BRPI0308507B1 - engenharia metabólica para a utilização de xilose aperfeiçoada de saccharomyces cerevisiae - Google Patents

Abstract

"engenharia metabólica para a utilização de xilose aperfeiçoada de saccharomyces cerevisiae". a presente invenção se refere a um método para a preparação de uma cepa de saccharoniyces cerevisiae que produz etanol, cepa que opcionalmente utiliza xilose, compreendendo genes para a super expressão de xilose redutase, de xilitol desidrogenase e de xiluloquinase. em concordância com a presente invenção, o referido método está caracterizado pelo fato de que em adição aos referidos genes, os genes para a produção de fosfoacetil-transferase, e de acetaldeído desidrogenase são introduzidos e, opcionalmente super expressados. a presente invenção se refere à utilização de uma levedura recombinante. também em concordância com,a presente invenção, a referida utilização está caracterizada pelo fato de que a levedura é preparada em concordância com o método descrito acima, para a produção de etanol opcionalmente contendo xilose em meio de crescimento, e/ou para a produção de etanol contendo xilose em meio de crescimento.

Description

"ENGENHARIA METABÓLICA PARA A UTILIZAÇÃO DE XILOSE APERFEIÇOADA DE SACCHAROMYCES CEREVISIAE" DESCRIÇÃO DA PRESENTE INVENÇÃO

Campo técnico da presente invenção A presente invenção se refere a uma cepa para a utilização de xilose aperfeiçoada pela Saccharomyces cerevisiae recombinante.

Panorama da presente invenção A crise de petróleo no inicio dos anos 1.970 iniciou uma intensa busca por uma alternativa ao petróleo como combustível de automóvel. 0 etanol emergiu como um bom candidato, desde que ele pode, em uma grande extensão, substituir o petróleo sem grandes modificações de motores de combustão. Ele pode ser produzido a partir de biomassa lignocelulósica, renovável, tal como os resíduos de agricultura e de florestas. Diferentemente do petróleo, o etanol produzido a partir de fonte renovável, não determina uma contribuição em rede de dióxido de carbono para a atmosfera e deveria, conseqüentemente, não contribuir para o aquecimento global. A Suécia almeja substituir 15 % dos combustíveis fundamentados em petróleo com combustíveis derivados de fontes renováveis em torno de 2.010 (Kommunikationskommitén, 1.996).

Adicionalmente, o etanol pode substituir algum do combustível (gasolina) nos motores de hoje em dia sem quaisquer ajustamentos de qualquer modo, ou pelo menos ajustamentos muito pequenos. O material lignocelulósico contém principalmente celulose, hemicelulose e lignina. Na média, madeira em peso seco consiste de 40 % de celulose, 18 % de hemicelulose e 22 % de lignina (Taherzadeh, e outros, 1.997). A celulose é composta de resíduos de glucose, enquanto a hemicelulose é um hetero polímero consistindo de hexoses (manose e galactose) e de pentoses (xilose e arabinose). A lignina é um polímero aromático heterogêneo feito de precursores de fenil propanóides.

Para liberar as hexoses e as pentoses fermentáveis, o material lignocelulósico é hidrolisado (Saddier, e outros, 1.993; Stenberg, e outros, 1.998; Tengborg, e outros, 1.998). Durante a hidrólise, as substâncias inibidoras de fermentação como os fenólicos, os derivados de furano (furfural e hidroximetil furfural) e os ácidos (ácido acético, ácido fórmico e ácido levulínico) são formados a partir de componentes no material lignocelulósico (Larsson, e outros, 1.999; Palmgvist e Hahn-Hãgerdal, 2.000a; Palmqvist e Hahn-Hãgerdal, 2.000b). 0 etanol é um produto de baixo valor onde a matéria prima contabiliza para uma grande fração do custo total. Portanto, a utilização eficiente de matéria prima é de importância crucial para um processo economicamente conceptível (Hinman, e outros, 1.989; von Sivers e Zacchi, 1.996). Um microorganismo ideal para utilizar para a fermentação de material lignocelulósico deveria: (I) possuir uma abrangente faixa de substrato e fermentar todos os açúcares para etanol, preferivelmente com alto rendimento e produtividade e (II) sobreviver em um hidrolisado com inibidores de fermentação.

Os microorganismo considerados para a fermentação de material lignocelulósico incluem Escherichia coli (Moniruzzaman, e outros, 1.996), Klabsiella oxytoca (Moniruzzaman, e outros, 1.996), Zymomonas mobilis (Bothast, e outros, 1.999), Pichia stipitis (Ferrari, e outros, 1.992) e Saccharomyces cerevisiae (Bjõrling e Lindman, 1.989; Olsson e Hahn-Hágerdal, 1.993;

Moniruzzaman, e outros, 1.996; Taherzadeh, e outros, 1.999; e Hahn-Hágerdal, e outros, 2.001). O homem utilizou a levedura S. cerevisiae para a fabricação de pão e para a produção de bebidas alcoólicas por milhares de anos. A S. cerevisiae cresce anaerobicamente em glucose (Andreasen e Stier, 1.953; Andreasen e Stier, 1.954; Visser, e outros, 1.990) e produz etanol a partir de glucose com alto rendimento e alta produtividade (Kolot, 1.980).

Adicionalmente, a S. cerevisiae está adaptada para altas concentrações de etanol (Jones, 1.989) e possui melhor tolerância em direção aos inibidores de fermentação comparada com as bactérias (Olsson e Hahn-Hágerdal, 1.993) e outra levedura (Bjõrling e Lindman, 1.989; Olsson e Hahn-Hágerdal, 1.993). Entretanto, diferentemente de bactérias e de várias cepas de levedura (Skoog e Hahn-Hágerdal, 1.988), tipos selvagens de S. cerevisiae podem não utilizar pentoses como xilose e arabinose. Ainda mais, depois da introdução de genes que codificam enzimas que catalisam etapas em utilização de pentose inicial, o crescimento e o rendimento de etanol de S. cerevisiae recombinante foram empobrecidos. Estão descritos aqui os esforços que se empreenderam para analisar a utilização de xilose pela S. cerevisiae recombinante e para aperfeiçoar a sua habilidade de utilização de xilose.

Engenharia metabólica para aperfeiçoar a utilização de xilose em Saccharomyces cerevisiae Com a introdução da tecnologia de DNA recombinante se tornou possível clonar genes a partir de um organismo e transferir os genes para um outro organismo, excluir genes no genoma e também variar os níveis de expressão dos genes. É, por conseqüência, posssível realizar modificações direcionadas de rotas metabólicas. Esta nova disciplina é chamada de Engenharia Metabólica e foi definida como "Aperfeiçoamento de atividades celulares pela manipulação de funções enzimáticas, de transporte, e reguladoras da célula com a utilização de tecnologia de DNA recombinante" (Bailey, 1.991) e "Modificação intencional de metabolismo intermediário utilizando técnicas de DNA recombinante" (Cameron e Tong, 1.993). Como todos os campos clássicos de engenharia, a engenharia metabólica está caracterizada pelo fato de que uma etapa de análise e uma etapa de síntese (Bailey, 1.991; Stephanopoulos, 1.994; Nielsen, 1.998). Na etapa de análise, o microorganismo está fisiologicamente caracterizado e avaliado utilizando, por exemplo, MFA (análise de fluxo metabólico), mensurações de atividade enzimática ou análises de expressão (Nielsen, 2.001). A análise proporciona informação sobre onde modificações genéticas podem aperfeiçoar a performance do microorganismo. A etapa de síntese envolve a construção de uma cepa, com modificações genéticas fundamentadas sobre a análise, utilizando tecnologia de DNA recombinante. A nova cepa recombinante é então analisada utilizando a mesma metodologia como para a sua cepa paterna. Se a análise revela que aperfeiçoamento adicional é requerido, novos alvos para a manipulação genética são identificados seguidos por uma nova rodada de sínteses e de análises. 0 ciclo Análise - Genética Projeto - Síntese é repetido até que a propriedade desejada é obtida. A engenharia metabólica foi o assunto de muitos artigos (Cameron e Tong, 1.993; Nielsen, 2.001; Stephanopoulos, 1.999). Irá focalizar-se aqui como esta abordagem foi aplicada para gerar cepas de S. cerevisiae utilizando xilose.

Rotas para a utilização de xilose A utilização de xilose é muito difundida entre bactérias. A etapa inicial em utilização de xilose bacteriana é a sua isomerização para xilulose pela xilose isomerase (XX) (Hochster e Watson, 1.954) (FIGURA 1). Algumas espécies de levedura e de fungos filamentosos crescem em xilose como a única fonte de carbono. A levedura e os fungos filamentosos primeiro reduzem xilose para xilitol utilizando xilose redutase (XR) e depois disso xilitol é oxidado para xilulose pela xilitol desidrogenase (XDH) (Chiang e Knight, 1.960) (FIGURA 1). A S. cerevisiae foi considerada não ter a capacidade de crescimento em xilose (Wang e Schreider, 1.980), mas cresceu em xilulose (Wang e Schreider, 1.980) e produziu etanol a partir deste substrato (Chiang, e outros, 1.981). Foi mais tarde descoberto que a S. cerevisiae possui enzimas com atividades de XR (Batt, e outros, 1.986; Kuhn, e outros, 1.995) e de XDH (Batt, e outros, 1.986; Richard, e outros, 1.999) e consumia baixas quantidades de xilose quando cometabolizada com glucose, galactose ou ribose (van Zil, e outros, 1.989; van Zil, e outros, 1.993). A utilização de xilulose sugere uma conexão entre a xilulose e o metabolismo central. 0 gene de S. cerevisiae XKS1 codifica a enzima xiluloquinase (XK) (Ho e Chang, 1.989; Rodriguez-Pena, e outros, 1.998), que fosforilaza xilulose para xilulose 5-fosfato. Na maior parte dos microorganismos xilulose 5-fosfato é metabolizada através da rota de pentose fosfato (PPP) (FIGURA 2) , mas algumas bactérias, notadamente bactérias de ácido lático, possuem uma fosfocetolase que cliva (quebra) xilulose 5-fosfato em gliceraldeido 3-fosfato e acetil fosfato. Existem muitos relatos sobre a atividade de fosfocetolase em levedura (Whitworth e Ratledge, 1.977; Evans e Ratledge, 1.984; Ratledge e Holdsworth, 1.985), mas a levedura provavelmente também utiliza PPP para metabolizar xilulose 5-fosfato (Lighthelm, e outros, 1.988).

Embora tipos selvagens de S. cerevisiae tenham enzimas que possuem as atividades da rota de utilização de xilose inicial, as suas atividades são excessivamente baixas para possibilitar o crescimento em xilose e, conseqüentemente, a S. cerevisiae foi transformada com genes heterólogos que codificam XI e XR/XDH. As xilose isomerases a partir de várias bactérias foram clonadas e introduzidas em S. cerevisiae (Ho, e outros, 1.983; Sarthy, e outros, 1.987; Ãmore, e outros, 1.989; Moes, e outros, 1.996), mas somente xylA a partir de bactéria termofilica Thermus thermophilus gerou uma enzima ativa em S. cerevisiae (Walfridsson, e outros, 1.996). 0 transformante teve a capacidade para consumir três vezes mais xilose do que uma cepa de controle. A XI a partir de Thermus thermophilus possuia somente atividade de traço a 30 °C, enquanto a mais alta atividade enzimática foi obtida a 85 °C.

As XRs a partir de diferentes microorganismos foram caracterizadas e elas compartilham uma característica comum nas suas preferências por NADPH como um cofator. A aldose redutase não específica de S. cerevisiae possuindo atividade de XR (Kuhn, e outros, 1.995) e de XR a partir de Candida utilis (Bruinenberg, e outros, 1.983) utiliza exclusivamente NADPH, enquanto a XR a partir de P. stipitis (Verduyn, e outros, 1.985b; Rizzi, e outros, 1.988) e a partir de Candida tenius (Neuhauser, e outros, 1.997) tem também a capacidade para utilizar NADH. A proporção da atividade específica de XR a partir de P. stipitis utilizando NADH e NADPH separadamente foi aproximadamente de 0,65, sem consideração da tensão de oxigênio no meio (Skoog e Hahn-Hàgerdal, 1.990). A P. tannophilus produz duas isoenzimas de XR, uma das quais pode utilizar tanto NADH e quanto NADPH, enquanto a outra é estritamente dependente de NADPH (Verduyn, e outros, 1.985a). A limitação em oxigênio favorece a enzima utilizando ambos os cofatores (VanCauwenberge, e outros, 1.989). Diferentemente de XR, XDH a partir de todos os microorganismos estudados quase que somente utiliza NAD+ como cofator (Bruinenberg, e outros, 1.983; Bruinenberg, e outros, 1.984; Richard, e outros, 1.999; Rizzi, e outros, 1.989b). A S. cerevisiae foi transformada com os genes de P. stipitis XYLl e XYL2 que codificam para XR e para XDH, respectivamente, (Kõtter e Ciriacy, 1.993; Tantirungkij, e outros, 1.993; Walfridsson, e outros, 1.995). A escolha de P. stipitis como o organismo doador foi fundamentada sobre a sua capacidade de utilizar NADH na etapa de redução de xilose. A fermentação de xilose etanólica com cepas de S. cerevisiae recombinantes que produzem XR/XDH resultou em baixo rendimento de etanol e em considerável formação de subproduto de xilitol. Isto é atribuído a: (I) transporte de xilose insuficiente; (II) termodinâmicas desfavoráveis na conversão de xilose a xilulose; (III) desbalanço de cofator nas reações de XR/XDH; e (IV) um subdesenvolvimento de PPP.

Transporte de xilose A S. cerevisiae não possui transportadores específicos para xilose, que é ao invés disso transportada através de difusão facilitada pelos transportadores de hexose. Estes possuem até 100 vezes afinidade mais baixa para xilose do que para glucose (Kotyk, 1.967; Cirillo, 1.968; Busturia e Lagunas, 1.986; Kõtter e Ciriacy, 1.993), e conseqüentemente, xilose é menos eficientemente transportada dentro da célula quando tanto a glucose e quanto a xilose estão presentes no meio. Em um cultivo quimio-estático anaeróbico da S. cerevisiae recombinante, utilizando xilose, TMB 3001, utilizando a glucose e a xilose na alimentação, a absorção específica de xilose aumentou com taxa de diluição mais baixa e concentração de alimentação de xilose mais alta. A concentração de glucose residual diminuiu com taxa de diluição mais baixa e uma concentração de glucose mais baixa favorecida em absorção de xilose. A absorção de xilose foi também menos eficiente do que aquela de glucose durante a fermentação anaeróbica de S. cerevisiae TMB 3399 e TMB 3400.

Estes resultados sugerem que a baixa afinidade para xilose poderia conferir para a etapa de transporte controle significativo do fluxo metabólico. Entretanto, uma investigação demonstrou uma capacidade de transporte 30 vezes mais alta para a xilose do que a taxa efetiva de consumo de xilose {Kõtter e Ciriacy, 1.993), de maneira que o impacto de transporte de xilose sobre o fluxo global de xilose é ainda nâo evidente.

Tei^odiíiâjnica de utilização de xilose A constante de equilíbrio para a redução de xilose para xilitol foi estimada ser de 0,575 x 103 em pH 7 (Rizzi, e outros, 1.988), e para a subseqüente oxidação de xilitol para xilulose, a constante de equilíbrio em pH 7 é de 6,9 x 10-4 [Rizzi, e outros, 1.989a). Por conseqüência, ambas as reações favorecem a formação de xilose e a termodinâmica da reação de XDH é desfavorável na direção de fermentação etanólica. É, entretanto, desapropriado considerar uma rota termodinamicamente não conceptivel fundamentado sobre a presença de reações com constantes de equilíbrio desfavoráveis. Em concordância com a Segunda Lei da Termodinâmica, processo espontâneo ocorre na direção que aumenta a desordem global (ou entropia) do universo. Um critério mais conveniente para a reação termodinamicamente conceptivel é uma energia livre de Gibbs negativa {AG) . Considere-se a reação única: oA + bB——>cC + dD ou cC+dD-b£-aÁ = G

Se for assumido que os sistemas biológicos são soluções diluídas e, consequentemente, que os coeficientes de fugacidade e de atividade são iguais a 1, a energia livre de Gibbs para uma reação química, AG, ê definida como· se segue: Portanto, AG é influenciada pela energia livre de Gíbbs padrão (standard) (AG°) bem como pela concentração dos metabólitos envolvidos na reação.

Um algoritmo foi desenvolvido para calcular a faixa de concentração de metabólito permitida onde todas as reações em uma rota possuem uma AG negativa, e portanto, tornam a rota conceptível (Mavrovouniofcis, 1.993). Quando este algoritmo foi aplicado para as reações que convertem xilose em piruvato utilizando a rota ilustrada na FIGURA 2, as reações entre desídroxiacetona fosfato e 1,3-gliceraldeído bifosfato impuseram as maiores restrições termodinâmicas. Desde que as mesmas reações foram responsáveis pelas maiores restrições termodinâmicas em conversão de glucose para piruvato (Mavrovouniotis, 1,993) foi concluído que a conversão de xilose para piruvato não introduz novos gargalos termodinâmicos. As reações fortemente favoráveis de XR e de XK que ocorrem antes e depois da reação de XDH compensaram para a termodinâmica desfavorável da reação de XDH.

Desbalanço de cofator Um desbalanço de cofator aparece a partir do fato de que a reação de XR preferivelmente consome NAJDPH, enquanto a reaçao de XDH produz exclusivamente NÃDH, Quando menos ΝΑΏΗ é consumida na reação de XR, menos NAD* está disponível para a reação de XDH. 0 excesso de NADH gerado nas reações de XR/XDH não· pode ser regenerado para NAD* pela reação catalisada pela álcool desidrogenase (ADH) , desde que esta reação oxida a NADH formada na reação de gliceraldeído 3-fosfato (FIGURA 2) . Se a quantidade de NAD+ é insuficiente, o xilitol se acumula e é excretado (Bruinenberg, e outros, 1.983). A XR e a XDH foram submetidas à engenharia de proteína (Webb e Lee, 1.982; Metzger e Hollenberg, 1.995; Zhang e Lee, 1.997; Kostrzynska, e outros, 1.998) para enganar o desbalanço de cofator. A mutagênese direcionada em sítio foi utilizada em uma tentativa para alterar a preferência de cofator de XR a partir de NADPH para NADH. A enzima resultante perdeu de 80 % - 90 % de sua atividade específica e a afinidade para xilose diminuiu em mais do que dez vezes (Kostrzynska, e outros, 1.998). A afinidade para NADPH diminuiu, mas permaneceu constante para NADH. Tentativas também foram feitas para alterar a especificidade de cofator de XDH na direção de NADP+ ao invés de NAD+. Entretanto, a afinidade para NADP+ permaneceu não modificada, enquanto a afinidade para NAD+ diminuiu em nove vezes e a atividade específica das XDHs mutagenadas diminuiu entre 50 % e 70 % daquela da enzima original (Metzger e Hollenberg, 1.995).

As preferências para NADPH na reação catalisada em XR e para NAD+ na reação catalisada em XDH, respectivamente, poderíam possuir uma origem termodinâmica. Nas células de S. cerevisiae crescidas anaerobicamente em glucose, a proporção de NADPH para NADP+ é de cerca de 5, ao passo que a proporção de NADH para NAD* é de cerca de 0,15 (Anderlund, e outros, 1.999). Se estas proporções forem assumidas para também serem válidas para a fermentação de xilose, utilizando NADPH para a redução de xilose e NAD+ para a oxidação de xilitol, as reações catalisadas pela XR e pela XDH se tornam termodinamicamente conceptíveis ao longo de uma faixa maior de concentrações de metabólito comparadas com a utilização de qualquer outra combinação de cofatores nestas reações. A análise de fluxo metabólico de S. cerevisiae TMB 3001, crescida anaerobicamente em cultivo quimio-estático, revelou uma utilização flexível de NADH e de NADPH na reação de XR. 0 fluxo de redução de xilose mediada por NADPH diminuiu com a taxa de diluição aumentando, enquanto o fluxo de redução de xilose mediada por NADH permaneceu constante. 0 conteúdo de RNA e de proteína da biomassa aumentou com a taxa de diluição, o que conduz a uma demanda mais alta de NADPH, e deixa menos NADPH para a reação de XR. Com a concentração de xilose aumentando na alimentação, seguida por um fluxo mais alto de redução de xilose utilizando NADH. A relação em atividades entre XR, XDH e XK foi manipulada para diminuir a formação de xilitol (Walfridsson, e outros, 1.997; Eliasson, e outros, 2.001). Um modelo cinético fundamentado sobre dados de cinética divulgados para as três enzimas indicadas como proporção de atividade otimizada de XR : XDH : XK de 1 : 10 : 4, modelo cinético que foi também confirmado experimentalmente (Eliasson, e outros, 2.001). 0 modelo cinético também mostrou que a proporção de NADH/NAD+ fortemente influenciou a proporção otimizada. Por outro lado, a levedura natural P. stipitis utilizando xilose possui atividade de XR mais alta do que atividade de XDH sob todos os níveis de oxigenação e não excreta xilitol ainda mesmo durante a anaerobiose, (Lighthelm, e outros, 1.988). Foi demonstrado que P. stipitis estritamente utiliza NADH para a redução de xilose durante a anaerobiose (Lighthelm, e outros, 1.988). A NADH é oxidada para NAD+ na presença de um aceptor (receptor) de elétron. Quando presente, o oxigênio regenera NAD+ na cadeia de transporte de elétron. Durante o cultivo limitado em oxigênio de S. cerevisiae TMB 3001, a oxigenação aumentada conduz a um rendimento aproximadamente constante de etanol, enquanto os rendimentos de glicerol e de xilitol diminuiram (Eliasson, e outros, 2.001). A adição de receptores de elétrons externos de acetaldeido (Lighthelm, e outros, 1.989) e de acetoina (Bruinenberg, e outros, 1.983; Lighthelm, e outros, 1.989) para a fermentação de xilose pelas leveduras P. tannophilus e C. utilis fermentando xilose naturalmente regeneraram NAD+ e preveniram acumulação de xilitol extracelular. Também em S. cerevisiae TMB 3001 a excreção de xilitol anaeróbica diminuiu sob a adição de acetoina e, como com C. utilis, existiu um aumento marcante na produção de acetato (Bruinenberg, e outros, 1.983). Portanto, a resposta de S. cerevisiae recombinante sobre a adição de acetoina foi similar para aquela das leveduras naturais utilizando xilose. 0 furfural, que é produzido no pré-tratamento de material lignocelulósico (Larsson, e outros, 1.999) e que mostrou ser um inibidor de fermentação etanólica pela S. cerevisiae (Larsson, e outros, 1.999; Sanchez e Bautista, 1.988, Taherzadeh, e outros, 1.999) também diminuiu a formação de xilitol. A MFA de adição de acetoina para S. cerevisiae TMB 3001 cultivada anaerobicamente em xilose mostrou um fluxo aumentado para etanol e que NADPH foi produzida na conversão de acetaldeido para acetato ao invés de na PPP oxidativa. Como uma conseqüência, mais carbono é canalizado através da parte inferior de glicólise onde ATP é produzida. A produtividade de ATP aumentou a partir de 0,9 mmol de ATP (g biomassa h)_1 para 1,8 mmol de ATP (g biomassa h)”1, mas ainda assim nenhum crescimento foi detectado. A interpretação destes resultados foi a de que a ATP não é limitante de crescimento anaeróbico em xilose de S. cerevisiae TMB 3001. A PPP subdesenvolvida A S. cerevisiae recombinante, como oposta para a P. stipitis natural utilizando xilose, acumula a sedoheptulose 7-fosfato intermediária quando cultivada em xilose (Kõtter e Ciriacy, 1.993). Foi sugerido que a S. cerevisiae possui uma PPP subdesenvolvida e especialmente atividade de transaldolase (TAL) insuficiente. A super expressão de TAL determinou melhor crescimento em xilose, mas não aperfeiçoou a produção de etanol (Walfridsson, e outros, 1.995) . Durante o cultivo de S. cerevisiae TMB 3001 em uma mistura de glucose e de xilose, o fluxo entre ribulose 5-fosfato e xilulose 5-fosfato foi muito baixo em todas as taxas de diluição e de concentrações de xilose. Em glucose esta reação prossegue na direção a partir de ribulose 5-fosfato para xilulose 5-fosfato. A utilização de xilose sem a excreção de xilitol requer que esta reação prossiga na direção oposta, a partir de xilulose 5-fosfato para ribulose 5-fosfato. A super expressão de ribulose 5-fosfato-3-epimerase (RPE) em S. cerevisiae TMB 3001 não aumenta a utilização de xilose (Johansson, 2.001). Ainda assim, esta enzima merece atenção. A S. cerevisiae RPE possui um valor de Km de 1,5 mM (Bar, e outros, 1.996) - 2,4 mM (Kiely, e outros, 1.973) para ribulose 5-fosfato, mas não existem relatos sobre seu valor de Km para xilulose 5-fosfato. Se a RPE em S. cerevisiae possui uma afinidade significativamente mais baixa (= mais alto Km) para xilulose 5-fosfato do que para ribulose 5-fosfato, isto deveria significar uma atividade especifica mais baixa para converter xilulose 5-fosfato para ribulose 5-fosfato e, por conseqüência, uma utilização de xilose diminuída.

Os organismos naturais que fazem utilização de xilose poderíam muito bem possuir RPEs com afinidades mais altas para xilulose 5-fosfato do que a RPE de S. cerevisiae.

Descrição detalhada da presente invenção Foi agora descoberto ser possível aperfeiçoar a produção de etanol em concordância com a presente invenção, por uma cepa para a preparação de uma produção de etanol, opcionalmente cepa de Saccharomyces cerevisiae utilizando xilose, compreendendo genes para a super expressão de xilose redutase, xilitol desidrogenase e xiluloquinase, que está caracterizado pelo fato de que em adição aos referidos genes, os genes para a produção de fosfoacetiltransferase, e de acetaldeído desidrogenase são introduzidos e, opcionalmente super expressados, seguindo uma nova rota metabólica para a regeneração de NAD+.

Em uma concretização preferida da presente invenção, um gene para a produção de fosfocetolase é introduzido e, opcionalmente, super expressado.

Em concordância com uma concretização preferida da presente invenção, os genes para a produção de fosfocetolase, de fosfoacetiltransferase (também chamada de fosfotransacetilase) , e de acetaldeido desidrogenase são derivados a partir de qualquer organismo procariótico.

Em concordância com uma concretização preferida adicional da presente invenção, o gene que codifica para fosfocetolase é clonado a partir de qualquer bactéria de ácido lático hetero fermentativa, por intermédio do que preferivelmente a bactéria de ácido lático hetero fermentativa é selecionada a partir do grupo consistindo de Lactobacillus pentosus, de Lactobacillus plantarum, e de Leuconostoc mesenteroides.

Em concordância com uma concretização preferida da presente invenção, os genes que codificam para fosfato acetiltransferase são clonados a partir de qualquer bactéria que produz etanol, por intermédio do que preferivelmente os genes que codificam para fosfato acetiltransferase são clonados a partir de protozoários de Entamoeba histolytica e de Giardia lablia.

Em concordância com uma concretização preferida adicional da presente invenção, o(s) gene(s) que codifica(m) para acetaldeido desidrogenase (é)são clonado(s) a partir de qualquer bactéria que produz etanol, ou acetaldeido desidrogenase (de acilação) pode ser adicionada como tal.

Em uma concretização preferida da presente invenção, o gene que codifica para acetaldeido desidrogenase é clonado a partir de Entamoeba histolytica.

Um aspecto adicional da presente invenção abrange a utilização de uma levedura recombinante preparada em concordância com a presente invenção, para a produção de etanol opcionalmente contendo xilose em meio de crescimento.

Uma nova rota metabóllca para a regeneração de NAD+ Em cepas de S. cerevisiae recombinante, produzindo XR e produzindo XDH, a regeneração de NAD+ é a chave para a conversão de xilose para etanol sem a formação de subproduto de glicerol ou de xilitol. Como apresentado em seções precedentes, os investigadores tentaram a regeneração de NAD+ na reação catalisada em XR pelo aumento da afinidade por NADH de XR ou pela adição de receptores de elétrons externos, a redução dos quais consome NADH. Uma rota ideal utilizando xilose possibilita a estrita utilização de NADPH para XR e regenera NAD+ para a reação de XDH em outra parte no metabolismo, de maneira que receptores de elétrons externos não são requeridos. Isto pode ser conseguido pela incorporação de partes da rota de fosfocetolase em S. cerevisiae (FIGURA 3) . Se os genes que codificam fosfocetolase (E.C 4.1.2.9) , fosfato acetiltransferase (E.C 2.3.1.8) e acetaldeido desidrogenase (de acilação) (E.C 1.2.1.10) são transformados em S. cerevisiae, NADH em excesso pode ser regenerada em NAD+.

No caso extremo de uma NADPH estritamente utilizando XR, um terço da xilulose 5-fosfato é clivada (quebrada) para gliceraldeido 3-fosfato e acetil fosfato. 0 gliceraldeido 3-fosfato é redox neutralizadamente convertido para etanol, enquanto o acetil fosfato é primeiro convertido para a acetil coenzima A, que é posteriormente convertida para o acetaldeido e o etanol utilizando uma NADH em cada etapa. A termodinâmica da reação de fosfocetolase (Thauer, e outros, 1.977), da reação de acetil transferase (Rado e Hoch, 1.973) e da reação de álcool desidrogenase (Burton, 1.974) são favorecidas na direção de formação de produto. Utilizando esta rota, o rendimento de ATP é de 1,17 mol de ATP mol de xilose-1 comparado com o rendimento teórico máximo de 1,67 mol de ATP mol de xilose-1. 0 rendimento de etanol é, entretanto, o rendimento teórico, de 1,67 mol de etanol mol de xilose-1, ou 0,51 g de etanol g de xilose-1. Em adição, para a regeneração de NAD+, a introdução desta rota serve como uma rotina alternativa para a PPP para a utilização de xilose. As possíveis limitações na PPP não oxidativa poderíam, por conseqüência, serem menos pronunciadas.

Nesta rota de fosfocetolase hipotética, a NADH formada como um resultado do desbalanço de cofator nas reações de XR/XDH, mas também a NADH formada a partir da biosíntese de amino ácido (Jones e Fink, 1.982), pode ser regenerada para formar NAD+. A produção de glicerol podería então ser eliminada em fermentação de glucose para etanol, por intermédio disso aumentando o rendimento e a proficuidade (rendibilidade) do processo de fermentação etanólica. A fosfocetolase foi relatada como sendo essencial para o crescimento bem sucedido de levedura em xilose (Evans e Ratledge, 1.984a), mas a redox neutralidade é somente obtida em combinação com uma acetaldeído desidrogenase de acilação. Um efeito adicional da expressão desta enzima é a possibilidade de conversão extracelular de acetato em etanol (FIGURA 3) . O acetato é convertido para a acetil coenzima A pela ACS1 (De Virgílio, e outros, 1.992) e pela ACS2 (Van den Berg e Steensma, 1.985) e poderia depois disso ser reduzida para o etanol, como foi descrito anteriormente. Um mol de NAD+ é regenerado ao custo de um mol de ATP. Desde que um mol de NAD+ extra podería garantir a assimilação de um mol de xilitol que pode determinar 1,67 mol de ATP (FIGURA 3), o ganho em rede para a célula é de 0,67 mol de ATP. Adicionalmente, o efeito benéfico de expressão de uma acetaldeído desidrogenase de acilação é de duas vezes. Devido à regeneração de NAD+, menos xilitol é excretado e o rendimento de etanol é aumentado, e adicionalmente, o acetato, que está presente no hidrolisado lignocelulósico (Larsson, e outros, 1.999) e que é considerado um inibidor (Larsson, e outros, 1.999), é reduzido e o hidrolisado é por intermédio disso detoxifiçado.

Para gerar esta nova rota metabólica em S. cerevisiae, a acetaldeído desidrogenase (de acilação) a partir de Lactococcus lactis (Bolotin, e outros, 2.001) (número de acesso GenBank AE006444) e a partir de Clostridium acetobutylicum (Toth, e outros, 1.999) (número de acesso GenBank AF132754) e o suposto gene de fosfocetolase a partir de Schizosacharomyces pombe (número de acesso GenBank AL031786) foram amplificadas com PCR (FIGURA 5) e clonados em vetores de multicópia sob o controle de forte promotor de GPD (Mumberg, e outros, 1.995). A S. cerevisiae foi transformada com os plasmídeos, mas nem em um ou nem em outro caso a atividade enzimática correspondente poderia ser detectada.

Ambas as acetaldeído desidrogenases eram de origem bacteriana e a deficiência de atividade poderia ser devida às diferentes utilizações de códon, à degradação proteolítica ou à incorreta modificação pós-translacional em S. cerevisiae. A fosfocetolase a partir de Bifidobacterium lactis foi clonada e seqüenciada (Melle, e outros, 2.001). Uma seqüência similar (identidade em amino ácido de 37 %) foi descoberta na levedura de Schizosacharomyces pombe e é designada como uma "suposta fosfocetolase". A decisão de clonar o gene de suposta fosfocetolase a partir de S. pombe ao invés de B. lactis foi fundamentada sobre as tentativas que falharam precedentemente para clonar as acetaldeido desidrogenases bacterianas. Em S. cerevisiae não existe seqüência similar para o gene que codifica B. lactis, mas a seqüência de suposta fosfocetolase a partir de S. pombe mostra 28 % de homologia com o produto de gene que codifica transcetolase (TKL2) em S. cerevisiae. Por conseqüência, o gene de suposta fosfocetolase em S. pombe podería ser uma transcetolase. Estudos adicionais têm que ser empreendidos para demonstrar a conceptibilidade desta rota.

Mutagênese aleatória Em teoria, o conceito de engenharia metabólica é simples e direto: análise da rota metabólica do microorganismo sm, gene(s) alvo(s) para a super expressão/eliminação, criação da cepa recombinante e a sua avaliação (Nielsen, 2.001). Repetição do procedimento se o objetivo não foi conseguido. Na realidade, o sucesso da engenharia metabólica é altamente dependente da correta identificação do gene almejado para a eliminação/super expressão, correta expressão e duplicação das proteínas heterólogas e a correta localização de uma proteína super expressada (Balley, e outros, 1.996). As enzimas de acetaldeido desidrogenase a partir de L. lactis e a partir de C. acetobutylicum e a suposta fosfocetolase a partir de S. pombe não mostram atividade em S. cerevisiae [Seção 2.6]. Adicionalmente, as xilose isomerases a partir de numerosas bactérias foram clonadas e introduzidas em S. cerevisiae (Ho, e outros, 1.983; Amore, e outros, 1.989; Sarthy, e outros, 1.987), e somente foi relatado mostrar baixa atividade enzimática (Walfridsson, e outros, 1.996). Resultados desapontadores podem ocorrer, embora a expressão de gene seja bem sucedida. A super expressão de genes individuais na glicólise mais baixa em S. cerevisiae sucedeu em aumento da atividade das enzimas correspondentes, mas não aperfeiçoou a taxa de crescimento em glucose como foi antecipado (Schaaff, e outros, 1.989). Entretanto, embora os resultados não tenham sido como esperados, eles podem ainda assim serem de importância.

Antes da introdução da moderna tecnologia de DNA, a mutagênese aleatória e a subseqüente seleção foram utilizadas para aperfeiçoar industrialmente importantes microorganismos. A mutagênese aleatória em combinação com uma pressão de seleção foram um pré-requisito não somente para a evolução de microorganismos, mas também para todas as espécies sobre a Terra. Se uma mutação conduz a uma capacidade aperfeiçoada para sobreviver em um determinado ambiente, os indivíduos contendo a mutação irão eventualmente sobrepujar os indivíduos que não possuem a mutação. A performance de microorganismos pode também ser aperfeiçoada por uma adaptação de longa duração em um ambiente quimio-estático, sem a adição de agentes mutagênicos (Brown e Oliver, 1.982; Aarnio, e outros, 1.991). A utilização de variação em combinação com a seleção como um método para aperfeiçoar as características de um microorganismo é chamada de Engenharia Evolucionária (Butler, e outros, 1.996) e foi o assunto de um recente artigo (Sauer, 2.001). A engenharia metabólica e a engenharia evolucionária não deveríam ser consideradas como tecnologias que competem, mas com mais preferência, como complementares uma em relação à outra. Com a engenharia metabólica é possível fazer saltos (pulos) em evolução e substituir um grande número de mutações. Em se assumindo que se quer introduzir uma xilose redutase em S. cerevisiae e nenhuma seqüência similar é conhecida [o que não é verdade para a S. cerevisiae desde que alguma aldose redutase possui a atividade de XR (Kuhn, e outros, 1.995)]. 0 número de seqüências possíveis aumenta exponencialmente com as unidades de informação, (4 nucleotídeos para DNA) e o comprimento de seqüência [(954 Jbp para XR (Hallborn, e outros, 1.991)] (Sauer, 2.001). Para obter um gene de XR específico através de mutação aleatória, 4954 mutações têm que acontecer. Na realidade, o número de mutações requerido é mais baixo desde que os resíduos de amino ácido que constróem a enzima são normalmente codificados para isso pelos vários códons. Adicionalmente, cerca de dos nucleotídeos irão estar aleatoriamente corretos a partir do começo.

Nas seções a seguir, está descrito como a mutagênese aleatória em combinação com a engenharia metabólica gerou cepas de S. cerevisiae com utilização de xilose aperfeiçoada e as maneiras nas quais as cepas mutagenadas diferem a partir das cepas paternas. A mutagênese aleatória em combinação com a engenharia metabólica conduziu ao desenvolvimento de uma cepa com capacidade de utilização de xilose superior, que possibilitou a caracterização completa do crescimento de S. cerevisiae TMB 3400 em xilose.

Ambas as rotas resultam em uma molécula extra de acetaldeido. A FIGURA 5 mostra perfis de cultivo de fermentações de xilose de S. cerevisiae TMB 3001 (contendo os genes de XR, de XDH e de XK) (Eliasson, e outros, 2.000). As fermentações foram realizadas em um fermentador de 3 1 New Brunswick Bioflo III (New Brunswick Scientific Co., Edison, NJ, USA) em pH = 5,5 e T = 30 graus. 0 meio consistia de 20 g/i de glucose, e 50 g/1 de xilose mais sais minerais, elementos de traço, vitaminas e ergosterol/TWEEN (Verduyn, e outros, 1.990). Para obter as condições anaeróbicas, o fermentador foi continuamente espargido com nitrogênio em uma taxa de 0,2 1/min. Pode ser observado que o rendimento de etanol é muito baixo, de cerca de 0,13 g/g de xilose e a maior parte da xilose termina em xilitol. 0 acetaldeido foi continuamente alimentado para o fermentador em uma taxa baixa. Neste caso, nenhum xilitol é formado e o rendimento de produção de etanol aumenta significativamente. Isto indica que o acetaldeido extra produzido a partir das rotas 1 e 2 anteriormente pode solucionar o problema de secreção de xilitol.

Como uma conclusão, pode ser estabelecido que o xilitol e também a formação de subproduto de glicerol deveríam ser prevenidos se as atividades enzimáticas para fosfocetolase, para fosfato acetil transferase e para acetaldeido desidrogenase (de acilação) fossem introduzidas em S. cerevisiae. Em uma tal rota hipotética, o excesso de NADH formado tanto a partir de oxidação de xilitol ou quanto a partir de síntese de amino ácido deveria ser regenerado para NAD+ pela conversão de acetil fosfato, formado na reação de fosfocetolase, para etanol utilizando a fosfato acetil transferase, a acetaldeído desidrogenase (de acilação) e a álcool desidrogenase. A mutagênese aleatória foi de maneira bem sucedida utilizada para desenvolver a S. cerevisiae recombinante TMB 3400 que possui uma taxa de crescimento específico máxima de 0,14 h”1 em xilose, comparada com 0,025 h”1 para a sua cepa paterna, a que não sofreu mutagênese, a S. cerevisiae recombinante TMB 3399. A S. cerevisiae TMB 3400 mostrou níveis de expressão de mRNA elevados de (I) HXT5, que codifica um transportador de hexose, (TI) XKS1, que codifica xiluloquinase, uma enzima envolvida em uma das etapas iniciais de utilização de xilose, e (III) SOL3, GND1, TAL1 e TKL1, que codificam enzimas na rota de pentose fosfato. 0 rendimento de biomassa de S. cerevisiae TMB 3400 em xilose, de 0,43 g de biomassa g de xilose”1, foi mais baixo do que aquele em glucose, de 0,47 g de biomassa g de xilose”1.

Estabelecimento da nova rota de fermentação para etanol: a rota de fosfocetolase - fosfotransacetilase - acetaldeído desidrogenase Desde há mais de uma década, que as estratégias de engenharia metabólica foram aplicadas para aperfeiçoar a eficiência de produção de etanol a partir de fermentação de xilose com S. cerevisiae. As diferentes abordagens racionais e evolucionárias resultaram tanto em rendimentos de etanol aperfeiçoados (Jeppsson, e outros, 2.002a) ou quanto em taxas de fermentação de xilose aperfeiçoadas (Aristidou, e outros, 1.999), mas geralmente nunca em um aumento significativo simultâneo de ambos os parâmetros fisiológicos. Para conseguir produtividades de etanol em xilose comparáveis com aquelas em glucose, tanto a taxa de fermentação aperfeiçoada e quanto o rendimento aperfeiçoado, são necessários. Nesta estruturação, a rota de fosfocetolase - fosfotransacetilase - acetaldeido desidrogenase podería oferecer uma nova oportunidade para alcançar um marco em aperfeiçoamento de eficiência de fermentação de xilose. Esta rota é amplamente utilizada pelas bactérias de ácido lático hetero fermentativas, convertendo primeiro a xilulose 5-fosfato para o acetil fosfato e o gliceraldeído fosfato, e então o acetil fosfato para a acetil coenzima A, que é finalmente reduzida para o acetaldeido (FIGURA 5). Em catabolismo de xilose de levedura anaeróbica, esta rota podería proporcionar uma oportunidade alternativa para reoxidar excedente de NADH, canalizando o fluxo de carbono para a produção de etanol, se suportada por uma eliminação da aldeído desidrogenase (ald.6) , constitutiva, citosólica e dependente de NADP. Juntamente com os conseqüentes decréscimo de xilitol e acumulação de glicerol, o bypass (desvio) do CO2 produzindo reação de piruvato descarboxilase poderia potencialmente aumentar os rendimentos tanto efetivo e quanto teórico de etanol.

Para estabelecer uma rota de fosfocetolase -fosfotransacetilase - acetaldeido desidrogenase em S. cerevisiae, foi analisada a super expressão da fosfocetolase de Bifidobacterium 1 ac tis [xfp), da fosfotransacetilase de Bacillus subtil is ípta), e da acetaldeído desidrogenase de Encamoeba histolytica. {Ehadh2) na presença ou na ausência de uma eliminação da citosólica e constitutiva aldeido desidrogenase (ald€) em S. cerevísiae TMB 3001, Materials e métodos Cepas e meios As presentes experimentações foram inoculadas com a cepa de 5. cerevisiae recombinante MB 3001 [CEN.PK 113-7A (MATa, his3-Al, MAL2-8c, SUC2) his3: YIpXR/XDH/XK], que contém a integridade de rota de utilização de xilose {Eliasson, e outros, 2.000) . A super expressão de XR é controlada pelo promotor e terminador de álcool desidrogenase, considerando que a super expressão de XDH e de XK estão ambas sob o controle de promotores e de terminadores de fosfoglicerato quinase. As experimentações de engenharia metabólica racional sobre o estabelecimento da rota de fosfocetolase - fosfotransacetilase - acetaldeído desidrogenase em levedura foram realizadas com a cepa TMB 3001c [CEN.PK 2-1C {MATa; ura3-52; trpl-289; leu2-3f 112; his3-Al, MAL2-8c, SUC2) his3: YIpXR/XDH/XK].

Para as experimentações de análise fisiológica e de evolução, culturas de levedura cresceram a 30 °C em meio mínimo contendo por litro: 5 g de (NH4) 2S04,- 3 g de KH2P04 ; 0,5 g de MgS04*7H20; 15 mg de EDTA; 4,5 mg de ZnSO4»7Hs0; 0,3 mg de CoCl2·6H20; 1 mg de MnCl2»4H20; 0,3 mg de CuS04»4H20; 4,5 mg de CaCl2*2H20; 3 mg de FeS04*7H20; 0,4 mg de Na2Mo04*2H20; 1 mg de H3BO3; 0,1 mg de Kl; 0,05 mg de biotina; 1 mg de pantotenato de Ca; 1 mg de ácido nicotínico; 25 mg de inositol; 1 mg de tiamina de HC1; 1 mg de piridoxina de HC1; e 0,2 mg de ácido para-aminobenzóico (pH = 5) (Verduyn, e outros, 1.992) . Em culturas quimio-estáticas, 0,1 g l”1 de polipropileno glicol P 2000 foram adicionados para prevenir a formação de espuma. O meio foi suplementado com ergosterol (Fluka) e Tween 80 (Sigma) para cultivo anaeróbico. Ambos os componentes foram dissolvidos em etanol fervente a 99,8 % (v/v) e foram adicionados para o meio em uma concentração final de 0,01 g l”1 e de 0,42 g l”1, respectivamente. Os meios sólidos foram preparados pela adição de 1,5 % (v/v) de Agar técnico (Becton Dickinson) . Para o crescimento anaeróbico em placas de xilose, alíquotas de população foram lavadas duas vezes com PBS (8 g l”1 de NaCl; 0,2 g 1_1 de KC1; 1,44 g 1_1 de Na2HP04; 0,24 g l”1 de KH2PO4; pH = 7) e plaqueadas sobre meio mínimo anaeróbico contendo 20 g l”1 de xilose como a fonte de carbono única. As placas foram incubadas a 30 °C em vasos vedados, utilizando o sistema de GasPack Plus (Becton Dickinson) para proporcionar uma atmosfera anaeróbica, que foi verificada pelas tiras de indicador (Becton Dickinson).

Procedimentos de clonagem e transformação de levedura As técnicas biológicas moleculares padrão (standard) foram utilizadas para clonar os genes da fosfocetolase (xfp), da fosfotransacetilase (pta) e da acetaldeído desidrogenase (Ehadh2) sob o forte promotor HXT7 truncado nos plasmídeos de multicópia de levedura p426HXT7, p424HXT7 e p425HXT7 (Hauf, 1.998), respectivamente. O gene de Bifidobacterium lactis xfp foi sub-clonado pela ligação do fragmento de DNA 2,6 kbp, que resultou a partir da digestão de EcoRI-HindIII do plasmídeo de pFPK6 (Melle, e outros, 2.001} , depois da extração de gel (QUIAEX II, QUIAGEN, Basiléia, Suíça). Analogamente, a Entamoeba histolytica Ehadh2 contendo fragmento de cDNA 3 kbp foi sub-clonado a partir da digestão de BamHI-Xbal de pET3a-Ehadh2 (Yong, e outros, 1.996) em plasraídeo de p425HXT7 digerido era BamBJ-Spel, 0 gene de Bacillus subtil is pta foi amplificado com taq DMA polimerase (Promega, Madison, WI} pela PCR [Ciclo: 1x2 min a 95 °C; 30 x (1 min a 95 °C; 0,5 min a 58 °C; 1,25 min a 74 °C) ; 5 min a 74 °C) a partir do DMA genômico de Bacillus subtilis utilizando os seguintes primeros: Fwd: 5'-cgg gat cca tgg cag att tat ttt caa cag tg-3';

Rev: 5'-cca tcg atg tcg aga gct gcc att gtc tcc-3'.

Este Fragmento foi ligado utilizando os sítios de restrição de BamHI-Clal de p424HXT7.

Os plasmideos foram transformados em S. cerevisiae pelo método de acetato de lí tio utilizando o kit de transformação da S.c. EasyComp (Invítrogen, Carisbad, CA), Eliminação de ald6 0 cassete de KanMX com as regiões de flanco de 500 bp a montante e de 500 bp a jusante da ald€ ORF foi obtido a partir do cromossomo de DNA de S. cerevisiae YQ2767 (BY4741; MATa; his3Al; leu2A0; metlSAO; ura3A0; YPLÕ61w: : kanMX4) [Euroscarf, Frankfurt, Alemanha) pela PCR [Ciclo: 1 x 5 min a 94 °C; 40 x (0,5 min a 94 °C; 1 min a 52 °C; 2,83 min a 72 °C) ; 10 min a 72 °C] utilizando os seguintes oligonucleotídeos: 5'-gac aaa aga aaa acg acc gaa aag g-3' e 5'-ata tga tct ctg atg gcg aaa tgg-3'. 0 produto de PCR foi transformado pelo método de acetato de litro em TMB 3001c gerando 3WB 3111c pela seleção para recombinação homóloga sobre placas de YPD contendo geneticina (300 μg/ml) . A eliminação de ald.6 foi verificada pela PCR com os mesmos prímeros utilizados para gerar os seguintes fragmento de DNA e os dois prímeros internos de KanMX: 5'-tga ttt tga tga cga gcg taa t-3' e 5'-ctg cag cga gga gcc gta at-3'. A rota de fosfocetolase - fosfotransacetilase -a ce tal dei do desl drogenase Para avaliar a conceptibi1 idade do estabelecimento da rota de fosfocetolase - fosfotransacetilase - acetaldeído desidrogenase em S. cerevísiae, e para investigar o seu efeito em fermentação de xilose, foi analisada a super expressão de diferentes combinações de xfp, de pta e de Ehadh2 em TMB 3001c e em 3MB 3111c em performance de fermentação de xilose. Os dados fisiológicos foram determinados durante a fase de consumo de xilose de um crescimento de cultura em batelada anaeróbico sobre meio mínimo de 50 g/1 de glucose e de 50 g/1 de xilose, depois de eliminação de glucose (FIGURA 5) - A super expressão da acetaldeído desidrogenase sozinha ou em combinação com a fosfotransacetilase, ambas em um panorama de eliminação de aldeído desidrogenase [ald€) mostra os melhores aperfeiçoamentos em rendimento de etanol (de até mais do que 30 %) e em taxa de absorção de xilose especifica (de até 75 %) . Adicionalmente, a super expressão da enzima de fosfocetolase aparenta não ser necessária para conseguir os últimos aperfeiçoamentos, mas possui mais preferivelmente um efeito negativo, aumentando a produção de acetato também na cepa de eliminação de aldeído desidrogenase. Não obstante, a última cepa mostra em geral um rendimento de acetato significativamente diminuído.

Marcantemente, tais cepas engenheiradas metabolicamente possuem taxas de consumo de xilose específica até duplicadas e de até 40 % de aumento de rendimento de etanol em xilose. Até os dias hodiernos, quase todas as estratégias de engenharia metabólica bem sucedidas resultaram tanto em rendimento mais alto ou quanto em taxa mais alta, estes últimos resultados evidentemente indicando a importância da nova estratégia de engenharia metabólica.

LEGENDAS DAS FIGURAS DA PRESENTE INVENÇÃO FIGURA 1: Interconversões de xilose e de xilulose em bactérias e em levedura. Conforme (Hahn-Hâgerdal, e outros, 2.001). FIGURA 2: Um esquema metabólico para a formação de etanol a partir de xilose. FIGURA 3: Conversão redox - neutra de xilose para etanol utilizando a fosfocetolase, a acetil transferase e a acetaldeído desidrogenase (indicada pelas linhas tracejadas). FIGURA 4: Redução de acetato para etanol utilizando a acetaldeído desidrogenase de acilação. FIGURA 5: Rota de fosfocetolase - fosfotransacetilase - acetaldeído desidrogenase integrada dentro do catabolismo de xilose de levedura. XFP: Fosfocetolase; PTA: Fosfotransacetilase; EADH2: Acetaldeído desidrogenase; ALD6: Aldeído desidrogenase, citosólica (NADP) . FIGURA 6: Efeitos em performance de fermentação de xilose da super expressão de diferentes combinações de enzimas da rota de fosfocetolase - fosfotransacetilase - acetaldeído desidrogenase em TMB 3001c (controle) e em TMB 3111c {Aald6) . Os parâmetros fisiológicos mostrados se referem para a fase de consumo de xilose de culturas em batelada anaeróbicas sobre meio mínimo de 50 g/1 de glucose e de 50 g/1 de xilose, depois de eliminação de glucose, Para uma pessoa especializada no estado da técnica, é evidente que as várias concretizações preferidas da presente Invenção não estão restringidas para aquelas que estão descritas somente neste relatório descritivo, mas podem ser variadas dentro do escopo de proteção das reivindicações de patente anexas apresentadas pela presente invenção no quadro reivindicatório a seguir.

Nas páginas 33/41 a 41/41 a seguir, a presente invenção apresenta um Apêndice com as Referências que são consideradas importantes para descrever o estado da técnica relacionado para a presente invenção. Este referido Apêndice é aqui incorporado como referência e parte importante como complemento para as informações que estão apresentadas pela presente invenção.

Apêndice de Referências (Páginas 33/41 até 41/41). reeerências da eresente invenção Aarnio, T, H., Suihko, M. L. and Kauppinen, V. S. (1991).

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REIVINDICAÇÕES

Claims (9)

1. Método para a preparação de uma cepa de Saccharomyces cerevisiae produtora de etanol que utiliza xilose, compreendendo genes para super expressão de xilose redutase, xilitol desidrogenase e xiluloquinase, caracterizado pelo fato de que a cepa compreende adicionalmente genes que codificam para fosfoacetiltransferase e acetaldeido desidrogenase, que são super expressos, em que o dito gene que codifica para fosfoacetiltransferase é derivado a partir de qualquer organismo procariótico ou a partir dos protozoários Entamoeba histolytica e Giardia lablia, e em que o dito gene que codifica para acetaldeido desidrogenase é derivado a partir de qualquer organismo procariótico ou a partir do protozoário Entamoeba histolytica.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o gene que codifica para fosfocetolase é introduzido.

3. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o gene que codifica para fosfocetolase é super expresso.

4. Método, de acordo com as reivindicações 2 e 3, caracterizado pelo fato de que o gene xfp que codifica para fosfocetolase é clonado a partir de qualquer bactéria de ácido lático hetero fermentativa.

5. Método, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a bactéria de ácido lático hetero fermentativa é Bifidobacterium lactis.

6. Método, de acordo com as reivindicações 1-3, caracterizado pelo fato de que o gene que codifica para fosfoacetiltransferase é clonado a partir de qualquer bactéria que produz etanol.

7. Método, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o gene é pta que codifica para fosfoacetiltransferase e é clonado a partir de Bacillus subtilis.

8. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o gene que expressa aldeido desidrogenase, ALD6, é excluído.

9. Uso de uma cepa conforme qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de ser para a produção de etanol.