BRPI0507554B1 - meio de cultura para a produção de fungos filamentosos - Google Patents
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Abstract
meio de cultura para a produção de fungos filamentosos e dexscrito um meio de cultura para fungos filamentosos compreendendo pelo menos uma fonte de carbono escolhida do grupo consistindo em melaço, extrato de malte e sacarose e pelo menos uma fonte de nitrogênio orgânico escolhida de extrato de levedura e milhocina; é também desrito um método para a produção de fungos filamentosos, em particular fungos nematófagos, em escala industrial, compreendendo a etapa de semeadura de conídios de tais fungos no meio de cultura mencionado acima e mantendo- tal meio de cultura a uma temperatura de 23-30<198> por umtempo de 5-10 diaas para se obter a reprudução e crescimento dos fungos.
Description
MEIO DE CULTURA RARA A PRODUÇÃO DE FUNGOS FILAMENTOSOS
Campo da Invenção A presente invenção refere-se ao campo técnico dos agentes fito-sanitários.
Em particular, a invenção refere-se a um meio de cultura para fungos filamentosos, mais especificamente fungos nematófagos * Estado da Técnica A utilização de microorganismos, e em particular fungos, como agentes fito-sanitários constitui uma prática crescente comum..
Produtos a base fungos sâo já comercializados para o combate a insetos, fungos £1 topatogênicos e outros parasites típicos de agricultura.
Por exemplo, na patente U5 5 011 092, são descritos agentes nematófagos para o combate de nematóides do gênero Meloidogyne, Hetherodera e Di tylesichxts, consistindo em cepas particulares de Arthrobotrys conoides Dreschsler, um fungo filamentoso.
Os nematóides mencionados acima são responsáveis por sérias doenças vegetais e fúngicas e provocam perdas econômicas enormes, na medida em que levam ao comprometimento de 50-70% da colheita. A utilização de fungos nematófagos, como alternativa a produtos químicos antiparasitãrios convencionais {por exemplo, brometo de metila, tricloronitrometano, dicloro-propeno, etc.) para aplicação ao solo antes de seu cultivo ou a carbamatos aplicados diretamente às culturas, permite que sérios problemas, tais como esterilização do solo, destruição do balanço ecológico e toxidez potencial para o homem e animais, sejam evitados.
Fungos nematófagos são, desta forma, particularmente adequados para uso em agricultura orgânica, no entanto ainda apresentam alto custo, como resultado das dificuldades de produzi-los industrialmente em grandes quantidades.
Existe, por esta razão, uma necessidade de tornar os fungos nematófagos menos dispendiosos disponíveis para utilização na agricultura. 0 problema base da presente invenção foi o de prover um meio de cultura para fungos filamentosos e, em particular, para fungos nematófagos, que possibilite a produção destes microorganismos a nível industrial em grandes quantidades e em períodos de tempos curtos, com uma redução consequente no custo do produto final.
Sumário da Invenção Tal problema foi solucionado, de acordo com a invenção, por um meio de cultura para fungos filamentosos compreendendo pelo menos uma fonte de carbono do grupo consistindo em melaço, extrato de malte e sacarose e pelo menos uma fonte de nitrogênio orgânico escolhida entre extrato de levedura e miihocina.
Preferivelmente, a pelo menos uma fonte de carbono mencionada acima constitui de 70 a 85% em peso do peso seco do meio de cultura e a pelo menos uma fonte de nitrogênio orgânico constitui de 15 a 30% em peso do peso seco do meio de cultura. O meio de cultura de acordo com a presente invenção pode incluir também uma fonte de nitrogênio mineral, consistindo em nitratos ou sais de amônio. A fonte de nitrogênio mineral mencionada acima é usualmente adicionada gradualmente ao meio de cultura durante o crescimento dos fungos em. uma quantidade não maior que 10% em peso do peso seco do meio de cultura e usualmente entre 5 e 8% em peso. üma composição preferida do meio de cultura da presente invenção consiste em 75-85% de extrato de malte e 15-25% de extrato de levedura (as percentagens são, como no restante do presente relatório, em peso do peso seco do meio de cultura).
Um outro meio de cultura preferido de acordo com a invenção compreende 60-651 de melaço, 10-15% de sacarose, 10-15% de milhocina e 10-151 de extrato de levedura. Vantajosamente, tal meio de cultura contém, adicionalmente, de 5 a 8% de uma fonte de nitrogênio mineral, em particular hidrogenofosfato de ciiamõnio.
Um meio de cultura adicional preferido de acordo com a presente invenção contém duas fontes de carbono, isto é, extrato de malte, em uma quantidade de 25-30%, e melaço, em uma quantidade de 40-45%, bem como milhocina, em uma quantidade de 25-30%.
Descrição detalhada da invenção A presente invenção será descrita mais adiante com referência a algumas realizações exemplificativas providas com propósitos ilustrativos e não 1imitantes♦ Antes de se proceder com a ilustração de um. exemplo, consideramos como útil prover algumas especificações relativas aos componentes do meio de cultura de acordo com a invenção. 0 extrato de malte e/ou melaço e/ou sacarose são utilizados como fontes de carbono. O extrato de malte é obtido pela germinação de cereais (em geral cevada). Na germinação, são produzidas enzimas especificas (amilases), as quais provocam a conversão do amido em açúcares. 0 extrato de malte contém cerca de 60% de maltose, vitaminas e numerosos micronutrientes.
Os melaço constituem um sub-produto da indústria do açúcar e se apresenta na forma de um líquido viscoso preto ámarronzado, contendo 10% de água, 35% de sacarose, 20% de outros açúcares e 15% de cinzas. 0 extrato de levedura e a milhocina são utilizados como fontes de nitrogênio orgânico. 0 extrato de levedura é obtido pela autólise de Saccharomyces cerevisiae e se apresenta na forma de um pó amarelo pálido fino, facilmente solúvel em água. O extrato de levedura contém peptídeos, aminoácidos livres, purina e bases pírimidínicas, bem como vitaminas solúveis em água do grupo B. 0' extrato de levedura contém um teor de nitrogênio total de 10% e um teor de nitrogênio α-amínico de 5%. A milhocina é obtida através da maceraçào de grãos de milho a 50°C por 24-48 horas em água contendo dióxido de enxofre. Este reagente provoca a desestruturação da rede protéica que circunda os grãos de amido e oferece a vantagem de prevenir o desenvolvimento de microorganismos indesejáveis durante a maceraçào. A milhocina contém um teor de nitrogênio total de 7% e um teor de nitrogênio a- aminico de 1,7% e contém também 5% de açúcares, 4% de potássio, 31 de fósforo e 17% de diferentes minerais. Vários meios de cultura baseados nas fontes de carbono e nitrogênio acima foram testados. Estes meios podem ser classificados nas três classes a seguir: - ciasse 1: meio contendo extrato de malte como a fonte de carbono principal; - classe 2: meio contendo melaço como a principal fonte de carbono; - classe 3: meio no qual a fonte de carbono principal consiste em extrato de malte e melaço. 0 teor percentual da fonte de nitrogênio orgânico do meio de acordo com a invenção pede ser reduzido, substituindo-se parte de tal fonte de nitrogênio orgânico com uma fonte de nitrogênio inorgânico (nitratos ou compostos de amônio), a qual é adicionada gradualmente em pequenas quantidades durante a cultura. Esta adição de nitrogênio inorgânico durante a cultura permite uma melhor nutrição do microorganismo e, no caso de fungos fiiamentosos, o fortalecimento dos filamentos miceliais. A substituição de parte da fonte de nitrogênio orgânico com uma fonte de nitrogênio inorgânico tem também a vantagem de reduzir os custos de produção, na medida em que a fonte de nitrogênio orgânico (extrato de levedura e milhocina) constitui o componente mais dispendioso do meio de cultura de acordo com a invenção. 0 meio de cultura de acordo com a invenção é particularmente adequado para uso na produção de fungos fiiamentosos da família Moniliales. Em particular, nos exemplos apresentados abaixo, foram utilizados os fungos filamentosos Arthrobotrys conoides Dreschsler. Porém, cabe frisar que somente os Exemplos 3 e 4 demonstram a presente invenção, enquanto que os Exemplos 1, 2, 5, 6 e 7 sao apresentados por fins ilustrativos, EXEMPLO 1 Este diz refere-se á classe 1 de meio de cultura. O crescimento de fungos filamentosos foi conduzida em um frasco Erlen de 300 ml, contendo 150 ml de meio de cultura. O meio consiste em 20 g/1 de extrato de malte e 4 g/1 de extrato de levedura e foi esterilizado antes da semeadura com conidios dos fungos em questão. O tempo de cultura foi de 6 dias a partir da semeadura a uma temperatura de cerca de 27°C. A partir do terceiro dia em diante, amostras foram coletadas do meio de cultura para se determinar a massa seca (g/1} e o número de propágulos (CFU/1). De maneira a se determinar a massa seca, 20 ml do meio de cultura foram filtrados e então secados em um forno a 100°C por 24 horas. O número de propágulos foi determinado em 1 ml do meio de cultura.
Um sumário dos resultados obtidos é mostrado na Tabela 1, como se segue.
Tabela 1 EXEMPLO 2 O teste realizado no exemplo 1 foi repetido em um mini-reator de 2 litros contendo 1,2 litros de meio de cultura do exemplo 1. As condições experimentais foram as mesmas do exemplo 1, apenas com a diferença de que a amostragem se iniciou no dia seguinte à semeadura dos conidios, 0 mini-reator em questão é um recipiente com um fundo redondo, provido com um agitador de lâmina, meios de aquecimento e resfriamento, meio de insuflaçao de ar, bem como sondas para a detecção de pH, 0-» e temperatura.
Um sumário dos resultados obtidos ê mostrado na Tabela 2, como se segue.
Tabela 2 Ao final de sete dias de cultura, quase Θ gramas de fungos por litro de meio de cultura são assim obtidos com 6, 08x109 propágulos. EXEMPLO 3 Este se refere a um teste realizado com a classe 2 de meio de cultura A cultura de fungo filamentoso foi realizada em um frasco Erlen de 300 ml, contendo 160 ml de meio de cultura. O meio consistia em 62,5% (por peso) de melaço na base do peso seco do meio de cultura (corresponde a 25 g/1), 12,5% p.p- de sacarose {5 g/1), 12,5% p.p. de milhocina (5 g/1) e 12,5% p.p. de extrato de levedura (5 g/1), e foi esterilizado antes da semeadura com os conídios do fungo em questão. A cultura foi incubada por 6 dias a partir da semeadura a uma temperatura de cerca de 27°C, A partir do terceiro dia em diante, amostras foram coletadas do meio de cultura para se determinar a massa seca (g/1) e o número de propágulos {CFU/1}. De maneira a se determinar a massa seca, 20 ml do meio de cultura foram filtrados e então secados em um forno a 100°C por 24 horas. O número de propágulos foi determinado em um ml de meio de cultura.
Um sumário dos resultados obtidos é mostrado na Tabela 3, como se segue.
Tabela 3 EXEMPLO 4 0 teste realizado no exemplo 3 foi repetido em um miní-reator de 2 litros contendo 1,2 litros de meio de cultura do exemplo 3. As condições experimentais foram as mesmas do exemplo 3, apenas com a diferença de que a amostragem se iniciou no dia seguinte á semeadura dos conídios.
Um sumário dos resultados obtidos é mostrado na Tabela 4, como se segue.
Tabela 4 Os resultados mostrados para os dias a partir do quinto dia parecem anômalos, mas isto é apenas devido a uma concentração excessiva de fungos no meio de cultura, o que não mais permite que amostras homogêneas sejam coletadas. A última amostra foi coletada diretamente do reator.
Neste caso, em sete dias, mais de 10 gramas de fungos por litro de meio de cultura foram obtidos com um teor de propãgulos de 3,77x10’. EXEMPLO 5 Este se refere a um teste realizado com um meio de cultura da classe 3. A cultura do fungo filamentoso foi conduzida em um. frasco Erlen de 300 ml, contendo 150 ml de meio de cultura. O meio consistia em 15 g/1 de melaço, 10 g/1 de extrato de malte e 10 g/1 de milhocina, e foi esterilizado antes da semeadura com conidios do fungo em questão, A cultura foi incubada por 6 dias a partir da semeadura a uma temperatura de cerca de 27°c. A partir do terceiro dia em diante, amostras foram coletadas do meio de cultura para se determinar a massa seca (g/1) e o número de propágulos (CFU/1). De maneira a se determinar a massa seca, 20 ml do meio de cultura foram filtrados e então secados em um forno a 100°C por 24 horas. 0 número de propágulos foi determinado em 1 ml do meio de cultura.
Um sumário dos resultados obtidos é mostrado na Tabela 5, como se segue.
Tabela 5 EXEMPLO 6 0 teste realizado no exemplo 5 foi repetido em um mini-reator de 2 litros contendo 1,2 litros de meio de cultura do exemplo 5. As condições experimentais foram as mesmas do exemplo 5, apenas com a diferença de que a amostragem se iniciou no dia seguinte à semeadura dos conídios.
Um sumário dos resultados obtidos ê mostrado na Tabela 6, como se segue.
Tabela 6 Em sete dias, mais de 10 gramas de fungos por litro de meio de cultura foram obtidos com um teor de propáguios de 2,22x1Qs. EXEMPLO 7 O meio de cultura do exemplo 3 foi modificado como se segue, de maneira a se reduzir o teor das duas fontes de nitrogênio orgânico, as quais sào os componentes mais dispendiosos; 25 g/i de melaço; 5 g/1 de sacarose; 2.5 g/1 de milhocina; 2.5 g/.l de extrato de levedura.
Com tal meio de cultura, uma cultura de teste (A) , utilizando-se o fungo mencionado acima, foi conduzida para comparação com outras duas culturas de teste (B e C), nas quais o mesmo meio de cultura foi utilizado e as quais envolveram adições subseqüentes de uma fonte de nitrogênio mineral a partir do quarto dia em diante.
No teste B, foram adicionados 0,21 g de hidrogenofosfato de diamônio três vezes a partir do quarto dia (mais precisamente no quarto, sexto e oitavo dias), para uma adição total de 0,63 g, e no teste C foram adicionados 0,28 g três vezes, novamente a partir do quarto dia (mais precisamente no quarto, sexto e oitavo dias), para uma adição total de 0,84 g.
Os testes foram conduzidos em frascos Erlen de 500 mi, contendo 300 ml de meio de cultura, esterilizado antes da semeadura dos conídios.
No nono e último dia de cultura, o teor de nitrogênio total do meio de cultura como tal (A) foi igual a 0,85 g/1 enquanto que no meio com adição de hidrogen o fosfato de diamônio (A e B) foi igual a 1,05 g/1 (A) e 1,26 g/1 (B), respect ivamente. A partir do terceiro dia em diante, amostras do meio de cultura foram coletadas a cada dois dias para se determinar a massa seca (g/1) e o número de propágulos (CFU/1). De maneira a se determinar a massa seca, 20 ml do meio de cultura foram, filtrados e então secados em um forno a 10 0 ° C por 24 horas. 0 número de propágulos foi determinado em. 1 ml do meio de cultura.
Um sumário dos resultados obtidos é mostrado na Tabela 7, como se segue.
Tabela 7 MS = massa seca {g/1) CFU - propágulos/1 Como pode ser observado a partir da tabela mostrada acima, a adição de uma fonte de nitrogênio mineral, especialmente quando em pequena quantidade (teste B) , produz um aumento considerável ria massa seca a ser obtida, a partir do sétimo dia de cultura, e um aumento de mais de 100% no número de propágulos a ser obtido no mesmo tempo de cultura.
Claims (5)
1. Meio de cultura para fungos filamentosos, caracterizado pelo fato de compreender 60-651 de melaço, 10-15% de sacarose, 10-15% de milhocina, e 10-151 de extrato de levedura,
2. Meio de cultura, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de compreender adicionalmente 5 a 8% de uma fonte de nitrogênio mineral.
3. Meio de cultura, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que referida fonte de nitrogênio mineral consiste de hidrogenofosfato de diamônio.
4.
Método para a produção de fungos filamentosos, em particular, fungos nematófagos em escala industrial, caracterizado pelo fato de compreender a etapa de semeadura de conídios dos ditos fungos em um meio de cultura de acordo com a reivindicação 1, e manter-se dito meio de cultura a uma temperatura de 23-30eC por um tempo de 5-10 dias para se obter a reprodução e crescimento dos fungos.
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