BRPI0603871B1

BRPI0603871B1 - composições farmacêuticas para o tratamento de tripanossomíases e de doença de chagas

Info

Publication number: BRPI0603871B1
Application number: BRPI0603871-9A
Authority: BR
Inventors: Antonio Raimundo Lima Cruz Teixeira
Original assignee: Fundação Universidade De Brasília
Priority date: 2006-08-24
Filing date: 2006-08-24
Publication date: 2021-01-12
Also published as: WO2008022422A1; BRPI0603871B8; BRPI0603871A

Abstract

COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS PARA O TRATAMENTO DE TRIPANOSSOMÍASES E DE DOENÇA DE CHAGAS. A presente invenção se refere ao tratamento de tripanossomíases visando á cura de indivíduos infectados por protozoários pertencentes á família Trypanosomatidae que sofrem de doença crônica. Mais especificamente, a invenção trata de composições farmacêuticas baseadas na associação de substâncias tendo atividade antiparasitária com substâncias inibidoras de vias de sinalização que possibilitam a integração do kDNA de T. cruzi no genoma do hospedeiro. Uma concretização se refere a composição farmacêutica da invenção compreende como ingredientes: (i) uma quantidade farmacologicamente eficaz de pelo menos uma substância com atividade antiparasitária; (ii) uma quantidade farmacologicamente eficaz de pelo menos um inibidor de vias metabólicas com atuação no impedimento da integração do kDNA de T cruzi no genoma do hospedeiro; (iii) opcionalmente, aditivos compatíveis com qualquer um dos ingredientes (i) ou (ii); e (iv) um veículo farmaceuticamente aceitável. Uma segunda concretização se refere a composição farmacêutica da invenção compreende como ingredientes: (i) uma quantidade farmacologicamente eficaz de pelo menos uma substância com atividade antiparasitária: (ii) uma quantidade farmacologicamente eficaz de pelo menos inibidor de vias metabólicas com atuação no impedimento da integração do kDNA de um dos protozoários pertencentes à família Trypanosomatidae no (...).

Description

Campo da invenção

A presente invenção se refere ao tratamento de tripanossomíases 5 visando à cura de indivíduos infectados por protozoários pertencentes à família Trypanosomatidae que sofrem de doença crônica. Mais especificamente, a invenção trata de composições farmacêuticas baseadas , na . associação de substâncias tendo atividade antiparasitária com substâncias inibidoras de vias de sinalização que possibilitam a integração io do kDNA de T cruzi no genoma do hospedeiro.

Fundamentos da invenção

Na família Trypanosomatidae estão incluídos os parasitos de maior relevância médica e veterinária. São eles: (i) o Trypanosoma cruzi que produz a doença de Chagas nas Américas, (ii) o Trypanosoma brucei que é 15 o agente causador da doença do sono na África e (iii) as espécies Leishmania que são responsáveis pelas leishmanioses em todo o mundo.

A Doença de Chagas, causada pelo protozoário T cruzi, afeta 18 milhões de pessoas na América Latina, o que representa um ônus social de seis bilhões de dólares na região (WHO. Control of Chagas Disease. 20 Technical Report Series 811, 1991). A morbidade e letalidade decorrentes da doença de Chagas são mais elevadas do que a soma produzida pela malária, esquistossomose e leishamnioses (Schmunis, Medicina: 59: 125134, 1999). No Brasil, são seis milhões os portadores da doença. O T cruzi é transmitido aos mamíferos por triatomíneos e a infecção 25 ocorre pela invasão de células de fagócito, a qual pode ser transmitida para outros indivíduos por transfusão de sangue ou transmissão vertical (de mãe para o filho através da placenta). As lesões patológicas encontradas no coração e sistema digestivo de pacientes de doença de Chagas crônica podem ficar ocultas por décadas após a infecção inicial, não sendo 30 explicadas exclusivamente pela destruição do tecido do hospedeiro lesado 2/30 pelo parasito ativo. A unidade de rejeição mínima, que consiste de células hospedeiras alvo, isentas de parasito, lisadas por células mononucleares do sistema imunológico, tem sido um denominador comum da patologia da doença de Chagas. 5 Na década passada, o tratamento da doença de Chagas foi motivo de polêmica em razão do pouco conhecimento sobre a patogênese da doença crônica e das lesões características que se formavam nos pacientes chagásicos. Havia questionamento sobre a relevância do tratamento antiparasitário no manejo clínico dessa enfermidade (Zhang L, Tarleton RL io 1999. Parasite persistence correlates with disease severity and localization in chronic Chagas' disease. J Infect Dis 180: 480-6). Entretanto, os estudos sobre auto-imunidade como fator importante na patogênese da doença jamais excluiu a persistência do parasito no hospedeiro humano (Tarleton RL 2003. Chagas disease: a role for autoimmunity? Trends Parasitol 19: 15 447-51). Desde então, vem se firmando o consenso sobre a necessidade de desenvolver esquemas terapêuticos verdadeiramente eficientes com base na premissa de que a eliminação da carga parasitária evitaria lesões produzidas diretamente pelo parasito e, além disso, ajudariam a interromper as reações auto-imunes que sustentam as lesões graves que com 20 freqüência estão associadas com a morte do chagásico (Urbina J.A. e Docampo, R. 2003. Specific chemotherapy of Changes disease: controversies and advances. Trends in Parasitol. 19: 495-500).

Os pontos-chave na medicina humana e veterinária são aqueles que estão associados com o surgimento de sintomas e sinais que podem ser 25 reconhecidos como aspectos clínicos de uma doença. Qualquer processo biológico persistentemente infeccioso pode ser dividido em tantos estágios quantas são as medidas necessárias para aliviar os sintomas e tratar os sinais. No caso das infecções causadas por T cruzi, esse processo pode ser dividido em dois estágios que se sucedem, o agudo e o crônico. 30 A doença de Chagas tem uma fase aguda, de curta duração, que, em uma parte dos doentes, progride para uma fase crônica. A fase aguda 3/30 requer um período de “instalação” de pelo menos 72 horas para que o parasita passe pelos ciclos de replicação antes que o sistema imunológico do hospedeiro tenha tempo de desenvolver uma reação no sítio da infecção. Ainda que haja reação de defesa (inflamação) no ponto de entrada, os 5 amastigotos intracelulares passam por múltiplos ciclos de divisão. A fase aguda é geralmente assintomática, e tem uma incubação de uma semana a um mês após a picada. No local da picada pode-se desenvolver uma lesão volumosa local eritematosa (vermelha) e edematosa (inchada) (o chagoma). Outros sintomas possíveis são febre, linfadenopatia, anorexia, io hepatoesplenomegalia, miocardite e, mais raramente meningocefalite. No entanto, nos casos agudos sintomáticos as manifestações clínicas associadas à infecção desaparecem após cerca de dois meses. O tratamento com medicamentos antiparasitários pode levar a um índice de cura de até 80%. Entre 20 e 60% dos casos agudos se transformam, em 2 a 15 3 meses, em portadores da infecção crônica indeterminada (sem doença aparente),com parasitas sangüíneos. Os doentes não tratados podem vir a falecer ou passar para o estágio de doença crônica, clinicamente manifesta.

A infecção crônica permanece assintomática (fase indeterminada) durante dez a vinte anos. Entretanto, neste período o parasita continua a se 20 reproduzir em baixa quantidade, causando danos irreversíveis em diversos órgãos do sistema nervoso e no coração. Apesar de o fígado também ser afetado, é rara a ocorrência de problemas na medida que esse órgão é capaz de regeneração. A doença de Chagas crônica torna-se aparente somente após uma ou duas décadas de progressão, com aparecimento 25 gradual de demência (3% dos casos iniciais), cardiomiopatia (insuficiência cardíaca, em 30% dos casos), ou dilatação do trato digestivo (megaesôfago . ou megacólon em 6%), devido à destruição da inervação e das células musculares desses órgãos. No cérebro há freqüentemente a formação de granulomas. 30 Os tratamentos da doença de Chagas até hoje conhecidos ignoram essa diferença crucial entre as fases aguda e crônica da doença. Na verdade, os medicamentos disponíveis são voltados para a fase aguda da doença de Chagas.

Já é conhecido o uso de derivados de quinona como agentes anti- protozoários. Na patente US 5.780.514 é descrito um método de tratamento 5 terapêutico ou profilático de infecções causadas por protozoários, incluindo os cinetoplastídeos, por exemplo, o T. cruzi, caracterizado pelo uso da substância 2-[4-(4-clorofenil)ciclo-hexil]-3-hidroxi-1,4-naftoquinona.

Na busca por um tratamento eficaz para doenças causadas por protozoário Tripanossoma também foi proposto, no documento US io 6.875.584, o uso de vacina multicomponente compreendendo um polipeptídeo imunogênico e um polinucleotídeo, sendo que o polipeptídeo compreende um sítio de ligação de glicosilfosfotidilinositol e o polinucleotídeo compreende uma região codificante de nucleotídeo que codifica o polipeptídeo imunogênico. 15 No entanto, as substâncias antiparasitárias disponíveis e que são mais correntemente utilizadas no tratamento de pacientes chagásicos são os compostos nitroheterocíclicos. O nitrofurano nifurtimox (Lampit®, da ' Bayer) e o derivado nitroimidazólico benzonidazol (Rochagan®, da Roche) são os medicamentos mais usados. A atividade dessas substâncias anti-T. 20 cruzi depende da presença do grupo nitro que, além da atividade anti- parasitária, também determina a sua toxicidade porque ambos os compostos agem via redução do grupo nitro para produzir metabólitos tóxicos (por exemplo, anion superóxido, peróxido de hidrogênio e seus intermediários). A atuação dessas substâncias sobre o T. cruzi baseia-se no 25 fato de que esse parasito apresenta deficiência na destoxificação dos metabólitos do oxigênio, tornando-se altamente susceptível ao “stress” oxidativo (Docampo, R. 2001. Recent developments in the chemotherapy of Chagas disease. Curr Pharm Des 7'. 11571164).

É também conhecido que o nifurtimox e o benzonidazol têm atividade 30 significativa na fase aguda da doença, podendo ser alcançado o índice de até 80% de cura parasitológica (Kirchhoff, L.V. 1999. Chagas disease (American Trypanosomiasis): a tropical disease now emerging in the United States. In Emerging Infections 3 (Scheid, W.M. et al., eds), pp 111-134. ASM Press; Cançado J.R. 1999. Criteria of Chagas disease cure. Mem. Inst. Oswaldo Cruz 94: 331-336). Todavia, a eficácia dessas substâncias varia de 5 acordo com as áreas geográficas, possivelmente devido a diferenças na susceptibilidade do T. cruzi a esses medicamentos (Andrade S.G. et al. 1992. Specific chemotherapy of Chagas disease: a comparison between the response in patients and experimental animals infected with the same strains. Trans R Soc Trop Med Hyg 86: 624-626). A literatura também io registra a atividade antiparasitária limitada desses compostos quando eles são usados nas formas crônicas da doença. Alguns estudos mostraram que pacientes chagásicos crônicos tratados com benzonidazol não alcançaram cura parasitológica, mas tiveram redução significante na ocorrência de alterações eletrocardiográficas e menor freqüência de deterioração das 15 condições clínicas (Bahia-Oliveira, L.M.G. et al. 2000. Immunological and clinical evaluation of chagasic patients subjected to chemotherapy during the acute phase of Trypanosoma cruzi infection 14-30 years ago. J. Infect Dis. 182: 634-638; Viotti R, Vigliano C, Armenti H, Segura E. 1994. Treatment of chronic Chagas' disease with benznidazole: clinical and serological evolution 20 of patients with long term follow-up. Am Heart Journal 127: 151-162). Essa informação é importante porque o efeito redutor da carga parasitária pode ser usado no tratamento da doença crônica com uma associação de princípios ativos com vistas à cura. O sucesso de um tratamento “multidrogas” significaria a cura parasitológica e a interrupção do caráter 25 evolutivo das lesões da doença de Chagas.

Portanto, a diferença marcante na atividade antiparasitária nas fases aguda e crônica da infecção pelo T. cruzi mostra a necessidade de desenvolvimento de modalidades diferenciadas de tratamento (Braga MS, Lauria-Pires L, Arganaraz ER, Nascimento RJ, Teixeira AR. (2000). 30 Persistent infections in chronic Chagas' disease patients treated with anti-Trypanosoma cruzi nitroderivátives. Rev Inst Med Trop Sao Paulo. May- Jun;42(3):157-61; Lauria-Pires, L., Braga, M.S., Vexenat, A.C., Simões-

Barbosa, A.S., Tinoco, D.L., e Teixeira, A.R.L. (2000). Progressive chronic Chagas heart disease ten years after treatment with anti-Trypanosoma cruzi nitroderivatives. Am. J. Trop. Med. Hyg. 63, 43-55; Urbina & Docampo, 2003). Urbina e cols. (1996) (Urbina, J.A., Payares, G., Molina, J., Sanoja, J 5 C., Liendo, A., Lazaardi, K., Piras, M.M., Piras, R., Perez, N., Wincker, P., /

Ryley, J.F. 1996. Cure of short- and long-term experimental Chagas'disease :useing DO870. Science, 273: 969-971) mostraram que os derivados triazólicos inibidores da síntese de esteróis do T. cruzi, atuando sobre a C14oc demetilase, tinham potente atividade seletiva antiprotozoário. Essa io informação resultou na experimentação de outros compostos em desenvolvimento como antifúngicos sistêmicos. Desde então todos os derivados triazólicos vêm sendo considerados candidatos à triagem para tratamento da doença de Chagas experimental (Urbina & Docampo, 2003). Por último, os pesquisadores da Venezuela e do Instituto René Rachou, 15 Belo Horizontes (Urbina e cols., 2003) verificaram que o composto TAK-187, um composto triazólico de ação prolongada, produzia eliminação da infecção aguda e crônica do T. cruzi em cobaias (Urbina e cols., 2003).

Em resumo, para um eficaz tratamento do paciente chagásico crônico é fundamental estabelecer uma associação medicamentosa que, por um 20 lado, reduza a carga parasitária e, por outro, impeça o desenvolvimento de reações auto-imunes que são características da fase crônica. Além disso, é importante fazer o monitoramento do tratamento, especialmente na fase crônica da doença, para eliminar ou reduzir ao mínimo a ocorrência de mecanismos de auto-imunidade causadores de efeitos deletérios, e até 25 mesmo letais, no paciente.

Sumário da Invenção:

Foi agora verificado que o tratamento eficaz da doença de Chagas requer o uso de pelo menos uma substância antiparasitária associada a inibidores de vias metabólicas que impeçam as mutações no genoma do 30 chagásico decorrentes da capacidade de integração do kDNA dé 'T- cruzi no genoma do hospedeiro. Além disso, é essencial que o tratamento seja monitorado por meio de um método diagnóstico que possa detectar marcadores específicos da integração do kDNA de T. cruzi no genoma do hospedeiro.

Uma primeira concretização da presente invenção refere-se a 5 composições farmacêuticas compreendendo: (i) pelo menos uma substância com atividade antiparasitária, (ii) pelo menos um inibidor de vias metabólicas com atuação no impedimento da integração do kDNA de T. cruzi no genoma do hospedeiro, (iii) opcionalmente, aditivos e (iv) veículo farmaceuticamente aceitável. . io Uma segunda concretização da presente invenção refere-se a composições farmacêuticas compreendendo: (i) pelo menos uma substância com atividade antiparasitária, (ii) pelo menos um inibidor de vias metabólicas com atuação no impedimento da integração do kDNA de um dos membros da família Trypanosomatidae no genoma do hospedeiro, (iii) 15 opcionalmente, aditivos e (iv) veículo farmaceuticamente aceitável.

Breve descrição das figuras: A Figura 1 mostra a integração dos minicírculos de Trypanosoma cruzi no genoma de macrófagos em conseqüência da infecção. A Figura 2 mostra a inibição da integração de seqüências de 20 minicírculos de kDNA mediante tratamento dos macrófagos humanos com concentrações micromolares de Vpin (AZT), Cholo (GENISTEINA), e Flaxo (OFLOXACINA).

Descrição detalhada da invenção:

Primeiramente, para facilitar a compreensão da presente invenção, 25 são fornecidas algumas definições estreitamente relacionadas com o objeto da mesma. - “substâncias com atividade antiparasitária”, no contexto da invenção, significa qualquer substância com capacidade de reduzir a carga parasitária em indivíduo infectado por protozoário, incluindo substâncias selecionadas do grupo consistindo de compostos nitro-heterocíclicos, incluindo derivados triazólicos, e inibidores de crescimento do parasito no hospedeiro. - “inibidor de vias metabólicas com atuação no impedimento da integração do kDNA de T. cruzi no genoma do hospedeiro”, no contexto da invenção, 5 significam os inibidores de proteínas que participam das reações de integração do kDNA de T cruzi no genoma do hospedeiro, as quais resultam na formação dos marcadores específicos de dita integração representados pelos fragmentos de 1,2, 1,8 e 2,2 kb oriundos da clivagem do DNA do indivíduo infectado por T cruzi com a enzima de restrição Nsil io ou EcoRI. - “inibidor de vias metabólicas com atuação no impedimento da integração do kDNA de um dos membros da família Trypanosomatidae no genoma do hospedeiro”, no contexto da invenção, significam os inibidores de proteínas que participam das reações de integração do kDNA de dito protozoário no 15 genoma do hospedeiro e que resultam na formação de marcadores específicos de dita integração. - “protozoário pertencente à família Trypanosomatidae”, no contexto da invenção, significa um membro do grupo consistindo de Trypanosoma cruzi, Trypanosoma brucei e Leishmania sp. que parasita um hospedeiro e tem a 20 capacidade de integrar o kDNA de seus minicírculos ao genoma de dito hospedeiro. - “marcadores específicos de integração do kDNA de T. cruzi no genoma do hospedeiro”, no contexto da invenção, significam os fragmentos de 1,2, 1,8 e 2,2 kb oriundos da clivagem do DNA do indivíduo infectado por T. crüzi 25 com a enzima de restrição Nsil ou EcoRI. ■:

A manifestação clínica em pacientes com a doença de Chagas crônica leva várias décadas para repercutir na saúde e provavelmente é decorrente da acumulação de mutações deletérias que sucedem no genoma do chagásico ao longo de anos ou décadas. Por esse motivo, um;;:. 30 tratamento eficaz para essa doença deve se basear não só no controle da carga parasitária como, também, nas condições que conduzem à fase crônica da doença e a mantêm. Como será detalhado mais adiante, de acordo com a presente invenção esse objetivo é alcançado com o impedimento da integração de múltiplas seqüências de kDNA no genoma do chagásico associado à redução da carga parasitária no indivíduo infectado.

Embora não seja o objetivo da presente descrição ficar limitada a uma explicação teórica, os resultados das muitas experiências realizadas até o momento têm mostrado que a persistência do parasito no hospedeiro infectado com o T. cruzi deve ser uma fonte constante de kDNA, o qual pode ser mobilizado e integrado em vários sítios do genoma. Acredita-se que a infecção persistente no curso da doença de Chagas representa uma fonte de kDNA geradora de novas integrações. A partir dessa infecção residual (fonte), mutações de kDNA vão se acumulando até o momento em que ocorrem eventos de integração em sítios sensíveis do genoma, destruindo ou formando novos genes e resultando em efeitos deletérios para o indivíduo infectado.

De acordo com a presente invenção e para melhor estudar a integração dos minicírculos no genoma humano e rastrear as subseqüentes mudanças, ao longo do tempo, na sua localização, foi utilizado um protocolo usando macrófagos cultivados. Também foram usadas células vivas de T. cruzi para infectar uma população de macrófagos imortalizados, seguida da re-clonagem e manutenção prolongada de linhagens isentas de parasito em cultura de células.

O DNA de culturas de macrófagos U937 infectados com T. cruzi foi submetido a hibridizações Southern com uma sonda da região conservada de minicírculo homólogo (kCR). O DNA das células infectadas com T. cruzi mostrou um padrão distinto de bandas que não foi apresentado pelo DNA de T. cruzi testado com a sonda kCR indicando, portanto, que o DNA do minicírculo está em uma configuração diferente na amostra do DNA de macrófago infectado, em comparação com o DNA^do cinetoplasto. As amostras de macrófagos infectados com T. cruzi colhidas no quarto dia após a infecção mostraram padrões diferentes de bandas; ou seja, além da banda de 360-pb representando o cinetoplasto, foram formadas com o DNA de macrófagos infectados bandas de tamanhos maiores, de 1,2, 1,8 e 2,2 kb, as quais não estavam presentes no DNA do parasito. \ 5 Como mostrado na Figura 1, pode ser visualizada a integração dos minicírculos de T. cruzi no genoma de macrófagos em conseqüência da infecção. Em (A) é apresentada a hibridização Southern de digestos de A/s/l de macrófagos com sete dias de infecção e de macrófagos com trinta dias (pós-infecção) com sonda'de kCR em blots de géis de agarose a,0,8%. Em io (B), podem ser vistos os produtos de amplificação de minicírculos por PCR corados com brometo de etídio, usando primers S34/67. Os perfis formados com o T. cruzi e com o macrófago com sete dias de infecção estão alterados nos macrófagos pós-infecção pela ausência da banda de 0,12 kb e seus catâmeros. Em (C), estão mostrados os produtos de amplificação do 15 nDNA por PCR corados com brometo de etídio usando Tcz1/2. A ausência da banda de 0,36 kb no Southern blot e dos produtos de PCR de 0,2 kb no DNA de macrófago no trigésimo dia pós-infecção indica que a infecção por T. cruzi havia sido erradicada, deixando os minicírculos integrados no genoma da célula hospedeira. 20 A determinação dessas bandas características da integração do kDNA de T. cruzi no genoma do hospedeiro traz um marco inigualável na busca por tratamento seguro e eficaz de doença de Chagas na fase crônica.

Essa importante constatação serviu de base para o estabelecimento do método e kit de diagnóstico para o monitoramento do tratamento de 25 tripanossomíases crônicas. No pedido de patente co-pendente intitulado “MÉTODO DE DIAGNÓSTICO E DE MONITORAMENTO DO TRATAMENTO DE TRIPANOSSOMÍASES CRÔNICAS, MÉTODO DE DIAGNÓSTICO E DE MONITORAMENTO DO TRATAMENTO DA DOENÇA DE CHAGAS CRÔNICA, E KIT DE DIAGNÓSTICO PARA USO 30 NO DIAGNÓSTICO E NO MONITORAMENTO DO TRATAMENTO DE TRIPANOSSOMÍASES CRÔNICAS E DA DOENÇA DE CHAGAS”, da ora depositante, é feito o detalhamento dos ditos método e kit de diagnóstico e de monitoramento do referido tratamento.

Como mencionado anteriormente, no caso do parasito T. cruzi, os marcadores específicos de integração do kDNA de T. cruzi no hospedeiro 5 são os fragmentos dos minicírculos de 2,2, 1,8 e 1,2 kb oriundos do DNA do macrófago infectado com T. cruzi e clivado com /Vs/I.

O monitoramento do tratamento de tripanossomíases crônicas, incluindo a doença de Chagas crônica, é realizado por meio de um kit de diagnóstico incluindo todos os reagentes necessários à identificação da io integração do kDNA do parasito no genoma do hospedeiro com base nos marcadores específicos de dita integração.

No caso da tripanossomíase americana o agente etiológico da doença de Chagas é o protozoário T. cruzi cujos marcadores de integração do kDNA do parasito no genoma do hospedeiro são os fragmentos de 1,2, 15 1,8 e de 2,2 kb obtidos pela clivagem do DNA genômico de macrófagos humanos infectados por T. cruzi com a enzima de restrição específica A/s/1 ou EcoRI.

As técnicas de obtenção do DNA genômico, sua digestão e hibridização dos fragmentos são amplamente conhecidas dos técnicos em 20 biologia molecular e podem ser encontrados em obras de referência como em Sambrook et al. (1989). Nos casos particulares, por exemplo, de extração do DNA e do kDNA de Trypanosoma cruzi e Leishmania, as referências são fornecidas na descrição do procedimento. O detalhamento das técriicas gerais e particulares dos organismos é provido nóS exemplos 25 fornecidos mais adiante. •

O tratamento da amostra do indivíduo infectado por T. cruzi é feito utilizando o mesmo procedimento aplicado aos macrófagos humanos para a obtenção dos marcadores específicos da integração do kDNA de T. cruzi.

Maiores detalhes sobre tais procedimentos são encontrados no 30 pedido de patente co-pendente intitulado “MÉTODO DE DIAGNÓSTICO E 12/30 DE MONITORAMENTO DO TRATAMENTO DE TRIPANOSSOMÍASES CRÔNICAS, MÉTODO DE DIAGNÓSTICO E DE MONITORAMENTO DO TRATAMENTO DA DOENÇA DE CHAGAS CRÔNICA, E KIT DE DIAGNÓSTICO PARA USO NO DIAGNÓSTICO E NO MONITORAMENTO 5 DO TRATAMENTO DE TRIPANOSSOMÍASES CRÔNICAS E DA DOENÇA DE CHAGAS” que é aqui incorporado a título de referência.

Como mencionado anteriormente, a descoberta de que na fase crônica da doença de Chagas ocorre a integração do kDNA do parasito T. cruzi no genoma do hospedeiro veio esclarecer a diferença , na. reação de io pacientes infectados pelo parasito ao tratamento com drogas antiparasitárias, evidenciando a diferenciação de cura das fases aguda e crônica.

Portanto, a presente invenção vem revolucionar o tratamento da doença de Chagas na medida em que possibilita a cura pela interrupção da 15 integração do kDNA no genoma do indivíduo infectado associado à redução da carga parasitária. Em outras palavras, a presente invenção possibilita o tratamento da doença de Chagas crônica antes indisponível. Para tanto, de acordo com a invenção as novas composições farmacêuticas associam aos já conhecidos agentes antiparasitários, os inibidores de vias metabólicas do 20 hospedeiro que permitem a integração do kDNA de T. cruzi.

Para compreender as premissas que levaram à presente invenção, faz-se a seguir uma breve descrição da utilização dos mecanismos do hospedeiro pelo parasito T. cruzi desde a infecção.

Evidências experimentais mostram que a integração de seqüências 25 de minicírculos de kDNA de T. cruzi no genoma da célula hospedeira é um fenômeno dependente de energia. O estresse metabólico representado pela penetração do protozoário no citoplasma da célula hospedeira gera modificações bioquímicas na célula. As interações moleculares, possivelmente entre glicoproteínas presentes na membrana do protozoário 30 e um ligante específico presente na superfície da célula hospedeira ativam as vias metabólicas associadas com o aumento do consumo de oxigênio e glicose. A produção de energia, iniciada no ciclo de Krebs, é utilizada em todos os compartimentos da célula que responde ao estímulo da infecção intracelular. De fato, foi reconhecida a ativação de múltiplas vias de tradução de sinais, tendo sido verificado que fosfatases e fosforilases 5 (proteíno-quinases) exercem um papel fundamental na transferência horizontal do kDNA. Entretanto, são as quinases que regulam a diferenciação e divisão celular a montante e, conseqüentemente, têm.um papel ativo nessa integração. Essa atividade foi comprovada por meio do emprego de inibidores específicos de vias metabólicas que impediram a io transferência do DNA do T. cruzi para a célula hospedeira.

De acordo com a presente invenção, foram usadas substâncias específicas que inibem as vias de sinalização associadas com o crescimento e diferenciação da célula visando a impedir a integração do kDNA de T. cruzi no genoma do indivíduo infectado. 15 Os marcadores da integração do kDNA de T. cruzi no genoma da célula hospedeira acima mencionados, ou seja, os fragmentos de 2,2, 1,8 e 1,2 kb presentes em macrófagos infectados por T. cruzi, foram utilizados para definir os inibidores de vias metabólicas específicas envolvidas na integração do DNA do parasito no genoma do hospedeiro. Além disso, 20 como as formas do parasito em divisão se mostraram mais susceptíveis à toxicidade causada pela droga do que os macrófagos, os ensaios de dose de resposta e a determinação da dose ótima do inibidor foram realizados com as formas epimastigotas de T. cruzi.

A concentração ótima para cada droga foi determinada em ensaios 25 de dose de resposta apresentando efeito citopático mínimo ou ausência do mesmo tanto para formas epimastigotas de T. cruzi como para macrófagos humanos U937. A Figura 2 mostra a inibição da integração de seqüências de minicírculos de kDNA mediante tratamento dos macrófagos humanos com 30 concentrações micromólares de Vpin (AZT), Cholo (GENISTEINA), e Flaxo. (OFLOXACINA). É importante notar que essas drogas impediram a formação das bandas indicativas da integração na altura de 1,2, 1,8 e 2,2 kb. Essas mesmas bandas foram formadas nos controles “mock”, quando as células hospedeiras foram tratadas com Brdu (BROMODEOXIURIDINA) e Cpto (CAMPTOTECINA). O DNA de T. cruzi formou a banda esperada de 5 0,36 kb e o macrófago normal (CONTR) não formou banda. O DNA usado em cada coluna foi clivado com A/s/l.

Em outras palavras, a dose ótima de inibidor foi usada para avaliar o envolvimento de vias de sinalização específica na transferência horizontal de kDNA dentro do genoma do macrófago. Esses ensaios consistiram na io infecção de uma quantidade suficiente, por exemplo, 4x106 macrófagos U937 com 20x106 tripomastigotos de T. cruzi colhidos de culturas de células musculares L6. Antes da infecção, as células foram independentemente misturadas com dose ótima do inibidor específico por 30 minutos à temperatura ambiente. No quarto dia, as células infectadas por T. cruzi 15 foram colhidas e o DNA digerido com A/s/l foi submetido a análise de hibridização Southern. As células tratadas com ciclo-heximida, um potente inibidor da síntese protéica na indução de apoptose celular (Tran, S.F., Holmstrom, T.H., Ahonen. M., Kahari, V-M. E Eriksson, J.E. (2001). MAPK/ERK overrides the apoptotic signaling from Faz, TNF and TRAIL 20 receptors. J. Biol. Chem., 276: 16484-16490), da mudança morfológica de epimastigotos (rounding-up) e da inibição de crescimento, mostraram uma única banda de kDNA de 0,36 kb na hibridização Southern.

A análise de Southern blot foi feita com sonda de kCR em que os inibidores de fosfatase, polimerase III e I e de mutação pontual, 25 respectiva mente, microcistina LR, CamptotéCina é Br-dU (Bromodesoxiuridina) apresentaram as bandas de kDNA de 1,2, 1,8 e 2,2 kb que haviam sido transferidas para o genoma do macrófago. Diferentemente desses inibidores, os inibidores de fosforilases, polimerases e de divisão celular de fase tardia impediram a transferência desses fragmentos de 30 kDNA para o genoma do macrófago. As células tratadas com microcistina foram coletadas no vigésimo primeiro dia pós-infecção e não apresentaram o fragmento de 0,36 kb. Os controles positivo (DNA de T. cruzi) e negativo (DNA de macrófago não-infectado) revelaram o fragmento de 0,36 kb e a ausência de hibridização, respectivamente. Além disso, a microcistina LR que demonstrou ser o mais potente inibidor de fosfatases PP-1 e PP-2 (Suganuma, M., Fujiki, H., Okabe, S., Nishiwaki, S., Brautigan, D., 5 Ingebritsen, T.S. e Rosner, M.R. (1992). Toxicon 30: 873-878), retardou o crescimento celular, mas não evitou a formação das bandas de kDNA de 1,2, 1,8 e 2,2 kb, as quais estavam presentes nos macrófagos pós-infecção. Esses resultados foram validados por experimentos mostrando que a concentração inibitória usada não evitou o crescimento intracelular de io amastigotos.

Foi ainda verificado que, quando tripomastigotos metacíclicos (106) que haviam sido tratados com dose ótima de um inibidor, foram usados para infectar células musculares L6, o exuberante crescimento do parasito foi moderadamente ou levemente atrasado por microcistina, Br-dU e 15 mitomicina C. O restante dos inibidores não apresentaram efeito sobre o crescimento dos amastigotos.

Os resultados obtidos com o uso de substâncias inibidoras específicas de vias de sinalização, como mostrado na Figura 2, permitem deduzir que as categorias de inibidores mais promissoras para impedir a 20 integração do kDNA de T. cruzi no genoma de indivíduos infectados são: (i) inibidores de serina/treonina proteína quinase (PKC); (ii) inibidor de tirosina proteína quinase (PTK) e (iii) compostos de isoquinolina.

A análise dos resultados mostra que, apesar de a genisteína não ter efeito direto sobre o crescimento e diferenciação do parasito, a sua 25 atividade inibidora da transferência.horizontal do kDNA pode ser observada • 'I na Figura 2.

Também foi observado que a 1-(5-isoquinolina-sulfonil)-piperazina apresentou um efeito moderado, mas a estaurosporina interrompeu o crescimento celular e induziu a diferenciação de epimastigoto em 30 amastigoto. . 7 16/30

Os inibidores de fosforilação de proteínas evitaram a formação dos fragmentos de 1,2, 1,8 e 2,2 kb e, portanto, impediram a transferência horizontal de minicírculos de kDNA de integração estável no genoma de macrófagos, independente das mudanças celulares induzidas pelas formas 5 de T. cruzi. Foi também verificado que a ofloxacina, um inibidor de topoisomerases II e IV procarióticas, e etoposide, que inibe a topoisomerase II, tiveram efeito moderado sobre o crescimento do epimastigoto, mas impediram a formação dos fragmentos dos marcadores específicos de 1,2, 1,8 e 2,2 kb, enquanto que a camptotecina, que é um agente inibidor da io topoisomerase I impediu o crescimento do parasito sem evitar a formação dos fragmentos dos marcadores específicos da integração do kDNA de T. cruzi no genoma do hospedeiro. O AZT apresentou perfil de atividade semelhante ao da ofloxacina e do etoposide. Esses resultados permitem deduzir que as topoisomerases II e IV procarióticas e eucarióticas são 15 necessárias para a transferência horizontal de seqüências de minicírculos de kDNA para o genoma da célula hospedeira, o que não ocorre com as topoisomerases I e III. Além disso, é possível dizer que os inibidores de transcriptase reversa, como AZT (nucleosídeo) ou nevirapina (não- nucleosídeo) também impedem a transferência horizontal de kDNA para o 20 DNA do macrófago.

Adicionalmente, é possível dizer que a inibição da integração do kDNA de T. cruzi no genoma do hospedeiro é possibilitada pelo tratamento dos macrófagos humanos com concentrações micromolares de Vpin, Cholo, e Flaxo, respectivamente, AZT, genisteina e ofloxacina. Observe-se que 25 essas substâncias impediram a formação das bandas indicativas da integração na altura de 1,2, 1,8 e 2,2 kb. Essas mesmas bandas foram formadas nos controles “mock', os quais consistiram no uso de bromodeoxiuridina, droga que substitui adenina pela uridina sem interferir na replicação do DNA, ou de camptotecina que inibe a topoisomerase I sem 30 interferir na divagem do minicírculo do kDNA necessária para a sua integração. O DNA de T. cruz/formou a banda esperada de 0,36 kb. O .DNA usado em cada coluna foi clivado com Nsil.

Deve, ainda, ser mencionado que a conclusão da replicação de DNA parece ser essencial para uma transferência bem-sucedida da seqüência de minicírculo de kDNA para o genoma da célula hospedeira. No caso da mitomicina C, formadora de ligações cruzadas no DNA, houve um retardo 5 no crescimento de epimastigoto e impedimento da formação dos fragmentos dos marcadores específicos de 1,2, 1,8 e 2,2 kb. A colchicina, que inibe a polimerização/despolimerização de tubulina; também evitou a formação dos fragmentos dos marcadores específicos, impedindo, portanto, a transferência genética horizontal. io Como exemplos de compostos com atividades específicas sobre alvos centrais nas vias de sinalização da diferenciação e divisão celular e que, portanto, inibem a integração do kDNA de T. cruzi no genoma do hospedeiro, podem ser citados: - 1 -[N,O-bis[5-isoquinolina-sulfonil]-N-metil-L-tirosil]-4-fenil piperazina 15 (composto KN 62), potente e seletivo inibidor da CAM quinase II; - cloreto de 1-(5-isoquinolina-sulfonil) piperazina, (composto I 1392), inibidor da proteína quinase C (PKC), proteína quinase A e da miosina quinase; - di-cloreto de 1-(isoquinolina-sulfonil)-2-metil piperazina, inibidor da proteína quinase C e da proteína quinase dependente de nucleotídeo 20 cíclico; - estaurosporina, potente inibidor da PKC e da topoisomerase II; - genisteína (4',5,7-tri-hidroxiisoflavona), inibidor de proteína tirosina quinase; - inibidores nucleosídicos da transcriptase reversa, por exemplo, zidovudina, 25 (3'-azido-3'-desoxitimidina, AZT), didanosina, zalcitabina, estavudina, lamivudina, abacavir; - inibidores não-nucleosídicos da transcriptase reversa, por exemplo, nevirapina, delavirdina, efavirenz; , < - ciclo-heximida (3-[2-(3,5-dimetil-2-oxociclo-hexil)-2-hidroxietil]-glutarimida, CHX), inibidor da síntese protéica; - actinomicina D, inibidor da transcrição do DNA pela RNA polimerase; - colchicina, apresentando efeito antimitótico; 5 - mitomicina C; - etoposide, inibidor da topoisomerase II; - ofloxacina, inibidor das topoisomerases II e IV; - - Vpin (3'-azido-3'-desoxitimidina, AZT); - Cholo (genisteina (4',5,7-tri-hidroxiisoflavona), inibidor de proteína tirosina 10 quinase); - Flaxo (ofloxacina, inibidor das topoisomerases II e IV).

As composições farmacêuticas da presente invenção compreendem (i) pelo menos uma substância antiparasitária, (ii) pelo menos um inibidor de vias metabólicas com atuação no impedimento da integração do kDNA de T. 15 cruzi no genoma do hospedeiro, (iii) opcionalmente, aditivos e (iv) um veículo farmaceuticamente aceitável.

De preferência, as substâncias inibidoras de vias metabólicas presentes nas composições da invenção são selecionadas do grupo consistindo de inibidores de fosforilase e de polimerases que atuam na 20 integração do kDNA de T. cruzi ao genoma humano, tais como, proteína- quinases, topoisomerases. É fornecida acima uma lista não-exaustiva e não-limitativa de exemplos de tais inibidores. A característica essencial dessas substâncias nas composições farmacêuticas da presente invenção é a não-formação dos fragmentos correspondentes aos marcadores 25 específicos de integração do kDNA de T. cruzi ao genoma do hospedeiro, como aqui definidos. Como inibidores de vias metabólicas mais preferidos são os compostos destituídos de efeitos tóxicos severos, mais preferivelmente os selecionados do grupo consistindo de: Vpin (3'-azido-3'- 19/30 desoxitimidina, AZT); Cholo (genisteina (4',5,7-tri-hidroxiisoflavona), inibidor de proteína tirosina quinase) e Flaxo (ofloxacina, inibidor das topoisomerases II e IV).

De preferência, as substâncias antiparasitárias que constituem as 5 composições da invenção são os compostos nitro-heterocíclicos, especialmente os derivados triazólicos e imidazólicos, e os inibidores do crescimento do parasito no hospedeiro.

Exemplos de compostos nitro-heterocíclicos preferidos como componentes das composições farmacêuticas da presente invenção são o io benzonidazol, nifurtimox, triazóis antifúngicos (por exemplo, posaconazol, ravuconazol, TAK-187).

Exemplos de inibidores do crescimento do parasito no hospedeiro 15 como componentes das composições farmacêuticas da presente invenção são microcistina, camptotecina, Bromodeoxiuridina (Brdu) e outros que não inteferem na divisão celular. / No caso da tripanossomíase africana, as substâncias antiparasitárias em uso ou em fase de testes clínicos em 2005 são: pentamidina, suramin, DB 289, melarsoprol, efornitina e nifurtimox. Maiores detalhes podem ser obtidos em Croft, S.L., Barret, M.P. e Urbina, J.A. (2005). Chemotherapy of trypanosomiases and leishmaniasis. Trends in Parasitol. 21 (11): 508-512.

Para as leishmanioses, são conhecidas, com antiparasitárias, as 5 seguintes substâncias: estibogluconato de sódio, antimoniato de meglumina, anfotericina B, anfotericina B lipossômica, pentamidina, miltefosina, paromomicina, sitamaquine e imiquimod (ver Croft et al. (2005) acima mencionado).

A quantidade dos princípios ativos presentes nas composições io farmacêuticas da presente invenção, ou seja, a pelo menos uma substância antiparasitária e o pelo menos um inibidor de integração do kDNA de T. cruzi no genoma do hospedeiro, é uma quantidade farmacologicamente eficaz, podendo variar em uma faixa de 1,0 mg a 200 mg por quilograma de peso corporal, mais preferencialmente na faixa de 25 a 100 mg do princípio 15 ativo/kg de peso corporal. Deve ser ressaltado que para neonatos doses menores devem ser consideradas.

Como mencionado acima, as composições farmacêuticas da invenção compreendem os ingredientes ativos (associação da pelo menos uma substância antiparasitária e de pelo menos um inibidor de integração 20 do kDNA de T. cruzi no genoma do hospedeiro) e um veículo que além de farmaceuticamente aceitável deve ser compatível com os outros ingredientes da formulação.

As composições farmacêuticas da invenção podem estar em uma forma farmacêutica apropriada, tal como as de uso oral, sólida ou líquida; 25 formulação de aplicação tópica, tal como pomada, creme, gel ou ainda pode ser uma formulação de aplicação parenteral (incluindo subcutânea, intradérmica, intramuscular e intravenosa).

No caso de comprimidos, a formulação, ainda, pode conter aditivos tais como ligantes, lubrificantes, agentes tensoativos. Os comprimidos 30 podem ser revestidos ou estarem na forma de formulações dispersíveis ou de liberação controlada. No caso de cápsulas, a formulação pode estar na -forma de pó ou de grânulos. As formulações líquidas podem ser soluções, emulsões ou dispersões.

Os componentes das composições farmacêuticas da presente 5 invenção outros que não os princípios ativos são bem conhecidos da técnica farmacêutica e dispensam maiores detalhes. Os técnicos em produção farmacêutica saberão, a partir dos ensinamentos da presente invenção escolher as formas farmacêuticas apropriadas e como produzi-las.

A presente invenção é adicionalmente ilustrada pelos exemplos a io seguir que são providos meramente a título exemplificativo da invenção, não havendo a intenção de limitar seu escopo. Certas modificações e equivalentes ficarão evidentes para aqueles especialistas na técnica e devem ser considerados como incluídos dentro do escopo da presente invenção.

15 Exemplo 1 Infecção de macrófagos com T. cruzi

As formas tripomastigotas de T. cruz/foram usadas para infectar-os macrófagos U937 na proporção de 5:1 que resultou na infecção e sobrevivência das células fagocíticas (como descrito em Teixeira et al., 20 1994). Após quatro semanas os macrófagos não apresentavam o parasito livre no sobrenadante do meio de cultura, o que também foi confirmado por inoculação em camundongos. O DNA foi extraído dos macrófagos infectados e a erradicação da infecção foi confirmada por PCR e Southern blot com primers e sondas específicas. Igualmente foi extraído DNA de 25 macrófagos livres de infecção para uso como controle.

Nos experimentos controle de DNA, as formas promastigotas de L. braziliensis braziliensis (LTB 300) foram usadas para infectar os macrófagos na proporção de 5:1. As células foram mantidas a 37°C em meio DMEM, pH 7,2 e SBF a 10%. Para a obtenção do DNA dos promastigotas, o cultivo 22/30 também foi feito na mesma concentração de meio e a 24°C. O DNA dos macrófagos livres de infecção foi utilizado como controle.

Exemplo 2 Extração do DNA genômico dos macrófagos

Os macrófagos foram processados de acordo com o método descrito por Sambrook et al. (1989). Foram feitas duas lavagens com TBS (Tris-HCL 20 mM pH 7,2, NaCI 0,5M) a 3500 x g por 15 minutos e o sedimento foi ressuspenso em 2 ml de tampão de extração (Tris-HCI 1 mM pH 8,0, EDTA 0,1 M pH 8,0, SDS a 0,5%, RNAse 200 μg/ml). Após 1 hora de incubação a io 37°C, foi adicionada proteinase K em uma concentração final de 100 μg/ml, prosseguindo-se a incubação por mais 12 horas. As células foram submetidas a duas extrações com igual volume de clorofane (fenol:clorofórmio:álcool isoamílico; proporção 25:24:1), à temperatura ambiente e sob leve agitação. As fases orgânicas e aquosas foram 15 separadas por centrifugação a 5000 x g por 10 minutos. O DNA foi precipitado com 1/10v de acetato de sódio 3M pH 4,7 e 2,5v de etanol a 100% gelado, e após 30 minutos de incubação a 80°C, foi sedimentado por centrifugação a 12000 x g a 4°C por 15 minutos. O sedimento foi lavado duas vezes com etanol a 70% gelado, seco e depois ressuspenso em 20 tampão TE (Tris-HCI 10 mM pH 8,0, EDTA 1 mM pH 8,0). O DNA foi analisado por eletroforese em gel de agarose a 1 % e estocado a 4°C.

Exemplo 3 Extração do DNA de T. cruzie Leishmania ...

As formas epimastigotas de T. cruzi e promastigotas de L. braziliensis 25 (controle) crescidas em meio LIT e DMEM, respectivamente, foram centrifugadas a 1500 x g por 15 minutos e o sedimento lavado duas vezes com TBS e ressuspenso em tampão de lise na concentração de 5x107 células/ml de solução. Foi feita incubação a 37°C por 1 hora e, depois, adicionaram-se 100 μg/ml de proteinase K e incubóli-se por mais 12 horas. Procedeu-se a duas extrações de clorofane, seguidas de uma extração de clorofil. O DNA foi precipitado com acetato de sódio 3M pH 4,7 e de etanol a 100% gelado e o sedimento foi lavado duas vezes com etanol a 70% gelado. Depois de seco, o DNA foi ressuspenso em tampão TE, analisado 5 por eletroforese em gel de agarose a 1 % e estocado a 4°C.

Exemplo 4 Extração de kDNA de T. cruzi e de Leishmania

O kDNA de T. cruzi e de L. braziliensis foi extraído segundo metodologia descrita por Perez-Morga & Englund, P.T. (1993) (Perezio Morga, D.L. e Englund, P.T. (1993). The attachment of minicircles to kinetoplast DNA networks during replication. Cell 74: 703-711). Uma quantidade de 5x107 formas epimastigotas e promastigotas foi centrifugada a 1500 x g por 15 minutos e o sedimento foi lavado duas vezes com PBS. Em seguida, o sedimento foi ressuspenso em 630 μl de tampão NET100 15 (Tris-HCI 10 mM pH 8,0, EDTA 100 mM pH 8,0, NaCI 100 mM) e as células foram lisadas com 71 μl de SDS a 10%, tendo sido adicionados 7 μl de proteinase K a 20 mg/ml.

O lisado foi incubado a 37°C durante 12 horas e, após incubação, foi delicadamente homogeneizado por aproximadamente 10 vezes com o 20 auxílio de uma seringa. Em seguida foram acrescentados 690 μl de NET100 + 20% de sacarose. A mistura foi centrifugada a 14000 rpm por 15 minutos. Em seguida, o sobrenadante foi removido cuidadosamente, deixando-se aproximadamente 30 μl. Por fim, adicionaram-se novamente 690 μl de NET100 + 20% de sacarose, repetindo a centrifugação. 25 Após a centrifugação, o sedimento foi ressuspenso em 1000 μl de água destilada, seguindo-se duas extrações de clorofane e clorofil. O kDNA foi precipitado com 2,5v de etanol a 100% e 0,1v de acetato de sódio 3M pH 8,0. O sedimento foi lavado duas vezes com etanol a 70% e ressuspenso em 200 μl de tampão TE. OrkDNA extraído foi mantido a 4°C.

Exemplo Quantificação, digestão enzimática e análise eletroforética do DNA

As amostras de DNA genômico foram quantificadas e analisadas quanto à sua qualidade e integridade através de eletroforese em gel de agarose a 0,8%, em tampão TAE (Tris-acetato 90 mM pH 8,0, EDTA 25 5 mM). Além disso, a quantificação do DNA também foi feita através de método espectrofotométrico, de acordo com Sambrook et al. 1989.

Para a digestão enzimática, foram utilizadas enzimas de restrição (adquiridas da Invitrogen), seguindo as orientações do fabricante, ou seja, para cada μg de DNA foram utilizadas 2 a 3 unidades de enzima. Os io produtos de digestão foram incubados de 4 a 12 horas e depois separados por eletroforese em gel de agarose.

Os fragmentos de DNA foram excisados do gel de agarose após a separação eletroforética e purificados utilizando-se o kit “DNA Purification System" (Promega) e procedendo de acordo com as instruções do 15 fabricante.

Exemplo 6 Análise do DNA por Southern blot '

Após separação eletroforética, o DNA foi transferido para uma membrana de nylon Biodyne B (Invitrogen) usando a técnica de 20 transferência alcalina seguindo os ensinamentos de Sambrook et al., 1989. Resumidamente, a técnica consiste em utilizar uma solução desnaturante (NaOH 0,4 M) que, por capilaridade, transfere o DNA do gel de agarose para a membrana. No caso do DNA genômico, é necessária a depurinação prévia do DNA com uma solução de HCI 0,25M. Após a transferência, o 25 DNA foi fixado pela secagem da membrana que foi guardada à temperatura ambiente até a sua utilização.

Exemplo 7 Obtenção das sondas usadas na hibridização

As sondas foram marcadas através do kit “Random Primer Labelling System” (Invitrogen) onde há inserção de [a32P]dATP na seqüência da fita de DNA molde sintetizada através da atividade de polimerase da enzima Klenow e da presença de primers hexaméricos aleatórios. A reação foi 5 realizada de acordo com as instruções do fabricante do kit, como a seguir resumido: - 30 ng de DNA, em um volume final de 25 μl, foram desnaturados a 100°C por 10 minutos e depois colocados no gelo; - foram adicionados 2 μl de dCTP, 2 μl de dGTP e 2 μl de dTTP; 15 μl de io tampão; 3 μl de [oc32P]dATP e 1 μl de Klenow; - a reação foi incubada por 3 horas a 25°C e parada pela adição de 5 μl de tampão de parada e os produtos resultantes (sondas) foram mantidos a -20°C.

As sondas foram purificadas por cromatografia em coluna Sephadex 15 G-50 (Sambrook et al., 1989) e a incorporação radioativa foi confirmada por cintilografia. As sondas foram usadas dentro dos limites de concentração de 1 a 2 x 106 cpm/ml de solução de hibridização, sendo que as atividades específicas obtidas foram sempre acima de 108 cpm/μg de DNA.

Exemplo 8 20 Hibridização

As membranas foram pré-hibridizadas durante 4 horas a 65°C em solução de SDS 0,5%, Solução de Denhart 5X e 100 μg/ml de DNA de salmão conforme instruções do fabricante da membrana Biodyne B (Invitrogen). 25 As sondas desnaturadas foram adicionadas à solução e a hibridização prosseguiu por mais 18 horas a 65°C. As lavagens das membranas foram realizadas com graus crescentes de estringência para remover sondas não ligadas à membrana.

Foram feitas duas lavagens com SSC2X/SDS a 0,1% a 65°C por 15 minutos, seguidas de duas lavagens com SSC0,1X/SDS a 0,1% a 65°C por 15 minutos. As membranas úmidas foram envolvidas em filme plástico de PVC e expostas em cassete metálico com filme (Kodak T-MAT) sensível a 5 raios X a 80°C. A exposição variou de 12 horas a 7 dias e, em seguida, o filme foi revelado.

Em alguns casos as membranas foram des-hibridizadas com solução contendo formamida a 50% (v/v), SSC2X, SDS a 1% (p/v) a 68°C por 12 horas; seguindo-se de uma lavagem rápida com SSC0.1X/SDS a io 0,1% para remover a formamida. A membrana foi mantida a 4°C até o momento de sua utilização.

Exemplo 9 PCR e amplificação de seqüências de kDNA e DNA nuclear de T. cruzi

As amplificações de seqüências de kDNA e de DNA nuclear de T. 15 cruzi foram realizadas utilizando os primers específicos anteriormente mencionados, ou seja as seqüências de primers S34 (5' ACA CCA ACC CCA ATC GAA CC 3'); S35 (5' ATA ATG TAC GGG (T/G)GA GAT GC 3'); S36 (5' GGT TCG ATT GGG GTT GGT G 3') e S67 (5' GGT TTT GGG AGG GG(G/C) (G/C)(T/G)T C 3') para a amplificação do kDNA de T. cruzi 20 (Sturm et al., 1989) e TcZ1 (5' GAG CTC TTG CCC CAC ACG GGT GCT 3') e TcZ2 (5' CCT CCA AGC AGC GGA TAG TTC ACG 3') para a amplificação do DNA nuclear de T. cruzi (Moser et al., 1989).

As amplificações foram padronizadas nas seguintes condições: foram utilizados 100 ng de DNA de macrófago (template) e os reagentes do kit de 25 PCR da Invitrogen; tampão de reação (KCI 50 mM, Tris-HCI 10 mM pH 9,0 e MgClz 1,5 mM), 100 ng de cada primer, dNTPs 0,2 mM e 2,5 unidades de Taq DNA polimerase. Foram incluídos em todas as reações os devidos controles, negativo e positivo, no qual foi usada a quantidade de 100 pg de DNA total de T. cruzi Berenice. Todas as reações de PCR foram realizadas.. 30 no termociclador modelo PTC-100 da MJ Research seguindo o seguinte ' programa: 94°C/5 minutos 32 ciclos (94°C/30 segundos, Tm°C do primer/1 minuto, 72/1 minuto) 72°C/7 minutos 5 4°C

As reações de PCR foram feitas em triplicata e os produtos amplificados foram visualizados após eletroforese em gel de agarose a 1 % corado com 0,5 mg/ml de brometo de etídio. Em seguida, esses produtos amplificados foram transferidos para uma membrana de nylon e hibridizados io com sondas específicas.

Exemplo 10 Ensaios de inibição da integração do kDNA de T. cruzi em células hospedeiras usando drogas específicas

Nos ensaios de inibição com drogas específicas, as suspensões de 15 tripomastigotos de T. cruzi e macrófagos (na proporção de 5:1) em meio mínimo essencial de Dubecco (DBME) contendo uma concentração definida de uma droga inibidora foram mantidas à temperatura ambiente por 30 minutos antes de serem misturadas e incubadas em atmosfera de CO2 a 5% a 37°C. As culturas de macrófagos com infecção intracelular por T. cruzi 20 tiveram o mesmo crescimento da cultura isenta de parasito. As células cultivadas foram colhidas em várias ocasiões e, após três lavagens com PBS, foram usadas para extração de DNA. Nos experimentos controle, foi •-< usado DNA extraído de macrófagos não-infectados e. DNA de epimastigotos de T. cruzi. 25 Crescimento dos parasitos: Tripomastigotos de T. cruzi pertencentes ao arquétipo Berenice foram cultivados a partir da linhagem de células músculàres de murino (L6) cultivadas em DMEM, pH 7,2, com FBS a 10%, 100 Ul/ml de penicilina, 100 28/30 μg/ml de estreptomicina e L-glutamina 250 nM sob CO2 a 5%, a 37°C. As formas epimastigotas de T. cruzi foram crescidas em meio axênico de triptose de infusão de fígado, a 27°C. As formas do parasito foram colhidas na fase de crescimento exponencial.

5 Infecção dos macrófagos:

Os tripomastigotos de T. cruzi infecciosos colhidos do sobrenadante de cultura de células musculares foram usadas para infectar macrófagos da linhagem U937 em uma razão de 5:1 que resultou em parasitismo com sobrevivência das células fagocitadas (Teixeira, A.R., Arganaraz, E.R., io Freitas, L.H. Jr., Laçava, Z.G.M., Santana, J.M. e Luna, H. (1994). Possible integration of Trypanosoma cruzi kDNA minicircles into the host cell genome by infection. Mutat. Res. 305: 197-209). Quatro semanas após, as culturas de macrófagos infectados com T. cruzi apresentando ausência de T. cruzi sobrenadante no meio de cultura foram, posteriormente, observados após 15 sucessivas passagens e monitorados por co-cultivo em meio axênico e por sub-inoculação em camundongos desmamados. A erradicação da infecção foi confirmada por PCR e hibridização Southern com primers e sondas específicos.

Tratamento dos macrófagos com inibidores específicos:

A concentração ótima para cada droga específica foi determinada em ensaios de dose resposta mostrando ausência ou mínimo efeito citopático, tanto para dividir as formas epimastigotas de T. cruzi quanto para os macrófagos U937. A concentração final de cada inibidor em meio DBME foi como se segue: AZT, 36,7 μM; Br-dU, 100 μM; camptotecina, 50 μM; 25 colchicina, 50 μM; ciclo-heximida, 5 μM; etoposide, 50 μM; genisteína, 10 (4',5,7-tri-hidroxiisoflavona);1-[N,0-bis[5-isoquinolina-sulfonil]-N-metil-L- tirosil]-4-fenil piperazina, 15 nM; 1-(5-isoquinolina-sulfonil) piperazina, 70 nM; microcistina LR, 12,5 μM; mitomicina C, 10 μM; nevirapina, 37 μM; ofloxacina, 30 μM e estaurosporina, 100 nM. As células cultivadas foram 30 coletadas em várias ocasiões e, após três lavagens em PBS, foram usadas 29/30 para a extração de DNA.

Exemplo 11

Validação dos resultados de inibição da integração do kDNA de T. cruzi em células hospedeiras usando drogas específicas 5 A validação dos resultados do exemplo anterior foi realizada em experimentos destinados a avaliar a toxicidade da dose usada como inibidora da divisão de amastigoto intracelular. O procedimento consistiu de incubação de 106 formas tripomastigotas de T. cruz/* infecciosas, não- divididas com dose ótima de um inibidor, por 30 minutos à temperatura io ambiente, antes de serem usadas para infectar monocamadas de células musculares L6 crescidas em poços de uma placa de 24 poços. Os tripomastigotos que entraram nas células musculares se diferenciaram em amastigotos, os quais sofreram multiplicação por fissão binária. O número de amastigotos dentro das células musculares foi contado com o auxílio de 15 um microscópio Carl Zeiss Axiophot sob ampliação de 800X. No quarto dia pós-infecção, as células na superfície dos poços foram fixadas com etanol e coradas com azul de metileno ou de Giemsa. Os resultados dessas avaliações mostraram que a ciclo-heximida inibiu a divisão de amastigotos intracelular em uma razão de 5 vezes. No entanto, a microcistina, Br-dU e 20 mitomicina C reduziram a razão da divisão de amastigotos em células musculares por aproximadamente um-terço e a colchicina interferiu minimamente com o crescimento intracelular. Por outro lado, os inibidores de fosforilase e de polimerase não apresentaram efeito na relação de divisão de amastigotos presentes no citoplasma de células musculares L6. 25 Esses resultados mostram que a ausência dos fragmentos de kDNA de 1,2, 1,8 e 2,2 kb é devida ao efeito inibidor de fosforilase, polimerase, mitomicina C ou colchicina e, portanto, não devem estar associados com a toxicidade que evitaria o crescimento do parasito intracelular.

Exemplo 12

Foi feita a inoculação do T. cruzi em macrófagos humanos tratados com concentrações micromolares de inibidores de vias de sinalização associadas com integração de kDNA: AZT, ofloxacina e genisteina. Nos experimentos controle “mock”, os macrófagos foram tratados com as drogas bromodeoxiuridina e camptotecina. Finalmente, o controle positivo foi 5 representado pelo DNA do T. cruzi, enquanto o controle negativo foi representado pelo DNA do macrófago humano normal.

Claims

1. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA caracterizada por compreender como ingredientes: (i) pelo menos uma substância com atividade antiparasitária selecionada do grupo: benzonidazol, nifurtimox, posaconazol, ravuconazol e TAK-187. (ii) pelo menos um inibidor de vias metabólicas com atuação no impedimento da integração do kDNA de um dos protozoários pertencentes à família Trypanosomatidae no genoma do hospedeiro selecionado do grupo: ofloxacina, genisteína, AZT, nevirapina, delavirdina, efavirenz, ciclo-heximida (3-[2- (3,5-dimetil-2-oxociclo-hexil)-2-hidroxietil]-glutarimida e actinomicina D.

2. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, de acordo com a reivindicação 1 caracterizada pelos componentes ativos estarem na faixa de concentração entre 25 a 100 mg do princípio ativo/kg de peso corporal.

3. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, de acordo com as reivindicações 1 e 2, caracterizada pelo fato de que o inibidor de vias metabólicas com atuação no impedimento da integração do kDNA de T. cruzi no genoma do hospedeiro evita a formação dos fragmentos dos marcadores específicos de 1,2, 1,8 e 2,2 kb oriundos da clivagem do DNA do indivíduo infectado por T. cruzi com a enzima de restrição NsiI ou EcoRI.

4. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA caracterizada por compreender como ingredientes: (i) pelo menos uma substância com atividade antiparasitária selecionada do grupo: pentamidina, suramin, DB 289, melarsoprol, efornitina e nifurtimox; (ii) pelo menos um inibidor de vias metabólicas com atuação no impedimento da integração do kDNA de um dos protozoários pertencentes à família Trypanosomatidae no genoma do hospedeiro selecionado do grupo: ofloxacina, genisteína, AZT, nevirapina, delavirdina, efavirenz, ciclo-heximida (3-[2- (3,5-dimetil-2-oxociclo-hexil)-2-hidroxietil]-glutarimida e actinomicina D.

5. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelos componentes ativos estarem na faixa de concentração entre 25 a 100 mg do princípio ativo/kg de peso corporal.

6. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, de acordo com as reivindicações 4 e 5, caracterizada pelo inibidor de vias metabólicas impedir a integração do kDNA de T. brucei no genoma do hospedeiro.

7. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA caracterizada por compreender como ingredientes: (i) pelo menos uma substância com atividade antiparasitária selecionada do grupo: estibogluconato de sódio, antimoniato de meglumina, anfotericina B, anfotericina B lipossômica, pentamidina, miltefosina, paromomicina, sitamaquine e imiquimod; (ii) pelo menos um inibidor de vias metabólicas com atuação no impedimento da integração do kDNA de um dos protozoários pertencentes à família Trypanosomatidae no genoma do hospedeiro selecionado do grupo: ofloxacina, genisteína, AZT, nevirapina, delavirdina, efavirenz, ciclo-heximida (3-[2- (3,5-dimetil-2-oxociclo-hexil)-2-hidroxietil]-glutarimida e actinomicina D.

8. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelos componentes ativos estarem na faixa de concentração entre 25 a 100 mg do princípio ativo/kg de peso corporal.

9. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, de acordo com as reivindicações 7 e 8, caracterizada pelo inibidor de vias metabólicas impedir a integração do kDNA de Leishmania sp no genoma do hospedeiro.

10. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, de acordo com as reivindicações de 5 1 a 3, ou de 4 a 6, ou de 7 a 9, caracterizada por compreender ao menos um excipiente farmaceuticamente aceitável.

11. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, de acordo com a reivindicação 10, caracterizada por estar em uma forma farmacêutica apropriada, tal como as de uso oral, sólida ou líquida; formulação de aplicação tópica, tal como 10 pomada, creme, gel ou ainda pode ser uma formulação de aplicação parenteral (incluindo subcutânea, intradérmica, intramuscular e intravenosa).