BRPI0314915B1 - método para a obtenção de plantas de soja e vetor de transformação - Google Patents

Abstract

"planta leguminosa, vetor de transformação e método para a obtenção de plantas leguminosas". a presente invenção refere-se à transformação de plastídeos a partir de plantas e, mais precisamente, à produção de plantas leguminosas transplastômicas férteis, particularmente de soja transplastômica fértil.

Description

Campo da Invenção

A presente invenção refere-se à transformação de plastídeos de plantas e, mais precisamente, à produção de plantas leguminosas transplastômicas férteis, particularmente soja transplastômica fértil.

Antecedentes da Invenção

Em plantas, as informações genéticas são distribuídas em três compartimentos celulares: o núcleo, a mitocôndria e os plastídeos. Cada um destes compartimentos conduz o seu próprio genoma. Há alguns anos, os plastídeos de plantas superiores vêm sendo alvo atrativo de manipulações genéticas. Os plastídeos de plantas (cloroplastos, sítio de fotossíntese, amiloplastos armazenadores de amido, elaioplastos, etioplastos, cromoplastos armazenadores de carotenóides etc.) são centros importantes de biossíntese que, além da fotossíntese, são responsáveis pela produção de compostos industrialmente importantes, tais como aminoácidos, carboidratos, ácidos graxos e pigmentos. Os plastídeos são derivados de um precursor indiferenciado comum, o proplastídeo e, portanto, em dada espécie de planta, possuem o mesmo conteúdo genético.

O genoma do plastídeo, ou plastoma, de plantas superiores consiste em uma molécula de DNA circular de fita dupla de 120 a 160 quilobases, que conduz uma seqüência grande invertida e repetida (cerca de 25 kb). Uma característica notável do genoma do plastídeo repousa na presença de várias cópias idênticas deste genoma em todas as células e todos os tipos de plastídeos. Dependendo do estágio de desenvolvimento, uma célula de folha de tabaco pode conter até 10.000 cópias de plastoma. É possível, portanto, manipular células vegetais que contenham até 20.000 cópias de um gene de interesse, que pode potencialmente resultar em alto nível de

expressão de genes heterólogos.

A transformação de genomas de plastídeos a partir de plantas oferece um enorme potencial para a biotecnologia vegetal e muitas vantagens atrativas em comparação com a transformação convencional do genoma 5 nuclear. A primeira vantagem repousa no próprio mecanismo de transformação de plastídeos. Especificamente, a integração de um transgene no plastoma ocorre através de um fenômeno de recombinação homóloga dupla. Este processo possibilita direcionar precisamente a região do plastoma no qual se deseja a integração do gene de interesse, particularmente utilizando seqüências de plastídeos posicionadas em qualquer dos lados do transgene sobre o vetor de transformação. Este direcionamento preciso evita o efeito de “posição” comumente observado em eventos de transformação nuclear.

A segunda vantagem reside no alto número de cópias de transgene por plastídeo. As células vegetais podem ser manipuladas de forma a conterem até 20.000 cópias de um gene de interesse. Esta característica permite altos níveis de expressão de transgene, o que pode resultar em um acúmulo de proteínas recombinantes variando até 40% do total de proteínas celulares solúveis (De Cosa et al., 2001, Nat. Biotechnol. 19, 71-74).

A natureza procariótica do plastídeo constitui outro atributo, particularmente permitindo-se a expressão de genes organizados em operons e a tradução eficiente de mRNAs policistrônicos. Isso facilita particularmente o funcionamento coordenado de vários transgenes, limitando, ao mesmo tempo, a quantidade de etapas de transformação e a necessidade de uso de diversos marcadores de seleção (Daniell, 1998, Nat. Biotechnol. 16, 345-8; De Cosa et 25 al., 2001, Nat. Biotechnol. 19, 71-74).

Outra vantagem da transformação de plastídeos em comparação com a transformação nuclear reside no controle da dispersão de transgenes no ambiente. Em muitas angiospermas, os plastídeos possuem hereditariedade materna estrita e o DNA do plastídeo não é transmitido através do pólen.

particularidade limita, portanto, em muito o risco de dispersão do transgene no ambiente e sua potencial propagação para plantas vizinhas.

Muitas aplicações de transformação de plastídeos possibilitaram a confirmação das vantagens desta tecnologia sobre a transformação nuclear. Desta forma, a sobreexpressão, a partir do plastoma de tabaco, de genes para determinar a tolerância a herbicidas tais como glifosato (Daniell, 1998, Nat. Biotechnol. 16, 345-8; documentos WO 99/10513; Ye et al., 2000; WO 01/04331, WO 01/04327) ou fosfinotricina (Basta) (Lutz et al., 2001, Physiol.

Plant 125, 1585-1590), confere excelente tolerância a estes herbicidas. Outras aplicações geraram a produção de plantas transplastômicas que são tolerantes a insetos ou que sobreproduzem proteínas terapêuticas (McBride et al., 1995; Patente US 5.451.513; Staub et al., 2000, Nat. Biotech. 18, 333-338).

Para obter a transformação de plastídeos, o DNA transformante deve cruzar a parede celular, a membrana plasmática e a dupla membrana da organela antes de atingir o estroma. Neste caso, a técnica mais comumente utilizada para transformar o genoma do plastídeo é a de bombardeamento de partículas (Svab e Maliga, 1993, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A., Fev 1, 90 (3): 913-7).

Atualmente, em plantas superiores, a transformação estável de plastídeos é comumente conduzida apenas em tabaco, Nicotiana tabacum (Svab e Maliga, 1990, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 87, 8526-8530; Svab e Maliga, 1993, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A., fev 1, 90 (3): 913-7). Embora esta técnica tenha demonstrado sua eficácia em tabaco, a sua transposição para 25 grandes culturas de espécies vegetais aparentemente enfrenta obstáculos técnicos. Um destes obstáculos pode não ser uma dificuldade em transformação, mas provavelmente uma limitação nos sistemas para o cultivo in vitro de tecidos atualmente disponíveis e nos métodos de transformação e de

V tf ' π« d t 8 regeneração de plantas transplastômicas. Algum progresso recente foi atingido, ' ^v' * entretanto, com a transformação de plastídeos a partir de arroz (Khan, M. S. e Maliga, 1999, Nat. Biotechnol. 17, 910-915), de Arabidopsis thaliana (Sikdar et al., 1998, Plant Cell Reports 18: 20-24), de batata (Sidorov et al., 1999, Plant J.

19 (2): 209-216), de Brassica napus (Chaudhuri et al., 1999) e de tomate (Ruf et al., 2001, Nat. Biotechnol. 19, 870-875).

Recentemente, Zhang et al., (2001, J. Plant Biotechnol. 3, 39-44) descreveram uma técnica de transformação de plastídeos a partir de uma suspensão de células de soja sob freqüência muito baixa. Entretanto, esta técnica gera tecidos incapazes de regenerar plantas. De conhecimento dos inventores, nenhuma planta leguminosa transplastômica fértil e, mais especificamente, nenhuma planta de soja transplastômica fértil foi obtida até o presente.

Uma grande quantidade de espécies de culturas pertence à família das plantas leguminosas, particularmente, plantas produtoras de proteínas tais como ervilha, favas, feijão, grão-de-bico, lentilhas, plantas

produtoras de óleo, tais como soja e amendoim, e forragem, tal como alfafa ou trevo. Uma propriedade fundamental de plantas leguminosas, que é grandemente responsável pelo seu valor agronômico, é o seu alto teor de proteína. Esta propriedade as tomam plantas selecionadas para a sobreexpressão de proteínas de interesse.

A soja, essencialmente cultivada na América Latina, América do Norte e também na China, é exportada principalmente para a Europa. Ao longo dos últimos anos, características de resistência a herbicida ou a insetos pragas 25 foram introduzidas no genoma nuclear da soja. Estas manipulações genéticas no genoma nuclear da soja foram realizadas em virtude da técnica de bombardeamento de partículas. Muitos genótipos foram, portanto, produzidos e exibem um aumento da tolerância a herbicidas (Roundup Ready Soybean,

V

1995, Crop

al., 1996, Plant Physiol. 112: 121-129) ou melhoria nas características de qualidade, tais como ácidos graxos, fitatos, aminoácidos (Soy 2000, 8^a Conferência Bianual de Biologia Molecular e Celular da Soja, Lexington,

Kentucky, Estados Unidos).

Neste contexto e em vista das vantagens técnicas da transformação de plastídeos mencionada acima, está se tornando crucial desenvolver uma técnica confiável de transformação e regeneração de plantas leguminosas transplastômicas férteis, particularmente soja. Desta forma, os inventores desenvolveram um método de transformação em alta freqüência de plastomas de soja, gerando plantas férteis. Este método pode ser facilmente adaptado à transformação de outras plantas leguminosas de interesse agronômico.

Descrição da Invenção

A presente invenção refere-se a uma planta leguminosa transplastômica fértil.

De acordo com a presente invenção, a expressão “planta leguminosa” destina-se a indicar uma planta da família Fabaceae. As plantas leguminosas preferidas de acordo com a presente invenção são as plantas leguminosas de interesse agronômico, tais como ervilha (Pisum sativum), feijão-fava grande (Vicia faba major), feijão-fava (Vicia faba minor), lentilhas (Lens culinaris), feijão (Phaseolus vulgaris), grão-de-bico (Cicer arietinum), soja (Glycine max), amendoim (Arachis hypogea), alfafa (Medicago sativa) ou trevo (Trifolium sp.).

De acordo com uma realização preferida da presente invenção, a planta leguminosa transplastômica fértil é soja, Glycine max.

De acordo com a presente invenção, o termo “transplastômico” destina-se a indicar plantas que tenham integrado de forma estável ao seu

V <> .?· plastoma pelo menos um cassete de expressão que é funcional em plastídeos.

O plastoma consiste do genoma das organelas celulares diferentes do núcleo e da mitocôndria. Um cassete de expressão de acordo com a presente invenção compreende, entre outros elementos, pelo menos um promotor que é funcional em plastídeos de células vegetais, uma seqüência que codifica uma proteína de interesse e um terminador que é funcional em plastídeos de células vegetais. O mencionado cassete de expressão pode conter elementos genéticos originários a partir da planta transformada ou a partir de qualquer outro organismo. Além disso, o cassete de expressão pode conter mais de uma 10 seqüência codificadora de uma proteína de interesse, tal como no caso de operons.

Preferencialmente, as plantas leguminosas transplastômicas de acordo com a presente invenção encontram-se no estado homoplásmico (homoplasmic). O estado homoplásmico corresponde a um estado de acordo 15 com o qual todas as células contêm uma população de plastomas idênticos. De acordo com a presente invenção, plantas transplastômicas encontram-se no estado homoplásmico quando todas as suas células contêm apenas cópias de plastomas transformados e não contêm mais nenhuma cópia de plastomas não transformados. Este estado geralmente é obtido através da seleção das cópias 20 de plastomas que tenham integrado o cassete de expressão, particularmente por meio da combinação do mencionado cassete de expressão com um gene que codifica um marcador de seleção. Os plastomas que não integraram o marcador de seleção são eliminados em seguida quando os tecidos transformados são colocados em contato com o agente de seleção 25 correspondente.

De acordo com a presente invenção, as plantas leguminosas transplastômicas são férteis. Uma planta fértil é uma planta capaz de produzir uma linhagem viável em virtude de ciclo reprodutivo sexual. Particularmente,

V

R>

transformada correspondem a seqüências que exibem 80% de identidade com as seqüências correspondentes no plastoma da planta leguminosa a ser transformada, de preferência, 90% de identidade, de maior preferência, 95% e, de maior preferência ainda, 99% de identidade. De acordo com uma realização 5 preferida da presente invenção, as seqüências homólogas a uma zona do plastoma da planta leguminosa a ser transformada correspondem a seqüências que exibem 100% de identidade com as seqüências correspondentes no

plastoma da planta leguminosa a ser transformada.

A presente invenção refere-se, portanto, a um vetor apropriado para a transformação de plastídeos, caracterizado pelo fato de que as duas seqüências homólogas a uma zona do plastoma da planta leguminosa a ser transformada correspondem a seqüências que permitem a integração do cassete de expressão a uma região intergênica do plastoma. De acordo com uma realização preferida, a mencionada zona corresponde à região do operon de RNA ribossômico do plastoma.

A presente invenção também compreende uma planta leguminosa

transplastômica fértil, caracterizada pelo fato de que compreende pelo menos um cassete de expressão inserido em uma região intergênica do plastoma. De acordo com uma realização preferida, a mencionada região intergênica é selecionada a partir da região do operon de RNA ribossômico do plastoma.

De acordo com uma realização específica da presente invenção, uma das duas seqüências homólogas compreende os genes ou uma parte deles, que codifica o RNA ribossômico 16S (16SrRNA) e o RNA de transferência de valina (trnV) e a outra seqüência homóloga compreende a 25 região intergênica ou uma parte dela, localizada entre o gene trnV θ o operon rps12/7. A presente invenção refere-se, portanto, a um vetor apropriado para a transformação de plastídeos, caracterizado pelo fato de que uma das duas seqüências homólogas compreende os genes que codificam o RNA

V / η»—1?

uma planta fértil de acordo com a presente invenção é uma planta transplastômica capaz de transmitir o cassete de expressão integrado no seu plastoma para os seus descendentes.

A presente invenção também compreende vetores de transformação apropriados para a transformação de plastídeos. A expressão “vetor apropriado para a transformação de plastídeos” destina-se a indicar um vetor capaz de integrar de forma estável o(s) cassete(s) de expressão que

contém no plastoma de célula vegetais. Convenientemente, um vetor apropriado para a transformação de plastídeos de acordo com a presente invenção é um vetor que compreende pelo menos duas seqüências homólogas a uma zona do plastoma da planta leguminosa a ser transformada, em que as mencionadas seqüências homólogas flanqueiam pelo menos um cassete de expressão. De acordo com uma realização preferida, as mencionadas seqüências homólogas flanqueiam, além de um cassete de expressão que codifica uma ou mais proteínas de interesse, pelo menos um outro cassete de

expressão que codifica um marcador de seleção. Com esses vetores, a integração do(s) cassete(s) de expressão no plastoma é conduzida através de recombinação homóloga dupla das duas seqüências homólogas com uma zona do plastoma da planta leguminosa a ser transformada, presente sobre o vetor, com as seqüências correspondentes no plastoma da planta leguminosa a ser transformada. Convenientemente, as duas seqüências homólogas a uma zona do plastoma da planta leguminosa a ser transformada permitem a integração do(s) cassete(s) de expressão em uma zona intergênica do genoma de plastídeo sem interromper a integridade ou o funcionamento dos genes de plastídeos. Preferencialmente, esta zona corresponde à região do operon de RNA ribossômico do plastoma.

De acordo com uma realização específica da presente invenção, as seqüências homólogas a uma zona do plastoma ou planta leguminosa a ser

V transformada correspondem a seqüências que exibem 80% de identidade com as seqüências correspondentes no plastoma da planta leguminosa a ser transformada, de preferência, 90% de identidade, de maior preferência, 95% e, de maior preferência ainda, 99% de identidade. De acordo com uma realização 5 preferida da presente invenção, as seqüências homólogas a uma zona do plastoma da planta leguminosa a ser transformada correspondem a seqüências que exibem 100% de identidade com as seqüências correspondentes no

plastoma da planta leguminosa a ser transformada.

A presente invenção refere-se, portanto, a um vetor apropriado para a transformação de plastídeos, caracterizado pelo fato de que as duas seqüências homólogas a uma zona do plastoma da planta leguminosa a ser transformada correspondem a seqüências que permitem a integração do cassete de expressão a uma região intergênica do plastoma. De acordo com uma realização preferida, a mencionada zona corresponde à região do operon 15 de RNA ribossômico do plastoma.

A presente invenção também compreende uma planta leguminosa transplastômica fértil, caracterizada pelo fato de que compreende pelo menos um cassete de expressão inserido em uma região intergênica do plastoma. De acordo com uma realização preferida, a mencionada região intergênica é selecionada a partir da região do operon de RNA ribossômico do plastoma.

De acordo com uma realização específica da presente invenção, uma das duas seqüências homólogas compreende os genes ou uma parte deles, que codifica o RNA ribossômico 16S (16SrRNA) e o RNA de transferência de valina (trnV) e a outra seqüência homóloga compreende a região intergênica ou uma parte dela, localizada entre o gene trnV e o operon rps12/7. A presente invenção refere-se, portanto, a um vetor apropriado para a transformação de plastídeos, caracterizado pelo fato de que uma das duas seqüências homólogas compreende os genes que codificam o RNA

V *'· ribossômico 16S (16SrRNA) e o RNA de transferência de valina (trnV) e em que a outra seqüência homóloga compreende a região intergênica localizada entre o gene trnV e o operon rps12/7.

A presente invenção também compreende, portanto, uma planta leguminosa transplastômica fértil, caracterizada pelo fato de que compreende pelo menos um cassete de expressão inserido em uma região intergênica do plastoma, em que a mencionada região intergênica do plastoma está localizada entre o gene trnV e o operon rps12/7.

De acordo com uma realização preferida da presente invenção, a planta leguminosa a ser transformada é a soja. De acordo com esta realização, a seqüência que compreende os genes que codificam o RNA ribossômico 16S (16SrRNA) e o RNA de transferência de valina (TrnV) corresponde à seqüência representada pelo identificador SEQ ID N° 1 e a seqüência que compreende a região intergênica localizada entre o gene TrnV e o operon rps12/7 corresponde à seqüência representada pelo identificador SEQ ID

N° 2. A presente invenção refere-se, portanto, a um vetor apropriado para a transformação de plastídeos, caracterizado pelo fato de que a seqüência homóloga que compreende os genes que codificam o RNA ribossômico 16S (16SrRNA) e o RNA de transferência de valina (TrnV) é representada pelo identificador de seqüência SEQ ID N° 1 e que a seqüência homóloga que compreende a região intergênica localizada entre o gene TrnV e o operon rps12/7 é representada pelo identificador de seqüência SEQ ID N° 2.

De acordo com uma realização específica, a presente invenção compreende, portanto, uma planta de soja transplastômica fértil, caracterizada pelo fato de que compreende pelo menos um cassete de expressão inserido em uma região intergênica do plastoma, em que o mencionado cassete de expressão é inserido entre as seqüências de plastoma de soja correspondentes aos identificadores SEQ ID N° 1 e SEQ ID N° 2.

De acordo com uma realização preferida da presente invenção, a sequência homóloga que compreende os genes que codificam o RNA ribossômico 16S (16SrRNA) e o RNA de transferência de valina (TrnV) é posicionada em 5’ do cassete de expressão e a seqüência homóloga que 5 compreende a região intergênica localizada entre o gene TrnV e o operon rps12/7 é posicionado em 3’ do cassete de expressão. Em uma outra

realização, as duas sequências homólogas podem ser posicionadas na posição reversa com relação ao cassete de expressão.

Os vetores de transformação apropriados para a transformação de plastídeos de acordo com a presente invenção compreendem pelo menos um cassete de expressão. Um cassete de expressão de acordo com a presente invenção compreende, ligados funcionalmente entre si, pelo menos um promotor que é funcional em plastídeos de células vegetais, uma seqüência que codifica uma proteína de interesse e um terminador que é funcional em plastídeos de células vegetais. A expressão “ligados funcionalmente entre si” indica que os mencionados elementos do cassete de expressão são ligados

entre si de tal forma que sua função é coordenada e permite a expressão da seqüência de codificação. Como forma de exemplo, um promotor é ligado funcionalmente a uma seqüência de codificação quando é capaz de garantir a expressão da mencionada seqüência de codificação. A construção de um cassete de expressão de acordo com a presente invenção e a montagem dos seus vários elementos pode ser conduzida utilizando métodos bem conhecidos dos técnicos no assunto, particularmente os descritos em Sambrook et al., (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Nolan C., ed., Nova Iorque,

Estados Unidos: Cold Spring Harbor Laboratory Press). A seleção dos elementos reguladores que compõem o cassete de expressão depende essencialmente da planta e do tipo de plastídeo no qual devem funcionar e os técnicos no assunto são capazes de selecionar elementos reguladores que são

* funcionais em uma dada planta.

Dentre os promotores que são funcionais em plastídeos de células vegetais, pode-se mencionar, como forma de exemplo, o promotor do gene psbA, que codifica a proteína D1 de PSII (Staub et al., 1993, EMBO 5 Journal 12 (2): 601-606), ou o promotor constitutivo do operon de RNA

ribossômico, Prrn (Staub et al., 1992, Plant Cell 4: 39-45). De forma geral, qualquer promotor derivado de um gene de plastoma vegetal será apropriado, e os técnicos no assunto serão capazes de fazer a escolha adequada dentre os vários promotores disponíveis, de forma a obter um modo desejado de expressão (constitutivo ou indutível). Um promotor preferido de acordo com a presente invenção compreende o promotor Prrn de tabaco combinado com uma porção 5’ da região não-traduzida 5’ do gene rbcL de tabaco (Svab e Maliga, 1993, Proc. Natl. Acad. Sei. 90: 913-917).

Dentre os terminadores que são funcionais em plastídeos de células vegetais, pode-se mencionar, como forma de exemplo, o terminador do gene psbA de tabaco (Shinozaki et al., 1986, EMBO J. 5: 2043-2049; Staub et

al., 1993). De forma geral, qualquer terminador derivado de um gene de plastoma vegetal será apropriado, e os técnicos no assunto serão capazes de realizar a escolha apropriada a partir dos vários terminadores disponíveis.

Convenientemente, o vetor utilizado na presente invenção pode conter, além de um cassete de expressão que compreende uma seqüência que codifica uma proteína de interesse, pelo menos um outro cassete de expressão que compreende uma seqüência que codifica um marcador de seleção. O marcador de seleção possibilita a seleção dos plastídeos e das células que foram efetivamente transformadas, ou seja, que incorporaram o(s) cassete(s) de expressão ao seu plastoma. Tal marcador também possibilita a obtenção de plastídeos transplastômicos férteis no estado homoplásmico. Dentre as seqüências utilizáveis que codificam os marcadores de seleção, pode-se

./ < Fls.

raso:

% 'O mencionar as dos genes para resistência a antibióticos, tais como, |3õf^_s exemplo, a do gene aadA que codifica um aminoglicosídeo 3”adeniltransferase, que confere resistência a espectinomicina e a estreptomicina (Svab et al., 1993; Staub et al., 1993) ou do gene higromicino fosfotransferase (Gritz et al., 1983, Gene 25: 179-188), mas também as dos genes para tolerância a herbicidas, tais como o gene bar (White et al., 1990, Nucleic Acid Res. 18 (4): 1062) para tolerância a bialafós, o gene EPSPS (US 5.188.642) para tolerância a glifosato ou, alternativamente, o gene HPPD (WO 96/38567) para tolerância a isoxazóis. Pode-se também fazer uso das seqüências de genes repórteres que codificam enzimas facilmente identificáveis, tais como a enzima GUS, ou seqüências de genes que codificam pigmentos ou enzimas que regulam a produção de pigmentos nas células transformadas. Esses genes são descritos especificamente nos documentos WO 91/02071, WO 95/06128,

WO 96/38567 e WO 97/04103.

De acordo com uma realização preferida da presente invenção, o gene que codifica um marcador de seleção é o gene aadA que codifica um aminoglicosídeo 3”-adeniltransferase, que confere às células e plastídeos transformados, resistência a espectinomicina e a estreptomicina (Svab et al., 1993; Staub et al., 1993).

A presente invenção também se refere a um método para a obtenção de plantas leguminosas transplastômicas férteis. Este método compreende as etapas de:

(a) transformação de tecidos embriogênicos obtidos a partir de embriões imaturos de plantas leguminosas com um vetor apropriado para a transformação vegetal;

(b) seleção dos tecidos transformados; e (c) regeneração das plantas transplastômicas férteis a partir dos tecidos transformados.

v-*.

Para implementar o método de acordo com a presente invenção, a etapa de transformação (a) deverá ser conduzida sobre tecidos embriogênicos obtidos a partir de embriões imaturos de plantas leguminosas. Preferencialmente, os tecidos embriogênicos são calos ou qualquer outro 5 tecido que contenha células que tenham conservado um estado totipotente.

Os tecidos embriogênicos podem ser transformados através de

qualquer método de transformação direta (DNA descoberto (naked)) ou indireta de células vegetais. Dentre os métodos de transformação que podem ser utilizados para obter plantas transplastômicas de acordo com a presente invenção, um deles consiste em colocar as células ou tecidos das plantas a serem transformadas em contato com polietilenoglicol (PEG) e o vetor de transformação (Chang e Cohen, 1979, Mol. Gen. Genet. 168 (1), 111-115; Mercenier e Chassy, 1988, Biochimie 70 (4), 503-517). A eletroporação é um outro método que consiste em submeter as células ou tecidos a serem transformados e os vetores a um campo elétrico (Andreason e Evans, 1988,

Biotechniques 6 (7), 650-660; Shigekawa e Dower, 1989, Aust. J. Biotechnol. 3 (1), 56-62). Outro método consiste na injeção direta dos vetores nas células ou nos tecidos através de microinjeção (Gordon e Ruddle, 1985, Gene 33 (2), 121136). A transformação de plastomas pode também ser conduzida utilizando bactérias do gênero Agrobacterium, preferencialmente, através de infecção das células ou tecidos das mencionadas plantas com A. tumefaciens (Knopf, 1979,

Subcell. Biochem. 6, 143-173; Shaw et al., 1983, Gene 23 (3): 315-330) ou A.

rhizogenes (Bevan e Chilton, 1982, Annu. Rev. Genet. 16: 357-384; Tepfer e

Casse-Delbart, 1987, Microbiol. Sei. 4 (1), 24-28). Preferencialmente, a transformação de células ou tecidos vegetais com Agrobacterium tumefaciens é conduzida de acordo com o protocolo descrito por Ishida et al., (1996, Nat.

Biotechnol. 14 (6), 745-750). Para a transformação de plastomas, a linhagem de Agrobacterium utilizada deverá ser elaborada de tal forma a dirigir a» ♦

especifica mente o seu T-DNA para plastídeos.

De acordo com uma realização preferida do método segundo a presente invenção, será utilizado o método de “bombardeamento de partículas”. Este consiste no bombardeamento dos tecidos embriogênicos com partículas, preferencialmente feitas de ouro ou tungstênio, sobre as quais são adsorvidos os vetores de acordo com a presente invenção (Bruce et al., 1989,

Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 86 (24), 9692-9696; Finer et al., 1992, Plant Ceil

Rep. 11, 232-238; Klein et al., 1992, Biotechnoiogy 10 (3), 286-291; Patente US

4.945.050).

De acordo com o presente método de obtenção de plantas leguminosas transplastômicas férteis, os tecidos embriogênicos são transformados com um vetor apropriado para transformação de plastídeos, conforme descrito na presente invenção.

Durante a etapa (a) de transformação dos tecidos embriogênicos, nem todos os tecidos submetidos à técnica de transformação integram o vetor. A etapa (b) de seleção dos tecidos transplastômicos transformados é conduzida colocando-se os tecidos submetidos à etapa de transformação (a) em contato com o agente de seleção correspondente ao gene marcador de seleção utilizado. Durante esta fase, somente as células que integraram o gene marcador de seleção sobreviverão em contato com o agente de seleção e formarão calos verdes. O período de tempo para o qual os tecidos são colocados em contato com o agente de seleção depende do marcador de seleção e do agente utilizado, e pode ser facilmente determinado pelos técnicos no assunto. Preferencialmente, este período de tempo corresponde a um período que varia até a formação dos mencionados calos verdes a partir dos tecidos transformados.

A etapa (c) de regeneração de plantas transplastômicas férteis a partir dos tecidos transformados é conduzida através da indução da formação to *

de embriões a partir dos tecidos transplastômicos selecionados na etapa (b). A indução da formação de embriões é geralmente conduzida colocando-se os mencionados tecidos em contato com um meio de embriogênese apropriado. Esses meios são conhecidos dos técnicos no assunto. Um meio preferido de 5 acordo com a presente invenção é o meio descrito em Finer e McMullen (1991).

Uma vez induzidos, os embriões formados são colocados em um

meio apropriado para que germinem. Preferencialmente, o meio apropriado para germinação é um meio ágar que compreende os elementos nutritivos necessários para germinação. As plântulas formadas são plantadas em seguida em um substrato apropriado para o crescimento vegetal. Um substrato preferido é a terra ou uma mistura com base em terra.

A presente invenção também compreende partes das plantas leguminosas transplastômicas férteis e os descendentes dessas plantas. O 15 termo “partes” destina-se a indicar qualquer órgão dessas plantas, seja este aéreo ou subterrâneo. Os órgãos aéreos são os caules, as folhas e as flores

que compreendem os órgãos reprodutores masculino e feminino. Os órgãos subterrâneos são principalmente as raízes, mas podem também ser tubérculos. O termo “descendentes” destina-se a indicar principalmente as sementes que contêm os embriões derivados da reprodução destas plantas entre si. Por extensão, o termo “descendentes” aplica-se a todas as sementes formadas em cada nova geração derivada de cruzamentos nos quais pelo menos um dos parentais é uma planta transformada de acordo com a presente invenção. Os descendentes podem também ser obtidos através da multiplicação vegetativa 25 das mencionadas plantas transformadas. As sementes de acordo com a presente invenção podem ser revestidas com uma composição agroquímica que compreende pelo menos um produto ativo que possui uma atividade selecionada a partir de atividades fungicidas, herbicidas, inseticidas, nematicidas, * Pis..... ^IQL 1 bactericidas ou virucidas.

Dentre as seqüências que codificam uma proteína de interesse que podem ser integradas às plantas leguminosas transplastômicas de acordo com a presente invenção, pode-se fazer menção às seqüências codificadoras de genes que codificam uma enzima para resistência a um herbicida, tais como, por exemplo, o gene bar que codifica a enzima PAT (White et al., NAR

18: 1062, 1990), que confere tolerância a bialafós, o gene que codifica uma enzima EPSPS (WO 97/04103), que confere tolerância a glifosato, ou o gene que codifica uma enzima HPPD (WO 96/38567), que confere tolerância a isoxazóis. Pode-se também mencionar um gene que codifica uma toxina inseticida, tal como um gene que codifica uma δ-endotoxina da bactéria

Bacillus thuríngiensis (WO 98/40490). Também é possível introduzir nessas plantas os genes para resistência a doenças, tais como um gene que codifica a enzima oxalato oxidase, conforme descrito no Pedido de Patente EP 0.531.498 ou na Patente US 5.866.778, ou um gene que codifica outro peptídeo antibacteriano e/ou antifúngico,

97/30082, WO 99/24594, WO tal como os descritos nos documentos WO

99/02717, WO 99/53053 e WO 99/91089.

Também é possível introduzir genes que codificam características agronômicas vegetais, particularmente um gene que codifica uma enzima delta-6 desaturase, conforme descrito nas Patentes US 5.552.306 e US 5.614.313 e nos documentos WO 98/46763 e WO 98/46764, ou um gene que codifica uma enzima serina acetiltransferase (SAT), conforme descrito nos documentos WO 00/01833 e WO 00/36127.

De acordo com uma realização específica da presente invenção, as plantas leguminosas transplastômicas de acordo com a presente invenção podem ser transformadas com um cassete de expressão que codifique uma proteína de interesse farmacêutico ou veterinário. Como forma de exemplo, essa proteína pode ser um anticoagulante (protease de soro, hirudina), <ρ *

interferon ou albumina de soro humano. As proteínas produzidas pelas plantas de acordo com a presente invenção podem também ser anticorpos ou proteínas utilizadas como base para vacinas.

Os exemplos abaixo possibilitam ilustrar a presente invenção, 5 sem, entretanto, limitar o seu escopo.

Exemplos

Exemplo 1

Construção de Vetor Apropriado para Transformação de Plastídeos de Soja

O plasmídeo pCLT312 contém um cassete de expressão heterólogo, AADA-312, flanqueado por dois fragmentos de DNA de plastídeo de soja, RHRR (Região de Recombinação Homóloga Direita) e LHRR (Região de Recombinação Homóloga Esquerda), que permitem a integração dirigida para a região do operon de RNA ribossômico do plastídeo de soja. Esta região de inserção é diferente daquela utilizada por Zhang et al., (2001). A região

RHRR contém os genes que codificam o 16SrRNA (sob o controle do promotor

operon de RNA ribossômico, indicado Prm) e TrnV (SEQ ID N° 1). A região LHRR contém a região intergênica entre o gene TrnV e o operon rps12/7 (SEQ ID N° 2). Nenhum gene de plastídeo é interrompido após a recombinação homóloga com estas seqüências.

O cassete de expressão do vetor pCLT312 (AADA-312, SEQ ID

N° 10) contém um gene quimérico composto de 5’ a 3’, do promotor “curto” do operon de RNA ribossômico de tabaco (PrrnC, nucleotídeos 102.564 a 102.715 do plastoma de Nicotiana tabacum; Shinozaki et al., 1986), uma porção 5’rbcL da região não-traduzida 5’ do gene rbcL do tabaco (nucleotídeos 57.569 a 25 57.584 do plastoma de Nicotiana tabacum; Shinozaki et al., 1986), a seqüência de codificação do gene aadA e o terminador 3’psbA de tabaco (nucleotídeos

533 a 146 do plastoma de N. tabacum; Shionozaki et al., 1986). O produto do gene aadA, aminoglicosídeo 3”-adeniltransferase, confere resistência a

espectinomicina e estreptomicina sobre as plantas transformadas no nível do seu genoma de plastídeo (Svab ete al, 1993; Staub et al., 1993).

O vetor pCLT312 foi obtido conforme descrito abaixo.

Os dois fragmentos de DNA de plastídeo de soja (que constituem as regiões de recombinação homólogas RHRR e LHRR) foram amplificados através de PCR a partir de DNA total de Glycine max (cv. Jack) (PWO DNA polimerase, Stratagene). A região RHRR foi obtida utilizando os

oligonucleotídeos OSSD5 (SEQ ID N° 4) e OSSD3 (SEQ ID N° 3). O anelamento (sob temperatura de 60 °C) deste par de primers causou a amplificação de um fragmento de 1.800 bp. Além disso, a seqüência desses primers gera sítios de restrição 5’ e 3’ que permitem a clonagem subseqüente. A região LHRR foi amplificada utilizando os primers OSSG5 (SEQ ID N° 6) e OSSG3 (SEQ ID N° 5), projetados de forma a inserir sítios de restrição 5’ e 3’. Durante os ciclos da reação de PCR, a temperatura de anelamento aplicada é de 60 °C. O produto de PCR com cerca de 1.400 bp obtido é de tamanho maior que o esperado (1.180 bp), determinado de acordo com a seqüência de

plastoma de soja publicada em GeneBank (X07675). O seqüenciamento dos fragmentos de PCR destas duas regiões exibe a presença de inserção de 217 bp na região LHRR. Esta região inserida, de acordo com a seqüência analisada, não contém ORF e é considerada como sendo uma região intergênica.

Após purificação em gel de agarose, estes dois fragmentos de

PCR, RHRR e LHRR, foram clonados no vetor pPCRscript (Strategene), de forma a gerar os vetores pCLT309 e pCLT308, respectivamente. A região 25 LHRR excisada do vetor pCLT309 através de digestão de Kpnl foi clonada em pCLT308 digerido anteriormente com esta enzima. Um cassete de expressão heteróloga de plastídeo de tabaco foi clonado em seguida no vetor pCLT300 obtido, utilizando as enzimas Xhol e Hindlll, para gerar o vetor pCLT311. Este

cassete contém um gene quimérico composto, de 5’ a 3’, do promotor “curto” PrmC do operon de RNA ribossômico de tabaco, uma porção 5’rbcL da região não traduzida 5’ do gene rbcL de tabaco, a seqüência de codificação de um gene de interesse e o terminador 3’psbA de tabaco. O gene de interesse 5 presente em pCLT311 foi excisado através de digestão com as enzimas Ncol e

Xbal e substituído em seguida com o gene aadA liberado por estas mesmas

enzimas do plasmídeo pCLT115. O vetor de transformação de plastídeos obtido é denominado pCLT312.

Exemplo 2

Transformação de Genqmas de Plastídeos de Soja Através de

Bombardeamento

A técnica utilizada para a transformação de soja é o bombardeamento de partículas. Ele é aplicado a tecidos embriogênicos de soja. Os tecidos embriogênicos de Glycine max (cv. Jack) foram obtidos 15 (preparados sob condições estéreis) em duas fases: uma fase de indução e uma fase de multiplicação.

Vagens de soja são colhidas em uma estufa quando os embriões ainda estão imaturos (comprimento máximo de 3 mm). Eles são descontaminados com alvejante diluído e enxaguados com água esterilizada.

As vagens são abertas sob uma capela, sob condições estéreis, e os embriões são recuperados. Os dois cotilédones são separados e colocados com a face externa para baixo sobre meio de indução de ágar D40. O meio D40 é um meio

Murashige e Skoog descrito em Murashige e Skoog (1962, A Revised Médium for Rapid Growth and Bioassays with Tobacco Tissue Cultures, Physiol. Plant,

15: 473-479). Ele compreende (em mg/l): NH4HO3: 1650, H3BO3: 6,2;

CaCI₂.2H₂O: 332,2; CoCI₂.6H₂O: 0,025; CuSO₄.5H₂O: 0,025; Na₂EDTA: 37,26;

FeSO₄.7H₂O: 27,8; MnSO₄.7H₂O: 16,9; Na₂MoO₄.2H₂O: 0,25; Kl: 0,83; KNO₃:

1990; KH₂PO₄: 170; ZnSO₄.7H₂O: 8,6; vitamina B5 de Gamborg (Gamborg, #*

Fls____10?^^» 'A •ς -r*° 'Xs-^·

Miller e Ojima, 1968, Nutrient Requirements ofSuspension Cultures of Soybean

Root Cells, Exp. Cell Res. 50: 151-158, composto de (em mg/l): mioinositol:

100; ácido nicotínico: 1; piridoxina-HCI: 1; tiamina-HCI: 10) e também 40 mg/l de 2,4-D; 6% de sacarose; e 0,3% de gelrita, pH 7,0.

Este meio é rico em açúcar e em 2,4-D, substâncias que são necessárias para a indução de embriões somáticos. Os embriões são mantidos sobre este meio por três semanas a 24°C, com dada luminosidade e

fotoperíodo (16 horas de dia e 8 horas de noite).

Os embriões somáticos que se desenvolveram na superfície dos cotilédones são recuperados e colocados em placas em seguida sobre meio

D20, que compreende essencialmente os mesmos elementos do meio D40, com exceção da concentração de 2,4-D, que é de 20 mg/l, e da concentração de sacarose, que é reduzida de 60 g/l para 30 g/l, sob pH 5,7. Esta fase de amplificação dura 2 semanas sobre o meio D20 a 28°C.

Os embriões são subcultivados regularmente em seguida sobre meio FNL derivado daquele descrito por Samoylov et al., (1998). O meio FNL modificado compreende (em mg/l): Na₂EDTA: 37,24; FeSO₄, 7H₂O: 27,84; MgSO₄, 7H₂O: 370; MnSO₄, H₂O: 16,9; ZnSO₄, H₂O: 8,6; CuSO₄, 7H₂O: 0,025; CaCI₂, 2H₂O: 440; Kl: 0,83; CoCI₂, 6H₂O: 0,025; KH₂PO₄: 170; H₃BO₃: 6,2;

Na₂Mo0₄, 2H₂O: 0,25; mioinositol: 100; ácido nicotínico: 1; piridoxina-HCI: 1; tiamina-HCI: 10; (NH₄)₂SO₄: 460; KNO₃: 2820; asparagina: 670; 1% sacarose;

2,4-D: 10; 0,3% gelrita; pH 5,7. Este meio, que é menos rico em açúcar e 2,4D, possibilita a obtenção de calos apropriados para transformação sob freqüência muito alta em três ou quatro rodadas de subcultivo conduzidas 25 aproximadamente a cada 15 dias.

Para a transformação de plastídeos de soja através de bombardeamento, os tecidos embriogênicos de soja “FNL” são colocados em placas a 4°C por 16 a 20 horas. Estes calos são colocados em seguida em

Á ^Pls___¹

R^br—,0¾ £* *^_S-V^V uma cápsula metálica gradeada e então bombardeados sobre as suas duas faces (frontal e traseira) utilizando “PIG” (Arma de Fluxo Interno de Partículas), conforme descrito em Finer et al., (1992, Plant Cell Rep. 11, 232-238). Micropartículas de ouro (partículas com 0,6 pm de diâmetro) são complexadas com o DNA (vetor pCLT312, 5 pg/tiro) na presença de CaCh (0,8 a 1 M) e espermidina (14 a 16 mM) de acordo com os métodos descritos na literatura (Russell et al., 1992). Os calos embriogênicos de soja bombardeados são

cortados em seguida em pequenos pedaços de 1,5 a 2 mm e transferidos sobre meio FNL de ágar que contém o agente de seleção.

Exemplo 3

Seleção das Linhagens Transplastômicas de Soja

3.1. Avaliação da Sensibilidade de Soja a Espectinomicina

Atualmente, somente o gene aadA que confere resistência a espectinomicina foi utilizado com sucesso como marcador para seleção de 15 eventos transplastômicos. Verificamos inicialmente a sensibilidade de soja a espectinomicina. De fato, algumas espécies vegetais, tais como arroz, são

naturalmente resistentes a espectinomicina, pois possuem 16SrRNA que sofreu mutação. Deste ponto de vista, calos de soja embriogênicos foram colocados sobre meio FNL suplementado com espectinomicina sob concentração de 100 mg/l, 300 mg/l (dose utilizada no estado da técnica para seleção de batatas - Sidorov et al., 1999), 500 mg/l (dose utilizada no estado da técnica para seleção de tabaco - Svab e Maliga, 1990; Svab et al., 1993), 600 mg/l e 700 mg/l. Estes calos foram subcultivados sobre o mesmo meio após três semanas. Para todas estas concentrações, os tecidos começam a branquear após cerca de 2 semanas, o que demonstra a sensibilidade natural da soja a espectinomicina.

3.2. Seleção de Linhagens Transplastômicas

Após 2 dias sobre meio FNL, os calos de soja embriogênicos tr ²² - F15—Jú % fofo.·.—& \P c\ <>

<.>zv* bombardeados com pCLT312 (conforme descrito acima) são recuperados e transferidos em seguida sobre gaze de seleção estéril, de forma a ficarem em contato direto com meio de seleção ágar FNL contendo 200 mg/l de espectinomicina. Os tecidos são subcultivados sobre este mesmo meio após

15 dias e, em seguida, após 15 dias adicionais, sobre meio ágar FNL contendo

300 mg/l de espectinomicina. Após 20 dias, eles são novamente subcultivados

sobre o último meio. De acordo com este método de seleção, somente os tecidos transformados permanecem verdes. Os primeiros calos verdes, que são resistentes a espectinomicina, aparecem após 1,5 a 2 meses. Estes supostos transformantes de plastídeos são então mantidos sobre um meio FNL suplementado com 150 mg/l de espectinomicina.

Onze eventos resistentes a espectinomicina (200 mg/l) foram obtidos a partir de quatro bombardeamentos (quinze calos em média por bombardeamento). Os primeiros supostos transformantes apareceram após 63 dias (2 meses). Estes 15 calos foram amplificados em seguida em meio SBP6 líquido (contendo 150 mg/l de espectinomicina), de forma a permitir a regeneração de plantas e análises

moleculares. O meio SBP6 é descrito em Finer e Nagasawa (1988, Development of an Embryogenic Suspension Culture of Soybean (Glycine max Meríll.) Plant Cell. Tissue and Organ Culture 15: 125-136). Ele contém os ingredientes a seguir (em mg/l): Na₂EDTA: 37,24; FeSO₄.7H₂O: 27,84; MgSO₄.7H₂O: 370; MnSO₄.H₂O: 16,9;

ZnSO₄.H₂O: 8,6; CuSO₄.7H₂O: 0,025; CaCI₂.2H₂O: 440; Kl: 0,83; CoCI₂.6H₂O:

0,025; KH₂PO₄: 170; H₃BO₃: 6,2; Na₂MoO₄.2H₂O: 0,25; mioinositol: 100; ácido nicotínico: 1; piridoxina-HCI: 1; tiamina-HCI: 10; NH₄NO₃: 800; KNO₃: 3000;

asparagina: 670; 6% sacarose; 2,4-D: 5; pH 5,7.

Exemplo 4

Identificação das Linhagens Transplastõmicas de Soja e Estudo do Estado Homoplásmico destas Várias Linhagens Através de Southern Blot

As linhagens transplastõmicas foram identificadas através de

Southern Blot (Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Nolan C., ed., Nova Iorque, Estados Unidos: Cold Spring Harbor Laboratory Press) sobre calos e, em seguida, sobre as plantas derivadas desses calos.

O DNA total de dez calos dos onze calos resistentes a espectinomicina foi extraído com um kit comercial (Qiagen: “Dneasy Plant Mini Kit’). Entretanto, qualquer técnica de extração de DNA conhecida dos técnicos no assunto pode ser utilizada com validade (Sambrook et al., 1989, Molecular

Cloning: A Laboratory Manual, Nolan C. ed., Nova Iorque, Estados Unidos:

Cold Spring Harbor Laboratory Press). Um gg de DNA extraído de cada um desses dez calos foi digerido em seguida com a enzima de restrição de EcoRI (Biolabs). Esta digestão possibilita gerar fragmentos de interesse com um tamanho que pode ser explorado através de Southern Blot, particularmente um fragmento de 4042 bp para os plastomas transformados, um fragmento de 2667 bp para os plastomas do tipo selvagem e um fragmento de 2452 bp para 15 os plastomas transformados que sofreram recombinação entre os dois PrrnCs (tabaco e soja). De fato, como os mecanismos de recombinação dentro do

plastídeo são muito ativos, é possível a ocorrência de recombinação entre esses dois elementos de seqüências altamente homólogos, orientados na mesma direção.

Os fragmentos de DNA são separados através de eletroforese com lenta migração por uma noite a 55V em gel de agarose a 0,8% (QA Agarose® Multipropósito, QBIOGENE). A transferência foi conduzida em seguida convencionalmente (Maniatis et al., 1989). Estes fragmentos de DNA são revelados através de hibridização com sondas radioativas (³²P marcadas) que são de dois tipos: uma sonda que se hibridiza no transgene aadA (sonda que revela apenas os transplastomas) e uma sonda que se hibridiza em uma parte da região intergênica do DNA de plastídeo (sonda para visualizar as três formas de plastomas, correspondentes aos nucleotídeos 2293 a 3068 do

plastoma de Glycine max; Genebank X07675). Estas duas sondas foram amplificadas através de PCR (com o par OSSG5 - SEQ ID N° 6 - e OSSG310 SEQ ID N° 7 - para a sonda que se hibridiza na região intergênica do DNA de plastídeo e o par OAAX3 - SEQ ID N° 8 - e OAAN5 - SEQ ID N° 9 - para a 5 sonda aadA) e marcadas em seguida com ³²P (kit Megaprime, AMERSHAM).

As duas membranas foram lavadas com soluções de estringência crescente (6xSSC, depois 2xSSC - 0,1% SDS e 0,1xSSC - 0,1% SDS a 65°C). Após 2

horas de exposição a -80°C, com uma tela de intensificação, o autorradiograma revelou a presença de faixa esperada de 4042 pb (correspondente ao plastoma transformado com aadA) em cada um dos dez calos resistentes a espectinomicina testados. Todos os eventos de soja tolerantes a espectinomicina testados são, portanto, transplastômicos. Ao contrário da transformação com plastídeo de todas as espécies obtidas até hoje (Svab et al., 1993; Staub et al., 1993; Sidorov et al., 1999; Sikdar S. R. et al., 1998), nenhum mutante espontâneo resistente a esse antibiótico, devido a mutações específicas no gene de plastídeo 16SrRNA, foi observado em nossos

experimentos de transformação de soja.

Além disso, nove dos dez eventos encontram-se no estado homoplásmico (ou pelo menos muito perto), pois apenas o calo número 1 ainda contém cópias de plastomas do tipo selvagem visíveis através de Southern

Blot. Nenhum evento de recombinação entre os dois Prrns consecutivos (PrrnC de tabaco e Prrn de soja nativa), orientados na mesma direção, foi detectado através desta análise.

Exemplo 5

Regeneração das Plantas Transplastômicas de Soja

As plantas transplastômicas de soja foram regeneradas da forma a seguir. Quando tecidos suficientes foram produzidos em meio FNL, eles são convertidos em seguida em embriões utilizando um meio descrito por Finer e

McMullen em Transformation of Soybean via Particle Bombardment of

Embryogenic Suspension Culture Tissue, in Vitro Cell. Dev. Biol. 27P: 175-182,

1991. Após três a quatro transferências sobre este meio contendo 150 mg/l de espectínomicina, os embriões são secos em ar em placa Petri por 2 dias antes 5 da germinação sobre meio Murashige e Skoog (vitaminas B5) na metade da resistência iônica (50% das quantidades de meio MS) com 15 g/l de sacarose,

150 mg/l de espectínomicina e 7 g/l de fitagar, pH 5,7. Quando as plantas

jovens estiverem bem desenvolvidas (estágio de três folículas) e enraizadas, estas são transferidas em seguida para um substrato com base em turfa de “recipiente instantâneo” (jiffy pot) por um período de 10 a 15 dias para fase de aclimatação antes de serem transferidas para uma estufa. As plantas são cultivadas em seguida em estufa em condições de cultivo idênticas às da soja não transplastômica. Durante a floração, o pólen é removido, de forma a realizar polinização artificial das plantas não transgênicas, a fim de verificar a não transmissão da característica de resistência à espectínomicina por esses órgãos reprodutores.

Além disso, o controle da transmissão correta do cassete de expressão e do estado homoplásmico dos descendentes é conduzido através de PCR e Southern Blot. As sementes derivadas das várias linhagens transplastômicas foram cultivadas sobre meio do tipo Murashige e Skoog sob metade da resistência iônica contendo 15 g/l de sacarose e 500 mg/l de espectínomicina. Todas as sementes germinaram e produziram plantas tolerantes a espectínomicina, ao contrário das sementes do tipo selvagem. Este experimento demonstra, portanto, a estabilidade e transmissão do cassete de expressão para os descendentes. Além disso, todas as plantas transplastômicas de soja obtidas são férteis. Este é, portanto, o primeiro relatório que descreve a produção de uma planta transplastômica fértil diferente de tabaco e tomate (Ruf et al., 2001). De fato, em primeiro lugar, todos os , B

X </ eventos transplastômicos de A. thaliana e de arroz produzidos até o presente foram estéreis (Sikdar et al., 1998; Khan e Maliga, 1999) e, em segundo lugar, nunca havia sido possível regenerar células de soja transformadas em plantas férteis (Zhang et al., 2001).

Exemplo 6

Expressão do Gene 2maroA em Plastídeos de Soja

6.1. Construção de Vetores

Os vetores pCLT317, pCLT318, pCLT319 e pCLT320 para a introdução da seqüência do gene aroA com mutação dupla (2maroA) entre os 10 genes trnV e rps12/7 na região com repetição invertida do genoma de plastídeo de Glycine max derivam de pCLT312 (conforme descrito no Exemplo 1). Todos contêm dois cassetes de expressão adjacentes e heterólogos flanqueados pelas seqüências de plastídeos LHRR e RHRR de soja, idênticos aos de pCLT312. Estes dois cassetes de expressão encontram-se na mesma 15 orientação de transcrição do gene de soja nativa 16SrDNA (RRHR) no plasmídeo pCLT318 e pCLT320 ou na orientação de transcrição invertida no plasmídeo pCLT317 e pCLT319.

O cassete de seleção AADA contém a seqüência de codificação do gene aadA transcrito a partir de um promotor sintético que consiste do 20 promotor do gene 16SrDNA de tabaco (PrrnC) fundido com a região 5’ não traduzida do gene rbcL de plastídeo de tabaco (5’rbcLNt), conforme descrito por Svab e Maliga (1993) e na Patente US 5.877.402. A região reguladora 3’psbA foi utilizada para estabilizar o mRNA do gene de interesse (Svab e Maliga, 1993; Patente US 5.877.402). O fragmento Notl-EcoRV AADA foi 25 clonado em sítios de restrição de Notl/Nrul de pCLT405 (correspondentes ao vetor pMCS5 da Mobitech rompido nos sítios de restrição Ncol e Xbal) para formar o pCLT165. O sítio de restrição Xbal presente após o códon de parada da seqüência de codificação de aadA foi eliminado em seguida em pCLT165

para gerar pCLT166 (que contém o conjunto AADA-166; SEQ ID N° 11).

O cassete de expressão do gene 2maroA contém os promotores de polimerase codificados nucleares e de plastídeos (PEP/NEP) do gene

16SrDNA de tabaco (PrrnL), um sítio de ligação de ribossomos (RBS) do G10L (Ye et al., 2001, The Plant J. 25: 261-270; Hajdukiewicz, documento WO

01/04327), a seqüência de codificação 2maroA (Stalker et al., 1985, J. Biol.

Chem. 260 (8): 4724-4728; o gene AroA de Salmonella typhimuríum que

contém duas mutações que introduzem uma Isoleucina na posição 97 e uma

Serina na posição 101) e a região não traduzida 3’ do gene rbcL de plastídeo de tabaco. Além disso, em vetores de transformação de plastídeos pCLT317 e pCLT318, o gene de interesse é fundido na sua extremidade 5’ (sítio Ncol) aos primeiros 14 aminoácidos da proteína GFP (Ye et al., 2001, The Plant J. 25:

261-270; Pang et al., 1996; Plant Physiol. 112 (3): 893-900), a fim de aumentar a eficiência de tradução ou aumentar a estabilidade da proteína de fusão.

O cassete de expressão foi montado a partir de elementos reguladores de plastídeos amplificados por PCR. O promotor de rRNA 16S, PrrnL, foi amplificado através de PCR a partir do DNA total de Nicotiana tabacum (cv PBD6) utilizando dois primers específicos:

otprrncõ: 5’-caattgtcgcgagaattcgctagcggcgccgctcccccgccgtcgttc-3’ e otprmc3: 5’-atcgatccgcgggagctcggtaccatgcatcgtctagattcggaattgtctttc cttcc-3’.

O fragmento de PCR foi clonado no pPCRscript para formar pCLT160. A fim de eliminar os potenciais códons de início ATG, foi inserido um C na posição 102, um G foi deletado na posição 126, o A na posição 111 foi 25 convertido em T e o T em G na posição 134. O vetor resultante é denominado pCLT161.

Para sintetizar a fusão do 5’UTR do gene G10L com os primeiros 14 aminoácidos do GFP (Pang et al., 1996) (G10L::14aaGFP), os primers, a seguir:

Og10L5: 5’-tatctagaaataattttgtttaactttaagaaggagatatacccatgggcaa gggcg-3’; e

Opgfp3: 5’-ggatgcattgcttaagattgggaccacgccagtgaacagttcctcgcccttg cccatgggtatatct-3’, foram anelados entre si e alongados utilizando tecnologia de PCR padrão e Pwo DNA polimerase (Roche). Estes oligonucleotídeos também foram elaborados a fim de criar um sítio de restrição de Xbal na extremidade 5’ e Bfrl

e Nsil na extremidade 3’ da fusão G10L::14aaGFP. Um sítio de restrição Ncol é inserido na junção entre o 5’UTR do gene G10L e o 14aa do GFP. Este sítio

Ncol oferece a possibilidade de eliminar o 14aaGFP se necessário. O fragmento de PCR foi clonado no vetor TOPO (Invitrogen) para formar pCLT411.

O gene 2maroA de Salmonella typhimiríum foi amplificado através de PCR, utilizando os oligonucleotídeos:

OaroAdbõ: 5’-gccttaagctccatggaatccctgacgttacaaccc-3’; e

OaroAdb3: 5’-gcgatgcataatttaaattaggcaggcgtactcattcg-3’.

Um fragmento de PCR foi purificado e clonado no vetor pPCRscript (Stratagene) para gerar pCLT406.

A região não traduzida 3’ do gene rbcL de plastídeo de tabaco (3’rbcLNt) (nucleotídeos 59.035 a 59.246 do plastoma de N. tabacurrr,

Shinozaki et al., 1986) foi amplificada através de PCR a partir do DNA total de

Nicotiana tabacum (cv PBD6) e clonada no pPCRscript para formar pCLT162. Um fragmento de Dralll/Swal que contém o 3’rbcLNt foi clonado downstream (a juzante) do gene 2maroA nos sítios Dralll/Swal de pCLT406 para formar 25 pCLT164. O fragmento de Bfrl/Nsil pCLT164 de 1.517 bp que conduz

2maroA::3’rbcLNt foi clonado em pCLT411 aberto com enzimas de restrição

Bfrl e Nsil para gerar pCLT169. O fragmento Nsil/Xbal

G10L::14aaGFP::2maroA::3’rbcLNt foi clonado downstream do PrmLNt no

pCLT161 para gerar pCLT170 que contém o cassette AROA completo (AROA170; SEQ ID N° 12). O conjunto Nhel/Nsil AROA-170 foi clonado downstream do cassete de seleção AADA-166 em pCLT166 para formar pCLT171.

Os dois cassetes de expressão AADA-166 e AROA-170 foram clonados adicionalmente entre as duas regiões de recombinação RHRR e

LHRR, idênticas a pCLT312, seja na mesma orientação de transcrição ou na orientação inversa do gene 16SrDNA de soja nativo (em RRHR). A fim de criar

sítios de restrição apropriados para clonagem, dois sítios de restrição múltiplos (SMC1 e SMC2) foram obtidos utilizando tecnologia PCR padrão através do anelamento e alongamento dos oligonucleotídeos a seguir OSMC5 (5gaaagcttcggaccgtagtttaaacaggcccatatggcct-3’) com

OSMC3 (5’gactcgagttaattaatcggcgcgccaggccatatg-3’) para SMC1 e OSMC51 (5gagcggccgcctcgagcggaccgtagtttaaacaggcccatatggcct-3’) com OSMC31 (5’gaaagcttttaattaatcggcgcgccaggccatatg-3’) para SMC2. Os SMC1 e SMC2 foram digeridos por enzima de restrição Hindlll e Xhol e clonados em pCLT312 digerido pelas mesmas enzimas para gerar, respectivamente, pCLT316 e

pCLT315. Os dois cassetes de expressão AADA-166 e AROA-170 foram clonados na forma de fragmento Pmel-Pacl pCLT171 de 3.189 bp nos sítios de restrição Pmel e Pacl de pCLT315 e pCLT316 para formar os vetores de transformação de plastídeos pCLT317 e pCLT318, respectivamente. A fim de avaliar a influência do 14aaGFP sobre a expressão do transgene, pCLT317 e pCLT318 foram digeridos por enzima de restrição Ncol para remover o

14aaGFP e ligados para gerar pCLT319 e pCLT320, respectivamente. Os cassetes de expressão do gene 2maroA presente em pCLT319 e pCLT320 são idênticos e denominados AROA-319 (SEQ ID N° 13). Os cassetes de expressão encontram-se na mesma orientação de transcrição do gene

16SrDNA de soja nativo (RRHR) nos plasmideos pCLT318 e pCLT320 ou na orientação de transcrição invertida nos plasmideos pCLT317 e pCLT319.

, v*.

Todos os vetores de transformação de plastídeos foram

construídos a fim de gerar excisão do gene aadA após a integração dos cassetes no interior do plastoma. De fato, os dois transgenes são dirigidos por um Prm de tabaco presente no mesmo sentido de transcrição. Quando o 5 cassete AADA-166 estiver upstream (a montante) de um dos genes de interesse, poderá ser obtida uma eliminação do marcador selecionável através da recombinação homóloga entre os dois promotores.

6.2. Transformação

Experimentos de transformação de plastídeos foram conduzidos conforme descrito nos Exemplos 2 e 3 através de bombardeamento de tecido embriogênico de soja, utilizando partículas de ouro revestidas com todos os vetores de transformação de plastídeos descritos acima. Supostos transformantes foram selecionados conforme descrito no Exemplo 3 sobre meio de espectinomicina. A fim de distinguir evento transplastômico de mutante espontâneo ou transformante nuclear, análise de PCR foi realizada sobre o DNA total a partir de cada calo resistente a antibióticos obtido utilizando vários pares específicos de oligonucleotídeos.

Exemplo 7 Expressão do Gene de Heliomicina em Plastídeos de Soja 20 7.1. Construção de vetor

O pCLT321 é derivado de pCLT317. O fragmento de heliomicina de PCR Ncol/Blunt amplificado através de PCR utilizando os oligonucleotídeos P2 (5’-ACACCATGGATAAATTAATTGG-3’) e P3 (5’CCTCTAGATTAAGTTTCACACCAAC-3’) de genoma de Heliothis virescens 25 (documento WO 99/53053) e registrado para expressão em plastídeos de tabaco foi clonado nos sítios de restrição Ncol e Swal de pCLT317, substituindo o gene 2maroA. O pCLT321 conduz o AADA-166 e os cassettes de heliomicina (HELIO-321; SEQ ID N° 14) na orientação de transcrição inversa

do gene 16SrDNA de soja nativo. O cassette HELIO-321 é conduzido pelo PrrnL fundido com o RBS do G10L mas sem o primeiro 14aa do GFP.

7.2. Transformação

Experimentos de transformação de plastídeos foram conduzidos conforme descrito nos Exemplos 2 e 3, através do bombardeamento de tecido embriogênico de soja, utilizando partículas de ouro revestidas com todos os vetores de transformação de plastídeos descritos acima. Supostos transformantes foram selecionados conforme descrito no Exemplo 3 sobre meio de espectinomicina. A fim de distinguir evento transplastômico de mutante espontâneo ou transformante nuclear, foi realizada análise de PCR sobre DNA total de cada calo resistente a antibiótico utilizando vários pares específicos de oligonucleotídeos.

7.3. Análise de SojaTransplastõmica Antifúngica

A estratégia para a análise por PCR dos transformantes com pCLT321 foi de descarregar o primer P6 (5’GTTAAGGTAACGACTTCGGCATGG-3’) imediatamente fora do RHRR no gene 16SrDNA de soja, fora da região de recombinação homóloga, ao mesmo tempo em que era descarregado o outro P5 (5’ctcagtactcgagttatttgccgactaccttggtgatctcgcc-3’) sobre o gene aadA. Um produto de PCR de 2.838 bp deverá ser obtido no caso de integração de transgene no plastoma. O produto esperado foi observado para os calos transgênicos 1, 3 e 4 obtidos utilizando o vetor de soja pCLT321. Plantas não bombardeadas (controles) não geraram qualquer produto de PCR, conforme esperado. Estes resultados de PCR demonstram que o gene aadA realmente está integrado ao plastoma de soja no sítio esperado. A integração dos dois cassetes de expressão no plastoma de soja foi demonstrada utilizando os primers P7 (5CATGGGTTCTGGCAATGCAATGTG-3’)/P8 (5’-CAGGATCGAACTCTCCATGA GATTCC-3’) projetado para descarregar sobre os dois lados do sítio de

integração do gene exógeno em LHRR e RHHR, respectivamente. Dois produtos de PCR de 1.030 bp e 3.054 bp deverão ser observados para determinar o plastoma de WT e o transplastoma, respectivamente. Os produtos esperados foram obtidos para o WT e as linhagens transplastômicas 1, 3 e 4.

As linhagens resistentes a espectinomicina 1, 3 e 4 são, portanto, transplastômicas. A presença de alguns fragmentos de WT indicou alguma heteroplasmia. Um fragmento adicional de PCR de 1.666 bp é observado

nestas três linhagens transplastômicas que correspondem provavelmente ao transplastoma recombinado após extirpar-se o cassette AADA-166 através de recombinação homóloga. A integração dos dois cassetes de expressão no plastoma de soja foi confirmada utilizando outros dois conjuntos de primers P1 (5’-CGTATCGAATAGAACATGCTTAG-3’; descarregando sobre LHRR)/P2 (5ACACCATGGATAAATTAATTGG-3’; sobre o gene de heliomicina) e P4 (5’CGTCATACTTGAAGCTAGACAGGC-3’; descarregando sobre aadA)/P3 (515 CCTCTAGATTAAGTTTCACACCAAC-3’; sobre o gene de heliomicina). Produtos de PCR esperados de 520 bp e 922 bp correspondentes ao

transplastoma foram obtidos para o evento transplastômico 1, 3 e 4, utilizando os primers P1/P2 e P4/P3, respectivamente.

A seleção de PCR para eventos transplastômicos demonstrou que três dentre quatro clones resistentes integram os transgenes como o gene aadA ligado ao gene heliomicina no plastoma de soja. Estes três eventos transplastômicos foram avançados para etapas adicionais de regeneração.

Para determinar o acúmulo de heliomicina, foi realizada análise

Western Blot sobre uma única linhagem transplastômica, o evento número 1. O 25 total de proteína celular solúvel foi extraído de folhas de soja do tipo selvagem e de embriões de soja transplastômica. Western Blot foi sondada com anticorpos anti-heliomicina. Uma série de diluições de padrão de heliomicina purificado foi utilizada para quantificar a expressão da heliomicina. Os ir »

resultados de Western Blot demonstram acúmulo muito fraco de proteína heliomicina nas linhagens transplastômicas. Uma das razões poderá ser a formação de corpos de inclusão insolúveis ou degradação da heliomicina devido a mau dobramento de ligações de dissulfeto presentes na proteína.

Exemplo 8

Expressão do gene hppd em Plastídeos de Soja

8.1. Construção de Vetores

O gene hppd de Pseudomonas fluorescens (Rüetschi et al., Eur.

J. Biochem., 205, 459-466, 1992, documento WO 96/38567) foi amplificado através de PCR utilizando os oligonucleotídeos Ohppd5 (5’gccttaagctccatggcagatctatacgaaaacccaatgggc-3’) e Ohppd3 (5’gccatttaaattaatcggcggtcaatacaccacgacgcacctg-3’)- Um fragmento de PCR de 1.099 bp foi purificado e clonado no vetor pPCRscript para gerar pCLT409. Um fragmento de Ncol/Swal pCLT409 que contém o gene hppd foi clonado nos 15 sítios de restrição Ncol e Swal de pCLT317, resultando em pCLT323. O pCLT323 conduz os cassetes AADA-166 e hppd (HPPD-323, SEQ ID N° 15) na

orientação de transcrição inversa do gene 16SrDNA de soja nativa. O cassette

HPPD-323 é dirigido pelo PrrnL fundido com o RBS do G10L, mas sem o primeiro 14aa do GFP.

8.2. Transformação

Experimentos de transformação de plastídeos foram conduzidos conforme descrito nos Exemplos 2 e 3 através de bombardeamento de tecido embriogênico de soja, utilizando partículas de ouro revestidas com todos os vetores de transformação de plastídeos descritos acima. Supostos 25 transformantes foram selecionados conforme descrito no Exemplo 3 sobre meio de espectinomicina. A fim de distinguir evento transplastômico de mutante espontâneo ou transformante nuclear, análise de PCR foi realizada sobre DNA total a partir de cada calo resistente a antibióticos obtido utilizando vários pares

específicos de oligonucleotídeos.

8.3. Análise de Soja Transplastõmica Tolerante a Herbicidas

A análise de PCR utilizando uma primeira deposição sobre o plastoma nativo, fora da região de recombinação homóloga, ao mesmo tempo 5 que se deposita o outro dos genes aadA ou hppd, demonstrou que os calos resistentes a espectinomicina são transplastômicos.

A fim de detectar o acúmulo de HPPD no evento transplastômico de pCLT323, embriões foram cultivados sobre meios FNL contendo 1 ppm de DKN, a molécula ativa do herbicida isoxaflutol. Os resultados demonstram que, 10 após 25 dias de cultura, embriões transplastômicos são tolerantes a 1 ppm de DKN, ao contrário de embriões WT cultivados nas mesmas condições.

Exemplo 9

Expressão do Gene cry1 Ab em Plastídeos de Soja

9.1. Construção de Vetores

O gene crylAb de Bacillus thuringiensis (Bt) (GeneBank X04698) que codifica a protoxina CrylAb foi amplificado através de PCR utilizando os oligonucleotídeos OcryWT5 (5’-gccttaagctccatggataacaatccgaacatcaatg-3’) e OcryWTL3 (5’-gccatttaaattattcctccataagaagtaattccacgctgtccacg-3’) de genoma de Bacillus thuringiensis (linhagem berliner 1715). A parte 5’ do gene crylAB que codifica a toxina também foi amplificada através de PCR utilizando os oligonucleotídeos OcryWTõ e OcryWTC3 (5’-gccatttaaattaatcatattctgcctcaaaggt tacttctgccggaac-3’).

Um fragmento de PCR de 3.490 e 1.873 bp para os genes crylAb que codificam a pro-toxina CrylAb e a toxina CrylAb, respectivamente, foi 25 purificado e clonado no vetor pPCRscript para gerar pCLT408 e pCLT407, respectivamente.

Um fragmento de pCLT408 Ncol/Swal contendo o gene crylAb foi clonado nos sítios de restrição Ncol e Swal de pCLT317, resultando em

pCLT327 que contém o cassette CRYL327 (SEQ ID N° 17). Um fragmento de Ncol/Swal pCLT407 que contém o gene crylAb da toxina foi clonado nos sítios de restrição de Ncol e Swal de pCLT317, resultando em pCLT329 que contém o cassette CRYS329 (SEQ ID N° 18). O pCLT327 e pCLT329 conduzem o 5 AADA-166 e os cassettes CRYL327 ou CRYS329 na orientação de transcrição inversa do gene 16SrDNA de soja nativa. Os cassettes CRYL327 ou CRYS329 são dirigidos pelo PrrnL::G10L, mas sem o primeiro 14aa do GFP.

Um fragmento de Ncol/Sfil pCLT317 que contém o

PrrnL::G10L::14aaGFP foi ligado a pCLT327 digerido pelas enzimas de restrição Ncol e Sfil para formar pCLT325 que contém o cassette CRYL325 (SEQ ID N° 16). O pCLT325 conduz os dois cassetes de expressão AADA-166 e CRYL325 na orientação de transcrição inversa do Prm nativo. Um fragmento de Ncol/Swal pCLT325 que contém o gene crylAb que codifica a pro-toxina foi clonado nos sítios de restrição de Ncol e Swal de pCLT318, resultando em pCLT322. O pCLT322 conduz os dois cassetes de expressão AADA-166 e

CRYL327 na mesma orientação de transcrição do Prrn nativo. O gene crylAb

de protoxina é dirigido pelo PrrnL::G10L, mas sem o primeiro 14aa do GFP.

Um fragmento de Swal/Sfil pCLT325 que contém

PrrnL::G10L::14aaGFP foi ligado a pCLT318 digerido pelas enzimas de restrição Swal e Sfil para formar pCLT324. O pCLT324 conduz os dois cassetes de expressão AADA-166 e CRYL325 na mesma orientação de transcrição do Prrn nativo. O gene crylAb que codifica a pro-toxina é dirigido pelo PrrnL::G10L::14aaGFP.

9.2. Transformação

Experimentos de transformação de plastídeos foram conduzidos conforme descrito nos Exemplos 2 e 3 através de bombardeamento de tecido embriogênico de soja, utilizando partículas de ouro revestidas com todos os vetores de transformação de plastídeos descritos acima. Supostos

transformardes foram selecionados conforme descrito no Exemplo 3 sobre meio de espectinomicina. A fim de distinguir evento transplastômico de transformante mutante ou nuclear espontâneo, foi realizada análise de PCR sobre o DNA total de cada calo resistente a antibióticos obtido, utilizando vários

pares específicos de oligonucleotídeos.

9.3. Análise de Soja Transplastômica Resistente a Insetos

Análise de PCR utilizando um prímer depositado sobre o plastoma nativo, fora da região de recombinação homóloga, enquanto o depósito do outro sobre os genes aadA e crylAb demonstrou que os calos resistentes a 10 espectinomicina são transplastômicos.

Utilizando FlashKits Bt CrylAb (ABC Biokits), foi examinado o acúmulo de proteína CrylAb em embriões de soja WT e transplastômica. Os resultados demonstram que o surgimento de uma faixa (linha de amostra vermelha) para o evento transplastômico de pCLT327 e não para o WT. O 15 evento transplastômico pCLT327 expressa desta forma a proteína CrylAb.

Claims (8)

1. Reivindicações

   1. MÉTODO PARA A OBTENÇÃO DE PLANTAS DE SOJA, transplastômicas férteis, caracterizado pelo fato de compreender as etapas de:

   5 (a) transformação de tecidos embriogênicos obtidos a partir de embriões imaturos de plantas de soja com um vetor apropriado para a transformação de plastídeos;

   (b) seleção dos tecidos transformados; e (c) regeneração de plantas transplastômicas férteis a partir dos 10 tecidos transformados;

   em que o vetor apropriado para a transformação de plastídeos é um vetor que compreende pelo menos duas sequências homólogas a uma zona do plastoma da planta de soja a ser transformada, em que as mencionadas sequências homólogas flanqueiam pelo menos um cassete de 15 expressão, em que as ditas sequências homólogas correspondem a sequências que permitem a integração do cassete de expressão em uma região intergênica do plastoma e em que uma das duas sequências homólogas compreende os genes que codificam RNA ribossômico 16S (16SrRNA) e o RNA de transferência de valina (TrnV), sendo que a outra sequência homóloga 20 compreende a região intergênica localizada entre o gene TrnV e o operon rps12/7.
2. 2. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato da sequência homóloga que compreende os genes que codificam o RNA ribossômico 16S (16SrRNA) e o RNA de transferência de valina (TrnV) 25 ser representada pelo identificador de sequências SEQ ID N° 1, sendo que a sequência homóloga que compreende a região intergênica localizada entre o gene TrnV e o operon rps12/7 é representada pelo identificador de sequências SEQ ID N° 2.

   Petição 870190026679, de 20/03/2019, pág. 8/10
3. 3. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato da sequência homóloga que compreende os genes que codificam o RNA ribossômico 16S (16SrRNA) e o RNA de transferência de valina (TrnV) ser posicionada a 5' do cassete de expressão, sendo que a sequência homóloga que compreende a região intergênica localizada entre o gene TrnV e o operon rps12/7 é posicionada a 3' do cassete de expressão.
4. 4. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações

   1 a 3, caracterizado pelo fato das ditas sequências homólogas flanquearem, além de um cassete de expressão que compreende uma sequência que codifica uma proteína de interesse, pelo menos um outro cassete de expressão que compreende uma sequência que codifica um marcador de seleção.
5. 5. VETOR DE TRANSFORMAÇÃO, apropriado para a transformação de plastídeos de soja, caracterizado pelo fato de compreender pelo menos duas sequências homólogas a uma zona do plastoma da planta de soja a ser transformada, em que as mencionadas sequências homólogas flanqueiam pelo menos um cassete de expressão, e em que uma das duas sequências homólogas compreende os genes que codificam RNA ribossômico 16S (16SrRNA) e o RNA de transferência de valina (TrnV), sendo que a outra sequência homóloga compreende a região intergênica localizada entre o gene TrnV e o operon rps12/7.
6. 6. VETOR, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato da sequência homóloga que compreende os genes que codificam o RNA ribossômico 16S (16SrRNA) e o RNA de transferência de valina (TrnV) ser representada pelo identificador de sequências SEQ ID N° 1, sendo que a sequência homóloga que compreende a região intergênica localizada entre o gene TrnV e o operon rps12/7 é representada pelo identificador de sequências SEQ ID N° 2.

   Petição 870190026679, de 20/03/2019, pág. 9/10
7. 7. VETOR, de acordo com a reivindicação 5 ou 6, caracterizado pelo fato da sequência homóloga que compreende os genes que codificam o RNA ribossômico 16S (16SrRNA) e o RNA de transferência de valina (TrnV) ser posicionada a 5' do cassete de expressão, sendo que a

   5 sequência homóloga que compreende a região intergênica localizada entre o gene TrnV e o operon rps12/7 é posicionada a 3' do cassete de expressão.
8. 8. VETOR, de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a 7, caracterizado pelo fato das ditas sequências homólogas flanquearem, além de um cassete de expressão que compreende uma sequência que codifica