BRPI0617631A2 - planta transgênica, parte de planta transgênica, seqüência de polinucleotìdeo isolada e método para produzir uma planta transgênica com conteúdo aumentado de celulose quando comparado com uma planta não transgênica - Google Patents

Abstract

<B>PLANTA TRANSGENICA, PARTE DE PLANTA TRANSGêNICA, SEQüêNCIA DE POLINUCLEOTIDEO ISOLADA E MéTODO PARA PRODUZIR UMA PLANTA TRANSGêNICA COM CONTEUDO AUMENTADO DE CELULOSE QUANDO COMPARADO COM UMA PLANTA NAO TRANSGêNICA<D>Polinucleotídeos, construções de DNA e métodos são descritas para a modificação do conteúdo de celulose nos tecidos de uma planta. As plantas são transformadas com construções que codificam ou um gene de sacarose sintase de Anabaena sp. ativo ou um gene de sacarose sintase de nódulo de soja, conduzindo ao conteúdo de celulose aumentado quando superexpresso sob o controle de um promotor preferencial de cambio/xilema. Plantas transformadas que possuem o gene da sacarose sintase de Anabaena sp. ou de nódulo de soja demonstraram conteúdo de celulosa aumentado, uma característica que é desejada para melhorar árvores lenhosas para extração de celulose durante a separação das fibras celulósicas da polpa e a fabricação de papel.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para: "PLANTATRANSGÊNICA, PARTE DE PLANTA TRANSGÊNICA, SEQÜÊNCIA DEPOLINUCLEOTÍDEO ISOLADA E MÉTODO PARA PRODUZIR UMA PLANTATRANSGÊNICA COM CONTEÚDO AUMENTADO DE CELULOSE QUANDOCOMPARADO COM UMA PLANTA NÃO TRANSGÊNICA".

PEDIDOS RELACIONADOS

Este pedido reivindica prioridade do pedido No. US60/728,743, depositado em 21 de outubro de 2005, cujoescopo está incorporado por referência na sua totalidade.

CAMPO DA INVENÇÃO

Esta invenção relaciona-se à biologia molecular e àregulação de síntese de proteínas através da introdução degenes exógenos em células de plantas, preferencialmentedentro de seu genoma. Mais especificamente, o métodorelaciona-se à modificação do conteúdo de celulose em umacélula de planta pela introdução de um gene exógeno quecodifica uma enzima da sacarose sintase ativa.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO E ESTADO DA TÉCNICA

Sacarose sintase (E.C. 2.4.1.13) é uma enzima quecatalisa a quebra de sacarose em UDP-glicose e frutose. Emplantas, sacarose sintase é encontrada em tecidos drenotais como tubérculos, sementes, frutos, meristemas etronco. Reações subseqüentes em tecidos de estocagemutilizam UDP-glicose para gerar amido, enquanto em outrostecidos UDP-glicose e frutose podem ser acumulados ouadicionalmente convertidos em outros compostos, como acelulose. Múltiplas isoformas de sacarose sintase foramidentificadas em plantas, a maioria delas apresentando umtípico padrão de expressão tecido-específico. Huang et al. ,Biosci. Biotech. Biochem. 60:233-239 (1996); Chourey etal., Mol. Gen. Genet. 203:251-255 (1986). Particularmente,diversas isoformas da sacarose sintase são encontradaspredominantemente ou exclusivamente em tecidos onde ocorremo crescimento da biomassa através da divisão celularmassiva e deposição na parede celular, tal como odesenvolvimento secundário do xilema e nódulos de raiz.Rouhier & Usuda, Plant Cell Physiol. 42:583-593 (2001);Komina et al., Plant Physiol. 129: 1664-1673 (2002).

Plantas regulam a sacarose sintase tanto no níveltranscricional quanto pós-traducional, incluindo inibiçãopor feedback pela glicose/frutose e fosforilação. Asacarose sintase de milho tem se mostrado serreversivelmente fosforilada no resíduo Ser-15, o qual êconservado entre todas as seqüências de plantas examinadasaté a presente data. Hardin et al., Plant Physiol. 134:1427-1438 (2004).

Em cianobactérias, como Anabaena sp., a sacarosesintase desempenha um papel na fixação de nitrogênio emestruturas especializadas chamadas de heterocistos.Schilling & Ehrnsperger, Z. Naturforsch 40c: 776-779(1985) . Foi sugerido que, nestes organismos, a sacarosesintase é a responsável pela síntese de sacarose, enquantosua função em plantas é a quebra da sacarose. Salerno &Curatti, Trends Plant Sei. 8: 63-69 (2003).

Celulose é um dos principais componentes da paredecelular de plantas, fornecendo força mecânica e rigidez.Normalmente, a madeira seca contém cerca de 3 0% a cerca de50% de celulose e cerca de 20% a cerca de 30% dehemicelulose, veja Higuchi et al. , Biochemistry and MolecularBiology of Wood, Springer Verlag (1997) , embora estes númerosgeralmente mudem quando a árvore está sujeita à mudançasambientais. Por exemplo, madeira sobre estresse decompressão geralmente exibe um forte decréscimo no conteúdode celulose, enquanto na madeira tensionada há maiscelulose. Timmell, Compression Wood in Gymnosperms, SpringerVerlag (1986) .

Celulose é um polímero de resíduos de glicoses ligadosna posição beta-1,4 sintetizados por uma ou mais enzimas decelulose sintase que catalizam a assembléia de unidades deUDP-glicose em microfibrilas de celulose em complexosprotéicos conhecidos como rosetas na membrana plasmática.Delmer & Amor, Plant Cell 7: 987-1000 (1995). Em plantassuperiores, o grau de polimerização de glucanas varia entreas paredes celulares primárias e secundárias, com paredessecundárias produzindo microfibrilas de maior pesomolecular. Brown et al. , Trends Plant Sei. 1: 149-156(1996). Parede celular em madeiras tensionadas tambémpossui elevado conteúdo de celulose, grau de polimerizaçãoe índices de cristalinidade aumentados. Tais variações nograu de polimerização em paredes celulares são consideradasdependentes de quais isoformas da celulose sintase estãoenvolvidas na síntese de celulose. Haigler & Blanton, Proc.Natl Acad. Sei. USA 93: 12082-12085 (1996). Haigler &Blanton, Proc. Natl Acad. Sei. USA 93: 12082-12085 (1996).

Por outro lado, pouco se sabe sobre como os complexosprotéicos de celulose sintase funcionam, e se estescomplexos protéicos são capazes de acoplar a síntese decelulose com a quebra da sacarose, a qual acredita-sefornecer unidades de UDP-glicose para a síntese de celuloseem todas as células da planta através da ação de sacarosessintases. Delmer, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol.Biol. 50: 245-276 (1999).

Konishi et al., Plant Physiol. 134: 1146-1152 (2004)relatou a superexpressão de sacarose sintase de broto defeijão em 25 linhagens independentes de Populus. Enquantotodas as linhagens apresentaram altos níveis de sacarosesintase nas folhas, nenhuma apresentou deposição decelulose aumentada. Os autores especulam que este resultadopode ocorrer devido às plantas possuírem mecanismosregulatórios que controlam o transporte de açúcar da fontepara o dreno, particularmente quando as fontes de tecidoscontêm elevado nível de sacarose sintase. Alternativamente,Konishi et al. , presume que a ausência de deposição decelulose aumentada em suas linhagens transgênicas podeestar associada com o uso de um promotor constitutivo, oqual poderia ter conduzido de forma ineficiente a partiçãode sacarose entre fonte e dreno.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Em um aspecto, a invenção fornece uma plantatransgênica compreendendo uma molécula de ácido nucléico desacarose sintase de origem não vegetal, onde a referidaplanta contém um conteúdo de celulose alterado emcomparação com a planta não-transgênica desprovida de talmolécula. Em uma modalidade, a planta transgênica é obtidaatravés da transformação da planta com um vetor deexpressão compreendendo a referida molécula de ácidonucléico sacarose sintase de origem não vegetal sobre ocontrole de um promotor capaz de funcionamento em umaplanta. Em outra modalidade, a molécula de ácido nucléico é(a) uma seqüência compreendendo SEQ ID Nos.: 1 ou 2; ou (b)uma seqüência de (a) com uma ou mais bases excluídas,substituídas, inseridas, ou adicionadas.

Em uma modalidade, a planta transgênica possui oconteúdo de celulose aumentado. Em outra modalidade, aplanta transgênica possui o conteúdo de lignina diminuído.Em uma modalidade, a planta transgênica é uma dicotiledôneaou uma monocotiledônea. Em outra modalidade, a plantatransgênica é uma gimnosperma. Em uma modalidade adicional,a planta é uma árvore lenhosa. Em ainda uma modalidadeadicional, a árvore silvestre é uma planta do gêneroEucalyptus, Populus, ou Pinus. Em outra modalidade, aplanta transgênica é selecionada do grupo consistindo deuma folha, um caule, uma flor, um ovário, uma fruta, umasemente e um calo.

Em outro aspecto, a invenção fornece um método paraproduzir uma planta transgênica com conteúdo de celuloseaumentado quando comparado com uma planta transgênica,compreendendo (i) transformar a célula de uma planta comuma seqüência de sacarose sintase de origem não vegetal sobo controle de um promotor capaz de funcionamento em umaplanta, (ii) cultivar a referida célula de plantatransformada sob condições que promovam o crescimento deuma planta, e (iii) selecionar uma planta transgênica queexibe conteúdo aumentado de celulose.Em uma modalidade, a seqüência de nucleotídeo é umgene de sacarose sintase compreendendo: (a) uma seqüênciade nucleotídeos compreendendo SEO ID Nos: 1 ou 2; ou (b)uma seqüência de nucleotídeos de (a) com uma ou mais basesexcluídas, substituídas, inseridas ou adicionadas. Em umamodalidade, a planta transgênica é uma dicotiledônea oumonocotiledônea. Em outra modalidade, a planta transgênicaé uma gimnosperma.

Em outro aspecto, a invenção fornece uma seqüência depolinucleotídeos isolada compreendendo uma seqüência deácido nucléico codificando um polipeptídeo que é capaz deaumentar os níveis de sacarose sintase e de celulose em umaplanta.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

A Figura 1 ilustra a reação catalisada pela sacarosesintase em plantas e o acoplamento da geração de UDP-Glicose com a via de biossíntese de celulose.

A Figura 2 ilustra esquematicamente o vetor plasmidialpara a expressão em plantas pALELLYX-Susy da invençãocompreendendo um promotor preferencial de cambio/xilema,dirigindo a expressão da seqüência de nucleotídeos dasacarose sintase da presente invenção.

A Figura 3 ilustra esquematicamente o vetor plasmidialpara expressão em plantas pALELLYX-SusyN da invençãocompreendendo um promotor preferencial de cambio/xilema,dirigendo a expressão de uma seqüência de nucleotideosnativa da sacarose sintase de Anabaena sp.

A Figura 4 ilustra esquematicamente o vetor plasmidialpara expressão em plantas pALELLYX-Susycu da invençãocompreendendo um promotor preferencial de câmbio/xilema,dirigindo a expressão de seqüências de nucleotideos com usode códons adaptados codificando a enzima sacarose sintasede Anabaena sp.

A Figura 5 mostra o conteúdo de celulose de diversaslinhagens transgênicas transformadas com o vetor plasmidialpara expressão em planta pALELLYX-SusyN da invenção e aplanta controle não-transgenica respectiva. O asteriscodenota valores de conteúdo de celulose médiosestatisticamente significativos (P<0,01, teste T).

A Figura 6 mostra o conteúdo de celulose de diversaslinhagens transgênicas transformadas com o vetor plasmidialpara expressão em planta pALELLYX-Susycu e respectivaplanta controle não-transgenica. O asterisco denota valoresmédios de conteúdo de celulose estatisticamentesignificativos (P<0,05, teste T).

A Figura 7 mostra o conteúdo de celulose de trêsgenótipos de uma planta transgênica Tl transformada com ovetor plasmidial para expressão em planta pALELLYX-Susycu dapresente invenção. O asterisco denota valores médios deconteúdo de celulose estatisticamente significativos(P<0,05, teste T) .

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Os inventores da presente invenção mostraram quesacarose sintases de origem não vegetal, tais como aquelasencontradas em cianobactérias, podem não ser reguladas poruma planta que foi geneticamente modificada para expressaresta enzima, por razões que incluem, mas não estãolimitadas à ausência de fosforilação regulatória ou outrossítios alostéricos tais como aqueles geralmente encontradosem sacarose sintases de plantas. Da mesma forma, osinventores observaram que uma sacarose sintase de origemnão vegetal, introduzida em plantas hospedeiras, podeafetar a síntese de sacarose, e ainda não estaria sujeita arepressão da expressão pela planta hospedeira. Assim, ospresentes inventores realizaram o desejo de transformarárvores lenhosas e outras culturas que produzem fibras decelulose com construções de DNA que codificam a enzima dasacarose sintase de origem não-vegetal. A enzima heterólogapode aumentar a conversão de glicose em UDP-glicose, queposteriormente pode ser usada como uma unidade deconstrução para síntese de celulose.

Dessa forma, a presente invenção relaciona-se comcomposições compreendendo seqüências de DNA da sacarosesintase de origem não vegetal e polipeptídeos da sacarosesintase de origem não vegetal. O ilustrativo das seqüênciasde nucleotídeos que codificam sacarose sintase conforme apresente invenção são as SEQ ID Nos: 1 e 2.

De acordo com um aspecto da presente invenção, ummétodo é fornecido para modificar o conteúdo de celulose emtecidos de plantas, tais como células fibrosas do xilema deangiospermas lenhosas, células dos traqueídeos do xilema degimnospermas e células fibrosas de sementes de algodãoatravés do controle da atividade da sacarose sintase. Deacordo com este aspecto da invenção, células de plantas ouplantas inteiras são transformadas com uma seqüênciacodificando a sacarose sintase a partir de um organismo deorigem não vegetal, preferencialmente uma Anabeana sp.,cuja seqüência, quando expressa em células fibrosas doxilema de angiospermas, traqueídeos do xilema degimnospermas, ou células fibrosas de semente de algodão,causa conversão aumentada de sacarose em UDP-glicose,conduzindo à disponibilidade aumentada de UDP-glicose parabiossíntese de celulose.

Além do aumento da biossíntese e deposição decelulose, a presente invenção fornece, concomitantemente,um meio para diminuir a deposição de lignina. Aconcentração elevada de lignina em árvores apresenta umproblema significativo para a indústria de papel, quenecessariamente gasta recursos consideráveis para separar alignina da fibra de celulose. Dessa forma, é desejávelreduzir o conteúdo de lignina em plantas lenhosas atravésda modificação genética. Hu et al. , Nafcure Biotechnology17: 808-812 (1999), descobriu que a supressão dabiossíntese de lignina aumentou a deposição de celulose, oque sugeriu uma relação inversa entre a biossíntese delignina e de celulose. Devido ao fato dos presenteinventores terem desenvolvido uma estratégia para aumentara deposição de celulose através da expressão da sacarosesintase de origem não-vegetal, concomitante, o decréscimona deposição de lignina também pode ocorrer.

Todos os termos técnicos aqui usados são termoscomumente usados em bioquímica, biologia molecular eagricultura, e podem ser compreendidos por uma pessoaversada na técnica a qual esta invenção pertence. Taistermos técnicos podem ser encontrados em: Molecular Cloning: ALaboratory Manual, 3a ed. , vol. 1-3, ed. Sambrook e Russel,Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor,N.Y. 2001; Current Protocols in Molecular Biology, ed. Ausubel etal., Greene Publishing Associates and Wiley Interscience,Nova Iorque, 1988 (com atualizações periódicas); ShortProtocols in Molecular Biology : a compendium of Methods from CurrentProtocols in Molecular Biology, 5a ed., vol. 1-2, ed. Ausubel etal., John Wiley & Sons, Inc. (2002); Genome Analysis: ALaboratory Manual, vol. 1-2, ed. Green et al., Cold SpringHarbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1997. Asmetodologias envolvendo técnicas de biologia de plantas sãodescritas aqui e são descritas em detalhes em trabalhoscomo Methods in Plant Molecular Biology: A Laboratory Course Manual,ed. Maliga et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor, N.Y., 1995. Várias técnicas usando PCRsão descritas, por exemplo, em Innis et al., PCR Protocols: AGuide to Methods and Applications, Academic Press, San Diego,1990 e em Dieffenbach e Dveksler, PCR Primer: A LaboratoryManual, 2a ed. , Cold Spring Harbor Laboratory Press, ColdSpring Harbor, N.Y., 2003. Os pares de iniciadores de PCRpodem ser derivados de seqüências conhecidas, através douso de técnicas conhecidas como, por exemplo, programas decomputador desenvolvidos para tal objetivo, por exemplo,Primer, Versão 0.5 (1991), Whitehead Institute forBiomedical Research, Cambridge, MA. Métodos para síntesequímica de ácidos nucléicos são discutidos, por exemplo, emBeaueage e Caruthers, Tetra. Letts, 22: 1859-1862 (1981) eMatteucci e Caruthers, J. Am. Chem. Soc., 103: 3185 (1981).

As digestões com enzimas de restrição, fosforilações,ligações e transformações foram feitas como descritas emSambrook et al. , Molecular Cloning : A Laboratory Manual, SegundaEdição (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press. Todos osreagentes e materiais usados para o crescimento emanutenção de células bacterianas foram obtidos do AldrichChemicals (Milwaukee, WI), DIFCO Laboratories (Detroid,MI), Invitrogen (Gaithersburg, MD) , ou Sigma ChemicalCompany (St. Louis, MO), a não ser que de outra formaespecificado.

O termo "codificar" refere-se ao processo pelo qual umgene, através dos mecanismos de transcrição e tradução,fornece informação para uma célula a partir da qual umasérie de aminoácidos pode ser organizada em uma seqüênciaespecifica de aminoácidos para produzir uma enzima ativa.

Devido à degeneração do código genético, certas mudanças debases na seqüência de DNA não alteram a seqüência deaminoácido na proteína. Portanto, entende-se quemodificações nas seqüências de DNA codificando sacarosesintase, que não afetem substancialmente as propriedadesfuncionais da enzima da sacarose sintase, são contempladas.

Nesta descrição, o termo "expressão" refere-se àprodução do produto protéico codificado por um gene."Superexpressão" refere-se à produção de um produto gênicoem organismos transgênicos que excede os níveis de produçãoem organismos normais ou não transformados.

Seqüências de sacarose sintase de origem não vegetal

Genes de sacarose sintase têm sido identificados emdiversas espécies de origem não vegetal, exemplificadas porcianobactérias (Anabeana sp.), proteobactérias(N.europaea), colorófitas (C. vulgaris e C. obliquus) eprotistas {E.gracilis). Dessa forma a frase "de origem nãovegetal sacarose sintase" refere-se aqui a qualquermolécula de ácido nucléico, gene, polinucleotídeo, DNA,RNA, mRNA ou cDNA que for isolada a partir do genoma de umaespécie de origem não vegetal e que confere atividade daenzima sacarose sintase.

Uma sacarose sintase de origem não vegetal apropriadapara a presente invenção pode ser obtida a partir de umamiríade de organismos que são caracterizados pela presençade um gene da sacarose sintase que é menos regulado por umaplanta hospedeira que contém e expressa o gene. Porexemplo, as seqüências de sacarose sintase de plantascontêm domínios de fosforilação que regulam a expressão dogene, visto que muitas seqüências de sacarose sintase decianobactérias, por exemplo, não apresentam domínios defosforilação. Ao contrário das sacaroses sintases deplantas, acredita-se que as sacaroses sintases de origemnão vegetal são menos sujeitas à inibição por feedbacknegativo na planta hospedeira.

Para o objetivo da presente invenção, um gene desacarose sintase de origem não vegetal é preferencialmenteisolado a partir de espécies de cianobactéria. Maispreferencialmente, um gene de sacarose sintase de origemnão vegetal é isolado a partir de uma cianobacteriasfilamentosas e heterocísticas. Espécies de cianobactériaque ilustram a presente invenção são Aphanocapsa sp.,Aphanothece sp. , Chamaesiphon sp., Chroococcus sp.,Chroogloeocystis sp., Croeosphaera sp., Cyanobacterium sp.,Cyanobium sp., Cyanothece sp. , Dactylocoeeopsis sp.,Gloeocapsa sp., Gloeotheee sp., Johannesbaptistia sp.,Merismopedia sp., Microeystis sp., Rhabdoderma sp.,Synechocoeeus sp., Synechoeystis sp., Thermosyneehoeoceussp., Anabaena sp., Anabaenopsis sp., Aphanizomenon sp.,Aulosira sp., Cyanospira sp. , Cylindrospermopsis sp.,Cylindrospermum sp., Mojavia sp., Nodularia sp., Nostoesp., Raphidiopsis sp., Triehormus sp., Calothrix sp.,Gloeotriehia sp., Scytonema sp. , Scytonematopsis sp.,Arthrospira sp., Geitlerinema sp., Halomieronema sp.,Halospirulina sp., Katagnymene sp., Leptolyngbya sp.,Limnothrix sp., Lyngbya sp., Mieroeoleus sp., Oscillatoriasp., Phormidium sp., Planktothrieoides sp., Planktothrixsp., Pleetonema sp., Pseudanabaena sp., Sehizothrix sp. ,Spirulina sp., Symploca sp., Trichodesmium sp., Tychonemasp. , Chroococcidiopsis sp., Dermoearpa sp. , Dermoearpellasp., Myxosareina sp., Pleurocapsa sp., Stanieria sp.,Xenococcus sp. , Proehloron sp., Prochlorococcus sp.,Prochlorothrix sp. , Capsosira sp. , Chlorogloeopsis sp.,Fiseherella sp., Hapalosiphon sp., Mastigocladopsis sp.,Nostochopsis sp., Stigonema sp., Symphyonema sp., Umezakiasp., Westiellopsis sp., Aearyoehloris sp.

Por exemplo, um gene de sacarose sintase isolado apartir de Anabaena sp. é um gene de sacarose sintase deorigem não vegetal e pode ser usado para modificar oconteúdo de celulose de tecidos e/ou órgãos de plantas, deacordo com a presente invenção. Preferencialmente, asacarose sintase de origem não vegetal é obtida a partir doDNA genômico de Anabaena sp. , tal como a seqüênciadeterminada na SEQ ID No: 1. A SEQ ID No: 1 representa aseqüência de sacarose sintase como encontrada no DNAgenômico de Anabaena sp., que possui uma identidade menorque 55% em relação aos cDNAs de planta que codificam asproteínas da sacarose sintase. Notavelmente, SEQ ID No:1 édesprovida de um sítio de fosforilação conservado próximo aregião N-terminal, que é requerida para a fosforilação deproteína em espécies eucarióticas.

Uma seqüência de sacarose sintase de origem nãovegetal pode ser sintetizada ab initio como uma seqüênciacom otimização de códons. Veja Young and Dong, NucleidAcids Res 32: e59 (2004). Por exemplo, SEQ ID No:2 forneceuma seqüência de DNA que codifica uma enzima sacarosesintase na qual todos os códons foram modificados demaneira a apresentar os códons geralmente preferidos emplantas para cada aminoácido. Dessa forma, SEQ ID NO: 2possui uma identidade menor que 55% em relação às proteínasde sacarose sintase codificadas por cDNAs de plantas, mas aseqüência de proteína codificada é idêntica à seqüência deproteína codificada por uma seqüência sem otimização decódon, e, portanto, também é desprovida de um sítio defosforilação conservado próximo a região N-terminal.

Adicionalmente, a categoria de seqüências apropriadasde sacarose sintase de origem não vegetal inclui umamolécula de ácido nucléico compreendida de uma variante daSEQ ID No. 1 ou SEQ ID No. 2, com uma ou mais basesexcluídas, substituídas, inseridas ou adicionadas, cujavariante codifica um polipeptídio com atividade da enzimasacarose sintase. Desta forma, seqüências contendo"seqüências de base com uma ou mais bases excluídas,substituídas, inseridas ou adicionadas" retêm atividadefisiológi ca mesmo quando a seqüência de aminoãcidoscodificada tem um ou mais aminoácidos substituídos,excluídos, inseridos ou adicionados. Seqüências denucleotídeos contendo tais modificações e que codificam umaisoforma da enzima sacarose sintase estão incluídas noescopo da presente invenção. Por exemplo, a calda Poli A oua região terminal 5' ou 3' não traduzida podem serexcluídas, e bases podem ser excluídas até a extensão emque os aminoácidos estejam excluídos. Bases também podemser substituídas, desde que não ocorra mudança na ordem detradução da seqüência. Bases também podem ser "adicionadas"até a extensão em que aminoácidos estejam adicionados. Éessencial, entretanto, que qualquer uma de taismodificações não resulte na perda da atividade da enzimasacarose sintase. Um DNA modificado neste contexto pode serobtido através da modificação das seqüência de bases do DNAda invenção, de modo que os aminoácidos em locaisespecíficos sejam substituídos, excluídos, inseridos ouadicionados por mutagênesis sitio-especifica, por exemplo.Zoller & Smith, Nucleic Acid Res. 10: 6487-6500 (1982).

Uma seqüência de sacarose sintase de origem nãovegetal pode ser sintetizada ab initio a partir de basesapropriadas, por exemplo, usando uma seqüência de proteínaapropriada divulgada aqui como uma guia para criar umamolécula de DNA que, ainda que diferente da seqüência deDNA nativa, resulte na produção de uma proteína com a mesmaseqüência de aminoácidos ou similar. Este tipo de moléculade DNA sintética é útil quando introduzida em uma seqüênciade DNA de planta, codificando uma proteína heteróloga, aqual reflete o uso de uma freqüência de códons diferentes(de origem não vegetal), se usada sem modificação, poderesultar em uma tradução ineficiente pela plantahospedeira. A seqüência de DNA caracterizada como SEQ IDNo:2 é uma molécula com tal otimização do uso de códon, porexemplo.

A presente invenção ainda fornece moléculas de ácidonucléico compreendendo a seqüência de nucleotideo da SEQ IDNo :1 e 2, que codifica uma enzima de sacarose sintaseativa, onde a enzima tem uma seqüência de aminoácidos quecorresponde à SEQ ID No :3 e onde a proteína da presenteinvenção inclui substituições, adições e exclusões deaminoácidos que não alterem a função da enzima sacarosesintase. SEQ ID NO.: 3 possui, em média, menos de 40% dehomologia de seqüências com as proteínas eucarióticas.Elementos Regulatórios Apropriados

A invenção fornece moléculas de ácido nucléico queprovavelmente causam conteúdo alterado de celulose emplantas transformadas. Um aspecto importante da presenteinvenção é o uso de construções de DNA onde a seqüência denucleotídeos que codifica uma sacarose sintase éoperacionalmente ligada a uma ou mais seqüênciasregulatórias, que dirigem a expressão da seqüência desacarose sintase em certos tipos celulares, órgãos outecidos, de forma a alterar o conteúdo de celulose de umaplanta transformada, sem afetar impropriamente suafisiologia e desenvolvimento normal.

O sistema vascular compreende tecidos de floema exilema e são coletivamente referidos como "tecidovascular". Promotores específicos do sistema vascular, taiscomo promotores preferenciais de xilema podem ser úteis porefetuar a expressão das moléculas de ácido nucléico dainvenção, especificamente em tecido vascular, especialmentetecido de xilema. Assim, "xilema-preferido" ou"preferencial de xilema" significa que as moléculas deácido nucléico da presente invenção são mais ativas noxilema do que em qualquer outro tecido da planta. Opromotor selecionado deve causar a superepressão de umaenzima de sacarose sintase de origem não vegetal, conformea presente invenção, para modificar o tamanho do xilema,para desta forma modificar a composição química do xilemada planta hospedeira, ou ambos.

Promotores apropriados são ilustrados, mas não deforma limitada, pelo promotor do gene da tubulina (TUB)preferencial de xilema, o promotor do gene da proteínatransportadora de lipídeo (LTP) preferencial de xilema e opromotor do gene cumarato-4-hidroxilase (C4H) preferencialde xilema. Outros promotores apropriados são divulgados nopedido de patente internacional PCT/BR2005/000041,depositado em 2 8 de março de 2 005, que é incorporado aquicomo referência.

Elementos regulatórios adicionais, para uso de acordocom a presente invenção, são descritos abaixo sob osubtítulo "construções de DNA".

Plantas para Engenharia Genética

A presente invenção compreende a manipulação genéticade plantas, especialmente árvores e culturas que produzemfibras celulósicas, tais como algodão, para aumentar aatividade da sacarose sintase em tecidos vasculares oucélulas de fibra de sementes via introdução de um gene desacarose sintase de origem não vegetal, preferencialmentesob o controle de um promotor preferencial de xilema. 0resultado é uma síntese e deposição de celulose aumentados.Na presente descrição, "planta" significa qualquermaterial de planta contendo celulose que pode sermanipulado geneticamente, incluindo, mas não de formalimitada, células diferenciadas e/ou não diferenciadas,protoplastos, plantas inteiras, tecidos de plantas, órgãode plantas ou qualquer componente da planta tal como folha,caule, raiz, gema, tubérculo, fruto, rizoma ou outro.

Plantas que podem ser manipuladas geneticamente deacordo com a presente invenção incluem, mas não limitadasàs árvores, tais como espécies de Eucalyptus (E. alba, E.

albens, E. amygdalina, E. aromaphloia, E. baileyana, E.balladoniensis, E. bicostata, E. botryoides, E.brachyandra, E. brassiana, E. brevistylis, E. brockwayi, E.camaldulensis, E. ceracea, E. cloeziana, E. coccifera, E.cordata, E. comuta, E. corticosa, E. crebra, E.

croajingolensis, E. curtisii, E. dalrympleana, E. deglupta,E. delegatensis, E. delicata, E. diversicolor, E.diversifolia, E. dives, E. dolichocarpa, E. dundasii, E.dunnii, E. elata, E. erythrocorys, E. erythrophloia, E.eudesmoides, E. falcata, E. gamophylla, E. glaucina, E.

globulus, E. globulus subsp. bicostata, E. globulus subsp.globulus, E. gongylocarpa, E. grandis, E. grandis χurophylla, E. guilfoylei, E. gunnii, E. hallii, E.houseana, E. jacksonii, E. Iansdowneana, E. Iatisinensis,E. Ieucophloia, E. leucoxylon, E. Iockyeri, E. Iucasii, E.

maidenii, E. marginata, E. megacarpa, E. melliodora, E.michaeliana, E. microcorys, E. microtheca, E. muelleriana,E. nitens, E. nitida, E. obliqua, E. obtusiflora, E.occidentalis, E. optima, E. ovata, E. pachyphylla, E.pauciflora, E. pellita, E. perriniana, E. petiolaris, E.pilularis, Ε. piperita, Ε. platyphylla, Ε. ροlyanthemos, Ε.populnea, Ε. preissiana, Ε. pseudoglobulus, Ε. pulchella,Ε. radiata, Ε. radiata subsp. radiata, Ε. regnans, Ε.risdonii, Ε. robertsonii, Ε. rodwayi, Ε. rubida, Ε.

rubiginosa, Ε. saligna, Ε. salmonophloia, Ε. scoparia, Ε.sieberi, Ε. spathulata, Ε. staeri, Ε. stoatei, Ε. tenuipes,Ε. tenuiramis, Ε. tereticornis, Ε. tetragona, Ε.tetrodonta, Ε. tindaliae, Ε. torquata, Ε. umbra, Ε.urophylla, Ε. vernicosa, Ε. viminalis, Ε. wandoo, Ε.

wetarensis, Ε. willisii, Ε. willisii subsp. falciformis, Ε.willisii subsp. willisii, Ε. woodwardii) , espécies dePopulus (P. alba, P. alba χ Ρ. grandidentata, Ρ. alba χ Ρ.tremula, Ρ. alba χ Ρ. tremula var. glandulosa, Ρ. alba χ Ρ.tremuloides, Ρ. balsamifera, Ρ. balsamifera subsp.

trichocarpa, Ρ. balsamifera subsp. trichocarpa χ Ρ.deltoides, Ρ. ciliata, Ρ. deltoides, Ρ. euphratica, Ρ.euramericana, Ρ. kitakamiensis, Ρ. Iasiocarpa, Ρ.laurifolia, Ρ. maximowiczii, Ρ. maximowiczii χ Ρ.balsamifera subsp. trichocarpa, Ρ. nigra, Ρ. sieboldii χ Ρ.

grandidentata, Ρ. suaveolens, Ρ. szechuanica, Ρ. tomentosa,Ρ. tremula, Ρ. tremula χ Ρ. tremuloides, Ρ. tremuloides, Ρ.wilsonii, Ρ. canadensis, Ρ. yunnanensis) , coníferas comopinheiro "loblolly" (Pinus taeda), pinheiro dos pântanos(Pinus elliotii), pinheiro ponderosa (Pinus ponderosa) ,pinheiro americano (Pinus contorta) , e pinheiro Monterey(Pinus radiata); abeto-de-douglas (Pseudotsuga menziesii) ;tsuga canadense (Tsuga canadensis); abeto-de-sitka (Piceaglauca); sequóia (Sequoia sempervirens); abetos verdadeiroscomo abeto de prata (Abies amabilis) e abeto-balsâmico(Abies balsamea) ; e cedros como o cedro vermelho (Thujaplicata) e o cedro-amarelo-do-alasca (Chamaecyparisnootkatensis) .

Plantas que produzem fibras também são incluídas nestecontexto. Culturas ilustrativas são algodão (Gossipiumspp.), fibra do linho (Linum usitatissimum) , Urtiga (Urticadioica), Lúpulo (Humulus lupulus), tília (Tilia cordata, T.x. europaea e T. platyphyllus), "spanish broom" (Spartiumjunceum), rami (Boehmeria nivea) , "paper mulberry"(Broussonetya papyrifera) , "New Zealand flax" (Phormiumtenax) , "dogbane" (Apocynum cannabinum) , espécies de nIris"(I. douglasiana, I. macrosiphon e I. purdyi) , "milkweeds"(Asclepia species), abacaxi, banana e outras. Tambémcontempladas estão culturas forrageiras, tais como alfalfa,azevém, festuca e trevo.

Na presente descrição, "planta transgênica" refere-sea uma planta que tem incorporada uma seqüência de DNA,incluindo, mas não de forma limitada, genes que não estãopresentes normalmente no genoma da planta hospedeira,seqüências de DNA não transcritas normalmente em RNA outraduzidas em uma proteína ("expressa") ou quaisquer outrosgenes ou seqüências de DNA que se deseja introduzir naplanta não transformada, tais como genes que podemnormalmente estar presentes na planta não transformada, masque se deseja manipular geneticamente ou ter sua expressãoalterada. A categoria de "planta transgênica" inclui tantoum transformante primário quanto uma planta que inclui umtransformante em sua linhagem, como por exemplo, a partirde uma introgressão padrão ou através de outra técnica decruzamento.

É contemplado que, em alguns momentos, o genoma de umaplanta transgênica inventiva terá sido aumentado através daintrodução estável de um transgene. Em outros momentos,entretanto, o gene introduzido irá remover uma seqüênciaendógena. Nesse sentido, um gene preferido, de acordo com apresente invenção, é uma seqüência de DNA de sacarosesintase de origem não vegetal, particularmente obtida apartir de espécies de cianobactérias Anabaena.Construções de DNA

De acordo com um aspecto da presente invenção, umaseqüência de sacarose sintase de origem não vegetal éincorporada em uma construção de DNA que é apropriada paratransformação de plantas. Tal construção de DNA pode serusada para modificar a expressão do gene de sacarosesintase em plantas, como descrito acima.

Dessa forma, são fornecidas construções de DNAcompreendendo uma seqüência de sacarose sintase de origemnão vegetal, sob o controle de uma região operante deiniciação da transcrição em uma planta, de modo que aconstrução possa gerar RNA na célula da planta hospedeira.Preferencialmente, a região de iniciação da transcrição éparte de um promotor preferido de tecido vascular ou dexilema, tais como qualquer um dos mencionados acima.

Construções de DNA recombinantes podem ser feitasusando técnicas padrão. Por exemplo, a seqüência de DNApara transcrição pode ser obtida tratando um vetor quecontém a referida seqüência com enzimas de restrição paracortar o segmento apropriado. A seqüência de DNA paratranscrição pode também ser gerada pelo anelamento eligação de oligonucleotídeos sintéticos ou usandooligonucleotídeos sintéticos em uma reação em cadeia dapolimerase (PCR) para fornecer sítios de restriçãoadequados em cada extremidade. A seqüência de DNA então éclonada em um vetor contendo seqüências de promotoresupstream e downstream.

A expressão de vetores da invenção podem também conterseqüências de terminação, que estão posicionadas downstreamàs moléculas de ácido nucléico da invenção, de forma que atranscrição de mRNA é terminada, e seqüências poli Aadicionadas. Como exemplo de tais terminadores estão oterminador do vírus do mosaico de couve-flor (CaMV) 3 5S e o terminador do gene nopalina sintase (Tnos). O vetor deexpressão pode também conter enhancers, códons deiniciação, seqüências sinais para splicing e seqüênciasdirecionadoras.

Vetores de expressão da invenção podem também conter um marcador de seleção através do qual as células de plantatransformadas podem ser identificadas em meio de cultura. Omarcador pode estar associado com a molécula de ácidonucléico heteróloga, isto é, o gene operacionalmente ligadoa um promotor. Como usado aqui, o termo "marcador" refere- se a um gene que codifica uma característica ou um fenótipoque permite a seleção ou o rastreamento de uma planta oucélula de planta contendo o marcador. Usualmente, o genemarcador codificará resistência a antibióticos ou aherbicidas. Isto permite a seleção de células transformadas dentre células que não são transformadas ou transfectadas.

Exemplos de marcadores de seleção apropriados incluemadenosina deaminase, diidrofolato redutase, higromicina-B-fosfotransferase, timidina quinase, xantina-guanina fosfo-ribosiltransferase, resistência a glifosato e glufosinato eamino-glicosídeo 3'-O-fosfotransferase (resistências acanamicina, neomicina e G418). Estes marcadores incluemresistência ao G418, higromicina, bleomicina, canamicina egentamicina. A construção também pode conter o marcador deseleção do gene Bar que confere resistência aos análogos doherbicida fosfinotricina como o glufosinato de amônio(Thompson et al., EMBO J., 9:2519-2523, 1987). Outrosmarcadores de seleção apropriados são bem conhecidos.

Seqüências de replicação, de origem bacteriana ouviral, também podem ser incluídas para permitir que o vetorseja clonado em um hospedeiro bacteriano ou fago.Preferencialmente, é usada uma origem de replicaçãoprocariótica para uma grande amplitude de hospedeiros Ummarcador de seleção para bactéria pode ser incluído parapermitir a seleção de células bacterianas que carreguem aconstrução desejada. Marcadores de seleção procarióticosapropriados também incluem resistência aos antibióticoscomo canamicina ou tetraciclina.

Outras seqüências de DNA codificando funçõesadicionais também podem estar presentes no vetor, como éconhecido na arte. Por exemplo, quando Agrobacterium é ohospedeiro, as seqüências de T-DNA podem ser incluídas parafacilitar a subseqüente transferência e incorporação paraos cromossomos da planta.Transformação de Plantas

Construções de acordo com a invenção podem ser usadaspara transformar qualquer célula de planta, utilizandotécnicas de transformação apropriadas. Células de planta degimnosperma e angiosperma, incluindo monocotiledôneas edicotiledôneas, podem ser transformadas nas várias maneirasconhecidas na arte. Por exemplo, veja Klein et al. ,Biotechnology 4: 583-590 (1993); Bechtold et al. , C. R.Acad. Sei. Paris 316:1194-1199 (1993); Bent et al. , Mol.Gen. Genet. 204:383-396 (1986); Paszowski et al., EMBO J.3: 2717-2722 (1984); Sagi et al. , Plant Cell Rep. 13: 262-266 (1994) .

Espécies de Agrobacterium tais como A. tumefaciens ouA. rhizogenes podem ser usadas, por exemplo, de acordo comNagel et al. , Microbiol Lett 67: 325, 1990. Em resumo, ométodo ensina que Agrobacterium pode ser transformada comum vetor de expressão vegetal via, por exemplo,eletroporação, após a qual a Agrobaeterium é introduzida emcélulas de plantas via, por exemplo, o bem conhecido métododo disco foliar. Métodos adicionais para realizar istoincluem, mas não de forma limitada, eletroporação,bombardeamento de partículas, precipitação por fosfato decálcio e fusão por polietileno glicol, transferência paragrãos de pólen em germinação, transformação direta (Lorz,et al., Mol. Genet. 199: 179-182, 1985), e outros métodosconhecidos na arte. Se o marcador de seleção for empregado,tal como resistência a canamicina, torna-se mais fácildeterminar quais células foram transformadas com sucesso.

Os métodos de transformação por Agrobacteriumdiscutidos acima são conhecidos como sendo úteis paratransformar dicotiledôneas. Adicionalmente, de Ia Pena etal., Nature 325:274-276, 1987, Rodhes et al., Science 240:204-207, 1988, e Shimamato et al. , Nature 328: 274-276,198 9, todos os quais estão incorporados por referência,transformaram monocotiledôneas (cereais) usando

Agrobac terium. Veja também Bechtold, et al., C.R. Acad.Sei. Paris 316, 1994, mostrando o uso da infiltração avácuo para transformação mediada por Agrobacterium.

A presença de uma proteína, polipeptídeo ou moléculade ácido nucléico em uma célula particular pode ser medidapara determinar se, por exemplo, uma célula tenha sidotransformada ou transfectada com sucesso. A habilidade deexecução de tais ensaios é bem conhecida, e não necessitaser reiterada aqui.

Quantificando Conteúdo de Celulose e Lignina

Plantas transgênicas da presente invenção sãocaracterizadas pelo conteúdo aumentado de celulose epreferencialmente, conteúdo diminuído de lignina. Conteúdode celulose aumentado na planta modificada geneticamente épreferencialmente alcançado através do aumento da atividadeda sacarose sintase nos tecidos da planta onde ocorre adeposição de celulose. Na descrição da planta da invenção,"conteúdo de celulose aumentado" refere-se a um aumentoquantitativo na quantidade de celulose na planta quandocomparada a uma quantidade de celulose na planta nãotransformada. Um aumento quantitativo de celulose pode seranalisado por vários métodos, como por . exemplo, pelaquantificação baseada nos açúcares totais após hidróliseácida de polissacarideos no caule moído de madeira. Chiangand Sarkanen, Wood Sei. Technol., 17: 217-226 (1983);Davis, J. Wood Chem. Technol., 18: 235-252 (1988).

O conteúdo de celulose na planta modificada dainvenção pode ser aumentado a níveis de cerca de 105% acerca de 200%, preferencialmente cerca de 110% a cerca de175%, mais preferencialmente ainda cerca de 115% a cerca de150% do conteúdo de celulose da planta não transformada. Amodalidade preferida da planta da invenção possui umconteúdo de celulose de cerca de 120% a cerca de 140% doconteúdo de celulose da planta não transformada.

Devido ao fato da biossíntese aumentada de celulosepoder reduzir o conteúdo de lignina, plantas transgênicasda invenção podem ter conteúdo de celulose aumentado econteúdo de lignina reduzido. Veja Hu et al., NatureBiotechnol. 17: 808-812 (1999). Nesta descrição, portanto,as frases "conteúdo de lignina reduzido" e "conteúdo delignina diminuído" significam uma redução quantitativa naquantidade de lignina na planta, quando comparada a umaquantidade de lignina em uma planta não-transformada. Aredução quantitativa de lignina pode ser analisada porvários métodos, como por exemplo, o método de ligninaKlason (Kirk et al., Method in Enzymol. 161: 87-101 (1988))ou brometo de acetila (Iiyama et al., Wood Sei. Technol.22: 271-280 1988)).

O conteúdo de lignina na planta modificada da presenteinvenção pode ser reduzido a níveis de cerca de 5% a cercade 90%, preferencialmente cerca de 10% a cerca de 75%, maispreferencialmente cerca de 15% a cerca de 65% do conteúdode lignina de uma planta não transformada. A forma derealização preferida da planta da invenção possui umconteúdo de lignina de cerca de 20% a cerca de 60% doconteúdo de lignina da planta não transformada.

Exemplos específicos são apresentados abaixo demétodos para obtenção de genes de enzima sacarose sintasede cianobacteria, bem como para introdução do gene alvo,via Agrobacterium, para produzir plantas transformadas.Eles devem ser entendidos como exemplos e não comolimitações da presente invenção.

Exemplo 1. Isolamento de uma seqüência de DNA de sacarosesintase de Anabaena sp. PCC7120.

(a) Preparação do DNA genômico

Anabaena sp. PCC 7120 (ATCC) foi crescida em meio BG-11 sob luz fluorescente fria constante com agitaçãodelicada por uma semana ou até o meio de cultura termostrado uma coloração verde. Células de cianobacteriaforam peletizados e tratadas com 1% de Triton X-100; IOmMde Tris pH 8,0; ImM de EDTA pH 8,0 a 95 °C por 30 minutos. Omaterial lisado foi extraído duas vezes com CHCl3 e osobrenadante resultante foi usado como uma fonte deamostras de DNA genômico para as reações de PCRsubseqüentes.

(b) Projeto de iniciadores de PCR

Uma seqüência de DNA codificadora de sacarose sintasede Anabaena variabilis ATCC 29413 já foi determinada edepositada no GenBank sob número de acesso AJ292758.Baseado nesta seqüência, oligômeros de DNA foramsintetizados como iniciadores para PCR, incluindo ou aregião em torno do primeiro códon ATG ou em torno do códonde terminação da ORF principal codificadora da enzimasacarose sintase.

Iniciadores foram projetados para amplificar a regiãocodificadora inteira da ORF principal da sacarose sintase,isto é, do ATG até o códon de parada. As seqüências dosiniciadores são dadas abaixo:

Susy_s3 Tamanho: 27 SEQ ID NO: 4

ATCCATATGTCAGAATTGATGCAAGCG

Susy_as3 Tamanho: 33 SEQ ID NO: 5

TCAGATCTTACCGATATTTATGCTGTTCTAATA

(c) Amplificação por PCR

A amostra de DNA genômico obtido em (a) foi usado comomolde, e os iniciadores projetados em (b) foram usados paraPCR. As etapas de PCR envolveram 4 0 ciclos de 1 minuto a94°C, 1 minuto a 50°C, e 2 minutos a 720C seguidos de umaetapa adicional de elongação a 72 0C por 7 minutos. Osprodutos de PCR foram isolados por eletroforese em 1,0% degel de agarose, seguido por coloração por brometo de etídeodo gel de eletroforese e detecção das bandas amplificadasem um transiluminador de UV. As bandas amplificadas edetectadas foram verificadas e excisadas do gel de agarosecom uma lâmina. Os pedaços de gel foram transferidos paramicrotubos de 1,5 mL, e os fragmentos de DNA foram isoladose purificados utilizando-se o kit GFX PCR clean-up and gelband purification (Amersham). Os fragmentos de DNArecuperados foram subclonados em vetor de clonagem pGEM-T(Promega), transformados em E. colí, e então usados parapreparar DNA plasmidial da forma usual, que foi entãoseqüenciado pelo método dideoxi (Messing, Methods inEnzymol., 101, 20-78 (1983)) usando química BigDye (AppliedBiosystems), originando a seqüência de DNA descrita aquicomo SEQ ID NO: 1 para uso de acordo com as realizaçõesdescritas na presente invenção.

Exemplo 2. Síntese da seqüência de DNA com utilizaçãopreferencial de cõdons.

A síntese do gene foi executada conforme oprocedimento descrito por Yong & Dong, Nucl. Acid Res. 32:e59 (2004). Em resumo, oligonucleotídeos de 50-mer,cobrindo a toda a seqüência de DNA foram sintetizados demaneira que os iniciadores adjacentes apresentassem umasobreposição de 10 pares de base. Para sintetizar um genede sacarose sintase codificando uma enzima de sacarosesintase de Anabaenal foram desenhados 62 iniciadores,incluindo oligonucleotídeos em ambas as extremidades daseqüência para inserir sítios de restrição das enzimas NdeIe Xbal no produto final de PCR. Na primeira etapa de PCR,os iniciadores são separados em reações de alongamento, demaneira que cada reação contenha quatro iniciadoresadjacentes, incluindo dois dos iniciadores adjacentes dareação anterior. Na segunda etapa, quatro grupos de oitoreações de alongamento são reunidas e submetidas à outrareação de extensão, seguida por uma terceira reação de PCRcom iniciadores de flanqueamento para amplificar -800 paresde base, cobrindo toda a seqüência de DNA sintético. Essesquatro fragmentos são ligados por um PCR de sobreposição emuma quarta etapa de amplificação, que também incluirá ossítios de restrição de NdeI and XbaI em ambas extremidadesfinais da molécula de DNA.

Exemplo 3. Preparo de plantas transgênicas de Nicotiana

Os genes de sacarose sintase obtidos no Exemplo 1 e 2acima foram introduzidos em uma planta hospedeira paraproduzir plantas transgênicas de Nicotiana.

(a) Preparo de construções e transformação deAgrobacterium

As construções de expressão puderam ser preparadasatravés da clivagem de genes sacarose sintase obtidos nosExemplos 1 e 2 acima com enzimas de restrição apropriadasde forma a incluir toda a fase aberta de leitura e ainserir o gene no vetor de transformação de plantapALELLYX-Susy (figura 2) junto a um promotor apropriado.Por exemplo, o gene SuSy de Anabaena, obtido no exemplo 1,foi clonado no vetor de expressão mencionado previamentedownstream de um promotor preferencial para xilema do geneda tubulina (TUB) de Populus deltoides, como especificadono pedido internacional PCT No. PCT/BR2005/000041,depositado em 28 de março de 2005 (Figura 3) .Alternativamente, o gene de sacarose sintase de Anabaenacom códons modificados obtido no exemplo 2, foi clonado novetor de expressão mencionado previamente downstream de umpromotor preferencial para xilema do gene da tubulina (TUB)de Populus deltoides descrito acima (figura 4) . Aconstrução de expressão resultante foi amplificada em E.coli, e então transformada em Agrobacterium tumef adenscepa LBA4404 por congelamento-descongelamento ("freezethawing").

(b) Transformação de Nicotiana benthamiana mediada porAgrobacterium

Transformação de Nicotiana sp. foi realizadautilizando o método do disco-foliar de Horsch et al.,Science 227: 1229 (1985), usando uma construção de DNAcompreendendo o gene da sacarose sintase nativa de Anabaenaou o gene sintético com o códon modificado obtido em (a)operacionalmente ligado ao promotor TUB de um gene xilema-preferido. Os transformantes foram selecionados através docrescimento em meio de Murashige e Skoog (Sigma, St. Louis,Mo.) contendo 100 miligramas/litro de herbicida BASTA e 500mg/L de carbenicilina (Sigma). As gemas transformadas deNicotiana foram enraizadas em meio de Murashige e Skoog, esubseqüentemente transferidas para solo e crescidas na casade vegetação.

(c) Verificação da inserção de genes exógenos nogenoma da planta hospedeira por PCR

PCR pode ser usado para verificar a integração daconstrução no genoma de plantas transgênicas. Doisiniciadores específicos foram sintetizados com base naconstrução e usados para amplificar por PCR a construçãocorrespondente do DNA genômico de transformantes deNicotiana. Para a construção que contém a ORF principal desacarose sintase de Anabaena sob controle do promotor dogene da tubulina de Populus, preferencial para xilema, doisiniciadores específicos foram sintetizados:

Susy_seq3 Tamanho: 20 SEQ ID NO.: 6

CAAGAATTGCAAGAACGTTG

Susy_as3 Tamanho: 33 SEQ ID NO: 5

TCAGATCTTACCGATATTTATGCTGTTCTAATA

Para a construção que contém um gene sintético desacarose sintase de Anabaena SP com códons modificados sobcontrole do promotor do gene da tubulina de Populus,preferencial para xilema, dois iniciadores específicosforam sintetizados:

SUSY_CU_RT 1 Tamanho: 28 SEQ ID NO. : 7

CTAGGCTCGATAGGATCAAGAACCTCAC

SUSY_CU_RT2 Tamanho: 28 SEQ ID NO. : 8GATAGCCTTCTCAGAGATGATGTTCCAG

A mistura de reação de PCR continha 100 ng de DNAgenômico da planta transformada, e 0,2 μΜ de cadainiciador, 100 μΜ de cada deoxirribonucleotídeo trifosfato,1 χ tampão de PCR e 2,5 unidades de AmpliTaq DNA polimerase(Applied Biosystems) em um volume total de 50 μΐ. Osparâmetros de ciclos foram como se segue: 94 0C por 1minuto, 500C por 1 minuto e 720C por 3 minutos, por 40ciclos, com 5 minutos de extensão a 72 °C. Os produtos dePCR foram submetidos à eletroforese em um gel de agarose1%.

(d) Determinação do nível de expressão do transgene emplantas transgênicas

RT-PCR semi-quantitativo foi usado para detectar oacúmulo de transcritos de sacarose sintase de Anabaena emtecido caulinar de plantas transgênicas. O RNA total foiisolado de caules retirados de plantas transgênicas Tl deNicotiana de 3 meses de idade usando o método CTAB (Aldriche Cullis (1993) Plant Mol. Biol. Report. 11: 128-141).

O cDNA foi sintetizado a partir de 500 ng de RNA totalusando Superscript II RNase H-RT (Invitrogen, USA) . Osiniciadores descritos acima foram utilizados cominiciadores que codificam constitutivamente o gene paragliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (GAPDH), como umcontrole interno para normalizar a quantidade de RNA totalusado em cada amostra. PCR foi feito com uma diluição de12,5 vezes da primeira fita de cDNA sob as seguintescondições: 94°C por 3 minutos e 27 ciclos a 94°C por 1minuto, 52 a 60°C por 45 segundos, e 72°C por 1 minuto e 30segundos.

Exemplo 4. Análise Histoquímica de Plantas Transgênicas

Em resumo, caules de Nicotiana transgênica e plantascontrole foram seccionados e fixados em 4% deparaformaIdeido por 24 horas. Os tecidos fixados foramdepois seccionados em um micrótomo (Leica RM2255) esubseqüentemente foram corados com azul de Astra/safranina.As secções histológicas coradas foram observadas emmicroscópio invertido Leica DMlL usando campo de iluminaçãoclaro-escuro.

Exemplo 5. Alimento do conteúdo de celulose em plantastransgênicas superexpressando sacarose sintase em tecidovascular

Os caules principais de cinco eventos transgênicos deNicotiana transformadas com a construção que compreende ogene da sacarose sintase nativo de Anabaena sp. sobcontrole do promotor do gene da tubulina de Populusdeltoides, preferencial para xilema e de plantas controlenão transgênicas foram coletadas e secas ao ar livre porduas semanas. Os caules secos foram cortados em pedaços epulverizados em um moinho de faca, com peneira de 30"mesh". As amostras do pó de caule foram depois submetidasà análises químicas para determinação do conteúdo decelulose e lignina. Em resumo, o conteúdo de celulose ehemicelulose foram determinados com base nos açúcarestotais após a hidrolise ácida destes polissacarideos nocaule da madeira. A madeira molda foi seca a vácuo à 4 50C ehidrolisado com H2SO4. Utilizando cromatografia de trocaiônica, glucanas e outros polissacarideos (hemiceluloses)foram quantificados baseados na composição do hidrolisado.Chiang & Sarkanen, IVood Sei. Technol. 17: 217-226 (1983);Davis, J. Wood Chem. Technol. 18: 235-252 (1988).

Dois dos eventos transgênicos, conhecidos porexpressar o transgene de acordo com o procedimentodetalhado no Exemplo 3, mostraram um aumentoestatisticamente significante no conteúdo de celulose(Figura 5) . 0 evento transgênico 25 exibe 54% de celuloseem comparação a 4 8,6% em plantas controle, representando umaumento significante de 11% no conteúdo de celulose(P<0,01; teste t) . 0 evento transgênico 53 exibe 52% decelulose em comparação a 48,6% em plantas controle,representando um aumento no conteúdo de celulose de 7%(Figura 5; P<0,01; teste t). Adicionalmente, o eventotransgênico 25 exibiu uma diminuição significante noconteúdo de lignina (19,15% em comparação a 23,3% emplantas controle; P<0,001; teste t), como analisado pelométodo gravimétrico de Klason.

Cinco dos onze eventos transgênicos TO, transformadoscom a construção que compreende um gene de sacarose sintasede Anabaena sp. , com os códons modificados, mostraram umaumento significante estatisticamente no conteúdo decelulose. Os eventos transgênicos BI092-51A, BI092-11C,BI092-13B, BI092-29B e BI092-16A exibiram um aumentosignificante no conteúdo de celulose quando comparado aovalor médio de plantas controle (P<0,05; teste t) (Figura6). Por exemplo, o evento trangênico BI092-51A exibe 55,28%de celulose em comparação a 51,7% em plantas controle nãotransgênicas, representando um aumento significante deaproximadamente 7% no conteúdo de celulose.

Apôs atingida a maturidade, os eventos TO com o genede sacarose sintase de Anabaena sp., com códons modificadosforam auto-polinizados para geração de linhagens TI.Plantas que são homozigotas dominantes apresentaram umaumento significante de 7% no conteúdo de celulose (P<0,05,teste t) , quando comparadas às plantas homozigotasrecessivas (Figura 7).

Várias modificações e alterações desta invençãotornar-se-ão aparentes para aqueles versados na técnica semsair do escopo e o espírito desta invenção, e deve serentendido que esta invenção não deve ser limitada àsilustrações aqui especificadas.

Claims (19)

1. Planta transgênica compreendendo uma molécula deácido nucléico de sacarose sintase de origem não vegetalcaracterizado pelo fato de que a dita planta possui oconteúdo de celulose alterado comparado com uma planta nãotransgênica sem a dita molécula.

2. Planta transgênica, de acordo com a reivindicação-1, caracterizado pelo fato de ser obtida pela transformaçãoda planta com um vetor de expressão compreendendo a ditamolécula de ácido nucléico da sacarose sintase de origemnão vegetal, sob o controle de um promotor capaz defuncionar na planta.

3. Planta transgênica, de acordo com a reivindicação-1, caracterizado pelo fato da dita molécula de ácidonucléico ser:a. uma seqüência de nucleotídeos compreendendo o SEQID No: 1 OU 2; OUb. uma seqüência de (a) com uma ou mais basesexcluídas, substituídas, inseridas ou adicionadas.

4. Planta transgênica, de acordo com a reivindicação-1, caracterizado pelo fato da dita planta ter conteúdo decelulose aumentado.

5. Planta transgênica, de acordo com a reivindicação-1, caracterizado pelo fato da dita planta ter conteúdo deLignina diminuído.

6. Planta transgênica, de acordo com a reivindicação-1, caracterizado pelo fato da dita planta ser umadicotiledônea.

7. Planta transgênica, de acordo com a reivindicação-1, caracterizado pelo fato da dita planta ser umamonocotiledônea.

8. Planta transgênica, de acordo com a reivindicação-1, caracterizado pelo fato da dita planta ser umagimnospema.

9. Planta transgênica, de acordo com a reivindicação-1, caracterizado pelo fato da dita planta ser uma árvorelenhosa.

10. Planta transgênica, de acordo com a reivindicação-9, caracterizado pelo fato da dita árvore lenhosa ser umaplanta de Eucalyptus.

11. Planta transgênica, de acordo com a reivindicação-9, caracterizado pelo fato da dita árvore lenhosa ser umaplanta de Populus.

12. Planta transgênica, de acordo com a reivindicação-9, caracterizado pelo fato da dita árvore lenhosa ser umaplanta de Pinus.

13. Parte de planta transgênica, de acordo com areivindicação 1, caracterizada pelo fato de ser selecionadade um grupo consistindo de uma folha, um caule, uma flor,um ovário, um fruto, uma semente ou um calo;

14. Método para produzir uma planta transgênica comconteúdo aumentado de celulose quando comparado com umaplanta não transgênica caracterizado pelo fato decompreender (i)transformar uma célula de planta com umaseqüência de sacarose sintase de origem não vegetal sob ocontrole de um promotor capaz de funcionar na planta, (ii)cultivar a dita célula de planta transformada sob condiçõesque promovam o crescimento da planta e (iii)selecionar aplanta transgênica que exibe conteúdo de celuloseaumentado.

15. Método, de acordo com a reivindicação 14,caracterizado pelo fato da seqüência de nucleotídeo ser umgene da sacarose sintase compreendendo:a. uma seqüência de nucleotídeos compreendendo o SEQID No: 1 ou 2; OUb. uma seqüência de (a) com uma ou mais basesexcluídas, substituídas, inseridas ou adicionadas.

16. Método, de acordo com a reivindicação 15,caracterizado pelo fato da dita planta ser umadicotiledônea.

17. Método, de acordo com a reivindicação 15,caracterizado pelo fato da dita planta ser umamonocotiledônea.

18. Método, de acordo com a reivindicação 15,caracterizado pelo fato da dita planta ser uma gimnosperma.

19. Seqüência de polinucleotídeo isoladacaracterizado pelo fato de compreender uma seqüência deácido nucléico que codifica um polipeptídeo que é capaz deaumentar os níveis de sacarose sintase e de celulose naplanta.