BR102022013195A2 - Bioinoculante de origem fúngica promotor da germinação de sementes e enraizamento de plantas - Google Patents

Abstract

bioinoculante de origem fúngica promotor da germinação de sementes e enraizamento de plantas. o presente pedido de patente se refere ao uso de biomolécula tensoativa (biossurfactante) produzido pelo fungo filamentoso absidia cylindrospora var. cylindrospora ucp 1301 isolado do meio de cultura alternativo e de baixo custo, como bioinoculante para aplicação na indução da germinação de sementes e enraizamento de lactuca sativa l. as sementes de l. sativa apresentam dificuldades no processo de germinação, sendo descrito que necessita da exposição à luz em comprimentos de onda na faixa de 400 a 660 nm. contudo, esses efeitos de luz ainda são considerados confusos para alface, e a aplicação de diodos emissores de luz (leds) na horticultura está em constante expansão, porém com elevados custos, além do consumo de energia da fonte de iluminação, quando aplicados na horticultura. no entanto, o uso do biossurfactante demonstraram que a biomolécula tensoativa foi capaz de estimular a germinação de 99% de sementes de alface (lactuca sativa) e também com ação específica no índice de geminação, apresentando uma resposta significativamente diferente (p<0,05) na concentração de 25% da concentração micelar crítica (cmc) do biossurfactante, quando comparado ao controle. portanto, o biossurfactante pode ser considerado como um bioinoculante indutor da germinação e do crescimento radicular. esta invenção demonstra pela primeira vez, que o biossurfactante produzido por absidia cylindrospora var. cylindrospora ucp 1301 é capaz de induzir a germinação de sementes de lactuca sativa l., e promover o crescimento radicular do vegetal.

Description

Campo da Invenção

[001] O presente pedido de patente de invenção trata de um surfactante natural eco sustentável, caracterizado como lipopetídeo biossintetizado pelo fungo filamentoso Absidia cylindrospora var. cylindrospora UCP 1301, com efeito indutor na germinação de sementes de Lactuca sativa L. Este bioproduto consiste em uma biomolécula, com propriedade tensoativa que atua acelerando o processo de germinação, de sementes com dificuldades de germinação e no processo de enraizamento. Este biossurfactante apresenta função de bioinoculante, tendo como vantagem perpetuar as melhores condições para germinação em tempo reduzido, contribuindo fortemente para acelerar o enraizamento, em especial, para espécies economicamente importantes com dificuldades de enraizar.

Antecedentes da Invenção

[002] Surfactantes inclui uma grande variedade de compostos, tanto sintéticos como biológicos (biossurfactante), como substâncias microbianas valiosas, de superfície ativas e biologicamente eficientes, que possuem várias propriedades distintas em comparação com os tensoativos sintéticos, incluindo condições de produção suaves, multifuncionalidade, maior biodegradabilidade e menor toxicidade (Gayathiri, E. et al. Agronomy, v.12, n.662, p.1-35, 2022). Os biossurfactantes podem ser produzidos por micro-organismos, como bactérias, leveduras e fungos filamentosos (Jahan, R. et al. Advance Colloid Interface Science, v. 275, Article ID 102061, 2020).

[003] Biossurfactantes são metabólitos secundários de origem microbiana de baixo peso molecular, apresentando uma porção hidrofílica (cabeça), constituída de açúcares, aminoácidos, ácido graxo e grupos funcionais, como ácidos carboxílicos (Gayathiri, E. et al. Agronomy, v.12, n.662, p.1-35, 2022). Estas moléculas são de caráter anfifílico, contendo uma porção do seu arranjo, uma cauda hidrofóbica ligada à cabeça hidrofílica, que lhes permitem existir em a interface entre meios polares e não-polares (Jahan, R et al. Advance Colloid Interface Science, v. 275, Article ID 102061, 2020). Os biossurfactantes são conhecidos pela sua excelente atividade de superfície que consiste na redução da tensão superficial e interfacial entre diferentes fases (ar-líquido, líquido-líquido e sólido-líquido); possuindo baixa concentração micelar crítica (CMC) e emulsões estáveis (Uzoigwe, C. et al; Frontiers Microbiology, v. 6, p. 245, 2015).

[004] A escolha por biossurfactantes ecológicos ao contrário dos surfactantes sintéticos é devido a relevantes propriedades como biodegradabilidade, baixa toxicidade, compatibilidade ambiental, maior especificidade, mais eficazes em condições ambientais extremas e pela produção a partir de fontes renováveis (Ayed, H.B. et al. Biodegradation, v. 30, no. 4, p. 273-286, 2019).

[005] Estas biomoléculas atuam em vários setores industriais, como na indústria têxtil, alimentícia e farmacêutica, e principalmente, na biorremediação, na recuperação melhorada do petróleo e em uma grande variedade de aplicações, como na área da agricultura como bioinoculantes, biodefensivos e indutores de crescimento vegetal (Sharma, R.; Oberoi, H. S.; Recent advances in Applied Microbiology, p. 55-88, 2017; Park, T. et al. Energy and Fuels, v.33, n. 6, p.4909-4920, 2019). No campo da agricultura, de um modo geral, os biossurfactantes são utilizados no processo de hidrofilização de solos, no sentido de promover solubilidade, possibilitando dessa forma uma distribuição uniforme do fertilizante no solo (Ijaz, M. et al; Microbiome in Plant Health and Disease, p. 421-446, 2019). Os biossurfactante também podem atuar no processo de biodegradação de defensivos químicos e poluentes possibilitando qualidade do solo agrícola, além de atuas na promoção indireta do crescimento das plantas, considerando que essas biomoléculas possuem atividade antimicrobiana, e no aumento da interação micro-organismo-vegetal em benefício para a planta (A. Sarwar, A. et al. PLoS One, v.13, Article ID e0198107, 2018; Toral, L. et al. Frontiers in Microbiology, v.9, p.1315-1412, 2018).

[006] O termo "biofertilizante"é em muitos países em desenvolvimento, muito utilizado, contudo, em outros países, o termo "bioinoculante"é denominado para agentes biológicos que promovem o crescimento das plantas. Portanto, em ambos os casos, esses bioprodutos são baseados na sua origem microbiana ou metabólitos produzidos por via microbiana (Ijaz, M. et al; Microbiome in Plant Health and Disease, p. 421-446, 2019). Estes agentes biológicos melhoram a biodisponibilidade de minerais essenciais, desse modo, aumentam a fertilidade do solo e subsequente absorção de nutrientes pelas plantas (Ijaz, M. et al; Microbiome in Plant Health and Disease, p. 421-446, 2019; Maitra, S. et al. Microorganisms, v.10, n.51, p. 1-35, 2022).

[007] Prevê-se que o mercado global de biofertilizantes testemunhe um CAGR de 12,1% durante o período de previsão (2022-2027). Devido à pandemia do COVID-19, ocorreu uma interrupção na cadeia de suprimentos por causa do setor agrícola que teve de enfrentar problemas como indisponibilidade de mão de obra, barreiras de transporte, restrição de acesso ao mercado e falta de estoques em algumas regiões, afetando levemente o crescimento do mercado de biofertilizantes. O aumento da prática da agricultura orgânica, a necessidade de melhorar a matéria orgânica do solo e a estrutura regulatória favorável são os principais fatores que impulsionam o mercado, o qual propõe também que os bionoculantes sejam entregues com segurança para a planta ou dentro do corpo da planta e ainda, que tenham mecanismos eficientes para promover o crescimento das plantas e ou destruição de pragas específicas (Ijaz, M. et al; Microbiome in Plant Health and Disease, p. 421-446, 2019).

[008] Com o advento de programas de manejo integrado de pragas que promovem o uso de biofertilizantes, espera-se que o setor agrícola presencie um aumento no uso de biofertilizantes. A maioria dos países europeus e norte- americanos e alguns asiáticos estabeleceram regulamentações adequadas para controlar o uso de produtos químicos sintéticos para proteção de cultivos e, portanto, criar um ecossistema de negócios promissor para biofertilizantes. Os governos de muitos países estão fornecendo vários esquemas para incentivar os fabricantes de biofertilizantes e estão tomando várias iniciativas para mudar as práticas agrícolas convencionais para as práticas agrícolas orgânicas. Portanto, espera-se que o aumento da adoção da agricultura orgânica e um ambiente regulatório favorável impulsionem o crescimento do mercado estudado durante o período de previsão (Global Market, 2021).

[009] Nos Estados Unidos, os fertilizantes micorrízicos são os mais usados em hortaliças. O setor de hortaliças é o setor que mais cresce na horticultura canadense. Em 2019, houve um total de 838 operações comerciais de hortaliças com 17,6 milhões de metros quadrados de área de produção. O uso de fungos micorrízicos provou aumentar os rendimentos e proporcionar condições sustentáveis de crescimento em sistemas de produção orgânica e hidropônicos. Assim, os biofertilizantes podem ser uma opção viável para os produtores em estufas. Da mesma forma, um aumento no consumo de nutrição vegetal de base biológica nos últimos dois anos foi observado no México. Rhizobium e Mycorrhizasão os biofertilizantes populares utilizados no país devido ao custo- benefício dessas soluções de base biológica. Portanto, com a crescente demanda por soluções agrícolas econômicas e novas tecnologias inovadoras para produzir biofertilizantes, espera-se que o mercado de biofertilizantes cresça significativamente nos próximos períodos (Global Market, 2021).

[0010] Nas bioformulações, as células bacterianas ou metabólitos microbianos devem ser capazes de tolerar diversos fatores desfavoráveis. Em situações como dessecação e ambientes com temperaturas elevadas, os bioinoculantes devem suportar elevadas taxas de viabilidade e ter eficiência no desenvolvimento das plantas por longos períodos (Ijaz, M. et al; Microbiome in Plant Health and Disease, p. 421-446, 2019). E ainda, a aplicação consorciada de diferentes micro-organismos como promotores de crescimento de plantas, com metabólitos isolados apresenta efeitos sinérgicos importantes para o desenvolvimento e a produtividade da planta (Ijaz, M. et al; Microbiome in Plant Health and Disease, p. 421-446, 2019; Maitra, S. et al. Microorganisms, v.10, n.51, 1-35, 2022).

[0011] Formulações eficientes devem conter metabólitos microbianos que não apenas aumentam a eficiência e o prazo de validade, mas também, demonstrem ser compatíveis com o meio ambiente (Ijaz, M. et al; Microbiome in Plant Health and Disease, p. 421-446, 2019). Os metabólitos produzidos por biossintése incluem protetores, adjuvantes, estimulantes, antimicrobianos, promotores de enraizamento e crescimento vegetal, os quais estão sendo implementados em diferentes indústrias em diferentes regiões no mundo. Estas bioformulações serão mais efetivas, quando os possíveis problemas relacionados à mudanças climáticas e distintas regiões geográficas (Ijaz, M. et al; Microbiome in Plant Health and Disease, p. 421-446, 2019; Maitra, S. et al. Microorganisms, v.10, n.51, 1-35, 2022).

[0012] Neste cenário, as plantas desenvolvem com notáveis capacidades de regeneração e propagação. As plantas podem propagar sexualmente e vegetativamente/assexuadamente devido à sua capacidade de desenvolver raízes adventícias (RAs) de órgãos aéreos, o que leva ao desenvolvimento de novas plantas clonais geneticamente idênticas (Lakehal, A.; Bellini, C.; Physiol Plant, v. 165, p. 90-100, 2019). Assim, a propagação vegetativa ou clonal é explorada na horticultura e viveiros florestais para produzir muitos clones, de forma relativamente rápida.

[0013] No entanto, para algumas espécies economicamente importantes, são difíceis enraizar nessas condições de viveiros (Lakehal, A.; Bellini, C.; Physiol Plant, v. 165, p. 90-100, 2019; Vieira, C.S.S. et al. J. Toxicol. Environ. Health, Part A, v.85, n.14, p. 561-572, 2022). A exemplo, espécies como Eucalyptus e Pinus a taxa de desenvolvimento de RA sem aplicações exógenas de fitohormônios é muito baixa (Lakehal, A.; Bellini, C.; Physiol Plant, v. 165, p. 90100, 2019). Contudo, não está ainda esclarecido a grande variedade de plantas não apresentar uma capacidade de formar RAs. Entretanto, torna-se evidente que os processos metabólicos que regulam a iniciação de formação de RAs estão integrados aos efeitos fitohormonais, ligados à produção de auxina, como o fator principal, porém, e possível que uma variedade de outros fito-hormônios funcione por meio de complexas interações, modulando os níveis de biossíntese, metabolismo, transporte e sinalização (Lakehal, A.; Bellini, C.; Physiol Plant, v. 165, p. 90-100, 2019).

[0014] Os estados da técnica no campo patentário concebem menção a inoculantes para uma grande variedade de aplicabilidade em culturas agrícolas e especificamente para germinação e enraizamento, apresentando diferenças quanto a aplicação da tecnologia descrita na presente invenção, bem como a origem do produto.

[0015] O documento BR 10 2016 000130 7 A2 relata a invenção que compreende um inoculante em forma de gel, contendo a bactéria B. megaterium inserida em CMC e amido, para uso em solos agricultáveis, proporcionando a disponibilização do fósforo, contribuindo para promoção do crescimento do vegetal de interesse. Refere-se a um composto com a finalidade de induzir ao aumento da quantidade de fósforo disponível para absorção pelas plantas a partir do solo. A invenção permite a introdução de uma estirpe de Bacillus megaterium strain10 acessos GI:952025480 no solo, que tem o efeito de aumentar a solubilidade de fosfatos que podem ser nativos no solo ou adicionados a ele, na forma de fosfato de rocha, de fosfato insolúvel ou fertilizante industrializado. A invenção é utilizada para aumentar as taxas de crescimento e o rendimento das culturas. Contudo, o presente pedido de patente diferencia da presente invenção por utilizar um metabólito microbiano isolado de elevada compatibilidade de indução da germinação e ao enraizamento de sementes com dificuldades de germinar.

[0016] O documento PI 0205800-6 B1 trata-se de a uma composição sinergística útil como bioinoculante, a referida composição compreendendo cepas bacterianas de acessão N°s. NRRL B30486, NRRL B-30437 e NRRL-B 301488, individualmente, ou em todas as combinações possíveis, e opcionalmente veículo, com cada uma das cepas mostrando atividade promotora de planta, atividade de controle dos fungos fitopatogênicos, capacidade de tolerar condições de tensão abiótica, capacidade de solubilização de fosfato sob condições de tensão abiótica. Adicionalmente, o método de produzir e isolar as referidas cepas bacterianas difere do presente pedido de patente que consiste em aplicar um bioproduto de origem microbiana na germinação e na indução do enraizamento de plantas com dificuldades de enraizar.

[0017] O documento BR 10 2019 016288 0 A2 menciona um inoculante biológico com atividade fertilizante e fungicida. E descrito que um bioinoculante deve possuir os referidos efeitos combinados, compreendendo o uso de Bradyrhizobium japonicum e isolados específicos do gênero Trichoderma. O bioinoculante quando aplicado em lavouras de soja têm a função de prevenir doenças transmitidas por fungos. Mais particularmente, o bioinoculante da invenção é útil para proteger as culturas de soja contra a infecção por Fusarium sp., Colletotrichum sp., Cercospora sp., Sclerotinia sp. e Rhizoctonia sp. Este documento difere do presente pedido de patente por apresentar um produto formulado com fontes sintéticas e onerosas para indução de enraizamento.

[0018] O documento BR 10 2012 016934 7 B1 descreve a aplicação de uma suspensão bacteriana endofítica e/ou rizosférica isolada a partir de uma planta e do solo rizosférico, para indução do enraizamento de mudas micropapagadas de bananeira. O inoculante descrito difere do produto bioinoculante proposto no presente pedido de patente, consistindo em uso de fungo filamentoso com potencial de produção de biossurfactante com ação indutora da germinação de sementes e promotora do enraizamento de plantas difíceis de enraizar.

[0019] O documento BR 10 2020 009375 4 A2 descreve a presente invenção de um processo para a produção de um bio-inoculante acrescido de regulador vegetal, da classe das auxinas, utilizando um meio de cultura de baixo custo, com base em resíduos agroindustriais disponíveis como a milhocina, e o subproduto do processo de produção de biodiesel, o glicerol, como fontes de nitrogênio e carbono para o crescimento microbiano. Mais especificamente, a presente invenção refere-se a um meio e um processo para a produção de bio- inoculantes e um regulador de crescimento vegetal da classe das auxinas, o ácido indol-3-acético, a partir de espécies de Enterobacter sp., Bacillus megaterium e Paenibacillus polymyxa, e à composição resultante que é promotora de crescimento vegetal. A presente invenção difere do bioinoculante, considerando que no presente pedido de patente, consiste no uso apenas de bactérias na produção de bioinoculante, além do uso associado do ácido indol- 3-acético.

Descrição da Invenção

[0020] A presente invenção baseia-se em um método eficaz e economicamente viável e atrativo para promoção da germinação e enraizamento de estacas de Lactuca sativa L. ramosissima, através do contato desta planta com o biossurfactante produzido por Absidia cylindrospora var. cylindrospora UCP 1301 provavelmente, na indução da síntese de fitohormônios.

[0021] O biossurfactante isolado de A. cylindrospora var. cylindrospora UCP 1301 foi produzido em meio de cultura contendo fontes naturais e alternativas de carbono e nitrogênio, e de baixo custo, constituído de milhocina, subproduto agroindustrial do milho, proveniente do processamento do milho, e por glicerol bruto, proveniente do excedente da produção de biodiesel.

[0022] A Tabela 1 representam o biossurfactante produzido por Absidia cylindrospora var. cylindrospora UCP 1301 isolado, liofilizado e caracterizado.

[0023] A coleta e o preparo do material vegetal foram realizados da seguinte forma: sementes de Lactuca sativa foram adquiridas do comércio na área da agricultura.

[0024] Os testes de bioensaio foram realizados usando placas de Petri de 100 x 15 mm e uma camada de papel filtro. Em cada placa, sobre o papel umedecido com 5 ml da solução teste, foram colocadas vinte sementes de Lactuca sativa, intactas e de tamanho quase idêntico (Priac et al, 2017) de cada solução teste (pH ~ 7,0), com fotoperíodo de 12 h e a 25 ± 1 °C, durante sete dias. A cada dois dias eram adicionados mais 5 ml de água destilada para evitar a dessecação [(Tigre et al. 2012- (Tigre, R. C. et al. Ecotoxicol. Environ. Safety, v.84, p. 125132, 2012)]; Rede et al. 2019- (Rede, D. et al. Total Environment^. 673, p. 102109, 2019.). Para cada concentração testada são realizadas cinco réplicas. Como controle usando água destilada.

[0025] O delineamento experimental utilizado foi o de blocos ao acaso, com quatro tratamentos (bandejas) com 100 células, com (repetições), totalizando 400 unidades experimentais.

[0026] Observou-se que a germinação das sementes ocorreu até 24 horas. As sementes foram avaliadas quanto aos seguintes parâmetros: Índice de Germinação, Alongamento Relativo da Radícula, Alongamento Relativo do Hipocótilo e Ganho Relativo de Biomassa.

[0027] Os valores do Índice de Geminação divididos em três categorias de acordo com os efeitos de toxicidade observados: inibição do alongamento da raiz, 0 < RGI < 0,8; não significativo seguindo os efeitos, 0,8 < RGI < 1,2; e estimulação do alongamento radicular, RGI > 1,2 (Young et al. 2012, Lumbaque et al 2016). O Índice de Geminação apresentou resposta significativamente diferente (p<0,05) na concentração de 25% da CMC, mas não nas demais, quando comparado ao controle, sendo considerado indutor do crescimento radicular (Figura 1).

[0028] Com relação ao crescimento da parte aérea nenhuma das concentrações testadas apresentou diferença significativa. As amostras tratadas com concentração de 100% da CMC apresentaram ganho de biomassa significativo (p<0,05), mesmo que não tenha sido verificado a indução do alongamento da raiz ou hipocótilo.

[0029] A FIGURA 1 apresenta o bioinoculante e demonstra a indução da germinação de semente e enraizamento pela ação do bioinoculante de Lactuca sativa L. com os resultados de todos os tratamentos propostos, ou seja, germinação e enraizamento.

[0030] A TABELA 2 representa os valores obtidos do Índice de Germinação, Alongamento Relativo da Radícula, Alongamento Relativo do Hipocótilo e Ganho Relativo de Biomassa, após tratamento com o bioinoculante.

Breve descrição das Tabelas e Figuras

[0031] Figura 1 - Biossurfactante/Bioinoculante isolado de Absidia cylindrospora var. cylindrospora UCP 1301 (a); b - montagem de placa, escala = 10mm; c - semente de Lactuca sativa, escala = 1mm; d - medidas rd = radícula, hi = epicótilo, escala =10mm; e = placa controle negativos após 168 horas, escala = 10 mm; f = placa amostra 3,125% da CMC após 168 horas, escala = 10 mm; g = placa amostra 6,25% da CMC após 168 horas, escala = 10 mm; h = placa amostra 12,5% da CMC após 168 horas, escala = 10 mm; i = placa amostra 25% da CMC após 168 horas, escala = 10 mm; j = placa amostra 50% da CMC após 168 horas, escala = 10 mm; f = placa amostra 100% da CMC após 168 horas, escala = 10 mm.

[0032] Tabela 1- Características do biossurfactante produzido por Absidia cylindrospora var. cylindrospora UCP1301.

[0033] Tabela 2a. Ação do biossurfactante/bioiniculante Na germinação de sementes de Lactuca sativa L.

[0034] Tabela 2b. Ação do biossurfactante/bioiniculante no tamanho da raiz e do hipocótilo de Lactuca sativa L.

[0035] Tabela 2c. Ação do biossurfactante/bioiniculante na biomassa seca de Lactuca sativa L.

Claims (3)

1. “BIOSSURFACTANTE INDUTOR DA GERMINAÇÃO E PROMOTOR ENRAIZAMENTO DE Lactuca sativa L.” caracterizado pelo biossurfactante de Absidia cylindrospora var. cylindrospora UCP 1301 cultivado em meio alternativo de baixo custo e método de inoculação por contato direto e absorção do biossurfactante.

2. Processo de acordo com a reivindicação 1: Caracterizado pelo fato do biossurfactante ser sintetizado por Absidia cylindrospora var. cylindrospora UCP 1301, em meio de baixo custo ser atóxico e biocompativel.

3. Processo de acordo com a reivindicação 1: Caracterizado pelo método de inoculação por contato direto e absorção do bioinoculante em sementes de Lactuca sativa L., o biossurfactante liofilizado.