BRPI0617818A2

BRPI0617818A2 - suporte polimérico biodegradável com material de ecm

Info

Publication number: BRPI0617818A2
Application number: BRPI0617818-9A
Authority: BR
Inventors: Peter Sylvest Nielsen; Brian Nielsen; Lene Karin Jespersen; Hanne Everland; Lene Feldskov Nielsen
Original assignee: Coloplast As
Priority date: 2005-10-27
Filing date: 2006-10-26
Publication date: 2011-08-09
Also published as: CA2625467A1; JP2009513207A; WO2007048831A3; WO2007048831A2; AU2006307897A1; US8053559B2; EP1942957B1; US20090280154A1; EP1942957A2

Abstract

<B>SUPORTE POLIMéRICO BIODEGRADáVEL COM MATERIAL DE ECM<D>A presente invenção refere-se a adicioção de regiões descontinuas de Matriz Extra Celular (ECM) a um suporte polimérico biodegradável.Desse modo é possível combinar a faixa de propriedades físicas que o suporte polimérico pode oferecer com as propriedades de reconstrução da ECM. é descrita a quantidade ótima de material de ECM Isolado para cadaaplicação e esta concentração é igualmente distribuída no curantivo evitando, portanto, altas concentrações desnecessárias de ECM. Além do efeito da ECM, a estrutura porosa do material base fornece às células uma estrutura de crescimento interno.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "SUPORTEPOLIMÉRICO BIODEGRADÁVEL COM MATERIAL DE ECM".

Campo da Invenção

A presente invenção refere-se a um suporte polimérico quecompreende uma camada biodegradável que tem material ECM na forma deflocos, fibras, partículas, pó ou similares incorporado à camada biodegradá-vel.

Antecedentes

Suportes poliméricos são estruturas usadas para direcionar aorganização, o crescimento e a diferenciação de células no processo deformação de um novo tecido funcional.

Para se conseguir o objetivo de reconstrução de tecidos, os su-portes poliméricos devem satisfazer alguns requisitos específicos. São ne-cessários uma alta porosidade e um tamanho de poro adequado para facili-tar o crescimento da célula e a difusão na estrutura inteira tanto de célulascomo de nutrientes. A biodegradabilidade é essencial, pois os suportes poli-méricoss precisam ser absorvidos pelos tecidos circundantes sem a neces-sidade de remoção cirúrgica.

Foram investigados muitos materiais diferentes (naturais e sinté-ticos, biodegradáveis e permanentes) para uso como suportes poliméricos. Amaioria destes materiais é conhecida no campo da medicina antes do ad-vento da engenharia dos tecidos como um tópico de pesquisa, tendo sido jáempregados como suturas bioabsorvíveis. Exemplos destes materiais sãocolágeno ou alguns poliésteres alifáticos lineares.

No entanto, quando se testam suportes poliméricos obtidas emlaboratório in vivo, freqüentemente é observado, que as células nao crescemfacilmente nestes suportes poliméricos, talvez devido ao fato de que não sãoencontradas moléculas de sinal biológico, por exemplo, fatores de cresci-mento, em suportes poliméricos obtidos sinteticamente.

Para se melhorar as propriedades biológicas dos suportes poli-méricos e para acelerar a cicatrização da ferida, diversos laboratórios adi-cionaram fatores de crescimento a um suporte polimérico sintético e obser-varam efeitos benéficos em relação à cicatrização da ferida. Em todas estaspublicações foi incorporado um único fator de crescimento em uma folha ouhidrogel. Os fatores de crescimento examinados foram FGF-2 (1; 2), β-FGF-2 testado em uma concentração de 25 μ9/ατι2 (2), FGF-1 (3; 4), EGF (5)(14),ou TGF-β (6; 7) em uma concentração de 2 μς/σηι2. Matrizes acelulares ex-tracelulares (ECM) para vertebras de sangue quente são usadas extensiva-mente em engenharia de tecido e em cirurgia plástica (8). Foi demonstradoque ECM acelular contém diversos fatores de crescimento (9-11). As ECMscontêm um lote de moléculas biológicas e foi demonstrado que as célulasfacilmente povoam estas folhas com ECMs concentradas (12; 13). As ECMsno mercado atualmente são de origem humana ou porcina. As células sãoremovidas do tecido e o tecido é subseqüentemente Iiofilizado e cortado emfolhas. As folhas de origem porcina vêm em diferentes tamanhos. O preçodestas folhas é muito alto. As folhas estão regularmente duras quando nãohidratadas. Um exemplo é o das folhas da companhia Acélula. Eles vendemfolhas de ECM (Matriz de Bexiga Urinária, UBM) que aceleram a cicatrizaçãoda ferida. Tal folha (7x5 cm) pesa em torno de 100 mg e tem uma densida-de em torno de 190 mg/cm3.

O uso de ECMs ou de proteínas de ECM no tratamento de feri-das é conhecido. Estes produtos estão na forma de folhas ou de hidrogéis.Exemplos de produtos de folha são OASIS da Healthpoint (folha de ECMporcina liofilizada) e Graftjacket da Wright medicai (folha de ECM humanaliofilizada). As folhas fornecem tanto um suporte polimérico como uma mistu-ra complexa de proteínas às células da ferida. Exemplos de produtos semserem suportes poliméricos que contenham proteínas ECM no mercado, éXelma da Mõlnlycke, que é um hidrogel que contém um extrato de proteínada ECM de dentes de porcos em desenvolvimento.

Sumário

O presente pedido de patente descreve que os efeitos promoto-res do crescimento de ECM são mantidos se o ECM for incorporado a umsuporte polimérico. Demonstra-se que quando se usam suportes poliméricoscontendo material ECM, mais altas concentrações de ECM surpreendente-mente não fornecem melhor morfologia da célula. As concentrações meno-res do que 60% são suficientes para se obter a melhor morfologia e distribui-ção da célula. Além disso, é demonstrado que pela variação da concentra-ção de material de ECM distinto em suportes poliméricos, as característicasfísicas do suporte polimérico variam, porém, as variações são dependentesdo material do suporte polimérico. O presente pedido de patente fornece es-te conhecimento para o paciente demonstrando uma estratégia de esteriliza-ção que mantém a atividade biológica do Material ECM depois da esteriliza-ção.

Descrição Detalhada

A presente invenção refere-se a um suporte polimérico compósi-to temporário que compreende partículas de ECM separadas.

Pela adição de regiões descontínuas de ECM a um suporte po-limérico é possível combinar a faixa de propriedades físicas (por exemplo,resistência, maciez, flexibilidade, durabilidade) que o suporte polimérico po-de oferecer com as propriedades de reconstrução da ECM. Além disso, opreço de tal suporte polimérico será mais baixo do que os outros suportespoliméricos de ECM tanto porque o pó é um produto de rejeito da produçãode folhas de ECM acelulares como porque a quantidade ótima de MaterialECM distinto para cada aplicação pode ser determinada e igualmente distri-buída no tratamento, portanto evitando altas concentrações desnecessáriasde ECM. Além do efeito do ECM, a estrutura porosa do material base forne-ce às células uma estrutura para crescimento interno. Em uma modalidade éobtida uma região descontínua de ECM por adição de Material de ECM dis-tinto, tais como partículas, flocos, fibras ou pó.

Uma fase distinta de Material ECM significa material de ECMque esteja distinguido em sua forma e densidade do material de base queesteja incrustrado no mesmo. Isto pode ser demonstrado por seções de his-tologia como observado no exemplo 5 ou por microscópio eletrônico de var-redura (SEM) observado no exemplo 6. Pela adição de regiões descontínuasde ECM, pode-se controlar a concentração de ECM. Como apresentado nosexemplos (por exemplo, exemplos 2 e 3), é importante que a concentraçãoseja controlada para otimizar o crescimento da célula.

É preferível, que o Material ECM seja adicionado ao suporte po-limérico antes da formação do suporte polimérico (por exemplo, secagempor congelamento). Desta maneira, o Material ECM é distribuído homogene-amente no suporte polimérico. Isto é, no tempo que é preciso para solidificaro suporte polimérico (por exemplo, durante o congelamento) a densidade doMaterial ECM podia ser um pouco maior em uma extremidade do suportepolimérico do que na outra. No entanto, no presente contexto uma distribui-ção homogênea é responsável por tal gradiente de densidade através dosuporte polimérico contanto que a densidade no centro do suporte poliméricoseja > 0. Desse modo, uma modalidade preferida refere-se a um suportepolimérico temporário, contínuo, que compreenda regiões de ECM descontí-nuas homogeneamente distribuídas em que a concentração de regiões des-contínuas de ECM esteja entre 20% (peso/peso) e 60% (peso/peso).

No presente contexto, um suporte polimérico temporária significaum suporte polimérico que desaparece; é hidrolisado, é rompido, é biode-gradado/biorreabsorvível/bioabsorvível, é dissolvido ou de outras maneirasdesaparece do local da ferida. Esta é uma imensa vantagem clínica, poisnão há nada a remover da ferida. Desse modo, o tecido recém-formado nãoé perturbado nem pressionado por remoção do suporte polimérico temporá-rio. É tipicamente preferível que o suporte polimérico seja rompido durante 1dia a 10 semanas - dependendo da aplicação. Para aplicações em feridaaberta, é preferível que o suporte polimérico seja rompido durante 1-10 dias,tal como 2-7 dias. Em um aspecto da invenção, o suporte polimérico é bio-degradável.

Em uma modalidade o suporte polimérico é um suporte poliméri-co contínua. Isto é, um suporte polimérico de uma fase continua. Um suportepolimérico contínuo com regiões descontínuas resulta em um material com-pósito.

Como com outros materiais compósitos, este é um material pro-jetado constituído de dois ou mais materiais constituintes com propriedadesfísicas ou químicas significativamente diferentes e que permanece separadoe distinto dentro da estrutura acabada.

A matriz extracelular (ECM) é a parte não celular de tecidos deanimal ou de um ser humano. A ECM é, portanto, o material complexo quecircunda as células. Conseqüentemente, é preferível que as regiões descon-tínuas de ECM sejam regiões isentas de célula. As regiões isentas de célulasão obtidas pelo uso de métodos físicos, enzimáticos e/ou químicos. As ca-madas de células podem ser removidas fisicamente, por exemplo, por ras-pagem do tecido. Podem ser usados detergentes e enzimas para destacaras células umas das outras no tecido. Também podem ser usadas água ououtras soluções hipotônicas, pois a hipotonicidade irá provocar o rompimentodas células e conseqüentemente, facilitar o processo de descelularização.

Uma outra maneira de se obter regiões isentas de célula é pelaadição da ECM em pó (regiões descontínuas de ECM) à matriz do suportepolimérico. Um produto isento de célula minimiza o risco de alguma rejeiçãoimunológica uma vez implantada, pois os componentes das células podemprovocar uma resposta imunogênica.

Em termos amplos há três componentes principais nas ECMs:elementos fibrosos (particularmente colágeno, elastina ou reticulina), proteí-nas de ligação (por exemplo, fibronectina, laminina) e moléculas para preen-chimento de espaço (habitualmente glicosaminoglicanos). Sabe-se que asECMs atraem células e promovem a proliferação celular servindo como umreservatório de fatores de crescimento e de citoquinas (9; 10). Um suportepolimérico temporário que contém ECMs particuladas usadas em uma feridaserá povoado por células tanto das bordas da ferida como por células dosangue que está circulando. Quando as células invadirem o suporte polimé-rico, o material do suporte polimérico será degradado e eventualmente o su-porte polimérico será substituído pelo novo tecido.

A concentração das regiões descontínuas de ECM é de prefe-rência mais alta do que 15% (peso/peso), isto é, mais alta do que 20% (pe-so/peso), tal como maior que 30% (peso/peso). A concentração das regiõesdescontínuas de ECM é de preferência inferior a 95% (peso/peso), isto é,inferior a 90% (peso/peso), tal como inferior a 80% (peso/peso) ou inferior a70% (peso/peso). Em uma modalidade particular preferida da invenção aconcentração está entre 20% (peso/peso) e 60% (peso/peso), tal como entre20% (peso/peso) e 40% (peso/peso).

A pele de seres humanos compreende uma camada superior deepiderme, formada, entre outros, por queratinócitos. Abaixo da epidermeencontra-se a derme, formada, entre outros, por fibroblastos, porém tambémpor células endoteliais.

Quando se promove o crescimento de fibroblastos, os presentesexemplos (por exemplo, exemplo 3) demonstram que o aumento da concen-tração de ECM de 0% (peso/peso) até em torno de 60% (peso/peso) resultaem uma melhoria acentuada no número de células sobre a superfície do su-porte polimérico e na morfologia da célula. Desse modo, um aspecto da in-venção refere-se a um dispositivo para tratamento da ferida que compreende40% (peso/peso) até 60% (peso/peso) de ECM para promover o crescimentode fibroblastos.

Quando se promove o crescimento de queratinócitos, os presen-tes exemplos que usam suportes poliméricos de gelatina demonstram que oaumento da concentração de ECM de 0% (peso/peso) até em torno de 25%(peso/peso) resulta em uma melhoria acentuada na capacidade das célulascrescerem juntas (como os queratinócitos fariam), na morfologia da célula eno número total de células. No entanto, o aumento da concentração de ECMacima de 40% (peso/peso) resulta em uma diminuição na promoção docrescimento da célula em termos do número de células na superfície, da suamorfologia e do número de células. Desse modo, um aspecto da invençãorefere-se a um dispositivo para tratamento da ferida que compreende 20%(peso/peso) até 30% (peso/peso) de ECM para promover o crescimento dequeratinócitos.

O curativo para a ferida da presente invenção pode compreendemúltiplas camadas. Estas camadas podiam incluir 1 ou mais camadas dematerial biodegradável, que todos opcionalmente compreendem ECM. Se oECM for incorporado a mais do que uma camada a dose pode variar atravésdas camadas. Em uma modalidade, a primeira camada compreende 40 %(peso/peso) até 60% (peso/peso) de ECM; a segunda camada 20% (pe-so/peso) até 30% (peso/peso) de ECM.

Em uma outra modalidade, o suporte polimérico é projetado paraestimulação do crescimento de diferentes tipos de célula. Isto é, para estimu-lação do crescimento de fibroblastos a concentração ótima é de 40% (pe-so/peso) - 60% (peso/peso) de ECM, a concentração ótima para células en-doteliais é de 30% (peso/peso) - 60% (peso/peso), enquanto que para a es-timulação do crescimento de queratinócitos, a concentração ótima é de des-de 20% (peso/peso) até 30% (peso/peso). Uma modalidade da invençãorefere-se a um dispositivo para tratamento da ferida que compreende doissuportes poliméricos, um primeiro suporte polimérico para a estimulação defibroblastos com uma concentração de regiões descontínuas de ECM de40% (peso/peso) - 60% (peso/peso) e um segundo suporte polimérico paraa estimulação de queratinócitos com uma concentração de regiões descon-tínuas de ECM de 20% (peso/peso) até 30% (peso/peso). Um terceiro supor-te polimérico pode ser adicionado ao dispositivo para tratamento da feridacom uma concentração de regiões descontínuas de Material ECM de 20%(peso/peso) até 30% (peso/peso).

Os presentes dados permitem o uso de um suporte poliméricoque compreende 40% (peso/peso) - 60% (peso/peso) de regiões descontí-nuas de ECM para a estimulação de crescimento de fibroblasto. Os presen-tes dados também permitem o uso de um suporte polimérico que compreen-de 20% (peso/peso) até 30% (peso/peso) de regiões descontínuas de ECMpara a estimulação de crescimento de queratinócito.

É nossa experiência, que, quando se promove o crescimento defibroblastos, os fibroblastos em crescimento irão realizar a excreção de fato-res de crescimento que induzem o crescimento de queratinócitos. Dessemodo, um aspecto preferido da invenção refere-se a um suporte poliméricoem que a concentração de regiões descontínuas de ECM está entre 40%(peso/peso) e 50% (peso/peso). Por este motivo, o crescimento do fibroblas-to é promovido de tal modo que o crescimento do queratinócito seja subse-qüentemente promovido e a ferida seja cicatrizada.A concentração de ECM na estrutura do suporte polimérico écalculada como por cento em peso/peso. Isto é: concentração (peso/peso) =Mecm/(Mecm + Msuporte polimérico) x 100%, em que Mecm é a massa em gramasde ECM e MsuPorte polimérico é a massa em gramas de (que não contém o ECM).

Em um suporte polimérico que possa ser dissolvido (por exem-plo, MPEG-PLGA) dissolve-se o suporte polimérico em solvente e filtram-seos ECMs. Depois da secagem por congelamento, o material é pesado.

Em um suporte polimérico que não pode ser dissolvido o materi- al é incrustado em um material apropriado para incrustação (por exemplo,parafina), secionado em um número estatisticamente representativo e cora-do usando-se um corante apropriado que cora somente os ECMs e não osmateriais do suporte polimérico. Usando-se a análise de imagem as quanti-dades de ECMs são calculadas em relação ao suporte polimérico.

Os Materiais ECMs preferidos contêm componentes de ECMbioativos derivados da fonte de tecido dos materiais. For exemplo, eles po-dem conter Fator de crescimento-2 de Fibroblasto (FGF básico), Fator decrescimento-beta de Transformação (TGF-beta) e fator de crescimento en-dotelial vascular (VEGF). Também é preferível que os materiais de ECM dainvenção contenham componentes bioativos adicionais incluindo, por exem-plo, um ou mais de colágenos, glicosaminoglicanos, glicoproteínas e/ou pro-teoglicanos. O ECM pode incluir a membrana de base, que é constituídaprincipalmente de colágeno do tipo IV, Iamininas e proteoglicanos. O Materi-al ECM da invenção é, de preferência, preparado partindo de tecido colhidode animais criados para a produção de carne, inclusive, porém não limitadosa, porcos, gado bovino e ovino. Outros vertebrados de sangue quente tam-bém são úteis como uma fonte de tecido, porém a maior disponibilidade detais tecidos provenientes de animais usados para a produção de carne tornapreferível tal tecido. Os porcos que são geneticamente engenheirados para ser isentos do galacatosila, alfa 1,3 galactose (epitopo de GAL) podem serusados como a fonte de tecidos para a produção do Material ECM. Em umamodalidade preferida o ECM será de origem porcina.O Material ECM pode ser obtido de qualqúer animal. Ele podiaser derivado de, porém não limitado a, tecido intestinal, bexiga, fígado, baço,estômago, nódulos linfáticos ou pele. ECM derivado de pele de cadáver hu-mano, submucosa de bexiga urinária porcina (UBS), matriz de bexiga uriná-ria porcina (UBM) ou submucosa de intestino delgado porcino (SIS) são par-ticularmente preferidos.

O tecido humano é de preferência evitado para minimizar atransferência de doenças. Desse modo, em uma modalidade preferida asregiões descontínuas de ECM são obtidas de tecidos de animais. Em virtudeda similaridade das espécies, é preferível usar ECM de mamífero do sanguequente.

Em uma modalidade preferida em particular as regiões descon-tínuas de ECM são partículas de UBM (Matriz de Bexiga Urinária). O materi-al de UBM compreende um coquetel único de proteínas do ECM das quaisalgumas foram avaliadas quantitativamente: TGF-β 293 ± 8 pg/g, b-FGF3862 ± 170 pg/g e VEGF 475 ± 22 pg/g (que é pg VEGF/g UBM). Com umadensidade média de 3 mg/cm2, a concentração está em torno de TGF-β: 0,9pg/cm2 em uma folha de ECM, b-FGF: 11,6 pg/cm2 e VEGF 1,4 pg/cm2.

Um aspecto da invenção é fornecer um suporte polimérico comdosagem constante de fatores de crescimento.

Uma propriedade do suporte polimérico usada na presente in-venção é distribuir as regiões descontínuas de ECM dentro do material baseporoso, tal que a ECM seja acessível para as células. Quando as célulasmigram através da matriz do suporte polimérico, as regiões descontínuas deECM estão expostas à atividade da protease e degradadas o que se acreditaresulte na liberação dos componentes biologicamente ativos provenientesdas regiões descontínuas de ECM (14). Desse modo, a liberação de compo-nentes biologicamente ativos pode ser mantida um pouco constante durantetodo o período de utilização, fornecendo desse modo uma dosagem umpouco constante ao leito da ferida e às células. Em uma modalidade, as re-giões descontínuas de ECM estão igualmente distribuídas dentro do suportepolimérico temporário.O ECM se apresenta em diversas formas micronizadas: por e-xemplo, como partículas, flocos, fibras ou pó. Todas estas são consideradasregiões descontínuas de ECM, isto é, Materiais ECMs isolados.

Uma forma preferida de regiões descontínuas de ECM é a departículas de ECM. Preferivelmente partículas com um diâmetro médio deaproximadamente 150 μιη. Este é determinado por um Malvern InstrumentMastersizer 200 para média pesada em volume. For exemplo, uma médiapesada em superfície de 100 μιτι, pode ter as menores partículas de 3 μιη,as maiores partículas de 750 μιη. Uma média pesada em volume seria, nes-te caso, 250 μιτι.

Pela distribuição das regiões descontínuas de ECM em um su-porte polimérico poroso, é possível otimizar as propriedades físicas (por e-xemplo, resistência, maciez, flexibilidade, durabilidade) do suporte poliméricosem um impacto importante proveniente das regiões descontínuas de ECM.

Para se obter tanto o efeito benéfico dos ECMs como as propri-edades físicas que um suporte polimérico poroso possa oferecer, o ECMparticulado pode ser incluído em um curativo para ferida tal como um supor-te polimérico e ser usado para engenharia de tecido (por exemplo, remode-lagem de engenharia de tecido mole, osso, cartilagem, Iigamentos e ten-dões) ou em aplicações dentais. Este suporte polimérico poroso devia, depreferência, ser de um material que fosse biodegradável. O suporte poliméri-co temporário pode estar ou em uma forma liofilizada, em uma forma fibrosa(tecido ou não tecido), em uma forma espumada ou como um filme. Em to-das as formas as regiões descontínuas de ECM são acessíveis às célulastanto na superfície externa como interna da estrutura porosa / fibrosa.

O material usado para o suporte polimérico pode ser qualquermaterial biodegradável, proveniente tanto de fontes sintéticas como naturais.Entre os suportes poliméricos construídos com materiais naturais, particu-larmente preferidos são aqueles à base de derivados da matriz extracelular.Exemplos de tais materiais são materiais de proteína, tal como colágeno oufibrina e materiais polissacarídicos, como quitosana ou glicosaminoglicanos(GAGs).Em uma modalidade o suporte polimérico biodegradável é cons-tituído de substâncias que contenham proteína. Isto irá permitir a degrada-ção por enzimas proteolíticas. Tais suportes poliméricos são de preferênciaconstituídos de proteínas tais como colágeno, queratina, fibrina, elastina,laminina, vimentina, vitronectina, fibronectina, fibrinogênio e derivados dosmesmos e similares ou de proteínas desnaturadas tal como gelatina.

Fabricando-se os suportes poliméricos com a utilização de mate-riais polímeros tais como gelatina, fibrina, ácido hialurônico, colágeno, quiti-na, quitosana, queratina, alginato, PLA e PLGA é possível variar as caracte-rísticas físicas (resistência, maciez, flexibilidade) através de combinações emodificações.

Em uma outra modalidade o suporte polimérico biodegradável éconstituído de substâncias que contêm carboidrato/polissacarídeo. Isto irápermitir a degradação por hidrólise e a degradação enzimática dos polissa-carídeos. Tais suportes poliméricos são de preferência constituídos de polis-sacarídeos tais como heparan sulfato, sulfato de condroitina, dermatan sulfa-to, heparina, queratan sulfato e derivados dos mesmos, alginatos, celuloseHSC e derivados de celulose (CMC), alguns alginatos, quitosana, quitina,pectina e derivados de pectina, ácido hialurônico e proteoglicanos (mucopo-lissacarídeos) e derivados dos mesmos.

Em um outro aspecto o suporte polimérico temporário é sintético.Tais suportes poliméricos são principalmente degradados por hidrólise emcombinação com digestão enzimática. Estos suportes poliméricos são depreferência obtidos partindo de materiais selecionados do grupo que consis-te em PLA (polilactídeo), PGA (poliglicolídeo), PLGA (poli (lactídeo-co-glico-lídeo)), MPEG-PLGA, PCL (policaprolactona), poli ortoésteres, polidioxano-na, polianidridos, polihidroxialcanoato e copolímeros dos materiais mencio-nados acima.

Exemplos de suportes poliméricos/géis naturais bem conhecidossão à base de colágeno (3; 6), à base de fibrina (4), à base de quitosana (1)ou à base de gelatina (2; 7).

Um material sintético usado comumente é o PLA - ácido polilác-tico. Este é um poliéster, que se degrada dentro do corpo humano para for-mar ácido láctico, uma substância química que ocorre naturalmente que éfacilmente removida do corpo. Materiais similares são ácido poliglicólico(PGA) e policaprolactona (PCL): o seu mecanismo de degradação é similaràquele de PLA1 porém eles exibem respectivamente uma taxa de degrada-ção mais rápida e mais lenta comparadas ao PLA. Tal polímero de MPEG-PLGA pode ser sintetizado como a seguir: MPEG, DL-lactídeo, glicolídeo e4% (peso/volume) de octanoato estanoso em tolueno são adicionados a umfrasco em uma "glove box" com atmosfera de nitrogênio. O frasco é fechado,aquecido e agitado até que o seu conteúdo fique transparente e homogêneoe então colocado em uma estufa a 120 - 200°C durante 1 minuto - 24 horas.A síntese também pode ser feita em uma solução em um solvente adequado(por exemplo, dioxana) para facilitar a purificação subseqüente. Então, sãoadicionados MPEG, DL-lactídeo, glicolídeo, 4% de 2-etilhexanoato estanosoe dioxana a um frasco em uma "glove box" com atmosfera de nitrogênio etratados como acima.

O polímero pode ser purificado como a seguir: o polímero é dis-solvido em um solvente adequado (por exemplo, dioxana, tetrahidrofurano,clorofórmio, acetona) e precipitado com agitação em um não solvente (porexemplo, água, metanol, etanol, 1-propanol ou 2-propanol) a uma temperatu-ra de -40°C - 40°C. O polímero é deixado sedimentar, o solvente é descar-tado e o polímero é seco em uma estufa a vácuo a 40°C - 120°C/durantetoda a noite.

Como ilustrado no texto anterior, o material base do suporte po-limérico pode ser constituído de material de origem sintética e/ou natural -inclusive de combinações dos mesmos. Portanto o suporte polimérico podecompreender combinações de proteínas, polissacarídeos e polímeros sinté-ticos.

Uma função do suporte polimérico usado na presente invenção éfornecer uma matriz que promova o crescimento da célula. Um critério parapromover o crescimento interno da célula no suporte polimérico é um supor-te polimérico que seja sólido à temperatura ambiente. Isto é, o suporte poli-mérico tem uma estrutura física fixa, uma estrutura bicòntínua. Por esta es-trutura, as células são ajudadas a migrar através do suporte polimérico eformar um novo tecido.

Um outro critério para promover o crescimento da célula é umsuporte polimérico que tenha poros abertos ou pelo menos uma porosidadeque permita a migração da célula.

A porosidade é definida como P = 1 -p (V/M) em que P é a poro-sidade do suporte polimérico, ρ a densidade do sistema polimérico usado, Mo peso e V o volume dos suportes poliméricos fabricados.

Uma modalidade da invenção refere-se a um suporte poliméricoporoso que compreende regiões descontínuas de ECM como aqui descritas.Como ilustrado nos exemplos, uma porosidade de mais do que 50% permiteo crescimento da célula. Desse modo, em uma modalidade preferida o su-porte polimérico como descrito compreende uma porosidade de mais do que50%, tal como > 80%, até mesmo mais do que 90% ou como poroso a 95%.

É preferível que o suporte polimérico porosa tenha poros abertosinterligados.

Em uma modalidade preferida da invenção, o suporte poliméricotemporário tem uma espessura entre 0,1 e 8 mm, de preferência entre 0,3 e3 mm e até mesmo mais preferivelmente entre 0,5 e 2 mm. Em uma modali-dade em particular preferida da invenção a espessura da camada biodegra-dável é de aproximadamente 1 mm. Em uma modalidade preferida da inven-ção a camada biodegradável está em contato direto com a ferida.

O suporte polimérico de acordo com a presente invenção temcomo objetivo o seu uso como curativo para feridas. Um fator para ser lem-brado em curativos para feridas é torná-lo macio e ajustável. Por macio eajustável, neste contexto, entende-se que ele não seja incômodo ou doloro-so, quando aplicado em uma ferida aberta, pois as bordas não devem ferir eincomodar ao redor de ferida sensível e o curativo deverá ser flexionado a-companhando as curvaturas da ferida. Isto também garante contato diretoentre a área da ferida e o suporte polimérico que contém o ECM.

Um exemplo de tal matriz macia e ajustável é uma quitosana,preparada em uma solução a 1 - 2% (peso/peso) e secada por congelamen-to. O resultado é uma matriz aberta que seja macia, isto é, um suporte poli-mérico com poros abertos interligados. Esta matriz também tem poros sufici-entemente abertos para permitir o crescimento e a migração da célula.

Em um conjunto de modalidades, o curativo de acordo com ainvenção é usado para feridas graves, feridas de queimaduras, feridas crôni-cas e/ou feridas cirúrgicas.

Em uma outra modalidade, o curativo de acordo com a invençãoé usado em cirurgia plástica. Em uma modalidade relacionada, o suporte polimérico que com-preende regiões descontínuas de ECM é usado para engenharia de tecido(por exemplo, remodelagem de tecido mole, osso, cartilagem, Iigamentos etendões) ou em aplicações dentais.

Em muitos destes usos, é um requisito que o curativo de acordocom a invenção seja esterilizado. Uma modalidade da invenção refere-se aum suporte polimérico contínuo, esterilizado, temporário que compreenderegiões descontínuas de ECM. Este é tipicamente expresso como um supor-te polimérico contínuo, temporário que compreende regiões descontínuas deECM em embalagem hermética a bactérias, com uma marcação na embala-gem de que este produto é esterilizado. Como ilustrado no Exemplo 4, a es-terilização, por exemplo, por radiação mantém o efeito biológico de ECM -dependente do tipo de suporte polimérico. Os materiais herméticos à bacté-rias são bem-conhecidos do versado na técnica.REFERÊNCIA

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Figuras

Figura 1: medidas de LDH de suportes poliméricos de gelatinasemeados com fibroblastos humanos primários em três concentrações dife-rentes (Célula/cm2). As barras representam o crescimento no dia 3, medidocomo Abs.

Figura 2: medidas de LDH de suportes poliméricos de MPEG-PLGA semeados com fibroblastos humanos primários em três concentra-ções diferentes (Célula/cm2). As barras representam o crescimento no dia 3,medido como Abs.

Figura 3: medidas de LDH de suportes poliméricos de gelatinassemeados com queratinócitos humanos primários em três concentraçõesdiferentes (Célula/cm2). As barras representam o crescimento no dia 3, me-dido como Abs.

Figura 4: medidas de LDH de suportes poliméricos de MPEG-PLGA semeados com queratinócitos humanos primários em três concentra-ções diferentes (Célula/cm2). As barras representam o crescimento no dia 3,medido como Abs.

Figura 5: medidas de LDH de suportes poliméricos de gelatinasemeados com células endoteliais de veia umbilical humana em três concen-trações diferentes (Célula/cm2). As barras representam o crescimento no dia-3, medido como Abs.

Figura 6: medidas de LDH de suportes poliméricos de MPEG-PLGA semeados com células endoteliais de veia umbilical humana em trêsconcentrações diferentes (Célula/cm2). As barras representam o crescimentono dia 3, medido como Abs.

Figura 7: imagens digitais da distribuição de partículas de ECMno suporte polimérico de MPEG-PLGA.

Figura 8: foto SEM de suporte polimérico de MPEG-PLGA (Au-mento de 250 x).

Figura 9: foto SEM de MPEG-PLGA contendo 40% de partículasde ECM (Aumento de 250 x).

Figura 10: imagem digital de crescimento endotelial em suportepolimérico de MPEG-PLGA.

Figura 11: imagem digital de crescimento endotelial em MPEG-PLGA contendo 23% de partículas de ECM.

Figura 12: imagem digital de crescimento endotelial em MPEG-PLGA contendo 23% de partículas de ECM que apresentam um aumento demorfologia semelhante a capilar nas camadas mais profundas do suportepolimérico.

Exemplos

Exemplo 1: Crescimento interno de fibroblastos humanosprimários em suportes poiiméricos sintéticos com e sem partículas deECM

Suportes poiiméricos constituídos de poliésteres biodegradáveiscontendo partículas de UBM (AceII) (diâmetro médio de aproximadamente150 μm) a 40% (peso/peso) foram comparados com suportes poiiméricos sem as partículas de ECM em um teste de morfologia da célula e crescimen-to em 3D.

Metóxi-polietileno glicol - Poli (lactídeo-co-glicolídeo) (Mn 2.000-30.000, LG 1:1 ) foi dissolvido em 1,4-dioxana a uma solução de 1,5%. Parao suporte polimérico que contém UBM, foi adicionado 0,03 g de UBM a 3 mlde solução de polímero (40% em peso/peso de matéria seca), misturado aalta velocidade e despejado em matriz de 3 χ 3 cm. A solução foi congeladaa - 5°C e Iiofilizada a -20°C durante 5 horas e 20°C durante aproximada-mente 60 horas. As amostras foram subseqüentemente colocadas sob suc-ção (com bomba hidráulica) em um dessecador durante 5 horas.

Foram avaliados o teste do crescimento e a morfologia dos fi-broblastos primários semeados na superfícies dos dois suportes poliméricos.

Os resultados dos dias 1, 3 e 7 foram classificados de 1 - 5, com1 correspondendo ao pior caso e 5 sendo o melhor. No suporte poliméricomisturado com partículas de ECM a distribuição e o crescimento das célulasforam classificados como grau 5 em todos os dias e foram melhores do queo suporte polimérico de controle (classificados 2 Vfe em todos os dias).

Conclusão: a atividade biológica da matriz de ECM em pó man-tém a atividade depois da incorporação a um suporte polimérico sintético ecausa um crescimento consideravelmente melhor no suporte poliméricoquando comparado ao suporte polimérico apenas.

Exemplo 2: Morfologia da célula e crescimento em 3D emcompósitos de gelatina-ECM contendo 5 concentrações diferentes deECM.

Um estudo da morfologia da célula e do crescimento em 3D defibroblastos primáriois semeados sobre a superfície de suportes poliméricosde gelatina-ECM. Os suportes poliméricos de gelatina foram reticulados poraquecimento e continham concentrações crescentes de UBM (0,12% (pe-so/peso), 26% (peso/peso), 41% (peso/peso), 51% (peso/peso) e 58% (pe-so/peso)). As concentrações foram calculadas como a quantidade de UBMem relação à quantidade total de sólidos o que significa um suporte poliméri-co de 58% (peso/peso) contido em 0,05 g de polímero e 0,07 g de UBM cor-respondente a 13,8 mg de UBM/cm3.

A gelatina de origem de pele porcina, do tipo A, bloom 175 (Sig-ma) foi dissolvida em água milli-Q e t-BuOH (95:5) para uma solução a 1%.Para amostras que contenham UBM,a UBM foi adicionada à solução man-tendo-se agitação (0, 12, 26, 41, 51, 58% peso/peso: 0, 0,007, 0,018, 0,035,0,053, 0,07 g/suporte polimérico). 5 ml da solução de gelatina contendo UBMforam derramados na matriz (D = 5 cm). A matriz com a solução foi colocadaem + 5°C durante 1 hora, então congelada a -20°C e Iiofilizada a -20°C du-rante 5 horas e a 20 0C durante 36 horas. As amostras foram subseqüente-mente reticuladas em estufa a vácuo a 120 0C durante 15 horas.

Este estudo demonstrou que pelo aumento da concentração deUBM no suporte polimérico compósito os fibroblastos estavam mais bem-distribuídos e tinham uma mais alta taxa de proliferação comparada ao semUBM. Nos primeiros dois dias do estudo, foi observado que em suportes po-liméricos sem UBM1 as células estavam crescendo somente na área em queelas tinham sido aplicadas, enquanto que as células estavam melhor e maisuniformemente distribuídas sobre a superfície dos suportes poliméricos emque a concentração da UBM estava acima de 26% (peso/peso). Desde o dia14 era evidente que um menor número de células foi encontrado no suportepolimérico de gelatina sem UBM em comparação com suportes poliméricoscompósitos que contenham UBM. Em relação à morfologia da célula os fi-broblastos tinham uma morfologia arredondada, porém aderente aos supor-tes poliméricos de gelatina planos, porém com uma crescente quantidade deUBM foi observada uma morfologia fibroblástica crescente. Da UBM a 41%(peso/peso) foram observadas as melhores morfologia e distribuição dosfibroblastos. O aumento da concentração de UBM acima de 41% (pe-so/peso) não resultou em melhor morfologia ou distribuição das células nossuportes poliméricos compósitos.

Exemplo 3: Preparação e morfologia da célula e crescimentoem 3D em suportes poliméricos compósitas de MPEG-PLGA ou con-tendo gelatina a 6 diferentes concentrações de partículas de ECM.

Preparação de suportes poliméricos compósitoas de gelatina eECM: gelatina de pele porcina, tipo A, Gelita pharmagrade 832 foi dissolvidaem água milli-Q e t-BuOH (95:5) para uma solução a 1%. Para amostrascontendo UBM, a UBM foi adicionada à solução mantendo-sé agitação; 0,0,006, 0,013, 0,021, 0,033, 0,05, 0,075 g/suporte polimérico (0, 10, 20, 30,40, 50, 60 % peso/peso). 5 ml solução de gelatina contendo UBM foram des-pejados na matriz (D = 5 cm). A matriz com a solução foi colocada em + 5°Cdurante 1 hora, então congelada a -20°C e Iiofilizada a -20°C durante 5 ho-ras e a 20°C durante 18 horas. As amostras foram subseqüentemente reticu-ladas em uma estufa a vácuo a 130 °C durante 15 horas.

Preparação de suportes poliméricos compósitos de MPEG-PLGA e ECM: metóxi-polietileno glicol - Poli (lactídeo-co-glicolídeo) (Mn2.000-30.000, LG 1:1 ) foi dissolvido em 1,4-dioxana a uma solução a 1,5%.

Para amostras que contenham UBM, a UBM foi adicionada à solução man-tendo-se agitação; 0, 0,017, 0,038, 0,064, 0,1, 0,15, 0,225 g/suporte polimé-rico (0, 10, 20, 30, 40, 50, 60% peso/peso), misturada em alta velocidade e10 ml despejados em uma matriz de 7,3 χ 7,3 cm. A solução foi congelada a-5°C e Iiofilizada a -20°C durante 5 horas e 20°C durante aproximadamente-15 horas. As amostras foram subseqüentemente colocadas sob sucção(bomba hidráulica) em um dessecador durante 24 horas.

Para avaliar a morfologia da célula e o crescimento em 3D dossuportes poliméricos compósitos, foram feitos recortes de cada tipo dos su-portes poliméricos e semeados com fibroblastos humanos primários (passa-gem 3), células endoteliais de veia umbilical humana (HUVEC, passagem 4)ou queratinócitos primários (passagem 5) sobre a superfície dos suportespoliméricos com uma densidade de 2,5 χ 104 células/cm2 em um pequenovolume do meio de crescimento (fibroblastos primários em 10 % FCS emDMEM; HUVECs em EGM-2; queratinócitos primários em KGM-2) contendoantibióticos (penicilina, estreptomicina e Amphotericin B). Os suportes poli-méricos foram incubados a 37°C a 5% de CO2 antes de ter sido adicionado omeio de crescimento adicional. A avaliação da adesão das células, da morfo-logia, do crescimento e da população do suporte polimérico foi realizada nosdias 1, 3 e 7 por tingimento das células com vermelho neutro seguido pelaavaliação usando-se um microscópio invertido Leica DMIRE2 adaptado comuma câmera colorida resfriada Evolution MP (Media Cybernetics). Foramobtidas imagens digitais usando Image Pro Plus 5.1 software (Media Cyber-netics). O número de células foi calculado usando-se Kit de Detecção deCitotoxicidade ("Cytotoxicity Detection Kit") - (LDH, Roche Diagnosties Gm-bH). As células foram semeadas em três concentrações diferentes (1,25 χ104, 2,5 χ 104 e 5 χ 104 células/cm2) no topo dos diferentes tipos de suportepolimérico da mesma maneira que acima. Os suportes poliméricos foramavaliados nos dias 1, 3 e 7 por lavagem dos suportes poliméricos com PBSantes da Iise da célula usando-se 0,5% de CHAPS durante 20 horas a 4°Cem um agitador plano. O sobrenadante foi transferido para uma microplaca ea quantidade de LDH medida de acordo com as instruções do fabricante.

Fibroblastos

A medida quantitativa de fibroblastos apresentou um número decélulas crescente com o aumento do tempo, porém nenhum efeito foi obser-vado entre as diferentes concentrações de UBM nos suportes poliméricos degelatina (figura 1).

Nos suportes poliméricos de MPEG-PLGA as células estavamaumentando tanto com o tempo como com a quantidade de UBM no suportepolimérico (figura 2). A morfologia da célula e o crescimento em 3D no su-porte polimérico de gelatina sem UBM apresentados nos primeiros dias doestudo de células aderentes crescendo com uma morfologia arredondada epermanecendo onde estão quando elas tinham sido aplicadas. Estas célulasse tornaram um pouco mais do formato fusiforme durante o resto do estudo.A adição de 10% (peso/peso) de UBM ao suporte polimérico não variou estepadrão porém a 20 % (peso/peso) de UBM um número crescente de célulasestavam se tornando células de formato fusiforme com morfologia fibroblás-tica normal e as células começando a se espalhar mais sobre a superfície. A30 - 40% (peso/peso) foi observado uma máxima na razão de células doformato fusiforme e foi observada uma variação das células que crescem nasuperfície dos suportes poliméricos para um crescimento em que as célulasestão crescendo em profundidade dos suportes poliméricos com uma morfo-logia mais em 3D das células. Em MPEG-PLGA foi observado o mesmo pa-drão com algumas exceções: o aumento da concentração de UBM forneceum número crescente de células sobre e dentro dos suportes poliméricos. A20 -30% (peso/peso) de UBM foi observado um maior espalhamento de cé-lulas e mais células com morfologia de aspecto fusiforme. De 40% (pe-so/peso) e acima as células estão começando a crescer com morfologia em3D e em vez de crescer sobre a superfície, agora estão crescendo em pro-fundidade do suporte polimérico.Queratinócitos

A semeadura de queratinócitos primários no topo do suporte po-limérico de gelatina com 10 % (peso/peso) de UBM demonstrou um aumentono número de células comparado ao suporte polimérico sem UBM. Uma má-5 xima no número de células foi observada a 10 -20% (peso/peso) de UBMnos primeiros dias do estudo, porém, posteriormente ao estudo 20 - 30%(peso/peso) de UBM apresentaram um efeito máximo. O aumento da con-centração de UBM resultou na diminuição do número de células no suportepolimérico (figura 3).

No suporte polimérico de MPEG-PLGA foi observado o maiornúmero de células no suporte polimérico sem UBM. A adição de UBM resul-tou em uma diminuição no número de células encontradas no suporte poli-mérico sem aumentar o número de UBM. Este efeito se tornou mais e maisacentuado no final do estudo. Geralmente, uma variação relativa grande foiobservada entre duplicatas devido à sobreposições nas concentrações (figu-rai). A morfologia da célula e o crescimento em 3D apresentaram finos que-ratinócitos crescendo isolados aderentes à superfície do suporte poliméricode gelatina. No suporte polimérico com 10% (peso/peso) de UBM um maiornúmero de células estava crescendo em conexão próxima entre si, como empequenas folhas. Este efeito pareceu ser mais acentuado com o tempo. Au-mentando a concentração até 20 - 30% (peso/peso) de UBM ainda dandoorigem ao crescimento coerente, porém não tão próximo quanto em 10%(peso/peso) de UBM. Acima de 20 - 30% (peso/peso) de UBM foi observadoum maior crescimento de célula isolada com maior difusão das células jun-tamente com um menor número de células. Nos suportes poliméricos deMPEG-PLGA sem UBM as células foram coletadas no centro do suporte po-limérico crescendo próximas juntas, quase como em uma folha. O aumentoda concentração de UBM resultou em uma maior difusão das células juntascom um número decrescente de células. Nas duas concentrações mais altasforam encontradas células mortas aprisionadas na estrutura do suporte po-limérico.

élulas EndoteliaisSuportes poliméricos de gelatina semeados com Huvec1S apre-sentaram uma tendência a aumentar em número até um valor ótimo em tor-no de 20 - 30% (peso/peso) de UBM onde depois foi observada uma diminu-ição (figura 5). MPEG- PLGA com Huvec1S demonstrou que o aumento dasconcentrações de UBM resultou no aumento do número de células. Geral-mente, foram observadas grandes variações com sobreposições em concen-trações adjacentes em ambos os tipos de suportes poliméricos usando Hu-vec's (figura 6). A morfologia da célula e o crescimento em 3D demonstraramque aumentando a UBM até 30% (peso/peso) a UBM no suporte poliméricode gelatina fornece uma maior capacidade dos Huvec1S de aderir à superfícieque está crescendo com uma morfologia de achatamento com extensõescurtas normais. De 40 % (peso/peso) para cima as células estavam cres-cendo com uma morfologia mais arredondada e um número descrescente decélulas. No suporte polimérico de MPEG-PLGA sem UBM os Huvec1S eramem pequeno número e crescendo com morfologia arredondada resultandoem nenhuma célula no dia 7. A adição de 10 - 20% (peso/peso) de UBM aosuporte polimérico fornece um efeito de espalhar as células, porém nenhumefeito sobre a morfologia. O aumento da concentração acima de 30 - 40%(peso/peso) fornece a morfologia ótima da célula e aumentando-se a con-centração mais ainda fornece até mesmo mais crescimento em 3D das célu-las. Geralmente, também foram observadas variações na morfologia da célu-la e crescimento em 3D tanto nos suportes poliméricos de gelatina como deMPEG-PLGA que contêm UBM. Sumário do efeito do aumento das concen-trações de UBM sobre os fibroblastos primários, os queratinócitos primáriose as células endoteliais humanas:<table>table see original document page 25</column></row><table>Exemplo 4: Efeito de esterilização de ECM +/- incorporaçãoem suportes poliméricos sobre a morfologia da célula e crescimentoem 3D de fibroblastos primários.

Metóxi-polietileno glicol - Poli (lactídeo-co-glicolídeo) (Mn 2.000-30.000, L:G 1:1) foi dissolvido em 1, 4-dioxana a uma solução a 1,5%. Paraamostra contendo UBM, 0,045 g de UBM não esterilizada foi adicionado a 10ml de solução de polímero (23% em peso/peso de matéria seca), misturadaa alta velocidade e despejada em uma matriz de 7 χ 7 cm. A solução foicongelada a -5°C e Iiofilizada a -20°C durante 5 horas e 20°C durante apro-ximadamente 18 horas. As amostras foram subseqüentemente colocadassob sucção (bomba hidráulica) em um dessecador durante 15 horas.

As amostras com e sem UBM foram beta irradiadas por 0, 1 χ 25kGy e 2 χ 25 kGy. Uma outra amostra foi preparada da mesma maneira, po-rém foi usada uma UBM pré-esterilizada (2 χ 25 kGy de radiação beta)(0,045 g/5ml de solução) e a amostra não foi esterilizada depois da prepara-ção.

Gelatina de origem de pele porcina, tipo A, bloom 175 (Sigma)foi dissolvida em água milli-Q e t- BuOH (95:5) para uma solução a 1%.0,015 g de UBM não esterilizada foi adicionado a 5 ml de solução (23% empeso/peso de matéria seca) mantendo-se agitação e despejada na matriz(D = 5 cm). A matriz com a solução foi colocada em + 5°C durante 2 horas,então congelada a -20°C e Iiofilizada a -20°C durante 5 horas e a 20°C du-rante 20 horas. As amostras foram subseqüentemente reticuladas em umaestufa a vácuo a 120°C durante 15 horas. As amostras com e sem UBM fo-ram beta irradiadas por 0 e 1 χ 25 kGy e 2 χ 25 kGy. Foi preparada uma ou-tra amostra da mesma maneira sem UBM. As amostras foram esterilizadasdepois da preparação a 0, 1 χ 25 kGy e 2 χ 25 kGy.

Gelatina de origem de pele porcina, tipo A, bloom 175 (Sigma)foi dissolvida em água milli-Q e t- BuOH (95:5) para uma solução a 1%. 0,015g de UBM pré-esterilizada (1 χ 25 kGy) foi adicionado a 5 ml de solu-ção (23% em peso/peso de matéria seca) mantendo-se agitação e despeja-do na matriz (D = 5 cm). A matriz com a solução foi colocada em + 5°C du-rante 1 hora, então congelada a -20°C e Iiofilizada a -20°C durante 5 horas ea 20°C durante 50 horas. As amostras foram subseqüentemente reticuladasem uma estufa a vácuo a 130 0C durante 15 horas.

O estudo da morfologia da célula e do crescimento em 3D de-monstrou que uma radição crescente de folhas de UBM folhas reduziu onúmero de células sobre as folhas de UBM1 porém sem efeito sobre a morfo-logia das células. No suporte polimérico de gelatina e na gelatina com 30%(peso/peso) de UBM foram observados um número decrescente de células euma variação na morfologia de células fibroblásticas típicas a uma mais ar-redondada com o maior efeito observado no suporte polimérico de gelatina.

A esterilização de partículas de UBM antes da incorporação osuportes poliméricos de gelatina fornece uma melhor morfologia da célula eo crescimento em 3D comparado à incorporação de partículas de UBM antesda esterilização do suporte polimérico. No MPEG-PLGA resultou uma radia-ção crescente em um maior número de células com morfologia fibroblásticadevido ao maior umedecimento do suporte polimérico. A radiação dos supor-tes poliméricos de MPEG-PLGA contendo 30% (peso/peso) de UBM resultouem um número de células até mesmo maior e uma morfologia mais 3D dosfibroblastos também comparada com um suporte polimérico em que as par-tículas de UBM foram irradiadas antes da incorporação ao suporte poliméri-co.

Este estudo demonstrou que a mais alta atividade biológica foialcançada no suporte polimérico de gelatina não irradiado e que a radiaçãodiminuía a atividade. Ao contrário, foi descoberta a mais alta atividade bioló-gica quando as partículas de UBM foram incorporadas ao suporte poliméricode MPEG-PLGA e subseqüentemente esterilizado. Acredita-se que a radia-ção diminui a atividade biológica da UBM. A radiação pode afetar o materialdo suporte polimérico de uma maneira negativa ou positiva dependendo domaterial em relação a uma atividade biológica. Há indicações que demons-tram que o material do suporte polimérico (por exemplo, MPEG-PLGA) podeter um efeito protetor da UBM durante a esterilização.

Exemplo 5: Partículas Isoladas de ECM em MPEG-PLGA.Suportes poliméricos de MPEG-PLGA contendo 41% (pe-so/peso) de partículas de UBM foram semeados fibroblastos primários nasuperfície dos suportes poliméricos com uma densidade de 2,5 χ 10^4 célu-las/cm2 em um pequeno volume do meio de crescimento (10% FCS emDMEM contendo antibióticos (penicilina, estreptomicina e Amphotericin B).

Os suportes poliméricos foram incubados a 37°C a 5% de CO2 antes de tersido adicionado o meio de crescimento adicional. Depois de 7 dias os supor-tes poliméricos foram colocados em fixador de Lillys durante 3 dias antes deincrustrar em parafina, secionando em fatias de 8 μm e corando por erosãode hematoxilina de Meyer (HE). Foram coletadas imagens digitais (aumentosde 4 χ e de 20 x) usando-se um microscópio BX-60 Olympus adaptado comuma câmera colorida resfriada Evolution MP (Media Cybernetics) e foramobtidas imagens digitais usando Image Pro Plus 5.1 software.

As imagens digitais da distribuição das partículas de ECM nosuporte polimérico de MPEG-PLGA apresentaram partículas UBM isoladascoradas de vermelho por HE e distinguidas do material do suporte poliméri-co. Os fibroblastos que estão crescendo no suporte polimérico foram tingidosde azul (figura 7).

Exemplo 6: Partículas isoladas de UBM em MPEG-PLGA a-presentadas por SEM.

Foram preparados suportes poliméricos còmo descritos no Exemplo 1.

As fotos de SEM estão mostrando suportes poliméricos deMPEG-PLGA com (figura 9) e sem (figura 8) partículas de UBM. As fotos sãotiradas na superfície do topo do suporte polimérico a um aumento de 250. Asfotos de SEM foram tiradas no Instituto tecnológico Dinamarquês. (2005-160).

Exemplo 7: Três crescimentos dimensionais endoteliais ediferenciação em suportes poliméricos que contêm partículas de ECM.

Metóxi-polietileno glicol - Poli (lactídeo-co-glicolídeo) (Mn 2.000-30.000, L:G 1:1 ) foi dissolvido em 1,4-dioxana a uma solução a 1,5 %. Paraamostras contendo UBM, foi adicionado 0,045 g de UBM não esterilizada a10 ml de solução de polímero (23% peso/peso de matéria seca), misturadosa alta velocidade e despejado em uma matriz de 7 χ 7 cm. A solução foicongelada a -5°C e Iiofilizada a -20°C durante 5 horas e 20°C durante apro-ximadamente 16 horas. As amostras foram subseqüentemente colocadassob sucção (bomba hidráulica) em um dessecador durante 15 horas.

Células endoteliais primárias humanas de cordão umbilical foramco-cultivadas com fibroblastos primários dermais humanos sobre a superfíciede suportes poliméricos de MPEG-PLGA e de suporte polimérico contendo23% (peso/peso) de UBM. As construções foram cultivadas submersas emmeio de crescimento endotelial definido durante 6-10 dias depois dos quaiselas são suspensas em ar e cultivadas durante mais 9 dias. No dia final dacultura construções foram fixas com tampão a 4% de formalina, bisseciona-da e incrustada em parafina.

Por tingimento com peroxidase imunohistoquímica de CD31/PECAM (molécula de adesão da célula endotelial da plaqueta) células endo-teliais foram visualizadas em seções de 5μιη. Identificação dos fibroblastos,seções paralelas foram coradas com PECAM peroxidase combinada comum contratingimento com hema-toxilina. Como o crescimento endotelial e adiferenciação são influenciados pelo desempenho do fibroblasto, todos osmateriais do suporte polimérico foram testados com 2 populações diferentesde fibroblasto, porém não dando origem a resultados diferentes.

Todos os suportes poliméricos de MPEG-PLGA suportam ocrescimento do fibroblasto e endotelial. Fibroblastos foram encontrados emtodo o volume de todos os suportes poliméricos de MPEG-PLGA. As partícu-las de UBM foram homogeneamente distribuídas e os suportes poliméricospermanecem intactos durante a cultura. O cultivo de células endoteliais efibroblastos nos suportes poliméricos de MPEG-PLGA no entanto provocaapenas o crescimento endotelial na superfície - as células endoteliais seproliferam dentro de uma matriz produzida pelos fibroblastos vizinhos no to-po do suporte polimérico. A adição de partículas de UBM promovem o cres-cimento do fibroblasto e endotelial nas camadas mais profundas dos supor-tes poliméricos e as células endotelial adotam a morfologia semelhante acapilar. As células endoteliais são direcionadas ao longo da superfície daspartículas de UBM em vez de migrar para as mesmas. Portanto, descobriu-se que inclusive as partículas de UBM nos suportes poliméricos levam auma melhoria muito distinta no crescimento endotelial e na diferenciação. As diferentes populações de fibroblasto não estavam dando origem a diferentesresultados.

Suportes poliméricos de MPEG-PLGA (figura 10) e 23% (pe-so/peso) de UBM em MPEG-PLGA (Figura 11 ) apresentam crescimento decélulas endoteliais na superfície do suporte polimérico de MPEG-PLGA emque o crescimento é na profundidade que contém as partículas de UBM (oendotélio é corado de vermelho (apresentado preto) - os fibroblastos nãoestão visíveis).

Foi observada morfologia semelhante a capilar de células endo-teliais na camada mais profunda de suporte polimérico de MPEG-PLGA quecontém 23% (peso/peso) de UBM (figura 12). Estas estruturas não foramobservadas no suporte polimérico de MPEG-PLGA.

Exemplo 8: Propriedades físicas e mecânicas de suportespoliméricos que contêm diferentes concentrações de partículas deEC M.

Amostras preparadas:

Suporte polimérico secado por congelamento com matriz de ge-latina.

Suporte polimérico secado por congelamento com matriz de ge-latina e 40% em peso/peso de partículas de UBM.

Suporte polimérico secada por congelamento com matriz de gelatina e80% em peso/peso de partículas de UBM

Gelatina de origem de pele porcina, tipo A (PG-832-6 Gelita) foidissolvida em água milli-Q e t- BuOH (95:5) para uma solução a 1%. Paraamostras contendo UBM, a UBM foi adicionada à solução mantendo-se agi-tação (40% em peso/peso: 0,033 g/5ml, 80% em peso/peso: 0,2 g/5 ml). 5 mlda solução de gelatina que contêm a UBM foram despejados na matriz (D =5 cm). A matriz com a solução foi colocada em + 5°C durante 2,5 horas, en-tão congelada até -20°C e Iiofilizada a -20°C durante 5 horas e a 20°C du-rante 100 horas. As amostras foram subseqüentemente reticuladas em umaestufa a vácuo a 130 °C durante 15 horas.

Amostras preparadas:

Suporte polimérico secado por congelamento com matriz dePLGA.

Suporte polimérico secado por congelamento com matriz dePLGA e 40% (peso/peso) de partículas de UBM.

Suporte polimérico secado por congelamento com matriz dePLGA e 80% (peso/peso) de partículas de UBM.

Metóxi-polietileno glicol - Poli (lactídeo-co-glicolídeo) (Mn 2.000 -30.000, L:G 1:1) foi dissolvido em 1,4-dioxana para uma solução a 1,5%.Para amostras que contenham UBM, a UBM foi adicionada à solução de po-límero (40% (peso/peso): 0,1 g/10 ml, 80% (peso/peso): 0,6 g/10 ml), mistu-rada a alta velocidade e despejada em matriz de 7 χ 7 cm. A solução foicongelada sobre uma camada de 1,4-dioxana a -5°C e Iiofilizada a -20°Cdurante 5 horas e 20°C durante aproximadamente 100 horas. As amostrasforam subseqüentemente colocadas sob sucção (bomba hidráulica) em umdessecador durante 15 horas.

Propriedades físicas e testagem mecânica

Dependendo do material da matriz e da quantidade de UBM adi-cionada, podem ser conseguidas diferentes propriedades físicas e mecânicas.

• A porosidade diminui com a quantidade de UBM adicionada,desse modo aumenta a densidade.

• Se a matriz for hidrófoba, a UBM irá fornecer capacidade noestado úmido.

Suportes poliméricos de gelatina mantêm a sua resistência àtração até pelo menos 40% (peso/peso) de UBM, depois do que esta dimi-nui, ao passo que os suportes poliméricos de PLGA são levemente reforça-dos pelas partículas de UBM. A baixa concentração de material em combi-nação com o processo de secagem por congelamento fornece baixa resis-tência à tração, o que também é o caso para as amostras neste exemplo.

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A altura é medida com um medidor de régua.

A densidade é calculada como: Densidade = Massa/(Área χ Al-gura)

A porosidade é calculada como:

Porosidade = (densidade do polímero - densidade da amostra)/densidade do polímero. A densidade do polímero é ajustada em peso deacordo com a UBM adicionada (3 mg/cm3).

A capacidade no estado úmido é calculada como o período detempo para que uma gotícula de água seja totalmente absorvida pela amos-tra, foto monitorada.

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A testagem de tração foi realizada em um texturômetro da Stable Mi-cro Systems.

Claims

1. Suporte polimérico contínuo, temporário que compreende re-giões descontínuas de ECM em que a concentração de regiões descontí-nuas de ECM está entre 20% (peso/peso) e 60% (peso/peso).

2. Suporte polimérico temporário de acordo com a reivindicação-1, em que o suporte polimérico é biodegradável.

3. Suporte polimérico temporário de acordo com a reivindicação-1 ou 2, em que as regiões descontínuas de ECM são homogeneamente dis-tribuídas.

4. Suporte polimérico temporário de acordo qualquer uma dasreivindicações 1 a 3, em que o suporte polimérico biodegradável é constituí-do de substâncias que contêm proteínas.

5. Suporte polimérico temporário de acordo qualquer uma dasreivindicações 1 a 3, em que o suporte polimérico biodegradável é constituí-do de substâncias que contêm polissacarídeos.

6. Suporte polimérico temporário de acordo qualquer uma dasreivindicações 1 a 3, em que o suporte polimérico biodegradável é constituí-do de substâncias que contêm polímeros sintéticos.

7. Suporte polimérico temporário de acordo qualquer uma dasreivindicações anteriores, em que o suporte polimérico biodegradável éconstituído de qualquer combinação de material fornecido de acordo com asreivindicações 4 a 6.

8. Suporte polimérico temporário de acordo qualquer uma dasreivindicações anteriores, em que o suporte polimérico tem poros abertosinterligados.

9. Suporte polimérico temporário de acordo qualquer uma dasreivindicações anteriores, em que o suporte polimérico tem uma espessurade 0,1 a 8 mm.

10. Suporte polimérico temporário de acordo qualquer uma dasreivindicações anteriores, em que o suporte polimérico é colocado em umaembalagem hermética a bactérias, com uma marcação na embalagem deque este produto é esterilizado.