, com a composição de base e com o comprimento da sonda. Sondas de norma- lização preferidas são selecionadas de maneira a refletir o comprimento médio das outras sondas sendo utilizadas, mas podem ser selecionadas também para cobrir uma faixa de comprimentos. Além disto, o(s) controle(s) de normalização pode(m) ser selecionado(s) de maneira a refletir a composição de base média das outras sondas sendo utilizadas. Em uma realização, apenas uma ou umas poucas sondas de normaliza- ção são utilizadas, e estas são selecionadas de tal forma que hibridizem convenientemente (isto é, sem formação de estruturas secundárias) e não pareiem com quaisquer sondas de teste. Numa modalidade, os controles de normalização são genes de mamífero.

As sondas de controle de nível de expressão se hibridizam especificamente com genes expressos constitutivamente presentes na amostra biológica. Virtualmente qualquer gene expresso constitutiva- mente se constitui em um alvo adequado para sondas de controle de nível de expressão. Tipicamente, sondas de controle de nível de expres- são apresentam seqüências complementares a subseqüências de "genes de manutenção" ("housekeeping genes") expressos constitutivamente incluindo, mas, sem limitação, alguns genes da fotossíntese.

As sondas de "controle negativo" não são complementares a qualquer dos oligonucleotídeos de teste (isto é, os oligonucleotídeos relacionados com parede celular e madeira da invenção), controles de normalização, ou controles de expressão. Numa modalidade, o controle negativo é um gene de mamífero que não é complementar a qualquer outra seqüência na amostra.

Os termos "fundo" e "intensidade de sinal de fundo" refe- rem-se a sinais de hibridização resultantes de ligação não específica ou outras interações entre os ácidos nucléicos alvo rotulados (isto é, mRNA presente na amostra biológica) e componentes do arranjo de oligonucle- otídeo. Os sinais de fundo podem ser também produzidos por fluores- cência intrínseca dos componentes do arranjo em si.

Um sinal de fundo pode ser calculado a partir do arranjo to- tal, ou um sinal de fundo diferentes pode ser calculado para cada ácido nucléico alvo. Numa modalidade, o fundo é calculado como a intensi- dade de sinal de hibridização média para o mais baixo dos 5 a 10% das sondas de oligonucleotídeos sendo utilizadas ou, onde um sinal de fundo diferente é calculado para cada gene alvo, para o mais baixo dos a 10% das sondas para cada gene. Quando as sondas de oligonucleo- tídeos correspondendo a um gene de desenvolvimento de madeira ou da biossíntese de parede celular particular se hibridiza convenientemente e, desta forma, aparenta se ligar especificamente a uma seqüência alvo, não devem ser utilizadas em um cálculo de sinal de fundo. Alternati- vamente, o fundo pode ser calculado como a média da intensidade do sinal de hibridização produzido pela hibridização a sondas que não são complementares a qualquer seqüência encontrada na amostra (por exemplo, sondas direcionadas para ácidos nucléicos de senso oposto ou a genes não encontrados na amostra). Nos métodos de micro-arranjo, o fundo pode ser calculado como a média da intensidade do sinal produ- zido pelas regiões do arranjo que não contêm quaisquer sondas de oligonucleotídeos.

C - Métodos Baseados em PCR

Noutra modalidade, métodos baseados em PCR são utiliza- dos para se detectar a expressão de polinucleotídeo. Estes métodos incluem reação em cadeia de polimerase mediado por transcriptase reversa (RT-PCR) incluindo reação em cadeia de polimerase mediada por transcriptase reversa quantitativa em tempo real e de ponto final (Q-RTPCR). Estes métodos são bem conhecidos na técnica. Por exemplo, métodos de PCR quantitativa podem ser realizados utilizando- se kits e métodos que estão disponíveis comercialmente, por exemplo, da Applied BioSystems e Stratagene®. Ver também Kochanowski, "QUANTITATIVE PCR PROTOCOLS" (Humana Press, 1999); Innis e colaboradores, supra; Vandesompele e colaboradores, Genome Biol 3: RESEARCH0034 (2002); Stein, CellMol Life Sci 59: 1235 (2002).

A expressão de polinucleotídeo pode ser também observada em solução utilizando-se Q-RTPCR. A Q-RTPCR se baseia na detecção de um sinal fluorescente produzido proporcionalmente durante a amplificação de um produto de PCR. Ver Innis e colaboradores, supra. Tal como o método de PCR tradicional, esta técnica emprega iniciadores de oligonucleotídeo para PCR, tipicamente com de 15 a 30 bases de comprimento, que se hibridizam a fitas opostas e regiões que flanquei- am a região do DNA de interesse. Além disso, uma sonda (por exemplo, TaqMan®, Applied Biosystems) é desenhada para se hibridizar a uma seqüência alvo entre os iniciadores positivos e reversos trAlém disso utilizados na técnica PCR. A sonda é rotulada na extremidade 5' com um fluoróforo repórter, tal como 6-carboxifluoresceína (6-FAM) e um fluoróforo de interrupção como 6-carboxi-tetrametil-rodamina (TAMRA). Desde que a sonda esteja intacta, a transferência de energia fluorescen- te ocorre, o que resulta na absorbância da emissão fluorescente do fluoróforo repórter pela interrupção do fluoróforo. Como a Taq polime- rase estende o iniciador, entretanto, a atividade intrínseca de nuclease de 5' para 3' da Taq degrada a sonda, liberando o fluoróforo repórter. O aumento no sinal de fluorescência detectado durante o ciclo de amplifi- cação é proporcional à quantidade de produto gerado em cada ciclo.

Os iniciadores de amplificação positivos e reversos e a son- da de hibridização interna são desenhados para se hibridizarem especi- ficamente e de forma única a um derivado de nucleotídeo do transcrito de um gene alvo. Numa modalidade, o critério de seleção para as seqüências iniciadoras e sonda incorpora restrições relativas ao teor e tamanho do nucleotídeo para atender as exigências da TaqMan®. SYBR Green® pode ser utilizada como uma alternativa Q- RTPCR sem sonda ao ensaio com e Taqman®, discutido acima. ABI PRISM® 7900 aSEQUENCE DETECTION SYSTEM USER GUIDE APPLIED BIOSYSTEMS', capítulos 1-8, App. A-F. (2002).

Um dispositivo mensura alterações na intensidade da emis- são fluorescente durante a amplificação PCR. A mensuração é realizada em "tempo real", isto é, conforme o produto da amplificação se acumula na reação. Outros métodos podem ser utilizados para de mensurar alterações na fluorescência resultante da digestão da sonda. Por exemplo, polarização de fluorescência pode distinguir entre moléculas grandes e pequenas com base na variação molecular ("molecular tumbling") (ver patente US 5.593.867).

D - Métodos de Detecção de Proteína

Proteínas podem ser observadas por qualquer meio conhe- cido na técnica, incluindo métodos imunológicos, ensaios enzimáticos e técnicas de arranjo de proteína/proteômicas.

A determinação do estado traducional pode ser realizada de acordo com vários métodos de proteína. Por exemplo, monitoramento do genoma total de proteína - o "proteoma" - pode ser realizado pela construção de um micro-arranjo no qual os locais de ligação compreen- dem anticorpos, preferivelmente anticorpos monoclonais, imobilizados específicos para uma pluralidade de proteínas apresentando uma seqüência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID Nos.: 231-460, ou proteínas codificadas pelos polinucleotídeos das SEQ ID Nos.: 1-230 ou variantes conservativas destas. Ver Wildt e colaboradores, Nature Biotechnol 18:989 (2000). Métodos para a obtenção de anticorpos policlonais e monoclonais são bem conhecidos, conforme descrito, por exemplo, em Harlow & Lane, aANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL" (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988). Alternativamente, proteínas podem ser separadas em sis- temas de eletroforese em gel em duas dimensões. A eletroforese em gel em duas dimensões é bem conhecida na técnica e tipicamente envolve focalização isoelétrica ao longo de uma primeira dimensão seguida de eletroforese SDS-PAGE ao longo de uma segunda dimensão. Ver, por exemplo, Hames e colaboradores, "GEL ELECTROPHORESIS OF PROTE- INS: A PRACTICAL APPROACH" (IRL Press, 1990). Os eletroferogramas resultantes podem ser analisados por várias técnicas, incluindo técni- cas de espectrometria de massa, western blotting e análise de marcação imunológica utilizando anticorpos policlonais e monoclonais, e micro- seqüenciamento interno e de terminal N.

3 - Correlacionando Expressão Genética com Fenótipo e Desenvolvimento de Tecido

Conforme discutido acima, a invenção prove métodos e fer- ramentas para se correlacionar a expressão de polinucleotídeo de parede celular a fenótipo vegetal. A expressão de polinucleotídeo pode ser examinada em uma planta apresentando um fenótipo de interesse e comparada com uma planta que não apresenta o fenótipo ou apresenta um fenótipo diferente. Esse fenótipo inclui, mas sem limitação a, tolerância aumentada à seca, resistência a herbicida, altura reduzida ou aumentada, ramificação reduzida ou aumentada, tolerância aumen- tada ao frio e geada, vigor aumentado, cor aperfeiçoada, características de saúde e nutricionais aumentadas, armazenagem aumentada, rendimento aumentado, tolerância a condições salinas aumentada, resistência da madeira ao decaimento, resistência aumentada a doenças fúngicas, atração alterada a insetos peste, tolerância a metais pesados aumentada, tolerância a doenças aumentada, tolerância a insetos aumentada, tolerância a estresse hídrico aumentada, teor em açúcares aumentado, textura aperfeiçoada, teor em fosfato reduzido, germinação aumentada, absorção de micro-nutrientes aumentada, composição em amido aumentada, longevidade floral aumentada, produção de novas resinas e produção de novas proteínas ou peptídeos.

Noutra modalidade, o fenótipo inclui uma ou mais das se- guintes características: propensão em formar madeira de reação, período reduzido de juventude, período de juventude aumentado, ramificações com capacidade de auto-poda, desenvolvimento reproduti- vo acelerado ou desenvolvimento reprodutivo retardado.

Em uma modalidade adicional, o fenótipo que é diferente nas plantas comparadas inclui um ou mais do que se segue: qualidade de lignina, estrutura de lignina, composição de madeira, aparência da madeira, densidade da madeira, resistência da madeira, rigidez da madeira, polimerização de celulose, dimensões de fibra, tamanho de lúmen, outros componentes vegetais, divisão celular vegetal, desenvol- vimento célula vegetal, número de células por unidade de área, tama- nho de célula, formato de célula, composição da parede celular, taxa de formação de madeira, aparência estética da madeira, formação de defeitos de caule, ângulo médio de microfibrila, largura da camada da parede celular S2, taxa de crescimento, taxa de formação de raiz, proporção de desenvolvimento vegetativo de raiz em relação à ramifica- ção, índice de área foliar, e formato de folha.

O fenótipo pode ser acessado por qualquer meio adequado conforme discutido acima.

Em uma modalidade adicional, a expressão de polinucleotí- deo pode ser correlacionada a um dado ponto na divisão celular, um dado ponto do desenvolvimento da planta, e em uma dada amostra de tecido. O tecido vegetal pode ser examinado em diferentes estágios do ciclo celular, a partir de tecido vegetal em diferentes estágios de desen- volvimento, a partir de tecido vegetal em várias épocas do ano (por exemplo, primavera χ verão), a partir de tecidos vegetais submetidos a diferentes condições ambientais (por exemplo, variações de luz e temperatura) e/ou a partir de diferentes tipos de tecido e células vegetais. De acordo com uma realização, o tecido vegetal é obtido durante vários estágios de maturidade e durante diferentes estações do ano. Por exemplo, o tecido vegetal pode ser coletado de células em divisão de caule, xilema em diferenciação, células de madeira em início de desenvolvimento, células de madeira primaveril diferenciadas, células de madeira de verão diferenciadas.

Será óbvio para os especialistas na técnica que várias modi- ficações e variações podem ser realizadas nos métodos e composições da presente invenção sem que se afaste do espírito e escopo da inven- ção. Desta forma, pretende-se que a presente invenção abranja as modificações e variações deste que recaiam no escopo das reivindica- ções anexas e suas equivalentes.

Os exemplos a seguir são fornecidos para ilustrar a presen- te invenção. Deve ser entendido, entretanto, que a invenção não se limita às condições ou detalhes descritos nestes exemplos. Por todo o relatório descritivo, qualquer e todas as referências a um documento disponível publicamente, incluindo uma Patente US, são especificamen- te incorporados como referência em sua totalidade.

Exemplo 1

Isolamento e Caracterização de Clones de cDNA de Eucalyptus grandis

Bibliotecas de expressão de cDNA de Eucalyptus grandis fo- ram preparadas a partir de inflorescências maduras, floema de madeira precoce, tecido floral, tecido foliar (duas bibliotecas independentes), raízes de alimentação, raízes estruturais, xilema ou xilema de madeira precoce, e foram construídas e examinadas como se segue. RNA total foi extraído do tecido vegetal utilizando-se o pro- tocolo de Chang e colaboradores, (Plant Molecular Biology Repórter 11:113-116 (1993)). O mRNA foi isolado da preparação de RNA total utilizando-se ou um kit de isolamento de mRNA Poly(A) Quik (Stratage- ne, La Jolla, CA) ou Dynal Beads Oligo (dT)25 (Dynal, Skogen, Noruega). Foi construída uma biblioteca de expressão de cDNA a partir do mRNA purificado por síntese com transcriptase reversa seguindo-se a inserção dos clones de cDNA em Lambda ZAP utilizando-se um kit de síntese de cDNA ZAP Express (Stratagene), de acordo com o protocolo do fabrican- te. Os cDNAs resultantes foram empacotados utilizando-se uma Gigapack II Packaging Extract (Stratagene) utilizando-se uma alíquota (1-5 al) dos 5 μΐ da reação de ligação dependendo da biblioteca. O corte de massa da biblioteca foi realizado utilizando-se células XLl-Blue MRF e células XLOLR (Stratagene) com fago auxiliar ExAssist (Stratagene). Os fagomídeos cortados foram diluídos com caldo NZY (Gibco BRL, Gaithersburg, MD) e plaqueados em placas de agar LB-kanamicina contendo X-gal e isopropiltio-beta-galactosídeo (IPTG).

Das colônias plaqueadas e selecionadas por DNA miniprep, 99% continham uma inserção adequada para seqüenciamento. As colônias positivas foram cultivadas em caldo NZY com kanamicina e o cDNA foi purificado por meio de Iise alcalina e precipitação com polieti- lenoglicol. Gel de agarose foi utilizado para se selecionar os moldes de seqüenciamento para contaminação cromossômica. Seqüências do iniciador Dye foram preparadas utilizando-se um equipamento Turbo Catalyst 800 (Perkin Elmer/Applied Biosystems Division, Foster City, CA) de acordo com o protocolo do fabricante.

A seqüência de DNA para clones positivos foi obtida utili- zando-se um seqüenciador Perkin Elmer/Applied Biosystems Division Prism 377. Os clones de cDNA foram seqüenciados primeiro a partir da extremidade 5' e, em alguns casos, também a partir da extremidade 3'. Para alguns clones, a seqüência interna foi obtida utilizando-se ou análise de corte com exonuclease III, produzindo uma biblioteca de sub- clones de tamanhos diferentes em pBK-CMV, ou por seqüenciamento direto utilizando-se iniciadores gene-específicos desenhados para identificar regiões do gene de interesse.

As seqüências de cDNA determinadas foram comparadas

com seqüências conhecidas na base de dados EMBL utilizando-se os algoritmos de computador FASTA e/ou BLASTN. Alinhamentos múlti- plos de seqüências redundantes foram utilizados para se construir seqüências de consenso confiáveis. As seqüências de cDNA determina- das são providas nas SEQ ID Nos.: 1-230. Com base na similaridade com seqüências conhecidas de outras espécies vegetais, as seqüências de polinucleotídeos isoladas foram identificadas como codificadoras de proteínas de madeira e de parede celular, como detalhado nas Tabelas 1 e 2. As seqüências de polipeptídeo previstas correspondendo às se- qüências de polinucleotídeo das SEQ ID Nos.: 132-230 são providas nas SEQ ID Nos.: 362-460.

Exemplo 2

Isolamento e Caracterização de Clones

de cDNA de Pinus ra.dia.ta

Bibliotecas de expressão de cDNA de Pinus radiata (prepa-

radas a partir ou de tecidos de inflorescências, células cultivadas em suspensão, floema de madeira precoce (duas bibliotecas independen- tes), tecido de meristema fascicular, estróbilo masculino, raiz (linhagem desconhecida), raízes de alimentação, raízes estruturais, estróbilo feminino, cone primórdia, cones femininos receptores e xilema (duas bibliotecas independentes)) foram construídas e examinadas conforme descrito acima no Exemplo 1.

A seqüência de DNA para clones positivos foi obtida utili- zando-se iniciadores positivos e reversos em um seqüenciador Perkin Elmer/Applied Biosystems Division Prism 377 e as seqüências determi- nadas foram comparadas com seqüências conhecidas na base de dados conforme descrito acima.

Com base na similaridade a seqüências conhecidas de ou- tras espécies vegetais, as seqüências de polinucleotídeo isoladas foram identificadas como codificadoras de proteínas de madeira e de parede celular, conforme mostrado na Tabela 1. As seqüências de polipeptídeo previstas correspondendo às seqüências de polinucleotídeo das SEQ ID Nos.: 1-131 são providas nas SEQ ID Nos.: 231-361.

Exemplo 3 Isolamento de RACE 5'

De maneira a se identificar uma seqüência 5' ou 3' adicional de uma seqüência de cDNA parcial em uma biblioteca de cDNA, foi realizada uma amplificação rápida das extremidades 5' e 3' do cDNA. Utilizando-se o kit de amplificação de cDNA SMART RACE (Clontech Laboratories, Palo Alto, Calif.). Em geral o método engloba primeira- mente o isolamento de poli(A) mRNA, realizando a síntese da primeira e segunda fitas do cDNA para gerar um cDNA de fita dupla, bloqueando as extremidades do cDNA, e então ligação do adaptador SMART RACE Adaptor ao cDNA para formar uma biblioteca cDNA ds ligado a adapta- dor. Foram desenhados iniciadores de gene específicos para serem utilizados juntamente com os iniciadores específicos adaptados tanto para a reação RACE 5' quanto para a RACE3'. Utilizando-se as reações RACE 5' e 3', foram obtidos fragmentos RACE 5' e 3', seqüenciados e clonados. O processo pode ser repetido até que as extremidades 5' e 3' do comprimento total do gene estejam identificadas. Um cDNA de comprimento total pode ser gerado por PCR utilizando-se iniciadores específicos para as extremidades 5' e 3' do gene por PCT extremidade- extremidade.

Por exemplo, de maneira a se amplificar a região 5' ausente de um gene a partir da primeira fita de cDNA, foi desenhado um iniciador 5'—>3' da fita oposta da seqüência molde, e da região entre -100-200 bp da seqüência molde. Uma amplificação bem sucedida deve fornecer uma sobreposição de -100 bp da seqüência de DNA entre a extremidade 5' do molde e o produto de PCR.

O RNA foi extraído de quatro tecidos de pinheiro, a saber, plântula, xilema, floema e raiz estrutural utilizando-se o protocolo Concert Reagent (Invitrogen, Carlsbad, CA) e procedimentos de isola- mento e extração padrão. O RNA resultante foi então tratado com DNase, utilizando-se 10 U/μΙ de DNase I (Roche Diagnostics, Basel, Suíça). Para 100 pg de RNA, foram utilizados 9 μΐ IOx tampão de DNase (Invitrogen, Carlsbad, CA), 10 μΐ de DNase I Roche e 90 μΐ de água livre de Rnase. O RNA foi então incubado à temperatura ambiente por 15 minutos e foi 1/10 em volume de 25 mM EDTA. Foi utilizado um mini kit RNeasy (Qiagen, Venlo, Holanda) para limpar o RNA de acordo com o protocolo do fabricante.

Para sintetizar o cDNA, o RNA extraído de xilema, floema, plântula e raiz, foi utilizado e o kit de amplificação de cDNA SMART RACE (Clontech Laboratories Inc, Palo Alto, CA) foi seguido de acordo com o protocolo do fabricante. Para PCR RACE, o cDNA dos quatro tipos de tecido foi combinado. A mistura principal para PCR foi criada pela combinação de volumes iguais de cDNA de tecido de xilema, floema, raiz e plântulas. As reações PCR foram realizadas em placas de PCR de 96 poços, com 1 μΐ de iniciador da placa de diluição de iniciador (10 mM) nas posições dos poços correspondentes. Foram separados 49 μΐ da mistura principal para uma placa de PCR com iniciadores. O ciclo térmico teve início em um GeneAmp 9700 (Applied Biosystems, Foster City, CA) com os seguintes parâmetros: 94°C (5 segundos). 72°C (3 minutos), 5 ciclos; 94°C (5 segundos), 70°C (10 segundos), 72°C (3 minutos), 5 ciclos;

94°C (5 segundos), 68°C (10 segundos), 72°C (3 minutos), 25 ciclos.

O cDNA foi separado em um gel de agarose seguindo-se procedimentos padrão. Foram cortados fragmentos do gel e eluídos do gel utilizando-se o kit de eluição Qiagen 96-well Gel, seguindo-se as instruções do fabricante.

Os produtos de PCR foram ligados em pGEMTeasy (Prome- ga, Madison, WI) em uma placa de 96 poços durante a noite de acordo com as seguintes especificações: 60-80 ng de DNA, 5 μΐ 2X tampão de ligação rápida, 0,5 μΐ do vetor pGEMTeasy, 0,1 μΐ de DNA ligase, completado para 10 μΐ com água, e incubado durante a noite.

Cada clone foi transformado em E. coli seguindo-se proce- dimentos padrão e o DNA foi extraído de 12 clones coletados seguindo- se protocolos padrão. A extração do DNA e a qualidade do DNA foram verificadas em gel de agarose a 1%. A presença da inserção de tamanho correto em cada um dos clones foi determinada por digestão de restri- ção, utilizando-se a endonuclease de restrição EcoRl, e gel de eletrofore- se, seguindo-se procedimentos laboratoriais padrão.

25

Exemplo 4 Cura de uma Seqüência EST

Durante a produção de bibliotecas de cDNA, os transcritos originais ou suas contrapartes de DNA podem apresentar característi- cas que não permitem que codifiquem proteínas funcionais. Pode haver inserções, deleções, substituições de bases, ou introns cortados ou não cortados inapropriadamente. Se tais características existirem, é freqüentemente possível as identificar de tal forma que possam ser alteradas. Cura semelhante foi realizada em qualquer seqüência que apresenta homologia a seqüências em bases de dados públicas.

O que se segue é um exemplo genérico de como uma se- qüência foi curada. Após a determinação da seqüência de DNA, a análise BLAST mostrou que está relacionada a um gene de Arabidopsis na seqüência genômica de Arabidopsis disponível publicamente. Entretanto, em vez de codificar um polipeptídeo de aproximadamente 240 aminoácidos, a seqüência sendo curada foi prevista como codifi- cando um produto de apenas 157 resíduos de aminoácidos, sugerindo um erro na seqüência de DNA. De maneira a se identificar onde a região de codificação genuína poderia estar, a seqüência de DNA da extremidade de cada EST foi traduzida em cada um dos três quadros de leitura e as seqüências previstas foram alinhadas com a seqüência de aminoácidos do gene de Arabidopsis. Foi encontrado que o segmento de DNA em uma parte da EST codificou uma seqüência com similaridade com o terminal carboxila do gene de Arabidopsis. Por esta razão, aparentemente um intron não cortado estava presente na EST.

Introns não cortados são um problema relativamente pe- queno no que diz respeito ao uso de uma seqüência clonada para super-expressão do gene de interesse. Pode-se esperar que o RNA resultante da transcrição do cDNA seja submetido a um processamento normal para remover o intron. Espera-se também que as construções anti-senso e de RNAi funcionem no sentido a suprimir o gene de interesse. Em outras ocasiões, pode ser desejável se identificar os limites precisos do intron de tal forma que possa ser removido. Quando a seqüência em questão apresenta uma seqüência publicada que é altamente similar, é possível se encontrar o intron por alinhamento das duas seqüências e identificando-se os locais em que a identidade de seqüência diminui, auxiliada pelo conhecimento de que introns se iniciam com a seqüência EST e finalizam com a seqüência AG.

Quando existe alguma dúvida quanto ao local do intron tendo em vista a não disponibilidade de seqüências altamente similares, o local do intron foi verificada experimentalmente. Por exemplo, oligômeros de DNA foram sintetizados flanqueando a região em que o intron suspeito foi localizado. RNA de espécies fonte, ou Pinus ou Eucalyptus, foi isolado e utilizado como molde para a obtenção de cDNA utilizando-se transcriptase reversa. Os iniciadores selecionados foram então utilizados em uma reação PCR para amplificar o segmento de DNA cortado corretamente (tamanho previsto de aproximadamente 350 bp abaixo do segmento correspondente da seqüência consenso original) da população de cDNAs. O segmento amplificado foi então submetido a análise de seqüência e comparado com uma seqüência consenso para se identificar as diferenças.

O mesmo procedimento foi utilizado quando se suspeitou de um evento de corte alternado (permanência de intron parcial, ou perda parcial de um exon). Quando uma EST apresentou uma alteração pequena, tal como uma inserção ou deleção de um número pequeno de bases, a análise computacional da seqüência EST pode ainda indicar sua localização quando o produto de tradução de tamanho incorreto foi previsto ou se houve uma troca de quadro óbvia. A verificação da seqüência verdadeira foi realizada por síntese de iniciadores, produção de um novo cDNA, e amplificação com PCR conforme descrito acima.

Exemplo 5 Dados de Eucalyptus in silico

A expressão genética in silico foi utilizada para se determi- nar a associação de bibliotecas de EST consenso. Para cada biblioteca, uma seqüência consenso foi determinada a partir do número de ESTs em qualquer classe de tecido dividido pelo número total de ESTs em uma classe multiplicado por 1000. Estes valores forneceram um valor normalizado que não se desvia muito do seqüenciamento a partir de uma biblioteca. Várias bibliotecas foram amostradas para um valor consenso, incluindo bibliotecas de reprodução, inflorescência reproduti- va, inflorescência reprodutiva, fruto, folha, floema, câmbio, xilema, raiz, caule, seiva vegetativa, planta completa.

Conforme mostrado abaixo, uma quantidade de seqüências da invenção exibe a expressão vascular preferida (mais de 50% dos hits por estas seqüências se as bases de dados foram pesquisadas randomi- camente estariam em bibliotecas obtidas a partir de tecido vascular em desenvolvimento) e, desta forma, é provável que estejam envolvidas em processos de desenvolvimento relacionados a madeira. Muitas das proteínas de parede celular e de madeira remanescentes exibem expres- são vegetativa preferida, sugerindo expressão nos processos de desen- volvimento foliar e processos relacionados à fotossíntese, ou expressão preferida em raiz, sugerindo expressão em processos de desenvolvimen- to de raiz e absorção de água e nutrientes. Os dados são mostrados na Tabela 5. «4

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A expressão genética in silico foi utilizada para se deter- minar a associação de bibliotecas de EST consenso. Para cada bibliote- ca, uma seqüência consenso foi determinada a partir do número de ESTs em qualquer classe de tecido dividido pelo número total de ESTs em uma classe multiplicado por 1000. Estes valores fornecem um valor normalizado que não se desvia muito do seqüenciamento a partir de uma biblioteca. Várias bibliotecas foram amostradas para um valor consenso, incluindo bibliotecas de reprodução, inflorescência reproduti- va, inflorescência vegetativa, fruto, folha, floema, câmbio, xilema, raiz, caule, seiva vegetativa, planta completa.

Conforme mostrado abaixo, uma quantidade de seqüên- cias da invenção exibem expressão vascular preferida (mais de 50% dos hits por estas seqüências se as bases de dados foram pesquisadas randomicamente estariam em bibliotecas obtidas a partir de tecido vascular em desenvolvimento) e, desta forma, é provável que estejam envolvidas em processos de desenvolvimento relacionados a madeira. Muitas das proteínas de parede celular e de madeira remanescentes exibem expressão vegetativa preferida, sugerindo expressão nos proces- sos de desenvolvimento foliar e processos relacionados à fotossíntese, ou expressão preferida em raiz, sugerindo expressão em processos de desenvolvimento de raiz e absorção de água e nutrientes. Os dados são mostrados na Tabela 6. U Ei

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l> Exemplo 7

Este Exemplo ilustra como polinucleotídeos importantes pa- ra o desenvolvimento de madeira em P. radiata foram determinados e como oligonucleotídeos que se ligam exclusivamente a estes genes foram desenhados e sintetizados para uso em um micro-arranjo.

Árvores de polinizadas em aberto com aproximadamente 16 anos de idade foram selecionadas de locais de plantação-crescimento, nos Estados Unidos para pinheiro loblolly, e na Nova Zelândia para pinheiro radiata. As árvores foram derrubadas durante a primavera e verão para se comparar a expressão de genes associados com estes estágios diferentes de desenvolvimento de madeira. As árvores foram derrubadas individualmente e foram removidas seções de tronco da parte inferior aproximadamente a de um a dois metros da base e dentro de um a dois metros abaixo da coroa viva. A seção removida da extre- midade basal do tronco continha madeira madura. A seção removida da parte abaixo da coroa viva continha madeira jovem. As amostras coletadas durante a primavera foram denominadas de madeira precoce ou madeira primaveril, enquanto as amostras coletadas durante o verão são consideradas como madeira tardia ou madeira de verão (Larson e colaboradores, Gen. Tech. Rep. FPL-GTR-129. Madison, WI: U.S. Department of Agriculture, Forest Service, Forest Products Laboratory. 42p.).

Foram isolados tecidos das seções de tronco de tal forma que foram removidos floema, câmbio, xilema em desenvolvimento, e xilema em maturação. Estes tecidos foram coletados apenas do anel de crescimento do ano em curso. Na remoção do tecido em cada caso, o material foi imediatamente mergulhado em nitrogênio líquido para preservar os ácidos nucléicos e outros componentes. A casca foi removida da seção e o tecido de floema foi removido da face interna da casca por raspagem com uma lâmina de barbear. O tecido de câmbio foi isolado da face externa da seção descascada por raspagem branda da superfície. O xilema em desenvolvimento e o xilema em lignificação foram isolados por realização seqüencial de raspagem mais vigorosa do tecido remanescente. Os tecidos foram transferidos do nitrogênio líquido para recipientes para armazenagem de longo prazo a -70°C até o momento da extração do RNA e subseqüente análise.

Exemplo 8

Este Exemplo ilustra um procedimento para extração e pu- rificação de RNA, que foi particularmente útil para RNA obtido a partir de ponteiros de conífera, xilema, câmbio e floema.

O tecido foi obtido de ponteiros de conífera, xilema, câmbio e floema. O tecido foi congelado em nitrogênio líquido e moído. O RNA total foi extraído utilizando-se o reagente Concert Plant RNA (Invitro- gen). A amostra de RNA resultante foi extraída em fenol:clorofórmio e tratada com DNase. O RNA foi então incubado a 65°C por 2 minutos seguindo-se centrifugação a 4°C por 30 minutos. Após a centrifugação, o RNA foi extraído em fenol pelo menos 10 vezes para a remoção de contaminantes.

O RNA foi, além disso, limpo utilizando-se colunas Rneasy (Qiagen). O RNA purificado foi quantificado utilizando-se o reagente RiboGreen (Molecular Probes) e a pureza foi acessada por eletroforese em gel.

O RNA foi, então, amplificado utilizando-se MassageAmp (Ambion). Foram adicionados aminoalil-UTP e UTP livre à transcrição in vitro do RNA purificado a uma proporção de 4:1 de aminoalil-UTP para UTP. O aminoalil-UTP foi incorporado na nova fita de RNA enquanto era transcrito. O grupo aminoalil foi então reagido com corantes Cy para ligar um rótulo colorimétrico ao RNA amplificado resultante utilizando-se o procedimento da Amersham modificado para uso com RNA. O corante não incorporado foi removido por precipitação com etanol. O RNA rotulado foi quantificado por espectrofotometria (Nano- Drop). O RNA rotulado foi fragmentado por aquecimento a 95°C como descrito em Hughes e colaboradores, Nature Biotechnol 19:342 (2001).

Exemplo 9

Este Exemplo ilustra como genes importantes para o desen- volvimento de madeira em P. radiata foram determinados e como oligonucleotídeos que se ligam exclusivamente a estes genes foram desenhados e sintetizados para uso em um micro-arranjo.

Pinheiros da espécie P. radiata foram crescidos condições

de sob luz natural. As amostras de tecido foram preparadas como descrito em, por exemplo, Sterky e colaboradores, Proc. NatΊ Acad. Sei. 95:13330 (1998). Especificamente, amostras de tecido foram coletadas de árvores lenhosas apresentando uma altura de 5 metros. As amos- tras de tecido das árvores lenhosas foram preparadas por tomando-se seções tangenciais através da região do câmbio do caule. Os caules foram secionados horizontalmente em seções variando de jovem (topo) a madura (base). As seções de caule separadas por estágio de desenvol- vimento foram posteriormente separadas em 5 camadas por descasca- mento em seções de floema, floema em diferenciação, câmbio, xilema em diferenciação, xilema em desenvolvimento, e xilema maduro. As amostras de tecido, incluindo folhas, inflorescências, brotações e raízes, foram também preparadas a partir de plântulas da espécie P. radiata.

O RNA foi isolado e foram geradas ESTs como descrito no Exemplo 1 ou em Sterky e colaboradores, supra. As seqüências de ácidos nucléicos das ESTs derivadas das amostras contendo madeira em desenvolvimento foram comparadas com seqüências de ácidos nucléicos de genes conhecidos como estando envolvidos na síntese de polissacarídeos. As ESTs das amostras que não contêm madeira em desenvolvimento foram também comparadas com seqüências de genes conhecidos como estando envolvidos no ciclo celular vegetal. Uma análise de hibridização in silico foi realizada utilizando-se BLAST (NCBI) como se segue.

Exemplo 10

As seqüências que mostraram hibridização in silico às ESTs obtidas a partir das amostras contendo madeira em desenvolvimento, mas que não se hibridizaram às ESTs das amostras não contendo madeira em desenvolvimento foram selecionadas para exame posterior.

Os clones de cDNA contendo seqüências que se hibridiza-

ram aos genes mostrando expressão preferida para madeira foram selecionados a partir de bibliotecas de cDNA utilizando-se técnicas bem conhecidas em biologia molecular. Utilizando-se a informação da seqüência, foram desenhados oligonucleotídeos de tal forma que cada oligonucleotídeo fosse específico para apenas uma seqüência de cDNA na biblioteca. As seqüências de oligonucleotídeos são providas na Tabela 5. Sondas de oligonucleotídeo de 60-meros foram desenhadas utilizando-se o método de Li e Stormo, supra, ou utilizando-se um programa de computador tal como o ArrayDesigner, GeneScan e ProbeSelect.

Os oligonucleotídeos foram então sintetizados in situ como descrito em Hughes e colaboradores, Nature Biotechnol. 19:324 (2002) ou como descrito em Kane e colaboradores, Nucleic Acids Res. 28:4552 (2000) e fixados em uma lâmina de vidro ativado (Sigma-Genosis, The Woodlands, TX) utilizando-se um ligante amino 5'. A posição de cada oligonucleotídeo na lâmina era conhecida.

Exemplo 11

Este Exemplo ilustra como detectar a expressão de genes de Pinus radiata do presente pedido que são importantes na formação de madeira utilizando-se um micro-arranjo de oligonucleotídeo preparado como descrito acima. Este é um exemplo de um experimento projetado em bloco incompleto balanceado realizado utilizando-se amostras de RNA preparadas a partir de floema (P), câmbio (C), xilema em expansão na fase madura encontrados em uma camada abaixo do câmbio (Xl) e em diferenciação, células de xilema em lignificação encontradas mais profundamente no mesmo anel de crescimento (X2). Neste exemplo, a expressão do gene no ciclo celular foi comparada entre quatro amostras, a saber, P, C, Xl e X2.

No verão, plantas da espécie Pinus radiata foram derruba- das e a casca do caule principal foi imediatamente retirada gentilmente para revelar o floema e o xilema. O floema e o xilema foram então retirados com um bisturi para recipientes separados de nitrogênio líquido. Os ponteiros (folhas) e inflorescências das árvores foram também colhidos com um bisturi para recipientes separados de nitro- gênio líquido. O RNA foi subseqüentemente isolado das amostras de tecido congeladas como descrito no Exemplo 1. Quantidades iguais de microrganismos do RNA total foram purificadas de cada amostra utilizando-se colunas Rneasy Mini (Qiagen, Valencia, CA) de acordo com as instruções do fabricante.

As reações de amplificação foram realizadas para cada uma das amostras de tecido P, C, Xl e X2. As reações de amplificação foram realizadas utilizando-se o kit MessageAmp da Ambion, um procedimen- to de amplificação baseado em T7, seguindo-se as instruções do fabri- cante, exceto que foi adicionado um aaUTP rotulado ao reagente durante a etapa de amplificação. O aaUTP foi incorporado no RNA anti- senso resultante formado durante esta etapa. Rótulos fluorescentes CyDye foram acoplados ao aaUTP em uma reação não enzimática como descrito no Exemplo 8. Os RNAs anti-senso amplificados rotulados foram precipitados e lavados, e então ensaiados para pureza utilizando- 10

se um espectrofotômetro NanoDrop. Estes RNAs anti-senso rotulados, correspondendo ao RNA isolado das amostras de tecido P, C, Xl e X2, constituíram os ácidos nucléicos de amostra, os quais são referidos como amostras P, C, Xl e X2.

Amostras de controle de normalização de ácidos nucléicos conhecidos foram adicionadas a cada amostra em uma diluição em série de 500, 200, 100, 50, 25 e 10 pg/μΐ para a quantificação dos sinais. Controles positivos correspondendo a genes específicos mos- trando expressão em todos os tecidos de pinheiro, tais como genes de manutenção, foram também adicionados à amostra vegetal.

Cada um de quatro lâminas de micro-arranjo foi incubada com 125 μΐ de uma amostra de P, C, Xl ou X2 sob uma cobertura a 42°C por 16-18 horas. Os arranjos foram lavados em 1 χ SSC, SDS 0,1% por 10 minutos e então em 0,1 χ SSC, SDS 0,1% por 10 minutos e

deixados secar.

As lâminas do arranjo foram escanerizadas utilizando-se um scanner a laser Axon e analisadas utilizando-se o programa GenePix Pro. Os dados das lâminas de micro-arranjo foram submetidos à análise de dados de micro-arranjo utilizando-se o programa GenStat SAS ou o programa Spotfire. Os dados fora da distribuição foram removidos e os dados raciométricos para cada um dos conjuntos de dados foram normalizados utilizando-se uma normalização global que emprega um ajuste "cubic spline" para corrigir desvios diferenciais do corante e efeitos espaciais. Uma segunda transformação foi realizada para se ajustar as proporções do sinal de controle para uma média log2 = 0 (isto é, proporção 1:1). Os dados normalizados foram então subme- tidos a uma análise de variância.

A intensidade média de sinal para cada sinal a qualquer posição dada na lâmina de micro-arranjo foi determinada para cada uma de três lâminas amostras P, C, Xl e X2. Este sinal médio/posição sonda foi comparado com um sinal na mesma posição na lâmina amostra que foi utilizada para o cálculo da média. Por exemplo, um sinal médio em uma dada posição foi determinado para P, C e Xl e o sinal nesta posição na lâmina de micro-arranjo X2 foi comparado com o valor do sinal médio de P, C e XI.

Os dados de sinal foram então verificados com RT-PCR para se confirmar a expressão genética no tecido alvo dos genes correspon- dentes aos oligonucleotídeos únicos na sonda.

Exemplo 12

Este Exemplo ilustra como RNAs de tecidos de espécies múltiplas de pinheiro, neste caso tanto árvores de P. radiata quanto pinheiro loblolly P. taeda, foram selecionadas para análise do padrão de expressão genética associada com o desenvolvimento de madeira em seções das árvores formadoras de madeira jovem e madeira madura, utilizando-se os micro-arranjos derivados de seqüências de cDNA de P. radiata descritas no Exemplo 4.

Árvores polinizadas em aberto com aproximadamente 16 anos de idade foram selecionadas de locais de plantação-crescimento, nos Estados Unidos para o pinheiro loblolly e na Nova Zelândia para o pinheiro radiata. As árvores foram derrubadas durante a primavera e o verão para se comparar a expressão de genes associados com estes diferentes estágios de desenvolvimento de formação de madeira. As árvores foram derrubadas individualmente e seções do tronco foram removidas da área de base aproximadamente um a dois metros da base e dentro de um ou dois metros abaixo da coroa. A seção removida da extremidade basal do tronco contém madeira madura. A seção removi- da abaixo da coroa contém madeira jovem. As amostras coletadas durante a primavera foram denominadas de madeira precoce ou madeira de primavera, enquanto as amostras coletadas durante o verão foram consideradas como madeira tardia ou madeira de verão. Larson e colaboradores, Geri. Tech. Rep. FPL-GTR-129, Madison, WI: U.S. Department of Agriculture, Forest Service, Forest Products Laboratory. p.42.

Foram isolados tecidos das seções de tronco de tal forma que foram removidos o floema, câmbio, xilema em desenvolvimento, e xilema em maturação. Estes tecidos foram coletados apenas do anel de crescimento do ano em curso. Na remoção do tecido em cada caso, o material foi imediatamente mergulhado em nitrogênio líquido para preservar os ácidos nucléicos e outros componentes. A casca foi removida da seção e o tecido de floema foi removido da face interna da casca por raspagem com uma lâmina de barbear. O tecido de câmbio foi isolado da face externa da seção descascada por raspagem branda da superfície. O xilema em desenvolvimento e o xilema em lignificação foram isolados por realização seqüencial de raspagem mais vigorosa do tecido remanescente. Os tecidos foram transferidos do nitrogênio líquido para recipientes para armazenagem de longo prazo a -70°C até o momento da extração do RNA e subseqüente análise.

Exemplo 13

Este Exemplo ilustra procedimentos alternativos àqueles u- tilizados no exemplo acima para e extração e purificação de RNA, particularmente úteis para RNA obtido de uma variedade de tecidos de plantas lenhosas, e um procedimento alternativo para hibridização e análise de dados utilizando-se os arranjos descritos nos Exemplos 7 e 9.

RNA foi isolado de acordo com o protocolo de Chang e cola- boradores, Plant Mol Biol Rep. 11:113. O DNA foi removido utilizando- se DNase I (Invitrogen, Carlsbad, CA) de acordo com as recomendações do fabricante. A integridade das amostras de RNA foi determinada utilizando-se o bioanalisador Agilent 2100 (Agilent Technologies, EUA).

De cada tecido 10 pg de RNA total foram transcritos em re- verso em cDNA utilizando-se métodos conhecidos.

No caso de tecido de floema de Pinus radiata, pode ser difícil se extrair quantidades suficientes de RNA total para procedimentos de rotulagem normais. O RNA total foi extraído e tratado conforme descri- to previamente e 100 ng de RNA total foram amplificados utilizando-se o sistema de amplificação de RNA Ovation™ Nanosample da NuGEN™ (NuGEN, CA, EUA). Kits de amplificação semelhantes tais como os fabricados pela Ambion podem ser utilizados alternativamente. O RNA amplificado foi transcrito em reverso em cDNA e rotulado conforme descrito acima.

Foram realizadas hibridização e lavagens de estringência u- tilizando-se o protocolo descrito no pedido de patente US para "Methods and Kits for Labeling and Hybridizing cDNA for Microarray Analysis" {supra) a 42°C. Os arranjos (lâminas) foram pesquisados utilizando-se um sistema de análise de micro-arranjo ScanArray 4000 (GSI Lumo- nics, Ottawa, ON, Canadá). Os valores de intensidade brutos não normalizados foram gerados utilizando-se o programa QUANTARRAY (GSI Lumonics, Ottawa, ON, Canadá).

Um desenho experimental em bloco incompleto totalmente balanceado (Kerr e Churchill, Gen. Res. 123: 123, 2001) foi utilizado de maneira a se desenhar um experimento com arranjo que permitiria inferências estatísticas máximas dos dados analisados.

Os dados de expressão genética foram analisados utilizan- do-se o pacote de programas SAS® Microarray Solution (The SAS Institute, Caiy, NC5 EUA). Os dados resultantes foram então visualiza- dos utilizando-se JMP® (The SAS Institute, Caiy, NC, EUA). A análise realizada para este experimento foi uma aborda- gem ANOVA com especificação de modelo misto (Wolfinger e colaborado- res, J. Comp. Biol. 8:625-637). Foram aplicadas duas etapas de mode- los lineares mistos. O primeiro, modelo de normalização, foi aplicado para normalização global ao nível de lâmina. O segundo, modelo genético, foi aplicado para se obter inferência estatística rigorosa em cada gene. Ambos os modelos estão mostrados nos Modelos (1) e (2).

Iog2(YyTds) = Oij + Dk+ Si + DSki + COlJkis (1) Rflkla - μ%> + Df + Sf + DSf1 + SSf + eflkls (2)

Yijkis representa a intensidade do s° ponto na lâmina Io com o corante k° aplicando-se o tratamento j° para a linhagem celular i°. Gij, Dk, Si e DSki representam o efeito médio no tratamento j° na linhagem celular i°, o efeito do corante k°, o efeito randômico da lâmina Io, e o efeito da interação randômica do corante k° na lâmina Io. Oijkis é o erro estocástico. Rflkls representa o residual do gene g° do modelo (1). ,

Df, Sf e DSf representam os papéis similares a Dk, Si e DSki

exceto que são específicos para o gene g°. SS f representa o ponto por

efeito randômico da lâmina para o gene g°. E sflkls representa o erro

estocástico. Todos os termos randômicos são assumidos como sendo distribuídos normalmente e mutuamente independentes em cada modelo.

De acordo com a análise descrita acima, observou-se que certos cDNAs, alguns dos quais são mostrados na Tabela 7, correspon- dem a níveis de estado de equilíbrio diferentes do RNA, o que pode corresponder a diferenças na expressão genética ou estabilidade do transcrito. O •Η

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Exemplo 14

Este Exemplo demonstra como se pode correlacionar a ex- pressão de gene de polissacarídeo com fenótipos de madeira agronomi- camente importantes tais como densidade, rigidez, resistência, distân- cia entre ramos, e grão espiral.

Árvores maduras de pinheiro propagadas por clonagem fo-

ram selecionadas entre a progênie de árvores parentais conhecidas como apresentando características de crescimento superior e resistên- cia a importantes doenças fúngicas. A casca foi removida de uma seção tangencial e as árvores foram examinadas quanto a densidade média da madeira no quinto anel anual à altura do peito, rigidez e resistência da madeira, e grão espiral. As árvores foram também caracterizadas por suas alturas, distância média entre os ramos principais, tamanho de coroa, e forquilha.

De maneira a se obter famílias de plântulas que segreguem os genes principais que afetam a densidade, rigidez, resistência, distân- cia entre ramos, grão espiral e outras características que possam estar ligadas a qualquer um dos genes que afeta estas características, árvores não apresentando pais comuns foram escolhidas para cruzamentos específicos com o critério de que exibam a maior variação entre si no que diz respeito a critérios de densidade, rigidez, resistência, distância entre ramos, e grão espiral. Desta forma, pólen de uma árvore exibindo alta densidade, baixa distância média entre os ramos principais, e grão espiral alto, foi utilizado para polinizar cones das árvores mais não relacionadas entre as seleções exibindo densidade mais baixa, distância média maior entre os ramos principais, e o mais baixo grão espiral. É útil se observar que as "árvores mais" foram cruzadas de tal forma que pólen de uma árvore mais exibindo alta densidade foi utilizado para polinizar cones em desenvolvimento de uma outra árvore mais exibindo alta densidade, por exemplo, e pólen de uma árvore exibindo distância média baixa entre os ramos principais foi utilizado para polinizar cones em desenvolvimento de uma outra árvore exibindo baixa distância média entre os ramos principais.

As sementes foram coletadas destas polinizações controla- is das e cultivadas de tal forma que a identidade parental foi mantida para cada semente e utilizada para propagação vegetativa, de tal forma que cada genótipo estava representado por rametes múltiplos. A propaga- ção vegetativa foi obtida utilizando-se micro-propagação, poda ou enxertia de glomérulo. Alguns rametes de cada genótipo foram armaze- nados enquanto os propágulos vegetativos de cada genótipo foram cultivados até um tamanho suficiente para o estabelecimento de um campo de plantio. Os genótipos foram dispostos em um desenho replicado e cultivados sob condições de campo onde a temperatura diária e a quantidade de chuva foram determinadas e registradas.

As árvores foram medidas a várias idades para se determi-

nar a expressão e segregação da densidade, rigidez, resistência, distân- cia entre ramos, grão espiral e qualquer outra característica observável que possa estar ligada a qualquer um dos genes que afeta estas carac- terísticas. As amostras foram coletadas para caracterização de teor de celulose, teor de lignina, ângulo de microfibrila de celulose, densidade, rigidez, resistência, morfologia traqueíde, largura de anel e outras. Foi então coletado RNA de amostras replicadas das árvores mostrando rigidez e densidade divergentes, ou outras características, dos genótipos que foram de alguma outra forma tão similares quanto possível no tipo de crescimento, na primavera e outono de tal forma que foi ensaiado o desenvolvimento de madeira precoce e tardia. Estas amostras foram examinadas quanto a expressão genética de maneira similar à mostrada na Tabela 8 abaixo. Clt Ih

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Exemplo 15

Este Exemplo demonstra como respostas a condições ambi-

entais tais como luz e estação do ano alteram o fenótipo vegetal e podem ser correlacionadas à expressão do gene de polissacarídeo utilizando-se micro-arranjos. Em particular, as alterações na expressão genética associadas com densidade de madeira são examinadas.

Árvores de três genótipos híbridos de E. grandis propagados

por clonagem são crescidas em um local com uma estação climática que mede temperaturas e precipitação pluviométrica diárias. Durante a primavera e verão subseqüente, rametes geneticamente idênticos de três genótipos diferentes são primeiramente fotografados com marcas de orientação norte-sul, utilizando-se fotografia com resolução suficiente para mostrar as características da casca de partes jovens e maduras da planta, e então foram derrubadas. A idade das árvores é determinada por registros de plantio e confirmada por uma contagem dos anéis anuais. Em cada uma destas árvores, a madeira madura é definida como os anéis mais externos da árvore abaixo da altura do peito, e a madeira jovem como os anéis mais internos acima da altura do peito. Cada árvore é setorizada de acordo como se segue:

NM - MADURA LADO NORTE

SM - MADURA LADO SUL

25

NT - TRANSIÇÃO LADO NORTE ST - TRANSIÇÃO LADO SUL NJ - JOVEM LADO NORTE SJ - JOVEM LADO SUL

O tecido foi colhido do tronco da planta bem como de folhas jovens e maduras. As amostras são preparadas simultaneamente para análise de fenótipo, incluindo morfologia vegetal e características bioquímicas, e análise da expressão genética. A altura e o diâmetro da árvore no ponto em que cada setor foi tomado são registrados, e uma amostra de solo da base da árvore é tomada para ensaio químico. As amostras preparadas para análise da expressão genética são pesadas e colocadas em nitrogênio líquido para preparação subseqüente das amostras de RNA para uso no experimento de micro-arranjo. Os tecidos são anotados como se segue:

P - floema;

C- câmbio;

Xl - xilema em expansão;

X2 - xilema em diferenciação e lignificação.

Fatias finas das seções tangencial e radial de cada um dos setores do tronco são fixadas como descrito em Ruzin, "PLANT MICRO- TECHNIQUE AND MICROSCOPY", Oxford University Press, Inc., New York, NY (1999) para exame anatômico e confirmação do estágio de desenvolvimento da madeira. 0 ângulo de microfibrila é examinado nos diferentes estágios de desenvolvimento da madeira, por exemplo, fases juvenil, de transição e madura de madeira de Eucalyptus grandis. Outras características examinadas são a proporção de fibras para elementos vasculares e tecido de raio em cada setor. Além disso, as amostras são examinadas quanto a características que se alteram entre madeira jovem e madura e entre madeira de primavera e madeira de verão, tais como morfologia de fibra, tamanho de lúmen e largura da camada da parede celular S2 (mais espessa). As amostras são exami- nadas, além disso, quanto os valores de densidade no quinto anel e determinação do módulo de elasticidade utilizando-se técnicas bem conhecidas dos especialistas na técnica de ensaio de madeira. Ver, por exemplo, Wang e colaboradores, Non-destructive Evaluations of Trees, "EXPERIMENTAL TECHNIQUES', pp. 25-30 (2000).

Para a análise bioquímica, 50 gramas de cada uma das a- mostras colhidas são liofilizados e analisados utilizando-se ensaios bioquímicos bem conhecidos dos especialistas na técnica de bioquímica vegetal para quantidades de açúcares, aminoácidos, lipídeos, outros extratos, lignina e celulose. Ver, por exemplo, Pettersen & Schwandt, J. WoocL Chem. & Technol 11 :495 (1991).

No presente exemplo, os fenótipos escolhidos para compa-

ração são densidade alta da madeira, densidade média da madeira, e densidade baixa da madeira. Amostras de ácido nucléico são prepara- das como descrito nos Exemplos 1 e 2, a partir de árvores colhidas na primavera e no verão. A formação do perfil de expressão genética por hibridização e análise de dados é realizada como descrito acima.

Utilizando-se técnicas similares e indivíduos propagados por clonagem, se pode examinar a expressão de genes de polissacarídeo na medida em que está relacionada com outras características comple- xas da madeira tais como resistência, rigidez e espiralidade.

Exemplo 16

Este Exemplo demonstra como um gene do presente pedido pode ser ligado a um promotor preferido de tecido e expresso em pinheiro resultando em uma planta com densidade de madeira aumen- tada. Um gene do presente pedido, que é determinado pelos mé- todos dos exemplos anteriores como sendo altamente expresso durante o início da primavera, é clonado em uma construção de DNA apresen- tando um polipeptídeo relacionado com densidade operativamente ligado a um promotor, é colocado em um vetor binário apropriado e transformado em pinheiro utilizando-se os métodos descritos aqui. Plantas de pinheiro são transformadas como descrito aqui e as plantas de pinheiro transgênicas são utilizadas para se estabelecer um plantio florestal. Uma densidade aumentada mesmo na madeira de primavera (madeira precoce) é observada nas plantas de pinheiro transgênicas em relação às plantas de pinheiro de controle que não são transformadas com a construção de DNA relacionada com densidade.

Exemplo 17

Este Exemplo demonstra como a análise da expressão gené- tica pode ser utilizada para se encontrar variantes genéticas que estão presentes em plantas maduras apresentando o fenótipo desejado. A presença ou ausência de uma variante tal pode ser utilizada para se prever o fenótipo de uma planta madura, permitindo a varredura de plantas no estágio de plântula. Embora este exemplo empregue euca- lipto, o método utilizado aqui é também útil em programas de melhora- mento para pinheiro e outras espécies de árvores.

É examinada a seqüência de um gene putativo relacionado à densidade é utilizada para a sondagem de DNA genômico isolado de Eucalyptus que varia em densidade como descrito nos fenótipos vege- tais. Um híbrido exibe densidade de madeira alta e um outro híbrido exibe densidade de madeira mais baixa. Um marcador molecular na parte 3' da região de codificação é encontrado que distingue uma variante genética de alta densidade de uma variante genética de densi- dade mais baixa.

15

20 Este marcador molecular possibilita aos melhoradores vege- tais ensaiar híbridos de Eucalyptus não transgênicos para possíveis perfis de densidade, enquanto as árvores estão ainda no estágio de plântula, enquanto na ausência do marcador, os melhoradores devem esperar até que as árvores tenham crescido por vários anos antes que a densidade na idade de corte possa ser prevista de forma confiável. Isto possibilita a manutenção seletiva em plantio das melhores árvores no estágio de plântula em vez de uma operação de dispendiosa de seleção e separação e resultante erosão na idade de desbaste. Este marcador molecular é Além disso útil no programa de melhoramento para se determinar quais pais irão produzir progênie de cruzamento de alta densidade.

Os marcadores moleculares encontrados na parte 3' da re- gião de codificação do gene que não correspondem às variantes obser- vadas mais freqüentemente em árvores híbridas de Eucalyptus não transgênicas de densidade mais alta ou mais baixa são também úteis. Estes marcadores são tidos como úteis para a identificação de diferen- tes genótipos de Eucalyptus, para utilização no rastreamento de identi- dade no programa de melhoramento e em plantações.

Exemplo 19

Este Exemplo demonstra a utilização de um promotor prefe- rido vascular ligado funcionalmente a um dos genes do presente pedido.

Um promotor preferido vascular, tal como qualquer um dos descritos no Pedido de Patente US 10/703.091, depositado em 7 de novembro de 2003, é, então, ligado a um dos genes do presente pedido e utilizado para transformar espécies arbóreas. Níveis amplificados do transcrito do gene candidato no xilema dos transformantes resultam em um fenótipo de biomassa de xilema aumentada.

Noutro Exemplo, um promotor preferido vascular tal como qualquer um dos descritos no pedido de patente US número de série 10/717.897, depositado em 21 de novembro de 2003, ou no pedido de patente US número de série 10/703.091, depositado em 7 de novembro de 2003, ambos incorporados aqui como referência. Por exemplo, um promotor preferido vascular é ligado a uma construção de RNAi conten- do seqüências de um dos genes do presente pedido e utilizado para transformar uma árvore do gênero do qual o gene foi isolado. Níveis de transcrito reduzidos do gene candidato no xilema dos transformantes resultam em um fenótipo de biomassa de xilema aumentado.

Exemplo 19

Este Exemplo demonstra a utilização de um promotor prefe- rido vascular funcionalmente ligado a um dos genes do presente pedido.

O plasmídeo pOX16 foi clonado utilizando-se as seguintes etapas. Primeiramente foi obtido o plasmídeo pWVK223 (Figura 225, SEQ ID No.: 691) um plasmídeo derivado do pBI121 (Clontech Labora- tories, Palo Alto CA) que contém o promotor 35S da seqüência GUS substituído com o promotor 4CL de P. taeda (Patente US 6.252.135) NOS que aciona o gene NPTII substituído o promotor UBQ10 de Arabi- dopsis (Sunj C. W. & Callis, J. (1997) PlantJ., 11:101-111). Um sítio de clonagem múltipla foi adicionado nos sítios de HindIII e ClaI utilizando- se os oligonucleotídeos complementares sintetizados MCSI e MCSII.

MCSI AGCTCTACAATTGGCTAGCAAAGTACTTAA-

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MCSII G ATGTTAAC C GATC GTTTC ATG AATTTC GAAGG-

TAGC

O pWVK223 foi, então, utilizado como esqueleto para a cri- ação do plasmídeo intermediário pOXl (Figura 226, SEQ ID No.: 692) pela substituição do terminador NOS com o terminador AGAMOUS de Liquidambar styraciflua (LSAGter) (patente US 6.444.877). Os sítios de restrição para Nhel and Scal no plasmídeo pOXl foram então utilizados para adicionar o gene da SEQ ID No.: 8, isolado do clone de cDNA apropriado do Exemplo 2 para se criar o plasmídeo pOX16 (Figura 227 e SEQ ID No.: 693).

A construção de DNA de controle pOX2 foi engenheirada pe- la utilização do plasmídeo POXl como esqueleto. O gene GUS INT (Vancanneyt e colaboradores, Mol Gen. Genet. 220:245-250, 1990) foi adicionado nos sítios de HindIII e SmaI do plasmídeo pOXl para se criar o plasmídeo pOX2 (Figura 228 e SEQ ID No.: 694).

Exemplo 20

Este Exemplo demonstra a transformação e propagação de choupo-do-canadá (Populus deltóides). As construções pOX16 e pOX2 foram obtidas como descrito no exemplo anterior e foram inoculadas em culturas de Agrobacterium por técnicas padrão.

Culturas de plantas de Populus deltóides foram mantidas em meio BTM livre de hormônio (Chalupa, Communicationes Instituti Forestalls Checosloveniae 13:7-39, 1983, comercialmente disponível da Sigma/Aldrich) ou meio WPM (maio para planta lenhosa - Lloyd, G., e McCown, B., 1981. iiWoody plant médium. Proc. Intern. Plant Prop. Soe." 30:421, comercialmente disponível da Sigma/Aldrich) em uma casa de crescimento com fotoperíodo de 16 horas. Para a transforma- ção, foram cortados assepticamente pecíolos das plantas utilizando-se uma lâmina de bisturi afiada, cortes com comprimentos de 4-6 mm, e colocados em meio DKW (Driver e Kuniyuki, 1984, McGranahan e colaboradores, 1987, disponível comercialmente da Sigma/Aldrich) com 1 mg/ml de BAP e 1 mg/ml de NAA, imediatamente após a colheita, e incubados em uma câmara de crescimento escura (28°C) por 24 horas.

Culturas de Agrobaeterium contendo a construção pOX16 foram crescidas para a fase log, indicada por uma ODõoo entre 0,8 e 1,0 A, e peletizadas e re-suspensas em um volume igual de meio de indução de Agrobacterium (AIM) (sais de WPM com glicose a 5 g/l, 250 μΜ de acetosiringona, 2 mM de tampão fosfato, e 0,05 M de MES, pH 5,8). O pélete foi re-suspenso por vórtice. As células bacterianas foram incu- badas por uma hora neste meio a 28°C em uma câmara ambiental, com agitação a 100 rpm.

Após o período de indução, os explantes de Populus deltóí- des foram expostos à mistura de Agrobacterium por 15 minutos. Os explantes foram então ligeiramente secados em toalhas de papel estéreis, recolocados no mesmo meio vegetal e cultivados no escuro a 18-20°C. Após um período de três dias de co-cultivo, os explantes foram transferidos para meio DKW no qual a concentração de NAA foi reduzida para 0,1 Ug/ml e ao qual foram adicionados 400 mg/l de timentina para erradicar a Agrobacterium.

Após 4 dias no meio de erradicação, os explantes foram transferidos para caixas magenta pequenas contendo o mesmo meio suplementado com timentina (400 mg/l) bem como o agente de seleção geneticina (50 mg/l). Os explantes foram transferidos a cada duas semanas para meio de seleção fresco. Os calos que cresceram na presença do agente de seleção foram isolados e sub-cultivados em meio de seleção fresco a cada três semanas. Os calos foram observados quanto a produção de brotos adventícios.

Os brotos adventícios foram observados normalmente no período de dois meses a partir do início da transformação. Estes conjuntos de brotos foram transferidos para meio DKW ao qual se adicionou NAA, e no qual a concentração de BAP foi reduzida para 0,5 mg/ml, para alongamento dos brotos, tipicamente por cerca de 14 semanas. Os brotos alongados foram cortados e transferidos para meio WPM ou BTM livres de hormônio a pH 5,8, contendo 20 g/l de sacarose g/l de carvão ativo. Ver Tabela 9 abaixo.

Tabela 9

Meio de enraizamento para Populus deltóides

Componentes do meio BTM-I mg/l NH4NO3 412 KNO3 475 Ca(N03)2.4H20 640 CaCl2.2H20 440* MgSO4.7H20 370 KH2PO4 170 MnSO4-H2O 2,3 ZnSO4.7H20 8,6 CuSO4.5H20 0,25 CoCl2.6H20 0,02 KI 0,15 H3BO3 6,2 Na2MoO4.2H20 0,25 FeSO4.7H20 27,8 Na2EDTA.2H20 37,3 Mioinositol 100 Ácido nicotínico 0,5 Piridoxina HCl 0,5 Tiamina HCl 1 Glicina 2 Sacarose 2000

Carvão ativo 5000

Após do desenvolvimento de raízes, tipicamente quatro se- manas, as plantas transgênicas foram propagadas em casas de vegeta- ção por métodos de estaquia, ou in uitro por indução de brotação axilar por quatro semanas em meio DKW contendo 11,4 μΜ de zeatina, após o que os brotos multiplicados foram separados e transferidos para um meio de indução de raiz. As plantas enraizadas foram transferidas para o solo para avaliação do crescimento em condições de casa de vegetação e campo.

Exemplo 21

Este Exemplo demonstra o efeito da transformação de uma árvore com as construções do Exemplo 19.

Plantas de Populus deltóides transformadas com os plasmí- deos pOX16 e pOX2 tal como descrito no Exemplo 20 foram crescidas em super-células de Ray Leach ClO "Cone-tainers"™ em casa de vegetação. Após 5 meses as plantas foram medidas quanto a altura, calibre e volume. As medidas de altura foram tomadas com precisão de cm medindo-se do pescoço do colar da super-célula até o meristema apical de cada planta. Os calibres das plantas foram medidos utilizan- do-se um medidor digital (Mitutoyo - Aurora, Illinois) com precisão de 0,01 mm. As medidas de calibre foram tomadas na região mais clara do tronco (isto é, ramificações, nós ou protuberâncias) um pouco acima do pescoço do colar da super-célula. O índice volumétrico foi calculado utilizando-se a seguinte fórmula: Volume = (raio)2 * 3,1415926 * altura.

As plantas transformadas com o pOX16 com o gene da SEQ

ID No.: 8, quando comparadas com as plantas de controle com GUS do pOX2, apresentaram altura, calibre e volume maiores. Quando se compara todos os 65 rametes de todas as linhagens transgênicas de pOX16 com todos os 26 rametes produzidos de todas as 3 linhagens transgênicas do controle pOX2, observa-se que a altura média foi 126% maior que a do controle, o calibre médio foi 134% maior que o do controle e o índice volumétrico médio foi 227% maior que o do controle. LO

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ιη Tabela 11 Medidas das Plantas Transgênicas Para Cada Linhagem Transgênica.

Plasmídeo Linhagem

Número

de rametes

(n)

índice de Volume Médio

Altura Calibre Média Médio

(cm)

(mm)

(cm3) pOXló TDL003769 6 6,82 45,00 4,37 pOX16 TDL003978 15 35,15 92,97 6,81 pOXlõ TDL003979 14 50,89 98,61 8,02 pOXló TDL003980 15 30,82 90,07 6,54 pOXlõ TDL003981 15 36,45 89,14 7,07 pOX2 TDL003824 11 15,73 65,91 5,49 pOX2 TDL003823 10 13,81 76,70 4,69 pOX2 TDL003819 5 13,38 64,80 5,07

Quando se analisa cada linhagem transgênica separada- mente observa-se que 4 das 5 linhagens transgênicas pOX16 apresen- taram aumentos significativos de altura, calibre e volume, quando em comparação com os controles. Isto pode ser facilmente observado nos gráficos abaixo. Altura Média

120.00

100.00

80.00 ·

E 60.00

40.00

20.00 ■

0.00

TDL003991 pOX16

TDL003824 pOX2

TDL003823 pOX2

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Plasmídeo e Linhagem Transgênica Calibre Médio

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Plasmídeoe Linhagem Transgênica

índice Volumétrico Médio

60.00

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TDL003824 pOX2

TDL003823 pOX2

TDL003815 pOX2

Plasmídeo e Linhagem Transgênica

Claims

"Polinucleótidos Isolados, Proteína da Parede da Célula de Planta, Construção de DNA, Células de Planta, Plantas Transgênícas, Seqüências Isoladas de Nucleótidos, Métodos de Produção de Planta Transgênica, de Correlação da Expressão de Polinucleótido em Duas Amostras Diferentes e da Posse de um Penótipo de Planta com o Nível de Expressão de Polinucleótido na Planta de um ou Mais Polinucleótidos, de Detecção de um ou Mais Polinucleótidos Numa Amostra e de uma ou Mais Seqüências de Ácido Nucléico Codificadas por um ou Mais Polinucleótidos numa Amostra, Polpa de Madeira, Combinações Para Detectar a Expressão de um ou Mais Polinucleótidos, Microarranjo e Kit Para Detectar a Expressão de Gene" Reivindicações

1. - Polinucleótido Isolado, caracterizado por que e compreende uma seqüência de ácido nucléico que codifica um polipeptídeo que regula o desenvolvimento da parede da célula.

2. - Polinucleótido Isolado, de acordo com a Reivindicação 1, caracte- rizado por que o referido polinucleótido funciona numa célula de planta.

3. - Polinucleótido Isolado, de acordo com a Reivindicação 1, caracte- rizado por que o polinucleótido isolado compreende uma seqüência de ácido nucléico selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 1-230

4. - Polinucleótido Isolado, de acordo com a Reivindicação 3, caracte- rizado por que o polinucleótido é normalmente expresso numa espécie de Eucalyptus ou Pinus.

5. - Polinucleótido Isolado, de acordo com a Reivindicação 4, caracte- rizado por que o polinucleótido é normalmente expresso numa espécie de Eucalyptus grandis.

6. - Polinucleótido Isolado, de acordo com a Reivindicação 4, caracte- rizado por que o polinucleótido é normalmente expresso em Pinus radiata.

7. - Polinucleótido Isolado, de acordo com a Reivindicação 1, caracte- rizado por que o polinucleótido é normalmente expresso numa espécie de conífera.

8. - Polinucleótido Isolado, de acordo com a Reivindicação 7, caracte- rizado por que a conífera é selecionada do grupo que consiste em pinheiro branco oriental, branco ocidental, pinheiro Sugar, pinheiro vermelho, pinheiro Pitch, pinheiro Jack, pinheiro de folha comprida, pinheiro de folha curta, pinheiro Loblolly, pinheiro Slash, pinheiro da Virgínia, pinheiro Ponderosa, pinheiro Jeffrey e pinheiro Lodgepole, pinheiro Radiata e híbridos cruzados dos mesmos.

9. - Polinucleótido Isolado, de acordo com a Reivindicação 7, caracte- rizado por que a conífera é selecionada do grupo que consiste em Abies firma, Cedrus deodara, Cedrus deodara eAlbospica', Cedrus deodara iAurea', Cedrus deodara eKashmir', Cedrus deodara fShalimar' Cedrus deodara eSilver mist, Cedrus deodara eImp Branco', Cedrus Ubani (ssp. Atlantica) glauca, Cedrus Ubani (ssp.atlantica) glauca pêndula, Cedrus libani eNana', Cedrus libani pêndula, Cedrus Ubani brevifolia, Cedrus Ubani var. Stenacoma, Chamaecypans lawsoniana, Chamaecyparis nootkatensis ePendula', Chamaecyparis obtusa eCnppsii', Chamaecypans pisifera eBulevar', Chamaecyparis pisifera eFilifera Aurea', Chamaecypa- ris thyoides eBlue Sport, CryptomeHa japoniea eSehhan Sugi', Cryptome- ria japoniea eVilmoriniana', Cunninghamia laneeolata eGlauca', Cuppres- sus arizonica var. Glabra eBlue Jce', Cuppressus arizoniea eBlue Sapphire, Ginhgo biloba, Ginhgo biloba eAutumn Glod, Glyptostrobus pensilis, Juniperus chinensis eTorulosa', Juniperus scopulorum eTollesons', Juniperus virginiana, Larix haempferi, Metasequoia glyptostroboides, Picea abies, Picea abies Pêndula, Picea abies eRemontii', Pieea glauca eSanders Blue, Pinus χ hahhodensis, Pinus nigra var. Nigra, Picea omoriha, Pinus densiflora eUmbraculifera', Pinus elliottii, Pinus flexilis eVanderwolf Pyramid, Pinus pinea, Pinus massoniana, Pinus strobus, Pinus strobus 'Pêndula', Pinus sylvestris eFrench Blue, Pinus sylvestris eMitsch Weeping, Pinus taeda, Pinus radiata, Pinus Pinascer, Pinus thunbergiana, Pinus virginiana, Pseudotsuga menziesii, Pseudolarix amabilis, Sequoia sempervirens, Taxodium ascendens, Taxodium distichum, Thuja oecidentalis eFiliformis', Tsuga Canadensis eGolden Splendor', χ Cuppressocyparis leylandii, χ Cuppressocyparis leylandii ePost Sentinel, χ Cuppressocyparis leylandii eCaslewellan', χ Cuppres- socyparís leylandii eNaylors Blue, e cruzamentos híbridos das mesmas.

10. - Polinucleótido Isolado, de acordo com a Reivindicação 7, carac- terizado por que a conífera é uma árvore de pinheiro Amarelo do Sul.

11. - Polinucleótido Isolado, de acordo com a Reivindicação 10, caracterizado por que a Meridional Amarela anseia é selecionado do grupo que consiste em Pinus taeda, Pinus serotina, Pinus palustris e Pinus elliottii e híbridos.

12. - Polinucleótido Isolado, de acordo com a Reivindicação 1, carac- terizado por que o polinucleótido é normalmente expresso numa árvore selecionada do grupo que consiste em castanheiro, freixo, faia, tília americana, vidoeiro, cerejeira preta, nogueira preta, castanheira da Califórnia, choupo-do-canadá, olmo, eucalipto, olmo americano, nogueira norte-americana, azevinho, alfarrobeira, magnólia, bordo, carvalho, álamo, acácia, faia preta, teca, amieiro vermelho, paulônia real, sassafrás, liquidámbar, sicômoro, tupelo, salgueiro e álamo amarelo e cruzamentos híbridos intra e inter-espécies das mesmas.

13. - Polinucleótido Isolado, de acordo com a Reivindicação 1, carac- terizado por que o polinucleótido é normalmente expresso numa gimnospérmica ou numa angiospérmica.

14. - Polinucleótido Isolado, de acordo com a Reivindicação 1, carac- terizado por que o polinucleótido expressa um polipeptídeo que é capaz de regular a síntese da parede da célula numa planta monocotiledônea.

15. - Polinucleótido Isolado, de acordo com a Reivindicação 14, caracterizado por que a referida planta monocotiledônea é selecionada do grupo que consiste em grama, trigo, milho, arroz, aveia, cevada, orquídea, íris, lírio, cebola, cana-de-açúcar e sorgo.

16. - Polinucleótido Isolado, de acordo com a Reivindicação 15, caracterizado por que a referida grama é selecionada do grupo que consiste em Agrostis spp., Poa pratensis, Lolium spp.} grama azul do Kentucky e Mistura Ryegrass Perene; Festuca arundinacea, Festuca rubra commutata, Cynodon dactylon, Pennisetum clandestinum, Stenota- phrum secundatum, Zoysia japonica e Dichondra micrantha.

17.- Polinucleótido Isolado, de acordo com a Reivindicação 1, caracte- rizado por que o polinucleótido expressa um polipeptídeo que é capaz de regular a síntese da parede da célula numa planta dicotiledônea.

18. - Polinucleótido Isolado, de acordo com a Reivindicação 17, 5 caracterizado por que a referida planta dicotiledônea é selecionada do grupo que consiste em algodão, tabaco, Arabidopsis, tomate, batata, aspen, eucalipto, liquidâmbar, acácia, álamo, salgueiro, teca, caoba, castanheiro, olmo, beterraba, brócolos, cassava, batata doce, pimenta, poinsettia, legumes, alfafa, soja, cenoura, morango, alface, carvalho, bordo, noz, rosa, hortelã, abóbora, margarida, gerânio e cacto.

19. - Polinucleótido Isolado, de acordo com a Reivindicação 1, carac- terizado por que o referido polipeptídeo é capaz de sobrerregular ou subregular a biossíntese da parede da célula numa planta.

20. - Polinucleótido Isolado, de acordo com a Reivindicação 19, caracterizado por que o referido gene é endógeno ao genoma da planta.

21. - Polinucleótido Isolado, de acordo com a Reivindicação 20, caracterizado por que o fenótipo de uma planta que expressa o polinucleótido isolado em pelo menos uma célula é diferente do fenótipo de uma planta da mesma espécie que não expressa o polinucleótido isolado em nenhuma de suas células.

22. - Polinucleótido Isolado, de acordo com a Reivindicação 21, caracterizado por que o fenótipo da planta que expressa o polinucleóti- do isolado compreende uma diferença na qualidade da lignina em comparação com uma planta da mesma espécie que não expressa o polinucleótido isolado.

23. - Polinucleótido Isolado, de acordo com a Reivindicação 22, caracterizado por que a diferença na qualidade da lignina é caracteri- zada por uma mudança na estrutura da molécula da lignina.

24. - Polinucleótido Isolado, de acordo com a Reivindicação 21, caracterizado por que o fenótipo da planta que expressa o polinucleóti- do isolado compreende uma diferença na composição da madeira em comparação com uma planta da mesma espécie que não expressa o polinucleótido isolado.

25. - Polinucleótido Isolado, de acordo com a Reivindicação 21, caracterizado por que o fenótipo da planta que expressa o polinucleóti- do isolado compreende uma diferença na composição da fibra em comparação com uma planta da mesma espécie que não expressa o polinucleótido isolado.

26. - Polinucleótido Isolado, de acordo com a Reivindicação 21, caracterizado por que o fenótipo da planta que expressa o polinucleóti- do isolado compreende uma diferença na divisão celular da planta em comparação com uma planta da mesma espécie que não expressa o polinucleótido isolado.

27. - Polinucleótido Isolado, de acordo com a Reivindicação 21, caracterizado por que o fenótipo da planta que expressa o polinucleóti- do isolado compreende uma diferença no desenvolvimento da célula da planta em comparação com uma planta da mesma espécie que não expressa o polinucleótido isolado.

28. - Polinucleótido Isolado, caracterizado por que compreende a seqüência de qualquer um de SEQ ID NOs: 1-230, ou uma variante das mesmas.

29. - Polinucleótido Isolado, de acordo com a Reivindicação 28, caracterizado por que a referida variante codifica um polipeptídeo que é capaz de regular o desenvolvimento da parede da célula numa planta.

30. - Proteína da Parede da Célula de Planta, caracterizada por que compreende a seqüência de aminoácido de qualquer uma de SEQ ID NOs: 1-230 ou variante das mesmas, em que a referida proteína da parede da célula é capaz de regular o desenvolvimento da parede da célula numa planta.

31. - Polinucleótido Isolado, de acordo com a Reivindicação 28, caracterizado por que a referida variante tem uma identidade de seqüência que é maior ou igual a 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%,93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86%, 85%, 84%, 83%, 82%, 81%, 80%, 79%, 78%, 77%, 76%, 75%, 74%, 73%, 72%, 71%, 70%, 69%, 68%, 67%, 66%, 65%, 64%, 63%, 62%, 61% ou 60% em seqüência a qualquer uma de SEQ ID NOs: 1-230.

32. - Proteína da Parede da Célula de Planta, de acordo com a Reivindicação 30, caracterizada por que a referida variante tem uma identidade de seqüência que é maior ou igual a ,99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86%, 85%,84%, ,83%, 82%, 81%, 80%, 79%, 78%, 77%, 76%, 75%, 74%, 73%, 72%, ,71%, 70%, 69%, 68%, 67%, 66%, 65%, 64%, 63%, 62%, 61% ou 60% em seqüência a qualquer uma de SEQ ID NOs: 1-230.

33. - Construção de DNA, caracterizada por que compreende (i) pelo menos um polinucleótido que tem a seqüência de qualquer uma de SEQ ID NOs: 1-230, e (ii) um promotor, em que o referido promotor e o citado polinucleótido são operavelmente ligados.

34. - Construção de DNA, de acordo com a Reivindicação 33, caracte- rizada por que o referido promotor é selecionado do grupo que consiste num promotor constitutivo, um promotor forte ou um promotor induzível.

35. - Construção de DNA, de acordo com a Reivindicação 34, caracte- rizada por que o referido promotor é regulado por qualquer um dentre ferimento, jasmonato de metila ou ácido salicílico.

36. - Construção de DNA, de acordo com a Reivindicação 33, caracte- rizada por que o referido polinucleótido produz uma transcrição de RNA.

37. - Construção de DNA, de acordo com a Reivindicação 36, caracte- rizada por que a referida transcrição de RNA tem uma seqüência de anti-sentido de um gene que é endógeno para uma célula de planta.

38. - Construção de DNA, de acordo com a Reivindicação 36, caracte- rizada por que a referida transcrição de RNA induz interferência de RNA de um gene que é normalmente expresso numa célula de planta.

39. - Célula de Planta, caracterizada por que compreende uma construção de DNA que compreende (i) pelo menos um polinucleótido que tem a seqüência de qualquer uma dentre SEQ ID NOs: 1-230 e (ii) um promotor, em que o referido polinucleótido codifica uma proteína que regula o desenvolvimento da parede da célula e em que o citado promotor e dito polinucleótido são operavelmente ligados.

40. - Planta Transgênica, caracterizada por que compreende a célula de planta da Reivindicação 39.

41. - Célula de Planta, caracterizada por que compreende uma construção de DNA que compreende (i) pelo menos um polinucleótido que tem a seqüência de qualquer uma dentre SEQ ID NOs: 1-230 e (ü) um promotor, em que o referido polinucleótido codifica uma proteína que regula o desenvolvimento da madeira e em que o citado promotor e dito polinucleótido são operavelmente ligados.

42. - Planta Transgênica, caracterizada por que compreende a célula de planta da Reivindicação 41.

43. - Método de Produção de Planta Transgênica, caracterizado por que compreende (a) transformar uma célula de planta com uma construção de DNA que compreende (i) pelo menos um polinucleótido que tem a seqüência de qualquer uma dentre SEQ ID NOs: 1-230 e (ii) um promotor, em que o referido polinucleótido codifica uma proteína que regula o desenvolvimento da parede da célula; (b) cultivar a citada célula de planta transformada sob condições que promovem o cresci- mento de uma planta e (c) selecionar uma planta transgênica que exibe um fenótipo que é diferente de uma planta da mesma espécie que não contém dita construção de DNA.

44. - Método de Produção de Planta Transgênica, de acordo com a Reivindicação 43, caracterizado por que o fenótipo da planta que expressa o polinucleótido e o ácido nucléico pretendidos é caracterizado por uma diferença na qualidade da lignina em comparação com uma planta da mesma espécie que não contém a construção de DNA.

45. - Método de Produção de Planta Transgênica, de acordo com a Reivindicação 44, caracterizado por que a diferença na qualidade da lignina é caracterizada por mudança na estrutura da molécula de lignina.

46. - Método de Produção de Planta Transgênica, de acordo com a Reivindicação 43, caracterizado por que o fenótipo da planta que expressa o polinucleótido e o ácido nucléico pretendidos é caracterizado por uma diferença na composição da madeira em comparação com uma planta da mesma espécie que não contém a construção de DNA.

47. - Método de Produção de Planta Transgênica, de acordo com a Reivindicação 43, caracterizado por que o fenótipo da planta que expressa o polinucleótido é caracterizado por uma diferença no rendi- mento de fibra em comparação com uma planta da mesma espécie que não contém a construção de DNA.

48. - Método de Produção de Planta Transgênica, de acordo com a Reivindicação 43, caracterizado por que o fenótipo da planta que expressa o polinucleótido é caracterizado por uma diferença na divisão celular na planta em comparação com uma planta da mesma espécie que não contém a construção de DNA.

49. - Método de Produção de Planta Transgênica, de acordo com a Reivindicação 43, caracterizado por que o fenótipo da planta que expressa o polinucleótido é caracterizado por uma diferença no desen- volvimento celular da planta em comparação com uma planta da mesma espécie que não contém a construção de DNA.

50. - Polpa de Madeira, caracterizada por que é obtida a partir de uma árvore transgênica que expressa um polipeptídeo que compreende uma seqüência de aminoácido de qualquer uma dentre SEQ ID NOs. 1-230.

51. - Planta Transgênica, caracterizada por que expressa um polipep- tídeo que compreende uma seqüência de aminoácido de qualquer uma dentre SEQ ID NOs: 1-230, em que o referido aminoácido confere uma característica à planta selecionada do grupo que consiste na tolerância aumentada à seca, altura reduzida ou aumentada, volume reduzido ou aumentado, ramificação reduzida ou aumentada, tolerância intensifica- da ao frio e à geada, vigor melhorado, cor realçada, saúde e característi- cas nutricionais intensificadas, armazenamento melhorado, rendimento realçado, tolerância intensificada ao sal, tolerância intensificada a metal pesado, tolerância aumentada a doença, tolerância aumentada a insetos, tolerância aumentada ao estresse de água, doçura intensifica- da, gosto melhorado, textura melhorada, conteúdo de fosfato diminuído, germinação aumentada, captura de micronutriente intensificada, composição de amido melhorada, longevidade da flor melhorada e produção de proteínas ou peptídeos inovativos.

52. - Planta Transgênica, caracterizada por que expressa um polipep- tídeo que compreende a seqüência de aminoácido de qualquer uma dentre SEQ ID NOs: 1-230, em que disse que planta tem um reduzido ou aumentou período de juventude em comparação com uma planta do tipo selvagem da mesma espécie.

53. - Planta Transgênica, caracterizada por que expressa um polipep- tídeo que compreende a seqüência de aminoácido de qualquer uma dentre SEQ ID NOs: 1-230, em que a referida planta tem galhos de auto- abcissão.

54. - Seqüência Isolada de Nucleótidos, caracterizada por que tem a seqüência de nucleótidos de qualquer uma de SEQ ID NO: 1-230 e seqüências de nucleótidos tendo 60% identidade de seqüência com a seqüência de nucleótidos de SEQ ID NO: de 1-230 e que são capazes de regular o desenvolvimento da parede celular da planta.

55. - Seqüência Isolada de Nucleótidos, caracterizada por que tem a seqüência de nucleótidos de qualquer uma de SEQ ID NO: 1-230 e seqüências de nucleótidos tendo 65% identidade de seqüência com qualquer das seqüência de nucleótidos de SEQ ID NO: 1-230 e que são envolvidas no desenvolvimento da madeira.

56. - Seqüência Isolada de Nucleótidos, caracterizada por que tem a seqüência de nucleótidos de qualquer uma de SEQ ID NO: 1-230 e seqüências de nucleótidos tendo 70% identidade de seqüência com qualquer das seqüências de nucleótidos de SEQ ID NO: 1-230 e que regulam a biogênese da parede celular.

57. - Método de Correlação da Expressão de Polinucleótido em Duas Amostras Diferentes, caracterizado por que compreende: detectar um nível de expressão de um ou mais polinucleóti- dos que codificam produto codificado por uma seqüência de ácido nucléico selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 1-230 e variantes conservadoras das mesmas numa primeira amostra; detectar um nível de expressão de um ou mais polinucleóti- dos numa segunda amostra; comparar o nível de expressão de um ou mais polinucleóti- dos na primeira amostra com o nível de expressão de um ou mais polinucleótidos na segunda amostra; e correlacionar uma diferença no nível de expressão de um ou mais polinucleótidos entre a primeira e a segunda amostras.

58. - Método de Correlação da Expressão de Polinucleótido em Duas Amostras Diferentes, de acordo com a Reivindicação 57, caracteriza- do por que a primeira amostra e a segunda amostra são cada um de um tipo diferente de tecido da planta.

59. - Método de Correlação da Expressão de Polinucleótido em Duas Amostras Diferentes, de acordo com a Reivindicação 57, caracteriza- do por que a primeira amostra e a segunda amostra são do mesmo tecido e a primeira amostra e a segunda amostra são, cada uma, colhidas durante uma estação diferente do ano.

60. - Método de Correlação da Expressão de Polinucleótido em Duas Amostras Diferentes, de acordo com a Reivindicação 57, caracteriza- is do por que a primeira amostra e a segunda amostra são obtidas a partir de plantas em fases diferentes de desenvolvimento.

61. - Método de Correlação da Posse de um Fenótipo de Planta com o Nível de Expressão de Polinucleótido na Planta de um ou Mais Polinucleótidos, caracterizado por que compreende: detectar um nível de expressão de um ou mais polinucleóti- dos que codificam um produto codificado por uma seqüência de ácido nucléico selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 1-230 e variantes conservadoras das mesmas numa primeira planta que possui um fenótipo; detectar um nível de expressão de um ou mais polinucleóti- dos numa segunda planta a que falta o fenótipo; comparar o nível de expressão de um ou mais polinucleóti- dos na primeira planta com o nível de expressão de um ou mais polinucleótidos na segunda planta; e correlacionar uma diferença no nível de expressão de um ou mais polinucleótidos entre a primeira e a segunda plantas com a posse do fenótipo.

62. - Método de Correlação da Posse de um Fenótipo de Planta com o Nível de Expressão de Polinucleótido na Planta de um ou Mais Polinucleótidos, de acordo com a Reivindicação 57, caracterizado por que a primeira amostra e a segunda amostra são ambas obtidas a partir de um tecido de planta selecionado do grupo que consiste em tecido vascular, apical meristema, câmbio vascular, xilema, floema, raiz, flor, cone, fruta e semente.

63. - Método de Correlação da Posse de um Fenótipo de Planta com o Nível de Expressão de Polinucleótido na Planta de um ou Mais Polinucleótidos, de acordo com a Reivindicação 62, caracterizado por que os tecidos de planta da primeira amostra e da segunda amostra são, cada um, obtidos a partir de um tipo diferente de tecido.

64. - Método de Correlação da Posse de um Fenótipo de Planta com o Nível de Expressão de Polinucleótido na Planta de um ou Mais Polinucleótidos, de acordo com a Reivindicação 62, caracterizado por que a primeira amostra e a segunda amostra são, cada uma, obtidas a partir de um tecido de planta numa fase diferente de desenvolvimento.

65. - Método de Correlação da Posse de um Fenótipo de Planta com o Nível de Expressão de Polinucleótido na Planta de um ou Mais Polinucleótidos, de acordo com a Reivindicação 61 ou 62, caracteri- zado por que tanto a primeira planta como a segunda planta ou células de planta são de uma mesma espécie selecionada a partir das espécies de Eucayptus e Pinus.

66. - Método de Correlação da Posse de um Fenótipo de Planta com o Nível de Expressão de Polinucleótido na Planta de um ou Mais Polinucleótidos, de acordo com a Reivindicação 61 ou 62, caracteri- zado por que a primeira e a segunda plantas ou células de planta são - de uma espécie selecionada a partir de Bucayptus grandis ou Pinus radiata.

67. - Método de Correlação da Posse de um Fenótipo de Planta com o Nível de Expressão de Polinucleótido na Planta de um ou Mais Polinucleótidos, de acordo com a Reivindicação 57, 61 ou 62, caracte- rizado por que a etapa de detecção é efetuada usando um ou mais polinucleótidos capazes de hibridizar para uma seqüência de ácido nucléico selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 1-230 sob condições de hibridação normais.

68. - Método de Correlação da Posse de um Fenótipo de Planta com o Nivel de Expressão de Polinucleótido na Planta de um ou Mais Polinucleótidos, de acordo com a Reivindicação 57, 61 ou 62, caracte- rizado por que a etapa de detecção é efetuada usando um ou mais polinucleótidos capazes de hibridizar para um produto de expressão de polinucleótido codificado por uma seqüência de ácido nucléico selecio- nada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 1-230 sob condições de hibridação normais.

69. - Método de Correlação da Posse de um Fenótipo de Planta com o Nível de Expressão de Polinucleótido na Planta de um ou Mais Polinucleótidos, de acordo com a Reivindicação 57, 61 ou 62, caracte- rizado por que a etapa de detecção é afetada por hibridação para um ácido nucléico marcado.

70. - Método de Correlação da Posse de um Fenótipo de Planta com o Nível de Expressão de Polinucleótido na Planta de um ou Mais Polinucleótidos, de acordo com a Reivindicação 66, caracterizado por que o ou mais polinucleótidos são marcados com uma etiqueta detectá- vel.

71. - Método de Correlação da Posse de um Fenótipo de Planta com o Nível de Expressão de Polinucleótido na Planta de um ou Mais Polinucleótidos, de acordo com a Reivindicação 67, caracterizado por que pelo menos um do ou mais polinucleótidos hibridizam para uma região 3' não transladada de um dentre um ou mais polinucleótidos.

72. - Método de Correlação da Posse de um Fenótipo de Planta com o Nível de Expressão de Polinucleótido na Planta de um ou Mais Polinucleótidos, de acordo com a Reivindicação 68, caracterizado por que pelo menos um ou mais polinucleótidos hibridizam para a região 3' não transladada de um dentre um ou mais polinucleótidos.

73. - Método de Correlação da Posse de um Fenótipo de Planta com o Nível de Expressão de Polinucleótido na Planta de um ou Mais Polinucleótidos, de acordo com a Reivindicação 67, caracterizado por que um ou mais polinucleótidos compreendem uma seqüência de ácido nucléico selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 1-230.

74. - Método de Correlação da Posse de um Fenótipo de Planta com o Nível de Expressão de Polinucleótido na Planta de um ou Mais Polinucleótidos, de acordo com a Reivindicação 68, caracterizado por que um ou mais polinucleótidos compreendem uma seqüência de ácido nucléico selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 1-230.

75. - Método de Correlação da Posse de um Fenótipo de Planta com o Nível de Expressão de Polinucleótido na Planta de um ou Mais Polinucleótidos, de acordo com a Reivindicação 67, caracterizado por que um ou mais polinucleótidos é selecionado do grupo que consiste em DNA e RNA.

76. - Método de Correlação da Posse de um Fenótipo de Planta com o Nível de Expressão de Polinucleótido na Planta de um ou Mais Polinucleótidos, de acordo com a Reivindicação 68, caracterizado por que um ou mais polinucleótidos é selecionado do grupo que consiste em DNA e RNA.

77. - Método de Correlação da Posse de um Fenótipo de Planta com o Nível de Expressão de Polinucleótido na Planta de um ou Mais Polinucleótidos, de acordo com a Reivindicação 57, 61 ou 62, caracte- rizado por que compreende ainda, antes das etapas de detecção, a etapa de amplificar um ou mais polinucleótidos na primeira e na segunda planta ou células da planta.

78. - Método de Correlação da Posse de um Fenótipo de Planta com o Nível de Expressão de Polinucleótido na Planta de um ou Mais Polinucleótidos, de acordo com a Reivindicação 57, 61 ou 62, caracte- rizado por que compreende ainda, antes das etapas de detecção, a etapa de marcar um ou mais polinucleótidos na primeira e na segunda planta ou células de planta com uma etiqueta detectável.

79. - Combinação Para Detectar a Expressão de um ou Mais Polinu- cleótidos, compreendendo dois ou mais oligonucleotídeos, caracteri- zada por que cada oligonucleotídeo é capaz de hibridizar para uma seqüência de ácido nucléico selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 461-690.

80. - Combinação Para Detectar a Expressão de um ou Mais Polinu- cleótidos, compreendendo dois ou mais oligonucleotídeos, caracteri- zada por que cada oligonucleotídeo é capaz de hibridizar para um produto de expressão de polinucleótido codificado por uma seqüência de ácido nucléico selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs:l-230.

81. - Combinação Para Detectar a Expressão de um ou Mais Polinu- cleótidos, compreendendo dois ou mais oligonucleotídeos, de acordo com a Reivindicação 79, caracterizada por que cada um dentre os dois ou mais oligonucleotídeos hibridiza para uma diferente da seqüência de ácido nucléico selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs:l-230.

82. - Combinação Para Detectar a Expressão de um ou Mais Polinu- cleôtidos, compreendendo dois ou mais oligonucleotídeos, de acordo com a Reivindicação 80, caracterizada por que cada um dentre os dois ou mais oligonucleotídeos hibridiza para uma seqüência de nucleótidos codificada por uma diferente da seqüência de ácido nucléico seleciona- da a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 1-230.

83. - Combinação Para Detectar a Expressão de um ou Mais Polinu- cleótidos, compreendendo dois ou mais oligonucleotídeos, de acordo com a Reivindicação 79, caracterizada por que pelo menos um dos dois ou mais oligonucleotídeos hibridiza para uma região 3' não transladada de uma seqüência de ácido nucléico selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 1-230.

84. - Combinação Para Detectar a Expressão de um ou Mais Polinu- cleótidos, compreendendo dois ou mais oligonucleotídeos, de acordo com a Reivindicação 80, caracterizada por que pelo menos um dos dois ou mais oligonucleotídeos hibridiza para uma seqüência de ácido nucléico que é complementar a uma região 3' não translada de uma seqüência de ácido nucléico selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 1-230.

85. - Combinação Para Detectar a Expressão de um ou Mais Polinu- cleótidos, compreendendo dois ou mais oligonucleotídeos, de acordo com a Reivindicação 79 ou 80, caracterizada por que cada um dos dois ou mais oligonucleotídeos é compreendido de menos do que cerca de -100 bases de nucleotídeos.

86. - Combinação Para Detectar a Expressão de um ou Mais Polinu- cleótidos, compreendendo dois ou mais oligonucleotídeos, de acordo com a Reivindicação 79, caracterizada por que pelo menos um dos dois ou mais oligonucleotídeos compreende uma seqüência de ácido nucléico selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 461-690.

87. - Combinação Para Detectar a Expressão de um ou Mais Polinu- cleótidos, compreendendo dois ou mais oligonucleotídeos, de acordo com a Reivindicação 80, caracterizada por que pelo menos um dos dois ou mais oligonucleotídeos compreende uma seqüência de ácido nucléico selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 461-690.

88. - Combinação Para Detectar a Expressão de um ou Mais Polinu- cleótidos, compreendendo dois ou mais oligonucleotídeos, de acordo com a Reivindicação 79, caracterizada por que cada um dos dois ou mais oligonucleotídeos hibridiza para um gene que codifica uma proteína selecionada do grupo que consiste em Oí-amilase, Arabinogalac- tan, Calnexina, Calreticulina, Sintase da celulose, Dirigente, Expansina, Extensina, Galacturanl,4^-galacturonidase, Glicose-I-fosfato adenil- transferase, Glicosil transferase, Glicosil hidrolase, Glicosido hidrolase, Proteínas ricas em Hidroxiprolina, Manose-6-Fosfato Isomerase, Mano- se-1 -Fosfato Guaniniltransferase, Nucleotidil transferase, Pectinas, Pectina Metilesterase, Fosfomanomutase, proteína de resposta de resistência a doença de planta, Poligalacturonase, Pólen de alergêneo/ expansina, Amido Enzima de Ramificação de Ramificação de Amido, Sintase deo Amido, Sucrose-Fosfato Sintase, Sintase de Sacarose, UTP- glicose-1-fosfato uridililransferase, Sintase do Xiloglucan, Xiloglucan transferase: Xiloglucosil e Yieldinaa.

89. - Combinação Para Detectar a Expressão de um ou Mais Polinu- cleótidos, compreendendo dois ou mais oligonucleotídeos, de acordo com a Reivindicação 80, caracterizada por cada um dos dois ou mais oligonucleotídeos hibridiza para uma seqüência de ácido nucléico codificada por um gene que codifica uma proteína selecionada do grupo que consiste em Oí-amilase, Arabinogalactan, Calnexina, Calreticulina, Sintase da celulose, Dirigente, Expansina, Extensina, Galacturan 1,4-β- galacturonidase, Glicose-I-fosfato adeniltransferase, Glicosil transfera- se, Glicosil hidrolase, Glicosido hidrolase, Proteínas de Hidroxiprolina rico, Manose-6-Fosfato Isomerase, Manose-I-Fsfato Guaniniitransfera- se, Nucleotidil transferase, Pectinaas, Peetina Metilesterase, Fosfoma- " . nomutase, proteína de resposta de resistência a doença de planta, Poligalacturonase, Pólen alergêneo/expansina, Enzima de Ramificação de Amido, Sintase de Amido, Sucrose-Fosfato Sintase, Sacarose Sintase, UTP-glucose-1-fosfato uridililtransferase, Xiloglucan Sintase, Xiloglu- can: Xiloglucosil transferase e Yieldinaa.

90. - Combinação Para Detectar a Expressão de um ou Mais Polinu- cleótidos, compreendendo dois ou mais oligonucleotídeos, acordo com a Reivindicação 88, caracterizada por que cada um dos dois ou mais oligonucleotídeos hibridiza para um gene que codifica uma diferente das proteínas.

91. - Combinação Para Detectar a Expressão de um ou Mais Polinu- cleótidos, compreendendo dois ou mais oligonucleotídeos, acordo com a Reivindicação 89, caracterizada por que cada um dos dois ou mais oligonucleotídeos hibridiza para uma seqüência de ácido nucléico codificado por um gene que codifica uma diferente das proteínas.

92. - Combinação Para Detectar a Expressão de um ou Mais Polinu- cleótidos, compreendendo dois ou mais oligonucleotídeos, acordo com a Reivindicação 88, caracterizada por que cada um dos dois ou mais oligonucleotídeos hibridiza para um gene diferente.

93. - Combinação Para Detectar a Expressão de um ou Mais Polinu- cleótidos, compreendendo dois ou mais oligonucleotídeos, acordo com a Reivindicação 89, caracterizada por que cada um dos dois ou mais oligonucleotídeos hibridiza para uma seqüência de ácido nucléico codificada por um gene diferente.

94. - Combinação Para Detectar a Expressão de um ou Mais Polinu- cleótidos, compreendendo dois ou mais oligonucleotídeos, de acordo com a Reivindicação 79 ou 80, caracterizada por que compreende desde cerca de 2 até mais ou menos 5.000 dos dois ou mais oligonucle- otídeos.

95. - Combinação Para Detectar a Expressão de um ou Mais Polinu- cleótidos, compreendendo dois ou mais oligonucleotídeos, de acordo com a Reivindicação 79 ou 80, caracterizada por que cada um dos dois ou mais oligonucleotídeos é marcado com uma etiqueta detectável.

96. - Microarranjoi caracterizado por que compreende a combinação da Reivindicação 79, proporcionada sobre um suporte sólido, em que cada um dos referidos dois ou mais oligonucleotídeos ocupa um local único no citado suporte sólido.

97. - Método de Detecção de um ou Mais Polinucleótidos Numa Amostra, caracterizado por que compreende: contatar a amostra com dois ou mais oligonucleotídeos, em que cada oligonucleotídeo é capaz de hibridizar para um gene que compreende uma seqüência de ácido nucléico selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 1-230 sob condições de hibridação normal; e detectar um ou mais polinucleótidos de interesse que são hibridizados para um ou mais oligonucleotídeos.

98. - Método de Detecção de uma ou Mais Seqüências de Ácido Nucléico Codificadas por um ou Mais Polinucleótidos numa Amos- tra, caracterizado por que compreende: contatar a amostra com dois ou mais oligonucleotídeos, em que cada oligonucleotídeo é capaz de hibridizar para uma seqüência de ácido nucléico codificada por um gene que compreende uma seqüência de ácido nucléico selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID N0s:l~ 230 sob condições de hibridação normal; e detectar uma ou mais seqüências de ácido nucléico que são hibridizadas para um ou mais oligonucleotídeos.

99. - Método de Detecção de uma ou Mais Seqüências de Ácido Nucléico Codificadas por um ou Mais Polinucleótidos numa Amos- tra, de acordo com a Reivindicação 97, caracterizado por que cada um dos dois ou mais oligonucleotídeos hibridiza para um gene que compre- ende uma diferente da seqüência de ácido nucléico selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 1-230.

100. - Método de Detecção de uma ou Mais Seqüências de Ácido Nucléico Codificadas por um ou Mais Polinucleótidos numa Amos- tra, de acordo com a Reivindicação 98, caracterizado por que cada um dos dois ou mais oligonucleotídeos hibridiza para uma seqüência de ácido nucléico codificada por um gene que compreende uma diferente da seqüência de ácido nucléico selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 1-230.

101. - Método de Detecção de uma ou Mais Seqüências de Ácido Nucléico Codificadas por um ou Mais Polinucleótidos numa Amos- tra, de acordo com a Reivindicação 97, caracterizado por que pelo menos um ou mais dos dois oligonucleotídeos hibridiza para uma região 3' não transladada de um gene que compreende uma seqüência de ácido nucléico selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs 1-230.

102. - Método de Detecção de uma ou Mais Seqüências de Ácido Nucléico Codificadas por um ou Mais Polinucleótidos numa Amos- tra, de acordo com a Reivindicação 98, caracterizado por que pelo menos um ou mais dos dois oligonucleotídeos hibridiza para uma seqüência de ácido nucléico que é complementar para uma região 3' não transladada de um gene que compreende uma seqüência de ácido nucléico selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 1-230.

103. - Método de Detecção de uma ou Mais Seqüências de Ácido Nucléico Codificadas por um ou Mais Polinucleótidos numa Amos- tra, de acordo com a Reivindicação 97 ou 98, caracterizado por que cada um dos dois ou mais oligonucleotídeos é compreendido de menos do que cerca de 100 bases de nucleotídeos.

104. - Método de Detecção de uma ou Mais Seqüências de Ácido Nucléico Codificadas por um ou Mais Polinucleótidos numa Amos- tra, de acordo com a Reivindicação 97, caracterizado por que pelo menos um dos dois ou mais oligonucleotídeos compreende uma seqüência de ácido nucléico selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs 461-690.

105. - Método de Detecção de uma ou Mais Seqüências de Ácido Nucléico Codificadas por um ou Mais Polinucleótidos numa Amos- tra, de acordo com a Reivindicação 98, caracterizado por que pelo menos um dos dois ou mais oligonucleotídeos compreende uma seqüência de ácido nucléico selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 461-690.

106. - Método de Detecção de uma ou Mais Seqüências de Ácido Nucléico Codificadas por um ou Mais Polinucleôtidos numa Amos- tra, de acordo com a Reivindicação 97, caracterizado por que cada um dos dois ou mais oligonucleotídeos hibridiza para um gene que codifica uma proteína selecionada do grupo que consiste em oí-amilase, Arabi- nogalactan, Calnexina, Calreticulina, Sintase da celulose, Dirigente, Expansinaj Extensina, Galacturan 1,4-B-galacturonidase, Glicose-I- fosfato adeniltransferase, Glicosil transferase, Glicosil hidrolase, Glico- sido hidrolase, Proteínas ricas em Hidroxiprolina, Manose-6-Fosfato Isomerase, Manose-I-Fosfato Guaniniltransferase, Nucleotidil transfe- rase, Pectinaas, Pectina Metilesterase, Fosfomanomutase, proteína de resposta de resistência a doença de planta, Poligalacturonase, Pólen alergêneo/expansina, Enzima de Ramificação de Amido, Sintase de Amido, Sucrose-Fosfato Sintase, Sacarose Sintase, UTP-glucose-l-fosfa- to uridililtransferase, Xiloglucan Sintase, Xiloglucan: Xiloglucosil trans- ferase e Yieldina.

107. - Método de Detecção de uma ou Mais Seqüências de Ácido Nucléico Codificadas por um ou Mais Polinucleôtidos numa Amos- tra, de acordo com a Reivindicação 98, caracterizado por que cada um dos dois ou mais oligonucleotídeos hibridiza para uma seqüência de ácido nucléico codificada por um gene que codifica uma proteína selecionada do grupo que consiste em ot-amilase, Arabinogalactan, Calnexina, Calreticulina, Sintase da celulose, Dirigente, Expansina, Extensina, Galacturan 1,4-B-galacturonidase, Glicose-I-fosfato adenil- transferase, Glicosil transferase, Glicosil hidrolase, Glicosido hidrolase, Proteínas ricas em Hidroxiprolina, Manose-6-Fosfato Isomerase, Manose-I-Fosfato Guaniniltransferase, Nucleotidil transferase, Pectina- as, Pectina Metilesterase, Fosfomanomutase, proteína de resposta de resistência a doença de planta, Poligalacturonase, Pólen alergêneo/ expansina, Enzima de Ramificação de Amido, Sintase de Amido, Sucrose-Fosfato Sintase, Sacarose Sintase, UTP-glucose-1 -fosfato uridililtransferase, Xiloglucan Sintase, Xiloglucan: Xiloglucosil transfe- rase e Yieldina.

108. - Método de Detecção de uma ou Mais Seqüências de Ácido Nucléico Codificadas por um ou Mais Polinucleótidos numa Amos- tra, de acordo com a Reivindicação 106, caracterizado por que cada um dos dois ou mais oligonucleotídeos hibridiza para um gene que codifica uma diferente das proteínas.

109. - Método de Detecção de uma ou Mais Seqüências de Ácido Nucléico Codificadas por um ou Mais Polinucleótidos numa Amos- tra, de acordo com a Reivindicação 107, caracterizado por que cada um dos dois ou mais oligonucleotídeos hibridiza para uma seqüência de ácido nucléico codificada por um gene que codifica uma diferente das proteínas.

110. - Método de Detecção de uma ou Mais Seqüências de Ácido Nucléico Codificadas por um ou Mais Polinucleótidos numa Amos- tra, de acordo com a Reivindicação 97 ou 98, caracterizado por que os dois ou mais oligonucleotídeos são proporcionados sobre um suporte sólido, em que cada um dos dois ou mais oligonucleotídeos ocupa um local único no suporte sólido.

111. - Método de Detecção de uma ou Mais Seqüências de Ácido Nucléico Codificadas por um ou Mais Polinucleótidos numa Amos- tra, de acordo com a Reivindicação 110, caracterizado por que o suporte sólido compreende desde cerca de 2 até mais ou menos 5.000 dos dois ou mais oligonucleotídeos.

112. - Método de Detecção de uma ou Mais Seqüências de Ácido Nucléico Codificadas por um ou Mais Polinucleótidos numa Amos- tra, de acordo com a Reivindicação 97 ou 98, caracterizado por que compreende ainda, antes da etapa de contato, a etapa de amplificar um ou mais polinucleótidos ou seqüências de ácido nucléico na amostra.

113. - Método de Detecção de uma ou Mais Seqüências de Ácido Nucléico Codificadas por um ou Mais Polinucleótidos numa Amos- tra, de acordo com a Reivindicação 97 ou 98, caracterizado por que compreende ainda, antes da etapa de contato, a etapa de marcar um ou mais polinucleótidos ou seqüências de ácido nucléico na amostra com uma etiqueta detectável.

114. - Kit Para Detectar a Expressão de Gene, caracterizado por que compreende o microarranjo de Reivindicação 96 em conjunto com um ou mais tampões ou reativos para uma reação de hibridação de nucleo- tídeos.

115. - Método de Produção de Planta Transgênica, de acordo com a Reivindicação 43, caracterizado por que o fenótipo da planta que expressa o polinucleótido é caracterizado por uma diferença em síntese de amido em comparação com uma planta da mesma espécie que não contém a construção de DNA.

116. - Polinucleótido Isolado, de acordo com a Reivindicação 21, caracterizado por que o fenótipo da planta que expressa o polinucleótido isolado compreende uma diferença em altura, volume ou rendimento em comparação com uma planta da mesma espécie que não expressa o polinucleótido isolado.

117. - Método de Produção de Planta Transgênica, de acordo com a Reivindicação 43, caracterizado por que o fenótipo da planta que expressa o polinucleótido e o ácido nucléico pretendido é caracterizado por uma diferença em altura, volume ou rendimento, em comparação com uma planta da mesma espécie que não contém a construção de DNA.