BRPI0611834A2 - processo de extração e medição da atividade enzimática em rações - Google Patents

Abstract

PROCESSO DE EXTRAçãO E MEDIçãO DA ATVIDADE ENZIMáTICA EM RAçõES. A presente invenção refere-se a processos de detecção de enzimas enzimaticamente ativas em rações, adicionadas na etapa de pré- peletização. Além disso, a presente invenção refere-se ao campo da detecção de enzimas termotolerantes, adicionadas à ração na etapa de pré- peletização. Em particular, a presente invenção refere-se à detecção de uma enzima fitase, em particular uma fitase de E. Coli ou uma fitase derivada de E. Coli em rações, tal como Quantum(r) fitase.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "PROCESSODE EXTRAÇÃO E MEDIÇÃO DA ATIVIDADE ENZIMÁTICA EM RAÇÕES".

O presente pedido de patente reivindica o benefício da data derequerimento do Pedido de Patente Provisório norte-americano Ne60/692.474, depositado 21 de Junho de 2005, que é aqui incorporado porreferência.

Campo da Invenção

A presente invenção refere-se ao campo das análises enzimáti-cas para rações animais e, mais particularmente, refere-se à detecção deenzimas com atividade enzimática em rações, adicionadas na etapa de pré-peletização, tal como enzimas termotolerantes. Em particular, a presenteinvenção refere-se à detecção de uma enzima fitase, em particular uma fita-se de E. Coli ou uma fitase derivada de E. Coli em rações, tal como Quan-tum® fitase. Este processo de extração desenvolvido tem-se também reve-lado igualmente eficiente na extração da fitase e outras enzimas expressasno grão de milho transgênico.

Antecedentes da Invenção

A fitase (mioinositol hexaquisfosfato fosforilase, EC 3.1.3.8) cata-lisa a hidrólise das ligações de éster fosfórico do fitato (mioinositol hexaquis-fosfato). Ao longo da última década e meia, as fitases fúngicas e bacterianastêm sido utilizadas com êxito como aditivo na dieta de animais monogástri-cos para melhorar a biodisponibilidade do fitato, fosfato e outros minerais.

Para medir a atividade enzimática deste aditivo para rações animais, Enge-Ien e colegas publicaram um processo "simples e rápido" de medição da ati-vidade da fitase (Engelen AJ, et al., Simple and rapid determination of phvta-se activitv. J AOAC Infl. 77(3):760-64 (1994)). As condições de análise (37,0°epH 5,5) recomendadas por estes autores eram as condições ótimas dereação para a fitase de Aspergillus niger (Natuphos®), a única fitase entãodisponível no mercado. Uma versão oficial deste processo básico foi publi-cada em 1996, na quarta edição do Food Chemicals Codex (FCC). Nestedocumento, uma unidade de fitase (FTU) foi definida como "a quantidade deenzima que liberta fosfato inorgânico a 1 pmol/min a partir de fitato de sódio0,0051 ml/L a 37,0°C a pH 5,50 nas condições de ensaio".

Uma versão modificada do processo fitase FCC IV, destinado amedir a atividade fitase em rações animais foi publicada por Engelen et al.(Determination of phytase activitv in feed by a colorimetric enzvmatic me-thod: collaborative interlaboratorv studv. J. AOAC Intl. 84:629-33 (2001)).Este processo foi também publicado como processo oficial AOAC 2000.12Atividade fitase em rações e é designado em geral como o "processo AO-AC". É, essencialmente, o mesmo que o processo FCC mas inclui etapasadicionais de moagem e extração de amostras de ração antes da análiseenzimática.

No entanto, o processo AOAC de medição da fitase na raçãocarece de grande precisão e robusta reprodutibilidade, em especial paraamostras de ração de lotes de ração doseados pré-peletização com formula-ções secas granuladas ou em partículas de fitases e também fitases deriva-das de Escherichia coli (E.coli). Por conseguinte, existia a necessidade deadaptar o processo AOAC de fitase na ração para fitases adicionadas pré-peletização e mais especificamente para fitases derivadas de E.coli, adicio-nadas pré-peletização.

Tradicionalmente, as enzimas eram pulverizadas sobre o péleteda ração depois da etapa de peletização, porque as enzimas não eram ter-moestáveis e não poderiam sobreviver às elevadas temperaturas utilizadasno processo de peletização, o que inclui o acondicionamento por vapor.Quando a enzima era pulverizada sobre o pélete da ração arrefecido, a en-zima era distribuída mais uniformemente e só à superfície do pélete. Maisrecentemente, as enzimas estão a ser adicionadas às massas ou ração mis-turada seca pré-peletização como formulações secas, granuladas ou particu-ladas, concentradas, em que a enzima é aplicada a um veículo ou embebidaem um veículo ou agente de volume. As partículas de produto secas podemtambém ser revestidas de cera, por exemplo para melhorar a resistênciatérmica. Uma vantagem-chave deste tipo de formulação seca concentradareside na possibilidade de ser adicionada à ração utilizando sistemas demanipulação de microingredientes secos já existentes, no máximo moinhospara rações. Uma principal desvantagem dos concentrados secos adiciona-dos pré-peletização, porém, reside na aplicação da atividade enzimática nãocomo uma pulverização uniforme mas sim em uma forma particulada con-centrada e a uma taxa de inclusão extremamente baixa. Este fato cria novosdesafios relacionados com a distribuição uniforme do produto pelo lote deração (mistura), com implicações tanto para a liberação da enzima nos ani-mais (isto é doseamento uniforme) bem como para a capacidade de repro-dução dos processos analíticos (isto é, capacidade de reprodução da análiseenzimática de subamostra para subamostra).

Estão a ser utilizadas novas enzimas termoestáveis nas raçõespara animais (Garrett et al., Applied and Environmental Microbiology 70(5):3041-3046 (2004)). As novas enzimas termoestáveis podem ser adicionadaspré-peletização uma vez que podem resistir às elevadas temperaturas utili-zadas no acondicionamento por vapor e processo de peletização. A utiliza-ção de processos analíticos na ração tradicionais não permitiu medições fi-dedignas e reproduzíveis da atividade enzimática das amostras de ração. Asatividades enzimáticas medidas eram muito variáveis de análise para análisedas subamostras das mesmas amostras de ração. Fatores possíveis quecontribuem para esta variabilidade incluem a) distribuição não-uniforme daspartículas de produto seco, especialmente em amostras de lotes de raçãoem massa devido à deposição do produto em amostras armazenadas, b)amostras e subamostras de lotes não representativas resultantes de tama-nho de amostra insuficiente, c) extração ineficiente da enzima das partículasde produto seco pélete, em que a enzima é embebida no veículo ou agentede volume ou encerrada na matriz da ração em resultado, por exemplo degelatinização do amido e d) baixa relação sinal-ruído na análise da atividadedevido a condições de análise subótimas.

As enzimas de formulação seca são tipicamente adicionadas àração a taxas de inclusão muito baixas, tendo como resultado concentraçõesextremamente baixas de enzima na mistura complexa da ração. Por exem-plo, a dose recomendada de Quantum® Phytase (uma fitase derivada de E.coli) 2500D para frangos é 500 FTU/kg de ração. A dose é atingida a umataxa de inclusão de 200 gramas de 2500D por tonelada métrica de ração, oque corresponde a uma diluição de 5000 vezes do produto na ração. Porconseguinte, é necessária uma análise muito sensível para a medição exac-ta da atividade da fitase na ração. Para uma sensibilidade máxima da análi-se é crítico que as condições da análise sejam estabelecidas ao pH e tempe-raturas ótimo da enzima. Tal como anteriormente mencionado, as condiçõesde análise da medição da atividade fitase descritas no processo AOAC (En-gelen, A.J., et al. 2001) e que definem a unidade de fitase padrão ou FTUsão ótimas para a fitase Aspergillus niger. No entanto, estas condições nãosão ótimas para fitases derivadas destas fontes, tal como E. Coli e quandousadas comprometem a sensibilidade e fiabilidade da análise.

Melhorar a relação sinal-ruído para as medições da atividadefitase aumenta a exatidão da análise mas, no entanto, não reduz a grandevariação observada nos resultados da análise através de ambas as amos-tras do lote da ração replicadas e através das subamostras replicadas dasamostras de lotes. Os factores que contribuem para a variabilidade da análi-se pelas amostras e subamostras foram mencionados anteriormente e inclu-em distribuição heterogênea da enzima fitase na amostra e extração ineficazou não-quantitativa da enzima, em especial de rações acondicionadas porvapor e granuladas. Estas observações demonstram a necessidade de pro-cessamento consistente de amostras, bem como de um procedimento efici-ente de extração da atividade fitase de amostras de ração animal.

Por conseguinte, existia uma necessidade de uma medição re-produzível e fidedigna da atividade enzimática em amostras de ração quan-do a enzima é adicionada pré-peletização ou adicionada como um pélete. Apresente invenção tem aperfeiçoamentos significativos em relação à análiseenzimática na ração tradicional, tornando possível obter medições reprodu-zíveis, fidedignas da atividade enzimática em amostras replicadas, recolhi-das de lotes de ração animal. Os aperfeiçoamentos da presente invençãoutilizam um tamanho da amostra do lote da ração maior, moendo a amostrado lote da ração, reduzindo-a a uma dimensão de partícula menor e utilizan-do um tampão de extração de pH alcalino.Sumário da Invenção

A presente invenção refere-se a um processo de extração e me-dição da atividade enzimática em ração, incluindo as etapas de:

a) a moagem de uma amostra de ração de pelo menos cerca de300 gramas ± 30 gramas, de forma que cerca de 80 % do material tem umadimensão de partícula de 250 pm ou menos para fazer uma amostra de ra-ção moída;

b) mistura da amostra de ração moída com um tampão de boratoaquoso de cerca de 25 mM de borato de sódio a cerca de pH 10,0;

c) extração da enzima da amostra de ração moída e

d) medição da atividade enzimática nas condições que atingemuma relação sinal-ruído óptirna para a enzima de interesse.

Breve Descrição das Figuras

A figura 1 é um gráfico que mostra que o tampão de borato desódio a pH 10 recupera mais atividade fitase de ração peletizada em compa-ração com outros tampões a pH 5, 7, 8 e 10. 70QC e 83°C referem-se ao a-condicionamento da ração e temperaturas de peletização. As concentraçõesde tampão foram todas 25 mM. Não foi adicionado Tween® 20. As atividadesde fitase relativas no gráfico eram expressas como a percentagem da ativi-dade enzimática recuperada utilizando tampão de borato (pH 10).

A figura 2 é um gráfico que mostra que a concentração do fosfa-to existente dos extratos de ração dependia do tampão de extração e pH. Asconcentrações de tampão foram todas 25 mM. Não foi adicionado Tween®20. NaOAC, acetato de sódio, Tris1 Tri-HCI, borato, borato de sódio.

A figura 3 é um gráfico que mostra que o tampão de borato desódio a pH 10, com 0,01 % de Tween® 20 extrai a atividade de fitase maiseficientemente da ração peletizada em comparação com o tampão de dilui-ção AOAC (250 mM de acetato de sódio a pH 5,5, 0,01 % de Tween® 20, 1mM de CaCI2). Os lotes de ração foram misturados, acondicionados e péle-tes em dois moinhos diferentes (moinhos A e B) e as amostras do lote deração foram processadas e as subamostras foram analisadas em duplicadopara determinar a atividade de fitase conforme descrito no exemplo 3, comexceção do tampão de diluição AOAC que substituiu o tampão de borato apH 10 em um dos tratamentos. De resto, os extratos receberam igual trata-mento. A atividade da fitase recuperada é expressa como uma percentagemda atividade recuperada da amostra de massa correspondente (mesmo moi-nho, mesmo lote) utilizando tampão de extração de borato (pH 10).

A figura 4 é um gráfico que mostra que o tampão de borato desódio a pH 10, com 0,01 % de Tween® 20 extrai a atividade da fitase maiseficientemente da ração peletizada em comparação com o tampão de dilui-ção AOAC (250 mM de acetato de sódio a pH 5,5, 0,01 % de Tween® 20,68,4 mM de CaCI2). Os lotes de ração foram misturados, acondicionados epéletes no moinho de ração C e as amostras e subamostras do lote de raçãoforam extraídos tal como descrito no exemplo 3. Os extratos de amostras deração moídas foram diluídos com tampão de diluição AOAC e analisados apH 5,5 e 37°C para determinar FTU/kg de ração. A amostra dé massa extra-ída com tampão de borato de sódio a pH 10 continha 871 FTU/kg e as a-mostras peletizadas a 70°C, 83°C e 86°C continham, respectivamente, 68%, 23 % e 13 % desta atividade inicial. A atividade fitase é expressa como apercentagem da atividade enzimática recuperada de cada tipo de amostraextraída com tampão de borato (pH 10).

As figuras 5A e B são gráficos que comparam o processo AOACe o processo da fitase do presente pedido de patente. O processo oficialAOAC 2000.12 subestima a atividade fitase em ração peletizada contendoQuantum® Phytase 2500D. As amostras de ração peletizada do moinho A(figura 5A, topo) e moinho D (figura 5B, fundo) foram moídas e as subamos-tras foram extraídas tanto de acordo com o processo descrito presentemente(extração em tampão de borato de sódio a pH 10 e diluição e análise a pH4,5, 60°C) ou de acordo com o processo oficial AOAC 2000.12. A amostracontinha cerca de 200 FTU/kg, medida de acordo com o novo processo eutilizando, um fator de conversão de 5,66 unidades = 1 FTU. A figura mostrao gráfico das absorvâncias medidas (a 415 nm) depois da adição do reagen-te color-stop à análise de reação e a mistura de fundo (fund). Atenção, o pHda mistura reacional para a enzima extraída com tampão de borato a pH 10não podia passar para pH 4,5 (para análise de fitase) com uma diluição demenos de 5 vezes do extrato.

As figuras 6A e B mostram os resultados de uma extração se-qüencial de farinha de semente de milho transgênico com diferentes tampões. Amostra "5,5" é tampão de diluição AOAC (250 mM de acetato de sódio pH 5,5, 1 mM de CaCI2, 0,01 % de Tween® 20). Amostra "8" é 50 mMTris-HCI, pH 8,0, 100 mM de NaCI, 2 mM de EDTA. A amostra "10" é 25 mMde borato de sódio pH 10, 0,01 % de Tween® 20. A figura 6A é um gráficoque mostra a atividade da fitase total extraída das amostras de farinha repli-cadas. A atividade da fitase extraída da amostra número 3 foi definida como100 % (atividade de fitase máxima extraída). A figura 6B é uma análise daWestern blot de extratos analisados na figura 6A.

A figura 7 é uma fotografia de Western blot e um gráfico quemostra que o tampão de extração de borato de sódio pH 10, com 0,01 % deTween® 20 extrai >95 % da atividade da fitase recombinante total (e proteínada fitase recombinante) a partir de farinha de milho moída. Foram extraídasamostras de farinha de milho em 1 a 3 rondas com tampão B e tampão Τ. Otampão B consistia em 25 mM de borato de sódio (pH 10), 0,01 % de Twe-en® 20. O tampão T (tampão de extração de proteína total) consistia em 12,5mM de borato de sódio a pH 10, 1 % de SDS, 2 % de 1-mercaptoetanol. To-po: Análise de Western blot de todos os extratos. Farinha de milho transgê-nico: amostras 48, 53, 49, 54, 50, 55 e 60. Farinha de milho não-transgênico:amostra 61. QP, extrato de Quantum® Phytase 2500D. Fundo: atividade dafitase só dos extratos do tampão B. Deve-se ter em consideração que, de-pois da extração com o tampão de desnaturação TPEB, a atividade da fitasenão foi analisada.

A figura 8 é um gráfico que mostra uma extração mais eficientedas três enzimas recombinantes expressas em sementes de milho transgê-nico utilizando tampão de borato pH 10, em comparação com tampão deacetato de sódio pH 5,5. Foram extraídas cinco amostras replicadas de se-mente de milho transgênico moído a pH 10 (25 mM de borato de sódio a pH10, 0,01 % de Tween® 20) e pH 5,5 (250 mM de acetato de sódio, 0,01 % deTween® 20). Os extratos foram diluídos e analisados por meio de ELISA. Aquantidade relativa da proteína da enzima recombinante extraída a pH 5,5 écomparada com a quantidade da proteína extraída utilizando tampão de bo-rato a pH 10.

A figura 9 é um gráfico que mostra a análise da dimensão departícula do produto seco Quantum® fitase 2500D (não moído) e amostrasde ração peletizâda, moídas com um moinho de martelos (Laboratory Mill3600, Perten Instruments com peneira de 0,8 mm) e moinho de discos (La-boratory Mill 3100, Perten Instruments com disco Ns 1 na posição 0).

A figura 10 é um gráfico de comparação da análise de dimensãode partícula da ração em massa (não moída) e pélete de ração moída. Moi-nho de laboratório 3600 (Perten Instruments); moinho de disco com disco Ng1 na posição 0. Moinho de laboratório 3100 (Perten Instruments); moinho demartelos com peneira de 0,8 mm. Moinho de café, modelo Kitchen AidBCG100WH1. Cada barra representa a média de 9 fracionamentos: Trêsamostras de 50 gramas foram moídas e de cada uma destas foram fraciona-das três subamostras de 10 gramas.

A figura 11A e B são gráficos que mostram a variabilidade daatividade de fitase recuperada de 10 subamostras, retiradas de uma únicaamostra de lote de ração moída de ração em massa e de ração peletizada. Aexperiência foi realizada por duas vezes. Figura 11 A: Rep 1. Figura 11B:Rep 2.

A figura 12A e B mostram o efeito do tamanho da amostra dolote de ração quanto à variabilidade da atividade enzimática recuperada damassa e ração peletizada. As amostras moídas foram analisadas quanto àatividade da fitase, de acordo com o procedimento descrito no exemplo 3. Afigura 12A (topo) mostra a variabilidade média da medição da atividade dafitase por extrações repetidas. Esta variabilidade é definida como o coefici-ente interanálises da variação (CV). Cada barra representa a média de trêsvalores CV interanálises, sendo cada um dos três valores, ele próprio a mé-dia de três extrações. As barras de erro indicam a variabilidade dos valoresCV inter-análise nas três amostras moídas. Figura 12B: Variabilidade damedição da atividade da fitase nas amostras moídas triplicadas. Cada barrarepresenta o CV da medição da atividade de fitase das amostras moídastriplicadas do tamanho indicado.

Descrição Detalhada da Invenção

A presente invenção refere-se a um processo de extração e me-dição da atividade enzimática em ração, incluindo as etapas de:

a) a moagem de uma amostra de ração de pelo menos cerca de300 gramas ± 30 gramas, de forma que cerca de 80 % do material tem umadimensão de partícula de 250 μιτι ou menos para fazer uma amostra de ra-ção moída;

b) misturar a amostra de ração moída com um tampão de boratoaquoso de cerca de 25 mM de borato de sódio a cerca de pH 10,0;

c) extrair a enzima da amostra de ração moída e

d) medir a atividade enzimática.

O processo refere-se ainda ao fato da enzima ser fitase, amilaseou celulase. Uma outra concretização é quando a fitase é uma fitase deE.coli ou uma fitase derivada de E.coli. Outra concretização é quando a fita-se é Quantum® Phytase.

A presente invenção refere-se também a quando a amostra deração é uma amostra de ração em massa ou peletizado.

A presente invenção refere-se também a quando a medição daatividade enzimática é uma análise de fitase executada a pH 4,5 e 60°C.

A presente invenção refere-se à medição da atividade enzimáti-ca, em que a enzima da ração foi produzida em uma planta transgênica. Emparticular, quando a enzima da ração é fitase, celulase ou amilase.

A invenção será agora descrita mais pormenorizadamente fa-zendo referência aos seguintes exemplos. Estes exemplos são fornecidosapenas para ilustração e não se pretende que constituam limitações, excetoem caso de indicação em contrário.

Exemplos

Exemplo 1. Manipulação E Moagem De Amostras De Ração Contendo

Quantum® PhytaseEste processo descreve o processamento e moagem das amos-tras de ração animal contendo Quantum® Phytase 2500D na preparação pa-ra extração da atividade da fitase para a análise enzimática.

Equipamento

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Equipamento de proteção pessoal

Utilizar as seguintes precauções de segurança em laboratórioquando executar este processo. Utilizar luvas de látex isentas de nitrilas oude pós, jaleco, óculos de proteção, máscara antipoeiras e proteções de ou-vidos. Manter as mãos, vestuário e cabelo afastados do moinho. Desligar omoinho antes de limpar e ao remover e substituir peças e receptáculos. NÃOagitar o grão nas tremonhas com as mãos. Limpar a área de trabalho comaspirados no fim. Esvaziar o aspirador após cada utilização para impedir aacumulação de farinha e infestação de bolor.

Mistura. Se o tamanho da amostra primária exceder os 330g é necessário oseguinte procedimento de mistura. Os sacos de amostra primária devem serrodados um mínimo de 12 vezes em cada direção (12 vezes no sentido ver-tical, 12 vezes para a esquerda, etc.) antes do saco ser aberto e recolhida aamostra secundária. Se não houver espaço suficiente para misturar a amos-tra primária no saco, esvaziar o conteúdo para um contentor com um volumede amostra igual para fazer espaço antes da mistura.

Moagem. Colocar o funil de plástico diretamente no moinho de forma que aração escorra diretamente para a câmara do moinho. Não utilizar o acessó-rio de controle da ração com vácuo que é normalmente posicionado entre ofunil e o moinho uma vez que este ficará rapidamente entupido com ração.Cuidado: Não pôr os dedos no funil durante o funcionamento do moinho.Moer 300 g de ração bem misturada* em um moinho de martelos Perten3100 com uma peneira de 0,8 mm de tamanho de poro. Lentamente (a umavelocidade de 100 g de ração por minuto ou menor) adicionar a ração nomoinho de forma a evitar o aquecimento da ração e/ou entupimento da pe-neira. *Nota que, se o tamanho da amostra primária for superior a 330 g, aamostra primária deve ser misturada cuidadosamente, conforme descritoanteriormente no parágrafo "Mistura" antes da amostra secundária de 300 gser removida antes da moagem no moinho de martelos. Se o tamanho deamostra primária for >100 gramas mas <330 gramas, moer toda a amostraprimária e registrar o peso da amostra não misturada/não moída no relatórioapresentado.

Quando se mói uma série de amostras, medir e registrar a tem-peratura da primeira amostra moída imediatamente depois da transferênciapara o saco de armazenagem. Para todas as amostras subsequentes nãodeixar a temperatura após moagem subir mais de 5°C acima da temperaturada primeira amostra moída. Pelo contrário, prever tempo adicional para queo moinho arrefeça depois da limpeza antes de continuar com a amostra se-guinte.

Limpar o moinho entre cada amostra com a escova do moinhode martelos Perten, vareta de plástico e aspirador. Misturar bem a amostramoída antes da armazenagem e novamente antes de remover subamostrasmoídas para análise. Recomenda-se (Apêndice 1) que as amostras primá-rias submetidas sejam 300 g (±30 g) e que todos os 300 g da amostra primá-ria sejam moídos em moinho de martelos. Se forem incluídas repetições,estas têm de ser rotuladas claramente com um identificador único. Cadauma das amostras de ração dos 300 g deve ser moída em separado e anali-sada em separado. As amostras devem ser moídas por ordem, desde a do-sagem mais baixa até à dosagem mais elevada (com limpeza entre cadaamostra).

Exemplo 2: Preparação, armazenagem e manipulação do controle e amos-tras de verificação para a análise de Quantum® Phytase na raçãoPrincípio. Este processo descreve a preparação de Quantum® "25D" (Quan-tum® 2500D diluído 100 vezes). 25D é utilizado para controles Il e Ill no pro-cesso analítico na-ração de Quantum® Phytase, descrito no exemplo 3 emseguida. Este processo descreve também a armazenagem e manipulaçãode amostras de verificação de ração contendo Quantum® Phytase 2500D.

Materiais

Quantum® "25D" Padrão

Quantum® 2500D

Suporte de trigo

Amostras de verificação de ração moídasSacos de plástico Zip-loc®, tubos de ensaio para centrifugadorade plástico de 50 ml tipo Falcon® e esponjas de umidade com indicador de cor.

Moaqem das amostras e limpeza do moinho: Seguir "Manipulação e moa-gem de amostras de ração contendo Quantum® Phytase 2500D" no exemplo 1, supra.

Preparação do controle Quantum® Phytase 25D: moinho 320 g de suportede trigo seco. Limpar moinho. Moer 10,0 g de produto Quantum® Phytaseseco (Quantum 2500D®). Pesar 297,00 g de suporte de trigo seco moído ecolocar em saco de plástico. Pesar 3,00 g de amostra de Quantum® moída ecombinar com amostra de suporte de trigo. Selar o saco e misturar cuidado-samente "25D" conforme descrito no exemplo 1.

Depois de misturar, abrir saco e excluir o ar do saco. Colocar osaco em outro saco de plástico. Adicionar duas ou mais esponjas de úmida-de, excluir o ar e selar o saco exterior. Controlar a intervalos regulares esubstituir as esponjas de umidade conforme as necessidades. Armazenar osaco contendo 25D a 4°C. Em alternativa, guardar as amostras sob refrige-ração (de preferência 4°C) a uma umidade relativa baixa (de preferência <30 % UR).

Armazenagem das amostras de verificação da ração: Colocar a amostra deração moída em üm saco de plástico. Excluir o ar do saco. Colocar este sacoem um segundo saco de plástico. Adicionar pelo menos 2 esponjas de umi-dade ao segundo saco. Excluir o ar do saco do saco exterior e selar. Nãoselar o saco interior que contém a ração. Controlar a intervalos regulares esubstituir as esponjas de umidade conforme as necessidades. Guardar a4°C. A ração tem de ser mantida fria (para evitar infestação por insetos) eseca (para evitar formação de bolor). IMPORTANTE: Não selar o saco inte-rior, de forma que a esponja de umidade possa absorver também a umidadedo saco interior. Em alternativa, guardar as amostras sob refrigeração (depreferência 4°C) a uma umidade relativa baixa (de preferência <30 % UR).Pesaqem de amostras de ração moídas para extração: Antes de pesar su-bamostras, equilibrar a ração moída em saco duplo à temperatura ambientedurante pelo menos 2 horas. Pesar 4,5000 g (± 0,050 g) da amostra, regis-trar o peso e o nome da amostra do lado do tubo de ensaio. Colocar a amos-tra em tubo de ensaio rotulado e selar com tampa.

Exemplo 3: Determinação de atividade enzimática da fitase extraível da ra-ção a pH 4,5 e 60°C por meio de Liberação de fosfato inorgânica.

Este procedimento inclui um processo de extração da enzimafitase a partir da ração, seguida de análise enzimática da fitase extraída. Aanálise da fitase baseia-se na detecção de fosfato inorgânico liberado dosubstrato de fitato de sódio, pela ação hidrolítica da enzima fitase. A reaçãoenzimática é efetuada durante 60 minutos a pH 4,5 e 60°C, seguida de im-pregnação simultânea da reação e desenvolvimento de cor.

O desenvolvimento da cor, que é medido por espectrofotometriaa 415 nm, é o resultado da formação de complexos de fosfato inorgânicoliberado enzimaticamente com íons de molibdato e vanadato do reagente decoloração.

Uma unidade de Quantum® Phytase (QPU) é a quantidade deenzima que libera 1 pmol de fosfato inorgânico de fitato de sódio por minutoa 60°C e a pH 4,5. A unidade de Quantum® Phytase (QPU)1 presentementedefinida, é DIFERENTE da unidade de fitase internacional (FTU); sendo ofator de conversão (QPU/FTU) aproximadamente igual a 5,66 para Quan-tum® Phytase. (O fator de conversão pode ser determinado empiricamentepara cada conjunto de análises por comparação do resultado da análise parao controle 25D, descrito no exemplo 2 e a atividade fitase do lote original emFTU/g). FTU é definida como a quantidade de enzima que libera 1 μηιοΙ defosfato inorgânico de fitato de sódio por minuto a 37°C e a pH 5,5. Atenção,as atividades enzimáticas da fitase em amostras de ração e amostras deQuantum® Phytase (seco e líquido) são freqüentemente rotuladas em FTU.

Produtos químicos

Ácido acético glacial, 17,55 mol/L Fisher N9 A38-500 ou equivalente(CH3COOH)

Solução de hidróxido de amônio, 29 % p/v Fisher Ng A669-500 ou equivalente(NH4OH)

Metavanadato de amônio (NH4VO3) Sigma N9 A-1183 ou equivalente

Molibdato de amônio tetra-hidratado Fluka Nq 09880 ou equivalente(NH4)6M 7o244H20)

ácido nítrico concentrado >65 % (HNO3) Fisher Ne A200-500 ou equivalente

Ácido fítico (sal dodecassódico de arroz, Sigma N2 P-3168 (sem substituto)(C6H6O24P6Nai2)

Dihidrogenofosfato de potássio, (KH2PO4) Fisher Ne BP362-1 ou equivalenteAcetato de sódio trihidratado Fisher Ng BP334-1 ou equivalente(CH3C00Na*3H20)

Borato de sódio decahidratado Sigma Nq S-9640 ou equivalente(Na2B4O7jIOH2O)

hidróxido de sódio (NaOH) Sigma Ng S-0899

Tween® 20 (monolaurato de polioxietileno Sigma Ng P-7949 ou equivalentesorbitano)Equipamento (equivalentes podem ser substituídos)

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Consumíveis

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Comentários gerais. Utilizar todas as precauções de segurança apropriadasem laboratório quando executar esta análise. Garantir que os reagentes eartigos de vidro estão isentos de contaminação de fosfatos. Os pipetadores ebalanças analíticas devem ser calibrados regularmente. Usar água desioni-zada para preparar todos os reagentes e testar soluções. Depois da análiserecolher todas as amostras que contêm solução color stop em um recipientepara resíduos em separado e eliminar em conformidade. Todas as centrifu-gações devem ter lugar em uma centrifugadora com o seu mostrador datemperatura na temperatura ambiente.Preparação de-reaqentes

Solução-mãe de heptamolibdato de amônio. Dissolver 100 gramas de hep-tamolibdato de amônio em 900 mL de água desionizada. Adicionar 10 mL dehidróxido de amônio (29%) e transferir quantitativamente para um frasco vo-lumétrico de 1,0 L Ajustar o volume a 1,0 L com água desionizada e envol-ver o frasco com folha de alumínio para proteger da luz. Manter à temperatu-ra ambiente, protegido da luz durante não mais de 30 dias.

Solução-mãe de vanadato de amônio. Dissolver 2,35 gramas de vanadatode amônio em 800 mL de água desionizada em um frasco volumétrico. Co-brir bem o gargalo do frasco volumétrico com várias camadas de parafilme.Aquecer a amostra em um banho de água a 60°C para ajudar a dissolução.Assim que o vanadato de amônio se dissolveu completamente sob uma ca-pela bem ventilada, adicionar 20 mL de ácido nítrico dissolvido durante agi-tação. (O ácido nítrico diluído é feito por meio da adição de 7 mL de ácidonítrico concentrado a 13 mL de água desionizada). Deixar arrefecer até àtemperatura ambiente, transferir para um frasco volumétrico de 1,0 L e ajus-tar o volume a 1,0 L com a água desionizada. Envolver o frasco com folha dealumínio para proteger da luz. Manter à temperatura ambiente, protegido daluz durante não mais de 30 dias.

Solução Color stop. A quantidade de solução color stop que terá de ser feitavai depender do número de amostras que vão ser analisadas. A preparaçãodesta solução deve ser efetuada em uma capela bem ventilada. Para umasolução color stop de 100 mL, mistura-se 25 mL de solução-mãe de hepta-molibdato de amônio com 25 mL de solução-mãe de vanadato de amônio.Adicionar lentamente a esta mistura 16,5 ml de ácido nítrico diluído (7 mL deácido nítrico concentrado e 13 mL de água desionizada) com mistura cons-tante para evitar precipitação. Ajustar o volume de 100 mL de água desioni-zada em um frasco volumétrico. A cor da solução stop deve ser amarelo-pálido. Depois da análise recolher todas as amostras que contêm soluçãocolor stop em um recipiente para resíduos em separado e eliminar em con-formidade. Preparar fresco no próprio dia da utilização.Tampão acetato, 250 mM, pH 4,5. Dissolver 12,04 gramas de acetato desódio trihidratado em 900 mL de água desionizada com 9,2 mL de ácido acé-tico glacial. Ajustar o pH da amostra a 4,5 com ácido acético ou com hidróxi-do de sódio diluído. Adicionar a este 1,0 mL de uma solução de Tween® 20 a10 % (p/v). Transferir quantitativamente o material para um frasco volumétri-co e ajustar o volume a 1,0 L de água desionizada. Manter a 4°C durante 30dias no máximo.

Substrato de fitato de sódio (9.09 mM). Dissolver 2,1 gramas (2,27 mmols)de fitato de sódio em aproximadamente 200 mL de tampão de acetato a 250mM a pH 4,5. Ajustar o pH, à temperatura ambiente, a 4,5 utilizando ácidoacético. Transferir a solução para um frasco volumétrico de 250 mL e ajustaro volume a 250 mL com tampão de acetato a pH 4,5. Preparar de fresco nopróprio dia da utilização.

Fosfato de potássio padrão (7,2 mM). Pesar 0,980 grama de dihidrogenofos-fato de potássio e dissolver em 250 mM de tampão de acetato em um frascovolumétrico de 1,0 L. Ajustar o pH a 4,5 se necessário, com ácido acético ouhidróxido de sódio e ajustar o volume a 1,0 L com 250 mM de tampão deacetato pH 4,5 (5,4). Manter a 4°C durante 90 dias no máximo.

Solução de Tween® 20 (10 % p/v). Dissolver 5 gramas de Tween® 20 em 40mL de água desionizada em um frasco volumétrico e ajustar o volume a 50mL com água desionizada. Manter a 4°C durante 3 meses no máximo.Tampão de extração de borato de sódio a 25 mM, pH 10,0. Dissolver 9,53gramas de borato de sódio em 900 mL de água desionizada. Ajustar o pH dotampão a 10,0 utilizando hidróxido de sódio diluído. Se indicado, pode-seadicionar a esta adição 1,0 mL de solução de Tween® 20 a 10 %. Transferiro material para um frasco volumétrico de 1,0 L e ajustar o volume a 1,0 L deágua desionizada. Manter a 4°C durante 30 dias no máximo.Preparação da amostra e análise enzimática da fitase

(a) Moagem. A moagem foi efetuada conforme é descrito no e-xemplo 1 anteriormente, que descreve a manipulação e a moagem de amos-tras de ração, contendo Quantum® Phytase 2500D.

(b) amostra de controle e de verificação. Inclui uma amostra decontrole e uma amostra de verificação com cada análise.

I. Controle 25D: Para um padrão Quantum® seco adicionar 90mg de Quantum® 25D em um tubo de centrifugadora de 50 ml_, seguido de42 mL de tampão de extração de borato. Esta quantidade de 25D suspensaem um tampão de 42 ml corresponde a uma amostra de ração de 4,5 gra-mas, contendo Quantum® Phytase 2500D a uma velocidade de inclusão de200 gramas por tonelada. A esta velocidade de inclusão a Quantum® Phyta-se 2500D irá fornecer uma dose final de 500 FTU/kg de ração.

II. Amostra de verificação: Uma amostra de ração em massa,com quantidade conhecida de efeito de fitase extraível. Amostras de 25D eamostras de verificação de ração podem ser obtidas da Syngenta AnimalNutrition (3054 Cornwallis Rd., Research Triangle Park, NC 27709, USA).Realizar pelo menos extrações duplicadas para o controle 25D e a amostra20 de verificação. Analisar cada extrato em triplicado.

(c) extração de fitase. Para cada amostra moída de 300 g prepa-rar três tubos de centrifugadora de 50 mL, contendo cada um 4,50 g +/-0,050 g de ração finamente moída. (Antes da pesagem da amostra, misturarbem a ração moída). Colocar o tubo na balança. Determinar o peso vazio dabalança e adicionar 42 mL de tampão de extração de borato de sódio ao tu-bo de ensaio. O tampão de extração deve estar à temperatura ambiente an-tes da utilização. Registrar a massa do tampão adicionado. Fechar bem atampa, agitar até que toda a ração fique suspensa e misturar em um rotadordurante 30 minutos à temperatura ambiente (-22 -C). Selecionar uma velo-cidade de agitação que mantenha toda a ração suspensa ao longo do pro-cedimento de extração (70 a 75 no rotador de laboratório). Centrifugar a so-lução durante 10 minutos a 1800 χ g. A fração sobrenadante será utilizadacomo a enzima-mãe. O sobrenadante pode ter duas camadas, uma camadainferior relativamente transparente e uma camada turva superior. É esta ca-mada inferior que deve ser utilizada para a análise. Diluir o sobrenadante decada extração conforme descrito na seção (d). Utilizar então sobrenadantediluído (de cada extração) para análises triplicadas. O sobrenadante deveser guardado a 4°C. Começar a reação de análise no espaço de três horasdepois da extração.

(d) Diluição de trabalho da análise. Em uma balança tarada adi-cionar e registrar a massa de 0,5 mL de enzima extraída da seção (c). Adi-cionar 4,5 mL de tampão de acetato, utilizando pipetas de repetição e regis-trar a massa total do extrato e tampão. Agitar em vórtex as diluições e centri-fugar a 1800 χ g durante 10 minutos para remover sais precipitados (reco-mendado 5 mL de volume de amostra). Com esta diluição de 1:10 espera-seque a ração em massa contendo Quantum® Phytase a 500 FTU/kg observeum OD415 entre 0,9 e 1,1 na análise final.

Determinação da diluição ótima: Quando o nível esperado deatividade de fitase não é conhecido poderá ser necessário um estudo rápidode determinação do alcance para determinar a velocidade de diluição ótimapara obter uma análise de amostra particular à escala. O estudo de determi-nação dó alcance é conduzido por meio da preparação da extração como seindica em seguida. As variações da análise são então feitas relativamente àpreparação da diluição de trabalho listada em seguida.

Para o estudo de determinação do alcance, faz-se um conjuntode diluições de trabalho em uma base volumétrica e estas são então passa-das por uma análise modificada de Quantum® Phytase. A análise de deter-minação do alcance pode ser passada com apenas um único tubo de reaçãopara cada diluição a ser testada e sem reação em brancos. Assim que ficadeterminada a velocidade de diluição óptima, continua-se a análise por meioda preparação das diluições de trabalho de acordo com o protocolo detalha-do em seguida. A absorvância-alvo a 415 nm situa-se entre 0,4 e 1,1. A cur-va-padrão foi observada para manter linear ao nível OD 1,4. Cálculo da dilui-ção de trabalho: Tomar a massa de extração e dividir o valor pela massatotal de líquido no tubo de ensaio. O inverso desse número será o fator dadiluição de trabalho.

Curva-padrão de fosfato. Utilizar o fosfato de potássio padrão preparadocomo o anterior e o tampão de acetato anterior para atingir os seguintes pa-drões de fosfato: Tabela 1: Curva-padrão de fosfato

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Recolhem-se alíquotas dos volumes de fosfato/tampão enume-rados na tabela anterior em tubos de ensaio. Adicionar 1,0 mL de substratode fitato de sódio a cada tubo-padrão e agitar no vórtex para misturar. Adi-cionar 1,0 mL de solução color stop aos padrões a seguir à análise e mistu-rar. Deixar repousar durante 5 minutos à temperatura ambiente para concluira reação de coloração; esta operação é seguida de centrifugação a 1800 χg, durante 10 minutos, clarificar a solução antes das medições da absorvân-cia. As medições espectroscópicás devem ser realizadas no espaço de 90minutos após a reação de impregnação. Uma curva-padrão de fosfato deveser preparada de cada vez que se realiza um conjunto de análises. A absor-vância para as amostras de enzimas de ensaio deve estar dentro dos limitesda absorvância da curva-padrão. Caso contrário, diluir mais as amostras erepetir a análise.

Análise enzimática da fitase

Recolhe-se uma alíquota de 1,0 mL de substrato de fitato de só-dio em tubos de ensaio de 15 mL e submete-se a pré-incubação durante 2minutos a 60°C (ver resumo das adições de amostra/reagente, posterior-mente). Preparar três tubos de ensaio para as reações enzimáticas e outrostrês para a reação em branco para cada amostra de enzima (6 tubos desubstrato no total por amostra). Pré-incubar as amostras de enzimas da dilu-ição de trabalho de 5 mL, preparadas como anteriormente descrito, durante2 minutos a 60°C.

Na seqüência de uma pré-incubação de 2 minutos adicionar 0,5mL de amostra de ensaio da diluição de trabalho para 3 dos 6 tubos desubstrato. Começar a contar o tempo em um cronômetro no momento daadição da enzima diluída no_primeiro tubo. Continuar a adicionar amostra deenzima diluída aos segundo e terceiro tubos de substrato de fitato de sódio auma velocidade constante (isto é, adição de enzima diluída a um tubo a cada5 segundos mas não adicionar a enzima diluída aos três tubos em branconesta fase da análise. A velocidade de adição de enzima constante, estabe-lecida durante esta porção da análise irá ser necessária novamente duranteo protocolo de impregnação de reação. Depois da adição da última alíquotade enzima diluída, agitar em vórtex todos os tubos de reação e devolvê-lostodos rapidamente ao banho de água a 60°C. Incubar durante 60 minutos.Incubar a diluição de trabalho da enzima em conjunto com as reações (nobanho de água a 60-C durante o tempo de reação de 60 minutos) para mi-nimizar diferenças entre amostra em branco correspondente.

Na seqüência do período de incubação de 60 minutos, adicionar1,0 mL de solução color stop a cada tubo de ensaio da reação enzimática etambém a cada tubo de ensaio em branco utilizando a velocidade de adiçãode amostra constante estabelecida anteriormente (utilização de pipetas derepetição pode aumentar a eficiência do processo). Agitar em vórtex todosos tubos de ensaio extinguidos.

Depois de impregnar os tubos de reação em branco com solu-ção color stop, adicionar 0,5 mL de diluição de trabalho de enzima a cada um.

Subseqüentemente à adição de reagente color stop a todos ostubos de ensaio agitar novamente em vórtex para garantir a mistura comple-ta dos reagentes, deixar repousar durante 5 minutos para concluir o desen-volvimento de cor e centrifugar a 1800 χ g durante 10 minutos para clarificaras amostras antes de recolher medições da absorvância. As medições es-pectroscópicas devem ser realizadas no espaço de 90 minutos após a extinção.

Medições espectroscópicas e cálculos de atividade.

Utilizando tanto uma cuvete de plástico (1 cm de comprimentodo trajeto, semimicro) vidro ou quartzo, proceder à leitura de todas as amos-tras de curva padrão, em branco ê de fosfato a 415 nm e registrar os valo-res. Ter cuidado de não perturbar o material precipitado nos tubos de ensaioao transferir a solução para as cuvetes, depois da centrifugação.

Cada extração terá 6 cuvetes associadas. Os conteúdos de cadatubo de ensaio serão vertidos para uma diferente cuvete. Fazer as leiturasdas três reações antes das leituras das três cuvetes de referência. Esta or-dem é necessária para um cálculo adequado da atividade na folha de cálculo.

Calcular a absorvância corrigida para cada amostra de curvapadrão de fosfato por meio da subtração de 0 pmol de medição de absor-vância de fosfato. A curva padrão é gerada registando a absorvância a415nm como uma função de pmols de fosfato. A curva-padrão é apresenta-da em conjunto com os parâmetros de regressão linear.

Os pmols de fosfato detectados na análise são calculados utili-zando a absorvância corrigida de fundo para cada réplica e interpolando-autilizando os parâmetros de regressão da curva-padrão de fosfato.

QPU é definido como pmols/min a pH 4,5 e 60°C. Unidades/mLé calculado por meio da divisão de pmols de fosfato pelo tempo de reaçãode 60 minutos e depois pelo volume de enzima diluída, adicionada à reação(0,5 mL).

QPU/mL no tampão de extração é então calculado pela multipli-cação de QPU/mL no extrato diluído pelo fator de diluição.

Para determinar as unidades de enzima na ração, QPU/mL noextrato é multiplicado pela massa do tampão de extração e dividido pelo pe-so da ração extraída.

Pode ser utilizada uma folha de cálculo para encontrar a médiadas leituras da absorvância das análises triplicadas e as leituras de referên-cia em triplicado em conjunto com o desvio-padrão e co-variância em % paracada extrato. Será ideal que as três leituras tenham um CV inferior a 6 % efiquem dentro dos limites de absorvância de 0,4 a 1,1.

O protocolo acima foi executado como anteriormente descritopara medir a fitase em amostras enviadas para cinco laboratórios. Os dadossão apresentados nas tabelas 2 e 3.

As extrações foram realizadas em amostras de ração em massae peletizada que continham Quantum® Phytase adicionado pré-peletizaçãocomo formulação seca.

Tabela 2. Atividade de fitase recuperada de amostras de raçãoem massa e peletizadas, fabricadas em 4 moinhos (A, B, D, E) e analisadasem 5 laboratórios (1 a 5). Laboratórios 1, 2, 4 e 5 utilizaram o processo analí-tico descrito no exemplo 3 e o laboratório 3 utilizou o processo de elevadodébito do exemplo 4. O produto 25D é as amostras de controle 25D, descri-tas no exemplo 3. Este produto tem uma concentração mínima garantida defitase de 2500 FTU/g quando utilizado antes do fim do prazo de validade.

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Tabela 3. Atividade de fitase média, recuperada de 8 amostrasde ração, conforme medido por 5 laboratórios, utilizando 2 formatos de pro-cessos (exemplos 3 e 4). Estas são as médias de laboratório para laborató-rio dos dados registados na tabela 2.

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Exemplo 4: Versão de débito elevado da determinação de atividade enzimá-tica da fitase extraível da ração a pH 4.5 e 60°C por meio de liberação defosfato inorgânico.

Esta versão da análise da fitase introduziu um novo formato paramaior débito e conveniência. Substitui por exemplo os frascos de vidro utili-zados para extrações por tubos de plástico tipo Falcón e substituiu as dilui-ções e análises em tubos de cultura de vidro por blocos e placas de 96 cavi-dades.

Este processo de extração e análise foi desenvolvido para a de-terminação da atividade de Quantum® Phytase em amostras de ração ani-mal. Este processo mede a atividade de Quantum® Phytase em ração que ésuposto ter aproximadamente 500 FTU/kg de atividade enzimática. Este en-saio baseia-se na detecção de fosfato inorgânico liberado do substrato defitato de sódio, pela ação enzimática hidrolítica da fitase.

A fitase (mioinositol hexaquisfosfato fosfohidrolase) é uma enzi-ma que catalisa a liberação do fosfato a partir do fitato. A atividade da fitasena ração é determinada pela extração da fitase a partir de amostras de ra-ção, recorrendo a tampão de borato (pH 10,0) e subseqüente diluição doextrato até uma concentração apropriada. Uma porção destes extratos diluí-dos é então calculada e depois incubada com fitato de sódio durante 60 mi-nutos a 60°C, pH 4,5, seguido de impregnação simultânea e detecção colo-rimétrica. O fosfato inorgânico gerou complexos com íons de molibdato e devanadato, resultando na formação de cor. A absorvância do ácido vanado-molibdofosfórico, de cor amarela, cuja concentração é proporcional à con-centração de íons fosfato na mistura reacional, é medida a um comprimentode onda de 415 nm. A absorvância medida é utilizada para determinar aconcentração de íons fosfato em comparação com uma curva de calibraçãode fosfato-padrão.

As interferências na análise podem ser provocadas por contami-nantes no solvente, reagentes, artigos de vidro e outros aparelhos de pro-cessamento de amostras. Garantir que os reagentes e artigos de vidro nãosejam contaminados com fosfato. Todos os reagentes e aparelhos têm deser comprovados por rotina como estando isentos de interferências nas con-dições da análise, passando uma amostra em branco de matriz com cadaanálise. Utilizar reagentes e solventes de elevada pureza para minimizar oproblema de interferência. Outras interferências podem ser provocadas porcontaminantes que são co-extraídos da matriz da amostra. A extensão dasinterferências da matriz irão variar de fonte para fonte, conforme a naturezae a diversidade do complexo de fabricação ou procedimentos de recolha deamostras. Algumas amostras podem ter outro material de referência que ab-sorva também a 415 nm e por conseguinte interfira com a determinação daatividade enzimática. Esta análise destina-se apenas à determinação da ati-vidade da fitase em ração nas condições descritas.Aparelhos (equivalentes podem ser substituídos)

Espectrofotômetro UV/VIS, Spectra Max PLUS 384, Molecular Device

• Sistema de recolha de dados, SoftMax Pro Std.

· Vórtex Genie®, Fisher brand, Cat. N9 12-812.

• Balança analítica com resolução de 0,1 mg, Mettler XS204 balance

• Centrifugadora, Eppendorf 581ORRotador de laboratório Glascol 099A 0616700026 (unidade de base)com cabeça de suporte de tubos de ensaio RD50

• Cronômetro de laboratório, vários da Fisherbrand

• Medidor de pH, Mettler Toledo MP220 com um eletrodo de elevadaqualidade

• Padrões de pH, soluções de pH 10, 7,0 e 4,0Pipetadores, Gilson Pipetman P-200, P-1000, P-5000

• Banho de água com controle da temperatura com bomba de circulação,Fisher Scientific

· Vários artigos de vidro e consumíveis

• Agitadores magnéticos com barras agitadoras e ou agitador orbital ourotador para mistura das amostras

• Pipetas de repetição Eppendorf, pipeta de repetição plus (Cat N- 21-380-9), e Cat Nq 21 -381-115, para repetição de 25 mL

· Pipetassimplesoudemulticanal

• Tubos de ensaio para centrifugadora de 50 mL Fisherbrand 06-443-20ou equivalente

• Placas de 96 cavidades, placas transparentes Costar Assay/Path Flatbottom, Costar

· Blocos de 12 cavidades profundas, VWR 12-Channel Reservoir Cat. Ng 82007-294

• Blocos de 96 cavidades, Greiner Master Block 1,2 mL. ISC-BioexpressCat. Ns T-3058-4

Reagentes e materiais (equivalentes podem ser substituídos)

· Quantum® Phytase seco certificado, Syngenta Animal Nutrition

• Matriz de ração à base de trigo, Syngenta Animal Nutrition

• Matriz de ração à base de milho-soja, NCSU (North Carolina State Uni-versity)

• ácido acético (glacial) Fisher N9 A38-500 ou equivalente

· Solução de hidróxido de amônio, (29 % em p/v) Fisher Ng A669-500

• Metavanadato de amônio, Sigma N9 A-1183Molibdato de amônio tetra-hidratado, Fluka N9 09880• ácido nítrico (concentrado >65 %) Fisher A200-500

• Ácido fítico (sal dodecassódico de arroz), Sigma, Lote Nq 094K 1094,P-3168

• Dihidrogenofosfato de potássio Fisher N9 BP362-1 ou equivalenteAcetato de sódio trihidratado, Fisher Nq BP334

• Tween 20 (monolaurato de polioxieteleno sorbitol), Sigma Lote N9011560, BP 337-500

Borato decahidratado (Na2B4O7lIOH2O), Sigma N9 P-7949

• hidróxido de sódio (NaOH)

Preparação de reaqentes tal como anteriormente descrito no exemplo 3.

Extração da fitase

Preparar e rotular três tubos de ensaio para centrifugação paracada amostra. Certificar-se que todas as amostras de ração estão à tempe-ratura ambiente antes da pesagem. Ajustar a tara de uma balança analíticacertificada a zero e depois registrar o peso de cada tubo de centrifugação de50 mL, vazio e tampa do tubo. A cada tubo de 50 ml adicionar 4,50 g de ra-ção moída. Registrar o peso exato (massa em gramas de amostra utilizadaem cada extração). Obter um padrão pré-pesado de 0,3 FTU/g, dois 0,5FTU/g e um 0,8 FTU/g.

Utilizando um dispensador de fluido, analítico, calibrado adicio-nar 42 mL de tampão de borato de sódio a cada tubo contendo a ração me-dida. Depois de adicionar o tampão de borato de sódio a cada amostra, tarara balança e registrar o peso exato do peso total do tubo. Calcular o peso dotampão por meio da subtração tanto do peso do tubo como do peso da raçãoa partir do peso total.

Fechar firmemente a tampa, então agitar em vórtex e vigorosa-mente a amostra até toda a matéria particulada estar suspensa.

Ajustar o cronômetro e misturar em rotador de laboratório duran-te 30 minutos à temperatura ambiente (-22 9C). O mostrador do rotador deveestar nos 70. Verifique se nenhuma das amostras tem fugas e se as amos-tras estão a ser misturadas.

Remover cuidadosamente as amostras do rotador e então centri-fugar as amostras durante 10 minutos a 1800 χ g.

Remover cuidadosamente os tubos da centrifugadora e colocá-los em um suporte. O sobrenadante pode ter duas camadas, uma camadarelativamente transparente imediatamente abaixo de uma camada turva su-perior. É esta camada inferior que deve ser utilizada para as diluições detrabalho da análise.

Diluição de trabalho da análise.

Utilizando um pipetador P1000 calibrado, adicionar 0,250 ml_ deenzima extraída da camada transparente do sobrenadante e dispensar emum bloco de 12 cavidades profundas.

Com um autodispensador calibrado adicionar 4,75 mL de tam-pão de acetato de sódio a cada cavidade da placa de 12 cavidades, conten-do a enzima extraída da etapa. O resultado será uma diluição de trabalho de1:20. Misturar bem as diluições girando o bloco para a frente e para trás.

Assegurar para que não entorne ou haja contaminação cruzada de qualquerum dos conteúdos.

Centrifugar as diluições durante 10 minutos a 1800 χ g para re-mover todos os sais precipitados.

Determinação da diluição ótima: Se a diluição de trabalho não for 1:20 é ne-cessário ajustar toda a análise à escala, ajustar a proporção de material ex-traído com 250 mM de tampão de acetato de sódio em conformidade. Man-ter o volume final de cada diluição de trabalho a 5 mL. Espera-se que umadiluição de 1:20 de ração em massa, contendo Quantum® Phytase a 500(FTU/kg) tenha uma leitura de OD415 entre 0,4 e 0,8 nesta análise terminal.

Análise enzimática da fitase

Em um bloco dè 96 cavidades profundas, atribuir três cavidadesa cada uma das reações enzimáticas e reações em branco. O resultado de-verá ser seis cavidades por cada amostra.

Para um bloco de 96 cavidades profundas limpo adicionar 0,3mL de substrato de fitato de sódio às seis filas superiores utilizando um pipe-tador multicanal de 12 cavidades.

Colocar o bloco de 96 cavidades profundas contendo substrato eas placas de 12 cavidades contendo o extrato da enzima em um banho deágua a 60°C e deixar os conteúdos pré-incubar durante 2 minutos.

Na seqüência da pré-incubação de 2 minutos ajustar o cronôme-tro para 60 minutos e imediatamente adicionar 0,15 mL de diluição de traba-Iho do bloco de 12 cavidades às três primeiras filas (A a C) do bloco de 96cavidades profundas. Um pipetador multicanal de 12 cavidades pode serutilizado nesta etapa. No entanto, é necessário garantir a adição do extratoda enzima nas cavidades apropriadas e trocar as pontas entre cada aplica-ção de cada amostra.

Agitar rapidamente em vórtex as amostras no bloco de 96 cavi-dades profundas e voltar a colocar o bloco imediatamente no banho de águaa 60°C. É necessário garantir que não haja contaminação cruzada ou que osconteúdos sejam derramados com uma mistura no vórtex demasiado vigorosa.

Durante a incubação da análise enzimática preparar os padrõesde fosfato. Fazer dois conjuntos de padrões separados. Deve-se garantirque não haja adição da solução color stop aos padrões nesta altura.

Na seqüência da incubação de 60 minutos adicionar 0,3 mL desolução color stop a todas as reações enzimáticas e reações em branco nobloco de 96 cavidades utilizando um pipetador de 12 cavidades, multicanal.

Remover tanto o bloco de 96 cavidades profundas e o bloco decavidades do banho de água a 60°C. Agitar em um vórtex e misturar cui-dadosamente os conteúdos em um bloco de 96 cavidades profundas.

Adicionar 0,15 mL de diluição de trabalho enzimática do bloco de12 cavidades a cada uma das cavidades de reação em branco do bloco de96 cavidades profundas. Todas as cavidades para cada amostra (filas AaF)devem conter um total de 0,75 mL de solução.

Agitar em um vórtex cuidadosamente cada bloco de 96 cavida-des profundas para misturar os conteúdos. Esperar 5 minutos para concluir odesenvolvimento de cor. Nesta altura adicionar 1 mL de solução color stopaos padrões de fosfato preparados previamente. Centrifugar cada bloco de96 cavidades durante 10 minutos a 1800 χ g. Centrifugar os padrões de fos-fato durante 10 minutos a 1800 χ g. Remover cuidadosamente o(s) bloco(s)e tubos de ensaio da centrifugadora.

Medições espectroscópicas e cálculos de atividade.

Utilizar uma pipeta multicanal de 12 cavidades para transferir 0,3mL de solução transparente para uma placa de 96 cavidades legível paraespectrofotómetro. Deve-se ter cuidado para não perturbar o material preci-pitado nas cavidades na seqüência da centrifugação. Além disso, utilizar aponta da pipeta para rebentar quaisquer bolhas na placa de 96 cavidadesantes da leitura no espectrofotómetro. Em alternativa, a placa de 96 cavida-des pode ser feita girar a 800 χ g durante 1 minuto para remover as bolhas.

Adicionar 0,3 mL dos padrões de fosfato às cavidades apropriadas.

Adicionar 0,3 mL de tampão de acetato de sódio a qualquer al-véolo vazio restante. Utilizar qualquer software de espectrofotómetro ou po-dem ser executados cálculos manuais para obter dados da atividade utili-zando leituras OD a 415 nm.

Colocar a placa de 96 cavidades em uma bandeja do leitor deplaca do espectrofotómetro e proceder à leitura das amostras ao comprimen-to de onda de 415 nm. Registo das leituras.

Curva de calibracão de fosfato padrão

Preparação de solução-mãe padrão de fosfato de potássio. Secar uma quan-tidade suficiente de di-hidrogenofosfato de potássio em um forno a vácuo,entre 100 e 104°C durante 2 horas. Arrefecer à temperatura ambiente emdessecador. Preparar solução-mãe padrão de dihidrogenofosfato de potás-sio (KH2PO4) com concentração de 7,2 mM em um frasco volumétrico de 1,0L. Pesar 7,2 mmols (-0,980 grama conforme a pureza do produto) de dihi-drogenofosfato de potássio e dissolver em aproximadamente 800 mL de 250mM de tampão de acetato de sódio. Verificar o pH e ajustar conforme ne-cessário a pH 4,5 com ácido acético ou hidróxido de sódio. Então perfazer ovolume com tampão de acetato de sódio e misturar cuidadosamente. Guar-dar esta solução em um frasco de vidro a 4°C durante 30 dias no máximo.Preparação de padrões de fosfato de potássio. Utilizar o fosfato de potássiopadrão preparado como o anterior e o tampão de acetato para atingir os se-guintes padrões de fosfato:

Tabela 4 Curva-padrão de fosfato

<table>table see original document page 32</column></row><table>

Recolhem-se alíquotas dos volumes de fosfato/tampão enume-rados na tabela acima em tubos de ensaio. Adicionar 1,0 mL de substrato defitato de sódio a cada tubo-padrão e agitar no vórtex.

Adicionar 1,0 mL de solução color stop aos padrões a seguir àanálise e misturar. Deixar repousar durante 5 minutos à temperatura ambien-te para concluir a reação de coloração; esta operação é seguida de centrifu-gação a 1800 χ g, durante 10 minutos para clarificar a solução antes dasmedições da absorvância. As medições espectroscópicas devem ser reali-zadas no espaço de 90 minutos após a reação de impregnação. Uma curva-padrão de fosfato deve ser preparada de cada vez que se realiza um conjun-to de análises.

Cálculos: Registo da curva de calibracão do fosfato padrão.

Registrar a absorvância correta a 415 nm (Δ OD415nm, a mediçãoda absorvância de cada solução de calibração padrão de fosfato depois desubtrair a absorvância medida para a solução de fosfato de 0 pmol) comouma função da concentração de fosfato (em μΜ) no eixo X. Em seguida, uti-liza-se o programa de regressão linear, gera-se a linha de "melhor ajusta-mento" e sua equação correspondente.

Y=MX+B em que,Y= Δ OD4i5nm (eixo Y do gráfico)

M = declive da curva de calibração do fosfato-padrão.

X= μΜ de fosfato(eixo X do gráfico)

B = intercepção da curva de calibração do fosfato-padrão.

Estimativa da concentração de fosfato inorgânico liberado devidoà reação enzimática catalisada por fitase. Calcular a concentração μΜ de íonde fosfato utilizando as seguintes equações:

C=(H-B)/M

em que C = concentração (μΜ) de Pi

H= AOD415nm = OD4i5nm por amostra de reação enzimática - OD415nm para aamostra de referência da enzima

B = intercepção da curva de calibração-padrão.

M = declive da curva de calibração-padrão.

Determinação da atividade fitase em uma amostra de ração.

Determinação do efeito fosfato em uma amostra, utilizando asequações dadas abaixo:

A =[(Cx Vr/Va) χ (Vi/1000) xDf]/(t χ Ws)

em que,

A - Atividade da fitase expressa em μηιοίβε de Pi liberados por minuto por gde amostra de ração

C = concentração de Pi liberado, expresso em μΜ; (C = (H-B)/M, conformeanteriormente descrito)

Vr = volume total (em ml) de mistura reacional depois da adição da soluçãocolor stop (0,75 ml como na presente análise)

Va = volume (em ml) de extrato de enzima diluído, utilizado para cada análi-se (tal como na presente análise é de 0,15 ml)

Vi = volume inicial (em ml) (ou massa, assumindo que a densidade é igual a 1) de solução de extração (tal como no presente SOP é ~ 42 ml).

Df= Fator de diluição da solução de trabalho (Df = Vd/Vt, em que Vd = volu-me (ou massa, assumindo que a densidade é igual a 1) da enzima extraídautilizada na diluição de trabalho e Vt = volume final (ou massa, assumindoque a densidade é igual a 1) de extrato de enzima diluído)t = período de tempo (em minutos) de incubação durante a análise de fitase(60 minutos tal como na análise presente)

Ws = massa inicial (em g) de amostra utilizada para cada extração (~ 4,5 gcomo na análise).

A análise da fitase de elevado débito anterior foi realizada comamostras e teve os resultados tal como anteriormente no exemplo 3, nastabelas 3 e 4.

Exemplo 5: A extração eficiente de fitase da ração tanto em massa comopeletizada, utilizando um novo tampão de borato é necessária para a análisede exatidão da atividade.

Efeito do pH do tampão de extração na recuperação da atividade da fitase

Para otimizar a extração de Quantum® Phytase da ração peleti-zada foi testada uma variedade de tampões e condições de extração. Nestaexperiência (figura 1) as amostras de ração moídas foram extraídas em cin-co tampões diferentes e em condições de pH 4. A eficiência da extração decada tampão foi testada em amostras de ração em massa e em amostras deração acondicionadas a 70°C (pélete a 70°C) e a 83°C (pélete a 83°C). Atemperatura inferior de 70°C não é tipicamente utilizada para o acondicio-namento da ração, enquanto que a temperatura superior de 83°C se situa aonível utilizado na fabricação comercial de ração para aves e porcos. Os re-sultados demonstram que a eficiência da extração da fitase de ração acondi-cionada e peletizada dependeu tanto do pH como da natureza química dotampão.

Os resultados desta experiência mostram também que a eficiên-cia da extração de um tampão particular dependia muito da temperatura doacondicionamento da ração. Na figura 1, a atividade da fitase extraída dasamostras de ração moídas com tampão de borato de sódio pH 10 foi definidacomo 100% para cada tipo de amostra (massa, pélete a 70°C, pélete a83°C). Para ração em massa, os tampões a pH 5, 7 e 8 extraíram cerca de100 % da atividade extraída pelo tampão de borato de sódio pH 10. TampãoCAPS a pH 10 extraiu cerca de 117 % da atividade extraída pelo tampão deborato de sódio pH. Para pélete a 70°C, os outros quatro tampões extraírampelo menos 80 % da atividade de fitase em comparação com o tampão deborato de sódio a pH 10. No entanto, o tampão de borato de sódio pH 10revelou ser muito mais eficiente do que os outros tampões na extração daatividade da fitase de ração acondicionada à temperatura mais elevada. Aeficiência de extração relativa do tampão de acetato de sódio pH 5 no péletede 83°C foi de apenas cerca de 25 % em comparação com o tampão de bo-rato de sódio a pH 10. Tampões de MOPS pH 7 e CAPS pH 10 extraíramcerca de metade da atividade extraída pelo tampão de borato pH 10. Final-mente, o tampão de Tris pH 8 teve uma eficiência semelhante ao tampão deborato pH 10 em cerca de 70 %.

Efeito do tampão de extração pH no fosfato de referência

Um tampão de extração da fitase preferido teria também de mi-nimizar a extração de fosfato endógeno ou de referência das amostras deração. Sejam suplementadas com fitase ou não, as rações para animais mo-nogástricos são ainda fortificadas com fosfato inorgânico, tipicamente sob aforma de fosfato monocálcico ou fosfato dicálcico. Este componente de fos-fato inorgânico na ração, para além do fosfato presente nos componentesvegetais da ração, não é distinguível do fosfato liberado pela atividade dafitase durante uma análise enzimática. Por conseguinte é vantajoso minimi-zar a concentração de fosfato extraído da ração enquanto se maximiza aconcentração de fitase extraída. Atingir uma baixa concentração de fosfatode referência, relativamente à concentração de fitase em um extrato de ra-ção tem como resultado uma proporção sinal-ruído maior para a análise daatividade da fitase. Como se mostra na figura 2, o borato de sódio a pH 10recupera mais atividade da fitase de ração peletizada em comparação comoutros tampões a pH 5 (NaOAC), 7 (MOPS), 8 (Tris) e 10 (CAPS). 70°C e83°C refere-se à temperatura de acondicionamento e peletização da ração.

A figura 2 mostra também que o tampão de borato de sódio a pH10 extraiu menos fosfato endógeno ou de referência das amostras de raçãomoídas em comparação com os outros quatro tampões testados. Do mesmomodo, o tampão de borato de sódio pH 10 extraiu a mesma quantidade defosfato endógeno de cada um dos três tipos de amostra de ração (massa,pélete a 70°C, pélete a 83°C). Em contraste, a concentração de fosfato dereferência nos extratos com pH 5, pH 7 e pH 10 foi muito variável, depen-dendo do tipo de amostra de ração. A consistência na concentração de fos-fato endôgeno extraído é crítica para atingir resultados exatos e reproduzí-veis da análise da fitase, em especia] quando a enzima está presente a con-centrações muito baixas, como é o caso destas amostras de ração para animais.

Comparação do tampão de borato de sódio-pH 10 e tampão de diluição AO-AC

A figura 3 apresenta uma confirmação adicional que o tampãode borato de sódio pH 10 a 25 mM é um tampão de extração de fitase efici-ente para utilizar com ração peletizada. As amostras de ração em massa egranuladas, contendo Quantum® Phytase 2500D foram obtidas de dois moi-nhos de investigação, designados AeB. Escolheu-se ração acondicionada aelevadas temperaturas para esta comparação, de forma a enfatizar a superi-or eficácia do tampão de borato na extração da atividade da fitase da raçãopeletizada. Nesta experiência, subamostras replicadas das mesmas amos-tras de ração moída foram extraídas ou no tampão de borato ou em um tam-pão que consistia em 250 mM de acetato de sódio pH 5,5 e 0,01 % de Twe-en® 20. Este tampão é o tampão de diluição descrito em AOAC Official Me-thod 2000.12 Phytase Activity in Feed. Passará a referir-se a este tampãocomo o tampão de diluição AOAG. Todos os extratos foram então mais diluí-dos com tampão de diluição AOAC. Os extratos diluídos foram analisados apH 4,5 e 60°C, de acordo com o processo do exemplo 3. Como se mostra nafigura 3, o tampão de borato pH 10 extraiu cerca do dobro da quantidade deatividade de fitase do pélete, fabricado no moinho B, em comparação com otampão de diluição AOAC. A diferença entre os tampões de extração foimais óbvia para ração fabricada no moinho A. Neste caso, a utilização detampão de borato pH 10 teve como resultado a recuperação de nove vezestanta atividade de fitase da ração peletizada (em relação à massa) em com-paração com o tampão de diluição AOAC.

Comparação do tampão de borato de sódio pH 10 e tampão de ração AOACRealizou-se uma análise semelhante, utilizando amostras deração fabricadas no moinho C. Neste caso, as subamostras de amostras deração moídas foram extraídas utilizando 25 mM de tampão de borato de só-dio pH 10 e um tampão que consiste em 250 mM de acetato de sódio pH 5,5,0,01 % de Tween 20 e 68,4 mM de CaCI2. Este tampão é o tampão de ex-tração da ração, descrito em AOAC Official Method 2000.12 Phytase Activityin Feed. Passará a referir-se a este tampão como o tampão de ração AOAC.

A figura 4 mostra que_o tampão de borato de sódio pH 10 foimais eficiente do que o tampão AOAC na extração da atividade de fitase detodos os tipos de amostra de ração. Mais notável, o tampão de borato extra-iu mais de duas vezes a atividade de fitase extraída pelo tampão de raçãoAOAC a partir da ração que tinha sido acondicionada e peletizada a tempe-raturas mais elevadas de 83°C e 86°C.

Comparação do processo totalmente otimizado, presentemente descrito eAOAC Official Method 2000.12.

O AOAC Official Method 2000.12 não detecta atividade da fitasenalgumas amostras de ração peletizada que contêm níveis significativos defitase adicionada pré-peletização. As amostras de ração peletizada dos moi-nhos AeD foram analisadas, tanto utilizando o processo presentementedescrito como utilizando o AOAC Official Method 2000.12. Os valores dadensidade ótica das reações enzimáticas para a atividade da fitase e fosfatode referência são resumidas nas figuras 5A e B. Utilizando o novo processocom diluição de extratos de borato de pH 10, tanto 10 vezes como 5 vezes,em tampão de diluição de pH 4,5 teve como resultado uma proporção sinal-ruído >2 para amostras dos moinhos A e D. Em contraste, utilizando o AO-AC Official Method não foi detectada qualquer atividade da fitase acima dosníveis de fosfato de referência em extratos diluídos a partir de 10 vezes, até1,5 vez na preparação da análise da atividade.

Exemplo 6: É necessária uma extração eficiente de fitase de farinha de milhotransqênico, utilizando o tampão de borato descrito no exemplo 1, para aexatidão da análise da atividade

Comparação da extração a pH 5,5, 8, 10 utilizando farinha de milho transqê-nico que expressa a fitase

Enzimas de ração recombinantes, comercialmente disponíveissão todas produzidas em hospedeiros de expressão microbiana. No entanto,as culturas transgénicas representam um processo alternativo para a produ-ção de enzimas para ração recombinantes. A produção de fitase derivada deE.coli termotolerante em grãos de milho foi recentemente descrita em (publi-cação do pedido de patente norte-americana n9. 2003-0170293). Uma van-tagem da produção de enzimas de ração em grãos de. milho reside na possi-bilidade de fabricação de um equivalente das formulações de produto secoexistentes simplesmente moendo o milho. Formulações de produto secocomercialmente disponíveis podem consistir em enzima seca em um agentede volume ou veículo, tal como farelo de trigo. Em alternativa a enzima podeser embebida no agente de volume, por exemplo em uma formulação de tipopélete extrudida. A fitase expressa em grãos de milho é naturalmente embe-bida no agente de volume, que neste caso consiste nas células individuaisdo tecido do endosperma da semente.

A comercialização de uma enzima fitase formulada como milhotransgênico moído irá exigir uma extração eficiente da enzima desde a fari-nha de milho para uma medição exata das concentrações da enzima. Foramtestadas as eficiências de extração do tampão de borato de sódio a pH 10com 0,01 % de Tween® 20 descrito no exemplo 3, um tampão consistindoem 50 mM de Tris-HCI pH 8,0, 100 mM de NaCI e 2 mM de EDTA e o Tam-pão de Diluição AOAC descrito anteriormente (250 mM de acetato de sódioa pH 5,5, 1 mM de CaCI2, 0,01 % Tween® 20). Amostras replicadas de 1grama de farinha de milho transgênico contendo fitase recombinante endô-gena foram extraídas seqüencialmente. Os extratos foram diluídos comTampão de Diluição AOAC e a atividade da fitase dos extratos diluídos foimedida a pH 5,5 e 37 QC. Os resultados são apresentados na figura 6. OTampão de Diluição AOAC, que é o tampão-padrão utilizado para extrair aatividade da fitase das formulações de produto seco, comercialmente dispo-níveis, não extrai de forma eficiente a fitase da farinha de milho transgênicomoído. Este tampão extraiu <30 % da atividade da fitase extraída pelo tam-pão de borato de sódio pH. Por conseguinte, este tampão não é um tampãode extração aceitável, para utilizar com uma fitase expressa em grãos demilho. Os resultados nas figuras 6A e B demonstram ainda que o tampão deborato de sódio de pH 10 com Tween® 20 (0,01 %) extrai mais de 90 % dototal de atividade de fitase extraível na primeira de duas extrações seqüenciais.

Extração eficiente com borato de pH 10,0 confirmada por meio de Westernblottinq

No entanto, os resultados descritos na seção anterior e apresen-tados na figura 6 não põem de parte a possibilidade à proteína de fitase re-combinante adicional, ativa ou inativa, permanecer na farinha extraída e serresistente à extração neste tampão. Para confirmar que o tampão de boratode sódio de pH 10, com Tween® 20 extrai toda ou quase toda a proteína defitase recombinante realizou-se outra série de extrações seqüenciais. Nestaexperiência, amostras de 0,4 grama de farinha de milho transgênico foramextraídas seqüencialmente em 1 a 3 rondas, tanto com tampão de borato desódio de pH 10 suplementado com Tween® 20 ou com um tampão desnatu-rante que foi desenvolvido para a extração da proteína total do grão de mi-lho, incluindo a fração de proteína prolamina muito insolúvel. Este tampão deextração desnaturante, a que refere-se como Tampão de Extração de Prote-ína Total (TPEB) consiste em 12,5 mM de borato de sódio (pH 10), 1 % deSDS e 2 % de 1 -mercaptoetanol (Wallace, et al., Plant Physiology 92:192-96,1990).

As amostras replicadas de farinha de milho transgênico e umaúnica amostra de farinha de milho de controle (não-transgênica) foram extra-ídas com tampão de borato de pH 10. Estes extratos da primeira ronda sãoapresentados em Western blot na figura 7 (pistas 1, 4, 6, 9, 11, 14, 17). Emprimeiro lugar, o pélete foi lavado uma vez com água gelada. Todos os ex-tratos contêm uma única banda proeminente de cerca de 45 kD, conformeprevisto para a fitase expressa em milho, descrito em (Lanahan e Betts, pu-blicação do pedido de patente norte-americana n° 2003-0170293).

O pélete de borato da primeira ronda foi então reextraido sejacom tampão de borato ou com TPEB desnaturante e os péletes de borato dasegunda ronda foram lavados com água e reextraídos com TPEB. Estes ex-tratos foram também analisados em Western blot apresentado na figura 1.

Não estava presente fitase imunodetectável adicional nos extratos da ronda2 e ronda 3 (pistas 2, 3, 5, 7, 8, 10, 12, 13, 15, 16) no nível de sensibilidadedesta mancha.

Todos os extratos da ronda 1 e da ronda 2 em tampão de boratode sódio de. pH 10 foram também analisados quanto à atividade da fitase,como se mostra no gráfico da figura 7. A atividade da fitase média dos extra-tos de borato pH 10,0 da ronda 1 foi 505 ± 38 FTU/g (inclui replicados adi-cionais não apresentados na figura). Cinco amostras de farinha de milhotransgênico replicado foram extraídas seqüencialmente com tampão de bo-rato (só são apresentadas na figura três, as amostras 48, 49, 50). A ativida-de da fitase média dos cinco extratos de borato da ronda 1 foi 509 FTU/g e aatividade média dos cinco extratos da ronda 2, do mesmo conjunto de péle-tes foi 23 FTU/g. A atividade de fitase residual extraída na ronda 2 não foidetectada pela análise de Western blot ao nível de sensibilidade desta man-cha. A atividade de fitase total extraída (soma das ronda 1 e ronda 2) foi, emmédia 531 FTU/g com 95,8 % da atividade extraída na ronda 1. Este resul-tado demonstra que o tampão de borato de pH 10 com 0,01 % de Tween®20 utilizado é eficiente entre 95 e 96 % na extração da atividade de fitase emuma única extração de 60 min de farinha de milho transgênico com agitaçãocontínua à temperatura ambiente.

Extensão do processo a proteínas recombinantes adicionais expressas emgrãos de milho transgênico.

Foi testada a capacidade do tampão de borato de sódio pH 10para extrair outras enzimas recombinantes eficientemente da farinha de mi-lho. Foram extraídas amostras de semente de milho transgênico contendocelulase recombinante e amilase recombinante a pH 10 (25 mM de borato desódio a pH 10, 0,01 % de Tween® 20) e pH 5,5 (250 mM de acetato de sódioa pH 5,5, 0,01 % de Tween® 20). Os extratos foram diluídos e analisados pormeio de ELISA. Os resultados são resumidos na figura 8. As amostras defarinha de milho contendo a mesma fitase recombinante, analisada nas figu-ras 6 e 7 foram incluídas na experiência para comparação. O tampão de pH5,5 extraiu 32 %, 0 % e 66 % das proteínas de fitase, amilase e celulase,respectivamente, que foram extraídas pelo tampão de borato de pH 10.

Exemplo 7. A pulverização do produto seco de enzima para ração quandopresente em ração, a taxas de inclusão comerciais é necessária para umaprecisão aceitável da análise da atividade.

Os produtos de enzima para ração particulados são adicionadosa ração em massa (não peletizada) a taxas de inclusão extremamente bai-xas. Por exemplo, recomenda-se a adição de Quantum® Phytase 2500D àdieta de frangos a 200 gramas de produto por tonelada métrica de ração. Odesenvolvimento de um-processo analítico-exato, preciso e prático para aatividade enzimática em ração exige a disponibilidade de amostras de raçãouniformes e representativas. Uma dimensão de lote comercial típica pararação para animais pode ser 5 a 10 toneladas. Amostras convenientes paraanálise são <1 kg e de preferência menos. O AOAC Official Method 2000.12especifica que uma amostra de ração de 100 a 150 gramas é moída até umadimensão de partícula < 1 mm e depois são analisadas subamostras de 5gramas cada. Por conseguinte, para se atingir uma medição exata e precisada atividade da fitase utilizando este processo oficial, uma amostra de lotede lote de 100 a 150 gramas tem de ser representativa do lote de várias to-neladas. Além disso, a pequena amostra de 100 a 150 gramas tem de sermuito homogênea e bem misturada de forma que as subamostras de 5 gra-mas rendam resultados semelhantes.

No trabalho de desenvolvimento do processo analítico inicial pa-ra o produto seco Quantum® Phytase, utiliza-se tamanhos de amostra e pro-cessos de processamento de amostra consistentes com os especificados noAOAC Official Method 2000.12. Estes processos geraram de forma consis-tente resultados da análise da atividade com uma variação inaceitavelmenteelevada tanto nas subamostras replicadas como nas amostras de lote repli-cadas. Este resultado implicou uma heterogeneidade da amostra do lotecomo a causa da variabilidade das medições da análise da atividade.Para compreender melhor a distribuição das partículas de produ-to de Quantum® Phytase 2500D nas amostras de ração são analisadosgrãos individuais de ração quanto à presença da proteína Quantum® Phyta-se, utilizando ELISA. Como se mostra na tabela 3, detectou-se Quantum®Phytase em cerca de um terço dos péletes de ração de um lote que continhaQuantum® Phytase 2500D na taxa de inclusão recomendada de 200 gramaspor tonelada métrica. A fração de péletes contendo uma ou mais partículasde Quantum® Phytase 2500D aumentou para cerca de 50 % à medida que ataxa de inclusão do produto aumentou para 400 gramas por tonelada (tabela 5).

Tabela 5. À taxa de inclusão do produto recomendado a maioriados péletes não contêm produto. Amostras do pélete de ração contendoQuantum® Phytase 2500D às taxas de inclusão de 200 e 400 gramas portonelada métrica da ração foram analisadas individualmente quanto à pre-senca da proteina de Quantum Phytase.

<table>table see original document page 42</column></row><table>

O pélete de ração médio destes lotes pesava cerca de 170 mg.Por conseguinte, uma subamostra de 5 gramas seria derivada de, em média,cerca de 30 grânulos (10 pos. e 20 neg.). Além disso, uma amostra de lotede 100 a 150 gramas de ração iria conter, em média, entre 600 e 900 péle-tes no total. Uma vez que, tal como ficou demonstrado na tabela 4, não seespera que a maioria destes péletes contenha partículas do produto enzimá-tico, o potencial para heterogeneidade da amostra é elevado e irá dependerda atenção dada à recolha da amostra e divisão da amostra em cada etapaantes da análise.

Um grande desafio para estabelecer uma capacidade analíticade rotina para um serviço de apoio ao produto comercial garante que cadaamostra submetida à análise é cuidadosamente misturada de acordo com oprocedimento-padrão. Mas freqüentemente, na prática, não é este o caso talcomo qualquer procedimento manual muito rotineiro e repetitivo. Por conse-guinte, será testada a idéia de poder gerar uma amostra de lote de raçãomais homogênea e uniforme ao aumentar a concentração de partículas deproduto enzimático na amostra do lote de ração. Este objetivo pode ser atin-gido por meio da pulverização da amostra do lote de ração até uma dimen-são de partícula média pequena. Para esta experiência compara-se doisprocessos de moagem para o processamento de amostras de lote de raçãode cerca de 300 gramas. O primeiro processo utilizou um moinho de tipodisco (Laboratory Mill 3600, Perten Instruments), que foi utilizado primeiropara misturar as amostras de ração em massa e fragmentar e misturar asamostras de pélete. Neste contexto designa-se o Laboratory Mill 3600 comomoinho de discos. O segundo processo utilizou um moinho de tipo batedorou de tipo martelo (Laboratory Mill 3100, Perten Instruments) que é utilizadocom uma peneira de 0,8 mm, pulverizou eficientemente os componentes daração, incluindo o produto seco da enzima até < 500 mícrons. Neste contex-to designa-se o Laboratory Mill 3100 como moinho de martelos. A figura 9mostra a distribuição da dimensão de partícula de uma amostra de Quan-tum® Phytase 2500D e de amostras de ração moída. Quantum® Phytase2500D é quase todo > 0,5 mm. A amostra de ração moída com o moinho dediscos (3600) consiste em primeiro lugar em partículas > 0,5 mm. Em con-traste, o moinho de martelos (3100) pulverizou as partículas de ração até <0,25 mm na sua maioria. Estes resultados demonstram que a moagem deamostras de ração utilizando o moinho de martelos reduz a dimensão departícula de todos os componentes da ração, incluindo o produto seco enzi-mático. A conseqüência desta etapa de pulverização consiste no aumentodo número de partículas do produto seco enzimático de ração por unidadede amostra da ração.

Os moinhos de café são vulgarmente utilizados para moer amos-tras de lote de ração por conveniência. Testes de moagem adicionais sãorealizados para comparar os perfis de dimensão de partícula da ração emmassa (não moída) e ração peletizada utilizando o moinho de discos, moi-nho de café e moinho de martelos. Os resultados são apresentados na figura10. Nesta experiência o moinho de café atingiu um nível de dimensão departícula intermédio, entre o moinho de martelos e o moinho de discos. Omoinho de martelos foi o único dos três moinhos que gerou partículas pre-dominantemente < 0,25 mm.

Em seguida, investigou-se se estas diferenças na pulverizaçãodaamostra (e produto) tiveram _o efeito pretendido de aumento da homoge-neidade e uniformidade das amostras de lote da ração. Os resultados deuma experiência típica são apresentados na figura 11.

Nesta experiência foram moídas amostras duplicadas de raçãoem massa e amostras duplicadas de ração peletizada utilizando um moinhode discos e um moinho de martelos como se descreve anteriormente e nafigura 9 e na figura 10. Dez subamostras replicadas foram extraídas e anali-sadas quanto à atividade de fitase, conforme descrito no exemplo 3. O coefi-ciente de variação (CV) da medição da atividade da fitase nas 10 amostras(definido como CV interanálise ou a variabilidade nas extrações replicadas)foi determinado para cada uma das quatro amostras moídas. A experiênciafoi realizada por duas vezes e os resultados são registrados nos painéis A eB. Nas duas experiências, o CV interanálise foi superior quando as amostrasforam moídas utilizando um moinho de discos, em comparação com um mo-inho de martelos. Além disso, as amostras de massa processadas no mes-mo tipo de moinho deram um CV inter-análise consistentemente superior.Estes resultados demonstram a importância da pulverização da amostra comum moinho de martelos para gerar uma amostra de lote de ração uniformeque possa ser dividida em subamostras para uma análise enzimática precisa.

Em outra série de experiências determinou-se que o tamanho daamostra do lote de ração ótimo para moagem em moinho de martelos é >100 g. A experiência resumida na figura 12 mostra que uma dimensão deamostra do lote de 100 g tem como resultado uma variabilidade inaceitavel-mente elevada nas medições da atividade de fitase de amostras moídas re-plicadas. Por outras palavras, uma amostra moída de 100 g não é fidedig-namente representativa do lote de ração completo. Amostras (10 kg) de ra-ção em massa e ração peletizada, tratada com Quantum® Phytase 2500D auma taxa de inclusão de 200 g por tonelada foram obtidas do moinho F. Aamostra de 10 kg foi misturada cuidadosamente e foram removidas amos-tras menores de 100 g, 300 g, 500 g e 700 g em triplicado. Estas subamos-tras foram moídas de acordo com o procedimento de moagem descrito noexemplo 1. Cada subamostra moída foi extraída em triplicado e cada extratofoi analisado em triplicado de acordo com o procedimento descrito no exem-pio 3. A figura 12A mostra os CV inter-análise médios para os 4 conjuntos deamostras moídas. A medição da atividade de fitase foi muito reproduzível(CV <10 %) nas extrações replicadas quando o tamanho da amostra moídaera >100 g. A figura 12B mostra os CVs das medições da atividade de fitase(não visível) como uma função do tamanho da amostra moída. Esta é a vari-abilidade da análise de amostra moída para amostra moída, definida aquicomo o CV interamostra. Os resultados demonstram que a reprodutibilidadeda medição da fitase é inaceitavelmente baixa quando uma amostra de lotede 100 g é utilizada (CV >15 % para massa epélete). Amostras de lote moí-do de 300, 500 e 700 gramas renderam CVs interamostra aceitáveis (<15%).

Exemplo 8: Determinação de atividade enzimática da fitase extraível degrãos de milho e milho moído a pH 5,5 por meio de Liberação de Fosfato Inorgânico.

Esta análise baseia-se na detecção de fosfato inorgânico Iibera-do do substrato de fitato de sódio, pela acção hidrolítica enzimática da fitase.O substrato de fitato de sódio e a enzima de fitase são incubados durante 60minutos a 37°C, seguido por reação de impregnação simultânea e detecçãocolorimétrica. A formação de cor que é medida por espectrofotometria a 415nm é o resultado dos íons de molibdato e vanadato que complexificam comfosfato inorgânico.

Definição da unidade 2.0. Uma unidade de fitase (FTU) é a quantidade deenzima que libera 1 μιτιοΙ de fosfato inorgânico por minuto a partir de fitatode sódio a 37°C e a pH 5,5 em condições-padrão de análise.

Os materiais, produtos químicos e preparação de soluções fo-ram descritos anteriormente, no exemplo 2.

Preparação da amostra. Moagem. Moer 50 g de grãos de milho ou milhomoído (artigo de ensaio) bem misturados em um moinho de martelos Perten3100 com uma peneira de < 0,8 mm de tamanho de poro. Se o moinho co-meçar a aquecer, deixará o moinho arrefecer entre cada moagem. Misturarbem depois de moer e antes de remover as amostras moídas para análise.

Recomenda-se que o tamanho de amostra para moagem seja 50 g. Notarque, se o tamanho da amostra for maior que 50 g, a amostra deve ser mistu-rada extremamente bem antes de se recolher a alíquota de 50 g da amostrapara moagem em moinho de martelos.

Controles/padrões. Preparar um lote de Quantum® 2500D para utilizaçãocomo controle, por meio de moagem de 50 g de amostra, como descrito an-teriormente. Depois da moagem, misturar bem antes de remover as amos-tras Incluir um conjunto de controles com cada análise. OPCIONAL. Para umcontrole negativo utilizar milho moído (sem fitase (semente em branco).

Quantum® Phytase 2500D moído. Adicionar 0,40 g de Quantum® 2500D(moído como descrito anteriormente) a um frasco volumétrico de 100 mL,seguido de extração com tampão até 100 ml. Na folha da diluição introduzirum peso de amostra de 1,0 g para esta amostra. OPCIONAL. Para um con-trole positivo de Quantum® em farinha de milho, misturar 400 mg de Quan-tum® 2500D com 600 mg de farinha de milho negativa em um balão volumé-trico de 100 ml, seguido por tampão de extração de borato até perfazer 100ml (assumindo uma atividade de 1.000 FTU/g). OPCIONAL. Quantum® Phy-tase líquido. Para o Quantum® líquido padrão, diluir uma amostra de Quan-tum® líquida com uma concentração de 15.000 FTU/g 1:15 (200 ul 15.000FTU/g + 2,8 ml de tampão de acetato de sódio, pH 5,5). Em alternativa, umaamostra de 5000 L com uma concentração >5000 FTU/g é diluída 1:5 (600 ul5000 L + 2,4 ml de tampão de acetato de sódio, pH 5,5). Registrar todas asdiluições. Adicionar 1.000 FTU (1 ml) do Quantum® Phytase líquido existenteem laboratório diluído (1.000 FTU/g) para um frasco volumétrico e encheraté 100 ml com tampão de extração de borato de sódio. Na folha da diluiçãodesta amostra introduzir um peso da amostra de 1,0 g. Os extratos do con-trole anterior serão diluídos tal como o produto seco de fitase de milho, comuma atividade esperada de 1.000 FTU/g.

Extração de Amostra e Preparação da Diluição

Extração de produto seco. A extração é efectuada em um frasco volumétricode 100 ml. Em uma balança tarada medir e registrar a massa do(s) frasco(s)volumétrico(s) de gargalo largo, de 100 mL. Pesar aproximadamente 1,0grama (+/-,05) de produto seco de fitase de milho e adicionar ao(s) frasco(s)volumétrico(s) de 100 ml pré-pesado. Pesar e registrar o peso do frasco vo-lumétrico de 100 ml com o 1,0 g de fitase de milho adicionado. Adicionar 25mM de tampão de extração de borato de sódio, pH 10,0 até à marca no fras-co. Repetir a pesagem do balão cheio e registrar a massa final. Acrescentaruma barra de agitação magnética ao frasco com cuidado para não entornaro líquido quando se acrescentar a barra de agitação, depois colocar em umagitador magnético e extrair durante 60 minutos à temperatura ambiente(-22 sC). Lavar quaisquer partículas de milho aderentes ao gargalo do frascocom o líquido presente no bulbio por meio de inversão o frasco algumas ve-zes antes de dar início à extração. Uma velocidade de agitação vigorosa de-ve ser utilizada ao longo de todo o procedimento de extração. A solução fica-rá com um aspecto leitoso, turvo. Depois da incubação de 60 minutos, remo-ver o frasco e pipetar 10 ml para um tubo de ensaio de vidro de 16 χ 100 ecentrifugar durante 10 minutos a 2.000 g. Passar à diluição. Três replicaçõesdevem ser conduzidas para cada lote de produto de fitase seco sob análise.

Determinação da massa total do tampão utilizado no protocolo de extração:

Subtrair a massa do produto de fitase seco mais a massa dofrasco vazio da massa do frasco com os conteúdos sólidos e tampão. Estaquantidade estará em unidades de gramas (g).

Diluição Primária do Extrato. Um tubo de vidro será necessáriopara cada amostra extraída. Tarar a balança com o tubo vazio e depois adi-cionar 0,5 mL do extrato de produto seco IX. Registrar a massa do extratoadicionado. Adicionar 4,5 ml a 250 mM de tampão de acetato de sódio e pe-sar o tubo uma vez mais (esta será a massa total do líquido). Registrar todasas medições. Agitar cuidadosamente em vórtex o tubo contendo a diluiçãoprimária.

Cálculo do Fator de Diluição Primário: Tomar a massa do extrato IX adicio-nado (aproximadamente 0,5 g) e dividir pela massa total de líquido no tubo(aproximadamente 5,0 g). O inverso deste valor é o fator de diluição primá-rio. Será aproximadamente 10 com base na massa.

Diluição Secundária do Extrato. Um tubo de vidro será necessá-rio para cada amostra diluída. Tarar a balança com o tubo vazio e depoisadicionar 0,5 mL da diluição 1:10 do extrato de produto seco. Registrar amassa do extrato adicionado. Adicionar 4,5 ml a 250 mM de tampão de ace-tato de sódio e pesar o tubo uma vez mais (esta será a massa total do líqui-do). Registrar todas as medições. Agitar cuidadosamente em vórtex o tubocontendo a diluição secundária.

Cálculo do Fator de Diluição Secundário: Tomar a massa do extrato diluído1:10 adicionado (aproximadamente 0,5 g) e dividir pela massa total de líqui-do no tubo (aproximadamente 5,0 g). O inverso deste valor é o fator de dilui-ção secundário. Será aproximadamente 10 com base na massa. A diluiçãototal é 1:100.

Diluição de trabalho da análise. Dado que serão encontrados produtos secosde fitase de milho com concentrações de fitase variáveis ao longo desta aná-lise, poderá ser necessário um estudo de determinação de alcance rápidopara determinar a taxa de diluição ótima para passar uma análise de amos-tra particular à escala. O estudo de determinação do alcance é conduzidopor meio da preparação do extrato de produto seco e diluições primária esecundária. As variações da análise são então feitas relativamente à prepa-ração da diluição de trabalho listada em seguida.

Para o estudo de determinação do alcance, faz-se um conjuntode diluições de trabalho em uma base volumétrica e estas são então passa-das por uma análise modificada de fitase de milho. A análise de determina-ção do alcance pode ser passada com apenas um único tubo de reação paracada diluição a ser testada e sem reação em branco. Assim que fica deter-minada a velocidade de diluição ótima, continua-se a análise por meio dapreparação das diluições de trabalho. A absorvância-alvo a 415 nm situa-seentre 0,4 e 1,1. Para o produto seco de fitase de milho na gama de 1.000FTU/g, uma diluição de trabalho de aproximadamente 1:500 irá produzir umaleitura da absorvância dentro da escala. O produto seco de fitase de milho a1.000 FTU/g, a uma diluição de 1:500 deve ter uma leitura da absorvânciade 415 nm de aproximadamente 0,5.

Um tubo de vidro será necessário para cada amostra diluída.Tarar a balança com o tubo vazio e depois adicionar 1,0 mL do produto secodiluído 1:100. Registrar a massa do extrato adicionado. Adicionar 4,0 ml a250 mM de tampão de acetato de sódio e pesar o tubo uma vez mais (estaserá a massa total do líquido). Registrar todas as medições. Agitar cuidado-samente em vórtex o tubo contendo a diluição de trabalho.

Cálculo do Fator de Diluição de Trabalho: Tomar a massa do extrato diluído1:100 adicionado (aproximadamente 1,0 g) e dividir pela massa total de lí-quido no tubo (aproximadamente 5,0 g). O inverso deste valor é o fator dediluição de trabalho. Será aproximadamente 5 com base na massa. A dilui-ção total é 1:500 (diluição 1:100 χ diluição 1:5). As diluições descritas encon-tram-se no tabela 5 seguinte.

Tabela 6 Diluições

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A diluição de trabalho irá variar conforme a atividade esperada do produtoseco de fitase. Este exemplo é para uma atividade esperada de 1.000 U/g.Se uma diluição de trabalho não for 1:500 é necessário ajustar toda a análi-se à escala, ajustar a proporção de material de diluição secundário ao 250mM de tampão de acetato de sódio em conformidade. Manter o volume finalde cada diluição de trabalho a 5 mL.

Preparação de Amostras da Curva Padrão de Fosfato. Utilizar a solução defosfato de potássio padrão de 7,2 mM, preparado como o anterior para atin-gir os seguintes padrões de fosfato:

Tabela 7 Curva-padrão de fosfato

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Recolhem-se alíquotas dos volumes de fosfato/tampão enume-rados na tabela anterior em tubos de ensaio. Adicionar 1,0 mL de substrato acada tubo-padrão e agitar no vórtex para misturar. Adicionar 1,0 mL de solu-ção color stop aos padrões a seguir à análise e misturar. Com a adição detodos os reagentes, o volume final de cada amostra de curva padrão será2,5 mL. As amostras da curva-padrão de fosfato não precisam de ser incu-badas a 37°C durante os 60 minutos. Tem de ser preparada uma curva-padrão de fosfato de cada vez que se realiza um conjunto de análises masnão tem de ser conduzida em duplicado dado que as variações na curva-padrão são mínimas de análise para análise. O nível de concentração dacurva-padrão de fosfato é tal que o padrão 7 irá apresentar uma absorvânciade aproximadamente 1,1 a 1,2 a 415 nm. As absorvâncias da amostra deanálise não devem ultrapassar este valor limite superior. Caso contrário diluirmais enzima de ensaio e repetir a análise.

Análise enzimática da fitase. Recolhe-se uma alíquota de 1,0 mL de substra-to de fitato de sódio em tubos de ensaio de vidro, de 16 χ 100 mm e subme-te-se a pré-incubação durante 5 minutos a 37°C (ver resumo das adições deamostra/reagente, abaixo). Preparar três tubos de ensaio para as reaçõesenzimáticas e outros três para a reação em branco para cada amostra deenzima (6 tubos de substrato no total por replicação da enzima). A utilizaçãode tubos de ensaio de tampa roscada não é necessária dado que a evapo-ração durante a reação é negligenciável.

Submeter a pré-incubação as amostras de enzima em diluiçãode trabalho de 5 mL durante 5 minutos a 37°C. Este período de incubaçãode 5 minutos equilibra o substrato e enzima para uma temperatura apropria-da antes da reação de iniciação.

Na seqüência de uma pré-incubação de 5 minutos adicionar 0,5mL de amostra da diluição de trabalho ao primeiro dos seis tubos de substra-to de fitato de sódio de 1,0 ml_. Começar a contar o tempo em um cronôme-tro no momento da adição da enzima diluída no primeiro tubo. Continuar aadicionar amostra de enzima diluída aos segundo e terceiro tubos de subs-trato de fitato de sódio á uma velocidade constante (isto é, adição de enzimadiluída a um tubo a cada 5 segundos) mas não adicionar a enzima diluídaaos três tubos em branco nesta fase da análise. A velocidade de adição deenzima constante, estabelecida durante esta porção da análise irá ser ne-cessária novamente durante o protocolo de impregnação de reação. Depoisda adição da última alíquota de enzima diluída, agitar em vórtex todos ostubos de reação e devolvê-los todos rapidamente ao banho de água a 37°C.Incubar durante 60 minutos.

Na seqüência do período de incubação de 60 minutos, adicionar1,0 mL de solução color stop a cada tubo da reação enzimática e também acada tubo de ensaio em branco, utilizando a taxa de adição de amostraconstante estabelecida anteriormente. A utilização de uma taxa de adiçãoconstante irá garantir que cada amostra passa por 60 minutos de tempo dereação. Agitar em vórtex para misturar todos os tubos de ensaio extingüidos.

Depois de extinguir os três tubos de reação em branco com so-lução color stop, adicionar 0,5 mL de amostra de enzima diluída a cada um.

Adicional 1,0 mL de solução color stop a cada uma das 7 amos-tras de curva-padrão de fosfato. Todos os tubos de reação, em branco eamostras-padrão de fosfato terão agora 2,5 ml de solução. Depois da adiçãodo reagente color stop a todos os tubos de ensaio, agitar em vórtex as a-mostras mais um pouco para garantir a mistura completa dos reagentes ecentrifugar a 2.000 g durante 10 minutos para clarificar as amostras antes deproceder às medições da absorvância.

Medições espectroscópicas e cálculos de atividade. Utilizando tanto umacuvete de plástico (1 cm de comprimento do trajecto, semimicro) como dequartzo, ajustar a zero o espectrofotômetro UV a 415 nm utilizando dH20.

Proceder à leitura de todas as amostras de curva-padrão de fosfato a 415nm e registrar os valores. Deve-se ter cuidado para não perturbar o materialprecipitado nos tubos de ensaio, na seqüência da centrifugação.

Para as 7 amostras de curva-padrão de fosfato tomar cada me-dição UV e subtrair a leitura de fosfato 0 Mmol (fosfato-padrão 1). Esta ope-ração corrige todas as leituras da curva-padrão de fosfato, por meio da sub-tração de um reagente em branco. Registrar a absorvância a 415 nm comouma função da quantidade de fosfato e depois calcular a linha de "melhorajustamento" ao longo dos dados definidos utilizando um programa de re-gressão linear.

Para as amostras da reação enzimática tomar a média das trêsleituras (estas devem situar-se dentro de 5 % umas das outras e cair ideal-mente dentro do limite da absorvância entre 0,4 e 1,1) e subtrair a média dastrês leituras de referência.

Tomar a absorvância corrigida de referência para cada replica-ção e interpolá-la utilizando os parâmetros de regressão da curva-padrão defosfato. O valor interpolado é calculado em unidades de pmols.

Dividir cada valor pmols interpolado por 60 minutos para obter otempo de reação e pela massa (em gramas) de uma alíquota de 0,5 ml_ de250 mM de tampão de acetato de sódio, conforme determinado. As unidadesdeste cálculo são em pmols/min/g ou em unidades de fitase por grama(FTU/g) por definição.

Tomar o valor FTU/g e multiplicá-lo pelo fator de diluição utiliza-do para obter as leituras da amostra à escala. O fator de diluição é o produtodas diluições primária, secundária e de trabalho da análise determinadasanteriormente, respectivamente.

Multiplicar o valor de FTU/g ajustado à diluição, calculado pelamassa total do tampão que foi utilizado no procedimento de extração da fita-se e depois dividir esse valor pela quantidade de material seco utilizado naextração. A massa do tampão de extração e a quantidade de material secoextraído deve ser aproximadamente 100 g e 1,0 g respectivamente. A ativi-dade calculada final é uma atividade baseada na massa que é representadaem unidades de fitase por grama de produto de fitase Quantum (FTU/g).

Este processo de análise para a fitase de milho foi realizado e osresultados são apresentados nas figuras 7 e 8. Este processo de extraçãoresultou suficientemente para amostras de ração feitas com milho transgêni-co que expressava uma enzima fitase.

Enquanto que a presente invenção tem vindo a ser descrita fa-zendo referência a concretizações específicas da mesma, observar-se-á quesão possíveis numerosas variações, modificações e outras concretizações e,assim, todas estas variações, modificações e concretizações devem serconsideradas como sendo abrangidas pelo escopo da presente invenção.

São discutidas e citadas numerosas patentes, pedidos de patente e referên-cias na presente especificação e todas estas são incorporadas na íntegracomo referências.

Claims (8)

1. Processo de extração e medição da atividade enzimática emração, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de:a) moer de uma amostra de ração de cerca de 300 gramas ± 30gramas, de forma que cerca de 80 % do material tenha uma dimensão departícula de 250 μιτι ou menos para fazer uma amostra de ração moída;b) misturar a amostra de ração moída com um tampão de boratoaquoso de.cerca de 25 mM de borato de sódio a_cerca de pH 10,0 ± Tween®-20 a cerca de 0,01 %;c) extração a enzima da amostra de ração moída ed) medir a atividade enzimática.

2. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelofato de que a enzima é uma fitase, amilase ou celulase.

3. Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelofato de què a fitase é uma fitase de E.coli ou uma fitase derivada de E.coli.

4. Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelofato de que a fitase é Quantum® Phytase.

5. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelofato de que a amostra de ração é uma amostra de ração em massa ou peletizada.

6. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelofato de que a medição da atividade enzimática é uma análise de fitase exe-cutada a pH 4,5 e 60°C.

7. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelofato de que a enzima da ração foi produzida em uma planta transgênica.

8. Processo de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelofato de que a enzima da ração é uma fitase, celulase ou amilase.