BRPI0612103A2

BRPI0612103A2 - uso de um polipeptìdeo ou um derivado ou análogo do mesmo, e, método de prevenção e/ou tratamento de uma contaminação fúngica e/ou por protista

Info

Publication number: BRPI0612103A2
Application number: BRPI0612103-9A
Authority: BR
Inventors: Curtis Dobson
Original assignee: Ai2 Ltd
Priority date: 2005-06-28
Filing date: 2006-06-26
Publication date: 2011-12-20
Also published as: HK1113162A1; US20150190462A1; AU2006263600B2; US8916516B2; CA2610720A1; GB0513096D0; EP1896502B1; PL1896502T3; DK1896502T3; WO2007000584A8; WO2007000584A1; US20080207508A1; JP2008546831A; ES2427171T3; EP1896502A1; KR20080030060A; US20120258907A1; RU2008102928A; CN101208355A; KR20110099069A

Abstract

USO DE UM POLIPEPTìDEO OU UM DERIVADO OU ANáLOGO DO MESMO, E, MéTODO DE PREVENçãO E/OU TRATAMENTO DE UMA CONTAMINAçãO FúNGICA E/OU POR PROTISTA. A presente invenção se refere ao uso de polipeptídeos compreendendo repetições de um peptídeo derivado de uma região de ligação ao receptor de Proteoglicana de Sulfato de Heparana (HSPG) de uma apolipoproteina para o tratamento ou prevenção de uma infecção fúngica ou por protista. A invenção ainda se refere ao uso de tais peptídeos para o tratamento ou prevenção da contaminação de superficies ou objetos com tais peptídeos.

Description

"USO DE UM POLIPEPTÍDEO OU UM DERIVADO OU ANÁLOGO DO MESMO, E, MÉTODO DE PREVENÇÃO E/OU TRATAMENTO DE UMA CONTAMINAÇÃO FÚNGICA E/OU POR PROTISTA"

A presente invenção se refere a polipeptídeos, derivados ou análogos dos mesmos com atividade antimicrobiana e a ácidos nucleicos que codificam os mesmos. Mais especificamente, a invenção se refere a polipeptídeos, derivados ou análogos dos mesmos com atividade anti-fungica e/ou anti-protista. A invenção ainda proporciona o uso de tais polipeptídeos, derivados, análogos ou ácidos nucleicos como medicamentos e também em métodos de tratamento. A invenção ainda se estende a objetos e superfícies revestidas com os polipeptídeos.

Peptídeos antimicrobianos são um componente chave do sistema imune inato, geralmente contendo 20-40 aminoácidos, tendo uma carga líquida positiva e com a maioria tendo sido identificada até o momento em espécies de não-mamíferos. Ambos esses fatores limitam sua utilidade como produtos terapêuticos em seres humanos ou mamíferos. Isso é em virtude de dificuldades na produção comercial de tais peptídeos grandes e do risco de efeitos adversos de peptídeos de origem não-humana. Em 2006, em torno das 890 seqüências listadas no banco de dados internacional de peptídeo antimicrobiano Trieste fhttp://www.bbcm.units.it/~tossi/amsdb.html), somente 35 eram de origem humana e, dessas, apenas 3 têm menos de 20 aminoácidos de comprimento. Alguns peptídeos antimicrobianos sintéticos curtos também foram desenvolvidos. Contudo, esses têm a desvantagem dos riscos associados de efeitos antigênicos ou tóxicos em virtude de sua origem não humana.

Tais peptídeos foram caracterizados em seis grupos (Bradshaw, J.P., Biodrugs, 2003: 17: 235-240), com as seguintes três classes sendo mais estudadas (Bowman H.G., Journal of Internai Medicine, 2003: 254:197-215):

(i) peptídeos lineares carecendo de cisteínas e freqüentemente com uma estrutura anfifática α-helicoidal em solução, por exemplo, LL-37 humana (SEQ ID No 1): - LLGDFFRKSKEKIGKEFKRI VQRIKDFLRN LVPRTES;

(ii) peptídeos com 3 ligações de dissulfeto, proporcionando peptídeos com uma beta-folha dimérica plana, por exemplo, a-defensina humana: - HNP-I (SEQ ID No. 2)

<formula>formula see original document page 3</formula>

(iii) peptídeos com tendências incomuns em determinados aminoácidos, tais como prolina, arginina, triptofano ou histidina, por exemplo, PR-39 de Porco (SEQ ID No. 3): - RRRPRPPYLP RPRPPPFFPP RLPPRIPPGF PPRFPPRFP; ou indolicidina de vaca (SEQ ID No. 4): - ILPWKWPWWP WRR.

Descobriu-se que alguns peptídeos têm a capacidade de inibir o crescimento de fungos. Exemplos de tais peptídeos incluem Cecropinas, Buforinas, Pleuoridina, Pirrocoricina, metalnikowina, sheperinas, AcAMPl e Ac-AMP2, Histatinas, Taquiplesina II, Androctonina, Protegrina I, α Defensinas e β Defensinas, Penaeidinas, Taquicitina, Heliomicina, proteína WTl de defensina WTl, defensina alfAFP, So-dl-7, DmAMPl. Além disso, descobriu-se que alguns peptídeos inibem, adicionalmente, protozoários (por exemplo, Megainina e dermaseptina). Foi mostrado que outros inibem fungos e protozoários (por exemplo, Gambicina). Contudo, no momento, o mecanismo de tais agentes para conferir suas atividade anti-füngicas e/ou anti-protozoários não é totalmente compreendido.

Uma série de peptídeos antibacterianos que foram descritos na literatura científica têm um forte caráter catiônico e, freqüentemente, consistem de resíduos de arginina e lisina. Contudo, nem todos os peptídeos contendo arginina e lisina têm atividade antimicrobiana. Por exemplo, Azuma e colaboradores (Peptides, 21: 327-330 (2000)) reportaram que derivados peptídicos de apolipoproteína E têm forte ação antibacteriana, comparável com aquela da gentamicina. Contudo, o peptídeo apoEi34.15i de Azuma (18 aminoácidos de comprimento) não tem atividade em geral, a despeito de conter argininas em ambas as posições 142 e 147. Similarmente, Azuma demonstrou que o peptídeo apoEi34.i55 (22 aminoácidos de comprimento) tinha atividade antibacteriana muito baixa e o peptídeo apoE134-151 (26 aminoácidos de comprimento) tinha atividade antibacteriana grandemente reduzida. Finalmente, Azuma e colaboradores investigaram apenas a atividade antibacteriana dos peptídeos apoE-derivados e não avaliaram quaisquer outros efeitos antimicrobianos, por exemplo, atividade contra fungos ou protistas.

Após a pesquisa realizada por Azuma e colaboradores, o inventor da presente invenção investigou a ação de determinados polipeptídeos baseados em apolipoproteínas BeE contra vírus. O inventor estabeleceu que determinados polipeptídeos têm atividade antiviral. Os resultados de sua pesquisa são descritos no PCT/GB2004/005438 e PCT/GB2004/005360. Esses polipeptídeos antivirais compreendem repetições aleatórias, e variantes das mesmas, dos peptídeos: apoEi41.i49 (LRKLRKRLL - SEQ ID No. 5) e apoB3359-3367 (RLTRKRGLK - SEQ ID No. 6), bem como repetições de modificações intimamente relacionadas de SEQ ID No. 5 ou SEQ ID No. 6. Esses peptídeos são derivados de ou compreendem a região de ligação do receptor de LDL / receptor de HSPG das apolipoproteínas EeB.

Embora o inventor não deseje estar preso a qualquer hipótese, ele considera, provavelmente, que esses polipeptídeos antivirais exercem suas ações antivirais através de uma série de mecanismos, com aqueles que afetam a fixação viral sendo particularmente favorecidos. O inventor sugere que dimerização de peptídeos derivados da região de ligação do receptor de LDL / receptor de HSPG dessas apolipoproteínas (como uma repetição em tandem ou variantes da mesma) é importante para um efeito antiviral.

A despeito do fato de que agentes antivirais não são relacionados a agentes antibacterianos em virtude de seus diferentes modos de ação sobre vírus e bactérias, respectivamente, o inventor também decidiu investigar se polipeptídeos baseados nos peptídeos virais discutidos acima também tinham propriedades antibacterianas. Os resultados dessa pesquisa são descritos no PCT/GB2005/000769. Para sua surpresa, o inventor descobriu que, alem de atividade antiviral, esses polipeptídeos também exibiram atividade antibacteriana.

O inventor da presente invenção continuou suas investigações sobre esses polipeptídeos baseado em apolipoproteínas BeE. conseqüentemente, a despeito do fato de que agentes antivirais e agentes antibacterianos não são relacionados a agentes anti-fungicos e agentes que exibem atividade com relação a outros microorganismos, em virtude de seus diferentes modos de ação sobre vírus, bactérias e fungos, respectivamente, o inventor da presente invenção também decidiu investigar se polipeptídeos baseados nos peptídeos antivirais/antibacterianos discutidos acima tinham quaisquer propriedades anti-fungicas ou exibiam qualquer atividade contra quaisquer outros microorganismos.

Especificamente, o inventor se perguntou se a construção de uma repetição (por exemplo, repetições aleatórias) de peptídeos derivados da região de ligação do receptor de LDL / receptor de HSPG dessas apolipoproteínas podem ter outros efeitos antimicrobianos, por exemplo, contra fungos ou outros microorganismos, tais como protozoários. Em particular, o inventor se perguntou se repetições da região apoEi4i.149 poderiam, inesperadamente, exibir atividade anti-fungica e/ou anti-protista. Para sua surpresa, ele descobriu que polipeptídeos, conforme definido abaixo, exibem atividade anti-fungica e também contra outros microorganismos, além das atividade antivirais e antibacterianas, as quais tinham sido demonstradas anteriormente.

De acordo com um primeiro aspecto da invenção, é proporcionado uso de um polipeptídeo ou um derivado ou análogo do mesmo compreendendo repetições de um peptídeo derivado de uma região de ligação do receptor de Proteoglicana de Sulfato de Heparana (HSPG) de uma apolipoproteína para a fabricação de um medicamento para o tratamento de uma infecção fungica e/ou por protista.

Pelo termo "derivado ou análogo do mesmo", entenda-se um polipeptídeo dentro do qual os resíduos de aminoácido são substituídos por resíduos (quer aminoácidos naturais, aminoácidos não naturais ou mímicos de aminoácido) com cadeias laterais ou propriedades da parte principal do peptídeo similares. Adicionalmente, um ou ambos os términos de tais polipeptídeos podem ser protegidos por grupos de proteção N- e C-terminal, por exemplo, grupos com propriedades similares a grupos acetila ou amida. Será apreciado que a seqüência de aminoácido pode ser variada, truncada ou modificada uma vez que o polipeptídeo final é formado ou durante o desenvolvimento dos peptídeos repetidos (por exemplo, a 9-mer).

De preferência, o polipeptídeo da invenção compreende pelo menos duas repetições de um peptídeo derivado de uma região de ligação do receptor de HSPG de uma apolipoproteína. Será apreciado que o polipeptídeo pode compreender repetições do mesmo peptídeo (isto é, um homodímero ou polímero do mesmo peptídeo). Alternativamente, o polipeptídeo pode compreender uma repetição de dois ou mais peptídeos relacionados (isto é, um heterodímero ou um polímero compreendendo dois ou mais tipos de peptídeo de monômero peptídico). Se o polipeptídeo compreende diferentes peptídeos, será apreciado que tais peptídeos compartilharão as características que eles tem ou derivaram de uma região de ligação do receptor de HSPG de uma apolipoproteína, conforme definido no primeiro aspecto da invenção. É preferido que os polipeptídeos de acordo com a invenção compreendam dímeros ou polímeros de tais peptídeos ligados N terminal a C terminal de um modo que seria conhecido por aqueles habilitados na técnica como uma repetição em tandem. Conseqüentemente, a menos que o contexto oriente de outro modo, quando nós nos referimos à "repetições aleatórias" aqui, entenda-se uma repetição de peptídeos que são, ou são derivados de, uma região de ligação do receptor de HSPG de uma apolipoproteína. Tais repetições aleatórias podem ser homodímeros (ou polímeros de um único peptídeo) ou podem compreender um heterodímero (ou polímero de peptídeos relacionados), conforme discutido acima.

O termo "peptídeos derivados de", conforme usado aqui, se destina a descrever ou incluir peptídeos da região de ligação do receptor de HSPG de uma apolipoproteína que foram modificados. Modificação adequada pode incluir substituição, adição ou deleção de aminoácido. O peptídeo derivado ou peptídeo modificado está disposto como uma repetição em tandem de acordo com o primeiro aspecto da invenção. Surpreendentemente, e completamente contrário à expectativa, foi mostrado que polipeptídeos, derivados ou análogos dos mesmos de acordo com o primeiro aspecto da invenção, exibem atividade anti-fungica e/ou anti-protista.

Quando o termo "um truncamento do mesmo" é usado aqui, entenda-se que o polipeptídeo de acordo com a invenção ou o peptídeo constituinte tem um tamanho reduzido através de remoção ou deleção de um ou mais aminoácidos. A redução de aminoácidos pode ser através de remoção de resíduos do C ou N término do polipeptídeo ou pode ser através de deleção de um ou mais aminoácidos de dentro dos peptídeos constituintes.

Os inventores descobriram anteriormente que polipeptídeos, conforme definido acima, têm atividade antiviral e antibacteriana. Contudo, para surpresa dos inventores, quando os polipeptídeos de acordo com o primeiro aspecto foram testados sobre fungos e protistas, eles também mostraram eficácia anti-füngica e também atividade contra protistas, conforme mostrado nos Exemplos. Conseqüentemente, os inventores acreditam que, portanto, eles mostram uma nova indicação médica para esses polipeptídeos.

O medicamento de acordo com o primeiro aspecto da invenção pode ser usado no tratamento médico de seres humanos ou para uso veterinário. O medicamento é, de preferência, usado para tratar infecções fungicas de seres humanos ou outros mamíferos.

O polipeptídeo usado para prevenir ou tratar infecções fungicas e/ou por protistas é, de preferência, derivado da mesma espécie que o indivíduo que está sendo tratado. Quando esse indivíduo é um ser humano, é preferido que o polipeptídeo seja baseado em repetições derivadas de apolipoproteínas humanas.

Pelo termo "infecção füngica", entenda-se uma infecção com, ou causada por, um fungo. Infecções que podem ser tratadas incluem: blastomicose, coccidiodomicose, criptococcose, histoplasmose, esporotricose, cromoblastomicose, lobomicose, dermatofitose, dermatomicose, onichomicose, piedra, micetoma, fusariose, pitiríase versicolor, tinea barbae, tinea capitis, tinea corporis, tinea cruris, tinea favosa, tinea nigra, tinea pedis, faeohipomicose, rinosporidiose, aspergilose, queratite micótica, candidíase.

Pelo termo "infecção protista" entenda-se uma infecção com, ou causada por, um protista. Doenças causadas por infecção com Protista incluem giardíase e outros distúrbios gastrintestinais, incluindo desinteria e diarréia amébica, leishmaníase cutânea e visceral, doença de Chagas, coccidiose, icterícia, tricomaníase, doença do sono Africana, marés vermelhas, toxoplasmose, malaria e queratite microbiana, incluindo queratite por Acanthamoeba.

Em geral, agentes antivirais, tais como acyclovir, ribavirina ou enfuvirtida (T-20), raramente são úteis contra infecções fungicas em virtude de seus modos completamente diferentes de ação. Similarmente, agentes anti- fungicos, tais como Butenafina, Butoconazola ou Naftifme, raramente são úteis contra infecções virais. Conseqüentemente, o inventor da presente invenção ficou muito surpreso pelo fato de os polipeptídeos de acordo com o primeiro aspecto da invenção mostrarem eficácia antiviral e antibacteriana e também atividade contra infecções füngicas e/ou por protistas. Era completamente inesperado que os peptídeos de acordo com a invenção tivessem atividade através de dos Reinos, isto é, atividade no Reino Monera (bactérias e vírus) e no Reino Fungi e também no Reino Protista. O inventor ficou surpreso pelo fato de os peptídeos de acordo com a invenção terem tal versatilidade e tal ampla faixa de atividade, uma vez que isso muito raramente ocorre.

Embora o inventor não deseje estar ligado a qualquer hipótese, ele sugeriu que o mecanismo de ação anti-fúngico/anti-protista pelos polipeptídeos de acordo com a invenção pode envolver um efeito de danificação direto ao fungo ou protista, quer mediado através da membrana ou através de objetivação de um local dentro do fungo ou protista. Além disso, bloqueio de fixação ou entrada de parasitas intracelulares (por exemplo, Plasmodium) em células hospedeiras também possível. Possivelmente, é por essas razões que descobriu-se que apenas um número surpreendentemente pequeno de seqüências peptídicas (isto é, aquelas definidas pelo primeiro aspecto da invenção) é eficaz contra fungos e/ou protistas.

A maioria dos polipeptídeos de acordo com a invenção eram surpreendentemente ativos como agentes anti-fungicos e/ou anti-protistas e também agentes antivirais e agentes antibacterianos. E possível que, em algumas modalidades da invenção, os peptídeos possam exibir combinações das atividades antimicrobianas acima. Por exemplo, os peptídeos podem exibir atividade anti-füngica ou anti-protista (e várias combinações de atividade antibacteriana e antiviral). Polipeptídeos preferidos de acordo com o primeiro aspecto exibem atividade anti-fungica e anti-protista e, além disso, atividade antibacteriana e/ou atividade antiviral. Será evidente que essa atividade quádrupla exibida pelos polipeptídeos é mais vantajosa, uma vez que eles podem ser usados para prevenir ou tratadas infecções fungicas, infecções por protista e também infecções virais e bacterianas, de preferência, de modo simultâneo.

Os polipeptídeos de acordo com o primeiro aspecto da invenção podem compreender repetições de peptídeos derivados de uma região de ligação ao receptor de Proteoglicana de Sulfato de Heparana (HSPG) de apolipoproteína B humana ou apolipoproteína E humana. É preferido que o polipeptídeo de acordo com o primeiro aspecto da invenção compreenda uma repetição em tandem (conforme definido acima) de peptídeos derivados de uma grupamento B de domínio de ligação ao receptor de LDL de apolipoproteína B, conforme definido por Law e Scott (J. Lipid Res. 1990, 31: 1109- 20) ou, alternativamente, de um grupamento B de domínio de ligação ao receptor de LDL de apolipoproteína E (J. Lipid Res. 1995, 36: 1905-1918). O grupamento B de domínio de ligação ao receptor de LDL de apolipoproteína B pode estar localizado dentro de uma região de ligação do receptor de HSPG de apolipoproteína Beo grupamento B de domínio de ligação ao receptor de LDL de apolipoproteína E pode estar localizado dentro de uma região de ligação do receptor de HSPG de apolipoproteína E.

O inventor conduziu experimentos exaustivos para avaliar a atividade anti-fungica e anti-protista de peptídeos de apolipoproteínas e derivados dos mesmos. Peptídeos e derivados de ApoE e ApoB foram um foco particular. O inventor descobriu que a seqüência monomérica apoE141.i49 (veja Tabela 1 e SEQ ID No. 5); a apoB3359.3367 (veja Tabela 1 e SEQ ID No. 6) e a apoB3359.3367 modificada (veja Tabela 1 e SEQ ID No. 7) não tinham atividade anti-fungica detectável. Contudo, surpreendentemente, o inventor descobriu que repetições de tais peptídeos (isto é, polipeptídeos de acordo com o primeiro aspecto da presente invenção) exibem atividade anti-fungica e/ou anti-protista. Os Exemplos 1 e 4 ilustram a eficácia anti-fungica dos polipeptídeos de acordo com a invenção e os Exemplos 2 e 5 ilustram a atividade anti-protista dos polipeptídeos de acordo com a invenção.

Embora o inventor não deseje estar preso a qualquer hipótese, o inventor acredita que os resíduos de aminoácido catiônicos nos peptídeos apoEui.149 (baseados em SEQ ID No. 5) e peptídeos apoB3359.3367 (baseados em SEQ ID No. 6) e peptídeos apoB3359_3367 modificados (baseado em SEQ ID No. 7), quando na forma de repetições aleatórias, permitem que atividade anti-fungica e atividade anti-protista ocorram. O inventor também estabeleceu que determinados derivados desses peptídeos também têm atividade anti- fungica e/ou anti-protista, incluindo modificações e truncamentos das seqüências peptídicas.

O inventor realizou algumas análises detalhadas de polipeptídeos com atividade anti-fungica e anti-protista e, em particular, aqueles baseados em repetições de peptídeos derivados da região de ligação ao receptor de Proteoglicana de Sulfato de Heparana (HSPG) de apolipoproteína B ou apolipoproteína Ε. O inventor produziu um alinhamento de seqüência entre os aminoácidos de apoE141.i49 (isto é, a 9-mer de SEQ ID No. 5), alinhado com os aminoácidos de apoEi4i.i49 (isto é, a 9-mer de SEQ ID No. 5) e também a forma modificada de apoB3359_3367 (isto é, a 9-mer de SEQ ID No. 7). Os alinhamentos de seqüência são mostrados na Tabela 1. Será apreciado que essas três 9-mers, ou derivados das mesmas, são repetidas nos polipeptídeos de acordo com a presente invenção para formar pelo menos uma 18-mer, a qual pode ser opcionalmente truncada.

Tabela 1: Análise de seqüências peptídicas eficazes exibindo propriedades anti-fungicas/anti-protistas <table>table see original document page 12</column></row><table>

A luz desses dados de alinhamento, o inventor percebeu que há um motivo de aminoácido recorrente (conservado) em cada um dos polipeptídeos anti-fungicos compreendendo repetições aleatórias de um peptídeo derivado de uma região de ligação ao receptor de Proteoglicana de Sulfato de Heparana (HSPG) de apolipoproteína B (apoB3359_3367 (SEQ ID No. 6)) ou da apolipoproteína B modificada (apoB3359_3367 (SEQ ID No. 7)) ou apolipoproteína E (apoE14i.i49 (SEQ ID No. 5)) ou um truncamento da mesma. Esse motivo corresponde a um tripeptídeo: Arginina-Lisina-Arginina (RKR), o qual é encontrado nos resíduos de aminoácido designados: 4, 5, 6 de SEQ ID. No. 5 e SEQ ID No. 7 e SEQ ID No. 6. O inventor percebeu que todos os polipeptídeos de acordo com a invenção exibindo atividade anti-fungica e/ou anti-protista compreendem esses motivos RKR.

Portanto, é especialmente preferido que o polipeptídeo de acordo com a invenção compreenda pelo menos dois motivos RKR (isto é, o polipeptídeo compreende uma repetição em tandem de peptídeos compreendendo motivos RKR).

Será apreciado que os polipeptídeos de acordo com a presente invenção compreendem pelo menos dois ou mais motivos RKR (isto é, um motivo RKR por repetição). Em situações onde o polipeptídeo compreende uma repetição trimérica (3x) ou repetição tetramérica (4x) ou mesmo um número maior de repetições, o polipeptídeo compreende, de preferência, pelo menos três ou pelo menos quatro motivos RKR, respectivamente.

Peptídeos preferidos compreendem dois motivos RKR e consistem de 18 aminoácidos ou menos. Em uma modalidade da invenção, o polipeptídeo de acordo com o primeiro aspecto pode compreender uma repetição dimérica do peptídeo compreendendo o motivo RKR e, de preferência, tem a fórmula I:

{abcRKRxyz} + {^bVRKRxyz'}

em que a, b, c, a', b', c', x, y, z, x', y', z1 são resíduos de aminoácido e em que o polipeptídeo compreende o peptídeo abcRKRxyz e o peptídeo aVc'RKRxyz', os quais são repetições de SEQ ID No. 5, SEQ ID No. 6 ou SEQ ID No. 7 e derivados dos mesmos. Tais derivados podem compreender SEQ ID No. 5, SEQ ID No. 6 ou SEQ ID No. 7, em que pelo menos um resíduo de aminoácido desse peptídeo, outro que não os motivos RKR, podem ser substituídos por uma Arginina (R), Tirosina (Y), Metionina (M), Isoleucina (I), Fenilalanina (F), Triptofano (W), Cisteína (C) ou um derivado dos mesmos. O peptídeo também pode compreender uma substituição de Histidina (H).

É preferido que as substituições de aminoácido sejam por um resíduo de Arginina (R), Fenilalanina (F) ou Triptofano (W) e, mais preferivelmente, um resíduo de Triptofano (W) ou um derivado do mesmo.

Adequadamente, um ou mais, mais adequadamente dois ou mais e, ainda mais adequadamente, três ou mais resíduos de aminoácido podem ser substituídos por uma Arginina (R), Tirosina (Y), Metionina (M), Isoleucina (I), Fenilalanina (F), Triptofano (W), Cisteína (C) ou um derivado dos mesmos. Em uma modalidade da invenção, é preferido que quatro ou mais, mais preferivelmente cinco ou mais e, ainda mais preferivelmente, seis ou mais resíduos de aminoácido do polipeptídeo de acordo com o primeiro aspecto da invenção possa ser substituído por esses aminoácidos ou um derivado dos mesmos. De preferência, o resíduo substituído ou trocado é o primeiro, segundo, terceiro, sétimo, oitavo, nono, décimo, décimo primeiro, décimo segundo, décimo sexto, décimo sétimo ou décimo oitavo resíduo do peptídeo definido pela fórmula I. O polipeptídeo de acordo com a invenção pode compreender 18 aminoácidos (ou derivados dos mesmos) e, desse modo, corresponder à seqüência definida pela fórmula I com ou sem as substituições discutidas acima. Nesse caso, a posição de aminoácido 1 corresponde a a; a posição 2 corresponde a b; a posição 3 corresponde a c; a posição 4 corresponde ao aminoácido R (do motivo RKR) e assim por diante.

Contudo, o inventor descobriu, surpreendentemente, que polipeptídeos truncados baseado na fórmula I também têm eficácia como agentes anti-füngicos e/ou agentes anti-protistas. Conseqüentemente, polipeptídeos preferidos ou derivados dos mesmos podem ter menos de 18 aminoácidos. Por exemplo, alguns polipeptídeos de acordo com o primeiro aspecto da invenção podem ter 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10 aminoácidos de comprimento. Deleções são, de preferência, feitas nas posições 1, 2, 8, 9, 10, 11,17 e/ou 18 do polipeptídeo definido pela fórmula I.

O inventor também descobriu, surpreendentemente, que polipeptídeos baseados na fórmula I, mas tendo resíduos de aminoácido adicionais, também têm eficácia como agentes anti-fungicos/anti-protistas. Conseqüentemente, polipeptídeos preferidos ou derivados dos mesmos podem ter mais de 18 aminoácidos. Por exemplo, alguns polipeptídeos de acordo com o primeiro aspecto da invenção podem ter 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou mais aminoácidos de comprimento. Adições podem ser feitas no N ou C-término ou no núcleo do polipeptídeo. Adições podem ser feitas antes do resíduo 'a' (isto é, na extremidade N-terminal do polipeptídeo) ou antes de 'a" (isto é, no núcleo do polipeptídeo), conforme definido na fórmula I. Adições podem ser feitas no resíduo 'z' (isto é, no núcleo do peptídeo) ou após 'z" (na extremidade C-terminal do peptídeo), conforme definido na fórmula I.

Contudo, a adição é, de preferência, feita na posição 0, 1,2, 8, 9, 10, 11, 17 e/ou 18 do peptídeo definido pela fórmula I. Mais preferivelmente, adições são feitas antes da posição 0 do peptídeo, isto é, aminoácidos são adicionados ao N-término antes do primeiro aminoácido no resíduo 'a' definido pela fórmula I.

O polipeptídeo de acordo com a fórmula I pode, de preferência, compreender os seguintes aminoácidos:

a & a' = é independentemente selecionado de Arginina (R); Tirosina (Y); Metionina (M); Isoleucina (I); Fenilalanina (F); Triptofano (W); Leucina (L); Lisina (K); Histidina (H); Cisteína (C); ou é deletado;

b & b' = é independentemente selecionado de Arginina (R); Tirosina (Y); Metionina (M); Isoleucina (I); Fenilalanina (F); Triptofano (W); Leucina (L); Lisina (K); Cisteína (C); ou é deletado;

c & c' = é independentemente selecionado de Arginina (R); Tirosina (Y); Metionina (M); Isoleucina (I); Fenilalanina (F); Triptofano (W); Leucina (L); Lisina (K); Histidina (H); Cisteína (C); Treonina (T); ou é deletado;

χ & x' = é independentemente selecionado de Arginina (R); Tirosina (Y); Metionina (M); Isoleucina (I); Fenilalanina (F); Triptofano (W); Leucina (L); Lisina (K); Histidina (H); Cisteína (C), Glicina (G); ou é deletado;

y & y' = é independentemente selecionado de Arginina (R); Tirosina (Y); Metionina (M); Isoleucina (I); Fenilalanina (F); Triptofano (W); Leucina (L); Lisina (K); Cisteína (C); Histidina (H); ou é deletado;

z & z' = é independentemente selecionado de Arginina (R); Tirosina (Y); Metionina (M); Isoleucina (I); Fenilalanina (F); Triptofano (W); Leucina (L); Lisina (K); Cisteína (C); Histidina (H); ou é deletado.

O polipeptídeo da fórmula I pode compreender pelo menos um aminoácido adicional, o qual pode ser independentemente selecionado de Arginina (R); Tirosina (Y); Metionina (M); Isoleucina (I); Fenilalanina (F); Triptofano (W); Leucina (L); Lisina (K); Histidina (H). De preferência, o aminoácido adicional é adicionado antes do aminoácido na posição 'a' no peptídeo da fórmula I, isto é, ao N-término.

Conseqüentemente, será apreciado que o polipeptídeo de acordo com a invenção pode compreender uma 18-mer de {abcRKRxyz} e {a'bVRKRxyz'}, no qual abe, a'b'c', xyz e x'y'z' são definidos conforme acima ou um truncamento do mesmo. Será apreciado que, por exemplo, a pode ser diferente de a' e b pode ser diferente de b' e c pode ser diferente de c' e assim por diante.

O polipeptídeo de acordo com o primeiro aspecto pode, de preferência, ser um homodímero da fórmula II:

{abcRKRxyz} + {abcRKRxyz}

em que a, b, c, x, y e z são conforme definido para a fórmula I.

Conforme com o polipeptídeo da fórmula I, o polipeptídeo da fórmula II pode compreender pelo menos um aminoácido adicional, o qual pode ser independentemente selecionado de Arginina (R); Tirosina (Y); Metionina (M); Isoleucina (I); Fenilalanina (F); Triptofano (W); Leucina (L); Lisina (K); Histidina (H). De preferência, o aminoácido adicional é adicionado antes do aminoácido na posição 'a' no peptídeo da fórmula II, isto é, ao N-término.

Conseqüentemente, será apreciado que o polipeptídeo de ácordo com a invenção compreende uma 18-mer de {abcRKRxyz} e {abcRKRxyz}, na qual abs e xyz são definidos conforme acima ou um truncamento do mesmo.

O polipeptídeo definido pela fórmula II compreende, de preferência, os seguintes aminoácidos:

a = é independentemente selecionado de Arginina (R);

Tirosina (Y); Metionina (M); Isoleucina (I); Fenilalanina (F); Triptofano (W); Cisteína (C); ou é deletado;

b = é independentemente selecionado de Arginina (R); Tirosina (Y); Metionina (M); Isoleucina (I); Fenilalanina (F); Triptofano (W); Cisteína (C);ou é deletado;

c = é independentemente selecionado de Fenilalanina (F); ou Triptofano (W); Cisteína (C); ou é deletado;

χ = é independentemente selecionado de Fenilalanina (F); Triptofano (W); Cisteína (C);ou é deletado;

y = é independentemente selecionado de Fenilalanina (F); Triptofano (W); Cisteína (C); ou é deletado;

ζ = é independentemente selecionado de Arginina (R); Tirosina (Y); Metionina (M); Isoleucina (I); Fenilalanina (F); Triptofano (W); Cisteína (C);ou é deletado.

Esses polipeptídeos preferidos podem compreender pelo menos um aminoácido adicional, o qual pode ser Fenilalanina (F) ou Triptofano (W) ou Leucina (L). De preferência, o aminoácido adicional é adicionado antes do aminoácido na posição 'a' no polipeptídeo da fórmula II, isto é, ao N-término.

Os inventores também apreciaram que polipeptídeos podem ser empregados de acordo com a invenção que compreende mais de apenas uma repetição dimérica aleatória (2x) de um peptídeo derivado de uma região de ligação ao receptor de Proteoglicana de Sulfato de Heparana (HSPG) de uma apolipoproteína B ou apolipoproteína E ou um truncamento do mesmo. Por exemplo, polipeptídeos compreendendo uma repetição trimérica (3x) ou uma repetição tetramérica (4x) ou mesmo um número maior de repetições de um peptídeo derivado de uma região de ligação ao receptor de Proteoglicana de Sulfato de Heparana (HSPG) de uma apolipoproteína B ou apolipoproteína E podem ser empregados como agentes anti-füngicos e/ou anti-protistas úteis.

Conseqüentemente, é preferido que o polipeptídeo possa ter a fórmula III:

{abcRKRxyz}n

em que a, b, c, x, y, e ζ são conforme definido acima com referência à fórmula I ou II e em que η é igual a 2, 3, 4 ou 5 ou mais.

Outros polipeptídeos preferidos podem compreender repetições do peptídeo de 18-mer (ou truncamento do mesmo) definido pela fórmula I (por exemplo, repetições de um heterodímero de 9-mers compreendendo o peptídeo da fórmula I).

É mais preferido que o polipeptídeo de acordo com o primeiro aspecto possa compreender uma repetição de apoEi4i.i49 (SEQ ID NO. 5) ou derivados e truncamentos do mesmo. Tais peptídeos representam uma modalidade importante da invenção. Conseqüentemente, em um segundo aspecto, é proporcionado uso de um polipeptídeo, derivado ou análogo do mesmo compreendendo uma repetição do peptídeo apoE14i.149 (SEQ ID NO. 5) ou um truncamento do mesmo; ou uma repetição de uma variante do peptídeo apoE14M49 no qual pelo menos um resíduo de Leucina (L) é substituído por Triptofano (W), Arginina (R), Lisina (K), Tirosina (Y) Cisteína (C) ou Fenilalanina (F), para a fabricação de um medicamento para o tratamento de uma infecção ou contaminação fungica e/ou por protista.

Por "uma repetição do peptídeo apoEi4i_i49", entenda-se um polipeptídeo compreendendo uma repetição da seqüência peptídica: LRKLRKRLL (SEQ ID No 5), isto é, uma 9-mer. O polipeptídeo compreende, de preferência, a seqüência de aminoácido: LRKLRKULLLRKLRKRLL (SEQ ID NO. 8), isto é, uma 18-mer, a qual é um dímero de repetição em tandem de SEQ ID No. 5. SEQ ID No. 8 também é referida aqui como GIN 1 ou GINlp (em que ρ significa proteção N terminal (por exemplo, por um grupo acetila) e proteção C terminal apor exemplo, por um grupo amida). GINlp também é referida aqui como MU 10.

Por "um truncamento do mesmo", entenda-se que a repetição (por exemplo, a 18-mer de SEQ ID No. 8) tem o tamanho reduzido através de remoção de aminoácidos. A redução de aminoácidos pode ser através de remoção de resíduos do C- e/ou N-término ou pode ser através de deleção de um ou mais aminoácidos de dentro do núcleo do polipeptídeo (por exemplo, aminoácidos 2-17 de SEQ ID No. 8).

O inventor identificou que Triptofano (W), Arginina (R)5 Lisina (K), Tirosina (Y), Cisteína (C) ou Fenilalanina (F) pode ser substituído por Leucina em repetições aleatórias apoEi4i.i49 e que tais polipeptídeos têm, surpreendentemente, atividade anti-füngica/anti-protista.

E mais preferido que os polipeptídeos de acordo com o segundo aspecto da invenção compreende um polipeptídeo, derivado ou análogo do mesmo compreendendo uma repetição dimérica de apoE14i.149 ou um truncamento do mesmo, caracterizado pelo fato de pelo menos um resíduo de Leucina (L) do dímero de SEQ ID No. 8 ser substituído por um resíduo de Triptofano (W) ou Fenilalanina (F).

É mais preferido que pelo menos um resíduo de Leucina (L) do dímero de SEQ ID No. 8 seja substituído por um resíduo de Triptofano (W).

Conforme discutido em maiores detalhes abaixo, SEQ ID No. 8 pode ser manipulada com uma série de diferentes substituições e deleções para fazer polipeptídeos com atividade anti-füngica e/ou anti-protista. É preferido que o polipeptídeo de acordo com o segundo aspecto da invenção tenha pelo menos duas substituições independentemente selecionadas de: substituições Triptofano (W), Arginina (R), Lisina (K)5 Tirosina (Y), Cisteína (C) ou Fenilalanina (F) e, mais preferivelmente, três ou mais substituições. É preferido que essas múltiplas substituições sejam por Triptofano (W), Arginina (R), Lisina (K), Tirosina (Y) ou Fenilalanina (F) e, ainda mais preferido, que essas sejam múltiplas substituições por Triptofano (W).

Além de uma ou mais substituições de L por K, R, Y, F, C ou W, é preferido que pelo menos um outro aminoácido (de preferência, pelo menos um outro resíduo de leucina) seja substituído por Arginina (R), Tirosina (Y), Metionina (M), Isoleucina (I), Fenilalanina (F) ou Triptofano (W). É particularmente preferido que essa outra substituição seja F ou W.

O inventor também apreciou que podem ser empregados polipeptídeos de acordo com a invenção que compreendem mais de apenas uma repetição em tandem dimérica de ApoEi4m49 ou um truncamento ou variante do mesmo. Por exemplo, um trímero ou tetrâmero ou número maior de repetições pode ser empregado como agentes anti-fungicos e/ou anti- protistas.

Os polipeptídeos de acordo com o segundo aspecto podem ser sintetizados de modo que outros aminoácidos são adicionados ao mesmo. Por exemplo, um, dois, três ou mais aminoácidos podem ser adicionados ao C ou N término de um peptídeo de SEQ ID No. 8 ou um derivado de tal peptídeo, conforme definido acima. Alternativamente, o polipeptídeo pode compreender uma repetição em tandem de um peptídeo que é maior do que os nove aminoácidos de SEQ ID No. 5. Tais peptídeos podem ter aminoácidos adicionados ao N término, C término e/ou entre os 9o e 10° aminoácidos de SEQ ID No. 8. E mais preferido que o aminoácido seja adicionado ao C término e também entre o 9o e 10° aminoácidos de SEQ ID No. 8. Será apreciado que tais peptídeos podem, então, ser modificados conforme descrito acima para polipeptídeos derivados de SEQ ID No. 8.

O polipeptídeo substituído pode compreender 18 aminoácidos (ou derivados do mesmo) e, desse modo, corresponder ao comprimento total de uma repetição dimérica aleatória de apoEui. I49. Contudo, os inventores também descobriram, surpreendentemente, que alguns polipeptídeos truncados selecionados baseados em SEQ ID No. 8 também têm eficácia como agentes anti-fungicos e/ou anti-protistas. Conseqüentemente, polipeptídeos ou derivados preferidos dos mesmos podem ter menos de 18 aminoácidos. Por exemplo, alguns polipeptídeos de acordo com o segundo aspecto da invenção podem ter 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10 ou menos aminoácidos de comprimento. Será apreciado que formas modificadas de W, Y, R, K, C ou F podem ser substituídas na repetição em tandem de apoEi4i.i49 por uma série de variantes de aminoácido que podem ser conhecidas por aqueles habilitados na técnica. Tais polipeptídeos ainda terão atividade anti-fungica e/ou anti- protista, contanto que a modificação não altere significativamente suas características químicas. Por exemplo, hidrogênios sobre as aminas da cadeia lateral de R ou K podem ser substituídos por grupos metileno (-NH2 — > - NH(Me) ou -N(Me)2 ).

Outros polipeptídeos preferidos de acordo com o segundo aspecto da invenção (compreendendo repetições aleatórias de peptídeos derivados de apoE14M49) podem compreender uma das seguintes seqüências de aminoácido:

(a) WRKWRKRWWWRKWRKRWW (SEQ ID NO. 9). Esse polipeptídeo corresponde a uma repetição dimérica aleatória de comprimento total de apoEi4M49 (SEQ ID NO. 8) com todas as Leucinas substituídas por resíduos de Triptofano. Esse polipeptídeo é designado GIN 7 ou MU 4 quando referido aqui.

(b) WRKWRKRWRKWRKR (SEQ ID No. 10). Esse polipeptídeo corresponde a uma repetição dimérica aleatória de comprimento total de apoEi4i.149 (SEQ ID NO. 8) com todas as Leucinas substituídas por resíduos de Triptofano e truncada pela excisão de aminoácidos 9, 10, 17 e 18, isto é, é uma 14-mer. Esse polipeptídeo é designado GIN 32 quando referido aqui.

(c) WRKWRKRWWLRKLRKRLL (SEQ ID No. 11). Esse polipeptídeo corresponde a uma repetição dimérica aleatória de comprimento total de apoE14M49 (SEQ ID NO. 8) com um subconjunto de Leucinas substituídas por resíduos de Triptofano, isto é, é uma 18-mer. Esse polipeptídeo é designado GIN 34 quando referido aqui.

(d) YRKYRKRYYYRKYRKRYY (SEQ ID No. 12). Esse polipeptídeo corresponde a uma repetição dimérica aleatória de comprimento total de apoEi4M49 (SEQ ID NO. 8) com todas as Leucinas substituídas por resíduos de tirosina, isto é, é uma 18-mer. Esse polipeptídeo é designado GIN 41 ou MU6 quando referido aqui.

(e) LRKLRKRLRKLRKR (SEQ ID No. 13). Esse polipeptídeo corresponde à repetição dimérica aleatória de comprimento total Ml de apoEi4i_i49 (SEQ ID NO. 8) truncada pela excisão de aminoácidos 9, 10, 17 e 18, isto é, é uma 14-mer. Esse polipeptídeo é designado GIN 8 quando referido aqui.

(f) LRKRLLLRKLRKRLL (SEQ ID No. 14). Esse polipeptídeo corresponde a uma repetição dimérica aleatória de comprimento total de apoEi4i.i49 (SEQ ID NO. 8) truncada pela excisão de aminoácidos 1, 2 e 3, isto é, é uma 15-mer. Esse polipeptídeo é designado GIN 2 quando referido aqui.

(g) FRKFRKRFFFRKFRKRFF (SEQ ID No. 15). Esse polipeptídeo é designado MU 7 quando referido aqui.

(h) WRKWRKRWWRKWRKRWW (SEQ ID NO. 16). Esse polipeptídeo corresponde à SEQ DD No. 9 com o resíduo de W na posição 9 deletado. Esse polipeptídeo é designado MU 58 quando referido aqui.

(i) WRKWRKRWRKWRKRW (SEQ ID NO. 17). Esse polipeptídeo corresponde à SEQ ID No. 9 com os resíduos de W nas posições 9, 10 e 18 deletados. Esse polipeptídeo é designado MU 59 quando referido aqui.

(j) WRKWRKRWWFRKWRKRWW (SEQ ID NO. 18). Esse polipeptídeo corresponde à SEQ ID No. 9 com o resíduo de W na posição 10 substituído por uma F. Esse polipeptídeo é designado MU 60 quando referido aqui.

(k) WRKWRKRFFWRKWRKRFF (SEQ ID NO. 19). Esse polipeptídeo corresponde à SEQ ID No. 9 com os resíduos de W nas posições 9, 10, 17 e 18 substituídos por resíduos de F. Esse polipeptídeo é designado MU 61 quando referido aqui.

(l) WRKRWWR WRKRWWR (SEQ ID N0.20). Esse polipeptídeo é designado MU 81 quando referido aqui.

(m) LRKLRKRLLRLRKLRKRLLR (SEQ ID NO. 21). Esse polipeptídeo é designado MU 82 quando referido aqui.

(n) WRKWRKRWWRWRKWRKRWWR (SEQ ID NO. 22). Esse polipeptídeo é designado MU 83 quando referido aqui.

(o) LRKLRKRLLWRKWRKRWW (SEQ ID NO.23). Esse polipeptídeo corresponde à SEQ ID No. 8 com os resíduos de L nas posições 10, 13, 17 e 18 substituídos por resíduos de W. Esse polipeptídeo é designado MU 111 quando referido aqui.

(p) LRKLRKRLLLRKLRKRWW (SEQ ID NO. 24). Esse polipeptídeo corresponde à SEQ ID No. 8 com os resíduos de L nas posições 17 e 18 substituídos por resíduos de W. Esse polipeptídeo é designado MU 112 quando referido aqui.

(q) LRKLRKRLLWRKWRKRLL (SEQ ID NO. 25). Esse polipeptídeo corresponde à SEQ ID No. 8 com os resíduos de L nas posições 10 e 13 substituídas por resíduos de W. Esse polipeptídeo é designado MU 113 quando referido aqui.

(r) WRKWRKRLLLRKLRKRLL (SEQ ID N0.26). Esse polipeptídeo corresponde à SEQ ID No. 8 com os resíduos de L nas posições 1 e 4 substituídos por resíduos de W. Esse polipeptídeo é designado MU 114 quando referido aqui.

(s) WRKLRKRLLLRKLRKRLL (SEQ ID NO.27). Esse polipeptídeo corresponde à SEQ ID No. 8 com o resíduo de L na posição 1 substituído por resíduos de W. Esse polipeptídeo é designado MU 115 quando referido aqui.

(t) WRKWRKFFFRKWRKRWW (SEQ ID NO.28). Esse polipeptídeo corresponde à SEQ ID No. 9 com os resíduos de W nas posições 8, 9 e 10 substituídos por resíduos de F e o resíduo de R na posição 7 deletados. Esse polipeptídeo é designado MU 116 quando referido aqui.

(u) WRKWRKRWWFRKFRKRFF (SEQ ID NO. 29). Esse polipeptídeo corresponde à SEQ ID No. 9 com os resíduos de W nas posições 10, 13, 17el8 substituídos por resíduos de F. Esse polipeptídeo é designado MU 117 quando referido aqui.

(v) CRKCRKRCCCRKCRKRCC (SEQ ID NO. 30). Esse polipeptídeo corresponde a uma repetição dimérica aleatória de comprimento total de apoEi4M49 (SEQ ID NO. 8) com todas as Leucinas substituídas por resíduos de cisteína, isto é, é uma 18-mer. Esse polipeptídeo é designado MU 12 quando referido aqui.

(w) RRKRRKRRRRRKRRKRRR (SEQ ID NO. 31). Esse polipeptídeos corresponde à repetição dimérica aleatória de comprimento total de apoui.149 (SEQ ID NO. 8) com todas as Leucinas substituídas por resíduos de arginina, isto é, é uma 18-mer. Esse polipeptídeo é designado MU 16 quando referido aqui.

(x) MRKMRKRMMMRKMRKRMM (SEQ ID NO. 32). Esse polipeptídeo corresponde à repetição dimérica aleatória de comprimento total de apoEi4M49 (SEQ ID NO. 8) com todas as Leucinas substituídas por resíduos de metionina, isto é, é uma 18-mer. Esse polipeptídeo é designado MU 5 quando referido aqui.

(y) IRKIRKRIIIRKIRKRII (SEQ ID NO. 33). Esse polipeptídeo corresponde à repetição dimérica aleatória de comprimento total de apoE141-i49 (SEQ ID NO. 8) com todas as Leucinas substituídas por resíduos de isoleucina, isto é, é uma 18-mer. Esse polipeptídeo é designado MU 8 quando referido aqui.

(z) HRKHRKRHHHRKHRKRHH (SEQ ID NO. 34). Esse polipeptídeo corresponde à repetição dimérica aleatória de comprimento total de apoEi41.149 (SEQ ID NO. 8) com todas as Leucinas substituídas por resíduos de histidina, isto é, é uma 18-mer. Esse polipeptídeo é designado MU 19 quando referido aqui.

Em modalidades mais preferidas, os polipeptídeos de acordo com o segundo aspecto da invenção (compreendendo repetições aleatórias de peptídeos derivados de apoEui.uç) compreendem uma das seguintes seqüências de aminoácido:

(i) WRKWRKRWWWRKWRKRWW (SEQ ID NO. 9). Esse polipeptídeo corresponde a uma repetição dimérica aleatória de comprimento total de apoE14M49 (SEQ ID NO. 8) com todas as Leucinas substituídas por resíduos de Triptofano. Esse polipeptídeo é designado GIN 7 ou MU 4 quando referido aqui;

(ii) FRKFRKRFFFRKFRKRFF (SEQ ID No. 15). Esse polipeptídeo é designado MU 7 quando referido aqui;

(iii) LRKLRKRLLLRKLRKRLL (SEQ ID NO. 8), isto é, uma 18-mer, a qual é uma repetição dimérica aleatória de SEQ ID No. 4. SEQ ID No. 8 é também referida aqui como GIN 1 ou GINlp (em que ρ significa proteção N-terminal (por exemplo, por um grupo acetila) e proteção C terminal (por exemplo, por um grupo amida). GIN Ip é também referida aqui como MU 10; e

(iv) WRKWRKRLLLRKLRKRLL (SEQ ID NO.26). Esse polipeptídeo corresponde à SEQ ID No. 4 com os resíduos de L nas posições 1 e 4 substituídos por resíduos de W. Esse polipeptídeo é designado MU 114 quando referido aqui. Esse polipeptídeo é designado GIN 11 quando referido aqui.

De acordo com outra modalidade do primeiro aspecto da invenção, polipeptídeos preferidos compreendem repetições de peptídeos derivados de uma região de ligação ao receptor de HSPG de apolipoproteína B ou uma variante ou truncamento dos mesmos. Conseqüentemente, em um terceiro aspecto, é proporcionado uso de um polipeptídeo ou um derivado ou análogo do mesmo compreendendo repetições de um peptídeo derivado de uma região de ligação ao receptor de HSPG de apolipoproteína B para a fabricação de um medicamento para o tratamento de uma infecção ou contaminação fungica e/ou por protista.

De preferência, o polipeptídeo, derivado ou análogo do mesmo compreende uma repetição a qual é derivada de um grupamento B de domínio de ligação ao receptor de LDL de apolipoproteína B. De preferência, o polipeptídeo, derivado ou análogo do mesmo compreende uma repetição do peptídeo apoB3359_3367 (SEQ ID No. 6) ou um truncamento ou variante do mesmo.

O polipeptídeo de acordo com o terceiro aspecto da invenção pode ser uma repetição dimérica aleatória de apoB3359_3367 (SEQ ID No. 6) com a seqüência de aminoácido: RLTRKRGLKRLTRKRGLK, isto é, uma 18-mer (SEQ ID No. 36).

Peptídeos de acordo com o terceiro aspecto da invenção podem também ser trancados conforme definido aqui. A redução de aminoácidos pode ser através de remoção de resíduos do C- e/ou N-término ou pode ser através de deleção de um ou mais aminoácidos de dentro do núcleo do peptídeo (isto é, aminoácidos 2-17 de SEQ ID No. 36).

É preferido que os polipeptídeos de acordo com o terceiro aspecto compreendam pelo menos dois motivos RKR ou mais se o polipeptídeo é um trímero ou um tetrâmero e assim por diante.

Polipeptídeos preferidos de acordo com o terceiro aspecto compreendem a repetição dimérica aleatória do peptídeo apoB3359.3367 (isto é, o polipeptídeo de SEQ ID No. 36) ou um truncamento do mesmo, caracterizado pelo fato de pelo menos um resíduo de aminoácido, outro que não motivos de RKR, ter sido substituído por um resíduo de Glicina (G), Treonina (T), Histidina (H), Triptofano (W), Arginina (R) ou Leucina (L) ou derivados do mesmo.

Adequadamente, um ou mais, mais adequadamente dois ou mais e, ainda mais adequadamente, três ou mais resíduos de aminoácido podem ser substituídos por um resíduo de Glicina (G), Treonina (T), Histidina (H), Triptofano (W), Arginina (R) ou Leucina (L) ou derivado do mesmo. De preferência, quatro ou mais, mais preferivelmente cinco ou mais e, ainda mais preferivelmente, seis ou mais resíduos de aminoácido podem ser substituídos por esses aminoácidos ou derivados dos mesmos. De preferência, o resíduo de aminoácido trocado ou substituído é o primeiro, segundo, terceiro, sétimo, oitavo, nono, décimo, décimo primeiro, décimo segundo, décimo sexto, décimo sétimo ou décimo oitavo resíduo de SEQ ID NO: 36.

De preferência, o polipeptídeo de acordo com o terceiro aspecto compreende o polipeptídeo de SEQ ID NO: 36 ou um truncamento do mesmo caracterizado pelo fato de pelo menos um resíduo de aminoácido ter sido substituído por um resíduo de Triptofano (W), Arginina (R) ou Leucina (L) ou derivado do mesmo.

Adequadamente, um ou mais, mais adequadamente, dois ou mais e, ainda mais adequadamente, três ou mais resíduos de aminoácido podem ser substituídos por um resíduo de Triptofano (W), Arginina (R) ou Leucina (L) ou derivado do mesmo. De preferência, quatro ou mais, mais preferivelmente cinco ou mais e, ainda mais preferivelmente, seis ou mais resíduos de aminoácido podem ser substituídos por um resíduo de Triptofano (W), Arginina (R) ou Leucina (L) ou derivado do mesmo. De preferência, o resíduo substituído ou trocado é o primeiro, segundo, terceiro, sétimo, oitavo e/ou nono resíduo da seqüência de aminoácido repetida de apoB3359.3367 ou combinações dos mesmos.

O polipeptídeo de acordo com a invenção pode compreender 18 aminoácidos (ou derivados do mesmo) e, desse modo, corresponde ao comprimento total de SEQ ID NO: 36 com ou sem as substituições discutidas acima. Contudo, os inventores descobriram, surpreendentemente, que polipeptídeos truncados baseados em SEQ ID NO: 36 também têm eficácia como agentes anti-fungicos e/ou anti-protistas. Conseqüentemente, polipeptídeos preferidos ou derivados dos mesmos podem ter menos de 18 aminoácidos. Por exemplo, alguns polipeptídeos de acordo com o terceiro aspecto da invenção podem ter 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10 ou menos aminoácidos de comprimento. Deleções são, de preferência, feitas nas posições 1, 2, 8, 9, 10, 11, 17 e/ou 18 de SEQ ID No. 36.

Em uma modalidade preferida, o polipeptídeo de acordo com o terceiro aspecto pode, de preferência, ter a fórmula IV:

{abcRKRxyz} + {a'b'c'RKRxyz'}

em que:

a & a' = é independentemente selecionado de um resíduo positivamente carregado, o qual pode ser selecionado de Arginina (R) ou Lisina (K) ou Histidina (H); Leucina (L); Triptofano (W); ou é deletado;

b & b' = é independentemente selecionado de Leucina (L); Arginina (R); Lisina (K); ou é deletado;

c & c' = é independentemente selecionado de Treonina (T); Triptofano (W); ou um resíduo positivamente carregado, o qual pode ser selecionado de Arginina (R) ou Lisina (K) ou Histidina (H);

χ & x' = é independentemente selecionado de Glicina (G); Triptofano (W); Leucina (L); ou um resíduo positivamente carregado, o qual pode ser selecionado de Arginina (R) ou Lisina (K) ou Histidina (H);

y & y' = é independentemente selecionado de Leucina (L); um resíduo positivamente carregado, o qual pode ser selecionado de Arginina (R) ou Lisina (K) ou Histidina (H); ou é deletado;

z & z' = é independentemente selecionado de um resíduo positivamente carregado, o qual pode ser selecionado de Arginina (R) ou Lisina (K) ou Histidina (H); ou Leucina; ou é deletado. O polipeptídeo de acordo com o terceiro aspecto também pode, de preferência, ter a fórmula V:

{abcRKRxyz} + {abcRKRxyz}

em que:

a = é independentemente selecionado de um resíduo positivamente carregado, o qual pode ser selecionado de Arginina (R) ou Lisina (K) ou Histidina (H); Leucina (L); Triptofano (W); ou é deletado;

b = é independentemente selecionado de Leucina (L); Arginina (R); Lisina (K); ou é deletado;

c = é independentemente selecionado de Treonina (T); Triptofano (W); ou um resíduo positivamente carregado, o qual pode ser selecionado de Arginina (R) ou Lisina (K) ou Histidina (H);

χ = é independentemente selecionado de Glicina (G); Triptofano (W); Leucina (L); ou um resíduo positivamente carregado, o qual pode ser selecionado de Arginina (R) ou Lisina ( K) ou Histidina (H);

y = é independentemente selecionado de Leucina (L); um resíduo positivamente carregado, o qual pode ser selecionado de Arginina (R) ou Lisina (K) ou Histidina (H); ou é deletado;

z = é independentemente selecionado de um resíduo positivamente carregado, o qual pode ser selecionado de Arginina (R) ou Lisina (K) ou Histidina (H); ou Leucina (L); ou é deletado.

O polipeptídeo de formula V pode, mais preferivelmente, compreender os seguintes aminoácidos:

a = é independentemente selecionado de Triptofano (W); Arginina (R); Leucina (L); ou é deletado;

b = é independentemente selecionado de Leucina (L); Arginina (R) ou Lisina (K); ou é deletado;

c = é independentemente selecionado de Triptofano (W); Treonina (T); Lisina (K); χ = é independentemente selecionado de Triptofano (W); Glicina (G); Leucina (L); Arginina (R);

y = é independentemente selecionado de Leucina (L); um resíduo positivamente carregado, o qual pode ser selecionado de Arginina (R) ou Lisina (K) ou Histidina (H); ou é truncado aqui;

z = é independentemente selecionado de um resíduo positivamente carregado, o qual pode ser selecionado de Arginina (R) ou Lisina (K) ou Histidina (H); ou Leucina (L); ou é truncado aqui.

Os inventores também apreciaram que os polipeptídeos podem ser empregados de acordo com a invenção que compreendem mais do que apenas uma repetição dimérica aleatória de apoB3359.3367 (SEQ ID No. 36) ou uma variante ou truncamento do mesmo. Por exemplo, polipeptídeos compreendendo um trímero ou tetrâmero ou mesmo um número maior de repetições de SEQ ID NO: 6 pode ser empregado como agentes anti- fungicos/protistas úteis.

Conseqüentemente, é preferido que o polipeptídeo possa, de preferência, ter a fórmula VI:- {abcRKRxyz}n

em que a, b, c, x, y e ζ são conforme definido acima com referência à fórmula IV ou V e em que η é igual a 2, 3, 4 ou 5 ou mais. Será apreciado que peptídeos monoméricos {abcRKRxyz} podem ser idênticos ou podem variar, conforme definido acima.

Outros polipeptídeos preferidos podem compreender repetições da 18mer (ou truncamentos da mesma) definidas pela fórmula IV ou V (por exemplo, repetições de um heterodímero dos peptídeos de 9mer definidos pela fórmula IV).

Outros polipeptídeos preferidos de acordo com o terceiro aspecto da invenção podem compreender uma das seguintes seqüências de aminoácido: a) RTRKRGRRTRtCRGR (SEQ ID NO. 37). Esse polipeptídeo é designado GESi 36 quando referido aqui;

b) LRKRKRLLRKRKRL (SEQ ID NO. 38). Esse polipeptídeo é designado GIN 37 quando referido aqui;

c) LRKRKRLRKI,RKRKRLRK (SEQ ID NO. 39). Esse polipeptídeo é designado GIN 38 quando referido aqui;

d) WRWRKRWRKWRWRKRWRK (SEQ ID NO. 40). Esse polipeptídeo é designado GIN 33 quando referido aqui;

e) LLRKRLKRLLLRKRLKRL (SEQ ID NO. 41). Esse polipeptídeo é designado MU 24 quando referido aqui;

f) RRWRKRWRKWRWRKRWRK (SEQ ID NO. 42). Esse polipeptídeo é designado MU 28 quando referido aqui;

g) KRWRKRWRKWRWRKRWRK (SEQ ID NO. 43). Esse polipeptídeo é designado MU 29 quando referido aqui;

h) LRWRKRWRKWRWRKRWRK (SEQ ED NO. 44). Esse polipeptídeo é designado MU 30 quando referido aqui;

i) HRWRKRWRKWRWRKRWRK (SEQ ID NO. 45). Esse polipeptídeo é designado MU 31 quando referido aqui;

j) RWRKRWRKWRWRKRWRK (SEQ ID NO. 46). Esse polipeptídeo é designado MU 32 quando referido aqui;

k) RRWRKRWRKRRWRKRWRK (SEQ ID NO. 47). Esse polipeptídeo é designado MU 33 quando referido aqui;

1) LRWRKRWRKLRWRKRWRK (SEQ ID NO. 48). Esse polipeptídeo é designado MU 35 quando referido aqui;

m) HRWRKRWRKHRWRKRWRK (SEQ ID NO. 49). Esse polipeptídeo é designado MU 36 quando referido aqui;

n) RWRKRWRKRWRKRWRK (SEQ ID NO. 50). Esse polipeptídeo é designado MU 37 quando referido aqui;

o) RWRKRGRKRWRKRGRK (SEQ ID NO. 51). Esse polipeptídeo é designado MU 69 quando referido aqui;

p) RWRKRWRKRWRKRWRK (SEQ ID NO. 52). Esse polipeptídeo é designado MU 71 quando referido aqui;

q) RKRGWKWRKRGWKW (SEQ ID NO. 53). Esse polipeptídeo é designado MU 73 quando referido aqui;

r) RLTRKRGRLTRKRG (SEQ ID NO. 54). Esse polipeptídeo é designado MU 74 quando referido aqui; e

s) WRWRKRWRKWRWRKRWRK (SEQ ID NO. 55). Esse polipeptídeo é designado MU 27 quando referido aqui.

Derivados de polipeptídeos de acordo com a invenção podem ser usados para tratar infecções fungicas e/ou por protistas. Tais derivados podem aumentar ou diminuir a meia-vida do polipeptídeo in vivo. Exemplos de derivados capazes de aumentar a meia-vida dos polipeptídeos de acordo com a invenção incluem derivados peptóides dos polipeptídeos, derivados de D-aminoàcido dos polipeptídeos e híbridos de peptídeo-peptóide.

Polipeptídeos de acordo com a invenção podem ser submetidos à degradação através de uma série de meios (tal como atividade de protease em sistemas biológicos). Tal degradação pode limitar a biodisponibilidade dos polipeptídeos e, conseqüentemente, a capacidade dos polipeptídeos de obter sua função biológica. Existem amplas faixas de técnicas bem estabelecidas pelas quais derivados que têm estabilidade intensificada em contextos biológicos podem ser projetados e produzidos. Tais derivados polipeptídicos podem ter biodisponibilidade aperfeiçoada como um resultado de resistência aumentada à degradação protease-mediada. De preferência, um derivado ou análogo adequado para uso de acordo com a invenção é mais resistente à protease do que o peptídeo do qual ele é derivado.

De preferência, o polipeptídeo pode ser tornado mais resistente à protease através de proteção do N e/ou C término. Por exemplo, o N término pode ser protegido por um grupo acetila ou por um grupo alquila ou arila ou um grupo alquila-CO ou arila-CO, cada um dos quais pode ser opcionalmente substituído. O C término pode ser protegido por um grupo amida ou por um grupo amida substituído.

Resistência à protease de um derivado polipeptídico e do polipeptídeo do qual ele é derivado pode ser avaliada por meio de ensaios de degradação de proteína bem conhecidos. Os valores relativos de resistência à protease para o derivado polipeptídico e polipeptídeo podem, então, ser comparados.

Derivados peptóides dos polipeptídeos da invenção podem ser prontamente projetados a partir de conhecimento da estrutura do polipeptídeo de acordo com os primeiro, segundo ou terceiro aspectos da invenção. Software comercialmente disponível pode ser usado para desenvolver derivados peptóides de acordo com protocolos bem estabelecidos.

Retropeptóides (nos quais todos os aminoácidos são substituídos por resíduos de peptóide na ordem invertida) são também capazes de imitar polipeptídeos antibacterianos derivados de apolipoproteínas. Espera- se que um retropeptóide se ligue na direção oposta na ranhura de ligação de ligante, quando comparado a um peptídeo ou híbrido de peptóide-peptídeo contendo um resíduo de peptóide. Como um resultado, as cadeias laterais dos resíduos de peptóide são capazes de apontar na mesma direção que as cadeias laterais no peptídeo original.

Uma outra modalidade de uma forma modificada do polipeptídeo de acordo com a invenção compreende formas de D-aminoácido do polipeptídeo. O preparo de peptídeos usando D-aminoácidos ao invés de L-aminoácidos diminui grandemente qualquer ruptura indesejada de tal agente através de processos metabólicos normais, diminuindo as quantidades de agente a qual precisa ser administrada, junto com a freqüência de sua administração. Outras modificações nas seqüências polipeptídicas também são consideradas e dentro do escopo da invenção reivindicada, isto é, aquelas as quais ocorrem durante ou após tradução, por exemplo, através de acetilação, amidação, carboxilação, fosforilação, clivagem proteolítica ou ligação a um ligante.

O inventor acredita que polipeptídeos, derivados ou análogos de acordo com a invenção podem ser usados na prevenção ou tratamento de qualquer infecção fungica ou por protista. De acordo com uma modalidade preferida da invenção, espécies medicamente importantes (por exemplo, animais e o homem) podem ser tratadas de acordo com os primeiro, segundo ou terceiro aspectos da invenção para prevenir ou tratar uma infecção causada por um fungo. Pelo termo "fungo" entenda-se qualquer um dos numerosos organismos eucariotas do reino Fungi. Esses tendem a carecer de clorofila e podem oscilar, quanto à forma, de unicelular a multicelular e podem ser hifas filamentosas ramificadas que freqüentemente produzem corpos de frutificação. Conseqüentemente, os fungos podem ser filamentosos.

Exemplos de espécies fóngicas as quais causam infecções fungicas medicamente importantes (por exemplo, no homem ou em situações veterinárias) e as quais podem ser tratadas pelos peptídeos de acordo com a invenção podem ser independentemente selecionadas de um grupo consistindo de: Chytridiomycota; Zygomycota; Ascomycota; Basidiomycota; Lichens; Deuteromyeota; Mitosporidia; e Straminipila.

Chytridiomyeota preferidos contra os quais os polipeptídeos de acordo com a invenção podem ter atividade podem ser independentemente selecionados de um grupo consistindo de: Neocallimasticales; Blastocladiales; Ckytriddiales; Spizellomyeetales; e Monoblepharidales.

Zygomycota preferidos contra os quais os polipeptídeos de acordo com a invenção podem ter atividade podem ser independentemente selecionados de: Mucorales\ ou Entomophthorales. Basidiomycota contra os quais os polipeptídeos de acordo com a invenção podem ter atividade podem ser independentemente selecionados de um grupo consistindo de: Sporidiales e Hymenomycetes.

Sporidiales podem incluir Cryptococcus neoformans e Hymenomyeetes preferidos podem incluir Malassezia spp.

Mueorales contra os quais os polipeptídeos de acordo com a invenção podem ter atividade podem ser independentemente selecionados de: Mueoraeeae; Absidia; Apophysomyces; Mucor; Rhizomueor; Syneephalastraceae; Mortierellaeeae; Saksenaeaeeae; Thamnidiaeeae\ e Cunninghamellaeeae.

Mueoraeeae contra os quais os peptídeos são ativos podem incluir Rhizopus, por exemplo, Rhizopus arrhizus. Absidia preferidos incluem Absidia eorymbifera. Apophysomyces preferidos incluem Apophysomyces elegans. Syneephalastraceae preferidos incluem Syncephalastrum raeemosum. Saksenaeaeeae preferidos incluem Saksenaea vasiformis. Thamnidiaeeae preferidos incluem Cokeromyees reeurvatus. Cunninghamellaceae preferidos incluem Cunninghamella bertholletiae.

Entomophthorales preferidos contra os quais os peptídeos de acordo com a invenção são ativos podem ser independentemente selecionados de um grupo consistindo de: Basidiobolaeeae; Entomophthoraeeae; Completoriaeeae; Aneylistaeeae; Meristaeraeeeae\ e Neozygitaeeae. Basidiobolaceae preferidos incluem Basidiobolus ranarum e Laeazia loboi. Aneylistaeeae preferidos incluem Conidiobolus eoronatus e Conidiobolus ineongruus.

Ascomyeota preferidos contra os quais os peptídeos de acordo com a invenção são ativos podem ser independentemente selecionados de um grupo consistindo de: Ascomyeetes e Endomyetes.

Ascomyeetes preferidos contra os quais os peptídeos de acordo com a invenção são ativos podem ser independentemente selecionados de um grupo consistindo de: Onygenales; Histoplasma spp.; Onygenaceae; Laboulbeniomycetes; Protoascomycetes; Euascomycetes; Chaetothyriales; Aseomyeotina; Paracoccidioides; Cladosporium; Endomycetes; Saccharomycetales; Dipodascaeeae; e Saccharomycetaeeae.

Onygenales preferidos incluem Arthrodermataeeae, por exemplo, Epidermophyton spp.; Microsporum spp. e Trichophyton spp. Histoplasma spp. Preferidos incluem Histoplasma eapsulatum. Euaseomyeetes preferidos podem ser independentemente selecionados de um grupo consistindo de Bipolaris spp, Blastomyees dermatitidis, Coceidioides immitis, Coceidioides posadasii, Curvularia spp., Fonseeaea, Leptosphaeria spp., Madurella, Neotestudina spp., Phialophora, Piedraia spp., Pseudalleseheriam, Pyrenoehaeta, Scedosporium spp., Scopulariopsis spp. e Sporothrix sehenckii. Chaetothyriales preferidos incluem Exophiala spp. e Wangiella spp.. Aseomyeotina preferidos incluem Aeremonium spp. Paracoccidioides preferidos incluem Paracoccidioides brasiliensis. Endomycetes preferidos incluem Saccharomycetales, incluindo Dipodascaeeae e Saccharomycetaceae. Dipodaseaceae preferidos incluem Dipodascus earthroeonidia.

Saccharomycetaeeae mais preferidos contra os quais os peptídeos de acordo com a invenção são ativos podem ser independentemente selecionados de um grupo consistindo de: Candida; Eurotiales; e Hypocreales.

Exemplos de Candida spp preferidos contra os quais os peptídeos de acordo com a invenção podem ser ativos podem ser independentemente selecionados de um grupo consistindo de: Candida tropiealis; Candida glahrata; Candida parapsilosis; Candida krusei; Candida lusitaniae; e, mais preferivelmente, Candida albieans. Um Candida albieans mais preferido é Candida albieans 6862.

Eurotiales preferidos incluem Aspergillus spp. Aspergillus preferidos contra os quais os peptídeos de acordo com a invenção podem ser ativos podem ser independentemente selecionados de um grupo consistindo de: Aspergillus flavus; Aspergillus fumigatus; Aspergillus glaucus; Aspergillus nidulans; Aspergillus niger; e Aspergillus terreus. Um A. fumigatus mais preferido é AF293.

Hypocreales preferidos incluem Vusarium spp.. Fusarium preferidos contra os quais os peptídeos de acordo com a invenção podem ser ativos podem ser independentemente selecionados de um grupo consistindo de: Fusarium solani; Fusarium oxysporum\ e Fusarium chlamydosporum. Fusarium spp mais preferidos incluem Fusarium spp 5889 ou Fusarium spp 6507.

Polipeptídeos, derivados ou análogos de acordo com a invenção podem ser usados no tratamento contra qualquer protista ou infecção ou contaminação por protista. Pelo termo "protista" entenda-se qualquer um dos numerosos organismos eucariotas geralmente unicelulares do reino Protista. Contudo, será apreciado que alguns protistas são multicelulares. O protista pode ser um protozoário. Algumas formas de Protista são responsáveis por causar doença, especialmente em seres humanos.

Por exemplo, protistas (ou Protocista) preferidos contra os quais os peptídeos de acordo com a presente invenção são eficazes podem ser independentemente selecionados de um grupo consistindo de: Chlorophyta (Alga Verde); Phaeophyta (Alga Marrom); Pyrrophyta (Dinoflagelados); Chrysophyta (Diatomáceas); Rhodophyta (Alga Vermelha); Charophyta (Stoneworts); e Euglenophyta (Euglena).

Outros exemplos de protistas preferidos incluem organismos dentro do Filo Apicomplexa, tais como organismos independentemente selecionados de um grupo consistindo de: Coccidia; Hemogregarina spp.; Eimeria; Isospora; Sarcocystis cruzi; Toxoplasma spp.; Cryptosporidium spp.; e Cyclospora eayetanensis. Outros exemplos preferidos incluem Haemosporoina. Haemosporoina mais preferidos incluem Plasmodium spp. Será apreciado que Plasmodium spp é o protista responsável por transportar e transmitir malária, uma doença a qual causa milhões de mortes anualmente. Plasmodium spp preferido pode ser independentemente selecionado de um grupo consistindo de Plasmodium vivax; Plasmodium malariae; Plasmodium ovale; e, mais preferivelmente, Plasmodium falciparum.

Isospora preferidos incluem Isospora belli. Toxoplasma spp. Preferidos incluem Toxoplasma gondii. Cryptosporidium spp. preferidos incluem Cryptosporidium parvum.

Outros exemplos preferidos de protistas contra os quais os peptídeos de acordo com a presente invenção são eficazes podem incluir organismos dentro do Filo myxozoa, por exemplo, Myxobolus cerebralis.

Outros exemplos preferidos de protistas contra os quais os peptídeos de acordo com a presente invenção são eficazes podem incluir organismos dentro do Filo Ciliophora. Ciliophora preferidos contra os quais os peptídeos de acordo com a presente invenção são eficazes podem ser independentemente selecionados de um grupo consistindo de:

Ichthyophthirius multifiliis e Trichodina sp. e aqueles dentro da Classe Litostomatea, incluindo Balantidium coli.

Outros exemplos preferidos de protistas contra os quais os peptídeos de acordo com a presente invenção são eficazes incluem organismos dentro do Filo Sarcomastigophora. Esses organismos podem incluir: (i) aqueles dentro do subfilo Mastigophora (os flagelados); e (ii) aqueles dentro do subfilo Sareodina.

Exemplos preferidos de organismos dentro do subfilo Mastigophora podem ser independentemente selecionados de um grupo consistindo de Chilomastix mesnili; Dientamoeba fragilis; Triehomonas vaginalis; Giardia lamblia; Cryptobia salmositiea; Leishmania spp; e Trypanosoma spp, por exemplo, Trypanosoma cruzi.

Exemplos preferidos de organismos dentro do subfilo Sarcodina podem ser independentemente selecionados de um grupo consistindo: Entamoeba histolytica; e amebas não parasíticas, por exemplo, Naegleris Fowleri, Balamuthia mandrillaris e Acanthamoeba spp.. Acanthamoeba spp preferidos contra os quais os peptídeo de acordo com a presente invenção são eficazes podem incluir organismos independentemente selecionados de um grupo consistindo de: A. astronyxis; A. comandoni; A. divionensis; A. griffini; A. hatchetti; A. healyi; A. jacobsi; A. lenticulata; A. culbertsoni; A. Iugdunensis; A. mauritaniensis; A. palestinensis; A. pearcei; A. polyphaga; A. pustulosa; A. quina; A. rhysodes; A. royreba; A. terricola; A. triangularis; A. tubiashi; A. polyphaga\ e A. castellanii.

O inventor conduziu experimentos (Exemplo 1) para determinar a atividade anti-fóngica contra os fungos de teste Aspergillus fumigatus AF293, Aspergillus niger, Aspergillus terreus, Candida albicans 6862, Fusarium spp 5889 e Fusarium spp 6507. A atividade anti-fungica dos polipeptídeos de acordo com a invenção pode ser observada na Tabela 2. Conseqüentemente, de preferência, os polipeptídeos de acordo com a invenção exibem atividade anti-fungica contra pelo menos um, de preferência pelo menos dois e, mais preferivelmente, todos os Aspergillus spp., Candida spp. e Fusarium spp. De preferência, os polipeptídeos de acordo com a invenção exibem atividade anti-fungica contra todos de Aspergillus, Candida albicans 6862, Fusarium spp 5889 e Fusarium spp 6507.

Os inventores descobriram que MU4, MUlO e MUl 14 são particularmente ativos contra Aspergillus spp, em particular, A. fumigatus AF293, Aspergillus niger e Aspergillus terreus. Além disso, os inventores descobriram que MU4, MUlO e MUl 14 são particularmente eficazes contra Candida spp. e, em particular, Candida albicans. Além disso, os inventores descobriram que MU4, MUlO e MUl 14 são particularmente eficazes contra Fusarium spp. e, em particular, F. graminarium.

Além disso, para testar a atividade dos polipeptídeos divulgados aqui de matar fungos, o inventor também conduziu experimentos (Exemplo 2) para determinar a atividade anti-protista contra os protistas de teste, isto é, Acanthamoeba polyphaga (trofozoitas). Conforme pode ser observado na Tabela 3, todos os três peptídeos de acordo com a invenção (MU4, MU7, MUlO e MUl 14 sob teste) eram reagentes contra Acanthamoeba e, em particular, Acanthamoeba polyphaga.

Outras aplicações anti-fungicas e anti-protistas preferidas são descritas nos Exemplos 4 e 5, respectivamente.

Polipeptídeos de acordo com a invenção podem ser usados para tratar infecções fungicas e/ou por protistas como uma monoterapia (isto é, uso do polipeptídeo como o único antimicrobiano) ou em combinação com outros compostos ou tratamentos usados em terapia anti-fungica ou anti- protista. Por exemplo, os polipeptídeos podem ser combinados com agentes anti-fóngicos convencionais, tais como: Arnorolfme, Butenafina, Naftifma, Terbinafme, Flucitosina, Fluconazola, Butoconazola, Itraconazola, Cetoconazola, Posaconazola, Ravuconazola, Voriconazola, Clotrimazola, Econazola, Miconazola, Oxiconazola, Sulconazola, Terconazola, Tioconazola, Nicomicina Z, Caspofungina, Micafungina (FK463), Anidulafungina (LY303366), Anfotericina B (AmB), Complexo Lipídico de AmB, Dispersão Coloidal de AmB, AmB Lipossômica, Suspensão Oral de AmB, Nistatina lipossômica, Nistatina tópica, Pimaricina, Griseofulvina, Ciclopiroxolamina, Haloprogina, Tolnaflato, Undecilenato.

Alternativamente, os polipeptídeos podem ser combinados com agentes anti-protistas convencionais, tais como: isetionato de propamidina, brolina, imidazolas (por exemplo, miconazola), aminoglicosídeos tópicos (por exemplo, neomicina) e anti-sépticos tópicos (por exemplo, polihexametileno biguanida), clorexidina propamidina, Cloroquina, Fansidar (Pirimetamina, Sulfadoxina) Amodiaquina Quinina/Quinidina, Halofantrina, Mefloquina, Arteméter/Artesunato, Malarona, Cloroquina, Proguanil e Doxiciclina.

Polipeptídeos de acordo com a invenção podem ser formulados em composições tendo uma série de diferentes formas dependendo, em particular, da maneira pela qual o polipeptídeo será usado. Assim, por exemplo, a composição pode estar na forma de um pó, tablete, cápsula, líquido, pomada, creme, gel, hidrogel, aerossol, spray, micela, emplastro transdérmico, lipossoma ou outra forma adequada que pode ser administrada a uma pessoa ou animal. Será apreciado que o veículo da composição da invenção deverá um o qual é bem tolerado pelo indivíduo ao qual ele é fornecido e, de preferência, permite a distribuição dos polipeptídeos ou derivados a um tecido alvo.

Composições compreendendo polipeptídeos, agentes, ácidos nucleicos ou derivados de acordo com a invenção podem ser usadas em uma série de formas. Por exemplo, administração oral pode ser requerida, caso no qual o composto pode estar contido dentro de uma composição que pode, por exemplo, ser ingerida oralmente na forma de um tablete, cápsula ou líquido. Alternativamente, a composição pode ser administrada sistemicamente através de injeção na corrente sangüínea. Injeções podem ser intravenosas (bolo ou infusão) ou subcutâneas (bolo ou infusão). Os compostos podem ser administrados através de inalação (por exemplo, intranasalmente).

Composições compreendendo polipeptídeos de acordo com a invenção podem ser oralmente administradas ou sistemicamente administradas. Além disso, composições podem ser administradas através de aerossol, por exemplo, usando um atomizador, as quais podem ser administradas nasalmente ou através de um inalador via os pulmões.

Alternativamente, as composições podem ser topicamente aplicadas, por exemplo, na forma de um creme ou gel. Administração tópica é útil quando um indivíduo a ser tratado tem uma infecção bacteriana na pele. A composição pode ser aplicada intravaginalmente (por exemplo, se requerido para proteger o indivíduo de doenças sexualmente transmissíveis) ou retalmente.

Os polipeptídeos e derivados dos mesmos podem também ser incorporados dentro de um dispositivo com liberação lenta ou retardada. Tais dispositivos podem, por exemplo, ser inseridos sobre ou sob a pele e o composto pode ser liberado durante semanas ou mesmo meses. Tais dispositivos podem ser particularmente vantajosos quando tratamento a longo prazo com um polipeptídeo ou derivado de acordo com a invenção é requerido e o qual normalmente requererá administração freqüente (por exemplo, pelo menos injeção diária).

Será apreciado que a quantidade de um polipeptídeo ou derivado que é requerida é determinada por sua atividade biológica e biodisponibilidade a qual, por sua vez, depende do modo de administração, das propriedades físico-químicas do polipeptídeo, agente, ácido nucleico ou derivado empregado e se o polipeptídeo, agente, ácido nucleico ou derivado está sendo usado como uma monoterapia ou em terapia combinada. A freqüência de administração também será influenciada pelos fatores mencionados acima e particularmente a meia-vida do polipeptídeo, agente, ácido nucleico ou derivado dentro do indivíduo que está sendo tratado.

Dosagens ótimas a serem administradas podem ser determinadas por aqueles habilitados na técnica e variarão com o polipeptídeo em uso particular, a resistência do preparado, o modo de administração, o tipo de infecção que está sendo tratada ou prevenida e o avanço da condições doentia. Fatores adicionais dependendo do indivíduo que está sendo tratado em particular resultarão em uma necessidade de ajustar as dosagens, incluindo idade, peso, sexo, dieta do indivíduo e momento de administração.

Aqueles habilitados na técnica apreciarão que um conhecimento da IC50 para os polipeptídeos permitirá que eles calculem a concentração de polipeptídeo em uma formulação em particular e também a quantidade de um polipeptídeo que deverá ser administrada a um indivíduo que precisa de tratamento. O inventor descobriu que os polipeptídeos, e derivados dos mesmos, de acordo com a invenção têm, de preferência, uma eficácia para inibição de crescimento fungico de modo que seu valor de IC5o está em torno de 75 μΜ ou menos, mais preferivelmente cerca de 60 μΜ ou menos, ainda mais preferivelmente cerca de 50 μΜ ou menos e, ainda mais preferivelmente, cerca de 40 μΜ ou menos. Contudo, é preferido que o valor de IC50 seja cerca de 30 μΜ ou menos, mais preferivelmente cerca de 20 μΜ ou menos e, ainda mais preferivelmente, cerca de 10 μΜ ou menos. Na verdade, no caso de pelo menos alguns dos peptídeos de acordo com a invenção, o inventor ficou mais surpreso ao estabelecer que valores de IC50 de cerca de 5 μΜ ou menos e mesmo de cerca de 2,5 μΜ ou menos eram obteníveis (por exemplo, MU4). Aqueles habilitados na técnica apreciarão como os valores de IC50 podem ser calculados para fungos.

Polipeptídeos e derivados dos mesmos de acordo com a invenção têm, de preferência, uma eficácia para inibição de crescimento protista de modo que seu valor de IC50 é cerca de 250 μΜ ou menos. E mais preferido que o valor de IC50 para inibição de crescimento de protistas seja cerca de 100 μΜ ou menos, mais preferivelmente cerca de 50 μΜ ou menos e, ainda mais preferivelmente, cerca de 40 μΜ ou menos. Conforme acima, aqueles habilitados na técnica apreciarão como os valores de IC50 podem ser calculados para protistas.

Procedimentos conhecidos, tais como aqueles convencionalmente empregados pela indústria farmacêutica (por exemplo, experimentação in vivo, experimentos clínicos, etc.), podem ser usados para estabelecer formulações específicas de polipeptídeos ou derivados de acordo com a invenção e regimes terapêuticos precisos (tais como doses diárias e a freqüência de administração).

Geralmente, uma dose diária entre 0,01 μΕ/kg de peso corporal e 0,5 g/kg de peso corporal de polipeptídeos ou derivados de acordo com a invenção pode ser usada para a prevenção e/ou tratamento de uma infecção viral, dependendo de qual polipeptídeo, agente, ácido nucleico ou derivado específico é usado. Mais preferivelmente, a dose diária está entre 0.01 mg/kg de peso corporal e 200 mg/kg de peso corporal e, mais preferivelmente, entre aproximadamente 1 mg/kg e 100 mg/kg.

Doses diárias podem ser fornecidas como uma única administração (por exemplo, uma única injeção diária). Alternativamente, o polipeptídeo ou derivado do mesmo usado pode requer administração duas ou mais vezes durante um dia. Como um exemplo, polipeptídeos de acordo com a invenção podem ser administrados como duas (ou mais, dependendo da gravidade da condição) doses diárias de entre 25 mg e 7000 mg (isto é, admitindo um peso corporal de 70 kg). Um paciente que está recebendo tratamento pode tomar uma primeira dose ao acordar e, então, uma segunda dose ao anoitecer (se sob um regime com duas doses) ou em intervalos de 3 ou 4 horas após isso. Alternativamente, um dispositivo com liberação lenta pode ser usado para fornecer doses ótimas a um paciente sem a necessidade de administrar doses repetidas.

A presente invenção proporciona uma composição farmacêutica compreendendo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um polipeptídeo ou derivado de acordo com a invenção e, opcionalmente, um veículo farmaceuticamente aceitável. Em uma modalidade, a quantidade do polipeptídeo ou derivado do mesmo é uma quantidade de cerca de 0,01 mg a cerca de 800 mg. Em outra modalidade, a quantidade do polipeptídeo, agente, ácido nucleico ou derivado é uma quantidade de cerca de 0,01 mg a cerca de 500 mg. Em outra modalidade, a quantidade do polipeptídeo ou derivado é uma quantidade de cerca de 0,01mg a cerca de 250 mg. Em outra modalidade, a quantidade do polipeptídeo ou derivado é uma quantidade de cerca de 0,1 mg a cerca de 60 mg. Em outra modalidade, a quantidade do polipeptídeo ou derivado é uma quantidade de cerca de 0,1 mg a cerca de 20 mg.

A presente invenção proporciona um processo para fabricação de uma composição farmacêutica compreendendo combinação de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um polipeptídeo ou derivado do mesmo de acordo com a invenção e um veículo farmaceuticamente aceitável.

Uma "quantidade terapeuticamente eficaz" é qualquer quantidade de um polipeptídeo ou derivado de acordo com a invenção a qual, quando administrada a um indivíduo, proporciona prevenção e/ou tratamento de uma infecção fungica e/ou por protista. Um "indivíduo" pode ser um vertebrado, mamífero, animal doméstico ou ser humano.

Um "veículo farmaceuticamente aceitável", conforme referido aqui, é qualquer veículo fisiológico conhecido por aqueles habilitados na técnica útil na formulação de composições farmacêuticas.

Em uma modalidade preferida, o veículo farmacêutico é um líquido e a composição farmacêutica está na forma de uma solução. Em outra modalidade, o veículo farmaceuticamente aceitável é um sólido e a composição está na forma de um pó ou tablete. Em uma outra modalidade, o veículo farmacêutico é um gel e a composição está na forma de um creme ou semelhante.

Um veículo sólido pode incluir uma ou mais substâncias, as quais também podem atuar como agentes de flavorização, lubrificantes, solubilizantes, agentes de suspensão, cargas, agentes de deslizamento, auxiliares de compressão, aglutinantes ou agentes de desintegração de tablete; ele também pode ser um material de encapsulação. Em pós, o veículo é um sólido finamente dividido que está em mistura com o polipeptídeo ou derivado ativo finamente dividido. Em tabletes, o polipeptídeo ou derivado ativo é misturado com um veículo tendo as propriedades de compressão necessárias em proporções adequadas e compactado no formato e tamanho desejados. Os pós e tabletes contêm, de preferência, até 99% do polipeptídeo ou derivado ativo.

Veículos sólidos adequados incluem, por exemplo, fosfato de cálcio, estearato de magnésio, talco, açúcares, lactose, dextrina, amido, gelatina, celulose, polivinilpirrolidina, ceras de baixo ponto de fusão e resinas de troca de íons.

Veículos líquidos são usados no preparo de soluções, suspensões, emulsões, xaropes, elixires e composições pressurizadas. O polipeptídeo ou derivado ativo pode ser dissolvido ou suspenso em um veículo líquido farmaceuticamente aceitável tal como água, um solvente orgânico, uma mistura de ambos ou óleos ou gorduras farmaceuticamente aceitáveis. O veículo líquido pode conter outros aditivos farmacêuticos adequados, tais como solubilizantes, emulsificantes, tampões, conservantes, adoçantes, agentes de flavorização, agentes de suspensão, agentes de espessamento, colorantes, reguladores de viscosidade, estabilizantes ou osmo- reguladores. Exemplos adequados de veículos líquidos para administração oral e parenteral incluem água (parcialmente contendo aditivos conforme acima, por exemplo, derivados de celulose, de preferência solução de carbóxi metil celulose de sódio), álcoois (incluindo álcoois monoídricos e álcoois poliídricos, por exemplo, glicóis) e seus derivados e óleos (por exemplo, óleo de coco fracionado e óleo de amendoim). Para administração parenteral, o veículo também pode ser um éster oleoso, tal como oleato de etila e miristato de isopropila. Veículos líquidos estéreis são úteis em composições na forma líquida estéril para administração parenteral. O veículo líquido para composições pressurizadas pode ser hidrocarboneto halogenado ou outro propelente farmaceuticamente aceitável.

Composições farmacêuticas líquidas as quais são soluções ou suspensões estéreis podem ser utilizadas, por exemplo, para injeção intramuscular, intratecal, epidural, intraperitoneal, intravenosa e particularmente subcutânea, intracerebral ou intra-cérebroventricular. O polipeptídeo ou derivado pode ser preparado como uma composição sólida estéril que pode ser dissolvida ou suspensa no momento de administração usando água estéril, solução salina ou outro meio injetável estéril apropriado. Veículos se destinam a incluir aglutinantes, agentes de suspensão, lubrificantes, flavorizantes, adoçantes, conservantes, corantes e revestimentos inertes e necessários.

Polipeptídeos ou derivados de acordo com a invenção podem ser administrados oralmente na forma de uma solução ou suspensão estéril contendo outros solutos ou agentes de suspensão (por exemplo, solução salina ou glicose o bastante para tornar a solução isotônica), sais biliares, acácia, gelatina, monoleato de sorbitan, polisorbato 80 (ésteres de oleato de sorbitol e seus anidridos copolimerizados com óxido de etileno) e semelhantes.

Os polipeptídeos também podem ser administrados oralmente na forma de composição líquida ou sólida. Composições adequadas para administração oral incluem formas sólidas, tais como pílulas, cápsulas, grânulos, tabletes e pós, e formas líquidas, tais como soluções, xaropes, elixires e suspensões. Formas úteis para administração parenteral incluem soluções estéreis, emulsões e suspensões.

Os polipeptídeos ou derivados podem ser usados para tratar qualquer mamífero, por exemplo, ser humano, animal de criação, animal de estimação, para impedir que infecção ocorra.

A guisa de exemplo, os polipeptídeos ou derivados de acordo com a invenção podem ser usados para prevenir infecções por Candida. Quando esse é o caso, o medicamento pode ser formulado como um creme e pode ser usado na forma de um pessário.

A guisa de outro exemplo, polipeptídeos ou derivados de acordo com a invenção podem ser usados para prevenir infecções de "pé de atleta". Quando esse é o caso, o medicamento pode ser formulado como um creme e pode ser aplicado à área afetada da pele.

A guisa de outro exemplo, polipeptídeos ou derivados de acordo com a invenção podem ser usados para prevenir ou tratar malária.

Quando usado para prevenir infecção, então, é preferido que uma quantidade terapeuticamente eficaz do polipeptídeo (por exemplo, cerca de 10 mg do polipeptídeo) seja administrada à pele do indivíduo em uma composição adequada, por exemplo, como um creme, loção ou aerossol. Será apreciado que existem métodos os quais objetivam prevenir ou tratar malária no homem. Um de tais métodos de tratamento (ou regime) consiste de administração intravenosa do composto Quinina a um paciente. A dose de carga é aproximadamente 15 mg/kg de base de quinina em cerca de 10 ml/kg de solução salina normal ou dextrose a 5% e é injetada no indivíduo durante um período de cerca de 4 horas. Doses de manutenção subseqüentes de cerca de 8,3 mg/kg de base de quinina são, então, infundidas no paciente ou indivíduo durante 4 horas e a cada 8 horas, até que uma administração oral de quinina seja possível. Em pacientes que requerem mais de 72 horas de tratamento intravenoso, a dose pode ser reduzida para cerca de 5,6 mg de base por kg fornecida a cada 8 horas. O inventor da presente invenção acredita que os peptídeos de acordo com a invenção podem ser usados em si ou em conjunto com ou como um suplemento aos regimes de tratamento existentes para malária. Por exemplo, quantidades terapeuticamente eficazes (por exemplo, cerca de 10 mg) do peptídeo de acordo com a invenção podem ser adicionadas à solução de quinona a ser injetada no indivíduo. O peptídeo de acordo com a invenção pode ou não ser administrado oralmente. Contudo, é preferido que o peptídeo não seja administrado oralmente.

De acordo com um quarto aspecto da invenção, é proporcionado um método de prevenção e/ou tratamento de uma infecção fungica e/ou por protista compreendendo administração, a um indivíduo que precisa de tal tratamento, de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um polipeptídeo, derivado ou análogo ou ácido nucleico de acordo com a invenção.

O método de acordo com o quarto aspecto da invenção pode empregar qualquer medicamento e qualquer uso discutido com relação aos primeiro, segundo e terceiro aspectos da invenção.

Será apreciado que infecções fungicas e por protista também podem ser um problema em plantas importantes para horticultura e/ou agricultura. Portanto, as formulações de peptídeos discutidas acima podem ser adaptadas para aplicação à plantas. Assim, de acordo com um quinto aspecto da invenção, é proporcionado um método de prevenção ou tratamento de uma infecção fungica e/ou por protista de uma planta compreendendo aplicação de um polipeptídeo conforme definido nos primeiro, segundo ou terceiro aspectos da invenção a uma planta que precisa de tal tratamento.

Os polipeptídeos conforme definido acima podem ser usados como agentes antimicrobianos para pulverização sobre safras e semelhantes. Por exemplo, os peptídeos também podem ser usados para tratar infecções fungicas de espécies de planta, incluindo contaminação fungica de safras de cereal, contaminação fungica de grãos armazenados, murchidão da batata e modo penulgento de uvas.

Exemplos de espécies fungicas as quais causam infecções fungicas agricolamente importantes (por exemplo, em plantas) e as quais podem ser tratadas pelos peptídeos de acordo com a invenção podem incluir Ascomycetes preferidos, os quais podem ser independentemente selecionados de um grupo consistindo de: Erisyphe; Pueeinia; Leptoshaeria; Thanatephorus; Pyrieularia; Phytopthora; Plasmopara; Alternaria; Guignardia; Pseudoceroeosporella; Venturia; Monolinia; e Ustilago. Além disso, outros exemplos de fungos agricolamente importantes incluem Botryotinia spp; e Cochilobus spp; e, mais preferivelmente, Magnaporthe spp. Um Magnaporthe spp. Preferido inclui Μ. grisea.

Os polipeptídeos podem ser usados para tratar espécies de planta sofrendo de uma infecção fúngica ou por protista. Aqueles habilitados na técnica apreciarão que a formulação e dosagem precisas para uso agrícola ou em horticultura dependerão do peptídeo usado, do tipo de planta tratada, do tamanho da planta tratada e também da escala de tratamento requerida (por exemplo, pode ser requerido que muitos acres ou uma única planta seja tratada). Em geral, uma quantidade do polipeptídeo eficaz para tratamento de uma única planta de batata é cerca de 0,01-100 mg. E mais preferido que cerca de 10 mg do polipeptídeo sejam administrados diretamente sobre a planta ou às suas raízes em uma formulação adequada, por exemplo, por um líquido ou spray.

Polipeptídeos usados no quinto aspecto da invenção podem ser adicionados à formulações existentes usadas para tratar plantas, tais como pesticidas, agentes para matar ervas daninhas, etc. Por exemplo, Ridomil Gold MZ pode ser aplicado à folhagem de plantas de batata para controlar a requeima causada por Phytophthora infestam. Preliminarmente na estação, 1,2 Kg de Ridomil Gold MZ podem ser aplicados à safra por acre. Tratamentos preventivos são iniciados quando as condições são favoráveis para a doença (isto é, de preferência, antes de infecção). Até três aplicações podem ser feitas, em intervalos de 14 dias. O inventor acredita que tais regimes para prevenção de murchidão da batata podem ser suplementados e, surpreendentemente, aperfeiçoados através de incorporação dos peptídeos de acordo com a invenção na solução Ridomil Gold MZ.

O inventor entende que os polipeptídeos de acordo com a invenção também podem ser colocados em uma série de outros usos antimicrobianos (quer em um contexto clínico ou de outro modo). Por exemplo, além de administração dos polipeptídeos a um paciente, animal ou planta, eles podem ser usados para revestir superfícies e objetos para prevenir ou tratar contaminação fungica e/ou por protista.

Portanto, em um sexto aspecto, é proporcionado um método de prevenção e/ou tratamento de uma contaminação fungica e/ou por protista compreendendo revestimento de um objeto ou uma superfície que precisa do mesmo com uma quantidade de um polipeptídeo de acordo com os primeiro, segundo ou terceiro aspectos da invenção, que é eficaz para matar ou prevenir crescimento de fungos e/ou protistas.

Será apreciado que o polipeptídeo pode ser particularmente útil para revestimento de superfícies ou objetos os quais é requerido serem assépticos. Conforme discutido acima, muitos dos polipeptídeos têm a vantagem de que eles são anti-fungicos, anti-protistas e, além disso, também antivirais e antibacterianos. Conseqüentemente, o polipeptídeo terá um efeito anti-microbiano muito amplo através de vários reinos. Além disso, conforme discutido em maiores detalhes abaixo, os polipeptídeos são capazes de aderir à superfícies e são, desse modo, eficazes durante períodos de tempo mais longos.

Os polipeptídeos podem ser usados para revestir qualquer objetivo ou dispositivo o qual é usado em uma situação biológica ou médica, tal como um dispositivo médico, e para a qual pode ser importante prevenir uma contaminação fungica ou por protista que pode levar a qualquer infecção em um paciente. Exemplos de dispositivos médicos que podem ser revestidos de acordo com o sexto aspecto da invenção incluem lentes, lentes de contato, cateteres, stents, curativos para cicatrização de feridas, contraceptivos, implantes cirúrgicos e articulações de reposição.

Os polipeptídeos são particularmente úteis para revestimento de biomateriais e objetos e dispositivos feitos dos mesmos. Contaminação/infecção fungica ou por protista de biomateriais pode ser particularmente problemática porque o fungo ou protista pode usar tal material como um substrato para crescimento. Biomateriais (por exemplo, colágenos e outros polímeros biológicos) podem ser usados para revestir articulações artificiais. Alternativamente, determinados implantes podem compreender substancialmente tais biomateriais.

Os polipeptídeos podem ser usados para revestir superfícies em ambientes os quais é requerido serem assépticos. Por exemplo, os polipeptídeos podem ser usados em ambientes médicos. Os polipeptídeos podem ser usados para manter divisórias hospitalares limpas. Eles podem ser usados para limpar superfícies de equipamento (por exemplo, mesas de operação) em salas de operação, bem como paredes e pisos de salas de operação. Os inventores acreditam que os polipeptídeos serão úteis para melhorar a esterilidade em geral.

Os polipeptídeos podem ser formulados em soluções para limpeza de objetos e superfícies. Por exemplo, eles podem ser um constituinte de rotina de soluções fisiológicas (por exemplo, como um constituinte de solução salina fisiológica).

O Exemplo 3 ilustra bem como polipeptídeos de acordo com a invenção aderem à lentes de contato. Conseqüentemente, os peptídeos de acordo com a invenção são muito úteis, uma vez que foi mostrado que eles aderem fortemente a um artigo ou superfície usada em um cenário biológico.

Será apreciado que a lista acima de objetos e superfícies aos quais os polipeptídeos de acordo com a invenção podem ser aplicados não é exaustiva. Conseqüentemente, os polipeptídeos podem ser administrados a qualquer superfície a qual está propensa a uma contaminação füngica ou por protista, por exemplo, superfícies e produtos de cozinha e banheiro, tais como o assento de um vaso sanitário ou o vaso sanitário em si.

Em uma modalidade preferida, os polipeptídeos podem ser incluídos em solução salina usada para armazenar lentes de contato.

Polipeptídeos preferidos de acordo com a invenção sal altamente carregados positivamente. Isso torna os mesmos particularmente adequados para revestimento de superfícies e objetos para prevenir crescimento de amplas categorias de fungos e protistas. O Exemplo 3 e Figuras 3 e 4 ilustram claramente bem como os polipeptídeos de acordo com a invenção aderem a uma faixa de diferentes superfícies, isto é, vidro (lamínulas), vidro previamente revestido com o biomaterial (poli)lactídeo-co- glicolídeo (PLGA) e lentes de contato.

De preferência, revestimento do objetivo ou superfície pode ser realizada através de preparo de uma solução aquosa em um pH e temperatura apropriados para os referidos polipeptídeos de acordo com a invenção. O objeto ou superfície é exposta à referida solução durante um tempo suficiente para permitir imobilização ou absorção de uma quantidade adequada dos polipeptídeos à superfície dos mesmos ou permitir tempo suficiente para matar o fungo ou protista.

Em uma modalidade preferida do sexto aspecto da invenção, uma solução suficientemente concentrada de um polipeptídeo de acordo com a invenção é preparada e contatada com o objeto a ser revestido durante um período de tempo suficiente. Aqueles habilitados na técnica apreciarão como fazer uma solução de polipeptídeo da concentração requerida, uma vez que isso dependerá do polipeptídeo que está sendo usado em particular e do fungo ou protista a ser tratado e da superfície que está sendo revestida. Por exemplo, o objeto pode ser inserido na solução (por exemplo, compreendendo cerca de 40 μΜ do polipeptídeo) e deixado durante cerca de 15 minutos em torno de 20 °C. Após exposição ao polipeptídeo, o objeto pode ser lavado, por exemplo, em um tampão adequado, tal como PBS. Pode ser requerido deixar o objeto no tampão de lavagem durante a noite. Após lavagem, o polipeptídeo, então, terá aderido ao objeto e o objeto, revestido com o polipeptídeo protetor, está pronto para uso.

De acordo com um sétimo aspecto da invenção, é proporcionada um lente de contato pelo menos parcialmente revestida com um polipeptídeo de acordo com os primeiro, segundo ou terceiro aspectos da invenção. O polipeptídeo aplicado à superfície da lente de contato impede que contaminação fungica e/ou por protista ocorre, que pode resultar em infecções que ocorrem nos olhos do usuário.

Em uma modalidade, a lente pode ser uma lente descartável de um dia (isto é, usada durante um dia e, então, descartada), caso no qual contaminação fungica e/ou por protista é evitada antes que a lente seja usada e também quando de remoção de sua embalagem. Conseqüentemente, a lente pode ser pré-tratada com o polipeptídeo e/ou pode ser embalada em uma solução contendo o polipeptídeo. A lente revestida com o polipeptídeo reduz a probabilidade de uma infecção fungica no usuário que pode ocorrer enquanto a lente de contato está sendo usada.

Alternativamente, uma lente pode ser repetidamente usada em uma base diária durante vários meses ou anos, mas tirada e lavada e guardada em uma solução durante a noite. Quando esse é o caso, um revestimento de polipeptídeo sobre a lente (antes do primeiro uso) e/ou de preferência uso dos polipeptídeos em soluções de lavagem para a lente, reduzirá significativamente a probabilidade de que uma infecção fungica ou por protista do usuário ocorra enquanto a lente está sendo usada ou a lente seja contaminada enquanto está guardada e lavada durante a noite.

Em outra modalidade, a lente pode ser uma lente de uso prolongado, a qual é constantemente usada nos olhos durante períodos de tempo prolongados, por exemplo, mais de um dia, vários dias, uma semana ou mesmo um mês ou mais. Usuários de tais lentes de contato têm um risco de desenvolver uma infecção fungica ou por protista. Conseqüentemente, nesse caso, o polipeptídeo pode ser usado para revestir a lente antes de seu primeiro uso. Uso de tais lentes revestidas reduzirá grandemente a probabilidade de que uma infecção fungica ou por protista ocorra enquanto a lente está sendo usada durante tais períodos prolongados de tempo. Em uma modalidade preferida, a lente é revestida com um polipeptídeo de acordo com a invenção e, onde apropriado, guardada e/ou lavada em uma solução compreendendo o polipeptídeo.

Será apreciado que agentes que aumentam a atividade dos polipeptídeos ou derivados ou análogos de acordo com a invenção podem ser usados para aumentar "indiretamente" a atividade de tais polipeptídeos, derivados ou análogos. Assim, de acordo com um oitavo aspecto da invenção, é proporcionado um agente capaz de aumentar a atividade biológica de um polipeptídeo, derivado ou análogo de acordo com os primeiro, segundo ou terceiro aspectos da invenção para uso como um medicamento para tratamento de uma infecção fungica e/ou por protista.

Agentes capazes de aumentar a atividade biológica de polipeptídeos, derivados ou análogos de acordo com a invenção podem obter seu efeito através de uma série de meios. Por exemplo, tais agentes podem aumentar a expressão de tais polipeptídeos, derivados ou análogos.

Alternativamente (ou além disso), tais agentes podem aumentar a meia-vida dos polipeptídeos, derivados ou análogos de acordo com a invenção em um sistema biológico, por exemplo, através de diminuição da reposição dos polipeptídeos, derivados ou análogos.

O inventor ainda estabeleceu que vários polipeptídeos ou agentes de acordo com a invenção podem ser combinados e usados para prevenir ou tratar uma ampla faixa de infecções/contaminações fungicas ou por protista (bem como infecções/contaminações virais e bacterianas). Por exemplo, pode ser preferido tratar uma infecção/contaminação fungica ou por protista com uma combinação de polipeptídeos de acordo com qualquer um dos primeiro, segundo ou terceiro aspectos, tal como um polipeptídeo independentemente selecionado de um grupo consistindo de MU4, MU7, MUlO ou MUl 14. Contudo, será apreciado que diferentes combinações de polipeptídeos podem ser usadas para prevenir ou tratar diferentes infecções fungicas ou por protista.

Além disso, o polipeptídeo e agentes de acordo com a invenção podem ser usados para minimizar, prevenir ou tratar contaminação ou crescimento fungico ou protista através de uso como ou em conjunto com um conservante. Conseqüentemente, os polipeptídeos e agentes podem ser usados como um conservante em gêneros alimentícios. Além disso, os polipeptídeos e agentes podem ser usados para minimizar ou prevenir crescimento fungico ou protista em culturas, por exemplo, em trabalho de cultura tecidual, para suplementar ou repor antibióticos e outros agentes anti- fungicos/anti-protistas. Além disso, os polipeptídeos podem ser usados como agentes seletivos, como um agente diagnóstico, por exemplo, para crescimento fungico ou protista em meios de cultura. Por exemplo, um primeiro polipeptídeo pode ser adicionado ao meio, o qual é particularmente ativo contra um primeiro fungo, e um segundo polipeptídeo pode ser adicionado ao meio, o qual é particularmente ativo contra um segundo fungo. Um método similar poderia ser usado para diagnóstico de protista.

Os polipeptídeos, análogos ou derivados da invenção representam produtos que podem, vantajosamente, ser expressos por células biológicas. Portanto, a presente invenção também proporciona, em um nono aspecto, uma seqüência de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo, derivado ou análogo de acordo com os primeiro, segundo ou terceiro aspectos da invenção.

Ácidos nucleicos preferidos de acordo com o nono aspecto da invenção podem ser selecionados do grupo consistindo de: SEQ ID No. 56 (cttcgtaaacttcgtaaacgtcttctt), SEQ ID No. 57 (cgtcttactcgtaaacgtggtcttaaa), SEQ ID No. 58 (cttcgtaaacgtcttcttcttcgtaaacttcgtaaacgtcttctt), SEQ ID No. 59 (caatctactgaagaacttcgtgttcgtcttgctagtcatcttcgtaaacttcgtaaacgtcttctt), SEQ ID No. 60 (cttcgtgttcgtcttgctagtcatcttcgtaaacttcgtaaacgtcttcttcgtgatgctgatgatcttcaa aaacgtcttgctgtttatcttcgtgttcgtcttgctagtcatcttcgtaaacttcgtaaacgtcttcttcgtgatgctgat gatcttcaaaaacgtcttgctgtttat), SEQ ID No. 61 (cttcgtaaacttcgtaaacgtcttcttcttcgtaaacttcgtaaacgtcttctt), SEQ ID No. 62 (tggcgtaaatggcgtaaacgttggtggtggcgtaaatggcgtaaacgttggtgg), SEQ ID No. 63 (tggcgtaaatggcgtaaacgttggtggcgtaaatggcgtaaacgttgg), SEQ ID No. 64 (tggcgtaaat ggcgtaaacgttggtggcttcgtaaacttcgtaaacgtcttctt), SEQ ID No. 65 (tatcgtaaatatcgtaaacg ttattattatcgtaaatatcgtaaacgttattat), SEQ ID No. 66 (cttcgtaaacttcgtaaacgtcttcgtaaacttcgtaaacgt), SEQ ID No. 67 (cgtcttactcgtaaacgtggtcttaaacgtcttactcgtaaacgtggtcttaaa), SEQ ID No. 68 (cgtactcgtaaacgtggtcgtcgtactcgtaaacgtggtcgt), SEQ ID No. 69 (cttcgtaaacgtaaacgtcttcttcgtaaacgtaaacgtctt), SEQ ID No. 70 (cttcgtaaacgtaaacgtcttcgtaaacttcgtaaacgtaaacgtcttcgtaaa), SEQ ID No. 71 (tggcgttggcgtaaacgttggcgtaaatggcgttggcgtaaacgttggcgtaaa), SEQ ID No. 72 (MU4) (tggcgtaaatggcgtaaacgttggtggtggcgtaaatggcgtaaacgttggtgg), SEQ ID No. 74 (MUlO) (ttacgtaaattacgtaaacgtttattattacgtaaattacgtaaacgtttatta) e SEQ ID No. 75 (MUI 14) (tggcgtaaatggcgtaaacgtttattattacgtaaattacgtaaacgtttatta).

Ácidos nucleicos preferidos ainda incluem aqueles correspondendo à moléculas de DNA que codificam quaisquer polipeptídeos preferidos de acordo com a invenção.

Será apreciado que, em virtude da redundância do código genético, uma seqüência de ácido nucleico de acordo com a invenção pode variar com relação à seqüência que ocorre naturalmente (por exemplo, nos genes de ApoB ou ApoE), proporcionando um códon que codifica um polipeptídeo, derivado ou análogo do mesmo de acordo com os primeiro, segundo ou terceiro aspectos da invenção.

Será apreciado que os polipeptídeos, derivados e análogos de acordo com a invenção representam agentes favoráveis a serem administrados através de técnicas envolvendo expressão celular de seqüências de ácido nucleico que codificam tais moléculas. Tais métodos de expressão celular são particularmente adequados para uso médico, no qual os efeitos terapêuticos dos polipeptídeos, derivados e análogos são requeridos durante um período prolongado.

Assim, de acordo com um décimo aspecto da presente invenção, é proporcionada uma seqüência de ácido nucleico de acordo com o aspecto anterior da invenção para uso como um medicamento.

De acordo com um décimo primeiro aspecto, é proporcionado uso do ácido nucleico para o preparo de um medicamento para tratamento de uma infecção fungica e/ou por protista.

O ácido nucleico pode, de preferência, ser uma seqüência de ácido nucleico isolada ou purificada. A seqüência de ácido nucleico pode ser, de preferência, uma seqüência de DNA.

A seqüência de ácido nucleico pode ainda compreender elementos capazes de controlar e/ou intensificar sua expressão. A molécula de ácido nucleico pode estar contida dentro de um vetor adequado para formar um vetor recombinante. O vetor pode, por exemplo, ser um plasmídeo, cosmídeo ou fago. Tais vetores recombinantes são altamente úteis como sistemas de distribuição para transformação de células com a molécula de ácido nucleico.

Vetores recombinantes também podem incluir outros elementos funcionais. Por exemplo, os vetores recombinantes podem ser projetados de modo que o vetor se reproduza automaticamente na célula. Nesse caso, elementos que induzem à replicação de ácido nucleico podem ser requeridos no vetor recombinante. Alternativamente, o vetor recombinante pode ser projetado de modo que o vetor e a molécula de ácido nucleico recombinante se integrem no genoma de uma célula. Nesse caso, seqüências de ácido nucleico as quais favorecem a integração objetivada (por exemplo, através de recombinação homóloga) são desejáveis. Vetores recombinantes também podem compreender DNA que codifica genes que podem ser usados como marcadores selecionáveis no processo de clonagem.

O vetor recombinante também pode ainda compreender um promotor ou regulador para controlar a expressão do gene, conforme requerido.

A molécula de ácido nucleico pode ser (mas não necessariamente) uma a qual se torna incorporada no DNA das células do indivíduo que está sendo tratado. Células não diferenciadas podem ser estavelmente transformadas, levando à produção de células filha geneticamente modificadas (caso no qual, regulação de expressão no indivíduo pode ser requerida, por exemplo, com fatores de transcrição específicos ou ativadores de gene). Alternativamente, o sistema de distribuição pode ser projetado para favorecer transformação instável ou transitória de células diferenciadas no indivíduo que está sendo tratado. Quando esse é o cão, regulação de expressão pode ser menos importante porque expressão da molécula de DNA cessará quando as células transformadas morrem ou param de expressar a proteína (idealmente, quando o efeito terapêutico requerido foi obtido).

Um sistema de distribuição pode proporcionar a molécula de ácido nucleico ao indivíduo sem que ela seja incorporada em um vetor. Por exemplo, a molécula de ácido nucleico pode ser incorporada dentro de um lipossoma ou partícula viral. Alternativamente, uma molécula de ácido nucleico nu pode ser inserida nas células de um indivíduo através de um meio adequado, por exemplo, captação endocitótica direta.

A molécula de ácido nucleico pode ser transferida para células de um indivíduo a ser tratado através de transfecção, infecção, microinjeção, fusão celular, fusão de protoplasto ou bombardeamento balístico. Por exemplo, transferência pode ser através de transfecção balística com partículas de ouro revestidas, lipossomas contendo a molécula de ácido nucleico, vetores virais (por exemplo, adenovírus) e meios para proporcionar captação direta de ácido nucleico (por exemplo, endocitose) através de aplicação da molécula de ácido nucleico diretamente.

Modalidades da invenção serão agora ainda descritas, à guisa de exemplo apenas, com referência aos Exemplos e figuras a seguir, nas quais:

A Figura 1 mostra dados de espectrometria de massa típicos e ilustra que o peptídeo era >95% puro;

A Figura 2 mostra dados de HPLC típicos e ilustra que o peptídeo era >95% puro;

A Figura 3 ilustra lentes de contato Acuvue da Johnson and Johnson as quais tinham sido tratadas durante 15 min com GINlp a 40 μΜ (o qual tinha sido sintetizado com a adição de um resíduo de cisteína tendo uma tag fluorescente), então, lavada 4 vezes, incluindo um embebimento durante a noite em 25 ml de PBS, conforme discutido no Exemplo 3;

A Figura 4 ilustra lamínulas de vidro (BG) ou lamínulas previamente revestidas com o biomaterial (poli)lactídeo-co-glicolídeo (PLGA), as quais tinham sido tratadas durante 15 min com GINlp a 40 μΜ (o qual tinha sido sintetizado com a adição de um resíduo de cisteína tendo uma tag fluorescente), então, lavada 4 vezes, incluindo um embebimento durante a noite em 25 ml de PBS, conforme discutido no Exemplo 3; e

A Figura 5 ilustra a inibição de invasão de hepatócitos por Plasmodium spp. mediada pelos peptídeos de acordo com a invenção em: (A) células incubadas com Plasmodium e peptídeo; e (B) células incubadas com Plasmodium, lavadas e, então, peptídeo adicionado, conforme discutido no Exemplo 5.

EXEMPLOS

O inventor realizou uma série de experimentos para investigar a atividade anti-fungica e também anti-protista dos polipeptídeos de acordo com a invenção. A atividade dos polipeptídeos foi testada contra uma série de diferentes fungos (Exemplos 1 e 4) e protistas (Exemplos 2 e 5). Além disso, o inventor investigou a capacidade dos polipeptídeos de aderir a uma variedade de superfícies, por exemplo, lentes de contato, vidro e superfícies revestidas com o biomaterial "PLGA" (Exemplo 3) e, desse modo, prevenir contaminação fóngica ou por protista.

Peptídeos

Peptídeos (incluindo polipeptídeos de acordo com a invenção) foram obtidos na forma liofilizada a partir de um fornecedor comercial (AltaBioscience, University of Birmingham) e foram produzidos em uma escala de 5 micromoles. Aqueles habilitados na técnica conhecerão as técnicas padrões, as quais estão disponíveis para síntese de peptídeos, uma vez que uma seqüência de aminoácido se torne disponível. N-términos foram protegidos através da adição de um grupo acetila e os C-términos foram protegidos através da adição de um grupo amida. Pequenas quantidades de peptídeo foram pesadas em tubos de Eppendorf estéreis antes da adição de PBSA suficiente para produzir uma solução de estoque a 0,4 mM, a qual foi congelada a -85°C em alíquotas.

O peso molecular dos peptídeos foi confirmado através de espectrometria de massa por desabsorção a laser usando um analisador Finnigan LASERMAT 2000 MALDI-Time of Flight ou um espectrômetro de massa por MALDI-TOF da Scientific Analysis Group. Purificação por HPLC de peptídeos foi realizada usando uma coluna de fase reversa C-4 analítica Vydac usando TFA a 0,1% e TFA a 0,1%/acetonitrila a 80% como solventes ou, para alguns peptídeos, uma coluna de Fase Reversa Cl8 ACE, usando TFA a 0,05% e acetonitrila a 60% como solventes. Dados de espectrometria de massa típicos e traços de cromatografia de líquido de alto desempenho (HPLC) (pureza >95%) para o peptídeo GINlp são mostrados nas Figuras 1 e 2.

Exemplo 1 - Experimento para testar a atividade anti-fúngica de peptídeos

Quatro compostos foram fornecidos como uma solução aquosa, 400 μΜ. Diluições seriais foram preparadas além de um controle, o qual era um fármaco anti-fungico convencional, Anfotericina B. Anfotericina B é obtida dos laboratórios Invitrogen ou Melford.

Os peptídeos sob teste foram:

(i) MU4 - WRKWRKRWWWRKWRKRWW (SEQ ID NO. 9);

(ii) MUl0 - LRKLRKRLLLRKLRKRLL (SEQ ID NO. 8); e

(iii) MUl 14 - WRKWRKRLLLRKLRKRLL (SEQ ID NO. 26).

Testagem inicial dos peptídeos foi realizada contra os seguintes organismos:

1) Aspergillus fumigatus AF293 (cepa NCPF7367 da Cultura Collection)

2) Candida albicans 6862 (isolado clínico)

3) Fusarium spp 5889 (isolado clínico)

4) Fusarium spp 6507 (isolado clínico)

5) Aspergillus terreus (isolado clínico)

6) Aspergillus niger (isolado clínico)

7) Staphylococcus aureus (cepa Oxford, a qual é uma cepa de referência padrão usada em testagem de MIC)

A bactéria S. aureus foi testada com cada um dos peptídeos como um controle. Uma suspensão de cada organismo em um meio de crescimento apropriado foi adicionada às diluições dos peptídeos de forma a proporcionar faixas de concentração de 40 μΜ a 0,04 μΜ para cada um dos peptídeos e 64-0,025 μ§/ηι1 para anfotericina B. Cepas fungicas foram testadas em meio RPML RPMI é meio padrão do Roswell Park Memorial Institute (Morton, H.C., (1970), A survey of Commercially Available Tissue Culture Media In Vitro 6: 89-108).

S. aureus foi testado em caldo Isosensitest. Agar Isosensitest é um meio padrão para MIC usado por muitos laboratórios de hospital para MICs bacterianas usando um método de difusão em disco. O padrão de referência é Oxoid CM471. Também disponível na forma de caldo, CM473, para o método de ensaio de diluição de caldo bacteriano. NCCLS ref M7-A4. Ambos os métodos de NCCLS cotados são os métodos padrões.

O inóculo final para S. aureus era 5 χ 10^4 cfu/ml. O inóculo final para C. albicans era 2 χ IO3 cfu/ml. O inóculo final para Aspergillus fumigatus e paraFusarium spp era 2 χ 10^4 cfu/ml.

Lâminas de Candida e S. aureus foram lidas após 24 horas de incubação e as cepas de Aspergillus e Fusarium lidas após 48 horas. A MIC foi tomada como a menor concentração de fármaco ou composto que causou redução >80% no crescimento comparado com um controle isento de fármaco.

Tabela 2 - Efeito anti-fungico dos peptídeos

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A partir da Tabela 2, será observado que o peptídeo MU4 é o mais ativo dos peptídeos testados tendo atividade contra todas as quatro espécies fungicas testadas e, também surpreendentemente, contra S. aureus (uma bactéria gram positiva). Peptídeo MU4 é também ativo contra Aspergillus niger. Contudo, MU4 mostra baixa atividade contra Aspergillus terreus, o qual é conhecido por ser resistente a vários fármacos anti-fungicos.

MUlO e MUl 14 também mostraram atividade anti-fungica, embora em uma extensão menor do que o MU4. Contudo, MUlO e MUl 14 mostraram atividade anti-fungica contra Fusarium 5889. A atividade dos peptídeos é surpreendente pelo fato de que eles são mais ativos contra Fusarium spp do que contra Aspergillus spp.

Conclusão

Usando métodos de testagem anti-fungica padrões, é mostrado que os peptídeos de acordo com a invenção têm atividade anti-fungica. Além disso, surpreendentemente, alguma atividade antibacteriana também está presente. Peptídeo MU4 é particularmente potente contra Aspergillus fumigatus, Aspergillus niger e Fusarium spp. Os outros peptídeos (MU10 e MUl 14) são menos ativos, mas ainda mostram atividade anti-fungica.

Exemplo 2 - Experimento para testar a atividade anti-protista de peptídeos

Os compostos de teste foram selecionados contra os trofozoitas de isolados clínicos de Acanthamoeba spp. usando um procedimento de ensaio em lâmina de microtitulação. Os organismos eram Acanthamoeba polyphaga (veja, para detalhes sobre a cepa e metodologia usada: Hughes, R. & Kilvington, S. (2001). A comparison of hydrogen peroxide contact Iens disinfection systems and solutions against Acanthamoeba polyphaga. Antimicrob. Agents Chemother. 45: 2038-2043). Cepa Ros de Acanthamoeba polyphaga foi usada em todo o estudo. A cepa foi originalmente isolada de um caso não publicado de queratite por aeanthamoeba no Reino Unido em 1994.

Uso do ensaio em lâmina de microtitulação permitiu a determinação da concentração mínima de trofozoíta amebicida (MATC), a qual é a concentração mínima de trofozoíta amebicida ^g/ml) = menor concentração de morte do estímulo com trofozoíta (1 χ IO"4) e também a concentração mínima inibitória de trofozoíta (MITC), a qual é a concentração mínima inibitória de trofozoíta ^g/ml) = menos concentração que impede que os trofozoitas se dividam ou mata cerca de 50% da população. Os valores podem, então, ser usadas para selecionar concentrações de fármaco para uso em experimentos de tempo-morte para estudar a cinética de morte de Acanthamoeba.

Os peptídeos sob teste foram:

(i) MU4 - WRKWRKRWWWRKWRKRWW (SEQID NO. 9);

(ii) MU7 - FRKFRKRFFFRKFRKRFF (SEQ ID No. 15).

(iii) MUlO - LRKLRKRLLLRKLRKRLL (SEQ ID NO. 8); e

(iv) MUl 14 - WRKWRKRLLLRKLRKRLL (SEQ ID NO. 26).

Tabela 3 - Efeitos anti-protistas dos peptídeos

<table>table see original document page 65</column></row><table>

MITC = concentração inibitória mínima de trofozoíta (μΜ)

MATC = concentração mínima amebicida de trofozoíta (μΜ)

NR = não registrado, uma vez que uma MITC não foi observada

Conclusão

Fazendo referência à Tabela 3, pode ser observado que MU4 mostrou uma maior atividade anti-protista, tendo os menores valores de MITC e MATC através de morte de Acanthamoeba polyphaga. MU 7 e MUl 14 mostraram boa atividade contra Acanthamoeba polyphaga, uma vez que eles mostraram uma MATC de 93,1 e 98,8, respectivamente. Finalmente, MUl O também mostrou atividade anti-protista, com uma MATC de 207,1.

Exemplo 3 - Revestimento de dispositivos médicos com polipeptídeos anti-fúngicos/anti-protistas

Polipeptídeos de acordo com a invenção podem ser usados para revestir dispositivos médicos propensos à contaminação com fungos ou protistas. Exemplos de tais dispositivos médicos incluem lentes, cateteres, stents, curativos para cicatrização de feridas e dispositivos contraceptivos. Os polipeptídeos também podem ser aplicados à superfícies em ambientes médicos, incluindo superfícies de equipamento para uso em salas de operação. Os inventores da invenção mostraram que os polipeptídeos de acordo com a invenção aderem à lentes de contato, vidro e superfícies revestidas com o biomaterial "PLGA".

Revestimento de uma superfície pode ser realizado através de preparo de uma solução aquosa concentrada de um polipeptídeo (por exemplo, 200 μΜ) em um pH apropriado (por exemplo, pH de 7,4) para o polipeptídeo específico. Uma superfície é, então, exposta à solução aquosa em uma temperatura adequada (por exemplo, 37 0C) durante um tempo suficiente (por exemplo, 2 horas) para permitir imobilização ou absorção de uma quantidade adequada do polipeptídeo à superfície da mesma.

Para testar se os peptídeos de acordo com a invenção poderiam ser imobilizados sobre um biomaterial ou outras superfícies, os inventores obtiveram uma forma fluorescentemente rotulada do GINlp (Advanced Biomedical, Oldham, Reino Unido). Uma solução de estoque a 40 μΜ desse polipeptídeo rotulado foi preparada em PBS e alíquotas de 250 μΐ foram inseridas nas cavidades de uma microlâmina com 24 cavidades. Os inventores, então, colocaram vários materiais nessas soluções de peptídeo, esses sendo: (i) lentes de contato Acuvue da Johnson and Johnson; (ii) lamínulas de vidro sem revestimento; ou (iii) lamínulas previamente revestidas com o biomaterial (poli)lactídeo-co-glicolídeo (PLGA: lâminas revestidas fornecidas pelo Prof Jian Lu, Department of Physics, University of Manchester).

Após incubação a 200 0C durante 15 min nas soluções de peptídeo, os materiais foram removidos e, então, lavados colocando em 1 ml de PBS. Os materiais foram, então, examinados através de microscopia por fluorescência (usando um microscópio de inversão Olympus 1X70 adaptado com um conjunto de filtro Chroma 35002v2) e os resultados foram registrados através de fotografia. Os materiais foram, então, lavados mais duas vezes em 1 ml de PBS e, então, finalmente deixados embeber durante a noite a 37 0C em 25 ml de PBS. O nível de fluorescência foi observado e registrado após cada lavagem, novamente através de observação microscópica e fotografia conforme descrito acima.

Fazendo referência à Figura 3, são mostradas lentes de contato Acuvue da Johnson and Johnson as quais tinham sido tratadas durante 15 min com GINlp a 40 μΜ (isto é, MU10) (o qual tinha sido sintetizada com uma tag fluorescente), então, lavada 4 vezes, incluindo um embebimento durante a noite em 25 ml de PBS. A Figura 3(a) mostra uma lente não tratada e uma lente tratada com GINlp (após 4 lavagens), sob iluminação com luz branca ou fluorescência GFP, usando um microscópio Olympus 1X70. Conseqüentemente, mesmo após lavagem repetida, a lente reteve uma quantidade significativa de peptídeo, de modo que fluorescência é visível mesmo a olho nu, conforme mostrado na Figura 3(b). As imagens foram capturadas usando uma câmera digital Canon EOS300D, usando um conjunto de filme ISO1600 e com um tempo de exposição de 0,3 s para imagens fluorescentes.

Fazendo referência à Figura 4, são mostradas lamínulas de vidro (BG) ou lamínulas previamente revestidas com o biomaterial (poli)lactídeo-co-glicolídeo (PLGA), a qual tinha sido tratada durante 15 min com GINlp a 40 μΜ (o qual tinha sido sintetizado com uma tag fluorescente), então, lavada 4 vezes, incluindo um embebimento durante a noite em 25 ml de PBS. O nível de fluorescência foi observado usando um microscópio Olympus 1X70 para amostras após cada lavagem (Wl, W2, W3 e W4). Conseqüentemente, pode ser observado que o nível de fluorescência não diminui perceptivelmente após qualquer uma das lavagens, sugerindo que o polipeptídeo adere firmemente a uma faixa de superfícies. As imagens foram capturadas usando uma câmera digital Canon EOS300D, com um tempo de exposição de 5 s usando um conjunto de filme ISOl600. Conseqüentemente, as Figuras 3 e 4 mostram que todos os três tipos de material pareciam reter níveis similares de GIN lp, a despeito de lavagem extensiva, sugerindo que o polipeptídeo é adequado para revestimento de várias superfícies (conforme mostrado na Figura Iae Figura 4). Em particular, descobriu-se que as lentes de contato absorvem quantidades significativas do polipeptídeo (presumivelmente em virtude de sua maior área de superfície), de modo que a fluorescência era claramente visível a olho nu, mesmo após a quarta lavagem, conforme mostrado na Figura 3b.

Conclusões

A partir da Tabela 2, pode ser visto que os polipeptídeos de acordo com a presente invenção mostram atividade anti-füngica contra pelo menos uma, se não duas e se não três das seis diferentes cepas de fungo avaliadas. Em particular, MU 4, MU 10 e MU 114 são particularmente eficazes. Um dos peptídeos mais ativos é MU 4, o qual é ativo contra C. albicans 6862, Aspergillus fumigatus, Fusarium spp 5889, Fusarium spp 6507, Aspergillus terreus e Aspergillus niger.

A partir da Figura 3, pode ser visto que os polipeptídeos de acordo com a presente invenção também mostram atividade anti-protista contra Acanthamoebapolyphaga. Em particular, MU 4, MU 7, MU IOe MU 114 são particularmente eficazes.

E notável observar que MU 4 era surpreendentemente ativo contra fungos e protistas.

Cada um desses polipeptídeos de acordo com a invenção é derivado de uma região de ligação ao receptor de Proteoglicana de Sulfato de Heparana (HSPG) de apolipoproteína E. Além disso, cada polipeptídeo é uma repetição em tandem e compreende dois motivos RKR. Os dados ilustram a surpreendente propriedade de que repetições aleatórias de acordo com a invenção são agentes anti-fungicos e anti-protistas eficazes.

Exemplo 4 - Eficácia anti-fúngica contra uma série de fungos O inventor expandiu o trabalho conduzido no Exemplo 1 através de testagem de uma biblioteca expandida de peptídeos derivados de apolipoproteína B ou apolipoproteína E de forma a avaliar adicionalmente polipeptídeos de acordo com a invenção. Esses experimentos foram conduzidos usando as seguintes espécies fungicas?

Fusarium solani I(FS1);

Fusarium solani 2 (FS2);

Fusarium solani 3 (FS3);

Fusarium solani 4 (FS4);

Aspergillus fumigatus 293(AF); e

Condida albicans (CA).

FS1-FS4 foram obtidos da Bristol PHLS (British Public Health Laboratory Service Reino Unido). Aspergillus fumigatus 293 está publicamente disponível como a cepa NCPF7367 da Culture Collection (National Collection of Pathogenic Fungi Public Health Laboratory, Mycological Reference Laboratory Myrtle Road, Kingsdown, Bristol BS2 8EL). O Candida albicans era um isolado clínico obtido através de meios padrões.

Os métodos usados para determinar os valores de IC50 para cada peptídeo eram conforme descrito no Exemplo 1. Uma IC50 de menos ou cerca de 40 μΜ foi tomada como tendo boa atividade anti-fungica.

A Tabela 4 proporciona dados para peptídeos que eram derivados de apoE.

Tabela 4 - Valores de MIC (redução >80%) contra 6 espécies fungicas de peptídeos derivados de apoE

<table>table see original document page 69</column></row><table> <table>table see original document page 70</column></row><table>

Na Tabela 4 será apreciado que MU1-MU20 corresponde à repetição em tandem de peptídeos baseados em apoEi4i-i49, (MU10), no qual cada resíduo de L é substituído por outro aminoácido (MU1-MU9 e MUll- MU20). Polipeptídeos de acordo com a presente invenção exibiram boa atividade anti-füngica, com valores de IC5o <40 μΜ contra pelo menos quatro dos fungos testados. MU 4, MU 6, MU 7, MUl0, MUl2, MUl6 e MUl8 são peptídeos anti-fungicos particularmente eficazes. O peptídeo mais preferido, MU4, tem atividade comparável à anfotericina Β. A Tabela 4 ilustra que uma série de peptídeos baseados em repetições aleatórias substituídas de peptídeos baseados em apoE141-149, os quais caem foram de definição dos polipeptídeos de acordo com a invenção, são ineficazes com relação a peptídeos de acordo com a invenção.

Será observado que o polipeptídeo preferido MU 4 (uma repetição em tandem de WRKWRKRWW) tem boa atividade anti-fungica, enquanto que o monômero sobre o qual ele é baseado, MU45, é ineficaz. Isso ilustra que repetições aleatórias de ApoEui. e derivados do mesmo (conforme definido aqui) são agentes anti-fungicos surpreendentemente eficazes.

A Tabela 5 apresenta dados para peptídeos que são derivados de apoB.

Tabela 5 - Valores de MIC para peptídeos derivados de apolipoproteína B

<table>table see original document page 71</column></row><table>

A partir da Tabela 5, será observado que os peptídeos MU27 e MU28, os quais são peptídeos de acordo com a presente invenção, mostram boa atividade anti-fungica contra pelo menos cinco das diferentes cepas fungicas avaliadas.

Será apreciado que MU25 e MU26 têm atividade reduzida. Esses peptídeos se assemelham intimamente aos peptídeos MU27 e MU28 de acordo com a invenção, mas tinham os motivos RKR modificados ou alterados.

Exemplo 5 — Eficácia anti-malária de peptídeos de acordo com a invenção

Experimentos foram conduzidos para ilustrar que peptídeos de acordo com a invenção são eficazes na prevenção de infecção de hepatócitos cultivados por esporozoitos de Plasmodium e, desse modo, demonstram que os peptídeos têm eficácia para prevenção e tratamento de malária. Métodos

Preparo de esporozoiíos de Plasmodiunr. Mosquitos Anopheles stephensi de 3-5 dias de idade foram alimentados sobre camundongos Swiss Webster infectados com P. berghei (NK65) os quais tinham sido verificados através do esfregaço sangüíneo com relação à abundância de parasitas em estágio de gametócito. Esporozoitos de glândula salivar foram coletados nos dias 18 a 31 pós-refeição de sangue infectiva. Os mosquitos foram enxaguados em etanol a 70% e lavados em Meio de Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM) antes de dissecção da glândula salivar. As glândulas foram gentilmente trituradas, centrifugadas a 80 χ g durante 3 min para remover os restos de mosquito e esporozoitos contados em um hemocitômetro.

Ensaio de desenvolvimento de esporozoito: Células Hepa 1-6 (ATCC CRL-1830, American Type Culture Collection, Manassas, VA), uma linhagem de célula de hepatoma de camundongo permissiva para desenvolvimento de esporozoitos de P. berghei, foram cultivadas (8 χ IO4 células/cavidade) em lâminas com câmara Permanox Lab-Tek (Nalgene Nunc Corp., Naperville, II.) e crescidas até confluentes. No dia do experimento, esporozoitos foram dissecados dos mosquitos e pré-incubados com Meio de Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM; Invitrogen, Carlsbad, CA) com BSA a 1% apenas ou com o polipeptídeo indicado a 50 μg/ml durante 1 hora a 28 °C e colocados sobre células na presença contínua do inibidor em DMEM contendo soro fetal de bezerro a 10% (meio completo). Após 1 hora a 37°C, o meio contendo esporozoitos desprendidos foi removido e substituído por meio completo. 40 horas depois, as células foram fixadas com metanol gelado e estágios exoeritrocíticos (EEFs) foram corados com mAb 2E6 (Tsuji, M., D. Mattei, R.S. Nussenzweig, D. Eichinger e F. Zavala. 1994. Demonstration of heat-shock protein 70 in the sporozoite stage of malaria parasites. Parasitology Research 80:16-21), seguido por uma imunoglobulina anti- camundongo conjugada a FITC. O número de EEFs em cada cavidade foi contado com uma objetiva de 40X sobre um microscópio fluorescente Nikon. Em outros experimentos, células Hepa 1-6 foram pré-tratadas com os polipeptídeos a 50 μg/ml em meio completo durante 1 hora, lavadas e, então, esporozoitos foram adicionados em meio completo sem polipeptídeo e o ensaio foi continuado conforme esboçado acima.

Resultados

A Fig. 5 mostra que MUlO e MU4 inibem a entrada de P. berghei em células Hepa 1-6. Em experimentos adicionais nos quais células foram tratadas com esses peptídeos, lavadas com meio de cultura de células antes de estímulo final com P. berghei, o MU4 reteve sua capacidade de bloquear a entrada de P. berghei, sugerindo que esse composto pode se ligar à superfície dessas células irreversivelmente, com isso, então, impedindo posteriormente a entrada do parasita. Esse modelo com roedor é amplamente usado para estudar a entrada de Plasmodium no fígado; atividade, conforme demonstrado aqui, significa quase certamente que a entrada de Plasmodium falciparum (e outras espécies Plasmodium) no fígado seria similarmente impedida.

Esses dados ilustram que peptídeos de acordo com a invenção podem ser usados no tratamento de malária e outros infecções por protista. LISTAGEM DE SEQÜÊNCIA

<110> The University of Manchester Dobson, Curtis

<120> Tratamento de Infecções Microbianas

<130> PCB/P89893PWO

<160> 89

<170> PatentIn Versão 3.3

<210> 1

<211> 37

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 1

Leu Leu Gly Asp Phe Phe Arg Lys Ser Lys Glu Lys Ile Gly Lys Glu 15 10 15

Phe Lys Arg Ile Val Gln Arg Ile Lys Asp Phe Leu Arg Asn Leu Val 20 25 30

Pro Arg Thr Glu Ser 35

<210> 2

<211> 30

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 2

Ala Cys Tyr Cys Arg Ile Pro Ala Cys Ile Ala Gly Glu Arg Arg Tyr 1 5 10 15

Gly Thr Cys Ile Tyr Gln Gly Arg Leu Trp Ala Phe Cys Cys 20 25 30

<210> 3

<211> 39

<212> PRT

<213> Sus sp.

<400> 3

Arg Arg Arg Pro Arg Pro Pro Tyr Leu Pro Arg Pro Arg Pro Pro Pro 15 10 15

Phe Phe Pro Pro Arg Leu Pro Pro Arg Ile Pro Pro Gly Phe Pro Pro 20 25 30

Arg Phe Pro Pro Arg Phe Pro 35

<210> 4

<211> 13

<212> PRT

<213> Bos sp.

<400> 4

Ile Leu Pro Trp Lys Trp Pro Trp Trp Pro Trp Arg Arg 1 5 10

<210> 5

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 5

Leu Arg Lys Leu Arg Lys Arg Leu Leu 1 5

<210> 6

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 6

Arg Leu Thr Arg Lys Arg Gly Leu Lys 1 5

<210> 7

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Seqüência artificial baseada em resíduos de apoB humana

<400> 7

Leu Arg Thr Arg Lys Arg Gly Arg Lys 1 5

<210> 8

<211> 18

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Seqüência aleatória de seqüência ID No. 5

<400> 8

Leu Arg Lys Leu Arg Lys Arg Leu Leu Leu Arg Lys Leu Arg Lys Arg 1 5 10 15 Leu Leu

<210> 9

<211> 18

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Polipeptideo artificial designado GIN 7 ou MCJ 4 <400> 9

Trp Arg Lys Trp Arg Lys Arg Trp Trp Trp Arg Lys Trp Arg Lys Arg 15 10 15

Trp Trp

<210> 10

<211> 14

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Polipeptideo Artificial designado GIN 32 <400> 10

Trp Arg Lys Trp Arg Lys Arg Trp Arg Lys Trp Arg Lys Arg 15 10

<210> 11

<211> 18

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Polipeptideo Artificial designado GIN 34 <400> 11

Trp Arg Lys Trp Arg Lys Arg Trp Trp Leu Arg Lys Leu Arg Lys Arg 15 10 15

Leu Leu

<210> 12

<211> 18

<212> PRT

<213> Artificial

<220> <223>

Polipeptideo Artificial designado GIN 41 ou MU6 <400> 12

Tyr Arg Lys Tyr Arg Lys Arg Tyr Tyr Tyr Arg Lys Tyr Arg Lys Arg 1 5 10 15

Tyr Tyr

<210> 13

<211> 14

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Polipeptideo artificial designado GIN 8 <400> 13

Leu Arg Lys Leu Arg Lys Arg Leu Arg Lys Leu Arg Lys Arg 1 5 10

<210> 14

<211> 15

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Polipeptideo Artificial designado GIN 2 <400> 14

Leu Arg Lys Arg Leu Leu Leu Arg Lys Leu Arg Lys Arg Leu Leu 1 5 10 15

<210> 15

<211> 18

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Polipeptideo artificial designado MU7 <400> 15

Phe Arg Lys Phe Arg Lys Arg Phe Phe Phe Arg Lys Phe Arg Lys Arg 1 5 10 15

Phe Phe

<210> 16

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Polipeptideo Artificial designado MU 58 <400> 16

Trp Arg Lys Trp Arg Lys Arg Trp Trp Arg Lys Trp Arg Lys Arg Trp 15 10 15

Trp

<210> 17

<211> 15

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Polipeptideo Artificial designado MU59 <400> 17

Trp Arg Lys Trp Arg Lys Arg Trp Arg Lys Trp Arg Lys Arg Trp 15 10 15

<210> 18

<211> 18

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Polipeptideo Artificial designado MU 60 <400> 18

Trp Arg Lys Trp Arg Lys Arg Trp Trp Phe Arg Lys Trp Arg Lys Arg 15 10 15

Trp Trp

<210> 19

<211> 18

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Polipeptideo Artificial designado MU 61 <400> 19

Trp Arg Lys Trp Arg Lys Arg Phe Phe Trp Arg Lys Trp Arg Lys Arg 15 10 15

Phe Phe

<210> 20 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial

<220>

<223> Polipeptideo Artificial designado MU 81 <400> 20

Trp Arg Lys Arg Trp Trp Arg Trp Arg Lys Arg Trp Trp Arg 1 5 10

<210> 21

<211> 20

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Polipeptideo Artificial designado MU 82 <400> 21

Leu Arg Lys Leu Arg Lys Arg Leu Leu Arg Leu Arg Lys Leu Arg Lys 1 5 10 15

Arg Leu Leu Arg 20

<210> 22

<211> 20

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Polipeptideo artificial designado MU 83 <400> 22

Trp Arg Lys Trp Arg Lys Arg Trp Trp Arg Trp Arg Lys Trp Arg Lys 1 5 10 15

Arg Trp Trp Arg 20

<210> 23

<211> 18

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Polipeptideo Artificial designado MU 111 <400> 23

Leu Arg Lys Leu Arg Lys Arg Leu Leu Tirp Arg Lys Trp Arg Lys Arg 1 5 10 15

Trp Trp <210> 24

<211> 18

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Polipeptideo Artificial designado MU 112 <400> 24

Leu Arg Lys Leu Arg Lys Arg Leu Leu Leu Arg Lys Leu Arg Lys Arg 15 10 15

Trp Trp

<210> 25

<211> 18

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Polipeptideo Artificial designado MtJ 113 <400> 25

Leu Arg Lys Leu Arg Lys Arg Leu Leu Trp Arg Lys Trp Arg Lys Arg 15 10 15

Leu Leu

<210> 26

<211> 18

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Polipeptideo Artificial designado MU 114 <400> 26

Trp Arg Lys Trp Arg Lys Arg Leu Leu Leu Arg Lys Leu Arg Lys Arg 15 10 15

Leu Leu

<210> 27

<211> 18

<212> PRT

<213> Artificial

<220> <223> Polipeptideo Artificial designado MU 115 <400> 27

Trp Arg Lys Leu Arg Lys Arg Leu Leu Leu Arg Lys Leu Arg Lys Arg 1 5 10 15

Leu Leu

<210> 28

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Polipeptideo Artificial designado MU 116

<400> 28

Trp Arg Lys Trp Arg Lys Phe Phe Phe Arg Lys Trp Arg Lys Arg Trp

Trp

<210> 29

<211> 18

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Polipeptideo Artificial designado MU 117 <400> 29

Trp Arg Lys Trp Arg Lys Arg Trp Trp Phe Arg Lys Phe Arg Lys Arg 1 5 10 15

Phe Phe

<210> 30

<211> 18

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Polipeptideo artificial designado MU 12 <400> 30

Cys Arg Lys Cys Arg Lys Arg Cys Cys Cys Arg Lys Cys Arg Lys Arg 1 5 10 15

Cys Cys <210> 31

<211> 18

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Polipeptideo Artificial designado MU 16

<400> 31

Arg Arg Lys Arg Arg Lys Arg Arg Arg Arg Arg Lys Arg Arg Lys Arg 1 5 10 15

Arg Arg

<210> 32

<211> 18

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Polipeptideo Artificial designado MU 16 <400> 32

Met Arg Lys Met Arg Lys Arg Met Met Met Arg Lys Met Arg Lys Arg 1 5 10 15

Met Met

<210> 33

<211> 18

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Polipeptideo artificial designado MU 8 <400> 33

Ile Arg Lys Ile Arg Lys Arg Ile Ile Ile Arg Lys Ile Arg Lys Arg 1 5 10 15

Ile Ile

<210> 34

<211> 18

<212> PRT

<213> Artificial

<220> <223> Polipeptideo Artificial designado MU 19 <400> 34

His Arg Lys His Arg Lys Arg His His His Arg Lys His Arg Lys Arg 15 10 15

His His

<210> 35

<211> 22

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Polipeptideo Artificial designado GIN 11 <400> 35

Gln Ser Thr Glu Glu Leu Arg Val Arg Leu Ala Ser His Leu Arg Lys 15 10 15

Leu Arg Lys Arg Leu Leu 20

<210> 36

<211> 18

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial 18-mer based on Sequence ID No. 6

<400> 36

Arg Leu Thr Arg Lys Arg Gly Leu Lys Arg Leu Thr Arg Lys Arg Gly 15 10 15

Leu Lys

<210> 37

<211> 14

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Polipeptideo Artificial designado GIN 36 <400> 37

Arg Thr Arg Lys Arg Gly Arg Arg Thr Arg Lys Arg Gly Arg 15 10

<210> 38 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial

<220>

<223> Polipeptideo Artificial designado GIN 37 <400> 38

Leu Arg Lys Arg Lys Arg Leu Leu Arg Lys Arg Lys Arg Leu 1 5 10

<210> 39

<211> 18

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Polipeptideo Artificial designado GIN 38 <400> 39

Leu Arg Lys Arg Lys Arg Leu Arg Lys Leu Arg Lys Arg Lys Arg Leu 1 5 10 15

Arg Lys

<210> 40

<211> 18

<212> PRT

<213> Artificial

<22 0>

<223> Polipeptideo Artificial designado GIN 33 <400> 40

Trp Arg Trp Arg Lys Arg Trp Arg Lys Trp Arg Trp Arg Lys Arg Trp 1 5 10 15

Arg Lys

<210> 41

<211> 18

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Polipeptideo Artificial designado MU 24 <400> 41

Leu Leu Arg Lys Arg Leu Lys Arg Leu Leu Leu Arg Lys Arg Leu Lys 1 5 10 15 Arg Leu

<210> 42

<211> 18

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Polipeptideo Artificial designado MU 28 <400> 42

Arg Arg Trp Arg Lys Arg Trp Arg Lys Trp Arg Trp Arg Lys Arg Trp 15 10 15

Arg Lys

<210> 43

<211> 18

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Polipeptideo Artificial designado MU 29 <400> 43

Lys Arg Trp Arg Lys Arg Trp Arg Lys Trp Arg Trp Arg Lys Arg Trp 15 10 15

Arg Lys

<210> 44

<211> 18

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Polipeptideo Artificial designado MU 30 <400> 44

Leu Arg Trp Arg Lys Arg Trp Arg Lys Trp Arg Trp Arg Lys Arg Trp 15 10 15

Arg Lys

<210> 45

<211> 18

<212> PRT

<213> Artificial <220>

<223> Polipeptideo Artificial designado MU 31 <400> 45

His Arg Trp Arg Lys Arg Trp Arg Lys Trp Arg Trp Arg Lys Arg Trp 15 10 15

Arg Lys

<210> 46

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Polipeptideo Artificial designado MU 32 <400> 46

Arg Trp Arg Lys Arg Trp Arg Lys Trp Arg Trp Arg Lys Arg Trp Arg 15 10 15

Lys

<210> 47

<211> 18

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Polipeptideo Artificial designado MU 33 <400> 47

Arg Arg Trp Arg Lys Arg Trp Arg Lys Arg Arg Trp Arg Lys Arg Trp 15 10 15

Arg Lys

<210> 48

<211> 18

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Polipeptideo Artificial designado MU 35 <400> 48

Leu Arg Trp Arg Lys Arg Trp Arg Lys Leu Arg Trp Arg Lys Arg Trp 15 10 15 Arg Lys

<210> 49

<211> 18

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Polipeptideo Artificial designado MU 36 <400> 49

His Arg Trp Arg Lys Arg Trp Arg Lys His Arg Trp Arg Lys Arg Trp 15 10 15

Arg Lys

<210> 50

<211> 16

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Polipeptideo Artificial designado MU 37 <400> 50

Arg Trp Arg Lys Arg Trp Arg Lys Arg Trp Arg Lys Arg Trp Arg Lys 15 10 15

<210> 51

<211> 16

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Polipeptideo Artificial designado MU 69 <400> 51

Arg Trp Arg Lys Arg Gly Arg Lys Arg Trp Arg Lys Arg Gly Arg Lys 15 10 15

<210> 52

<211> 16

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Polipeptideo Artificial designado MU 71 <400> 52

Arg Trp Arg Lys Arg Trp Arg Lys Arg Trp Arg Lys Arg Trp Arg Lys 15 10 15 <210> 53

<211> 14

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Polipeptideo Artificial designado MCJ 73 <400> 53

Arg Lys Arg Gly Trp Lys Trp Arg Lys Arg Gly Trp Lys Trp 1 5 10

<210> 54

<211> 14

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Polipeptideo Artificial designado MU 74 <400> 54

Arg Leu Thr Arg Lys Arg Gly Arg Leu Thr Arg Lys Arg Gly 1 5 10

<210> 55

<211> 18

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Polipeptideo Artificial designado MlJ 27 <400> 55

Trp Arg Trp Arg Lys Arg Trp Arg Lys Trp Arg Trp Arg Lys Arg Trp 1 5 10 15

Arg Lys

<210> 56

<211> 27

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 56

cttcgtaaac ttcgtaaacg tcttctt 27

<210> 57

<211> 27

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 57

cgtcttactc gtaaacgtgg tcttaaa

27 <210> 58

<211> 45

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Ácido nucleico artificial que codifica o polipeptideo da invenção

<400> 58

cttcgtaaac gtcttcttct tcgtaaactt cgtaaacgtc ttctt

<210> 59

<211> 66

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Ácido nucleico artificial que codifica o polipeptideo da invenção

<400> 59

caatctactg aagaacttcg tgttcgtctt gctagtcatc ttcgtaaact tcgtaaacgt 60

cttctt 66

<210> 60

<211> 180

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Ácido nucleico artificial que codifica o polipeptideo da invenção

<400> 60

cttcgtgttc gtcttgctag tcatcttcgt aaacttcgta aacgtcttct gatgatcttc aaaaacgtct tgctgtttat cttcgtgttc gtcttgctag aaacttcgta aacgtcttct tcgtgatgct gatgatcttc aaaaacgtct

tcgtgatgct 60

tcatcttcgt 120 tgctgtttat 180

<210> 61

<211> 54

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Ácido nucleico artificial que codifica o polipeptideo da invenção

<400> 61

cttcgtaaac ttcgtaaacg tcttcttctt cgtaaacttc gtaaacgtct tctt 54

<210> 62

<211> 54

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Ácido nucleico artificial que codifica o polipeptideo da invenção <400> 62

tggcgtaaat ggcgtaaacg ttggtggtgg cgtaaatggc gtaaacgttg gtgg 54

<210> 63

<211> 48

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Ácido nucleico artificial que codifica o polipeptideo da invenção <400> 63

tggcgtaaat ggcgtaaacg ttggtggcgt aaatggcgta aacgttgg 48

<210> 64

<211> 54

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Ácido nucleico artificial que codifica o polipeptideo da invenção <400> 64

tggcgtaaat ggcgtaaacg ttggtggctt cgtaaacttc gtaaacgtct tctt 54

<210> 65 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Ácido nucleico <400> 65

tatcgtaaat atcgtaaacg ttattattat cgtaaatatc gtaaacgtta ttat

54

<210> 66

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Ácido nucleico artificial que codifica o polipeptideo da invenção <400> 66

cttcgtaaac ttcgtaaacg tcttcgtaaa cttcgtaaac gt 42

<210> 67

<211> 54

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Ácido nucleico artificial que codifica o polipeptideo da invenção

<400> 67

cgtcttactc gtaaacgtgg tcttaaacgt cttactcgta aacgtggtct taaa

54 <210> 68

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Ácido nucleico artificial que codifica o polipeptideo da invenção <400> 68

cgtactcgta aacgtggtcg tcgtactcgt aaacgtggtc gt 42

<210> 69

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Ácido nucleico artificial que codifica o polipeptideo da invenção <400> 69

cttcgtaaac gtaaacgtct tcttcgtaaa cgtaaacgtc tt 42

<210> 70

<211> 54

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Ácido nucleico artificial que codifica o polipeptideo da invenção <400> 70

cttcgtaaac gtaaacgtct tcgtaaactt cgtaaacgta aacgtcttcg taaa 54

<210> 71

<211> 54

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Ácido nucleico artificial que codifica o polipeptideo da invenção <400> 71

tggcgttggc gtaaacgttg gcgtaaatgg cgttggcgta aacgttggcg taaa 54

<210> 72

<211> 54

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Ácido nucleico artificial que codifica o polipeptideo designado MU

<400> 72

tggcgtaaat ggcgtaaacg ttggtggtgg cgtaaatggc gtaaacgttg gtgg

54 <210> 73

<211> 54

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Ácido nucleico artificial que codifica o polipeptideo designado MU

<400> 73

tttcgtaaat ttcgtaaacg tttttttttt cgtaaatttc gtaaacgttt tttt 54

<210> 74

<211> 54

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Ácido nucleico artificial que codifica o polipeptideo designado MU

<400> 74

ttacgtaaat tacgtaaacg tttattatta cgtaaattac gtaaacgttt atta 54

<210> 75

<211> 54

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Ácido nucleico artificial que codifica o polipeptideo designado MU 114

<400> 75

tggcgtaaat ggcgtaaacg tttattatta cgtaaattac gtaaacgttt atta 54

<210> 76

<211> 18

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Polipeptideo Artificial designado MU 1 <400> 76

Glu Arg Lys Glu Arg Lys Arg Glu Glu Glu Arg Lys Glu Arg Lys Arg 1 5 10 15

Glu Glu

<210> 77

<211> 18

<212> PRT

<213> Artificial

<220> <223> Polipeptideo Artificial designado MU 2 <400> 77

Ala Arg Lys Ala Arg Lys Arg Ala Ala Ala Arg Lys Ala Arg Lys Arg 1 5 10 15

Ala Ala

<210> 78

<211> 18

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Polipeptideo Artificial designado MU 3 <400> 78

Asp Arg Lys Asp Arg Lys Arg Asp Asp Asp Arg Lys Asp Arg Lys Arg 1 5 10 15

Asp Asp

<210> 79

<211> 18

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Polipeptideo Artificial designado MU 9 <400> 79

Gln Arg Lys Gln Arg Lys Arg Gln Gln Gln Arg Lys Gln Arg Lys Arg 1 5 10 15

Gln Gln

<210> 80

<211> 18

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Polipeptideo Artificial designado MU 11 <400> 80

Asn Arg Lys Asn Arg Lys Arg Asn Asn Asn Arg Lys Asn Arg Lys Arg 1 5 10 15

Asn Asn <210> 81

<211> 18

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Polipeptideo Artificial designado MU 13 <400> 81

Ser Arg Lys Ser Arg Lys Arg Ser Ser Ser Arg Lys Ser Arg Lys Arg 15 10 15

Ser Ser

<210> 82

<211> 18

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Polipeptideo Artificial designado MU 14 <400> 82

Val Arg Lys Val Arg Lys Arg Val Val Val Arg Lys Val Arg Lys Arg 15 10 15

Val Val

<210> 83

<211> 18

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Polipeptideo Artificial designado MU 15 <400> 83

Thr Arg Lys Thr Arg Lys Arg Thr Thr Thr Arg Lys Thr Arg Lys Arg 15 10 15

Thr Thr

<210> 84

<211> 18

<212> PRT

<213> Artificial

<220> <223> Polipeptideo Artificial designado MU 17

<400> 84

Gly Arg Lys Gly Arg Lys Arg Gly Gly Gly Arg Lys Gly Arg Lys Arg 1 5 10 15

Gly Gly

<210> 85

<211> 18

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Polipeptideo Artificial designado MU 18 <400> 85

Lys Arg Lys Lys Arg Lys Arg Lys Lys Lys Arg Lys Lys Arg Lys Arg 1 5 10 15

Lys Lys

<210> 86

<211> 18

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Polipeptideo Artificial designado MU 20

<400> 86

Pro Arg Lys Pro Arg Lys Arg Pro Pro Pro Arg Lys Pro Arg Lys Arg 1 5 10 15

Pro Pro

<210> 87

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Polipeptideo Artificial designado MU 45

<400> 87

Trp Arg Lys Trp Arg Lys Arg Trp Trp 1 5

<210> 88 <211> 18

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Polipeptideo Artificial designado MU 25 <400> 88

Trp Arg Trp Arg Arg Arg Trp Arg Lys Trp Arg Trp Arg Arg Arg Trp 1 5 10 15

Arg Lys

<210> 89

<211> 18

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Polipeptideo Artificial designado MU 26 <400> 89

Trp Arg Trp Lys Lys Lys Trp Arg Lys Trp Arg Trp Lys Lys Lys Trp 1 5 10 15

Arg Lys

Claims

1. Uso de um polipeptídeo ou um derivado ou análogo do mesmo, compreendendo repetições de um peptídeo derivado de uma região de ligação ao receptor de Proteoglicana de Sulfato de Heparana (HSPG) de uma apolipoproteína, caracterizado pelo fato de ser para a fabricação de um medicamento para a prevenção ou tratamento de uma infecção fungica e/ou por um protista.

2. Uso de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato do polipeptídeo ser derivado de uma região de ligação ao receptor de Proteoglicana de Sulfato de Heparana (HSPG) de uma apolipoproteína B ou apolipoproteína E.

3. Uso de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato do peptídeo ser derivado de um grupamento B de domínio de ligação ao receptor de LDL de apolipoproteína B ou de um grupamento B de domínio de ligação ao receptor de LDL de apolipoproteína E.

4. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato do polipeptídeo compreender pelo menos dois motivos RKR.

5. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato do polipeptídeo compreender uma repetição dimérica aleatória de: SEQ ID No. 5; SEQ ID No. 6; SEQ ID No. 7; ou um derivado das mesmas, em que pelo menos um outro resíduo de aminoácido que não motivos RKR é substituído por uma Arginina (R), Tirosina (Y), Metionina (M), Isoleucina (I), Fenilalanina (F), Triptofano (W), Cisteína (C) ou um derivado dos mesmos.

6. Uso de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato do resíduo substituído ou trocado ser o primeiro, segundo, terceiro, sétimo, oitavo, nono, décimo, décimo primeiro, décimo segundo, décimo sexto, décimo sétimo ou décimo oitavo resíduo do polipeptídeo.

7. Uso de acordo com a reivindicação 5 ou a reivindicação 6, caracterizado pelo fato da pelo menos uma substituição de aminoácido ser um resíduo de uma Arginina (R), uma Fenilalanina (F) ou um Triptofano (W) ou um derivado do mesmo.

8. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato do polipeptídeo ter a fórmula: <formula>formula see original document page 98</formula> em que: a & a' = é independentemente selecionado de Arginina (R); Tirosina (Y); Metionina (M); Isoleucina (I); Fenilalanina (F); Triptofano (W); Leucina (L); Lisina (K); Histidina (H); Cisteína (C); ou é deletado; b & b1 = é independentemente selecionado de Arginina (R); Tirosina (Y); Metionina (M); Isoleucina (I); Fenilalanina (F); Triptofano (W); Leucina (L); Lisina (K); Cisteína (C); ou é deletado; c & c' = é independentemente selecionado de Arginina (R); Tirosina (Y); Metionina (M); Isoleucina (I); Fenilalanina (F); Triptofano (W); Leucina (L); Lisina (K); Histidina (H); Treonina (T); Cisteína (C); ou é deletado; χ & x' = é independentemente selecionado de Arginina (R); Tirosina (Y); Metionina (M); Isoleucina (I); Fenilalanina (F); Triptofano (W); Leucina (L); Lisina (K); Histidina (H); Glicina (G); Cisteína (C); ou é deletado; y & y' = é independentemente selecionado de Arginina (R); Tirosina (Y); Metionina (M); Isoleucina (I); Fenilalanina (F); Triptofano (W); Leucina (L); Lisina (K); Histidina (H); Cisteína (C); ou é deletado; z & z' = é independentemente selecionado de Arginina (R); Tirosina (Y); Metionina (M); Isoleucina (I); Fenilalanina (F); Triptofano (W); Leucina (L); Lisina (K); Histidina (H); Cisteína (C); ou é deletado.

9. Uso de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato do polipeptídeo compreender pelo menos um aminoácido adicional o qual pode ser independentemente selecionado de Arginina (R); Tirosina (Y); Metionina (M); Isoleucina (I); Fenilalanina (F); Triptofano (W); Leucina (L); Lisina (K); Histidina (H) e aminoácido adicional o qual é adicionado antes do aminoácido na posição 'a' no peptídeo de fórmula I no N-término.

10. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato do polipeptídeo compreender uma repetição do peptídeo apoEni-uç (SEQ ID NO. 5) ou uma variante do mesmo.

11. Uso de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato da repetição em tandem compreender pelo menos duas substituições independentemente selecionadas de substituições de Triptofano (W), Arginina (R), Lisina (K), Tirosina (Y) ou Fenilalanina (F).

12. Uso de acordo com as reivindicações 10 ou 11, caracterizado pelo fato do polipeptídeo compreender a seqüência de aminoácido conforme definido por qualquer uma de SEQ ID NOs: 8-34.

13. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato do polipeptídeo compreender repetições de um peptídeo derivado de uma região de ligação ao receptor de HSPG de apoB.

14. Uso de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato do polipeptídeo ser derivado de um grupamento B do domínio de ligação ao receptor de LDL da apolipoproteína B.

15. Uso de acordo com a reivindicação 13 ou a reivindicação -14, caracterizado pelo fato do polipeptídeo compreender uma repetição em tandem de apoB3359.3367 (SEQ ID No. 6) ou um truncamento ou variante do mesmo.

16. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 13 a -15, caracterizado pelo fato do polipeptídeo compreender a seqüência de aminoácido conforme definido em qualquer uma de SEQ ID NOs: 36-55.

17. Uso de polipeptídeos de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 16, caracterizado pelo fato de ser para a prevenção ou tratamento de uma infecção por Ascomicete.

18. Uso de polipeptídeos de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 17, caracterizado pelo fato de ser para a prevenção ou tratamento de uma infecção com um fungo independentemente selecionado do grupo consistindo de Aspergillus spp.; Candida spp.; e Fusarium spp.

19. Uso de polipeptídeos de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 18, caracterizado pelo fato de ser para a prevenção ou tratamento de uma infecção por Sarcodina.

20. Uso de polipeptídeos de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 19, caracterizado pelo fato de ser para a prevenção ou tratamento de uma infecção por Plasmodium spp ou Acanthamoeba spp.

21. Método de prevenção e/ou tratamento de uma contaminação fungica e/ou por protista, caracterizado pelo fato de compreender revestimento de um objeto ou uma superfície que precisa do mesmo com uma quantidade de um polipeptídeo como definido em qualquer uma das reivindicações precedentes que é eficaz para morte ou prevenção do crescimento de fungos ou protistas.

22. Método de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de um objeto ser revestido e ser selecionado de: dispositivos médicos, lentes, lentes de contato, cateteres, stents, curativos para cicatrização de feridas, contraceptivos, implantes cirúrgicos e articulações de reposição.

23. Método de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato da superfície ser revestida e a superfície ser selecionada de: superfícies de alas de hospitais, superfícies de salas de cirurgia, superfícies de cozinha e superfícies sanitárias.