BRPI0314086B1 - Processo de produção de planta transgênica tendo sensibilidade a ácido abscísico aumentada através da introdução de ácido nucleico que codifica polipeptídeo beta da farnesil transferase mutado, aumentando assim a tolerância ao estresse e senescência em plantas - Google Patents

Abstract

"tolerância ao estresse e senescência retardada em plantas". as novas construções e processos desta invenção aumentam a tolerância em plantas a estresses ambientais e a senescência. os ácidos nucléicos que codificam uma farnesil transferase vegetal são descritos, assim como são as plantas e sementes transgênicas que incorporam estes ácidos nucléicos e proteínas. são também fornecidos inibidores da farnesil transferase que ocorre naturalmente que, quando expressa, aumentará a tolerância à seca nas plantas, aumentará a resistência à senescência e modificará o hábito de crescimento.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para PROCESSO DE PRODUÇÃO DE PLANTA TRANSGÊNICA TENDO SENSIBILIDADE A ÁCIDO ABSCÍSICO AUMENTADA ATRAVÉS DA INTRODUÇÃO DE ÁCIDO NUCLEICO QUE CODIFICA POLIPEPTÍDEO BETA DA FARNESIL TRANSFERASE MUTADO, AUMENTANDO ASSIM A TOLERÂNCIA AO ESTRESSE E SENESCÊNCIA EM PLANTAS.

FUNDAMENTO DA INVENÇÃO

A maior parte das plantas superiores encontra decréscimos pelo menos transitórios em relação ao teor de água em algum estágio de seu ciclo de vida e, como um resultado, evoluiu um número de mecanismos de proteção à dessecação. Se, entretanto, a alteração no déficit de água for prolongada, os efeitos sobre o crescimento e o desenvolvimento da planta podem ser profundos. O menor teor de água devido aos estresses hídricos, por calor ou por sais pode danificar as células vegetais de forma irreparável que por sua vez limita o crescimento da planta e a produtividade da planta de cultivo na agricultura.

As plantas respondem a condições adversas de seca, salinidade e calor com uma variedade de alterações morfológicas e fisiológicas. Embora nosso entendimento de mecanismos de tolerância de plantas a estes estresses seja fragmentar, foi proposto que o hormônio vegetal ácido abscísico (ABA) é um mediador essencial entre os estímulos ambiental e as repostas da planta. Os níveis de ABA aumentam em resposta a déficits hídricos e o ABA aplicado de forma exógena imita muitas das respostas normalmente induzidas pelo estresse hídrico. Uma vez que o ABA é sintetizado, este faz com que os estômatos foliares se fechem diminuindo assim a perda da água através da transpiração.

A identificação de genes que transduzem o ABA em uma resposta celular abre a possibilidade de explorar estes reguladores para aumentar a tolerância à dessecação em espécies de plantas de cultivo. A princípio, estes genes sinalizadores do ABA podem ser acoplados com os elementos de controle apropriados para permitir o crescimento e o desenvolvimento ótimo de plantas. Assim, não somente estes genes permitiríam o ajusSegue-se folha 1a

1a te genético das plantas de cultivo para suportar os insultos ambientais transitórios, como deveriam também ampliar os ambientes em que as plantas de cultivo tradicionais podem ser cultivadas.

Segue-se folha 2

trolam o crescimento e o desenvolvimento de plantas. Os genes que afetam adicionalmente outros processos metabólicos tais como a senescência e os hábitos de cultivo das plantas podem ser úteis em uma ampla variedade de plantas de cultivo e de plantas de horticultura.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Esta invenção se refere a ácidos nucléicos que codificam uma farnesil transferase que compreende a SEQ ID N²: 1 ou a SEQ ID N^e: 172.

Os ácidos nucléicos também abrangidos por esta invenção são tais seqüên-

cias de hibridização que codificam o equivalente ou o fragmento funcional das mesmas da SEQ ID N^e: 1 ou da SEQ ID N²: 172. A presente invenção se refere ainda a um método para aumentar a tolerância à seca de plantas utilizando inibidores dos produtos codificados por estes ácidos nucléicos. Ainda, esta invenção se refere ao controle de funções reguladoras em organismos fotossintéticos; por exemplo, no controle do hábito de crescimento, 15 da fluorescência, da produção de sementes, da germinação de sementes e * da senescência em tais organismos.

Esta invenção se refere ainda a um método para aumentar a tolerância à seca ou ao estresse de plantas através de alterações em ácidos nucléicos isolados ou recombinantes que codificam uma proteína farnesil 20 transferase (Ftase) ou um fragmento da mesma ou seu equivalente funcional. Os ácidos nucléicos que se hibridizam com o gene que codifica a Ftase (ERA1) são também abrangidos por esta invenção quando tais seqüências de hibridização codificam o equivalente funcional da proteína Ftase. A presente invenção também se refere a um método para aumentar a tolerância à 25 seca de plantas através da manipulação genética do gene ERA1 e seus equivalentes funcionais para aumentar a tolerância ao estresse em plantas de cultivo. A perda da função do gene ERA1 confere maior tolerância à seca no nível da planta madura. A natureza de um mutante de era1 com a perda da atividade da Ftase, por exemplo, demonstra que a inibição da farnesilação 30 aumenta as respostas do ABA em uma planta.

Ainda, esta invenção se refere à inibição da senescência em organismos fotossintéticos através da inibição da atividade da farnesil transfe-

rase. Os organismos fotossintéticos resultantes permanecem verdes e a viabilidade dos tecidos é mantida durante um período mais longo de tempo. Assim, os métodos para fornecer plantas mais verdes e uma redução na senescência fazem parte desta invenção.

Ainda em uma outra modalidade, são fornecidos métodos para modificar o hábito de crescimento e a indução de fluorescência das plantas. A perda da função do gene ERA1 sob condições ambientais particulares resulta em uma redução no número de ramos laterais produzidos em uma planta e um aumento no número de flores por inflorescência.

A invenção fornece ainda um método de produção de uma planta transgênica, que possui um fenótipo alterado tal como uma maior tolerância ao estresse (por exemplo, déficit hídrico, maior biomassa, maior rendimento), senescência retardada ou maior sensibilidade ao ABA através da introdução em uma célula vegetal de um composto que inibe a famesilação 15 de um polipeptídeo que compreende um motivo CaaX. Por inibição da farnesilação entende-se incluir que o composto inibe uma ou mais etapas no processo de três etapas de famesilação. Em um aspecto, o composto inibe a expressão ou a atividade da farnesiltransferase, da prenilprotease ou da prenilcisteína carboxil metiltransferase. Alternativamente, o composto é um 20 ácido nucléico anti-sentido da farnesil transferase ou um ácido nucléico em

grampo de cabelo de inibição do RNA de filamento duplo da farnesil transferase. Em alguns aspectos, o ácido nucléico está ligado de forma operacional a um promotor tal como um promotor constitutivo, um promotor que pode ser induzido pelo ABA, promotores específicos ao tecido ou um promotor espe cífico à célula-guarda.

Os exemplos de ácidos nucléicos anti-sentido são 20 ou mais ácidos nucléicos consecutivos complementares à SEQ ID N°: 1, 14, 40, 43,

80-85 ou 172. Alternativamente, os ácidos nucléicos anti-sentido incluem a SEQ iD Ni²: 36, 41,44 ou 54-64.

Em vários aspectos, o composto é um ácido nucléico que codifica o polipeptídeo da farnesiltransferase, da prenilprotease ou da prenilcisteína carboxil metiltransferase do fragmento da mesma. Alternativamente, o

- ί.

0' ‘ V

X

V? ν composto é um ácido nucléico que codifica um polipeptídeo mutado da farnesiltransferase, da prenilprotease ou da prenilcisteína carboxil metiltransferase do fragmento da mesma. Por mutado entende-se que o polipeptídeo não possui pelo menos uma atividade do polipeptídeo do tipo selvagem tal 5 como, por exemplo, a interação de subunidades, a ligação ao substrato ou a catálise de enzimas. Um polipeptídeo mutado forma um dímero, tal como um

heterodímero. Por exemplo, um polipeptídeo beta da farnesiltransferase mutada forma um dímero com um polipeptídeo alfa da farnesiltransferase. Preferencialmente, o polipeptídeo é menor que 400, 350, 314, 300 ou 200 ami10 noácidos de comprimento. Por exemplo, o composto inclui a SEQ ID N^e: 1,

14, 40, 43, 80-85 ou 172.

Em um aspecto adicional, o composto é um ácido nucléico que codifica um motivo CaaX ou um ácido nucléico que codifica um motivo CaaX ligado de forma operacional a um promotor.

Também estão incluídas na invenção as plantas produzidas pelos métodos da invenção e a semente produzida pelas plantas que produzem uma planta que possui um fenótipo alterado.

Esta invenção se refere ainda a uma seqüência reguladora útil para a engenharia genética de células vegetais para fornecer um método de 20 controle do padrão de expressão no tecido das seqüências de DNA ligadas a esta nova seqüência reguladora.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

As Figuras 1A-1C mostram a seqüência de ácido nucléico do gene ERA1 (SEQ ID N°: 1) em que os íntrons estão sublinhados e o códon 25 de início (ATG) está nas posições de nucleotídeos 1-3.

A Figura 2 é a seqüência de aminoácidos da proteína ERA1 (SEQ ID Ν^Ώ: 2).

As Figuras 3A-3B mostram a seqüência de ácidos nucléicos do promotor de ERA1 (SEQ iD N^s: 3).

A Figura 4 é a seqüência de aminoácidos da subunidade β do domínio de farnesilação de Arabidopsis (Arab.) (SEQ ID N°: 2) alinhada com a subunidade β dos domínios de farnesilação da ervilha (SEQ ID N°: 4), da

	levedura (SEQ ID Ns: 5) e do rato (SEQ ID N2: 6). Os resíduos que são idênticos aos da seqüência de Arabidopsis estão indicados com um ponto. Um traço indica um branco. As posições de aminoácidos do gene de Arabidopsis estão indicadas do lado direito.
5	A Figura 5 é uma fotografia de uma planta de Arabidopsis transformada com era1 (à direita) comparada com a planta do tipo selvagem (controle; isto é, que ocorre naturalmente) (à esquerda) sob condições extremamente secas. A Figura 6 é um gráfico que compara o teor de água de plantas
io	de Arabidopsis com atividade inativada ou mutante da Ftase (M. Columbia, era 1-2) e controles (M. C. controle, controle de era 1-2). A Figura 7 é um gráfico que compara a taxa de perda de água para as plantas de Arabidopsis com atividade inativada ou mutante da Ftase (Λ4. Columbia, era 1-2) e controles (M. C. controle, controle de era 1-2).
15 »	As Figura 8A-8E são comparações de folhas em envelhecimento das plantas de controle (do tipo selvagem) e das mutantes para era-2. As Figuras 9A-9C são comparações de níveis de transcrição em folhas em envelhecimento das plantas de controle (do tipo selvagem) e das mutantes para era-2.
20	A Figura 10 é uma ilustração que representa o constructo do ve-
	tor FTA anti-sentido pBI121. A Figura 11 é uma ilustração da análise de hibridização de Southem genômico de Arabidopsis thaliana transgênica anti-FTA. A Figura 12 é uma ilustração da análise de Northern de cinco
25	linhagens de Arabidopsis thaliana 35S-anti-FTA (plantas T3). A Figura 13 mostra uma análise de expressão por Western utilizando anticorpos anti-FTA para detectar os polipeptídeos FTA. A Figura 14 é um conjunto de fotografias que mostram os efeitos do ABA sobre o crescimento e o desenvolvimento das piantas novas. As
30	plantas novas transgênicas anti-sentido para FTA exibem maior sensibilidade ao ABA.

A Figura 15 mostra o efeito do ABA sobre o crescimento e o de-

senvolvimento de plantas novas.

A Figura 16 mostra fotografias de linhagens Columbia do tipo selvagem (A) e quatro transgênicas anti-sentido para FTA (B, C, D, E) de Arabidopsis thaliana após 8 dias sem regar.

A Figura 17 é uma ilustração da homologia entre as sequências de ácido nucléico (A) e de aminoácidos (B) de FTA provenientes de várias espécies de plantas com base na análise de ClustalW (é exibida a identidade percentual).

A Figura 18 é uma ilustração da homologia entre as seqüências

de ácido nucléico e de aminoácidos de FTB provenientes de várias espécies de plantas com base na análise de ClustalW (é exibida a identidade percentual).

A Figura 19 é uma ilustração do desempenho transgênico durante o estresse hídrico.

A Figura 20 é uma ilustração do peso fresco de brotos ou do a_w cúmulo de biomassa, após 6 dias de tratamento de estresse hídrico e 6 dias de tempo de recuperação.

A Figura 21 é uma ilustração do rendimento de sementes (gramas) obtido sob condições ótimas ou após um tratamento de estresse hídri20 co de 6 dias.

A Figura 22 é uma ilustração do crescimento vegetativo sob condições ótimas, é mostrado o peso fresco dos brotos 6 dias após a primeira flor ter aberto.

A Figura 23 é uma ilustração do efeito de um estresse biótico acoplado ao tratamento de estresse hídrico sobre o rendimento de sementes.

A Figura 24 é uma ilustração representativa da análise por eletroforese em gel dos produtos da PCR em um ensaio para detectar linhagens transgênicas de Brassica napus.

A Figura 25 é uma representação esquemática dos constructos de vetores; A) pBI121-AtCPP, B) pBI121-AtCCP anti-sentido, C) pBI121-HPAtCPP.

A Figura é uma ilustração das identidades de seqüência de

ácido nucléico (A) e de aminoácidos (B) que são determinadas através da análise de ClustaIW.

A Figura 27 é uma varredura de um Southern blot típico de li5 nhagens transgênicas de Arabidopsis T1 que carregam o constructo pBI121 AtCPP.

A Figura 28 é uma varredura de um Southern blot típico de linhagens transgênicas de Arabidopsis T3 que carregam o constructo pB1121 HP-AtCPP.

A Figura 29 é uma varredura de um Southern blot típico de linhagens transgênicas de Arabidopsis que carregam o constructo pRD29AAtCPP.

A Figura 30 é uma varredura de um Southern blot típico de linhagens transgênicas de Arabidopsis que carregam o constructo pRD29A15 HP-AtCPP.

A Figura 31 é uma ilustração que mostra a expressão relativa do produto da transcrição do mRNA de AtCPP (barras preenchidas) e os níveis da proteína AtCPP (barras pontilhadas) em várias linhagens transgênicas pB1121-AtCPP.

A Figura 32 é um histograma que mostra a porcentagem das linhagens que foram categorizadas como sensíveis ao ABA, moderadamente sensíveis ao ABA ou insensíveis ao ABA. As plantas novas foram analisadas sobre placas com ágar contendo 1 μΜ de ABA e avaliadas no 21² dia de crescimento. Trinta e seis linhagens do constructo de superexpressão de pBI121-AtCPP foram analisadas no 21² dia através do desenvolvimento de folhas e de plantas novas. Trinta e duas linhagens do constructo de regulação para menos 35S-HP-AtCPP foram analisadas no 21² dia em relação ao desenvolvimento de folhas e plantas novas. Cada linhagem foi analisada através da plantação de aproximadamente 100 sementes por piaca e as plantas novas foram avaliadas e registradas na forma da porcentagem de plantas novas insensíveis por placa. Cada linhagem foi então expressa na forma de uma porcentagem do tipo selvagem (Wt). As linhagens foram cate8

gorizadas como sensíveis (menos que 1 % de Wt) barras preenchidas, intermediárias (1-50% de Wt) com linhas diagonais ou insensíveis (mais de 50% de Wt) pontilhadas, com base em sua relação ao Wt e a porcentagem de cada categoria foi representada graficamente como um histograma.

A Figura 33 é uma ilustração que mostra a resposta da linhagem do tipo selvagem e de uma transgênica pRD29A-HP-AtCPP a várias concentrações de ABA em plantas novas de duas semanas de idade.

A Figura 34 é um histograma que mostra a análise de plantas

transgênicas contendo o constructo de superexpressão pBI121-AtCPP, (SEQ ID N^e: 4). Perda de água por grama de peso seco de broto após quatro dias de tratamento de estresse hídrico. As linhagens que estão marcadas com uma estrela são as que eram mais sensíveis ao ABA. As linhagens marcadas com um triângulo são moderadamente sensíveis ao ABA. As barras representam as médias de oito réplicas. As linhagens marcadas com um 15 ponto preenchido acima da barra representam linhagens que eram significativamente diferentes do controle em um valor de p = 0,05.

A Figura 35 é um histograma que mostra o rendimento de sementes em gramas de linhagens transgênicas de Arabidopsis de pBI121AtCPP cultivadas sob condições hídricas ótimas.

A Figura 36 é um gráfico de barras que mostra o crescimento e o rendimento de linhagens transgênicas de Arabidopsis de pBI121-AtCPP cultivadas sob condições hídricas ótimas mais uma condição de estresse biótico. São representados graficamente rendimentos na forma de uma % do tipo selvagem, o número de folhas por roseta, o peso fresco de folhas por roseta e peso seco dos brotos.

A Figura 37 são fotografias que mostram o crescimento das linhagens transgênicas de Arabidopsis de pBI121-AtCPP cultivadas em placas de ágar. As alterações visíveis no crescimento da raiz.

A Figura 38 é um gráfico de barras que mostra o crescimento de 30 linhagens transgênicas de Arabidopsis de pBI121-HP-AtCPP cultivadas sob condições hídricas ótimas. São representados graficamente o número de folhas por roseta, o peso seco de folhas por roseta e o peso seco dos brotos.

A Figura 39 é uma fotografia que mostra o Northern blot de plantas de Arabidopsis AN90AtFTB.

Os objetivos, as características e as vantagens anteriores e outros da invenção serão evidentes partindo da descrição mais particular a se5 guir das modalidades preferidas da invenção, que são ilustradas nas figuras em anexo nas quais como características de referência se referem às mesmas partes através das visões diferentes. As figuras não estão necessariamente em escala, sendo ao invés disso colocada ênfase sobre a ilustração

dos princípios da invenção.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Esta invenção se refere a plantas transgênicas que exibem um fenótipo alterado, por exemplo, maior tolerância ao estresse, senescência retardada, maior sensibilidade ao ABA, maior rendimento, maior produtividade e maior biomassa e métodos de produção das plantas através da introdu15 ção em uma célula vegetal de um composto que inibe a farnesilação de um polipeptídeo que compreende um motivo CaaX.

A farnesilação de proteínas, a adição de uma cadeia de 15 carbonos C-terminal, na proteína e o processamento subseqüente é uma reação enzímática de três etapas que inclui a farnesilação, a divagem proteolíti20 ca e a metilação. Em primeiro lugar, uma farnesiltransferase adiciona a cadeia de 15 carbonos C-terminal a um resíduo de cisteína conservado do motivo CaaX, onde C é uma Cistina, a é um aminoácido alifático e X é qualquer aminoácido. Em segundo lugar, os últimos três resíduos de aminoácidos (aaX) são clivados por uma prenil protease. Por último, a cisteína 25 modificada é metilada por uma metilase para criar o produto ativo final da via de farnesilação de proteínas. A Requerente mostrou que a superexpressão e a regulação para menos do gene da farnesil transferase alfa ou beta nas células vegetais (isto é, a primeira etapa na farnesilação) resultam em plantas com um fenótipo alterado tal como, mas não limitado à tolerância à seca 30 e à senescência retardada. As requerentes também mostraram que a superexpressão e a regulação para menos do gene da prenil protease (isto é, a segunda etapa na farnesilação) em células vegetais também resulta em uma

planta que exibe um fenótipo alterado incluindo, por exemplo, mas não limitado à tolerância à seca e à maior resistência ao estresse biótico e abiótico.

Estes resultados tomados juntos sustentam a hipótese de que a modificação da expressão de qualquer uma das enzimas na via da farnesilação (farnesil5 transferase, prenilprotease ou prenicisteína carboxil metiltransferase) em uma célula vegetal resultará em uma planta que exibe um fenótipo alterado.

A presente invenção fornece ainda novas seqüências de ácido nucléico da farnesiltransferase (isto é, alfa e beta), (Ftase) da CaaX prenil protease (CPP) isoladas, por exemplo, de Arabidopsis thaliana (At), Brassica

napus (Bn) e Glycine Max (Gm). A invenção fornece ainda os ácidos nucléicos anti-sentido da farnesiltransferase e da CaaX prenil protease e constructos que compreendem estes ácidos nucléicos. As seqüências são coletivamente referidas como ácidos nucléicos PPI, polinucleotídeos PPI ou ácidos nucléicos anti-sentido PPI e o polipeptídeo correspondente codificado é referido como um polipeptídeo PPI ou uma proteína PPI. A não ser que seja indicado de outra forma, entende-se que PPI se refira a qualquer uma das novas seqüências descritas aqui. A Tabela A abaixo resume os ácidos nucléicos e os polipeptídeos de acordo com a invenção

TABELA A

Descrição da Seqüência PPI	SEQ ID N°:
era1 (FTB)	1
era1 (FTB)	2
Promotor de ERa1	3
FTB de ervilha	4
FTB de levedura	5
FTB de rato	6
FTA de At	7
FTA de at	8
FTA de at	9
pBI121-35S-anti-AtFTA	10
FTA de at	11

FTAdeBn 12

FTA de Bn	13
FTB de Bn	14
FTB de Bn	15
iniciador	16
iniciador	17
iniciador	18
iniciador	19
iniciador	20
iniciador	21
iniciador	22
iniciador	23
iniciador	24
iniciador	25
iniciador	26
iniciador	27
iniciador	28
iniciador	29
iniciador	30
iniciador	31
iniciador	32
iniciador	33
iniciador	34
FTA de Bn	35
FTB de Bn	36
FTA de Gmax	37
FTA de Gmax	38
FTA de Gmax	39
G max FTB	40
G max FTB	41
G max FTB	42
FTB de milho Zea	43
FTB de milho Zea	44

FTB de milho Zea	45
pBI121-35S-AtFTA	46
pBI121-rd29A-anti-AtFTA	47
pBI121-35S-DA-AtFTA	48
pB1121 -RD29A-DA-AtFTA	49
MuA-anti-GmFTA	50
RD29A-anti-GmFTA	51
MuA-HP-GmFTA-Nos-Term	52
RD29AP-HP-GmFTA-Nos-Term	53
pBI121-35S-Anti-AtFTB	54
pBI121 -RD29AP-Anti-AtFTB	55
pBI121-35S-HP-AtFTB	56
pB1121 -RD29AP-HP-AtFTB	57
pBI121-35S-AtFTB	58
MuA-anti-GmFTB-Nos-Term	59
RD29AP-anti-GmFTB-Nos-Term	60
MuA-HP-GmFTB-Nos-Term	61
RD29AP-HP-GmFTB-Nos-Term	62
MuA-anti-FTB de milho Zea-Nos-Term	63
MuA-HP-FTB de milho Zea-Nos-Term	64
Ervilha-FT-A	65
Tomate-FTA	66
Arroz-FT-A	67
FT-A de milho Zea	68
Soja1-Ft-A	69

Soja2-FT-A	70
Triticum-FT-A	71
Ervilha-FT-A	72
Tomate-FTA	73
Arroz-FT-A	74
FT-A de milho Zea	75
Soja1-Ft-A	76
Soja2-FT-A	77
Triticum-FT-A	78
Vetor de FTB truncado com N90 FTB de At	79
Wiggum (FTB)	80
Dup-Soja-FTB	81
Dup-Milho-FTB	82
Ervilha-FT-B	83
Tomate-FTB	84
Tabaco-FTB	85
Iniciador Saci avançado	86
Wiggum (FTB)	87
Dup-Soja-FTB	88
Dup-Milho-FTB	89
Ervilha-FT-B	90
Tomate-FTB	91
Tabaco-FTB	92
Consensos FTA	93
Consensos FTB	94
Consensos FTA	95
Consensos FTB	96
AtCPP	97
AtCPP	98
AÍ-AFC1
pB1121-AtCPP	99
pBI121-HP-AtCPP	100
AtCPP BamFW	101

AtCPP SmaRV	102
AtCPP-HP-SacFW	103
AtCPP-HP-SacRV	104
pB1121-AtCPP Avançado	105
pBI121-antiAtCPP-SmaFW	106
pBI121-antiAtCPP-BamRV	107
p35S-HP-AtCPP Reverse	108
BnCPP	109
BnCPP	110
BnCPP antisense	111
GmCPP	112
GmCPP	113
GmCPP antisense	114
AtCPP antisense	115
SOJA-AT1	116
SOJA-AT1	117
SOJA-AT2	118
SOJA-AT2	119
SOJA-Milho	120
SOJA-Milho	121
SOJA-Soja	122
SOJA-Soja	123
AFC1	124
AFC1	125
AT4g01320	126
AT4g01320	127
AF007269	128
AF007269	129
pBI121-antisense-AtCPP	130
pRD29A-AtCPP	131
pRD29A-HP-AtCPP	132
pRD29A-anti-sentido-AtCPP	133
MuA-AtCPP	134

, . . ~:.

MuA-GmCPP	135	V
pBI121-GmCPP	136
pBI121-HP-GmCPP	137
pB1121 -anti-sentido-GmCPP	138
pRD29A-GmCPP	139
pRD29A-HP-GmCPP	140
pRD29A-anti-sentido-GmCPP	141
pBI121-BnCPP	142
pBI121-HP-BnCPP	143
pBI121-anti-sentido-BnCPP	144
pRD29A-BnCPP	145
pRD29A-HP-BnCPP	146
pRD29A-anti-sentido-BnCPP	147
MuA-BnCPP	148
GmCPP SmaFW	149
GmCPP SacRV	150
BnCPP-anti-SmaFW	151
BnCPP-anti-BamRV	152
BnCPP-HP-Sac-FW	153
BnCPP-HP-Sac-RV	154
BnCPP-HP-BamFW	155
BnCPP-HP-XbaRV	156
GmCPP-HP-Sac-FW	157
GmCPP-HP-Sac-RV	158
GmCPP-HP-BamFW	159
GmCPP-HP-XbaRV	160
PRD29AP	161
Nosterm-RV	162
Consentido - SOJA	163
Consentido - SOJA	164
Consentido - Genérico	165
Consentido - Genérico	166
Consentido - PPI	167

Consentido - PPI	168
Consentido - PPI/Genérico	169
Consentido - PPI/Genérico	170
Iniciador BamHI REV	171
AtFTB de Comprimento Completo	172
pBI121-AtFTB de comprimento completo	173
Iniciador	174
Iniciador	175
isoprenilcisteína carboxil metiltransferase	176
AtFTB de Comprimento Completo	177

Esta invenção também se refere a ácidos nucléicos isolados e proteínas codificadas por estes ácidos nucléicos que modificam o crescimento, a reprodução e a senescência de plantas. Em particular, os constructos desta invenção incluem um ácido nucléico isolado que codifica um polipeptí5 deo da farnesil transferase (Ftase) que compreende a SEQ ID N°: 1 ou 172 ou seu equivalente funcional ou fragmento da mesma e estes polipeptídeos ou proteínas da Ftase de fragmentos dos mesmos codificados por estes ácidos nucléicos. Em particular, esta invenção se refere a uma proteína em que a seqüência é a SEQ ID N²: 2 ou a SEQ ID N°: 177.

Ainda incluídos nesta invenção são os constructos de ácidos nucléicos que compreendem um promotor (promotor de ERA1) ligado de forma operacional a um ácido nucléico isolado que compreende a SEQ ID N²: 1 ou 172 ou seu equivalente funcional ou um complemento de qualquer uma das duas. Quando incorporado em uma planta, o promotor de ERA1 é regulado nas células-guardas da planta e pode afetar a perda de água através dos estômatos. Este promotor consiste em um ácido nucléico que compreende a SEQ ID N²: 3 (Figura 3).

As plantas, as sementes, a célula vegetal e os tecidos transgênicos que incorporam estes constructos também fazem parte desta invenção.

Consequentemente, em um aspecto desta invenção, é fornecido um método

para a obtenção de um produto gênico sob o controle de um promotor que opera primariamente nas células-guardas através da expressão de um gene que codifica o produto gênico na célula de uma planta que compreende as

etapas de: transformação de uma célula vegetal com um constructo de DNA que compreende a) uma região reguladora que compreende a SEQ ID N-: 3 ou uma parte funcional da mesma, DNA que compreende um gene estrutural que codifica um produto gênico e uma região não traduzida 3' que contém uma região de poliadenilação; regeneração de uma planta, organismo fotossintético ou cultura de tecido proveniente da célula; e colocando a planta, os

organismos fotossintéticos ou a cultura de tecido sob condições de forma que o promotor induza a transcrição do gene estrutural e o produto gênico seja expresso.

No contexto desta descrição, os termos região reguladora ou promotor se referem a uma seqüência de DNA, geralmente a montante (5’) 15 da seqüência codificadora de um gene estrutural, que controla a expressão da região codificadora através do fornecimento de sítios de reconhecimento e de ligação para a RNA polimerase e/ou outros fatores necessários para que a transcrição comece no sítio correto. O termo parte funcional ou fragmento funcional se refere a uma seqüência truncada de um promotor 20 desta invenção que mantém a capacidade de induzir a transcrição de um gene estrutural ERA sob as condições descritas para a atividade de uma proteína Ftase.

Os constructos e os métodos descritos aqui podem ser aplicados a todos os tipos de plantas e outros organismos fotossintéticos, incluindo, 25 mas não limitados a: angiospermas (monocotiledôneas e dicotiledôneas), gimnospermas, plantas que portam esporos ou que se reproduzem de forma vegetativa e as algas, incluindo a cianofita (alga verde-azulada). As plantas particularmente preferidas são as plantas que fornecem plantas de cultivo comercialmente valiosas, tais como milho, trigo, algodão, arroz, canola, ca30 na-de-açúcar, beterraba, girassol, batatas, tomates, brócolis, cenouras, alface, maçã, ameixa, laranja, limão, rosa e similares.

Ainda, os constructos e os métodos desta invenção podem ser

adaptados para qualquer parte da planta, protoplasto ou cultura de tecido em que o tecido é derivado de um organismo fotossintético. Entende-se que o termo parte da planta inclua uma parte de uma planta capaz de produzir uma planta regenerada. As partes de planta preferidas incluem as raízes e os brotos e as partes meristemáticas dos mesmos. Outras partes de planta abrangidas por esta invenção são: folhas, flores, sementes, epicotilédones, hipocotilédones, cotilédones, nodos de cotilédones, explantas, pólen, óvulos, tecido meristemático ou embrionário, protoplastos e similares. As plantas transgênicas podem ser regeneradas de qualquer uma destas partes de planta, incluindo a cultura de tecido ou os protoplastos e ainda provenientes de explantas. Os métodos variarão de acordo com a espécie da planta.

Esta invenção se refere às composições e aos constructos que compreendem ácidos nucléicos isolados (tanto DNA quanto RNA) que codificam uma Ftase ou partes da mesma de organismos fotossintéticos. Esta invenção se refere ainda às composições e aos constructos que compreendem ácidos nucléicos que codificam um promotor da Ftase. Em particular, o gene ERA1 que codifica a subunidade β da Ftase de Arabidopsis e uma sequência reguladora que regula a transcrição do gene ERA1 foram isolados e seqüenciados. Os ácidos nucléicos que codificam as Ftases de organismos fotossintéticos e homólogos ou análogos destes ácidos nucléicos, são abrangidos por esta invenção.

A invenção se refere ainda a métodos que utilizam ácidos nucléicos isolados e/ou recombinantes (DNA ou RNA) que são caracterizados por sua capacidade de se hibridizarem a (a) um ácido nucléico que codifica uma proteína ou um polipeptídeo da Ftase, tal como um ácido nucléico que possui as seqüências da SEQ ID N°: 1 ou da SEQ ID N^Q: 172 ou (b) uma parte do anterior (por exemplo, uma parte que compreende os nucleotídeos mínimos necessários para codificar uma proteína Ftase funcional; ou através da capacidade de codificar um polipeptídeo que possui a seqüência de aminoácidos de uma Ftase (por exemplo, SEQ ID N°: 2 ou SEQ ID N²: 177) ou de codificar equivalentes funcionais da mesma; por exemplo, um polipeptídeo que possui pelo menos 80% de similaridade de seqüência com a SEQ

ID N²: 2 ou com a SEQ ID N²: 177, que quando incorporado em uma célula vegetal, facilita o hábito de crescimento, a germinação das sementes e o metabolismo em um organismo fotossintético da mesma maneira que a SEQ ID N²: 1 ou 172). Um equivalente funcional de uma Ftase, portanto, teria pelo menos uma sequência de aminoácidos 80% similar e características similares, ou funcionaria substancialmente da mesma maneira que o polipeptídeo codificado pela SEQ ID N²: 2 ou SEQ ID N²: 177. Um ácido nucléico que se hibridiza com um ácido nucléico que codifica um polipeptídeo da Ftase tal como a SEQ ID N²: 2 ou a SEQ ID N²: 177 pode ter filamento duplo ou simples. A hibridização com o DNA tal como o DNA que possui a seqüência da SEQ ID N²: 1 ou 172, inclui a hibridização com o filamento mostrado ou com seu filamento complementar.

Em uma modalidade, a porcentagem de similaridade de seqüências de aminoácidos entre um polipeptídeo da Ftase tal como a SEQ ID N²: 2 ou a SEQ ID N²: 177 e equivalentes funcionais dos mesmos é de pelo menos aproximadamente 60% (>60%). Em uma modalidade preferida, a porcentagem de similaridade de seqüências de aminoácidos entre um polipeptídeo da Ftase e seus equivalentes funcionais é de pelo menos aproximadamente 75% (>75%). Mais preferencialmente, a porcentagem de similaridade de seqüências de aminoácidos entre um polipeptídeo da Ftase e seus equivalentes funcionais é de pelo menos aproximadamente 80% e ainda mais preferencialmente, de pelo menos aproximadamente 90%, quando aminoácidos consecutivos são comparados.

Os ácidos nucléicos isolados e/ou recombinantes que obedecem estes critérios compreendem ácidos nucléicos que possuem seqüências idênticas às seqüências de genes ERA1 que ocorrem naturalmente e de partes das mesmas ou variações dos genes que ocorrem naturalmente. Tais variações incluem mutantes que diferem pela adição, deleção ou substituição de um ou mais nucleotídeos, ácidos nucléicos modificados em que um ou mais nucleotídeos estão modificados (por exemplo, análogos de DNA ou de RNA) e mutantes que compreendem um ou mais nucleotídeos modificados.

Tais ácidos nucléicos, incluindo DNA ou RNA, podem ser detectados e isolados através da hibridização sob condições de alto rigor ou condições de rigor moderado, por exemplo, que são escolhidas de forma a não permitir a hibridização de ácidos nucléicos que não possuem seqüências complementares. As condições rigorosas para as hibridizações é um termo da técnica que se refere às condições de temperatura e de concentração de tampão que permitem a hibridização de um ácido nucléico particular com um outro ácido nucléico em que o primeiro ácido nucléico pode ser perfeitamente complementar ao segundo ou o primeiro e o segundo podem compartilhar algum grau de complementaridade que é menos que perfeito. Por exemplo, podem ser utilizadas certas condições de alto rigor que distinguem perfeitamente os ácidos nucléicos complementares daqueles com menos complementaridade. Condições de alto rigor e condições de rigor moderado para as hibridizações de ácidos nucléicos são explicadas nas páginas 2.10.12.10.16 (ver particularmente 2.10.8-11) e nas páginas 6.3.1-6 em Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel, F.M. e outros., eds., Vol. 1, contendo suplementos até o Suplemento 29, 1995), cujos ensinamentos são incorporados aqui como referência. As condições exatas que determinam o rigor da hibridização dependem não somente da força iônica, da temperatura e da concentração de agentes desestabilizantes tal como a formamida, mas também de fatores tais como o comprimento da seqüência de ácido nucléico, da composição de bases, da porcentagem de pareamentos errados entre as seqüências que se hibridizam e a freqüência de ocorrência de subconjuntos de tal seqüência dentro de outras seqüências não idênticas. Assim, as condições de rigor alto ou moderado podem ser determinadas de forma empíri ca.

Os procedimentos de hibridização de alto rigor podem (1) empregar baixa força iônica e alta temperatura para lavagem, tal como 0,15 M de NaCI/0,0015 M de citrato de sódio, pH 7,0 (0,1X de SSC) com 0,1% de dodecil sulfato de sódio (SDS) a 50°C; (2) empregar durante a hibridização 50% (v/v) de formamida com soluções de Denhardt 5X (0,1% peso/volume de albumina de soro bovino altamente purificada/0,1% p/v de Ficoll/0,1 % p/v de

X^4, >Ρ * Lftpolivinilpirrolidona), 50 mM de tampão de fosfato de sódio em pH 6,5 e 5X de

SSC a 42°C; ou (3) empregar a hibridização com 50% de formamida, 5X de

SSC, 50 mM de fosfato de sódio (pH 6,8), 0,1% de pirofosfato de sódio, soluções de Denhardt 5X, DNA de esperma de salmão submetido ao ultra-som (50 Mg/mL), 0,1% de SDS e 10% de sulfato de dextrano a 42°C, com lavagens a 42°C em 0,2X de SSC e 0,1 % de SDS. As condições de rigor moderado seriam similares exceto pelo fato de que a hibridização empregaria 25% de formamida no lugar de 50% de formamida.

Variando as condições de hibridização partindo de um nível de rigor no qual não ocorre hibridização até um nível em que a hibridização é primeiro observada, podem ser determinadas as condições que permitirão que uma certa seqüência se hibridize com as seqüências mais similares na amostra.

Os exemplos de condições estão descritos em Krause, Μ. H. e

S. A. Aaronson (1991) Methods in Enzymology, 200:546-556. Ainda, ver especialmente a página 2.10.11 em Current Protocols in Molecular Biology (supra), que descreve como se determinar as condições de lavagem para as condições de rigor moderado ou baixo. A lavagem é a etapa em que as condições são geralmente ajustadas de forma a determinar um nível mínimo de complementaridade dos híbridos. Geralmente, partindo da temperatura mais

baixa em que somente a hibridização homóloga ocorre, um pareamento errado de 1% entre os ácidos nucléicos que se hibridizam resulta em uma diminuição de 1°C na temperatura de fusão T_m, para qualquer concentração de SSC escolhida. Geralmente, a duplicação da concentração do SSC resul25 ta em um aumento na T_m de ~ 17°C. Utilizando estas linhas de guia, a temperatura de lavagem pode ser determinada empiricamente para o rigor moderado ou baixo, dependendo do nível de pareamento errado observado.

Os ácidos nucléicos isolados e/ou recombinantes que são caracterizados por sua capacidade de se hibridizarem com (a) um ácido nucléico que codifica um polipeptídeo da Ftase, tal como os ácidos nucléicos representados na forma da SEQ ID N^s: 1 ou 172, (b) o complemento da SEQ ID N^e: 1 ou 172, (c) ou uma parte de (a) ou de (b) (por exemplo, sob condições

de rigor alto ou moderado), podem codificar ainda uma proteína ou um polipeptídeo que possui pelo menos uma característica funcional de um polipeptídeo da Ftase, tal como a regulação da ramificação lateral sob ciclos de luz diurnos ou a regulação da resposta ao ABA ou a regulação da senescência.

Os ensaios enzimáticos, os testes de complementação ou outros métodos adequados também podem ser utilizados nos procedimentos para a identificação e/ou o isolamento de ácidos nucléicos que codificam um polipeptídeo tal como um polipeptídeo da seqüência de aminoácidos da SEQ ID N°: 2 ou da SEQ ID N°: 177 ou um equivalente funcional ou fragmento do mesmo deste polipeptídeo. As propriedades antigênicas das proteínas e dos polipeptídeos codificados pelos ácidos nucléicos que se hibridizam podem ser determinadas através de métodos imunológicos que empregam anticorpos que se ligam a um polipeptídeo da Ftase tais como o imunoblot, a imunoprecipitação e o radioimunoensaio. A metodologia da PCR, incluindo RAGE (Amplificação Rápida das Extremidades do DNA Genômico), também pode ser utilizada para selecionar e detectar a presença de ácidos nucléicos que codificam proteínas e polipeptídeos similares à Ftase e para auxiliar na clonagem de tais ácidos nucléicos partindo do DNA genômico. Os métodos da PCR para estas finalidades podem ser encontrados em Innis, M.A. e outros (1990) PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press, Inc., San Diego, CA., incorporado aqui como referência.

Os ácidos nucléicos descritos aqui são utilizados nos métodos da presente invenção para a produção de proteínas ou de polipeptídeos que são incorporados nas células, nos tecidos, nas partes de plantas, nas plantas e em outros organismos fotossintéticos. Em uma modalidade, o DNA que contém toda ou parte da seqüência codificadora para um polipeptídeo da Ftase ou o DNA que se hibridiza com o DNA que possui a seqüência da SEQ ID N^Q: 2 ou da SEQ ID N^e: 177 é incorporado em um vetor para a expressão de um polipeptídeo codificado nas células hospedeiras adequadas. O polipeptídeo codificado que consiste em uma subunidade da Ftase ou seu equivalente funcional é capaz de atividade da farnesil transferase. O termo vetor como utilizado aqui se refere a uma molécula de ácido nucléico ca-

paz de transportar um outro ácido nucléico com o qual esta foi ligada.

Os iniciadores e as sondas que consistem em 20 ou mais nucleotídeos contíguos dos ácidos nucléicos descritos anteriormente estão tam-

bém incluídos como parte desta invenção. Assim, um ácido nucléico desta invenção compreende uma seqüência específica de aproximadamente 20 até aproximadamente 200 ou mais nucleotídeos que são idênticos ou complementares a uma seqüência específica de nucleotídeos do DNA que codifica a proteína Ftase ou o mRNA transcrito. Estas sondas e iniciadores podem ser utilizados para identificar e isolar um ácido nucléico que codifica a 10 Ftase de outros organismos fotossintéticos.

Os ácidos nucléicos referidos aqui como isolados são ácidos nucléicos separados dos ácidos nucléicos do DNA genômico ou do RNA celular de sua fonte de origem (por exemplo, como este existe nas células ou em uma mistura de ácidos nucléicos tal como uma biblioteca) e podem ter 15 sofrido processamento adicional. Os ácidos nucléicos isolados incluem ácidos nucléicos obtidos através dos métodos descritos aqui, métodos similares ou outros métodos adequados, incluindo ácidos nucléicos essencialmente puros, ácidos nucléicos produzidos através da síntese química, através de combinações de métodos biológicos e químicos e ácidos nucléicos recombi20 nantes que são isolados. Os ácidos nucléicos referidos aqui como recombinantes são ácidos nucléicos que foram produzidos através da metodologia do DNA recombinante, incluindo os ácidos nucléicos que são gerados através de procedimentos que se baseiam em um método de recombinação artificial, tal como a reação em cadeia da polimerase (PCR) e/ou a clonagem 25 em um vetor que utiliza enzimas de restrição. Os ácidos nucléicos recombinantes são também aqueles que resultam de eventos de recombinação que ocorrem através dos mecanismos naturais das células, mas são selecionados após a introdução nas células de ácidos nucléicos planejados para permitir ou tornar provável um evento de recombinação. As partes dos ácidos 30 nucléicos isolados que codificam polipeptídeos que possuem uma certa função podem ser identificadas e isoladas, por exemplo, através do método de Jasin, M. e outros, Patente U.S. N^e 4.952.501.

Uma modalidade adicional da invenção é constituída de ácidos nucléicos ou oligonucleotídeos anti-sentido que são complementares, como um todo ou em parte, com uma molécula alvo que compreende um filamento sentido e pode se hibridizar com a molécula alvo. O alvo pode ser DNA ou seu correspondente de RNA (isto é, em que os resíduos T do DNA são resíduos U no correspondente de RNA). Quando introduzidos em uma célula, os

ácidos nucléicos ou os oligonucleotídeos anti-sentido podem inibir a expressão do gene codificado pelo filamento sentido ou pelo mRNA transcrito partindo do filamento sentido. Os ácidos nucléicos anti-sentido podem ser produzidos através de técnica-padrão. Ver, por exemplo, Shewmaker e outros, Patente U.S. N² 5.107.065.

Em uma modalidade particular, um ácido nucléico ou um oligonucleotídeo anti-sentido é completamente ou parcialmente complementar e pode se hibridizar com um ácido nucléico alvo (DNA ou RNA), em que o ácido nucléico alvo pode se hibridizar com um ácido nucléico que possui a seqüência do complemento do filamento na SEQ ID N²: 1 ou 172. Por exemplo, um ácido nucléico ou um oligonucleotídeo anti-sentido pode ser complementar a um ácido nucléico alvo que possui a seqüência mostrada como o filamento do quadro aberto de leitura da SEQ ID N²: 1 ou 172 ou o ácido nucléico que codifica um equivalente ou um fragmento do mesmo da Ftase ou a uma parte destes ácidos nucléicos suficiente para permitir a hibridização. Uma parte, por exemplo, uma seqüência de 16 nucleotídeos poderia ser suficiente para inibir a expressão da proteína. Os fragmentos que compreendem 25 ou mais nucleotídeos consecutivos complementares à SEQ ID N²: 1 ou à 172 poderíam ser também utilizados. Ou um ácido nucléico ou um oligonucleotídeo anti-sentido complementar às regiões 5' ou a 3’ ou que se sobrepõem ao códon de início da tradução (regiões não traduzidas e traduzidas a 5'), do gene ERA1 ou de um gene que codifica um equivalente ou fragmento funcional do mesmo pode ser também eficiente. Em uma outra modalidade, o ácido nucléico anti-sentido é totalmente ou completamente complementar e pode se hibridizar com um ácido nucléico alvo que codifica um polipeptídeo da Ftase.

Em adição aos ácidos nucléicos anti-sentido da invenção, podem ser construídos oligonucleotídeos que se ligarão ao ácido nucléico em dúplex no gene ou no complexo de DNA:RNA da transcrição, para formar um ácido nucléico contendo uma tripla hélice estável ou tríplex para inibir a 5 transcrição e/ou a expressão de um gene que codifica um polipeptídeo da

Ftase ou seu equivalente funcional. Frank-Kamenetskii, M. D. e Mirkin, S. M.

(1995) Ann. Rev. Biochem. 64:65-95. Tais oligonucleotídeos da invenção são construídos utilizando as regras de pareamento de bases da formação da hélice tripla e a seqüência de nucleotídeos do gene ou o mRNA para a 10 Ftase. Estes oligonucleotídeos podem bloquear a atividade do tipo Ftase de várias maneiras, incluindo a prevenção da transcrição do gene ERA1 ou através da ligação com o mRNA à medida que este é transcrito pelo gene.

Um outro aspecto da invenção se refere ao uso do silenciamento gênico pós-transcricional (PTGS) para reprimir a expressão gênica. O RNA de filamento duplo pode iniciar a repressão específica à seqüência da expressão gênica em plantas e animais. O RNA de filamento duplo é processado até oligômeros em dúplex curtos de 21-23 nucleotídeos de comprimento. Estes RNAs pequenos interferentes suprimem a expressão de genes endógenos e heterólogos de uma maneira específica à seqüência (Fire e ou20 tros, Nature 391:806-811, Carthew, Curr. Opin. in Cell Biol., 13:244-248, Elbashir e outros, Nature 411:494-498). Um constructo de supressão de RNAi pode ser planejado de várias maneiras, por exemplo, a transcrição de uma repetição invertida que pode formar uma molécula longa em grampo de cabelo, repetições invertidas separadas por uma seqüência espaçadora que 25 podería ser uma seqüência não relacionada tal como GUS ou uma seqüência de íntron. A transcrição de filamentos sentido e anti-sentido através de promotores opostos ou da co-transcrição de genes sentido ou anti-sentido.

Um outro aspecto da invenção se refere ao uso do silenciamento gênico pós-transcricional (PTGS) para reprimir a expressão gênica. O RNA de filamento duplo pode iniciar a repressão específica à seqüência da expressão gênica em plantas e animais. O RNA de filamento duplo é processado até oligômeros curtos de 21-23 nucleotídeos de comprimento. Estes

Υ:;

RNAs pequenos interferentes suprimem a expressão de genes endógenòs,.e heterólogos de uma maneira específica à seqüência (Fire e outros Nature

391:806-811, Carthew, Curr. Opin. in Cell Biol., 13:244-248, Elbashir e outros, Nature 411:494-498). Um constructo supressor de RNAi pode ser pla nejado de várias maneiras, por exemplo, a transcrição de uma repetição invertida que pode formar uma molécula grande em grampo de cabelo, repeti ções invertidas separadas por uma seqüência espaçadora que poderia ser uma seqüência não relacionada tal como GUS ou uma seqüência de íntron.

A transcrição de filamentos sentido e anti-sentido através de promotores opostos ou da co-transcrição de genes sentido e anti-sentido.

Um outro aspecto da invenção se refere ao uso da abordagem genética negativa dominante. Sucintamente, a presença de uma característica dominante, isto é, a expressão de um transgene, resulta em uma redução da atividade enzimática ou uma produção reduzida do produto final enzimático. Foi demonstrado que FT é um heterodímero formado por subunidades α e β. A atividade de FT se baseia na dimerização apropriada entre estas subunidades para formar uma enzima funcional. A expressão de uma subunidade não funcional interagirá com a segunda subunidade para produzir uma enzima não funcional e conseqüentemente uma atividade enzimática reduzida. O aspecto não funcional pode ser em relação, mas não limitado, à interação das subunidades, à ligação ao substrato ou à catálise por enzimas, por exemplo. Alternativamente, a característica expressa pode produzir um análogo do substrato que compete com o substrato nativo, o resultado final sendo uma menor farnesilação do substrato biologicamente ativo.

A invenção também se refere a proteínas ou aos polipeptídeos codificados pelos novos ácidos nucléicos descritos aqui. As proteínas e os polipeptídeos desta invenção podem ser isolados e/ou recombinantes. As proteínas ou os polipeptídeos referidos aqui como isolados são proteínas ou polipeptídeos purificados até uma condição além daquela em que existem nas células. Em uma modalidade preferida, são pelo menos 10% puros; isto é, substancialmente purificados. As proteínas ou os polipeptídeos isolados incluem proteínas ou polipeptídeos obtidos pelos métodos descritos infra,

métodos similares ou outros métodos adequados e incluem proteínas ou >

polipeptídeos essencialmente puros, proteínas ou polipeptídeos produzidos através da síntese química ou através de combinações de métodos biológicos e químicos e as proteínas ou polipeptídeos recombinantes que são iso5 lados. As proteínas ou os polipeptídeos referidos aqui como recombinantes são proteínas ou polipeptídeos produzidos através da expressão de ácidos nucléicos recombinantes.

Em uma modalidade preferida, a proteína ou parte da mesma

possui pelo menos uma função característica de uma Ftase; por exemplo, que afeta a atividade catalítica, por exemplo, a ramificação lateral normal, florículos/inflorescência, a germinação das sementes ou a abertura dos estômatos e a função de ligação e/ou a função antigênica (por exemplo, ligação de anticorpos que também se ligam à Ftase que ocorre naturalmente). Como tais, estas proteínas são referidas como as Ftases de origem vegetal 15 e incluem, por exemplo, Ftases que ocorrem naturalmente, variações (por exemplo, mutantes) de tais proteínas e/ou partes das mesmas. Tais variações incluem mutantes que diferem através da adição, da deleção ou da substituição de um ou mais resíduos de aminoácidos ou polipeptídeos modificados em que um ou mais resíduos são modificados e mutantes que com20 preendem um ou mais resíduos modificados.

A invenção se refere ainda às partes isoladas e/ou recombinantes de uma Ftase como descrito anteriormente, especialmente a subunidade β de uma proteína Ftase. Podem ser produzidas partes das enzimas que possuem função completa ou parcial por si próprias ou que quando mistura25 das juntas (embora completamente, parcialmente ou não funcional isoladamente), se montem com um ou mais outros polipeptídeos para constituir uma proteína funcional que possui pelo menos uma característica funcional de uma Ftase desta invenção.

Foram identificados vários genes que são induzidos pelo ABA.

Isto sugere que a tolerância induzida pelo ABA para condições ambientais adversas é um evento multigênico complexo. Assim, a identificação e a transferência de genes isolados em plantas de cultivo que aumentam a viabi28 lidade da planta sob condições ambientais diferentes por causa de sua maior capacidade de resposta ao ABA são novas e extremamente úteis.

Para identificar genes que poderíam ser controladores mais globais de processos vegetais regulados pelo ABA, foram aplicadas seleções 5 genéticas em várias espécies de plantas para isolar mutações que alteram a resposta da planta ao hormônio.

As mutações que conferem melhor resposta ao ABA (era) em sementes de Arabidopsis foram identificadas em relação a sua capacidade de prevenir a germinação das sementes com baixas concentrações de ABA 10 que permitem normalmente a germinação de sementes do tipo selvagem (controles, isto é, que ocorrem naturalmente). Destas, a classe de mutantes de era1, que inclui uma linhagem de DNA transferida (T-DNA) (era1-1, ecotipo Wassilewskija) e dois mutantes gerados com nêutrons (era1-2 e era1-3, ecotipo Columbia), tinham interesse adicional porque esta classe exibia me15 nor eficiência de germinação sob a pós-inibição normal. As mutações que aumentam a capacidade de resposta ao ABA devem, à princípio, ser mais dormentes. A dormência nos alelos era1 foi aliviada por um período de resfriamento de 4 dias; a eficiência da germinação de era1 aumentou com o período de tempo durante o qual as sementes são resfriadas. Em muitas 20 espécies de plantas, quebrar a dormência para permitir a germinação requer a vernalização e a exposição à umidade, ambientes a baixas temperaturas durante um período longo de tempo (Baskin e Baskin, 1971). O perfil de germinação dos mutantes era poderia refletir um estado maior de dormência induzida pelo ABA; conseqüentemente, estas sementes requerem uma ver25 nalização mais longa para germinarem. O suporte para esta alegação vem do constructo de mutantes duplos de era1 com mutantes biossintéticos (aba1-1) e insensíveis ao ABA (abi1-1 e abi3-6). Em todos os casos, os mutantes duplos possuíam uma dormência reduzida quando comparados com era 1, indicando que a maior dormência observada na semente era1 era depen30 dente da síntese ou da sensibilidade ao ABA.

Além de ampliar os espectro de novos mutantes de resposta ao ABA, as seleções de supersensibilidades também foram utilizadas para a identifi-

SP cação de reguladores negativos da sensibilidade ao ABA. Ou seja, a inibição deste gene funciona para aumentar a resposta ao ABA. Um destes genes (ERA1) foi clonado e foi demonstrado que codificava a subunidade β de uma proteína heterodimérica da farnesil transferase (Ftase) (Cutler e outros, 1996). A mutação era1-1, que é causada por uma inserção do T-DNA, permitia o isolamento de regiões genômicas da planta que flanqueavam as inserções. Utilizando as regiões flanqueadoras como sondas, o cDNA do tipo selvagem e os clones genômicos foram isolados. A análise da seqüência destas descreveu um gene abrangendo 3,5 kb de DNA genômico. O gene contém 13 íntrons que estão sublinhados nas Figuras 1A-1C e o sítio de inserção do T-DNA no era1-1 fica no íntron 8. A análise de Southern (DNA) do DNA do tipo selvagem, era1-2 e era1-3 submetidos à sonda com o cDNA de Era 1 revelou que ambos os alelos de nêutrons acelerados contêm deleções que abrangem o local ERA1. A mutagênese por nêutrons acelerados induziu pequenas deleções em Arabidopsis (Shirley e outros, 1992) e a análise genômica subseqüente com uma sonda de 14 kb que abrange o local ERA1 determinou o tamanho da deleção de era1-2 como sendo de aproximadamente 7,5 kb e a deleção de era1-3 como sendo ligeiramente maior. Assim todos os três alelos era1 continham interrupções no DNA no mesmo local, confirmando a identidade do local ERA.

A tradução conceituai do quadro aberto de leitura maior (404 aminoácidos) no gene ERA1 produziu uma proteína (Figuras 2 e 4) com uma alta similaridade de seqüência com os genes da subunidade β da proteína farnesil transferase de levedura, de ervilha e de mamífero (Goodman e outros, 1988; Chen e outros, 1991; Yang e outros, 1993). As farnesil transferases consiste em subunidades α e β que se dimerizam, formando uma enzima que catalisa a ligação do farnesil pirofosfato (15 carbonos) a proteínas que contêm um motivo CaaX COOH-terminal (Schafer e Rine, 1992), em que C significa o resíduo de cisteína, geralmente são aminoácidos alifáticos e X pode significar um resíduo de cisteína, de serina, de metionina ou de glutamina. Ambos os genes da subunidade β contêm uma região de aproximadamente 50 aminoácidos próxima ao seu COOH-terminal que é ausente na levedura e nos genes da subunidade β de animais.

Em sistemas de leveduras e de mamíferos, as Ftases modificam vá-

rias proteínas de transdução de sinal para a localização de membranas. Isto é conseguido através da ligação da cadeia lateral lipofílica do farnesil com a 5 proteína alvo através da Ftase. A ligação do grupo farnesila causa uma alteração na hidrofobicidade global do alvo permitindo que a proteína se ancore com si própria na membrana onde esta geralmente interage com outras moléculas de transdução de sinal. O fato da perda da atividade de farnesilação no mutante era1 levar a uma resposta maior da semente ao ABA sugere que 10 uma proteína alvo em Arabidopsis tem que estar localizada na membrana para atenuar o sinal do ABA. Assim, a farnesilação em Arabidopsis, parece ser necessária para a função normal de um regulador negativo da sensibilidade ao ABA.

O trabalho subseqüente mostrou que a perda da função do gene E15 RA1 em Arabidopsis confere uma maior tolerância aos estresses ambientais no nível da planta madura. Por exemplo, uma comparação das plantas do tipo selvagem e plantas mutantes era1 cultivadas no solo sob condições de laboratório padronizadas (24 h de luz, 150 μΕ m-2seg-i, 30% de umidade) mostrou que os mutantes não requerem água de forma tão frequente quanto

as plantas do tipo selvagem com a finalidade de manter a viabilidade (Figura

5). Quando as plantas mutantes e do tipo selvagem foram cultivadas até que a florescência ocorresse, a rega foi interrompida e as plantas foram obser- vadas cada dia subseqüente em relação a sinais de estresse. A perda de água era significativamente menor nas plantas mutantes comparada com a 25 das plantas do tipo selvagem (Figuras 6 e 7).

Para determinar se a maior tolerância à seca observada dos mutantes era estava relacionada com a função do gene ERA1, foram construídas plantas transgênicas contendo uma fusão do promotor de ERA1 com um gene GUS repórter (produzidas através da inserção de um fragmento de 5 Kb do 30 promotor ERA1 em um plasmídeo de T-DNA com GUS sem promotor). A análise das plantas transgênicas mostrou que ERA1 é expresso de forma transcricional no tecido da epiderme de Arabidopsis e que esta expressão é

específica à célula-guarda. A expressão de ERA1 foi também observada no tecido meristemático das plantas e nos pelos radiculares. A expressão na célula-guarda de ERA1 é coerente com a tolerância à seca do mutante uma vez que estas células são os reguladores principais da transpiração da água através da planta. Seria esperado que a condutância dos estômatos regulados por ERA1 requeresse a expressão do gene ERA1 nas células-guardas. Conseqüentemente, a perda da função do gene ERA1 resulta em célulasguardas que têm maior capacidade de resposta ao ABA, o que por sua vez, leva à regulação de células-guardas com maior resposta à seca. Portanto, a modificação da expressão ou da atividade da Ftase em plantas superiores, especialmente plantas de cultivo, terá efeitos profundos sobre a condutância e as taxas de transpiração dos estômatos nas plantas.

A natureza da mutação era1 em Arabidopsis demonstra que a inibição da farnesilação aumentará as respostas ao ABA em uma planta e a alteração desta atividade enzimática em espécies de cultivo. A inibição da atividade da Ftase em plantas de cultivo pode ser conseguida através de vários métodos. Por exemplo, a tecnologia anti-sentido de genes ERA1 cognatos em uma variedade de espécies de plantas de cultivo pode ser utilizada para reduzir a atividade da Ftase, aumentando assim a tolerância à seca. Produzindo especificamente RNA anti-sentido de ERA1 nas células-guardas, a quantidade de Ftase sintetizada pode ser reduzida até um nível que imitaria fenótipos de mutantes era. O promotor ERA1 é regulado em um número de tecidos diferentes variando de meristemas de brotos até pêlos radiculares. Determinando os elementos do promotor ERA1 que permitem a expressão em tecidos específicos, é possível ajustar a expressão de ERA1 anti-sentido em somente um tipo de tecido ou de célula, tal como as células-guardas.

Um outro método para inibir a atividade da Ftase em plantas é a produção de inibidores peptídicos específicos da farnesilação em plantas transgênicas. Nos sistemas de mamíferos e leveduras, a seqüência alvo terminal carboxila (CaaX, em que C=cisteína, x=alifático, X=qualquer aminoácido) que permite a ligação do grupo farnesila a proteínas específicas foi claramente definida. Os peptídeos que imitam estas seqüências alvo foram ‘Λ~ *8

produzidos e mostram a inibição da famesilação das proteínas alvo endógenas nestes sistemas. Além disso, CAIM é farnesilada in vivo em Arabidopsis. Assim, inibidores similares podem ser aplicados a plantas superiores para inibir de forma competitiva a Ftase in vivo. Novamente, isto pode ser feito através da expressão de peptídeos inibidores em plantas transgênicas através da síntese da sequência de DNA para um peptídeo CaaX e fundido da mesma em um promotor específico à célula-guarda. Em ambos os métodos, a utilização dos promotores apropriados, a Ftase anti-sentido ou os inibidores peptídicos podem ser especificamente direcionados e controlados.

Estão ainda incluídos na invenção os métodos de produção de uma planta transgênica. O método inclui a introdução em uma ou mais células vegetais de um composto que altera, por exemplo, inibe a famesilação de um polipeptídeo que possui um motivo CaaX no terminal carboxila na planta para gerar uma célula vegetal transgênica e a regeneração de uma planta transgênica partindo da célula transgênica. Em alguns aspectos, o composto altera, por exemplo, aumenta ou diminui a expressão ou a atividade da prenil protease CaaX. Alternativamente, o composto altera a expressão ou a atividade da farnesiltransferase. Em outros aspectos, o composto altera a expressão ou a atividade da isoprenilcisteína carboxil metiltransferase. O composto pode ser, por exemplo, (i) um polipeptídeo da prenil protease CaaX, da farnesiltransferase ou da isoprenilcisteína carboxil metiltransferase; (ii) um ácido nucléico que codifica um polipeptídeo da prenil protease CaaX, da farnesiltransferase ou da isoprenilcisteína carboxil metiltransferase; (iii) um ácido nucléico que aumenta a expressão de um ácido nucléico que codifica um polipeptídeo da prenil protease CaaX, da farnesiltransferase ou da isoprenilcisteína carboxil metiltransferase; (iv) um ácido nucléico que diminui a expressão de um ácido nucléico que codifica um polipeptídeo da prenil protease CaaX, da farnesiltransferase ou da isoprenilcisteína carboxil metiltransferase; (v) um ácido nucléico anti-sentido da prenil protease CaaX, da farnesiltransferase ou da isoprenilcisteína carboxil metiltransferase e derivados, fragmentos, análogos e homólogos do mesmo. Um ácido nucléico que aumenta a expressão de um ácido nucléico que codifica um polipeptídeo da prenil protease CaaX, da farnesiltransferase ou da isoprenilcisteína carboxil metiltransferase, por exemplo, promotores, intensificadores. O ácido nucléico pode ser endógeno ou exógeno. Preferencialmente, o composto é um polipeptídeo da prenil protease CaaX, da farnesiltransferase ou da isoprenilcisteína carboxil metiltransferase ou um ácido nucléico que codifica um polipeptídeo da prenil protease CaaX, da farnesiltransferase ou da isoprenilcisteína carboxil metiltransferase.

Estão incluídos na invenção métodos de produção de uma planta transgênica que possui maior resistência ao estresse, senescência retardada ou maior sensibilidade ao ABA. O método inclui a introdução em uma ou mais células vegetais de um composto que altera a expressão ou a atividade da farnesil transferase (isto é, farnesil transferase alfa ou beta) na planta. O composto pode ser, por exemplo, (i) um inibidor polipeptídico da farnesil transferase; (ii) um ácido nucléico que codifica um inibidor polipeptídico da farnesil transferase; (iii) um ácido nucléico que diminui a expressão de um ácido nucléico que codifica um polipeptídeo da farnesil transferase e, derivados, fragmentos, análogos ou homólogos do mesmo; (iv) um ácido nucléico anti-sentido da farnesil transferase. Um ácido nucléico que diminui a expressão de um ácido nucléico que codifica um polipeptídeo da farnesil transferase inclui, por exemplo, os ácidos nucléicos anti-sentido ou ácidos nucléicos inibidores de RNA. O ácido nucléico pode ser endógeno ou exógeno. Preferencialmente, o composto é um polipeptídeo da farnesil transferase ou um ácido nucléico que codifica um polipeptídeo da farnesil transferase. Mais preferencialmente, o composto é um ácido nucléico complementar a um ácido nucléico que codifica um polipeptídeo da farnesil transferase. Por exemplo, uma molécula de ácido nucléico anti-sentido.

Alternativamente, o composto é uma molécula de ácido nucléico que compreende uma seqüência de ácido nucléico que codifica um polipeptídeo mutado da farnesil transferase, da isoprenilcisteína carboxil metiltransferase ou da prenil protease CaaX. Por mutado entende-se que o polipeptídeo não possui uma ou mais funções de um polipeptídeo do tipo selvagem. Por exemplo, um polipeptídeo beta mutado da farnesiltransferase é um poli-

peptídeo que possui menos aminoácidos que um polipeptídeo do tipo selvagem de comprimento completo, mas ainda mantém a capacidade de se dimerizar com uma subunidade alfa. Por exemplo, um polipeptídeo beta mutado da farnesiltransferase é menor que 314 aminoácidos de comprimento. 5 Preferencialmente, o polipeptídeo beta mutado da farnesiltransferase compreende a seqüência de aminoácidos da SEQ ID N°: 1 ou um fragmento da mesma.

Em um outro aspecto, o composto é um ácido nucléico que codifica um motivo CaaX. Altemativamente, o motivo CaaX está ligado de forma 10 operacional a um promotor.

Está ainda incluída na invenção uma planta em que uma mutação foi introduzida no gene que codifica a farnesil transferase (isto é, alfa ou beta) que resulta em uma planta que possui menor atividade da farnesil transferase e maior tolerância ao estresse quando comparada com uma 15 planta do tipo selvagem. A mutação pode ser introduzida por meios químicos ou mecânicos.

Em vários aspectos, a planta transgênica possui um fenótipo alterado quando comparada com uma planta do tipo selvagem (isto é, não transformada). Por fenótipo alterado entende-se que a planta possui uma ou mais caracte-

rísticas que são diferentes daquelas da planta do tipo selvagem. Por exemplo, a planta transgênica possui uma maior resistência ao estresse. Por maior resistência ao estresse, entende-se que a planta transgênica pode crescer sob condições de estresse (por exemplo, alto teor de sais, menos água, baixas temperaturas, altas temperaturas) ou sob condições que normalmente inibiríam o crescimento de uma não transformada. Os estresses incluem, por exemplo, o estresse ao resfriamento, o estresse ao calor, o choque térmico, o estresse por sais, o estresse hídrico (isto é, seca), o estresse nutricional, doença, pragas de pasto, cicatrização de feridas, agentes patogênicos tais como, por exemplo, fungos, bactérias, nematóides, vírus ou ervas daninhas parasitas e herbicidas. As metodologias para determinar o crescimento da planta ou a resposta ao estresse incluem, por exemplo, as medidas da altura, as medidas de peso ou de biomassa, a área ou o número de folhas, a

capacidade de florescer, o uso da água, as taxas de respiração e o rendimento. Alternativamente, a planta transformada possui uma maior sensibilidade ao ABA (isto é, melhorada). A sensibilidade melhorada ao ABA ocorre no estágio de crescimento da planta nova. Alternativamente, a sensibilidade melhorada ao ABA ocorre no estágio de planta madura. Os fenótipos alterados adicionais incluem, por exemplo, maior crescimento vegetativo (por exemplo, maior número de folhas, espessura ou biomassa global), crescimento reprodutivo retardado (por exemplo, florescem mais tarde); maior vigor das plantas novas (por exemplo, maior biomassa e comprimento radicular), maior formação de raízes laterais e, portanto, a penetração no solo de um sistema vascular mais extenso resultando em um sistema de transporte melhorado.

A planta pode ser qualquer tipo de planta incluindo, por exemplo, as espécies dos gêneros Cucurbita, Rosa, Vitis, Juglans, Fragaría, Lotus, Medicago, Onobrychis, Trifolium, Trigonella, Vigna, Citrus, Linum, Geranium, Manihot, Daucus, Arabidopsis, Brassica, Raphanus, Sinapis, Atropa, Capsicum, Datura, Hyoscyamus, Lycopersicon, Nicotiana, Solanum, Petunia, Digitalis, Majorana, Ciahorium, Helianthus, Lactuca, Bromus, Asparagus, Antirrhinum, Heterocallis, Nemesis, Pelargonium, Panieum, Pennisetum, Ranunculus, Senecio, Salpiglossis, Cucumis, Browaalia, Glycine, Pisum, Phaseolus, Lolium, Oryza, Zea, Avena, Hordeum, Secale, Triticum, Sorghum, Gossypium, Picea, Caco e Populus.

Esta invenção fornece um método de produção de plantas tolerantes à seca que compreende: a preparação de um constructo de ácido nucléico que compreende um promotor ligado de forma operacional a um ácido nucléico que compreende ou que codifica anti-sentido à SEQ ID N^s: 1, 14, 40, 43, 80-85 ou 172 ou um ácido nucléico que compreende um equivalente funcional ou um fragmento do mesmo do anti-sentido; a inserção do constructo de ácido nucléico em um vetor; a transformação de uma planta, cultura de tecido ou células vegetais; e o crescimento da planta ou a regeneração de uma planta partindo da cultura de tecido ou das células vegetais; em que são produzidas plantas tolerantes à seca. Este método pode ser utilizado

quando o ácido nucléico é selecionado do grupo que consiste em 25-200 ou mais nucleotídeos consecutivos complementares à SEQ ID N²: 1,14, 40, 43, 80-85 ou 172, oligonucleotídeos que consistem em 25 ou mais nucleotídeos consecutivos da SEQ ID N²: 1,14, 40, 43, 80-85 ou 172 ou seu complemen5 to ou ácido nucléico que codifica um inibidor peptídico da farnesil transferase.

Em adição à regulação dos estômatos que é extremamente sensível ao ABA, as plantas era também demonstram senescência retardada sob

condições de seca, indicando que a farnesilação regula negativamente um número de respostas induzidas pela seca em Arabidopsis. As plantas era crescem sob condições normais de laboratório demorando mais para ficarem amareladas. As plantas mutantes permaneceram verdes e viáveis bem depois das do tipo selvagem ficarem senescentes e morrerem. As folhas soltas de uma planta mutante era não amarelam tão rápido quanto as folhas soltas das plantas do tipo selvagem (Figura 8). Folhas com tamanhos similares que eram idênticas em relação ao desenvolvimento foram tiradas de plantas do tipo selvagem e era e colocadas em placas de petri contendo ágar (Ver o Exemplo 7). Normalmente, uma folha do tipo selvagem começa a perder clorofila aproximadamente cinco dias depois e eventualmente branqueia. As 20 folhas das plantas mutantes permaneceram verdes durante um período duas vezes mais longo. Devido ao fato das folhas estarem em contato constante com o ágar, não sofreram estresse hídrico, indicando que a senescência reduzida do mutante era 1 não é um fenômeno induzido pela seca.

Além disso, sob um ciclo de 10 h de dia/16 h de noite, o ciclo de vida da planta pode ser duplicado versus o das plantas do tipo selvagem (3 meses). Parece, portanto, que a circulação da clorofila e os sinais de senescência são alterados no mutante era1. Por exemplo, as plantas do tipo selvagem e mutantes foram cultivadas em vasos sob condições bem regadas até os estágios de desenvolvimento em que as folhas das plantas do tipo selvagem 30 começassem a ficar senescentes (aproximadamente o tempo de desenvolvimento de flores). Naquele momento, as folhas similares em relação ao desenvolvimento foram analisadas em relação aos genes marcadores induzí

dos pela senescência através da análise de northern blot (Exemplo 8). Dois genes, SAG12 e SAG13, nos quais a transcrição é normalmente induzida durante a senescência nas plantas do tipo selvagem, não foram induzidos no mutante era1 (Figura 9). Ainda, a transcrição de CAB é mantida (Figura 9). Tomados juntos, estes resultados indicam que programa de indução da senescência nos mutantes era 1 é retardado comparado com o das plantas do tipo selvagem, mostrando que a perda da atividade da farnesilação causa um retardo da indução da senescência na planta mesmo sob condições em que o estresse hídrico não é um fator ambiental.

Em adição aos efeitos sobre a senescência e a perda de água, os mutantes era1 exibem uma diferença no hábito da ramificação e de florescência quando cultivados sob ciclos de luz diurna. Sob luz contínua (24 horas de luz/dia), o padrão de ramificação dos mutantes não difere daquele das plantas do tipo selvagem. Entretanto, quando é fornecido um período de escuridão, os mutantes não produzem tantos ramos laterais quanto as plantas do tipo selvagem. Quando medidas, as plantas com perda da atividade de farnesilação produziram somente 2,4 ramos por planta comparados com 3,6 ramos laterais por planta do tipo selvagem. Isto representa um decréscimo de 30% nos ramos laterais por planta.

A florescência é afetada também pela perda da atividade da Ftase. As plantas que não possuem atividade da Ftase produzem mais flores por planta (25-30 botões/inflorescência) que as plantas do tipo selvagem (10-15 botões/inflorescência). Assim, na média há o dobro dos botões de flores presentes nos mutantes em relação às plantas do tipo selvagem.

Estes efeitos pleiotróficos dos mutantes com perda na função de era1 sobre o desenvolvimento da planta inteira indicam que o gene ERA1 pode ser um regulador coordenado de um grupo de funções do desenvolvimento da planta.

Até agora, não há função conhecida para a farnesilação em plantas superiores, incluindo um papel na transdução de sinal do ABA. As Ftases foram encontradas em um número de plantas superiores tais como o tomate e a ervilha, de forma que é evidente que esta enzima possua funções ao

longo dos limites das espécies. Além disso, a superprodução de peptídeos alvo da farnesil transferase ou o uso de inibidores da farnesilação inativa completamente a Ftase em sistemas de mamíferos e de leveduras. Assim, inibidores similares podem ser aplicados a plantas superiores para inativar a 5 Ftase in vivo. Em ambos os casos com os promotores apropriados, a Ftase anti-sentido ou os inibidores peptídicos podem ser especificamente direcionados e controlados.

Os mutantes deficientes em relação à farnesilação são também supersensíveis à auxina exógena. O fato de estes mutantes exibirem ramifica10 ção reduzida e alterações menos importantes na organização do meristema, pode ser explicado através da regulação alterada da auxina. Assim, outras funções hormonais são afetadas neste mutante, o que indica que, em adição às vias do ABA, outras vias reguladas por hormônios são controladas pela atividade da Ftase. Estes resultados demonstram que o gene ERA1 fornece 15 um mecanismo molecular para coordenar a regulação de moléculas diferentes sinalizadoras de hormônios.

De acordo com a presente invenção, as plantas incluídas dentro do âmbito desta invenção são plantas superiores e inferiores do reino vegetal. As plantas maduras, as plantas novas e as sementes estão incluídas no âm20 bito da invenção. Uma planta madura inclui uma planta em qualquer estágio

no desenvolvimento além da planta nova partindo de semente. Uma planta nova partindo de semente é uma planta imatura muito jovem nos estágios iniciais do desenvolvimento. As partes das plantas, os protoplastos e a cultura de tecidos são também fornecidos por esta invenção.

As plantas transgênicas que possuem o fenótipo caracterizado pela mutação era1 estão incluídas dentro do âmbito da presente invenção. As sementes das plantas transgênicas são fornecidas por esta invenção e podem ser utilizadas para propagar mais plantas que contêm os constructos desta invenção.

A função de ERA1 em um número de plantas de cultivo pode ser inibida para aumentar a resposta da planta a condições ambientais adversas que requer a sinalização mediada pelo ABA. O controle da farnesilação em

plantas superiores regula a resposta de tecidos tanto embrionários quanto vegetativos a este hormônio (Cutler e outros, 1996). A sensibilidade aumentada se traduz em uma resposta mais rápida do tecido às condições de estresse que por sua vez confere maior proteção da planta ao estresse ambi5 ental. Devido ao fato de isto requerer somente o controle de um único gene, ERA1, deveria ser possível controlar a farnesilação em uma variedade de plantas através do controle da síntese ou da atividade desta enzima. Além

disso, o trabalho descrito aqui indica claramente que a alteração da via de transdução de sinal do ABA através da manipulação dos genes que contro10 Iam a resposta ao ABA torna possível aumentar a resposta da planta a condições adversas de estresse hídrico.

Para produzir as plantas transgênicas desta invenção, um constructo que compreende o gene que codifica a Ftase ou o ácido nucléico que codifica seu equivalente funcional e um promotor é incorporado em um vetor atra15 vés dos métodos conhecidos e utilizados pelos versados na técnica. O promotor pode compreender toda ou parte da SEQ ID N-: 3. O constructo também pode incluir quaisquer outros reguladores necessários tais como terminadores ou similares, ligados de forma operacional à sequência codificadora.

Pode ser também benéfico incluir uma seqüência líder 5', tal como a líder não traduzida proveniente do mRNA da proteína de revestimento do vírus

mosaico da alfafa (Jobling, S. A. e Gehrke, L. (1987) Nature 325:622-625) ou a líder do vírus de manchas cloróticas do milho (MCMV) (Lommel, S. A. e outros, (1991) Virology 81:382-385). Os versados na técnica reconhecerão a aplicabilidade de outras seqüências líderes para várias finalidades. Os e25 xemplos de constructos incluem as SEQ ID N—: 54-64.

As seqüências alvo são também úteis e podem ser incorporadas nos constructos desta invenção. Uma seqüência de direcionamento é geralmente traduzida em um peptídeo que direciona o produto polipeptídico da seqüência de ácido nucléico codificadora para uma localização desejada dentro da 30 célula, tal como para o plastídeo e fica separado do peptídeo após o trânsito do peptídeo estar completo ou concorrentemente ao trânsito. Os exemplos de seqüências de direcionamento úteis nesta invenção incluem, mas não

estão limitados à pré-seqüência mitocondrial de leveduras (Schmitz e outros

(1989) Plant Cell 7:783-791), a seqüência de direcionamento proveniente do gene relacionado com a patogênese (PR-1) do tabaco (Cornellisen e outros (1986) EMBO J. 5:37-40), os sinais de direcionamento aos vacúolos (Chrispeels, M. J. e Raikhel, N. V. (1992) Cell 68:613-616), as seqüências da via secretora tais como aquelas do RE ou de Golgi (Chrispeels, M. J. (1991) Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 42:21-53). As seqüências intraorganelares também podem ser úteis para os sítios internos, por exemplo, tilacóides em cloroplastos. Theg, S. M. e Scott, S. V. (1993) Trends in Cell Biol. 3:186-190.

Em adição às seqüências líderes 5', as seqüências terminadoras são geralmente incorporadas no constructo. Nos constructos de plantas, uma região não traduzida 3' (3' UTR) geralmente faz parte do plasmídeo de expressão e contém uma seqüência de terminação poliA. A região de terminação que é empregada será geralmente uma de conveniência, uma vez que as regiões de terminação parecem ser relativamente intercambiáveis. As regiões de terminação da octopina sintase e da nopalina sintase, derivadas do plasmídeo Ti de A. tumefaciens, são adequadas para tal uso nos constructos desta invenção.

Qualquer técnica adequada pode ser utilizada para introduzir os ácidos nucléicos e os constructos desta invenção para produzir plantas transgênicas com um genoma alterado. Para gramíneas tal como o milho, o bombardeio de microprojéteis (ver, por exemplo, Sanford, J. C. e outros, Patente U.S. N² 5.100.792 (1992)) pode ser utilizado. Nesta modalidade, um constructo de nucleotídeos ou um vetor que contém o constructo é revestido sobre partículas pequenas que são então introduzidas no tecido alvo (células) através da penetração balística em alta velocidade. O vetor pode ser qualquer vetor que permita a expressão do DNA exógeno sob condições apropriadas para a regeneração de plantas, resultando na produção de plantas transgênicas.

As plantas transgênicas que carregam o constructo são examinadas em relação ao fenótipo desejado utilizando uma variedade de métodos inclu indo, mas não limitados a um marcador fenotípico apropriado, tal como a resistência a um antibiótico ou a resistência a um herbicida ou a observação visual do tempo da indução da florescência comparado com o de plantas que ocorrem naturalmente.

Outros métodos conhecidos de inserção de constructos de ácidos nucléicos em plantas incluem a transformação mediada por Agrobacterium (ver, por exemplo, Smith, R. H. e outros, Patente U.S. N² 5.164.310 (1992)), a eletroporação (ver, por exemplo, Calvin, N., Patente U.S. N² 5.098.843 (1992)), a introdução utilizando feixes de laser (ver, por exemplo, Kasuya, T. e outros, Patente U.S. N² 5.013.660 (1991)) ou a introdução utilizando agentes tal como o polietileno glicol (ver, por exemplo, Golds, T. e outros (1993) Biotechnology, 11:95-97) e similares. Em geral, as células vegetais podem ser transformadas com uma variedade de vetores, tais como vetores virais, epissomais, vetores de plasmídeo Ti e similares, de acordo com os procedimentos bem-conhecidos. O método de introdução do ácido nucléico na célula vegetal não é crítico para esta invenção.

Os métodos desta invenção podem ser utilizados com técnicas de transformação in planta ou de sementes que não requerem cultivo ou regeneração. Os exemplos destas técnicas são descritos em Bechtold, N. e outros (1993) CR Acad. Sei. París/Life Sciences 376:118-93; Chang, S. S. e outros (1990) Abstracts of the Fourth International Conference on Arabidopsis Research, Vienna, p. 28; Feldmann, K. A. e Marks, D. M. (1987) Mol. Gen. Genet. 208:1-9; Ledoux, L. e outros (1985) Arabidopsis Inf. Serv. 22:111; Feldmann, K. A. (1992) Em: Methods in Arabidopsis Research (Eds. Koncz, C., Chua, N-H, Schell, J.) pp. 274-289; Chee e outros, Patente U.S. N² de Série 5.376.543.

A região de início da transcrição pode fornecer a expressão constitutiva ou a expressão regulada. Em adição ao promotor de ERA1, estão disponíveis muitos promotores que são funcionais em plantas.

Os promotores constitutivos para a expressão gênica em plantas incluem, mas não estão limitados aos promotores da octopina sintase, da nopalina sintase ou da manopina sintase de Agrobacterium, ao promotor do

vírus mosaico da couve-flor (35S), ao promotor do vírus mosaico da escrofulária (FMV) e ao promotor do vírus mosaico do tabaco (TMV). A expressão gênica constitutiva em plantas também pode ser fornecida pelo promotor da glutamina sintase (Edwards e outros (1990) PNAS 87:3459-3463), pelo promotor da sacarose sintetase 1 do milho (Yang e outros (1990) PNAS 87:4144-4148), pelo promotor do gene Rol-C do TLDNA do plasmídeo Ri (Sagaya e outros (1989) Plant Cell Physiol. 30:649-654) e pela região específica ao floema do promotor pRVC-S-3A (Aoyagi e outros (1988) Mol. Geri. Genet. 273:179-185).

Os promotores de choque térmico, o promotor da subunidade pequena da ribulose-1,6-bifosfato (RUBP) carboxilase (ssu), os promotores específicos ao tecido e similares podem ser utilizados para a expressão regulada de genes vegetais. Os promotores regulados pelo desenvolvimento, induzidos pelo estresse ou induzidos por agentes patogênicos também são úteis.

A região reguladora pode responder a um estímulo físico, tal como a luz, como com o promotor ssu da RUBP carboxilase, sinais de diferenciação ou metabólitos. O tempo e o nível de expressão da orientação sentido ou anti-sentido podem ter um efeito definido sobre o fenótipo produzido. Portanto, os promotores escolhidos, acoplados com a orientação do DNA exógeno e o sitio de integração de um vetor no genoma, determinarão o efeito do gene introduzido.

Os exemplos específicos de promotores regulados incluem ainda, mas não estão limitados aos promotores Kin1 e cor6.6 de baixa temperatura (Wang e outros (1995) Plant Mol. Biol. 28:605; Wang e outros (1995) Plant Mol. Biol. 28:619-634), ao promotor que pode ser induzido pelo ABA (Marcotte Jr. e outros (1989) Plant Cell 7:969-976), aos promotores de choque térmico, tal como o promotor de choque térmico hsp70 que pode ser induzido de Drosphilia melanogaster (Freeling, M. e outros (1985) Ann. Rev. of Genetics 19·. 297-323), ao promotor que pode ser induzido pelo frio de B. napus (White, T. C. e outros (1994) Plant Physiol. 706:917), ao promotor da álcool desidrogenase que é induzido pelo etanol (Nagao, R. T. e outros, Miflin, B. J., Ed. Oxford Surveys of Plant Molecular and Cell Biology, Vol. 3, p

384-438, Oxford University Press, Oxford 1986), ao promotor ASUS1 da sacarose sintase específico ao floema de Arabidopsis (Martin e outros (1993) Plant J. 4:367-377), ao promotor ACS1 (Rodrigues-Pousada e outros (1993) Plant Cell 5:897-911), ao promotor da proteína zeína de 22 kDa do milho (Unger e outros (1993) Plant Cell 5:831-841), ao promotor da lectina ps1 de ervilha (de Pater e outros (1993) Plant Cell 5:877-886), ao promotor phas de Phaseolus vulgaris (Frisch e outros (1995) Plant J. 7:503-512), ao promotor Lea (Thomas, T. L. (1993) Plant Cell 5:1401-1410), ao promotor do gene E8 gene do tomate (Cordes e outros (1989) Plant Cell 7:1025-1034), ao promotor PCNA (Kosugi e outros (1995) Plant J. 7:877-886), ao promotor NTP303 (Weterings e outros (1995) Plant J. 8:55-63), ao promotor OSEM (Hattori e outros (1995) Plant J. 7:913-925), ao promotor ADP GP da batata (MullerRober e outros (1994) Plant Cell 6:601-604), ao promotor Myb promoter da cevada (Wissenbach e outros (1993) Plant J. 4:411-422) e ao promotor da plastocianina de Arabidopsis (Vorst e outros (1993) Plant J. 4:933-945).

O vetor pode ser introduzido nas células através de um método apropriado para o tipo de células hospedeiras (por exemplo, transformação, eletroporação, transfecção). Para as finalidades desta descrição, os termos transformado com, transformante, transformação, transfectado com e transfecção todos se referem à introdução de um ácido nucléico em uma célula através de um dos vários métodos conhecidos pelos versados na técnica. A transformação de células procarióticas, por exemplo, é comumente conseguida através do tratamento das células com cloreto de cálcio de forma a torná-las competentes para captarem o DNA exógeno e então da mistura de tal DNA com as células competentes. As células procarióticas podem ser também infectadas com um vetor de bacteriófago recombinante.

Os ácidos nucléicos podem ser introduzidos nas células de organismos superiores através de infecção viral, transferência mediada por bactérias (por exemplo, o sistema de distribuição do T-DNA de Agrobacteríum), eletroporação, co-precipitação com fosfato de cálcio, microinjeção, lipofecção, bombardeio com partículas revestidas com ácidos nucléicos ou outras técnicas, dependendo do tipo celular. Para gramíneas tais como o milho e o

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______ί A: sorgo, pode ser utilizado o bombardeio de microprojéteis como descrito, por exemplo, em Sanford, J. C. e outros, Patente U.S. N² 5.100.792 (1992). Outros protocolos úteis para a transformação de plantas são fornecidos em Gelvin e outros, 1992. Os protocolos adequados para a transformação e para a transfecção de células são também encontrados em Sambrook e outros,

1989. Os constructos de ácidos nucléicos desta invenção também podem ser incorporados em partes específicas da planta tais como as descritas supra através das técnicas de transformação e de transfecção descritas aqui.

Para auxiliar na identificação das células vegetais transforma10 das, os constructos desta invenção são adicionalmente manipulados para incluir genes que codificam marcadores selecionáveis de plantas. Os marcadores selecionáveis de plantas úteis incluem enzimas que fornecem resistência a um antibiótico tal como a gentamicina, a higromicina, a canamicina ou similares. Similarmente, são úteis as enzimas responsáveis pela produ15 ção de um composto que pode ser identificado por alteração de cor tal como GUS (β-glucuronidase) ou por luminescência tal como a luciferase.

Por exemplo, a Ftase anti-sentido pode ser produzida através da integração de um complemento do gene ERA1 ligado ao DNA que compreende a SEQ ID N²: 3 no genoma de um vírus que entra nas células hospe20 deiras.

Quando as células ou os protoplastos que contêm o gene antisentido controlado por um promotor da presente invenção são obtidos, as células ou os protoplastos são regenerados em plantas inteiras. As células transformadas são então cultivadas sob condições apropriadas para a rege25 neração de plantas, o que resulta na produção de plantas transgênicas. A escolha da metodologia para a etapa de regeneração não é crítica, com protocolos adequados estando disponíveis para muitas variedades de plantas, tecidos e outros organismos fotossintéticos. Ver, por exemplo, Gelvin S. B. e

Schilperoort R. A., eds. Plant Molecular Biology Manual, Segunda Edição,

Supl. 1 (1995) Kluwer Academic Publishers, Boston MA, U.S.A.

As plantas transgênicas que carregam o constructo são examinadas em relação ao fenótipo desejado utilizando uma variedade de méto-

SOS dos que incluem, mas não estão limitados a um marcador fenotípico adequado, tal como a resistência a um antibiótico ou a resistência a um herbicida como descrito supra ou a observação visual de seu crescimento comparado com o crescimento de plantas que ocorrem naturalmente sob as mes5 mas condições.

Como utilizado aqui, o termo plantas transgênicas inclui plantas

que contêm DNA ou RNA que não ocorre naturalmente na planta do tipo selvagem (nativa) ou em variações conhecidas ou cópias adicionais ou invertidas do DNA que ocorre naturalmente e que é introduzido como descrito a10 qui. As plantas transgênicas incluem aquelas em que ácidos nucléicos isolados foram introduzidos e seus descendentes, produzidos partindo da semente, propagação vegetativa, cultura de células, tecidos ou protoplastos ou similares em que tal alteração é mantida.

Tais plantas transgênicas incluem, em uma modalidade, plantas transgênicas que são angiospermas, tanto monocotiledôneas quando dicotiledôneas. As plantas transgênicas incluem aquelas em que o DNA foi introduzido e a sua progênie, produzida por semente, propagação vegetativa, cultura de células, tecidos ou protoplastos ou similares.

A semente pode ser obtida partindo da planta regenerada ou de um cruzamento entre a planta regenerada e uma planta adequável da mesma espécie. Alternativamente, a planta pode ser propagada vegetativamente através do cultivo de partes da planta sob condições adequadas para a regeneração de tais partes da planta.

Ainda em um outro aspecto desta invenção são fornecidos cultu25 ra de tecido vegetal e protoplastos que contêm DNA que compreende um ácido nucléico de ERA1 anti-sentido ou alterado ligado de forma operacional a um promotor de ERA1, que altera a resposta da cultura de tecido ou dos protoplastos nas condições ambientais variáveis.

Os métodos desta invenção também podem ser utilizados com técnicas de transformação in planta ou de sementes que não requerem cultura ou regeneração. Os exemplos destas técnicas estão descritos em Bechtold, N. e outros. (1993) CR Acad. Sei. Paris/Life Sciences 376:118-93;

Chang, S. S. e outros (1990) Abstracts of the Fourth International Conference on Arabidopsis Research, Viena, p. 28; Feldmann, K. A. e Marks, D. M (1987) Mol. Gen. Genet. 208:1-9; Ledoux, L. e outros (1985) Arabidopsis Inf. Serv. 22:1-11; Feldmann, K. A. (1992) Em: Methods in Arabidopsis Research 5 (Eds. Koncz, C., Chua, N-H, Schell, J.) pp. 274-289; Chee e outros, Patente

U.S. N² de Série 5.376.543.

As moléculas de ácido nucléico isoladas da invenção podem ser utilizadas para expressar a proteína PPI (por exemplo, através de um vetor de expressão recombinante em uma célula hospedeira), para detectar mR10 NA de PPI (por exemplo, em uma amostra biológica) ou uma lesão genética em um gene PPI e para modular a atividade de PPI, como descrito adicionalmente, abaixo. Em adição, as proteínas PPI podem ser utilizadas para selecionar compostos que modulam a atividade ou a expressão da proteína PPI. Em adição, os anticorpos anti-PPI da invenção podem ser utilizados 15 para isolar proteínas PPI e modular a atividade da PPI.

A invenção fornece um método (também referido aqui como um ensaio de seleção) para a identificação de moduladores, isto é, compostos ou agentes candidatos ou de teste (por exemplo, peptídeos, imitadores de peptídeos, pequenas moléculas ou outras drogas) que se ligam às proteínas

PPI ou possuem um efeito estimulante ou inibidor sobre, por exemplo, a ex-

pressão da proteína PPI ou a atividade da proteína PPI. A invenção inclui ainda compostos identificados nos ensaios de seleção descritos aqui.

Em uma modalidade, a invenção fornece ensaios para selecionar os compostos candidatos ou de teste que se ligam a uma proteína ou polipeptídeo de PPI ou uma parte biologicamente ativa do mesmo. Os compostos de teste da invenção podem ser obtidos utilizando qualquer uma das várias abordagens em métodos de bibliotecas combinatórias conhecidas na técnica, incluindo: bibliotecas biológicas; bibliotecas em fase sólida ou em fase de solução paralelas que podem ser acessadas espacialmente; méto30 dos de bibliotecas sintéticas que requerem deconvolução; o método de biblioteca uma esfera um composto; e métodos de bibliotecas sintéticas utilizando seleção por cromatografia de afinidade. A abordagem das bibliotecas

biológicas está limitada às bibliotecas peptídicas, enquanto que as outras quatro abordagens podem ser aplicadas em peptídeos, oligômeros que não são peptídeos ou bibliotecas de moléculas pequenas de compostos. Ver, por exemplo, Lam, 1997. Anticancer Drug Design 12: 145. Entende-se que uma 5 pequena molécula como utilizado aqui, se refira a uma composição que possui um peso molecular menor que aproximadamente 5 kD e mais preferencialmente menor que aproximadamente 4 kD. As pequenas moléculas podem ser, por exemplo, ácidos nucléicos, peptídeos, polipeptídeos, imitado-

res de peptídeos, carboidratos, lipídeos ou outras moléculas orgânicas ou inorgânicas. As bibliotecas de misturas químicas e/ou biológicas, tais como extratos de fungos, bactérias ou algas, são conhecidas na técnica e podem ser verificadas com qualquer um dos ensaios da invenção. Os exemplos de métodos para a síntese de bibliotecas moleculares podem ser encontrados na técnica, por exemplo, em: DeWitt e outros, 1993. Proc. Natl: Acad. Sei.

U.S.A. 90: 6909; Erb e outros, 1994. Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 91: 11422; Zuckermann e outros, 1994. J. Med. Chem. 37: 2678; Cho e outros, 1993.

Science 261: 1303; Carrell e outros, 1994. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33: 2059; Carell e outros, 1994. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33: 2061; and Gallop e outros, 1994. J. Med. Chem. 37: 1233.

As bibliotecas de compostos podem ser apresentadas em solu ção (por exemplo, Houghten, 1992. Biotechniques 13: 412-421) ou sobre esferas (Lam, 1991. Nature 354: 82-84), em chips (Fodor, 1993. Nature 364: 555-556), bactérias (Ladner, Patente U.S. N^s 5.223.409), esporos (Ladner, Patente U.S. N° 5.233.409), plasmídeos (Cull e outros, 1992. Proc. Natl. A25 cad. Sei. USA 89: 1865-1869) ou em um fago (Scott e Smith, 1990. Science

249: 386-390; Devlin, 1990. Science 249: 404-406; Cwirla e outros, 1990.

Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 87: 6378-6382; Felici, 1991. J. Mol. Biol. 222: 301-310; Ladner, Patente U.S. N² 5.233.409).

Em uma modalidade, um ensaio com base em célula em que uma célula que expressa uma proteína PPI ou uma parte biologicamente ativa da mesma, é colocada em contato com um composto de teste e a capacidade do composto de teste de se ligar a uma proteína PPI é determina48

da. A célula, por exemplo, pode ser de origem de mamífero, de célula vegetal ou de célula de levedura. A determinação da capacidade do composto de teste de se ligar à proteína PPI pode ser realizada, por exemplo, acoplando o composto de teste com um radioisótopo ou uma marcação enzimática de forma que a ligação do composto de teste com a proteína PPI ou parte biologicamente ativa da mesma possa ser determinada através da detecção do composto marcado em um complexo. Por exemplo, os compostos de teste podem ser marcados com ¹²⁵l, ³⁵S, ¹⁴C ou ³H, diretamente ou indireta e o radioisótopo detectado através da contagem direta da radioemissão ou através da contagem da cintilação. Alternativamente, os compostos de teste podem ser marcados enzimaticamente com, por exemplo, peroxidase de raiz forte, fosfatase alcalina ou luciferase e a marcação enzimática detectada através da determinação de um substrato apropriado no produto. Em modalidade, o ensaio compreende colocar uma célula que expressa proteína PPI ou uma parte biologicamente ativa da mesma em contato um composto conhecido que se liga à PPI para formar uma mistura de ensaio, colocando a mistura de ensaio com um composto de teste e determinando a capacidade do composto de teste de interagir com uma proteína PPI, em que a determinação da capacidade do composto de teste de interagir com uma proteína PPI compreende a determinação da capacidade do composto de teste de se ligar preferencialmente à proteína PPI ou a uma parte biologicamente ativa da mesma quando comparada com o composto conhecido.

uma uma com

Em uma outra modalidade, um ensaio é um ensaio com base em célula que compreende colocar em contato uma célula que expressa uma proteína PPI ou uma parte biologicamente ativa da mesma, com um composto de teste e determinar a capacidade do composto de teste de modular (por exemplo, estimular ou inibir) a atividade da proteína PPI ou uma parte biologicamente ativa da mesma. A determinação da capacidade do composto de teste de modular a atividade da PPI ou de uma parte biologicamente ativa da mesma pode ser realizada, por exemplo, através da determinação da capacidade da proteína PPI se ligar ou de interagir com uma molécula alvo de PPI. Como utilizado aqui, molécula alvo é uma molécula com a qual uma proteína PPI se liga ou interage na natureza, por exemplo, uma molécula sobre a superfície de uma célula que expressa uma proteína que interage com a PPI, uma molécula na superfície de uma segunda célula, uma molécula no meio extracelular, uma molécula associada com a superfície interna de uma membrana celular ou uma molécula citoplasmática. Uma molécula alvo de PPI pode ser uma molécula sem ser PPI ou uma proteína ou polipeptídeo PPI da invenção. Em uma modalidade, uma molécula alvo de PPI é um componente de uma via de transdução de sinal que facilita a transdução de um sinal extracelular (por exemplo, um sinal gerado pela ligação de um composto a uma molécula ligada à membrana) através da membrana celular e na célula. O alvo, por exemplo, pode ser uma segunda proteína intercelular que possui atividade catalítica ou uma proteína que facilita a associação de moléculas de sinalização a jusante com PPI. A determinação da capacidade da proteína PPI de se ligar ou de interagir com uma molécula alvo de PPI pode ser realizada através de um dos métodos descritos anteriormente para a determinação da ligação direta. Em uma modalidade, a determinação da capacidade da proteína PPI de se ligar ou de interagir com uma molécula alvo de PPI pode ser realizada através da determinação da atividade da molécula alvo. Por exemplo, a atividade da molécula alvo pode ser determinada através da detecção da indução de um segundo mensageiro celular do alvo (isto é, Ca²⁺ intracelular, diacilglicerol, IP₃ etc.), da detecção da atividade catalítica/enzimática do alvo em um substrato apropriado, da detecção da indução de um gene repórter (que compreende um elemento regulador que responde à PPI ligado de forma operacional a um ácido nucléico que codifica um marcador detectável, por exemplo, a luciferase) ou da detecção de uma resposta celular, por exemplo, sobrevivência celular, diferenciação celular ou proliferação celular.

Ainda em uma outra modalidade, um ensaio da invenção é um ensaio isento de células que compreende colocar uma proteína PPI ou uma parte biologicamente ativa da mesma em contato com um composto de teste e determinar a capacidade do composto de teste de se ligar à proteína PPI

</K) ou uma parte biologicamente ativa da mesma. A ligação do composto de

teste com a proteína PPI pode ser determinada diretamente ou indiretamen-

te como descrito anteriormente. Em tal modalidade, o ensaio compreende colocar em contato a proteína PPI ou uma parte biologicamente ativa da 5 mesma com um composto conhecido que se liga à PPI para formar uma mistura de ensaio, colocar em contato a mistura de ensaio com um composto de teste e determinar a capacidade do composto de teste de interagir com uma proteína PPI, em que a determinação da capacidade do composto de teste de interagir com uma proteína PPI compreende a determinação da capaci10 dade do composto de teste se ligar preferencialmente à PPI ou uma parte biologicamente ativa da mesma quando comparada com o composto conhecido.

Ainda em uma outra modalidade, um ensaio é um ensaio isento de células que compreende colocar a proteína PPI ou uma parte biologica15 mente ativa da mesma em contato com um composto de teste e determinar a capacidade do composto de teste de modular (por exemplo, estimular ou inibir) a atividade da proteína PPI ou da parte biologicamente ativa da mesma. A determinação da capacidade do composto de teste de modular a atividade da PPI pode ser realizada, por exemplo, através da determinação da capacidade da proteína PPI de se ligar com uma molécula alvo de PPI atra-

vés de um dos métodos descritos anteriormente para a determinação da ligação direta. Em uma modalidade alternativa, a determinação da capacidade do composto de teste de modular a atividade da proteína PPI pode ser realizada através da determinação da capacidade da proteína PPI modular adicionalmente uma molécula alvo da PPI. Por exemplo, a atividade catalítica/enzimática da molécula alvo sobre um substrato apropriado pode ser determinada como descrito anteriormente.

Ainda em uma outra modalidade, o ensaio isento de células compreende colocar a proteína PPI ou uma parte biologicamente ativa da 30 mesma em contato com um composto conhecido que se liga com a proteína PPI para formar uma mistura de ensaio, colocar a mistura de ensaio com um composto de teste e determinar a capacidade do composto de teste de inte „-í

ragir com uma proteína PPI, em que a determinação da capacidade do composto de teste de interagir com uma proteína PPI compreende a determinação da capacidade da proteína PPI de se ligar preferencialmente ou modular a atividade de uma molécula alvo de PPI.

Os ensaios isentos de células da invenção são tratáveis ao uso

da forma solúvel ou da forma ligada à membrana da proteína PPI. No caso de ensaios isentos de células que compreendem a forma ligada à membrana da proteína PPI, pode ser desejável utilizar um agente de solubilização de forma que a forma ligada à membrana da proteína PPI seja mantida em so10 lução. Os exemplos de tais agentes de solubilização incluem detergentes não iônicos tais como a n-octilglicosídeo, a n-dodecilglicosídeo, a ndodecilmaltosídeo, a octanoil-N-metilglucamida, a decanoil-Nmetilglucamida, o Triton® X-100, o Triton® X-114, Thesit®, Isotridecipoli (éter de etileno glicol)_n, o sulfonato de N-dodecil-N,N-dimetil-3-amônio-1-propano, 15 o sulfonato de 3-(3-colamidopropil) dimetilaminiol-1-propano (CHAPS) ou o sulfonato de 3-(3-colamidopropil) dimetilaminiol-2-hidróxi-1-propano (CHAPSO).

Em mais de uma modalidade dos métodos de ensaio anteriores da invenção, pode ser desejável imobilizar a proteína PPI ou sua molécula 20 alvo para facilitar a separação das formas complexadas das não complexadas de uma ou de ambas as proteínas, assim como acomodar automação do ensaio. A ligação do composto de teste com a proteína PPI ou a interação da proteína PPI com uma molécula alvo na presença ou na ausência de um composto candidato, pode ser realizada em qualquer recipiente adequa25 do para conter os reagentes. Os exemplos de tais recipientes incluem placas para microtitulação, tubos de ensaio e tubos de microcentrífugas. Em uma modalidade, pode ser fornecida uma proteína de fusão que adiciona um domínio que permite que uma ou ambas as proteínas fiquem ligadas a uma matriz. Por exemplo, as proteínas de fusão GST-PPI ou as proteínas de fu30 são GST-alvo podem ser adsorvidas sobre esferas de glutationa sepharose (Sigma Chemical, St. Louis, MO) ou placas para microtitulação derivatizadas com glutationa, que são então combinadas com o composto de teste ou o

composto de teste e a proteína alvo não adsorvida ou a proteína PPI e a mistura é incubada sob condições que conduzem à formação de complexos (por exemplo, em condições fisiológicas para sal ou pH). Após a incubação, as esferas ou os cavidades das placas para microtitulação são lavados para remover quaisquer componentes não ligados, a matriz é imobilizada no caso de esferas, o complexo é determinado direta ou indiretamente, por exemplo, como descrito, supra. Alternativamente, os complexos podem ser dissociados da matriz e o nível de ligação ou de atividade da proteína PPI determinado utilizando técnica-padrão.

Outras técnicas para a imobilização de proteínas sobre matrizes também podem ser utilizadas nos ensaios de seleção da invenção. Por exemplo, a proteína PPI ou sua molécula alvo podem ser imobilizadas utilizando a conjugação da biotina e da estreptavidina. A proteína PPI ou as moléculas alvo biotiniladas podem ser preparadas partindo da biotina-NHS (N15 hidróxi-succinimida) utilizando técnicas bem-conhecidas dentro da técnica (por exemplo, o kit de biotinilação, Pierce Chemicals, Rockford, III.) e imobilizadas nas cavidades de placas de 96 cavidades revestidas com estreptavidina (Pierce Chemical). Alternativamente, anticorpos reativos com a proteína PPI ou com moléculas alvo, mas que não interferem com a ligação da prote20 ína PPI com sua molécula alvo, podem ser derivatizados nas cavidades da

placa e a proteína alvo ou PPI é capturada nas cavidades através da conjugação com anticorpos. Os métodos para detectar tais complexos, em adição aos descritos anteriormente para os complexos imobilizados com GST, incluem a imunodetecção de complexos utilizando anticorpos reativos com a proteína PPI ou molécula alvo, assim como os ensaios ligados a enzimas que se baseiam na detecção de uma atividade enzimática associada com a proteína PPI ou a molécula alvo.

Em uma outra modalidade, os moduladores da expressão da proteína PPI são identificados em um método em que uma célula é colocada 30 em contato com um composto candidato e a expressão do mRNA da PPI ou da proteína na célula é determinada. O nível de expressão do mRNA da PPI ou da proteína na presença do composto candidato é comparado com o ní-

vel de expressão do mRNA da PPI ou da proteína na ausência do composto candidato. O composto candidato pode então ser identificado como um modulador da expressão do mRNA da PPI ou da proteína com base nesta comparação. Por exemplo, quando a expressão do mRNA da PPI ou da pro5 teína é maior (isto é, estatística significativamente maior) na presença do composto candidato que em sua ausência, o composto candidato é identifi-

cado como um estimulador da expressão do mRNA da PPI ou da proteína. Alternativamente, quando a expressão do mRNA da PPI ou da proteína é menor (estatística significativamente menor) na presença do composto can10 didato do que em sua ausência, o composto candidato é identificado como um inibidor da expressão do mRNA da PPI ou da proteína. O nível de expressão do mRNA da PPI ou da proteína nas células pode ser determinado através de métodos descritos aqui para a detecção do mRNA da PPI ou da proteína.

*15 Em ainda um outro aspecto da invenção, as proteínas PPI podem ser utilizadas como proteínas de isca em um ensaio de dois híbridos ou em um ensaio de três híbridos (ver, por exemplo, a Patente U.S. N²

5.283.317; Zervos e outros, 1993. Cell 72: 223-232; Madura e outros, 1993.

J. Biol. Chem. 268: 12046-12054; Bartel e outros, 1993. Biotechniques 14:

920-924; Iwabuchi e outros, 1993. Oncogene 8: 1693-1696; e Brent WO

94/10300), para identificar outras proteínas que se ligam ou que interagem com a PPI (proteínas de ligação com a PPI ou PPI-bp) e modulam a atividade da PPI. É também provável que tais proteínas PPI estejam envolvidas na propagação de sinais pelas proteínas PPI na forma de, por exemplo, elementos a montante ou a jusante da via da PPI.

O sistema de dois híbridos se baseia na natureza modular da maioria dos fatores de transcrição, que consistem em domínios de ligação ao DNA e de ativação que podem ser separados. Sucintamente, o ensaio utiliza dois constructos de DNA diferentes. Em um constructo, o gene que codifica a PPI 30 é fundido e um gene que codifica o domínio de ligação ao DNA de um fator de transcrição conhecido (por exemplo, GAL-4). No outro constructo, uma seqüência de DNA, de uma biblioteca de seqüências de DNA, que codifica

uma proteína não identificada (presa ou amostra) é fundida com um gene que codifica o domínio de ativação do fator de transcrição conhecido. Se as proteínas isca e presa forem capazes de interagir, in vivo, formando um complexo dependente de PPI, os domínios de ligação e de ativação do DNA do fator de transcrição são colocados em proximidade íntima. Esta proximidade permite a transcrição de um gene repórter (por exemplo, LacZ) que está ligado de forma operacional a um sítio regulador da transcrição que responde ao fator de transcrição. A expressão do gene repórter pode ser detectada e as colônias de células que contêm o fator de transcrição funcional podem ser isoladas e utilizadas para a obtenção do gene clonado que codifica a proteína que interage com a PPI.

Ainda em um outro aspecto da invenção estão métodos que utilizam as plantas transgênicas da invenção para a identificação de componentes que interagem com a PPI através de protocolos de seleção genética. Estes componentes podem ser, por exemplo, elementos reguladores que modificam a expressão do gene PPI, proteínas de interação que modificam diretamente a atividade da PPI ou proteínas de interação que modificam os componentes da mesma via de transdução de sinal e exercem assim um efeito sobre a expressão ou a atividade da PPI. Sucintamente, os protocolos de seleção genética são aplicados nas plantas transgênicas da invenção e fazendo isso identificam genes relacionados que não são identificados utilizando uma estrutura básica do tipo selvagem para a seleção. Por exemplo, uma biblioteca marcada de ativação (Weigel e outros, 2000. Plant Physiol. 122: 1003-1013), pode ser produzida utilizando as plantas transgênicas da invenção como a estrutura básica genética. As plantas são então verificadas em relação a fenótipos alterados daqueles exibidos pelas plantas originais. Os métodos alternativos de produção de bibliotecas partindo de plantas transgênicas da invenção podem ser utilizados, por exemplo, mutações induzidas por reagentes químicos ou irradiação, métodos de inativação por inserção ou de ativação por inserção.

A invenção se refere ainda a novos agentes identificados pelos ensaios de verificação mencionados anteriormente e aos usos dos mesmos.

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Vetores de Expressão Recombinantes e Células Hospedei- ras

Um outro aspecto da invenção se refere a vetores, preferencialmente vetores de expressão, que contêm um ácido nucléico que codifica 5 uma proteína PPI ou derivados, fragmentos, análogos ou homólogos da mesma. Como utilizado aqui, o termo vetor se refere a uma molécula de ácido nucléico capaz de transportar um outro ácido nucléico ao qual foi ligada. Os exemplos de constructos de vetores de expressão incluem, por exemplo, os constructos das SEQ ID NP: 54-64. Um tipo de vetor é um 10 plasmídeo, que se refere a uma alça de DNA de filamento duplo circular em que segmentos de DNA adicionais podem ser ligados. Um outro tipo de vetor é um vetor viral, em que segmentos de DNA adicionais podem ser ligados no genoma viral. Certos vetores são capazes de se replicar de forma autônoma em uma célula hospedeira em que são introduzidos (por exemplo, 15 vetores bacterianos que possuem uma origem de replicação bacteriana).

Outros vetores ficam integrados no genoma de uma célula hospedeira após a introdução na célula hospedeira e assim são replicados junto com o genoma do hospedeiro. Além disso, certos vetores são capazes de direcionar a expressão de genes aos quais estão ligados de forma operacional. Tais ve20 tores são referidos aqui como vetores de expressão. Em geral, os vetores de expressão de utilidade nas técnicas do DNA recombinante estão freqüentemente na forma de plasmídeos. No presente relatório descritivo, plasmídeo e vetor podem ser utilizados de forma intercambiável uma vez que o plasmídeo é a forma mais comumente utilizada de vetor. Entretanto, é pre25 tendido que a invenção inclua tais outras formas de vetores de expressão, tais como vetores virais ou vetores de transformação de plantas, binários ou diferentemente, que servem para funções equivalentes.

Os vetores de expressão recombinantes da invenção compreendem um ácido nucléico da invenção em uma forma adequada para expres30 são do ácido nucléico em uma célula hospedeira, que significa que os vetores de expressão recombinantes incluem uma ou mais seqüências reguladoras, selecionadas com base nas células hospedeiras que serão utilizadas

para a expressão, que estão ligadas de forma operacional à seqüência de ácido nucléico que deve ser expressa.

Em relação a um vetor de expressão recombinante, ligado operacionalmente é entendido significar que a seqüência de nucleotídeo de interesse está ligada a uma seqüência(s) reguladora de maneira que permita a expressão da seqüência de nucleotídeo (por exemplo, em um sistema de transcrição/translação ou em um célula hospedeira quando o vetor é introduzido na célula hospedeira).

Pretende-se que o termo seqüência reguladora inclua promoto10 res, intensificadores e outros elementos de controle da expressão (por exemplo, sinais de poliadenilação). Tais seqüências reguladoras são descritas, por exemplo, em Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in

Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990). As seqüências reguladoras incluem as que direcionam a expressão constitutiva de uma se15 qüência de nucleotídeos em muitos tipos de célula hospedeira e as que direcionam a expressão da seqüência de nucleotídeos somente em certas células hospedeiras (por exemplo, seqüências reguladoras específicas ao teci-

do). Os exemplos de promotores adequados incluem, por exemplo, promotores constitutivos, promotores que podem ser induzidos pelo ABA, promotores específicos ao tecido ou promotores específicos à célula-guarda. Será considerado pelos versados na técnica que o planejamento do vetor de expressão pode depender de fatores tais como a escolha da célula hospedeira que será transformada, o nível de expressão da proteína desejada etc. Os vetores de expressão da invenção podem ser introduzidos nas células hos25 pedeiras para produzirem assim proteínas ou peptídeos, incluindo proteínas ou peptídeos de fusão, codificados por ácidos nucléicos como descrito aqui (por exemplo, proteínas PPI, formas mutantes de proteínas PPI, proteínas de fusão etc.).

Os vetores de expressão recombinantes da invenção podem ser planejados para a expressão de proteínas PPI em célula procarióticas ou eucarióticas. Por exemplo, as proteínas PPI podem ser expressas em células bacterianas tal como Escherichia coli, células de insetos (utilizando veto-

res de expressão de baculovírus), células de levedura, células vegetais ou células de mamíferos. As células hospedeiras adequadas são discutidas adicionalmente em Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in

Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990). Alternativamen5 te, o vetor de expressão recombinante pode ser transcrito e traduzido in vitro, por exemplo, utilizando seqüências reguladoras do promotor T7 e a T7 polimerase.

A expressão de proteínas em procariotos é mais freqüentemente realizada em Escherichia coli com vetores que contêm promotores constituti-

vos ou que podem ser induzidos que direcionam a expressão de proteínas de fusão ou sem ser de fusão. Os vetores de fusão adicionam um número de aminoácidos a uma proteína codificada pelos mesmos, geralmente no terminal amino da proteína recombinante. Tais vetores de fusão servem tipicamente para três finalidades: (/) aumentar a expressão da proteína recombi15 nante; (//) aumentar a solubilidade da proteína recombinante; e (7/7) auxiliar na purificação da proteína recombinante atuando como um ligante na purificação por afinidade. Freqüentemente, nos vetores de expressão de fusão, • um sítio de divagem proteolítica é introduzido na junção do porção de fusão e da proteína recombinante para possibilitar a separação da proteína recom20 binante do porção de fusão subseqüente à purificação da proteína de fusão.

Tais enzimas e suas seqüências de reconhecimento cognatas, incluem o Fator Xa, a trombina e a enteroquinase. Os vetores de expressão de fusão típicos incluem pGEX (Pharmacia Biotech Inc; Smith e Johnson, 1988. Gene 67: 31-40), pMAL (New England Biolabs, Beverly, Mass.) e pRIT5 (Pharma25 cia, Piscataway, N.J.) que fundem a glutationa-S-transferase (GST), a proteína de ligação E da maltose ou a proteína A, respectivamente, à proteína recombinante alvo.

Os exemplos de vetores de expressão de E. coli sem ser de fusão que podem ser induzidos adequados incluem o pTrc (Amrann e outros, (1988) Gene 69:301-315) e o pET 11d (Studier e outros, Gene Expression

Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990)60-89).

Uma estratégia para maximizar a expressão da proteína recombinante em E. coli é expressar a proteína em uma bactéria hospedeira com uma capacidade prejudicada de clivar de forma proteolítica a proteína recombinante. Ver, por exemplo, Gottesman, Gene Exfression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990) 119-128. Uma outra estratégia é alterar a seqüência de ácido nucléico do ácido nucléico que será inserido em um vetor de expressão de forma que os códons individuais para cada aminoácido sejam os utilizados preferencialmente em E. coli (ver, por exemplo, Wada e outros, 1992. Nucl. Acids Res. 20: 2111-2118). Tal alteração das seqüências de ácido nucléico da invenção pode ser realizada através de técnica-padrão de síntese de DNA.

Em uma outra modalidade, o vetor de expressão da PPI é um vetor de expressão de levedura. Os exemplos de vetores para a expressão na levedura Saccharomyces cerivisae incluem pYepSecl (Baldari e outros, 1987. EMBOJ. 6: 229-234), pMFa (Kurjan e Herskowitz, 1982. Cell 30: 933943), pJRY88 (Schultz e outros, 1987. Gene 54: 113-123), pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, Calif.) e picZ (InVitrogen Corp, San Diego, Calif.). Alternativamente, a PPI pode ser expressa em células de insetos utilizando vetores de expressão de baculovírus. Os vetores de baculovírus disponíveis para a expressão de proteínas em células de insetos cultivadas (por exemplo, células SF9) incluem a série do pAc (Smith e outros, 1983. Mol. Cell. Biol. 3: 2156-2165) e a série do pVL (Lucklow e Summers, 1989. Virology 170: 31-39).

Ainda em uma outra modalidade, um ácido nucléico da invenção é expresso em células de mamíferos utilizando um vetor de expressão de mamífero. Os exemplos de vetores de expressão de mamífero incluem pCDM8 (Seed, 1987. Nature 329: 840) e pMT2PC (Kaufman e outros, 1987. EMBO J. 6: 187-195). Quando utilizados em células de mamífero, as funções de controle dos vetores de expressão são freqüentemente fornecidas através de elementos reguladores virais. Por exemplo, os promotores comumente utilizados são derivados de polioma, adenovírus 2, citomegalovírus e vírus símio 40. Para outros sistemas de expressão adequados tanto para

células procarióticas quanto eucarióticas ver, por exemplo, Capítulos 16 e 17 de Sambrook e outros, Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2- ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989.

Ainda em uma outra modalidade, um ácido nucléico da invenção é expresso nas células vegetais utilizando um vetor de expressão vegetal. Os exemplos de sistemas de vetores de expressão vegetais incluem o plasmídeo indutor de tumor (Ti) ou parte do mesmo encontrado em Agrobacteríum, o DNA do vírus mosaico da couve-flor (CAMV) e vetores tal como pBI121.

Para a expressão em plantas, o cassete de expressão recombinante conterá em adição aos ácidos nucléicos da PPI, uma região promotora de planta, um sítio de início da transcrição (se a seqüência codificadora que será transcrita não tiver um) e uma seqüência de término da transcrição/de * 15 poliadenilação. A região de terminação/poliadenilação pode ser obtida do mesmo gene que a seqüência promotora ou pode ser obtida de genes diferentes. Os sítios únicos de enzimas de restrição nas extremidade 5' e a 3' do . cassete são tipicamente incluídos para permitir a fácil inserção em um vetor preexistente. Os exemplos de promotores adequados incluem promotores de 20 vírus vegetais tal como o promotor 35S do vírus mosaico da couve-flor

(CaMV) Odell e outros, Nature, 313: 810-812 (1985) e promotores de genes tais como a actina do arroz (McElroy e outros, Plant Cell, 163-171 (1990)); da ubiquitina (Christensen e outros, Plant Mol. Biol., 12: 619-632 (1992); e Christensen e outros, Plant Mol. Biol., 18: 675-689 (1992)); pEMU (Last e outros, Theor. Appl. Genet., 81: 581-588 (1991)); MAS (Velten e outros, EMBO J., 3: 2723-2730 (1984)); da histona H3 do milho (Lepetit e outros, Mol. Gen. Genet., 231: 276-285 (1992); e Atanassvoa e outros, Plant Journal,

2(3): 291-300 (1992)), o promotor 5' ou a 3' derivado do T-DNA de Agrobacterium tumefaciens, o promotor Smas, o promotor da cinamil álcool desidró30 genase (Patente U.S. N^fi 5.683.439), o promotor da Nos, o promotor de rubisco, o promotor de GRP1-8, o promotor ALS, (WO 96/30530), um promotor sintético, tais como os promotores Rsyn7, SCP e UCP, promotor da ribulose-

1,3-difosfato carboxilase, promotor específico aos frutos, promotores de choque térmico, promotores específicos às sementes e outras regiões de início da transcrição de vários genes vegetais, por exemplo incluem as várias regiões de início da opina, tais como, por exemplo, a octopina, a manopina e a nopalina.

Os elementos reguladores adicionais que podem ser conectados a uma seqüência de ácido nucléico da PPI para a expressão em células vegetais incluem terminadores, seqüências de poliadenilação e seqüências de ácidos nucléicos que codificam peptídeos sinais que permitem a localização dentro de uma célula vegetal ou secreção da proteína da célula. Tais elementos reguladores e métodos para adicionar ou trocar estes elementos pelo gene da PPI de elementos reguladores são conhecidos e incluem, mas não estão limitados às regiões de terminação e/ou de poliadenilação a 3' tais como as do gene da nopalina sintase (nos) de Agrobacterium tumefaciens (Bevan e outros, Nucl. Acids Res., 12: 369-385 (1983)); do gene do inibidor da proteinase II da batata (PINII) (Keil e outros, Nucl. Acids Res., 14: 5641

5650 (1986) e incorporado aqui como referência); e An e outros, Plant Cell, 1: 115-122 (1989)); e o gene 19S de CaMV (Mogen e outros, Plant Cell, 2: 1261-1272(1990)).

As seqüências de sinal de plantas, incluindo, mas não limitadas às seqüências de DNA/RNA que codificam o peptídeo sinal que direcionam as proteínas para a matriz extracelular da célula vegetal (Dratewka-Kos e outros, J. Biol. Chem., 264: 4896-4900 (1989)) e o gene de extensão de Nicotiana plumbaginifolia (DeLoose e outros, Gene, 99: 95-100 (1991)) ou peptídeos sinal que direcionam proteínas para os vacúolos como o gene da esporamina da batata-doce (Matsuka e outros, Proc. Nat'l Acad. Sei. (USA), 88: 834 (1991)) e o gene da lectina da cevada (Wilkins e outros, Plant Cell, 2: 301-313 (1990)) ou sinais que fazem com que as proteínas sejam secretadas tal como o de PRIb (Lind e outros, Plant Mol. Biol., 18: 47-53 (1992)) ou outros que direcionam as proteínas para os plastídeos tal como os da enoil-ACP redutase da semente de colza (Verwaert e outros, Plant Mol. Biol., 26: 189-202 (1994)) são úteis na invenção.

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Em uma outra modalidade, o vetor de expressão recombinante é capaz de direcionar a expressão do ácido nucléico preferencialmente em um tipo de célula particular (por exemplo, elementos reguladores específicos ao tecido são utilizados para expressar o ácido nucléico). Os elementos reguladores específicos ao tecido são conhecidos na técnica. São especialmente úteis na conexão com os ácidos nucléicos da presente invenção sistemas de expressão que são operáveis em plantas. Estes incluem sistemas que estão sob controle de um promotor específico ao tecido, assim como os que envolvem promotores que são operáveis em todos os tecidos vegetais.

Os promotores específicos aos órgãos são também bemconhecidos. Por exemplo, o promotor da patatina de classe I é ativado de forma transcricional somente no tubérculo da batata e pode ser utilizado para direcionar a expressão gênica no tubérculo (Bevan, M., 1986, Nucleic Acids Research 14:4625-4636). Um outro promotor específico da batata é o promotor da amido sintase ligada ao grânulo (GBSS) (Visser, R. G. R. e outros, 1991, Plant Molecular Biology 17:691-699). Outros promotores específicos aos órgãos apropriados para um órgão alvo desejado podem ser isolados utilizando procedimentos conhecidos. Estas sequências de controle são geralmente associadas com genes expressos exclusivamente no órgão desejado. Em uma planta superior típica, cada órgão possui milhares de mRNAs que estão ausentes em outros sistemas de organismos (revisado em Goldberg, P., 1986, Trans. R. Soc. London B314:343).

Para a produção in situ do mRNA anti-sentido de GST, as regiões do gene GST que são transcritas em mRNA de GST, incluindo as regiões não traduzidas do mesmo, são inseridas no vetor de expressão sob o controle do sistema promotor em uma orientação invertida. O mRNA transcrito resultante é então complementar ao normalmente produzido pela planta.

O sistema ou cassete de expressão resultante é ligado ou de outra forma construído para ser incluído em um vetor recombinante que é apropriado para a transformação de plantas. O vetor pode conter ainda um gene marcador selecionável através do qual as células vegetais transforma-

das podem ser identificadas em cultura. Geralmente o gene marcador codificará resistência a um antibiótico. Estes marcadores incluem a resistência a G418, à hidromicina, à bleomicina, à canamicina e à gentamicina. Após transformar as células vegetais, as células que possuem o vetor serão identi5 ficadas por sua capacidade de crescer em um meio contendo o antibiótico particular. As seqüências de replicação, de origem bacteriana ou viral, são geralmente também incluídas para permitir que o vetor seja clonado em um hospedeiro bacteriano ou de fago, preferencialmente uma origem de replicação procariótica com ampla faixa de hospedeiro é incluída. Um marcador 10 selecionável para bactérias também pode ser incluído para permitir a seleção de células bacterianas que carregam o constructo desejado. Os marcadores procarióticos adequados também incluem resistência a antibióticos tal como a canamicina ou a tetraciclina.

Outras seqüências de DNA que codificam funções adicionais •15 também podem estar presentes no vetor, como é conhecido na técnica. Por exemplo, no caso de transformações com Agrobacterium, as seqüências de T-DNA também serão incluídas para a transferência subseqüente para cro, mossomos vegetais.

Um outro aspecto da invenção se refere a células hospedeiras 20 em que um vetor de expressão recombinante da invenção foi introduzido. Os termos célula hospedeira e célula hospedeira recombinante são utilizados aqui de forma intercambiável. Deve ser entendido que tais termos se referem não somente à célula individual particular, mas também à progênie ou à progênie potencial de tal célula. Devido ao fato de que certas modificações po25 dem ocorrer nas gerações sucessoras por causa de mutação ou influências ambientais, tal progênie pode não, verdadeiramente, ser idêntica à célula original, mas está ainda incluída dentro do âmbito do termo que é utilizado aqui.

O vetor de DNA pode ser introduzido em células procarióticas ou 30 eucarióticas através de técnicas convencionais de transformação ou de transfecção. Como utilizado aqui, é pretendido que os termos transformação e transfecção se refiram a uma variedade de técnicas reconhecidas

na técnica para a introdução de ácido nucléico estranho (por exemplo, DNA) em uma célula hospedeira.

Uma célula hospedeira da invenção, tal como uma célula hospedeira procariótica ou eucariótica em cultura, pode ser utilizada para produzir (isto é, expressar) um polipeptídeo da invenção codificado em um quadro aberto de leitura de um polinucleotídeo da invenção. Conseqüentemente, a invenção fornece ainda métodos para a produção de um polipeptídeo utilizando as células hospedeiras da invenção. Em uma modalidade, o método compreende o cultivo da célula hospedeira da invenção (na qual um vetor de expressão recombinante que codifica um polipeptídeo da invenção foi introduzido) em um meio adequado tal como o que o polipeptídeo é produzido, em outra modalidade, o método também compreende isolar o peptídeo a partir do meio ou da célula hospedeira.

Vários número de tipos de células podem atuar como células hospedeiras adequadas para a expressão de um polipeptídeo codificado por um quadro aberto de leitura em um polinucleotídeo da invenção. As células vegetais hospedeiras incluem, por exemplo, células vegetais que poderíam funcionar como hospedeiros adequados para a expressão de um polinucleotídeo da invenção que inclui células epidérmicas, mesófilo e outros tecidos enterrados e tecidos vasculares em folhas, caules, órgãos florais e raízes de uma variedade de espécies de plantas, tais como Arabidopsis thaliana, Nicotiana tabacum, Brassica napus, Milho Zea, Oryza sativa, Gossypium hirsutum e Glycine max.

Alternativamente, pode ser possível produzir um polipeptídeo em eucariotos inferiores tal como levedura ou em procariotos tais como bactérias. As cepas de levedura potencialmente adequadas incluem cepas de Saccharomyces cerevisiae, de Schizosaccharomyces pombe, de Kluyveromyces, de Candida ou qualquer cepa de levedura capaz de expressar proteínas heterólogas. As cepas bacterianas potencialmente adequadas incluem Escherichia coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium ou qualquer cepa bacteriana capaz de expressar polipeptídeos heterólogos. Se o polipeptídeo for produzido em levedura ou em bactéria, pode ser necessário

modificar o polipeptídeo produzido nas mesmas, por exemplo, através da fosforilação ou da glicosilação dos sítios apropriados, com a finalidade de se obter um polipeptídeo funcional, se o polipeptídeo tiver o comprimento suficiente e a conformação para ter atividade. Tais ligações covalentes podem ser realizadas utilizando métodos químicos ou enzimáticos conhecidos.

Um polipeptídeo pode ser preparado através do cultivo de células hospedeiras transformadas sob condições de cultivo adequadas para a expressão da proteína recombinante. O polipeptídeo ou a proteína expressa resultante pode ser então purificada de tal cultura (por exemplo, do meio de cultura ou de extratos de células) utilizando processos de purificação conhecidos, tal como a filtração em gel e a cromatografia de troca iônica. A purificação do polipeptídeo ou da proteína também pode incluir uma coluna de afinidade contendo agentes que se ligarão à proteína; uma ou mais etapas em coluna sobre tais resinas de afinidade como a concanavalina A-agarose, a heparin-toyopearl® ou a Cibacrom blue 3GA Sepharose®; uma ou mais etapas envolvendo cromatografia de interação hidrofóbica utilizando resinas tais como fenil éter, butil éter ou propil éter; ou cromatografia por imunoafinidade.

Alternativamente, um polipeptídeo ou uma proteína também pode ser expressa em uma forma que irá facilitar a purificação. Por exemplo, pode ser expressa na forma de uma proteína de fusão contendo uma marcação de seis resíduos de histidina. A proteína marcada com histidina se ligará então a uma coluna de afinidade Ni. Após a eluição de todas as outras proteínas, a proteína marcada com histidina pode ser eluída para atingir uma purificação rápida e eficiente. Uma ou mais etapas de cromatografia líquida de alto desempenho em fase reversa (RP-HPLC) empregando meios hidrofóbicos para RP-HPLC, por exemplo, sílica-gel que possui grupos metila ou outros alifáticos suspensos, podem ser empregadas para purificar adicionalmente um polipeptídeo. Algumas ou todas as etapas de purificação anteriores, em várias combinações, também podem ser empregadas para fornecer um polipeptídeo recombinante isolado substancialmente homogêneo. A proteína ou o polipeptídeo purificado dessa forma é substancialmente isento

presente invenção como isolado.

Células Vegetais Transformadas e Plantas Transgênicas

A invenção inclui protoplasto, células vegetais, tecido vegetal e plantas (por exemplo, monocotiledôneas e dicotiledôneas transformadas com um ácido nucléico de PPI (isto é, sentido ou anti-sentido) ou um vetor de expressão contendo um ácido nucléico de PPI (isto é, sentido ou antisentido). Como utilizado aqui, entende-se que planta inclua não somente uma planta inteira, mas também uma parte da mesma (isto é, células e teci10 dos, incluindo, por exemplo, folhas, caules, brotos, raízes, flores, frutos e sementes).

A planta pode ser qualquer tipo de planta incluindo, por exemplo, espécies dos gêneros Cucurbita, Rosa, Vitis, Juglans, Fragaria, Lotus, Medicago, Onobrychis, Trífolium, Trigonella, Vigna, Citrus, Linum, Geranium, Ma’ 15 nihot, Daucus, Arabidopsis, Brassica, Raphanus, Sinapis, Atropa, Capsicum, Datura, Hyoscyamus, Lycopersicon, Nicotiana, Solanum, Petunia, Digitalis,

Majorana, Ciahorium, Helianthus, Lactuca, Bromus, Asparagus, Antirrhinum,

Heterocallis, Nemesis, Pelargonium, Panieum, Pennisetum, Ranunculus,

Senecio, Salpiglossis, Cucumis, Browaalia, Glycine, Pisum, Phaseolus, Loli20 um, Oryza, Zea, Avena, Hordeum, Secale, Triticum, Sorghum, Gossypium,

Picea, Caco e Populus.

Em alguns aspectos da invenção, a planta transformada é resistente a estresses bióticos e abióticos, por exemplo, estresse por resfriamento, estresse a sais, estresse hídrico (por exemplo, seca), doença, pragas de 25 pasto e cicatrização de feridas. Adicionalmente, a invenção inclui ainda uma planta transgênica que é resistente a agentes patogênicos tais como, por exemplo, fungos, bactérias, nematóides, vírus e ervas daninhas parasitas. Alternativamente, a planta transgênica é resistente a herbicidas ou possui senescência retardada. A planta transgênica possui um aumento no rendi30 mento, na produtividade, na biomassa ou na sensibilidade ao ABA. Por resistente entende-se que a planta cresce sob condições de estresse (por exemplo, alto teor de sais, pouca água, baixas temperaturas) ou sob condi-

ções que inibem normalmente, até um certo grau, o crescimento de uma planta não transformada. As metodologias para determinar o crescimento da planta ou a resposta ao estresse incluem, por exemplo, medidas da altura, medidas do peso, área foliar, capacidade de florescer, uso da água, taxas de 5 transpiração e rendimento.

A invenção inclui ainda células, tecidos, incluindo, por exemplo, folhas, caules, brotos, raízes, flores, frutos e sementes e a progênie derivada da planta transformada.

Vários métodos para introduzir genes estranhos nas plantas são conhecidos e podem ser utilizados para inserir um gene em uma planta hospedeira, incluindo protocolos de transformação física de plantas. Ver, por exemplo, Miki e outros, (1993) Procedure for Introducing Foreign DNA into Plants, Em: Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Glick e Thompson, eds., CRC Press, Inc., Boca Raton, páginas 67-88 e Andrew Bent em, ^M 15 Clough SJ e Bent AF, 1998. Floral dipping: a simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana. Os métodos escolhidos variam com a planta hospedeira e incluem métodos de transfecção química tais como o do fosfato de cálcio, a transformação com polietileno glicol (PEG), a transferência de genes mediada por microorganismos tal como A-

grobacterium (Horsch e outros, Science, 227: 1229-31 (1985)), a eletroporação, a transformação de protoplastos, a microinjeção, o mergulhamento de flores e o bombardeio biolístico.

Transformação mediada por Agrobacterium

O método mais amplamente utilizado para a introdução de um 25 vetor de expressão em plantas é baseado no sistema de transformação natural de Agrobacterium. A. tumefaciens e A. rhizogenes são bactérias do solo patogênicas para plantas que transformam geneticamente as células vegetais. Os plasmídeos Ti e Ri de A. tumefaciens e A. rhizogenes, respectivamente, carregam genes responsáveis pela transformação genética de plan30 tas. Ver, por exemplo, Kado, Crit. Rev. Plant Sei., 10: 1-32 (1991). As descrições dos sistemas de vetores de Agrobacterium e os métodos para a transferência gênica mediada por Agrobacterium são fornecidos em Gruber e ou-

tros, supra; e Moloney e outros, Plant Cell Reports, 8: 238-242 (1989).

As plantas de Arabidopsis transgênicas podem ser produzidas facilmente através do método de mergulhamento de plantas florescendo em uma cultura de Agrobacterium com base no método de Andrew Bent em,

Clough SJ e Bent AF, 1998. Floral dipping: a simplified method for Agrobacfe/wn-mediated transformation of Arabidopsis thaliana. As plantas do tipo selvagem são cultivadas até que a planta possua tanto flores em desenvolvimento quanto flores abertas. A planta é vertida durante 1 minuto em uma solução de cultura de Agrobacterium carregando o constructo gênico apro-

priado. As plantas são então deixadas na horizontal em uma bandeja e mantidas cobertas durante dois dias para manter a umidade e então endireitadas e embaladas para continuar o crescimento e o desenvolvimento das sementes. A semente madura é colhida em massa.

Transferência Gênica Direta “ 15 Um método que pode ser aplicado de forma geral de transformação de plantas é a transformação mediada por microprojéteis, em que o DNA é carregado na superfície de microprojéteis medindo aproximadamente , 1 até 4 μίτι. O vetor de expressão é introduzido nos tecidos vegetais com um dispositivo de biolística que acelera os microprojéteis a velocidades de 300 20 até 600 m/s que é suficiente para penetrar as paredes e as membranas celu-

lares da planta. (Sanford e outros, Part. Sei. Technol., 5: 27-37 (1987); Sanford, Trends Biotech, 6: 299-302 (1988); Sanford, Physiol. Plant, 79: 206-209 (1990); Klein e outros, Biotechnology, 10: 286-291 (1992)). Um outro método para a distribuição física do DNA para plantas é submeter as células alvo ao ultra-som como descrito em Zang e outros, BioTechnology, 9: 996-996 (1991). Alternativamente, fusões de lipossomos ou de esferoplastos foram utilizadas para introduzir vetores de expressão em plantas. Ver, por exemplo, Deshayes e outros, EMBO J., 4: 2731-2737 (1985); e Christou e outros, Proc. Nat'l. Acad. Sei. (USA), 84: 3962-3966 (1987). A captação direta do 30 DNA nos protoplastos utilizando a precipitação com CaCfe, álcool polivinílico ou poli-L-ornitina também foi relatada. Ver, por exemplo, Hain e outros, Mol.

Gen. Genet., 199: 161 (1985); e Draper e outros, Plant Cell Physiol., 23: 451-

458 (1982).

A eletroporação de protoplastos e células e tecidos inteiros também foi descrita. Ver, por exemplo, Donn e outros, (1990) Em: Abstracts of the Vll^e lnt;l. Congress on Plant Cell and Tissue Culture IAPTC, A2-38, página 53; D'Halluin e outros, Plant Cell, 4: 1495-1505 (1992); e Spencer e outros, Plant Mol. Biol., 24: 51-61 (1994).

Distribuição de Partículas por Ferimento/Agrobacter/um

Um outro protocolo de transformação básico útil envolve uma combinação de ferimento através do bombardeio de partículas, seguido pelo uso de Agrobacterium para a distribuição do DNA, como descrito por Bidney e outros, Plant Mol. Biol., 18: 301-31 (1992). Os plasmídeos úteis para a transformação de plantas incluem Bin 19. Ver Bevan, Nucleic Acids Research, 12: 8711-8721 (1984) e incorporado aqui como referência.

Em geral, o método de transformação do meristema intacto envolve o embebimento da semente durante 24 horas na escuridão, removendo os cotilédones e o radical da raiz, seguidos pelo cultivo dos explantas de meristema. Vinte e quatro horas mais tarde, as folhas primárias são removidas para expor o meristema apical. Os explantas são colocados com a copa apical voltada para cima e são bombardeados, por exemplo, duas vezes 20 com partículas, seguido pelo co-cultivo com Agrobacterium. Para iniciar o co-

cultivo para meristemas intactos, a Agrobacterium é colicada sobre o meristema. Após um período de co-cultivo de aproximadamente 3 dias, os meristemas são transferidos para o meio de cultura com cefotaxima mais canamicina para a seleção com NPTII.

O método do meristema dividido envolve o embebimento da semente, a quebra dos cotilédones para produzir uma fratura limpa no plano do eixo embrionário, o corte da ponta da raiz e então dividindo em dois os explantas de forma longitudinal entre as folhas primordiais. As duas metades são colocadas com a superfície do corte para cima sobre o meio e então 30 bombardeadas duas vezes com partículas, seguido pelo co-cultivo com Agrobacterium. Para os meristemas divididos, após o bombardeio, os meristemas são colocados em uma suspensão de Agrobacterium durante 30 mi-

nutos. São então removidos da suspensão para um meio de cultura sólido durante um co-cultivo de três dias. Após este período, os meristemas são transferidos para meio fresco com cefotaxima mais canamicina para a seleção.

Transferência através do Cruzamento da Planta

Alternativamente, uma vez que uma única planta transformada foi obtida através do método de DNA recombinante anterior, os métodos convencionais de cruzamento de plantas podem ser utilizados para transferir o gene e as seqüências reguladoras associadas através de cruzamento e de

retrocruzamento. Tais métodos intermediários compreenderão as etapas adicionais de: (1) cruzamento sexual da planta transgênica com uma planta de um segundo táxon; (2) recuperação do material reprodutivo da progênie do cruzamento; e (3) cultivo das plantas transgênicas partindo do material reprodutivo. Quando desejável ou necessário, as características agronômi15 cas do segundo táxon podem ser substancialmente preservadas expandindo este método para incluir as etapas adicionais de repetitivamente: (1) retrocruzamento da progênie transgênica com plantas não transgênicas do segundo táxon; e (2) seleção da expressão de um gene marcador associado entre a progênie do retrocruzamento, até que a porcentagem desejada das características do segundo táxon estejam presentes na progênie junto com o

gene ou os genes que conferem a característica do gene marcador.

Pelo termo táxon contido aqui, entende-se uma unidade de classificação botânica. Este inclui o gênero, a espécie, os cultivares, as variedades, as variações e outros grupos taxonômicos de menor importância 25 que não possuem uma nomenclatura coerente.

Regeneração de Transformantes

O desenvolvimento ou a regeneração de plantas partindo de protoplastos vegetais individuais ou de vários explantas é bem-conhecida na técnica (Weissbach e Weissbach, 1988). Este processo de regeneração e 30 crescimento inclui tipicamente as etapas de seleção de células transformadas, de cultivo das células individualizadas através dos estágios usuais de desenvolvimento embrionário até o estágio de plantícula enraizada. Os emi i

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briões e as sementes transgênicas são similarmente regenerados. Os brotos enraizados transgênicos resultantes são depois disso plantados em um meio de cultivo de planta apropriado tal como o solo.

O desenvolvimento ou a regeneração de plantas contendo o ge5 ne exógeno estranho que codifica um polipeptídeo de interesse introduzido pela Agrobacterium partindo de explantas foliares pode ser atingida através

de métodos bem-conhecidos na técnica tais como os descritos (Horsch e outros, 1985). Neste procedimento, os transformantes são cultivados na presença de um agente de seleção e em um meio que induz a regeneração de 10 brotos na linhagem de planta que está sendo transformada como descrito (Fraley e outros, 1983). Em particular, a Patente U.S. N^Q 5.349.124 (relatório descritivo incorporado aqui como referência) detalha a criação de células de alface transformadas geneticamente e plantas resultantes das mesmas que expressam proteínas híbridas em cristal que conferem atividade inseticida contra larvas de Lepidópteras a tais plantas.

Este procedimento tipicamente produz brotos dentro do período de dois até quatro meses e tais brotos são transferidos para um meio indutor de raiz apropriado contendo o agente seletivo e um antibiótico para prevenir o crescimento bacteriano. Os brotos que enraizaram na presença do agente seletivo para formar plantículas são então transplantados para o solo ou ou-

tros meios para permitir a produção de raízes. Estes procedimentos variam dependendo da linhagem de planta particular empregada, tais variações sendo bem-conhecidas na técnica.

Preferencialmente, as plantas regeneradas são autopolinizadas para fornecer plantas transgênicas homozigotas ou o pólen obtido das plantas regeneradas é cruzado com plantas crescidas partindo de sementes de linhagens preferencialmente endogâmicas importantes agronomicamente.

Inversamente, o pólen das plantas das linhagens importantes é utilizado para polinizar plantas regeneradas. Uma planta transgênica da pre30 sente invenção contendo um polipeptídeo desejado é cultivada utilizando métodos bem-conhecidos pelo versado na técnica.

Uma planta transgênica preferida é um segregante independente

SM e pode transmitir o gene e sua atividade para sua progênie. Uma planta ' transgênica mais preferida é homozigota para o gene e transmite tal gene para toda a sua prole no cruzamento sexual. A semente de uma planta transgênica pode ser cultivada no campo ou na estufa e as plantas transgê5 nicas sexualmente maduras resultantes são autopolinizadas para gerar plantas de cruzamento verdadeiro. A progênie destas plantas se torna linhagens de cruzamento verdadeiro que são avaliadas em relação à maior expressão do transgene.

MODALIDADES

Os constructos e os métodos desta invenção possuem várias aplicações de valor comercial, especialmente na prevenção da dessecação dos tecidos vegetais sob períodos de estresse hídrico. A manipulação genética de plantas de cultivo que incorporam inibidores da Ftase ou a inativação do gene que codifica a Ftase vegetal endógena permitiría que tais plantas ' 15 suportassem o estresse ambiental transitório e pode ampliar os ambientes em que estas plantas podem ser cultivadas. Assim, aumentando a tolerância das plantas de cultivo ao estresse ao frio, a sais e à seca, pode-se aumentar o rendimento das plantas sob tais condições adversas.

A tecnologia descrita aqui também pode ser utilizada para alterar o tempo de colheita e a qualidade da colheita das plantas. Por exemplo, a

superexpressão da Ftase podería levar a tempos de secagem menores das plantas de cultivo, tais como o milho e outras gramíneas. A secagem do milho envolve o uso de grandes quantidades de gás propano. Os tempos de secagem de plantas de cultivo tal como o centeio, que seca naturalmente nos campos, poderíam ser encurtados, tornando menos provável que a chuva deteriorasse a plantação.

Em adição, a inibição da farnesilação em plantas pode ser também utilizada para controlar o programa de senescência das plantas de forma que as folhas possam ser mantidas no estado verde mais tempo e os 30 frutos possam ser mantidos imaturos. Por exemplo, se um constructo antisentido de ERA1 ou do constructo da proteína de inibição da caixa CaaX fosse colocado sob o controle de um promotor induzido pela senescência, a planta induziría um inibidor da farnesilação à medida que o programa de se-

nescência fosse iniciado, que por sua vez inibiría a senescência. O resultado seria uma planta que permanece verde ou com frutos que permanecem imaturos. Assim, a planta poderia ser mantida produzindo um produto, tal como 5 uma parte vegetativa, flor ou fruto durante mais tempo. Assim, os horticultores poderíam produzir plantas que permaneceríam verdes e continuariam a

crescer enquanto uma planta do tipo selvagem da mesma variedade iria senescer sob as mesmas condições. Flores cortadas poderíam ser mantidas durante mais tempo. Ou um fruto poderia ser mantido imaturo, um importan10 te produto para a indústria vegetal onde produzir tempo de vida para o mercado é extremamente importante.

Ainda, a inibição da Ftase nos frutos e nos vegetais pode reduzir o murchamento. Assim, o murchamento do produto durante o transporte e envio poderia ser reduzido. Os frutos e os vegetais na prateleira dos arma* 15 zéns iriam requerer menos nebulização para mantê-los frescos e saborosos e haveria menos necessidade de encerar o produto tal como o pepino, as maçãs e as laranjas para evitar que ressequem.

, Menos rega também significaria que ataques de fungos e de bactérias sobre as plantas de cultivo ou frutos e vegetais fossem reduzidos.

Por exemplo, as doenças vegetais no campo que resultam do espalhamento

de agentes patogênicos de plantas do solo nas folhas e frutos das plantas poderíam ser inibidas.

No campo da horticultura, muitas variedades resistentes à seca poderíam ser produzidas para paisagismo e para uso como plantas orna25 mentais em casas. Seriam especialmente valiosas plantas que são utilizadas para cultura em vasos, como ornamentais dentro ou fora de domicílios e escritórios e que podem sobreviver com água infrequente. Isto seria uma vantagem considerável para jardineiros, especialmente durante os meses secos do verão em que plantas esquecidas secam rapidamente no sol. Ainda, as plantas cultivadas sob árvores e outras áreas sombreadas sofrem freqüentemente condições de seca e de luz limitada. A tecnologia fornecida aqui pode fornecer variedades de plantas que podem sobreviver melhor sob es-

tas condições.

Em uma modalidade adicional, os horticultores poderíam encontrar muitos usos para plantas em que os números de ramificações laterais e/ou flores podem ser regulados com ciclos de luz/escuridão. Os exemplos de plantas em que caules não ramificados mais longos conferem vantagens comerciais incluem rosas, cravos, lírios e similares. A capacidade de aumentar o número de flores ou florículos na planta é também uma vantagem altamente valiosa. Estas características poderíam também ser úteis para muitas plantas de cultivo agrícolas em que os rendimentos podem ser aumentados de uma maneira que também torna a colheita da plantação mais fácil.

Uma outra vantagem dos constructos e dos métodos fornecidos aqui é que o promotor ERA1 é ativo nas células-guardas das folhas. Uma parte do promotor do gene ERA1 pode ser fundida com um ácido nucléico anti-sentido para o gene ERA’ de forma que a atividade da Ftase fosse dimi nuída somente nas células-guardas.

Uma, modalidade adicional é o uso da característica de resistência à seca como um marcador selecionável da transformação nas plantas, células vegetais e tecidos vegetais. Um método de detecção da transformação em plantas consiste em: (a) incorporação de um constructo de ácido nucléico que compreende um promotor ligado de forma operacional ao ácido nucléico que compreende a seqüência anti-sentido para a SEQ ID N^e: 1 ou ao ácido nucléico que compreende um equivalente ou um fragmento funcional da mesma do anti-sentido; (b) inserção do constructo de ácido nucléico em uma planta, célula vegetal ou tecido vegetal; (c) cultivo da planta ou regeneração de uma planta partindo da célula vegetal ou do tecido vegetal até que os estômatos sejam formados; e (d) colocar a planta ou a planta regenerada sob condições em que a planta sofre estresse de seca, em que a sobrevivência da planta sob condições de seca comparada com a de plantas não transformadas é indicativa de transformação. Assim, esta tecnologia pode ser utilizada como um marcador genético selecionável, isto é, um marcador visual especialmente quando combinado com esquemas de seleção e de transformação de plantas.

Em adição, sem recorrer a estressar uma planta transgênica, o hábito de ramificação e/ou de florescência de plantas com perda da função da Ftase difere substancialmente daquele de plantas do tipo selvagem e pode ser utilizado como um marcador para a transformação bem sucedida. Es5 te método seria especialmente útil quando as técnicas de transformação in planta forem aplicadas. Sob condições de luz diurna, os brotos de plantas transgênicas demonstrarão menos ramificação lateral que a de brotos não transformados, indicando assim a perda eficiente da atividade da Ftase sem o uso de marcadores seletivos de antibióticos.

EXEMPLOS

Exemplo 1: Condições de mutagênese

As plantas de Arabidopsis utilizadas neste estudo foram cultivadas sob luz contínua em placas de petri contendo solo ou ágar como descrito em outro lugar (Haughn e Somerville 1986). Dois tipos selvagens distintos * 15 de Arabidopsis foram utilizados: Meyerowitz's Colombia (MCol) (Lelhe Seeds, Dripping Springs, TX) e Wassilewskija (Ws) (ABRC, Ohio State University). As sementes que sofreram mutação com o T-DNA foram selecionadas e os mutantes foram isolados no meio básico de Wassilewskija. Estes foram obtidos da coleção de estoque de sementes de Arabidopsis do Estado de

Ohio (números de estoque de ABRC CS2606-2654). A coleção de sementes

com T-DNA era compreendida de 49 grupos de 1200 proles da quarta geração (T4) derivadas de 100 parentais que sofreram mutação. Um parental que sofreu mutação foi obtido através da incubação de sementes do tipo selvagem (T1) durante a noite em uma cultura de Agrobacterium em satura25 ção contendo um plasmídeo de T-DNA que carrega um gene que confere resistência à canamicina. As sementes foram então lavadas em água e plantadas em vasos. As sementes da geração T2 foram obtidas de cada planta e testadas em relação à resistência à canamicina. As plantas resistentes à canamicina foram avançadas até a geração T3. As plantas da geração T4 foram fornecidas para o centro de estoque. Cada grupo foi verificado separadamente.

As sementes irradiadas com nêutrons acelerados foram selecio-

nadas e os mutantes foram isolados no meio básico de Meyerowitz's Colômbia. As sementes do tipo selvagem (N1) que sofreram mutação foram irradiadas com 60 Gy de nêutrons acelerados e cultivadas até a próxima geração. As sementes N2 foram obtidas na forma de grupos de aproximadamente 5 11.000 sementes geradas partindo dos parentais 1387 N1. Dez destes grupos foram verificados separadamente em relação às mutações de supersensibilidade ao ABA. Na verificação inicial, todas as sementes foram armazenadas a 4°C e foram plaqueadas sem embebimento. Para todas as verificações subseqüentes, as sementes foram embebidas a 4°C durante uma se-

mana em 0,3 μΜ de ABA e classificadas em relação à emergência de cotilédones após 5-7 dias a 22°C na luz.

Exemplo 2: Análise Genética

As linhagens mutantes foram retrocruzadas com o tipo selvagem três vezes. As mutações com T-DNA foram retrocruzadas com Ws e mutan15 tes de nêutrons acelerados até MCol. A segregação do fenótipo era foi sucedida pela plantação das sementes F2 tanto em 0,3 μΜ de ABA quando em embebimento durante quatro dias a 4°C. Após o embebimento, as placas foram transferidas para a temperatura ambiente na luz. A germinação foi medida na forma da presença ou da ausência de cotilédones expandidos 20 nas plantas novas uma semana após embebimento. Foram construídos mu-

tantes duplos através do cruzamento de linhagens homozigotas para cada mutação sucedido pela segregação e identificação das linhagens que carregavam um dos fenótipos mutantes. O alelo abi3 utilizado neste estudo é o ab/3-6 (Nambara e outros, 1994) e o alelo ab/Ί é o ab/1-1 (Koornneef e ou25 tros, 1982). O alelo era1-2 foi utilizado como o era original. A análise de segregação sugeriu que era1 suprimia parcialmente a insensibilidade de ab/1 ao ABA, de forma que as plantas F2 foram primeiro verificadas em relação à insensibilidade a 3 mM de ABA e as sementes F3 provenientes destas plantas foram classificadas em relação à sensibilidade a 0,3 μΜ de ABA. Os su30 postos mutantes duplos era1 abi1 tiveram sua progênie testada na geração

F4 e verificada através da análise de polimorfismo de DNA tanto para Era 1 quanto para Abi1. Para os mutantes duplos era 1 abi3, as sementes F2 foram &

verificadas em relação à insensibilidade a 3 μΜ de ABA e as plantas madu-

ras foram classificadas em relação a carpelos estendidos e sementes verdes imaturas (Nambara e outros, 1994). As supostas linhagens de mutantes duplos também foram verificadas através da análise de polimorfismo de DNA tanto para Era1 quanto para Abi3.

Exemplo 3: Análise de DNA e de RNA

Os métodos empregados para as extrações de DNA (Dellaporta e outros, 1983) e de RNA (Verwoerd e outros, 1989) eram como descrito em outro lugar. Os Southern blots de alto rigor foram realizados a 65°C de acor10 do com protocolos padronizados descritos em outro lugar (Sambrook e outros, 1989). Toda a verificação das bibliotecas genômicas e de cDNA foi feita em membranas Gelman BioTrace NT de acordo com as especificações do fabricante (Gelman Sciences). Para clonar as junções de inserção entre o TDNA e o DNA genômico no mutante era1-1 (isolado do DNA T12W) foi feita 15 uma biblioteca de DNA T12W em γ-ΖΑΡΙΙ (Stratagene). Os Southern blots genômicos do DNA T12W digerido com a endonuclease de restrição EcoR I e tratados com a sonda com o T-DNA da borda direita (RB) produziram três bandas (13,0 Kb, 7,0 Kb e 8,0 Kb). A análise subseqüente com enzimas de restrição adicionais verificou que as bandas de 7,0 e 8,0 Kb continham as 20 junções de inserção entre o T-DNA e o DNA flanqueador da planta. Estes fragmentos foram clonados através da digestão do' DNA genômico com EcoR I, do fracionamento do DNA digerido utilizando um Prep Cell (Pharmacia) e da identificação das frações contendo 7,0 e 8,0 Kb através da análise de Southern Blot utilizando a RB como uma sonda. As frações agrupadas con25 tendo ambos os fragmentos de 7,0 e de 8,0 Kb foram então ligadas aos braços do vetor γ-ΖΑΡΙΙ de acordo com as instruções do fabricante (Stratagene). Foi verificada uma biblioteca contendo aproximadamente 40.000 bacteriófagos recombinante individuais. Cinco placas positivas foram identificadas e as formas dos plasmídeos cortados dos insertos clonados foram isoladas de acordo com as instruções do fabricante (Stratagene). Os dois plasmídeos que se hibridizaram com a sonda da RB foram denominados de pL4B e pL7 e foram selecionados para uma caracterização adicional. Um fragmento de

restrição de EcoR l-EamH I de 2,3 kB proveniente do clone pL4B foi subclonado no plasmídeo pBluescript e denominado de pSC10. Um fragmento de restrição de Hind III- EamH I de 1,3 Kb proveniente do clone pL7 foi também subclonado no pBluescript e denominado de pSC11. Cada um destes plasmídeos contém aproximadamente 1,2 Kb de T-DNA ligadas ao DNA genômico flanqueador da planta. O pSC10 foi utilizado como uma sonda para verificar uma biblioteca de cDNA de Arabidopsis chamada de PRL2 λ-ZipLox (ABRC, Stock CD4-7). Esta verificação identificou cinco cDNAs positivos e o inserto de cDNA mais longo, o clone pZL23, foi utilizado para verificar mais 200.000 fagos PRL2 recombinantes. Subseqüentemente um inserto de cDNA mais longo, o clone pZL51, que continha um inserto de 1,35 Kb, foi isolado. Ambos os clones de cDNA pZL23 e pZL51 foram seqüenciados e utilizados para verificar 30.000 placas de γ-ΖΑΡΙΙ produzidas partindo do DNA genômico de Columbia do tipo selvagem parcialmente digerido com EcoR I. O - 15 constructo desta biblioteca foi como descrito anteriormente exceto pelo fato de que o DNA digerido não foi fracionado por tamanho. Esta verificação identificou quatro clones positivos. Os insertos foram cortados e as formas de plasmídeos cortadas foram isoladas de acordo com as instruções do fabricante. Uma região de 6 Kb abrangendo o clone pZL51 inteiro foi completa20 mente seqüenciada. Este inserto genômico e um inserto genômico de 14 Kb

isolado através da verificação de uma biblioteca genômica de λ-FIX de

Lansberg erecta através de métodos similares (ABRC Stock CD4-8) foram utilizados como sondas para analisar o tamanho da deleção nos mutantes de nêutron acelerado era1-2 e era1-3.

Exemplo 4: Ensaio da Proteína Farnesil Transferase

Os ensaios da farnesil transferase (Ftase) foram realizados utilizando a Ftase de extratos isentos de células de plantas do tipo selvagem e mutantes e heptapeptídeos sintéticos como o substrato para a reação. Os peptídeos foram obtidos na Genemed Biotechnologies, Inc. As sequências 30 peptídicas utilizadas se baseavam nos dados de Randall e outros (1993): GGCCAIM (-CAIM) e GGCCAIL(-CAIL). As soluções de peptídeos foram preparadas em dimetil sulfóxido (DMSO) a 100% contendo 10 mM de ditio-

treitol (DTT) e diluídas em 10 mM de DTT sem DMSO. Os extratos isentos

de células continham proteína solúvel isolada dos brotos de plantas de três semanas de idade, linhagens do tipo selvagem ou mutantes. Em primeiro lugar, 1 g de brotos frescos foi coletado e homogeneizado em um tampão contendo 50 mM de Hepes (pH 7,5), 1 mM de MgCI₂, 1 mM de EGTA, 5 mM de DTT, 2 pg/mL de leupeptina, 2 pg/mL de aprotinina e 1 mM de PMSF.

Depois, os restos e as membranas celulares foram removidos através de centrifugação a 4°C a 10.000 χ g durante 10 minutos e 100.000 χ g durante 30 minutos. Após a segunda centrifugação, o sobrenadante foi decantado e

a proteína solúvel total foi quantificada através do método de Bradford (1976). Os extratos de proteínas solúveis foram incubados a 30°C com um substrato peptídico e a farnesil pirofosfatase marcada radioativamente com ³H (FPP) (Amersham) durante 40 minutos. Cada mistura de reação continha os componentes a seguir em um volume final de 25 pL: 50 mM de Hepes

- 15 (pH 7,5), 5 mM de MgCI₂, 5 mM de DTT, 50 pM de peptídeo, 0,5 pM de [³H]FPP e 100 pg de extrato de proteínas solúveis. Uma reação de controle continha os extratos de proteínas solúveis que foram fervidos durante 5 minutos para desnaturar de forma irreversível toda a proteína. As reações foram terminadas através da adição de EDTA até uma concentração final de 20 50 mM e então salpicadas em placas (Millipore) para cromatografia de ca-

mada fina (TLC) com Sílica-gel 60. As placas para TLC foram desenvolvidas com n-propanol e água (7:3 v/v) durante 4-5 horas. As placas foram secas, borrifadas com En³Hance (New England Nuclear) e expostas a um filme Kodak X-OMAT AR a -70°C durante 4 dias.

Exemplo 5: Constructos gênicos da ERA-1-p-glucuronidase e plantas transgênicas

Os constructos de fusão da ERA1-p-glucuronidase (ERA1-GUS) foram produzidos através da inserção de um fragmento genômico de EcoR IH/nd III de 5 Kb do promotor ERA1 em um plasmídeo de T-DNA com GUS 30 sem promotor pBI121 contendo um gene que confere resistência ao antibiótico ampicilina. Este constructo foi então transformado na cepa de Agrobacterium LB4404. A Agrobacterium foi cultivada até uma densidade de 0,8 uni-

dade de D.O. (medido a 595 nm). As células foram então bastante lavadas em água, ressuspensas em 10% de glicerol esterilizado e o plasmídeo de DNA purificado codificando o constructo de fusão ERA1-GUS foi adicionado. Finalmente, a mistura de células e DNA foi submetida a um pulso em um 5 eletroporador a 200 Ohms 25 qF, 2,5 kvolts. As células foram então plaqueadas em placas de Luria Broth com ágar contendo 100 qg/mL de ampicilina e cultivadas durante 2 dias a 28°C. Os transformantes resistentes à ampicilina foram cultivados e o plasmídeo de DNA isolado das culturas através de

técnica-padrão foi utilizado nos experimentos de transformação de plantas 10 subsequentes.

As plantas transgênicas foram produzidas através da infiltração a vácuo das plantas com uma cultura de Agrobacterium saturada cultivada até uma densidade de 0,8 unidade de D.O. como medido a 595 nm. As plantas do tipo selvagem foram cultivadas sob condições padronizadas de labo15 ratório (a 25°C, 150 qE m’² seg’¹, umidade, luz constante) até produzirem seus primeiros brotos em aproximadamente 5 semanas. Depois, os caules das plantas foram removidos e as plantas foram submersas em uma soluções de Agrobacterium e colocadas sob um vácuo de 20 mBar durante 5 minutos. Após o vácuo ter sido interrompido, as plantas foram transferidas

para o solo e foi permitido que se recuperassem sob condições padronizadas de laboratório como descrito anteriormente. Após dois meses, as plantas produziram novas flores e a semente que foi coletada e permitida secar durante 2 semanas. A semente de plantas individuais foi plantada em placas de meio mínimo de Murashige e Skoog (MS) contendo 50 qg/mL de canami25 cina. As plantículas verdes resistentes à canamicina foram identificadas e transferidas para o solo após 2 semanas e foi permitido que crescessem para gerarem sementes. Estas sementes foram germinadas e as planta novas foram testadas em relação à atividade de GUS utilizando o substrato fluorescente de GUS Imagene Green (Molecular Probes, Eugene, Oregon). A 30 atividade de GUS foi analisada através da suspensão das plantas novas em tampão de GUS (50 mM de fosfato de sódio, pH 7,0, 10 mM de EDTA, 0,1% de Triton X-100, 0,1% de sarcosil sódio, 4 mM de Imagene Green) durante

2-4 horas na escuridão à temperatura ambiente. As plantas novas foram observadas sob um microscópio com aumento de 25X utilizando luz azul para gerar um sinal fluorescente positivo. Quando esta mistura é tratada com luz azul, a atividade de GUS produzirá uma luz amarela em um fundo autofluo5 rescência vermelha gerada pela clorofila vermelha.

Exemplo 6: Experimentos com Seca

Seis plantas novas do tipo selvagem e seis era1-2 foram cultivadas durante quatro semanas em luz constante com rega constante (25°C,

150 μΕ m’² seg'¹, 70% de umidade, luz constante). A planta e o vaso foram

pesados e os vasos foram então cobertos com folha de alumínio para retardar a evaporação do solo. Neste momento, as plantas não eram mais regadas e cada vaso era pesado diariamente. No final do experimento as plantas foram removidas dos vasos, que foram permitidos secar durante mais duas semanas, quando foram pesados para determinar o peso do solo seco e do ' 15 vaso. Este peso foi subtraído de cada amostra.

Exemplo 7: Alterações relacionadas com a idade em folhas soltas

O teor de clorofila em folhas de rosetas adultas em Columbia do tipo selvagem e em mutantes era1-2 foi comparado após a retirada das plantas. As plantas foram cultivadas sob luz e temperatura constantes (150 μΕ/m seg, 22°C) até uma idade de desenvolvimento similar de 3 semanas

após a germinação. Neste momento, a quinta folha de várias plantas que emergiram após a germinação foi removida e colocada em placas de petri contendo 0,8% ágar com sais mínimos. As placas foram seladas e coloca2 das a 22°C sob luz constante (50 μΕ/m seg) durante 12 dias. Foram tiradas fotografias e foram feitas comparações nos dias 0, 3, 6, 9 e 12.

Exemplo 8: Determinação dos níveis de transcrição para genes selecionados em folhas em envelhecimento.

As plantas mutantes (era1-2) e do tipo selvagem foram cultiva2 das sob luz e temperatura constantes (150 μΕ/m seg, 22°C) até uma idade 30 de desenvolvimento similar de 4 semanas após a germinação. Naquele momento, a quinta folha da roseta que emergiu após a germinação foi removida de todas as plantas. Estas folhas foram analisadas em relação aos níveis de

expressão de três genes: proteína de ligação à clorofila de Arabidopsis (CAB) e os genes ativados pela senescência 12 e 13 (SAG12 e SAG13). Os níveis dos produtos da transcrição do mRNA foram analisados através da análise de Northern blot nos dias 0, 4, 8 após as plantas bolted. O gene

CAB codifica a proteína de ligação à clorofila de Arabidopsis que está envol-

vida na captura da luz para a fotossíntese. Esta é necessária para a coloração verde da folha e é um bom marcador para a circulação da clorofila na planta. A CAB nas plantas do tipo selvagem exibe uma redução no nível de transcrição após a indução da senescência. Nenhuma redução no nível de 10 transcrição foi observada nas folhas em envelhecimento de mutantes era1-2.

O SAG12 e o SAG13 são genes de Arabidopsis clonados através da expressão diferencial durante a senescência (SAG significa gene ativado pela senescência (senescence activated gene)). A transcrição de ambos os genes é induzida durante o início da senescência nas plantas de Arabidopsis do tipo ‘ 15 selvagem. Estes genes não eram induzidos sob as mesmas condições de desenvolvimento nos mutantes era1-2.

Exemplo 9: Clonagem de FTA de Arabidopsis thaliana e Constructo do

Vetor para Transformação

A seqüência de FTA de Arabidopsis thaliana foi obtida através da RT-PCR partindo do RNA total isolado do tecido foliar utilizando os iniciadores que correspondem à SEQ ID N²: 17 e à SEQ ID N²: 18. O fragmento resultante foi digerido com BamHl e Smal e clonado no plasmídeo pCR2.1. O vetor da Clonetech pBI121 foi utilizado como a estrutura básica para o constructo anti-sentido. O gene GUS foi removido através da digestão com 25 BamHl e EcolCRI e substituído pelo inserto de FTA que foi cortado do pCR2.1-FTA utilizando Smal e BamHl e ligado no vetor da SEQ ID N²:10.

Tabela 1.

SEQ ID N²:17: 5'- AAAGGATCCTCAAATTGCTGCCACTGTAAT -3'

SEQ ID N²:18: 5’- AAACCCGGGATGAATTTCGACGAGAACGTG -3’

Exemplo 10: Clonagem das sequências de ácido nucléico de FTA e de FTB sem ser de comprimento completo de Brassica napus

O RNA foi isolado do tecido foliar e radicular utilizando o kit Qia-

	- - =- - - % L ζ -ú = - . F-.., ,TU-._T7,^~».-.^·.·^ ^¾. -aw ^--¾ -Ar^g~w» ~ * 2 «2 gen RNeasy. A RT-PCR foi realizada através de técnicas conhecidas utilizando os iniciadores exibidos na Tabela 2. A seqüência de FTA sequence foi obtida utilizando o par de iniciadores da SEQ ID N2:25 e SEQ ID Na:26. A seqüência de FTB foi obtida utilizando o par de iniciadores da SEQ ID Na:27
5	e SEQ ID Ns:28. Tabela 2. SEQ ID Na:25: 5’-GGATCCATGGATTACTTCCGTGCGATTTACTTCTCC-3' SEQ ID Na:26: 5'-AAAAAGCTTCCATGCCCAATAGTTAGCTCTTATTGGATC-3'
10 =. -W	SEQ ID N°:27: 5'-AAAAAGCTTTGGCTTTGTTACTGGATTCTTCATTCAAT3’ SEQ ID Na:28: 5'-AAATCTAGAAGCTTCATAATACCGATCCAAGACAATGTT-3' Os produtos da PCR foram separados da mistura de reação de
‘ 15	RT-PCR utilizando o kit de centrifugação de coluna Qiagen PCR e ligados no
♦ A*	vetor de clonagem pBluescript KS +. O vetor foi digerido com EcoRV e tratado com a Taq polimerase na presença de dTTP para produzir uma ponta coesiva a 3' para a ligação com os produtos da PCR. Os produtos da ligação foram transformados em células DH5a de E. coli, as colônias positivas foram
20	selecionadas e os insertos resultantes foram seqüenciados.
Λ	Exemplo 11: Clonagem das sequências de ácido nucléico de FTA e de FTB sem ser de comprimento completo provenientes de Glycine max e Zea maize O RNA foi isolado do tecido foliar e radicular utilizando o kit Qia-
25	gen RNeasy. A RT-PCR foi realizada através de técnicas conhecidas utilizando os iniciadores exibidos na Tabela 3. A seqüência de FTA de Glycine max foi obtida utilizando o par de iniciadores da SEQ ID Na:29 e SEQ ID Na:30. A seqüência de FTB de Glycine max foi obtida utilizando o par de iniciadores da SEQ ID Na:31 e SEQ ID Na:32. A seqüência de FTB de milho
30	Zea foi obtida utilizando o par de iniciadores da SEQ ID Na:33 e SEQ ID Na:34

Tabela 3.

SEQ ID N^e:29: 5’-AAAGGATCCATGGAATCTGGGTCTAGCGA-3'

SEQ ID N²:30: S-AAATCTAGAAGGAAGTCTGCTCTTGCGC-a'

SEQ ID N^s:31: 5'-AAATCTAGAGCCACCATTCCTCGCAACG-3'

SEQ ID N^e:32: 5'-AAAGAGCTCGTGGTGGAGAATCTGGGTGC-3'

SEQ ID N²:33: 5'-GGCGGATCCCGACCTACCGAGG-3'

SEQ ID N²:34: 5'-AAAGAGCTCGTGGATGGATTGGCTCCAGC-3'

Os produtos da PCR foram separados da mistura de reação da RT-PCR utilizando o kit de centrifugação de coluna Qiagen PCR e ligados no 10 vetor de clonagem pBluescript KS +. O vetor foi digerido com EcoRV e tratado com Taq polimerase na presença de dTTP para produzir uma ponta coesiva 3' para a ligação com os produtos da PCR. Os produtos da ligação foram transformados em células DH5a de E. coli, as colônias positivas foram selecionadas e os insertos resultantes seqüenciados.

* 15 Exemplo 12: Análise das Seqüências FTA de Arabidopsis thaliana «

Um ácido nucléico descrito de 999 nucleotídeos (também referi. do como FT1) é mostrado na Tabela 4A. Os iniciadores utilizados na PCR

estão representados em negrito._____________________________________

Tabela 4A. Seqüência de Nucleotídeos da FT1 (SEQ ID N²:7). Aaacccgggatgaatttcgacgagaccgtgccactgagccaacgattggagtggtcagacgtggtcccattgactcaggacgatggtccgaatccagtggtgccaattgcctacaaggaagagttccgcgagactatggattacttccgtgcgatttacttttccgacgagcgatctcctcgcgcactacgactcacggaagaaaccctcctcttaaactccggcaactacacagtgtggcatttcaggcgcctagtactcgaggcccttaatcacgacttgtttgaagaactcgagttcatcgaacgcattgctgaggataactctaagaactaccaactgtggcatcatcggcgatgggttgcagagaaactgggtcctgatgttgcagggagagaacttgaatttacccgtagagtactttcacttgatgccaaacattatcatgcttggtcacataggcagtggacactacgggcattaggaggatgggaagatgagctcgattactgtcacgagctccttgaagctgacgtctttaacaattccgcctggaatcagaggtattatgtcatcacccaatctcctttgttgggaggcctagaagccatgagagaatctgaagtaagctacacaatcaaagccattttaaccaatcctgcaaacgagagctcatggcgatacctaaaagcgctttacaaaga-

cgacaaagaatcctggattagtgatccaagtgtttcctcagtctgtttgaatgttctatcccgcacagattgcttccatggattcgctctgagcacccttttggatcttctatgtgatggactgagaccaaccaacgagcataaagactcagtgagagctctagctaatgaagaaccagagactaacttggccaatttggtgtgtactattcttggtcgtgtagatcctataagagctaactattgggcatggaggaagagcaagattacagtggcagcaatttgaggatccttt

Um polipeptídeo de FT1 descrito (SEQ ID N-:11) codificado pela

SEQ ID N°:7 possui 326 resíduos de aminoácidos e é apresentado na Tabela 4Β utilizando o código de aminoácido de uma única letra._________________

Tabela 4B. Seqüência da proteína FT1 codificada (SEQ ID N^g:11).

MNFDETVPLSQRLEWSDWPLTQDDGPNPWPIAYKEEFRETMDYFRAIYFSDERSPRALRLTEETLLLNSGNYTVWHFRRLVLEALNHDLFEELEFIERIAEDNSKNYQLWHHRRWVAEKLGPDVAGRELEFTRRVLSLDAKHYHAWSHRQWTLRALGGWEDELDYCHELLEADVFNNSAWNQRYYVITQSPLLGGLEAMRESEVSYTIKAILTNPANESSWRYLKALYKDDKESWISDPSVSSVCLNVLSRTDCFHGFALSTLLDLLCDGLRPTNEHKDSVRALANEEPETNLANLVCTILGRVDPIRANYWAWRKSKITVAAI

Devido à natureza da estratégia de clonagem, a seqüência apre5 sentada não contém qualquer seqüência não traduzida 5' ou 3'. Utilizando as seqüências descritas aqui como sondas de hibridização, é possível selecionar e isolar seqüências de comprimento completo de bibliotecas de cDNA ou genômicas ou utilizar a tecnologia de amplificação rápida das extremidades do cDNA (RACE) ou outras tais técnicas da PCR. A porcentagem de identi10 dade da seqüência de nucleotídeos de Arabidopsis thaliana e sua seqüência de aminoácidos codificada em relação às das seqüências publicadas é mostrada na Figura 17.

A presente invenção inclui ainda uma complementaridade de seqüências de ácido nucléico com a subunidade alfa da farnesil transferase 15 de Arabidopsis thaliana da SEQ ID N²: 7. A seqüência complementar descrita é mostrada na forma da SEQ ID N²: 8. A seqüência de ácido nucléico da

SEQ ID N²: 9 mostra a seqüência de ácido nucléico da SEQ ID N²: 8 que foi preparada para a ligação em um vetor de expressão.

SEQ ID N²: 8

aaaggatcctcaaattgctgccactgtaatcttgctcttcctccatgcccaatagttagctcttataggatctacacgaccaagaatagtacacaccaaattggccaagttagtctctggttcttcattagctagagctctcactgagtctttatgctcgttggttggtctcagtccatcacatagaagatccaaaagggtgctcagagcgaatccatggaagcaatctgtgcgggatagaacattcaaacagactgaggaaacacttggatcactaatccaggattctttgtcgtctttgtaaagcgcttttaggtatcgccatgagctctcgtttgcaggattggttaaaatggctttgattgtgtagcttacttcagattctctcatggcttctaggcctcccaacaaaggagattgggtgatgacataatacctctgattccaggcggaattgttaaagacgtcagcttcaaggagctcgtgacagtaatcgagctcatcttcccatcctcctaatgcccgtagtgtccactgcctatgtgaccaagcatgataatgtttggcatcaagtgaaagtactctacgggtaaattcaagttctctccctgcaacatcaggacccagtttctctgcaacccatcgc15 cgatgatgccacagttggtagttcttagagttatcctcagcaatgcgttcgatgaactcgagttcttcaaacaagtcgtgattaagggcctcgagtactaggcgcctgaaatgccacactgtgtagttgccggagtttaagaggagggtttcttccgtgagtcgtagtgcgcgaggagatcgctcgtcggaaaagtaaatcgcacggaagtaatccatagtctcgcggaactcttccttgtaggcaattggcaccactggattcggaccatcgtcctgagtcaatgggaccacgtc20 tgaccactccaatcgttggctcagtggcacggtctcgtcgaaattcatcccgggttt

SEQ ID N²: 9 gatcctcaaattgctgccactgtaatcttgctcttcctccatgcccaatagttagctcttataggatctacacgaccaagaatagtacacaccaaattggccaagttagtctctggttcttcattagctagagctctcactgagtctttatgctcgttggttggtctcagtccatcaca25 tagaagatccaaaagggtgctcagagcgaatccatggaagcaatctgtgcgggatagaacattcaaacagactgaggaaacacttggatcactaatccaggattctttgtcgtctttgtaaagcgcttttaggtatcgccatgagctctcgtttgcaggattggttaaaatggctttgattgtgtagcttacttcagattctctcatggcttctaggcctcccaacaaaggagattgggtgatgacataatacctctgattccaggcggaattgttaaagacgtcagcttcaa30 ggagctcgtgacagtaatcgagctcatcttcccatcctcctaatgcccgtagtgtccactgcctatgtgaccaagcatgataatgtttggcatcaagtgaaagtactctacgggtaaattcaagttctctccctgcaacatcaggacccagtttctctgcaacccatcgc-

cgatgatgccacagttggtagttcttagagttatcctcagcaatgcgttcgatgaactcgagttcttcaaacaagtcgtgattaagggcctcgagtactaggcgcctgaaatgccacactgtgtagttgccggagtttaagaggagggtttcttccgtgagtcgtagtgcgcgaggagatcgctcgtcggaaaagtaaatcgcacggaagtaatccatagtctcgcggaactcttccttgtaggcaattggcaccactggattcggaccatcgtcctgagtcaatgggaccacgtctgaccactccaatcgttggctcagtggcacggtctcgtcgaaattcatccc

FTA de Brassica napus

Um ácido nucléico descrito de 822 nucleotídeos (também referido como FT2) é mostrado na Tabela 5A. ____________________________

Tabela 5A. Seqüência de Nucleotídeos da FT2 (SEQ ID N²: 12). ATGGATTACTTCCGTGCGATTTACTTCTCCGACGAGCGTTCTGCTCGCGCGCTGCGACTCACGGAAGAAGCTCTCCGCTTAAACTCGGGCAACTACACCGTGTGGCACTTCGGGCGCTTAGTACTCGAGGAGCTTAATAACGACTTGTATGAAGAGCTCAAGTTCATCGAAAGCATTGCTGAGGATAACTCTAAGAACTACCAGTTGTGGCATCATCGACGATGGGTCGCAGAGAAACTGGGTCCTGATGTTGCAGGAAAGGAACTTGAGTTTACTCGGAGGGTACTATCACTTGATGCCAAGCATTATCATGCTTGGTCACATAGGCAGTGGGCGCTACAAGCATTAGGAGGATGGGAAAATGAGCTTAACTACTGCCACGAGCTCCTTGAAGCTGACGTCTTTAACAACTCTGCATGGAATCAGAGGTATTACGTTATAACTAGATCACCTTCGTTGGGAGGCCTAGAAGCCATGAGAGAATCTGAAGTAAGCTACACAGTCAAAGCCATTTTAGCAAATCCCGGGAACGAGAGCTCTTGGAGGTACCTGAAAGCCCTTTACAAAGACGACACAGAGTCTTGGATTAGTGATCCAAGTGTTTCCTCAGTCTGTTTGAAAGTTCTCTCACGCGCGGACTGCTTCCATGGATTCGCTCTGAGCACCCTTTTGGATCTTCTGTGCGATGGGTTGAGACCAACCAACGAGCATAGAGACTCGGTGAAAGCTCTAGCTAATGAAGAACCAGAGACTAACTTGGCCAATTTGGTGTGTACCATTCTGTGTCGTGTTGATCCAATAAGAGCTAACTATTGGGCATGG

Um polipeptídeo de FT2 descrito (SEQ ID N²: 13) codificado pela

SEQ ID N²: 12 possui 274 resíduos de aminoácidos e é apresentado na Ta-

bela 5B utilizando o código de aminoácido de uma única letra.

Tabela 5B. Seqüência de proteína de FT2 codificada (SEQ ID N^e: 13).

MDYFRAIYFSDERSARALRLTEEALRLNSGNYTVWHFGRLVLEELNNDLYEELKFIESIAEDNSKNYQLWHHRRWVAEKLGPDVAGLEKEFTRRVLSLDAKHYHAWSHRQWALQALGGWENELNYCHELLEADVFNNSAWNQRYYVITRSPSLGGLEAMRESEVSYTVKAILANPGNESSWRYLKALYKDDTESWISDPSVSSVCLKVLSRADCFHGFALSTLLDLLCDGLRPTNEHRDSVKALANEEPETNLANLVCTILCRVDPIRANYWAWKL

Devido à natureza da estratégia de clonagem, a seqüência apresentada não possui comprimento completo. Comparada com a seqüência de Arabidopsis thaliana há 42 aminoácidos faltando partindo do terminal amino 5 e 10 aminoácidos partindo do terminal carbóxi. A porcentagem de identidade da seqüência de nucleotídeos de Brassica napus e de sua seqüência de aminoácidos codificada em relação às seqüências publicadas é mostrada na Figura 17.

Utilizando as seqüências descritas aqui como sondas de hibridi10 zação, é possível selecionar e isolar seqüências de comprimento completo partindo de bibliotecas de cDNA ou genômicas ou utilizar a tecnologia de

rápida amplificação das extremidades do cDNA (RACE) ou outras tais técnicas da PCR.

A presente invenção inclui ainda uma seqüência de ácido nucléi15 co complementar à subunidade alfa da farnesil transferase de Brassica napus da SEQ ID N^s: 12. A seqüência complementar descrita é mostrada na forma da SEQ ID N²: 35.

SEQ ID NO:35

CCATGCCCAATAGTTAGCTCTTATTGGATCAACACGACACAGAA20 TGGTACACACCAAATTGGCCAAGTTAGTCTCTGGTTCTTCATTAGCTAGAGCTTTCACCGAGTCTCTATGCTCGTTGGTTGGTCTCAACCCATCGCACAGAAGATCCAAAAGGGTGCTCAGAGCGAATCCATGGAAGCAGTCCGCGCGTGAGAGAACTTTCAAACAGACTGAGGAAACACTTGGA-

TCCAAGAGCTCTCGTTCCCGGGATTTGCTAAAATGGCTTTGACTGTGTAGCTTACTTCAGATTCTCTCATGGCTTCTAGGCCTCCCAACGAAGGTGATCTAGTTATAACGTAATACCTCTGATTCCATGCAGA5 GTTGTTAAAGACGTCAGCTTCAAGGAGCTCGTGGCAGTAGTTAAGCTCATTTTCCCATCCTCCTAATGCTTGTAGCGCCCACTGCCTATGTGACCAAGCATGATAATGCTTGGCATCAAGTGATAGTACCCTCCGAGTAAACTCAAGTTCCTTTCCTGCAACATCAGGACCCAGTTTCTCTGCGACCCATCGTCGATGATGCCACAACTGGTAGTTCTTAGAGTTATCCTCAGCAA10 TGCTTTCGATGAACTTGAGCTCTTCATACAAGTCGTTATTAAGCTCCM . TCGAGTACTAAGCGCCCGAAGTGCCACACGGTGTAGTTGCCCGAGTTTAAGCGGAGAGCTTCTTCCGTGAGTCGCAGCGCGCGAGCAGAACGCTCGTCGGAGAAGTAAATCGCACGGAAGTAATCCAT

FTB de Brassica napus

- 15 Um ácido nucléico descrito de 1110 nucleotídeos (também referidocomo FT3) é mostrado na Tabela 6A.________________________________

Tabela 6A. Seqüência de Nucleotídeos da FT3 (SEQ ID N^g: 14). TGGCTTTGTTACTGGATTCTTCATTCAATTGCTTTGCTTGGGGAGTCTGTGGATGATGACTTAGAAAACAATGCAATCGATTTTCTTGGACGTTGCCAGGGTTCTGATGGTGGATATGGTGGTGGTCCTGGCCAACTTCCACATCTTGCAACAAGTTATGCTGCAGTGAATACACTTGTTACTTTAGGAGGTGAGAAAGCCTTCTCTTCAATTAACAGAGAACAAATGGCTTGTTTCTTAAGACGAATGAAGGATACAAATGGAGGTTTCAGGATGCATAATATGGGAGAAATAGATGTGCGAGCGTGCTACACTGCGATTTTGATTGCAAGCATCCTGAACATTGTGGATGATGAACTCACCCGCGGCTTAGGAGATTACATTTTGAGTTGCCAAACTTATGAAGGTGGCATTGGAGGGGAACCTGGCTCCGAAGCTCATGGTGGGTACACGTACTGTGGGTTGGCTACTATGATTTTAATCAATGAAGTCGACCGCTTGAATTTGGATTCGTTAATGAATTGGGTTGTACATCGACAAGGAGTAGAAATGGGATTCCAAGGTAGGACGAACAAATTGGTCGACGGTTGCTACACGTTTTGGCAGGCAGCCCCCTGTGTTCTACTACAGCGATTTTTTTCATCCCAGGATATGGCACC-

TCATGGATCATCATCACATATGTCACAAGGGACAGATGAAGATCACGAGGAACATGGTCATGATGAAGATGATCCTGAAGACAGTGATGAAGATGATTCTGATGAGGATAGCGATGAAGATTCAGGGAATGGTCACCAAGTTCATCATACGTCTACCTACATTGACAGGAGAATTCAACCTGTTTTTGATAGCCTCGGCTTGCAAAGATATGTGCTCTTGTGCTCTCAGGTTGCTGATGGTGGATTCAGAGACAAGCTGAGGAAACCCCGTGACTTCTACCACACATGTTACTGCCTAAGCGGTCTTTCCGTGGCTCAACACGCTTGGTCAAAAGACGAGGACACTCCTCCTTTGACTCGTGACATTTTGGGTGGCTACGCAAACCACCTTGAACCTGTTCACCTCCTCCACAACATTGTCTTGGATCGGTATTATGAAGCTTCTAGATTT

Um polipeptídeo de FT3 descrito (SEQ ID N°: 15) codificado pela SEQ ID N^e: 13 possui 370 resíduos de aminoácidos e é apresentado na Tabela 6B utilizando o código de aminoácidos de uma única letra._____________

Tabela 6B. Seqüência da proteína FT3 codificada (SEQ ID N^s: 15). WLCYWILHSIALLGESVDDDLENNAIDFLGRCQGSDGGYGGGPGQLPHLATSYAAVNTLVTLGGEKAFSSINREQMACFLRRMKDTNGGFRMHNMGEIDVRACYTAILIASILNIVDDELTRGLGDYILSCQTYEGGIGGEPGSEAHGGYTYCGLATMILINEVDRLNLDSLMNWWHRQGVEMGFQGRTNKLVDGCYTFWQAAPCVLLQRFFSSQDMAPHGSSSHMSQGTDEDHEEHGHDEDDPEDSDEDDSDEDSDEDSGNGHQVHHTSTYIDRRIQPVFDSLGLQRYVLLCSQVADGGFRDKLRKPRDFYHTCYCLSGLSVAQHAWSKDEDTPPLTRDILGGYANHLEPVHLLHNILVDRYYEASRF

Devido à natureza da estratégia de clonagem, a seqüência apre5 sentada não possui comprimento completo. Comparada com a seqüência de Arabidopsis thaliana há 31 aminoácidos faltando partindo do terminal amino e 5 aminoácido partindo do terminal carbóxi. A porcentagem de identidade da seqüência de nucleotídeos de Brassica napus e sua seqüência de aminoácidos codificada em relação às de seqüências publicadas é exibida na

Figura 18.

Utilizando as seqüências descritas aqui na forma de sondas de hibridização, é possível selecionar e isolar seqüências de comprimento completo provenientes de bibliotecas de cDNA ou genômicas ou utilizar a tecno5 logia da amplificação rápida das extremidades do cDNA (RACE) ou outras tais técnicas da PCR. As comparações de seqüências foram realizadas e as identidades percentuais são exibidas na Figura 17 e na Figura 18.

A presente invenção inclui ainda uma seqüência de ácido nucléi-

co complementar â subunidade beta da farnesil transferase de Brassica na10 pus da SEQ ID N²: 14. A seqüência complementar descrita é exibida na forma da SEQ ID N²: 36.

SEQ ID N²: 36 AAATCTAGAAGCTTCATAATACCGATCCAAGACAATGTTGTGGAGGAGGTGAACAGGTTCAAGGTGGTTTGCGTAGCCACCCAAAATGTCACGA- 15 GTCAAAGGAGGAGTGTCCTCGTCTTTTGACCAAGCGTGTTGAGCCACGGAAAGACCGCTTAGGCAGTAACATGTGTGGTAGAAGTCACGGGGTTTCCTCAGCTTGTCTCTGAATCCACCATCAGCAACCTGAGAGCACAAGAGCACATATCTTTGCAAGCCGAGGCTATCAAAAACAGGTTGAATTCTCCTGTCAATGTAGGTAGACGTATGATGAAC20 TTGGTGACCATTCCCTGAATCTTCATCGCTATCCTCATCAGAATCATCTTCATCACTGTCTTCAGGATCATCTTCATCATGACCÁTGTTCCTCGTGATCTTCATCTGTCCCTTGTGACATATGTGATGATGATCCATGAGGTGCCATATCCTGGGATGAAAAAAATCGCTGTAGTAGAACACAGGGGGCTGCCTGCCAAAACGTGTAGCAACCGTCGACCAATTTGTTCGTCCTACC25 TTGGAATCCCATTTCTACTCCTTGTCGATGTACAACCCAATTCATTAACGAATCCAAATTCAAGCGGTCGACTTCATTGATTAAAATCATAGTAGCCAACCCACAGTACGTGTACCCACCATGAGCTTCGGAGCCAGGTTCCCCTCCAATGCCACCTTCATAAGTTTGGCAACTCAAAATGTAATCTCCTAAGCCGCGGGTGAGTTCATCATCCACAATGTTCAGGATGCTTGCAA30 TCAAAATCGCAGTGTAGCACGCTCGCACATCTATTTCTCCCATATTATGCATCCTGAAACCTCCATTTGTATCCTTCATTCGTCTTAAGAAACAAGCCATTTGTTCTCTGTTAATTGAAGAGAAGGCTTTCTCACCTCCTAAA...........

GTAACAAGTGTATTCACTGCAGCATAACTTGTTGCAAGATGTGGAAGTTGGCCAGGACCACCACCATATCCACCATCAGAACCCTGGCAACGTCCAAGAAAATCGATTGCATTGTTTTCTAAGTCATCATCCACAGACTCCCCAAGCAAAGCAATTGAATGAAGAATCCAGTAACAAAGCCA

FTA de Glycine max

Um ácido nucléico descrito de 1041 nucleotídeos (também referido> como FT4) é exibido na Tabela 7A,___________________________________

Tabela 7A. Seqüência de Nucleotídeos de FT4 (SEQ ID N^g: 37). ATGGAATCTGGGTCTAGCGAAGGAGAAGAGGTGCAGCAACGCGTGCCGTTGAGGGAGAGAGTGGAGTGGTCAGATGTTACTCCGGTTCCTCAAAACGACGGCCCTAACCCTGTCGTTCCGATCCAGTACACTGAAGAGTTTTCCGAAGTTATGGATTACTTTCGCGCCGTTTACCTCACCGATGAACGCTCCCCTCGCGCCCTCGCTCTCACAGCCGAAGCCGTTCAATTCAACTCCGGCAACTACACTGTGTGGCATTTCCGACGGTTGTTACTTGAGTCGCTAAAAGTCGACTTGAACGATGAACTGGAGTTTGTGGAGCGTATGGCCGCTGGAAATTCTAAAAATTATCAGATGTGnATGTTCTGTAGGCATCCTAGACGATGGGTTGCCGAGAAGTTAGGTCCTGAAGCTAGAAACAATGAGCTCGAGTTCACCAAAAAGATACTGTCCGTTGATGCCAAACATTATCATGCATGGTCTCATAGACAGTGGGCTCTTCAAACACTAGGAGGATGGGAAGATGAACTTAATTATTGCACAGAACTACTTAAAGAAGACATTTTTAACAATTCTGCTTGGAATCAGAGATATTTTGTCATAACAAGGTCTCCTTTCTTGGGGGGCCTAAAAGCTATGAGAGAGTCTGAAGTGCTTTACACCATCGAAGCCATTATAGCCTACCCTGAAAATGAAAGCTCGTGGAGATATCTACGAGGACTTTATAAAGGTGAAACTACTTCATGGGTAAATGATCCTCAAGTTTCTTCAGTATGCTTAAAGATTTTGAGAACTAAGAGCAACTACGTGTTTGCTCTTAGCACTATTTTAGATCTTATATGCTTTGGTTATCAACCAAATGAAGACATTAGAGATGCCATTGACGCCTTAAAGACCGCAGATATGGATAAACAAGATTTAGATGATGATGAGAAAGGGGAACAACAAAATTTAAATATAGCACGAAATATTTGTTCTATCCTAAAACAAGTTGATCCAATTAGAACCAACTATTGGATTTGGCGCAAGAGCAGACTTCCT

______ yh

Um polipeptídeo de FT4 descrito (SEQ ID N²: 39) codificado pela SEQ ID N²: 37 possui 347 resíduos de aminoácidos e é apresentado na Tabela 7B utilizando o código de aminoácido de uma única letra.________________

Tabela 7B. Seqüência da proteína FT4 codificada (SEQ ID N²: 39).

MESGSSEGEEVQQRVPLRERVEWSDVTPVPQNDGPNPWPIQYTEEFSEVMDYFRAVYLTDERSPRALALTAEAVQFNSGNYTVWHFRRLLLESLKVDLNDELEFVERMAAGNSKNYQMXMFCRHPRRWVAEKLGERVILHARNNELEFTKKILSVDAKHYHAWSHRQWALQTLGGWEDELNYCTELLKEDIFNNSAWNQRYFVITRSPFLGGLKAMRESEVLYTIEAIIAYPENESSWRYLRGLYKGETTSWVNDPQVSSVCLKILRTKSNYVFALSTILDLICFGYQPNEDIRDAIDALKTADMDKQDLDDDEKGEQQNLNIARNICSILKQVDPIRTNYWIWRKSRLP

Devido à natureza da estratégia de clonagem, a seqüência apresentada não possui comprimento completo. A porcentagem de identidade da seqüência de nucleotídeos de Glycine max e sua seqüência de aminoácidos codificada em relação as de outras seqüências é exibida na Figura 17.

Utilizando as seqüências descritas aqui como sondas de hibridização, é possível selecionar e isolar seqüências de comprimento completo partindo de bibliotecas de cDNA ou genômicas ou utilizar a tecnologia de rápida amplificação das extremidades do cDNA (RACE) ou outras tais técnicas da PCR.

A presente invenção inclui ainda uma seqüência de ácido nucléico complementar à subunidade alfa de Glycine max da SEQ ID N²:37. A seqüência complementar descrita é mostrada na forma da SEQ ID N²: 38. SEQ ID N²: 38 AGGAAGTCTGCTCTTGCGCCAAATCCAATAGTTGGTTCTAATTGGATCAACTTGTTTTAGGATAGAACAAATATTTCGTGCTATATTTAAATTTTGTTGTTCCCCTTTCTCATCATCATCTAAATCTTGTTTATCCATATCTGCGGTCTTTAAGGCGTCAATGGCATCTCTAATGTCTTCATTTGGTTGATAACCAAAGCATATAAGATCTAAAATAGTGCTAAGAGCAAACACGTAGTTGCTCTTAGTTCTCAAAATCTTTAAGCATACTGAAJ/' í4«-'SÍ A-t^·^¹³’ _-Ar&Sk -^êíAÍ? »>1

GAAACTTGAGGATCATTTACCCATGAAGTAGTTTCACCTTTATAAAGTCCTCGTAGATATCTCCACGAGCTTTCATTTTCAGGGTAGGCTATAATGGCTTCGATGGTGTAAAGCACTTCAGACTCTCTCATAGCTTTTAGGCCCCCCAAGAAAGGAGACCTTGTTATGACAAAATATCTCTGATTCCAAGCA5 GAATTGTTAAAAATGTCTTCTTTAAGTAGTTCTGTGCAATAATTAAGTTCATCTTCCCATCCTCCTAGTGTTTGAAGAGCGCACTGTCTATGAGACCATGCATGATAATGTTTGGCATCAACGGACAGTATCTTTTTGGTGAACTCGAGCTCATTGTTTCTAGCTTCAGGACCTAACTTCTCGGCAACCCATCGTCTAGGATGCCTACAGAACATNCACATCTGA10 TAATTTTTAGAATTTCCAGCGGCCATACGCTCCACAAACTCCAGTTCAí TCGTTCAAGTCGACTTTTAGCGACTCAAGTAACAACCGTCGGAAATGCCACACAGTGTAGTTGCCGGAGTTGAATTGAACGGCTTCGGCTGTGAGAGCGAGGGCGCGAGGGGAGCGTTCATCGGTGAGGTAAACGGCGCGAAAGTAATCCATAACTTCGGAAAACTCTTCAGTGTACTGGA. 15 TCGGAACGACAGGGTTAGGGCCGTCGTTTTGAGGAACCGGAGTAACATCTGACCACTCCACTCTCTCCCTCAACGGCACGCGTTGCTGCACCTCTTCTCCTTCGCTAGACCCAGATTCCAT

FTB de Glycine max

Um ácido nucléico descrito de 1035 nucleotídeos (também refe20 rido como FT5) é exibido na Tabela 8A.______________________________.

Tabela 8A. Seqüência de Nucleotídeos da FT5 (SEQ ID N^g: 40), GCCACCATTCCTCGCAACGCCCAAACCCTCATGTTGGAGCTTCAACGCGATAATCACATGCAGTATGTCTCCAAAGGCCTTCGCCATCTCAGTTCCGCATTTTCCGTTTTGGACGCTAATCGACCCTGGCTCTGCTACTGGATCTTCCACTCCATTGCTTTGTTGGGAGAATCCGTCGATGATGAACTCGAAGATAACGCTATCGATTTTCTTAACCGTTGCCAGGATCCGAATGGTGGATATGCCGGGGGACCAGGCCAGATGCCTCATATTGCCACAACTTATGCTGCTGTTAATTCACTTATTACTTTGGGTGGTGAGAAATCCCTGGCATCAATTAATAGAGATAAACTGTATGGGTTTCTGCGGCGGATGAAGCAACCAAATGGTGGATTCAGGATGCATGATGAAGGTGAAATTGATGTTCGAGCTTGCTACACTGCCATTTCTGTTGCAAGTGTTTTGAACATTTTGGA-

TGATGAGCTGATCCAGAATGTTGGAGACTACATTATAAGCTGTCAAACATATGAGGGTGGCATTGCTGGTGAGCCTGGTTCTGAGGCTCATGGTGGGTACACCTTTTGTGGATTAGCTACAATGATTCTGATTGGTGAGGTTAATCACTTGGATCTGCCTCGATTAGTTGACTGGGTGGTATTCCGACAAGGTAAGGAATGTGGATTCCAGGGGAGAACAAATAAACTGGTGGATGGATGCTATTCCTTTTGGCAGGGAGGTGCTGTTGCTCTATTGCAAAGATTATCTTCTATTATCAACAAACAGATGGAAGAGACATCACAGATTTTTGCGGTATCTTATGTATCTGAAGCAAAAGAAAGTTTGGATGGAACCTCTAGTCATGCAACATGCCGTGGTGAGCATGAAGGCACCAGTGAATCCAGTTCATCTGATTTTAAAAATATTGCCTATAAATTTATTAATGAGTGGAGAGCACAAGAACCACTTTTTCACAGTATTGCTTTACAGCAATATATTCTCTTATGTGCACAGGAGCAAGAGGGTGGACTGAGAGACAAACCGGGTAAACGTAGAGATCATTATCACACATGTTACTGTTTAAGTGGACTCTCATTGTGCCAGTATAGTTGGTCAAAGCACCCAGATTCTCCACCAC

Um polipeptídeo FT5 descrito (SEQ ID N^s: 42) codificado pela SEQ ID N^a: 40 possui 378 resíduos de aminoácidos e é apresentado na Tabela 8B utilizando o código de aminoácido de uma única letra.

Tabela 8B. Seqüência da proteína FT5 codificada (SEQ ID N°: 42).

ATIPRNAQTLMLELQRDNHMQYVSKGLRHLSSAFSVLDANRPWLCYWIFHSIALLGESVDDELEDNAIDFLNRCQDPNGGYAGGPGQMPHIATTYAAVNSLITLGGEKSLASINRDKLYGFLRRMKQPNGGFRMHDEGE1DVRACYTAISVASVLNILDDELIQNVGDYIISCQTYEGGIAGEPGSEAHGGYTFCGLATMILIGEVNHLDLPRLVDWWFRQGKECGFQGRTNKLVDGCYSFWQGGAVALLQRLSSIINKQMEETSQIFAVSYVSEAKESLDGTSSHATCRGEHEGTSESSSSDFKNIAYKF1NEWRAQEPLFHSIALQQYILLCAQEQEGGLRDKPGKRRDHYHTCYCLSGLSLCQYSWSKHPDSPP

Devido à natureza da estratégia de clonagem, a seqüência apresentada não possui comprimento completo. A porcentagem de identidade da

seqüência de nucleotídeos de Glycine max e de sua seqüência de aminoácidos codificada em relação às de outras seqüências é mostrada na Figura 17. Utilizando as seqüências descritas aqui como sondas de hibridização, é possível selecionar e isolar seqüências de comprimento completo partindo de 5 bibliotecas de cDNA ou genômicas ou utilizar a tecnologia da rápida amplificação das extremidades do cDNA (RACE) ou outras tais técnicas da PCR.

A presente invenção inclui ainda uma seqüência de ácido nucléico complementar à subunidade beta de Glycine max da SEQ ID N^Q: 40. A seqüência complementar descrita é mostrada na forma da SEQ ID N°: 41.

SEQ ID N^Q: 41

GTGGTGGAGAATCTGGGTGCTTTGACCAACTATACTGGCACAATGAGAGTCCACTTAAACAGTAACATGTGTGATAATGATCTCTACGTTTACCCGGTTTGTCTCTCAGTCCACCCTCTTGCTCCTGTGCACATAAGAGAATATATTGCTGTAAAGCAATACTGTGAAAAAGTGGTTCTTGTGCTCTC- 15 CACTCATTAATAAATTTATAGGCAATATTTTTAAAATCAGATGAACTGGATTCACTGGTGCCTTCATGCTCACCACGGCATGTTGCATGACTAGAGGTTCCATCCAAACTTTCTTTTGCTTCAGATACATAAGATACCGCAAAAATCTGTGATGTCTCTTCCATCTGTTTGTTGATAATAGAAGATAATCTTTGCAATAGAGCAACAGCACCTCCCTGCCAAAAGGAATAGCA20 TCCATCCACCAGTTTATTTGTTCTCCCCTG G AATCCACATTCCTTACCTTGTCGGAATACCACCCAGTCAACTAATCGAGGCAGATCCAAGTGATTAACCTCACCAATCAGAATCATTGTAGCTAATCCACAAAAGGTGTACCCACCATGAGCCTCAGAACCAGGCTCACCAGCAATGCCACCCTCATATGTTTGACAGCTTATAATGTAGTCTCCAACATTCTGGATCA25 GCTCATCATCCAAAATGTTCAAAACACTTGCAACAGAAATGGCAGTGTAGCAAGCTCGAACATCAATTTCACCTTCATCATGCATCCTGAATCCACCATTTGGTTGCTTCATCCGCCGCAGAAACCCATACAGTTTATCTCTATTAATTGATGCCAGGGATTTCTCACCACCCAAAGTAATAAGTGAATTAACAGCAGCATAAGTTGTGGCAATATGAGGCATCTGGCC30 TGGTCCCCCGGCATATCCACCATTCGGATCCTGGCAACGGTTAAGAAAATCGATAGCGTTATCTTCGAGTTCATCATCGACGGATTCTCCCAACAAAGCAATGGAGTGGAAGATCCAGTAGCAGAGCCA-

GGGTCGATTAGCGTCCAAAACGGAAAATGCGGAACTGAGATGGCGAAGGCCTTTGGAGACATACTGCATGTGATTATCGCGTTGAAGCTCCAACATGAGGGTTTGGGCGTTGCGAGGAATGGTGGC

FTB de milho Zea

Um ácido nucléico descrito de 1235 nucleotídeos (também referidoi como FT6) é mostrado na Tabela 9A._________________________________

Tabela 9A. Seqüência de Nucleotídeos da FT6 (SEQ ID N°: 43). GGCGGATCCCGACCTACCGAGGCTCACGGTGACGCAGGTGGAGCAGATGAAGGTGGAGGCCAGGGTTGGCGACATCTACCGCTCCCTCTTCGGGGCCGCGCCCAACACGAAATCCATCATGCTAGAGCTGTGGCGTGATCAGCATATCGAGTATCTGACGCCTGGGCTGAGGCATATGGGACCAGCCTTTCATGTTCTAGATGCCAATCGCCCTTGGCTATGCTACTGGATGGTTCATCCACTTGCTTTGCTGGATGAAGCACTTGATGATGATCTTGAGAATGATATCATAGACTTCTTAGCTCGATGTCAGGATAAAGATGGTGGATATAGTGGTGGACCTGGACAGTTGCCTCACCTAGCTACGACTTATGCTGCTGTAAATACACTTGTGACAATAGGGAGCGAAAGAGCATTGTCATCAATCAATAGGGGCAACCTGTACAATTTTATGCTGCAGATGAAAGATGTATCAGGTGCTTTCAGAATGCATGATGGTGGCGAAATTGATGTCCGTGCTTCCTACACCGCTATATCGGTTGCCAGCCTTGTGAATATTCTTGATTTTAAACTGGCAAAAGGTGTAGGCGACTACATAGCAAGATGTCAAACTTATGAAGGTGGTATTGCTGGGGAGCCTTATGCTGAAGCACATGGTGGGTATACATTCTGTGGATTGGCTGCTTTGATCCTGCTTAATGAGGCAGAGAAAGTTGACTTGCCTAGTTTGATTGGCTGGGTGGCTTTTCGTCAAGGAGTGGAATGCGGATTTCAAGGACGAACTAATAAATTGGTTGATGGTTGCTACTCCTTTTGGCAGGGAGCTGCCATTGCTTTCACACAAAAGTTAATTACGATTGTTGATAAGCAATTGAGGTCCTCGTATTCCTGCAAAAGGCCATCAGGAGAGGATGCCTGCAGCACCAGTTCATATGGGTGCACCGCGAATAAGTCTTCCTCTGCTGTGGACTATGCGAAGTTTGGATTTGATTTTATACAACAGAGCAACCAAATTGGCCCACTCTTCCATAACATTGCCCTGCAACAATACATCCTACTTTGTTCTCAGGTACTAGAGGGAGGCTTGAGGGAi

554 ______-t

TAAGCCTGGAAAGAACAGAGATCACTATCATTCATGCTACTGCCTCAGTGGCCTCGCAGTTAGCCAGTACAGTGCCATGACTGATACTGGTTCGTGCCCATTACCTCAGCATGTGCTTGGACCGTACTCTAATTTGCTGGAGCCAATCCATCC

Um polipeptídeo de FT6 descrito (SEQ ID N⁹: 45) codificado pela SEQ ID N^e: 43 possui 414 resíduos de aminoácidos e é apresentado na Tabela 9B utilizando o código de aminoácido de uma única letra.________________

Tabela 9B. Seqüência de proteína de FT6 codificada (SEQ ID N⁹: 45).

ADPDLPRLTVTQVEQMKVEARVGDIYRSLFGAAPNTKSIMLELWRDQHIEYLTPGLRHMGPAFHVLDANRPWLCYWMVHPLALLDEALDDDLENDIIDFLARCQDKDGGYSGGPGQLPHLATTYAAVNTLVTIGSERALSSINRGNLYNFMLQMKDVSGAFRMHDGGEIDVRASYTAISVASLVNILDFKLAKGVGDYIARCQTYEGGIAGEPYAEAHGGYTFCGLAALILLNEAEKVDLPSLIGWVAFRQGVECGFQGRTNKLVDGCYSFWQGAAIAFTQKLITIVDKQLRSSYSCKRPSGEDACSTSSYGCTANKSSSAVDYAKFGFDFIQQSNQIGPLFHNIALQQYILLCSQVLEGGLRDKPGKNRDHYHSCYCLSGLAVSQYSAMTDTGSCPLPQHVLGPYSNLLEPIH

Devido à natureza da estratégia de clonagem, a seqüência apre5 sentada não possui comprimento completo. A porcentagem de identidade da

seqüência de nucleotídeos de Glycine max e sua seqüência de aminoácidos codificada em relação às de outras seqüências é mostrada na Figura 17. Utilizando as seqüências descritas aqui como sondas de hibridização, é possível selecionar e isolar seqüências de comprimento completo partindo de bibliotecas de cDNA ou genômicas ou utilizar a tecnologia de rápida amplificação das extremidades do cDNA (RACE) ou outras tais técnicas da PCR.

A presente invenção inclui ainda uma seqüência de ácido nucléico complementar à subunidade beta de Zea maize da SEQ ID N⁹: 43. A seqüência complementar descrita é mostra na forma da SEQ ID N⁹: 44.

SEQ ID NO:44

GGATGGATTGGCTCCAGCAAATTAGAGTACGGTCCAAGCACATGCTGAGGTAATGGGCACGAACCAGTATCAGTCATGGCACTGTACTGGC-

TGTTCTTTCCAGGCTTATCCCTCAAGCCTCCCTCTAGTACCTGAGAACAAAGTAGGATGTATTGTTGCAGGGCAATGTTATGGAAGAGTGGGCCAATTTGGTTGCTCTGTTGTATAAAATCAAATCCAAACTTCGCATAGTC5 CACAGCAGAGGAAGACTTATTCGCGGTGCACCCATATGAACTGGTGCTGCAGGCATCCTCTCCTGATGGCCTTTTGCAGGAATACGAGGACCTCAATTGCTTATCAACAATCGTAATTAACTTTTGTGTGAAAGCAATGGCAGCTCCCTGCCAAAAGGAGTAGCAACCATCAACCAATTTATTAGTTCGTCCTTGAAATCCGCATTCCACTCCTTGACGAAAAGCCACCCA10 GCCAATCAAACTAGGCAAGTCAACTTTCTCTGCCTCATTAAGCAGGATCAAAGCAGCCAATCCACAGAATGTATACCCACCATGTGCTTCAGCATAAGGCTCCCCAGCAATACCACCTTCATAAGTTTGACATCTTGCTATGTAGTCGCCTACACCTTTTGCCAGTTTAAAATCAAGAATATTCACAAGGCTGGCAACCGATATAGCGGTGTAGGAAGCACGGACA- 15 TCAATTTCGCCACCATCATGCATTCTGAAAGCACCTGATACATCTTTCATCTGCAGCATAAAATTGTACAGGTTGCCCCTATTGATTGATGACAATGCTCTTTCGCTCCCTATTGTCACAAGTGTATTTACAGCAGCATAAGTCGTAGCTAGGTGAGGCAACTGTCCAGGTCCACCACTATATCCACCATCTTTATCCTGACATCGAGCTAAGAAGTCTATGATATCATTCTCAAGATCATCA20 TCAAGTGCTTCATCCAGCAAAGCAAGTGGATGAACCATCCAGTAGCATAGCCAAGGGCGATTGGCATCTAGAACATGAAAGGCTGGTCCCATATGCCTCAGCCCAGGCGTCAGATACTCGATATGCTGATCACGCCACAGCTCTAGCATGATGGATTTCGTGTTGGGCGCGGCCCCGAAGAGGGAGCGGTAGA25 TGTCGCCAACCCTGGCCTCCACCTTCATCTGCTCCACCTGCGTCACCGTGAGCCTCGGTAGGTCGGGATCCGCC

Os ácidos nucléicos de FTA e de FTB e os aminoácidos descritos anteriormente possuem homologia com outros membros da família de proteínas FT (GenBank ID N~: U63298, U83707 e U73203; WO 00/14207;

Cutler e outros, Science 273(5279):1239-41, 1996; Ziegelhoffer e outros,

Proc Natl Acad Sei USA. 97(13):7633-8, 2000). A homologia entre estas e outras seqüências é exibida graficamente na análise de ClustalW mostrada

nas Tabelas 10A-10D. No alinhamento de ClustalW, os resíduos de aminoácidos sublinhados em preto indicam regiões de seqüência conservada (isto é, regiões que podem ser necessárias para preservar as propriedades estruturais ou funcionais), enquanto que os resíduos de aminoácidos destacados 5 são menos conservados e podem ser potencialmente alterados até uma extensão mais ampla sem alterar a estrutura ou a função da proteína.

Tabela 10A. Análise de Ácidos Nucléicos por ClustalW das Subunidades Alfa das FT

1) BNA-12; FT2 (SEQ ID N°: 12) s

jr 2) At-FT-A; FT1 (SEQ ID N²: 7)

3) PPI-Soja-FTA; FT4 (SEQ ID N²: 37)

4) Ervilha-FT-A (SEQ ID N²: 65)

5) Tomate-FTA (SEQ ID N²: 66)

6) Arroz-FT-A (SEQ ID N²: 67)

7) FT-A de milho Zea (SEQ ID N²: 68)

8) Soja1-FT-A (SEQ ID N²: 69)

9) Soja2-FT-A (SEQ ID N²: 70)

10) Triticum-FT-A (SEQ ID N²: 71)

20 30 40 50 60 70

BnA-12 ---------------------------------------------------------------------At-FT-A ---------------------------------------------------------------------PPI-Soja-FTA ---------------------------------------------------------------AT-G0A

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Tomate-FTA

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FT-A de milho Zea ----------------GCACGAGACAGCGCAATTACTTAAGCTATTTGTATTCGGATCTGATCCAACCC

100

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101

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102

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103

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Tomate-FTA

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109

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110

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At-FT-A PPI-Soja-FTA Ervilha-FT-A Tomate-FTA A Arroz-FT-A

FT-A de milho Zea Soja 1-FT-A Soja2-FT-A Triticum-FT-A Tabela 10B. Análise de aminoácido Clustalw W de subunidades FTalfa

1) BNA-12; FT2 (SEQIDNO:13)

2) At-FT-A; FT1 (SEQ ID NO:11)

3) PPI-Soja-FTA; FT4 (SEQ ID NO:39)

4) Ervilha-FT-A (SEQ ID NO:72)

5) Tomate-FTA (SEQ ID NO:73)

6) Arroz-FT-A (SEQ ID NO:74)

7) FT-A de milho Zea (SEQ ID NO:75)

8) Sojal-FT-A (SEQ IDNO:76)

9) Soja2-FT-A (SEQ ID NO:77)

10) Triticum-FT-A (SEQ ID NO:78)

BnA-12 --------------------ESHESiDfsSISSaHür

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Tabela 10C. Análise de aminoácido Clustalw W de subunidades FTbeta

1) PPI-BnFTb; FT3 (SEQ ID NO:14)

2) era1 (SEQIDNO:1)

3) Wiggum (SEQ ID NO:80)

4) PPI-Soja-FTB; FT5 (SEQ ID NO:40)

5) DuP-Soja-FTB (SEQ ID NO:81)

6) PPI-Milho-FTB; FT6 (SEQ ID NO:43)

7) DuP-Milho-FTB (SEQ ID NO:82)

8) Ervilha-FT-B (SEQ ID NO:83)

9) Tomate (SEQ ID NO:84)

10) Tabaco (SEQ ID NO:85)

20 30 40 50 60 70

PPI-BnFTb ---------------------------------------------------------------------era1 --------------------------------------------------------------------Wiggum ATGCCAGTAGTAACCCGCTTGATTCGTTTGAAGTGTGTAGGGCTCAGACTTGACCGGAGTGGACTCAATC

PPI-Soja-FTB ---------------------------------------------------------------------DuP-Soja-FTB ---------------------------------------------------------------------PPI-Milho-FTB ---------------------------------------------------------------------DuP-Milho-FTB ----------------------------------------------------------------------

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Tomate GTCGCTGACGAAATTTACAGTCAAGAGTAGTAACCGGTTGTAGTGAAAAAATGGAGTCGAGGAAAGTG0C

Tabaco -------------------------------------------------------GGCACGAGCGGC0C

150 160 170 180 190 200 210

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125

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126

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Tabela 10D. ClustalW Amino Acid Analysis of FT Beta Subunits

1) PPI-BnFTB; FT3 (SEQ ID NO:15)

2) era1 (SEQ ID NO:2)

3) Wiggum (SEQ ID NO:87)

4) PPI-Soja-FTB; FT5 (SEQ ID NO:42)

5) DuP-Soja-FTB (SEQ ID NO:88)

6) PPI-Milho-FTB; FT6 (SEQ ID NO:45)

7) DuP-Milho-FTB (SEQ ID NO:89)

8) Ervilha-FT-B (SEQ ID NO:90)

9) Tomate (SEQ IDNO:91)

10) Tabaco (SEQ ID NO:92)

20 30 40 50 60 70

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129 <·

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TSE§SSSDFKNIAYKBEEWRAQEEgãHglAÍIggniíIIgA

PPI-Milho-FTB --------~-n33YGCTAN------KSHSAVDYAKFGFDSiQQSNQIGigiSHNiA

DuP-Milho-FTB ------------H33YGCTAK ksSsavdyakfgfdBIqqsnqigSI5hniaI

Ervilha FT-B -----KE-CMDGÍEShÃTSHI-RHEG—____

MNEgcSSDVKNIGYNl31SEWRQSEiaiãHBAlPSnÍinga

Tomate SELSDEEEHBEGI§§HVQDTFPLGQAGACQENA§HSPKIADTGYEHI8I rp i AMRlsBãDSMYBgffnvfW^

Tabaco SELSDEE-HgQG|feSHVQKTCPLGQEG-____

QENAgDPTKlADTGYDSv[2]RTIAMREvgDgFY[EgBvBE§

430 440 450 460 470 480 490

-•I- ,| ..|··.·| -I ·|..··|

PPI-BnFTB dilSgQan-h era1 m^gíEn Wiggum KIP mEgJEn-BESi

PPI-Soja-FTB ®EQ

jYHTCYCLSGLSgQawgKSigDMPPLÍHSM

YHTCYCLSGLSgQgwjKB§DÍPPLÍE»B

DuP-Soja-FTB ^EQE^LigriadrigRlSBsÚsd^ffiBsSISLC&WfclViSlBHPlBsBa· [RDKPGK 8 RDH YH§CYCLSGLB^QYsL*lmm« S gPL·

PPI-Milho-FTB [gVLE pqhvi4§p8En-1J=B DuP-Milho-FTB gjVL pqhvl@pEEn-S!@2 Ervilha FT-B PKWM

Tomate vf@píEkc

Tabaco | _______ ____ ___ ___ g^FÍaMag^Gi^ÍMÍbt^i^dfe^i^^/TNEAiiwgaiPR^FapnaQNiina q®p|y[JwlErü

Lla>jaaqsNlã»jsrt;isBngEgiAvs5gEAMTDTGSclSnB

RDKPGKj

J3n®S1d |RDHYH§CYCLSGLS gQYSW§K agDSPPLÍYHTCYCLSGLS EQYSWHg^DSjjPL 53¾¾

500 510

PPI-BnFTB YgSRF------------------era1 N@3lEFFFKAA-------------Wiggum NglEFFFKAA-------------PPI-Soja-FTB ------------------------DuP-Soja-FTB ------------------------PPI-Milho-FTB ------------------------DuP-Milho-FTB ------------------------Ervilha FT-B RgHEFFSQL--------------Tomate YgjREYSQACETVSPLSLAPTFSET

Tabaco Y®RSFFSCL---------------

130

Está também incluída na invenção a seqüência consentido alfa da farnesil transferase da SEQ ID N²: 93 e a seqüência consentido beta da farnesil transferase da SEQ ID N²: 94. Para gerar a seqüência consentido, as seqüências da alfa farnesil transferase e da beta farnesil transferase da invenção foram alinhadas utilizando o programa BioEdit. A homologia entre as seqüências de polipeptídeo alfa da farnesil transferase (FTA) da invenção é mostrada graficamente na análise de ClustalW exibida na Tabela 10E. A homologia entre as seqüências de polipeptídeo beta da farnesil transferase (FTB) da invenção é mostrada graficamente na análise de ClustalW exibida na Tabela 10F.

Tabela 10E Análise de Aminoácidos de ClustalW das FT Alfa

20 30 40 50 60 70

BnA-12 -------------------------------------------------eESnBSSEAÍ33!3!

At-FT-A _______ ___________

MNFDE7^SQl5LjaEgs!SW\45L7tgD[Srê1dgldV]dlAnKg35F^iW»Wiag^aã

MHaaaaÊUla· __ _____ ___

PPI-Soja-FTA MESGSSEGEEVQQRE91R^aB^»yniaVPSlNlgB3

Consentido-—-—_jSSHk bEE®18ísBSíEiBEE1 H Iddd @ USEH

90

--1--1BnA-12

At-FT-A

PPI-Soja-FTA

M0AG[JgQiKS

Consentido

lLggsBKvSlNPgI3ãvgn

0RN

S2 Idalaaiaa^l

______________

150 1 60 1 70 180 1 90 200 210 gnAglj J ,Β,υ.ιίΓΤΐΠιΗιιτΐοΤΓΤΤΤπΤίΓΐΎΓ**¹'*''”***'^**^***^^^^

220 230 240 250 260 270 280

PPI-Soja-FTA ignsfriáiiKEígi Consentido iLSfflDAKHYHAWSHRQWALQjjLGGWEDEL^

131

kt^sj^lNÍCTME«|^tajijyl _______ __ __

PPI-Soja-FTAi{Effl^s^§j[L|SmE0nj0Y@Elg|stskVÀ^fc¥iÉBRGlyi»3GEll7 ^VNBJSQyj^Z^laiB-lgiKSNYM^fflsnM___ _____

Consentido____________________________ Ii?ldc8

290 300 310 320 330 340 350 ·Ί····|.···|····|.···|····|····|····|.···|.·.·|····|···.|····Ι····Ι__________________

BnA-12__Bgg@j2ajEEKEg§EKHES-------------Id^dàÉglWglW^d^gdk^gkWAUAfcL-----At-FT-A____________ JWijMBgjbÀiJL^SlKfgã^RCT^y-------------PPI-Soja-FTA E^^NEDlS^pM^ADMDKQDLDDDEKGgQQNlJgll·

0rn igsEKC^raS[mjffiji®^^p-Consentido^tSBgMfaaagklSlÍfeWil 0EE

KITVA

ÉEPETNLANLVCTILl

BnA-12 -(SEQ ID NO:13)

At-FT-A Al (SEQ ID NO:8) PPI-Soja-FTA - (SEQ ID NO:39)

Consentido -- (SEQ ID NO:93)

Tabela 10F Análise de Aminoácidos de ClustalW das FT Beta

20 30 40 50 60 70

PPI-BnFTB ---------------------------------------------------------------------PPI-Soja-FTB ----- -------AfilPR---------------------BIaqtlWMIqEIBnBíMqMvskSISBIlssCTSsMISWEI

PPI-Milho-FTB ADPDLPRLÜVTQVEQMKVEARVGDIYRSLFGAAPfl]TKSIEB^\A®QEiE2LTPSEBMGPffiHfflEgj|a __ consentido —Q----------------------lOfflasSSEB Ξ3Ξ3

90 100 110 120 130 140

PPI-BnFTB

PPI-Soja-FTB ggnAlrasraMiasii______

PPI-Milho-FTB MW!Í

Consentido

iPWLCYWlBHSIALLGESVDDgLEgNAIDFLERCQDfM ^TTYAAVNSLjTLGGEKglJJMMM········ __________ HBjALLjgEMDDDLENgDlDFL0RCQDg2Dl 06Ϋ§0δΡ00ΪΡΗΕΑΤΤΥΑΑνΝΤί\/ΊΪ0@Ε[£Α15·······Ι···ί |pwlcywiBhsiallgesvdddlennaidflBrcqd1dggy| GGPGQLPHLATTYAAVNTLVTLGGEKALS— ^fflBFLRRMKDjjNGGFRMHMGEIDVRACYTAlMA-l

JpCQTYEGG (3············· aLYBFLRRMKgBNGGFRMHD§GEIDVRACYTAIS-|

150

PPI-BnFTB gíHflMSSSST PPI-Soja-FTB

132 ____

PPI-Milho-FTB gWíGN^NBMLQffiiagVSfgAfd^^BGMÍlI^^Sft/ja ® L\4J^FJ^|AKgg^^^SjgggE ______ __

Consentido^^lS||UC^^^^jTHff|gm3a3rolÍnS! 03β2Ε5ΞΗΕΙΕΗΕ B3B SSÜ 32EEfflWuS3SSE

220 230 240 250 260 270 280

PPI-BnFTB

SÊffiãMgS

PPI-Soja-FTB

PPI-Milho-FTB

Consentido ^r ' ’

GajNHBSERBVDME l[2êaekvISES1gMaS3 ldlpslBwvvfrqg-I

ESSEESEI

290 300 310 320 330 340 350

PPI-BnFTB SgFF@SQ|gMAPHG^SHMgQGTDEDHEEHEHDEDDPEDSDEDDSD@DgDÊESG[BGHQVHHTStyidEr ____

PPI-Soja-FTB GOISglÍNÍgS!MEE1^QIFAVgYVSEAKHSLDtgg3SHATffiRgehegts^^sEfkE-iaykB]newEa

PPI-Milho-FTBEK2lT0WggLRS§-----YmCKRPSGHDACSHSSYG-StaNKS—^AVgYAK—FGFDBIqQSNQ ___

Consentido 03! 0] Sã -- S @ ESSã Ξ SE Ξ SI— SI E

360 370 380 390 400 410 420

PPI-BnFTB __________

QqEvSd§l kDEgFt3B5LRtBp[5B!FflgÍWZriM

WlaSABwH *DlggGSA______

PPI-Soja-FTB____ (μιΙ3!μΜ·ι»γιι·ΡαΒ ppi-Miiho-FTB QG0È®NEh^giffl|^05n|L@ssi3SSãS2N[3S!EEsConsentido [] |33!Β2ΠΞ33Ξ

0E5 ΗΞΕΞΕβΞΕΓΕΪ

430 440

PPI-BnFTB ® PPI-Soja-FTB PPI-Milho-FTB Consentido B BBB-—

LLHNILVDRYYEASRF (SEQ ID NO:15) (SEQ ID NO:42) — (SEQ ID NO:45) (SEQ ID NO:94)

Está também incluída na invenção a seqüência consentido alfa 45 da farnesil transferase da SEQ ID N²: 95 e a seqüência consentido beta da farnesil transferase da SEQ ID N²: 96. Para gerar a seqüência consentido, as seqüências alfa da farnesil transferase e beta da farnesil transferase da

133 invenção foram alinhadas utilizando o programa BioEdit. A homologia entre as seqüências de ácido nucléico alfa da farnesil transferase (FTA) da invenção é mostrada graficamente na análise de ClustalW exibida na Tabela 10G. A homologia entre as seqüências de ácido nucléico beta da farnesil transfe5 rase (FTB) da invenção é mostrada graficamente na análise de ClustalW exibida na Tabela 10H.

Tabela 10G Análise de Ácido Nucléico ClustalW FT Alfa

20 30 40 50 60

BnA-12

At-FT-A

80 90 100 110 120

BnA-12

130 140 150 160 170 180

BnA-12

190 200 210 220 230 240

BnA-12

/-X VJ

At-FT-A

gAACTCCGG^^MMMMMMIMMBM—bMMI

L«kUW3MCGACGAGCG|TCTCCTCGCGC|Cl1CGACTCACGGAAGA-M |agccctcc|cttaaactccggíE—

250 260 270 280 290 300

Ü

At-FT-A

PPI-Soja-FTA

310 320 330 340 350 360

BnA-12

At-FT-A

TGAAGAACTCGAGTTCATCGAACGCATTGCTGAGGATAACTCTAAGAACl

TACCAQSTGTGEIEHHHHHHHM^HHHHHÜHBHH γγα0οα6Ξτ6Τ6ΕΞ3······1Μ·Ι·^·······Ι

Consenso

TGAAGAACTCGAGTTCATCGAACGCATTGCTGAGGATAACTCTAAGAACl

TACCAGlTGTG^n^··············^···

370 380 390 400 410 420

135

BnA-12 E-----------ÇatcatcgacgatgggtEgcagagaaactgggtcctgatgttgcagg

257

At-FT-A E ----------catcatcgEcgatgggttgcagagaaactgggtcctgatgttgcagg

395

PPI-Soja-FTA natgttctgtagg g^AEcilAGEAA 419 Consenso E-----------331

CATC · T0GACG ATGGGTTGC gGAGAA §jjT0GGTCCT

BnA-12___________________________

At-FT-A

PPI-Soja-FTA ' c^®gSucEEBÍcS®aaa0aEaíESígíEcgííESB^0^®B

ÍffltEiTel8AÍg479 _____ _______ consenso___roEEESfflES£SiES2S HSSsSEffl iÍJiSãiBSES

490 500 510 520 530 540

At-FT-A

GTCBCATAGaCAGTGGGCDCIÜCAABCABTAGGAGGATGGGAAGATGAB CTTAATTAjjTG^MMM^—M WiffgffgTMGTCACATAGGCAGTGGGClCTACAAGCATTAGGAG^^^M iGATGGGAAGATGAGCTTAATTACTGgga—

550 560 570 580 590 600

BnA-12

At-FT-A________________________________________ ____________

136

AAG jTTTAACAATTCTGCjjTGGAATCAGA

610 620 630 640 650 660

BnA-12

At-FT-A _____________________________________________________

25íc^cca2S^SiíHíEEEEES3Sí0323^®SES@2E0EíH!

635

PPI-Soja-FTA

670 680 690 700 710 720

BnA-12__________________ ___ _____

GlVJgHlG^ÍTJeffi 557

At-FT-A___

A3HSüE3EcEEEESEGSaEAiE§cEE

PPI-Soja-FTA_________ :^G^q^lÉiAbKtW^cBggaA^Tl^AMcTft^GnagCT^

CG^G _________~

Consensc» kTiTíWcfil

730 740 750 760 770 780

BnA-12

At-FT-A gflaí»raiii755

PPI-Soja-FTA ________ ______

AHjjffiTMpGlgSA^TACTBgAnffiGnAMKCTgggTCAAHnBjTÍi ___________ ________________

Consenso P.íe!^«^íeLnga

137

-¼

790 800 810 820 830 840

BnA-12 ^I^A^iTOicnSAÍRêTgGBfí^ciíeiww^íeicfÁiB^eTHrwíefíWyÀT^·! 'Η···ϊ8071¥ίΗ»677

At-FT-A _______ ___________________________________ ^gTfeftgjAggcfgeTg^gAg^TngTgffg^Tcg^B^gcT^^^c?·^·?·!

!η···^ΜΑ^Ι815

PPI-Soja-FTA A02GAHjTBGA—

EaEBSt ABGAE^^B7fflC^GffiTte^utejTtoc^BÉBTA||lÉllA^!imu 836

Consenso5gggUaÍ|8|[jTOMS8ffl8ntraliciSn8ffilKi!e%Sll85MíHe fdTc?^!íg^HimSe^ígi734

850 860 870 880 890 900

BnA-12

At-FT-A

910 920 930 940 950 960

BnA-12__

797

At-FT-A__ >r^Aic7AW<W^W^VAWÉírf^^hÉií^círaCgragiCTSlgnTGgB

PPI-Soja-FTA CfêdfleflI0TG^TA0gEAAÈATn0GAÍEAjEATGSGABAGGG@AACAACAA0ATfl

TA 954

Consens	BMTGAAGAACCAf	3AGACTAACTTGGCCAATTTGGTGTGTAC
lATTCTGl	KTTCGTGTAGATCC	850

970 980 990 1000 1010 1020 i bji/àwI yj

HS^^BATAgAGAGCTAACTATTGGGC^^^^^M lATGGCTmA^A^^GATjggABTEGSA^CAAÍTlâfcMJ

138

E^EjET^CASG^AÍCTÍÍTffiTTCTCTÍCCTAA^CSAGT~rgCTÍCCA^TnA!gA

PcS^CDAT 1014____________ ____

Consenso &Φγα1·κφΕΕΗ3§ SEE Ξ® ΞΟΞ

889

1030 1040 1050 1060 1070 1080

BnA-12

At-FT-A aai®gB§a^ccc0aa0tcacaEiBgaaaaagacttgattattagttt

TTACGTAATT 1052

PPl-Soja-FTA TGG^lflgGS^AAGflGC^GACTTfgcii·

--------1041

Consenso ESüEEêS 0 0 50

822

900

-1041

900

1150 1160 1170

BnA-12 -------------------------------822 (SEQ ID NO: 12)

At-FT-A CAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA 1143 (SEQ ID NO:7)

PPl-Soja-FTA -------------------------------1041 (SEQ ID NO:37)

Consenso -------------------------------900 (SEQ ID NO:95)

Table 10H ClustalW Nucleic Acid Analysis of FT Beta

20 30 40 5060

PPI-BnFTb 1 eral 1

PPI-Soja-FTB 1

PPI-Milho-FTB GGCGGATCCCGACCTACCGAGGCTCACGGTGACGCAGGTGGAGCAGATGAAGGTGGAGGC 60

Consenso 1

80 90 100 110120

PPI-BnFTb 1 eral 1

PPI-Soja-FTB ---------------------------GCCACCATTCCTCGCAACGCCCAAACCCTCAT 32

PPI-Milho-FTB CAGGGTTGGCGACATCTACCGCTCCCTCTTCGGGGCCGCGCCCAACACGAAATCCATCAT 120

139

4»

Consenso

130 140 150 160 170 180

PPI-BnFTb -----era1 AjjGg0gJjTCAG

QaaEgSSg CjjTG

PPI-Soja-FTB G tccaaaBSccíít

PPI-Milho-FTB G

GACGCC-rtgaGCfiGA@G^TAgGG

Consenso üSEu ES^iE

;@3§θΠΤ CAAE@C@HjASl®SCAfiGC0GQ3]GflCQffiTcijCAE 92 ^^ÇIlGTGGggfgBncSG^TAriCGSGÍCTicra

JgTso __hSS ü EJíZSííj ss ü ES2 ü

GA1

190 200 210 220 230 240

PPI-BnFTb ---------------------------------bggagTngTijpinaagriTcíH^^ 26 _____ _____ era1 TCSGCAGÍlBlTCTTCCTFlAEflT^Tfl^lSSABST|gg?gÍTÍTa

119

PPI-Soja-FTB TTBCGCAfiBjTCCGTTTfiGEEcBSTlS^BSABSciKggl

OcjEciEEESSíÇTiicEEcjE 152 _____ ____

PPI-Milho-FTB ACgAGCCUllCATGTTCÍÍAB^eScEEnggcESTÍKg!a ~ ‘ ””---------ffiMGGllwSlCg_240

S giii nBraBSE nAnScnCT&íeffiMGGpBpjguCE240 _____ _________

Consenso S üiilíWffiSESÜESBSlíetetoi β§ bà^HM 65

280 290 300 aATGCSAlBGAjjTTflC·

AAT0GCTTTGCTjjGG| _______ATG^AlfiGAgnSCI i±)BjaaffãMSATTGCTTT(ai· |lSGAA@AjjAAgGCEATEGAÜT1 •Ja^HlTpBÍi.jASTTGCTTTGCI |GA@AA|EatBíMAT^GASt^~~ pgtfmSjWÃATTGCTTTGC _ lATGClATlGAlnlCTtmMMi

ÜT^G^GlS.TtgiG^í^rWClíiAII86 ______________

Gg^GAfflTlgiGraWc^^ATiiA55179 ____________

JÍG^A^ATScSjCEEfi^ESAC□|GffiAT@2AGEACÍjTSSBiSEETCnTSjCTU 300 e&EBEE ÜM0

310 --I PPI-BnFTb Ξ era1

PPI-Soja-FTB

IGGCC,

320 330 340 350 360

DiijlmA^riSi 146__ mafe^^GGTfflTg^Aregna^i^cBgngEnaa iTS^ABg^flÜ 239 ______________

AAC^Ttfjgtog^AnCSGALVÍgeffegT^CTgCCBSGPGAÍlGfetfTL«lÍAn 272

140

Egmaias

Consenso

BSCG0TGnÇAGGHlWaGATGGTGGATAT0GTGGT-|

UUSC^jCAgCT^···········

GFGCCAGG|T|C|GATGGTGGATATGGTGGTGG^B

3ãcSacttatgctgc0gtEaatScacttgttactttag1

IGGTG1 @AAAGCCgTQTC|S£|aHHHHHHHHHHHHHHHH| jACTTATGCTGCQGTtÍAATjjCACTT0TTACTTH _ cEacttatgctgcíjgtBaatEcacttgt^^M ;GA0ÃgAGCSH§TCES!flHI^HHiHI^Ml c|acttatgctgc|gt|aat1cacttgttactttagg1 κΠη·········Μ·Ι

370 -I

PPI-BnFTb era1

PPI-Soja-FTB GEErragBflc PPI-Milho-FTB GBgAAjEEEG

Consenso

SSEEra®»®

440 450 460 470 480

430

PPI-BnFTb TH^MbÍ^CCT^cEaC GCÜTBBÍICTÍIAAEA^aHEEH^HjÃ^EaI^aEE 266 era1^_íB^HfflMÜ®0®A033AÍEBcOTSÍÍÍÍTÍjAA@A^^n ^rgéCTÍAt«^GK<^A[<3§ 359

PPI-Soja-FTB A|jB^M^W^KgfJT^^CngÍAnGEGEÍBÍCnGCgGMtfC^ÍcyAVAXCC0A^^^SA|^^^B^392 ____ ____

PPI-Milho-FTB A>íj^ia3BlES^5GCEECCÍggÍACAAEgÍBÍABGCTGgAgHESS ___________C480 ____ _____

Consenso Ε^ΕΚΠΠΗΒΗϊπ gg^g

BaVJBc^Í B&TlíeW MS 259

490 500 510 520 530 540

PPI-BnFTb IQgA^^j^flA^ATGggBAt^^iAECTBiiGBgAH

SGlteiHrAT^mg^GaMlTEAÜ 326 ___________ eraT””jffiS E^SíSSÈ^ATGgEAgSEíiEHSÊSTggTggAig

MHrAT^xmeffiA^|gre<aaj 419 ____________

PPI-Soja-FTB AlB^M^^Alíe^lGAABgTg^TOgA^fcaTtggAgg @Τ|βί·^£3}^·2ΪΜ0ΕΠπΗ·Ππ3Γ45Ξ^

PPI-Milho-FTB IW^feA^^Alí^AllGGT^C^yAlà^Midg^WSTflCM7AX<^gCMS^jl^BB3ST540

Consenso iiidHg^iraAMígfii BS te^VA^áte^KSi BS BS flgS inwJwtet·! CTmScBiiãii

TGGATGATGAACT gACC550 560 570 580 590 600

....1....1. | | 1....1....1 II I....I

PPI-BnFTb ^^▼ATgSAgCCE^acCTÍÍGÍ

BGCHaCTUH^^mrÀTffllTTii 386 _____ _____ era1 Íí5^^5fAnccnA^T^mAlíefcf^íe7^tefÀyj^ÍC^11fJG45

141

EEcc PPI-Soja-FTB

ESgaatgQt· PPI-Milho-FTB __

SAA^AfggTGÍ^S____

Consenso Uggfflflgffl, EEE0SS lEHSjuyq

610 620 630 640 650 660

.·4··.·|. ·Μ I.. | L | I I. I I______________________ _________

PPI-BnFTb G0E[jEc^g^ggjgjE^B^SÍEGA^^ ^A^EEcjjS®^__

PPI-Soja-FTBA®dg^™^JgAH3Ü@3G^Í^^HECl®TE3GrgtgggllíÍgTg^^HBLW^ÍQd 572 _______

PPI-Milho-FTB AB§AggfrLAfA*A!d·^^^ gggjTATGBgT^^AB&AIAàlá 660 ____

Consenso TE tefefacròfflgiaa iES2^

9>

670 680 690 700 710 720

Ι-·Ι·-Ι__ ΰ1·ί^ΗΪΑ(ΗΚ£»0Τ£1·ΐΤΓΐΑ^ΐ

!TTGGCT@CTUTGATBrreSTl

3GAAAGUTG0C

TutgHHiGmrAir^AiiíiiíiACTic^El

....(

PPI-BnFTb era1

PPI-Soja-FTB gEEHsSjtaS

PPI-Milho-FTB τ0ΕϊΕΕΞ§

Consenso

EflS HEEhí|458 ígdAi SESEQüu ü ES fe^iícEtacri

,...|

PPI-BnFTb QaEEEatg era1 ______

Ê®\TGEg0Í PPI-Soja-FTB taagEEEtg PPI-Milho-FTB

EH§BgEE0tgc Consenso E EESSEESSê

730 740 750 760 770 780

...|·.·.|. I .|....(- ]... |. |________ __________________________________ rcGji^t^A^iWgaiTtSracAngc^T^McWcg

566 _______________

TCAjggjT^-· ^j*^ctEEcaíEEEM^ESía-

790 800

3GfiTG0cn^^OGSETTcE^E0g^g

692______ _______

TGGCi'fggaÍGEcTTrtggS~rr^Tc8 j§780 ___________ uoE iEsHaEEEESi Ξ2Ε

810 820 830 840

Γ

142

PPI-BnFTb G^GE^EgJjE^CggC [^deíC^^CC^TGUgTljMyECl[626_________ ___________ eral G^G00CTOffln|i!e!eiiaclÍ\^eTebiBfeHrjeiASAiBBBíeíeie^Xtteg CCTagCCffiTTGÍEjffipCIl 719__________

PPI-Soja-FTB f»^tfc]G^GTGSTG~ngcÍÍSgJllÍ 752______________ _______

PPI-Milho-FTB A^l^I^SBacÍlTg^TctWi^/AXglffiCiiiiggg ^!tfdG^ggTGgCATEcQTflCAC_840_

Consenso JEES I^AlBíeicSi 5EB sss g SãίΞΐΐΐι547 |GGTTGCTAC0C@TTTTGG-

850 860 870 880 890 900

PPI-BnFTb CTjSGCtF gjBATCCCAGg^iPtEGCACCTCBtBgA ___3TCACATATGTCAC 685

eral ^Ο@>άή%ΐΑΪΒΚΑ0ΟΟΑΑΊΐ8^ΐθΕΙΐΐ5ΑΩΩΤTC^lffiGATlklí^—CATATATCAG 775

PPI-Soja-FTB G DuSgT0TTATCA0C0AACAGATGGE_____ -C-----AGATTT 805

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PPI-Soja-FTB

PPI-Milho-FTB

Consenso —1135 — 1245 797

1390 1400 1410 1420

PPI-BnFTb -----------------------------------------1110 (SEQ ID NO:14) era1 TAAGAGTTTCCGTAGTGTTGTAACTTGTAAGATTTCAAAAG

1290 (SEQ ID NO:1)

PPI-Soja-FTB -----------------------------------------1135 (SEQ ID N^e: 40)

PPI-Milho-FTB-----------------------------------------1245 (SEQ ID N°: 43)

Consentido ----------------------------------------- 797 (SEQ ID N^e: 97)

Exemplo 13: Constructos de vetores para Transformação

As seqüências de FTA ou de FTB foram utilizadas para produzir constructos adequadas para a transformação em plantas e sob o controle de seqüências reguladoras apropriadas. As seqüências gênicas estavam na 40 orientação sentido para a superexpressão ou na orientação anti-sentido para a regulação para menos. Partes destas seqüências foram utilizadas para construir um constructo de inibição de RNA de filamento duplo (dsRNAi).

145

Uma seqüência de preferencialmente não menos que 21 nucieotídeos foi clonada como uma repetição invertida separada por um ligante que quando expressa resulta na regulação para menos do gene alvo. Foram criados vetores anti-sentido duplos (DA) em que uma repetição direta de uma seqüên5 cia anti-sentido é separada por uma seqüência espaçadora tal como GUS.

Foram utilizados promotores para a expressão constitutiva tal como o promotor 35S de CaMV, o promotor MuA de Zea maize ou que pode ser induzido através de informações ambientais ou celulares específicos tais como os níveis de ABA ou condições de seca que induzem a expressão do promotor fG 10 RD29A. Alternativamente, os promotores específicos aos tecidos ou às organelas tal como o promotor HIC ou CUT1 podem ser utilizados. Tais constructos foram transformados em Arabidopsis thaliana, Brassica, Zea maize, Glycine max. Outras espécies podem ser transformadas quando desejado.

V *

Cada espécie que será transformada pode fazer uso de seqüências regula15 doras específicas quando apropriado para tais espécies particulares. As plantas transformadas foram selecionadas e suas propriedades fenotípicas foram analisadas. As plantas transgênicas foram avaliadas em relação às características tais como maior tolerância à seca, acúmulo alterado de biomassa, rendimento, requerimentos nutricionais tais como minerais ou micro20 nutrientes, estresse biótico tal como uma infecção ou ataque por fungos, bactérias ou outro agente patogênico ou qualquer outra característica física ou bioquímica.

Exemplo 14: Transformação de Plantas

As plantas transgênicas de Arabidopsis thaliana foram produzi25 das através do método de mergülhamento de flores em uma cultura de Agrobacterium. As plantas do tipo selvagem foram cultivadas sob condições padronizadas até começarem a florescer. A planta foi vertida durante 2 minutos em uma solução de cultura de Agrobacterium. As plantas foram então embaladas durante dois dias para manter a umidade e então descobertas para continuar o crescimento e o desenvolvimento das sementes. A semente madura foi colhida em massa.

As plantas T1 transformadas foram selecionadas através da

146 germinação e do crescimento em placas de MS contendo 50 μg/mL de canamicina. As plantas novas verdes resistentes à canamicina foram identificadas após 2 semanas e transplantadas no solo. As plantas foram embaladas para garantir a autofertilização e a semente T2 de cada planta foi colhida separadamente. Durante o crescimento das plantas T1, foram colhidas amostras de folhas, o DNA foi extraído e foi realizada a análise de Southern.

As sementes T2 foram analisadas em relação à segregação da Kan^R. Das linhagens que exibiram um fenótipo de resistência de 3:1, as plantas T2 sobreviventes foram cultivadas, embaladas durante a produção de sementes e a semente T3 foi colhida de cada linhagem. A semente T3 foi novamente utilizada para a análise de segregação da Kan^R e as linhagens que exibiam um fenótipo de 100% de Kan^R foram selecionadas como linhagens homozigotas. Uma análise adicional foi feita utilizando a semente T3.

As plantas transgênicas de Brassica napus foram produzidas utilizando a transformação mediada por Agrobacterium do tecido do pecíolo do cotilédone. As sementes foram esterilizadas como a seguir. As sementes foram umedecidas com etanol a 95% durante um período de tempo curto tal como 15 segundos. Aproximadamente 30 ml_ de solução de esterelização I foram adicionados (70% de Javex , 100μΙ de Tween20) e deixados durante aproximadamente 15 minutos. A solução I foi removida e substituída por 30 mL da solução II (0,25% cloreto mercúrico, 100μΙ de Tween20) e incubados durante aproximadamente 10 minutos. As sementes foram lavadas com pelo menos 500 mL de água esterilizada destilada duas vezes e armazenadas em uma placa esterilizada. As sementes foram germinadas em placas de meio ¹/₂ MS, pH 5,8, suplementado com 1% de sacarose e 0,7% de ágar. Os cotilédones totalmente expandidos foram colhidos e plaqueados no Meio I (Murashige com substâncias orgânicas mínimas (MMO), 3% de sacarose,

4,5 mg/L de benzil adenina (BA), 0,7% de fitoágar, pH 5,8). Uma cultura de Agrobacterium contendo ao constructo de ácido nucléico de interesse foi cultivada durante 2 dias em meio AB Mínimo. Os explantas de cotilédones foram mergulhados de forma que somente a parte cortada do pecíolo fica em contato através de uma solução de Agrobacterium. Os explantas foram

147

então embebidos no Meio I e mantidos durante 5 dias a 24°C, com ciclos de luz escuridão de 16,8 h. Os explantas foram transferidos para o Meio II (Meio I, 300 mg/L de timentina) durante mais 7 dias e então no Meio III (Meio II, 20 de mg/L canamicina). Qualquer tecido radicular ou de broto que se desen5 volveu neste período foi dissecado. Os explantas foram transferidos para placas frescas de Meio III após 14 - 21 dias. Quando o tecido de broto regenerado se desenvolveu, o tecido regenerado foi transferido para o Meio IV (MMO, 3% de sacarose, 1,0% de fitoágar, 300 mg/L de timentina, 20 mg/L de canamicina). Uma vez que o tecido de broto saudável se desenvolveu, o 10 tecido de broto dissecado de qualquer tecido de calo foi mergulhado em 10X de IBA e transferido para o Meio V (Murashige e Skooge (MS), 3% de sacarose, 0,2 mg/L de ácido indol butírico (IBA), 0,7% de ágar, 300 mg/L de timentina, 20 mg/L de canamicina) para a formação de raízes. As plantículas saudáveis foram transferidas para o solo.

A Glycine max, o Zea maize e o algodão transgênicos podem ser produzidos utilizando métodos baseados em Agrobacterium que são conhecidos por um versado na técnica. Alternativa mente, pode-se utilizar um método de transformação por bombardeio de biolística de partículas e sem ser com partículas. Um exemplo de transformação por bombardeio de biolística sem ser 20 com partículas é fornecido no Pedido de Patente U.S. 20010026941. As plantas viáveis são propagadas e linhagens homozigotas são geradas. As plantas são testadas em relação à presença de tolerância à seca, fenótipos fisiológicos e bioquímicos que são descritos em outro lugar.

A tabela a seguir identifica os constructos e as espécies que foram transfor25 madas.

148

Tabela 11.

Espécies Transformadas

SEQ ID N^s: SEQ

SEQ ID N9: 10	pBI121-35S-anti-AtFTA	Arabidopsis thaliana
SEQ ID N9: 46	pBI121-35S-AtFTA	Arabidopsis thaliana	Brassica napus
SEQ ID N9: 47	pBI121-rd29A-anti- AtFTA	Arabidopsis thaliana	Brassica napus
SEQ ID N9: 48	pBI121-35S-DA-AtFTA	Arabidopsis thaliana	Brassica napus
SEQ ID Ns: 49	PBI121-RD29A-DA- AtFTA	Arabidopsis thaliana	Brassica napus
SEQ ID N9: 50	MuA-anti-GmFTA			Glycine
				max
SEQ ID N9: 51	RD29A-anti-GmFTA			Glycine
				max
SEQ ID N9: 52	MuA-HP-GmFTA-Nos- Term			Glycine max
SEQ ID N9: 53	RD29AP-HP-GmFTA- Nos-Term			Glycine max
SEQ ID Ns: 54	pBI121-35S-Anti-AtFTB	Arabidopsis thaliana	Brassica napus
SEQ ID N9: 55	pBI121-RD29AP-Anti- AtFTB	Arabidopsis thaliana	Brassica napus
SEQ ID Ne: 56	pBI121-35S-HP-AtFTB	Arabidopsis thaliana	Brassica napus
SEQ ID N5: 57	pBI121-RD29AP-HP- AtFTB	Arabidopsis thaliana	Brassica napus
SEQ ID N9: 58	pBI121-35S-AtFTB	Arabidopsis thaliana
SEQ ID Ne: 59	M uA-anti-Gm FTB-NosTerm			Glycine max
SEQ ID N9: 60	RD29AP-anti-GmFTB- Nos-Term			Glycine max
SEQ ID N9: 61	MuA-HP-GmFTB-Nos-			Glycine

149

Term

SEQ ID Ν^θ: 62

RD29AP-HP-GmFTBNos-Term

SEQ ID N^s: 64

MuA-anti-FTB de milho Zea-Nos-Term

MuA-HP-FTB de milho Zea-Nos-Term max Zea maize Zea maize

Os exemplos não limitantes de constructos de vetores adequados para a transformação de plantas são fornecidos na SEQ ID N²: 10, 4664.

SEQ ID N²: 10 gfttacccgccaatatatcctgtcaaacactgatagtttaaactgaaggcgggaaacgacaatctgatcatgagcggagaattaagggagtcacgttatgacccccgccgatgacgcgggacaagccgttttacgtttggaactgacagaaccgcaacgttgaaggagccactcagccgcgggtttctggagtttaatgagctaagcacatacgtcagaaaccattattgcgcgttcaaaagtcgcctaaggtcactatcagctagcaaatatttcttgtcaaaaatgctccactgacgttccataaattcccctcggtatccaattagagtctcatattcactctcaatccaaataatctgcaccggatctggatcgtttcgcatgattgaacaagatggattgcacgcaggttctccggccgcttgggtggagaggctattcggctatgactgggcacaacagacaatcggctgctctgatgccgccgtgttccggctgtcagcgcaggggcgcccggttctttttgtcaagaccgacctgtccggtgccctgaatgaactgcaggacgaggcagcgcggctatcgtggctggccacgacgggcgttccttgcgcagctgtgctcgacgttgtcactgaagcgggaagggactggctgctattgggcgaagtgccggggcaggatctcctgtcatctcaccttgctcctgccgagaaagtatccatcatggctgatgcaatgcggcggctgcatacgcttgatccggctacctgcccattcgaccaccaagcgaaacatcgcatcgagcgagcacgtactcggatggaagccggtcttgtcgatcaggatgatctggacgaagagcatcaggggctcgcgccagccgaactgttcgccaggctcaaggcgcgcatgcccgacggcgatgatctcgtcgtgacccatggcgatgcctgcttgccgaatatcatggtggaaaatggccgcttttctggattcatcgactgtggccggctgggtgtggcggaccgctatcaggacatagcgttggctacccgtgatattgctgaagagcttggcggcgaatgggctgaccgcttcctcgtgctttacggtatcgccgctcccgattcgcagcgcatcgccttctatcgccttcttgacgagttcttctgagcgggactctggggttcgaaatgaccgaccaagcgacgcccaacctgccatcacgagatttcgattccaccgccgccttctatgaaaggttgggcttcggaatcgttttccgggacgccggctggatgatcctccagcgcggggatctcatgctggagttc-

150 ♦

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152 ggcggtgaagggcaatcagctgttgcccgtctcactggtgaaaagaaaaaccaccccagtacattaaaaacgtccgcaatgtgttattaagttgtctaagcgtcaatttgtttacaccacaa-

tatatcctgcca

Α SEQ ID N^e: 10 é a seqüência de ácido nucléico do constructo de vetor pBI121-anti-sentido-FTA utilizado para transformar plantas de Arabidopsis. As seqüências em itálico são as repetições da borda direita e da esquerda (1-24, 5226-5230). A seqüência sublinhada é o promotor 35S (2515-3318). A seqüência em negrito é a seqüência alfa da farnesil transferase anti-sentido (3334-4317).

SEQ ID NO:46 gtttacccgccaatatatcctgtcaaacactgatagtttaaactgaaggcgggaaacgacaatctgatcatgagcggagaattaagggagtcacgttatgacccccgccgatgacgcgggacaagccgttttacgtttggaactgacagaaccgcaacgttgaaggagccactcagccgcgggtttctggagtttaatgagctaagcacatacgtcagaaac15 cattattgcgcgttcaaaagtcgcctaaggtcactatcagctagcaaatatttcttgtcaaaaatgctccactgacgttccataaattcccctcggtatccaattagagtctcatattcactctcaatccaaataatctgcaccggatctggatcgtttcgcatgattgaacaagatggattgcacgcaggttctccggccgcttgggtggagaggctattcggctatgactgggcacaacagacaatcggctgctctgatgccgccgtgttccggctgtcagcgca20 ggggcgcccggttctttttgtcaagaccgacctgtccggtgccctgaatgaactgcaggacgaggcagcgcggctatcgtggctggccacgacgggcgttccttgcgcagctgtgctcgacgttgtcactgaagcgggaagggactggctgctattgggcgaagtgccggggcaggatctcctgtcatctcaccttgctcctgccgagaaagtatccatcatggctgatgcaatgcggcggctgcatacgcttgatccggctacctgcccattcgaccaccaagcgaaacatcgcatcga25 gcgagcacgtactcggatggaagccggtcttgtcgatcaggatgatctggacgaagagcatcaggggctcgcgccagccgaactgttcgccaggctcaaggcgcgcatgcccgacggcgatgatctcgtcgtgacccatggcgatgcctgcttgccgaatatcatggtggaaaatggccgcttttctggattcatcgactgtggccggctgggtgtggcggaccgctatcaggacatagcgttggctacccgtgatattgctgaagagcttggcggcgaatgggctgaccgcttcc tcgtgctttacggtatcgccgctcccgattcgcagcgcatcgccttctatcgccttcttgacgagttcttctgagcgggactctggggttcgaaatgaccgaccaagcgacgcccaacctgccatcacgagatttcgattccaccgccgccttctatgaaaggttgggcttcggaa-

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154

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(Seqüência sublinhada: promotor 355; negrito:AtFTA))

SEQ ID NO:47 gtttacccgccaatatafcctgfcaaacactgatagtttaaactgaaggcgggaaacgacaatctgatcatgagcggagaattaagggagtcacgttatgacccccgccgatgacgcgggacaagccgttttacgtttggaactgacagaaccgcaacgttgaaggagccactcagccgcgggtttctggagtttaatgagctaagcacatacgtcagaaaccattattgcgcgttcaaaagtcgcctaaggtcactatcagctagcaaatatttcttgtcaaaaatgctccactgacgttccataaattcccctcggtatccaattagagtctcatattcactctcaatccaaataatctgcaccggatctggatcgtttcgcatgattgaacaagatggattgcacgcaggttctccggccgcttgggtggagaggctattcggctatgactgggcacaacagacaatcggctgctctgatgccgccgtgttccggctgtcagcgcaggggcgcccggttctttttgtcaagaccgacctgtccggtgccctgaatgaactgcaggacgaggcagcgcggctatcgtggctggccacgacgggcgttccttgcgcagctgtgctcgacgttgtcactgaagcgggaagggactggctgctattgggcgaagtgccggggcaggatctcctgtcatctcaccttgctcctgccgagaaagtatccatcatggctgatgcaatgcggcggctgcatacgcttgatccggctacctgcccattcgaccaccaagcgaaacatcgcatcgagcgagcacgtactcggatggaagccggtcttgtcgatcaggatgatctggacgaagagcatcaggggctcgcgccagccgaactgttcgccaggctcaaggcgcgcatgcccgacggcgatgatctcgtcgtgacccatggcgatgcctgcttgccgaatatcatggtggaaaatggccgcttttctggattcatcgactgtggccggctgggtgtggcggaccgctatcaggacatagcgttggctacccgtgatattgctgaagagcttggcggcgaatgggctgaccgcttcctcgtgctttacggtatcgccgctcccgattcgcagcgcatcgccttctatcgccttcttgacgagttcttctgagcgggactctggggttcgaaatgaccgaccaagcgacgcccaacctgccatcacgagatttcgattccaccgccgccttctatgaaaggttgggcttcggaatcgttttccgggacgccggctggatgatcctccagcgcggggatctcatgctggagttc155 ttcgcccacgggatctctgcggaacaggcggtcgaaggtgccgatatcattacgacagcaacggccgacaagcacaacgccacgatcctgagcgacaatatgatcgggcccggcgtccacatcaacggcgtcggcggcgactgcccaggcaagaccgagatgcaccgcgatatcttgctgcgttcggatattttcgtggagttcccgccacagacccggatgatccccgatcgttcaaacatttggcaataaagtttcttaagattgaatcctgttgccggtcttgcgatgattatcatataatttctgttgaattacgttaagcatgtaataattaacatgtaatgcatgacgttatttatgagatgggtttttatgattagagtcccgcaattatacatttaatacgcgatagaaaacaaaatatagcgcgcaaactaggataaattatcgcgcgcggtgtcatctatgttactagatcgggcctcctgtcaatgctggcggcggctctggtggtggttctggtggcggctctgagggtggtggctctgagggtggcggttctgagggtggcggctctgagggaggcggttccggtggtggctctggttccggtgattttgattatgaaaagatggcaaacgctaataagggggctatgaccgaaaatgccgatgaaaacgcgctacagtctgacgctaaaggcaaacttgattctgtcgctactgattacggtgctgctatcgatggtttcattggtgacgtttccggccttgctaatggtaatggtgctactggtgattttgctggctctaattcccaaatggctcaagtcggtgacggtgataattcacctttaatgaataatttccgtcaatatttaccttccctccctcaatcggttgaatgtcgcccttttgtctttggcccaatacgcaaaccgcctctccccgcgcgttggccgattcattaatgcagctggcacgacaggtttcccgactggaaagcgggcagtgagcgcaacgcaattaatgtgagttagctcactcattaggcaccccaggctttacactttatgcttccggctcgtatgttgtgtggaattgtgagcggataacaatttcacacagqaaacaqctatqaccatgattacqccaaqcttqcatqcctqcaqqgaqccataqatqcaattcaatcaaactqaaatttctqcaagaatctcaaacacqqaqatctcaaaqtttqaaaqaaaatttatttcttcqactcaaaacaaacttacqaaatttaqqtaqaacttatatacattatattgtaattttttqtaacaaaatgtttttattattattatagaattttactggttaaattaaaaatgaatagaaaaqgtgaattaagaggaqaqaqgaqqtaaacattttcttctattttttcatattttcaqqataaattattgtaaaaqtttacaagatttccatttgactagtgtaaatgaggaatattctctagtaaqatcattatttcatctacttcttttatcttctaccagtagaggaataaacaatatttagctcctttgtaaatacaaattaattttccttcttgacatcattcaattttaattttacgtataaaataaaagatcatacctattagaacgattaaggagaaatacaattcgaatgagaaggatgtgccgtttgttataataaacagccacacgacgtaaacgtaaaatgaccacatgatgqgccaatagacatggaccgactactaataatagtaagttacattttagqatggaataaatatcataccgacatcagttttgaaagaaaaggqaaaaaaagaaaaaataaataaaagatatactaccgacatgagttccaaaaaqcaaaaaaaaagatcaagccgacacagacacgcgtagagagcaaaatgactttgacgtcacaccacgaaaacagacgcttcatacgtgtccctttatctctctcagtctctctataaacttagtqaqaccctcctctgttttactcacaaatatgcaaactagaaaacaatcatcaggaataaagggtttgattacttctattggaaaqactctaqaggatcctcaaattgctgccactgtaatcttgctcttcctccatgcccaatagttagctcttataggatctacacgaccaagaatagtacacaccaaattggccaagttagtctctggttcttcattagctagagctctcactgagtctttatgctcgttggttggtctcagtccatcacatagaagatccaaaagggtgctcagagcgaatccatggaagcaatctgtgcgggatagaacattcaaacagactgaggaaacacttggatcactaatccaggattctttgtcgtctttgtaaagcgcttttaggtatcgccatgagctctcgtttgcaggattggttaaaatggctttgattgtgtagcttacttcagattctctcatggcttctaggcctcccaacaaaggagattgggtgatgacataatacctctgattccaggcggaattgttaaagacgtcagcttcaaggagctcgtgacagtaatcgagctcatcttcccatcctcctaatgcccgtagtgtccactgcctatgtgaccaagcatgataatgtttggcatcaagtgaaagtactctacgggtaaattcaagttctctccctgcaacatcaggacccagtttctctgcaacccatcgccgatgatgccacagttggtagttcttagagttatcctcagcaatgcgttcgatgaactcgagttcttcaaacaagtcgtgattaagggcctcgagtactaggcgcctgaaatgccacactgtgtagttgccggagtttaagaggagggtttcttc-

156

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SEQ ID NO:48 gtttacccgccaatatafccfcjtcaaacactgatagtttaaactgaaggcgggaaacgacaatctgatcatgagcggagaattaagggagtcacgttatgacccccgccgatga25 cgcgggacaagccgttttacgtttggaactgacagaaccgcaacgttgaaggagccactcagccgcgggtttctggagtttaatgagctaagcacatacgtcagaaaccattattgcgcgttcaaaagtcgcctaaggtcactatcagctagcaaatatttcttgtcaaaaatgctccactgacgttccataaattcccctcggtatccaattagagtctcatattcactctcaatccaaataatctgcaccggatctggatcgtttcgcatgattgaacaa30 gatggattgcacgcaggttctccggccgcttgggtggagaggctattcggctatgactgggcacaacagacaatcggctgctctgatgccgccgtgttccggctgtcagcgca_iZ ggggcgcccggttctttttgtcaagaccgacctgtccggtgccctgaatgaactgcaggacgaggcagcgcggctatcgtggctggccacgacgggcgttccttgcgcagctgtgctcgacgttgtcactgaagcgggaagggactggctgctattgggcgaagtgccggggcaggatctc35 ctgtcatctcaccttgctcctgccgagaaagtatccatcatggctgatgcaatgcggcggctgcatacgcttgatccggctacctgcccattcgaccaccaagcgaaacatcgcatcgagcgagcacgtactcggatggaagccggtcttgtcgatcaggatgatctggacgaagagcatcaggggctcgcgccagccgaactgttcgccaggctcaaggcgcgcatgcccgacggcgatgatctcgtcgtgacccatggcgatgcctgcttgccgaatatcatggtggaaaatggccgc40 ttttctggattcatcgactgtggccggctgggtgtggcggaccgctatcaggacatagcgttggctacccgtgatattgctgaagagcttggcggcgaatgggctgaccgcttcctcgtgctttacggtatcgccgctcccgattcgcagcgcatcgccttctatcgccttcttgacgagttcttctgagcgggactctggggttcgaaatgaccgaccaagcgacgcccaacctgccatcacgagatttcgattccaccgccgccttctatgaaaggttgggcttcggaa45 tcgttttccgggacgccggctggatgatcctccagcgcggggatctcatgctggagttcttcgcccacgggatctctgcggaacaggcggtcgaaggtgccgatatcattacgacagcaacggccgacaagcacaacgccacgatcctgagcgacaatatgatcgggcccggcgtccacatcaacggcgtcggcggcgactgcccaggcaagaccgagatgcaccgcgatatcttgctgcgttcggatattttcgtggagttcccgccacagacccggatgatccccgatcgttcaaa-

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GGCGATTAAAGAGCTGATAGCGCGTGACAAAAACCACCCAAGCGTGGTGATGTGGAGTATTGCCAACGAACCGGATACCCGTCCGCAAGGTGCACGGGAATATTTCGCGCCACTGGCGGAAGCAACGCGTAAACTCGACCCGACGCGTCCGATCACCTGCGTCAATGTAATGTTCTGCGACGCTCACACCGATACCATCAGCGATCTCTTTGATGTGCTGTGCCTGAACCGTTATTACGGATGGTATGTCCAAAGCGGCGATTTGGAAACGGCAGAGAAGGTACTGGAAAAAGAACTTCTGGCCTGGCAGGAGAAACTGTACACCGACATGTGGAGTGAAGAGTATCAGTGTGCATGGCTGGATATGTATCACCGCGTCTTTGATCGCGTCAGCGCCGTCGTCGGTGAACAGGTATGGAATTTCGCCGATTTTGCGACCTCGCAAGGCATATTGCGCGTTGGCGGTAACAAGAAAGGGATCTTCACTCGCGACCGCAAACCGAAGTCGGCGGCTTTTCTGCTGCAAAAACGCTGGACTGGCATGAACTTCGGTGAAAAACCGCAGCAGGGAGGCAAACAATGAATCAACAACTCTCCTGGCGCACCATCGTCGGCTACAGCCTCGGGAATTGCTACCGAGCTCGCTCTTCCTCCATGCCCAATAGTTAGCTCTTACAGGATCTACACGACCAAGAATAGTACACACCAAATTGGCCAAGTTAGTCTCTGGTTCTTCATTAGCTAGAGCTCTCACTGAGTCTTTATGCTCGTTGGTTGGTCTCAGTCCATCACATAGAAGATGCAAAAGGGTGCTCAGAGCGAATCCATGGAAGCAATCTGTGCGGGATAGAACATTCAAACAGACTGAGGAAACACTTGGATCACTAATCCAGGATTCTTTGTCGTCTTTGTAAAGAGCTTTTAGGTATCGCCATGAGCTCTCGTTTGCAGGATTGGTTAAAATGGCTTTGATTGTGTAGCTTACTTCAGATTCTCTCATGGCTTCTAGGCCTCCCAACAAAGGAGATTGGGTGATGACATAATACCTCTGATTCCAGGCGGAATTGTTAAAGACGTCAGCTTCAAGGAGCTCGTGACAGTAATCGAGCTCATCTTCCCATCCTCCTAATGCCCGctcgaatttccccgatcgttçaaacatttggcaataaagtttcttaagattgaatcctgttgccggtcttgcgatgattatcatataatttctgttgaattacgttaagcatgtaataattaacatgtaatgcatgacgttatttatgagatgggtttttatgattagagtcccgcaattatacatttaatacgcgatagaaaacaaaatatagcgcgcaaactaggataaattatcgcgcgcggtgtcatctatgttactagatcgggaattcactggccgtcgttttacaacgtcgtgactgggaaaaccctggcgttacccaacttaatcgccttgcagcacatccccctttcgccagctggcgtaatagcgaagaggcccgcaccgatcgcccttcccaacagttgcgcagcctgaatggcgcccgctcctttcgctttcttcccttcctttctcgccacgttcgccggctttccccgtcaagctctaaatcgggggctccctttagggttccgatttagtgctttacggcacctcgaccccaaaaaacttgatttgggtgatggttcacgtagtgggccatcgccctgatagacggtttttcgccctttgacgttggagtccacgttctttaatagtggactcttgttccaaactggaacaacactcaaccctatctcgggctattcttttgatttataagggattttgccgatttcggaaccaccatcaaacaggattttcgcctgctggggcaaaccagcgtggaccgcttgctgcaactctctcagggccaggcggtgaagggcaatcagctgttgcccgtctcactggtgaaaagaaaaaccaccccagtacattaaaaacgtccgcaatgtgttattaagttgtctaagcgtcaatttgtttacaccacaatatatcctgcca (Seqüência sublinhada: promotor 35S; negrito: seqüência AtFTA anti-sentido separada pela seq-GUS seq.))

159

SEQ ID NO:49 gíttacccgccaafataíccfgtcaaacactgatagtttaaactgaaggcgggaaacgacaatctgatcatgagcggagaattaagggagtcacgttatgacccccgccgatgacgcgggacaagccgttttacgtttggaactgacagaaccgcaacgttgaaggagccactcagccgcgggtttctggagtttaatgagctaagcacatacgtcagaaaccattattgcgcgttcaaaagtcgcctaaggtcactatcagctagcaaatatttcttgtcaaaaatgctccactgacgttccataaattcccctcggtatccaattagagtctcatattcactctcaatccaaataatctgcaccggatctggatcgtttcgcatgattgaacaagatggattgcacgcaggttctccggccgcttgggtggagaggctattcggctatgactgggcacaacagacaatcggctgctctgatgccgccgtgttccggctgtcagcgcaggggcgcccggttctttttgtcaagaccgacctgtccggtgccctgaatgaactgcaggacgaggcagcgcggctatcgtggctggccacgacgggcgttccttgcgcagctgtgctcgacgttgtcactgaagcgggaagggactggctgctattgggcgaagtgccggggcaggatctcctgtcatctcaccttgctcctgccgagaaagtatccatcatggctgatgcaatgcggcggctgcatacgcttgatccggctacctgcccattcgaccaccaagcgaaacatcgcatcgagcgagcacgtactcggatggaagccggtcttgtcgatcaggatgatctggacgaagagcatcaggggctcgcgccagccgaactgttcgccaggctcaaggcgcgcatgcccgacggcgatgatctcgtcgtgacccatggcgatgcctgcttgccgaatatcatggtggaaaatggccgcttttctggattcatcgactgtggccggctgggtgtggcggaccgctatcaggacatagcgttggctacccgtgatattgctgaagagcttggcggcgaatgggctgaccgcttcctcgtgctttacggtatcgccgctcccgattcgcagcgcatcgccttctatcgccttcttgacgagttcttctgagcgggactctggggttcgaaatgaccgaccaagcgacgcccaacctgccatcacgagatttcgattccaccgccgccttctatgaaaggttgggcttcggaatcgttttccgggacgccggctggatgatcctccagcgcggggatctcatgctggagttcttcgcccacgggatctctgcggaacaggcggtcgaaggtgccgatatcattacgacagcaacggccgacaagcacaacgccacgatcctgagcgacaatatgatcgggcccggcgtccacatcaacggcgtcggcggcgactgcccaggcaagaccgagatgcaccgcgatatcttgctgcgttcggatattttcgtggagttcccgccacagacccggatgatccccgatcgttcaaacatttggcaataaagtttcttaagattgaatcctgttgccggtcttgcgatgattatcatataatttctgttgaattacgttaagcatgtaataattaacatgtaatgcatgacgttatttatgagatgggtttttatgattagagtcccgcaattatacatttaatacgcgatagaaaacaaaatatagcgcgcaaactaggataaattatcgcgcgcggtgtcatctatgttactagatcgggcctcctgtcaatgctggcggcggctctggtggtggttctggtggcggctctgagggtggtggctctgagggtggcggttctgagggtggcggctctgagggaggcggttccggtggtggct^ctggtt^ccggtgattttgattatgaaaagatggcaaacgctaataagggggctatgaccgaaaatgccgatgaaaacgcgctacagtctgacgctaaaggcaaacttgattctgtcgctactgattacggtgctgctatcgatggtttcattggtgacgtttccggccttgctaatggtaatggtgctactggtgattttgctggctctaattcccaaatggctcaagtcggtgacggtgataattcacctttaatgaataatttccgtcaatatttaccttccctccctcaatcggttgaatgtcgcccttttgtctttggcccaatacgcaaaccgcctctccccgcgcgttggccgattcattaatgcagctggcacgacaggtttcccgactggaaagcgggcagtgagcgcaacgcaattaatgtgagttagctcactcattaggcaccccaggctttacactttatgcttccggctcgtatgttgtgtggaattgtgagcggataacaatttcacacaggaaacagctatqaccatgattacgccaagcttgcatgcctgcagggagccatagatgcaattcaatcaaactgaaatttctqcaagaatctcaaacacggagatctcaaagtttqaaaqaaaatttatttcttcqactcaaaacaaacttacqaaatttagqtagaacttatatacattatattgtaattttttgtaacaaaatgtttttattattattatagaattttactqqttaaattaaaaatqaatagaaaaggtgaattaagaggagagaqgaggtaaacattttcttctattttttcatattttcaggataaattattqtaaaagtttacaagatttccatttgac-

160

IL

tagtgtaaatgaggaatattctctagtaagatcattatttcatctacttcttttatcttctaccaqtaaaqqaataaacaatatttaqctcctttqtaaatacaaattaattttccttcttgacatcattcaattttaattttacqtataaaataaaaqatcatacctattagaacgattaagqaqaaatacaattcqaatgagaagqatgtgccqtttgttataataaacagccacacgacgtaaacqtaaaatgaccacatgatgggccaatacacatgqaccqactactaataatagtaagttacattttaggatqgaataaatatcataccqacatcagttttgaaagaaaagggaaaaaaagaaaaaataaataaaagatatactaccgacatgagttccaaaaaqcaaaaaaaaagatcaagccqacacagacacgcgtaqagagcaaaatgactttqacgtcacaccacgaaaacagacgcttcatacgtgtccctttatctctctcagtctctctataaacttagtgagaccctcctctgttttactcacaaatatqcaaactagaaaacaatcatcaggaataaaqqqtttgattacttctattggaaaggactctagaggatcctcGCTCTTCCTCCATGCCCAATAGTTAGCTCTTACAGGATCTACACGACCAAGAATAGTACACACCAAATTGGCCAAGTTAGTCTCTGGTTCTTCATTAGCTAGAGCTCTCACTGAGTCTTTATGCTCGTTGGTTGGTCTCAGTCCATCACATAGAAGATCCAAAAGGGTGCTCAGAGCGAATCCATGGAAGCAATCTGTGCGGGATAGAACATTCAAACAGACTGAGGAAACACTTGGATCACTAATCCAGGATTCTTTGTCGTCTTTGTAAAGAGCTTTTAGGTATCGCCATGAGCTCTCGTTTGCAGGATTGGTTAAAATGGCTTTGATTGTGTAGCTTACTTCAGATTCTCTCATGGCTTCTAGGCCTCCCAACAAAGGAGATTGGGTGATGACATAATACCTCTGATTCCAGGCGGAATTGTTAAAGACGTCAGCTTCAAGGAGCTCGTGACAGTAATCGAGCTCATCTTCCCATCCTCCTAATGCCCGgaggatccccATCTACCCGCTTCGCGTCGGCATCCGGTCAGTGGCAGTGAAGGGCGAACAGTTCCTGATTAACCACAAACCGTTCTACTTTACTGGCTTTGGTCGTCATGAAGATGCGGACTTGCGTGGCAAAGGATTCGATAACGTGCTGATGGTGCACGACCACGCATTAATGGACTGGATTGGGGCCAACTCCTACCGTACCTCGCATTACCCTTACGCTGAAGAGATGCTCGACTGGGCAGATGAACATGGCATCGTGGTGATTGATGAAACTGCTGCTGTCGGCTTTTCGCTCTCTTTAGGCATTGGTTTCGAAGCGGGCAACAAGCCGAAAGAACTGTACAGCGAAGAGGCAGTCAACGGGGAAACTCAGCAAGCGCACTTACAGGCGATTAAAGAGCTGATAGCGCGTGACAAAAACCACCCAAGCGTGGTGATGTGGAGTATTGCCAACGAACCGGATACCCGTCCGCAAGGTGCACGGGAATATTTCGCGCCACTGGCGGAAGCAACGCGTAAACTCGACCCGACGCGTCCGATCACCTGCGTCAATGTAATGTTCTGCGACGCTCACACCGATACCATCAGCGATCTCTTTGATGTGCTGTGCCTGAACCGTTATTACGGATGGTATGTCCAAAGCGGCGATTTGGAAACGGCAGAGAAGGTACTGGAAAAAGAACTTCTGGCCTGGCAGGAGAAACTGTACACCGACATGTGGAGTGAAGAGTATCAGTGTGCATGGCTGGATATGTATCACCGCGTCTTTGATCGCGTCAGCGCCGTCGTCGGTGAACAGGTATGGAATTTCGCCGATTTTGCGACCTCGCAAGGCATATTGCGCGTTGGCGGTAACAAGAAAGGGATCTTCACTCGCGACCGCAAACCGAAGTCGGCGGCTTTTCTGCTGCAAAAACGCTGGACTGGCATGAACTTCGGTGAAAAACCGCAGCAGGGAGGCAAACAATGAATCAACAACTCTCCTGGCGCACCATCGTCGGCTACAGCCTCGGGAATTGCTACCGAGCTCGCTCTTCCTCCATGCCCAATAGTTAGCTCTTACAGGATCTACACGACCAAGAATAGTACACACCAAATTGGCCAAGTTAGTCTCTGGTTCTTCATTAGCTAGAGCTCTCACTGAGTCTTTATGCTCGTTGGTTGGTCTCAGTCCATCACATAGAAGATCCAAAAGGGTGCTCAGAGCGAATCCATGGAAGCAATCTGTGCGGGATAGAA45

161

CATTCAAACAGACTGAGGAAACACTTGGATCACTAATCCAGGATTC-

TTTGTCGTCTTTGTAAAGAGCTTTTAGGTATCGCCATGAGCTCTCGTTTGCAGGATTGGTTAAAATGGCTTTGATTGTGTAGCTTACTTCAGATTCTCTCATGGCTTCTAGGCCTCCCAACAAAGGAGATTGGGTGATGACATAATACCTCTGATTCCAGGCGGAATTGTTAAAGACGTCAGCTTCAAGGAGCTCGTGACAGTAATCGAGCTCATCTTCCCATCCTCCTAATGCCCGctcgaatttccccgatcgttcaaacatttggcaataaagtttcttaagattgaatcctgttgccggtcttgcgatgattatcatataatttctgttgaattacgttaagcatgtaataattaacatgtaatgcatgacgttatttatgagatgggtttttatgattagagtcccgcaattatacatttaatacgcgatagaaaacaaaatatagcgcgcaaactaggataaattatcgcgcgcggtgtcatctatgttactagatcgggaattcactggccgtcgttttacaacgtcgtgactgggaaaaccctggcgttacccaacttaatcgccttgcagcacatccccctttcgccagctggcgtaatagcgaagaggcccgcaccgatcgcccttcccaacagttgcgcagcctgaatggcgcccgctcctttcgctttcttcccttcctttctcgccacgttcgccggctttccccgtcaagctctaaatcgggggctccctttagggttccgatttagtgctttacggcacctcgaccccaaaaaacttgatttgggtgatggttcacgtagtgggccatcgccctgatagacggtttttcgccctttgacgttggagtccacgttctttaatagtggactcttgttccaaactggaacaacactcaaccctatctcgggctattcttttgatttataagggattttgccgatttcggaaccaccatcaaacaggattttcgcctgctggggcaaaccagcgtggaccgcttgctgcaactctctcagggccaggcggtgaagggcaatcagctgttgcccgtctcactggtgaaaagaaaaaccaccccagtacattaaaaacgtccgcaatgtgttattaagttgtctaagcgtcaatttgtftacaccacaatatatcctgcca (Seqüência sublinhada: promotor RD29A; negrito: seqüência anti-sentido AtFTA, separada por seq. GUS)

SEQ ID NO:50 GAATTCAAATTTTTCGCCAGTTCTAAATATCCGGAAACCTCTTGGGATGCCATTGCCCATCTATCTGTAATTTATTGACGAAATAGACGAAAAGGAAGGTGGCTCCTATAAAGCACATCATTGCGATAACAGAAAGGCCATTGTTGAAGATACCTCTGCTGACATTGGTCCCCAAGTGGAAGCACCACCCCATGAGGAGCACCGTGGAGTAAGAAGACGTTCGAGCCACGTCGAAAAAGCAAGTGTGTTGATGTAGTATCTCCATTGACGTAAGGGATGACGCACAATCCAACTATCCATCGCAAGACCATTGCTCTATATAAGAAAGTTAATATCATTTCGAGTGGCCACGCTGAGCTCAGGAAGTCTGCTCTTGCGCCAAATCCAATAGTTGGTTCTAATTGGATCAACTTGTTTTAGGATAGAACAAATATTTCGTGCTATATTTAAATTTTGTTGTTCCCCTTTCTCATCATCATCTAAATCTTGTTTATCCATATCTGCGGTCTTTAAGGCGTCAATGGCATCTCTAATGTCTTCATTTGGTTGATAACCAAAGCATATAAGATCTAAAATAGTGCTAAGAGCAAACACGTAGTTGCTCTTAGTTCTCAAAATCTTTAAGCATACTGAAGAAACTTGAGGATCATTTACCCATGAAGTAGTTTCACCTTTATAAAGTCCTCGTAGATATCTCCACGAGCTTTCATTTTCAGGGTAGGCTATAATGGCTTCGATGGTGTAAAGCACTTCAGACTCTCTCATAGCTTTTAGGCCCCCCAAGAAAGGAGACCTTGTTATGACAAAATATCTCTGATTCCAAGCAGAATTGTTAAAAATGTCTTCTTTAAGTAGTTCTGTGCAATAATTAAGTTCATCTTCCCATCCTCCTAGTGTTTGAAGAGCCCACTGTCTATGAGACCATGCATGATAATGTTTGGCATCAACGGACAGTATCTTTTTGGTGAACTCGAGCTgagctcgaatttccccgatcgttcaaacatttggcaataaagtttcttaagattgaatcctgttgccggtcttgcgatgattatcata3^4’£ÍiéíÍÍ3^

162 taatttctgttgaattacgttaagcatgtaataattaacatgtaatgcatgacgttatttatgagatgggtttttatgattagagtcccgcaattatacatttaatacgcgatagaaaacaaaatatagcgcgcaaactaggataaattatcgcgcgcggtgtcatctatgttactagatcgggaattc (Promotor MuA sublinhado; negrito: Glicine Max anti-FTA; caso inferior: seq. NOS terminal

SEQ ID NO:51

GGAGCCATAGATGCAATTCAATCAAACTGAAATTTCTGCAAGAATCTCAAACACGGAGATCTCAAAGTTTGAAAGAAAATTTATTTCTTCGACTCAAAACAAACTTACGAAATTTAGGTAGAACTTATATACATTATATTGTAATTTTTTGTAACAAAATGTTTTTATTATTATTATAGAATTTTACTGGTTAAATTAAAAATGAATAGAAAAGGTGAATTAAGAGGAGAGAGGA-

TAAATTATTGTAAAAGTTTACAAGATTTCCATTTGACTAGTGTAAATGAGGAATATTCTCTAGTAAGATCATTATTTCATCTACTTCTTTTATCTTCTACCAGTAGAGGAATAAACAATATTTAGCTCCTTTGTAAATACAAATTAATTTTCCTTCTTGACATCATTCAATTTTAATTTTACGTATAAAATAAAAGATCATACCTATTAGAACGATTAAGGAGAAATACAATTCGAATGAGAAGGATGTGCCGTTTGTTATAATAAACAGCCACACGACGTAAACGTAAAATGACCACATGATGGGCCAATAGACATGGACCGACTACTAATAATAGTAAGTTACATTTTAGGATGGAATAAATATCATACCGACATCAGTTTTGAAAGAAAAGGGAAAAAAAGAAAAAATAAATAAAAGATATACTACCGACATGAGTTCCAAAAAGCAAAAAAAAAGATCAAGCCGACACAGACACGCGTAGAGAGCAAAATGACTTTGACGTCACACCACGAAAACAGACGCTTCATACGTGTCCCTTTATCTCTCTCAGTCTCTCTATAAACTTAGTGAGACCCTCCTCTGTTTTACTCACAAATATGCAAACTAGAAAACAATCATCAGGAATAAAGGGTTTGATTACTTCTATTGGAAAGAGGAAGTCTGCTCTTGCGCCAAATCCAATAGTTGGTTCTAATTGGATCAACTTGTTTTAGGATAGAACAAATATTTCGTGCTATATTTAAATTTTGTTGTTCCCCTTTCTCATCATCATCTAAATCTTGTTTATCCATATCTGCGGTCTTTAAGGCGTCAATGGCATCTCTAATGTCTTCATTTGGTTGATAACCAAAGCATATAAGATCTAAAATAGTGCTAAGAGCAAACACGTAGTTGCTCTTAGTTCTCAAAATCTTTAAGCATACTGAAGAAACTTGAGGATCATTTACCCATGAAGTAGTTTCACCTTTATAAAGTCCTCGTAGATATCTCCACGAGCTTTCATTTTCAGGGTAGGCTATAATGGCTTCGATGGTGTAAAGCACTTCAGACTCTCTCATAGCTTTTAGGCCCCCCAAGAAAGGAGACCTTGTTATGACAAAATATCTCTGATTCCAAGCAGAATTGTTAAAAATGTCTTCTTTAAGTAGTTCTGTGCAATAATTAAGTTCATCTTCCCATCCTCCTAGTGTTTGAAGAGCCCACTGTCTATGAGACCATGCATGATAATGTTTGGCATCAACGGACAGTATCTTTTTGGTGAACTCGAGCTgagctcgaatttccccgatcgttcaaacatttggcaataaagtttcttaagattgaatcctgttgccggtcttgcgatgattatcatataatttctgttgaattacgttaagcatgtaataattaacatgtaatgcatgacgttatttatgagatgggtttttatgattagagtcccgcaattatacatttaatacgcgatagaaaacaaaatatagcgcgcaaactaggataaattatcgcgcgcggtgtcatctatgttactagatcgggaattc (Promotor RD29A sublinhado; negrito; glycine Max anti-glicine Max FTA; caso inferior: seq NOS terminal)

O'

163

SEQ ID NO:52

GAATTCAAATTTTTCGCCAGTTCTAAATATCCGGAAACCTCTTGGGATGCCATTGCCCATCTATCTGTAATTTATTGACGAAATAGACGAAAAGGAAGGTGGCTCCTATAAAGCACATCATTGCGATAACAGAAAGGCCATTGTTGAAGATACCTCTGCTGACATTGGTCCCCAAGTGGAAGCACCACCCCATGAGGAGCACCGTGGAGTAAGAAGACGTTCGAGCCACGTCGAAAAAGCAAGTGTGTTGATGTAGTATCTCCATTGACGTAAGGGATGACGCACAATCCAACTATCCATCGCAAGACCATTGCTCTATATAAGAAAGTTAATATCATTTCGAGTGGCCACGCTGAGCTCAGGAAz

GTCTGCTCTTGCGCCAAATCCAATAGTTGGTTCTAATTGGATCAACTTGTTTTAGGATAGAACAAATATTTCGTGCTATATTTAAATTTTGTTGTTCCCCTTTCTCATCATCATCTAAATCTTGTTTATCCATATCTGCGGTCTTTAAGGCGTCAATGGCATCTCTAATGTCTTCATTTGGTTGATAACCAAAGCATATAAGATCTAAAATAGTGCTAAGAGCAAACACGTAGTTGCTCTTAGTTCTCAAAATCTTTAAGCATACTGAAGAAACTTGAGGATCATTTACCCATGAAGTAGTTTCACCTTTATAAAGTCCTCGTAGATATCTCCACGAGCTTTCATTTTCAGGGTAGGCTATAATGGCTTCGATGGTGTAAAGCACTTCAGACTCTCTCATAGCTTTTAGGCCCCCCAAGAAAGGAGACCTTGTTATGACAAAATATCTCTGATTCCAAGCAGAATTGTTAAAAATGTCTTCTTTAAGTAGTTCTGTGCAATAATTAAGTTCATCTTCCCATCCTCCTAGTGTTTGAAGAGCCCACTGTCTATGAGACCATGCATGATAATGTTTGGCATCAACGGACAGTATCTTTTTGGTGAACTCGAGCTTAAAGG7~GAA4C7~AC7TCA TGGGTAAA TGATCCTCAAGTTTCTTCAGTATGCTTAAAGATTTTGAGAACTAAGAGCAACTACGTGTTTGCTCTTAGCACTA TTTTAGA TCTTA TA TGCTTTGGTTATCAACCAAA TGAA GA CA TTA GA GA TGCCA TTGA CGCCTTAAA GA CCGCA GA TA TGGA TAAA CAAGA TTTA GA TGA TGA TGA GAAA GGGGAACAA CAAAA TTTAAA TA TA GCA CGAAA TA TTTG TTCTA TCCTAAAA CAAGTTGATCCAATTAGAACCAACTATTGGATTTGGCGCAAGAGCAGAC7TCCTgagctcgaatttccccgatcgttcaaacatttggcaataaagtttcttaagattgaatcctgttgccggtcttgcgatgattatcatataatttctgttgaattacgttaagcatgtaataattaacatgtaatgcatgacgttatttatgagatgggtttttatgattagagtcccgcaattatacatttaatacgcgatagaaaacaaaatatagcgcgcaaactaggataaattatcgcgcgcggtgtcatctatgttactagatcgggaattc (Sublinhado: seção Glicine max FTA anti-sentido; negrito: promotor Mua; itálico: seção de glycine max FTA de sentido; caso inferior: seq. NOS terminal)

SEQ ID NO:53 ggagccatagatgcaattcaatcaaactgaaatttctgcaagaatctcaaacacggagatctcaaagtttgaaagaaaatttatttcttcgactcaaaacaaacttacgaaatttaggtagaacttatatacattatattgtaattttttgtaacaaaatgtttttattattattatagaattttactggttaaattaaaaatgaatagaaaaggtgaattaagaggagagaggaggtaaacattttcttctattttttcatattttcaggataaattattgtaaaagtttacaagatttccatttgactagtgtaaatgaggaatattctctagtaagatcattatttcatctacttcttttatcttctaccagtagaggaataaacaatatttagctcctttgtaaatacaaattaattttccttcttgacatcattcaattttaattttacgtataaaataaaagatcatacctattagaacgattaaggagaaatacaattcgaatgagaaggatgtgccgtttgttataataaacagccacacgacgtaaacgtaaaatgaccacatgatgggccaatagacatggaccgactactaataatagtaagttacattttaggatggaataaatatcataccgacatca45

164

gttttgaaagaaaagggaaaaaaagaaaaaataaataaaagatatactaccgacatgagttccaaaaagcaaaaaaaaagatcaagccgacacagacacgcgtagagagcaaaatgactttgacgtcacaccacgaaaacagacgcttcatacgtgtccctttatctctctcagtctctctataaacttagtgagaccctcctctgttttactcacaaatatgcaaactagaaaacaatcatcaggaataaaqgatttqattacttctattqgaaaqAGGAAGTCTGCTCTTGCGCCAAATCCAATAGTTGGTTCTAATTGGATCAACTTGTTTTAGGATAGAACAAATATTTCGTGCTATATTTAAATTTTGTTGTTCCCCTTTCTCATCATCATCTAAATCTTGTTTATCCATATCTGCGGTCTTTAAGGCGTCAATGGCATCTCTAATGTCTTCATTTGGTTGATAACCAAAGCATATAAGATCTAAAATAGTGCTAAGAGCAAACACGTAGTTGCTCTTAGTTCTCAAAATCTTTAAGCATACTGAAGAAACTTGAGGATCATTTACCCATGAAGTAGTTTCACCTTTATAAAGTCCTCGTAGATATCTCCACGAGCTTTCATTTTCAGGGTAGGCTATAATGGCTTCGATGGTGTAAAGCACTTCAGACTCTCTCATAGCTTTTAGGCCCCCCAAGAAAGGAGACCTTGTTATGACAAAATATCTCTGATTCCAAGCAGAATTGTTAAAAATGTCTTCTTTAAGTAGTTCTGTGCAATAATTAAGTTCATCTTCCCATCCTCCTAGTGTTTGAAGAGCCCACTGTCTATGAGACCATGCATGATAATGTTTGGCATCAACGGACAGTATCTTTTTGGTGAACTCGAGCTTAAAGGTGAAACTACTTCATGGGTAAATGATCCTCAAGTTTCTTCAGTATGCTTAAAGATTTTGAGAACTAAGAGCAACTACGTGTTTGCTCTTAGCACTATTTTAGATCTTATATGCTTTGGTTATCAACCAAATGAAGACATTAGAGATGCCATTGACGCCTTAAAGACCGCAGATATGGATAAACAAGATTTAGATGATGATGAGAAAGGGGAACAACAAAATTTAAATATAGCACGAAATATTTGTTCTATCCTAAAACAAGTTGATCCAATTAGAACCAACTATTGGATTTGGCGCAAGAGCAGACTTCCTgagctcgaatttccccgatcgttcaaacatttggcaataaagtttcttaagattgaatcctgttgccggtcttgcgatgattatcatataatttctgttgaattacgttaagcatgtaataattaacatgtaatgcatgacgttatttatgagatgggtttttatgattagagtcccgcaattatacatttaatacgcgatagaaaacaaaatatagcgcgcaaactaggataaattatcgcgcgcggtgtcatctatgttactagatcgggaattc (Caso inferior em negrito: promotor RD 29A; caso inferior sublinhado: GMFTA; anti-sentido; caso superior: GM FTA de sentido; caso inferior: NOS terminal)

SEQ ID NO:54 gtttacccgccaatatatcctgtcaaacactgatagtttaaactgaaggcgggaaacgacaatctgatcatgagcggagaattaagggagtcacgttatgacccccgccgatgacgcgggacaagccgttttacgtttggaactgacagaaccgcaacgttgaaggagccactcagccgcgggtttctggagtttaatgagctaagcacatacgtcagaaaccattattgcgcgttcaaaagtcgcctaaggtcactatcagctagcaaatatttcttgtcaaaaatgctccactgacgttccataaattcccctcggtatccaattagagtctcatattcactctcaatccaaataatctgcaccggatctggatcgtttcgcatgattgaacaagatggattgcacgcaggttctccggccgcttgggtggagaggctattcggctatgactgggcacaacagacaatcggctgctctgatgccgccgtgttccggctgtcagcgcaggggcgcccggttctttttgtcaagaccgacctgtccggtgccctgaatgaactgcaggacgaggcagcgcggctatcgtggctggccacgacgggcgttccttgcgcagctgtgctcgacgttgtcactgaagcgggaagggactggctgctattgggcgaagtgccggggcaggatctcctgtcatctcaccttgctcctgccgagaaagtatccatcatggctgatgcaatgcggcggctgcatacgcttgatccggctacctgcccattcgaccaccaagcgaaacatcgcatcgagcgagcacgtactcggatggaagccggtcttgtcgatcaggatgatctggacgaagagcatcaggggctcgcgccagccgaactgttcgccaggctcaaggcgcgcatgcccgacggcga-

165

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u V •	166 tggatgatgaactcacccagggcctaggagattacatcttgagttgccaaacttatgaaggtggcattggaggggaacctggctccgaagctcacggtgggtatacctactgtggtttggctgctatgattttaatcaatgaggtcgaccgtttgaatttggattcattaatgaattgggctgtacatcgacaaggagtagaaatgggatttcaaggtaggacgaa-
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20	caacttaatcgccttgcagcacatccccctttcgccagctggcgtaatagcgaagaggcccgcaccgatcgcccttcccaacagttgcgcagcctgaatggcgcccgctcctttcgctttcttcccttcctttctcgccacgttcgccggctttccccgtcaagctctaaatcgggggctccctttagggttccgatttagtgctttacggcacctcgaccccaaaaaacttgatttgggtgatggttcacgtagtgggccatcgccctgatagacggtttttcgccctttgacgttggagtc-
25	cacgttctttaatagtggactcttgttccaaactggaacaacactcaaccctatctcgggctattcttttgatttataagggattttgccgatttcggaaccaccatcaaacaggattttcgcctgctggggcaaaccagcgtggaccgcttgctgcaactctctcagggccaggcggtgaagggcaatcagctgttgcccgtctcactggtgaaaagaaaaaccaccccagta-
•	cattaaaaacgtccgcaatgtgttattaagttgtctaagcgtcaatttgWacaccacaatatatcctgcca
30	(Sublinhado: promotor 35S anti-AtFTB) SEQ ID NO:55
	gfttacccgccaafafatcctgfcaaacactgatagtttaaactgaaggcgggaaacgacaatctgatcatgagcggagaattaagggagtcacgttatgacccccgccgatga-
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45	ctgtcatctcaccttgctcctgccgagaaagtatccatcatggctgatgcaatgcggcggctgcatacgcttgatccggctacctgcccattcgaccaccaagcgaaacatcgcatcgagcgagcacgtactcggatggaagccggtcttgtcgatcaggatgatctggacgaagagcatcaggggctcgcgccagccgaactgttcgccaggctcaaggcgcgcatgcccgacggcgatgatctcgtcgtgacccatggcgatgcctgcttgccgaatatcatggtggaaaatggccgc-

167

I

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168

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SEQ ID NO:56 gtttacccgccaatafatccfgfcaaacactgatagtttaaactgaaggcgggaaacga35 caatctgatcatgagcggagaattaagggagtcacgttatgacccccgccgatgacgcgggacaagccgttttacgtttggaactgacagaaccgcaacgttgaaggagccactcagccgcgggtttctggagtttaatgagctaagcacatacgtcagaaaccattattgcgcgttcaaaagtcgcctaaggtcactatcagctagcaaatatttcttgtcaaaaatgctccactgacgttccataaattcccctcggtatccaattagagtctca40 tattcactctcaatccaaataatctgcaccggatctggatcgtttcgcatgattgaacaagatggattgcacgcaggttctccggccgcttgggtggagaggctattcggctatgactgggcacaacagacaatcggctgctctgatgccgccgtgttccggctgtcagcgcaggggcgcccggttctttttgtcaagaccgacctgtccggtgccctgaatgaactgcaggacgaggcagcgcggctatcgtggctggccacgacgggcgttccttgcgcagctgtgctcga45 cgttgtcactgaagcgggaagggactggctgctattgggcgaagtgccggggcaggatctcctgtcatctcaccttgctcctgccgagaaagtatccatcatggctgatgcaatgcggcggctgcatacgcttgatccggctacctgcccattcgaccaccaagcgaaacatcgcatcgagcgagcacgtactcggatggaagccggtcttgtcgatcaggatgatctggacgaagagcatcaggggctcgcgccagccgaactgttcgccaggctcaaggcgcgcatgcccgacggcga169

tgatctcgtcgtgacccatggcgatgcctgcttgccgaatatcatggtggaaaatggccgcttttctggattcatcgactgtggccggctgggtgtggcggaccgctatcaggacatagcgttggctacccgtgatattgctgaagagcttggcggcgaatgggctgaccgcttcctcgtgctttacggtatcgccgctcccgattcgcagcgcatcgccttctatcgccttcttgacgagttcttctgagcgggactctggggttcgaaatgaccgaccaagcgacgcccaacctgccatcacgagatttcgattccaccgccgccttctatgaaaggttgggcttcggaatcgttttccgggacgccggctggatgatcctccagcgcggggatctcatgctggagttcttcgcccacgggatctctgcggaacaggcggtcgaaggtgccgatatcattacgacagcaacggccgacaagcacaacgccacgatcctgagcgacaatatgatcgggcccggcgtccacatcaacggcgtcggcggcgactgcccaggcaagaccgagatgcaccgcgatatcttgctgcgttcggatattttcgtggagttcccgccacagacccggatgatccccgatcgttcaaacatttggcaataaagtttcttaagattgaatcctgttgccggtcttgcgatgattatcatataatttctgttgaattacgttaagcatgtaataattaacatgtaatgcatgacgttatttatgagatgggtttttatgattagagtcccgcaattatacatttaatacgcgatagaaaacaaaatatagcgcgcaaactaggataaattatcgcgcgcggtgtcatctatgttactagatcgggcctcctgtcaatgctggcggcggctctggtggtggttctggtggcggctctgagggtggtggctctgagggtggcggttctgagggtggcggctctgagggaggcggttccggtggtggetetggttGGggtgattttgattatgaaaagatggeaaaegctaataagggggctatgaccgaaaatgc^cgatgaaaacgcgctacagtctgacgctaaaggcaaacttgattctgtcgctactgattacggtgctgctatcgatggtttcattggtgacgtttccggccttgctaatggtaatggtgctactggtgattttgctggctctaattcccaaatggctcaagtcggtgacggtgataattcacctttaatgaataatttccgtcaatatttaccttccctccctcaatcggttgaatgtcgcccttttgtctttggcccaatacgcaaaccgcctctccccgcgcgttggccgattcattaatgcagctggcacgacaggtttcccgactggaaagcgggcagtgagcgcaacgcaattaatgtgagttagctcactcattaggcaccccaggctttacactttatgcttccggctcgtatgttgtgtggaattgtgagcggataacaatttcacacaggaaacaQCtatqaccatqattacgccaaqcttqcatgcctgcaqcccacaqatqqttaqaqaqqcttacgcaqcaggtctcatcaagacqatctacccqaqcaataatctccaqqaaatcaaataccttcccaaqaaggttaaaqatqcagtcaaaaqattcaggactaactqcatcaagaacacaqaqaaaqatatatttctcaagatcaqaaqtactattccagtatgqacqattcaaqgcttgcttcacaaaccaaqgcaagtaatagagattggagtctctaaaaaqgtaqttcccactgaatcaaaggccatggagtcaaagattcaaatagaggacctaacaqaactcgccgtaaaqactggcgaacagttcatacagagtctcttacqactcaatgacaagaagaaaatcttcgtcaacatqqtggagcacgacacacttgtctactccaaaaatatcaaaqatacagtctcaqaagaccaaagggcaattgagacttttcaacaaagqgtaatatccggaaacctcctcqqattccattgcccaqctatctgtcactttattgtgaagataqtgqaaaaqgaaggtggctcctacaaatgccatcattgcqataaaqgaaaggccatcgttgaaqatgcctctgccgacagtgqtcccaaagatqqacccccacccacgaggaqcatcgtqgaaaaaqaagacgttccaaccacgtcttcaaagcaaqtqgattgatgtgatatctccactgacgtaagggatgacgcacaatcccactatccttcgcaagacccttcctctatataaqgaagttcatttcatttqgagagaacacgggggactctagaggatcctcCTCCTAGGCCCTGGGTGAGTTCATCATCCATAATATTTAGGATGCTTGCAACCGAAATTGCAGTGTAGCATGCACGAACATCCATTTCTCCCATATCATGCATCCTGAAACCTCCACTTGTATCCTTCATCCGTCTTAAAAAACAAGACATTTTTTCTCTATTAATTGAAGAAAGGGCTTTGTCACCTCCTAAAGTAACAAGTGCATTCACTGCAGCATAAGTAGTTGCAAGATGTGGAAGTTGGCCAGGACCACCACCGTATCCACCTTCAGAGCCCTGGCAGCGTCCAAGGAAGTCAATGGCATTGCTTTCTAATTCATCATCCACAGTCTCCCCAAGCAAAGCTATTGAATGAAGAATCCAGTAACAAAGC45

170

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171

tcagctgttgcccgtctcactggtgaaaagaaaaaccaccccagtacattaaaaacgtccgcaatgtgttattaagttgtctaagcgtcaatttgtftacaccacaatatatcctgcca (Sublinhado: promotor 35S; caso superior: AtFTB anti-sentido; negrito caso inferior; AtFTB sentido)

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172

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173

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SEQ ID ΝΟ.Ό1

GAATTCAAATTTTTCGCCAGTTCTAAATATCCGGAAACCTCTTGGGATGCCATTGCCCATCTATCTGTAATTTATTGACGAAATAGACGAAAA30 GGAAGGTGGCTCCTATAAAGCACATCATTGCGATAACAGAAAGGCCATTGTTGAAGATACCTCTGCTGACATTGGTCCCCAAGTGGAAGCACx CACCCCATGAGGAGCACCGTGGAGTAAGAAGACGTTCGAGCCAX 7 CGTCGAAAAAGCAAGTGTGTTGATGTAGTATCTCCATTGACGTAAGGGATGACGCACAATCCAACTATCCATCGCAAGACCATTGCTCTATA35 TAAGAAAGTTAATATCATTTCGAGTGGCCACGCTGAGCTCGTGGTGGA^ gaatctgggtgctttgaccaactatactggcacaatgagagtccacttaaacagtaacatgtgtgataatgatctctacgtttacccggtttgtctctcagtccaccctcttgctcctgtgcacataagagaatatattgctgtaaagcaatactgtgaaaaagtggttcttgtgctctccactcattaa40 TAAATTTATAGGCAATATTTTTAAAATCAGATGAACTGGATTCACTGGTGCCTTCATGCTCACCACGGCATGTTGCATGACTAGAGGTTCCATCCAAACTTTCTTTTGCTTCAGATACATAAGATACCGCAAAAATCTGTGATGTCTCTTCCATCTGTTTGTTGATAATAGAAGATAATCTTTGCAATAGAGCAACAGCACCTCCCTGCCAAAAGGAATAGCATCCATCCACCA45 GTTTATTTGTTCTCCCCTGGAATCCACATTCCTTACCTTGTCGGAATACCACCCAGTCAACTAATCGAGGCAGATCCAAGTGATTAACCTCACCAATCAGAATCATTGTAGCTAATCCACAAAAGGTGTACCCACCATGAGCCTCAGAACCAGGCTCACCAGCAATGCCACCCTCATATGTTTGACAGCTTATAATGTAGTCTCCAACATTCTGGATCAGCTCATCATCCAAAA-

TGTTCAAAACACTTGCAACAGAAATGGCAGTGTAGCAAGCTCGAACA- X TCAATTTCACCTTCATCATGCATCCTGAATCCACCATTTGGTTGCTTCATCCGCCGCAGAAACCCATACAGTTTATCTCTATTAATTGATGCCAGGGATTTCTCACCACCCAAAGTAATAAGTGAATTAACAGCAGCATAAGTTGTGGCAATATGAGGCATCTGGCCTGGTCCCCCGGCATATCCACCATTCGGATCCTGGCAACGGTTAAGAAAATCGATAGCGTTATCTTCGAGTTCATCATCGACGGATTCTCCCAACAAAGCAATGGAGTGGAAGATCCAGTAGCAGAGCCAGGGTCGATTAGCGTCCAAAACGGAAAATGCGGAACTGAGATGGCGAAGGCCTTTGGAGACATACTGCATGTGATTATCGCGTTGAAGCTCCAACATGAGGGTTTGGGCGTTGCGAGGAATGGTGGCGGTGAGGTTAATCACTTGGATCTGCCTCGATTAGTTGACTGGGTGGTATTCCGACAAGGTAAGGAATGTGGATTCCAGGGGAGAACAAATAAACTGGTGGATGGATGCTATTCCTTTTGGCAGGGAGGTGCTGTTGCTCTATTGCAAAGATTATCTTCTATTATCAA-

CAAACAGATGGAAGAGACATCACAGATTTTTGCGGTATCTTATGTATCTGAAGCAAAAGAAAGTTTGGATGGAACCTCTAGTCATGCAACATGCCGTGGTGAGCATGAAGGCACCAGTGAATCCAGTTCATCTGATTTTAAAAATATTGCCTATAAATTTATTAATGAGTGGAGAGCACAAGAACCACTTTTTCACAGTATTGCTTTACAGCAATATATTCTCTTATGTGCACAGGAGCAAGAGGGTGGACTGAGAGACAAACCGGGTAAACGTAGAGATCATTATCACACATGTTACTGTTTAAGTGGACTCTCATTGTGCCAGTATAGTTGGTCAAAGCACCCAGATTCTCCACCACgagctcgaatttccccgatcgttcaaacatttggcaataaagtttcttaagattgaatcctgttgccggtcttgcgatgattatcatataatttctgttgaattacgttaagcatgtaataattaacatgtaatgcatgacgttatttatgagatgggtttttatgattagagtcccgcaattatacatttaatacgcgatagaaaacaaaatatagcgcgcaaactaggataaattatcgcgcgcggtgtcatctatgttactagatcgggaattc (Caso superior: promotor RD29A, sublinhado: GmFTB anti-sentido; negrito: GMFTB sentido; caso inferior: NOS terminal)

SEQ ID NO:62 i?« GGAGCCATAGATGCAATTCAATCAAACTGAAATTTCTGCAAGAATCTCAAACACGGAGATCTCAAAGTTTGAAAGAAAATTTATTTCTTCGACTCAAAACAAACTTACGAAATTTAGGTAGAACTTATATACATTA35 TATTGTAATTTTTTGTAACAAAATGTTTTTATTATTATTATAGAATTTTACTGGTTAAATTAAAAATGAATAGAAAAGGTGAATTAAGAGGAGAGAGGAGGTAAACATTTTCTTCTATTTTTTCATATTTTCAGGATAAATTATTGTAAAAGTTTACAAGATTTCCATTTGACTAGTGTAAATGAGGAATATTCTCTAGTAAGATCATTATTTCATCTACTTCTTTTATCTTC40 TACCAGTAGAGGAATAAACAATATTTAGCTCCTTTGTAAATACAAATTAATTTTCCTTCTTGACATCATTCAATTTTAATTTTACGTATAAAATAAAAGATCATACCTATTAGAACGATTAAGGAGAAATACAATTCGAATGAGAAGGATGTGCCGTTTGTTATAATAAACAGCCACACGACGTAAACGTAAAATGACCACATGATGGGCCAATAGACATGGACCGACTACTAA45 TAATAGTAAGTTACATTTTAGGATGGAATAAATATCATACCGACATCAGTTTTGAAAGAAAAGGGAAAAAAAGAAAAAATAAATAAAAGATATACTACCGACATGAGTTCCAAAAAGCAAAAAAAAAGATCAAGCCGACACAGACACGCGTAGAGAGCAAAATGACTTTGACGTCACACCACGAAAACAGACGCTTCATACGTGTCCCTTTATCTCTCTCAGTCTCTCTATAAACTTA-

179

GTGAGACCCTCCTCTGTTTTACTCACAAATATGCAAACTAGAAAACAATCATCAGGAATAAAGGGTTTGATTACTTCTATTGGAAAGGTGGTGGAz

GAATCTGGGTGCTTTGACCAACTATACTGGCACAATGAGAGTCCACTTAAACAGTAACATGTGTGATAATGATCTCTACGTTTACCCGGTTTGTCTCTCAGTCCACCCTCTTGCTCCTGTGCACATAAGAGAATATATTGCTGTAAAGCAATACTGTGAAAAAGTGGTTCTTGTGCTCTCCACTCATTAATAAATTTATAGGCAATATTTTTAAAATCAGATGAACTGGATTCACTGGTGCCTTCATGCTCACCACGGCATGTTGCATGACTAGAGGTTCCATCCAAACTTTCTTTTGCTTCAGATACATAAGATACCGCAAAAATCTGTGATGTCTCTTCCATCTGTTTGTTGATAATAGAAGATAATCTTTGCAATAGAGCAACAGCACCTCCCTGCCAAAAGGAATAGCATCCATCCACCAGTTTATTTGTTCTCCCCTGGAATCCACATTCCTTACCTTGTCGGAATACCACCCAGTCAACTAATCGAGGCAGATCCAAGTGATTAACCTCACCAATCAGAATCATTGTAGCTAATCCACAAAAGGTGTACCCACCATGAGCCTCAGAACCAGGCTCACCAGCAATGCCACCCTCATATGTTTGACAGCTTATAATGTAGTCTCCAACATTCTGGATCAGCTCATCATCCAAAATGTTCAAAACACTTGCAACAGAAATGGCAGTGTAGCAAGCTCGAACATCAATTTCACCTTCATCATGCATCCTGAATCCACCATTTGGTTGCTTCATCCGCCGCAGAAACCCATACAGTTTATCTCTATTAATTGATGCCAGGGATTTCTCACCACCCAAAGTAATAAGTGAATTAACAGCAGCATAAGTTGTGGCAATATGAGGCATCTGGCCTGGTCCCCCGGCATATCCACCATTCGGATCCTGGCAACGGTTAAGAAAATCGATAGCGTTATCTTCGAGTTCATCATCGACGGATTCTCCCAACAAAGCAATGGAGTGGAAGATCCAGTAGCAGAGCCAGGGTCGATTAGCGTCCAAAACGGAAAATGCGGAACTGAGATGGCGAAGGCCTTTGGAGACATACTGCATGTGATTATCGCGTTGAAGCTCCAACATGAGGGTTTGGGCGTTGCGAGGAATGGTGGÇGGTGAGGTTAATCACTTGGATCTGCCTCGATTAGTTGACTGGGTGGTATTCCGACAAGGTAAGGAATGTGGATTCCAGGGGAGAACAAATAAACTGGTGGATGGATGCTATTCCTTTTGGCAGGGAGGTGCTGTTGCTCTATTGCAAAGATTATCTTCTATTATCAACAAACAGATGGAAGAGACATCACAGATTTTTGCGGTATCTTATGTATCTGAAGCAAAAGAAAGTTTGGATGGAACCTCTAGTCATGCAACATGCCGTGGTGAGCATGAAGGCACCAGTGAATCCAGTTCATCTGATTTTAAAAATATTGCCTATAAATTTATTAATGAGTGGAGAGCACAAGAACCACTTTTTCACAGTATTGCTTTACAGCAATATATTCTCTTATGTGCACAGGAGCAAGAGGGTGGACTGAGAGACAAACCGGGTAAACGTAGAGATCATTATCACACATGTTACTGTTTAAGTGGACTCTCATTGTGCCAGTATAGTTGGTCAAAGCACCCAGATTCTCCACCACgagctcgaatttccccgatcgttcaaacatttggcaataaagtttcttaagattgaatcctgttgccggtcttgcgatgattatcatataatttctgttgaattacgttaagcatgtaataattaacatgtaatgcatgacgttatttatgagatgggtttttatgattagagtcccgcaattatacatttaatacgcgatagaaaacaaaatatagcgcgcaaactaggataaattatcgcgcgcggtgtcatctatgttactagatcgggaattc (Upper Case: RD29A Promoter; Underlined: Antisense GmFTB; Bold: Sense GmFTB; Lower case: NOS terminater)

SEQ ID NO:63

GAATTCAAATTTTTCGCCAGTTCTAAATATCCGGAAACCTCTTGGGATGCCATTGCCCATCTATCTGTAATTTATTGACGAAATAGACGAAAA45

180

GGAAGGTGGCTCCTATAAAGCACATCATTGCGATAACAGAAAGGCCATTGTTGAAGATACCTCTGCTGACATTGGTCCCCAAGTGGAAGCACCACCCCATGAGGAGCACCGTGGAGTAAGAAGACGTTCGAGCCACGTCGAAAAAGCAAGTGTGTTGATGTAGTATCTCCATTGACGTAAGGGATGACGCACAATCCAACTATCCATCGCAAGACCATTGCTCTATATAAGAAAGTTAATATCATTTCGAGTGGCCACGCTGAGCTCGGA: TGGATTGGCTCCAGCAAATTAGAGTACGGTCCAAGCACATGCTGAGGTAATGGGCACGAACCAGTATCAGTCATGGCACTGTACTGGCTAACTGCGAGGCCACTGAGGCAGTAGCATGAATGATAGTGATCTCTGTTCTTTCCAGGCTTATCCCTCAAGCCTCCCTCTAGTACCTGAGAACAAAGTAGGATGTATTGTTGCAGGGCAATGTTATGGAAGAGTGGGCCAATTTGGTTGCTCTGTTGTATAAAATCAAATCCAAACTTCGCATAGTCCACAGCAGAGGAAGACTTATTCGCGGTGCACCCATATGAACTGGTGCTGCAGGCATCCTCTCCTGATGGCCTTTTGCAGGAATACGAGGACCTCAATTGCTTATCAACAATCGTAATTAACTTTTGTGTGAAAGCAATGGCAGCTCCCTGCCAAAAGGAGTAGCAACCATCAACCAATTTATTAGTTCGTCCTTGAAATCCGCATTCCACTCCTTGACGAAAAGCCACCCAGCCAATCAAACTAGGCAAGTCAACTTTCTCTGCCTCATTAAGCAGGATCAAAGCAGCCAATCCACAGAATGTATACCCACCATGTGCTTCAGCATAAGGCTCCCCAGCAATACCACCTTCATAAGTTTGACATCTTGCTATGTAGTCGCCTACACCTTTTGCCAGTTTAAAATCAAGAATATTCACAAGGCTGGCAACCGATATAGCGGTGTAGGAAGCACGGACATCAATTTCGCCACCATCATGCATTCTGAAAGCACCTGATACATCTTTCATCTGCAGCATAAAATTGTACAGGTTGCCCCTATTGATTGATGACAATGCTCTTTCGCTCCCTATTGTCACAAGTGTATTTACAGCAGCATAAGTCGTAGCTAGGTGAGGCAACTGTCCAGGTCCACCACTATATCCACCATCTTTATCCTGACATCGAGCTAAGAAGTCTATGATATCATTCTCAAGATCATCATCAAGTGCTTCATCCAGCAAAGCAAGTGGATGAACCATCCAGTAGCATAGCCAAGGGCGATTGGCATCTAGAACATGAAAGGCTGGTCCCATATGCCTCAGCCCAGGCGTCAGATACTCGATATGCTGATCACGCCACAGCTCTAGCATGATGGATTTCGTGTTGGGCGCGGCCCCGAAGAGGGAGCGGTAGATGTCGCCAACCCTGGCCTCCACCTTCATCTGCTCCACCTGCGTCACCGTGAGCCTCGGTAGGTCGGGATCCGCCgagctcgaatttccccgatcqttcaaacatttggcaataaagtttcttaagattgaatcctgttgccggtcttgcgatgattatcatataatttctgttgaattacgttaagcatgtaataattaacatgtaatgcatgacgttatttatgagatgggtttttatgattagagtcccgcaattatacatttaatacgcgatagaaaacaaaatatagcgcgcaaactaggataaattatcgcgcgcggtgtcatctatgttactagatcgggaattc (Caso superior: Promotos MuA; sublinhado: milho Zea FTB anti-sentido; caso inferior: NOS terminal)

SEQ ID NO:64

GAATTCAAATTTTTCGCCAGTTCTAAATATCCGGAAACCTCTTGGGATGCCATTGCCCATCTATCTGTAATTTATTGACGAAATAGACGAAAAGGAAGGTGGCTCCTATAAAGCACATCATTGCGATAACAGAAAGGC45 CATTGTTGAAGATACCTCTGCTGACATTGGTCCCCAAGTGGAAGCACCACCCCATGAGGAGCACCGTGGAGTAAGAAGACGTTCGAGCCA» ^4* 1 o , l^·^· k «(>·*»» -J—S _ -./ _aZ -,afer^»^ £ _ j 4* 4-.,-..1^2 —/« arrUAl -fcJSÃjSS ^'j.]

181

CGTCGAAAAAGCAAGTGTGTTGATGTAGTATCTCCATTGACGTAAGGGATGACGCACAATCCAACTATCCATCGCAAGACCATTGCTCTATATAAGAAAGTTAATATCATTTCGAGTGGCCACGCTGAGCTCGGA^ TGGATTGGCTCCAGCAAATTAGAGTACGGTCCAAGCACATGCTGAGGTAATGGGCACGAACCAGTATCAGTCATGGCACTGTACTGGCTAACTGCGAGGCCACTGAGGCAGTAGCATGAATGATAGTGATCTCTGTTCTTTCCAGGCTTATCCCTCAAGCCTCCCTCTAGTACCTGAGAACAAAGTAGGATGTATTGTTGCAGGGCAATGTTATGGAAGAGTGGGCCAATTTGGTTGCTCTGTTGTATAAAATCAAATCCAAACTTCGCATAGTCCACAGCAGAGGAAGACTTATTCGCGGTGCACCCATATGAACTGGTGCTGCAGGCATCCTCTCCTGATGGCCTTTTGCAGGAATACGAGGACCTCAATTGCTTATCAACAATCGTAATTAACTTTTGTGTGAAAGCAATGGCAGCTCCCTGCCAAAAGGAGTAGCAACCATCAACCAATTTATTAGTTCGTCCTTGAAATCCGCATTCCACTCCTTGACGAAAAGCCACCCAGCCAATCAAACTAGGCAAGTCAACTTTCTCTGCCTCATTAAGCAGGATCAAAGCAGCCAATCCACAGAATGTATACCCACCATGTGCTTCAGCATAAGGCTCCCCAGCAATACCACCTTCATAAGTTTGACATCTTGCTATGTAGTCGCCTACACCTTTTGCCAGTTTAAAATCAAGAATATTCACAAGGCTGGCAACCGATATAGCGGTGTAGGAAGCACGGACATCAATTTCGCCACCATCATGCATTCTGAAAGCACCTGATACATCTTTCATCTGCAGCATAAAATTGTACAGGTTGCCCCTATTGATTGATGACAATGCTCTTTCGCTCCCTATTGTCACAAGTGTATTTACAGCAGCATAAGTCGTAGCTAGGTGAGGCAACTGTCCAGGTCCACCACTATATCCACCATCTTTATCCTGACATCGAGCTAAGAAGTCTATGATATCATTCTCAAGATCATCATCAAGTGCTTCATCCAGCAAAGCAAGTGGATGAACCATCCAGTAGCATAGCCAAGGGCGATTGGCATCTAGAACATGAAAGGCTGGTCCCATATGCCTCAGCCCAGGCGTCAGATACTCGATATGCTGATCACGCCACAGCTCTAGCATGATGGATTTCGTGTTGGGCGCGGCCCCGAAGAGGGAGCGGTAGATGTCGCCAACCCTGGCCTCCACCTTCATCTGCTCCACCTGCGTCACCGTGAGCCTCGGTAGGTCGGGATCCGCCqqatccGCTGGGGAGCCTTA-

TGCTGAAGCACATGGTGGGTATACATTCTGTGGATTGGCTGCTTTGA30

182

CATTGCTTTCACACAAAAGTTAATTACGATTGTTGATAAGCAATTGA5 GGTCCTCGTATTCCTGCAAAAGGCCATCAGGAGAGGATGCCTGCAGCACCAGTTCATATGGGTGCACCGCGAATAAGTCTTCCTCTGCTGTGGACTATGCGAAGTTTGGATTTGATTTTATACAACAGAGCAACCAAATTGGCCCACTCTTCCATAACATTGCCCTGCAACAATACATCCTACTTTGTTCTCAGGTACTAGAGGGAGGCTTGAGGGATAAGCC- 10 TGGAAAGAACAGAGATCACTATCATTCATGCTACTGCCTCAGTGGCCIL M

W TCGCAGTTAGCCAGTACAGTGCCATGACTGATACTGGTTCGTGCCCATTACCTCAGCATGTGCTTGGACCGTACTCTAATTTGCTGGAGCCAATCCATCCaagcttgaatttccccgatcgttcaaacatttggcaataaagtttcttaagattgaatcctgttgccggtcttgcgatgattatcatataatttctgttgaattacgttaa15 gcatgtaataattaacatgtaatgcatgacgttatttatgagatgggtttttatgattagagtcccgcaattatacatttaatacgcgatagaaaacaaaatatagcgcgcaaactaggataaattatcgcgcgcggtgtcatctatgttactagatcggaagctt (Caso superior: Promotor MuA; Sublinhado: FTB de milho Zea Anti-sentido;

* Negrito: FTB de milho Zea no sentido; caso inferior: terminador de NOS)

Exemplo 15: Análise da PCR de Supostas Plantas Transgênicas

Para verificar que as supostas plantas transgênicas carregavam ^? o gene de interesse, foi realizada a análise da PCR. O DNA genômico foi isolado e a PCR foi corrida de acordo com protocolos e condições padronizados que são conhecidos pelo versado na técnica. Uma reação típica foi 25 realizada em um volume de 25 μΙ_ e os pares de iniciadores utilizados eram dependentes da combinação do gene e do promotor do constructo particular (Tabela 12).

As supostas plantas transgênicas de Brassica napus foram verificadas utilizando as combinações de iniciadores detalhadas na tabela abai30 xo. Um gel representativo que exibe os resultados da análise da PCR é mostrado na Figura 24 que representa plantas transgênicas que carregam o constructo pRD29A-anti-FTA. Os transformantes foram confirmados de uma

183

maneira análoga para cada espécie e transformação de constructo feita.

Tabela 12.

Nome do constructo	Nome do Iniciador	Seqüência do Iniciador (5'-3’)
35S-antiFTA	SEQ ID N2: 16	GCCGACAGTGGTCCCAAAGATGG
	SEQID N2: 17	AAAGGATCCTCAAATTGCTGCCACTGTAAT
rd29A-antiFTA	SEQ ID N2: 18	AAACCCGGGATGAATTTCGACGAGAACGTG
	SEQ ID N2: 19	GCAAGACCGGCAACAGGA
rd29B-antiFTA	SEQ ID N2: 20	TTTAAGCTTGACAGAAACAGTCAGCGAGAC
	SEQ ID N2: 17	AAACCCGGGATGAATTTCGACGAGAACGTG
35S-DA-FTA	SEQ ID N2: 21	GCTCTTCCTCCATGCCCA
	SEQ ID N2: 19	GCAAGACCGGCAACAGGA
rd29A-DA-FTA	SEQ ID N2: 22	TTTAAGCTTGGAGCCATAGATGCAATTCAA
	SEQ ID N2: 23	CGGGCATTAGGAGGATGGGAA
35S-HP-FTB	SEQ ID N2: 16	GCCGACAGTGGTCCCAAAGATGG
	SEQ ID N2: 24	GTCCGGAATTCCCGGGTC
rd29A-HP-FTB	SEQ ID N2: 22	TTTAAGCTTGGAGCCATAGATGCAATTCAA
	SEQ ID N2: 24	GTCCGGAATTCCCGGGTC

Exemplo 16: Análise de Southern

Análise de Southern genômico de anti-FTA de Arabidopsis thaliana transgênica. Os números indicam os números das linhagens. Cinco microgramas de DNA genômico de plantas T1 foram digeridos com H/ndlll (um sítio único no plasmídeo do T-DNA) e separados em um gel de agarose a 0,8%. A região que codifica NPTII foi utilizada como a sonda para a marcação radioativa. A Figura 11 mostra um resultado típico da análise de Southern indicando a presença do transgene.

Exemplo 17: Northern blots de linhagens FTA anti-sentido

O RNA foi isolado do tecido foliar em desenvolvimento de cinco linhagens de Arabidopsis thaliana 35S-anti-FTA (plantas T3). O blot foi primeiro submetido à sonda do produto da transcrição do FTA sentido de filamento simples marcado com P³² (Figura 3 painel A) que detecta o produto da transcrição anti-sentido, então lavado e submetido novamente à sonda com o produto da transcrição do FTA anti-sentido de filamento simples (Figu15

184 ra 12 painel B) que detecta o produto da transcrição sentido. A Figura 3 painel C mostra o gel corado com brometo de etídio para o blot. Aproximadamente 5 pg do RNA total foram carregados em cada faixa. A Figura 3 indica

o acúmulo do produto da transcrição anti-sentido do transgene e uma redu5 ção no produto da transcrição sentido nas plantas transgênicas.

Exemplo 18: Western blot de linhagens FTA anti-sentido com anticorpos Anti-FT-a.

Os anticorpos produzidos de acordo com os métodos do Exem-

plo 27 foram utilizados para analisar os extratos de proteínas de plantas transgênicas em western blots. A faixa 1 da Figura 13 é um padrão de peso molecular, a faixa 2 é a proteína FTA purificada, as faixas 3-10 são extratos de proteínas do mutante para ERA1, do tipo selvagem e 4 faixas da Arabidopsis thaliana transgênica. A Figura 13 ilustra a redução da proteína FTA que pode ser detectada nas linhagens transgênicas.

Exemplo 19: Sensibilidade ao ABA das plantas novas transgênicas.

Sementes de Columbia do tipo selvagem, era1-2 e sementes homozigotas T3 de duas linhagens tolerantes à seca anti-sentido de 35Santi-sentido-FTA foram plaqueadas em meio mínimo (1/2 MS) suplementado sem ABA (A), 0,3 μΜ (B), 0,5 μΜ (C) ou 1,0 μΜ de ABA (D). As placas foram 20 resfriadas durante 3 dias a 4°C na escuridão e incubadas durante 11 dias a

22°C com 24 horas de luz contínua. As linhagens era1 e transgênicas eram mais inibidas na germinação que as plantas do tipo selvagem. Os resultados são mostrados na Figura 14.

Fenótipos das plantas novas de doze dias de idade de Columbia do tipo selvagem, era1-2 e duas linhagens 35S-anti-sentido-FTA tolerantes à seca (9.9 & 21.2) em meio mínimo sem (A) ou com (B) 1 μΜ de ABA. A Figura 15 mostra o crescimento e o desenvolvimento reduzidos da raiz de linhagens era1 e transgênicas em relação aos das plantas do tipo selvagem. As linhagens 35S-anti-sentido-FTA exibem cresimento radicular reduzido, simi30 lar ao do mutante era1, em resposta ao ABA.

Uma linhagem transgênica de Brassica napus que carrega o constructo 35S-anti-sentido-FTA foi avaliada em relação à sensibilidade ao

185

ABA. Em aproximadamente 10μΜ foi observado um efeito que mostra o de-

senvolvimento e o vigor reduzidos da planta nova no cotilédone e no primeiro estágio foliar, indicando assim uma maior sensibilidade ao ABA.

A sensibilidade ao ABA foi avaliada em todas as plantas transgênicas enge5 nheiradas para possuírem menor ou maior expressão de FTA ou de FTB ou atividade através dos métodos acima. A concentração de ABA utilizada varia dependendo da espécie que está sendo examinada.

Exemplo 20: Experimento de Seca

Para avaliar a resposta de plantas sob estresse hídrico ou seca

pode-se expor as plantas a várias situações. Por exemplo, a planta pode ser removida do solo ou meio e ser colocada sob papel toalha durante um período de tempo, tal como 4 horas e então devolvida para uma placa para continuar o crescimento e o desenvolvimento. A sobrevivência e o vigor podem ser avaliados.

Alternativamente, pode-se impor um estresse hídrico de tal forma que se assemelhe mais intimamente a uma situação de campo contendo a água durante um período de tempo, tal como até 6 dias. As plantas foram cultivadas cinco plantas por vaso de 10,16 cm (4 polegadas), em um expe’ rimento de estresse hídrico com réplicas. Todos os vasos foram preenchidos com quantidades equivalentes de solo pré-misturado e umedecido homogê_zneo. As condições de cultivo eram de 16 horas de luz do dia (150-200 pmol/m /s) a 22°C e 70% de umidade relativa. No dia que a primeira flor abriu, o tratamento de seca foi iniciado primeiro através da uniformização do teor de água no solo em cada vaso em uma base em peso e então interrom25 pendo a rega. No final do tratamento de estresse hídrico, as plantas foram tipicamente colhidas para dados de biomassa ou regadas novamente para completar o ciclo de vida e para a determinação de dados de biomassa e rendimento. Os parâmetros fisiológicos foram avaliados sob condições de estresse e ótimas, por exemplo, o acúmulo de biomassa de brotos e raízes, o teor de água no solo, somente a perda de água ou como uma função de parâmetros tais como a biomassa, o rendimento de sementes e o número de folhas e a área das folhas. A Figura 16 mostra fotografias da Columbia do * X-j «. »14^-^ Ja. »< -^T * S> .pi. Xã^ i, J J^S^JÍ» íc _1»-^.^. ,» Slfr? ip- xij- *>u* tnjtjBu* -4fS ^ift4«.u,pj*eX- p pAkW.W^ « -ς w.fjrjw,'· <»»—yf «-X» _r ^S.u *4^$> JW

186 tipo selvagem (A) e de quatro linhagens transgênicas de Arabidopsis thalia i

na 35S-anti-sentido-FTA (B,C,D,E) após 8 dias de tratamento de estresse hídrico. A planta de controle fica visivelmente estressada e menos saudável.

Este experimento foi realizado em linhagens transgênicas contendo os veto5 res descritos pelas SEQ ID N—: 10, 46-64.

A tolerância à seca ou ao estresse hídrico é avaliada em todas as plantas transgênicas engenheiradas para possuírem expressão ou atividade de FTA ou de FTB reduzida ou aumentada através dos métodos descritos.

Exemplo 21: Análise da Perda de Água em linhagens de Arabidopsis 10 thaliana pRD29A-DA-FTA durante o estresse de seca

Xjr As plantas foram cultivadas 5 plantas por vaso de 10,16 cm (4 polegadas) e 6 vasos por linhagem. Quando as plantas tinham crescido até o primeiro estágio de flor, o tratamento de seca foi iniciado como descrito no rf

Exemplo 20. Os vasos eram pesados diariamente e no final do tratamento 15 de seca de 7 dias, todas as plantas foram colhidas para determinações de peso fresco e de peso seco dos brotos. A Figura 10 mostra a perda de água em uma base de peso seco por broto em 4 dias de tratamento de estresse hídrico. Das 31 linhagens examinadas neste experimento, 25 exibiam menor perda de água em relação ao tipo selvagem Columbia, das quais 22 eram

significativas estatisticamente. Todas as linhagens foram avaliadas em relação à sensibilidade ao ABA como descrito no Exemplo 14, a maior sensibilidade ao ABA (ABA^S) também se correlacionava com uma menor perda de água durante o tratamento de seca. As linhagens determinadas como possuindo a sensibilidade do tipo selvagem ao ABA (ABA⁷⁷¹) eram as mesmas 6 linhagens (linhagens 2, 36, 69, 29, 24, 21) que não exibiam uma perda de água reduzida comparadas com a do tipo selvagem.

O experimento anterior foi repetido utilizando duas linhagens de

ABA^S, uma linhagem ABA⁷⁷¹^ e um controle de Columbia. As plantas foram colhidas após 2,4 e 6 dias de tratamento de estresse hídrico para determina30 ções de peso seco de brotos. As ABA^S transgênicas possuíam maior biomassa foliar e de brotos, maiores teores de água no solo e menor perda de água por peso seco de broto quando comparadas com a ABA⁷⁷¹ ou controles

de Columbia. Os resultados eram coerentes em todos os três estágios d€ colheita.

Os dados mostrados neste exemplo foram obtidos utilizando plantas transgênicas que carregam o constructo pRD29A-DA-FTA. O expe5 rimento foi também realizado em linhagens que carregam variações dEste constructo tal como 35S-DA-FTA, pRD29A-anti-sentido-FTA ou 35S-antisentido-FTA, com tendências similares observadas de tolerância ao estresse hídrico. A perda de água do solo é avaliada em todas as plantas transgênicas engenheiradas para possuírem expressão ou atividade de FTA ou de 10 FTB reduzida ou aumentada através dos métodos descritos.

Exemplo 22: Análise do Peso Fresco de Brotos em linhagens de Arabidopsis thaliana pRD29A-DA-FTA durante o estresse de seca

As plantas foram cultivadas 5 plantas por vaso de 10,16 cm (4 polegadas) e 8 vasos por linhagem. Quando as plantas tinham crescido até 15 o primeiro estágio de flor, o tratamento de seca foi iniciado como descrito no Exemplo 20. As plantas foram regadas novamente após o tratamento de seca de 6 dias e foi permitido que se recuperassem durante mais 6 dias. As plantas foram colhidas e os pesos frescos foram determinados. A Figura 20 mostra os pesos frescos dos brotos. Este experimento consistia em 25 li20 nhagens transgênicas, das quais 2 são ABA⁷⁷⁷ (linhagens 2 e 69) e um controle Columbia do tipo selvagem. Todas as 23 linhagens ABA^S transgênicas possuíam pesos frescos de brotos maiores de forma significativa estatisticamente, na média de 44% maiores.

Os dados mostrados neste exemplo foram obtidos utilizando plantas trans25 gênicas que carregam o constructo pRD29A-DA-FTA. O experimento foi realizado em linhagens carregando variações dEste constructo tal como 35SDA-FTA, pRD29A-anti-sentido-FTA ou 35S-anti-sentido-FTA, com tendências similares observadas.

Exemplo 23: Análise do rendimento de sementes em linhagens de Ara30 bidopsis thaliana pRD29A-DA-FTA durante o estresse de seca e sob condições ótimas

As plantas foram cultivadas 1 planta por vaso de 10,16 cm (4 ««y f A «*. — <rr* í*- í- M -r-fe -A^»· *% *£* ϊ/ΐ '· * 4^*-* Τ' 1Λ \ I < Ά ¢-^S4? r- * ^Ç^UwAftSjf* oA fe * -¼^ *í 4^*/ *· *.·*& < 1 «.Α^Τλ

polegadas). Quando as plantas tinham crescido até o primeiro estágio de flor, o tratamento de seca foi iniciado como descrito no Exemplo 20. As plantas foram regadas novamente após o tratamento de seca de 6 dias e foi permitido que crescessem até a maturidade. O grupo ótimo não foi exposto 5 ao tratamento de seca.

A análise de rendimento indica que embora o tratamento de seca resulte em menores rendimentos, as plantas transgênicas não sofrem de forma tão grave quanto as de controle e mantêm uma vantagem de produtividade (Figura 21) como mostrado anteriormente no Experimento 22. A 10 comparação dos rendimentos produzidos pelas plantas transgênicas ABA^S versus as controles mostra que um rendimento maior 15% maior foi obtido sob condições ótimas e um aumento de 20% sob condições de seca. No grupo de tratamento de seca, 8 de 9 linhagens transgênicas exibiram maior rendimento que as de controle. A expressão do rendimento de cada linha15 gem obtida sob tratamento de seca como uma porcentagem de seu desempenho sob condições ótimas indica que 8 de 9 linhagens ABA^S tiveram desempenho superior a linhagem de controle enquanto que 4 de 9 tiveram desempenho superior os controles ABA^m

Os dados mostrados neste exemplo foram obtidos utilizando 20 plantas transgênicas que carregam o constructo pRD29A-DA-FTA. O experimento foi realizado em linhagens carregando variações d Este constructo tal como 35S-DA-FTA, pRD29A-anti-sentido-FTA ou 35S-anti-sentido-FTA, com tendências similares observadas.

Exemplo 24: Análise do crescimento vegetativo em linhagens de Arabi25 dopsis thaliana pRD29A-DA-FTA sob condições ótimas de crescimento

As plantas foram cultivadas 1 planta por vaso de 7,62 cm (3 polegadas) e 8 vasos por linhagem. As plantas foram colhidas em três estágios e os pesos frescos foram determinados. O estágio vegetativo foi definido como plantas novas de 14 dias de idade, o estágio de brotar como o apare30 cimento da primeira flor (plantas novas de 19-21 dias) e de florescimento médio como 6 dias partindo da primeira flor. Em cada um dos estágios anteriores, respectivamente 7, 8 e 10 das linhagens transgênicas ABA^S testadas

189 exibiam uma biomassa de peso fresco de brotos estatisticamente maior que a das plantas de controle (Figura 22). Uma linhagem Columbia e uma linhagem ABA^W (linhagem 2) foram utilizadas como o grupo de controle. Adicionalmente, havia uma tendência estatisticamente significativa para as linha5 gens transgênicas possuírem um número maior de folhas por roseta.

Os dados mostrados neste exemplo foram obtidos utilizando plantas transgênicas carregando o constructo pRD29A-DA-FTA. O experimento foi realizado em linhagens carregando variações dEste constructo tal como 35S-DAFTA, pRD29A-anti-sentido-FTA ou 35S-anti-sentido-FTA, com tendências r~·. 10 similares observadas.

F Μ*.

w Exemplo 25: Análise de linhagens pRD29A-DA-FTA de Arabidopsis thaliana sob tratamento de seca e estresse biótico

As plantas foram cultivadas 1 planta por vaso de 10,16 cm (4 polegadas) e 8 vasos. Quando as plantas tinham crescido até o estágio de 15 primeira flor, o tratamento de seca foi iniciado como descrito no Exemplo 20.

As plantas foram regadas novamente após o tratamento de seca de 7 dias e foi permitido que crescessem até a maturidade. Uma linhagem de controle Columbia (col) e uma linhagem transgênica foram avaliadas. A análise do rendimento de sementes indicou menos que os rendimentos normais, apro20 ximadamente 12% do rendimento ótimo esperado. Foi determinado que o

solo utilizado continha um contaminante fúngico que foi responsável pelos rendimentos reduzidos uma vez que o estresse biótico podería ter sido negado através da esterelização do solo antes do uso. O estresse biótico era menos grave na linhagem transgênica comparado com a de controle que 25 possuía um rendimento de 22% da linhagem transgênica. Nos grupos de planta do tratamento de seca, o estresse biótico era reduzido, entretanto, as transgênicas tiveram desempenho superior os controles em aproximadamente 4,5 vezes (Figura 23).

Os dados mostrados neste exemplo foram obtidos utilizando plantas transgênicas carregando o constructo pRD29A-DA-FTA. O experimento foi realizado em linhagens carregando variações dEste constructo tal como 35S-DA-FTA, pRD29A-anti-sentido-FTA ou 35S-anti-sentido-FTA, com

190 tendências similares observadas.

Exemplo 26: Análise de linhagens pRD29A-DA-FTA de Arabidopsis thaliana em relação ao número de estômatos

O número de estômatos tanto na superfície superior quanto na inferior da folha foi avaliado em duas linhagens transgênicas e um controle de Columbia do tipo selvagem. Foram feitas impressões com esmalte de unha de ambas as superfícies superior e inferior da quinta folha, as plantas estavam no estágio inicial de florescência. Não foram observadas diferenças na densidade dos estômatos.

Os dados mostrados neste exemplo foram obtidos utilizando plantas transgênicas carregando o constructo pRD29A-DA-FTA. O experimento foi realizado em linhagens carregando variações d Este constructo tal como 35S-DA-FTA, pRD29A-anti-sentido-FTA ou 35S-anti-sentido-FTA, com tendências similares observadas.

Exemplo 27: Produção de anticorpos policlonais contra FT-A e FT-B

As seqüências de FT isoladas de Arabidopsis thaliana foram clonadas no vetor de expressão de E. coli derivado do pET11D. Para gerar o constructo de FT-B marcada com Histidina, o clone de FT-B de Arabidopsis thaliana e o vetor pET foram digeridos com SamHI e ligados. As digestões 20 de restrição foram realizadas para verificar a orientação do inserto. Para produzir o constructo de FT-A, o clone de FT-A de Arabidopsis thaliana e o vetor pET foram digeridos com BamHI e EcoRI e subseqüentemente ligados. Os plasmídeos resultantes direcionaram a expressão de proteínas de fusão contendo 6 resíduos de histidina consecutivos nos N-terminais de AtFTA e 25 AtFTB. As proteínas de fusão foram expressas no hospedeiro bacteriano BL21(DE3) e purificadas utilizando a cromatografia quelante Hi-Trap como descrito pelo fabricante (Pharmacia). A fração solúvel do extrato bacteriano bruto contendo as proteínas de fusão His-FT foi carregada em uma coluna Hi-Trap (1,5 cm x 2,0 cm) e as proteínas foram eluídas com um gradiente 30 linear de 200 mL de 0,0 até 0,3 M de imidazol no tampão da coluna (25 mM de Tris-HCI, pH 7,5, 1 mM de DTT). As frações contendo as proteínas HisFT purificadas foram agrupadas, os sais foram extraídos e foram concentra-

191 das com um concentrador Centriprep-30 (Amicon). Todas as etapas de purificação foram realizadas a 4°C. Para gerar um anticorpo, a proteína de fusão

purificada foi adicionalmente separada através de SDS/PAGE e a banda corada com Coomassie correspondendo à proteína de fusão foi cortada. A proteína foi eluída do pedaço de gel através de eletroeluição e então emulsificada no adjuvante de Ribi (Ribi Immunochem) até um volume final de 1 mL.

A His-AtFTA ou a His-AtFTB (250 pg) foi injetada em um coelho da Nova

Zelândia de 3 kg no dia 1 e injeções de reforço foram fornecidas no dia 21 e no dia 35 com 200 pg da proteína. Os anti-soros com alto título foram obtidos uma semana após a injeção final. Estes anticorpos foram utilizandos na análise de western do exemplo 18, Figura 13.

Exemplo 28: Seleção de genes relacionados

As plantas transgênicas da invenção podem ser utilizadas para a identificação de genes que interagem com os genes da presente invenção. Pode-se utilizar as plantas transgênicas da invenção para selecionar genes relacionados, por exemplo, supressores, intensificadores ou moduladores da expressão ou da atividade gênica podem ser identificados através de protocolos de seleção genética. Com a finalidade de exemplo, uma biblioteca de mutantes pode ser gerada utilizando as plantas transgênicas da invenção como a estrutura básica genética. Estão disponíveis vários métodos e seriam conhecidos pelo versado na técnica. Por exemplo, agentes mutagênicos químicos tal como EMS podem ser utilizados para induzir mutações pontuais no genoma, a irradiação de nêutrons acelerados das sementes pode resultar em mutantes de deleção, podem ser produzidas bibliotecas de T-DNA que inativam genes através de efeitos de inserção ou métodos de marcação para ativação podem ser utilizados para produzir bibliotecas com genes regulados para mais. A análise destes tipos de bibliotecas pode identificar genes que recuperam ou modulam os fenótipos observados nas plantas transgênicas da presente invenção.

Exemplo 29: Amplificação através da RT-PCR e clonagem das prenil transferases CaaX

O RNA total foi isolado do tecido foliar de Arabidopsis thaliana,

192

X

Brassica napus e Glycine max, utilizando o kit Qiagen RNeasy e utilizado como molde para amplificar os genes CPP através da RT-PCR. As condi-

ções de reação eram como a seguir: tampão de reação 1X (10 mM de TrisHCI pH 8,8, 1,5 mM de MgCI₂, 50 mM de KCI), dNTPs a 200 μΜ, 1 pM dos iniciadores AtCPP BamFW e AtCPP SmaRV, 2,5 U de Pfu DNA polimerase e o molde mais água até um volume final de 100 μΙ_. As reações foram corridas a 1 minuto a 94°C, 1 minuto a 60°C, 1 minuto a 72°C, durante 30 ciclos. Os iniciadores utilizados para amplificar as seqüências de Arabidopsis e de Brassica através da PCR foram os identificados pela SEQ ID N^e: 101 e pela 10 SEQ ID N^e: 102. Os iniciadores utilizados para a amplificação da seqüência de Glycine pela PCR foram os identificados pela SEQ ID N^s: 149 e pela SEQ ID N²: 150. Os produtos da PCR foram separados da mistura de reação da RT-PCR utilizando o kit de centrifugação em coluna Qiagen PCR e ligados no vetor de clonagem preparado, pBluescript KS+. O vetor foi preparado a15 través da digestão com EcoRV e tratado com a Taq polimerase na presença de dTTP para produzir uma ponta coesiva a 3' adequada para a ligação com os produtos da PCR. Os produtos da ligação foram transformados em células DH5a de E. coli, as colônias positivas foram selecionadas e os insertos resultantes foram seqüenciados. A tecnologia acima pode ser aplicada para 20 a obtenção de seqüências homólogas e pode requerer iniciadores alternativos.

Tabela 13.

AtCPP BamFW: 5'-AAAGGATCCATGGCGATTCCTTTCATGG-3' (SEQ ID N²: 101

AtCPP SmaRV: 5'-AAACCCGGGTTAATCTGTCTTCTTGTCTTCTCCA-3' (SEQ ID N²: 102)

GmCPP SmaFW: 5'-AAACCCGGGATGGCGTTTCCCTACATGGAAGCC -3' (SEQ ID N²: 149)

GmCPP SacRV: 5'-AAAGAGCTCTTAGTCTTCCTTCTTATCCGGTTCG -3’ 30 (SEQ ID N²: 150)

Exemplo 30: Constructo de Vetores

A obtenção do constructo pB1121-AtCPP (SEQ ID N²: 99) foi

preparada como a seguir. O vetor pBI121 vector foi digerido com BamHI e Smal. O AtCPP, fragmento de DNA de 1,4 kb proveniente da RT-PCR (SEQ

ID N²: 97) foi digerido com BamHI e Smal e ligado no vetor pBI121. A seqüência de GUS foi então removida através da digestão com Smal e Ecol5 CRI e o vetor foi ligado após a purificação do vetor do inserto de GUS para produzir o vetor pBI121-AtCPP (Figura 25A). Este constructo foi utilizado para gerar adicionalmente constructos expressando o gene CPP de Brassica e Glycine. Para produzir o constructo pBI121-BnCPP (SEQ ID N²: 142) os pares de iniciadores identificados pela SEQ ID N²: 101 e pela SEQ ID N²:

102 são utilizados para a amplificação pela PCR do fragmento apropriado

t.z que está ligado no vetor original preparado. Para produzir o constructo pBI121-GmCPP (SEQ ID N²: 136) os pares de iniciadores identificados pela SEQ ID N²: 149 e pela SEQ ID N²: 150 são utilizados para a amplificação pela PCR do fragmento apropriado que está ligado no vetor original prepara15 do.

Obtenção do constructo pBI121-anti-sentido-AtCPP (SEQ ID N²: 130). O fragmento anti-sentido foi produzido utilizando a amplificação pela PCR com a SEQ ID N²: 97 como molde e os iniciadores identificados como a • SEQ ID N^s: 106 e a SEQ ID N²: 107, listados na Tabela 14. Este fragmento foi digerido com BamHI e Smal e utilizado para substituir o fragmento sentido do constructo pBI121-AtCPP (SEQ ID N²: 99), para fornecer a SEQ ID N²:

/ 130 (Figura 25B). Este constructo, SEQ ID N²: 130, foi utilizado para gerar adicionalmente constructos que expressam o gene CPP anti-sentido de Brassica e Glycine. Para produzir o constructo pBI121-anti-sentido-BnCPP (SEQ ID N²: 144) os pares de iniciadores identificados pela SEQ ID N²: 151 e pela SEQ ID N²: 152 são utilizados para a amplificação pela PCR do fragmento apropriado que está ligado no vetor original preparado. Para produzir o constructo pBI121-anti-sentido-GmCPP (SEQ ID N²: 138) os pares de iniciadores identificados pela SEQ ID N²: 153 e pela SEQ ID N²: 154 são utili30 zados para a amplificação pela PCR do fragmento apropriado que está ligado no vetor original preparado.

194 t

Obtenção do constructo pBI121-HP-AtCPP (SEQ ID N²: 100). A estratégia de clonagem envolvia o truncamento do gene GUS do pB1121 e o

flanqueamento da seqüência de GUS com um fragmento de AtCPP na orien tação anti-sentido a montante do GUS e na orientação sentido a jusante do

GUS. O vetor pBI121 foi digerido com Smal e Saci, a seqüência de GUS e os fragmentos do vetor foram purificados um dos outros. O fragmento de GUS isolado foi digerido utilizando EcoRV e o fragmento EcoRV/SacI de ponta cega de 1079 pb foi isolado. Este foi ligado de volta no vetor original digerido nos sítios Smal/Sacl. Este vetor intermediário foi utilizado na produção subseqüente dos vetores em grampo de cabelo. O fragmento AtCPP que será utilizado como a seqüência em grampo de cabelo específica ao gene foi isolado através da PCR. Os iniciadores identificados como SEQ ID N²: 103 e SEQ ID N²: 104, listados na Tabela 14, foram utilizados para gerar um fragmento de 596 pb. A clonagem do fragmento na orientação sentido foi conseguida através da digestão do fragmento AtCPP da PCR com Saci e a ligação no sítio de Saci na extremidade a 3' de GUS. Para inserir o mesmo fragmento a montante do GUS, o sítio de BamHI foi aberto e as extremidades foram tornadas cegas com Klenow. O fragmento de AtCPP amplificado pela PCR foi digerido com EcolCRI, que é um isoesquisômero da Saci, mas deixa extremidades cegas e ligado no sítio BamHI cego do vetor para fornecer o constructo final (Figura 25C). O constructo intermediária utilizado para produzir a SEQ ID N²: 100 acima continha somente o gene GUS truncado e nenhuma das seqüências de CPP deste vetor intermediário foi utilizada para gerar adicionalmente constructos expressando os constructos do gene CPP em grampo de cabelo de Brassica e Glycine. Para produzir o constructo pBI121-HP-BnCPP (SEQ ID N²: 143) os pares de iniciadores identificados pela SEQ ID N²: 153 e pela SEQ ID N²: 154 são utilizados para a amplificação pela PCR do fragmento senso e os pares de iniciadores identificados pela SEQ ID N²: 155 e pela SEQ ID N²: 156 são utilizados para a amplificação pela PCR do fragmento anti-sentido. Estes fragmentos são clonados no vetor intermediário preparado descrito anteriormente. Para produzir o constructo pBI121-HP-GmCPP (SEQ ID N²: 137) os pares de iniciadores identifi-

195 cados pela SEQ ID N^s: 157 e pela SEQ ID N²: 158 são utilizados para a amplificação pela PCR do fragmento sentido e os pares de iniciadores identificados pela SEQ ID N²: 159 e pela SEQ ID N²: 160 são utilizados para a amplificação pela PCR do fragmento anti-sentido. Estes fragmentos são clona5 dos no vetor intermediário preparado descrito anteriormente.

Os constructos de vetores anteriores foram modificados para colocar os genes sob o controle de promotores alternativos, tal como, mas não limitados ao RD29A ou ao MuA. Isto foi realizado através do corte da seqüência do promotor 35S e da substituição da mesma por uma seqüência 10 promotora apropriada. Desta forma as SEQ ID N—: 134 e 135 foram geradas e as SEQ ID N—: 133, 136-148 podem ser construídas.

Tabela 14

AtCPP-HP-SacFW 5'-CTGGAGCTCTTTTACCGAGGTTGGGCCTTGATCC3' (SEQ IDN²: 103)

AtCPP-HP-SacRV 5'-ATTGAGCTCCCAATGTCCAAGCTCGTGTGCAATA-3' (SEQ ID N²: 104)

AtCPP-anti-SmaFW 5'-AAACCCGGGATGGCGATTCCTTTCATGG-3' (SEQ ID N²: 106)

AtCPP-anti-BamRV 5’-AAAGGATCCTTAATCTGTCTTCTTGTCTTCTCCA-3' (SEQ ID N²: 107)

BnCPP-anti-SmaFW 5-AAACCCGGGATGGCGATTCCTTTCATGG -3' (SEQ IDN²: 151)

BnCPP-anti-BamRV 5'-AAAGGATCCTTAATCTGTCTTCTTGTCTTCTCC -3' (SEQ ID N²: 152)

BnCPP-HP-Sac-FW 5'- AAAGAGCTCTTCTACCAATGGTGGGACTCG -3' (SEQ IDN²: 153)

BnCPP-HP-Sac-RV 5'- AAAGAGCTCCCAGTGTCCCAGCTCGTGTG -3' (SEQ ID N²: 154)

BnCPP-HP-BamFW 5'- AAAGGATCCTTCTACCAATGGTGGGACTCG -3' (SEQ IDN²: 155)

BnCPP-HP-XbaRV 5'- AAATCTAGACCAGTGTCCCAGCTCGTGTG -3’ (SEQ IDN²: 156)

196

GmCPP-HP-Sac-FW

5'-GATGAGCTCACAAGATCAAGTCACAGCAATGCCT -3'

(SEQ ID N²: 157)

GmCPP-HP-Sac-RV 5'- AAAGAGCTCCCGGTTCGTCCAGCGCGGCC -3' (SEQ ID N²: 158)

GmCPP-HP-BamFW

5'- GATGGATCCACAAGATCAAGTCACAGCAATGCCT -3' (SEQ ID N²: 159)

GmCPP-HP-XbaRV 5'- CCTTCTAGACCGGTTCGTCCAGCGCGGCC -3'

(SEQ ID N²: 160)

Exemplo 31: Análise de Seqüência

CPP de Arabidopsis thaliana (AtCPP)

Um ácido nucléico descrito de 1275 nucleotídeos (SEQ ID N²:

97) e também referido como AtCPP, é mostrado na Tabela 15._____________

Tabela 15A. Seqüência de Nucleotídeos de AtCPP (SEQ ID N²: 97). ATGGCGATTCCTTTCATGGAAACCGTCGTGGGTTTTATGATAGTGATGTACATTTTTGAG

ACGTATTTGGATCTGAGGCAACTCACTGCTCTCAAGCTTCCAACTCTCCCGAAAACCTTG

GTTGGTGTAATTAGCCAAGAGAAGTTTGAGAAATCACGAGCATACAGTCTTGACAAAAGC TATTTTCACTTTGTTCATGAGTTTGTAACTATACTTATGGACTCTGCAATTTTGTTCTTT GGGATCTTGCCTTGGTTTTGGAAGATGTCTGGAGCTGTTTTACCGAGGTTGGGCCTTGAT CCGGAGAATGAAATACTGCATACTCTTTCATTCTTGGCTGGTGTTATGACATGGTCACAG ATCACTGATTTGCCATTTTCTTTGTACTCAACTTTCGTGATCGAGTCTCGGCATGGGTTC AACAAACAAACAATATGGATGTTCATTAGGGACATGATCAAAGGAACATTCCTCTCTGTC ATACTAGGCCCACCCATTGTTGCTGCGATAATTTTCATAGTCCA197

gt' .&

5*& b“

GAAAGGAGGTCCTTAT CTTGCCATCTATCTGTGGGCATTCATGTTTATCCTGTCTCTAGTGATGATGACTATATAC CCGGTCTTGATAGCACCGCTCTTCAACAAATTCACTCCTCTTCCAGATGGAGACCTCCGG GAGAAGATTGAGAAACTTGCTTCTTCCCTAAAGTTTCCTTTGAAGAAGCTGTTTGTTGTC GATGGATCTACAAGGTCAAGCCATAGCAATGCTTACATGTATGGTTTCTTTAAGAACAAA AGGATTGTTCTTTATGATACGTTGATTCAGCAGTGCAAGAATGAGGATGAAATTGTGGCG GTTATTGCACACGAGCTTGGACATTGGAAACTGAATCACACTACATACTCGTTCATTGCA GTTCAAATCCTTGCCTTCTTACAATTTGGAGGATACACTCTTCTCAGAAACTCCACTGAT

CTCTTCAGGAGTTTCGGATTTGATACACAGCCTGTTCTCATTGGTTTGATCATATTTCAG CACACTGTAATACCACTGCAACATCTAGTAAGCTTTGGCCTGAACCTCGTTAGTCGAGCG

TTTGAGTTTCAGGCTGATGCTTTTGCTGTGAAGCTTGACTATGCAAAAGATCTTCGTCCT

GCTCTAGTGAAACTACAGGAAGAGAACTTATCAACAATGAACACTGATCCATTGTACTCA

GCTTATCACTACTCACATCCTCCTCTTGTTGAAAGGCTTCGAGCCACTGATGGAGAAGAC

AAGAAGACAGATTAA

Um polipeptídeo de CPP descrito (SEQ ID N²: 98) codificado pela SEQ ID N²: 97 possui 424 resíduos de aminoácidos e é apresentado na Tabela 15B utilizando o código de aminoácido de uma única letra.

198

Tabela 15B. Seqüência da proteína CPP codificada (SEQ ID N⁹: 98).

MAIPFMETWGFMIVMYIFETYLDLRQLTALKLPTLPKTLVGVISQEKFEKSRAYSLDKS

YFHFVHEFVTILMDSAILFFGILPWFWKMSGAVLPRLGLDPENEILHTLSFLAGVMTWSQ

ITDLPFSLYSTFVIESRHGFNKQTIWMFIRDMIKGTFLSVILGPPIVAAIIFIVQKGGPY LAIYLWAFMFILSLVMMTIYPVLIAPLFNKFTPLPDGDLREKIEKLASSLKFPLKKLFW DGSTRSSHSNAYMYGFFKNKRIVLYDTLIQQCKNEDEIVAVIAHELGHWKLNHTTYSFIA

VQILAFLQFGGYTLLRNSTDLFRSFGFDTQPVLIGLIIFQHTVIPLQHLVSFGLNLVSRA

FEFQADAFAVKLDYAKDLRPALVKLQEENLSTMNTDPLYSAYHYSHPPLVERLRATDGED

KKTD

A presente invenção inclui ainda uma seqüência de ácido nucléico complementar à prenil protease CaaX de Arabidopsis thaliana da SEQ ID N⁹: 97. A seqüência complementar descrita é mostrada como a SEQ ID N⁹:

115.

SEQ ID N⁹: 115

TTAATCTGTCTTCTTGTCTTCTCCATCAGTGGCTCGAAGCCTTTCAACAAGAGGAGGATGTGAGTAGTGATAAGCTGAGTACAATGGATCAGTGTTCATTGTTGATAAGTTCTCTTCCTGTAGTTTCACTAGAGCAGGA10 CGAAGATCTTTTGCATAGTCAAGCTTCACAGCAAAAGCATCAGCCTGAAACTCAAACGCTCGACTAACGAGGTTCAGGCCAAAGCTTACTAGATGTTGCAGTGGTATTACAGTGTGCTGAAATATGATCAAACCAATGAGAACAGGCTGTGTATCAAATCCGAAACTCCTGAAGAGATCAGTGGAGTTTCTGAGAAGAGTGTATCCTCCAAATTGTAAGAAGGCAA15 GGATTTGAACTGCAATGAACGAGTATGTAGTGTGATTCAGTTTCCAATGTCCAAGCTCGTGTGCAATAACCGCCACAATTTCATCCTCATTC-

Λ

TTAAAGAAACCATACATGTAAGCATTGCTATGGCTTGACCTTGTAGATCCATCGACAACAAACAGCTTCTTCAAAGGAAACTTTAGGGAAGAAGCAAGTTTCTCAATCTTCTCCCGGAGGTCTCCATCTGGAAGAGGAGTGAATTTGTTGAAGAGCGGTGCTATCAAGACCGGGTATATAGTCATCATCACTAGAGACAGGATAAACATGAATGCCCACAGATAGATGGCAAGATAAGGACCTCCTTTCTGGACTATGAAAATTATCGCAGCAACAATGGGTGGGCCTAGTATGACAGAGAGGAATGTTCCTTTGATCATGTCCC10

TCACGAAAGTTGAGTACAAAGAAAATGGCAAATCAGTGATCTGTGACCATGTCATAACACCAGCCAAGAATGAAAGAGTATGCAGTATTTCATTCTCCGGATCAAGGCCCAACCTCGGTAAAACAGCTCCAGACATCTTCCAAAACCAAGGCAAGATCCCAAAGAACAAAATTGCAGAGTCCATAAGTATAGTTACAAACTCATGAACAAAGTGAAAATAGCTTTTGTCAAGAC15

TGTATGCTCGTGATTTCTCAAACTTCTCTTGGCTAATTACACCAACCAATCCAAATACGTCTCAAAAATGTACATCACTATCATAAAACCCACGA20

Devido à natureza da estratégia de clonagem, a seqüência apresentada não possui comprimento completo, mas estão faltando as regiões não traduzidas a 5' e a 3'. As identidades percentuais da seqüência de nucleotídeos de Arabidopsis thaliana e de sua seqüência de aminoácidos codificada em relação às de outras seqüências CPP como determinado pela análise de ClustalW são mostradas na Figura 26.

Utilizando as seqüências descritas aqui como sondas para hibridização, é possível selecionar e isolar seqüências de comprimento completo de bibliotecas de cDNA ou genômicas ou utilizar a tecnologia da rápida amplificação das extremidades do cDNA (RACE) ou outras tais técnicas da PCR.

CPP de Brassica napus (BnCPP)

Um ácido nucléico descrito de 1275 nucleotídeos (SEQ ID N²:

109) e também referido como BnCPP, é mostrado na Tabela 16.

200

Tabela 16A. Seqüência de Nucleotídeos de BnCPP (SEQ ID N^Q: 109).

ATGGCGATTCCTTTCATGGAAACCGTCGTTGGTTTTATGATAGTGATGTACGTTTTTGAGACGTATTTGGATCTGAGGCAACATACTGCTCTCAAGCTTCCCACTCTCCCAAAGACTTTGGTTGGAGTCATTAGCCAAGAGAAGTTTGAGAAATCTCGAGCTTACAGTCTTGACAAAAGCCATTTTCACTTTGTTCATGAGTTTGTTACTATACTTATGGACTCTGCGATTCTGTTCTTTGGGATCTTGCCTTGGTTTTGGAAGATATCTGGCGGCTTTCTACCAATGGTGGGACTCGATCCAGAGAATGAAATCCTGCACACTCTTTCATTCTTGGCTGGTCTTATGACATGGTCACAGATCACTGATTTGCCATTTTCTTTGTACTCAACTTTCGTGATCGAGTCTCGGCATGGGTTCAACAAACAAACAATATGGATGTTCATTAGGGACATGATCAAAGGAATACTCCTCTCTGTCATACCTGCCCCTCCTATCGTTGCCGCAATTATTGTTATAGTTCAGAAAGGAGGTCCTTACCTCGCCATCTATCTGTGGGCATTCATGTTTATCCTGTCTCTAGTGATGATGACTATATACCCTGTTTTGATTGCACCTCTTTTCAACAAGTTCACTCCTCTTCCTGATGGAGACCTCCGGGAGAAGATTGAGAAACTTGCTTCTTCTCTAAAGTTTCCTCTGAAGAAGCTGTTTGTTGTCGATGGATCTACAAGGTCAAGCCATAGTAATGCTTACATGTATGGTTTCTTCAAGAACAAAAGGATTGTTCTTTATGACACATTGATTCAGCAGTGCCAGAATGAGAATGAAATTGTGGCGGTTATTGCACACGAGCTGGGACACTGGAAGCTGAATCACACTACATACTCGTTCATTGCTGTTCAAATCCTTGCCTTCTTGCAATTTGGAGGATACACTCTTGTCAGAAACTCCACTGATCTCTTCAGGAGTTTTGGTTTTGATACACAACCAGTTCTCATTGGTTTGATCATATTTCAGCACACTGTAATACCACTTCAACACCTAGTAAGCTTTGACCTCAACCTTGTTAGTCGAGCGTTTGAGTTTCAGGCTGATGCTTTTGCAGTGAATCTTGGTTATGCAAAGGATCTACGTCCTGCCCTAGTGAAGCTACAGGAAGAGAACTTATCAGCGATGAACACAGACCCATTGTACTCAGCTTATCACTACTCACACCCTCCTCTTGTAGAGAGGCTTCGAGCCATTGATGGAGAAGACAAGAAGACAGATTAA

201

Um polipeptídeo de CPP descrito (SEQ ID N⁹: 110) codificado

pela SEQ ID N⁹: 109 possui 424 resíduos de aminoácidos e é apresentado

na Tabela 16B utilizando o código de aminoácido de uma única letra.________

Tabela 16B. Seqüência da proteína CPP codificada (SEQ ID N⁹:110). MAIPFMETWGFMIVMYVFETYLDLRQHTALKLPTLPKTLVGVISQEKFEKSRAYSLDKSHFHFVHEFVTILMDSAILFFGILPWFWKISGGFLPMVGLDPENEILHTLSFLAGLMTWSQITDLPFSLYSTFVIESRHGFNKQTIWMFIRDMIKGILLSVIPAPPIVAAIIVIVQKGGPYLAIYLWAFMFILSLVMMTIYPVLIAPLFNKFTPLPDGDLREKIEKLASSLKFPLKKLFVVDGSTRSSHSNAYMYGFFKNKRIVLYDTLIQQCQNENEIVAVIAHELGHWKLNHTTYSFIAVQILAFLQFGGYTLVRNSTDLFRSFGFDTQPVLIGLIIFQHTVIPLQHLVSFDLNLVSRAFEFQADAFAVNLGYAKDLRPALVKLQEENLSAMNTDPLYSAYHYSHPPLVERLRAIDGEDKKTD

A presente invenção inclui ainda uma seqüência de ácido nucléi5 co complementar à prenil protease Caax de Brassica napus da SEQ ID N⁹: 109. A seqüência complementar descrita é mostrada como a SEQ ID N⁹: 111.

SEQ ID NO:111

TTAATCTGTCTTCTTGTCTTCTCCATCAATGGCTCGAAGCCTCTCTA10 CAAGAGGAGGGTGTGAGTAGTGATAAGCTGAGTACAATGGGTCTGTGTTCATCGCTGATAAGTTCTCTTCCTGTAGCTTCACTAGGGCAGGACGTAGATCCTTTGCATAACCAAGATTCACTGCAAAAGCATCAGCCTGAAACTCAAACGCTCGACTAACAAGGTTGAGGTCAAAGCTTACTAGGTGTTGAAGTGGTATTACAGTGTGCTGAAATATGATCAAACCAATGA15 GAACTGGTTGTGTATCAAAACCAAAACTCCTGAAGAGATCAGTGGAGTTTCTGACAAGAGTGTATCCTCCAAATTGCAAGAAGGCAAGGATTTGAACAGCAATGAACGAGTATGTAGTGTGATTCAGCTTCCAGTGTCCCAGCTCGTGTGCAATAACCGCCACAATTTCATTCTCATTCTGGCACTGCTGAATCAATGTGTCATAAAGAACAATCCTTTTGTTC20 TTGAAGAAACCATACATGTAAGCATTACTATGGCTTGACCTTGTAGATC-

CATCGACAACAAACAGCTTCTTCAGAGGAAACTTTAGAGAAGAAGCAAGTTTCTCAATCTTCTCCCGGAGGTCTCCATCAGGAAGAGGAGTGAAC-

TTGTTGAAAAGAGGTGCAATCAAAACAGGGTATATAGTCATCATCACTAGAGACAGGATAAACATGAATGCCCACAGATAGATGGCGAGGTAA-

GGACCTCCTTTCTGAACTATAACAATAATTGCGGCAACGATAGGAGGGGCAGGTATGACAGAGAGGAGTATTCCTTTGATCATGTCCCTAATGAACATCCATATTGTTTGTTTGTTGAACCCATGCCGAGACTCGATCACGAAAGTTGAGTACAAAGAAAATGGCAAATCAGTGATCTGTGACCATGTCATAAGACCAGCCAAGAATGAAAGAGTGTGCAGGATTTCATTCTC-

TGGATCGAGTCCCACCATTGGTAGAAAGCCGCCAGATATCTTCCAAAACCAAGGCAAGATCCCAAAGAACAGAATCGCAGAGTCCATAAGTATAGTAACAAACTCATGAACAAAGTGAAAATGGCTTTTGTCAAGACTGTAAGCTCGAGATTTCTCAAACTTCTCTTGGCTAATGACTCCAACCAAAGTCTTTGGGAGAGTGGGAAGCTTGAGAGCAGTATGTTGCCTCA-

GATCCAAATACGTCTCAAAAACGTACATCACTATCATAAAACCAACGACGGTTTCCATGAAAGGAATCGCCAT

Devido à natureza da estratégia de clonagem, a seqüência apresentada não possui comprimento completo, mas estão faltando as regiões ’ não traduzidas a 5' e a 3'. As identidades percentuais da seqüência de nu20 cleotídeos de Brassica napus e sua seqüência de aminoácidos codificada «4 em relação às de outras seqüências de CPP como determinado pela análise de ClustalW são mostradas na Figura 26.

Utilizando as seqüências descritas aqui como sondas para hibridização, é possível selecionar e isolar seqüências de comprimento completo 25 de bibliotecas de cDNA ou genômicas ou utilizar a tecnologia da rápida amplificação das extremidades do cDNA (RACE) ou outras tais técnicas da PCR.

CPP de Glycine max (GmCPP)

Um ácido nucléico descrito de 1275 nucleotídeos (SEQ ID N²:

112) e também referido como GmCPP, é mostrado na Tabela 17.

Tabela 17A. Seqüência de Nucleotídeos de GmCPP (SEQ ID N²: 112).

ATGGCGTTTCCCTACATGGAAGCCGTTGTCGGATTTATGATATTAATGTACATTTTTGAAACTTACTTGGATGTGCGACAACATAGGGCCCTCAAACTTCCTACTCTTCCAAAGACTTTAGAGGGTGTTATCAGCCAAGAGAAATTTGAGAAATCTAGAGCCTATAGTCTTGATAAAAGCCACTTCCATTTTGTTCACGAGTTTGTGACAATAGTGACAGACTCTACAATTTTGTACTTTGGGGTATTGCCCTGGTTTTGGAAGAAATCAGGAGATTTTATGACAATAGCTGGTTTCAATGCTGAGAATGAAATACTGCATACCCTTGCCTTCTTAGCAGGGCTGATGATTTGGTCACAGATAACAGATTTGCCCTTTTCTCTGTACTCAACTTTTGTGATTGAGGCCCGTCATGGTTTTAATAAGCAAACACCATGGTTATTCTTTAGGGACATGCTTAAAGGAATTTTCCTTTCTGTAATAATTGGTCCACCTATTGTGGCTGCAATCATTGTAATAGTACAGAAAGGAGGTCCATACTTGGCCATCTATCTTTGGGTTTTTACGTTTGGTCTTTCTATTGTGATGATGACCCTTTATCCAGTACTAATAGCTCCACTCTTCAATAAGTTCACTCCACTTCCAGATGGTCAACTCAGGGAGAAAATCGAGAAACTTGCTTCCTCCCTCAACTATCCGTTAAAGAAACTATTTGTTGTCGATGGATCCACAAGATCAAGTCACAGCAATGCCTATATGTATGGATTCTTCAAGAACAAGAGGATTGTCCCTTATGACACATTAATTCAACAGTGCAAAGACGATGAGGAAATTGTTGCTGTTATTGCCCATGAGTTGGGACACTGGAAGCTCAACCATACTGTGTACACATTTGTTGCTATGCAGATTCTTACACTTCTACAATTTGGAGGATATACACTAGTGCGAAATTCAGCTGATCTGTATCGAAGCTTTGGGTTTGATACGCAGCCAGTCCTCATTGGGCTCATCATATTTCAGCATACTGTAATCCCACTTCAGCAATTGGTCAGCTTTGGTCTGAACCTAGTCAGCCGATCATTTGAATTTCAGGCTGATGGCTTTGCCAAGAAGCTTGGATATGCATCTGGATTACGCGGTGGTCTTGTGAAACTACAGGAGGAGAATCTGTCAGCTATGAATACAGATCCTTGGTACTCTGCTTATCACTATTCTCATCCTCCCCTTGTTGAAAGATTGGCCGCGCTGGACGAACCGGATAAGAAGGAA-

204

GACTAA

Um polipeptídeo de CPP descrito (SEQ ID N²: 113) codificado pela

SEQ ID N²: 112 possui 424 resíduos de aminoácidos e é apresentado

na Tabela 17B utilizando o código de aminoacido de uma única letra. Tabela 17B. Seqüência de proteína CPP codificada (SEQ ID N^Q: 113). MAFPYMEAWGFMILMYIFETYLDVRQHRALKLPTLPKTLEGVISQEKFEKSRAYSLDKS HFHFVHEFVTIVTDSTILYFGVLPWFWKKSGDFMTIAGFNAENEILHTLAFLAGLMIWSQ ITDLPFSLYSTFVIEARHGFNKQTPWLFFRDMLKGIFLSVIIGPPIVAAIIVIVQKGGPY LAIYLWVFTFGLSIVMMTLYPVLIAPLFNKFTPLPDGQLREKIEKLASSLNYPLKKLFW DGSTRSSHSNAYMYGFFKNKRIVPYDTLIQQCKDDEEIVAVIAHELGHWKLNHTVYTFVA MQILTLLQFGGYTLVRNSADLYRSFGFDTQPVLIGLIIFQHTVIPLQQLVSFGLNLVSRS FEFQADGFAKKLGYASGLRGGLVKLQEENLSAMNTDPWYSAYHYSHPPLVERLAALDEPD KKED * Y A presente invenção inclui ainda uma seqüência de ácido nucléi5 co complementar à prenil protease CaaX de Glycine max da SEQ ID N²: 112. A seqüência complementar descrita é mostrada como a SEQ ID N²: 114.

SEQIDNO.U4 TTAGTCTTCCTTCTTATCCGGTTCGTCCAGCGCGGCCAATCTTTCAA10 CAAGGGGAGGATGAGAATAGTGATAAGCAGAGTACCAAGGATCTGTATTCATAGCTGACAGATTCTCCTCCTGTAGTTTCACAAGACCACCGCGTAATCCAGATGCATATCCAAGCTTCTTGGCAAAGCCATCAGCCTGAAATTCAAATGATCGGCTGACTAGGTTCAGACCAAAGCTGACCAATTGCTGAAGTGGGATTACAGTATGCTGAAATATGATGAGCCCAA-

TGAGGACTGGCTGCGTATCAAACCCAAAGCTTCGATACAGATCAGCTGAATTTCGCACTAGTGTATATCCTCCAAATTGTAGAAGTGTAAGAATCTGCATAGCAACAAATGTGTACACAGTATGGTTGAGCTTCCAGTGTCCCAACTCATGGGCAATAACAGCAACAATTTCCTCATCGTCTTTGCAC5 TGTTGAATTAATGTGTCATAAGGGACAATCCTCTTGTTCTTGAAGAATCCATACATATAGGCATTGCTGTGACTTGATCTTGTGGATCCATCGACAACAAATAGTTTCTTTAACGGATAGTTGAGGGAGGAAGCAAGTTTCTCGATTTTCTCCCTGAGTTGACCATCTGGAAGTGGAGTGAACTTATTGAAGAGTGGAGCTATTAGTACTGGATAAAGGGTCATCATCACAA-

TAGAAAGACCAAACGTAAAAACCCAAAGATAGATGGCCAAGTATGGACCTCCTTTCTGTACTATTACAATGATTGCAGCCACAATAGGTGGACCAATTATTACAGAAAGGAAAATTCCTTTAAGCATGTCCCTAAAGAATAACCATGGTGTTTGCTTATTAAAACCATGACGGGCCTCAATCACAAAAGTTGAGTACAGAGAAAAGGGCAAATCTGTTATCTGTGACCAAATCA15 TCAGCCCTGCTAAGAAGGCAAGGGTATGCAGTATTTCATTCTCAGCATTGAAACCAGCTATTGTCATAAAATCTCCTGATTTCTTCCAAAACCAGGGCAATACCCCAAAGTACAAAATTGTAGAGTCTGTCACTATTGTCACAAACTCGTGAACAAAATGGAAGTGGCTTTTATCAAGACTATAGGCTCTAGATTTCTCAAATTTCTCTTGGCTGATAACACCCTCTAAA20 GTCTTTGGAAGAGTAGGAAGTTTGAGGGCCCTATGTTGTCGCACATC-

CAAGTAAGTTTCAAAAATGTACATTAATATCATAAATCCGACAACGGCTTCCATGTAGGGAAACGCCAT

Devido à natureza da estratégia de clonagem, a seqüência apresentada não possui comprimento completo, mas estão faltando as regiões 25 não traduzidas a 5' e a 3'. As identidades percentuais da seqüência de nucleotídeos de Glycine max e de sua seqüência de aminoácidos codificada em relação as de outras seqüências CPP que são determinadas pela análise de ClustalW são mostradas na Figura 26.

Utilizando as seqüências descritas aqui como sondas de hibridi30 zação, é possível selecionar e isolar seqüências de comprimento completo de bibliotecas de cDNA e genômicas ou utilizar a tecnologia da rápida amplificação das extremidades do cDNA (RACE) ou outras tais técnicas da PCR.

206

Os ácidos nucléicos e os aminoácidos de CPP descritos acima possuem homologia com outras seqüências de CPP descritas (GenBank ID N—: AL161491 (AT4g01320), AF007269 e AF353722; WO 02/16625 A2 ). A homologia entre estas e outras seqüências é mostrada na análise de ali5 nhamento de ClustalW mostrada nas Tabelas 18A-18B.

Tabela 18A. Análise de Ácidos Nucléicos de ClustalW da Prenil Protease

CaaX

PPI-AtCPP

SEQ ID N²: 97

PPI-BnCPP

PPI-GmCPP

SEQ IDN²: 109

SEQ ID N²: 112

SOJA AT1

SOJA AT2

SOJA-Milho

SOJA-Gm

SEQ IDN²: 116

SEQ ID N²: 118

SEQ IDN²: 120

SEQ ID N²: 122

AFC1 SEQ ID N²: 124

AT4g01320 SEQ ID N²: 126

10: AF007269 SEQ ID N²: 128

Alinhamento múltiplo de seqüências de CLUSTAL W (1.81)

PPI-GmCPP -----------------------------------------------------------20 SOJA-Gm -----------------------------------------------------------AT4g01320 -----------------------------------------------------------AF007269 ATGGCGATTCCTTTCATGGAAACCGTCGTGGGTAAGCTTCAAAACCTTTTTCTGAGACAT

PPI-AtCPP -----------------------------------------------------------25 SOJA_AT2 -----------------------------------------------------------afc1 -----------------------------------------------------------SOJA_AT1 -----------------------------------------------------------PPI-BnCPP -----------------------------------------------------------SOJA-Milho -----------------------------------------------------------PPI-GmCPP

SOJA-Gm

207

AT4g01320 -----------------------------------------------------------AF007269 TTTACTATCCTGTTTCACTCATCGTATTTCGTTTTTGTTTGGG

TTTTGCTTTCTGTGTTG

PPI-AtCPP

SOJA_AT2 ----------------------------------------------------afc1 -----------------------------------------------------------SOJA_AT1 -----------------------------------------------------------PPI-BnCPP -----------------------------------------------------------SOJA-Milho ------------------------------------------------------------

PPI-GmCPP -----------------------------------------------------------SOJA-Gm -----------------------------------------------------------AT4g01320 -----------------------------------------------------------AF007269 TGTGTGTTGAGATTCCATGACTCGTTTGTTTCATATAC15 CATCGTCTCTGCTTCTCGTTTC

PPI-AtCPP -----------------------------------------------------------SOJA AT2 -----------------------------------------------------------afc1 -----------------------------------------------------------SOJA_AT1 -----------------------------------------------------------. 20 PPI-BnCPP -----------------------------------------------------------0¾ SOJA-Milho -----------------------------------------------------------® y

PPI-GmCPP -----------------------------------------------------------SOJA_AT1 -----------------------------------------------------------25 PPI-BnCPP -----------------------------------------------------------SOJA-Milho -----------------------------------------------------------PPI-GmCPP -----------------------------------------------------------30 SOJA-Gm -----------------------------------------------------------AT4g01320 -----------------------------------------------------------AF007269 TAAATTTTGTTCTTTTCTAATAGTGCGTACCTTGATCTGAGGTTTTATTACTCCTACTAG

PPI-AtCPP -----------------------------------------------------------35 SOJA_AT2 -----------------------------------------------------------afc1 -----------------------------------------------------------SOJA_AT1 -----------------------------------------------------------208

PPI-BnCPP SOJA-Milho

PPI-GmCPP -----------------------------------------------------------SOJA-Gm -----------------------------------------------------------AT4g01320 -----------------------------------------------------------AF007269 TTTCTTGTCTTACTCGTGCGTTTGATTTGATTTGAGCTTATGTGATTTCATCATCTCTTC

PPI-AtCPP -----------------------------------------------------------SOJAAT2 -----------------------------------------------------------afc1 -----------------------------------------------------------SOJA_AT1 -----------------------------------------------------------PPI-BnCPP -----------------------------------------------------------SOJA-Milho -----------------------------------------------------------PPI-GmCPP -----------------------------------------------------------SOJA-Gm -----------------------------------------------------------AT4g01320 -----------------------------------------------------------AF007269 CTCGGTTTTAGAATGTACGGAGCTTCTCTGTTAACCAAAATCTAGGATTTGGGAAGAAAA

PPI-AtCPP -----------------------------------------------------------SOJA_AT2 -----------------------------------------------------------afc1 -----------------------------------------------------------SOJA_AT1 -----------------------------------------------------------PPI-BnCPP -----------------------------------------------------------SOJA-Milho -----------------------------------------------------------PPI-GmCPP -----------------------------------------------------------SOJA-Gm -----------------------------------------------------------AT4g01320 -----------------------------------------------------------AF007269 GTCGGAGTCTTTTTTTTCCTCATTCCCGATTGGAAATTGAGAATCTTGAAATTTTTCTTT

PPI-AtCPP -----------------------------------------------------------SOJA_AT2 -----------------------------------------------------------afc1 -----------------------------------------------------------SOJA_AT1 -----------------------------------------------------------PPI-BnCPP -----------------------------------------------------------SOJA-Milho -----------------------------------------------------------PPI-GmCPP -----------------------------------------------------------SOJA-Gm -------------------------------------CTAATACGACTCACTATAGGGC

AT4g01320 ------------------------------------------------------------

209

AF007269 GTTCAAGTCATACAGCTTGAGGTTTTGGGTTTTCTTGTCAGGGTATTATTATGTTCGTGA

PPI-AtCPP -----------------------------------------------------------SOJAAT2 -----------------------------------------------------------5 afc1 -------------------------------—-------------------------SOJA_AT1 -----------------------------------------------------------PPI-BnCPP -----------------------------------------------------------SOJA-Milho ------------------------------------------------------------

PPI-GmCPP -----------------------------------------------------------SOJA-Gm AAGCAGTGGTAACAACGCAGAGTACGCGGGGGGAGACGCATGGTTCTGAACTAATTGTTA

AT4g01320 -----------------------------------------------------------AF007269 CTGCAACTAGAGTTTTCTGGAGTTTTTTGAAATGGGTT15 TTGTGTTGTGGAACCGTATGTG

PPI-AtCPP -----------------------------------------------------------SOJA_AT2 -----------------------------------------------------------afc1 -----------------------------------------------------------SOJAAT1 -----------------------------------------------------------20 PPI-BnCPP -----------------------------------------------------------SOJA-Milho -----------------------------------------------------------PPI-GmCPP -----------------------------------------------------------25 SOJA-Gm TAAATAATACCTAAAATTTTGAGTTGTCCTAAACATTGGGGTTTAAACAAATCCAATCTC

AT4g01320 -----------------------------------------------------------AF007269 AATGTTGCATCAAAACTCTTTCAGTGCTCCAATGTTTCCATCAGTAGTCAGCACAAGAGA

PPI-AtCPP -----------------------------------------------------------SOJAAT2 -----------------------------------------------------------fc afc1 -----------------------------------------------------------SOJAAT1 -----------------------------------------------------------PPI-BnCPP -----------------------------------------------------------35 SOJA-Milho -----------------------------------------------------------PPI-GmCPP -----------------------------------------------------------SOJA-Gm TCAATATAAAACCCAATGATCTCACC40 CTCACTCCGTTTCTGATTTCTCACTCTTCGTT

AT4g01320 -----------------------------------------------------------AF007269 TCTTTTTATATCTGGTTGATCAAAAAAGTAGATGATGTTATTGAATTTTCAGTGATGGAG

PPI-AtCPP -----------------------------------------------------------45 SOJA_AT2 -----------------------------------------------------------afc1 -----------------------------------------------------------SOJA_AT1 -----------------------------------------------------------PPI-BnCPP -----------------------------------------------------------SOJA-Milho ------------------------------------------------------------

TACATGGAAGCCG

SOJA-Gm TCTCGTTCGGTTCATCAGCGTGTGTCTCAGCCATGGCGTTTCCC-TACATGGAAGCCG

AT4gO1320 ---------------------------------ATGGCGATTCCTTTCATGGAAACCG

AF007269 TATCTGTTGTTGTGGCATTTAGAGTAGATTCGTATTTCATCTTCTGTTTTATTCTTTTTC

PPI-AtCPP ------TTCATGGAAACCG

SOJAAT2 -----TTCATGGAAACCG afc1

SOJA_AT1 -----TTCATGGAAACCG

PPI-BnCPP -----TTCATGGAAACCG

SOJA-Milho -----•ATGGCGATTCCTATGGCGATTCCTATGGCGATTCCT-TTCATGGAAACCG

-------ATGGCGATTCCTATGGCGATTCCT20

TTGTCGGATTTATGATATTAATGTACATTTTTGAAACT25

PPI-GmCPP

TACTTGGATGTGCGACAACATA

SOJA-Gm TTGTCGGATTTATGATATTAATGTACATTTTTGAAACTTACTTGGATGTGCGACAACATA

AT4gO1320 TCGTGGGTTTTATGATAGTGATGTACATTTTTGAGACGTATTTGGATCTGAGGCAACTCA

AF007269 TTACAGGTTTTATGATAGTGATGTACATTTTTGAGACGTATTTGGATCTGAGGCAACTCA

PPI-AtCPP TCGTGGGTTTTATGATAGTGATGTACATTTTTGAGACGTATTTGGATCTGAGGCAACTCA

SOJA_AT2 TCGTGGGTTTTATGATAGTGATGTACATTTTTGAGACGTATTTGGATCTGAGGCAACTCA afc1 TCGTGGGTTTTATGATAGTGATGTACATTTTTGAGACGTATTTGGATCTGAGGCAACTCA

SOJA_AT1 TCGTGGGTTTTATGATAGTGATGTACATTTTTGAGACGTATTTGGATCTGAGGCAACTCA

PPI-BnCPP TCGTTGGTTTTATGATAGTGATGTACGTTTTTGAGACGTATTTGGATCTGAGGCAACATA

SOJA-Milho -----------------------------------------------------------PPI-GmCPP GGGCCCTCAAACTTCCTACTCTTCCAAAGACTTTAGAGGGTGTTATCAGCCAAGAGAAAT

SOJA-Gm GGGCCCTCAAACTTCCTACTCTTCCAAAGACTTTAGAAGGTGTTATCAGCCAAGAGAAAT

AT4g01320 CTGCTCTCAAGCTTCCAACTCTCCCGAAAACCTTGGTTGGTGTAATTAGCCAAGAGAAGT

AF007269 CTGCTCTCAAGCTTCCAACTCTCCCGAAAACCTTGGTTGGTGTAATTAGCCAAGAGAAGT

211

PPI-AtCPP CTGCTCTCAAGCTTCCAACTCTCCCGAAAACCTTGGTTGGTGTAATTAGCCAAGAGAAGT

SOJA AT2 CTGCTCTCAAGCTTCCAACTCTCCCGAAAACCTTGGTTGGTGTAATTAGCCAAGAGAAGT afc1 CTGCTCTCAAGCTTCCAACTCTCCCGAAAACCTTGGTTGGT10

GTAATTAGCCAAGAGAAGT

SOJAAT1 CTGCTCTCAAGCTTCCAACTCTCCCGAAAACCTTGGTTGGTGTAATTAGCCAAGAGAAGT

PPI-BnCPP CTGCTCTCAAGCTTCCCACTCTCCCAAAGACTTTGGTTGGAGTCATTAGCCAAGAGAAGT

SOJA-Milho -----------------------------------------------------------15

PPI-GmCPP

TTGAGAAATCTAGAGCCTATAGSOJA-Gm

TTGAGAAATCTAGAGCCTATAG

AT4g01320

TTGAGAAATCACGAGCATACAG

AF007269 TTGAGAAATCACGAGCATACAGTCTTGACAAAAGGTTTCGTCTTGATCATATTTATATCA

PPI-AtCPP TTGAGAAATCACGAGCATACAG-----------------------------------SOJA_AT2 TTGAGAAATCACGAGCATACAG--------------------------------25 — afc1 TTGAGAAATCACGAGCATACAG-------------------------------------SOJA_AT1 TTGAGAAATCACGAGCATACAG--------------------------------PPI-BnCPP —

SOJA-Milho

TTGAGAAATCTCGAGCTTACAG-----------------------------------

PPI-GmCPP ------------------------------------------TCTTGATAAA—AGCCA

SOJA-Gm ------------------------------------------TCTTGATAAA—AGCCA

AT4g01320 -----------------------GGATATCATCACTGAGAACTTTAATATATGCAGCTA AF007269 TTTTAGTTTTTTATAATTGCCAGGGG? GAACTTTAATATATGCAGCTA

PPI-AtCPP ------------------------------------------TCTTGACAAA—AGCTA

SOJA AT2 ------------------------------------------TCTTGACAAA—AGCTA afc1 ------------------------------------------TCTTGACAAA—AGCTA

SOJA_AT1 ------------------------------------------TCTTGACAAA—AGCTA

PPI-BnCPP ------------------------------------------TCTTGACAAA—AGCCA

SOJA-Milho -----------------------------------------------------------PPI-GmCPP CTTCCATTTTGTTCACGAGTTTGTGACAATAGTGACAGACTCTACAATTTTGTACTTTGG _Γ 4«™λ_ ^¼¾^ ‘ · ^J - «toUfciuw — a _ L n. -^~ >^+* Λ-ΛχζοΧ^ íi^-w&ix· Λ 5 P»rt ~ «T *&. <^·^ “_. í

212

SOJA-Gm CTTCCATTTTGTTCACGAGTTTGTGACAATAGTGACAGACTCTACAATTTTGTACTTTGG

AT4gO1320 TTTTCACTTTGTTCATGAGTTTGTAACTATACTTATGGACTCTGCAATTTTGTTCTTTGG

AF007269 TTTTCACTTTGTTCATGAGTTTGTAACTATACTTATGGACTCTGCAATTTTGTTCTTTGG

PPI-AtCPP TTTTCACTTTGTTCATGAGTTTGTAACTATACTTATGGACTCTGCAATTTTGTTCTTTGG

SOJA_AT2 TTTTCACTTTGTTCATGAGTTTGTAACTATACTTATG10 GACTCTGCAATTTTGTTCTTTGG afc1 TTTTCACTTTGTTCATGAGTTTGTAACTATACTTATGGACTCTGCAATTTTGTTCTTTGG

SOJA_AT1 TTTTCACTTTGTTCATGAGTTTGTAACTATACTTATGGACTCTGCAATTTTGTTCTTTGG

PPI-BnCPP TTTTCACTTTGTTCATGAGTTTGTTACTATACTTATGGACTCTGCGATTCTGTTCTTTGG

SOJA-Milho -----------------------------------------------------------PPI-GmCPP

GGTATTGCCCTGGTTTTGGAAG —

SOJA-Gm

GGTATTGCCCTGGTTTTGGAAG------------------AT4g01320

GATCTTGCCTTGGTTTTGGAAG

AF007269 GATCTTGCCTTGGTTTTGGAAGGTACATATCTGGTTTCGGTATACAGTATCTCATTTTGA

PPI-AtCPP GATCTTGCCTTGGTTTTGGAAG-----------------------------------SOJA_AT2 GATCTTGCCTTGGTTTTGGAAG----------------------------------30 — afc1 GATCTTGCCTTGGTTTTGGAAG-------------------------------------SOJA_AT1 GATCTTGCCTTGGTTTTGGAAG----------------------------------PPI-BnCPP GATCTTGCCTTGGTTTTGGAAG----------------------------------35 —

SOJA-Milho -----------------------------------------------------------PPI-GmCPP ------------------------------------------------AAATCAGGAGAT

SOJA-Gm ------------------------------------------------AAATCAGGAGAT

AT4g01320 ------------------------------------------------ATGTCTGGAGCT

AF007269 ATATAGAGTTGTTACATTACAATTGTAAAGTTTTCATTTTTACCTTAG ATGTCTGGAGCT

PPI-AtCPP -----------------------------------------------ATGTCTGGAGCT

SOJA AT2

------------------------------------------------ATGTCTGGAGCA afc1 SOJA_AT1 PPI-BnCPP SOJA-Milho

ATGTCTGGAGCT

-------ATGTCTGGAGCT

-------ATATCTGGCGGC

213

PPI-GmCPP TTTATGACAATAGCTGGTTTCAATGCTGAGAATGAAATACTGCATACCCTTGCCTTCTTA SOJA-Gm TTTATGACAATAGCTGGTTTCAATGCTGAGAATGAAATACTGCATACCCTTGCCTTCTTA

AT4gO1320 GTTTTACCGAGGTTGGGCCTTGATCCAGAGAATGAAATACTGCATACTCTTTCATTCTTG

AF007269 GTTTTACCGAGGTTGGGCCTTGATCCAGAGAATGAAATACTGCATACTCTTTCATTCTTG

PPI-AtCPP GTTTTACCGAGGTTGGGCCTTGATCCGGAGAATgaaatactgcatactctttcattcttg

SOJAAT2 GTTTTACCGAGGTTGGGCCTTGATCCAGAGAATGAAATACTGCATACTCTTTCATTCTTG afc1 GTTTTACCGAGGTTGGGCCTTGATCCAGAGAATGAAATACTGCATACTCTTTCATTCTTG

SOJAAT1 GTTTTACCGAGGTTGGGCCTTGATCCAGAGAATGAAATACTGCATACTCTTTCATTCTTG

PPI-BnCPP TTTCTACCAATGGTGGGACTCGATCCAGAGAATGAAATCCTGCACACTCTTTCATTCTTG

SOJA-Milho -----------ACGAGGCTGAGTGCTGAGAATGAGATAATACACACCCTTGCTTTCTTA ★ * * * ******** ** * ** ** *** * *****

GCAGGGCTGATGATTTGGTCACAG

PPI-GmCPP

SOJA-Gm	GCAGGGCTGATGATTTGGTCACAG------------------------------
AT4g01320	GCTGGTGTTATGACATGGTCACAG------------------------------

AF007269 GCTGGTGTTATGACATGGTCACAGGTGTTCCAAATAAACCCCTTCATATAGTCCTATACG

PPI-AtCPP	GCTGGTGTTATGACATGGTCACAG-------------------------------
SOJA AT2	GCTGGTGTTATGACATGGTCACAG------------------------------

afc1 GCTGGTGTTATGACATGGTCACAG

SOJAAT1	GCTGGTGTTATGACATGGTCACAG-
PPI-BnCPP	GCTGGTGTTATGACATGGTCACAG-
SOJA-Milho	GCTGGTTCCATGGTTTGGTCGCAG
** **	*** ***** **

PPI-GmCPP -----------------------------------------------------------SOJA-Gm -----------------------------------------------------------AT4g01320 -----------------------------------------------------------AF007269 TTTAGCATCAAAATATCTATTTTCTTAAGATAATAATATTTCTTTTATATTCTGATGCAG

PPI-AtCPP -----------------------------------------------------------SOJA_AT2 ------------------------------------------------------------

214 afc1 ---------------------------------------

S0JA_AT1 -----------------------------------------------------------PPI-BnCPP -----------------------------------------------------------SOJA-Milho -----------------------------------------------------------PPI-GmCPP ATAACAGATTTGCCCTTTTCTCTGTACTCAACTTTTGTGATTGAGGCCCGTCATGGTTTT

SOJA-Gm ATAACAGATTTGCCCTTTTCTCTGTACTCAACTTTTGTGATTGAGGCCCGTCATGGTTTT

AT4g01320 ATCACTGATTTGCCATTTTCTTTGTACTCAACTTTCGTGATCGAGTCTCGGCATGGGTTC

AF007269 ATCACTGATTTGCCATTTTCTTTGTACTCAACTTTCGTGATCGAGTCTCGGCATGGGTTC

PPI-AtCPP ATCACTGATTTGCCATTTTCTTTGTACTCAACTTTCGT15 GATCGAGTCTCGGCATGGGTTC

SOJA_AT2 ATCACTGATTTGCCATTTTCTTTGTACTCAACTTTCGTGATCGAGTCTCGGCATGGGTTC afc1 ATCACTGATTTGCCATTTTCTTTGTACTCAACTTTCGTGATCGAGTCTCGGCATGGGTTC

SOJA_AT1 ATCACTGATTTGCCATTTTCTTTGTACTCAACTTTCGTGATCGAGTCTCGGCATGGGTTC

PPI-BnCPP ATCACTGATTTGCCATTTTCTTTGTACTCAACTTTCGTGATCGAGTCTCGGCATGGGTTC

SOJA-Milho ATTACAGACTTGCCGTTCTCTCTCTATTCAACTTTTGT25 TATAGAGGCTCGACATGGTTTT ★ ★ ★★ ★★ ★★★★★ ★★ ★★★ ★ ★★ ★****★*★ ★★ ★★ * ★★ ★★★★★ ★★

PPI-GmCPP SOJA-Gm

AATAAG-----------------------------------------------------AATAAG-----------------------------------------------------30

AT4gO132O AACAAA-----------------------------------------------------AF007269 AACAAAGTATGTCGTATTTCCAACACTACCTTGTGACTTACGTTTTTTTATCAGAGATGT

PPI-AtCPP AACAAA-----------------------------------------------------SOJA_AT2 AACAAA-----------------------------------------------------35 afc1 AACAAA-----------------------------------------------------SOJA_AT1 AACAAA-----------------------------------------------------PPI-BnCPP AACAAA-----------------------------------------------------SOJA-Milho

AACAAG-----------------------------------------------------** **

PPI-GmCPP -------------------------------CAAACACCATGGTTATTCTTTAGGGACA

SOJA-Gm -------------------------------CAAACACCATGGTTATTCTTTAGGGACA

AT4g01320 -------------------------------45 CAAACAATATGGATGTTCATTAGGGACA AF007269 GGATTAAATTTGCTTCTAAATTCTGTTGACAGCAAACAATATGGATGTTCATTAGGGACA

PPI-AtCPP -----------------------------—

CAAACAATATGGATGTTCATTAGGGACA

Υ __7 . < °^Α _ “ * * *·' — »>r_ —«· Α,-ίΛ-,Α W .-.(, W1— _? λ Α-Α,ρ.4-Ζ «Mji a _f,^.. te, —*_ < -_t - ΐ^«Σ* ÜS>«-^W 7»-. V—» ,« A4x _t,j_HííãSl

215

S0JA_AT2 -------------------------------CAAACAATATGGATGTTCATTAGGGACA afc1 -------------------------------CAAACAATATGGATGTTCATTAGGGACA

S0JA_AT1 -------------------------------CAAACAATATGGATGTTCATTAGGGACA

PPI-BnCPP -------------------------------CAAACAATATGGATGTTCATTAGGGACA

SOJA-Milho -------------------------------10 CAAACTATATGGCTCTTCATTAGGGATA

PPI-GmCPP TGCTTAAAGGAATTTTCCTTTCTGTAATAATTGGTCCACCTATTGTGGCTGCAATCATTG

SOJA-Gm TGCTTAAAGGAATTTTCCTTTCCGTAATAATTGGTCCACCTATTGTGGCTGCAATCATTG

AT4gO1320 TGATCAAAGGAACATTCCTCTCTGTCATACTAGGCCCACCCATTGTTGCTGCGATAATTT

AF007269 TGATCAAAGGAACATTCCTCTCTGTCATACTAGGCC20 CACCCATTGTTGCTGCGATAATTT

PPI-AtCPP TGATCAAAGGAACATTCCTCTCTGTCATACTAGGCCCACCCATTGTTGCTGCGATAATTT

SOJA_AT2 TGATCAAAGGAACATTCCTCTCTGTCATACTAGGCCCACCCATTGTTGCTGCGATAATTT afc1 TGATCAAAGGAACATTCCTCTCTGTCATACTAGGCCCACCCATTGTTGCTGCGATAATTT

SOJA_AT1 TGATCAAAGGAACATTCCTCTCTGTCATACTAGGCCCACCCATTGTTGCCGCGATAATTT

PPI-BnCPP TGATCAAAGGAATACTCCTCTCTGTCATACCTGCCCC30 TCCTATCGTTGCCGCAATTATTG SOJA-Milho TGATCAAAGGAATTTTACTATCCATGATATTGGGGCCACCAATCGTGGCTGCTATCATCT ** * ******* * ** ** * *★★ * ★* ** ** ★* ★* ** ** **

PPI-GmCPP

TAATAGTACAG------------------------------------------------SOJA-Gm

TAATAGTACAG---------------------------AT4g01320 TCATAGTCCAG------------------------------------------------AF007269 TCATAGTCCAGGTTTGATGATTCTGGATTCATCTTATT40

TCTGAGTTTTTCACATGGATGA

PPI-AtCPP TCATAGTCCAG--------------------------------------------SOJA_AT2 TCATAGTCCAG-------------------------------------------afc1 TCATAGTCCAG------------------------------------------------SOJA AT1

TCATAGTCCAG------------------------------------------------PPI-BnCPP SOJA-Milho

TTATAGTTCAG------------------------------------------------ACATAGTACAG------------------------------------------------***** ***

PPI-GmCPP SOJA-Gm AT4g01320

216

AF007269 CTATTCTCCATTGAGTGTGAGCTTCAAAGTTTTTAGTTTTCGTGTTAAAAATTTAAAATT

PPI-AtCPP -----------------------------------------------------------SOJAAT2 -----------------------------------------------------------5 afc1 -----------------------------------------------------------S0JA_AT1 -----------------------------------------------------------PPI-BnCPP -----------------------------------------------------------SOJA-Milho -----------------------------------------------------------10 PPI-GmCPP -----------------------------------AAAGGAGGTCCATACTTGGCCATC SOJA-Gm -----------------------------------AAAGGAGGTCCATACTTGGCCATC AT4g01320 -----------------------------------15 AAAGGAGGTCCTTATCTTGCCATC t Φ AF007269 TGCTTCTCTGAGCATGAAGTTTCTATCTTTTTCCAGAAAGGAGGTCCTTATCTTGCCATC

PPI-AtCPP -----------------------------------AAAGGAGGTCCTTATCTTGCCATC

SOJAAT2 -----------------------------------AAAGGAGGTCCTTATCTTGCCATC afc1 ------------------------------------AAAGGAGGTCCTTATCTTGCCATC

SOJA_AT1 -----------------------------------AAAGGAGGTCCTTATCTTGCCATC

PPI-BnCPP -----------------------------------AAAGGAGGTCCTTACCTCGCCATC SOJA-Milho -----------------------------------ATTGGAGGACCTTACCTGGCTATA • * ***** ** ** * ** **

PPI-GmCPP TATCTTTGGGTTTTTACGTTTGGTCTTTCTATTGTGATGATGACCCTTTATCCAGTACTA

SOJA-Gm TATCTTTGGGTTTTTACGTTTGGTCTTTCTATTGTGATX g GATGACCCTTTATCCAGTACTA

AT4gO1320 TATCTGTGGGCATTCATGTTTATCCTGTCTCTAGTGAT35 GATGACTATATACCCGGTCTTG

AF007269 TATCTGTGGGCATTCATGTTTATCCTGTCTCTAGTGATGATGACTATATACCCGGTCTTG

PPI-AtCPP TATCTGTGGGCATTCATGTTTATCCTGTCTCTAGTGATGATGACTATATACCCGGTCTTG

SOJA_AT2 TATCTGTGGGCATTCATGTTTATCCTGTCTCTAGTGATGATGACTATATACCCGGTCTTG afc1 TATCTGTGGGCATTCATGTTTATCCTGTCTCTAGTGATGATGACTATATACCCGGTCTTG

SOJA_AT1 TATCTGTGGGCATTCATGTTTATCCTGTCTCTAGTGAT45 GATGACTATATACCCGGTCTTG

PPI-BnCPP TATCTGTGGGCATTCATGTTTATCCTGTCTCTAGTGATGATGACTATATACCCTGTTTTG

SOJA-Milho TATCTCTGGGGTTTTATGTTTGTATTAGCTCTACTGATGATGACAATATACCCCATTGTG

, 217 i

***** **** ** * **** * ** * ********** ***** * *

PPI-GmCPP

ATAGCTCCACTCTTCAATAAGTTCACTCCA·

SOJA-Gm

AT4g01320

ATAGCTCCACTCTTCAATAAGTTCACTCCA·

ATAGCACCGCTCTTCAACAAGTTCACTCCT·

ATAGCACCGCTCTTCAACAAGTTCACTCCTGTGTGTATT-

AF007269

TCTGTCATGGCCATTTTACAA

PPI-AtCPP

ATAGCACCGCTCTTCAACAAATTCACTCCTSOJA AT2 afc1

SOJA AT1

ATAGCACCGCTCTTCAACAAGTTCACTCCT·

ATAGCACCGCTCTTCAACAAGTTCACTCCT------------------------ATAGCACCGCTCTTCAACAAGTTCACTCCT------------------PPI-BnCPP

---------SOJA-Milho

ATTGCACCTCTTTTCAACAAGTTCACTCCT-------------------ATAGCTCCTCTGTTCAACAAGTTCACTCCT------------------** ** ** ** ***** ** ********

PPI-GmCPP -----------------------------------------------------------SOJA-Gm -----------------------------------------------------------AT4g01320 -----------------------------------------------------------AF007269 TTCACTGCTTGTTTGCATATGTTGTTACCAGACAATATAATCTCCCGCTTTTTTATGGCT

PPI-AtCPP -----------------------------------------------------------SOJA_AT2 -----------------------------------------------------------afc1 -----------------------------------------------------------SOJA_AT1 -----------------------------------------------------------PPI-BnCPP -----------------------------------------------------------SOJA-Milho -----------------------------------------------------------PPI-GmCPP

CTTCCAGATGGTCAACTCAGGGAGAAAATCGAGAAACTTGCTTCCTCCCTCAACTA

SOJA-Gm

CTTCCAGATGGTCAACTCAGGGAGAAAATCGAGAAACTTGCTTCCTCCCTCAACTA

AT4g01320

CTTCCAGATGGAGACCTCCGGGAGAAGATTGAGAAACTTGCTTCTTCTCTAAAGTT

AF007269 ATAGCTTCCAGATGGAGACCTCCGGGAGAAGATTGAGAAACTTGCTTCTTCTCTAAAGTT

PPI-AtCPP

CTTCCAGATGGAGACCTCCGGGAGAAGATTGAGAAACTTGCTTCTTCCCTAAAGTT

218

A®

SOJA_AT2

CTTCCAGATGGAGACCTCCGGGAGAAGATTGAGAAACTTGCTTCTTC-

TCTAAAGTT afc1

CTTCCAGATGGAGACCTCCGGGAGAAGATTGAGAAACTTGCTTCTTCTCTAAAGTT

SOJA_AT1

CTTCCAGATGGAGACCTCCGGGAGAAGATTGAGAAACTTGCTTCTTCTCTAAAGTT

PPI-BnCPP

CTTCCTGATGGAGACCTCCGGGAGAAGATTGAGAAACTTGCTTCTTCTCTAAAGTT

SOJA-Milho

CTTCCTGAAGGAGTCCTCAGGGAAAAAATAGAGAAGCTGGCAGCTTCCCTCAAGTT ***** ** ** *** **** ** ** ***** ** ** * ** ** ** *

PPI-GmCPP TCCGTTAAAGAAACTATTTGTTGTCGATGGATCCACAAGATCAAGTCACAGCAATG—SOJA-Gm TCCGTTAAAGAAACTATTTGTTGTCGATGGATCCACAAGATCAAGTCACAGCAATG—AT4gO1320 TCCTTTGAAGAAGCTGTTTGTTGTCGATGGATCTACAAGGTCAAGCCATAGCAATG—

AF007269 TCCTTTGAAGAAGCTGTTTGTTGTCGATGGATCTACAAGGTCAAGCCATAGCAATGTGAG

PPI-AtCPP TCCTTTGAAGAAGCTGTTTGTTGTCGATGGATCTACAAGGTCAAGCCATAGCAATG—SOJA_AT2 TCCTTTGAAGAAGCTGTTTGTTGTCGATGGATCTACAAGGTCAAGCCATAGCAATG— afc1 TCCTTTGAAGAAGCTGTTTGTTGTCGATGGATCTACAAGGTCAAGCCATAGCAATG—

SOJA_AT1 TCCTTTGAAGAAGCTGTTTGTTGTCGATGGATCTACAAGGTCAAGCCATAGCAATG—

PPI-BnCPP TCCTCTGAAGAAGCTGTTTGTTGTCGATGGATCTACAAGGTCAAGCCATAGTAATG—

SOJA-Milho TCCTTTGAAAAAGCTTTTCGTGGTAGATGGGTCTACCAGATCAAGCCACAGTAATG—*** * ** ** ** ** *★ ** ***** ** ** ★* ***** ** ** ****

PPI-GmCPP -----------------------------------------------------------SOJA-Gm -----------------------------------------------------------AT4g01320 -----------------------------------------------------------AF007269 AAGCTTGAGATCTCTTCCTACCTACTTTACTCTAGTTTACCATTAGAAGCTTACGTATCT

PPI-AtCPP -----------------------------------------------------------SOJA_AT2 -----------------------------------------------------------afc1 -----------------------------------------------------------SOJA_AT1 -----------------------------------------------------------PPI-BnCPP -----------------------------------------------------------SOJA-Milho -----------------------------------------------------------219

PPI-GmCPP ---------------CCTATATGTATGGATTCTTCAAGAACAAGAGGATTGTCCCTTAT SOJA-Gm ---------------5 CCTATATGTATGGATTCTTCAAGAACAAGAGGATTGTCCTTTAT

AT4g01320 ---------------CTTACATGTATGGTTTCTTTAAGAACAAAAGGATTGTTCTTTAT AF007269 TGTTACATCATACAGGCTTACATGTATGGTTTCTTTAAGAACAAAAGGATTGTTCTTTAT

PPI-AtCPP ---------------CTTACATGTATGGTTTCTTTAAGAACAAAAGGATTGTTCTTTAT

SOJA_AT2 ---------------CTTACATGTATGGTTTCTTTAAGAACAAAAGGATTGTTCTTTAT

afc1 ---------------CTTACATGTATGGTTTCTTTAAGAACAAAAGGATTGTTCTTTAT

SOJA_AT1 ---------------CTTACATGTATGGTTTCTTTAAGAACAAAAGGATTGTTCTTTAT

PPI-BnCPP ---------------CTTACATGTATGGTTTCTTCAAGAACAAAAGGATTGTTCTTTAT

SOJA-Milho ---------------CCTACATGTATGGTTTTTTCAAGAACAAGCGCATAGTACTCTAT ★ ** ******** ** ** ******** * ** ** * ***

PPI-GmCPP

GACACATTAATTCAACAG-----------------------------------------SOJA-Gm

GACACATTAATTCAACAG-----------------------------------------25

AT4g01320 GATACGTTGATTCAGCAG-----------------------------------------AF007269 GATACGTTGATTCAGCAGGTACTGTGACTCTTGATGCTTCAAACG AG CTATACTCACATT

PPI-AtCPP GATACGTTGATTCAGCAG-----------------------------------------SOJA AT2 GATACGTTGATTCAGCAG------------------------------------------

afc1

SOJA_AT1 PPI-BnCPP SOJA-Milho ** ** ** ***** ***

GATACGTTGATTCAGCAG------GATACGTTGATTCAGCAGGACACATTGATTCAGCAGGACACATTGATTCAGCAG

PPI-GmCPP --------------------------------------------TGCAAAGACGATGAGG

SOJA-Gm --------------------------------------------TGCAAAGACGATGAGG

AT4g01320 --------------------------------------------TGCAAGAATGAGGATG

AF007269 TCTGTTTCTGGTTCTGAAACATAACATAATCTTCTATTGT40 GCAGTGCAAGAATGAGGATG

PPI-AtCPP

--------------------------------------------TGCAAGAATGAGGATG

SOJA_AT2 --------------------------------------------TGCAAGAATGAGGATG afc1 --------------------------------------------TGCAAGAATGAGGATG

SOJA_AT1

PPI-BnCPP

SOJA-Milho

--------------------------------------------TGCAAGAATGAGGATG --------------------------------------------TGCCAGAATGAGAATG --------------------------------------------TGTAGCAATGAGGATG * ** * *

&e~, 4λί~<τ ?:

220

PPI-GmCPP AAATTGTTGCTGTTATTGCCCATGAGTTGGGACACTGGAAGCTCAACCATACTGTGTACA

SOJA-Gm AAATTGTTGCTGTTATTGCCCATGAGTTGGGACACTGGAAGCTCAACCATACTGTGTACA

AT4gO1320 AAATTGTGGCGGTTATTGCACACGAGCTTGGACATTGGAAACTGAATCACACTACATACT

AF007269 AAATTGTGGCGGTTATTGCACACGAGCTTGGACATTGGAAACTGAATCACACTACATACT

PPI-AtCPP AAATTGTGGCGGTTATTGCACACGAGCTTGGACATTGGAAACTGAATCACACTACATACT

SOJA_AT2 AAATTGTGGCGGTTATTGCACACGAGCTTGGACATTGGAAACTGAATCACACTACATACT afc1 AAATTGTGGCGGTTATTGCACACGAGCTTGGACATTGGAAACTGAATCACACTACATACT

SOJA_AT1 AAATTGTGGCGGTTATTGCACACGAGCTTGGACATTGGAAACTGAATCACACTACATACT

PPI-BnCPP AAATTGTGGCGGTTATTGCACACGAGCTGGGACACTGGAAGCTGAATCACACTACATACT

SOJA-Milho AGATAGTTTCTGTTATAGCACATGAACTTGGACACTGGAAACTCAATCATACTGTCTATT ***** * ***** ** ** ** * ***** ***** ** ** ** *** **

PPI-GmCPP CATTTGTTGCTATGCAG------------------------------------------SOJA-Gm CATTTGTTGCTATGCAG------------------------------------------AT4g01320 CGTTCATTGCAGTTCAA------------------------------------------AF007269 CGTTCATTGCAGTTCAAGTGAGGCTCAACCGACAGTTCAAAAACTTACTCACATCTACAT

PPI-AtCPP CGTTCATTGCAGTTCAA------------------------------------------SOJA_AT2 CGTTCATTGCAGTTCAA------------------------------------------afc1 CGTTCATTGCAGTTCAA------------------------------------------SOJA_AT1 PPI-BnCPP SOJA-Milho

CGTTCATTGCAGTTCAA------------------------------------------CGTTCATTGCTGTTCAA------------------------------------------CCTTTGTAGCTGTCCAG------------------------------------------* ** * ** * **

PPI-GmCPP ---------------- -ATTCTTACA

SOJA-Gm ---------------------------------------------------ATTCTTACA

AT4g01320 ATCCTTGCC

AF007269 TTCACTTAAGAAATCATGTCTTATGACCCTCTCTCAATGTTTTGCTTGCAGATCCTTGCC

PPI-AtCPP ---------------------------------------------------ATCCTTGCC

SOJA_AT2 ---------------------------------------------------ATCCTTGCC afc1 ---------------------------------------------------ATCCTTGCC

SOJA_AT1 ---------------------------------------------------ATCCTTGCC

PPI-BnCPP --------------------------------------------------ATCCTTGCC

SOJA-Milho ---------------------------------------------------CTGCTTATG

PPI-GmCPP CTTCTACAATTTGGAGGATATACACTAGTGCGAAATTCAGCTGATCTGTATCGAAGCTTT

221

SOJA-Gm CTTCTACAATTTGGAGGATATACACTAGTGCGAAATTCAGCTGATCTGTATCGAAGCTTT

AT4gO1320 TTCTTACAATTTGGAGGATACACTCTTGTCAGAAACTCCACTGATCTCTTCAGGAGTTTC

AF007269 TTCTTACAATTTGGAGGATACACTCTTGTCAGAAACTCCACTGATCTCTTCAGGAGTTTC

PPI-AtCPP TTCTTACAATTTGGAGGATACACTCTTCTCAGAAACTCCACTGATCTCTTCAGGAGTTTC

SOJA_AT2 TTCTTACAATTTGGAGGATACACTCTTGTCAGAAACTCCACTGATCTCTTCAGGAGTTTC afc1 TTCTTACAATTTGGAGGATACACTCTTGTCAGAAACTCCACTGATCTCTTCAGGAGTTTC

SOJA_AT1 TTCTTACAATTTGGAGGATACACTCTTGTCAGAAACTCCACTGATCTCTTCAGGAGTTTC

PPI-BnCPP TTCTTGCAATTTGGAGGATACACTCTTGTCAGAAACTCCACTGATCTCTTCAGGAGTTTT

SOJA-Milho TTTCTTCAATTTGGAGGATATACTCTAGTAAGGAGCTCCAAAGATCTATTTGGAAGTTTT * ★ ************** ** * * * ** ***** ★ *

PPI-GmCPP GGGTTTGATACGCAGCCAGTCCTCATTGGGCTCATCATATTTCAG--------------SOJA-Gm GGGTTTGATACGCAGCCAGTCCTCATTGGGCTCATCATATTTCAG--------------AT4gO1320 GGATTTGATACACAGCCTGTTCTCATTGGTTTGATCATATTTCAG--------------AF007269 GGATTTGATACACAGCCTGTTCTCATTGGTTTGATCATATTTCAGGTTTGTTATTTTTGC

PPI-AtCPP GGATTTGATACACAGCCTGTTCTCATTGGTTTGATCATATTTCAG--------------SOJA_AT2 GGATTTGATACACAGCCTGTTCTCATTGGTTTGATCATATTTCAG--------------afc1 GGATTTGATACACAGCCTGTTCTCATTGGTTTGATCATATTTCAG--------------SOJA_AT1 GGATTTGATACACAGCCTGTTCTCATTGGTTTGATCATATTTCAG--------------PPI-BnCPP GGTTTTGATACACAACCAGTTCTCATTGGTTTGATCATATTTCAG--------------SOJA-Milho GGCTTCAAGGACCAGCCAGTAATAATTGGATTGATCATTTTCCCG--------------** ** * ** ★* ** * ***** * ***** ** * ★

PPI-GmCPP -----------------------------------------------------------SOJA-Gm -----------------------------------------------------------AT4g01320 -----------------------------------------------------------AF007269 CTTTTGACACTAATCTAATGAATCAAGGATGGATTAAGAAAAAAAAACTCTAAACCTTTG

PPI-AtCPP -----------------------------------------------------------SOJA_AT2 ------------------------------------------------------------

222 afc1 -----------------------------------------------------------S0JA_AT1 -----------------------------------------------------------PPI-BnCPP -----------------------------------------------------------SOJA-Milho -----------------------------------------------------------5 PPI-GmCPP ------------------------—

CATACTGTAATCCCACTTCAGCAATTGGTCAGC SOJA-Gm --------------------------CATACTGTAATCCCACTTCAGCAATTGGTCAGC

AT4g01320 --------------------------10 CACACTGTAATACCACTGCAACATCTAGTAAGC

AF007269 GTTATATCTCCTGTCTGATTATCACAGCACACTGTAATACCACTGCAACATCTAGTAAGC

PPI-AtCPP --------------------------CACACTGTAATACCACTGCAACATCTAGTAAGC

SOJA_AT2 --------------------------CACACTGTAATACCACTGCAACATCTAGTAAGC afc1 --------------------------CACACTGTAATACCACTGCAACATCTAGTAAGC

SOJA_AT1 --------------------------20 CACACTGTAATACCACTGCAACATCCAGTAAGC

PPI-BnCPP --------------------------CACACTGTAATACCACTTCAACACCTAGTAAGC

SOJA-Milho --------------------------CACACCATAATACCCATCCAACACCTTCTGAGC nr ** ** **** ** * ** ** * ***

PPI-GmCPP TTTGGTCTGAACCTAGTCAGCCGATCATTTGAATTT-

CAGG-------------------SOJA-Gm TTTGGTCTGAACCTAGTCAGCCGATCATTTGAATTT30 CAGG-------------------AT4gO1320 TTTGGCCTGAACCTCGTTAGTCGAGCGTTTGAGTTTCAGG-------------------AF007269 TTTGGCCTGAACCTCGTTAGTCGAGCGTTTGAGTTTCAGGTACCATCTTACAATCCCTCA

PPI-AtCPP TTTGGCCTGAACCTCGTTAGTCGAGCGTTTGAGTTTCAGG-------------------SOJA_AT2 TTTGGCCTGAACCTCGTTAGTCGAGCGTTTGAGTTTCAGG-------------------afc1 TTTGGCCTGAACCTCGTTAGTCGAGCGTTTGAGTTTCAGG—

---------------SOJA_AT1 TTTGGCCTCAACCTTGTTAGTCGAGCGTTTGAGTTTCAGG-------------------PPI-BnCPP TTTGACCTCAACCTTGTTAGTCGAGCGTTTGAGTTTCAGG-------------------45 SOJA-Milho TTTCGCCTGAACCTTGTCAGCAGAGCATTTGAATTTCAGG-------------------*** ** ***** ** ** ** * ***** *******

PPI-GmCPP SOJA-Gm

223

AT4g01320 ---------------------------——--------------------------AF007269 AGATCCAACCATAGTTTCTTTATTGCAATGGCAGCCTCATCTACTAATCTGAGTTAACGT

PPI-AtCPP -----------------------------------------------------------5 S0JAAT2 ---------------------------------------------------------— afc1 --------------------------------------------------------—

S0JA_AT1 -----------------------------------------------------------PPI-BnCPP ---------------------------------------------------------SOJA-Milho -----------------------------------------------------------0

PPI-GmCPP -----------CTGATGGCTTTGCCAAGAAGCTTGGATATGCATCTGGATTACGCGGTG SOJA-Gm -----------CTGATGGCTTTGCCAAGAAGCTTGGATATGCATCTGGATTACGCGGTG

AT4g01320 -----------CTGATGCTTTTGCTGTGAAGCTTGGCTATGCAAAAGATCTTCGTCCTG AF007269 TCCTTTTGCAGGCTGATGCTTTTGCTGTGAAGCTTGGCTATGCAAAAGATCTTCGTCCTG

PPI-AtCPP -----------20 CTGATGCTTTTGCTGTGAAGCTTGACTATGCAAAAGATCTTCGTCCTG SOJAAT2 -----------CTGATGCTTTTGCTGTGAAGCTTGGCTATGCAAAAGATCTTCGTCCTG afc1 -----------CTGATGCTTTTGCCGTGAAGCTTGGCTATGCAAAAGATCTTCGTCCTG 25 SOJA_AT1 -----------CTGATGCTTTTGCTGTGAAGCTTGGCTATGCAAAAGATCTTCGTCCTA PPI-BnCPP -----------CTGATGCTTTTGCAGTGAATCTTGGTTATGCAAAGGATCTACGTCCTG SOJA-Milho -----------30 CTGATGCCTTTGCCAAGAACCTTGGATATGCCCCTCAGCTCCGAGCAG

PPI-GmCPP

GTCTTGTGAAACTACAGG-----------------------------------------35

SOJA-Gm GTCTTGTGAAACTACAGG-----------------------------------------AT4gO1320 CTCTAGTGAAACTACAGGTCAGAGAAGATAACAACAGAACACAAACTGTTACCTCAATTT

AF007269 CTCTAGTGAAACTACAGGTCAGAGAAGATAACAACAGAACACAAACTGTTACCTCAATTT

PPI-AtCPP CTCTAGTGAAACTACAGG-----------------------------------------40 SOJA_AT2 CTCTAGTGAAACTACAGG-----------------------------------------afc1 CTCTAGTGAAACTACAGG------------------------------------------

SOJA AT1 PPI-BnCPP

CTCTAGTGAAACTACAGGCCCTAGTGAAGCTACAGG

SOJA-Milho

CCCTTGTTAAACTACAGG-----------------------------------------★★ ** ★★ *******

PPI-GmCPP ------------------------------------------AGGAGAATCTGTCAGCTA

SOJA-Gm ------------------------------------------AGGAGAATCTGTCAGCTA

AT4g01320 GTGTCACACACTTAAATGGATTTTTTGTTGGGATTTTGCAGGAAGAGAACTTATCAGCAA

224

AF007269 GTGTCACACACTTAAATGGATTTTTTGTTGGGATTTTGCAGGAAGAGAACTTATCAGCAA

PPI-AtCPP

------------------------------------------AAGAGAACTTATCAACAA

SOJA AT2

------------------------------------------AAGAGAACTTATCAGCAA afc1 ------------------------------------------AAGAGAACTTATCAGCAA

SOJA_AT1 ------------------------------------------AAGAGAACTTATCAGCAA

PPI-BnCPP ------------------------------------------AAGAGAACTTATCAGCGA

SOJA-Milho ------------------------------------------AGGAGAACTTGTCTGCGA * ***** * ** * *

PPI-GmCPP TGAATACAGATCCTTGGTACTCTGCTTATCACTATTCTCATCCTCCCCTTGTTGAAAGAT

SOJA-Gm TGAATACAGATCCTTGCT-CGTGCCG--------------------------15

AT4gO1320 TGAACACTGATCCATTGTACTCAGCTTATCACTACTCACATCCTCCTCTTGTTGAAAGGC

AF007269 TGAACACTGATCCATTGTACTCAGCTTATCACTACTCACATCCTCCTCTTGTTGAAAGGC

PPI-AtCPP TGAACACTGATCCATTGTACTCAGCTTATCACTACTCACATCCTCCTCTTGTTGAAAGGC

SOJAAT2 TGAAAACTGATCTATTGTACTCAGCTTATCACTACTCACATCCTCCTCTTGTTGAAAGGC afc1 TGAACACTGATCCATTGCACTCAGCTTATCACTACTCACATCCTCCTCTTGTTGAAAGGC

SOJA_AT1 TGAATACTGATCCATTGTACTCAGCTTATCACTACTCACATCCTCCTCTTGTTGAAAGGC

PPI-BnCPP TGAACACAGACCCATTGTACTCAGCTTATCACTACTCACACCCTCCTCTTGTAGAGAGGC

SOJA-Milho TGAACACCGATCCTTGGTATTCGGCATATCACTACTCCCACCCACCACTCGTCGAGAGGC **** ***** * **

PPI-GmCPP TGGCCGCGCTGGACGA—

ACCGGATAAGAAGGAAGACTAA------------------SOJA-Gm -----------------------------------------------------------AT4g01320 TTCGAGCCATTGATGG—

AGAAGACAAGAAGACAGATTAA------------------AF007269 TTCGAGCCATTGATGG—

AGAAGACAAGAAGACAGATTAA------------------PPI-AtCPP TTCGAGCCACTGATGG—

AGAAGACAAGAAGACAGATTAA------------------SOJA_AT2 TTCGAGCCATTGATGG—

AGAAGACAAGAAGACAGATTAA------------------afc1 TTCGAGCCATTGATGG—AGAAGACAAGAAGACAGATTAA·

SOJA_AT1 TTCGAGCCATTGATGG—

AGAAGACAAGAAGACAGATTAA------------------PPI-BnCPP TTCGAGCCATTGATGG—

AGAAGACAAGAAGACAGATTAA------------------45

225

SOJA-Milho TGCAAGCTTTGGAAGATTCAGACGACAAAAAAGAAGATTAGTCGATCCTTGTATGAGGTT

PPI-GmCPP -----------------------------------------------------------SOJA-Gm -----------------------------------------------------------AT4g01320 -----------------------------------------------------------AF007269 -----------------------------------------------------------PPI-AtCPP -----------------------------------------------------------10 SOJA_AT2 -----------------------------------------------------------afc1 -----------------------------------------------------------15

SOJA_AT1 PPI-BnCPP SOJA-Milho CAGTGCTTGGATGGTGAGGGTTT

TACATATGGATTTTTCCCTGCCACATGCACACCGATT20

PPI-GmCPP SOJA-Gm AT4g01320 AF007269 PPI-AtCPP SOJA_AT2 afc1

SOJA_AT1 -----------------------------------------------------------25 PPI-BnCPP -----------------------------------------------------------SOJA-Milho TGACATAGGAGTGTTGTCAAAGCTTTAGAGTGCATCTTTCGGTCAGGTGCAACAGCCTTT

PPI-GmCPP -----------------------------------------------------------SOJA-Gm -----------------------------------------------------------AT4g01320 -----------------------------------------------------------AF007269 -----------------------------------------------------------PPI-AtCPP -----------------------------------------------------------35 SOJA_AT2 -----------------------------------------------------------afc1 -----------------------------------------------------------SOJA_AT1 -----------------------------------------------------------PPI-BnCPP -----------------------------------------------------------SOJA-Milho CGGTCATTGAGACATATAAGCGAATTAGCTAT40 TAAAAAAAACAGAACTGTTGCATCAAAA

PPI-GmCPP -----------------------------------------------------------SOJA-Gm -----------------------------------------------------------45 AT4g01320 ------------------------------------------------------------AF007269 -----------------------------------------------------------PPI-AtCPP -----------------------------------------------------------SOJA_AT2 -----------------------------------------------------------afc1 ------------------------------------------------------------

226

S0JA_AT1 -----------------------------------------------------------PPI-BnCPP -----------------------------------------------------------SOJA-Milho AAAAAAAAAAAAAAGAAACAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGAAAAAAAAAAAAAAAA

PPI-GmCPP ---------------------------------------------------SOJA-Gm ---------------------------------------------------AT4g01320 ---------------------------------------------------10 AF007269 ---------------------------------------------------PPI-AtCPP ---------------------------------------------------SOJA_AT2 ---------------------------------------------------afc1 ----------------------------------------------------

SOJA_AT1 ---------------------------------------------------15 PPI-BnCPP ---------------------------------------------------SOJA-Milho AAAAAGTGCTCTGCGTTGTTACCACTGCTTGCCCTATAGTGATCGTATCAGA

Tabela 18B. Análise de aminoácido clustalW de CaaX prenil protease

9:

10: AF007269

PPI-AtCPP PPI-BnCPP PPI-GmCPP SOJA_AT1 SOJA_AT2 SOJA-Milho SOJA-Gm

AFC1 SEQ ID NO:125 AT4g01320

SEQ ID NO:98

SEQ ID NO:110

SEQ ID NO:113

SEQ IDNO.U7

SEQ ID NO:119

SEQ ID NO:121

SEQ ID NO:123

SEQ ID NO:127

SEQ ID NO:129

MAFPYMEAWGFMILMYIFETYLDVRQHRALKLPTLPK35

PPI-GmCPP

TLEG-------VISQEKFEKSR

SOJA-Gm MAFPYMEAVVGFMILMYIFETYLDVRQHRALKLPTLPKTLEG-------VISQEKFEKSR

AF007269 MAIPFMETWGFMIVMYIFETYLDLRQLTALKLPTLPKTLI

AT4g-AtCPP MAIPFMETWGFMIVMYIFETYLDLRQLTALKLPTLPKTLV40 GVISQEKFEKSRAYRDIIT

SOJAAT2 MAIPFMETWGFMIVMYIFETYLDLRQLTALKLPTLPKTLVG-------VISQEKFEKSR

AFC1 MAIPFMETWGFMIVMYIFETYLDLRQLTALKLPTLPKTLVG-— —VISQEKFEKSR

SOJA_AT1 MAIPFMETWGFMIVMYIFETYLDLRQLTALKLPTLPKTLVG-------VISQEKFEKSR

PPI-AtCPP MAIPFMETVVGFMIVMYIFETYLDLRQLTALKLPTLPKTLVG------VISQEKFEKSR

227

PPI-BnCPP MAIPFMETVVGFMIVMYVFETYLDLRQHTALKLPTLPKTLVG-------VISQEKFEKSR

SOJA-Milho -----------------------------------------------------------PPI-GmCPP AYSLDKSHFHFVHEFVTIVTDSTILYFGVLPWFWKKSGDFMTIAGFNAENEILHTLAFLA

SOJA-Gm AYSLDKSHFHFVHEFVTIVTDSTILYFGVLPWFWKKSGDFMTIAGFNAENEILHTLAFLA

AF007269 -----------------------------------------------------------AT4g-AtCPP ENFNICSYFHFVHEFVTILMDSAILFFGILPWFWKMSGAVLPRLGLDPENEILHTLSFLA

SOJA_AT2 AYSLDKSYFHFVHEFVTILMDSAILFFGILPWFWKMSGAVLPRLGLDPENEILHTLSFLA

AFC1 AYSLDKSYFHFVHEFVTILMDSAILFFGILPWFWKMSGAVLPRLGLDPENEILHTLSFLA

SOJA_AT1 AYSLDKSYFHFVHEFVTILMDSAILFFGILPWFWKMSGAVLPRLGLDPENEILHTLSFLA

PPI-AtCPP AYSLDKSYFHFVHEFVTILMDSAILFFGILPWFWKMSGAVL20 PRLGLDPENEILHTLSFLA

PPI-BnCPP AYSLDKSHFHFVHEFVTILMDSAILFFGILPWFWKISGGFLPMVGLDPENEILHTLSFLA

SOJA-Milho -------------------------------------------TRLSAENEIIHTLAFLA

PPI-GmCPP GLMIWSQITDLPFSLYSTFVIEARHGFNKQTPWLFFRDMLKGIFLSVIIGPPIVAAIIVI

SOJA-Gm GLMIWSQITDLPFSLYSTFVIEARHGFNKQTPWLFFRDMLKGIFLSVIIGPPIVAAIIVI

AF007269 -------TDLPFSLYSTFVIESRHGFNKQTIWMFIRDMIKGTFLSVILGPPIVAAIIFI

AT4g-AtCPP GVMTWSQITDLPFSLYSTFVIESRHGFNKQTIWMFIRDMIKGTFLSVILGPPIVAAIIFI

SOJAAT2 GVMTWSQITDLPFSLYSTFVIESRHGFNKQTIWMFIRD35 MIKGTFLSVILGPPIVAAIIFI

AFC1 GVMTWSQITDLPFSLYSTFVIESRHGFNKQTIWMFIRDMIKGTFLSVILGPPIVAAIIFI

SOJA_AT1 GVMTWSQITDLPFSLYSTFVIESRHGFNKQTIWMFIRDMIKGTFLSVILGPPIVAAIIFI

PPI-AtCPP GVMTWSQITDLPFSLYSTFVIESRHGFNKQTIWMFIRDMIKGTFLSVILGPPIVAAIIFI

PPI-BnCPP GLMTWSQITDLPFSLYSTFVIESRHGFNKQTIWMFIRDMIKGILLSVIPAPPIVAAIIVI

SOJA-Milho GSMVWSQITDLPFSLYSTFVIEARHGFNKQTIWLFIRD45 MIKGILLSMILGPPIVAAIIYI **************.******** *.*.*★*.** .**.* ******** *

AFC1 VQKGGPYLAIYLWAFMFILSLVMMTIYPVLIAPLFNKFTPLPDGDLREKIEKLASSLKFP

228

SOJA AT1

VQKGGPYLAIYLWAFMFILSLVMMTIYPVLIAPLFNKFTPLPDGDLREKIEKLASSLKFP

PPI-AtCPP

VQKGGPYLAIYLWAFMFILSLVMMTIYPVLIAPLFNKFTPLPDGDLREKIEKLASSLKFP

PPI-BnCPP VQKGGPYLAIYLWAFMFILSLVMMTIYPVLIAPLFNKFTPLPDGDLREKIEKLASSLKFP

SOJA-Milho

VQIGGPYLAIYLWGFMFVLALLMMTIYPIVIAPLFNKFTPLPEGVLREKIEKLAASLKFP ** ********** * * *.,.***.**..************.* *********.**..*

PPI-GmCPP LKKLFVVDGSTRSSHSNAYMYGFFKNKRIVPYDTLIQQCKDDEEIVAVIAHELGHWKLNH

SOJA-Gm

LKKLFVVDGSTRSSHSNAYMYGFFKNKRIVLYDTLIQQCKDDEEIVAVIAHELGHWKLNH

AF007269

LKKLFVVDGSTRSSHSNAYMYGFFKNKRIVLYDTLIQQCKNEDEIVAVIAHELGHWKLNH

AT4g-AtCPP LKKLFVVDGSTRSSHSNAYMYGFFKNKRIVLYDTLIQQCKNEDEIVAVIAHELGHWKLNH

SOJA AT2

LKKLFWDGSTRSSHSNAYMYGFFKNKRIVLYDTLIQQCKNEDEIVAVIAHELGHWKLNH

AFC1

LKKLFWDGSTRSSHSNAYMYGFFKNKRIVLYDTLIQQCKNEDEIVAVIAHELGHWKLNH

SOJA AT1

LKKLFWDGSTRSSHSNAYMYGFFKNKRIVLYDTLIQQCKNEDEIVAVIAHELGHWKLNH

PPI-AtCPP

LKKLFVVDGSTRSSHSNAYMYGFFKNKRIVLYDTLIQQCK25

NEDEIVAVIAHELGHWKLNH

PPI-BnCPP

LKKLFWDGSTRSSHSNAYMYGFFKNKRIVLYDTLIQQCQNENEIVAVIAHELGHWKLNH

SOJA-Milho

LKKLFWDGSTRSSHSNAYMYGFFKNKRIVLYDTLIQQCSNEDEIVSVIAHELGHWKLNH

PPI-GmCPP

TVYTFVAMQILTLLQFGGYTLVRNSADLYRSFGFDTQPVLIGLIIFQHTVIPLQQLVSFG ****************************** ******** .,,***,*************

SOJA-Gm TVYTFVAMQILTLLQFGGYTLVRNSADLYRSFGFDTQPVLIGLIIFQHTVIPLQQLVSFG

AF007269 TTYSFIAV--------------------------------------QHTVIPLQHLVSFG

AT4g-AtCPP TTYSFIAVQILAFLQFGGYTLVRNSTDLFRSFGFDTQPV5 LIGLIIFQHTVIPLQHLVSFG

SOJA_AT2 TTYSFIAVQILAFLQFGGYTLVRNSTDLFRSFGFDTQPVLIGLIIFQHTV1PLQHLVSFG

AFC1 TTYSFIAVQILAFLQFGGYTLVRNSTDLFRSFGFDTQPVLIGLIIFQHTVIPLQHLVSFG

SOJA_AT1 TTYSFIAVQILAFLQFGGYTLVRNSTDLFRSFGFDTQPVLIGLIIFQHTVIPLQHPVSFG

PPI-AtCPP TTYSFIAVQILAFLQFGGYTLLRNSTDLFRSFGFDTQPVLIGLIIFQHTVIPLQHLVSFG

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Exemplo 32: Transformação de Plantas

As plantas transgênicas de Arabidopsis foram produzidas através do método de mergulhamento de plantas em florescência em uma cultu30 ra de Agrobacterium, com base no método de Andrew Bent em, Clough SJ e

Bent AF, 1998. Floral dipping: a simplified method for Agrobacteriummediated transformation of Arabidopsis thaliana. As plantas do tipo selvagem

231 'b-W^r foram cultivadas sob condições padronizadas até que a planta tivesse tanto flores em desenvolvimento quanto flores abertas. A planta foi vertida durante 2 minutos em uma solução de cultura de Agrobacterium carregando o constructo gênica apropriada. As plantas foram deixadas na horizontal em uma bandeja e foram cobertas durante dois dias para manter a umidade e então endireitadas e embaladas para continuar o crescimento e o desenvolvimento das sementes. A semente madura foi colhida em massa.

As plantas T1 transformadas foram selecionadas através da germinação e do cultivo em placas de MS contendo 50 μg/mL de canamicina. As plantas novas verdes resistentes à canamicina (Kan^R) foram identificadas após um crescimento de 2 semanas e transplantadas no solo. As plantas foram embaladas para garantir a autofertilização e a semente T2 de cada planta foi colhida separadamente. Durante o crescimento das plantas T1, amostras foliares foram colhidas, o DNA foi exraído e foram realizados o Southern blot e a análise da PCR.

As sementes T2 foram analisados em relação à segregação de Kan^R. Partindo destas linhagens que mostravam um fenótipo de resistência de 3:1, as plantas T2 foram cultivadas, embaladas durante a produção de sementes e a semente T3 foi colhida de cada linhagem. A semente T3 foi novamente utilizada para a análise da segregação de Kan^R e as linhagens exibindo o fenótipo de 100% de Kan^R foram selecionadas como linhagens homozigotas. A análise molecular e fisiológica adicional foi feita utilizando plantas novas T3.

Plantas transgênicas de Brassica napus, Glycine max e Zea maize foram produzidas utilizando a transformação mediada por Agrobacterium do tecido do pecíolo do cotilédone. As sementes foram esterilizadas como a seguir. As sementes foram umedecidas com etanol a 95% durante um período curto de tempo tal como 15 segundos. Aproximadamente 30 mL da solução de esterilização I foram adicionados (70% de Javex , 100 μί de Tween20) e mantidos durante aproximadamente 15 minutos. A solução I foi removida e substituída por 30 mL da solução II (0,25% de cloreto mercúrico, 100 μί de Tween20) e incubados durante aproximadamente 10 minutos. As

232

4'

232 ^K .Ri z sementes foram lavadas com pelo menos 500 mL de água esterilizada duplamente destilada e armazenadas em uma placa esterilizada. As sementes foram germinadas em placas de meio ¹/₂ MS, pH 5,8, suplementadas com 1% de sacarose e 0,7% de águar. Os cotilédones completamente expandi5 dos foram colhidos e colocados no Meio I (substâncias orgânicas mínimas de Murashige (MMO), 3% de sacarose, 4,5 mg/L de benzil adenina (BA), 0,7% de fitoágar, pH 5,8). Uma cultura de Agrobacterium contendo o constructo de ácido nucléico de interesse foi cultivada durante 2 dias em meio

Mínimo AB. Os explantas de cotilédones foram mergulhados de forma que somente a porção cortada do pecíolo ficasse em contato com a solução de Agrobacterium. Os explantas foram então embebidos em Meio I e mantidos durante 5 dias a 24°C, com ciclos de luz escuridão de 16,8 h.

Os explantas foram transferidos para o Meio II (Meio I, 300 mg/L de timentina) durante mais 7 dias e então para o Meio III (Meio II, 20 mg/L de canamicina). Qualquer tecido radicular ou de broto que tenha se desenvolvido naquele momento foi dissecado. Os explantas foram transferidos para placas frescas de Meio III após 14-21 dias. Quando o tecido de broto regenerado se desenvolveu, o tecido regenerado foi transferido para o Meio IV (MMO, 3% de sacarose, 1,0% de fitoágar, 300 mg/L de timentina, 20 mg/L de canamicina). Uma vez que o tecido saudável de broto se desenvolveu, o > tecido de broto dissecado de qualquer tecido de calo foi mergulhado em 10X de IBA e transferido para o Meio V (Murashige e Skooge (MS), 3% de sacarose, 0,2 mg/L do ácido indol butírico (IBA), 0,7% de ágar, 300 mg/L de timentina, 20 mg/L de canamicina) para o enraizamento. As plantículas sau25 dáveis foram transferidas para o solo. O método anterior, com ou sem modificações é adequado para a transformação de várias espécies de plantas incluindo Glycine max, Zea maize e algodão.

Glycine max, Zea maize e algodão transgênicos podem ser produzidos utilizando métodos baseados em Agrobacterium que são conheci30 dos pelo versado na técnica. Alternativamente, pode-se utilizar um método de transformação de bombardeio de biolística de partículas ou sem ser partículas. Um exemplo de transformação biolística sem ser com partículas é

233

fornecido no Pedido de Patente U.S. 20010026941. Este método foi utilizado para produzir plantas transgênicas de Glycine max e de Zea maize. As plantas viáveis são propagadas e as linhagens homozigotas são geradas. As plantas são testadas em relação à presença da tolerância á seca, fenótipos fisiológicos e bioquímicos que são descritos em outro lugar.

A tabela a seguir identifica os constructos e as espécies que foram transformadas.

Tabela 19 Lista de Transformação

SEQ ID N°: Constructo Espécie Transformada

99	pBII121-AtCPP	A. thaliana, B. napus
100	pBII121-HP-AtCPP	A. thaliana
131	pRD29A-AtCPP	A. thaliana, B. napus
132	pRD29A-HP-AtCPP	A. thaliana
134	MuA-AtCPP	Glycine max, Milho Zea

Os exemplos não limitantes de constructos de vetores adequados para a transformação de plantas são fornecidos nas SEQ ID N—: 99, 5, 35-53.

SEQ ID NO:99 gtttacccgccaatatatcctgtcaaacactgatagtttaaactgaaggcgggaaacgacaatctgatcatgagcggagaattaagggagtcacgttatgacccccgccgatgacgcgggacaagccgttttacgtttggaactgacagaaccgcaacgttgaaggagccactcagccgcgggtttctggag tttaatgagctaagcacatacgtcagaaaccattattgcgcgttcaaaagtcgcctaaggtcactatcagctagcaaatatttcttgtcaaaaatgctccactgacgttccataaattcccctcggtatccaattagagtctcatattcactctcaatccaaataatctgcaccggatctggatcgtttcgcatgattgaacaagatggattgcacgcaggttctccggccgcttgggtggagaggctattcggctatgactgggcacaacagacaatcggctgctctgatgccgccgtgttccggctgtcagcgcaggggcgcccggttctttttgtcaagaccgacctgtccggtgccctgaatgaactgcaggacgaggcagcgcggctatcgtggctggccacgacgggcgttccttgcgcagctgtgctcgacgttgtcactgaagcgggaagggactggctgctattgggcgaagtgccggggcaggatctcctgtcatctcaccttgctcctgccgagaaagtatccatcatggctgatgcaatgcggcggctgcatacgcttgatccggctacctgcccattcgaccaccaagcgaaacatcgcatcgagcgagcacgtactcggatggaagccggtc-

caggctcaaggcgcgcatgcccgacggcgatgatctcgtcgtgacccatggcgatgcctgcttgccgaatatcatggtggaaaatggccgcttttctggattcatcgactgtggccggctgggtgtggcggaccgctatcaggacatagcgttggctacccgtgatattgctgaagagc5 ttggcggcgaatgggctgaccgcttcctcgtgctttacggtatcgccgctcccgattcgcagcgcatcgccttctatcgccttcttgacgagttcttctgagcgggactctggggttcgaaatgaccgaccaagcgacgcccaacctgccatcacgagatttcgattccaccgccgccttctatgaaaggttgggcttcggaatcgttttccgggacgccggctggatgatcctccagcgcggggatctcatgctggagttcttcgcccacgggatctctgcggaacaggcggtcgaa-

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A SEQ ID N²: 99 é a seqüência de ácido nucléico de pBI121AtCPP. As seqüências em itálico são as repetições das bordas direita e esquerda. A seqüência sublinhada é o promotor 35S e a seqüência em negrito é a seqüência sentido de AtCPP.

SEQ ID N²: 100 gtttacccgccaatatatcctgtcaaacactgatagtttaaactgaaggcgggaaacgacaatctgatcatgagcggagaattaagggagtcacgttatgacccccgccgatgacgcgggacaagccgttttacgtttggaactgacagaaccgcaacgttgaaggagccactcagccgcgggtttctggagtttaatgagctaagcacatacgtcagaaaccattattgcgcgttcaaaagtcgcctaaggtcactatcagctagcaaatatttcttgtcaaaaatgctccactgacgttccataaattcccctcggtatccaattagagtctcatattcactctcaatccaaataatctgcaccggatctggatcgtttcgcatgattgaacaagatggattgcacgcaggttctccggccgcttgggtggagaggctattcggctatgactgggcacaacagacaatcggctgctctgatgccgccgtgttccggctgtcagcgcaggggcgcccggttctttttgtcaagaccgacctgtccggtgccctgaatgaactgcaggacgaggcagcgcggctatcgtggctggccacgacgggcgttccttgcgcagctgtgctcgacgttgtcactgaagcgggaagggactggctgctattgggcgaagtgccggggcaggatctcctgtcatctcaccttgctcctgccgagaaagtatccatcatggctgatgcaatgcggcggc-

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238

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SEQ IDN²: 130 gtffacccgccaatafatcctgfcaaacactgatagtttaaactgaaggcgggaaacgacaatctgatcatgagcggagaattaagggagtcacgttatgacccccgccgatga·* Ά « f cgcgggacaagccgttttacgtttggaactgacagaaccgcaacgttgaaggagccactcagccgcgggtttctggagtttaatgagctaagcacatacgtcagaaaccattattgcgcgttcaaaagtcgcctaaggtcactatcagctagcaaatatttc25 ttgtcaaaaatgctccactgacgttccataaattcccctcggtatccaattagagtctcatattcactctcaatccaaataatctgcaccggatctggatcgtttcgcatgattgaacaagatggattgcacgcaggttctccggccgcttgggtggagaggctattcggctatgactgggcacaacagacaatcggctgctctgatgccgccgtgttccggctgtcagcgcaggggcgcccggttctttttgtcaagaccgacctgtccggtgccctgaatgaactgcagga30 cgaggcagcgcggctatcgtggctggccacgacgggcgttccttgcgcagctgtgctcgacgttgtcactgaagcgggaagggactggctgctattgggcgaagtgccggggcaggatctcctgtcatctcaccttgctcctgccgagaaagtatccatcatggctgatgcaatgcggcggctgcatacgcttgatccggctacctgcccattcgaccaccaagcgaaacatcgcatcga-

239

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-r; f

A SEQ ID N²: 130 é a seqüência de ácido nucléico de pBI121anti-sentido-AtCPP. As seqüências em itálico são as repetições das bordas direita e esquerda. A seqüência sublinhada é o promotor 35S. A seqüência em letra maiúscula é a seqüência anti-sentido de AtCPP.

SEQIDN²:131 gttfecccgccaatatafccígtcaaacactgatagtttaaactgaaggcgggaaacgacaatctgatcatgagcggagaattaagggagtcacgttatgacccccgccgatgacgcgggacaagccgttttacgtttggaactgacagaaccgcaacgttgaaggagccactcagccgcgggtttctggagtttaatgagctaagcacatacgtcagaaaccattattgcgcgttcaaaagtcgcctaaggtcactatcagctagcaaatatttcttgtcaaaaatgctccactgacgttccataaattcccctcggtatccaattagagtctcatattcactctcaatccaaataatctgcaccggatctggatcgtttcgcatgattgaacaagatggattgcacgcaggttctccggccgcttgggtggagaggctattcggctatgac30

242 tgggcacaacagacaatcggctgctctgatgccgccgtgttccggctgtcagcgcaggggcgcccggttctttttgtcaagaccgacctgtccggtgccctgaatgaactgcaggacgaggcagcgcggctatcgtggctggccacgacgggcgttccttgcgcagctgtgctcgacgttgtcactgaagcgggaagggactggctgctattgggcgaagtgccggggcaggatctc5 ctgtcatctcaccttgctcctgccgagaaagtatccatcatggctgatgcaatgcggcggctgcatacgcttgatccggctacctgcccattcgaccaccaagcgaaacatcgcatcgagcgagcacgtactcggatggaagccggtcttgtcgatcaggatgatctggacgaagagcatcaggggctcgcgccagccgaactgttcgccaggctcaaggcgcgcatgcccgacggcgatgatctcgtcgtgacccatggcgatgcctgcttgccgaatatcatggtggaaaatggccgc10 ttttctggattcatcgactgtggccggctgggtgtggcggaccgctatcaggacatagcgttggctacccgtgatattgctgaagagcttggcggcgaatgggctgaccgcttcctcgtgctttacggtatcgccgctcccgattcgcagcgcatcgccttctatcgccttcttgacgagttcttctgagcgggactctggggttcgaaatgaccgaccaagcgacgcccaacctgccatcacgagatttcgattccaccgccgccttctatgaaaggttgggcttcggaa15 tcgttttccgggacgccggctggatgatcctccagcgcggggatctcatgctggagttcttcgcccacgggatctctgcggaacaggcggtcgaaggtgccgatatcattacgacagcaacggccgacaagcacaacgccacgatcctgagcgacaatatgatcgggcccggcgtccacatcaacggcgtcggcggcgactgcccaggcaagaccgagatgcaccgcgatatcttgctgcgttcggatattttcgtggagttcccgccacagacccggatgatccccgatcgttcaaa20 catttggcaataaagtttcttaagattgaatcctgttgccggtcttgcgatgattatcatataatttctgttgaattacgttaagcatgtaataattaacatgtaatgcatgacgttatttatgagatgggtttttatgattagagtcccgcaattatacatttaatacgcgatagaaaacaaaatatagcgcgcaaactaggataaattatcgcgcgcggtgtcatctatgttactagatcgggcctcctgtcaatgctggcggcggctctggtggtggttctggtggcggctctga25 gggtggtggctctgagggtggcggttctgagggtggcggctctgagggaggcggttccggtggtggctctggttccggtgattttgattatgaaaagatggcaaacgctaataagggggctatgaccgaaaatgccgatgaaaacgcgctacagtctgacgctaaaggcaaacttgattctgtcgctactgattacggtgctgctatcgatggtttcattggtgacgtttccggccttgctaatggtaatggtgctactggtgattttgctggctctaattcccaaatggc30 tcaagtcggtgacggtgataattcacctttaatgaataatttccgtcaatatttaccttccctccctcaatcggttgaatgtcgcccttttgtctttggcccaatacgcaaaccgcctctccccgcgcgttggccgattcattaatgcagctggcacgacaggtttcccgactggaaagcgggcagtgagcgcaacgcaattaatgtgagttagctcactcattaggcaccccaggc-

243 tttacactttatgcttccggctcgtatgttgtgtggaattgtgagcggataacaatttcacacaggaaacagctatgaccatgattacgccaagcttgcatgcctgcagggagççatagai tqcaattcaatcaaactgaaatttctqcaagaatctcaaacacggaqatctcaaaqtttgaaaqaaaatttatttcttcgactcaaaacaaacttacgaaatttaggtagaactta5 tatacattatattqtaattttttgtaacaaaatgtttttattattattatagaattttactqgttaaattaaaaatgaataqaaaaggtqaattaagaqgagagaggaqqtaaacattttcttctattttttcatattttcaggataaattattgtaaaaqtttacaaqatttccatttgac-

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244 tcgttcattgcagttcaaatccttgccttcttacaatttggaggatacactcttctcagaaactccactgatctcttcaggagtttcggatttgatacacagcctgttctcattggtttgatcatatttcagcacactgtaataccactgcaacatctagtaagctttggcctgaacctcgttagtcgagcgtttgagtttcaggctgatgcttttgctgtgaagc5 ttgactatgcaaaagatcttcgtcctgctctagtgaaactacaggaagagaacttatcaacaatgaacactgatccattgtactcagcttatcactactcacatcctcctcttgttgaaaggcttcgagccactgatggagaagacaagaagacagattaacccctcgaatttccccgatcgttcaaacatttggcaataaagtttcttaagattgaatcctgttgccggtcttgcga-

tgattatcatataatttctgttgaattacgttaagcatgtaataattaacatgtaatgcatgacgttatttatgagatgggtttttatgattagagtcccgcaattatacatttaatacgcgatagaaaacaaaatatagcgcgcaaactaggataaattatcgcgcgcggtgtcatctatgttactagatcgggaattcactggccgtcgttttacaacgtcgtgactgggaaaaccctggcgttacccaacttaatcgccttgcagcacatccccctttcgccagctggcgtaatagcgaagaggcccgcaccgatcgcccttcccaacagttgcgcagcctgaatggcgcccgctc15 ctttcgctttcttcccttcctttctcgccacgttcgccggctttccccgtcaagctctaaatcgggggctccctttagggttccgatttagtgctttacggcacctcgaccccaaaaaacttgatttgggtgatggttcacgtagtgggccatcgccctgatagacggtttttcgccctttgacgttggagtccacgttctttaatagtggactcttgttccaaactggaacaacactcaaccctatctcgggctattcttttgatttataagggattttgccgatttcggaaccac20 catcaaacaggattttcgcctgctggggcaaaccagcgtggaccgcttgctgcaactctctcagggccaggcggtgaagggcaatcagctgttgcccgtctcactggtgaaaagaaaaaccaccccagtacattaaaaacgtccgcaatgtgttattaagttgtctaagcgtcaatttgtttacaccacaafafaíccígcca

A SEQ ID N^e: 131 é a seqüência de ácido nucléico de RD29A25 AtCPP. As seqüências em itálico são as repetições das bordas direita e esquerda. A seqüência sublinhada é o promotor RD29A. A seqüência em negrito é a seqüência sentido de AtCPP.

SEQ IDN^Q: 132 gttfacccgccaatatatcctgtcaaacactgatagtttaaactgaaggcgggaaacgac 30 aatctgatcatgagcggagaattaagggagtcacgttatgacccccgccgatgacgcgggacaagccgttttacgtttggaactgacagaaccgcaacgttgaaggagccactcagccgcgggtttctggagtttaatgagctaagcacatacgtcagaaaccattattgcgcgttcaaaagtcgcctaaggtcactatcagctagcaaatatttc245 ttgtcaaaaatgctccactgacgttccataaattcccctcggtatccaattagagtctcatattcactctcaatccaaataatctgcaccggatctggatcgtttcgcatgattgaacaa-

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gcgagcacgtactcggatggaagccggtcttgtcgatcaggatgatctggacgaagagcatcaggggctcgcgccagccgaactgttcgccaggctcaaggcgcgcatgcccgacggcgatgatctcgtcgtgacccatggcgatgcctgcttgccgaatatcatggtggaaaatggccgcttttctggattcatcgactgtggccggctgggtgtggcggaccgctatcaggacatagcgttggctacccgtgatattgctgaagagcttggcggcgaatgggctgaccgcttcc15 tcgtgctttacggtatcgccgctcccgattcgcagcgcatcgccttctatcgccttcttgacgagttcttctgagcgggactctggggttcgaaatgaccgaccaagcgacgcccaacctgccatcacgagatttcgattccaccgccgccttctatgaaaggttgggcttcggaatcgttttccgggacgccggctggatgatcctccagcgcggggatctcatgctggagttcttcgcccacgggatctctgcggaacaggcggtcgaaggtgccgatatcattacgacagcaa20 cggccgacaagcacaacgccacgatcctgagcgacaatatgatcgggcccggcgtccaca- tcaacggcgtcggcggcgactgcccaggcaagaccgagatgcaccgcgatatcttgctgcgttcggatattttcgtggagttcccgccacagacccggatgatccccgatcgttcaaacatttggcaataaagtttcttaagattgaatcctgttgccggtcttgcgatgattatcatataatttctgttgaattacgttaagcatgtaataattaacatgtaatgcatgacgttattta25 tgagatgggtttttatgattagagtcccgcaattatacatttaatacgcgatagaaaacaaaatatagcgcgcaaactaggataaattatcgcgcgcggtgtcatctatgttactagatcgggcctcctgtcaatgctggcggcggctctggtggtggttctggtggcggctctgagggtggtggctctgagggtggcggttctgagggtggcggctctgagggaggcggttccggtggtggctctggttccggtgattttgattatgaaaagatggcaaacgctaataa30 gggggctatgaccgaaaatgccgatgaaaacgcgctacagtctgacgctaaaggcaaacttgattctgtcgctactgattacggtgctgctatcgatggtttcattggtgacgtttccggccttgctaatggtaatggtgctactggtgattttgctggctctaattcccaaatggctcaagtcggtgacggtgataattcacctttaatgaataatttccgtcaatatttaccttcc-

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248 tgggtttttatgattagagtcccgcaattatacatttaatacgcgatagaaaacaaaata-

tagcgcgcaaactaggataaattatcgcgcgcggtgtcatctatgttactagatcgggaattcactggccgtcgttttacaacgtcgtgactgggaaaaccctggcgttacccaacttaatcgccttgcagcacatccccctttcgccagctggcgtaatagcgaagaggcc5 cgcaccgatcgcccttcccaacagttgcgcagcctgaatggcgcccgctcctttcgctttcttcccttcctttctcgccacgttcgccggctttccccgtcaagctctaaatcgggggctccctttagggttccgatttagtgctttacggcacctcgaccccaaaaaacttgatttgggtgatggttcacgtagtgggccatcgccctgatagacggtttttcgccctttgacgttggagtccacgttctttaatagtggactcttgttccaaactggaacaacactcaaccctatctcgggc10 tattcttttgatttataagggattttgccgatttcggaaccaccatcaaacaggattttcgcctgctggggcaaaccagcgtggaccgcttgctgcaactctctcagggccaggcggtgaagggcaatcagctgttgcccgtctcactggtgaaaagaaaaaccaccccagtacattaaaaacgtccgcaatgtgttattaagttgtctaagcgtcaatttgfflacaccacaafá/afccfgcca

A SEQ ID N^e: 132 é a seqüência de ácido nucléico de RD29A15 HP-AtCPP. As seqüências em itálico são as repetições das bordas direita e esquerda. A seqüência sublinhada é o promotor RD29A. A seqüência em negrito é a seqüência anti-sentido de AtCPP. A seqüência em letra maiúscula representa o fragmento truncado de GUS. A seqüência em negrito e sublinhada representa o fragmento sentido da prenil protease CaaX de A. thalia20 na.

SEQ IDN²: 133 gtttacccgccaatetatcctgtcaaacactgatagtttaaactgaaggcgggaaacgacaatctgatcatgagcggagaattaagggagtcacgttatgacccccgccgatgacgcgggacaagccgttttacgtttggaactgacagaaccgcaacgttgaaggagccactca25 gccgcgggtttctggagtttaatgagctaagcacatacgtcagaaaccattattgcgcgttcaaaagtcgcctaaggtcactatcagctagcaaatatttcttgtcaaaaatgctccactgacgttccataaattcccctcggtatccaattagagtctcatattcactctcaatccaaataatctgcaccggatctggatcgtttcgcatgattgaacaagatggattgcacgcaggttctccggccgcttgggtggagaggctattcggctatgac30 tgggcacaacagacaatcggctgctctgatgccgccgtgttccggctgtcagcgcaggggcgcccggttctttttgtcaagaccgacctgtccggtgccctgaatgaactgcaggacgaggcagcgcggctatcgtggctggccacgacgggcgttccttgcgcagctgtgctcgacgttgtcactgaagcgggaagggactggctgctattgggcgaagtgccggggcaggatctc-

249 ctgtcatctcaccttgctcctgccgagaaagtatccatcatggctgatgcaatgcggcggctgcatacgcttgatccggctacctgcccattcgaccaccaagcgaaacatcgcatcgagcgagcacgtactcggatggaagccggtcttgtcgatcaggatgatctggacgaagagcatcaggggctcgcgccagccgaactgttcgccaggctcaaggcgcgcatgcccgacggcga5 tgatctcgtcgtgacccatggcgatgcctgcttgccgaatatcatggtggaaaatggccgcttttctggattcatcgactgtggccggctgggtgtggcggaccgctatcaggacata-

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251

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A SEQ ID N^e: 133 é a seqüência de ácido nucléico de RD29Aanti-sentido-AtCPP. As seqüências em itálico são as repetições das bordas direita e esquerda. A seqüência sublinhada é o promotor RD29A. A seqüência em letra maiúscula é a seqüência anti-sentido de AtCPP.

SEQ IDN²: 134 gtttacccgccaatatatccfgtcaaacactgatagttiaaactgaaggcgggaaacgacaatctgatcatgagcggagaattaagggagtcacgttatgacccccgccgatgacgcgggacaagccgttttacgtttggaactgacagaaccgcaacgttgaaggagccactcagccgcgggtttctggagtttaatgagctaagcacatacgtcagaaac252 cattattgcgcgttcaaaagtcgcctaaggtcactatcagctagcaaatatttcttgtcaaaaatgctccactgacgttccataaattcccctcggtatccaattagagtctcatattcactctcaatccaaataatctgcaccggatctggatcgtttcgcatgattgaacaagatggattgcacgcaggttctccggccgcttgggtggagaggctattcggctatgac5 tgggcacaacagacaatcggctgctctgatgccgccgtgttccggctgtcagcgcaggggcgc^ccggtt^ctttttgt^caag^accg^acctgt^ccggtgccctgaatgaactg^caggacgaggcagcgcggctatcgtggctggccacgacgggcgttccttgcgcagctgtgctcgacgttgtcactgaagcgggaagggactggctgctattgggcgaagtgccggggcaggatctcctgtcatctcaccttgctcctgccgagaaagtatccatcatggctgatgcaatgcggcggc10 tgcatacgcttgatccggctacctgcccattcgaccaccaagcgaaacatcgcatcgagcgagcacgtactcggatggaagccggtcttgtcgatcaggatgatctggacgaagagcatcaggggctcgcgccagccgaactgttcgccaggctcaaggcgcgcatgcccgacggcgatgatctcgtcgtgacccatggcgatgcctgcttgccgaatatcatggtggaaaatggccgcttttctggattcatcgactgtggccggctgggtgtggcggaccgctatcaggacata15 gcgttggctacccgtgatattgctgaagagcttggcggcgaatgggctgaccgcttcctcgtgctttacggtatcgccgctcccgattcgcagcgcatcgccttctatcgccttcttgacgagttcttctgagcgggactctggggttcgaaatgaccgaccaagcgacgcccaacctgccatcacgagatttcgattccaccgccgccttctatgaaaggttgggcttcggaatcgttttccgggacgccggctggatgatcctccagcgcggggatctcatgctggagttc20 ttcgcccacgggatctctgcggaacaggcggtcgaaggtgccgatatcattacgacagcaa« cggccgacaagcacaacgccacgatcctgagcgacaatatgatcgggcccggcgtccacatcaacggcgtcggcggcgactgcccaggcaagaccgagatgcaccgcgatatcttgctgcgttcggatattttcgtggagttcccgccacagacccggatgatccccgatcgttcaaacatttggcaataaagtttcttaagattgaatcctgttgccggtcttgcgatgattatcata25 taatttctgttgaattacgttaagcatgtaataattaacatgtaatgcatgacgttatttatgagatgggtttttatgattagagtcccgcaattatacatttaatacgcgatagaaaacaaaatatagcgcgcaaactaggataaattatcgcgcgcggtgtcatctatgttactagatcgggcctcctgtcaatgctggcggcggctctggtggtggttctggtggcggctctgagggtggtggctctgagggtggcggttctgagggtggcggctctgagggaggcggttc30 cggtggtggctctggttccggtgattttgattatgaaaagatggcaaacgctaataagggggctatgaccgaaaatgccgatgaaaacgcgctacagtctgacgctaaaggcaaacttgattctgtcgctactgattacggtgctgctatcgatggtttcattggtgacgtttccggccttgctaatggtaatggtgctactggtgattttgctggctctaattcccaaatggc-

253 tcaagtcggtgacggtgataattcacctttaatgaataatttccgtcaatatttaccttccctccctcaatcggttgaatgtcgcccttttgtctttggcccaatacgcaaaccgcctctccccgcgcgttggccgattcattaatgcagctggcacgacaggtttcccgactggaaagcgggcagtgagcgcaacgcaattaatgtgagttagctcactcattaggcaccccaggc5 tttacactttatgcttccggctcgtatgttgtgtggaattgtgagcggataacaatttcacacaggaaacagctatgaccatgattacgccaagctGGGAAATTTTTCGCCAGTTCTAAATATCCGGAAACCTCTTGGGATGCCATTGCCCATCTATCTGTAATTTATTGACGAAATAGACGAAAAGGAAGGTGGCTCCTATAAAGCACATCATTGCGATAACAGAAAGGCCATTGTTGAAGATACCTCTGC-

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254 ttgactatgcaaaagatcttcgtcctgctctagtgaaactacaggaagagaacttatcaacaatgaacactgatccattgtactcagcttatcactactcacatcctcctcttgttgaaaggcttcgagccactgatggagaagacaagaagacagattaacccctcgaatttccccgatcgttcaaacatttggcaataaagtttcttaagattgaatcctgttgccggtcttgcga5 tgattatcatataatttctgttgaattacgttaagcatgtaataattaacatgtaatgcatgacgttatttatgagatgggtttttatgattagagtcccgcaattatacatttaatacgcgatagaaaacaaaatatagcgcgcaaactaggataaattatcgcgcgcggtgtcatctatgttactagatcgggaattcactggccgtcgttttacaacgtcgtgactgggaaaaccc

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A SEQ ID N²: 134 é a seqüência de ácido nucléico de MuA* AtCPP. As seqüências em itálico são as repetições das bordas direita e es? querda. A seqüência em letra maiúscula é o promotor MuA. A seqüência sentido da prenil protease CaaX de A. thaliana está em negrito. SEQ IDN²: 135 gttfacccgccaatatatcctgtcaaacactgatagtttaaactgaaggcgggaaacgacaatctgatcatgagcggagaattaagggagtcacgttatgacccccgccgatgacgcgggacaagccgttttacgtttggaactgacagaaccgcaacgttgaaggagccactcagccgcgggtttctggagtttaatgagctaagcacatacgtcagaaaccattattgcgcgttcaaaagtcgcctaaggtcactatcagctagcaaatatttc30 ttgtcaaaaatgctccactgacgttccataaattcccctcggtatccaattagagtctcatattcactctcaatccaaataatctgcaccggatctggatcgtttcgcatgattgaacaagatggattgcacgcaggttctccggccgcttgggtggagaggctattcggctatgactgggcacaacagacaatcggctgctctgatgccgccgtgttccggctgtcagcgca-

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A SEQ ID N⁹: 135 é a seqüência de ácido nucléico de MuAGmCPP. As seqüências em itálico são as repetições das bordas direita e esquerda. A seqüência em letra maiúscula é o promotor MuA. A seqüência sentido da prenil protease CaaX de G. max está em letra maiúscula e em negrito.

SEQ ID N⁹: 136 gfffacccgccaatatatcctgtcaaacactgatagtttaaactgaaggcgggaaacgacaatctgatcatgagcggagaattaagggagtcacgttatgacccccgccgatgacgcgggacaagccgttttacgtttggaactgacagaaccgcaacgttgaaggagccactcagccgcgggtttctggagtttaatgagctaagcacatacgtcagaaac30 cattattgcgcgttcaaaagtcgcctaaggtcactatcagctagcaaatatttcttgtcaaaaatgctccactgacgttccataaattcccctcggtatccaattagagtctcatattcactctcaatccaaataatctgcaccggatctggatcgtttcgcatgattgaacaagatggattgcacgcaggttctccggccgcttgggtggagaggctattcggctatgac.“ -J'· *

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259 tttacactttatgcttccggctcgtatgttgtgtggaattgtgagcggataacaatttcacacaqgaaacaqctatqaccatqattacqccaaqcttqcatQcctQcaqcccacaga-

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260 »

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A SEQ ID N²: 135 é a seqüência de ácido nucléico de pBI121GmCPP. As seqüências em itálico são as repetições das bordas direita e esquerda. A seqüência sublinhada é o promotor 35S. A seqüência sentido da prenil protease CaaX de G. max está em negrito.

SEQ IDN²: 137 gtttacccgccaatafatccígfcaaacactgatagtttaaactgaaggcgggaaacgacaatctgatcatgagcggagaattaagggagtcacgttatgacccccgccgatga30 cgcgggacaagccgttttacgtttggaactgacagaaccgcaacgttgaaggagccactcagccgcgggtttctggagtttaatgagctaagcacatacgtcagaaaccattattgcgcgttcaaaagtcgcctaaggtcactatcagctagcaaatatttcttgtcaaaaatgctccactgacgttccataaattcccctcggtatccaattagagtctca-

261 tattcactctcaatccaaataatctgcaccggatctggatcgtttcgcatgattgaacaagatggattgcacgcaggttctccggccgcttgggtggagaggctattcggctatgac-

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263

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264

A cacgttcgccggctttccccgtcaagctctaaatcgggggctccctttagggttccgatttagtgctttacggcacctcgaccccaaaaaacttgatttgggtgatggttcacgtagtgggccatcgccctgatagacggtttttcgccctttgacgttggagtccacgttctttaatagtggactcttgttccaaactggaacaacactcaaccctatctcgggctattc5 ttttgatttataagggattttgccgatttcggaaccaccatcaaacaggattttcgcctgctggggcaaaccagcgtggaccgcttgctgcaactctctcagggccaggcggtgaagggcaatcagctgttgcccgtctcactggtgaaaagaaaaaccaccccagtacattaaaaacgtccgcaatgtgttattaagttgtctaagcgtcaatttgrftfacaccacaatatatcctgcca

A SEQ ID N²: 137 é a seqüência de ácido nucléico de pBI12110 HP-GmCPP. As seqüências em itálico são as repetições das bordas direita e esquerda. A seqüência sublinhada é o promotor 35S. A seqüência em negrito é o fragmento da prenil protease anti-sentido de G. max. A seqüência em negrito e sublinhada é o fragmento sentido da prenil protease de G. max e a seqüência em letra maiuscula é o fragmento truncado de GUS.

SEQIDN²:138 gtttacccgccaatatatcctgfcaaacactgatagtttaaactgaaggcgggaaacgacaatctgatcatgagcggagaattaagggagtcacgttatgacccccgccgatgacgcgggacaagccgttttacgtttggaactgacagaaccgcaacgttgaaggagccactcagccgcgggtttctggagtttaatgagctaagcacatacgtcagaaac20 cattattgcgcgttcaaaagtcgcctaaggtcactatcagctagcaaatatttcttgtcaaaaatgctccactgacgttccataaattcccctcggtatccaattagagtctcatattcactctcaatccaaataatctgcaccggatctggatcgtttcgcatgattgaacaagatggattgcacgcaggttctccggccgcttgggtggagaggctattcggctatgactgggcacaacagacaatcggctgctctgatgccgccgtgttccggctgtcagcgca25 ggggcgcccggttctttttgtcaagaccgacctgtccggtgccctgaatgaactgcaggacgaggcagcgcggctatcgtggctggccacgacgggcgttccttgcgcagctgtgctcgacgttgtcactgaagcgggaagggactggctgctattgggcgaagtgccggggcaggatctcctgtcatctcaccttgctcctgccgagaaagtatccatcatggctgatgcaatgcggcggctgcatacgcttgatccggctacctgcccattcgaccaccaagcgaaacatcgcatcga30 gcgagcacgtactcggatggaagccggtcttgtcgatcaggatgatctggacgaagagcatcaggggctcgcgccagccgaactgttcgccaggctcaaggcgcgcatgcccgacggcgatgatctcgtcgtgacccatggcgatgcctgcttgccgaatatcatggtggaaaatggccgcttttctggattcatcgactgtggccggctgggtgtggcggaccgctatcaggacata-

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266 ♦

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A SEQ ID N²: 138 é a seqüência de ácido nucléico de pBI121anti-sentido-GmCPP. As seqüências em itálico são as repetições das bordas direita e esquerda. A seqüência sublinhada é o promotor 35S. A seqüência 15 em negrito é a seqüência anti-sentido de GmCPP.

SEQ ID N²: 139 gtttacccgccaatafefccfgfcaaacactgatagtttaaactgaaggcgggaaacgacaatctgatcatgagcggagaattaagggagtcacgttatgacccccgccgatgacgcgggacaagccgttttacgtttggaactgacagaaccgcaacgttgaaggagccactca20 gccgcgggtttctggagtttaatgagctaagcacatacgtcagaaaccattattgcgcgttcaaaagtcgcctaaggtcactatcagctagcaaatatttc* β ttgtcaaaaatgctccactgacgttccataaattcccctcggtatccaattagagtctcatattcactctcaatccaaataatctgcaccggatctggatcgtttcgcatgattgaacaagatggattgcacgcaggttctccggccgcttgggtggagaggctattcggctatgac25 tgggcacaacagacaatcggctgctctgatgccgccgtgttccggctgtcagcgcaggggcgcccggttctttttgtcaagaccgacctgtccggtgccctgaatgaactgcaggacgaggcagcgcggctatcgtggctggccacgacgggcgttccttgcgcagctgtgctcgacgttgtcactgaagcgggaagggactggctgctattgggcgaagtgccggggcaggatctcctgtcatctcaccttgctcctgccgagaaagtatccatcatggctgatgcaatgcggcggc30 tgcatacgcttgatccggctacctgcccattcgaccaccaagcgaaacatcgcatcgagcgagcacgtactcggatggaagccggtcttgtcgatcaggatgatctggacgaagagcatcaggggctcgcgccagccgaactgttcgccaggctcaaggcgcgcatgcccgacggcga-

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A SEQ ID N^e: 139 é a seqüência de ácido nucléico de pRD29AGmCPP. As seqüências em itálico são as repetições das bordas direita e 20 esquerda. A seqüência sublinhada é o promotor RD29A. A seqüência em negrito é a seqüência sentido de GmCPP.

gtítacccgccaatatatccfgtcaaacactgatagtttaaactgaaggcgggaaacgacaatctgatcatgagcggagaattaagggagtcacgttatgacccccgccgatgacgcgggacaagccgttttacgtttggaactgacagaaccgcaacgttgaaggagccactca25 gccgcgggtttctggagtttaatgagctaagcacatacgtcagaaaccattattgcgcgttcaaaagtcgcctaaggtcactatcagctagcaaatatttcttgtcaaaaatgctccactgacgttccataaattcccctcggtatccaattagagtctcatattcactctcaatccaaataatctgcaccggatctggatcgtttcgcatgattgaacaagatggattgcacgcaggttctccggccgcttgggtggagaggctattcggctatgac30 tgggcacaacagacaatcggctgctctgatgccgccgtgttccggctgtcagcgcaggggcgcccggttctttttgtcaagaccgacctgtccggtgccctgaatgaactgcaggacgaggcagcgcggctatcgtggctggccacgacgggcgttccttgcgcagctgtgctcgacgttgtcactgaagcgggaagggactggctgctattgggcgaagtgccggggcaggatctc-

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274

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A SEQ ID N⁹: 140 é a seqüência de ácido nucléico de pRD29AHP-GmCPP. As seqüências em itálico são as repetições das bordas direita e esquerda. A seqüência sublinhada é o promotor RD29A. A seqüência em negrito é a seqüência anti-sentido de GmCPP, a seqüência em negrito e sublinhada é a seqüência sentido de GmCPP.

SEQ ID N⁹:141 gtttacccgccaatatatcctgtcaaacactgatagtttaaactgaaggcgggaaacgacaatctgatcatgagcggagaattaagggagtcacgttatgacccccgccgatgacgcgggacaagccgttttacgtttggaactgacagaaccgcaacgttgaaggagccactcagcc gcgggtttctggagtttaatgagctaagcacatacgtcagaaac15 cattattgcgcgttcaaaagtcgcctaaggtcactatcagctagcaaatatttcttgtcaaaaatgctccactgacgttccataaattcccctcggtatccaattagagtctcatattcactctcaatccaaataatctgcaccggatctggatcgtttcgcatgattgaacaagatggattgcacgcaggttctccggccgcttgggtggagaggctattcggctatgactgggcacaacagacaatcggctgctctgatgccgccgtgttccggctgtcagcgca20 ggggcgcccggttctttttgtcaagaccgacctgtccggtgccctgaatgaactgcaggacgaggcagcgcggctatcgtggctggccacgacgggcgttccttgcgcagctgtgctcgacgttgtcactgaagcgggaagggactggctgctattgggcgaagtgccggggcaggatctcctgtcatctcaccttgctcctgccgagaaagtatccatcatggctgatgcaatgcggcggctgcatacgcttgatccggctacctgcccattcgaccaccaagcgaaacatcgcatcga25 gcgagcacgtactcggatggaagccggtcttgtcgatcaggatgatctggacgaagagcatcaggggctcgcgccagccgaactgttcgccaggctcaaggcgcgcatgcccgacggcgatgatctcgtcgtgacccatggcgatgcctgcttgccgaatatcatggtggaaaatggccgcttttctggattcatcgactgtggccggctgggtgtggcggaccgctatcaggacatagcgttggctacccgtgatattgctgaagagcttggcggcgaatgggctgaccgcttcc30 tcgtgctttacggtatcgccgctcccgattcgcagcgcatcgccttctatcgccttcttgacgagttcttctgagcgggactctggggttcgaaatgaccgaccaagcgacgcccaacctgccat cacgagatttcgattccaccgccgccttctatgaaaggttgggcttcggaa-

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277 tggcgttacccaacttaatcgccttgcagcacatccccctttcgccagctggcgtaatagcgaagaggcccgcaccgatcgcccttcccaacagttgcgcagcctgaatggcgcccgctcct ttcgctttcttcccttcctttctcgccacgttcgccggctttccccgtcaagctctaaatcgggggctccctttagggttccgatttagtgctttacggcacctcgaccccaaaaaac5 ttgatttgggtgatggttcacgtagtgggccatcgccctgatagacggtttttcgccctttgacgttggagtccacgttctttaatagtggactcttgttccaaactggaacaacactcaaccctatctcgggctattcttttgatttataagggattttgccgatttcggaaccac10 catcaaacaggattttcgcctgctggggcaaaccagcgtggaccgcttgctgcaactctctcagggccaggcggtgaagggcaatcagctgttgcccgtctcactggtgaaaagaaaaaccac cccagtacattaaaaacgtccgcaatgtgttattaagttgtctaagcgtcaatttgtttacaccacaatatatcctgcca

A SEQ ID N⁹: 141 é a seqüência de ácido nucléico de pRD29Aanti-sentido-GmCPP. As seqüências em itálico são as repetições das bordas direita e esquerda. A seqüência sublinhada é o promotor RD29A. A seqüên15 cia em negrito é a seqüência anti-sentido de GmCPP.

SEQ ID N⁹: 142 gtftfacccgccaafatafcctgfcaaacactgatagtttaaactgaaggcgggaaacgacaatctgatcatgagcggagaattaagggagtcacgttatgacccccgccgatgacgcgggacaagccgttttacgtttggaactgacagaaccgcaacgttgaaggagccactca20 gccgcgggtttctggagtttaatgagctaagcacatacgtcagaaaccattattgcgcgttcaaaagtcgcctaaggtcactatcagctagcaaatatttcttgtcaaaaatgctccactgacgttccataaattcccctcggtatccaattagagtctcatattcactctcaatccaaataatctgcaccggatctggatcgtttcgcatgattgaacaagatggattgcacgcaggttctccggccgcttgggtggagaggctattcggctatgac25 tgggcacaacagacaatcggctgctctgatgccgccgtgttccggctgtcagcgcaggggcgcccggttctttttgtcaagaccgacctgtccggtgccctgaatgaactgcaggacgaggcagcgcggctatcgtggctggccacgacgggcgttccttgcgcagctgtgctcgacgttgtcactgaagcgggaagggactggctgctattgggcgaagtgccggggcaggatctcctgtcatctcaccttgctcctgccgagaaagtatccatcatggctgatgcaatgcggcggc30 tgcatacgcttgatccggctacctgcccattcgaccaccaagcgaaacatcgcatcgagcgagcacgtactcggatggaagccggtcttgtcgatcaggatgatctggacgaagagcatcaggggctcgcgccagccgaactgttcgccaggctcaaggcgcgcatgcccgacggcgatgatctcgtcgtgacccatggcgatgcctgcttgccgaatatcatggtggaaaatggccgc-

278 ttttctggattcatcgactgtggccggctgggtgtggcggaccgctatcaggacatagcgttggctacccgtgatattgctgaagagcttggcggcgaatgggctgaccgcttcctcgtgctttacggtatcgccgctcccgattcgcagcgcatcgccttctatcgccttcttgacgagttcttctgagcgggactctggggttcgaaatgaccgaccaagcgacgcccaacctgccatcacgagatttcgattccaccgccgccttctatgaaaggttgggcttcggaatcgttttccgggacgccggctggatgatcctccagcgcggggatctcatgctggagttcttcgcccacgggatctctgcggaacaggcggtcgaaggtgccgatatcattacgacagcaacggccgacaagcacaacgccacgatcctgagcgacaatatgatcgggcccggcgtccacatcaacggcgtcggcggcgactgcccaggcaagaccgagatgcaccgcgatatcttgctgcgttcggatattttcgtggagttcccgccacagacccggatgatccccgatcgttcaaacatttggcaataaagtttcttaagattgaatcctgttgccggtcttgcgatgattatcatataatttctgttgaattacgttaagcatgtaataattaacatgtaatgcatgacgttatttatgagatgggtttttatgattagagtcccgcaattatacatttaatacgcgatagaaaacaaaatatagcgcgcaaactaggataaattatcgcgcgcggtgtcatctatgttactagatcgggcctcctgtcaatgctggcggcggctctggtggtggttctggtggcggctctgagggtggtggctctgagggtggcggttctgagggtggcggctctgagggaggcggttccggtggtggctctggttccggtgattttgattatgaaaagatggcaaacgctaataagggggctatgaccgaaaatgccgatgaaaacgcgctacagtctgacgctaaaggcaaacttgattctgtcgctactgattacggtgctgctatcgatggtttcattggtgacgtttccggccttgctaatggtaatggtgctactggtgattttgctggctctaattcccaaatggctcaagtcggtgacggtgataattcacctttaatgaataatttccgtcaatatttaccttccctccctcaatcggttgaatgtcgcccttttgtctttggcccaatacgcaaaccgcctctccccgcgcgttggccgattcattaatgcagctggcacgacaggtttcccgactggaaagcgggcagtgagcgcaacgcaattaatgtgagttagctcactcattaggcaccccaggctttacactttatgcttccggctcgtatgttgtgtggaattgtgagcggataacaatttcacacaggaaacagctatgaccatgattacgccaagcttgcatgcctgcagcccacagatqqttagagaggcttacgcagcaggtctcatcaagacqatctacccgagcaataatctccaggaaatcaaataccttcccaagaaggttaaagatgcagtcaaaagattcaqgactaactqcatcaaqaacacagagaaagatatatttctcaagatcagaagtactattccagtatggacgattcaaggcttgcttcacaaaccaaggcaagtaatagagattggagtctctaaaaaggtagttcccactgaatcaaaggccatggagtcaaagattcaaataqaggacctaacagaactcgccgtaaagactggcgaacagttcatacagagtctcttacgactcaatgacaagaagaaaatcttcgtcaacatggtgqaqcacgacacacttgtctactccaaaaatatcaaa-

279

I qatacagtctcagaaqaccaaagggcaattqaqacttttcaacaaaqqgtaatatccggaaacctcctcgqattccattgcccagctatctqtcactttattgtgaagatagtqgaaaaqqaaggtqgctcctacaaatqccatcattqcqataaaggaaaggccatcqttgaaqatgcctctgccgacaqtggtcccaaagatggacccccacccacqaggaqca-

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gtcattagccaagagaagtttgagaaatctcgagcttacagtcttgacaaaagccattttcactttgttcatgagtttgttactatacttatggactctgcgattctgttctttgggatcttgccttggttttggaagatatctggcggctttctaccaatggtgggactcgatccagagaatgaaatcctgcacactctttcattcttggctggtcttatgacatggtcacagatcactgatttgccattttctttgtactcaactttcgtgatcgagtc15 tcggcatgggttcaacaaacaaacaatatggatgttcattagggacatgatcaaaggaatactcctctctgtcatacctgcccctcctatcgttgccgcaattattgttatagttcagaaaggaggtccttacctcgccatctatctgtgggcattcatgtttatcctgtctctagtgatgatgactatataccctgttttgattgcacctcttttcaacaagttcactcctcttcctgatggagacctccgggagaagattgagaaacttgcttcttctctaaagtttcctctgaa20 gaagctgtttgttgtcgatggatctacaaggtcaagccatagtaatgcttacatgtatggtttcttcaagaacaaaaggattgttctttatgacacattgattcagcagtgccagaa~ tgagaatgaaattgtggcggttattgcacacgagctgggacactggaagctgaatcacactacatactcgttcattgctgttcaaatccttgccttcttgcaatttggaggatacactcttgtcagaaactccactgatctcttcaggagttttggttttgatacacaaccagttc tcattggtttgatcatatttcagcacactgtaataccacttcaacacctagtaagctttgacctcaaccttgttagtcgagcgtttgagtttcaggctgatgcttttgcagtgaatcttggttatgcaaaggatctacgtcctgccctagtgaagctacaggaagagaacttatcagcgatgaacacagacccattgtactcagcttatcactactcacaccctcctcttgtagagaggcttcgagccattgatggagaagacaagaagacagattaacccctcgaatttccccga30 tcgttcaaacatttggcaataaagtttcttaagattgaatcctgttgccggtcttgcgatgattatcatataatttctgttgaattacgttaagcatgtaataattaacatgtaatgcatgacgttatttatgagatgggtttttatgattagagtcccgcaattatacatttaatacgcgatagaaaacaaaatatagcgcgcaaactaggataaattatcgcgcgcggtgtcatc-

280 tatgttactagatcgggaattcactggccgtcgttttacaacgtcgtgactgggaaaaccctggcgttacccaacttaatcgccttgcagcacatccccctttcgccagctggcgtaatagcgaagaggcccgcaccgatcgcccttcccaacagttgcgcagcctgaatggcgcccgctcctttcgctttcttcccttcctttctcgccacgttcgccggctttccccgtcaagctctaaa-

tcgggggctccctttagggttccgatttagtgctttacggcacctcgaccccaaaaaacttgatttgggtgatggttcacgtagtgggccatcgccctgatagacggtttttcgccctttgacgttggagtccacgttctttaatagtggactcttgttccaaactggaacaacactcaaccctatctcgggctattcttttgatttataagggattttgccgatttcggaaccaccatcaaacaggattttcgcctgctggggcaaaccagcgtggaccgcttgctgcaactctc-

tcagggccaggcggtgaagggcaatcagctgttgcccgtctcactggtgaaaagaaaaaccaccccagtacattaaaaacgtccgcaatgtgttattaagttgtctaagcgtcaatttgtttacaccacaatatatcctgcca

A SEQ ID N⁹: 142 é a seqüência de ácido nucléico de pBI121BnCPP. As seqüências em itálico são as repetições das bordas direita e es15 querda. A seqüência sublinhada é o promotor 35S. A seqüência em negrito é a seqüência anti-sentido de BnCPP.

SEQ ID N⁹: 143 gtttacccgccaatatatcctgtfcaaacactgatagtttaaactgaaggcgggaaacgacaatctgatcatgagcggagaattaagggagtcacgttatgacccccgccgatga20 cgcgggacaagccgttttacgtttggaactgacagaaccgcaacgttgaaggagccactca-

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281 tgatctcgtcgtgacccatggcgatgcctgcttgccgaatatcatggtggaaaatggccgcttttctggattcatcgactgtggccggctgggtgtggcggaccgctatcaggacatagcgttggctacccgtgatattgctgaagagcttggcggcgaatgggctgaccgcttcctcgtgctttacggtatcgccgctcccgattcgcagcgcatcgccttctatcgccttcttga5 cgagttcttctgagcgggactctggggttcgaaatgaccgaccaagcgacgcccaacctgccatcacgagatttcgattccaccgccgccttctatgaaaggttgggcttcggaatcgttttccgggacgccggctggatgatcctccagcgcggggatctcatgctggagttcttcgcccacgggatctctgcggaacaggcggtcgaaggtgccgatatcattacgacagcaa-

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282 gaagaaaatcttcqtcaacatqgtgqagcacgacacacttqtctactccaaaaatatcaaaqatacaqtctcaqaaqaccaaaqqqcaattqaqacttttcaacaaaqqgtaatatccggaaacctcctcggattccattgcccaqctatctgtcactttattqtqaagatagtggaaaaggaaqqtqqctcctacaaatqccatcattgcgataaagqaaaggccatcgttgaagatqcctctqccqacagtqqtcccaaagatgqacccccacccacgaggagcatcgtgqaaaaagaagacqttccaaccacqtcttcaaagcaagtggattgatgtqatatctccactgacgtaaggqatqacqcacaatcccactatccttcqcaaqacccttcctctatataaqgaagttcatttcatttgqagagaacacgggggactctagaccaqtgtcccagctcgtgtgcaataaccgccacaatttcattctcattctggcactgctgaatcaatgtgtcataaagaacaatccttttgttcttgaagaaaccatacatgtaagcattactatggcttgaccttgtagatccatcgacaacaaacagcttcttcagaggaaactttagagaagaagcaagtttctcaatcttctcccggaggtctccatcaggaagaggagtgaacttgttgaaaagaggtgcaatcaaaacagggtatatagtcatcatcactagagacaggataaacatgaatgcccacagatagatggcgaggtaaggacctcctttctgaactataacaataattgcggcaacgataggaggggcaggtatgacagagaggagtattcctttgatcatgtccctaatgaacatccatattgtttgtttgttgaacccatgccgagactcgatcacgaaagttgagtacaaagaaaatggcaaatcagtgatctgtgaccatgtcataagaccagccaagaatgaaagagtgtgcaggatttcattctctggatcgagtcccaccattggtagaaggatccccATCTACCCGCTTCGCGTCGGCATCCGGTCAGTGGCAGTGAAGGGCGAACAGTTCCTGATTAACCACAAACCGTTCTACTTTACTGGCTTTGGTCGTCATGAAGATGCGGACTTGCGTGGCAAAGGATTCGATAACGTGCTGATGGTGCACGACCACGCATTAATGGACTGGATTGGGGCCAACTCCTACCGTACCTCGCATTACCCTTACGCTGAAGAGATGCTCGACTGGGCAGATGAACATGGCATCGTGGTGATTGATGAAACTGCTGCTGTCGGCTTTTCGCTCTCTTTAGGCATTGGTTTCGAAGCGGGCAACAAGCCGAAAGAACTGTACAGCGAAGAGGCAGTCAACGGGGAAACTCAGCAAGCGCACTTACAGGCGATTAAAGAGCTGATAGCGCGTGACAAAAACCACCCAAGCGTGGTGATGTGGAGTATTGCCAACGAACCGGATACCCGTCCGCAAGGTGCACGGGAATATTTCGCGCCACTGGCGGAAGCAACGCGTAAACTCGACCCGACGCGTCGGATCACCTGCGTCAATGTAATGTTCTGCGACGCTCACACCGATACCATCAGCGATCTCTTTGATGTGCTGTGCCTGAACCGTTATTACGGATGGTATGTCCAAAGCGGCGATTTGGAAACGGCAGAGAAGGTACTGGAAAAAGAACTTCTGGCCTGGCAGGA-

283

GAAACTGTACACCGACATGTGGAGTGAAGAGTATCAGTGTGCATGGCTGGATATGTATCACCGCGTCTTTGATCGCGTCAGCGC-

CGTCGTCGGTGAACAGGTATGGAATTTCGCCGATTTTGCGACCTCGCAAGGCATATTGCGCGTTGGCGGTAACAAGAAAGGGATCTTCACTCGCGACCGCAAACCGAAGTCGGCGGCTTTTCTGCTGCAAAAACGCTGGACTGGCATGAACTTCGGTGAAAAACCGCAGCAGGGAGGCAAACAATGAatcaacaactctcctggcgcaccatcgtcggctacagcctcgggaattgctaccgagctcttctaccaatqqtgggactcgatccagagaatgaaatcctgcacactctttcattcttggctggtcttatgacatggtcacagatcactgatttgccattttctttqtactcaactttcqtqatcqaqtctcgqcatqqqttcaacaaacaaacaatatqqatgttcattagggacatgatcaaaggaatactcctctctqtcatacctqcccctcctatcqttqccqcaattattqttataqttcaqaaaqqaqqtccttacctcqccatctatctqtqqqcattcatqtttatcctqtctctaqtqatqatqactatataccctgttttgattqcacctcttttcaacaaqttcactcctcttcctqatggagacctccqggaqaaqattqaqaaacttqcttcttctctaaaqtttcctctqaaqaaqctqtttqttqtcqatggatctacaaggtcaaqccatagtaatgcttacatgtatggtttcttcaaqaacaaaaqqattqttctttatqacacattqattcaqcaqtqccaqaatqaqaatqaaattgtggcggttattgcacacgagctgggacactggqaqctcqaatttccccqatcgttcaaacatttggcaataaagtttcttaagattgaatcctgttgccggtcttgcgatgattatcatataatttctgttgaattacgttaagcatgtaataattaacatgtaatgcatgacgttatttatgagatgggtttttatgattagagtcccgcaattatacatttaatacgcgatagaaaacaaaatatagcgcgcaaactaggataaattatcgcgcgcggtgtcatctatgttactagatcgggaattcactggccgtcgttttacaacgtcgtgactgggaaaaccctggcgttacccaacttaatcgccttgcagcacatccccctttcgccagctggcgtaatagcgaagaggcccgcaccgatcgcccttcccaacagttgcgcagcctgaatggcgcccgctcctttcgctttcttcccttcctttctcgccacgttcgccggctttccccgtcaagctctaaatcgggggct^ccctttagggttccgatttagtgctttacggcacctcgaccccaaaaaacttgatttgggtgatggttcacgtagtgggccatcgccctgatagacggtttttcgccctttgacgttggagtccacgttctttaatagtggactcttgttccaaactggaacaacactcaaccctatctcgggctattcttttgatttataagggattttgccgatttcggaaccaccatcaaacaggattttcgcctgctggggcaaaccagcgtggaccgcttgctgcaactctctcagggccaggcggtgaagggcaatcagctgttgcccgtctcactggtgaaaagaaaaac284

caccccagtacattaaaaacgtccgcaatgtgttattaagttgtctaagcgtcaatttgtttacaccacaatatatcctgcca

A SEQ ID N^s: 143 é a seqüência de ácido nucléico de pBI121HP-BnCPP. As seqüências em itálico são as repetições das bordas direita e esquerda. A seqüência sublinhada é o promotor 35S. A seqüência em negrito é a seqüência anti-sentido de BnCPP, a seqüência em negrito e sublinhada é o fragmento sentido de BnCPP e a letra maiúscula indica o fragmento truncado de GUS.

SEQ ID N^a: 144 gtttacccgccaatatatcctgtcaaacactgatagtíiaaactgaaggcgggaaacgacaatctgatcatgagcggagaattaagggagtcacgttatgacccccgccgatgacgcgggacaagccgttttacgtttggaactgacagaaccgcaacgttgaaggagccactca gccgcgggtttctggagtttaatgagctaagcacatacgtcagaaac cattattgcgcgttcaaaagtcgcctaaggtcactatcagctagcaaatatttc15 ttgtcaaaaatgctccactgacgttccataaattcccctcggtatccaattagagtctcatattcactctcaatccaaataatctgcaccggatctggatcgtttcgcatgattgaacaagatggattgcacgcaggttctccggccgcttgggtggagaggctattcggctatgactgggcacaacagacaatcggctgctctgatgccgccgtgttccggctgtcagcgcaggggcgcccggttctttttgtcaagaccgacctgtccggtgccctgaatgaactgcagga20 cgaggcagcgcggctatcgtggctggccacgacgggcgttccttgcgcagctgtgctcgacgttgtcactgaagcgggaagggactggctgctattgggcgaagtgccggggcaggatctcb j ctgtcatctcaccttgctcctgccgagaaagtatccatcatggctgatgcaatgcggcggctgcatacgcttgatccggctacctgcccattcgaccaccaagcgaaacatcgcatcgagcgagcacgtactcggatggaagccggtcttgtcgatcaggatgatctggacgaagagca25 tcaggggctcgcgccagccgaactgttcgccaggctcaaggcgcgcatgcccgacggcgatgatctcgtcgtgacccatggcgatgcctgcttgccgaatatcatggtggaaaatggccgcttttctggattcatcgactgtggccggctgggtgtggcggaccgctatcaggacatagcgttggctacccgtgatattgctgaagagcttggcggcgaatgggctgaccgcttcctcgtgctttacggtatcgccgctcccgattcgcagcgcatcgccttctatcgccttcttga30 cgagttcttctgagcgggactctggggttcgaaatgaccgaccaagcgacgcccaacctgccatcacgagatttcgattccaccgccgccttctatgaaaggttgggcttcggaatcgttttccgggacgccggctggatgatcctccagcgcggggatctcatgctggagttcttcgcccacgggatctctgcggaacaggcggtcgaaggtgccgatatcattacgacagcaa-

285 cggccgacaagcacaacgccacgatcctgagcgacaatatgatcgggcccggcgtccaca· tcaacggcgtcggcggcgactgcccaggcaagaccgagatgcaccgcgatatcttgctgcgttcggatattttcgtggagttcccgccacagacccggatgatccccgatcgttcaaacatttggcaataaagtttcttaagattgaatcctgttgccggtcttgcgatgattatcata5 taatttctgttgaattacgttaagcatgtaataattaacatgtaatgcatgacgttatttatgagatgggtttttatgattagagtcccgcaattatacatttaatacgcgatagaaaacaaaatatagcgcgcaaactaggataaattatcgcgcgcggtgtcatctatgttactaga-

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Μ* &

5B-; . Hl

A SEQ ID N°: 144 é a seqüência de ácido nucléico de pBI121anti-sentido-BnCPP. As seqüências em itálico são as repetições das bordas direita e esquerda. A seqüência sublinhada é o promotor 35S. A seqüência em negrito é a seqüência anti-sentido de BnCPP.

SEQ ID N²: 145 gtttacccgccaafatatcctgtcaaacactgatagtttaaactgaaggcgggaaacgacaatctgatcatgagcggagaattaagggagtcacgttatgacccccgccgatgacgcgggacaagccgttttacgtttggaactgacagaaccgcaacgttgaaggagccactcagccgcgggtttctggagtttaatgagctaagcacatacgtcagaaaccattattgcgcgttcaaaagtcgcctaaggtcactatcagctagcaaatatttc15 ttgtcaaaaatgctccactgacgttccataaattcccctcggtatccaattagagtctcatattcactctcaatccaaataatctgcaccggatctggatcgtttcgcatgattgaacaagatggattgcacgcaggttctccggccgcttgggtggagaggctattcggctatgactgggcacaacagacaatcggctgctctgatgccgccgtgttccggctgtcagcgcaggggcgcccggttctttttgtcaagaccgacctgtccggtgccctgaatgaactgcagga20 cgaggcagcgcggctatcgtggctggccacgacgggcgttccttgcgcagctgtgctcgacgttgtcactgaagcgggaagggactggctgctattgggcgaagtgccggggcaggatctcctgtcatctcaccttgctcctgccgagaaagtatccatcatggctgatgcaatgcggcggctgcatacgcttgatccggctacctgcccattcgaccaccaagcgaaacatcgcatcgagcgagcacgtactcggatggaagccggtcttgtcgatcaggatgatctggacgaagagca25 tcaggggctcgcgccagccgaactgttcgccaggctcaaggcgcgcatgcccgacggcgatgatctcgtcgtgacccatggcgatgcctgcttgccgaatatcatggtggaaaatggccgcttttctggattcatcgactgtggccggctgggtgtggcggaccgctatcaggacatagcgttggctacccgtgatattgctgaagagcttggcggcgaatgggctgaccgcttcctcgtgctttacggtatcgccgctcccgattcgcagcgcatcgccttctatcgccttcttga30 cgagttcttctgagcgggactctggggttcgaaatgaccgaccaagcgacgcccaacctgccatcacgagatttcgattccaccgccgccttctatgaaaggttgggcttcggaatcgttttccgggacgccggctggatgatcctccagcgcggggatctcatgctggagttcttcgcccacgggatctctgcggaacaggcggtcgaaggtgccgatatcattacgacagcaa-

tcaacggcgtcggcggcgactgcccaggcaagaccgagatgcaccgcgatatcttgctgcgttcggatattttcgtggagttcccgccacagacccggatgatccccgatcgttcaaacatttggcaataaagtttcttaagattgaatcctgttgccggtcttgcgatgattatcatataatttctgttgaattacgttaagcatgtaataattaacatgtaatgcatgacgttatttatgagatgggtttttatgattagagtcccgcaattatacatttaatacgcgatagaaaacaaaatatagcgcgcaaactaggataaattatcgcgcgcggtgtcatctatgttactagatcgggcctcctgtcaatgctggcggcggctctggtggtggttctggtggcggctctgagggtggtggctctgagggtggcggttctgagggtggcggctctgagggaggcggttccggtggtggctctggttccggtgattttgattatgaaaagatggcaaacgctaataagggggctatgaccgaaaatgccgatgaaaacgcgctacagtctgacgctaaaggcaaacttgattctgtcgctactgattacggtgctgctatcgatggtttcattggtgacgtttccggccttgctaatggtaatggtgctactggtgattttgctggctctaattcccaaatggctcaagtcggtgacggtgataattcacctttaatgaataatttccgtcaatatttaccttccctccctcaatcggttgaatgtcgcccttttgtctttggcccaatacgcaaaccgcctctccccgcgcgttggccgattcattaatgcagctggcacgacaggtttcccgactggaaagcgggcagtgagcgcaacgcaattaatgtgagttagctcactcattaggcaccccaggctttacactttatgcttccggctcgtatgttgtgtggaattgtgagcggataacaatttcacacaggaaacagctatgaccatgattacgccaagcttgcatgcctgcagggagççatagar tgcaattcaatcaaactgaaatttctgcaagaatctcaaacacggaqatctcaaaqtttqaaaqaaaatttatttcttcqactcaaaacaaacttacqaaatttaqqtaqaacttatatacattatattgtaattttttgtaacaaaatgtttttattattattataqaattttactqqttaaattaaaaatqaataqaaaaqqtqaattaaqaqqaqaqaqqaqqtaaacattttcttctattttttcatattttcaqqataaattattqtaaaaqtttacaaqatttccatttqactaqtgtaaatgagqaatattctctaqtaaqatcattatttcatctacttcttttatcttctaccaqtagaggaataaacaatatttagctcctttqtaaatacaaattaattttccttcttgacatcattcaattttaattttacgtataaaataaaaqatcatacctattagaacgattaaggagaaatacaattcgaatgagaagqatqtqccgtttgttataataaacagccacacgacgtaaacqtaaaatgaccacatgatggqccaatagacatgqaccgactactaataatagtaagtíacattttaqqatqqaataaatatcataccqacatcaqttttgaaaqaaaagggaaaaaaagaaaaaataaataaaagatatactaccgacatgagttccaaaaagcaaaaaaaaagatcaaqccgacacagacacgcqtagagaqcaaaatqactttgacgtcacaccacgaaaacagacqcttcatacgtgtccctttatctctctcaqtctctctataaac-

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290 ttgatttgggtgatggttcacgtagtgggccatcgccctgatagacggtttttcgccctttgacgttggagtccacgttctttaatagtggactcttgttccaaactggaacaacactcaaccctatctcgggctattcttttgatttataagggattttgccgatttcggaaccaccatcaaacaggattttcgcctgctggggcaaaccagcgtggaccgcttgctgcaactctc5 tcagggccaggcggtgaagggcaatcagctgttgcccgtctcactggtgaaaagaaaaaccaccccagtacattaaaaacgtccgcaatgtgttattaagttgtctaagcgtcaatttgtttacaccacaatatatcctgcca

A SEQ ID N^e: 145 é a seqüência de ácido nucléico de pRD29ABnCPP. As seqüências em itálico são as repetições das bordas direita e es10 querda. A seqüência sublinhada é o promotor RD29A. A seqüência em negrito é a seqüência sentido de BnCPP.

SEQ ID N⁹: 146 gtfttacccgccaaíaíatcctgfcaaacactgatagtttaaactgaaggcgggaaacgacaatctgatcatgagcggagaattaagggagtcacgttatgacccccgccgatga15 cgcgggacaagccgttttacgtttggaactgacagaaccgcaacgttgaaggagccactcagccgcgggtttctggagtttaatgagctaagcacatacgtcagaaaccattattgcgcgttcaaaagtcgcctaaggtcactatcagctagcaaatatttcttgtcaaaaatgctccactgacgttccataaattcccctcggtatccaattagagtctcatattcactctcaatccaaataatctgcaccggatctggatcgtttcgcatgattgaacaa20 gatggattgcacgcaggttctccggccgcttgggtggagaggctattcggctatgactgggcacaacagacaatcggctgctctgatgccgccgtgttccggctgtcagcgcaggggcgcccggttctttttgtcaagaccgacctgtccggtgccctgaatgaactgcaggacgaggcagcgcggctatcgtggctggccacgacgggcgttccttgcgcagctgtgctcgacgttgtcactgaagcgggaagggactggctgctattgggcgaagtgccggggcaggatctc25 ctgtcatctcaccttgctcctgccgagaaagtatccatcatggctgatgcaatgcggcggctgcatacgcttgatccggctacctgcccattcgaccaccaagcgaaacatcgcatcgagcgagcacgtactcggatggaagccggtcttgtcgatcaggatgatctggacgaagagcatcaggggctcgcgccagccgaactgttcgccaggctcaaggcgcgcatgcccgacggcgatgatctcgtcgtgacccatggcgatgcctgcttgccgaatatcatggtggaaaatggccgc30 ttttctggattcatcgactgtggccggctgggtgtggcggaccgctatcaggacatagcgttggctacccgtgatattgctgaagagcttggcggcgaatgggctgaccgcttcctcgtgctttacggtatcgccgctcccgattcgcagcgcatcgccttctatcgccttcttgacgagttcttctgagcgggactctggggttcgaaatgaccgaccaagcgacgcccaacctgc291 catcacgagatttcgattccaccgccgccttctatgaaaggttgggcttcggaatcgttttccgggacgccggctggatgatcctccagcgcggggatctcatgctggagttcttcgcccacgggatctctgcggaacaggcggtcgaaggtgccgatatcattacgacagcaacggccgacaagcacaacgccacgatcctgagcgacaatatgatcgggcccggcgtccacatcaacggcgtcggcggcgactgcccaggcaagaccgagatgcaccgcgatatcttgctgcgttcggatattttcgtggagttcccgccacagacccggatgatccccgatcgttcaaacatttggcaataaagtttcttaagattgaatcctgttgccggtcttgcgatgattatcatataatttctgttgaattacgttaagcatgtaataattaacatgtaatgcatgacgttatttatgagatgggtttttatgattagagtcccgcaattatacatttaatacgcgatagaaaacaaaatatagcgcgcaaactaggataaattatcgcgcgcggtgtcatctatgttactagatcgggcctcctgtcaatgctggcggcggctctggtggtggttctggtggcggctctgagggtggtggctctgagggtggcggttctgagggtggcggctctgagggaggcggttccggtggtggct^ctggttc^cggtgattttgattatgaaaagatggcaaacgctaataagggggctatgaccgaaaatgccgatgaaaacgcgctacagtctgacgctaaaggcaaacttgattctgtcgctactgattacggtgctgctatcgatggtttcattggtgacgtttccggccttgctaatggtaatggtgctactggtgattttgctggctctaattcccaaatggctcaagtcggtgacggtgataattcacctttaatgaataatttccgtcaatatttaccttccctccctcaatcggttgaatgtcgcccttttgtctttggcccaatacgcaaaccgcctctccccgcgcgttggccgattcattaatgcagctggcacgacaggtttcccgactggaaagcgggcagtgagcgcaacgcaattaatgtgagttagctcactcattaggcaccccaggctttacactttatgcttccggctcgtatgttgtgtggaattgtgagcggataacaatttcacacaqqaaacagctatgaccatqattacgccaagcttqcatqcctqcaaqqaqccatagatgcaattcaatcaaactqaaatttctgcaagaatctcaaacacgqaqatctcaaagtttgaaagaaaatttatttcttcgactcaaaacaaacttacqaaatttagqtagaacttatatacattatattgtaattttttqtaacaaaatqtttttattattattatagaattttactggttaaattaaaaatgaataqaaaaggtqaattaaqaqqagaqagqagqtaaacattttcttctattttttcatattttcagqataaattattgtaaaagtttacaaqatttccatttqactaqtqtaaatgaqqaatattctctaqtaagatcattatttcatctacttcttttatcttctaccagtaqaqgaataaacaatatttagctcctttqtaaatacaaattaattttccttcttgacatcattcaattttaattttacqtataaaataaaaqatcatacctattaqaacgattaaggaqaaatacaattcgaatgagaaggatgtgccgtttqttataataaacaqccacacqacqtaaacqtaaaatgaccacatgatgggccaataqacatqqaccgactactaataatagtaagttacattttagqatqqaataaatatcataccgacatcaqttttqaaaqaaaa-

292 qqqaaaaaaaqaaaaaataaataaaagatatactaccqacatqaqttccaaaaaqcaaaaaaaaaqatcaaqccgacacaqacacgcqtaqaqaqcaaaatqactttqacqtcacaccacgaaaacagacgcttcatacqtgtccctttatctctctcagtctctctataaacttaqtgaqaccctcctctqttttactcacaaatatgcaaactaqaaaacaatcatcagqaa5 taaagqqtttgattacttctattggaaaggactctaqaccagtgtcccagctcgtqtgcaataaccgccacaatttcattctcattctggcactgctgaatcaatgtgtcataaagaacaatccttttgttcttgaagaaaccatacatgtaagcattactatggcttgaccttgtagatccatcgacaacaaacagcttcttcagaggaaactttagagaagaagcaagtttctcaatcttctcccggaggtctccatcaggaagaggagtgaacttgttgaaaagaggtgcaatcaaaa-

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293

TCGCAAGGCATATTGCGCGTTGGCGGTAACAAGAAAGGGATCTTCACTCGCGACCGCAAACCGAAGTCGGCGGCTTTTCTGCTGCAAAAACGCTGGACTGGCATGAACTTCGGTGAAAAACCGCAGCAGGGAGGCAAACAATGAATCAACAACTCTCCTGGCGCACCATCGTCGGCTACAGCCT CGGGAATTGCTACCGAGCTCttctaccaatqgtggqactcgatccagagaatgaaatcctqcacactctttcattcttqgctggtcttatgacatggtcacagatcactgatttgccattttctttgtactcaactttcqtqatcgagtctcggcatgggttcaacaaacaaacaatatggatgttcattaqggacatgatcaaagqaatactcctctctgtcatacctgcccctcctatcqttgccgcaattattgttatagttcagaaaggaggtccttacctcgccatctatctgtgggcattcatgtttatcctqtctctagtgatgatqactatataccctgttttgattgcacctcttttcaacaagttcactcctcttcctgatggaqacctccgggaqaagattgaqaaacttqcttcttctctaaagtttcctctgaaqaaqctgtttgttgtcqatggatctacaaqqtcaagccatagtaatgcttacatgtatggtttcttcaagaacaaaaggattqttctttatgacacattgattcagcagtgccagaatgagaatqaaattgtggcggttattQcacacqaqctqqqacactqqqaqctcqaatttccccqatcgttcaaacatttggcaataaagtttcttaagattgaatcctgttgccggtcttgcgatgattatcatataatttctgttgaattacgttaagcatgtaataattaacatgtaatgcatgacgttatttatgagatgggtttttatgattagagtcccgcaattatacatttaatacgcgatagaaaacaaaatatagcgcgcaaactaggataaattatcgcgcgcggtgtcatctatgttactagatcgggaattcactggccgtcgttttacaacgtcgtgactgggaaaaccctggcgttacccaacttaatcgccttgcagcacatccccctttcgccagctggcgtaatagcgaagaggcccgcaccgatcgcccttcccaacagttgcgcagcctgaatggcgcccgctcctttcgctttcttcccttcctttctcgccacgttcgccggctttccccgtcaagctctaaatcgggggctccctttagggttccgatttagtgctttacggcacctcgaccccaaaaaacttgatttgggtgatggttcacgtagtgggccatcgccctgatagacggtttttcgccctttgacgttggagtccacgttctttaatagtggactcttgttccaaactggaacaacactcaaccctatctcgggctattcttttgatttataagggattttgccgatttcggaaccaccatcaaacaggattttcgcctgctggggcaaaccagcgtggaccgcttgctgcaactctctcagggccaggcggtgaagggcaatcagctgttgcccgtctcactggtgaaaagaaaaaccaccccagtacattaaaaacgtccgcaatgtgttattaagttgtctaagcgtcaattígtttacaccacaatatatcctgcca

A SEQ ID N°: 146 é a seqüência de ácido nucléico de pRD29AHP-BnCPP. As seqüências em itálico são as repetições das bordas direita e

294

esquerda. A seqüência sublinhada é o promotor RD29A. A seqüência em negrito é a seqüência anti-sentido de BnCPP, a seqüência em negrito e sublinhada é o fragmento sentido de BnCPP e a seqüência em letra maiúscula representa o fragmento truncado de GUS.

SEQ ID N²: 147 gtttacccgccaafafafcctgtcaaacactgatagtttaaactgaaggcgggaaacgacaatctgatcatgagcggagaattaagggagtcacgttatgacccccgccgatgacgcgggacaagccgttttacgtttggaactgacagaaccgcaacgttgaaggagccactcagccgcgggtttctggagtttaatgagctaagcacatacgtcagaaac

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295

taatttctgttgaattacgttaagcatgtaataattaacatgtaatgcatgacgttatttatgagatgggtttttatgattagagtcccgcaattatacatttaatacgcgatagaaaacaaaatatagcgcgcaaactaggataaattatcgcgcgcggtgtcatctatgttactagatcgggcctcctgtcaatgctggcggcggctctggtggtggttctggtggcggctctga5 gggtggtggctctgagggtggcggttctgagggtggcggctctgagggaggcggttccggtggtggctctggttccggtgattttgattatgaaaagatggcaaacgctaataagggggctatgaccgaaaatgccgatgaaaacgcgctacagtctgacgctaaaggcaaacttgattctgtcgctactgattacggtgctgctatcgatggtttcattggtgacgtttccggccttgctaatggtaatggtgctactggtgattttgctggctctaattcccaaatggc10 tcaagtcggtgacggtgataattcacctttaatgaataatttccgtcaatatttaccttcc- ctccctcaatcggttgaatgtcgcccttttgtctttggcccaatacgcaaaccgcctctccccgcgcgttggccgattcattaatgcagctggcacgacaggtttcccgactggaaagcgggcagtgagcgcaacgcaattaatgtgagttagctcactcattaggcaccccaggctttacactttatgcttccggctcgtatgttgtgtggaattgtgagcggataacaatttca15 cacaqqaaacaqctatqaccatgattacqccaaqcttqcatqcctqcaggqaqccataga* tqcaattcaatcaaactqaaatttctqcaaqaatctcaaacacqqaqatctcaaaqtttqaaaqaaaatttatttcttcqactcaaaacaaacttacqaaatttaqgtaqaacttatatacattatattqtaattttttqtaacaaaatqtttttattattattataqaattttactqqttaaattaaaaatqaataqaaaaqqtgaattaaqaggaqagaqqaqgtaaacattttc20 ttctattttttcatattttcaggataaattattgtaaaagtttacaagatttccatttgactagtgtaaatqaggaatattctctagtaaqatcattatttcatctacttcttttatcttc’ζ taccagtagaggaataaacaatatttagctcctttgtaaatacaaattaattttccttcs ttgacatcattcaattttaattttacgtataaaataaaagatcatacctattagaacgattaaggagaaatacaattcgaatgagaaggatgtgccgtttgttataataaacagcca25 cacgacgtaaacgtaaaatgaccacatgatgggccaatagacatggaccgactactaataatagtaagttacattttaggatggaataaatatcataccgacatcagttttgaaagaaaagggaaaaaaagaaaaaataaataaaagatatactaccgacatgagttccaaaaagcaaaaaaaaagatcaagccgacacagacacgcgtagagagcaaaatgactttgacgtcacaccacgaaaacaqacgcttcatacgtgtccctttatctctctcaqtctctctataaac30 ttagtgagaccctcctctgttttactcacaaatatgcaaactagaaaacaatcatcaggaataaagggtttgattacttctattggaaaggactctagaggatccttaatctgtcttcttgtcttctccatcaatggctcgaagcctctctacaagaggagggtgtgagtagtgataagctgagtacaatgggtctgtgttcatcgctgataagttctcttcctgtagcttcacta-

tcaaacgctcgactaacaaggttgaggtcaaagcttactaggtgttgaagtggtattacagtgtgctgaaatatgatcaaaccaatgagaactggttgtgtatcaaaaccaaaactcctgaagagatcagtggagtttctgacaagagtgtatcctccaaattgcaagaaggcaa5 ggatttgaacagcaatgaacgagtatgtagtgtgattcagcttccagtgtcccagctcgtgtgcaataaccgccacaatttcattctcattctggcactgctgaatcaatgtgtcataaagaacaatccttttgttcttgaagaaaccatacatgtaagcattactatggcttgaccttgtagatccatcgacaacaaacagcttcttcagaggaaactttagagaagaagcaagtttctcaatcttctcccggaggtctccatcaggaagaggagtgaacttgttgaaaagaggtgcaatcaaaacagggtatatagtcatcatcactagagacaggataaacatgaatgcccacagatagatggcgaggtaaggacctcctttctgaactataacaataattgcggcaacgataggaggggcaggtatgacagagaggagtattcctttgatcatgtccctaatgaacatccatattgtttgtttgttgaacccatgccgagactcgatcacgaaagttgagtacaaagaaaatggcaaatcagtgatctgtgaccatgtcataagaccagccaagaatgaaagagtgtgca15 ggatttcattctctggatcgagtcccaccattggtagaaagccgccagatatcttccaaaaccaaggcaagatcccaaagaacagaatcgcagagtccataagtatagtaacaaactcatgaacaaagtgaaaatggcttttgtcaagactgtaagctcgagatttctcaaacttctcttggctaatgactccaaccaaagtctttgggagagtgggaagcttgagagcagtatgttgcctcagatccaaatacgtctcaaaaacgtacatcactatcataaaaccaacga20 cggtttccatgaaaggaatcgccatcccctcgaatttccccgatcgttcaaa-

catttggcaataaagtttcttaagattgaatcctgttgccggtcttgcgatgattatcatataatttctgttgaattacgttaagcatgtaataattaacatgtaatgcatgacgttatttatgagatgggtttttatgattagagtcccgcaattatacatttaatacgcgatagaaaacaaaatatagcgcgcaaactaggataaattatcgcgcgcggtgtcatctatgttactaga25 tcgggaattcactggccgtcgttttacaacgtcgtgactgggaaaaccctggcgttacccaacttaatcgccttgcagcacatccccctttcgccagctggcgtaatagcgaagaggcccgcaccgatcgcccttcccaacagttgcgcagcctgaatggcgcccgctcctttcgctttcttcccttcctttctcgccacgttcgccggctttccccgtcaagctctaaatcgggggctccctttagggttccgatttagtgctttacggcacctcgaccccaaaaaacttgatttgggtga30 tggttcacgtagtgggccatcgccctgatagacggtttttcgccctttgacgttggagtccacgttctttaatagtggactcttgttccaaactggaacaacactcaaccctatctcgggctattcttttgatttataagggattttgccgatttcggaaccaccatcaaacaggattttcgcctgctggggcaaaccagcgtggaccgcttgctgcaactctctcagggcca297

‘X Fí ggcggtgaagggcaatcagctgttgcccgtctcactggtgaaaagaaaaaccaccccagtacattaaaaacgtccgcaatgtgttattaagttgtctaagcgtcaamgftfôcaccacaatatafcctgcca

A SEQ ID N^fl: 147 é a seqüência de ácido nucléico de pRD29Aanti-sentido-BnCPP. As seqüências em itálico são as repetições das bordas 5 direita e esquerda. A seqüência sublinhada é o promotor RD29A. A seqüência em negrito é a seqüência anti-sentido de BnCPP.

SEQ ID N®: 148 gfttacccgccaatatafcctgfcaaacactgatagtttaaactgaaggcgggaaacgacaatctgatcatgagcggagaattaagggagtcacgttatgacccccgccgatga10 cgcgggacaagccgttttacgtttggaactgacagaaccgcaacgttgaaggagccactca-

gccgcgggtttctggagtttaatgagctaagcacatacgtcagaaaccattattgcgcgttcaaaagtcgcctaaggtcactatcagctagcaaatatttcttgtcaaaaatgctccactgacgttccataaattcccctcggtatccaattagagtctcatattcactctcaatccaaataatctgcaccggatctggatcgtttcgcatgattgaacaa15 gatggattgcacgcaggttctccggccgcttgggtggagaggctattcggctatgactgggcacaacagacaatcggctgctctgatgccgccgtgttccggctgtcagcgcaggggcgcccggttctttttgtcaagaccgacctgtccggtgccctgaatgaactgcaggacgaggcagcgcggctatcgtggctggccacgacgggcgttccttgcgcagctgtgctcga-

cgttgtcactgaagcgggaagggactggctgctattgggcgaagtgccggggcaggatctc20 ctgtcatctcaccttgctcctgccgagaaagtatccatcatggctgatgcaatgcggcggotgcatacgcttgatccggctacctgcccattcgaccaccaagcgaaacatcgcatcgagcgagcacgtactcggatggaagccggtcttgtcgateaggatgatctggacgaagagcatcaggggctcgcgccagccgaactgttcgccaggctcaaggcgcgcatgcccgacggcgatgatctcgtcgtgacccatggcgatgcctgcttgccgaatatcatggtggaaaatggccgc25 ttttctggattcatcgactgtggccggctgggtgtggcggaccgctatcaggacatagcgttggctacccgtgatattgctgaagagcttggcggcgaatgggctgaccgcttcctcgtgctttacggtatcgccgctcccgattcgcagcgcatcgccttctatcgccttcttgacgagttcttctgagcgggactctggggttcgaaatgaccgaccaagcgacgcccaacctgccatcacgagatttcgattccaccgccgccttdatgaaaggttgggcttcggaa30 tcgttttccgggacgccggctggatgatcctccagcgcggggatetcatgctggagttcttcgcccacgggatctctgcggaacaggcggtcgaaggtgccgatatcattacgacagcaacggccgacaagcacaacgccacgatcdgagcgaraatatgatcgggcccggcgtccacatcaacggcgtcggcggcgactgcccaggcaagaccgagatgcaccgcgatatcttgc-

298 tgcgttcggatattttcgtggagttcccgccacagacccggatgatccccgatcgttcaaacatttggcaataaagtttcttaagattgaatcctgttgccggtcttgcgatgattatcata-

taatttctgttgaattacgttaagcatgtaataattaacatgtaatgcatgacgttatttatgagatgggtttttatgattagagtcccgcaattatacatttaatacgcgatagaaaa5 caaaatatagcgcgcaaactaggataaattatcgcgcgcggtgtcatctatgttactagatcgggcctcctgtcaatgctggcggcggctctggtggtggttctggtggcggctctgagggtggtggctctgagggtggcggttctgagggtggcggctctgagggaggcggttccggtggtggctctggttccggtgattttgattatgaaaagatggcaaacgctaataagggggctatgaccgaaaatgccgatgaaaacgcgctacagtctgacgctaaaggcaaac10

ttgattctgtcgctactgattacggtgctgctatcgatggtttcattggtgacgtttccggccttgctaatggtaatggtgctactggtgattttgctggctctaattcccaaatggctcaagtcggtgacggtgataattcacctttaatgaataatttccgtcaatatttaccttccctccctcaatcggttgaatgtcgcccttttgtctttggcccaatacgcaaaccgcctctccccgcgcgttggccgattcattaatgcagctggcacgacaggtttcccgactggaaa15 gcgggcagtgagcgcaacgcaattaatgtgagttagctcactcattaggcaccccaggctttacactttatgcttccggctcgtatgttgtgtggaattgtgagcggataacaatttcacacaqgaaacaqctatqaccatqattacqccaaqctqggaaatttttcgccaqttctaaatatccqqaaacctcttqgqatqccattgcccatctatctqtaatttattqacqaaataqacqaaaaqqaagqtqqctcctataaagcacatcattgcgataacagaaagqccattqttqaa20 gatacctctqctgacattggtccccaagtggaagcaccaccccatgaggagcaccgtqqagtaagaagacgttcgagccacgtcqaaaaagcaagtgtgttgatgtagtatctccattga* * cgtaagqgatgacgcacaatccaactatccatcgcaagaccattgctctatataagaaa»4. À gttaatatcatttcgagtggccacgctgagggggatccatggcgattcctttcatggaaaccgtcgttggttttatgatagtgatgtacgtttttgagacgtatttggatctgaggcaaca25 tactgctctcaagcttcccactctcccaaagactttggttggagtcattagccaagagaagtttgagaaatctcgagcttacagtcttgacaaaagccattttcactttgttcatgagtttgttactatacttatggactctgcgattctgttctttgggatcttgccttggttttggaagatatctggcggctttctaccaatggtgggactcgatccagagaatgaaatcctgcacactctttcattcttggctggtcttatgacatggtcacagatcac30 tgatttgccattttctttgtactcaactttcgtgatcgagtctcggcatgggttcaacaaacaaacaatatggatgttcattagggacatgatcaaaggaatactcctctctgtcatacctgcccctcctatcgttgccgcaattattgttatagttcagaaaggaggtccttacctcgc catctatctgtgggcattcatgtttatcctgtctctagtgatgatgactatataccc.í^Íi/síi ι'.Ή.'.'ΪΓ imV

299 tgttttgattgcacctcttttcaacaagttcactcctcttcctgatggagacctccggga gaagattgagaaacttgcttcttctctaaagtttcctctgaagaagctgtttgttgtcga-

tggatctacaaggtcaagccatagtaatgcttacatgtatggtttcttcaagaacaaaa ggattgttctttatgacacattgattcagcagtgccagaatgagaatgaaattgtggcggttattgcacacgagctgggacactggaagctgaatcacactacatactcgttcattgctgttcaaatccttgccttcttgcaatttggaggatacactcttgtcagaaactccactgatctcttcaggagttttggttttgatacacaaccagttctcattggtttgatcatatttcagcacactgtaataccacttcaacacctagtaagctttgacctcaaccttgttagtcgagcgtttgagtttcaggctgatgcttttgcagtgaatcttggttatgcaaaggatctacgtcctgccctagtgaagctacaggaagagaacttatcagcgatgaacacagacccattgtactcagcttatcactactcacaccctcctcttgtagagaggcttcgagccattgatggagaagacaagaagacagattaacccctcgaatttccccgatcgttcaaacatttggcaataaagtttcttaagattgaatcctgttgccggtcttgcgatgattatcatataatttctgttgaattacgttaagcatgtaataattaacatgtaatgcatgacgttatttatgagatgggtttttatgattagagtcccgcaattatacatttaatacgcgatagaaaacaaaatatagcgcgcaaactaggataaattatcgcgcgcggtgtcatctatgttactagatcgggaattcactggccgtcgttttacaacgtcgtgactgggaaaaccctggcgttacccaacttaatcgccttgcagcacatccccctttcgccagctggcgtaatagcgaagaggcccgcaccgatcgcccttcccaacagttgcgcagcctgaatggcgcccgctcctttcgctttcttcccttcctttctcgccacgttcgccggctttccccgtcaagctctaaatcgggggctccctttagggttccgatttagtgctttacggcacctcgaccccaaaaaacttgatttgggtgatggttcacgtagtgggccatcgccctgatagacggtttttcgccctttgacgttggagtccacgttctttaatagtggactcttgttccaaactggaacaacactcaaccctatctcgggctattcttttgatttataagggattttgccgatttcggaaccaccatcaaacaggattttcgcctgctggggcaaaccagcgtggaccgcttgctgcaactctctcagggccaggcggtgaagggcaatcagctgttgcccgtctcactggtgaaaagaaaaaccaccccagtacattaaaaacgtccgcaatgtgttattaagttgtctaagcgtcaatttgtttacaccacaatatatcctgcca

A SEQ ID N²: 148 é a seqüência de ácido nucléico de MuABnCPP. As seqüências em itálico são as repetições das bordas direita e esquerda. A seqüência sublinhada é o promotor MuA. A seqüência em negrito é a seqüência sentido de BnCPP.

Exemplo 33. Análise de Southern

300

A análise de Southern blot genômico de Arabidopsis transgênica

foi realizada utilizando técnica-padrão conhecidas pelo versado na técnica.

Tipicamente, 10 gg de DNA foram submetidos à eletroforese em um gel de agarose a 0,8% e transferidos para uma membrana apropriada tal como a 5 Hybond N+ (Amersham Pharmacia Biotech). As condições de préhibridização e de hibridização eram como as sugeridas pelo fabricante da membrana, tipicamente a 65°C. A lavagem com rigor final era tipicamente a 1X SSC e 0,1% de SDS a 65°C. A região codificadora de NPTII foi tipicamente utilizada como a sonda marcada radioativa mente na análise de Sou10 thern blot.

Trinta e sete linhagens de Arabidopsis foram selecionadas como linhagens de superexpressão de pBI121-AtCPP homozigotas para exames adicionais. A Figura 27 mostra um blot representativo que confirma a presença do transgene pB1121-AtCPP. As linhagens foram confirmadas como 15 sendo transgênicas através da análise da PCR utilizando iniciadores específicos ao transgene nos ensaios da PCR.

Trinta e três linhagens de Arabidopsis foram selecionadas como linhagens de regulação para menos em grampo de cabelo pB1121-HPAtCPP homozigotas para exames adicionais. A Figura 28 mostra um blot 20 representativo que confirma a presença do constructo em grampo de cabelo pBI121-HP-AtCPP. Todas as linhagens foram confirmadas como sendo transgênicas através da análise da PCR utilizando iniciadores específicos ao transgene nos ensaios da PCR.

As linhagens de Arabidopsis foram selecionadas como linhagens 25 de superexpressão pRD29A-AtCPP homozigotas para exames adicionais. A Figura 29 mostra um blot representativo que confirma a presença do transgene pRD29A-AtCPP. As linhagens foram confirmadas como sendo transgênicas através da análise da PCR utilizando iniciadores específicos ao transgene nos ensaios da PCR.

As linhagens de Arabidopsis foram selecionadas como linhagens pRD29A-HP-AtCPP homozigotas para exames adicionais. A Figura 30 mostra um blot representativo que confirma a presença do transgene pRD29A-

301

HP-AtCPP. As linhagens foram confirmadas como sendo transgênicas atra

vés da análise da PCR utilizando iniciadores específicos ao transgene nos ensaios da PCR.

Exemplo 34: Análise da PCR de plantas transgênicas

A PCR foi utilizada como um método para confirmar a presença do transgene em todas as linhagens transgênicas e em cado constructo. As misturas típicas da PCR continham: tampão de reação 1X (10 mM de TrisHCI pH 8,8, 1,5 mM de MgCh,, 50 mM de KCI), dNTPs a 200 μΜ, 1 pM de

iniciadores para frente e para trás, 2,5U de Taq DNA polimerase e o molde mais água até um volume final de 50 μΙ_. As reações foram corridas a 1 minuto a 94°C, 1 minuto a 60°C, 1 minuto a 72°C, durante 30 ciclos. Os iniciadores utilizados na análise das plantas transgênicas pB1121-AtCPP e pBI121-HP-AtCPP eram como mostrado na Tabela 20. Os iniciadores utilizados na análise de pRD29A-AtCPP eram RD29AP1 (SEQ ID N⁹: 161) e _ 15 SEQ ID N^e: 102. Os iniciadores utilizados na análise de plantas transgênicas pRD29A-HP-AtCPP eram os identificados como RD29AP1 (SEQ ID N²: 161), SEQ ID N²: 103 e SEQ ID N²: 103, Nosterm-RV (SEQ ID N²: 162).

Tabela 20.

pBI121-AtCPP BamFW: 5'-GCCGACAGTGGTCCCAAAGATGG-3' (SEQ ID N-.105) % p35S-AtCPP SmaRV:

Õ^AAACCCGGGTTAATCTGTCTTCTTGTCTTCTCCA-S' (SEQ ID N⁹: 102) p35S-HP-AtCPP BamFW:

5'-CTGGAGCTCTTTTACCGAGGTTGGGCCTTGATCC-3' (SEQ ID N²: 103) p35S-HP-AtCPP SmaRV: 5'-GCAAGACCGGCAACAGGA-3' (SEQ ID N⁹: 108)

PRD29AP1: õ-TTTAAGCTTGGAGCCATAGATGCAATTCAA -3' (SEQ ID N²: 161) pRD29AP1: 5'-TTTAAGCTTGGAGCCATAGATGCAATTCAA -3' (SEQ ID N²: 161)

Nosterm-RV:

(SEQ IDN²: 162)

5'-GCAAGACCGGCAACAGGA-3'

302

Exemplo 35: Análise de northern de plantas transgênicas

O RNA total foi isolado do tecido foliar em desenvolvimento de

linhagens de 35S-AtCPP Arabidopsis (plantas T3). Aproximadamente 10 pg do RNA total foram carregados em cada faixa. O Northern blot foi primei5 ro submetido à sonda com o produto da transcrição anti-sentido de filamento simples marcado com P³² de AtCPP que detecta o produto da transcrição sentido e então a sonda foi eliminada e submetido novamente à sonda com o cDNA da β-tubulina que foi utilizada como uma referência. As bandas de hibridização de AtCPP e da β-tubulina foram verificadas e quantificadas utili10 zando o programa UN-Scan-lt (Silk Scientific, Utah, USA) e a proporção das duas bandas de hibridização para cada amostra foi obtida. A proporção das plantas do tipo selvagem foi ajustada em 100% e foi comparada com a das linhagens transgênicas. Vinte e uma de vinte e sete linhagens exibiram maior expressão do produto da transcrição de AtCPP quando comparada à do . 15 tipo selvagem. Os valores variavam de 104% até 282% do tipo selvagem. Os resultados de cinco linhagens (35, 84, 76, 136 e 156) das 21 linhagens com superexpressão são mostrados na Figura 31.

Exemplo 36: Produção de anticorpos policlonais contra AtCPP

Os anticorpos anti-AtCPP foram gerados utilizando a proteína de fusão AtCPP superexpressa em E. coli. O vetor de superexpressão, pMALp2, contém o gene malE de 1175 pb que fica localizado a montante de AtCPP e codifica uma proteína de ligação à maltose de 43 KDa (MBP). O fragmento de DNA de BamHl/Smal de 1275 pb de AtCPP foi inserido no pMAL-p2 nos sítios BarnHI e Sa/I. O sítio Sa/I foi convertido em ponta cega utilizando o fragmento de Klenow. A proteína de fusão resultante MBPAtCPP foi então superexpressa em DH5a e purificada através da afinidade de uma etapa para MBP como descrito pelo fabricante (New England Biolab). A fração solúvel do extrato bacteriano bruto contendo a proteína de fusão MBP-AtCPP foi carregada em uma coluna de amilose (1,5 cm x 10,0 cm) e as proteínas foram eluídas com 10 mM de maltose no tampão de coluna (50 mM de Tris-HCI, pH 7,5, 1 mM de EDTA e 200 mM de NaCI). As frações contendo a proteína de fusão MBP-AtCPP purificada foram agrupa-

das e concentradas em um concentrador Centriprep-30 (Amicon). Todas as etapas de purificação foram realizadas a 4°C. Para gerar um anticorpo, a proteína de fusão purificada foi adicionalmente separada por SDS-PAGE e a banda corada com Coomassie correspondendo à proteína de fusão foi cortada. A identidade da proteína de fusão foi confirmada através da análise de Western utilizando anticorpos anti-MBP (obtidos da New England Biolab). A proteína foi eluída do pedaço de gel por eletroeluição e então emulsificada em adjuvante de Ribi (Ribi Immunochem) até um volume final de 1 mL. A proteína MBP-AtCPP foi injetada em um coelho da Nova Zelândia de 3 kg no dia 1 e injeções de reforço foram fornecidas no dia 21 e no dia 35 com 175 pg da proteína para cada vez. Foram obtidos anti-soros com alto título uma semana após a injeção final.

Exemplo 37: Análise de Western blot de linhagens transgênicas 35S-AtCPP utilizando anticorpos Anti-AtCPP.

A análise de Western foi realizada para examinar o nível de expressão de AtCPP nas linhagens transgênicas comparado com o das plantas do tipo selvagem. O anticorpo anti-Bip, uma proteína de lúmen do RE (Stressgen, Victoria, BC, Canadá) foi utilizada como uma referência. As proteínas totais foram extraídas do tecido foliar em desenvolvimento de cinco linhagens ABA^S e um controle do tipo selvagem. As bandas da proteína antigênica de AtCPP e de Bip foram verificadas e quantificadas utilizando o programa UNScan-lt (Silk Scientific, Utah, USA) e a proporção das duas bandas de proteína para cada amostra foi obtida. A proporção das plantas do tipo selvagem foi ajustada em 100% e foi comparada com as das linhagens transgênicas. Os dados são apresentados na Figura 31 indicando que o nível da proteína AtCPP era maior nas linhagens transgênicas comparado com o das plantas do tipo selvagem.

Exemplo 38: Sensibilidade ao ABA de plantas novas transgênicas.

Aproximadamente 100 sementes foram analisadas por linhagem por placa de 9 cm. As sementes foram plaqueadas em meio mínimo (1/2 MS) sem ABA ou suplementado com 1,0 μΜ de ABA. As placas foram resfriadas durante 3 dias a 4°C na escuridão e incubadas durante até 21 dias a

304

22°C com 24 horas de luz contínua. As placas foram avaliadas em relação à

germinação, à expansão de cotilédones, ao desenvolvimento de folhas verdadeiras e ao vigor da planta nova. As plantas novas foram avaliadas em relação à sensibilidade ao ABA ao longo de 21 dias de crescimento em que 5 as plantas jovens sensíveis ao tempo ficaram presas no estágio de cotilédone, faltavam folhas verdadeiras e exibiam inibição do crescimento radicular. As plantas Columbia de controle do tipo selvagem possuíam dois até três pares de folhas verdadeiras e um sistema radicular bem desenvolvido. As linhagens foram categorizadas como sensíveis ao ABA (ABA^S) se menos de 10 1% das plantas se assemelhasse ao controle, moderadamente sensíveis ao

ABA (ABA^ms) se mais de 1%, mas menos de 50% se assemelhassem ao controle ou insensíveis ao ABA (ABA^wt) se mais de 50% se assemelhassem ao controle.

Por exemplo, se uma placa tivesse 20 plantas novas saudáveis - 15 e a placa de controle tivesse 60 plantas novas saudáveis, a linhagem seria 33% do controle e categorizada com moderadamente sensível ao ABA. Todos os quatro constructos de vetores (pBI121-AtCPP, pBI121Hp-AtCPP, pRD29AHp-AtCPP, pRD29A-ATCPP) resultaram em linhagens transgênicas de Arabidopsis que possuíam maior sensibilidade ao ABA que é um indicati20 vo de tolerância ao estresse. Os dados para todos os 4 constructos são % mostrados na Figura 32. Das linhagens transformadas com o constructo pBI121-AtCPP para superexpressarem o gene AtCPP, 58% (21 de 36) foram classificadas como sensíveis e 30% adicionais (11 de 36) foram classificados como moderadamente sensíveis. Estas linhagens foram testadas nova25 mente nas gerações T4 e T5 e a sua sensibilidade ao ABA ainda estava presente indicando que a sensibilidade ao ABA é uma característica que pode ser herdada. Das linhagens transformadas com o constructo pBI121-HPAtCPP para regular para menos o gene AtCPP através da inibição com RNA de filamento duplo, 15% (7 de 45) foram classificadas com sensíveis e 31% 30 (14 de 45) foram classificadas como moderadamente sensíveis. Para ilustrar a sensibilidade aumentada de linhagens transgênicas ao ABA, a Figura 33 mostra os resultados da germinação e do desenvolvimento de plantas novas

305

ao longo de uma faixa de concentrações de ABA. O tipo selvagem e a pRD29A-HP-AtCPP são comparadas. Das linhagens transformadas com pRD29AHp-AtCPP 70% (12 de 17) exibiam alta sensibilidade e 24% (4 de 17) exibiam sensibilidade moderada ao ABA. Das linhagens transformadas com pRD29A-AtCPP 29% (5 de 17) exibiam alta sensibilidade e 12% (2 de 17) sensibilidade moderada ao ABA. Claramente todos os 4 constructos de transgenes são alteradoras da sensibilidade ao ABA e da transdução de sinal do ABA.

¹⁰

Exemplo 39: Experimentos de Seca

Plantas de Arabidopsis foram cultivadas cinco plantas por vaso de 4 ou de 3, em um experimento de estresse hídrico com réplicas. Todos os vasos foram preenchidos com quantidades iguais de solo pré-misturado e umedecido homogêneo. As plantas foram cultivadas sob 16 horas de luz do dia (150-200 pmoles/m²/s) a 22°C e umidade relativa de 70%. No dia que a , 15 primeira flor abriu, o tratamento de seca foi iniciado. Primeiro o teor de água no solo em cada vaso foi equilibrado com uma base em peso e qualquer adição de água a mais nas plantas foi interrompida. Foram tiradas medidas diárias do teor de água no solo registrando o peso total do vaso. No final do tratamento de seca (6 até 9 dias para experimentos com vasos de 4 e 4-5 dias para experimentos com vasos de 3) as plantas foram colhidas e os

pesos secos dos brotos foram determinados. As diferenças no crescimento da planta foram fatoradas na análise através da expressão da perda de água em uma base de peso seco por grama de broto.

39a) pBI121-AtCPP, Seleção de estresse à seca:

A análise das linhagens transgênicas pBI121-AtCPP durante os experimentos de tratamento de estresse hídrico de um período de até oito dias, mostra uma forte tendência para um maior teor de água no solo e uma perda de água reduzida por grama de biomassa de broto. Após três dias de tratamento com estresse hídrico, a maior parte das linhagens possuía um 30 maior teor de água no solo em relação ao do controle do tipo selvagem com quatro de vinte e quatro linhagens, 146, 149, 156 e 97, mostrando uma diferença estatisticamente significativa. A quantidade de água perdida por grama

306 de biomassa de broto era inferior para todas as linhagens exceto uma (95) e

treze destas linhagens eram significativamente diferentes do controle Columbia do tipo selvagem (Figura 34). Todas as linhagens exibindo uma perda de água inferior estatisticamente significativa por grama de biomassa de bro5 to também exibiam uma maior sensibilidade ao ABA. Há ainda uma forte tendência, para todas menos uma linhagem (95), que é ABA^wt, para uma biomassa de brotos maior no final do tratamento de estresse de seca. Sete destas linhagens 136, 146, 23, 46, 76, 84 e 9, eram estatisticamente significativa partindo do controle em um valor de p = 0,05.

39b) pBI121-AtCPP, Perda de água por grama de biomassa de broto durante o tratamento de estresse hídrico:

As linhagens 35, 76, 95 e um controle do tipo selvagem foram cultivados e colocados sob um tratamento de estresse hídrico como acima. As plantas foram coletadas nos dias 2, dias 4 e dias 6 de tratamento de se15 ca. As linhagens ABA^S, 35 e 76, exibiam uma redução estatisticamente significativa na perda de água em relação ao peso seco de broto em todos os três pontos de tempo (Tabela 21). Adicionalmente, as duas linhagens transgênicas ABA^S possuíam maior biomassa de brotos, por causa da maior biomassa foliar e mantiveram os teores mais altos de água no solo durante o 20 tratamento de seca.

Tabela 21. Perda de água (g) por peso seco de broto (g) após 2, 4 e 6 dias

W de tratamento de estresse de seca. Os valores em negrito indicam diferenças estatisticamente significantes partindo de Columbia.

	2 dias	4 dias	6 dias
Linha- gem	Média	Erro Padrão	Média	Erro Padrão	Média	Erro Padrap
35	212,5	3,5	308,0	9,9	297,7	11,2
76	227,2	5,8	321,2	8,5	293,8	5,0
95	287,0	5,1	377,3	14,8	348,5	25,5
Columbia do tipo selvagem	265,3	11,8	408,2	7,7	345,9	6,7

307

39c) pBI121-AtCPP, Estresse à seca e recuperação de brotos:

A tolerância ao estresse hídrico e a determinação da capacidade de recuperação pós-tratamento de seca foram avaliadas utilizando 20 das 24 linhagens transgênicas pBI121-AtCPP. O tratamento de seca foi imposto durante 6 dias após os quais as plantas foram regadas e foi permitido que crescessem durante 6 dias. A biomassa fresca de brotos recuperados foi então determinada. O teor de água no solo destas plantas foi medido diariamente durante o tratamento de seca e os resultados confirmam as tendên-

cias observadas anteriormente. Todas as linhagens sensíveis ao ABA (A10 BA^S) que exibiram uma redução estatisticamente significativa de perda de água em uma base de peso seco por grama no experimento 39a, continuaram a mostrar um teor de água no solo significativamente maior que o das plantas de controle neste experimento (Tabela 22). Adicionalmente, a Tabela mostra que a biomassa fresca de brotos recuperados após 6 dias de tra15 tamento de seca era significativamente maior em todas as linhagens de ABA que na Columbia

Tabela 22. Teor de água no solo no dia 3 do tratamento de seca e peso fresco de brotos recuperados após 6 dias de tratamento de seca (os valores em negrito eram significativamente diferentes dos da Columbia em p = 0,05)

	Condição do ABA	Teor de água no solo dia 3	Biomassa de broto recuperada
Linhagem	ABA	Média (% inicial)	Erro Pa- drão	Média (g)	Erro Pa- drão
136	ABAS	46,6	1,9	4,5	0,16
14	ABAS	50,25	0,7	4,1	0,12
146	ABAS	45,9	2,5	4,0	0,11
147	ÃBÃ5	45,1	1,7	4,0	0,15
149	ABAS	45,3	1,8	3,8	0,17
156	ABAS	47,1	1,9	4,0	0,134
23	ABAS	49	1,4	4,0	0,17
33	ABAb	46,9	1,6	4,3	0,14
35	ABAS	41,7	1,7	4,0	0,11

^.ür

46	ABA5	44,8	1,7	3,8	0,09 y
63	ABA5	46,3	1,4	4,0	0,19
76	ABA5	47,8	1,0	3,9	0,17
79	ABA5	45,4	1,1	4,1	0,09
84	ABA5	46,8	1,9	4,1	0,16
85	ABA5	45,3	1,9	4,0	0,12
9	ABA5	45,2	2,1	3,9	0,12
93	ABAm	43,5	1,2	2,8	0,07
94	ABAS	46,9	1,5	3,9	0,13
97	ABAS	53	1,2	3,8	0,16
95	ABAwt	41,9	1,2	2,7	0,06
Columbia	ABAwt	41,3	1,0	2,7	0,04

39d) pBI121-AtCPP, Rendimento de sementes após o tratamento de estresse de seca:

O rendimento de sementes após o estresse de seca durante a florescência foi verificado utilizando dez linhagens transgênicas pBI1215 AtCPP, das quais oito eram ABA^S. As plantas foram cultivadas uma por vaso de 10,16 cm (4) e foram expostas a 9 dias de tratamento de seca como descrito acima. Um segundo grupo de plantas foi cultivado e mantido sob condições bem regadas como o grupo ótimo. Após 9 dias de condições de tratamento de seca as plantas foram regadas novamente e foi permitido que 10 continuassem a crescer e produzir sementes até a maturidade. Após as condições de tratamento de seca, todas as oito linhagens ABA^S tinham rendimentos maiores em relação aos dos controles, que variavam de 109% até 126% da Columbia (Tabela 23). O tratamento de seca resultou em uma redução do rendimento em todas as linhagens, incluindo os controles, em rela15 ção às plantas cultivadas sob condições ótimas. A expressão dos rendimentos de sementes obtidos do grupo tratado com seca em relação à mesma linhagem sob condições ótimas mostra que os transgênicos preservam uma porcentagem maior de rendimento ótimo de sementes do que as linhagens do tipo selvagem.

Tabela 23. Rendimento de Sementes após 9 dias de tratamento de seca

	Condição do ABA	Rendimento de Sementes (g por planta)
Linhagem	ABA	Média (g)	Erro Padrão	% Columbia	% Ótima
156	ABA5	0,735	0,044	126,2	83,7
63	ABAS	0,675	0,061	116,0	71,0
146	ABA5	0,666	0,053	114,4	72,9
94	ABA8	0,644	0,052	110,6	68,8
84	ABA5	0,642	0,049	110,4	61,8
76	ABA5	0,631	0,055	108,5	66,6
136	ABA5	0,630	0,051	108,3	74,1
35	ABA5	0,614	0,054	105,6	74,2
93	ABAwt	0,567	0,041	97,5	60,0
95	ABAwt	0,388	0,088	66,7	43,4
Columbia	ABAwt	0,582	0,060	100	53,8

39e) pBI121-AtCPP, Rendimento de sementes e crescimento sob condições hídricas ótimas:

As linhagens avaliadas acima e um número de linhagens adicio5 nais foram examinados em um experimento de crescimento e de rendimento sob condições bem regadas ótimas. Os resultados indicaram que as linhagens ABA^S eram mais curtas no estágio da primeira flor aberta, possuíam mais folhas nas rosetas, entretanto, na maturidade não havia diferenças na altura da planta de transgênicas e de Columbia. Além disso, os transgênicos 10 ABA^S exibiam rendimentos de sementes similares ou maiores variando de

95% até 121% do controle do tipo selvagem (Figura 35).

39g) pRD29A-HP-AtCPP seleção em relação ao fenótipo tolerante à seA análise de 17 linhagens transgênicas identificou 7 linhagens candidatas tolerantes à seca (12, 22, 23, 47, 82, 83, 90) com base de maior teor de água no solo e menor perda de água por g de peso seco de brotos (Tabela 24). Todas as 7 linhagens candidatas tolerantes à seca exibiram ca:

310

forte sensibilidade ao ABA e linhagens que não exibiram tolerância à seca não exibiam sensibilidade ao ABA.

Tabela 24. Teor de água no solo após 3 dias de tratamento de seca e perda de água por g de peso seco de brotos. Os valores em negrito são estatisti-

camente diferentes dos d	a Columbia do tipo selvagem (p = 0,05)
	Condição do ABA	Teor de água 2	no solo dia	Perda de água em 2 dias/g de broto DW
Linhagem	ABA	Média (% inicial)	Erro Pa- drão	Média (g/g)	Erro Padrão
10	ABA8	33,4	1,6	199,1	4,5
11	ABA8	34,6	3,3	173,1	1,6
12	ABA8	36,2	2,0	179,5	5,0
126	ABAM8	32,5	2,6	199,1	4,1
127	abaM8	33,5	2,0	195,6	10,6
14	ABAS	32,7	1,2	203	4,9
17	ABA8	29,9	1,8	200,7	7,3
22	ABA8	39,3	2,1	170,0	3,0
23	ABA8	35,7	1,4	174,9	2,6
42	ABAM8	28	0,7	185,4	5,8
47	ABA8	35,9	2,2	181,2	7,7
7	ABAwt	35	1,3	201,8	5,1
82	ABA8	36,7	2,2	178,3	4,0
83	ABA8	40	1,4	180,7	6,9
9	ABA8	31,4	1,4	173,8	8,7
90	ABA8	38,2	1,3	177,6	6,2
93	ABAWt	30,7	1,8	175,3	4,6
Columbia	ABAwt	32,1	1,2	196,9	6,2

Exemplo 40. Análise de Crescimento

A análise de crescimento da maior parte dos constructos promissoras foi ajustada em 3 estágios. Oito plantas por linhagem foram cultivadas em vasos de 3 com uma planta por vaso a 22°C, 16 h de luz (15010 200 gmoles/m²/s) e 70% de umidade relativa. As plantas foram colhidas no

311 estágio de crescimento vegetativo (plantas novas de 2 semanas de idade), no estágio de crescimento de brotar (na primeira flor aberta) e no estágio de crescimento na metade da florescência (5 até 7 dias da primeira flor aberta). Ainda, em alguns experimentos de crescimento, um grupo adicional de plan5 tas foi cultivado em vasos de 10,16 cm (4) (uma por vaso e 10 plantas por linhagem) até a maturidade para determinações de rendimento de sementes.

40a) pBI121-AtCPP cultivo sob condições ótimas e de estresse biótico

O crescimento e a produtividade das linhagens transgênicas pBI121-AtCPP de Arabidopsis foram examinados em vários estágios do de10 senvolvimento sob condições ótimas de crescimento. Embora as condições ótimas de crescimento tenham sido mantidas, as plantas foram avaliadas como estando sob um grau de estresse que foi determinado mais tarde como sendo um resultado das propriedades do solo. A análise do solo encontrou um contaminante fúngico que se acreditava ser responsável pelo es. 15 tresse biótico. Este estresse poderia ser negado através da esterilização do solo antes do uso. Oito linhagens ABA^S, duas com sensibilidade normal ao ABA (ABA^wt) e um controle de Columbia do tipo selvagem foram analisados.

A Figura 36 apresenta os resultados de vários parâmetros de crescimento (do estágio de florescência média) e de rendimento e cada ca20 racterística é expressa como uma porcentagem do controle de Columbia. Os resultados sustentam fortemente um fenótipo de crescimento melhorado. Este fenótipo de crescimento melhorado está presente em todos os estágios de crescimento. No estágio vegetativo, todas as plantas transgênicas ABA^S exibiram um aumento no número de folhas em relação ao do tipo selvagem 25 com quatro de oito linhagens que exibem uma diferença estatisticamente significativa. As duas linhagens ABA^wt mostraram a mesma quantidade ou menos folhas em relação ao tipo selvagem.

No estágio de brotar, as transgênicas ABA^S exibiam um aumento no número de folhas, mas as plantas eram mais curtas neste estágio (primei30 ra flor aberta) que as de controle. O peso fresco de brotos das transgênicas era significativamente maior em relação ao dos controles, variando de 80% até 342% do tipo selvagem. As transgênicas ABA^S exibiam um retardo na

312 florescência de um até três dias. As transgênicas ABA^wt não exibiam florescência retardada, maior peso fresco de brotos ou maior altura.

No estágio do desenvolvimento de florescência o fenótipo de maior crescimento é mantido (número de folhas e peso fresco maiores), entretanto, não 5 havia diferenças que pudessem ser observadas na altura da planta indicando que as transgênicas broto de forma mais curta, mas atinge a mesma altura final da planta.

É de significado particular a observação de que, sob estas condições (estresse biótico por causa da presença de fungos no solo), os ren10 dimentos das transgênicas ABA^S eram significativamente maiores, variando de 120% até 229% do controle do tipo selvagem. As linhagens ABA^wt exibiam rendimentos similares ou ligeiramente reduzidos em relação ao controle de Columbia. Esta descoberta indica que as linhagens transgênicas ABA^S são menos afetadas pelo estresse biótico. Foi confirmada esta observação, 15 , em que 5 das linhagens tolerantes à seca foram cultivadas em solo contaminado até a maturidade. Os rendimentos de sementes de linhagens transgênicas, muito embora enormemente reduzidos em relação às condições ótimas, eram 2,5 até 4,5 vezes maiores que os da Columbia do tipo selvagem (Tabela 25).

Tabela 25. Rendimento de sementes de linhagens pBI121-AtCPP cultivadas em solo contaminado. Os valores em negrito indicam diferenças estatísticas em p = 0,05

Linhagem	Sensibilidade ao ABA	Rendimento de Sementes por planta (g)	% de Columbia
156	ABA8	0,33 + 0,04	316%
23	ABA8	0,35 + 0,05	336%
76	ABA8	0,31 + 0,04	296%
84	ABA8	0,25 + 0,33	237%
9	ABA8	0,48 + 0,05	455%
Columbia	ABAwt	0,11+0,03

40b) pBI121-AtCPP crescimento inicial de plantas novas:

Quatro linhagens ABA^S e uma linhagem ABA^wt mais Columbia

313 foram examinadas em relação ao crescimento inicial de plantas novas sobre placas de ágar. Vinte sementes foram plaqueadas em uma linhagem sobre placas de ágar contendo 50% de MS com 1 % de sacarose e vitaminas e foram utilizadas 6 placas por linhagem. As placas foram colocadas em declive, o que permitiu que as raízes crescessem para baixo. O comprimento da raiz foi medido nas plantas novas com 7 dias de idade e a biomassa de brotos e de raízes foi determinada nas plantas novas com 11 dias de idade. Duas das linhagens transgênicas ABA^S possuíam raízes mais longas e todas as 4 linhagens ABA^S possuíam pesos secos de brotos 114% até 123% dos controles e pesos secos de raízes de 116% até 151% de controles. Como um resultado, as proporções da biomassa de brotos em relação à biomassa de raízes eram ligeiramente reduzidas nos transgênicos. Estes resultados indicam que o maior crescimento destes transgênicos é evidente no estágio inicial do crescimento, logo após a germinação e o crescimento radicular é maior em relação ao crescimento dos brotos. Em um experimento diferente, as plantas novas foram retiradas do ágar e as raízes foram coradas com azul de toluidina para mostrar a sua estrutura. A Figura 13 mostra que as linhagens transgênicas possuíam um sistema radicular lateral mais extenso, que contribuiría para uma maior biomassa de raízes.

40c) pRD29A-HP-AtCPP características ótimas de crescimento

Um estudo do crescimento ótimo foi conduzido com 10 linhagens como descrito anteriormente. Os dados do crescimento vegetativo mostraram que duas das linhagens (12 e 9) possuíam significativamente mais folhas e sete das linhagens (12, 22, 23, 47, 82, 9) possuíam uma biomassa de brotos significativamente maior. Os dados de brotar mostravam que oito das linhagens (12, 22, 23, 47, 82, 9, 90, 93) eram significativamente retardadas na florescência em um ou dois dias e sete das linhagens eram significativamente mais curtas que a Columbia na primeira flor aberta. Todas as linhagens exceto a 42 e a 7 possuíam um número significativa mente maior de folhas nas rosetas e peso fresco de brotos e esta tendência é mantida na colheita no florescimento médio (Figura 38). A altura da planta, entretanto, na colheita no florescimento médio não era significativamente diferente entre

as linhagens transgênicas e de controle. Todas as linhagens que exibiam este crescimento maior também exibiam tolerância à seca e sensibilidade ao

ABA.

Exemplo 41. Ultraestrutura de pBI121-AtCPP

Duas das linhagens tolerantes à seca e ABA^S (35 e 76) mais a

Columbia do tipo selvagem foram utilizadas para examinar as secções transversais de caule e de raiz em relação a quaisquer diferenças na ultraestrutura. Secções a mão livre de caules maduros (plantas florescendo durante

dias) foram obtidas acima do primeiro nodo, coradas com azul de toluidina e preservadas em glicerol. Os caules das plantas transgênicas pareciam possuir uma estrutura celular mais densa e conter um ou dois mais feixes vasculares que a Columbia do tipo selvagem indicando um sistema mais melhorado de transporte de água e nutrientes.

Discos foliares foram tirados e os pesos frescos foram determi- 15 nados. Os discos de folhas transgênicas eram significativamente mais pesados 20-24% maiores que os dos controles do tipo selvagem correspondentes. Acredita-se que este aumento seja um resultado de uma folha mais espessa.

Exemplo 42. Experimento de estresse ao frio de pBI12120 AtCPP

P Quatro linhagens ABA^S tolerantes à seca (156, 23, 35, 76) e uma 'í» J linhagem ABA^wt(95) linhagem mais Columbia do tipo selvagem foram incluídas em um estudo de estresse ao frio. As plantas foram cultivadas em vasos de 7,62 cm (3) (uma por vaso) com 10 vasos em réplica por linhagem a 25 22°C durante 10 dias (7 dias em placas com ágar e 4 no solo). O grupo do estresse ao frio foi transferido para 7°C durante 5 dias enquanto que o grupo ótimo era mantido a 22°C. Após 5 dias no frio tanto o grupo de estresse ao frio quanto o grupo ótimo foram coletados para a determinação da biomassa de brotos. As linhagens ABA^S e tolerantes à seca possuíam uma biomassa 30 de brotos significativamente maior que a Columbia tanto nos grupos ótimos (25 até 39% maior peso fresco de brotos) quanto de estresse ao frio (18 até

44% maior DW de brotos) (Tabela 26). Os resultados de um estresse ao frio

315

de oito dias mostraram que diferenças entre as linhagens transgênicas e Columbia era ainda mais pronunciadas (53 até 61% maior peso fresco de brotos). Este resultado indica um maior vigor da planta e uma melhor capacidade das transgênicas lidarem com o estresse ao frio.

Tabela 26. Peso fresco de brotos de pBI121-AtCPP ótima e estressada ao frio (5C para 5d). Os valores em negrito indicam uma diferença estatística a p = 0,05

Linhagem	Sensibilidade ao ABA	Peso Fresco Ótimo dos Brotos	Peso Fresco dos Brotos com Estresse ao Calor
		mg	% de Columbia	mg	% de Columbia
156	ABAS	95,4 + 3,7	137%	23,1 0,7	118%
23	ABAS	96,3 + 3,9	139%	28,3 1,5	144%
35	ABAS	87,0 + 1,7	125%	25,3 1,4	130%
76	ABAS	94,7 + 2,2	136%	27,3 1,5	140%
95	ABAWt	67 + 2,4	96%	21,4 1,0	109%
Columbia	ABAWt	69+1,9		19,6 1,1

Exemplo 43. Estresse à seca sob alta temperatura de pBI121-AtCPP

Um experimento de estresse à seca foi realizado como descrito acima exceto pelo fato de que a tem do dia de 32°C (16 h) e a temperatura da noite de 22°C (8 h) foram mantidas. Estas temperaturas foram atingidas diariamente ao longo de um período de rampa de 2 h. Quatro linhagens ABA^S e uma linhagem ABA^wt mais Columbia foram incluídas. As plantas foram monitoradas diariamente em relação à perda de água e ao teor de água no solo e após 5 dias de tratamento de seca, metade das plantas foi colhida e a outra metade foi novamente regada e foi permitido que se recuperasse durante quatro dias. Os brotos foram colhidos e o peso fresco dos brotos foi determinado. Os resultados (Tabela 27) deste experimento mostraram que as linhagens tolerantes à seca previamente identificadas mantiveram seu fenótipo de tolerância à seca a alta temperatura e eram capazes de se recuperar bem do estresse à seca a alta temperatura.

316

Tabela 27. Teor de água no solo no dia 2 e perda de água em 2 dias/peso seco final dos brotos mais peso fresco dos brotos em recuperação após 5

dias de estresse à seca a temperaturas de 32°C de dia e 22°C a noite. Os

valores em negrito indicam diferenças significativas partindo do controle de

Columbia.

linhagem	Sensibilidade ao ABA	Teor de água no solo dia 2	Perda de água em 2d/peso seco de broto	Peso fresco de broto recuperado (g)
136	ABAS	50,4 + 1,1	485,7 + 18,5	1,30 + 0,04
146	ABAS	52,1 ±1,0	504,5 + 7,9	1,15 ±0,04
35	ABAS	52,2 + 0,8	502,8 + 15,8	1,19 + 0,02
76	ABAS	52,1 ±0,6	435,6 + 10,5	1,11 ±0,03
95	ABAWt	50,0 + 0,9	518,2 + 13,0	0,86 + 0,03
Columbia	ABAWt	48,6 + 0,6	559,7 + 19,0	0,84 ±0,03

Exemplo 44. Estresse ao calor e rendimento de sementes de pBI121

AtCPP

Duas linhagens ABA^S e uma linhagem ABA^wt mais Columbia foram examinadas em relação ao efeito do estresse de calor durante a flo10 rescência sobre o rendimento final de sementes. As plantas foram cultivadas

em vasos de 10,16 cm (4 polegadas) (uma/vaso) como descrito anteriormente e 9 dias desde a primeira flor aberta a temperatura subiu de 22°C para 43°C ao longo de 2 horas e as plantas foram mantidas a 43°C durante 2 horas. A temperatura foi então diminuída novamente para 22°C durante 2 ho15 ras e as plantas foram cultivadas sob condições ótimas até a maturidade. Os rendimentos das sementes deste experimento são mostrados na Tabela 28.

Uma das linhagens tolerantes à seca (35) possuía um rendimento significativamente maior que a Columbia.

317

Tabela 28. Rendimento de sementes de linhagens pBI121-AtCPP após duas horas de estresse ao calor de 43°C 9 dias partindo da primeira flor aberta. Os valores em negrito são estatisticamente significativos partindo de Colum-

bia.

Linhagem	Sensibilidade ao ABA	Rendimento de sementes (g/planta)	Rendimento de sementes (% de col.)
35	ABAS	0,55 + 0,05	347%
76	ABAS	0,24 + 0,03	148%
95	ABAWt	0,11 +0,02	69%
Columbia	ABAWt	0,16 + 0,03

Foi avaliado o efeito do choque térmico sobre as linhagens de pBI121-AtCPP no estágio inicial de florescência. Três linhagens ABA^S (76, 136, 97) uma linhagem ABA^wt (95) e um controle do tipo selvagem de Columbia foram semeados em 128 superfícies planas de células, uma superfície planta por linhagem. No estágio inicial de florescência, as superfícies „ 10 planas foram expostas a uma temperatura de 46,8°C durante 50 minutos e então devolvidos para as condições de crescimento normais. A falta do crescimento contínuo partindo dos meristemas principais foi definida como a morte do meristema principal e classificada para cada linhagem. Os dados são mostrados na Tabela 29.

Tabela 29. Morte do meristema causada pe	o choque térmico
Linhagem	Tipo selvaqem	95	76	136	97
% de Morte	91	97	79	59	18

Exemplo 45. Determinações da densidade dos estômatos de pBI121AtCPP

Duas linhagens ABA^S (76 e 35) mais Columbia foram examinadas em relação á densidade dos estômatos na superfície foliar superior e na 20 inferior. Impressões com esmalte de unha da epiderme superior e inferior foram obtidas partindo de uma folha N°5 completamente expandida. Estas impressões foram analisadas sob o microscópio e o número de estômatos por 8,7 χ 10’⁸ m² foi contado. Não havia diferenças significativas encontradas entre transgênicas e Columbia nos estômatos da epiderme superior ou infe25 rior (Tabela 30). Os aumentos observados na tolerância à seca e na perda

318

de água reduzida não podem ser atribuídos a um número reduzido de estômatos por folha.

Tabela 30. Números de estômatos por 8,7 x 10’⁸ m² de epiderme abaxial e adaxial de folha N°5 completamente expandida em pBI121AtCPP.

Linhagem	Sensibilidade ao ABA	Estômatos na epiderme superior	Estômatos na epiderme inferior
35	ABAtí	68 + 5	103 ±7
76	ABAtí	58 + 6	120 + 16
Columbia	ABAWt	57 + 6	116 + 11

Exemplo 46. Seqüências Consentido de CPP

Estão também incluídas na invenção as seqüências consentido

is de CPP. As seqüências consentido foram geradas através do alinhamento do polipeptídeo de CPP e seqüências de ácidos nucléicos assim como seqüências homólogas utilizando o programa BioEdit.

O x na seqüência consentido representa qualquer aminoácido ou nucleotídeo. Preferencialmente x é uma substituição conservativa de aminoácido ou de nucleotídeo. Mais preferencialmente, x é o aminoácido ou o nucleotídeo mais prevalecente em uma certa posição. Por exemplo, o aminoácido na posição 145 of SEQ ID N²: 168 é uma prolina uma vez que ocorre 66% do tempo.

Tabela 31. Análise de ClustalW de Ácidos Nucléicos SOJA

1) SOJA_AT1 (SEQ ID N²: 116)

2) SOJA.AT2 (SEQ ID N²: 118)

3) SOJA-Milho (SEQ ID N²: 120)

4) SOJA-Soja (SEQ ID N²: 122)

5) Consentido (SEQ ID N²: 163)

20 30 40 5060

SOJAAT1 1

SOJA_AT2 1

SOJA-Milho 1

SOJA-Soja CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTAACAACGCAGAGTACGCGGGGGGAGACG 60

Consensos xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx

XXXXXXXXXXX 60

100 110 120

319

------------------------------------------------------------1

------------------------------------------------------------1

------------------------------------------------------------1 CATGGTTCTGAACTAATTGTTATAAATAATACCS0JA_AT1

S0JA_AT2

SOJA-Milho

SOJA-Soja

TAAAATTTTGAGTTGTCCTAAACATTG 120

Consensos xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx

XXXXXXXXXXX 120

130 140 150 160 170 180

SOJA_AT1 1

SOJA_AT2 1

SOJA-Milho 1

SOJA-Soja GGGTTTAAACAAATCCAATCTCTCAATATAAAACCCAATGATCTCACCCTCACTCCGTTT180

Consensos xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx

XXXXXXXXXXX 180

190 200 210 220 230 240

SOJA_AT1 --------------------------------------------------SOJAAT2 --------------------------------------------------SOJA-Milho ---------------------------------------------------

SOJA-Soja CTGATTTCTCACTCTTCGTTTCTCGTTCGGTTCATCAGCGTGTGTCTCAGCC

ATGGCG

240

Consensos xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx

XXXXXXXXXXX 240

250 260 270 280 290 300

ITTTATGAT

ITTTATGAT.

0gQgQ

2g3gH

SOJA-Milho

Consensos

-------------------------1 xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx

XXXXXXXXXXX 300

320

SOJA_AT2 Bugiei ncggG^A^cHlG]

SOJA-Milho -----SOJA-Soja Ktefe iiTtgSA^GrAWTii

Consensos

tcEct^tSEEEgHíESa^E j 128

-----------------------------₁__

T0GGggcSE33AHHg§TESH

xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx XXXXXXXXXXX 360

370 380 390 400 410 420

SOJA-Milho

Consensos gcüEiíS xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx XXXXXXXXXXX420

430 440 450 460 470 480 sojAAijcjjHWijg0i^^iB^^iHEcijTSTGE0SH

Πθί^1···ΜΠΙΗ··ϊ8ξΜΑΠΟΐΒΪ 248

SOJA_AT2 CÍMfaBÍ^Tg^QMraiA^gTCT^CnTCTTGE^gga Πθί·^··άΜΐΤ[Η··Μ58ΑΓΐθΒΪ 248

SOJA-Milho

SOJA-Soja

Consensos

|gactci3 xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx XXXXXXXXXXX 480

490 500 510 520 530 540

--I- --1--1--1--1--1--1--1--1__

SOJA AT1

GGTT^gg'

SOJA_AT2

GGTTgggfc

SOJA-Milho

ACEA@GSjGAGÜG

SOJA-Soja g·;

TAGCTEgfrTÍlCACTiG

Consensos xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxExxjjx

XXÜXgxgSiÊSE 540

jEãíjjMgJ^STGLETSEECTGLÊTUACgGH

SiSiCBAS^yyH 308 _____

ÍfaáiiÍag^AXefJTGiggTftf^ECAGmTliACgGCT

TGEneffiAEfeXCf^ 308

^^AAngAt^JtdA-rríiiAnGAffiACT

540 ‘;ΰα^·^ιί,

321

590 600

550 560 570 580

-·Ι-·Ι-·! | | l i .| -|·,·|,··|,·.|___ soja άτι it^A^wwíWÀWATgTlmTffiAiBíHMiGRHíqaiGnTlBB iiMcAiígqi^^cEiidagrtaB 368

Rg^cAH5m^^^llCCTBWAl 368

SOJA-Milho B^GarJAUABSQggCtgÜGSTbBWlAEhítfCÍlTCCCT ngGTin^Z^GWA!dAl7^gAM08O

SOJA-S^lÍaOilKj^ffifejljMgCtgiiGSCÍBÍHBiAgSAgglGCnGCT n^TTflSS^^^gHA^A^ 600 ___

Consensos jg^XarjxjjXBBxESxMgixSxÍBÍHllXgSxgTgXXXxCT BSxxxncgSSxs0^x&gxwB6oo

610 620 630 640 650 660

SOJA AT1 |>·^^ίΑΪ·«ί^·τίϊ^·νΑΤ·4^·^νΑΤ·^···Ο

EggSG^j^GlBcBÍxfflBAga 428 __________

SOJA AT2 jjrifi^AB··^ ΤΪ5Γή!^ί<^^·ΒΪ0 gggSGt«^íciriGÍÍÍC_ _

SOJA-Milho C|IjM«&jGB nggWg^gSTm ~

SOJA-Soja jjBfcMICIWffil cSgfrteaiaS

Consensos XjjtfgWj

ExSExSSEe

τΐΒτΒ0

690

680

GTGA'		GAG
GTGA'	5d	GAG

rg ig

CnCÍroTÍtoVAU>MlltSÍTCT«Ag^aGS8

140___ cia^iàyjA^Éàiit^^iiwgGta

660 _________ ____ χΠχ!^χΠΒ^η··ιχΗϊχ^ϊχΒ^5χ3 660

700 710 720

670

-.|·-Ι-Ι-Ι-Ι-Ι-Ι-Ι-Ι-|-|-|___________________ sojAATi H^Owg^AijGíi^iE^^^S^E^^EES CAlBrt^lCBgpaiCHÜECÍjASg488 caHEücü^

SQJA-Milhoffi!^io^CUCÍB{ffiB^eMeflTFAfc!AfcLEEl

MeyAl3T~rÍÍÍAgjAÍECA0GEl^niG^200 ___

SOJA-Soja ^SEníi^0Ecg^ __

Consensos ^^^X)O<S^S^>ÍiZ^XbMKtMrie^XElCBXflxLVAVAWcfiyAl XXjgxgjxQfi^X^XQXlgg 720

730 740 750 760 770 780

-.1....1-.1-.1.-.1 ·_ · · '

SOJA_AT1 CK«X^Clgíiai7ggi w^eicyAWewBSÍBigiTE^g o/-\ ΙΑ ΑΤΟ

OUvn__n I Z. I

SOJA-Milho GgafflfigAH

EgTifegffls§AESÍEcS

SOJA-Soja TjayjWMlS

I-I I IX I J. ..i__

Sca>íaiT^CM8GCT»AftlBBBÍ«^V^C>lC^!

₅₄₈ _____________ !GCTiArAMiir«irAU>icBCT

548 _______ τΗϊο^ϊοΓίΑ^ήχοΐΑΒΕΙ

3ic0QiGQA0ggjAEQ

780

260

322

Consensos xxwcruwxBIsxikI

810 xggxCTixCTixxxxCTraSixSKcBB

820 830 840

iTGATGACQATATACCCgGT ÈEZEKGaicTATCTETGGG] ItgatgacQatatacccEgi

EgHHEnfflETATci^TGGG] tgatgacBÃtatacccC ^•IFJBcfflMCTATCTHTGGG tgatgacBEjBtaBccBg· _______ pBfflgBffi^TATCTgiTGGGl gAgGTTT^W 1 ^CTgl^TGAiTGATGAcEEWAEccEEgTwrEMMlBMBMiMB^M

UCTfl 608_______ ______________ jCAÍiidiftíelBBiAÍidSifíirafr^eWeyj

ÜCTU 608

GflSiT^wiGiSATfiAGEgigracnaBI

CAflTGÍi 320 _____ ______

-T^çgmiGG-rtgi-TíIgiAnTtcirc^ ÜACII 840

850 860 870 880 890 900 .-1.-1 J k | | | .1 |. | |.-|___________________________________

SOJAAT1 [eyAMÍcíefÀXcfAX^aC^H^TOJGai 668

SOJAAT2 [<lÁtrcic7Àkà;xjftgC^3^«MGai 668

SOJA-Milho SyÀVfod«ÍT^WGI|pÀVÀWÀVJc^à^^^^flga TSBAggaB^yHBA^q^ABMij 380 sojA-soja_^u2gg^SÃfflEi]^ETEEHiE2SESASi^S2EH iragTdSlAWEA^e^^ElABi 900 ~~_________ __

ConsensosXSffiSgXySMjSplM^VÀWÁfAcÍ iiíA^^xgmggxECT xgExxxxHExBgíSxEExai 900

II

910 920 930 940 950 960

SOJA_AT1___________ ________________ πΰϋ·Μ·Μί«^Μ^ηΒ728

SOJA_AT2__________ ____________________

T^^gjgjggggjKTSjAE^iii^u^^^^ riGiiBraaraí<ifflrgcyÀiiS728

SOJA-Milho AgH

SOJA-Soja C

Consensos > xgfixgiixE | Λ a f*ΤΤΤΓΓ*ΓΈΊ/^δδΙϊΙδδγ* |GAGAAACTTGCTTcBTO8cT5AABTSTOC§n0A^M itttgttgtcgatggatcE^ímIMMMMMMIMM ^GAGAAEClgGC^cSTCEC7gAAglgTCCETrgAAEAA-| STEaGlgGAIT Γff 11 ΠΊι···Μ·|Μ·Μ·

970 980 990 1000 1010 1020

SOJA_AT2 »ígeiBBmÍÍTOBffisBwjEjB^W||íq| 788 _________

SOJA-Milho lí^elBBlTÍiiCEgWggW^GCffiCEilAGSl 500 ______

SOJA-Soja hícbklJMMfficB^S^SBGBSmEM^» 1020 ______

Consensos X^gXHSxB^^EX®?XÍwXky,ílíct*!Xiroxl!ilíeiíilíciflXΙ1]χΗϊχ0^®20χχ@χΒι>ΟΓι°²θ

1030 1040 1050 1060 1070 1080

..·1.·4··4·4····Ι····Ι·4·.Ί····Ι····Ι····Ι····Ι__

SOJAAT1

MCfÜíefJÀTilfÍájGgSG[c>jj&rioig 848 ______

SOJAAT2 TWB^cyJlÍMGMí^B^TeT^enag^G^OTge^

MefiMíefÀ^BÍ^G^GlãBigiBÍe?«> 848 ______

SOJA-Milho A^CI^^C^Aigfa^lWAXCl^eiíCI^GCAVÀlícyjS ^^^6ΗΡ®™τΗβ0Π4®Έ6Τ2~___

SOJA-Soja Cfflmjn^^EMlJAEÍÍEA^SES2EAG0C@2-r^ G@EESfiSjT®tSESSS31080________

Consensos XlSlXiCTroB^^xnHX^lÉWJX[fAtcÍÍCÍXEjXXX0x5^xB^

X®XfflxS|X>®>®!HÍ® 1080

1090 1100 1110 1120 1130 1140 l-.l | | I | | |„ ,|...J | |__ ^BC^XgMlJffi^^TlíCiefÁTÁVAtfflG^lWÀlC^giACAllÈ@ASjT®AHj908 soja_ati irJHÍ*jGÍFlCAiíl[Cl»íAajT&S?AS____ soja_at2 E^c^^í^^^2iíE^E®üg^®c0HíacairJHÍIGiílCA

SOJA-Milho [

ETflSciijTG

SOJA-Soja

DgtgH®

Consensos xxgxüjxxO

0T

0TTGC0GTflCA0ATE ________ |ACAflGA0CTTGGACAETGGAAACTEAATCAÍÍAC~rBn88

1908

TGjjftg vrwÃiYYj| xxuxfflí

ÃS

SOJA-Milho GB.....

SOJA-Soja

SjgcSÉE

Consensos χ^8χΠΒΠχΕΓι

ÍGA^CcTcTCATCTET^G^^^^fa^MM

IctgatcWERÍgKISíIíMM····^^· fcSI^·

w

1210 1220 1230 1240 1250 1260

324

Ι-Ι-·Ι-Ι-Ι-·Ι

St^SfSAhxcjBiicSsAiHj^BEAjAlMÍClC^BÍ^^^Cg^g^ÀX^CAgl740 _______ ______ ^ClíjTMgG||IBteTiWj»G[»WI»I*jAlgyicfStfABtfdGCCAGCCnGT

UGTp |TgATCATSTT%C

ÇAGCC

1280

UAAU 1260 ______ ______ ι·ιχχ0χχχχ[«χά·ΜχΒίΐχχπχ^·Μ5χχXXÜ1260

1270

SOJA_AT1 ^¥KÀ^^X^GMkt^TffiCAtlnALtgHB>íettf«IHlC βτ®τ®η

SOJA_AT2 ncgüTSST

SOJA-Milho

DtSícEEca!

SOJA-Soja ®

QaSjcEÉc

Consensos ΓΛ jjxSjxEE

1290 1300 1310 1320 .TACCAC

CAAG lAACCbAATA^ACTgCAAÇAI^^^SAGCTTTGGCCTCAACCj

1330 1340 1350 1360 1370 1380

-·Ι·-Ι·. | .| j . I I 4,4-1--1--1_________________

SOJA. AT1 ll^g^íC^tf^THBtfgTGTgWg^ÉÉgricm nBSgAAAl^RailüfeTCBiAiaMlAai 1148_________

SOJA_AT2~fl^Cí^re^jM^TjÍÍÍ^TGTg^gHBíeiCCÍ^I nB^AAA^TBiTSsTaareftÍmABi 1148__

SO J A-M il hoJjEE®SE3^^ÍllSScAA^EcSÍ^AÍHEECCCTCSGMiCÍmAGBA^CBSTai 860 __

SOJA-Soja SfejQS*ySffifi^GG

T ClgG ATjjASsCGGBgGB®

Consensos

ΠΒΒχχχχχχχχΠχμβ

|TTTGCg^GAAGCTTGG0TATGCA-|

1420 1430 1440

1390 1400 1410

....1....1 .|···.|·. | |· | | .·|···.|.···|····|___

SOJAAT1^^gEg^0AgeSÍÍAÍE^AS^-r^

Tic^ tf·8Αί1Μ^»^^ΊΐΕ1Ι8Β_1208 __

SOJA_AT2 Bagffimgffl^WAX<y/W<ÍÉiAbÉ<t<mAEiÍ^AESI

T^aTAÍÍM^«WjAÍ^T|fl^ 1208 ____

SOJA-Milho jWJMft^^ü^^G^cyÀVÀWiiGgraTBgGfcilíCfiyÀlC03 qq^tf<l7liG[<ifcriEG^Aiiacm 920__

SOJA-Soja CÍÍGIft&UMWc^TflffiABJjMg-BEClgGTGCEG—- 1434

Consensos X^^XHÍllikTcieiJXtelJefí^XXnXFKxBBx^rcltTJxCT

325 gx

GAT gXXQx@XXXXXXXgXXXXXX 1440

1450 1460 1470 1480 1490 1500

SOJA_AT1 WfeTffijAgE

CAfiTtaEhtSGAGAEWkj^

SOJA_AT2 HÉâ®SS

CAfi-rfgBIltSGAGAE^m

SOJA-Milho MriÜUgCS!

ttBg@3aEattceE®gJ

SOJA-Soja ------------------Consensos xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx XXXXXXXXXXX 1500

|AGGCTfiCgAGCTSiTHi~rg^ArÀTcleiwiTSGCT588

1268 dffiçg^GrMcMiGBMgg

1434

1510

|.

SOJA_AT1 -----------------------------------------------------1275

SOJA_AT2 -----------------------------------------------------1275

SOJA-Milho GHTTAGTCGATCCTTGTATGAGGTTTACATATGGATTTTTCCCTGCCACATGCACA 1040

SOJA-Soja ------------------------------------------------------------1434

Consensos xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx

XXXXXXXXXXX 1560

1570 1580 1590 1600 1610 1620

SOJA_AT1 1275

SOJA_AT2 1275

SOJA-Milho CCGATTCAGTGCTTGGATGGTGAGGGTTTTGACATAGGAGTGTTGTCAAAGCTTTAGAGT 1100

SOJA-Soja 1434

Consensos xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx

XXXXXXXXXXX 1620

1630 1640 1650 1660 1670 1680

SOJA_AT1 1275

SOJA_AT2 1275

SOJA-Milho GCATCTTTCGGTCAGGTGCAACAGCCTTTCGGTCATTGAGACATATAAGCGAATTAGCTA 1160

SOJA-Soja 1434

Consensos xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx XXXXXXXXXXX 1680

1690 1700 1710 1720 1730 1740

S0JA_AT1 1275

S0JA_AT2 -----------1275

SOJA-Milho TTAAAAAAAACAGAACTGTTGCATCAAAAAAAAAAAAAAAAAAGAAACAAAAAAAAAAAA 1220

SOJA-Soja 1434

Consensos xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx XXXXXXXXXXX 1740

1750 1760 1770 1780 1790 1800

SOJA_AT1 1275

SOJA_AT2 1275

SOJA-MiIho AAAAAAAAAAAAG AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGTGCTCTGCGTTGTTACCACTGCTTG 1280

SOJA-Soja -------------------------------------------------1434

Consensos χχχχχχχχχχχχχχχχχχχχχχχχχχχχχχχχχχχχχχχχχχχχχχχχχ

XXXXXXXXXXX 1800

1810 1820

SOJA_AT1 1275

SOJA_AT2 1275

SOJA-Milho CCCTATAGTGATCGTATCAGA 1301

SOJA-Soja 1434

Consensos XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX 1821

Tabela 32. Análise de ClustalW de Ácidos Nucléicos SOJA f 1) SOJA_AT1 (SEQ ID NO:117)

2) SOJA_AT2 (SEQ ID NO:119)

3) SOJA-Milho (SEQ ID NO:121)

4) SOJA-Soja (SEQ ID NO: 123)

5) Consensos (SEQ ID NO:164)

20 30 40 50 60

....1-4 ....[....|·.·.|··-·Ι·-·-Ι-·4····Ι··-·Ι soja_ati________F[^w2^dOviyiWlaàÉ^yj|gi_fgBLT

SOJA_AT2 [^lBF[^WiqaMII\Mldàá^lgLl5gLT

ALKLPTLPKTLALKLPTLPKTLSOJA-Milho

VfESlHR

Consensos SOJA

ALKLPTLXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX

327

ΧΧΧΧΧΧΧΧΧ 60

120

I ___________________________________

EEJSESm^avlprlES

80 90

--1.-1. I I ^ ·| |···.|.

SOJAAT1 Yfli aWÍIja^llLM

DPldgMWaÉIsia^vlirTmH 120

SOJA_AT2 ^EjEB®LMgEA|HF[ElHaEMMSgAVLPRL0S

DPWiaiag>flsiaafevffirnTOaa 120

SOJA-Milho -----------------------------------TRBsAHMiimiACT^slEvE^ 24 ______

SOJA-Soja Hl^^lJaffi|7nB5TfllYiagh/lBaWja^KlsglDFMTIAEFNAawaiimizWCT 120

Consensos SOJA ___ ___ xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx@2@]xH|lxg WagMxMx 120

130 140 150 160 170 180

-l-l -I | | | l- l-l-l-l-l__ soja_ati jÉBÍda^is>iaTjiaslÊffMaglK*WlViMldldriBIIKrii13ia

180 _______________

SOJA_AT2 j|»iBariye>idyjiasíÊinddg|^ÍLWMldldriailKrii13Isg

LwceiaakVÀVÁ!TlR^K<e<gjB 180__

SOJA-Milho lii>iBaa^¥s>iavjiaAfaStaa^ia»iiàWLldldriydlKriiLB5Mini

HddkmjiiYfwaiBadas 84 _________ ___

SOJA-Soja LUBjEraciréciiayjiaA^MdglK^iPÍ^LEFlZCTiLfRgirSTSWli

HddWAyAlIMkwlfagsH 180

Consensos SOJA HifllãÜSMSiMgtf ________ ___ _____

BxasMajÍkMix^xíãxiáflBixiasxxBSxnxgiadkteiiixiroaxfcleiaiÍ iso

190 200 210 220 230 240

-l-l | β I L | | | |- | . J__________

SOJA-AT1 |<SiaitoABwlllèjWal^bmdaiMdldSiaà ÍdigSffipM

0ã3S3i^S3®E®aE24o_________________ sojaat2 Rnio^^iiwwaiabdWdaiFÀidiaaig^ÉsiidiSDW lddMI=iaWs^addMBaSii^240

SOJA-Milho RUiaWGHmlãVllAllL ^sojA'^s<j^a._

033@SÉE^^NY0ESSff24o __ ________

Consensos SQJAjg?IWB«x5xl^lxxxfJiilftHxB5xxÍKjaaaÍiaaiaB

SxExBSãSEHExsIxxiMlSSsiiE 240

MMTIYP Eiaplfnkftplp§gEl-|

VMMT lYPVLI APLFN KFTPLPDG g L^m --- — ^ffl^HMBGSTRSSHSNAYMYGFFKNI^^^^SS^^^^fl

IvaviahelghwklnhtüysfIIaEB^

BgggHaMDGSTRSSHSNAYMYGFFKNKRIVLYDTLIQQCKNEDEI-l IvaviahelghwklnhiBys εΟαΕΞ··^····ΙΙ····^·· rpTOJMiWBnGSTRSSHSNAYMYGFFKNKRIVLYDTLIQQC§NEDEI-|

328

204 ____________________ _____

SOJA-Soja

Consensos SOJA

S^xxxx^xBHMHEüEWEBxBFExEnõõ

310 320 330 340 350 360

.....Ι-·|····|····Ι····|·-|···.|····|····|··.·|····|·-|__________________________________ soja_ati jO|Agra^gaBs®EiEB3SEaSESElE!Il SSHHI2E3p®ggS™j^[36^_______________

SOJAAT2 [2ΙΠϊ5ΞΕϊΙ^Εκ®^ρθο_~ __ __

SO J A-M i I ho ^LgMítf^SgKl^Ggg^KDS!^4lgnni ispiHijnsiBnridgSRawH^ 264 ________________ sQJA-soja ^®τΠ1μ^ΗΗΕ2ΕΕαΗ!υ^332ΠΕΜϊΕΒΠ ia>iÍiMiauiQivisIãmi^ft»ags 360 _______

Consensos SOJA XExBX)^»1jcieVBIVi^xBxlCTxxg!3aSxxBIsIBxfiaWB

ÉxinixnSxBkxxSãxMBifaaSx 360 jLVKLQEENLSAMN370 380 390 400 410 420

....1....1 I I I I I J. I 11..1__________________________________ sojaAri__gwJJ2g5y|SEEEKDH2PTB5gESãIIl^M graSL^Vfl^ÍkkBWH^RBIDGEE 420 __________ sojA_Ã^_fflj®SS®SEEKDHSPABH3ESsEI^H [^KngLLg^lÍJSsiaaMSalR^IDGElg 420 sojA-Milho BaaaaHSKN

jpoggAAj llÍjgW^V^VjgbVdsladMdaiQgLEDSg 324 __________ sojA-soja BaaHSGEKEB0sGB3GG[HaESaEB S3ÉJHS3CSC—---------------400 ___ __________

Consensos SOJA BS S^xl^xxBaTOxxMSxxIMaWddglIgyAlfflxQgXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX 420

430

400

SOJA_AT1 KJTD-------------------SOJA_AT2 kBtD-------------------SOJA-Milho DÈKEDSILVGLHMC

FRVHLSVRCNSLSVIETYKRISY 384

SOJA-Soja ---------------------------Consensos SOJA xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx

XXXXXXXXX 480

SOJA_AT1 SOJA_AT2 SOJA-Milho

CPIVIVS-----------------------------------------------------------------424

------------------------------------------------------------424

KKQNCCIKKKKKKETKKKKKKKKKKKKKKKVLCWTTA—- 429

329

SOJA-Soja ------------------------------------------------------------400

Consensos SOJA xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx — 525

550 560 570 580 590 600

SOJA_AT1 424

SOJA_AT2 424

SOJA-Milho 429

SOJA-Soja 400

Consensos SOJA --------------------------------------------------525

610 620 630 640 650 660

SOJAAT1 424

SOJA_AT2 424

SOJA-Milho 429

SOJA-Soja 400

Consensos SOJA 525

670 680 690 700 710 720

SOJA_AT1 424

SOJAAT2 424

SOJA-Milho 429

SOJA-Soja —400

Consensos SOJA 525

730 740 750 760 770 780

SOJA_AT1 424

SOJA-AT2 424

SOJA-Milho 429

SOJA-Soja 400

Consensos SOJA 525

790 800 810 820 830 840

SOJA_AT1 SOJAAT2 SOJA-Milho SOJA-Soja

------------------------------------------------------------424

------------------------------------------------------------424

------------------------------------------------------------400

Consensos SOJA

525

850 860 870 880 890 900

SOJA_AT1 SOJA_AT2

424

424

SOJA-Soja Consensos SOJA

400 — 525

910 920 930 940 950960

SOJA_AT1 424

SOJA_AT2 424

SOJA-Milho 429

SOJA-Soja 400

Consensos SOJA ----------------------------------------------------------- 525

970 980 990 1000 10101020

SOJA_AT1 424

SOJA_AT2 424

SOJA-Milho 429

SOJA-Soja 400

Consensos SOJA 525

1030 1040 1050 1060 10701080

SOJA_AT1 424

SOJA_AT2 424

SOJA-Milho 429

SOJA-Soja 400

Consensos SOJA 525

1090 1100 1110 1120 11301140

SOJA_AT1 424

SOJA_AT2 424

SOJA-Milho 429

SOJA-Soja 400

Consensos SOJA 525

1150 1160 1170 1180 11901200

SOJA_AT1 424

SOJA_AT2 424

SOJA-Milho 429

SOJA-Soja 400

Consensos SOJA 525

1210 1220 1230 1240 12501260

SOJA_AT1 SOJA_AT2 SOJA-Milho

-424

-424

-429

331

SOJA-Soja Consensos SOJA

1270 1280 1290 1300 13101320

SOJA_AT1 424

SOJA_AT2 424

SOJA-Milho 429

SOJA-Soja 400

Consensos SOJA 525

1330 1340 1350 1360 13701380

SOJA_AT1 ------------------------------------------------------------424

SOJA_AT2 ------------------------------------------------------------424

SOJA-Milho ---------------------------------------------- 429

SOJA-Soja ------------------------------------------------------------400

Consensos SOJA ------------------------------------------------------------525

Tabela 33. Análise ClustalW de ácidos nucléicos genéricos

1) afc1 (SEQ ID NO:124) 2) AT4gO132O (SEQ ID NO:126) 3) AF007269 (SEQ ID NO:128) 4) Consensos (SEQ ID NO:165)
10 20 30 40	50 II	60
afc1 ------------------------------------------		---------1
AT4g01320 ------------------------------------		--------------1

AF007269 ATGGCGATTCCTTTCATGGAAACCGTCGTGGGTAAGC₄ TTCAAAACCTTTTTCTGAGACAT 60 « Consensos xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx XXXXXXXXX60

80 90 100 110120 afc1 1

AT4g01320 1

AF007269 TTTACTATCCTGTTTCACTCATCGTATTTCGTTTTTGTTTGGGTTTTGCTTTCTGTGTTG 120

Consensos

XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX

XXXXXXXXX120

130 140 150 160 170 180 afc1 ------------------------------------------------------------1

332

AT4g01320 -------------------------------------------------------—- 1

AF007269 TGTGTGTTGAGATTCCATGACTCGTTTGTTTCATATACCA-

TCGTCTCTGCTTCTCGTTTC 180

Consensos xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx

XXXXXXXXX 180

190 200 210 220 230240

-^k afc1 1

AT4g01320 1

AF007269 TAAATTTTGTTCTTTTCTAATAGTGCGTACCTTGATCTGAGGTTTTATTACTCCTACTAG 240

Consensos xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx

XXXXXXXXX 240

250 260 270 280 290300 afc1 1

AT4g01320 -------------------------------------------------1

AF007269 TTTCTTGTCTTACTCGTGCGTTTGATTTGATTTGAGCTTATGTGATTTCATCATCTCTTC 300

Consensos xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx

XXXXXXXXX 300

310 320 330 340 350360 áfc1 1

AT4g01320 1

AF007269 CTCGGTTTTAGAATGTACGGAGCTTCTCTGTTAACCAAAATCTAGGATTTGGGAAGAAAA 360

Consensos xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx

XXXXXXXXX 360

370 380 390 400 410420 afc1 1

AT4g01320 1

AF007269 GTCGGAGTCTTTTTTTTCCTCATTCCCGATTGGAAATTGAGAATCTTGAAATTTTTCTTT 420

Consensos xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx

XXXXXXXXX 420

430 440 450 460 470 480

333 afc1 -------------------------------------—--------------------1

AT4g01320 ------------------------------------------------------------1

AF007269 GTTCAAGTCATACAGCTTGAGGTTTTGGGTTTTCTTGTCAGGGTATTATTATGTTCGTGA 480

Consensos

XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX XXXXXXXXX 480

490 500 510 520 530540 afc1 --------------------------------------------------------— 1

AT4gO132O 1

AF007269 CTGCAACTAGAGTTTTCTGGAGTTTTTTGAA

TGGGTTTTGTGTTGTGGAACCGTATGTG 540

Consensos xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx

XXXXXXXXX 540

550 560 570 580 590600 afc1 1

AT4g01320 1

AF007269 AATGTTGCATCAAAACTCTTTCAGTGCTCCAATGTTTCCATCAGTAGTCAGCACAAGAGA 600

Consensos xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx

XXXXXXXXX 600

610 620 630 640 650660 afc1 1

AT4gO132O -------------------------------------------------1

AF007269 TCTTTTTATATCTGGTTGATCAAAAAAGTAGATGATGTTATTGAATTTTCAGTGATGGAG 660

Consensos xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx

XXXXXXXXX 660

670 680 690 700 710 720 afc1 ^^^^^^^^ATGGCGATTCCTlTTCATGGAAACCG

AT4g01320

ATGGCGATTCC

TTCATGGAAACCG

AF007269 TATCTGTTGTTGTGGCATTTAGAGTAGATTCGlHjTTgATCnTgjGlfljTEfiTCTTTTTC 720

Consensos XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXHjXXgXXXÜxSjXXfijxEÍXXXXXXXX 720

334

730 740 750 760 770 780

0-1- J afc1 ΞΞΞΰ AT4gO132O ssssr AF007269

___________________JjEEüSSHEESiiliE^ES

Consensos QXXXXS^lMBM^^yATtiícf^íclÍÍWÁ^BlBBÍcUC^l

790 800 810 820 830 840 afc1

CTGCTCTCAAGCTTCCAACTCTCCCGAAAACCTTGGTTGGTGTAATTAοοοααοαοαα6ίϊΕ9^^Μ·Ι^^^^·Ι^^^·^Μ^·

AT4g01320

CTGCTCTCAAGCTTCCAACTCTCCCGAAAACCTTGGTTGGTGTAATTA-i οοοααοαοααο-γΉ^^Μ·1^^Μ·^^·^·ΜΙ

AF007269

CTGCTCTCAAGCTTCCAACTCTCCCGAAAACCTTGGTTGGTGTAATTA-I gccaagagaagtEEM^^MM^^^^MMMI^M^^^MÍ

Consensos

CTGCTCTCAAGCTTCCAACTCTCCCGAAAACCTTGGTTGGTGTAATTA-I gccaagagaagtESSHI^^^MÍ^^^^^MH^·^^^^·

850 860 870 880 890 900

...J,. | | | | | | | | | | | afc1 -------------------------AT4gO1 320 |ΪΞ^ΕΕπ^®3§®|^^ΕΟ—--------------------'¹⁶⁸ _______________________ afoo7269 HES@£EE!E^^^SES^EtcttgacaaaaGGTTTCGTCITGATCATATrrATATCA 900

Consensos UUi^SSÍESlãSfiÊESíSjES

SSEXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX 900

167

910 920 930 940 950 960 afc1 ------------------------------------------TCÍEG0C0AE—^SE182

AT4g01320 ----------------------------------------_

AF007269 TTTTAGTTTTTTATAATTGCCAGGG^Ít\WA^aB^ g^gn^HEESíESE 96o

Consensos xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxffixBxBx ExxxEEHE 960

970 980 990 1000 1010 1020

335 afc1 Íligíg^WMÍc^íefÀVÍcfJciaBíclfJÀWí^íJHBf^íelcfJHíeg

AT4g01320 || IMKffiMl

AF007269 j

263

Consensos	TTTTCACTTTG'	rTCATGAGTTTGTAACTATACTTATGGAC-
ITCTGCAATT	TTGTTCTTTGG	1020

1030 1040 1050 1060 1070 1080 ••·Ι-·|·-Ι····Ι····Ι····Ι-·Ι····Ι····Ι·-Ι·-Ι····Ι afci -----------------AT4g01320 ------------------285 ___________________________

AF007269 [cf^íHBtd^HBÍcl^BBBíeie7ÀTAWGTACATATCTGGTTTCGGTATACAGTATCTCATTTTGA 1080

264

Consensos xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx

XXXXXXXXXX 1080

GATCTTGCCTTGGTTTTGGAAG

1090 1100 1110 1120 1130 1140

AF007269 ATATAGAGTTGTTACATTACAATTGTAAAGTTTTCATTTTTACCTTAGaídrHíeWkW<Í11140

Consensos

XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXgj [ΑύΗΦ&ΜΒΪ 1140

1150 1160 1170 1180 1190 1200

IttWJtWBIIHmiBIIÍt 336

AT4g0l320 ^RwiMaifetmeieieiMMBwaremeMefcTjíé^ irÁXHÍ<leyÀir^HP||g|gaHQMJÍfi357

AF007269 BmWggeBMaSR afc1

AW ·Μ·ΤΑΤ£7ATMATAV «efr*’

|TGCATACTCTTTCATTCTTGrog	0
rajSgg|GTTTTACCGAGGT1	rGGGCCTTGATCCAGAGAATGAAAJ
ITACTGCATACTCTTTCATTCTTG	11200

1210 1220 1230 1240 1250 1260

CCTTCATATAGTCCTATACG 1260

336

Consensos ΜΗítfeiÍHBÍA1ÍcTàWAÍdcíwaB

SETeXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX1260

1270 1280 1290 1300 13101320 afc1 360

AT4gO132O 381

AF007269 TTTAGCATCAAAATATCTATTTTCTTAAGATAATAATATTTCTTTTATATTCTGATGCAG 1320

Consensos xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx

ΧΧΧΧΧΧΧΧΧ 1320

1330 1340 1350 1360 13701380

441________________

1380

1380 afc1 u&mfiíS AT4g01320 & btfcSjãig

AF007269 ΕΞΞΞΞ

Consensos

afc1 fifijfijíjjjj------426

AT4gO132O 447

AF007269 MWgTATGTCGTATTTCCAACACTACCTTGTGACTTACGTTTTTTTATCAGAGATGT 1440

Consensos 023

SEEXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX XXXXXXXX1440

Rgj^^^^^^^^^^MÇAAAÇAATATGGATGTTCATTAGGGACA [cAAACAATATOGA^^TOAnAGGGACA^^^^^^^^^^^^M baii«r^»w»CTBrAVA^iBrcÍHBmFAiiyAiãwirq«^^EcAAACAATA-| [tggatgttcattagggacaIe^mBMMMBMBMMÍÍM^^MI iTGGATGTTCATTAGGGACAjESj^^^^^^^^^Mi^M^M

1510 1520 1530 1540 1550 1560 •-Ι-·Ι····Ι····Ι-·Ι·-Ι-·Ι.....Ι····|····|····|.··.|______________________________________

MAliraflqSlSB^^Tl 514

337

AT4gO1320 ί«ί1ή!ΗήΜ<!·?^ΐ·8

535

Consensos ÍÍftll^^^^ftjÀXfA^BÍ^^líHíHÍOÍfÁirATil^AtcftKtfi^trf κ^ι·μ·ι<Ηϊ4^Λγλι··ι 156Õ

1570 1580 1590 1600 1610 1620

I | | ,| | |.·.·|...·|..·.1....|....|...·| afc1 ícagjgíjggg------------------------------------------------525

AT4g0132Ojg0rogJH»Jfi-------------------------------------------------546

AF007269 iBSaiSSSs^SGTTTGATGATTCTGGATTCATCTTATTTC-

TGAGTTTTTCACATGGATGA 1620

Consensos lífil xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx

TAGTCCAG

XXXXXXX 1620

1630 1640 1650 1660 1670 1680 afc1 ------------------------------------------------------------525

AT4gO132O ------------------------------------------------------------546

AF007269 CTATTCTCCATTGAGTGTGAGCTTCAAAGTTTTTAGTTTTCGTGTTAAAAATTTAAAATT 1680

Consensos xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx

XXXXXXXXX 1680 afc1 ----------------------------------549

AT4gO132O --------------------------------— ^▼AxgcTAXgqMwrAiwíci^iw 570 ___

AF007269 TGCTTCTCTGAGCATGAAGTTTCTATCTTTTTCCAG^I 1740 ____

Consensos XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXE^

MC7ÀltfC«»MÍFAlíHBÍClifo^W·! 1740

1750 1760 1770 1780 1790 1800 afci É lÈHàtíí 609__________________________

630

3ΒΒ^ΞιϊΞΞ3ΞΞΞΕΞΕΞΞ3

1800

3ϊΞ3ΞΠΖ3ΰ^ΞΞΞ^^Ξ3

1800

AF007269

Consensos

ÍÊHSZSZ5£

- 639 ____________________________________

AT4go 1320 -----------------------------660 ______

AF007269 E5E^2^^EHÍ^^S2E0ÍÍ^®EãÍGTGTGTATTTCTGTCATGGCCATW%CAA 1860 ___

Consensos

MBÍ^XHÍIHIXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX 1860 afc1 ------------------------------------------------------------₆39

AT4g01320 ------------------------------------------------------------660

AF007269 TTCACTGCTTGTTTGCATATGTTGTTACCAGACAATATAATCTCCCGCTTTTTTATGGCT 1920

Consensos xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx

XXXXXXXXX 1920 afd nSMBSl 695

AT4gO132O _____________________

MSMÍSSi 716 ..... —— — — —

FJjiIiW&WAKreCTTCCAGATC	IGAGACCTCCGGGAGAAGATTGA-
GAAACTTGCTTCTTCTCTAAAG

j 1980

Consensos X

1990 2000 2010 2020 2030 2040

-·Ι····Ι-·Ι·-Ι····Ι····Ι·-Ι····Ι-·Ι-·Ι·-Ι·-Ι____________________________

751

AT4gO1320 tfe!A tfèTA tf

772

AF007269 Éètf »tf tfe^tfc^tf /aWaVàI [CIQÍ«yAlCM^^g^RETGAG 2040

Consensos fetf íd íd tf íOTàI tfefil ÍH

XXXX 2040 afc1 AT4gO132O

751

772

CATTAGAAGCTTACGTATCT 2100

Consensos xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx

XXXXXXXXX 2100 afc1 ---------------Ηϊ2Ε5ϊ3Εϋ^3ϊϊΞϋΕΕΞ22Ξ22Ε^^^ϊΞϊΕ0ϊΞϊ 795

AT4g01320 ------------------------------------------

CTTACATGTATGGTTTCTTTAAGAZ	<CAAAAGGATTGTTCTTTA	11816
AF007269 TGTTACATCATÃCÃGG	CTTACATGTATGGTTTCTI	TAAGAA-I

ICAAAAGGATTGTTCTTTATEEi^^^^^^^^^^^^^^^MI

EEEEESE^^^^Smí^çttãcãtgtãtggtttctttaagaa^ IcaaaaggattgttctttatHEmM^B

2170 2180 2190 2200 2210 2220

813

834

AF007269

GATACGTTGATTCAGCAG

GTACTGTGACTCTTGATGCGATACGTTGATTCATTCAAACGAGCTATACTCACATT 2220

Consensos I xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx 2220

GCAG

2230 2240 2250 2260 2270 2280 afc1 -------------------------------------------4^S2^gggJgg3g829

AT4g01320 -------------------------------------------4feWAVAU^ICEW«h>rC 850

AF007269 TCTGTTTCTGGTTCTGAAACATAACATAATCTTCTATTGTGCAGIÍCi«yÀXeyAyAlí«Xge7Alrf 2280

Consensos _______

XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXiifcWJMM

2280 ^^^RaattgtggcggttattgcacacS^^^SS^^SS^

FtgaatcacactacatactIsESH^^^^^HHBIMM^HI^HHI^^^HÉ

LiEpMkwJAAATTGTGGCGGTTATTGC	DACACGAGCTTGGA-
CATTGGAAACTGAATCACACTACATAC' HEjEESIaaattgtggcggttattgc CATTGGAAACTGAATCACACTACATAC'	ACACGAGCTTGGA-I γΕ£Ξ!^····Ι
g3JS35Sj3AAATTGTGGCGGTTATTG( CATTGGAAACTGAATCACACTACATAC'	DACACGAGCTTGGA

I I

2350 2360 2370 2380 2390 2400

340

I I I I ·Ι μ Ι· I 1....1....1....1 afc1 MQÉÍ«lBtçim£ÍiIftM------------------------------------------AT4g0i 320 ffijmgggSSJgjnsgE------------------------------------AF007269 MSH^ilB^Sm^GTGAGGCTCAACCGACAGTTCAAAAACTTACTCACATCTACAT2400

Consensos

ΕΠΕ®<ΧΧΧΧΧΧΧΧΧΧΧΧΧΧΧΧΧΧΧΧΧΧΧΧΧΧΧΧΧΧΧΧΧΧΧΧΧΧΧΧΧΧ 2400

906 -----927

2470 2480 2490 2500 2510 2520

XT^oí^2MuSMEg^^g^facicyÁirÀWÀfaíHBíeiáw!AefiyAVAXWig8 AFoo7269j|SSgM0gffl§ÈE^SE®SHiEiE^0®^SS ÍÍC7A1ÍH WR^g^Siiíg 2520

Consensos hXde^iriWJtHíWíttrfATefÍ^TjHíeg (•EXHÍCftlíH 2520

BS^MgGATTT GATACACAGCCT GTT CTCATTGGTTT GAT CÁ-^M ItatttcagS^MMMMIMMM LWP!iIkWiÍGGATTTGATACACAGCCTGTTCTCATTGGTTTGATCA-| iTATrrCAGg^ggKTOn^JJEJUE·^^··· MdJà^jGGATTTGATACACAGCCTGTTCTCATTGGTTTGATCA-|

WiffPBBgabGAI I IbArACACAGCCTGTTCTCATTGGTTTGATCA-l lTATTTCAGg»ioi»x»x»xiIiI4»!4^;!i^MI^M^—

2590 2600 2610 2620 26302640 afc1 1020

AT4g01320 1041

AF007269 CTTTTGACACTAATCTAATGAATCAAGGATGGATTAAGAAAAAAAAACTCTAAACCTTTG 2640

Consensos xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx

341

ΧΧΧΧΧΧΧΧΧ 2640

2670 2680 2690 2700 afc! -------------------------1053

AT4gO132O ——--------——-----------------1074______________

AF007269 GTTATATCTCCTGTCTGATTATCACAGBEt<EtèhíAÍ3»hfjM 2700 ________________

Consensos XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX^WàT^Í^FàVAVJ·!

2700 afc1

2710 2720 2730 2740 2750 2760

- 1093___________________________________________________

AT4g01320

----------------— nu______________________ AF007269 tagTACCATCTTACAATCCCTCA 2760_________________

Consensos b ί BídcUfafegyAcriÍ«M B ítTclfecfAcieíet BícfiTet ftftB EHBXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX 2760 _afc1 ------------------------------------------------------------1093

AT4g01320 ------------------------------------------------------------1114

AF007269 AGATCCAACCATAGTTTCTTTATTGCAATGGCAGCCTCATCTACTAATCTGAGTTAACGT 2820

Consensos xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx

ΧΧΧΧΧΧΧΧΧ 2820 afc1

CTGATGCTTTTG	Eq	GTGAAGCTTGGCTATGCAAAAGATCTTCGTCCTG
1141 AT4g01320 -------
CTGATGCTTTTGCTGTGAAGCTTGGCTATGCAAAAGATCTTCGTCCTG

1162 _____________________________________

AFOO7269TCCTTnOCAGGSE2Í^UÍESS^^Sll^0

2880__

Consensos ΧΧΧΧΧΧΧΧΧΧΧΧ5Π^7<Ε?·7···Ϊ^Χ^Πο!Λ!^·^Μ^ή1 irct«yj^C^líHBMCltrfgia 2880

afc1	CTCTAGTGAAACTACAGG	|------------------------------------------1159
AT4g013	S1CTCTAGTGAAACTAC/	XGGTCAGAGAAGATAACAACAGAA-
CACAAA	OTGTTACCTCAATTTWEEE	>

.....

Consensos MÍHÍJC1 tefiTiTJHFaI ^^XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX 2940

afc1 —------------------------------------1177

Ai^goi32osrajgggggggraEEi^^uuH5Hi^®H5E^

MCfAlücfexef^Smgn^g·^ 1282

AF007269 Í?ê?av...»te.deWett»nê!ga itttMMrawi____J

Consensos _________

XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX^cWcE&W

3000

3010 3020 3030 3040 3050 3060 ·Ι-·Ι·-Ι-·Ι·-Ι-Ι-·Ι-·Ι-·Ι· · .|...·|·...|_______________________________________ afci_ijgJ[^^E0^SiEc^u^^HiE5ESS^ü^®íES

AT4g01320 ií«!rii«!gr __

JgOTgjSegjESiExEHEEBSiEnfflSESE3!0

3070 3080 3090

--1--1--1---1-1--1-1-. ________________

AT4goi 320 ii^®g3®B®jE®gffi@33JagHaa®SSSiEE

1380 __________________________________________________ afoo7269 HE§H§Eg0BESB§EES2sSffiH§®SBSã3iH!

³⁰⁹⁸ __________________________________

Consensos

3098

Tabela 34. Análise de ClustalW de aminoácidos genéricos

1) afc1 (SEQ ID NO:125)

2) AT4gO132O (SEQ ID NO:127)

3) AF007269 (SEQ ID NO: 129)

4) Consensos (SEQ ID NO:166)

20 30 40 50 60 afc1

MAIPFMETVVGFMIVMYIFETYLDLRQLTALKLPTLPKTL343

VGVISQEKFEKSRA	ÜS-LD58
AT4g01320	MAIPFMETWGFMIVMYIFETYLDLRQLTALKLPTLPKTÜ
VGVISQEKFEKSRA	SRDIIT 60

AF007269 kVAiiaj^i^íUvcia^lkVLU^IdàrAÍjBiWi^iai^daggíl

---------------41 ____________________ consensos Pubii QOíSSIãüS^ãiSIiSZEiSãiilsQ^SQaQSSSiS

H3ÜXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX 60

afc1

T—- 42

AF007269

Consensos Publi xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxgxxxxxxxxxxxx

XXXXXXXXXX 120

130 140 150 160 170 180

AT4goi 320 waaaMaÍàairfs!g|gTadSlK»ÍÉ WJ JsJrt kiÜKdiaBs^iTOddkT/ÀUiiai 180 iriÍa^^i^i^r^tadgk<*WOiidkiriMiiKciiaasffl'|ggddkVAUn3l93

Consensos Publi xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx

XXXXXXXXX 180 'Λ >w

ES^^Mvqkggpylaiylwafmfilslvmmtiypvliaplfnkftplpd-|
|00ΪΡΕΚΙΕΚί_Α88[_ΚΡΡ|^Μ·^···^······Μ·Ι
AT4g01320	|VQKGGPX	KLAIYLWAFMFILSLVMMTIYPVLIAPLFNKFTPL-
PDGDLREKIEKl	-ASSLKFP	1240 ______________________________________________
AF007269	7QKGGPY	LAIYLWAFMFILSLVMMTIYPVLIAPLFNKFTPL-I
IPDGDLREKIEKI	.ASSLKFP	153

Consensos Publi xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx

XXXXXXXXX 240

250 260 270 280 290 300 •-Ι-·Ι-·Ι····Ι····Ι-·Ι·-Ι·-Ι·-Ι-·Ι·-Ι·-Ι______________________________ iBldkVAyjrAlÍlaRMawBi 293

AT4goi32o η5Ββ2ΟΕΣ§^ϊ^^3ΚΞϊΞ3ΖΪ5Ξ33Η2Ι22ϊ3Κ5ΕΠΜΕ

344

M®

Consensos Publi

213 xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx

XXXXXXXXX 300

310 320 330 340 350 360

235

Consensos Publi xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxHxExxxxxxxxxxxxxxxxxxxxl xxEBxExxxxxJEgxx 360

370 380 390 400 410 420 afc1 lnlvsrafefqadafavklgyakdlrpalvklq^^^^^H

--------386

AT4goi32o HES!EE0332EEHSS2E332SI3EB52!SD3ã3n laidàffiVTSICVTHLNGFFVGIL 420_______________________________

AF007269 BSBE^3®SEHS52EE!S3EiEEÍ2Effl333IID ami----------------278

Consensos Publi

XXXXXXEExxxxxxxxxxxxxxxxHxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx

XXXXXXGXX 420

430 440 450 460 470 480

--------------------459

AF007269 -HaH^aEHgis^iaEiSaHsas^ESasESE

------------------316 _____________________________

Consensos Publi XXXXI*sWilEÍÍ»iatf^AVdEW8i«iaaWTJsiaÍ£<fl|g wawaaiBj---------------------480

Tabela 35. Análise ClustalW de ácidos nucléicos PPI

1) PPI-AtCPP (SEQ ID NO:97)

2) PPI-BnCPP (SEQ ID ΝΟ.Ί09)

3) PPI-SojaCPP (SEQ ID NO.112)

4) Consensos (SEQ ID NO:167)

345

laaaiffliMATGGCGATTCC l l I CATGGAAACCGTCGTEGGTΤΤΊ ATGA-| ItagtgatgtacatttttgagEM—· d d IsWiUATGGCGATTCCTTTCATGGAAACCGTCGTflGGTTTTA^M ItgatagtgatgtacEtttttgagEMMMMMMMMMMMI^M [TGA^^ATGTACATTTTTGAÍ^Íel “ AgCCGT|]GTgGG^TTTA ^Ujlt4.?4ÍATGGCGgTTCCBTS iTGATAETgATGTACETTTTTGASK»]

ICATGGAA gCCGTgGTgGG gTTTA110 120

IB^WSMacgtatttggatctgaggcaÃcEÃctoctctcÃÃg^B |TTCc0ACTCTCCCgAA0AcETTGlElMÍMlMiMi d d B :ffi<IdJlACGTATTTGGATCTGAGGCAACATACTGCTCTCAAGC-B IttccEactctcccaaagactttgIEMHíIHMIHí^·· ddS^R>jdjACÍÍTAETTGGAlETGEGBcAACATA^§GcBcTCAA5c-| iTTCCBACTCTBCCAAAGACTTlEfclCT '

130 140 150 160 170 180

|. | | l·. ________________________________________________________

PPI-AtCPP ^aíE^_

PPI-BnCPP ^ií^AgBCaiiàTct»í*^TeyÀTcf^cbBB^cL!cyÀy^^WcIi.l ^pp!'^SoiaCPP'

Consensos EXX^SX^lXaSjxflÃ^fÁVÀTCfÁX^^XilÍrcfiX^yÀ^WXXtcyÁl 0gxiEx03Hn®<E®g® 180 u>

^^^BBnATTTTCACTTTGTTCATGAG^^^^^^^^^^M [tggactctgcaattttgttctt4E———^M ddB=?ff»ld JcattttcactttgttcatgagtttgiBactatactta^^M ΠΌ0Α0τ0τ00ΕΑΤΊΕΤ6ΤΤ0ΤΤΊ@Β·······||·1Μ·^Η ICAEnScAiiTTTGTTCAEGAGTTTGigACBATAEl^AÍM |gactct0caattttgtSctttEEMMBM^^MBBWMMBI -..... ~!^^TTE^CASi^TTG^TTcAg^GAGTTTGTEAcEATAaTaA-^M

SgÃÇTC^CSATWGTSCTTTBB··········^·

PPI-SojaCPP toawmift---Consensos X0XyJ xxtefjHídixSxMi:

z·/

250 260 270 280 290 300

346 iigici/^g^tfgW^Agtfe^S 300_______

PPI-SojaCPP B^GnAiBírf^CM&qjiÍtfcfeteTefjACT iggAggEB gA|lllJAjjGA®E^ TÍEaBÍ 300 ____

Consensos Xltf^ÍBBÍtfefiifelS

HjxjjxxEx0xx ES 3oo

KxxiTOxBgxExxx310 320 330 340

-·Ι-·Ι-·Ι-·Ι-·Ι·-|-·|·-|·-|-·|····|····|_______________________________

PPI-AtCPP

360

PPI-BnCPP tfAltf·7Ε?£!·8 _ _

PPI-SojaCPP GBimc^Ví^hirÁtf gg^/À^CHFlGScmgiiABgA^GHjGSEjTlj^ _

Consensos xSxMflg^Sra^3ajxh||rf0yA><E!SxhfràixBxbBtf iiixBgxBBxxnx^íewxXilegWÁWiiffi 360

350 360

PPI-AtCPP	ATCACTGATTTG	CCATTTTCTTTGTACTCAACTTTCGTGA-
ITCGAGTCTC	X3GCATGGGTTC	420

ppi-Bncpp afifflaeg*iiBfyg«.MBÉBtfÉBtfíttftfÀVÀtfÉBtfdiícyÀi btfcyAtftftfgH«jjeMaBa420

PPI-SojaCPP^jASSÃ^^BBÍetygjClB^BgSlClíeiriXHÍfÁTiTeg blilT^tfSSÍTlã^gGEC^laa^^TíijT 420 ___

Consensos jfljXES g4££míd^xiiiiiaxi^Wtf?d^iiixBüB3 nxg^gxSxG&^tfrixraix 420

430 440 450 460 470 480

....1....1. J J J J. J . | | | | J_________________________________________

PPI-AtCPP ι tfÀVAVArieyÀ^cagffiHmmraffi4go PPI-BnCPPE^^^flfl^^gfljklígg^tf tfJW^gegyÀWAtfÀl _____“ PPI-SojaCPP^TWGSgjWffCGCTgagiílAEgggliig^gcyaS^gaGíji^0ES^Z253Í^WÍUflEu^ 480 __ ___________

Consensos ^xj^^y^^BXXCTEExflxbàí^XÍà/i.tggrihtfLlltfXnxtetgc^xxxitfmxim mix 480

IP

490 500 510 520 530 540

PPI-AtCPP to/ÁV^uAaggggÁW«lcCTiMSC!^MgGEnACTiiiíicCTi^ Sic^_____

PPI-BnCPP ^^CjECg^SjriHÉÍllCHÍigfiCgC^i-r^Btf ITCTCT

Sjt^____

PPI-SojaCPP agAÍBíetejWeLwHnMBgcrGBgR!g^lC^iTcgÍACT^ ESASíJêEEHggBçiSigS

Pnnconcne

Süx

ÇAGAAAGGAGGTCC

540 ____ xCTixgSixBgxBSxCTixCTiixfixCTCT

347

550 560 570 580 590 600

PPI-AtCPP

600 ____ _____

Α?λΐίΜ 600 ™ A ppi-sojacpp TBG^^Mktmi-ríraagTTíiiT^cEnigiGGTlgi-ríia riAniCTaSi^^C^w 600__

Consensos Xjj>^gfej>fa^í^ÍjXtfáSB]XXÍÍÍXBxf^*^lXXXMÍxPHlXnxMrq^Éria^rixxfixgiBlx 6oo

Ittccagatggagacctccgg^EMMIMMÍMMíII^MMM I d d B =BW d JCCÜGTÜTTG ATjjGCACCÜCTijTTCAACAAGTTC ACTCCTC-I IttccQgatggagacctccggI^I^ d d Bcflff4d üccSgtWtSatagcOccBctcttcaaOaagttcactgM IcSCTTCCAGATGGnOcTCgGG&MM—MiM——M ra^VUÍGCaCCgCTSTTCAABAAgTTCACTCCgC-l

670

IttccSgatggB

PPI-AtCPP siEssâsSSue

PPI-BnCPP meftraeTAi

PPI-SoiaCPPEE®EjAfiS

680 690 700 710 720 maig 720

720

PPI-SojaCPP_^&TfflKAgÍC[gjef^TMBíeiWWClWíHlC^cnAl7Sg

Egíüa^

Consensos Κ&Τ^ΕΧ611Χ^^ΑνΑΧΗ·ΜΜ·ϊ8χ8ί8χΒΒΪΧ^χΠχΗΒ8χΧQX&MxSjXlIlIflflãW 720

730 740 750 760 770 780

790 800 810 820 830 840

348

PPI-BnCPP HSS2SEESiE^33BgcH [efA^tefA<e:A^itf^||ídíefei^§ 840

PPI-SoiaCPP ^ge^Mí^lCECii^cyÀWÀ^àlA^àtfÀW^citf^AGEcEE^GaBaaMSÍTWr 840 _________

Consensos I^W^M^djXgXll^liíWX^XÜlxL^BtfÀ^Xl··^ SEExg χχΕΙχ5^χχ^χβ^λ·μϊχμ8χ 84o

850 860 870 880 890 900

PPI-BnCPP [«xdKAtfA^BS^BBBSffi^Srõoo

PPI-SojaCPP EjBrflfíegC^T^STigelgeyÀWAtfWcyÀTAttftfC^cB^ T^giGTGi^SABABjTGjÍíttHl 900 __

Consensos ^Jfá|JícBjX^XLgÁXeiXÍixteícyÀX^JXbícidAtJxMíX^lxt^^ xCTgixxxí^gxSxiiixxraíasx 900

StíEEEa

CTGAATCA-

910 920 930 940 950 960

-·Ι-·Ι·-Ι·-!·-Ι-·Ι·-Ι-·Ι····Ι·-Ι·-Ι·-Ι ____________________________ ppi-AtcppHij2ggj^jj^3SELi2^25õEg^^í^SgE

960

PPI-BnCPP SBCg^MgHBtfg^BtfÉlGWA^«ÉtfeyAWcWÍ/i.WAtfM ϋΞΰΞ^

PPI-SojaCPP ApGgE jGSjWiAgACÜTCi^ABB^el^SEig

SaMiaHig C[d*AVAVTíWAG[wicfer ~ ~ ~

Consensos X _____

ΠχχΠΧΧΒ^ΒΟΒΙΧΧΜίΜΜ 960

ETtgCAgATjj ______________________________

3ΑΑΑΠΤΟ0Ώ0ΊΌΑ'ΓΕΕΕ···Μ^··1·^·|

SjgC^ATEcTTgC^T^TECAATTTGGAGGATABACEC-l rCATTGGTTTGATCATATTTCAGjfafa—ÜBBMImmM I d sl B ;ΠΜ ί ^CTCTTCAGG AGTTTTGGÜTTTG ATACACA0CCAGTTC-M |Τ0ΑΤΤ00ΤΤΤ6ΑΤ0ΑΤΑΤΤΤ0Α6ΚΕΞ·^···^·Ι^··| IctStCTKgBagBtttgg@tttgatac@cagccagtBc-| 5ατοατατττοαοΡΞ3·······Μ··Ι AGgTTgGGgTTTGATACgCAgCCgG7%C-|

ΚΑΤΟΑΤΑΤττοΑΰΚΕΞΜ^ΗΗΙΙΗΙΜ··

TCÃrnGGg®

TCATTGG

1030 1040 1050 1060 1070 1080 |····|. J. j [ -I | J | |·.··|···.|__ ppi-Atcpp EgJgraggE^EaiGg2E®THESE^Sfi^^ irdÀVAtetHicSjgQreggfflg 1080__ ppi-BnCPP^^^SSrÀVAWjLWAtfitfAVATtWcM^a/AlÍTggiiggAta Sjc05^SiiS|^ _

PPI-SojaCPP ^TgmraKffllC^!gira^G^ATnGgSlCCT3g làltfdl^^dA^AiAHiCBgCM^TEA 1080 ______

Consensos S^XEXHíClE^lxS^mX!i^xW?XXnx!cSiXkxeWte3XX[S8

349

1080

ΒμΒΗμΜτΤΤ G AGTTTCAGGCTGATGC^^OCUGTOAAGCnO^M ItatgcaaaSgatctücgtcctUEMI^^—Μ^Μ^ΜΜΜ

X)

G3

HaWaaMGCTCTAGTGAAACTACAGGMGÃGÃÃcnTHOÃBcBM iTGAACACjjGATCCATTGTACTCAngaa^ a a B =I7M a 31GCgCTAGTGAAECTACAGGAAGAGAACTTATCAGC| ItgaacacagaEccattgtactcaIEBI^—ί _ d d KgEW d ÜGffiTCTÍjGTG AAACTACAGGA@GAGAAjET@TCAGCQA-| |TGAAjjACAGATCCÍjlSGTACTCgE51^M—MMMWWH ESJgJSSiG KGTGAABCTACAGGABGAGAAggTgTCABcgA-B |TGAAgACgGA T^GIACTC^^·^·^···^·^···

1210 1220 1230 1240 1250 1260

-·Ι·-Ι-·Ι·-Ι·-Ι-·Ι·-Ι-·Ι·-Ι··-Ι-·Ι··-Ι___________________________ ppi-Atcpp __ ppi-soiacpp

EATnGGCCagGCBG@0CEAECCG@aT 1260 _____

Consensos S«|gfaft&«irAix!ffix!^xK5bftMx5SSiHnxB^x^BxxiiXXXXggXXXXEflXfêXflXXXgflx 1260

1270

PPI-AtCPP ygttJ^egWWej&B|ttjl275

PPI-BnCPP 1275

PPI-SoiaCPPj^BfeGAgcyjCli^ 1275

Consensos ^^^^SXX^^Xi^^l275

Tabela 36. ClustalW Analysis of PPI Amino Acids

1) PPI-AtCPP (SEQ ID NO:98)

2) PPI-BnCPP (SEQ ID NO:110)

3) PPI-SojaCPP (SEQ ID NO:113)

4) Consensos (SEQ ID NO:168)

20 30 40 50 60

2½

350

80 90 100 110 120

....1-.1 | 1 | -| | | |. | | |_____________________________________

PPI-AtCPP lalflÍaaii^ayiÉLViíB^ÉIM^dyild^a^^drid^bg^ 0320ãüãEfflElEIHSi2o ____

PPI-BnCPP !Slalsjj^ySldan|lLMSEAlIlF[^l[ga55aM^lgrgor5LPMVfgLnpla^ialbsbblsd^wao^^¹²⁰________________________ ppj-sojaCPpTraJgJJg|JnEESnS2^03ES!BEESSHSEH ®®0ã3SEE^

Consensos PPI ________ ______ ____ xxfB5xfflxíSe!xBsiyjavjgX!effixfãxxxxExxxí3?l=ng!bílxl3Byc1l^lx^gB]

120

130 140 150 160 170 180 ppi-Atcpp IHiMagffibmayjls&iriÍMa^^^ HddkVA11IMm»Ikgqaa 180 __

PPI-BnCPP [H>Md^ii^iaaiasrêlÍWdg|«rtii^ivi5irêCTifggiLJgOTB paSSBMBWE^______ ρρι-SojaCPP [B»naa^yitc»a^i^dÍMd?IK»ibdVildddriXIIKc1ldM HEaáEEEDEB^ ___ Consensos PPI [HwISHayfalàkllsIXlg^friaSItffnxroÍXlSxlElriikilXIgffllXlllse Η]χχ33Η3Μ®3^3Γιθ0

190 200 210 220 230 240

IddaisiaWiUMa^iawaawãyi 240 __

Consensos PPI Bg^Bj^xg^xMSxyAWibixifoayjfciifldlaBkiaiaadBBxlB |gIdgddaW^31xxawaaB5fflB 240

PPI-AtCPP	DGSTRSSHÍ	SNAYMYGFFKNKRIVPYDTLIQQCKDDEEIVAd
VIAHELGHWK	LNHTVYTFV	0300__

PPI-BnCPP Ift^U^SMJFÀll^fiMaJaSiadffiLgnniWggQNENHroí

351

WükW^MDGSTRSSHSNAYMYGFFKNKRIVPYDTLIQQCKDDEEI-I |ΫΑνΐΑΗΕί-0ΗννΚΕΝΗΤνΥΤΡνΑ^·|^···Μ^·Μ··Ι regfl£flgg551DGSTRSSHSNAYMYGFFKNKRIVg<YDTLIQQcBS53EH |VAVIAHELGHWKLNHTBYgFBAE3—

310 320 330 340 350 360

370 380 390 400 410 420

430 440 450 460 470 480

IKKEDB

IkkQdI kked Sd· •••·Ι-·Ι·-Ι··-Ι····Ι-·Ι·-Ι-·Ι·-Ι-·Ι-·Ι-·Ι

PPI-AtCPP PPI-BnCPP PPI-SojaCPP Consensos PPI >

424 -424 - 424

480

Tabela 37. Análise de ClustalW de ácidos nucléicos genéricos/PPI

1) PPI-AtCPP (SEQ ID NO:97)

2) PPI-BnCPP (SEQ ID NO:109)

3) PPI-SojaCPP (SEQ ID ΝΟ.Ί12)

4) afc1 (SEQ ID NO: 124)

5) AT4gO132O (SEQ ID NO:126)

6) AF007269 (SEQ ID NO:128)

6) Consensos (SEQ ID NO:170)

20 30 40 50 60 70

PPI-AtCPP NA ---------------------------------------------------------------------PPI-BnCPP ---------------------------------------------------------------------352

PPI-SojaCPP afc1 —

AT4g01320 ---------------------------------------------------------------------AF007269 ATGGCGATTCCTTTCATGGAAACCGTCGTGGGTAAGCTTCAAAACCTTTTTCTGAGACATTTTACTATCC

Consensos ---------------------------------------------------------------------80 90 100 110 120 130 140

PPI-AtCPP NA ---------ATGGCGTTTCCCTACATGGAAGCCGTTGTCGGATTTATGATATTAATGTACATTTTTGAA

PPI-BnCPP ---------------------------------------------------------------------PPI-SojaCPP ---------ATGGCGTTTCCCTACATGGAAGCCGTTGTCGGATTTATGATATTAATGTACATTTTTGAA afc1 ---------------------------------------------------------------------AT4g01320 ---------------------------------------------------------------------AF007269 TGTTTCACTCATCGTATTTCGTTTTTGTTTGGGTTTTGCTTTCTGTGTTGTGTGTGTTGAGATTCCATGA

Consensos ----------ATGGCGATTCCTTTCATGGAAACCGTCGTGGTTTTATGATAT-ATGTACATTTTTGAA

150 160 170 180 190 200 210

PPI-AtCPP NA ACTTACTTGGATGTGCGACAACATAGGGCCCTCAAACTTCCTACTCTTCCAAAGACTTTAGAGGGTGTT

PPI-BnCPP ---------------------------------------------------------------------PPI-SojaCPP ACTTACTTGGATGTGCGACAACATAGGGCCCTCAAACTTCCTACTCTTCCAAAGACTTTAGAGGGTGTT afc1 ---------------------------------------------------------------------AT4g01320 ---------------------------------------------------------------------AF007269 CTCGTTTGTTTCATATACCATCGTCTCTGCTTCTCGTTTCTAAATTTTGTTCTTTTCTAATAGTGCGTA

Consensos -CTATTTGGAT—-TGGCAACATG—CCTCAACTTCCACTCTCC—AAACTTGGTGGTGTAT220 230 240 250 260 270 280

PPI-AtCPP NA ATCAGCCAAGAGAAATTTGAGAAATCTAGAGCCTATAGTCTTGATAAAAGCCACTTCCATTTTGTTCACG

PPI-BnCPP ---------------------------------------------------------------------PPI-SojaCPP ATCAGCCAAGAGAAATTTGAGAAATCTAGAGCCTATAGTCTTGATAAAAGCCACTTCCATTTTGTTCACG afc1 ---------------------------------------------------------------------AT4g01320 ----------------------------------------------------------------------

353

Λ'’' ^ιέ^ι Pí« · -\y>i ra ic-ubr >__

AF007269 CCTTGATCTGAGGTTTTATTACTCCTACTAGTTTCTTGTC-^.

TTACTCGTG-CGTTT-GATTTGATTTGAG

Consensos —AGCCAAGAGAAGI I IGAGAAATCTGAG— CTACAGTCTTGAAAAAG-CATT-CATTT-GTTCA-G

290 300 310 320 330 340350

PPI-AtCPP NA AGTTTGTGACAATAGTGACAGACTCTACAATTTTGTACTTTGGGGTATTGCCCTGGTTTTGGAAG

PPI-BnCPP ---------------------------------------------------------------------PPI-SojaCPP AGTTTGTGACAATAGTGACAGACTCTACAATTTTGTACTTTGGGGTATTGCCCTGGTTTTGGAAG afc1 ---------------------------------------------------------------------AT4g01320 ---------------------------------------------------------------------AF007269 CTTATGTGATTTCATCATCTCTTCCTCGGTTTTAGAATGTACGGAGCTTCTCTGTTAACCAAAATCTAG

Consensos AGTTTGTA-CATAGT-TAGACTCT-CAATTTTGT-CTTTGGG-TTTGCCTGGTTTTGGAA-----G

360 370 380 390 400 410 420

PPI-AtCPP NA AAATCAGGAGATTTTATGACAATAGCTGGTTTCAATGCTGAGAATGAAATACTGCATACCCTTGCCTTCT

PPI-BnCPP ---------------------------------------------------------------------PPI-SojaCPP AAATCAGGAGATTTTATGACAATAGCTGGTTTCAATGCTGAGAATGAAATACTGCATACCCTTGCCTTCT afc1 ---------------------------------------------------------------------AT4g01320 ---------------------------------------------------------------------AF007269 GATTTGGGAAGAAAAGTCGGAGTCTTTTTTTTCCTCATTCCCGATTGGAAATTGAGAATCTTGAAATTTT

Consensos AT-TCGGG—TTTTGCAA------TTGGT—

VÍ CATCGAGAATGAAAT-CTGCATACC-TT-CTTCT

430 440 450 460 470 480 490

PPI-AtCPP NA TAGCAGGGCTGATGATTTGGTCACAGATAACAGATTTGCCCTTTTCTCTGTACTCAACTTTT-—GTG

PPI-BnCPP --------------------------------------------------------------------PPI-SojaCPP TAGCAGGGCTGATGATTTGGTCACAGATAACAGATTTGCCCTTTTCTCTGTACTCAACTTTT-—GTG afc1 ---------------------------------------------------------------------AT4g01320 --------------------------------------------------------------------AF007269 TCTTTGTTCAAGTCATACAGCTTGAGGTTTTGGGTTTTCTTGTCAGGGTATTATTATGTTCGTGACTGCA

Consensos T-GCGGT-—ATGAT-GGTCACAGATA—

CGATTTGCCTTTTCTT-GTACTCAACTTT------GTG

500 510 520 530 540 550 560

354

PPI-AtCPP NA ATTGAGGCCCGTCATGGTTTTAATAAGCAAACACCATGGTTATTCTTTAGGGACATGCTTAAAGGAAT

PPI-BnCPP ---------------------------------------------------------------------PPI-SojaCPP ATTGAGGCCCGTCATGGTTTTAATAAGCAAACACCATGGTTATTCTTTAGGGACATGCTTAAAGGAAT afc1 ---------------------------------------------------------------------AT4g01320 ---------------------------------------------------------------------AF007269 ACTAGAGTTTTCTGGAGTTTTTTGAAATGGGTTTTGTGTTGTGGAACCGTATGTGAATGTTGCATCAAAA

Consensos AT-GAGTCCG-CATGGTTAAAACAAACA-------CATGGTT—

TCTTAGGGACATG-TAAAGGAAT

570 580 590 600 610 620 630

PPI-AtCPP NA TTTCCTTTCTGTAATAATTGGTCCACCTATTGTGGCTGCAA------TCATTGTAA-TAGTACAGAAAGG

PPI-BnCPP ---------------------------------------------------------------------PPI-SojaCPP TTTCCTTTCTGTAATAATTGGTCCACCTATTGTGGCTGCAA------TCATTGTAA-TAGTACAGAAAGG afc1 ---------------------------------------------------------------------AT4g01320 ---------------------------------------------------------------------AF007269 CTCTTTCAGTGCTCCAATGTTTCCATCAGTAGTCAGCACAAGAGATCTTTTTATATCTGGTTGATCAAAA

Consensos TTCCTTCTGTATA------G-CC-CCTATTGTG-CTGCAA------TATTGTA-TAGT-CAGAAAGG

640 650 660 670 680 690 700

PPI-AtCPP NA AGGTCCATACTTGGCCATCTATCTTTGGGTTTTTACGTTTGGTCTTTCTATTGTGATGATGACCCTTfi

PPI-BnCPP ------------------------ Afl

PPI-SojaCPP AGGTCCATACTTGGCCATCTATCTTTGGGTTTTTACGTTTGGTCTTTCTATTGTGATGATGACCCTTfi afc1 --------------------------------------------------------------------Ajj

AT4g01320 ------------------------ Ajj

AF007269 AAGTAGATGATGTTATTGAATTTTCAGTGATGGAGTATCTGTTGTTGTGGCATTTAGAGTAGATTCGTAjj

Consensos AGGTCC-----TATG-CCATCTATCTTGGG--------TTTAGTTTTCTTCTTGTGATGATGACC-Tjj

710 720 730 740 750 760 770

I

PPI-AtCPP NA AlgC0GjjAfflQA-_ _

AÜAGCTCC0C1®

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355

lficEfiGGASACEGÍEGTTGG13ÜT0TGATSG5GAnGI0CGBTT3TGSGAgGTATTTGG

PPI-SojaCPP AlMGÜASjAAflAGCTCC0CT®nEAATAAGÍEcSCTCCBcjjj]CC0GHÍGGÍjCAEClgAGGGAGAA afc1 θ^ΕθΕπΏθ®

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AT4g01320 GG@G0TÍJCHj!jjC0ÜGGASACEGÍj@GTGGG-Tflj-T0TGATSGÍÍGAfiGT0CESTTÍÍTG0GAgGTATTTGG

AF007269 TlEATCfil®Grríjl0ÜTCTTTTTCfiTACAGGTffi-T0TGA73 GflGAjÍG70CEÍÍTTÍjTG0GAEGTATTTGG

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880

890 900 910

780 790 800 810 820 830 840

PPI-AtCPP NA

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PPI-BnCPP caa0g2§t-íjüg

PPI-SojaCPP _____

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PPI-AtCPP NA ^TCE|^CA(^ctíGCET0TATGÍETG@ATTCTTCAAGAACAAGAGGATTGTCC—CTTATGACAC

PPI-BnCPP @-AG0^jTTGEEA®ãClEG0-GCTÍECAg------------PPI-SojaCPP EATCS®3CAC^C0EfiGCEl0TATGB0TG@ATTCTTCAAGAACAAGAGGATTGTCC—CTTATGACAC afd @-ag0ESjttg0@a®ücaEg0-gcaíEca@-----------------AT4g01320 fé-AGflfl^TTGE(gA^SÍCASGS-GCAÍÍBCAta------------AF007269 E-AGB2SSTTGB§A0SjCAEG0gcaEca@tcttgacaaaaggtttcgtcttgatcatatttatatcat

Consensos @-TC00E-CA7B§-EEOgCTA0-TGÍETG@TTCTTAAGAACAA-AGGATTGTC-----TTATGACAC icc-

356

920 930 940 950 960

PPI-AtCPP NA ATTAATTC-------------AACAGHG(

A

970 980

PPI-AtCPP NA ATTAATTC-------------AACAGjjGCA gAGACGATGSGGAA^TÜGriTG-CTBríCTBiGCaCAllGABg

PPI-BnCPP -----------------------------------------TCTTGACAAA— aSccHEttBacííti®

PPI-SojaCPP ATTAATTC-------------AACAGDGCA0AGACGATG^GAAEhBGBTG-CTtaiffiBigiGCBCAijGAffi afc1---------------------------------------------TCTTGACAAA—

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AT4g01320 ----------------------- ---GGÂÍÍATCETCACTGAGAigCTTT^AnAgÍATGCA!gcngraÍTrffiACnT~rta

AF007269 TTTAGTTTTTTATAATTGCCAGGGGAjlATCfflTCACTGAGA0CTTT0AjjAÍjATGCA@CHHÍJTTBACfiTT@

Consensos ATTATTC---------------ACAGjjGCA0--------G0AGAA0TÍÍGÍÍG—

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990 1000 1010 1020 1030 1040 1050

|....|..J^...|....|....|....|....|....|....|_|....|....|....| cEaíEct@tgBacaCAAJ]

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PPI-AtCPP NA J

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AT4g01320 jjjCATGAGI WE

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AF007269 jj|CATGAGTgT|§ 'ríÜSTBCÜTTGgGWar Consensos GHGGGACAC aHEcDtc—-A0BSE—c

CT

TGG

CT £

TGG |ETG@ACjjCTGgGAÍjDgAÍEClETGflACACAAU

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1080 1090 1100 1110 1120

1060 1070

....1....1. J J J ·Ι····|····|····|····|····|·.·.|....|··.·|

PPI-AtCPP NA HE®G@ATATACACTAGTGCGAAATTCAGCTGATCtgtatcgaagctttgggtttgatacgcagccagt

PPI-BnCPP -----------------------------------------------------------PPI-SojaCPP TATACACTAGTGCGAAATTCAGCTGATCTGTATCGAAGCTTTGGGTTTGATACGCAGCCAGT afc1

AT4g01320

AF007269

CATTTTGAATATAGAGTTGTTACATTACAAConsensos HEEEG@ATACAC-CTAGTG-AAATCC—TGATCT—TGAG-TTGGTTTGATAC-CAGCCG-

gtacatatctggtttcggtatacagtatcts

357

1130 1140 1150 1160 1170 1180 1190

PPI-AtCPP ΝΑ CCTCATTGGGCTCATCATATTTCAGC0ÜACTGTA0TSCCACBjC0GEA0TTgGBCA^TÍlgGjET—S

PPI-BnCPP ------------------------3^TCTGGCGGC-TTflCl®CgABI®GÍJGG@ACnC@AÍECAGAg

PPI-SojaCPP CCTCATTGGGCTCATCATATTTCAGCEfiACTGTASTECCACHjC0GEA0TTEGBCAEgTjÍEGjET-S afc1 -----------------------LljÍGTCTGG0GBT-GlíÍjT0CEG0g@jBgg^cHEaíEcagas

AT4g01320 --------------------------HjGTCTGG0GgT-GlHÍT0CEG0gStugg^cHEaíEcagaE _ __

AF007269 TTGTAAAGTTTTCATTTTTACCTTAGHjGTCTGG0GgTgiíüi0cEg0-g@4íígg@EcííEaíEcagaS

Consensos TCTCATTGG—TATCATATTTCAGC0QACTGTA0IECACjgjC>---CATGTAgS4ÍmEcTl-----1200 1210 1220 1230 1240 1250 1260 ppi-Atcpp na EEcct0gBcagcSgatEatüuga0üBtca^SEaíEgcBtíEcSSa@aagcttEgatatgcaTCTGGAT ___ _____ ρρι-BnCPP EEtga0aBcctg®caE-tSHBc0uúctt^üEgBctBaSEa®t@gtcacak--------------PPI-SojaCPP BgCCT0GBCAGCEGATffiATTCiGACTilTCAÍCMBifeAngGCn-rtiScB^AtgAAGCTTfflGATATGCATCTGGAT ___ _____ afc1 TGA0ABACTGg0TAElE^C0ffiCTTEgSH§GBBGTCACAffl--------------- ---- ------TGA0^ACTG^TASTSgFiCCTÍÍCTTg!agÍSGpg'CACAg--------------- ---- -----^TGAS^ACTGG^TASTMgilCCTiiCTTtaagÍgGigaGTCACAgGTGTTCCAAATAAAC _____

1TJCCT G------T0G CG aSHÍgEHÍTCA^SEaÍE-CBtÍEC-

AT4g01320

TnAlfeAB^

AF007269 τΠαϊϊ^αΒ^

Consensos _

-@AAGCT7@G-TATGCAGTCGG1270 1280 1290 1300 1310 1320 1330

PPI-AtCPP NA TACGCGGTGGTCTTGTGAAACTACAGGAGGAGAATCTGTCAGCT—ATGAATACAGATCCTTGGTA

PPI-BnCPP ---------------------------------------------------------------------PPI-SojaCPP TACGCGGTGGTCTTGTGAAACTACAGGAGGAGAATCTGTCAGCT— ATGAATACAGATCCTTGGTA afc1 ---------------------------------------------------------------------AT4g01320 ---------------------------------------------------------------------AF007269 CCCTTCATATAGTCCTATACGTTTAGCATCAAAATATCTATTTTCTTAAGATAATAATATTTCTTTTATA

358

Consensos -T--------GTCTAGTGAA-CTACAGGAGAGAA—TGTCAGC—ATGAA-ACAGATCCTTG-TA

1340 1350 1360 1370 1380 1390 1400 .-1.-1.-1.-1.-1.-1....1....1....1....1...1-1.-1.-1

PPI-AtCPP NA CTCT---GCTlfAWLWlA-rBcnCATCCnCCacn----flGTflG^AGAÜlSGCCGCGCBgG PPI-BnCPP ---------MAfgic^cTTHcE—-íraATgg _

PPI-SojaCPP CTCT—GCTTffiBSjATjicnCATCCiiCCEcjl—QGTBG^AGABT^GCCGCGCjEGABg^A— afc1 ------—J^lWAWlGAimiGSCATfWlTG—HAfgiC^CTTÍicE—-ÍEatEEEg-— _____

AT4g01320 -----------LWffiX^lGABlíiGSCATÍMfcbMTG—

HASSicEÜCTTnCfô-------ίϊ^Α '

AF007269 TTCTGATGCAGt nAfgic^CTTBdg-------HHa

Consensos CT C—

GCTrt^WÁlHlATCCACSTCCCiiiGnGAAAGAÜGMiG^GAGAAAtgAAGAGATAATCTA0ATTCT

iTTTCTTtfcM

3G

GAfi-riiGSCA-rtàiteÍITG—

1410 1420 1430 14401450

....|—|—|..J—I—l-J.......|-|..|

PPI-AtCPP NA -Cg|GGATA0G GAAGE1460 1470

PPI-BnCPP

-tHicgg

CATGGG

TTC

AACAAA

PPI-SojaCPP _CSGGATA0GAA@GAAG0g·®----------------------afc1

-t®cgg®ü^MttcEE^O

AT4g01320 -T®CGG

CATGGG

TTC

AACAAA

AF007269 - _______

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Consensos TTCMiTTTfalíeieiAGGTkViWÀTAVJGTATGTCGTATTTCCAACACTACCTTGTGACTTACGTTTTTTTATCA

1480 1490 1500 1510 1520 1530 1540

PPI-AtCPP NA ---------------------------------------------------------------------PPI-BnCPP --------------------------------------CAAACAATATGGATGTTCATTAGGGACATG,

PPI-SojaCPP afc1 —

CAAACAATATGGATGTTCATTAGGGACATG

AT4g01320 -------------------------------------CAAACAATATGGATGTTCATTAGGGACATG

359

AF007269 GAGÁTGTGGATTAAATTTGCTTCTAAATTCTGTTGACA-

1550 1560 1570 1580 1590 1600 1610 •-Ι····Ι-·Ι·-Ι-·Ι·-Ι····Ι-Ι-Ι-·Ι-·Ι··-Ι·-Ι-·Ι

PPI-AtCPP NA -----------------PPI-BnCPP iicMateWc

PPI-SojaCPP -----------------afd

CBBTaB^T^gGHiAai

AT4g01320

C^ltaBÍ<táT^GEÍÍAEiM|·

AF007269 cCTÍ7ESÍRfti^^GaiAH|Íí

Consensos cHiitàiíâS·

^^jMpyc|ft^rA!gTAtSG[gggABgg SjTQcanxaica^- ___ ^CSnr«HlftíÃlSt«JÍroSTA!gGtgggA!gg

311íBSffimm^/AT«frAfaGagS!Affia jcaj2gnc]WgGT__ t^gJSjÍSSjucISÈÊucSÍsgt

1620 1630 1640 1650 1660 1670 1680

PPI-AtCPP NA ---------------------------------------------------------------------PPI-BnCPP ---------------------------------------------------------------------PPI-SojaCPP ---------------------------------------------------------------------afc1 --------------------------------------------------------------------AT4g01320 ---------------------------------------------------------------------AF007269 TTGATGATTCTGGATTCATCTTATTTCTGAGTTTTTCACATGGATGACTATTCTCCATTGAGTGTGAGCT

Consensos TTGATGATTCTGGATTCATCTTATTTCTGAGTTTTTCACATGGATGACTATTCTCCATTGAGTGTGAGCT

1690 1700 1710 1720 1730 1740 1750

PPI-AtCPP NA ---------------------------------------------------------------------PPI-BnCPP ---------------------------------------------------------------------PPI-SojaCPP -------------------------------------------------------------------afc1 ---------------------------------------------------------------------AT4g01320 ---------------------------------------------------------------------AF007269 TCAAAGTTTTTAGTTTTCGTGTTAAAAATTTAAAATTTGCTTCTCTGAGCATGAAGTTTCTATCTTTTTC

Consensos TCAAAGTTTTTAGTTTTCGTGTTAAAAATTTAAAATTTGCTTCTCTGAGCATGAAGTTTCTATCTTTTTC

1760 1770 1780 1790 1800 1810 1820

PPI-AtCPP NA ---------------------------------360

lAAAGGAGGTOCnÃaCTSGCCATCTATCTGTGGGCATTCATGTTTATCC-B

ΨΙθΙΞ^.θΙθ^θ^θ^ΜΜΜΜΜΜΜΜ |AAAGGAGGTCCnAnCTBGCCMCT7MCK?TGGGC/mÕ!M?mÍMÕ^ ΠΌΤΟΤΟΤΑΰΤΰΑΤΰΑΤΟΑΜΜ·^··|·|Μ^^η^·Μ· AAAGGAGGTCC^nCTUgCCATCT^OT^TGGGC^OAT^mMÕ^ TGTCTCTAGTGATGATGA—|^—Μ——M ΟΞΞΞΙΒΒ^ααα-ΙΙΗΗ^ΗΗ^ΗΗΜΗΙΗ^Η^Ι GGAGGTCCTTAjjCTfiGCCATCTATCTGTGGGCATTCATGTTTATCCTGTCX tctagtgatgatga|H^HBMMHMHHMM^H1

Ξ35ΚΚΞ§ΑΑ/ν·ΗΙΗ^ΗΗΗΜΗΒΗ^ΙΜ^Η|

GGAGGTCCTTAUCTfiGCCATCTATCTGTGGGCATTCATGTTTATCCTGTCX

ΤΟΤΑ61ΌΑΊΌΑ1ΌΑ···||·^·····ΜΜ··ΜΜ

1900 1910 1920 1930 1940 1950 1960

PPI-AtCPP NA ---------------------------------------------------------------------PPI-BnCPP ---------------------------------------------------------------------PPI-SojaCPP ---------------------------------------------------------------------afc1 ---------------------------------------------------------------------AT4g01320 ---------------------------------------------------------------------AF007269 TTTACAATTCACTGCTTGTTTGCATATGTTGTTACCAGACAATATAATCTCCCGCTTTTTTATGGCTATA

Consensos TTTACAATTCACTGCTTGTTTGCATATGTTGTTACCAGA1970 1980 1990 2000 2010 2020 2030

PPI-AtCPP NA ---------------------------------PPI-BnCPP CTTCCjjGATGGAGACCTCCGGGAGAAGATTGAGAAACTTGCTTCTTCTC361

TAAAGTTTCCT§TGAAGAAG| |CTTCC0GATGGAGACCTCCGGGAGAAGATTGAGAAACTTGCTTCTTCTÇ-| nAAAGTTTCCiljTGAAGAAGMMMMM^MIMMMMMMM CTTCCBGATOGAGACCTOCGGGAGAAGAnOAGAAACnOCncnCT^ taaagtttccjütgaagaagB——É ES»5^McttccBgatggagacctccgggagaagattgagaaac-B TTGCTTCTTCTCTAAAGTTTCCTUTGAAGAAG—M gaSggaECTTCCSGATGGAGACCTCCGGGAGAAGATTGAGAAAC-M TTGCTTCTTCTCTAAAGTTTCCTfiTGAAGAAG^M—B

2040 2050 2060 2070 2080 2090 2100

PPI-AtCPP NA ---------------

2110 2120 2130 2140 2150 2160 2170

PPI-AtCPP NA ---------------------------------------------------------------------PPI-BnCPP --------------------------------------------------CTTACATGTATGGTTTC

PPI-SojaCPP afc1 —

AT4g01320 ----------------------------------------------------CTTACATGTATGGTTTC

CTTACATGTATGGTTTC

AF007269 ACTTTACTCTAGTTTACCATTAGAAGCTTACGTATCttgttacatcatacagg'

Consensos ACTTTACTCTAGTTTACCATTAGAAGCTTACGTATCTTGTTACATCATACAGG

CTTACATGTATGGTTTC

CTTACATGTATGGTTTC

2180 2190 2200 2210 2220 2230 2240

PPI-AtCPP NA ----------------------------------

362

AT4g°ⁱ³²Q

AF007269 uüTE^SEH^JE^ãüSuüHfiEESS^EGSl^i^H

MgÀEGTACTGTGJkCTCTTGATGCTTCAAA________ ________ consensos QBi3«S!33S2EEB3SiEnSfiSEEETS3GiB3EHEEI

HgaSGTACTGTGACTCTTGATGCTTCAAA

2250 2260 2270 2280 2290 2300 2310

PPI-AtCPP NA ----------------------------------------------------------------------

PPI-BnCPP --------------------------PPI-SojaCPP ——-------------------afc1 --------------------------------AT4g01320 ---------------------------AF007269 CGAGCTATACTCA-

CATTTCTGTTTCTGGTTCTGAAACATAACATAATCTTCTATTGTGCAA

Consensos CGAGCTATACTCACATTTCTGTTTCTGGTTCTGAAACATAACATAATCTTCTATTGTGCAgB58!a

TGC

AGAA

AGAA

2320 2330 2340 2350 2360 2370 2380

PPI-AtCPP NA -----------------------------------------------------------------------PPI-BnCPP E^gAÍSlí^lABraÉciàgrfc^B^BÉrfgÀWÀWcWggiGBg^ ^c»íci^Á^GmSECTiSK«^MEffiÍí^aiSSi ........

PPI-SojaCPP afc1 @ET

AT4g01320

BBShíúMaiBA

AF007269

Consensos

EEjTlXSe^jA

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|GHgJ pV5w|

O

IgS jGH

FàVàWJ kAATTGTGGCGi CACACTACATA TGAAATTGTGG CACACTACATA FGAAATTGTGG CACACTACATA TGAAATTGTGG CACACTACATA

2390 2400 2410 2420 2430 2440 2450

PPI-AtCPP NA -----------------------------------------------------------------ρρι-BnCPP QS&QEEjEÜBSES-----------------------------------------------PPI-SojaCPP ---------------------------------------------------------------------atei -----------------------------------------------AT4gO132O^JsJggS^Sjngg0-----------------------------------------------AF007269 IWaWcMAMÍWaWTGAGGCTCAACCGACAGTTCAAAAACTTACTCACATCTACATTTCACTTAAGAAA Consensos lífAXBÍdÜALciBtfAl^GT G AGGCT CAACCGACAGTTCAAAAACTTACTCACATCTACATTTCACTTAAGAAA

363

2460 2470 2480 2490 2500 2510 2520

PPI-AtCPP ΝΑ ---------------------------------------------------------------------PPI-BnCPP -------------------------------------TCCTTGCCTTCTTgCAATTTGGAGGATACAC

PPI-SojaCPP ---------------------------------afc1

AF007269 TCATGTCTTATGACCCTCTCTCAATGTTTTGCTTGCAG

CAATTTGGAGGATACAC

Consensos TCATGTCTTATGACCCTCTCTCAATGTTTTGCTTGCAG

CAATTTGGAGGATACAC

ATCCTTGCCTTCT

ATCCTTGCCTTCT

ÜAÜA2530 2540 2550 2560 2570 2580 2590

PPI-AtCPP NA ---------------------------------------------------------------------PPI-BnCPP

MTCTTGTCAGAAACTCCACTGATCTCTTCAGGA-:

itttgatacacaEccSgttctcattggtttg··

PPI-SojaCPP ----------------------------------------------------------------

2600 2610 2620 2630 2640 2650 2660

PPI-AtCPP NA ---------------------------------------------------------------------PPI-BnCPP ---------------------------------------------------------PPI-SojaCPP ---------------------------------------------------------------------afcl ---------------------------------------------------AF007269 SESHiI^EgTTTGTTATTTTTGCCTTTTGACACTAATCTAATGAATCAAGGATGGATTAAGAAAAA

Consensos EnSSEBEEEEGTTTGTTAI I I l IGCC I I I IGACACTAATCTAATGAATCAAGGATGGATTAAGAAAAA

2670 2680 2690 2700 2710 2720

2730

PPI-AtCPP NA

PPI-BnCPP -------------------------------------------CACACTGTAATACCACTjjCAAC

0c!Si

364

PPI-SojaCPP ----------------------------------------------------------------------

afc1 -------------------------------------------AT4g01320 -------------------------------------------AF007269 AAAACTCTAAACCTTTGGTTATATCTCCTGTCTGATTATCAcagHESSESüB^^SígSEEtSu

Consensos AAAACTCTAAACCTTTGGTTATATCTCCTGTCTGATTATCA2740 2750 2760 2770 2780 2790 2800

PPI-AtCPP NA ----------------------------------------------------------------------

2810 2820 2830 2840 2850 2860 2870

-S

PPI-AtCPP NA ---------------------------------------------------------------PPI-BnCPP -----------------------------------------------------------------PPI-SojaCPP ----------------------------------------------------------------afc1 3

AT4g01320 -g

AF007269 TCCAACCATAGTTTCTTTATTGCAATGGCAGCCTCATCTACTAATCTGAGTTAACGTTCCTTTTGCAGGg

Consensos TCCAACCATAGTTTCTTTATTGCAATGGCAGCCTCATCTACTAATCTGAGTTAACGTTCCTTTTGCAGGg

2880 2890 2900 2910 2920 29302940

PPI-AtCPP NA ----------------------------------------------------------------------

cü

PPI-SojaCPP --------------------------------------------___

AT4gO1320

ÜWdtfétfSWgMiggE^Hl^jMCTCAGA___

AFÕÕ7269_jK5jSSjJi^™^2jGHÍ^ECÍH]^^EA®SH

365

2950 2960 2970 2980 2990 3000 3010

PPI-AtCPP ΝΑ ---------------------------------------------------------------------PPI-BnCPP ---------------------------------------------------------------------PPI-SojaCPP ---------------------------------------------------------------------afc1 ---------------------------------------------------------------------AT4g01320 GAAGATAACAACAGAACACAAACTGTTACCTCAATTTGTGTCACACACTTAAATGGATTTTTTGTTGGGA AF007269 GAAGATAACAACAGAACACAAACTGTTACCTCAATTTGTGTCACACACTTAAATGGATTTTTTGTTGGGA Consensos GAAGATAACAACAGAACACAAAC-

3020 3030 3040 3050 3060 3070 3080

PPI-AtCPP NA ---------------------------------------------------------------------PPI-BnCPP ------0— ___________

PPI-SojaCPP ---------------------------------------------------------------------afc1 ------0— _________ _______ _________________

AT4g01320_rTTTGC]jGGA^^^^ÍHj^^AEÍEES3E^STS

AF007269 ΤΤΤΤΟΟ06ΟΑ^^Κ^ΏμΡ^^Α^^α!·^·]τ5^Ί1ΒΙ

Consensos TTTT GC0GGAB^^^^M^E&Átg^ACT&feyAWiXtfTB5TBl

Ea

Ea

3090 3100 3110 3120 3130

PPI-AtCPP NA --------------------------------------------------------

PPI-BnCPP	TCCTCI	ΠΌΊ
CAAGAAGAC/	XGATTA	a·

PPI-SojaCPP jAg0G

AGGCTTCGAGCCATTGATGGAGAAGA-

Tabela XX. ClustalW Analysis of PPI/Generic Nucleic Acids

1) PPI-AtCPP (SEQIDNO.-97)

366

2) PPI-BnCPP (SEQ ID NO: 109)

3) PPI-SojaCPP (SEQ ID ΝΟ.Ί12)

4) afc1 (SEQ IDNO:124)

5) AT4gO132O (SEQ ID NO:126)

6) AF007269 (SEQ ID NO:128)

6) Consensos (SEQ ID NQ:170)

20 30 40 50 60 70

PPI-AtCPP NA --------------------------------------------------------------------PPI-BnCPP -------------------------------------------------------------------PPI-SojaCPP ---------------------------------------------------------------------afc1 ---------------------------------------------------------------------AT4g01320 ---------------------------------------------------------------------AF007269 ATGGCGATTCCTTTCATGGAAACCGTCGTGGGTAAGCTTCAAAACCTTTTTCTGAGACATTTTACTATCC

Tabela 38. Análise ClustalW de aminoácidos genéricos / PPI

1)

2)

3)

4)

PPI-AtCPP PPI-BnCPP PPI-SojaCPP (SEQ ID NO:98) (SEQ IDNO.UO) (SEQ IDNO.U3) afc1 (SEQ ID NO:125)

5) AT4g01320 (SEQ ID NO:127)

6) AF007269 (SEQ ID NO: 129)

7) Consensos Gener (SEQ ID NO:169)

20 30 40 50 60

PPI-AtCPP

58___

PPI-BnCPP _ _ ppi-sq^^

----------------41 ________ ________ _________

Consensos Gener

SSÜXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX 60

80 90 100 110 120

PPI-AtCPP HSHfflESll

113

PPI-BnCPP ®

367

HSBlS^SlLMggAfflFEiBaESEEffiG FLPMViB-DPHaidlWHIsMl

113

PPI-SojaCPP Jg— ______ _______

HSJHÉ@aSjh/7®T|nY|Ev[ESnSSK^DFMTIA@FNA@O!iÍÍ!ASE

113 afc1 Jg----- ________-YldSláVJÍI^A^LMBB^ffiBSHa^aviáMgglAVLPRLELDpgonnisBW

113 ___________ ________

AT4gO1320 ENFNICSYHÍlãTjgldáViglLMfBSAiniFfgSlIlãlTOáVI&MgglAv lprl@ldpS2@IBH!sSEi2o

AF007269

Consensos Gener

xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx ΧΧΧΧΧΧΧΧΧ 120

130 140 150 160 170 180

..-1-.1.-I. ,J J | J. I r | ..J |________________

PPI-AtCPP ELMiíWribiwiaasiBhtgiiAViiaAldSMdSIMri

PPI-BnCPP

PPI-SojaCPP_

1L®I afc1

EHETSSÍÜâSaEEjajTã______________________

AT4goi32o _^^wjJÈEiE12ESSiãSIS3IE32ISíiE52I3EE2

EnSTSSKL@Sa®HF|1180

AF007269 - - - ___ iOiBaaejyiteÍÍaMlMdbMdftiKMiMiairlwMii^Tlgl^üqdakVÀ^Fll 93 Consensos Gener XXXXXXXXHwlarçlVmda!

gxi^sma^k^bixTOxIãx^il^x^xxiBcyjlxxrJafflikiiixn 18O ____ GjMllWSQITDLPFSLYSTFViÊERHGFNKQ-nSV^FBRD-l IflsviQgpp vaaii^iF' ~ ~ ' é^gWmHwsqitdlpfslystfviesrhgfnkqtiwmfird-I MIKGBLSViESpP VAAIlMll ' ...... ..

Ig1m|]wsqítdlpfslystfvieErhgfnkqtEw|1f@rd1 fFLSVlOGPPI VAAI Ι^ΐΕΞ··············

173

IL

PA

173

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Exemplo 47. clonagem constructo de vetor e sobreexpressão de seqüências AtFT-B os arabidosos produzem um fenotipo dominante negativo.

A farnesiltrasnferase é um heterodímero formado pelas suas su5 bunidades a- e β e a sua atividade compreende a dimerização apropriada entre estas subunidades. Uma sensitividade de ABA aumetada pode ser alcançada por meio de uma sobreexpressão de uma forma não totalmente amplificada de AtFTB (SEQ ID NO:1) em Arabidopsis. No experimento con** J clusivo, a sobreexpressão do atFTB de amplificação total falhou em alternar a sensitividade de ABA. Esses resultados sugerem que o fenotipo da resposta de ABA aumentada é similar ao resultado do efeito dominante da forma truncada de AtFTB. O AtFTB truncado pode ser não funcional ou possuir uma funcionalidade limitada In Vivo quando comparado a uma subunidade endógena de amplificação total. Entretanto, a redução da atividade de Ft resulta em uma sensitividade de ABA aumentada.

Clonagem

A seqüência da farnesiltransferase descrita pela SEQ ID N²: 1 foi clonada em um vetor apropriado sob o controle transcricional do promotor 35S de CaMV (vetor derivado do pBI121) na orientação sentido para a ex370 pressão em células vegetais. Este vetor foi denominado de AN90AtFTB e denominado SEQ ID N²: 79. A proteína codificada pela SEQ ID N²: 1 foi determinada à falta dos 270 nucleotídeos a 5' e, portanto, não codifica os 90 aminoácidos do terminal a 5'. A seqüência da farnesiltransferase de comprimento completo foi obtida utilizando o par de iniciadores identificado pela SEQ ID N²: 86 e pela SEQ ID N²: 171 e pela metodologia que é descrita em outro lugar neste documento. A seqüência resultante, identificada como SEQ ID N²: 172 foi clonada em um vetor apropriado sob o controle transcricional do promotor 35S de CaMV (vetor derivado do pBI121) na orientação sentido para a expressão em células vegetais. Este vetor foi denominado de pBI121 AtFTB, SEQ ID N²: 173. A proteína codificada pela SEQ ID N²: 172 foi determinada para representar o polipeptídeo de comprimento completo.

Transformação mediada por Agrobacterium, seleção da linhagem transgênica e teste de ABA.

A cepa de Agrobacterium GV3101 que carrega os constructos binários descritos anteriormente foi transformada em Arabidopsis thaliana através da transformação por mergulho floral mediada por Agrobacterium. As linhagens de Arabidopsis transformadas (T1) foram selecionadas em placas de Murashige/Skoog (Sigma) contendo canamicina (50 pg/pL). As plantas novas resistentes à canamicina foram então transferidas para o solo. As sementes T2 subseqüentes foram colhidas de linhagens transgênicas individuais para testes de ABA.

Análise de Northern blot. O RNA total foi isolado de plantas de Arabidopsis

T2 de duas semanas de idade do pBI121-AN90AtFTB, assim como das plantas Columbia do tipo selvagem e mutantes para era1. Depois de separado no gel de agarose, o RNA foi transferido para a membrana de nitrocelulose e foi hibridizado como a sonda de DNA do AN90AtFTB marcada com ³²P.

Superexpressão de pBI121-AN90AtFTB, não do pBI121-AtFTB resultou em uma maior sensibilidade ao ABA:

As plantas transgênicas foram selecionadas e avançadas para a segunda geração. As sementes T2 destas dois constructos foram submeti-

371

dos ao teste de ABA utilizando 0,0, 0,25, 0,5 e 1,0 μΜ de ABA em placas de meio mínimo MS-agarose. Das quinze linhagens de pBI121-AN90AtFTB, dez mostraram um maior fenótipo de sensibilidade ao ABA. A 0,5 μΜ de ABA, as sementes germinariam, entretanto, o desenvolvimento das plantas novas para estas 10 linhagens foi retardado ou interrompido, mostrando uma resposta hipersensível típica ao ABA. Em contraste, das quinze linhagens transgênicas pBI121-AtFTB, todas menos uma linhagem exibiram uma resposta normal ao ABA similar ao tipo selvagem para a germinação de sementes e o desenvolvimento de plantas novas.

A análise de Northern blot indicou que nas linhagens transgênicas de pBI121-AN90AtFTB, os níveis de expressão eram maiores que o nível do produto da transcrição de AtFTB endógeno como representado pelo controle do tipo selvagem. Isto indica que não é provável que o fenótipo de hipersensibilidade ao ABA destas linhagens transgênicas seja causado pela co-supressão transcricional. A maior resposta ao ABA se correlaciona com os resultados de outros métodos de regulação para menos de AtFTB, tais como constructos anti-sentido e de RNAi, de grampo de cabelo. É possível que a resposta de hipersensibilidade ao ABA observada nas linhagens transgênicas de AN90AtFTB seja causada por um efeito negativo dominante.

Os altos níveis de produtos da transcrição de AN90AtFTB deveríam produzir

uma abundância da forma truncada de AtFTB que pode ser ligar à AtFTA endógena e resultar na inibição competitiva da atividade da AtFTase.

Um suporte adicional para a interação da FT-B truncada com a FT-A endógena vem de um experimento de interação de duplo híbrido de levedura. O 25 uso do cDNA de AN90AtFTB como isca, identificou clones que de interação que foi descoberto que a maioria codifica FT-A.

SEQ ID N⁹: 79 Vetor Truncado de FT-B pBI121-AN90AtFTB gtfttacccgccaatatatccfgtcaaacactgatagtttaaactgaaggcgggaaacga30 caatctgatcatgagcggagaattaagggagtcacgttatgacccccgccgatgacgcgggacaagccgttttacgtttggaactgacagaaccgcaacgttgaaggagccactcagccgcgggtttctggagtttaatgagctaagcacatacgtcagaaaccattattgcgcgttcaaaagtcgcctaaggtcactatcagctagcaaatatttcttgtcaaaaatgctccactgacgttccataaattcccctcggtatccaattagagtctca35 tattcactctcaatccaaataatctgcaccggatctggatcgtttcgcatgattgaacaa-

372

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SEQ ID N0:171 REV Sítio do iniciador de sentido Saci (forward) 5' aaaggatcctcatgctgctttaaagaagaactcgat 3'

SEQ ID NO:172 FT-B de amplificação total cccgggatgccagtagtaacccgcttgattcgtttgaagtgtgtagggctcagacttgaccggagtggactcaatcggcgaatctgtcacggaggacacggggaatcaacgcggcggagagtgatggaagagctttcaagcctaaccgtgagtcagcgcgagcaatttctggtggagaacgatgtgttcgggatctataattacttcgacgccagcgacgtttctactcaaaaatacatgatggagattcagcgagataagcaattggattatctgatgaaaggcttaaggcagc374

ttggtccgcagttttcttccttagatgctaatcgaccttggctttgttactggattcttcattcaatagctttgcttggggagactgtggatgatgaattagaaagcaatgccattgacttccttggacgctgccagggctctgaaggtggatacggtggtggtcctggccaacttccacatcttgcaactacttatgctgcagtgaatgcacttgttactttaggaggtgacaaagccctttcttcaattaatagagaaaaaatgtcttgttttttaagacggatgaaggatacaagtggaggtttcaggatgcatgatatgggagaaatggatgttcgtgcatgctacactgcaatttcggttgcaagcatcctaaatattatggatgatgaactcacccagggcctaggagattacatcttgagttgccaaacttatgaaggtggcattggaggggaacctggctccgaagctcacggtgggtatacctactgtggtttggctgctatgattttaatcaatgaggtcgaccgtttgaatttggattcattaatgaattgggctgtacatcgacaaggagtagaaatgggatttcaaggtaggacgaacaaattggtcgatggttgctacacattttggcaggcagccccttgtgttctactacaaagattatattcaaccaatgatcatgacgttcatggatcatcacatatatcagaagggacaaatgaagaacatcatgctcatgatgaagatgaccttgaagacagtgatgatgatgatgattctgatgaggacaacgatgaagattcagtgaatggtcacagaatccatcatacatccacctacattaacaggagaatgcaactggtttttgatagcctcggcttgcagagatatgtactcttgtgctctaagatccctgacggtggattcagagacaagccgaggaaaccccgtgacttctaccacacatgttactgcctgagcggcttgtctgtggctcagcacgcttggttaaaagacgaggacactcctcctttgactcgcgacattatgggtggctactcgaatctccttgaacctgttcaacttcttcacaacattgtcatggatcagtataatgaagctatcgagttcttctttaaagcagcatgaggatcc

SEQ ID NO:177 Seqüência de aminioácido FT-B de amplificação total codificada pela Seq: NO:172 MPWTRLIRLKCVGLRLDRSGLNRRICHGGHGESTRRRVMEELSSLTVS25 QREQFLVENDVFGIYNYFDASDVSTQKYMMEIQRDKQLDYLMKGLRQLGPQFSSLDANRPWLCYWILHSIALLGETVDDELESNAIDFLGRCQGSEGGYGGGPGQLPHLATTYAAVNALVTLGGDKALSSINREKMSCFLRRMKDTSGGFRMHDMGEMDVRACYTAISVASILNIMDDELTQGLGDYILSCQTYEGGIGGEPGSEAHGGYTYCGLAAMILINEVDRLNLDSLMNWAVHR30 QGVEMGFQGRTNKLVDGCYTFWQAAPCVLLQRLYSTNDHDVHGSSHISEGTNEEHHAHDEDDLEDSDDDDDSDEDNDEDSVNGHRIHHTSTYINRR’ MQLVFDSLGLQRYVLLCSKIPDGGFRDKPRKPRDFYHTCYCLSGLSVAy* QHAWLKDEDTPPLTRDIMGGYSNLLEPVQLLHNIVMDQYNEAIEFFFKAA

SEQ ID NO:173 pBI121-AtFTB (Sobreexpressão do vetor de amplificação total) gtfftacccgccaatatatcctgtcaaacactgatagtttaaactgaaggcgggaaacgacaatctgatcatgagcggagaattaagggagtcacgttatgacccccgccgatga40 cgcgggacaagccgttttacgtttggaactgacagaaccgcaacgttgaaggagccactcagccgcgggtttctggagtttaatgagctaagcacatacgtcagaaaccattattgcgcgttcaaaagtcgcctaaggtcactatcagctagcaaatatttcttgtcaaaaatgctccactgacgttccataaattcccctcggtatccaattagagtctcatattcactctcaatccaaataatctgcaccggatctggatcgtttcgcatgattgaacaa45 gatggattgcacgcaggttctccggccgcttgggtggagaggctattcggctatgactgggcacaacagacaatcggctgctctgatgccgccgtgttccggctgtcagcgcaggggcgcccggttctttttgtcaagaccgacctgtccggtgccctgaatgaactgcaggacgaggcagcgcggctatcgtggctggccacgacgggcgttccttgcgcagctgtgctcgacgttgtcactgaagcgggaagggactggctgctattgggcgaagtgccggggcaggatctc-

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376

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EXEMPLO 48 Clonagem e transformação da isoprenilcisteína carboxil metiltransferase

A seqüência da isoprenilcisteína carboxil metiltransferase (ICMT) de Arabidopsis foi obtida através da amplificação pela RT-PCR utilizando o protocolo de amplificação descrito anteriormente. A seqüência foi produzida utilizando o par de iniciadores identificado pela SEQ ID N²: 174 (5aaaggatccatgacagagatcttcagtgacacca-3') e pela SEQ ID N²: 175 (5'45 aaagagctctcagttcacaaatggaacaccaga-3'). A seqüência é idêntica à relatada

377 pelo número de Acesso AB007648, Gl:10177821 (dezembro de 2000).

A seqüência isolada foi utilizada para gerar vetores de transfor-

mação de plantas planejados para expressar a proteína codificada ou para regular para menos a expressão. Os vetores foram utilizados para transformar Arabidopsis através do método de mergulho das flores descrito em outro lugar. As plantas transformadas foram selecionadas e propagadas. As análises moleculares e fisiológicas das linhagens transgênicas podem ser realizadas como detalhado em outros exemplos. Tais análises podem incluir: estudos moleculares tais como as análises da PCR, de Southern, de Northern e de Western; análises fisiológicas tais como: estudos do crescimento, tolerância ao estresse ambiental (seca, sal, calor, frio), tolerância ao estresse biótico, ao estresse nutricional assim como as análises bioquímicas. SEQ ID N^e: 176 atgacagagatcttcagtgacaccagcatcagacagttatctcaaatgctactatcactaa15 tcttcttccacatatccgaatacattctagccatcaccattcacggagcatcaaacgtaactcttagttcgcttttaatcaccaagcattacgctttagcaatgcttctgtcgcttctcgaatacctaacggagattatcctcttcccggggctgaaacaacactggtgggtcagcaactttggactcataatgatcatcgttggggaaatcatcaggaaggcagcgataataacagcgggaagatcgttcactcacctcataaagatcaactacgaagagcatcacgggc20 ttgtgactcatggtgtgtatagactaatgaggcatccaagttactgcggttttctcatctggtcggtcgggacacaagttatgctctgtaaccccgtttcagcagttgcgttcgcggttgtcgtgtggcggttttttgctcagagaataccgtacgaggagtattttctgaatcagttttttggggtacagtatctagagtatgcagagagtgttgcctctggtgttccatttgtgaactga

378

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Todas as citações neste pedido de patente aos materiais e métodos são incorporadas aqui como referência.

EQUIVALENTES

Os versados na técnica reconhecerão ou serão capazes de verificar utilizando não mais que experimentos de rotina, muitos equivalentes para as modalidades específicas da invenção descritas especificamente aqui. Pretende-se que tais equivalentes estejam abrangidos no âmbito das reivindicações a seguir.

Claims (3)

1. Processo de produção de uma planta transgênica tendo sensibilidade ao ABA aumentada, em que a dita planta possui um fenótipo alterado selecionado do grupo que consiste em maior tolerância ao estresse,

5 senescência retardada, maior sensibilidade ao ABA, maior rendimento, maior produtividade, e maior biomassa comparada com uma planta do tipo selvagem, caracterizado pelo fato de que compreende: a introdução em uma célula vegetal de um ácido nucleico isolado compreendendo SEQ ID NO: 176 ou um fragmento do mesmo que inibe a farnesilação de um polipeptídeo 10 que possui um motivo CaaX no terminal carboxila para gerar uma planta transgênica; e a regeneração de uma planta transgênica partindo da dita célula transgênica.

2. Processo da reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o ácido nucleico está ligado de forma operacional a um promotor que é ativo

15 na dita célula vegetal.

3. Processo da reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o dito promotor é selecionado do grupo que consiste em um promotor constitutivo, um promotor que pode ser induzido por ABA, promotores específicos ao tecido , e um promotor específico a células guardas.