BRPI0009396B1

BRPI0009396B1 - lipase, e, composição detergente

Info

Publication number: BRPI0009396B1
Application number: BRPI0009396-3A
Authority: BR
Inventors: Jesper Vind; Allan Svendsen; Shamkant Anant Patkar; Kim Vilbour Andersen; Dorte Aaby Halkier; Kirsten Bojsen
Original assignee: Novozymes A/S
Priority date: 1999-03-31
Filing date: 2000-03-30
Publication date: 2021-01-05
Also published as: CA2366843A1; CN1409760A; ES2498823T3; EP2278000A1; BR0009396A; EP1428874A3; DK2277999T3; ES2445330T3; CN100455663C; EP2277999A1; EP1428874B1; DK1428874T3; EP2277999B1; EP1428874A2

Abstract

"LIPASE, COMPOSIÇÃO DETERGENTE, SEQUÊNCIA DE DNA, VETOR DE EXPRESSÃO, CÉLULA HOSPEDEIRA TRANSFORMADA, E, PROCESSO PARA PRODUZIR A LIPASE". Certas variantes de lipolase (lipase do tipo selvagem de Humicola lanuginosa) têm um desempenho de primeira lavagem particularmente bom em uma solução detergente. As variantes devem compreender uma ou mais substituições com aminoácidos positivos perto do N-terminal na estrutura tridimensional. As variantes devem ainda compreender uma adição de peptídeo no C-terminal e/ou devem atender a certas limitações nos aminoácidos eletricamente carregados nas posições 90 a 101 e 210.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção diz respeito a variantes de lipase adequadas para uso em composições detergentes. Mais particularmente, a invenção diz respeito a variantes de lipase do tipo selvagem da cepa DSM 4109 de Humicola lanuginosa, apresentando um efeito de primeira lavagem.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

Por vários anos, as lipases têm sido usadas como enzimas detergentes para remover lipídeos ou manchas gordurosas das roupas e outros têxteis, particularmente uma lipase derivada de Humicola lanuginosa (EP 258 068 e EP 305 216) vendida sob o nome comercial de Lipolase® (produto da Novo Nordisk A/S). WO 92/05249, WO 94/25577, WO 95/22615, WO 97/04079 e WO 97/07202 apresentam variantes da lipase de H. Lanuginosa tendo propriedades melhoradas para fins de detergentes. Assim, a WO 97/04079 apresenta variantes que possuem uma adição de peptídeo (extensão) no N- terminal e/ou no C-terminal. WO 97/07202 apresenta variantes da lipase com “desempenho de primeira lavagem”, que são capazes de remover quantidades substanciais de gordura de uma amostra de tecido manchada de gordura em uma lavagem de um ciclo.

Há uma necessidade continuamente existente de se prover novas lipases com propriedades de lavagem melhoradas em uma variedade de detergentes comerciais. A presente invenção diz respeito a essas novas lipases.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Observou-se que certas variantes de Lipolase (lipase de Humicola lanuginosa do tipo selvagem) têm um desempenho de primeira lavagem particularmente bom em uma solução detergente. As lipases podem ainda proporcionar benefícios adicionais, tais como a manutenção da brancura e a reconstituição do desbotado.

Observou-se que as variantes devem compreender uma ou 5 mais substituições com aminoácidos positivos perto do N-terminal na estrutura tridimensional. As variantes devem ainda compreender uma adição de peptídeo no C-terminal e/ou devem atender a certas limitações nos aminoácidos eletricamente carregados nas posições 90 a 101 e 210.

Consequentemente, a invenção provê uma lipase que é um 10 polipeptídeo que tem uma seqüência de aminoácidos, a qual: a) tem pelo menos 90% de identidade com a lipase do tipo selvagem derivada da cepa DSM 4109 de Humicola lanuginosa', b) comparada à dita lipase do tipo selvagem, compreende uma substituição de um aminoácido eletricamente neutro ou negativamente 15 carregado na superfície da estrutura tridimensional dentro de 15 Â de El ou Q249 com um aminoácido positivamente carregado; e c) compreende uma adição de peptídeo no C-terminal; e/ou d) atende às seguintes limitações: i) compreende um aminoácido negativo na posição E210 da 20 dita lipase do tipo selvagem; ii) compreende um aminoácido negativamente carregado na região correspondente às posições 90 a 101 da dita lipase do tipo selvagem; e iii) compreende um aminoácido neutro ou negativo em uma posição correspondente a N94 da dita lipase do tipo selvagem e/ou tem uma 25 carga elétrica líquida negativa ou neutra na região correspondente às posições 90 a 101 da dita lipase do tipo selvagem.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO Humicola lanuginosa lipase

A lipase de referência usada nesta invenção é a lipase do tipo selvagem derivada da cepa DSM 4109 de ffunticbtí •íàÃugitiòsa*. ’Éla é descrita nas EP 258 068 e EP 305 216 e tem a seqüência de aminoácidos mostrada nas posições de 1 a 269 da SEQ ID NO: 2 da US 5.869.438. Nesta especificação, a lipase de referência também é referida como Lipolase.

SUBSTITUIÇÃO POR AMINOÁCIDO POSITIVO ‘

A lipase da invenção compreende uma ou mais (p°r exemplo 2 a 4, particularmente duas) substituições de um aminoácido eletricamente neutro ou negativamente carregado perto de El ou Q249, por um aminoácido positivamente carregado, preferivelmente R.

A substituição é na superfície da estrutura tridimensional dentro de 15 Â de El ou Q249, por exemplo em qualquer uma das posições 1 a 11, 90, 95, 169, 171 a 175, 192 a 211, 213 a 226, 228 a 258, 260 a 262.

A substituição pode ser dentro de 10 Â de El ou Q249, por exemplo em qualquer uma das posições 1 a 7, 10, 175, 195, 197 a 202, 204 a 206, 209, 215, 219 a 224, 230 a 239, 242 a 254.

A substituição pode ser dentro de 15 Â de El, por exemplo em qualquer uma das posições 1 a 11, 169, 171, 192 a 199, 217 a 225, 228 a 240, 243 a 247,249, 261 a 262.

A substituição é mais preferivelmente dentro de 10 Â de El, por exemplo em qualquer uma das posições 1 a 7, 10, 219 a 224 e 230 a 239.

Assim sendo, algumas substituições preferidas são S3R, S224R, P229R, T23 IR, N233R, D234R e T244R.

ADIÇÃO DE PEPTÍDEO NO C-TERMINAL I

A lipase pode compreender uma adição de peptídeo ligada a L269 do C-terminal. A adição de peptídeo melhora o desempenho de primeira lavagem em uma variedade de detergentes.

A adição de peptídeo preferivelmente consiste de 1 a 5 aminoácidos, por exemplo 2, 3 ou 4 aminoácidos. Os aminoácidos da adição de peptídeo serão numerados 270, 271 etc.

A adição de peptídeo pode i'coftisistir ’de^ ariiitteíácidos eletricamente neutros (por exemplo hidrofóbicos), por exemplo PGL ou PG. Em uma modalidade alternativa, a adição de peptídeo de lipase consiste de aminoácidos neutros (por exemplo hidrofóbicos) e o aminoácido C, e a lipase 5 compreende substituição de um aminoácido com C em uma localização adequada, de modo a formar uma ponte de dissulfeto com o C da adição de peptídeo. Exemplos são: 270C ligado a G23C ou T37C 271C ligado a K24C, T37C, N26C ou R81C 10 272C ligado a D27C, T35C, E56C, T64C ou R81C.

AMINOÁCIDOS NAS POSIÇÕES 90 A 101 E 210

A lipase da invenção preferivelmente atende a certas limitações nos aminoácidos eletricamente carregados nas posições 90 a 101 e 210. As lipases atendendo às limitações de carga são particularmente eficazes 15 em um detergente com alto teor de componente aniônico.

Assim, o aminoácido 210 pode ser negativo. E210 pode ser imutável ou ele pode ter a substituição E210D/C/Y, particularmente E210D.

A lipase pode compreender um aminoácido carregado negativamente em qualquer das posições 90 a 101 (particularmente 94 a 101), 20 por exemplo na posição D96 e/ou E99.

Além disso, a lipase pode compreender um aminoácido neutro ou negativo na posição N94, isto é N94 (neutro ou negativo), por exemplo N94N/D/E.

Igualmente, a lipase pode ter uma carga elétrica líquida 25 negativa ou neutra na região 90 a 101 (particularmente 94 a 101), isto é, o número de aminoácidos negativos é igual ou maior do que o número de aminoácidos positivos. Assim, a região pode ser não modificada a partir da Lipolase, tendo dois aminoácidos negativos (D96 e E99) e um positivo (K98), e tendo um aminoácido neutro na posição 94 (N94), ou a região pode 5 : : : i ser modificada por uma ou mais substituições.

Altemativamente, dois dos três aminoácidos N94, N96 e E99 podem ter uma carga elétrica negativa ou não modificada. Assim, todos os três aminoácidos podem ser não modificados ou podem ser modificados por 5 uma substituição conservativa ou negativa, isto é, N94 (neutra ou negativa), D (negativa) e E99 (negativa). Exemplos são N94D/E e D96E. Igualmente, um dos três pode ser substituído de modo a aumentar a carga elétrica, isto é, N94 (positiva), D96 (neutra ou positiva) ou E99 (neutra ou positiva). Exemplos são N94K/R, D96I/L/N/S/W ou E99N/Q/K/R/H. 10 A substituição de um aminoácido neutro por um negativo (N94D/E) pode melhorar o desempenho em um detergente aniônico. A substituição de um aminoácido neutro por um aminoácido positivo (N94K/R) pode prover uma lipase variante com bom desempenho tanto em um detergente aniônico quanto em um detergente aniônico/não iônico (um 15 detergente com, por exemplo, 40 a 70% aniônico do tensoativo total).

AMINOÁCIDOS EM OUTRAS POSIÇÕES

Observou-se que uma substituição Q249R/K/H pode melhorar o desempenho tanto em detergente aniônico quanto em aniônico/não iônico, e que uma substituição de R209 por um aminoácido neutro ou negativo (por 20 exemplo R209P/S) pode melhorar o desempenho no detergente aniônico. A lipase pode opcionalmente compreender a substituição G91A.

A lipase pode opcionalmente compreender substituições de um ou mais aminoácidos adicionais. Tais substituições podem, por exemplo, ser feitas de acordo com princípios conhecidos na técnica, por exemplo as 25 substituições descritas nas WO 92/05249, WO 94/25577, WO 95/22615, WO 97/04079 e WO 97/07202.

COMBINAÇÕES DE SUBSTITUIÇÕES

A variante de lipase com bom desempenho de primeira lavagem pode ser obtida por modificação da Lipolase, como segue. As substituições entre parênteses são opcionais.

NOMENCLATURA PARA AS MODIFICAÇÕES ÀMlHOÁCÍDOS

A nomenclatura aqui usada para definir mutações é essencialmente como descrito na WO 92/05249. Assim, T231R indica uma substituição de T na posição 231 por R. PGL ou 270P+ 271G+ 272L indica a adição de peptídeo PGL ligado ao C-terminal (L269).

AGRUPAMENTO DE AMINOÁCIDOS

Neste relatório descritivo, os aminoácidos são classificados como carregados negativamente, carregados positivamente ou eletricamente neutros, de acordo com sua carga elétrica em pH 10, que é típico do detergente da invenção. Assim, aminoácidos negativos são E, D, C (cisteína) e Y, particularmente E e D. Aminoácidos positivos são R, K e H, em particular R e K. Aminoácidos neutros são G, A, V, L, I, P, F, W, S, T, M, N, Q e C, quando fazendo parte de uma ponte de dissulfeto. Uma substituição por outro aminoácido no mesmo grupo (negativo, positivo ou neutro) é denominada substituição conservativa.

Os aminoácidos neutros podem ser divididos em hidrofóbico (G, A, V, L, I, P, F, W e C como parte de uma ponte de dissulfeto) e hidrofílico (S, T, M, N, Q).

IDENTIDADE DE AMINOÁCIDOS

A variante de lipase da invenção tem uma identidade de aminoácidos de pelo menos 90% (preferivelmente mais do que 95% ou mais do que 98%) com Lipolase.

O grau de identidade pode ser adequadamente determinado por meio de programas de computador conhecidos na técnica, tal como GAP fornecido no pacote de programas GCG (Manual de Programas para o Pacote Wisconsin, Versão 8, agosto de 1994, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711) (Needleman, S. B. e Wunsch, C. D. (1970), Journal of Molecular Biology, 48, 443-445), usando- se GAP com os seguintes ajustes para comparação de seqüências de polipeptídeos: penalidade de criação de GAP de 3.0:e penalidade’dfe.extensão de GAP de 0.1.

SEQUÊNCIA DE DNA, VETOR DE EXPRESSÃO, CÉLULA HOSPEDEIRA, PRODUÇÃO DE LIPASE

A invenção provê uma seqüência de DNA codificando a lipase da invenção, um vetor de expressão abrigando a seqüência de DNA, e uma célula hospedeira transformada contendo a seqüência de DNA ou o vetor de expressão. Estes podem ser obtidos por processos conhecidos na técnica.

A invenção também provê um processo de produzir a lipase mediante cultivo da célula hospedeira transformada sob condições conducentes para a produção da lipase, e recuperação da lipase do caldo resultante. O processo pode ser praticado de acordo com princípios conhecidos na técnica.

ADITIVO DETERGENTE

De acordo com a invenção, a lipase pode tipicamente ser usada como um aditivo em uma composição detergente. Este aditivo é convenientemente formulado como um granulado não formador de poeira, um líquido estabilizado, uma pasta ou uma enzima protegida. O aditivo pode ser preparado por processos conhecidos na técnica.

COMPOSIÇÃO DETERGENTE

As composições detergentes da invenção podem, por exemplo, ser formuladas como composições detergentes para lavagem de roupa manual ou a máquina, incluindo composições aditivas de lavagem de roupa e composições adequadas para uso no pré-tratamento de tecidos manchados, composições amaciantes de tecido adicionadas ao enxágüe, e composições para uso em operações de limpeza de superfícies duras domésticas em geral e operações de lavagem de louça.

A composição detergente da invenção compreende a lipase da invenção e um tensoativo. Adicionalmente, ela pode opcionalmente compreender um reforçador, outra enzima, supi^ssòrMe-éspxmiaviuii agente de amaciamento, um agente de inibição da transferência de corante e outros componentes convencionalmente usados em detergentes, tais como agentes de suspensão de sujeira, agentes de liberação de sujeira, abrilhantadores óticos, abrasivos, bactericidas, inibidores de embaciamento, agentes de coloração, e/ou perfumes encapsulados ou não encapsulados.

A composição detergente de acordo com a invenção pode estar nas formas líquida, de pasta, de géis, de barras ou granular. O pH (medido em solução aquosa na concentração de uso), comumente será neutro ou alcalino, por exemplo na faixa de 7 a 11, particularmente de 9 a 11. As composições granulares de acordo com a presente invenção também podem estar na “forma compacta”, isto é, podem ter uma densidade relativamente mais elevada do que os detergentes granulares convencionais, isto é, de 550 a 950 g/litro.

A lipase da invenção, ou opcionalmente outra enzima incorporada na composição detergente, é normalmente incorporada na composição detergente em um nível de 0,00001% a 2% de proteína enzimática em peso da composição, preferivelmente em um nível de 0,0001% a 1% da proteína enzimática em peso da composição, mais preferivelmente em um nível de 0,001% a 0,5% de proteína enzimática em peso da composição, ainda mais preferível em um nível de 0,01% a 0,2% de proteína enzimática em peso da composição.

A composição detergente da invenção pode compreender a lipase em uma quantidade correspondente a 10 a 50.000 LU por grama de detergente, preferivelmente de 20 a 5.000 LU/g, por exemplo 100 a 1000 LU/g. O detergente pode ser dissolvido em água para produzir um líquido de lavagem contendo enzima lipolítica em uma quantidade correspondente a 25 a 15.000 LU por litro de líquido de lavagem, particularmente de 100 a 5.000 LU/litro, por exemplo de 300 a 2.000 LU/litro. A quantidade de proteína lipase pode ser de 0,001 a 10 mg por grama de íetergshté óú dè Õ;OCH:á 100 mg por litro de líquido de lavagem.

Mais especificamente, a lipase da invenção pode ser incorporada nas composições detergentes descritas nas WO 97/04079, WO 5 97/07202, WO 97/41212, PCT7DK WO 98/08939 e WO 97/43375.

SISTEMA TENSOATIVO

O sistema tensoativo pode compreender tensoativos não iônicos, aniônicos, catiônicos, anfóteros e/ou zwitteriônicos. Como descrito acima, as variantes de lipase da invenção são particularmente adequadas para 10 detergentes que compreendam uma combinação de tensoativo aniônico e não iônico com 70 a 100% em peso de tensoativo aniônico e 0 a 30% em peso de não iônico, particularmente de 80 a 100% de tensoativo aniônico e de 0 a 20% de não iônico. Conforme ainda descrito, algumas lipases preferidas da invenção também são adequadas para detergentes que compreendam de 40 a 15 70% de tensoativo aniônico e de 30 a 60% de não iônico.

O tensoativo está tipicamente presente em um nível de 0,1% a 60% em peso, por exemplo de 1% a 40%, particularmente de 10 a 40%, preferivelmente de cerca de 3% a cerca de 20% em peso. Alguns exemplos de tensoativos são descritos abaixo.

20 TENSOATIVOS ANIÔNICOS

Tensoativos aniônicos preferidos incluem sulfato de alquila, sulfato etóxi de alquila, sulfonato de alquil benzeno linear, e misturas destes.

Os tensoativos de sulfato de alquila são sais ou ácidos solúveis em água da fórmula ROSO3M, em que R preferivelmente é uma 25 hidrocarbila C10-C24, preferivelmente uma alquila ou hidroxialquila tendo um componente alquila Cio-C2o, mais preferivelmente uma alquila ou hidroxialquila C12-C18, e M é H ou um cátion, por exemplo um cátion de metal alcalino (por exemplo sódio, potássio, lítio), ou amónio ou amónio substituído.

Os sulfonatos de alquilbenzeno sfeo adequacies,•^Spbciyriiente os sulfonatos de alquilbenzeno lineares (LAS) (cadeia reta), em que o grupo alquila preferivelmente contém de 10 a 18 átomos de carbono.

Tensoativos aniônicos adequados incluem os sulfato alcoxilados de alquila que são sais ou ácidos solúveis em água da fórmula RO(A)mSO3M, em que R é um grupo alquila ou hidroxialquila C10-C24 tendo um componente alquila C]o-C24, preferivelmente uma alquila ou hidroxialquila C12-C20, mais preferivelmente alquila ou hidroxialquila Ci2- C18, A é uma unidade etóxi ou propóxi, m é maior do que zero, tipicamente entre cerca de 0,5 e cerca de 6, mais preferivelmente entre cerca de 0,5 e cerca de 3, e M é H ou um cátion que pode ser, por exemplo, um cátion de metal (por exemplo, sódio, potássio, lítio, cálcio, magnésio etc.), cátion de amónio ou de amónio substituído. Sulfatos etoxilados de alquila, bem como sulfato propoxilados de alquila, são aqui considerados. Exemplos específicos de cátions de amónio substituídos incluem os cátions de metil-, dimetil-, trimetilamônio e os cátions de amónio quaternário, tais como os cátions de tetrametilamônio e de piperidínio dimetílico, e aqueles derivados de alquilaminas tais como etilamina, dietilamina, trietilamina, misturas destas, e outros.

Outros tensoativos aniônicos incluem sais (incluindo, por exemplo, os sais de sódio, potássio, amónio e amónio substituído, tais como os sais de mono-, di- e trietanolamina) de sabão, alcanossulfonatos C8-C22 primários ou secundários, olefinsulfonatos C8-C24, os ácidos policarboxílicos sulfonados preparados por sulfonação do produto pirolizado de citratos de metal alcalino terroso.

TENSOATIVO NÃO IÔNICO

O tensoativo pode compreender condensados de óxido de polialquileno (por exemplo óxido de polietileno) de fenóis alquílicos. O grupo alquila pode conter de cerca de 6 a cerca de 14 átomos de carbono, em uma cadeia reta ou cadeia ramificada. O óxido dê etilònó-pòàe.èstár-pfefcente em uma quantidade igual a cerca de 2 a cerca de 25 moles por mol de fenol alquílico.

O tensoativo pode também compreender produtos de condensação de álcoois alifáticos primários e secundários com cerca de 1 a cerca de 25 moles de óxido de etileno. A cadeia alquila do álcool alifático pode, ou ser reta ou ser ramificada, e geralmente contém de cerca de 8 a cerca de 22 átomos de carbono.

Além disso, o tensoativo não iônico pode compreender condensados de óxido de polietileno de fenóis alquílicos, produtos de condensação de álcoois alifáticos primários e secundários com cerca de 1 a cerca de 25 moles de óxido de etileno, alquilpolissacarídeos, e misturas destes. Mais preferidos são os etoxilatos de fenol alquílico Cg-C]4 tendo de 3 a 15 grupos etóxi, e etoxilatos de álcool Cg-Cl8 (preferivelmente a média Cio) tendo de 2 a 10 grupos etóxi, e misturas destes.

Tensoativos não iônicos preferidos são o etoxilato de álcool, o etoxilato fenólico de álcool, amida de ácido graxo poliidróxi, poliglicosídeo de alquila e misturas destes.

EXEMPLO DESEMPENHO DE PRIMEIRA LAVAGEM EM VÁRIAS DOSAGENS EM DETERGENTE ANIÔNICO

As seguintes 5 variantes de acordo com a invenção foram preparadas e testadas com 3 tipos de amostras de tecidos manchadas, e a lipase precursora foi incluída para comparação:

Um detergente comercial US com um alto teor de tensoativo aniônico foi aquecido para inativar as enzimas já presentes, e foi usado em 1,4 g/litro em uma máquina de lavagem de latíòraióHb:.térgót-o^metfer®. A dureza da água era de 6°dH (Ca:Mg 2:1), e as condições de lavagem foram de 1 ciclo a 30°C por 12 minutos, seguido por secagem durante a noite sobre papel de filtro. A variante de lipase foi adicionada em dosagens de 6400 e 5 12800 LU/litro. Determinações duplas foram feitas em duas lavagens separadas (mesmo TOM).

Os seguintes três tipos de amostras têxteis testados foram: Gordura/Vermelho Sudão sobre algodão estilo 400, recém-preparado; Batom wfk 20-LS sobre poliéster/algodão; e batom wfk 10-LS sobre algodão. A 10 remoção de sujeira foi avaliada pela medição da remissão em 460 nm após o primeiro ciclo de lavagem, e os resultados foram expressos como ΔR mediante subtração da remissão de um branco sem enzima.

Os resultados foram que cada variante em cada dosagem apresentou um desempenho de primeira lavagem melhorado em cada tipo de 15 tecido manchado (ΔR de 5 a 13), enquanto a enzima precursora não teve essencialmente nenhum efeito (ΔR = 0 ± 2) sob as mesmas condições.

Claims

1. Lipase, caracterizada pelo fato de ser um polipeptídeo que tem a sequência de aminoácidos da lipase do tipo selvagem de SEQ ID NO: 1 derivada da cepa DSM 4109 de Humicola lanuginosa, compreendendo substituições T231R e N233R; e adicionalmente atende as seguintes limitações: i) compreende um aminoácido negativo na posição E210 da dita lipase do tipo selvagem; ii) compreende um aminoácido negativamente carregado na região correspondente às posições 90 a 101 da dita lipase do tipo selvagem; e iii) compreende um aminoácido neutro ou negativo em uma posição correspondente a N94 da dita lipase do tipo selvagem e/ou tem uma carga elétrica líquida negativa ou neutra na região correspondente às posições 90 a 101 da dita lipase do tipo selvagem.

2. Lipase de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que compreende ainda uma substituição de aminoácido S3, S224, P229, D234 e T244 por R.

3. Lipase de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que compreende aminoácidos com carga elétrica negativa ou não modificada em pelo menos duas das posições N94, D96 e E99 da dita lipase tipo selvagem.

4. Lipase de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de que compreende uma substituição G91A, N94D/E/R, D96E/I/N/S/W, E99N/Q/R/H, R209P/S ou Q249K/H.

5. Lipase de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizada pelo fato de que compreende as substituições D96 (neutro ou positivo) +Q249K/H opcionalmente combinadas com R209 (neutro ou negativo).

6. Lipase de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que consiste em um dos seguintes conjuntos de substituições: - T231R + N233R; - R209P + T231R + N233R; - N33Q + D96S + T231R + N233R + Q249R; ou 5 - E99N + N101S + T231R + N233R + Q249R.

7. Composição detergente, caracterizada pelo fato de que compreende um tensoativo e a lipase como definida em qualquer uma das reivindicações de 1 a 6.

8. Composição detergente de acordo com a reivindicação 7, 10 caracterizada pelo fato de que o tensoativo compreende tensoativo aniônico em uma quantidade de mais do que 70% em peso do tensoativo total.