BR122022020015B1

BR122022020015B1 - Métodos de engenharia de uma planta tendo conteúdo reduzido de lignina e de obtenção de uma quantidade aumentada de açúcares solúveis de uma planta em uma reação de sacarificação

Info

Publication number: BR122022020015B1
Application number: BR122022020015-0A
Authority: BR
Inventors: Dominique Loque; Aymerick EUDES
Original assignee: The Regents Of The University Of California
Priority date: 2013-03-15
Filing date: 2014-03-11
Publication date: 2023-05-16
Also published as: US10900049B2; US20200017871A1; US20160017355A1; WO2014150504A3; BR112015022211A2; BR112015022211B1; US20210292780A1; US11873498B2; WO2014150504A2; US10415052B2; CA2940141C; CA2940141A1

Abstract

A presente invenção refere-se a um cassete de expressão compreendendo um polinucleotídeo que codifica uma proteína que desvia um precursor de monolignol de uma via de biossíntese de lignina na planta, que é operacionalmente ligada a um promotor heterólogo. São também fornecidos métodos de engenharia de uma planta tendo conteúdo reduzido de lignina, bem como células vegetais, partes vegetais e tecidos vegetais de tais plantas engendradas.

Description

REFERÊNCIA A PEDIDOS DE PATENTE RELACIONADOS

[0001] Este pedido de patente reivindica o benefício do Pedido Provisório de Patente U.S. No. 61/792.864, depositado em 15 de março de 2013, que é incorporado por referência neste pedido para todos os propósitos.

DECLARAÇÃO SOBRE DIREITOS DE INVENÇÕES FEITAS SOB PESQUISA E DESENVOLVIMENTO PATROCINADOS PELO GOVERNO FEDERAL

[0002] Esta invenção foi feita com o apoio do governo de acordo com o Contrato n° DE-AC02-05CH11231 concedido pelo Departamento Americano de Energia. O governo tem certos direitos nesta invenção.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[0003] A biomassa lignocelulósica vegetal é usada como uma ma téria-prima renovável para a produção de biocombustível e é uma alternativa promissora para o consumo de combustível fóssil. Entretanto, um gargalo principal na produção de biocombustível é a qualidade das matérias-primas disponíveis. As matérias-primas disponíveis têm uma alta resistência (recalcitrância) a serem reduzidas em açúcares simples que podem ser, por sua vez, convertidas em combustível. Por isso, melhorar a composição e/ou a digestibilidade da biomassa bruta terá um impacto benéfico importante na produção de biocombustíveis lignocelulósicos.

[0004] A biomassa lignocelulósica é principalmente composta de paredes celulares secundárias, que compreendem polímeros de polis- sacarídeos incorporados na lignina. A incorporação dos polímeros de polissacarídeos na lignina reduz sua extractabilidade e aceitabilidade a enzimas hidrolíticas, resultando na recalcitrância da parede celular à hidrólise enzimática. O conteúdo de lignina e a eficiência de sacarificação da parede celular vegetal normalmente são altamente correlacionados negativamente. Ver, por exemplo, Chen e Dixon, Nat. Bio- technol. 25:759-761 (2007); Jorgensen et al., Biofuel Bioprod. Bior. 1:119-134 (2007); and Vinzant et al., Appl. Biochem. Biotechnol. 62:99104 (1997). Entretanto, a maioria das tentativas na redução de conteúdo de lignina durante o desenvolvimento vegetal resultou em redu-ção severa do rendimento de biomassa (Franke et al., Plant J. 30:3345 (2002); Shadle et al., Phytochemistry 68:1521-1529 (2007); e Voelker et al. Plant Physiol. 154:874-886 (2010)) e por isso, há poucas culturas agrícolas tendo redução de lignina significante. Embora estratégias de silenciamento tenham sido usadas para reduzir a quantidade de lignina em plantas, permanece uma necessidade de métodos para reduzir a lignina em tipos específicos de células e tecidos que reduzem a recalcitrância da parede celular, dessa forma melhorando a extraibi- lidade e hidrólise de açúcares fermentáveis da biomassa vegetal. BREVE SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0005] Em um aspecto, a presente invenção fornece métodos de engenharia de uma planta tendo conteúdo de lignina reduzido. Em algumas modalidades, o método compreende: introdução na planta um cassete de expressão compreendendo um polinucleotídeo que codifica uma proteína que desvia um precursor de monolignol de uma via de biossíntese de lignina (por exemplo, uma via de biossíntese de álcool p-cumarílico, álcool sinapí- lico e/ou álcool coniferílico) na planta, e em que o polinucleotídeo é operacionalmente ligado a um promotor heterólogo; e cultura da planta sob condições nas quais a proteína que desvia o precursor de monolignol da via de biossíntese de lignina é expressa.

[0006] Em algumas modalidades, a proteína reduz a quantidade do chiquimato citosólico e/ou plastidial que está disponível para a via de biossíntese de lignina. Em algumas modalidades, a proteína é a chiquimato quinase (AroK), polipeptídeo pentafuncional AROM (ARO1), desidrochiquimato desidratase (DsDH), ou desidrochiquimato desidratase (QsuB). Em algumas modalidades, a proteína é substancialmente idêntica a uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6 ou SEQ ID NO:8.

[0007] Em algumas modalidades, a proteína reduz a quantidade de fenilalanina citosólica e/ou plastidial que está disponível para a via de biossíntese de lignina. Em algumas modalidades, em que a proteína é a fenilacetaldeído sintase (PAAS) ou fenilalanina aminomutase (PAM). Em algumas modalidades, a proteína é substancialmente idêntica a uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:10 ou SEQ ID NO:29.

[0008] Em algumas modalidades, a proteína reduz a quantidade de cinamato e/ou cumarato que está disponível para a via de biossín- tese de lignina. Em algumas modalidades, a proteína é p- cumarato/cinamato carboxilmetiltransferase (CCMT1) ou ácido fenila- crílico descarboxilase (PDC). Em algumas modalidades, a proteína é substancialmente idêntica a uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:12 ou SEQ ID NO:30.

[0009] Em algumas modalidades, a proteína reduz a quantidade de cumaroil-CoA, cafeoil-CoA e/ou feruloil-CoA que estão disponíveis para a via de biossíntese de lignina. Em algumas modalidades, a proteína é dioxigenase dependente de 2-oxoglutarato (C2’H), chalcona sintase (CHS), estilbeno sintase (SPS), cucuminoide sintase (CUS) ou benzalacetona (BAS). Em algumas modalidades, a proteína é subs-tancialmente idêntica a uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO; 35, ou SEQ ID NO:36.

[00010] Em algumas modalidades, a proteína ativa ou potência uma via metabólica que compete com a via de biossíntese de lignina pelo uso de precursores de monolignol. Em algumas modalidades, a via metabólica é uma via de biossíntese de estilbeno, uma via de biossín- tese de flavonoide, uma via de biossíntese de curcuminoide ou uma via de biossíntese de benzalacetona. Em algumas modalidades, a proteína é um fator de transcrição que ativa ou potência a via de biossín- tese de flavonoide. Em algumas modalidades, a proteína é substancialmente idêntica a uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:42, SEQ ID NO:43, SEQ ID NO:44 ou SEQ ID NO:45.

[00011] Em algumas modalidades, o promotor é um promotor específico para o tecido. Em algumas modalidades, o promotor é um promotor específico para parede celular secundária ou um promotor específico para célula fibrosa. Em algumas modalidades, o promotor é um promotor IRX5. Em algumas modalidades, o promotor é de um gene que é coexpresso na via de biossíntese de lignina (via de fenilpro- panoide), por exemplo, um promotor de um gene expresso na via mostrada na Figura 1. Em algumas modalidades, o promotor é um promotor C4H, C3H, HCT, CCR1, CAD4, CAD5, F5H, PAL1, PAL2, 4CL1 ou CCoAMT.

[00012] Em algumas modalidades, a proteína que desvia um precursor de monolignol de uma via de biossíntese de lignina é direcionada a um plastídeo na planta. Em algumas modalidades, o polinucleotí- deo compreende um sinal de direcionamento de plastídeo que é substancialmente idêntico à sequência de polinucleotídeos da SEQ ID NO:15.

[00013] Em algumas modalidades, a proteína desvia um precursor de monolignol de uma via de biossíntese de álcool sinapílico e/ou de álcool coniferílico. Em algumas modalidades, a planta tem conteúdo reduzido de unidades de guaiacil (G) e siringil (S) lignina.

[00014] Em algumas modalidades, a planta (ou parte vegetal, ou semente, flor, folha ou fruta da planta) é selecionada do grupo consistindo em Arabidopsis, álamo, eucalipto, arroz, milho, switchgrass, sorgo, painço, miscanthus, cana-de-açúcar, pinheiro, alfafa, trigo, soja, cevada, gramado, tabaco, cânhamo, bambu, colza, girassol, salgueiro e Brachypodium.

[00015] Em outro aspecto, a presente invenção fornece uma célula vegetal compreendendo um polinucleotídeo que codifica uma proteína que desvia um precursor de monolignol de uma via de biossíntese de lignina na planta, em que o polinucleotídeo é operacionalmente ligado a um promotor heterólogo.

[00016] Em algumas modalidades, a célula vegetal compreende um polinucleotídeo que codifica uma proteína que reduz a quantidade de chiquimato citosólico e/ou plastidial que está disponível para a via de biossíntese de lignina. Em algumas modalidades, a proteína é chiqui- mato quinase (AroK), polipeptídeo pentafuncional AROM (ARO1), de- sidrochiquimato desidratase (DsDH), ou desidrochiquimato desidratase (QsuB). Em algumas modalidades, a proteína é substancialmente idêntica a uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6 ou SEQ ID NO:8.

[00017] Em algumas modalidades, a célula vegetal compreende um polinucleotídeo que codifica uma proteína que reduz a quantidade de fenilalanina citosólica e/ou plastidial que está disponível para a via de biossíntese de lignina. Em algumas modalidades, em que a proteína é fenilacetaldeído sintase (PAAS) ou fenilalanina aminomutase (PAM). Em algumas modalidades, a proteína é substancialmente idêntica a uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:10 ou SEQ ID NO:29.

[00018] Em algumas modalidades, a célula vegetal compreende um polinucleotídeo que codifica uma proteína que reduz a quantidade do cinamato e/ou cumarato que está disponível para a via de biossíntese de lignina. Em algumas modalidades, a proteína é p- cumarato/cinamato carboxilmetiltransferase (CCMT1) ou fenilacrílico descarboxilase (PDC). Em algumas modalidades, a proteína é substancialmente idêntica a uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:12 ou SEQ ID NO:30.

[00019] Em algumas modalidades, a célula vegetal compreende um polinucleotídeo que codifica uma proteína que reduz a quantidade de cumaroil-CoA, cafeoil-CoA e/ou feruloil-CoA que está disponível para a via de biossíntese de lignina. Em algumas modalidades, a proteína é dioxigenase 2- dependente de oxoglutarato (C2’H), chalcona sintase (CHS), estilbeno sintase (SPS), cucuminoide sintase (CUS) ou benza- lacetona (BAS). Em algumas modalidades, a proteína é substancialmente idêntica a uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO; 35, ou SEQ ID NO:36.

[00020] Em algumas modalidades, a célula vegetal compreende um polinucleotídeo que codifica uma proteína ativa ou potência uma via metabólica que compete com a via de biossíntese de lignina pelo uso de precursores de monolignol. Em algumas modalidades, a via metabólica é uma via de biossíntese de estilbeno, uma via de biossíntese de flavonoide, uma via de biossíntese de curcuminoide ou uma via de biossíntese de benzalacetona. Em algumas modalidades, a proteína é um fator de transcrição que ativa ou potência a via de biossíntese de flavonoide. Em algumas modalidades, a proteína é substancialmente idêntica a uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:42, SEQ ID NO:43, SEQ ID NO:44 ou SEQ ID NO:45.

[00021] Em algumas modalidades, a célula vegetal compreende um promotor específico para o tecido. Em algumas modalidades, o promotor é um promotor específico para a parede celular secundária ou um promotor específico a célula fibrosa. Em algumas modalidades, o promotor é um promotor IRX5. Em algumas modalidades, a célula vegetal compreende um promotor de um gene que é coexpresso na via de bi- ossíntese de lignina (via de fenilpropanoide), por exemplo, um promotor de um gene expresso na via mostrada na Figura 1. Em algumas modalidades, o promotor é um promotor C4H, C3H, HCT, CCR1, CAD4, CAD5, F5H, PAL1, PAL2, 4CL1 ou CCoAMT.

[00022] Em algumas modalidades, a célula vegetal compreende um polinucleotídeo que codifica uma proteína que desvia um precursor de monolignol de uma via de biossíntese de lignina que é direcionada a um plastídeo na planta. Em algumas modalidades, o polinucleotídeo compreende um sinal de direcionamento de plastídeo que é substancialmente idêntico à sequência de polinucleotídeos da SEQ ID NO:15.

[00023] Em outro aspecto, a presente invenção fornece plantas que compreendem uma célula vegetal como descrito neste pedido. Em algumas modalidades, a planta tem conteúdo de lignina reduzido que está substancialmente localizado no tecido da parede celular secundária ou células fibrosas da planta.

[00024] Ainda em outro aspecto, a presente invenção fornece métodos de engenharia de uma planta tendo conteúdo de lignina reduzido pela expressão ou superexpressão de um inibidor competitivo de uma enzima da via de biossíntese de lignina. Em algumas modalidades, o método compreende: introdução na planta um cassete de expressão compreendendo um polinucleotídeo que codifica uma proteína que produz um inibidor competitivo de hidroxicinamoil-CoA chiquima- to/hidroxicinamoiltransferase quinato (HCT) na planta, em que o poli- nucleotídeo é operacionalmente ligado a um promotor heterólogo; e cultura da planta sob condições nas quais a proteína que produz um inibidor competitivo de HCT é expressa.

[00025] Em algumas modalidades, a proteína produz um ou mais dos inibidores competitivos protocatechuato, gentisato, catecol, 2,3-di- hidroxibenzoato, 3,6-di-hidroxibenzoato, ou 3-hidróxi-2- aminobenzoato. Em algumas modalidades, a proteína produz o inibidor competitivo de HCT protocatechuato. Em algumas modalidades, a proteína é desidrochiquimato desidratase (QsuB), desidrochiquimato desidratase (DsDH), isocorismato sintase (ICS), ácido salicílico 3- hidroxilase (S3H), salicilato hidroxilase (nahG) ou salicilato 5- hidroxilase (nagGH).

[00026] Em algumas modalidades, o polinucleotídeo que codifica uma proteína que produz um inibidor competitivo de HCT é operacionalmente ligado a um promotor específico para o tecido. Em algumas modalidades, o promotor é um promotor específico para a parede celular secundária ou um promotor específico para célula fibrosa. Em algumas modalidades, o promotor é um promotor IRX5. Em algumas modalidades, o promotor é de um gene que é expresso na via de bios- síntese de lignina (via de fenilpropanoide), por exemplo, um promotor de um gene expresso na via mostrada na Figura 1. Em algumas modalidades, o promotor é um promotor C4H, C3H, HCT, CCR1, CAD4, CAD5, F5H, PAL1, PAL2, 4CL1 ou CCoAMT.

[00027] Ainda em outro aspecto, a presente invenção fornece uma planta, parte vegetal, ou semente, flor, folha, ou fruta da planta ou uma célula vegetal compreendendo um polinucleotídeo que codifica uma proteína que produz um inibidor competitivo de HCT na planta, em que o polinucleotídeo é operacionalmente ligado a um promotor heterólo- go.

[00028] Ainda em outro aspecto, a presente invenção fornece a biomassa compreendendo tecido vegetal de uma planta ou parte de uma planta como descrito neste pedido.

[00029] Ainda em outro aspecto, a presente invenção fornece métodos de obtenção de uma quantidade aumentada de açúcares solúveis de uma planta em uma reação de sacarificação. Em algumas modalidades, o método compreende a submissão de uma planta, como descrito neste pedido, a uma reação de sacarificação, por meio disso aumentando a quantidade de açúcares solúveis que podem ser obtidos da planta quando comparada a uma planta selvagem.

[00030] Ainda em outro aspecto, a presente invenção fornece métodos de aumentar a digestibilidade da biomassa para ruminantes. Em algumas modalidades, o método compreende a introdução de um cassete de expressão como descrito neste pedido em uma planta; cultura da planta sob condições em que a proteína que desvia o precursor de monolignol da via de biossíntese de lignina, ou a proteína que produz um inibidor competitivo de HCT, é expressa; e obtenção da biomassa da planta, por meio disso aumentando a digestibilidade da biomassa para ruminantes.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[00031] Figura 1. Representação da via de biossíntese de lignina. Via de biossíntese de lignina modificada de Fraser e Chapple (2011). Descrições de enzimas: PAL: fenilalanina amônia-liase; C4H: cinama- to-4-hidroxilase; 4CL: 4-hidroxicinamato CoA-ligase; HCT: hidroxici- namoil-CoA chiquimato/quinato hidroxicinamoiltransferase; C3’H: 4- hidroxicinamato 3-hidroxilase; CCoAOMT: cafeoil-CoA O- metiltransferase; CCR: hidroxicinamoil-CoA NADPH oxidorredutase; COMT: cafeato O-metiltransferase; CAD: álcool hidroxicinamílico desi- drogenase; F5H: ferulato 5-hidroxilase. Nome dos precursores de lig- nina: 1, fenilalanina; 2, cinamato; 3, p-cumarato; 4, p-cumaroil-CoA; 5, p-cumaroil-chiquimato/quinato (R = chiquimato/quinato); 6, cafeoil- chiquimato/quinato; 7, cafeoil-CoA; 8, feruloil-CoA; 9, p-cumaraldeído; 10, coniferaldeído; 11, 5-hidróxi-coniferaldeído; 12, sinapaldeído; 13, álcool p-cumarílico; 14, álcool coniferílico; 15, álcool sinapílico.

[00032] Figura 2. Redução de lignina via depleção de chiquimato (cossubstrato de HCT). As estratégias para redução ou depleção da quantidade de chiquimato que está disponível para a via de biossínte- se de lignina são mostradas. (1) A quantidade de chiquimato citosólico que está disponível para a via de biossíntese de lignina pode ser reduzida ou depletada expressando uma chiquimato quinase como chiqui- mato quinase de M. tuberculosis ("MtAroK"). (2) A quantidade de chi- quimato plastidial que está disponível para a via de biossíntese de lig- nina pode ser reduzida ou depletada expressando uma proteína penta- funcional arom como a proteína pentafuncional arom de S. cerevisiae ("ScAro1"). A expressão plastidial da proteína pode ser realizada através de um sinal de direcionamento de plastídeo, por exemplo, como descrito neste pedido.

[00033] Figura 3. Redução de lignina via depleção de chiquimato e produção de novos finalizadores. Estratégias para redução ou deple- ção da quantidade de chiquimato que está disponível para a via de bi- ossíntese de lignina são mostradas. Por exemplo, a quantidade de chiquimato plastidial que está disponível para a via de biossíntese de lignina pode ser reduzida ou depletada expressando uma desidrochi- quimato desidratase como a desidrochiquimato desidratase de C. glu- tamicum ("CgQsuB") ou desidrochiquimato desidratase de P. anserina ("PaDsDH"). A expressão plastidial da proteína pode ser realizada através de um sinal de direcionamento de plastídeo, por exemplo, co-mo descrito neste pedido.

[00034] Figura 4. Redução de lignina através da depleção de fenila- lanina (substrato de PAL). Estratégias para redução ou depleção da quantidade de fenilalanina que está disponível para a via de biossínte- se de lignina são mostradas. Por exemplo, a quantidade de fenilalani- na (1) citosólica e/ou (2) plastidial que está disponível para a via de biossíntese de lignina pode ser reduzida ou depletada expressando uma fenilacetaldeído sintase como fenilacetaldeído sintase de P. hybrida ("PhPAAS"). A expressão plastidial da proteína pode ser realizada através de um sinal de direcionamento de plastídeo, por exemplo, como descrito neste pedido.

[00035] Figura 5. Redução de lignina através de depleção de fenila- lanina (substrato de PAL). Estratégias para redução ou depleção da quantidade da fenilalanina que está disponível para a via de biossínte- se de lignina são mostradas. Por exemplo, a quantidade de fenilalani- na (1) citosólica e/ou (2) plastidial que está disponível para a via de biossíntese de lignina pode ser reduzida ou depletada expressando uma fenilalanina aminomutase como fenilalanina aminomutase de T. canadensis ("TcPAM"). A expressão plastidial da proteína pode ser realizada através de um sinal de direcionamento de plastídeo, por exemplo, como descrito neste pedido.

[00036] Figura 6. Redução de lignina através de depleção de cina- mato (substrato de C4H) e cumarato (substrato de 4CL). Estratégias para redução ou depleção da quantidade do cinamato e/ou p-cumarato que está disponível para a via de biossíntese de lignina são mostradas. Por exemplo, a quantidade de cinamato e/ou p-cumarato citosóli- co que está disponível para a via de biossíntese de lignina pode ser reduzida ou depletada expressando uma cinamato/p-cumarato carbo- xila metiltransferase como cinamato/p-cumarato carboxila metiltransfe- rase de O. basilicum ("ObCCMT1").

[00037] Figura 7. Redução de lignina através de depleção de cina- mato (substrato de C4H) e cumarato (substrato de 4CL). Estratégias para redução ou depleção da quantidade de cinamato e/ou p-cumarato que está disponível para a via de biossíntese de lignina são mostradas. Por exemplo, a quantidade de cinamato e/ou p-cumarato citosóli- co que está disponível para a via de biossíntese de lignina pode ser reduzida ou depletada expressando uma fenilacrílico descarboxilase (PDC ou PAD).

[00038] Figura 8. Redução de lignina através de depleção de cu- maroil-CoA (substrato de HCT). Estratégias para redução ou depleção da quantidade de cumaroil-CoA que está disponível para a via de bi- ossíntese de lignina são mostradas. Por exemplo, a quantidade de cumaroil-CoA citosólica que está disponível para a via de biossíntese de lignina pode ser reduzida ou depletada expressando uma dioxige- nase dependente de 2-oxoglutarato como C2’H de R. graveolens (dio- xigenase dependente de 2-oxoglutarato) ("RbC2’H").

[00039] Figura 9. Redução de lignina através de depleção de cu- maroil-CoA (substrato de HCT). Estratégias para redução ou depleção da quantidade de cumaroil-CoA que está disponível para a via de bi- ossíntese de lignina são mostradas. Por exemplo, a quantidade de cumaroil-CoA citosólica que está disponível para a via de biossíntese de lignina pode ser reduzida ou depletada expressando uma chalcona sintase (CHS), estilbeno sintase (SPS), cucuminoide sintase (CUS) ou benzalacetona (BAS).

[00040] Figura 10. Redução de lignina através de depleção de feru- loil-CoA (substrato de CCR). Estratégias para redução ou depleção da quantidade da de feruloil-CoA que está disponível para a via de bios- síntese de lignina são mostradas. Por exemplo, a quantidade de feru- loil-CoA citosólica que está disponível para a via de biossíntese de lig- nina pode ser reduzida ou depletada expressando uma dioxigenase dependente de 2-oxoglutarato como C2’H de R. graveolens (dioxige- nase dependente de 2-oxoglutarato) ("RbC2’H").

[00041] Figura 11. Redução de lignina através de depleção de ca- feoil-CoA feruloil-CoA (substrato de CCR). Estratégias para redução ou depleção da quantidade de cafeoil-CoA e/ou feruloil-CoA que está disponível para a via de biossíntese de lignina são mostradas. Por exemplo, a quantidade de cafeoil-CoA e/ou feruloil-CoA citosólica que está disponível para a via de biossíntese de lignina pode ser reduzida ou depletada expressando uma chalcona sintase (CHS), sintase (SPS), cucuminoide sintase (CUS) ou benzalacetona (BAS).

[00042] Figura 12. Análise de fenótipo de crescimento de linhagens S-QsuB. Foto de plantas de 3 semanas em estágio de roseta. Nenhuma diferença fenotípica pode ser observada entre linhagens S-QsuB e plantas WT no estágio de roseta.

[00043] Figura 13. Total de açúcares redutores liberado da biomassa de tronco de linhagens S-QsuB e plantas WT após incubação de 72 h com um coquetel de enzimas celulolíticas. O total de açúcares redutores liberado da biomassa após pré-tratamento com água quente (1h a 120C) e incubação com um coquetel de enzimas celulolíticas (No- vozymes Cellic® CTec2) em uma carga de 0,88% (g de enzima/g de biomassa) foi medido usando o ensaio de ácido 3,5-dinitrossalicílico como descrito em Eudes et al. 2012 (Plant Biotech Journal 10(5):609- 620).

[00044] Figura 14. Curso de tempo do total de açúcares redutores liberados da biomassa de tronco de linhagens S-QsuB e plantas WT após incubação com cargas diferentes de um coquetel de enzimas ce- lulolíticas. Curso de tempo do total de açúcares redutores liberados da biomassa após pré-tratamento com água quente (1h a 120C) e incubação com cargas diferentes (0,88%, 0,176% ou 0,088%; g de enzi- ma/g de biomassa) de um coquetel de enzimas celulolíticas (No- vozymes Cellic® CTec2). As medidas foram realizadas como descrito em Eudes et al. 2012 (Plant Biotech Journal 10(5):609-620).

[00045] Figura 15. Total de açúcares redutores liberado da biomassa de tronco de linhagens S-DsDH após incubação de 72 h com um coquetel de enzimas celulolíticas. Curso de tempo do total de açúcar redutores liberado da biomassa após pré-tratamento com água quente (1h a 120°C) e incubação com um coquetel de enzimas celulolíticas (Novozymes Cellic® CTec2) em uma carga de 0,88% (g de enzima/g de biomassa). As medidas foram realizadas como descrito em Eudes et al. 2012 (Plant Biotech Journal 10(5):609-620).

[00046] Figura 16. Expressão de QsuB em troncos de Arabidopsis. A detecção por Western blot de QsuB marcado com o peptídeo AttB2 (tamanho aproximado de 70 kDa) usando o "anticorpo universal" e proteínas de tronco de nove transformantes T2 pC4H::schl::qsuB (C4H::qsuB) independentes de 6 semanas. Um extrato de proteína de tronco selvagem foi usado como um controle negativo (WT) e um marcador Ponceau da grande subunidade de Rubisco (rbcL) é mostrado como um controle de carga.

[00047] Figura 17. Espectros 13C-1H (HSQC) de alcance limitado parcial (região aromática) do material da parede celular de troncos se- nescidos maduros de plantas selvagens (WT), pC4H::schl::qsuB-1 (C4H::qsuB-1) e pC4H::schl::qsuB-9 (C4H::qsuB-9). Proporções de monômero de lignina são fornecidas nas figuras.

[00048] Figura 18. Polidispersividade de ligninas de enzimas celu- lolíticas de linhagens selvagens e C4H::qsuB. As ligninas de enzimas celulolíticas foram purificadas de troncos senescidos maduros de plantas selvagens (WT, linha preta), pC4H::schl::qsuB-1 (C4H::qsuB-1, linha vermelha) e pC4H::schl::qsuB-9 (C4H::qsuB-9, linha púrpura) e analisadas para polidispersividade por cromatografia de exclusão de tamanho (SEC). Os cromatogramas de SEC foram obtidos usando a fluorescência UV-F (Ex250/Em450). m, peso molecular.

[00049] Figura 19. Sacarificação de biomassa de troncos senesci- dos maduros de linhagens selvagens (WT) e pC4H::schl::qsuB (C4H::qsuB). (A) Quantidades de açúcares liberadas de biomassa após vários pré-tratamentos e digestão enzimática de 72 h com celu- lase (1% p/p). Os valores são médias ± DP de quatro replicatas biológicas (n = 4). Os asteriscos indicam diferenças significantes do tipo selvagem usando o teste t de Student não pareado (*P <0,05; ** P <0,005). (B) Quantidades de açúcares liberadas da biomassa após pré-tratamento com água quente e digestão enzimática de 72 h usando duas cargas de celulase diferentes (1% ou 0,2% p/p). Os valores são médias ± DP de quatro replicatas biológicas (n = 4). Os asteriscos indicam diferenças significantes do tipo selvagem na carga de celulase de 1% usando o teste t de Student não pareado (*P <0,05; ** P <0,005).

[00050] Figura 20. Via biossintética da lignina. Abreviaturas: DAHPS, 3-desóxi-D-arabino heptulosonato 7-fosfato sintase; DHQS, 3- desidroquinato sintase; DHQD/SD, 3-desidroquinato desidratase; SK, chiquimato quinase; ESPS, 3-fosfochiquimato 1- carboxiviniltransferase; CS, corismato sintase; CM, corismato mutase; PAT, prefenato aminotransferase; ADT, arogenato desidratase; PAL, fenilalanina amônia-liase; C4H, cinamato 4-hidroxilase; CSE, cafeoil chiquimato esterase; 4CL, 4-cumarato CoA ligase; CAD, álcool cinamí- lico desidrogenase; F5H, ferulato 5-hidroxilase; C3H, cumarato 3- hidroxilase; COMT, ácido cafeico 3-O-metiltransferase; CCR, cinamoil- CoA redutase; HCT, hidroxicinamoil-coenzima A chiquimato/quinato hidroxicinamoiltransferase; CCoAOMT, cafeoil/CoA-3-O- metiltransferase; qsuB, 3-desidrochiquimato desidratase de Coryne- bacterium glutamicum.

[00051] Figura 21. Localização subcelular de SCHL-QsuB. O painel esquerdo exibe a expressão transiente da proteína de fusão SCHL- QsuB-YFP expressa sob o controle do promotor 35S em células epi- dérmicas de N. benthamiana e imageadas pela microscopia confocal de varredura a laser. O painel central exibe cloroplastos fluorescentes e o painel direito mostra as imagens fundidas (colocalizações são visíveis como pontos amarelos). Barras de escala = 20 μm.

[00052] Figura 22. Sumário das mudanças de múltiplos observadas para os metabólitos solúveis em metanol extraídos de plantas que expressam QsuB.

[00053] Figura 23. Espectros 13C-1H (HSQC) de alcance limitado parcial (região alifática) do material da parede celular de troncos se- nescidos maduros de plantas selvagens (WT), pC4H::schl::qsuB-1 (C4H::qsuB-1) e pC4H::schl::qsuB-9 (C4H::qsuB-9).

[00054] Figura 24. Marcação de lignina por floroglucinol-HCl de seções de tronco de plantas selvagens (WT) e pC4H::schl::qsuB (C4H::qsuB) de 5 semanas.

[00055] Figura 25. Cromatogramas de LC-MS de ensaios de atividade de AtHCT in vivo. São apresentados os cromatogramas de LC- MS de conjugados de cumarato produzidos por AtHCT após alimentar uma cepa de levedura recombinante que coexpressa At4CL5 e AtHCT com p-cumarato e (A) chiquimato, (B) 3,6-di-hidroxibenzoato, (C) 3- hidróxi-2-aminobenzoato, (D) 2,3-di-hidroxibenzoato, (E) catecol, ou (F) protocatechuato. As estruturas de ésteres cumarato-di- hidroxibenzoato são arbitrárias mostradas com uma ligação éster na posição 3-hidróxi do anel di-hidroxibenzoato. A estrutura de cumaroil- 3-hidroxiantranilato (C) é representada como determinado em Moglia et al. (34).

[00056] Figura 26. Cromatograma de LC-MS do p-cumaraldeído detectado em extratos solúveis em metanol de troncos de linhagens que expressam QsuB.

[00057] Figura 27. Vias do inibidor competitivo.

[00058] Figura 28. As características e as abundâncias molares relativas (%) dos compostos liberados após piro-GC/MS de troncos maduros senescidos sem extrativos de plantas selvagens (WT) e pC4H::schl::qsuB (C4H::qsuB). Os valores entre parênteses são o SE de análises duplicadas. nd, não detectado.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO I. Definições

[00059] Como usado neste pedido, o termo "via de biossíntese de lignina" refere-se a uma via enzimática (via de fenilpropanoide) em plantas nas quais os monômeros de lignina (álcool (4-hidroxicinamil) p- cumarílico, álcool (3-metóxi-4-hidroxicinamil) coniferílico e álcool (3,5- dimetóxi 4-hidroxicinamil) sinapílico) são sintetizados da fenilalanina. A via de biossíntese de lignina e os componentes enzimáticos da via são representados, por exemplo, na Figura 1.

[00060] Como usado neste pedido, o termo "precursor de monolig- nol" refere-se a um substrato da via de biossíntese de lignina que é diretamente ou indiretamente sintetizado em um monômero de lignina. Em algumas modalidades, um precursor de monolignol é um substrato da via de biossíntese de lignina que é identificada em qualquer uma das Figuras 1 a 11.

[00061] Como usado neste pedido, o termo "proteína que desvia um precursor de monolignol de uma via de biossíntese de lignina" refere- se a uma proteína que ativa, promove, potência ou aumenta a expressão de uma reação enzimática ou via metabólica que reduz a quantidade do precursor de monolignol que está disponível para a síntese de um monômero de lignina. O termo inclui variantes polimórficas, alelos, mutantes e homólogos interespécies para as proteínas específicas (por exemplo, enzimas) descritas neste pedido. Um ácido nucleico que codifica uma proteína que desvia um precursor de monolignol de uma via de biossíntese de lignina (ou um ácido nucleico que codifica uma proteína que desvia um precursor de monolignol de uma via de álcool p-cumarílico, álcool sinapílico e/ou álcool coniferílico) refere-se a um gene, pré-mRNA, mRNA, e similares, incluindo ácidos nucleicos que codificam variantes polimórficas, alelos, mutantes e homólogos inte- respécies das proteínas particulares (por exemplo, enzimas) descritas neste pedido. Em algumas modalidades, um ácido nucleico que codifica uma proteína que desvia um precursor de monolignol de uma via de biossíntese de lignina (1) tem uma sequência de ácido nucleico tendo identidade de sequência nucleotídica maior que aproximadamente 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, preferencialmente 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% ou identidade de sequência nucleotídica superior, preferencialmente sobre uma região de pelo menos aproximadamente 10, 15, 20, 25, 50, 100, 200, 500 ou mais nucleotídeos ou sobre o comprimento do polinucleotídeo inteiro, para uma sequência de ácido nucleico de qualquer uma das SEQ ID NOs:1, 3, 5, 7, 9, 11, ou 13; ou (2) codifica um polipeptídeo tendo uma sequência de aminoácidos tendo identidade de sequência de aminoá- cidos maior que aproximadamente 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, preferencialmente 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% ou maior identidade de sequência de aminoácidos, preferencialmente sobre uma região de pelo menos aproximadamente 25, 50, 100, 200 ou mais aminoácidos ou sobre o comprimento do po- lipeptídeo inteiro, para um polipeptídeo codificado por uma sequência de ácido nucleico de qualquer uma das SEQ ID NOs:1, 3, 5, 7, 9, 11, ou 13, ou a uma sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOs:2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 42, 43, 44, ou 45. Em algumas modalidades, uma proteína que desvia um precursor de monolignol de uma via de biossíntese de lignina tem uma sequência de aminoácidos tendo identidade de sequência de aminoácidos maior que aproximadamente 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, preferencialmente 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% ou maior identidade de sequência de aminoácidos, preferencialmente sobre uma região de pelo menos aproximadamente 25, 50, 100, 200 ou mais aminoácidos ou sobre o comprimento do polipeptídeo inteiro, para uma sequência de aminoá- cidos de qualquer uma das SEQ ID NOs:2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 42, 43, 44, ou 45.

[00062] O termo "proteína que produz um inibidor competitivo de HCT" refere-se a uma proteína que diretamente ou indiretamente produz uma molécula que pode competir com p-cumaroil-CoA e/ou chi- quimato como um substrato para hidroxicinamoil-CoA chiquima- to/quinato hidroxicinamoiltransferase (HCT), por meio disso atuando como um inibidor competitivo de HCT. Exemplos não limitadores das moléculas (por exemplo, metabólitos) que podem atuar como inibidores competitivos de HCT são mostrados na Figura 27. Em algumas modalidades, o inibidor competitivo de HCT é protocatechuato, cate- col, 3,6-di-hidroxibenzoato, 3-hidróxi-2-aminobenzoato, ou 2,3-di- hidroxibenzoato. Dessa forma, em algumas modalidades, a proteína que produz um inibidor competitivo de HCT é uma proteína (por exemplo, uma enzima) que diretamente ou indiretamente produz protoca- techuato, catecol, 3,6-di-hidroxibenzoato, 3-hidróxi-2-aminobenzoato, ou 2,3-di-hidroxibenzoato, incluindo, mas não limitada às enzimas de- sidrochiquimato desidratase (QsuB), desidrochiquimato desidratase (DsDH), isocorismato sintase (ICS), ácido salicílico 3-hidroxilase (S3H), salicilato hidroxilase (nahG) e salicilato 5-hidroxilase (nagGH). Em algumas modalidades, um ensaio enzimático in vivo, por exemplo, como descrito na seção Exemplos abaixo, pode ser usado para determinar se uma molécula pode competir com p-cumaroil-CoA e/ou chi- quimato como um substrato de HCT.

[00063] Os termos "polinucleotídeo" e "ácido nucleico" são usados intercambiavelmente e referem-se a um polímero de fita única ou du- pla de bases de desoxirribonucleotídeos ou ribonucleotídeos lidas da extremidade 5’ a 3’. Um ácido nucleico da presente invenção geralmente conterá ligações fosfodiéster, embora em alguns casos, os análogos de ácidos nucleicos que podem ser usados podem ter esqueletos alternativos, compreendendo, por exemplo, ligações fosforamidato, fosforotioato, fosforoditioato, ou O-metilfosforoamidito (ver Eckstein, Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, Oxford University Press); esqueletos positivos; esqueletos não iônicos e esqueletos sem riboses. Dessa forma, os ácidos nucleicos ou polinucleotídeos também podem incluir nucleotídeos modificados que permitem ser transcritos por uma polimerase. A "sequência de polinucleotídeos" ou "sequência de ácidos nucleicos" incluem tanto as fitas antissenso como senso de um ácido nucleico como fitas simples individuais ou em um dúplex. Como será apreciado por aqueles na técnica, a descrição de uma fita simples também define a sequência da fita complementar; dessa forma as sequências descritas neste pedido também fornecem o complemento da sequência. A menos que de outra maneira indicado, uma sequência de ácidos nucleicos particular também implicitamente engloba variantes destas (por exemplo, substituições de códons degeneradas) e sequências complementares, bem como a sequência explicitamente indicada. O ácido nucleico pode ser DNA, tanto genô- mico como cDNA, RNA ou um híbrido, onde o ácido nucleico pode conter combinações de desoxirribo- e ribonucleotídeos, e combinações de bases, incluindo uracila, adenina, timina, citosina, guanina, inosina, xantina, hipoxantina, isocitosina, isoguanina, etc.

[00064] O termo "substancialmente idêntico", usado no contexto de dois ácidos nucleicos ou polipeptídeos, refere-se a uma sequência que tem identidade de sequência de pelo menos 50% com uma sequência de referência. A identidade percentual pode ser qualquer número inteiro de 50% a 100%. Algumas modalidades pelo menos incluem: 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99%, em comparação com uma sequência de referência usando os programas descritos neste pedido; preferencialmente BLAST usando os parâmetros padrão, como descrito abaixo. Por exemplo, um primeiro polinucleotídeo é substancialmente idêntico a uma segunda sequência de polinucleotídeos se a primeira sequência de polinucleotídeos for pelo menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à segunda sequência de polinucleotídeos.

[00065] Diz-se que duas sequências de ácidos nucleicos ou sequências polipeptídicas sejam "idênticas" se a sequência de nucleotí- deos ou de resíduos de aminoácidos, respectivamente, nas duas sequências forem as mesmas quando alinhadas com a correspondência máxima como descrito abaixo. Os termos "idêntico" ou "identidade" percentual, no contexto de duas ou mais sequências de ácidos nuclei- cos ou de polipeptídeos, referem-se a duas ou mais sequências ou subsequências que são as mesmas ou têm uma porcentagem especificada de resíduos de aminoácidos ou de nucleotídeos que são as mesmas, quando comparadas e alinhadas com a correspondência máxima sobre uma janela de comparação, como medido usando um dos seguintes algoritmos de comparação de sequência ou por alinhamento manual e inspeção visual. Quando a porcentagem da identidade de sequência é usada em referência para proteínas ou peptídeos, é reconhecido que as posições de resíduos que muitas vezes não são idênticas se diferenciam por substituições de aminoácidos conservati- vas, onde os resíduos de aminoácidos são substituídos por outros resíduos de aminoácidos com propriedades químicas similares (por exemplo, carga ou hidrofobicidade) e por isso não modificam as propriedades funcionais da molécula. Onde as sequências se diferenciam em substituições conservativas, a identidade de sequência percentual pode ser ajustada para cima para corrigir para a natureza conservativa da substituição. Os meios para fazer este ajuste são bem conhecidos por aqueles versados na técnica. Tipicamente isto envolve a marcação de uma substituição conservativa como uma parcial em vez de uma incompatibilidade completa, por meio disso aumentando a identidade de sequência de porcentagem. Dessa forma, por exemplo, onde um aminoácido idêntico é dado um escore de 1 e uma substituição não conservativa é dado um escore de zero, uma substituição conservativa é dada um escore entre zero e 1. A marcação de substituições conser- vativas é calculada de acordo com, por exemplo, o algoritmo de Meyers & Miller, Computer Applic. Biol. Sci. 4:11-17 (1988), por exemplo, como implementado no programa PC/GENE (Intelligenetics, Mountain View, Califórnia, EUA).

[00066] Para a comparação de sequência, tipicamente uma sequência atua como uma sequência de referência, com a qual as sequências de teste são comparadas. Ao usar um algoritmo de comparação de sequência, as sequências de teste e de referência são introduzidas em um computador, as coordenadas de subsequência são designadas, se necessárias, e os parâmetros do programa de algoritmo de sequência são designados. Os parâmetros do programa pré- configurados podem ser usados, ou parâmetros alternativos podem ser designados. O algoritmo de comparação de sequência então calcula a identidade de sequência percentual das sequências de teste em relação à sequência de referência, baseado nos parâmetros do programa.

[00067] Uma "janela de comparação", como usado neste pedido, inclui referência a um segmento de qualquer um do número de posições contíguas selecionadas a partir do grupo consistindo em 20 a 600, normalmente aproximadamente 50 a aproximadamente 200, mais normalmente aproximadamente 100 a aproximadamente 150 nas quais uma sequência pode ser comparada com uma sequência de referência do mesmo número de posições contíguas após as duas sequências serem otimamente alinhadas. Os métodos de alinhamento de sequências da comparação são bem conhecidos na técnica. O alinhamento ótimo de sequências para comparação pode ser conduzido, por exemplo, pelo algoritmo de homologia local de Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981), pelo algoritmo de alinhamento de ho- mologia de Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970), pela busca por método de similaridade de Pearson & Lipman, Proc. Nat’l. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988), por implementações computadoriza-das destes algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA e TFASTA no Pacote de Programas Wisconsin Genetics, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wisconsin), ou por alinhamento manual e inspeção visual.

[00068] Os algoritmos que são adequados para determinar a identidade de sequência percentual e a similaridade de sequência são os algoritmos BLAST e BLAST 2.0, que são descritos em Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-410 e Altschul et al. (1977) Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402, respectivamente. O programa para realizar análises BLAST está publicamente disponível no sítio Web do Centro Nacional de Informação Biotecnológica (NCBI). O algoritmo primeiro envolve identificação de pares de sequência de alto escore (HSPs) identificando palavras curtas de comprimento W na sequência de consulta, que combine ou satisfaça algum escore de limiar de valor positivo T quando alinhada com uma palavra do mesmo comprimento em uma sequência do banco de dados. T é referido como o limiar de escore de palavra de vizinhança (Altschul et al, supra). Estes acertos de palavras de vizinhança inicial atuam como sementes para iniciar buscar para encontrar HSPs mais longos que os contém. Os acertos de palavra então são estendidos em ambas as direções ao longo de cada se- quência para tão longe quanto o escore de alinhamento cumulativo possa ser aumentado. O grande número cumulativo é calculado usando, para sequências nucleotídicas, os parâmetros M (escore de recompensa de um par de combinação com resíduos; sempre >0) e N (escore de penalidade para incompatibilidade de resíduos; sempre <0). Para sequências de aminoácidos, uma matriz de marcação é usada para calcular o escore cumulativo. A extensão dos acertos de palavra em cada direção é parada quando: o escore de alinhamento cumulativo cai pela quantidade X do seu valor alcançado máximo; o escore cumulativo vai a zero ou abaixo, devido ao acúmulo de um ou mais alinhamentos de resíduos marcam de escore negativo; ou a extremi-dade de qualquer sequência for alcançada. Os parâmetros do algoritmo de BLAST W, T, e X determinam a sensibilidade e a velocidade do alinhamento. O programa BLASTN (para sequências nucleotídicas) usa como pré-configurados um tamanho de palavra (W) de 28, uma expectativa (E) de 10, M=1, N =-2, e uma comparação de ambas as fitas. Para sequências de aminoácidos, o programa BLASTP usa como pré-configurados um tamanho de palavra (W) de 3, uma expectativa (E) de 10, e a matriz de marcação BLOSUM62 (ver Henikoff & Heni- koff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915 (1989)).

[00069] O algoritmo BLAST também realiza uma análise estatística da similaridade entre duas sequências (ver, por exemplo, Karlin & Al- tschul, Proc. Nat’l. Acad. Sci. USA 90:5873-5787 (1993)). Uma medida da similaridade fornecida pelo algoritmo de BLAST é a probabilidade de menor soma (P(N)), que fornece uma indicação da probabilidade pela qual uma combinação entre duas sequências de nucleotídeos ou de aminoácidos ocorreria por acaso. Por exemplo, um ácido nucleico é considerado similar a uma sequência de referência se a probabilidade de menor soma em uma comparação do ácido nucleico de teste ao ácido nucleico de referência for menor que aproximadamente 0,01, mais preferencialmente menor que aproximadamente 10-5, e ainda mais preferencialmente menor que aproximadamente 10-20.

[00070] As sequências de ácidos nucleicos ou de proteínas que são substancialmente idênticas a uma sequência de referência incluem "variantes modificadas conservativamente". Com respeito a sequências de ácidos nucleicos particulares, as variantes modificadas conser- vativamente referem-se àqueles ácidos nucleicos que codificam sequências de aminoácidos idênticas ou essencialmente idênticas, ou onde o ácido nucleico não codifica uma sequência de aminoácidos, a sequências essencialmente idênticas. Por causa da degeneração do código genético, um grande número de ácidos nucleicos funcionalmente idênticos codificam qualquer proteína dada. Por exemplo, os códons GCA, GCC, GCG e GCU, todos codificam o aminoácido alanina. Dessa forma, em cada posição onde uma alanina é especificada por um códon, o códon pode ser alterado para qualquer um dos códons cor-respondentes descritos sem alterar o polipeptídeo codificado. Tais variações de ácidos nucleicos são "variações silenciosas", que são uma espécie de variações modificadas conservativamente. Cada sequência de ácidos nucleicos, neste pedido, que codifica um polipeptídeo também descreve cada variação silenciosa possível do ácido nucleico. Um versado reconhecerá que cada códon em um ácido nucleico (exceto AUG, que é ordinariamente o único códon de metionina) pode ser modificado para produzir uma molécula funcionalmente idêntica. Consequentemente, cada variação silenciosa de um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo é implícita em cada sequência descrita.

[00071] Quanto a sequências de aminoácidos, um versado reconhecerá que as substituições individuais, em um ácido nucleico, peptí- deo, polipeptídeo ou sequência proteica que altera um aminoácido único ou pequena porcentagem de aminoácidos na sequência codificada são uma "variante modificada conservativamente" onde a altera- ção resulta na substituição de um aminoácido por um aminoácido qui-micamente similar. As tabelas de substituição conservativas que fornecem aminoácidos funcionalmente similares são bem conhecidas na técnica.

[00072] Os seis seguintes grupos, cada um contém aminoácidos que são substituições conservativas entre si: 1) Alanina (A), Serina (S), Treonina (T); 2) Ácido aspártico (D), Ácido glutâmico (E); 3) Asparagina (N), Glutamina (Q); 4) Arginina (R), Lisina (K); 5) Isoleucina (I), Leucina (L), Metionina (M), Valina (V); e 6) Fenilalanina (F), Tirosina (Y), Triptofano (W). (ver, por exemplo, Creighton, Proteins (1984)).

[00073] Outra indicação que as sequências nucleotídicas são subs-tancialmente idênticas consiste em se duas moléculas se hibridizarem entre si ou com um terceiro ácido nucleico, sob condições estringen- tes. As condições estringentes são dependentes de sequência e serão diferentes em circunstâncias diferentes. Geralmente, condições estrin- gentes são selecionadas para serem aproximadamente 5°C mais baixas do que o ponto de fusão térmica (Tm) da sequência específica em uma força iônica e pH definidos. A Tm é a temperatura (sob força iôni- ca e pH definidos) no qual 50% da sequência alvo se hibridiza com uma sonda perfeitamente combinada. Tipicamente, as condições es- tringentes serão aquelas nas quais a concentração salina é aproximadamente 0,02 molar em pH 7 e a temperatura pelo menos é aproximadamente 60°C. Por exemplo, condições estringentes de hibridização, como hibridizações RNA-DNA em uma técnica de blotting são aquelas que incluem pelo menos uma lavagem em SSC 0,2X a 55°C por 20 minutos ou condições equivalentes.

[00074] Como usado neste pedido, o termo "promotor" refere-se a uma sequência de polinucleotídeos capaz de conduzir a transcrição de uma sequência de DNA em uma célula. Dessa forma, os promotores usados nas construções de polinucleotídeo da invenção incluem um elemento de controle transcricional cis- e trans-atuante e sequências reguladoras que estão envolvidas em regulação ou modulação da temporização e/ou taxa de transcrição de um gene. Por exemplo, um promotor pode ser um elemento de controle transcricional cis-atuante, incluindo um acentuador, um promotor, um terminador de transcrição, uma origem de replicação, uma sequência de integração cromossômi- ca, regiões 5’ e 3’ não traduzidas ou sequência intrônica, que estão envolvidos na regulação transcricional. Estas sequências cis-atuantes tipicamente interagem com proteínas ou outras biomoléculas para realizar (ligar/desligar, regular, modular, etc.) a transcrição gênica. Os promotores estão localizados 5’ em relação ao gene transcrito e, como usado neste pedido, incluem a sequência 5’ do códon de início de tradução (isto é, incluindo a região 5’ não traduzida do mRNA, tipicamente compreendendo 100-200 pb). Muitas vezes, as sequências promotoras principais estão em 1-5 kb do sítio de início de tradução, muitas vezes em 1 kpb e muitas vezes em 500 pb do sítio de início de tradu-ção. Por convenção, a sequência promotora é normalmente fornecida como a sequência na fita de codificação do gene que controla.

[00075] Um "promotor constitutivo" é aquele que é capaz de iniciar a transcrição em quase todos os tipos celulares, ao passo que um "promotor específico para o tipo de célula" inicia a transcrição somente em um ou alguns tipos de células particulares ou grupos de células que formam um tecido. Em algumas modalidades, o promotor é específico para parede celular secundária e/ou específico para célula fibrosa. Um "promotor específico para célula fibrosa" refere-se a um promotor que inicia substancialmente níveis mais altos de transcrição em células fibrosas quando comparadas com outras células não fibrosas da planta. Um "promotor específico para a parede celular secundária" refere-se a um promotor que inicia substancialmente níveis mais altos de transcrição em tipos de células que têm paredes celulares secundárias, por exemplo, tecidos lignificados como vasos e fibras, que podem ser encontrados em madeira e células da casca de uma árvore, bem como outras partes de plantas como a haste da folha. Em algumas modalidades, um promotor é específico para célula fibrosa ou específico para a parede celular secundária se os níveis de transcrição iniciados pelo promotor em células fibrosas ou paredes celulares secundárias, respectivamente, pelo menos forem de 3 vezes, de 4 vezes, de 5 vezes, de 6 vezes, de 7 vezes, de 8 vezes, de 9 vezes, de 10 vezes, de 50 vezes, de 100 vezes, de 500 vezes, de 1000 vezes superior ou mais quando comparados com os níveis de transcrição iniciados pelo promotor em outros tecidos, resultando na proteína codificada substancialmente localizada em células vegetais que possuem células fibrosas ou parede celular secundária, por exemplo, o tronco de uma planta. Exemplos não limitantes de promotores específicos para célula fibrosa ou para a parede celular secundária incluem os promotores direcionando a expressão dos genes IRX1, IRX3, IRX5, IRX7, IRX8, IRX9, IRX10, IRX14, NST1, NST2, NST3, MYB46, MYB58, MYB63, MYB83, MYB85, MYB103, PAL1, PAL2, C3H, CcOAMT, CCR1, F5H, LAC4, LAC17, CADc e CADd. Ver, por exemplo, Turner et al 1997; Meyer et al 1998; Jones et al 2001; Franke et al 2002; Ha et al 2002;Rohde et al 2004; Chen et al 2005; Stobout et al 2005; Brown et al 2005; Mitsuda et al 2005; Zhong et al 2006; Mitsuda et al 2007; Zhong et al 2007a, 2007b; Zhou et al 2009; Brown et al 2009; McCarthy et al 2009; Ko et al 2009; Wu et al 2010; Berthet et al 2011. Em algumas modalidades, um promotor é substancialmente idêntico a um promotor da via de biossíntese de lignina (por exemplo, um promotor de um gene que codifica uma proteína mostrada na Figura 1). Exem- plos não limitantes de sequências promotoras são fornecidos neste pedido como as SEQ ID NOs:17-28. Um promotor originado de uma espécie de plantas pode ser usado para direcionar a expressão gênica em outra espécie de plantas.

[00076] Um polinucleotídeo é "heterólogo" a um organismo ou uma segunda sequência de polinucleotídeos se o mesmo se originar de uma espécie estranha, ou, se da mesma espécie, for modificado da sua forma original. Por exemplo, quando se diz que um polinucleotídeo que codifica uma sequência polipeptídica está operacionalmente ligado a um promotor heterólogo, significa que o polinucleotídeo que codifica sequência que codifica o polipeptídeo é derivado de uma espécie ao passo que a sequência promotora é derivada de outras espécies diferentes; ou, se ambos são derivados das mesmas espécies, a sequência de codificação não está associada naturalmente com o promotor (por exemplo, é uma sequência de codificação geneticamente engendrada, por exemplo, de um gene diferente nas mesmas espécies ou alelo de um ecotipo diferente ou variedade ou um gene que não é naturalmente expresso no tecido alvo).

[00077] O termo "operacionalmente ligado" refere-se a uma relação funcional entre dois ou mais segmentos de polinucleotídeos (por exemplo, DNA). Tipicamente, refere-se à relação funcional de uma sequência reguladora transcricional a uma sequência transcrita. Por exemplo, uma sequência promotora ou acentuadora é operacionalmente ligada à sequência de DNA ou de RNA se estimular ou modular a transcrição da sequência de DNA ou de RNA em uma célula hospedeira apropriada ou outro sistema de expressão. Geralmente, as sequências reguladoras transcricionais promotoras, que são operacionalmente ligadas a uma sequência transcrita, são fisicamente contí-guas com a sequência transcrita, isto é, são cis atuantes. Entretanto, algumas sequências reguladoras transcricionais, como acentuadores, não têm de ser fisicamente contíguas ou localizadas na proximidade imediata com as sequências de codificação cuja transcrição aumenta.

[00078] O termo "cassete de expressão" refere-se a uma construção de ácido nucleico que, quando introduzido em uma célula hospedeira, resulta em transcrição e/ou tradução de RNA ou polipeptídeo, respectivamente. As construções antissenso ou senso que não são ou não podem ser traduzidas estão expressamente incluídas por esta definição. Tanto em caso de expressão de transgenes como em caso de supressão de genes endógenos (por exemplo, por supressão antis- senso, de RNAi ou senso) um versado reconhecerá que a sequência de polinucleotídeos inserida não precisa ser idêntica, mas somente pode ser substancialmente idêntica a uma sequência do gene do qual foi derivado. Como explicado neste pedido, estas variantes substancialmente idênticas são especificamente cobertas em relação a uma sequência de ácidos nucleicos específica.

[00079] O termo "planta", como usado neste pedido, refere-se a plantas inteiras e inclui plantas de uma variedade de níveis de ploidia, incluindo aneuploide, poliploide, diploide e haploide. O termo "parte vegetal," como usado neste pedido, refere-se a órgãos vegetativos de brotos e/ou estruturas (por exemplo, folhas, troncos e tubérculos), ramos, raízes, flores e órgãos florais (por exemplo, brácteas, sépalas, pétalas, estames, carpelos, anteras), óvulos (incluindo ovo e células centrais), semente (incluindo zigoto, embrião, endosperma e revestimento da semente), fruta (por exemplo, o ovário maduro), mudas, e tecido vegetal (por exemplo, tecido vascular, tecido triturado, e similares), bem como células vegetais individuais, grupos de células vegetais (por exemplo, células vegetais cultivadas), protoplastos, extratos vegetais e sementes. A classe das plantas que podem ser usadas nos métodos da invenção é geralmente tão ampla como a classe das plantas superiores e inferiores acessíveis a técnicas de transformação, in- cluindo angiospermas (plantas monocotiledôneas e dicotiledôneas), gimnospermas, samambaias e algas multicelulares.

[00080] O termo "biomassa", como usado neste pedido, refere-se ao material vegetal que é processado para fornecer um produto, por exemplo, um biocombustível como etanol, ou ração de gado ou uma celulose para produtos da indústria de polpa e papel. Tal material vegetal pode incluir plantas inteiras ou partes de plantas, por exemplo, troncos, folhas, ramos, brotos, raízes, tubérculos e similares.

[00081] O termo "conteúdo de lignina reduzido" engloba quantidade reduzida do polímero de lignina, quantidade reduzida de uma ou ambas unidades de guaiacil (G) e/ou siringil (S) lignina, tamanho reduzido de um polímero de lignina, por exemplo, uma cadeia de polímero de lignina mais curta devido a um número menor de monolignóis que são incorporados no polímero, um grau reduzido de ramificação do polímero de lignina ou preenchimento de espaço reduzido (também chamado de um volume preenchido reduzido). Em algumas modalidades, um polímero de lignina reduzido pode ser mostrado pela detecção de uma redução no peso molecular do polímero ou uma redução no número de monolignóis em pelo menos 2%, 5%, 10%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, ou mais, quando comparado com a molécula de lignina média em uma planta controle (por exemplo, uma planta não transgênica). Em algumas modalidades, o conteúdo de lignina reduzido pode ser mostrado pela detecção de uma redução no número ou quantidade de unidades de guaiacil(G) e/ou siringil (S) lignina na planta quando comparada com uma planta controle (por exemplo, uma planta não trans- gênica). Em algumas modalidades, uma planta, como descrita neste pedido, tem reduzido conteúdo de lignina se a quantidade de unidades de guaiacil (G) e/ou siringil (S) lignina na planta for reduzida em pelo menos aproximadamente 2%, 5%, 10%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50% ou mais, quando comparada com uma planta controle. Os métodos para detectar o conteúdo de lignina reduzido são descritos detalhadamente abaixo.

II. Introdução

[00082] As paredes celulares vegetais constituem uma rede polis- sacarídica de microfibrilas de celulose e hemicelulose introduzida em um polímero aromático conhecido como lignina. Este polímero ramificado é principalmente composto de três fenólicos derivados de fenil- propanoide (isto é, monolignóis) denominados álcoois p-cumarílico, coniferílico, e sinapílico que representam unidades p-hidroxifenil (H), guaiacil (G) e siringil (S) lignina (Boerjan et al., 2003). Os monolignóis têm um esqueleto de carbono C6C3 que consiste em um anel fenila (C6) e uma cadeia lateral de propano (C3). A lignina é crucial para o desenvolvimento de plantas terrestres conforme confere recalcitrância a paredes celulares vegetais. Também fornece resistência mecânica para o crescimento vertical, confere hidrofobicidade a vasos que transportam água e atua como uma barreira física contra patógenos que degradam as paredes celulares (Boudet, 2007). Notavelmente, o conteúdo de lignina e a composição são finamente regulados em resposta a estresses bióticos e abióticos ambientais (Moura et al., 2010).

[00083] Economicamente, a biomassa lignocelulósica de paredes celulares vegetais é largamente usada como matéria-prima para a produção de polpa na indústria de papel e como ração de gado ruminante. As matérias-primas vegetais também representam uma fonte de açúcares fermentáveis para a produção de moléculas sintéticas como produtos farmacêuticos e combustíveis de transporte usando micror-ganismos engendrados (Keasling, 2010). Entretanto, existem correlações negativas entre o conteúdo de lignina na biomassa vegetal e rendimento de polpa, digestibilidade de forragem ou hidrólise enzimática de polissacarídeos (de Vrije et al., 2002; Reddy et al., 2005; Dien et al., 2006; Chen and Dixon, 2007; Dien et al., 2009; Taboada et al., 2010; Elissetche et al., 2011; Studer et al., 2011). Consequentemente, reduzir a recalcitrância de lignina em matérias-primas vegetais é um foco principal de interesse, especialmente no campo de biocombustíveis lignocelulósicos para o qual a conversão enzimática eficiente de polis- sacarídeos em monossacarídeos é crucial para alcançar produção economicamente e ambientalmente sustentável (Carroll e Somerville, 2009).

[00084] A biossíntese de lignina é bem caracterizada e bem conservada através de plantas terrestres (Weng e Chapple 2010). Modificações genéticas como silenciamento de genes envolvidos em etapas particulares desta via ou sua regulação foram empregadas para reduzir o conteúdo de lignina (Simmons et al., 2010; Umezawa, 2010) mas esta abordagem muitas vezes resulta em fenótipos indesejados como nanismo, esterilidade, redução da biomassa vegetal, e suscetibilidade aumentada ao estresse ambiental e patógenos (Bonawitz e Chapple, 2010). Estes efeitos pleiotrópicos são geralmente as consequências de uma perda da integridade de parede celular secundária, o acúmulo de intermediários tóxicos, ativação constitutiva de respostas de defesa ou depleção de outros metabólitos derivados de fenilpropanoide que são essenciais para desenvolvimento e defesa vegetal (Li et al., 2008; Na- oumkina et al., 2010, Gallego-Giraldo et al., 2011). Alternativamente, modificação da estrutura recalcitrante e propriedades físico-químicas da lignina pode ser alcançada modificando sua composição de monô- mero. Por exemplo, a incorporação de coniferil ferulato na lignina melhora a degradação enzimática de polissacarídeos de paredes celulares (Grabber et al., 2008). Recentemente, demonstrou-se que o enriquecimento em unidades 5-hidróxi-G e redução de unidades S na lig- nina contribui para eficiências de sacarificação aumentadas sem afetar drasticamente os rendimentos de biomassa e conteúdo de lignina (Weng et al., 2010; Dien et al., 2011; Fu et al., 2011).

[00085] A presente invenção fornece uma estratégia alternativa para reduzir o conteúdo de lignina (por exemplo, reduzindo a quantidade de unidades p-hidroxifenil (H), guaiacil (G) e/ou siringil (S) lignina ou qualquer combinação de unidades H-lignina, G-lignina e S-lignina). Nesta estratégia, a planta é engendrada para expressar uma ou mais proteínas que desvia ou deriva um precursor de monolignol de uma via de biossíntese de lignina (por exemplo, uma via álcool p-cumarílico, álcool sinapílico e/ou álcool coniferílico) em uma via competitiva. Desviando ou derivando a produção de precursores de monolignol da produção de unidade p-hidroxifenil (H), guaiacil (G) e/ou siringil (S) lignina para a produção de produtos alternativos (por exemplo, estilbenos, fla- vonoides, curcuminoides ou benzalacetonas, protocatechuatos, ami- noácidos aromáticos, vitaminas, quinonas ou compostos voláteis) como descritos neste pedido, a quantidade de conteúdo de lignina ou sua composição, por exemplo, em tipos específicos de células ou tecidos como na parede celular secundária, pode ser alterada a fim de aumentar as eficiências de sacarificação sem afetar dramaticamente o rendimento de biomassa. A presente invenção também fornece plantas que são engendradas pelo método descrito neste pedido, bem como uma célula vegetal de tal planta, uma semente, flor, folha ou fruta de tal planta, uma célula vegetal que contém um cassete de expressão descrito neste pedido para expressar uma proteína desvia ou deriva um precursor de monolignol de uma via de biossíntese de lignina em uma via competitiva e biomassa que compreende tecido vegetal da planta ou parte da planta descrita neste pedido.

III. Plantas Tendo Conteúdo de Lignina Reduzido A . Expressão de uma Proteína que Desvia um Precursor de Monolignol de uma Via de Biossíntese de Lignina

[00086] Em um aspecto, a presente invenção fornece um método de engenharia de uma planta tendo conteúdo de lignina reduzido (por exemplo, quantidade reduzida de polímeros de lignina, tamanho reduzido de polímeros de lignina, grau reduzido de ramificação de polímeros de lignina ou preenchimento de espaço reduzido). Em algumas modalidades, a planta tem conteúdo reduzido de lignina que está substancialmente localizado em tipos específicos de células e/ou tecidos na planta. Por exemplo, em algumas modalidades, a planta tem conteúdo reduzido de lignina que está substancialmente localizado em paredes celulares secundárias e/ou células fibrosas. Em algumas modalidades, o método compreende: introdução na planta de um cassete de expressão compreendendo um polinucleotídeo que codifica uma proteína que desvia um precursor de monolignol de uma via de biossíntese de lignina (por exemplo, uma via de biossíntese de álcool p-cumarílico, álcool sinapí- lico e/ou álcool coniferílico) na planta, e em que o polinucleotídeo é operacionalmente ligado a um promotor específico para o tecido hete- rólogo; e cultura da planta sob condições nas quais a proteína que desvia o precursor de monolignol da via de biossíntese de lignina (por exemplo, a via de biossíntese de álcool p-cumarílico, álcool sinapílico e/ou álcool coniferílico) é expressa.

[00087] Em algumas modalidades, o gene que codifica uma proteína que desvia um precursor de monolignol de uma via de biossíntese de lignina (por exemplo, uma via de biossíntese de álcool p-cumarílico, álcool sinapílico e/ou álcool coniferílico) reduz a quantidade do chiqui- mato citosólico e/ou plastidial que está disponível para a via de bios- síntese de álcool p-cumarílico, álcool sinapílico e/ou álcool coniferílico; reduz a quantidade da fenilalanina citosólica e/ou plastidial que está disponível para a via de biossíntese de álcool p-cumarílico, álcool si- napílico e/ou álcool coniferílico; reduz a quantidade do cinamato e/ou cumarato que está disponível para a via de biossíntese de álcool p- cumarílico, álcool sinapílico e/ou álcool coniferílico; e/ou reduz a quantidade de cumaroil-CoA, cafeoil-CoA e/ou feruloil-CoA que está disponível para a via de biossíntese de álcool p-cumarílico, álcool sinapílico e/ou álcool coniferílico. Em algumas modalidades, o gene que codifica uma proteína que desvia um precursor de monolignol de uma via de biossíntese de lignina (por exemplo, uma via de biossíntese de álcool p-cumarílico, álcool sinapílico e/ou álcool coniferílico) ativa ou potência uma via metabólica que compete com a via de biossíntese de álcool p- cumarílico, álcool sinapílico ou álcool coniferílico para o uso de precursores de monolignol, incluindo, mas não limitada a uma via metabólica selecionada a partir de uma via de biossíntese de estilbeno, uma via de biossíntese de flavonoide e uma via de biossíntese de antocianina.

[00088] Um cassete de expressão, como descrito neste pedido, quando introduzido em uma planta, resulta na planta tendo conteúdo de lignina reduzido (por exemplo, quantidade reduzida de polímeros de lignina, tamanho reduzido de polímeros de lignina, grau reduzido da ramificação de polímeros de lignina ou preenchimento de espaço reduzido) que está especificamente localizado em certos tipos de células e/ou tecidos (por exemplo, especificamente localizado em paredes celulares secundárias e/ou células fibrosas), dessa forma reduzindo a recalcitrância da parede celular à hidrólise enzimática ao evitar defeitos no crescimento vegetal ou reduções do rendimento de biomassa.

[00089] Um versado na técnica entenderá que a proteína que desvia um precursor de monolignol de uma via de biossíntese de lignina que é introduzida na planta por um cassete de expressão descrito neste pedido não precisa ser idêntica às sequências proteicas descritas neste pedido (por exemplo, as sequências proteicas das SEQ ID NOs:2, 4, 6, 8, 10, 12, ou 14). Em algumas modalidades, a proteína que é introduzida na planta por um cassete de expressão é substancialmente idêntica (por exemplo, pelo menos 50%, pelo menos 55%, pe- lo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, ou pelo menos 99% idêntica) a uma sequência proteica descrita neste pedido (por exemplo, uma sequência proteica das SEQ ID NOs:2, 4, 6, 8, 10, 12, ou 14). Em algumas modalidades, a proteína que é introduzida na planta por um cassete de expressão é um homólogo, ortólogo ou parálogo de uma proteína que desvia um precursor de monolignol de uma via de biossíntese de lignina como descrito neste pedido (por exemplo, uma sequência proteica das SEQ ID NOs:2, 4, 6, 8, 10, 12, ou 14).

[00090] Sequências gênicas e de proteínas para enzimas que desviam um precursor de monolignol de uma via de biossíntese de lignina são descritas na Listagem de Sequências neste pedido. Adicionalmente, as sequências gênicas e de proteínas para estas proteínas e métodos para obter os genes ou proteínas, são conhecidos e descritos na técnica. Um versado na técnica reconhecerá que estas sequências gênicas ou de proteínas conhecidas na técnica e/ou como descritas neste pedido podem ser modificadas para produzir enzimas substancialmente idênticas, por exemplo, fazendo substituições conservativas em um ou mais resíduos de aminoácido. Um versado também reconhecerá que as sequências conhecidas fornecem orientação quanto ao que os aminoácidos podem ser variados para produzir uma enzima substancialmente idêntica. Por exemplo, usando um alinhamento de sequências de aminoácidos entre duas ou mais sequências proteicas, um versado reconhecerá que resíduos de aminoácido não são altamente conservados e dessa forma podem ser provavelmente modificados sem resultar em um efeito significante sobre a função da enzima. Proteínas que Reduzem a Quantidade de Chiquimato

[00091] Em algumas modalidades, uma proteína que desvia um precursor de monolignol de uma via de biossíntese de lignina reduz a quantidade de chiquimato citosólico e/ou plastidial que está disponível para a via de biossíntese de lignina. Exemplos de tal proteína são mostrados nas Figuras 2 e 3. Em algumas modalidades, a proteína é uma enzima que modifica um substrato de chiquimato, por exemplo, uma chiquimato quinase ou uma proteína pentafuncional arom. Em algumas modalidades, a proteína é uma enzima que utiliza chiquimato na síntese de outro composto (por exemplo, um protocatechuato, um aminoácido aromático, uma vitamina ou uma quinona), por exemplo, uma desidrochiquimato desidratase.

[00092] Exemplos não limitantes de uma enzima de chiquimato qui- nase são descritos em Gu et al., J. Mol. Biol. 319:779-789 (2002). Em algumas modalidades, a proteína é uma chiquimato quinase de Mycobacterium tuberculosis (AroK) tendo a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO:2. Em algumas modalidades, a proteína é substancialmente idêntica (por exemplo, pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, ou pelo menos 99% idêntica) à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:2. Em algumas modalidades, a proteína é um homólogo de uma chiquimato quinase de Mycobacterium tuberculosis (AroK) tendo a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO:2. Em algumas modalidades, um polinucleotídeo que codifica a chiquimato quinase compreende uma sequência de polinucleotídeos que é idêntica ou substancialmente idêntica (por exemplo, pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo me- nos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, ou pelo menos 99% idêntica) à SEQ ID NO:1.

[00093] Exemplos não limitantes da proteína são descritos em Duncan et al., Biochem. J. 246:375-386 (1987). Em algumas modalidades, a proteína é a enzima pentafuncional arom de Saccharomyces cerevi- siae (Aro1) tendo sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO:4. Em algumas modalidades, a proteína é substancialmente idêntica (por exemplo, pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, ou pelo menos 99% idêntica) à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:4. Em algumas modalidades, a proteína é um homólogo da enzima pentafuncional arom de Saccharomyces cerevisiae (Aro1) tendo a sequência de ami- noácidos apresentada na SEQ ID NO:4. Em algumas modalidades, um polinucleotídeo que codifica a proteína pentafuncional arom compreende uma sequência de polinucleotídeos que é idêntica ou substancialmente idêntica (por exemplo, pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, ou pelo menos 99% idêntica) à SEQ ID NO:3.

[00094] Exemplos não limitantes de desidrochiquimato desidratase são descritos em Teramoto et al., Appl. Environ. Microbiol. 75:34613468 (2009) e Hansen et al., Appl. Environ. Microbiol. 75:2765-2774 (2009). Em algumas modalidades, a proteína é desidrochiquimato de- sidratase de Corynebacterium glutamicum (QsuB) tendo a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO:6 ou desidrochiquimato desidratase de Podospora anserina (DsDH) tendo a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO:8. Em algumas modalidades, a proteína é substancialmente idêntica (por exemplo, pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, ou pelo menos 99% idêntica) à sequência de aminoá- cidos da SEQ ID NO:6 ou SEQ ID NO:8. Em algumas modalidades, a proteína é um homólogo de desidrochiquimato desidratase de Coryne- bacterium glutamicum (QsuB) tendo a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO:6 ou um homólogo de desidrochiquimato desidratase de Podospora anserina (DsDH) tendo a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO:8. Em algumas modalidades, um polinucleotídeo que codifica a desidrochiquimato desidratase compreende uma sequência de polinucleotídeos que é idêntica ou subs-tancialmente idêntica (por exemplo, pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, ou pelo menos 99% idêntica) à SEQ ID NO:5 ou SEQ ID NO:7.

Proteínas que Reduzem a Quantidade de Fenilalanina

[00095] Em algumas modalidades, uma proteína que desvia um precursor de monolignol de uma via de biossíntese de lignina reduz a quantidade da fenilalanina citosólica e/ou plastidial que está disponível para a via de biossíntese de lignina. Exemplos de tal proteína são mostrados nas Figuras 4 e 5. Em algumas modalidades, a proteína é uma enzima que modifica um substrato de fenilalanina. Em algumas modalidades, a proteína é uma enzima que utiliza a fenilalanina na síntese de outro composto (por exemplo, um composto volátil), por exemplo, uma fenilacetaldeído sintase ou uma fenilalanina aminomutase.

[00096] Exemplos não limitantes de uma fenilacetaldeído sintase são descritos em Kaminaga et al., J. Biol. Chem. 281:23357-23366 (2006) e em Farhi et al., Plant Mol. Biol. 72:235-245 (2010). Em algumas modalidades, a proteína é uma fenilacetaldeído sintase de Petunia hybrida (PAAS) tendo a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO:10. Em algumas modalidades, a proteína é substancialmente idêntica (por exemplo, pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, ou pelo menos 99% idêntica) à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:10. Em algumas modalidades, a proteína é um homólogo de uma fenilace- taldeído sintase de Petunia hybrida (PAAS) tendo a sequência de ami- noácidos apresentada na SEQ ID NO:10. Em algumas modalidades, um polinucleotídeo que codifica a fenilacetaldeído sintase compreende uma sequência de polinucleotídeos que é idêntica ou substancialmente idêntica (por exemplo, pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, ou pelo menos 99% idêntica) à SEQ ID NO:9.

[00097] Exemplos não limitantes da fenilalanina aminomutase são descritos em Feng et al., Biochemistry 50:2919-2930 (2011). Em algumas modalidades, a proteína é uma fenilalanina aminomutase de T. canadensis (PAM) tendo a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO:29. Em algumas modalidades, a proteína é substancialmente idêntica (por exemplo, pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, ou pelo menos 99% idêntica) à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:29. Em algumas modalidades, a proteína é um homólogo de uma fenilala- nina aminomutase de T. canadensis (PAM) tendo a sequência de ami- noácidos apresentada na SEQ ID NO:29.

Proteínas que Reduzem a Quantidade de Cinamato e/ou Cumarato

[00098] Em algumas modalidades, uma proteína que desvia um precursor de monolignol de uma via de biossíntese de lignina reduz a quantidade de cinamato e/ou cumarato que está disponível para a via de biossíntese de lignina. Exemplos de tal proteína são mostrados nas Figuras 6 e 7. Em algumas modalidades, a proteína é uma enzima que modifica um substrato de cinamato e/ou cumarato, por exemplo, uma carboxila cinamato/p-cumarato metiltransferase. Em algumas modalidades, a proteína é uma enzima que utiliza cinamato e/ou cumarato na síntese de outro composto (por exemplo, um composto volátil, por exemplo, estireno ou p-hidroxiestireno), por exemplo, ácido fenilacrílico descarboxilase ou ácido ferúlico descarboxilase.

[00099] Exemplos não limitantes da enzima cinamato/p-cumarato carboxila metiltransferase são descritos em Kapteyn et al., Plant Cell 19:3212-3229 (2007). Em algumas modalidades, a proteína é cinama- to/p-cumarato carboxila metiltransferase de Ocimum basilicum (CCMT) tendo a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO:12. Em algumas modalidades, a proteína é substancialmente idêntica (por exemplo, pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, ou pelo menos 99% idêntica) à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:12. Em algumas modalidades, a proteína é um homólogo de cinamato/p-cumarato carboxila metiltransferase de Ocimum basilicum (CCMT) tendo a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO:12. Em algumas modalidades, um polinucleotídeo que codifica cinamato/p-cumarato carboxila metiltransferase compreende uma sequência de polinucleotídeos que é idêntica ou substancialmente idêntica (por exemplo, pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, ou pelo menos 99% idêntica) à SEQ ID NO:11.

[000100] Exemplos não limitantes de ácido fenilacrílico descarboxila- se são descritos em McKenna et al., Metab Eng 13:544-554 (2011). Em algumas modalidades, a proteína é uma ácido fenilacrílico descar- boxilase de P. penosaceus (PDC) tendo a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO:30. Em algumas modalidades, a proteína é substancialmente idêntica (por exemplo, pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, ou pelo menos 99% idêntica) à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:30. Em algumas modalidades, a proteína é um homólogo de uma ácido fenilacrílico descarboxilase de P. penosaceus (PDC) tendo a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO:30.

Proteínas que Reduzem a Quantidade de Cumaroil-CoA, Cafeoil- CoA e/ou Feruloil-CoA

[000101] Em algumas modalidades, uma proteína que desvia um precursor de monolignol de uma via de biossíntese de lignina reduz a quantidade de cumaroil-CoA e/ou feruloil-CoA que está disponível para a via de biossíntese de lignina. Exemplos de tal proteína são mostrados nas Figuras 8 a 11. Em algumas modalidades, a proteína é uma enzima que modifica um substrato de cumaroil-CoA e/ou feruloil-CoA. Em algumas modalidades, a proteína é uma enzima que utiliza cuma- roil-CoA e/ou feruloil-CoA na síntese de outro composto (por exemplo, umbeliferona, um composto volátil, escopoletina, chalcona, tri- hidroxichalcona, estilbeno, curuminoide ou benzilacetona), por exemplo, dioxigenase dependente de 2-oxoglutarase, chalcona sintase, es- tilbeno sintase, cucuminoide sintase ou benzalacetona sintase.

[000102] Um exemplo não limitante de uma enzima dioxigenase dependente de 2-oxoglutarase é descrito em Vialart et al., Plant J. 70:460-470 (2012). Em algumas modalidades, a proteína é dioxige- nase dependente de 2-oxoglutarase de Ruta graveolens (C2’H) tendo a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO:14. Em algumas modalidades, a proteína é substancialmente idêntica (por exemplo, pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, ou pelo menos 99% idêntica) à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:14. Em algumas modalidades, a proteína é um homólogo de dioxigenase dependente de 2- oxoglutarase de Ruta graveolens (C2’H) tendo a sequência de amino- ácidos apresentada na SEQ ID NO:14. Em algumas modalidades, um polinucleotídeo que codifica dioxigenase dependente de oxoglutarase compreende uma sequência de polinucleotídeos que é idêntica ou substancialmente idêntica (por exemplo, pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, ou pelo menos 99% idêntica) à SEQ ID NO:13.

[000103] Outros exemplos não limitantes de proteínas que reduzem a quantidade de cumaroil-CoA, cafeoil-CoA e/ou feruloil-CoA que estão disponíveis para a via de biossíntese de lignina são chalcona sin- tase (CHS), estilbeno sintase (SPS), cucuminoide sintase (CUS) ou benzalacetona sintase (BAS), descrito em Katsuyama et al., J. Biol. Chem. 282:37702-37709 (2007); Sydor et al., Appl. Environ. Microbiol. 76:3361-3363 (2010); Jiang et al., Phytochemistry 67:2531-2540 (2006); Abe and Morita, Nat. Prod. Rep. 27:809 (2010); Dao et al., Phytochem Rev. 10:397-412 (2011); Suh et al., Biochem J. 350:229235 (2000); Tropf et al., J. Biol. Chem. 270:7922-7928 (1995); Knogge et al., Arch. Biochem. Biophys. 250:364-372 (1986); Ferrer et al., Nat. Struct. Biol. 6:775-784 (1999); Miyazono et al., Proteins 79:669-673 (2010); e Abe et al., Eur. J. Biochem. 268:3354-3359 (2001). Em algumas modalidades, a proteína é uma CHS de Physcomitrella pattens tendo a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO:31; uma CHS de Arabidopsis thaliana tendo a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO:32; SPS de Vitis vinifera tendo a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO:33; CUS de Oryza sa- tiva tendo a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO:34 ou SEQ ID NO:35; ou BAS de Rheum palmatum tendo a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO:36; ou um homólogo destas. Em algumas modalidades, a proteína é substancialmente idêntica (por exemplo, pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, ou pelo menos 99% idêntica) à sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOs:31, 32, 33, 34, 35 ou 36.

Proteínas que Ativam uma Via Metabólica Competitiva

[000104] Em algumas modalidades, uma proteína que desvia um precursor de monolignol de uma via de biossíntese de lignina ativa, regula para cima ou potência uma via metabólica que compete com a via de biossíntese de via de biossíntese de lignina pelo uso de precursores de monolignol. Exemplos não limitantes das vias metabólicas que são competitivas com a via de biossíntese de lignina incluem a via de biossíntese de estilbeno, a via de biossíntese de flavonoide, a via de biossíntese de curcuminoide e a via de biossíntese de benzalace- tona. Dessa forma, em algumas modalidades, a proteína que desvia um precursor de monolignol de uma via de biossíntese de lignina é uma proteína (por exemplo, um fator de transcrição, um fator de transcrição artificial baseado em TALE (ver Zhang et al., Nat. Biotechnol. 29:149-153 (2011)), ou uma enzima) que ativa, regula para cima, induz ou potência uma via de biossíntese de estilbeno, uma via de biossínte- se de flavonoide, uma via de biossíntese de curcuminoide ou uma via de biossíntese de benzalacetona.

[000105] Como um exemplo não limitante, uma proteína pode ser expressa que ativa, regula para cima, induz ou potência uma via de biossíntese de flavonoide. A via de biossíntese de flavonoide utiliza precursores de monolignol como cumaroil-CoA, cafeoil-CoA e feruloil- CoA da via de biossíntese de lignina para a síntese de flavonoides como chalconas, flavononas, di-hidroflavonóis, flavonóis e antociani- nas. Ver as Figuras 9 e 11. Em algumas modalidades, a proteína que desvia um precursor de monolignol de uma via de biossíntese de ligni- na é uma proteína que ativa, regula para cima, induz ou potência a expressão e/ou atividade de uma enzima na via de biossíntese de fla- vonoides (por exemplo, uma enzima como chalcona sintase ou flavonol sintase). Em algumas modalidades, a proteína que desvia um precursor de monolignol de uma via de biossíntese de lignina é um fator de transcrição. Os fatores de transcrição na via de biossíntese de fla- vonoide são conhecidos na técnica. Ver, por exemplo, Bovy et al., Plant Cell 14:2509-2526 (2002); Tohge et al., Plant J. 42:218-235 (2005); Peel et al., Plant J. 59:136-149 (2009); Pattanaik et al., Planta 231:1061-1076 (2010); e Hichri et al., J Exp Botany 62:2465-2483 (2011; incorporados por referência neste pedido. Exemplos não limi- tantes de fatores de transcrição na via de biossíntese de flavonoides incluem fatores de transcrição de MYB, fatores de transcrição hélice- alça-hélice básicos (bHLH) e fatores de transcrição WD40. Em algumas modalidades, a proteína é um fator de transcrição PAP1 R2R3 MYB de Arabidopsis thaliana tendo a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO:37; um fator de transcrição PAP2 R2R3 MYB de Arabidopsis thaliana tendo a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO:38; um fator de transcrição TT2 R2R3 MYB de Ara- bidopsis thaliana tendo a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO:39; um fator de transcrição NtAn2 R2R3 MYB de Nicotiana tabacum tendo a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO:40; um fator de transcrição LAP1 R2R3 MYB de Medicago trunca- tula tendo a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO:41; um fator de transcrição MYB-C R2R3 de Zea mays tendo a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO:42; um fator de transcrição MYC-Lc BHLH de Zea mays tendo a sequência de amino- ácidos apresentada na SEQ ID NO:43; um fator de transcrição TT8 BHLH de Arabidopsis thaliana tendo a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO:44; ou um fator de transcrição Myc1 BHLH de Vitis vinifera tendo a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO:45; ou um homólogo destes. Em algumas modalidades, a proteína é substancialmente idêntica (por exemplo, pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, ou pelo menos 99% idêntica) à sequência de aminoá- cidos de qualquer uma das SEQ ID NOs:37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, ou 45.

[000106] Em algumas modalidades, uma planta é engendrada para expressar duas, três, quatro ou mais proteínas como descrito neste pedido. Em algumas modalidades, a planta expressa duas ou mais proteínas, cada uma das quais é idêntica ou substancialmente idêntica às SEQ ID NOs:2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 42, 43, 44 ou 45. Em algumas modalidades, duas ou mais proteínas utilizam substratos diferentes ou ativam vias diferentes; por exemplo, em algumas modalidades a planta expressa uma primeira proteína que reduz a quantidade de chiquimato que está disponível para a via de biossíntese de lignina e uma segunda proteína que reduz a quantidade da fenilalanina que está disponível para a via de biossíntese de lignina. Em algumas modalidades, duas ou mais proteínas potencializam ou ativam a mesma via; por exemplo, em algumas modalidades a planta expressa um primeiro fator de transcrição e um segundo fator de transcrição que funcionam cooperativamente para induzir a via de biossíntese de flavonoide.

Proteínas que Produzem um Inibidor Competitivo de HCT

[000107] Em algumas modalidades, uma planta tendo conteúdo reduzido de lignina é engendrada expressando ou superexpressando um inibidor competitivo de uma enzima da via de biossíntese de lignina (por exemplo, uma molécula que compete com p-cumaroil-CoA e/ou chiquimato como um substrato de hidroxicinamoil-CoA chiquima- to/quinato hidroxicinamoiltransferase (HCT)). Em algumas modalidades, o método compreende: introdução na planta de um cassete de expressão que compreende um polinucleotídeo que codifica uma proteína que produz um inibidor competitivo de hidroxicinamoil-CoA chiquimato/quinato hi- droxicinamoiltransferase (HCT) na planta, em que o polinucleotídeo é operacionalmente ligado a um promotor heterólogo; e cultura da planta sob condições nas quais a proteína que produz um inibidor competitivo de HCT é expressa.

[000108] Em algumas modalidades, a proteína produz diretamente ou indiretamente um ou mais dos inibidores competitivos de protoca- techuato, gentisato, catecol, 2,3-di-hidroxibenzoato, 3,6-di- hidroxibenzoato, ou 3-hidróxi-2-aminobenzoato (por exemplo, catalisando a formação do inibidor competitivo ou catalisando a formação de um precursor para o inibidor competitivo). Exemplos de vias para produzir inibidores competitivos de HCT são mostrados na Figura 27.

[000109] Como um exemplo não limitante, em algumas modalidades, o inibidor competitivo de HCT é protocatechuato. Como mostrado na Figura 27, o protocatechuato pode ser produzido pela enzima desidro- chiquimato desidratase (QsuB) ou pela enzima desidrochiquimato de- sidratase (DsDH). Em algumas modalidades, a proteína que produz um inibidor competitivo de HCT é desidrochiquimato desidratase de Corynebacterium glutamicum (QsuB) tendo a sequência de aminoáci- dos apresentada na SEQ ID NO:6 ou desidrochiquimato desidratase de Podospora anserina (DsDH) tendo a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO:8. Em algumas modalidades, a proteína é substancialmente idêntica (por exemplo, pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, ou pelo menos 99% idêntica) à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:6 ou SEQ ID NO:8. Em algumas modalidades, a proteína é um homólogo de desidrochiquimato desidratase de Corynebacterium glu- tamicum (QsuB) tendo a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO:6 ou um homólogo de desidrochiquimato desidratase de Podospora anserina (DsDH) tendo a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO:8. Em algumas modalidades, um polinucleotí- deo que codifica desidrochiquimato desidratase compreende uma sequência de polinucleotídeos que é idêntica ou substancialmente idêntica (por exemplo, pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, ou pelo menos 99% idêntica) à SEQ ID NO:5 ou SEQ ID NO:7.

B. Expressão plastidial de proteínas

[000110] Em algumas modalidades, a proteína que desvia um precursor de monolignol de uma via de biossíntese de lignina, como descrito neste pedido, é expressa em uma ou mais organelas específicas da planta, por exemplo, no plastídeo da planta. A sequência de polinu- cleotídeos que codifica a proteína que desvia um precursor de monoli- gnol de uma via de biossíntese de lignina (por exemplo, um polinucleo- tídeo que codifica chiquimato quinase (AroK), polipeptídeo pentafunci- onal AROM (ARO1), desidrochiquimato desidratase (DsDH), desidro- chiquimato desidratase (QsuB), fenilacetaldeído sintase (PAAS) ou fenilalanina aminomutase (PAM), por exemplo, um polinucleotídeo compreendendo uma sequência que é idêntica ou substancialmente idêntica a uma sequência de polinucleotídeos da SEQ ID NO:1, 3, 5, 7, ou 9, ou um polinucleotídeo compreendendo uma sequência que codifica um polipeptídeo é idêntica ou substancialmente idêntica a uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:2, 4, 6, 8, 10, ou 29) pode ser engendrado para incluir uma sequência que codifica um sinal de direcionamento ou de trânsito da organela, por exemplo, um sinal de direcionamento ou de trânsito do plastídeo. Sinais de direcionamento ou de trânsito atuam facilitando o transporte de proteínas por membranas intracelulares, por exemplo, vacúolo, vesícula, plastídeo e mem-branas mitocondriais.

[000111] Em algumas modalidades, o sinal de direcionamento de plastídeo é um sinal de direcionamento descrito na Patente US No. 5.510.471, incorporado por referência neste pedido. Em algumas modalidades, o sinal de direcionamento de plastídeo é idêntico ou substancialmente idêntico (por exemplo, pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, ou pelo menos 99% idêntico) a uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:16. Em algumas modalidades, o sinal de direcionamento de plastídeo é idêntico ou substancialmente idêntico (por exemplo, pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, ou pelo menos 99% idêntico) a uma sequência de polinucleotídeos da SEQ ID NO:15. Em algumas modali-dades, o sinal de direcionamento de organela (por exemplo, o sinal de direcionamento de plastídeo) está ligado na estrutura com a sequência de codificação da proteína que desvia um precursor de monolignol de uma via de biossíntese de lignina.

C. Promotores

[000112] Em algumas modalidades, o polinucleotídeo que codifica a proteína que desvia um precursor de monolignol da via de biossíntese de lignina, ou a proteína que produz um inibidor competitivo de HCT, está operacionalmente ligada a um promotor heterólogo. Em algumas modalidades, o promotor é um promotor específico para célula ou tecido como descrito abaixo. Em algumas modalidades, o promotor é de um gene na via de biossíntese de lignina (por exemplo, um promotor de um gene expresso na via mostrada na Figura 1). Em algumas modalidades, o promotor é de um gene na via de biossíntese de lignina, com a ressalva que o promotor não seja o promotor nativo do polinu- cleotídeo que codifica a proteína que desvia um precursor de monolig- nol da via de biossíntese de lignina ou o promotor nativo do polinucleo- tídeo que codifica a proteína que produz um inibidor competitivo de HCT a ser expresso na planta. Em algumas modalidades, o promotor é um promotor C4H, C3H, HCT, CCR1, CAD4, CAD5, F5H, PAL1, PAL2, 4CL1 ou CCoAMT. Em algumas modalidades, o promotor é idêntico ou substancialmente idêntico a uma sequência de polinucleotídeos de qualquer uma das SEQ ID NOs:18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, ou 28.

Promotores Específicos para Células ou Tecidos

[000113] Em algumas modalidades, o polinucleotídeo que codifica a proteína que desvia um precursor de monolignol da via de biossíntese de lignina, ou a proteína que produz um inibidor competitivo de HCT, está operacionalmente ligado a um promotor específico para tecidos ou específico para células. Em algumas modalidades, o promotor é um promotor específico para a parede celular secundária ou um promotor específico para a célula fibrosa. O promotor específico para a parede celular secundária é heterólogo ao polinucleotídeo que codifica a proteína que desvia um precursor de monolignol da via de biossíntese de lignina, por exemplo, o promotor e a sequência que codifica o promotor são derivados de duas espécies diferentes. Um promotor é adequado para o uso como um promotor específico para a parede celular secundária se o promotor for expresso fortemente na parede celular secundária, por exemplo, em vaso e células fibrosas da planta, mas é expresso em um nível muito mais baixo ou não expresso em células sem a parede celular secundária. Um promotor é adequado para o uso como um promotor específico para célula fibrosa e se o promotor for expresso fortemente em células fibrosas quando comparadas com outras células não fibrosas da planta.

[000114] Em algumas modalidades, o promotor é um promotor IRX5. IRX5 é um gene que codifica uma celulose sintase da parede celular secundária Cesa4/IRX5, (Acesso Genbank No. AF458083_1). Em algumas modalidades, o promotor é idêntico ou substancialmente idêntico à sequência de polinucleotídeos pIRX5 da SEQ ID NO:17.

[000115] Promotores específicos para a parede celular secundária também são descritos na técnica. Ver, por exemplo, Mitsuda et al., Plant Cell 17:2993-3006 (2005); Mitsuda et al., Plant Cell 19:270-280 (2007); e Ohtani et al., Plant Journal 67:499-512 (2011).

[000116] Será apreciado por um versado na técnica que uma região promotora pode tolerar a variação considerável sem diminuição da atividade. Dessa forma, em algumas modalidades, um promotor (por exemplo, um promotor da via de biossíntese de lignina, um promotor específico para a parede celular secundária ou um promotor específico para célula fibrosa) são substancialmente idênticos (por exemplo, pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, ou pelo menos 99% idênticos) a uma sequência de polinucleotídeos de qualquer uma das SEQ ID NOs:17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, ou 28. A eficácia de um promotor pode ser confirmada usando um ensaio de gene repórter (por exemplo, β-glicuronidase ou GUS) conhecido na técnica.

D. Preparação de Vetores de Expressão Recombinante

[000117] Uma vez que a sequência promotora e a sequência de co dificação do gene de interesse (por exemplo, codificando uma proteína que desvia um precursor de monolignol da via de biossíntese de ligni- na) são obtidas, as sequências podem ser usadas para preparar um cassete de expressão para expressar o gene de interesse em uma planta transgênica. Tipicamente, os vetores de transformação vegetais incluem uma ou mais sequências de codificação de plantas clonadas (genômicas ou de cDNA) sob o controle transcricional de sequências 5’ e 3’ reguladoras e um marcador selecionável dominante. Tais vetores de transformação vegetal também podem conter um promotor (por exemplo, um promotor específico para a parede celular secundária ou promotor específico para célula fibrosa como descrito neste pedido), um sítio de iniciação de transcrição, um sinal de processamento de RNA (como sítios de junção de íntrons), um sítio de terminação de transcrição e/ou um sinal de poliadenilação.

[000118] Os vetores de expressão vegetal podem incluir sinais de processamento de RNA que podem ser posicionados dentro, a montante, ou a jusante da sequência de codificação. Além disso, os vetores de expressão podem incluir sequências reguladoras de região 3’ não traduzida de genes vegetais, por exemplo, uma região 3’ termina- dora para aumentar a estabilidade de mRNA para o mRNA, como a região terminadora de PI-II de batata ou regiões 3’ terminadoras de octopina ou nopalina sintase.

[000119] Os vetores de expressão vegetal rotineiramente também incluem genes marcadores selecionáveis dominantes para permitir pronta seleção de transformantes. Tais genes incluem os que codificam genes de resistência a antibióticos (por exemplo, resistência à higromicina, canamicina, bleomicina, G418, estreptomicina ou especti- nomicina), genes de resistência a herbicidas (por exemplo, fosfinotrici- na acetiltransferase), e genes que codificam enzimas de seleção positiva (por exemplo, manose isomerase).

[000120] Uma vez que um cassete de expressão compreendendo um polinucleotídeo que codifica a proteína que desvia um precursor de monolignol da via de biossíntese de lignina e operacionalmente ligado a um promotor como descrito neste pedido foi construído, técnicas padrão podem ser usadas para introduzir o polinucleotídeo em uma planta a fim de modificar a expressão gênica. Ver, por exemplo, protocolos descritos em Ammirato et al. (1984) Handbook of Plant Cell Culture-Crop Species. Macmillan Publ. Co. Shimamoto et al. (1989) Nature 338:274-276; Fromm et al. (1990) Bio/Technology 8:833-839; e Vasil et al. (1990) Bio/Technology 8:429-434.

[000121] A transformação e a regeneração de plantas são conhecidas na técnica, e a seleção da técnica de transformação mais apropriada será determinada pelo profissional. Métodos adequados podem incluir, mas não são limitados a: eletroporação de protoplastos vegetais; transformação mediada por lipossoma; transformação mediada por polietilenoglicol (PEG); transformação usando vírus; microinjeção de células vegetais; bombardeio de microprojéteis em células vegetais; infiltração a vácuo; e transformação mediada por Agrobacterium tume- ficiens. Transformação significa introduzir uma sequência nucleotídica em uma planta de uma forma a provocar a expressão estável ou transiente da sequência. Exemplos destes métodos em várias plantas in- cluem: Pat. U.S. Nos. 5.571.706; 5.677.175; 5.510.471; 5.750.386; 5.597.945; 5.589.615; 5.750.871; 5.268.526; 5.780.708; 5.538.880;

5.773.269; 5.736.369 e 5.610.042.

[000122] Seguinte à transformação, as plantas podem ser selecionadas usando um marcador selecionável dominante incorporado no vetor de transformação. Tipicamente, tal marcador conferirá resistência a antibióticos ou a herbicidas nas plantas transformadas ou a capacidade de crescer em um substrato específico, e a seleção de transforman- tes pode ser realizada expondo as plantas a concentrações apropriadas do antibiótico, herbicida ou substrato.

[000123] A codificação de polinucleotídeos de uma proteína que desvia um precursor de monolignol da via de biossíntese de lignina, bem como os polinucleotídeos que compreendem sequências promotoras de promotores específicos para a parede celular secundária ou promotores específicos para células fibrosas e, pode ser obtida de acordo com qualquer método conhecido na técnica. Tais métodos podem envolver reações de amplificação como PCR e outras reações baseadas em hibridização ou podem ser diretamente sintetizados.

E. Plantas nas Quais o Conteúdo de Lignina Pode Ser Re duzido

[000124] Um cassete de expressão compreendendo um polinucleotí- deo que codifica a proteína que desvia um precursor de monolignol da via de biossíntese de lignina e operacionalmente ligado a um promotor, ou compreendendo um polinucleotídeo que codifica a proteína que produz um inibidor competitivo de HCT e operacionalmente ligado a um promotor, como descrito neste pedido, pode ser expresso em vários tipos de plantas. A planta pode ser uma planta monocotiledônea ou uma planta dicotiledônea. Em algumas modalidades da invenção, a planta é uma planta verde de campo. Em algumas modalidades, a planta é uma gimnosperma ou conífera.

[000125] Em algumas modalidades, a planta é uma planta que é adequada para gerar biomassa. Exemplos de plantas adequadas incluem, mas não são limitados à Arabidopsis, álamo, eucalipto, arroz, milho, switchgrass, sorgo, painço, miscanthus, cana-de-açúcar, pinheiro, alfafa, trigo, soja, cevada, gramado, tabaco, cânhamo, bambu, colza, girassol, salgueiro, Jatropha e Brachypodium.

[000126] Em algumas modalidades, a planta na qual o cassete de expressão é introduzido é a mesma espécie de planta que o promotor e/ou como o polinucleotídeo que codifica a proteína que desvia um precursor de monolignol da via de biossíntese de lignina ou que codifica a proteína que produz um inibidor competitivo de HCT (por exemplo, um polinucleotídeo que codifica a proteína que desvia um precursor de monolignol da via de biossíntese de lignina e um promotor específico para parede celular secundária ou específico para célula fibrosa de Arabidopsis é expresso em uma planta Arabidopsis). Em algumas modalidades, a planta na qual o cassete de expressão é introduzido é uma espécie diferente da planta da que o promotor e/ou do que o polinucleotídeo que codifica a proteína que desvia um precursor de monolignol da via de biossíntese de lignina (por exemplo, um polinu- cleotídeo que codifica a proteína que desvia um precursor de monolig- nol da via de biossíntese de lignina e/ou um promotor específico para a parede celular secundária ou específico para célula fibrosa de Arabi- dopsis é expresso em uma planta de álamo). Ver, por exemplo, McCarthy et al., Plant Cell Physiol. 51:1084-90 (2010); e Zhong et al., Plant Physiol. 152:1044-55 (2010).

F. Rastreamento de Plantas Tendo Conteúdo de Lignina Reduzido

[000127] Após as plantas transformadas serem selecionadas, as plantas ou as partes das plantas podem ser avaliadas para determinar se a expressão da proteína que desvia um precursor de monolignol da via de biossíntese de lignina, ou a expressão da proteína que produz um inibidor competitivo de HCT, por exemplo, sob o controle de um promotor específico para a parede celular secundária ou um promotor específico para célula fibrosa, pode ser detectada, por exemplo, avaliando o nível de RNA ou proteína, medindo a atividade enzimática da proteína, e/ou avaliando o tamanho, peso molecular, conteúdo ou grau da ramificação nas moléculas de lignina encontradas nas plantas. Estas análises podem ser realizadas usando qualquer número de métodos conhecidos na técnica.

[000128] Em algumas modalidades, as plantas são rastreadas avaliando o nível de RNA ou proteína. Os métodos de medida da expressão de RNA são conhecidos na técnica e incluem, por exemplo, PCR, análise de Northern Blot, reação de polimerase em cadeia de transcriptase reversa (RT-PCR) e microarranjos. Os métodos de medida de níveis proteicos também são conhecidos na técnica e incluem, por exemplo, espectroscopia de massa ou técnicas baseadas no anticorpo como ELISA, Western blotting, citometria de fluxo, imunofluorescência e imuno-histoquímica.

[000129] Em algumas modalidades, as plantas são rastreadas avaliando a atividade da proteína que é expressa, e também avaliando o tamanho e a composição de lignina. Os ensaios enzimáticos das proteínas descritas neste pedido (por exemplo, chiquimato quinase (AroK), polipeptídeo pentafuncional AROM (ARO1), desidrochiquimato desidratase (DsDH), desidrochiquimato desidratase (QsuB), fenilace- taldeído sintase (PAAS), fenilalanina aminomutase (PAM), p- cumarato/cinamato carboxilmetiltransferase (CCMT1), ácido ferúlico descarboxilase (FDC1), ácido fenilacrílico descarboxilase (PDC1), dio- xigenase dependente de 2-oxoglutarato (C2’H), chalcona sintase (CHS), estilbeno sintase (SPS), cucuminoide sintase (CUS) ou benza- lacetona (BAS)) são bem conhecidos na técnica. As moléculas de lig- nina podem ser avaliadas, por exemplo, por ressonância magnética nuclear (RMN), espectrofotometria, microscopia, ensaios de lignina klason, tioacidólise, reagente de acetil-brometo ou por marcador histo- químico (por exemplo, com floroglucinol).

[000130] Como um exemplo não limitante, qualquer um de vários métodos conhecidos na técnica pode ser usado para quantificação e/ou análise de composição da lignina em uma planta ou parte vegetal como descrito neste pedido. O conteúdo de lignina pode ser determinado do extrato de resíduos de paredes celulares livres usando métodos de acetil brometo ou de Klason. Ver, por exemplo, Eudes et al., Plant Biotech. J. 10:609-620 (2012); Yang et al., Plant Biotech. J. (2013) (in press); e Dence et al. (eds) Lignin determination. Berlin: SpringerVerlag (1992); cada um dos quais é incorporado por referência neste pedido. Os resíduos de paredes celulares isentas de extrato correspondem à biomassa bruta, que foi extensivamente lavada para remover o componente solúvel em etanol. Eudes et al., Plant Biotech. J. 10:609-620 (2012); Yang et al., Plant Biotech. J. (2013) (em impressão); Sluiter et al., Determination of structural carbohydrates and lignin in biomass. Em: Laboratory Analytical Procedure. National Renewable Energy Laboratory, Golden, CO, USA; e Kim et al., Bio. Res. 1:56-66 (2008). A análise de composição de lignina e a determinação de subu- nidade de G/S lignina podem ser realizadas usando qualquer uma de várias técnicas conhecidas na técnica como espectroscopia 2D 13C-H1 HSQC RMN (Kim e Ralph, Org. Biomol. Chem. 8:576-591 (2010); Kim et al., Bio. Res. 1:56-66 (2008)); método de tioacidólise (Lapierre et al., Plant Physiol. 119:153-164 (1999); Lapierre et al., Res. Chem. Intermed. 21:397-412 (1995); Eudes et al., Plant Biotech. J. 10:609-620 (2012)); derivatização seguida do método de clivagem redutiva (método de DFRC; Lu e Ralph, J. Agr. Food Chem 46:547-552 (1998) e Lu e Ralph, J. Agr. Food Chem 45:2590-2592 (1997)) e método de croma- tógrafo a gás por pirólise (método de Py-GC; Sonoda et al., Anal. Chem. 73:5429-5435 (2001)) diretamente de resíduos de paredes celulares isentos de extrato ou enzima celulolítica de lignina (lignina CEL). A lignina CEL deriva de resíduos de paredes celulares, que foram hidrolisados com celulases brutas para depletar a fração de polis- sacarídeo e enriquecer a lignina (Eudes et al., Plant Biotech. J. 10:609620 (2012)).

IV. Métodos de Uso de Plantas Tendo Conteúdo de Lignina Reduzido

[000131] As plantas, partes de plantas, ou material de biomassa vegetal de plantas tendo lignificação reduzida devido à expressão de uma proteína que desvia um precursor de monolignol da via de bios- síntese de lignina ou devido à expressão de uma proteína que produz um inibidor competitivo de HCT, por exemplo, sob o controle de um promotor específico para a parede celular secundária ou um promotor específico para célula fibrosa, podem ser usadas para uma variedade de métodos. Em algumas modalidades, as plantas, as partes de plantas ou o material de biomassa vegetal geram menos biomassa recalcitrante para o uso em uma reação de conversão quando comparadas com plantas selvagens. Em algumas modalidades, as plantas, partes de plantas ou material de biomassa vegetal são usados em uma reação de sacarificação, por exemplo, sacarificação enzimática, para gerar açúcares solúveis em um nível aumentado de eficiência quando comparadas com plantas selvagens. Em algumas modalidades, as plantas, partes de plantas ou material de biomassa vegetal são usados para aumentar o rendimento de biomassa ou simplificar a jusante o processamento de indústrias de madeira (como papel, polpagem e construção) quando comparadas com plantas selvagens. Em algumas modalidades, as plantas, partes de plantas ou material de biomassa vegetal são usados para aumentar a qualidade de madeira com pro- pósitos de construção. Em algumas modalidades, as plantas, partes de plantas ou material de biomassa vegetal podem ser usados em uma reação de combustão, gaseificação, pirólise ou hidrólise de polis- sacarídeos (enzimática ou química). Em algumas modalidades, as plantas, partes de plantas ou material de biomassa vegetal são usados como ração para animais (por exemplo, ruminantes).

[000132] Os métodos de conversão, por exemplo, gaseificação de biomassa, são conhecidos na técnica. Resumidamente, em plantas de gaseificação ou material de biomassa vegetal (por exemplo, folhas e troncos) são trituradas em partículas pequenas e entram no gerador de gás junto com uma quantidade controlada de ar ou oxigênio e vapor. O calor e a pressão da reação quebram as ligações químicas da biomassa, formando o gás de síntese, que é posteriormente limpo para remover impurezas como enxofre, mercúrio, particulados e materiais-traço. O gás de síntese então pode ser convertido em produtos como etanol ou outros biocombustíveis.

[000133] Os métodos de sacarificação enzimática também são conhecidos na técnica. Resumidamente, as plantas ou material de biomassa vegetal (por exemplo, folhas e troncos) são opcionalmente pré- tratados com água quente diluída alcalina, AFEX (Explosão de Fibra por Amônia), líquido iônico ou ácido diluído, seguido da sacarificação enzimática usando uma mistura de enzimas hidrolíticas da parede celular (como hemicelulases, celulases e beta-glucosidases) em tampão e incubação das plantas ou material de biomassa vegetal com a mistura enzimática. Seguinte à incubação, o rendimento da reação de sacarificação pode ser prontamente determinado medindo a quantidade de açúcar redutor liberado, usando um método padrão para a detecção de açúcar, por exemplo, o método de ácido dinitrossalicílico bem co-nhecido pelos versados na técnica. As plantas engendradas conforme a invenção fornecem uma eficiência de sacarificação mais alta quando comparadas com plantas selvagens, enquanto o crescimento das plantas, o desenvolvimento ou a resistência de doença não são negativamente impactados.

EXEMPLOS

[000134] Os seguintes exemplos são fornecidos para ilustrar, mas não limitar a invenção reivindicada.

Exemplo 1: Estratégias de Desvio de um Precursor de Monolignol da Via de Biossíntese de Lignina

[000135] As plantas engendradas da presente invenção expressam um ou mais genes que codificam uma proteína que desvia um componente de precursor da via de biossíntese de lignina (Figura 1) para uma via competitiva. Este desvio reduz a quantidade da lignina que é produzida e aumenta a quantidade de produto produzido pela via competitiva.

[000136] As figuras 2 a 11 fornecem estratégias exemplares de desviar um componente precursor da via de biossíntese de lignina. Em uma estratégia (figuras 2 e 3), o precursor de monolignol, chiquimato, pode ser reduzido ou depletado. Por exemplo, a quantidade de chi- quimato citosólico e/ou plastidial que está disponível para a via de bi- ossíntese de lignina pode ser reduzida ou depletada expressando uma chiquimato quinase como chiquimato quinase de M. tuberculosis ("MtAroK"), uma proteína pentafuncional arom como a proteína penta- funcional arom de S. cerevisiae ("ScAro1"), uma desidrochiquimato desidratase como desidrochiquimato desidratase de C. glutamicum ("CgQsuB") ou desidrochiquimato desidratase de P. anserina ("Pa- DsDH").

[000137] Em outra estratégia (figuras 4 e 5), o precursor de monolig- nol, fenilalanina, pode ser reduzido ou depletado. Por exemplo, a quantidade de fenilalanina citosólica e/ou plastidial que está disponível para a via de biossíntese de lignina pode ser reduzida ou depletada expressando uma fenilacetaldeído sintase como fenilacetaldeído sin- tase de P. hybrida ("PhPAAS") ou uma fenilalanina aminomutase como fenilalanina aminomutase de T. canadensis ("TcPAM").

[000138] Em outra estratégia (figuras 6 e 7), os precursores de mo- nolignol, cinamato e/ou p-cumarato, são reduzidos ou depletados. Por exemplo, a quantidade de cinamato citosólico e/ou p-cumarato que está disponível para a via de biossíntese de lignina pode ser reduzida ou depletada expressando uma cinamato/p-cumarato carboxila metil- transferase como cinamato/p-cumarato carboxila metiltransferase de O. basilicum ("ObCCMT1") ou uma ácido fenilacrílico descarboxilase como ácido fenilacrílico descarboxilase de P. pentosaceus ("PDC").

[000139] Em outra estratégia (Figuras 8-11), os precursores de mo- nolignol, cumaroil-CoA, cafeoil-CoA e/ou feruloil-CoA, são reduzidos ou depletados. Por exemplo, a quantidade de cumaroil-CoA, cafeoil- CoA e/ou feruloil-CoA citosólico que está disponível para a via de bi- ossíntese de lignina pode ser reduzida ou depletada expressando uma dioxigenase dependente de 2-oxoglutarato como C2’H de R. graveo- lens (dioxigenase dependente de 2-oxoglutarato) ("RbC2’H"), uma chalcona sintase (CHS), uma estilbeno sintase (SPS), uma cucuminoi- de sintase (CUS) ou benzalacetona (BAS).

Exemplo 2: Geração de Linhagens Transgênicas que Expressam QsuB ou DsDH em plastídeos

[000140] O gene do promotor (pC4H) de lignina de C4H de Arabi- dopsis foi sintetizado com sítios de restrição flanqueadores SmaI e AvrII nas extremidades 3’ e 5’ respectivamente (Genscript). A sequência de codificação da sequência de peptídeo sinal de direcionamento cloroplástico (ctss; Patente US 5510471) foi otimizada por códon e sintetizada (Genscript), em seguida amplificada por PCR e inserida no sítio de restrição de AvrII localizado na extremidade 5’ de pC4H usando clonagem In-Fusion (Clontech). A fusão de DNA de pC4Hctss então foi usada para substituir o promotor IRX5 de pTKan-pIRX5 (Eudes et al. Plant Biotechnol J 10, 609-620 (2012)) usando tecnologia Gateway (Invitrogen) e gerar um novo vetor pTkan-pC4Hctss-GWR3R2. Este vetor é projetado para clonar em estrutura com a sequência ctss de qualquer gene de interesse anteriormente clonado em um vetor pDONR221.P3-P2 de acordo com instruções do fabricante (Invitro- gen).

[000141] As sequências nucleotídicas de codificação otimizada por códon de desidrochiquimato desidratases QsuB de Corynebacterium glutamicum (número de acesso A4QB63) e DsDH de Podospora anse- rina (número de acesso CAD60599) foram sintetizadas para a expressão em Arabidopsis (Genescript), clonado no vetor gateway pDONR221.P3-P2 de acordo com instruções do fabricante (Invitro- gen), e transferidas para pTkan-pC4Hctss-GWR3R2 por reação de LR clonase (Invitrogen) para gerar os vetores binários pTKan-pC4Hctss- QsuB e pTKan-pC4Hctss-DsDH respectivamente. As fusões em estrutura de cttss com as sequências de codificação QsuB e DsDH que foram verificadas pelo sequenciamento.

[000142] Ambas as construções foram introduzidas independentemente em plantas WT de Arabidopsis (ecotipo Col0) através de transformação mediada por Agrobacterium tumefaciens (Bechtold e Pelletier, Methods Mol Biol 82:259-266 (1998)) e várias linhagens independentes S-QsuB e S-DsDH que abrigam as fusões gênicas ctss::QsuB e ctss::DsDH foram geradas respectivamente.

Resultados

[000143] Nove linhagens independentes resistentes à canamicina e por isso abrigam a construção de pTKan-pC4Hctss-QsuB (linhagens de S-QsuB) foram selecionadas e analisadas na geração T2. Estas linhagens expressam a proteína de desidrochiquimato desidratase QsuB de Corynebacterium glutamicum fundida a um plastídeo que visa o peptídeo sinal para direcionar a proteína de QsuB nos seus plastí- deos. No estágio de roseta (3 semanas), as linhagens de S-QsuB eram fenotipicamente indistinguíveis de plantas selvagens (WT) (Figura 11). A biomassa de troncos senescidos secos coletados de linhagens S-QsuB e plantas WT foi usada para realizar a análise de sacarificação. Como mostrado na Figura 12, a quantidade de açúcares redutores liberados da biomassa de todas as linhagens S-QsuB foi mais alta em comparação com a quantidade liberada de plantas WT. Em particular, usando quantidade similar da enzima celulolítica, as linhagens S-QsuB #1, 4, e 9 mostraram eficiências de sacarificação melhoradas de até 3,0 vezes em comparação com plantas WT (Figura 12). Além disso, a quantidade de açúcares redutores liberados da biomassa de linhagens S-QsuB (#1, #4, #9) e plantas WT usando cargas diferentes do coquetel de enzimas celulolíticas foi investigada. Como mostrado na Figura 13, a eficiência de sacarificação foi em média 75% mais alta de três linhagens S-QsuB embora 10 vezes menos enzima fosse usada em comparação com a biomassa de WT. Este resultado mostra que muito menos enzima celulolítica é necessária para liberar quantidade similar de açúcares da biomassa de linhagens S-QsuB em comparação com aquela de plantas WT.

[000144] Alternativamente, cinco linhagens independentes resistentes à canamicina e por isso abrigam a construção pTKan-pC4Hctss- DsDH (linhagens S-DsDH) foram selecionadas e analisadas na geração T2. Estas linhagens expressam a proteína de desidrochiquimato desidratase DsDH de Podospora anserine fundida a um plastídeo que visa peptídeo sinal para direcionar a proteína de QsuB nos seus plas- tídeos. A biomassa de troncos senescidos secos coletada de linhagens de plantas S-DsDH e WT foi usada para realizar a análise de sacarificação. Como mostrado na Figura 14, usando quantidade idêntica da enzima celulolítica, a quantidade de açúcares redutores liberados ao longo do tempo da biomassa de todas as linhagens S-DsDH foi mais alta em comparação com a quantidade liberada das plantas WT, representando uma melhora de até 1,4 vezes após 72 h de hidrólise. Similarmente às linhagens S-QsuB, este resultado indica que a biomassa de linhagens S-DsDH é menos recalcitrante à digestão enzimá- tica de polissacarídeo em comparação com plantas WT. Exemplo 3: Expressão de uma 3-desidrochiquimato desidratase bacteriana reduz o conteúdo de lignina e melhora a eficiência de sacarificação de biomassa

RESUMO

[000145] A lignina confere a recalcitrância à biomassa vegetal usada como matérias-primas na agroindústria transformadora ou como uma fonte de açúcares renováveis para a produção de bioprodutos. As etapas metabólicas para a síntese de blocos de construção de lignina pertencem às vias de chiquimato e fenilpropanoide. Os esforços de engenharia genética para reduzir o conteúdo de lignina tipicamente empregam nocaute gênico ou técnicas de silenciamento gênico para reprimir constitutivamente uma destas vias metabólicas. Neste estudo, relatamos que a expressão de uma 3-desidrochiquimato desidratase (QsuB de Corynebacterium glutamicum) reduz a deposição de lignina nas paredes de célula de Arabidopsis. QsuB foi direcionada aos plastídeos para converter 3-desidrochiquimato - um intermediário da via de chi- quimato - em protocatechuato. Em comparação com plantas selvagens, as linhagens que expressam QsuB contêm quantidades mais altas de protocatechuato, cinamato, p-cumarato, p-cumaraldeído, e álcool cumarílico. Espectroscopia 2D-RMN, tioacidólise, e cromatogra- fia gasosa com pirólise/espectrometria de massa (piro-GC/MS) revelam um aumento de unidades p-hidroxifenil e uma redução de unidades guaiacilna lignina de linhagens de QsuB, enquanto a cromatogra- fia de exclusão do tamanho indica um grau mais baixo de polimeriza- ção de lignina. Os nossos dados mostram que a expressão de QsuB afeta principalmente uma das etapas enzimáticas-chave dentro da via biossintética de lignina. Finalmente, a biomassa destas linhagens exibe mais que uma melhora de duas vezes na eficiência de sacarificação. Concluímos que a expressão de QsuB em plantas, em combinação com promotores específicos, é uma estratégia de ganho de função promissora para a redução espaço-temporal da lignina na biomassa vegetal.

SIGNIFICÂNCIA

[000146] A lignina é um polímero aromático complexo encontrado em paredes de células vegetais que é basicamente responsável pela resistência e dureza da madeira. Estas propriedades também conferem "recalcitrância" à biomassa, portanto materiais de alto conteúdo de lig- nina são mais difíceis de quebrar em processos como a produção de biocombustíveis. Os esforços de reduzir o conteúdo de lignina por meio da alteração de expressão gênica vegetal muitas vezes resultam em rendimento de biomassa reduzido e comprometem a aptidão da planta. Neste estudo, apresentamos uma estratégia alternativa eficaz: redução do conteúdo de lignina e recalcitrância de biomassa por ex-pressão de uma 3-desidrochiquimato desidratase bacteriana nas plantas. Demonstramos que esta estratégia alcançou mudanças radicais na composição de lignina e estrutura em plantas transgênicas, bem como melhorou a conversão da biomassa em açúcares fermentáveis. INTRODUÇÃO

[000147] As paredes das células vegetais são a fonte primária da biomassa terrestre e consistem principalmente em polissacarídeos celulósicos e hemicelulósicos impregnados por ligninas. As ligninas são polímeros de álcoois p-hidroxicinamílicos (isto é, monolignóis), que são sintetizados dentro das células, exportados para a parede celular, e enfim sofrer polimerização oxidativa através das atividades de lacase e peroxidase. Os principais monolignóis - álcoois p-cumarílico, coniferíli- co e sinapílico - dão origem a unidades p-hidroxifenil (H), guaiacil (G) e siringil (S) lignina, respectivamente (1). Lignificação, em geral, confere resistência mecânica e hidrofobicidade em tecidos que desenvolvem paredes celulares secundárias, como esclerênquima (isto é, fibras) e vasos de xilema. Além do seu papel essencial para o crescimento vertical, a lignina também serve como uma barreira física contra patóge- nos que degradam as paredes celulares (2).

[000148] A biomassa lignocelulósica é usada para produção de papel e polpa, ração de gado ruminante, e mais recentemente foi considerada uma fonte importante de açúcares simples para produção fermenta- tiva de intermediários ou produtos químicos de alta tecnologia e bio- combustíveis (3). É bem documentado que a lignina na biomassa vegetal afeta negativamente o rendimento da polpa, a digestibilidade da forragem e a sacarificação de polissacarídeos (4-6). Isto incitou o interesse principal em desenvolver uma melhor compreensão da biossín- tese de lignina para reduzir a recalcitrância de biomassa modificando o conteúdo e/ou a composição de lignina.

[000149] A via de chiquimato, que é localizada em plastídeos em plantas, fornece um esqueleto de carbono para a síntese de fenilalani- na, o precursor da via de fenilpropanoide citosólica responsável pela biossíntese de monolignóis (Figura 20). Todas as etapas metabólicas e as enzimas correspondentes de ambas as vias são conhecidas e bem conservadas através das plantas terrestres (7-10). As abordagens clássicas da redução de lignina dependeram de modificações genéticas, como redução de transcritos e variação alélica de genes específicos da via de fenilpropanoide (11, 12). Entretanto, estas estratégias muitas vezes resultam em fenótipos indesejados - incluindo nanismo, esterilidade, e suscetibilidade aumentada a estresses ambientais - devido à perda da integridade da parede celular, depleção de outros me- tabólitos relacionados ao fenilpropanoide, acúmulo de intermediários da via ou ativação constitutiva de respostas de defesa (13, 14). Tais efeitos negativos infelizmente são difíceis de evitar por causa da especificidade não tecidual das estratégias empregadas: as variações aléli- cas são transmitidas a cada célula da planta durante as divisões celulares, e pequenos RNAs de interferência gerados para o silenciamento gênico movem-se geralmente de célula a célula e ao longo de grande distância em tecidos vegetativos (15).

[000150] Alternativamente, há novas estratégias de ganho de função promissoras que envolvem a expressão de proteínas específicas para reduzir a produção de três monolignóis principais ou modificar suas proporções. Usando promotores específicos com padrões de expressão restringidos, estas estratégias permitiriam a alteração da lignina em estágios de desenvolvimento posteriores ou, por exemplo, somente em certos tecidos como fibras - sem comprometer a funcionalidade dos vasos condutivos de transporte de água (14). Exemplos de tais proteínas expressas são fatores de transcrição que atuam como reguladores negativos da biossíntese de lignina (16-19); as enzimas que usam intermediários da via de lignina para síntese de metabólitos derivados (20-22); as enzimas engendradas que modificam monolignóis em suas formas não oxidáveis (23); ou proteínas que medeiam a degradação pós-transcricional de enzimas da via biossintética de lignina (24).

[000151] Neste estudo, informamos pela primeira vez, de acordo com a expressão de uma 3-desidrochiquimato desidratase bacteriana em Arabidopsis (25). Selecionamos QsuB de C. glutamicum e o direcionamos aos plastídeos para converter o precursor de chiquimato, 3- desidrochiquimato, em protocatechuato, com o propósito de reduzir o conteúdo de lignina e modificar sua composição e estrutura na biomassa de linhagens transgênicas. A análise metabolômica de plantas que expressam QsuB revelou quantidades mais altas de cinamato, p- cumarato, e de dois precursores diretos de unidades H-lignina: p- cumaraldeído e álcool p-cumarílico. De modo inverso, os precursores diretos de unidades G e S -coniferaldeído, álcool coniferílico, sinapal- deído, e álcool sinapílico - foram reduzidos. O conteúdo de lignina foi severamente reduzido nestas linhagens transgênicas e exibiu um enriquecimento de unidades H à custa de unidades G e um grau de poli- merização mais baixo. Em comparação com aquelas de plantas selvagens, as paredes celulares de linhagens que expressam QsuB liberaram quantidades significativamente mais altas de açúcares simples após tratamento com celulase e requereram menos enzima da sacarificação. Coletivamente, estes resultados suportam a hipótese que a expressão de QsuB plastídico afeta uma das etapas enzimáticas dentro da via biossintética de lignina.

RESULTADOS Expressão direcionada de QsuB em Arabidopsis

[000152] Uma sequência de codificação de QsuB foi clonada a jusante da sequência de codificação de um peptídeo sinal que visa o plastídeo (SCHL) para expressão em plastídeos. Usando a expressão transiente no tabaco, primeiro confirmamos que QsuB foi corretamente direcionado aos plastídeos analisando sua localização subcelular quando fundido no C-terminal a um marcador YFP (Figura 21). A sequência schl-qsuB foi clonada a jusante do promotor C4H de Arabi- dopsis para expressão em tecidos lignificantes de Arabidopsis. A análise por Western blot confirmou que QsuB foi expresso em troncos de várias plantas T2 homozigotas para a construção pC4H::schl::qsuB (Figura 16). Baseado na migração de marcadores de peso molecular, QsuB foi detectado em torno de 70 kDa, que corresponde ao tamanho teórico da sua sequência nativa após clivagem do peptídeo de trânsito de cloroplasto (Figura 16). Cinco linhagens com níveis de expressão de QsuB diferentes (C4H::qsuB-1, -3, -6, -7, e -9) foram selecionados para medida de biomassa. Embora uma redução de altura fosse observada para estas linhagens, somente duas delas (C4H::qsuB-1 e -9) mostrou uma redução leve do rendimento de biomassa (peso seco do tronco) em 18% e 21%, respectivamente (Tabela 1). Tabela 1. Altura e peso seco do tronco da inflorescência principal de plantas senescidas maduras selvagens (WT) e pC4H::schl::qsuB (C4H::qsuB).

n = número de plan tas analisadas. Os asteriscos indicam diferenças significantes da planta selvagem usando o teste t de Student não pa- reado (*P <0,05; ** P <0,005; *** P <0,001).

Análise de metabólito de linhagens C4H::qsuB

[000153] Metabólitos solúveis em metanol de troncos das linhagens C4H::qsuB-1 e C4H::qsuB-9 foram extraídos para análise (Tabela 2, Figura 22). Em comparação com plantas selvagens, o conteúdo de protocatechuato foi aumentado 53 e 485 vezes naquelas duas linhagens transgênicas, respectivamente. Entretanto, exceto para tirosina na linhagem C4H::qsuB-9, nenhuma redução significativa foi observada para o conteúdo de vários metabólitos derivados da via de chiqui- mato em plastídeos como salicilato e aminoácidos aromáticos. Em vez disso, o salicilato aumentaram levemente, 1,3, 1,4 vezes, em ambas as linhagens e fenilalanina foi 1,6 vezes superior na linhagem C4H::qsuB-1. De maneira interessante, vários metabólitos da via de fenilpropanoide aumentaram nas linhagens transgênicas. Cinamato e p-cumaraldeído somente foram detectados em linhagens transgênicas; enquanto os conteúdos de p-cumarato e de álcool p-cumarílico aumentaram, em comparação com aquelas selvagens, 14, 18 vezes e 3,5, 30 vezes, respectivamente. Kaempferol e quercetina, dois flavo- nóis derivados de p-cumaroil-CoA, também foram encontrados em quantidades mais altas em ambas as linhagens C4H::qsuB. Os precursores diretos de unidades S- e G-lignina foram negativamente alterados; coniferaldeído foi reduzido ~40% em ambas as linhagens trans- gênicas, enquanto álcool coniferílico, sinapaldeído, como álcool sinapí- lico foram reduzidos em duas vezes em C4H::qsuB-9 (Tabela 2).

[000154] Metabólitos ligados à parede celular liberados de resíduos de paredes celulares por hidrólise alcalina branda também foram analisados (Tabela 3). Protocatechuato foi encontrado em paredes celulares das linhagens C4H::qsuB mas não naquelas de plantas selvagens. O conteúdo de p-cumarato foi significativamente aumentado na linhagem C4H::qsuB-1, ao passo que ferulato foi reduzido em ambas as linhagens transgênicas. Tabela 2. Análise quantitativa de metabólitos solúveis em metanol em troncos de plantas de 6 semanas selvagens (WT) e pC4H::schl::qsuB (C4H::qsuB).

α (μg/g de peso fresco) β (μg/g de peso fresco) Φ Usando um limite de detecção de 34 ng/g de peso fresco Os valores são médias de quatro replicatas biológicas (n = 4). nd, não detectado. Os asteriscos indicam diferenças significantes da planta selvagem usando o teste t de Student não pareado (*P <0,1; ** P <0,05; *** P <0,005; **** P <0,001). Tabela 3. A análise quantitativa da célula aromáticos ligados à parede em troncos de plantas senescidos sem extrativos maduros selvagens (WT) e pC4H::schl::qsuB (C4H::qsuB).

Os valores são as médias das quatro replicatas biológicas (n = 3). nd, não detectado. Os asteriscos indicam diferenças significantes da planta selvagem usando o teste t de Student não pareado (*P <0,05; ** P <0,005; *** P <0,001). Análise composicional de parede celular de linhagens C4H::qsuB

[000155] Usando o método de Klason, o conteúdo de lignina medido no tronco de linhagens C4H::qsuB-1 e C4H::qsuB-9 foi reduzido 50% e 64%, respectivamente, em comparação com aquele da planta selvagem (Tabela 4). A análise da composição de monossacarídeos da parede celular mostrou quantidades mais altas de glicose (+ 4-10%), xi- lose (+ 13-19%), e outros açúcares menos abundantes nas linhagens transgênicas, resultando no aumento de 8% em açúcares totais de parede celular para a linhagem C4H::qsuB-1 e um aumento de 11% para a linhagem C4H::qsuB-9 (Tabela 4). Tabela 4. A composição química de troncos senescidos maduros de plantas selvagens (WT) e pC4H::schl::qsuB (C4H::qsuB).

Os valores são médias ± DP de análises em triplicata (n = 3). Os asteriscos indicam diferenças significantes da planta selvagem usando o teste t de Student não pareado (*P <0,05; ** P <0,005). Composição e estrutura monomérica de lignina em linhagens C4H::qsuB

[000156] A determinação da composição de monômero de lignina, usando tioacidólise, indicou um aumento na quantidade relativa de unidades H em linhagens transgênicas. Unidades H representaram 12,7% e 27,9% dos monômeros de lignina totais em linhagens C4H::qsuB-1 e C4H::qsuB-9, que correspondem a aumentos de 21 e 46 vezes em comparação com aqueles da planta selvagem, respectivamente (Tabela 5). A quantidade relativa de unidades G em transgê- nicos (~45%) também foi reduzida em comparação com a planta selvagem (~64%), ao passo que as unidades S foram superiores em C4H::qsuB-1 e inferiores em C4H::qsuB-9 (Tabela 5).

[000157] Espectros de RMN (2D 13C-1H-correlacionados, HSQC) do material da parede celular de linhagens C4H::qsuB-1 e C4H::qsuB-9 também foram obtidas para a determinação da composição de lignina e estrutura. A análise da região aromática dos espectros confirmou a quantidade relativa mais alta de unidades H em ambas as linhagens C4H::qsuB (29% e 64,4% respectivamente) em comparação com aquela na planta selvagem (3,6%), bem como uma redução de unidades G (Figura 17). Além disso, a análise da região alifática dos espec-tros indicou uma forte redução de ligações de fenilcumarana (β-5) e resinol (β-β) na lignina das linhagens transgênicas (Figura 23).

[000158] Finalmente, o material da parede celular dos troncos de linhagens selvagens e C4H::qsuB foram analisadas por piro-GC/MS. Para cada linhagem, a identificação e a quantificação relativa dos produtos de pirólise derivados de unidades H, G ou S permitiram a determinação das proporções H/G/S (Figura 28). Em comparação com a planta selvagem, as unidades H foram aumentadas 3,5 e 10 vezes, e as unidades G foram reduzidas 1,4 e 2,2 vezes, em linhagens C4H::qsuB-1 e C4H::qsuB-9, respectivamente. Tabela 5. Monômeros principais H, G e S derivados da lignina obtidos por tioacidólise de troncos maduros senescidos sem extrativos de plantas selvagens (WT) e pC4H::schl::qsuB (C4H::qsuB).

Os valores em parênteses são o DP de análises duplicadas. Os asteriscos indicam diferenças significantes de tipo selvagem usando o teste t de Student não pareado (*P <0,05; ** P <0,01). Ligninas das linhagens C4H::qsuB têm um grau de polimerização inferior

[000159] As frações de lignina foram isoladas de linhagens selvagens e C4H::qsuB para análise da sua polidispersividade usando cro- matografia de exclusão de tamanho (SEC). Os perfis de eluição adquiridos monitorando a fluorescência de UV-F da lignina dissolvida revelaram diferenças entre as linhagens selvagens e transgênicas (Figura 18). A área total de três picos de massa, correspondendo aos maiores fragmentos de lignina detectados entre 7,8 min e 12,5 min, foi significativamente reduzida em linhagens C4H::qsuB em comparação com a planta selvagem. O material de massa molecular similarmente intermediário, que elui em um quarto pico entre 12,5 min e 18 min, também foi menos abundante em linhagens C4H::qsuB. De modo inverso, a área que corresponde aos menores fragmentos de lignina, detectados entre 18 min e 23,5 min, foi aumentada nas linhagens transgênicas. Estes resultados demonstram uma redução do grau de polimerização de ligninas purificadas de plantas que expressam QsuB em comparação com aquelas da planta selvagem. Biomassa das linhagens C4H::qsuB mostram sacarificação melhorada

[000160] Os ensaios de sacarificação no material de tronco foram conduzidos para avaliar a recalcitrância da parede celular das linhagens C4H::qsuB. Como mostrado na Figura 19A, quantidades mais altas de açúcares foram liberadas após a hidrólise enzimática de 72 horas da biomassa das linhagens C4H::qsuB (-1, -3, -6, -7 e -9) em comparação com aquelas da planta selvagem em todos os pré- tratamentos testados. As melhoras de sacarificação variaram entre 79130% após água quente; 63-104% após solução alcalina diluída; e 2640% após pré-tratamentos com ácidos diluídos (Figura 19A). Além disso, experimentos de sacarificação similares usando biomassa pré- tratada com água quente, em cargas de celulase 5x mais baixa, revelaram que a biomassa de todas as linhagens C4H::qsuB liberam mais açúcar do que aquela da planta selvagem hidrolisada com uma carga de enzima típica (Figura 19B). Tomados em conjunto, estes dados demonstram que a celulose das linhagens C4H::qsuB são menos recalcitrantes à digestão por celulase e requerem uma quantidade mais baixa da enzima para ser convertida em altos rendimentos de açúcares fermentáveis.

DISCUSSÃO

[000161] Estratégias de ganho de função têm várias vantagens para a manipulação das vias metabólicas. Por exemplo, podem ser usados para a deposição de lignina bioengendrada em plantas através do melhor controle espaço-temporal da produção de monolignol em células lignificantes, e ajustar a composição de lignina e suas propriedades biofísicas (26). Por isso, a identificação de proteínas nas quais a expressão in planta resulta em modificações de conteúdo ou composição da lignina é de interesse especial e apresenta novas oportunidades. Neste trabalho, demonstramos que a expressão de 3- desidrochiquimato desidratase QsuB em plastídeos leva a redução drástica e modificações composicionais da lignina em Arabidopsis (Tabela 4). Como resultado, a biomassa destas plantas transgênicas exibe eficiência de sacarificação muito mais alta após o pré-tratamento (Figura 19A), que é um traço altamente desejado por várias agroindústrias e pelo setor de bioenergia. Além disso, a eficiência desta abordagem de reduzir o conteúdo de lignina na biomassa vegetal permite uma redução das cargas de enzimas hidrolíticas por pelo menos cinco vezes, ao conservar o maior potencial de sacarificação do que plantas de controle hidrolisadas na carga de enzimas padrão (Figura 19B). Consequentemente, a transferência desta tecnologia para culturas de produção de energia deve ter um grande impacto na rentabilidade econômica de produção de biocombustíveis celulósicos, uma vez que o custo da enzima é a barreira principal neste processo (27).

[000162] Neste estudo, como uma prova do conceito, usamos o promotor do gene AtC4H para assegurar a forte expressão de QsuB em todos os tecidos lignificantes da planta. Isto resultou em uma redução leve da altura das plantas de todas as linhagens; mas nenhuma redução significativa do rendimento de biomassa exceto de duas linhagens transgênicas, que expressaram QsuB muito fortemente (Tabela 1; Figura 16) e exibiram - em algumas seções transversais do tronco (Figura 24) - evidência do colapso de vasos que pode prejudicar a condutividade do xilema (14). No entanto, a nossa estratégia ofe-rece potencial para superar estes defeitos selecionando promotores mais estringentes (por exemplo, específicos para fibras) que excluiriam a expressão de QsuB de elementos condutivos para o xilema (26, 28). Além disso, espera-se que a tradução da nossa tecnologia de modelos vegetais para culturas seja direta: é baseada somente na expressão de QsuB, não requer nenhum contexto genético particular, e as vias de lignina e chiquimato são bem conservadas entre as plantas vasculares.

[000163] Uma consequência direta da expressão de QsuB é o acúmulo de protocatechuato na biomassa de plantas transgênicas (~1% de peso seco na linhagem C4H::qsuB-9; Tabela 2). Considerando as propriedades benéficas de protocatechuato na indústria de biopolíme- ros e setor de saúde humana, tal produção de novo adiciona valor comercial extra à biomassa de plantas que expressam QsuB (29, 30). Quantidades muito mais altas de protocatechuato foram recuperadas após tratamento ácido dos extratos solúveis em metanol de plantas transgênicas (dados não mostrados), o que sugere sua conjugação no citosol após a exportação dos plastídeos. De forma interessante, a expressão de QsuB não afetou substancialmente o nível de metabólitos derivados da via de chiquimato, como aminoácidos aromáticos e salici- lato, sugerindo que 3-desidrochiquimato plastídico não é limitante (Ta-bela 2). Por outro lado, um aumento de cinamato e p-cumarato foi observado nestas linhagens, acompanhadas por um acúmulo de agrupamentos de p-cumaraldeído e álcool p-cumarílico (Tabela 2 e Figura 22).

[000164] A análise da lignina composição monomérica - usando es- pectroscopia RMN 2D, tioacidólise, e piro-GC/MS - demonstrou ine-quivocamente um aumento em unidades H em plantas que expressam QsuB (Figura 17 e Figura 28; Tabela 5). Estes dados podem explicar o grau reduzido da polimerização destas ligninas, que foi anteriormente observada em vários mutantes de lignina que exibem alto teor de unidades H, a incorporação das quais tipicamente reduz ou para o alongamento da cadeia de lignina (31, 32; Figura 18). Por isso, a reticula- ção do polissacarídeo de lignina reduzida dentro da biomassa das linhagens transgênicas é esperada, e isto pode contribuir para sua di- gestibilidade enzimática superior.

[000165] Um baixo conteúdo de lignina rico em unidades H corresponde a um fenótipo anteriormente caracterizado em plantas reguladas negativamente para hidroxicinamoil-CoA chiquimato/quinato hidro- xicinamoil transferase (HCT), p-cumarato 3-hidroxilase (C3H) ou cafe- oil chiquimato esterase (CSE). Isto sugere que uma alteração destas etapas biossintéticas ocorreu nas linhagens C4H::qsuB (10, 32, 33). Uma explicação possível consiste em que a atividade de QsuB em plastídeos afeta a exportação do chiquimato dos plastídeos ao citosol. Isto limitaria indiretamente a disponibilidade de chiquimato citosólico usado para a etapa enzimática catalisada por HCT. A distribuição do chiquimato entre plastídeos e o citosol ainda é pouco entendida, e os níveis de chiquimato estavam abaixo do limite de detecção nos nossos extratos de troncos de plantas selvagens e transgênicas. Alternativamente, porque os estudos prévios relataram uma flexibilidade de substrato de HCTs (34, 35), o grande acúmulo de protocatechuato pode atuar como inibidor de AtHCT, que se acopla a p-cumaroil-CoA e chi- quimato. Usando um ensaio enzimático in vivo para determinar a preferência do substrato de AtHCT, confirmamos sua afinidade por p- cumaroil-CoA e chiquimato, mas também demonstramos sua capaci-dade de aceitar protocatechuato e vários outros substratos como cate- col, 3,6-di-hidroxibenzoato, 3-hidróxi-2-aminobenzoato, e 2,3-di- hidroxibenzoato (Figura 25). Por isso, não podemos excluir a possibilidade de que o agrupamento de protocatechuato acumulado nas plantas C4H::qsuB exerça uma inibição competitiva de HCT e limite a síntese de cumaroil chiquimato requerida para a produção de unidades Se G-lignina.

MATERIAIS E MÉTODOS Material vegetal e condições de crescimento

[000166] Sementes de Arabidopsis thaliana (ecotipo Colômbia, Col- 0) foram germinadas diretamente no solo. As condições de crescimento foram 150 μmol/m2/s, 22°C, umidade 60% e 10 h de luz por dia pelas primeiras 4-5 semanas, seguido de 14 h de luz por dia até a se- nescência. A seleção de plantas transgênicas T1 e T2 foi feita no meio de vitaminas de Murashige e Skoog (PhytoTechnology Laboratories, Shawnee Mission, KS), suplementado com sacarose 1%, ágar 1,5% e canamicina 50 μg/mL.

Geração de vetores binários

[000167] O promotor p35S, com um acentuador único, foi amplificado por PCR de pRT100 com iniciadores fosforilados F-p35S (5’- GTCAACATGGTGGAGCACGACAC-3’) e R-p35S (5’- CGAGAATCTAGATTGTCCTCTCCAAATGAAATGAACTTC-3’) e clo- nado em um vetor pTkan desfosforilado digerido por SmaI (36) para gerar um vetor pTKan-p35S. Posteriormente, um cassete GW-YFP foi extraído do vetor pX-YFP (37) por digestão com XhoI/SpeI e ligado em um vetor pTKan-p35S digerido com XhoI/SpeI para gerar o vetor pTkan-p35S-GWR1R2-YFP.

[000168] Uma construção de DNA quimérico foi sintetizado (GenScript, Piscatway, NJ): foi flanqueado das sequências gateway attB4r (extremidade 5’) e attB3r (extremidade 3’) e contido, na seguinte ordem, terminador tG7; os sítios de restrição SmaI, KpnI, HindIII e XhoI; uma sequência de 2,9 kb que corresponde ao promotor C4H de Arabi- dopsis (pC4H); e uma sequência que codifica um sinal de direcionamento de plastídeo (SCHL; 38). Esta construção attB4r-tG7-pC4H- schl-attB3r então foi subclonado no vetor de entrada Gateway pDONR221-P4rP3r pela recombinação BP (Life Technologies, Foster City, CA, EUA) para gerar pENTR-L4-tG7-pC4H-schl-L3. Uma reação de recombinação LR foi realizada com pTkan-pIRX5-GW (21), pENTR- L1-pLac-lacZalpha-L4 (Life Technologies, Foster City, CA, EUA), pENTR-L3-pLac-Tet-L2 (Life Technologies, Foster City, CA, EUA), e pENTR-L4-tG7-pC4H::schl-L3. A construção obtida foi posteriormente digerida por SmaI para remover os fragmentos pLac-lacZalpha e tG7. O fragmento pLac-Tet foi substituído pelo cassete gateway usando a recombinação BP para gerar o vetor pTKan-pC4H::schl-GWR3R2. Geração de um plasmídeo pTkan-pC4H::schl-qsuB e transforma- ção vegetal

[000169] Uma sequência de codificação gênica QsuB de C. glutami- cum (número de acesso GenBank YP_001137362.1) sem códon de parada e flanqueado com sítios de recombinação Gateway attB3 (extremidade 5’) e attB2 (extremidade 3’) foram sintetizados para a expressão em Arabidopsis (GenScript, Piscatway, NJ) e clonados no vetor de entrada Gateway pDONR221-P3P2 por recombinação BP (Life Technologies, Foster City, CA, EUA). Um clone de entrada verificado por sequência foi recombinado por LR com o vetor pTKan-pC4H::schl- GWR3R2 para gerar a construção pTKan-pC4H::schl-qsuB, que foi introduzida em plantas Arabidopsis selvagens (ecotipo Col-0) através de transformação mediada por Agrobacterium (39).

Análise por Western blot

[000170] As proteínas de troncos de Arabidopsis foram extraídas usando um tampão contendo Tris-HCl 250 mM pH 8,5, EDTA 25 mM, DTT 2 mM, β-mercaptoetanol 5 mM, e sacarose 10%; e foram quantificados usando o método de Bradford (40). As proteínas (15 μg) foram separadas por SDS-PAGE, marcadas e imunodetectadas usando um anticorpo universal, como anteriormente descrito (41).

Extração de metabólitos solúveis em metanol

[000171] Os troncos de Arabidopsis de linhagens selvagens e trans- gênicas de 6 semanas foram coletados em nitrogênio líquido e armazenados a -80°C até utilização adicional. Previamente à extração do metabólito, os troncos coletados foram pulverizados em nitrogênio líquido. Para a extração de metabólitos solúveis em metanol, 700-1000 mg de pó de tronco congelado foram misturados com 2 ml de metanol- água 80% (v/v) e misturados (1.400 rpm) por 15 min a 70°C. Esta etapa foi repetida quatro vezes. Os extratos agrupados foram clarificados pela centrifugação (5 min, 20.000 x g, à temperatura ambiente), misturados com 4 mL de água de grau analítico e filtrados usando filtros centrífugos Amicon Ultra (membrana de celulose regenerada PM de corte de 10.000 Da; EMD Millipore, Billerica, MA). Os extratos filtrados foram liofilizados e os precipitados resultantes dissolvidos em metanol- água 50% (v/v) antes da análise de LC-MS. Uma hidrólise ácida das amostras foi realizada para a quantificação de protocatechuato, salici- lato e flavonóis; uma alíquota dos extratos filtrados foi seca sob vácuo, ressuspensa com HCl 1 N e incubada a 95°C por 3 h. A mistura foi submetida a três etapas de particionamento em acetato de etila. As frações de acetato de etila foram agrupadas, secas a vácuo e ressus- pensas em metanol-água 50% (v/v) antes da análise de LC-MS.

Extração de aromáticos ligados à parede celular

[000172] Os troncos senescidos foram triturados em moinho de bolas usando um Moinho Misturador MM 400 (Retsch Inc., Newtown, PA) e bolas de aço inoxidável de 2 min em 30 s-1. Os resíduos de parede celular (CWR) isentos de extrativos foram obtidos lavando sequencialmente 60 mg de troncos triturados em moinho de bolas com 1 mL de etanol 96% em 95°C duas vezes por 30 min e misturando com 1 mL de etanol 70% duas vezes por 30 segundos. Os CWR resultantes foram secos a vácuo durante a noite a 30°C. Os CWR (6 mg) foram misturados com 500 μL de NaOH 2 M e agitados em 1400 rpm por 24 h a 30°C. A mistura foi acidificada com 100 μL de HCl concentrado e submetida a três etapas de particionamento em acetato de etila. As frações de acetato de etila foram agrupadas, secas a vácuo e suspensas em metanol-água 50% (v/v) antes da análise de LC-MS.

Análise de LC-MS

[000173] Como anteriormente descrito em Bokinsky et al. (42) e Eudes et al. (43) - aminoácidos aromáticos, e ácidos aromáticos e aldeídos, respectivamente - foram analisados usando cromatografia líquida de alta performance (HPLC), ionização de eletropulverização (ESI) e espectrometria de massa (MS) por tempo de voo (TOF). Os álcoois aromáticos foram analisados por HPLC - ionização química à pressão atmosférica (APCI) - MS por TOF. Sua separação foi conduzida no sistema de HPLC Agilent 1200 Series Rapid Resolution (Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA, EUA) usando uma Phenomenex Kinetex XB-C18 (comprimento de 100 mm, diâmetro interno 2,1 mm e tamanho de partícula 2,6 μm; Phenomenex, Torrance, CA, EUA). A fase móvel foi composta de ácido fórmico 0,1% em água (solvente A) e metanol (solvente B). O gradiente de eluição foi como se segue: de B 5% a B 25% por 6 min, B 25% a B 5% por 1 min, e mantido em B 5% por mais 3 min. Uma taxa de fluxo de 0,5 mL/min foi usada em todas as partes. O compartimento de coluna e a bandeja de amostra foram estabelecidos a 50°C e 4°C, respectivamente. O sistema de HPLC foi acoplado a um espectrômetro de massa Agilent Technologies 6210 LC/TOF com uma divisão 1:4 pós-coluna. A detecção espectrométrica de massa foi conduzida usando APCI no modo iônico positivo. Os experimentos de MS foram realizados no modo de exame completo, em 0,86 espectros/segundo, para a detecção de íons [M-H2O+H]+. Gases de secagem e nebulização foram estabelecidos em 10 L/min e 25 psi, respectivamente, e uma temperatura de gás de secagem de 330°C foi usada em todas as partes. O vaporizador e a coroa foram estabelecidos em 350°C e 4 μA respectivamente, e uma voltagem capilar de 3.500 V também foi usada. As voltagens do fragmentor e OCT1 RF foram, cada uma, estabelecidas em 135 V, enquanto a voltagem do separador foi estabelecida em 50 V. A aquisição e o processamento de dados foram realizados pelo pacote de programas MassHunter (Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA, EUA). Os metabólitos foram quantificados através de curvas de calibração de 10 pontos de compostos padrão autênticos para os quais os coeficientes R2 foram > 0,99. O conteúdo de p-cumaraldeído foi estimado integrando a área da eluição de pico de massa em Rt = 8,6 min ([M-H]- = 131,050238) e pa- ra o qual a proporção [massa teórica/massa observada] foi menor que ± 5 ppm (Figura 26).

Ensaios de carboidrato e de lignina

[000174] Para cada genótipo (planta selvagem, C4H::qsuB-1 e C4H::qsuB-9), as amostras consistiram em misturas iguais do material de tronco de três culturas independentes. A biomassa foi extraída sequencialmente por sonicação (20 min) com etanol 80% (três vezes), acetona (uma vez), clorofórmio-metanol (1:1, v/v, uma vez) e acetona (uma vez). Para a determinação da composição de carboidrato, a biomassa foi hidrolisada por ácido como anteriormente descrito (44). Após neutralização com CaCO3, os açúcares monoméricos da biomassa hidrolisados foram separados por cromatografia de troca aniô- nica de alta performance com detecção amperiométrica pulsada usando uma coluna PA20 (Dionex, Sunnyvale, CA, EUA) e quantificados como anteriormente descrito (45). Uma curva de calibração de padrões de monossacarídeos foi direcionada para a verificação de fatores de resposta. O protocolo de biomassa NREL padrão foi usado para medir a lignina e as cinzas (46). Todos os ensaios de carboidrato e de lignina foram conduzidos em triplicata. O procedimento de tioacidólise foi realizado como descrito (47, 48) e os monômeros derivados da lig- nina foram identificados pelo GC-MS como seus derivados trimetil- sililados.

Espectroscopia de RMN 2D heteronuclear de coerência de quantum único (HSQC) 13C-1H

[000175] Para cada genótipo (planta selvagem, C4H::qsuB-1 e C4H::qsuB-9), as amostras consistiram em misturas iguais do material de tronco de três culturas independentes. As amostras foram extraídas e trituradas em moinho de bolas como anteriormente descrito (49, 50). Os géis foram formados usando DMSO-d6/piridina-d5 (4:1) e sonicados até ficar homogêneo no depurador de bancada Branson 2510 (Bran son Ultrasonic Corporation, Danbury, Connecticut). A temperatura do banho foi estritamente monitorada e mantida abaixo de 55°C. As soluções homogêneas foram transferidas para tubos de RMN. Os espectros de HSQC foram adquiridos a 25°C usando um instrumento Bruker Avance-600 MHz equipado de uma criossonda de gradiente reverso de 5 mm 1H/13C usando um programa de pulso hsqcetgpsisp2.2 (ns = 400, ds = 16, número de incrementos = 256, d1 = 1,0 s) (53). Os deslocamentos químicos foram referenciados ao pico de DMSO central (δC/δH 39.5/2.5 ppm). A designação dos espectros HSQC foi descrita em outro local (51, 54). Uma análise semiquantitativa das integrais de volume dos picos de correlação de HSQC foi realizada usando o programa de processamento Topspin Bruker 3.1 (Windows). Apodização gaussiana em F2 (LB =-0,50, GB = 0,001) e seno co-seno quadrado em F1 (LB=-0,10, GB=0,001) foi aplicado antes da Transformada de Fourier 2D. Isolamento de lignina da enzima celulolítica

[000176] Para cada genótipo (planta selvagem, C4H::qsuB-1 e C4H::qsuB-9), as amostras consistiram em misturas iguais do material de tronco de três culturas independentes. A biomassa extraída foi triturada em moinho de bolas por 3 h por 500 mg da amostra (em ciclos 10 min ligado/10 min desligado) usando um moinho de bolas PM100 (Re- tsch, Newtown, PA) vibrando em 600 rpm em vasos de dióxido de zir- cônio (50 mL) contendo cargas de bolas de ZrO2 (10 x 10 mm). As paredes trituradas em moinho de bolas foram digeridas quatro vezes mais por 3 d a 50°C com polissacaridases Cellic CTec2 e HTec2 (No- vozymes, Davis, CA) e pectinase de Aspergillus niger (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) em tampão de citrato de sódio (pH 5,0). A lignina celu- lolítica obtida foi lavada com água deionizada e liofilizada durante a noite.

Cromatografia de exclusão de tamanho

[000177] Soluções de lignina, 1% (p/v), foram preparadas em 1-metil- 2-pirrolidinona de grau analítico (NMP). A polidispersividade da lignina dissolvida foi determinada usando técnicas analíticas que envolvem SEC UV-F250/400 como anteriormente descrito (53). Foi usado um sistema LC binário Agilent 1200 series (G1312B) equipado de arranjo de diodos (G1315D) e detectores de fluorescência (G1321A). A separação foi alcançada com uma coluna Mixed-D (tamanho de partícula 5 μm, 300 mm x 7,5 mm d.i., faixa de massa molecular linear de 200 a 400.000 u, Agilent Technologies Inc.) a 80°C usando uma fase móvel de NMP em uma taxa de fluxo de 0,5 ml/min. A absorvância de mate-riais eluindo da coluna foi detectada usando fluorescência UV-F (Ex250/Em450). As intensidades espectrais foram normalizadas pela área e as estimativas de massa molecular foram determinadas após calibração do sistema com padrões de poliestireno. Pré-tratamentos de paredes celulares e sacarificação

[000178] Os troncos senescidos triturados em moinho de bolas (10 mg) foram misturados com 340 μL de água, 340 μL de H2SO4 (1,2%, p/v), ou 340 μL de NaOH (0,25%, p/v) para pré-tratamentos com água quente, ácidos diluídos ou alcalinos diluídos, respectivamente; agitados em 1.400 rpm (30°C, 30 min), e autoclavados a 120°C por 1 h. As amostras pré-tratadas com ácido diluído foram neutralizadas com Na- OH 5 N (25 μL). A sacarificação foi iniciada adicionando 650 μL de 100 mM de tampão de citrato de sódio pH 5 (para amostras pré-tratadas com água quente e com alcalina diluída) ou 625 μL de 80 mM de tampão de citrato de sódio pH 6,2 (para amostras pré-tratadas por ácido diluído) contendo tetraciclina 80 μg/mL e celulase Cellic CTec2 1% p/p ou 0,2% p/p (Novozymes, Davis, CA). Após 72 h de incubação a 50°C com agitação (800 rpm), as amostras foram centrifugadas (20.000 x g, 3 min) e 10 μL do sobrenadante foi coletado para a medida de açúcares redutores usando o ensaio de ácido 3,5-dinitrossalicílico e solu- ções de glicose como padrões (54). Localização subcelular de QsuB

[000179] A sequência nucleotídica schl-qsuB da construção pTkan- pC4H::schl-qsuB foi amplificada usando oligonucleotídeos 5’- GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCATGGCTT- CGATCTCCTCCT-3’ (sítio attB1 sublinhado) e 5’- GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCGTTTGGGATAC- CTCTCTCTAAATCTC-3’ (sítio attB2 sublinhado) e clonado no vetor de entrada Gateway pDONR221-f1 (Lalonde S, et al. (2010) Front Physiol 1:24). Um clone de entrada verificado pela sequência foi LR recombi- nado com o vetor pTKan p35S GWR1R2 YFP para gerar a construção pTKan-p35S-schl-qsuB-YFP. A infiltração de folhas de N. benthamiana de 4 semanas foi feita usando a cepa GV3101 de Agrobacterium, após o método descrito por Sparkes et al. (Nat Protoc 1(4):2019-2025). As plantas que expressam transientemente a proteína de fusão SCHL- QsuB-YFP foram analisadas pela microscopia confocal de varredura a laser 2 d após infiltração. A microscopia foi realizada usando um dispositivo Zeiss LSM 710 (Carl Zeiss Microscopy, Jena, Alemanha) equipado com um laser de argônio (excitação em 514 nm e emissão coletada em 510 a 545 nm). Marcação histoquímica de lignina

[000180] A marcação histoquímica foi realizada como descrito por Pradhan-Mitra e Loqué ("Histochemical staining of Arabidopsis thaliana secondary cell wall elements", JoVE (em impressão)). Seções transversais basais do tronco (espessura de 100 μm) foram obtidas usando um vibrátomo. As seções foram incubadas por 3 min no reagente flo- roglucinol-HCl (VWR International, Brisbane, CA), enxaguadas com água e observadas usando microscopia ótica de campo claro (Leica Microsystems Inc., Buffalo Grove, IL).

Espectrometria de massa com cromatografia gasosa por pirólise

[000181] A composição química da lignina em amostras de parede celular vegetal foi analisada por cromatografia gasosa por pirólise (GC) / espectrometria de massa (MS) usando um método anteriormente descrito com algumas modificações (Del Río JC, et al. (2012) Agric Food J Chem 60 (23):5922-5935). A pirólise de paredes celulares ve-getais foi realizada com Pyroprobe 5200 (CDS Analytical, Inc.) conectado com GC/MS (Thermo Electron Corporation com Trace GC Ultra and Polaris-Q MS) equipado com uma coluna Agilent HP-5MS (30 m x 0,25 mm d.i., espessura de filme 0,25 μm). A pirólise foi realizada em 550°C. O cromatógrafo foi programado em 50°C (1 min) a 300°C em uma taxa de 30°C/min; a temperatura final foi mantida por 10 min. Hélio foi usado como o gás de veículo em uma taxa de fluxo constante de 1 mL/min. O espectrômetro de massa foi operado no modo de exame e a fonte iônica foi mantida em 300°C. Os compostos foram identificados comparando seus espectros de massa com aqueles da biblioteca NIST e os anteriormente relatados (Del Río JC, Gutiérrez A. (2006) J Agric Food Chem 54 (13):4600-4610; Ralph J, Hatfield RD (1991) J Agric Food Chem 39 (8):1426-1437). As áreas molares do pico foram calculadas para os produtos de degradação de lignina, as áreas somadas foram normalizadas. As análises em todas as amostras foram conduzidas em duplicata e os dados tiveram as médias calculadas e expressos como porcentagens.

Ensaio de atividade de HCT in vivo

[000182] Para a clonagem de AtHCT, RNA de Arabidopsis total (1 μg) foi extraído usando o kit de extração de RNeasy Plant (Qiagen, Valência, CA) e transcrito de forma reversa usando o Kit de Síntese Transcriptor First Strand cDNA (Roche Applied Science, Indianapolis, IN). A preparação do cDNA obtido foi usada para amplificar AtHCT (número de acesso GenBank NP_199704.1) usando os seguintes oli- gonucleotídeos 5’-GGG GAC AAG TTT GTA CAA AAA AGC AGG CTT C ATGAAAATTA ACATCAGAGA TTCC-3’ (sítio attBI sublinhado) e 5’-GGG GAC CAC TTT GTA CAA GAA AGC TGG GTCTCATATCT- CAAACAAAAACTTCTCAAAC-3’ (sítio attB2 sublinhado) para clonagem no vetor de entrada Gateway pDONR221-f1 por recombinação BP (Life Technologies, Foster City, CA). Um clone de entrada AtHCT verificado por sequência foi recombinado por LR com o vetor pDRf1- 4CL5-GW (41) para gerar a construção pDRf1-4CL5-AtHCT.

[000183] Para os ensaios de atividade de HCT, os vetores pDRf1- 4CL5-AtHCT e pDRf1-4CL5 foram transformados no pad1 nocaute de S. cerevisiae (MATa his3Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0 Δpadl, ATCC 4005833) como anteriormente descrito (41). As culturas noturnas de colônias únicas que abrigam os vetores pDRf1-4CL5-AtHCT e pDRf1- 4CL5 foram cultivadas em meio de levedura 2X com bases nitrogena- das sem aminoácidos (Difco, Detroit, MI) suplementado com glicose 6% e mistura 2X dropout sem uracila (Sunrise Science Products, San Diego, CA). As culturas noturnas foram usadas para inocular 10 mL de meio mínimo fresco em uma OD600 = 0,1. Os substratos (p-cumarato, catecol ou benzoatos) foram adicionados ao meio 4 h depois em uma concentração final de 1 mM e as culturas foram cultivadas por 22 h. Para a detecção dos produtos de conjugado de cumarato, uma alíquota do meio de cultura foi coletada, clarificada por centrifugação (20.000 x g por 5 min a 4°C), misturada com um volume igual de metanol-água 50% (v/v) e filtrada usando filtros centrífugos Amicon Ultra (membrana de celulose regenerada PM de corte 3.000 Da; Millipore, Billerica, MA) antes da análise de HPLC-ESI-MS TOF. REFERÊNCIAS 1. Boerjan W, Ralph J, Baucher M (2003) Lignin biosynthesis. Annu Rev Plant Biol 54:519-546. 2. Boudet A-M (2007) Evolution and current status of research in phenolic compounds. Phytochemistry 68(22-24):2722-2735. 3. Keasling JD (2010) Manufacturing molecules through metabolic en-gineering. Science 330(6009):1355-1358. 4. Baucher M, Halpin, C, Petit-Conil, M, Boerjan W (2003) Lignin: Genetic engineering and impact on pulping. Crit Rev Biochem Mol Biol 38(4):305-350. 5. Chen F, Dixon RA (2007) Lignin modification improves fermentable sugar yields for biofuel production. 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SEQUÊNCIAS ILUSTRATIVAS SEQ ID NO:1 - sequência de polinucleotídeos de MtAroK ATGGCACCAAAAGCTGTTTTAGTGGGACTTCCTGGAAGTGGAAAG TCCACTATCGGTAGAAGGTTGGCTAAAGCATTAGGAGTTGGTTTG TTAGACACTGATGTGGCTATAGAACAAAGGACAGGAAGATCAATA GCAGACATTTTTGCTACAGATGGTGAACAGGAGTTCAGAAGGATA GAAGAGGATGTTGTGAGAGCTGCATTGGCTGACCATGATGGTGTT CTTAGTTTGGGTGGAGGTGCAGTTACTTCCCCAGGAGTGAGAGCT GCACTTGCTGGTCACACAGTTGTGTATTTGGAAATCTCAGCTGCA GAGGGAGTGAGAAGGACAGGTGGTAACACCGTGAGACCACTTTT GGCAGGTCCTGATAGGGCTGAAAAGTATAGAGCTTTGATGGCAAA AAGGGCTCCTTTATACAGAAGGGTTGCTACTATGAGAGTGGATAC AAATAGAAGGAACCCAGGTGCAGTTGTTAGGCACATTTTATCCAG GTTGCAGGTTCCATCTCCTTCTGAGGCAGCTACT SEQ ID NO:2 - sequência de aminoácidos de MtAroK (chiquimato qui- nase de Mycobacterium tuberculosis; NP_217055) MAPKAVLVGLPGSGKSTIGRRLAKALGVGLLDTDVAIEQRTGRSIADI FATDGEQEFRRIEEDVVRAALADHDGVLSLGGGAVTSPGVRAALAG HTVVYLEISAAEGVRRTGGNTVRPLLAGPDRAEKYRALMAKRAPLYR RVATMRVDTNRRNPGAVVRHILSRLQVPSPSEAAT SEQ ID NO:3 - sequência de polinucleotídeos de ScAro1 ATGGTTCAGCTTGCTAAGGTGCCTATTTTGGGTAACGACATCATTC ACGTTGGATATAACATTCACGATCATTTGGTTGAGACTATTATCAA GCATTGTCCATCTTCTACTTATGTTATTTGTAACGATACCAACCTTT CTAAGGTTCCTTATTACCAACAGTTAGTGCTTGAGTTTAAGGCTTC TTTGCCAGAAGGAAGTAGATTGTTAACTTATGTTGTGAAACCTGGA GAGACTTCTAAGTCAAGGGAAACAAAAGCTCAATTGGAGGACTAC CTTTTGGTTGAAGGATGTACCAGAGATACTGTGATGGTTGCTATTG GTGGAGGTGTTATAGGTGATATGATTGGATTTGTGGCATCAACTTT CATGAGAGGTGTTAGGGTTGTGCAAGTGCCAACAAGTTTACTTGC TATGGTTGACAGTTCCATCGGAGGAAAGACAGCAATAGATACCCC ATTGGGAAAAAACTTTATTGGTGCTTTCTGGCAGCCTAAGTTCGTG CTTGTTGATATCAAGTGGCTTGAGACATTGGCTAAGAGAGAATTTA TCAACGGAATGGCAGAAGTTATCAAGACAGCTTGTATTTGGAACG CAGATGAGTTTACCAGATTGGAATCAAATGCTAGTTTGTTCTTAAA CGTTGTGAACGGTGCAAAGAACGTGAAGGTTACTAACCAACTTAC AAACGAGATCGATGAAATCTCAAATACCGACATCGAAGCTATGCTT GATCACACTTACAAACTTGTTTTGGAGTCTATCAAGGTGAAAGCAG AAGTTGTGTCTTCAGATGAGAGAGAAAGTTCCTTGAGGAACTTGC TTAACTTCGGTCATTCAATCGGACACGCTTACGAAGCAATCTTAAC TCCACAAGCTCTTCATGGAGAATGTGTTTCTATTGGTATGGTGAAG GAGGCAGAATTGTCAAGATACTTCGGAATATTAAGTCCTACACAG GTTGCAAGGTTGTCCAAAATTTTGGTTGCTTACGGTTTGCCAGTGT CTCCTGATGAGAAGTGGTTCAAGGAATTAACACTTCATAAAAAGAC CCCTTTAGACATCCTTTTGAAAAAGATGTCCATCGATAAAAAGAAT GAGGGTTCTAAAAAGAAAGTTGTGATCTTAGAATCTATCGGAAAGT GCTATGGAGACTCCGCTCAATTTGTTTCTGATGAGGACCTTAGATT CATTTTGACAGATGAAACCCTTGTTTACCCATTTAAAGATATACCT GCTGACCAACAGAAGGTTGTGATTCCACCTGGTAGTAAATCCATTT CTAACAGAGCATTGATCTTAGCTGCATTGGGTGAAGGACAGTGTA AGATAAAGAACCTTCTTCATTCAGATGACACTAAGCACATGCTTAC AGCAGTTCATGAATTGAAAGGTGCTACAATCTCTTGGGAGGATAA CGGAGAAACCGTTGTGGTTGAAGGTCATGGAGGTTCCACTTTGTC TGCTTGCGCAGATCCACTTTATTTGGGTAATGCTGGAACCGCATC AAGATTTTTAACTAGTCTTGCTGCTTTGGTTAACTCAACTTCTTCAC AAAAGTACATTGTGTTAACTGGTAATGCAAGAATGCAACAGAGGC CAATCGCTCCTTTAGTTGATTCTCTTAGAGCAAACGGAACAAAGAT CGAGTACCTTAACAACGAAGGTTCACTTCCTATCAAGGTTTACACT GATAGTGTGTTCAAAGGAGGTAGAATAGAATTAGCTGCAACAGTT AGTTCCCAATATGTGTCTTCAATTCTTATGTGTGCTCCATACGCAG AAGAGCCTGTTACTTTAGCTCTTGTGGGAGGAAAGCCAATCTCAA AATTGTACGTTGATATGACAATCAAGATGATGGAAAAGTTCGGAAT CAACGTTGAGACTTCTACTACAGAACCATACACATACTACATCCCT AAGGGTCATTACATCAACCCTTCAGAGTACGTTATCGAAAGTGATG CTAGTTCCGCAACTTATCCATTAGCTTTCGCTGCAATGACCGGAAC CACTGTGACTGTTCCTAATATTGGATTTGAATCTCTTCAAGGTGAC GCTAGATTCGCAAGGGATGTTTTGAAGCCAATGGGTTGTAAAATC ACTCAGACAGCTACCTCAACAACCGTTAGTGGTCCACCTGTGGGA ACATTAAAGCCACTTAAACACGTTGACATGGAACCTATGACAGATG CTTTCTTGACCGCATGTGTGGTTGCTGCAATTTCACATGATAGTGA CCCAAATTCTGCTAACACTACAACCATAGAGGGAATAGCAAACCA AAGAGTTAAGGAATGCAACAGGATCTTGGCTATGGCAACTGAGTT AGCTAAATTTGGTGTTAAAACTACAGAATTACCTGATGGAATCCAG GTGCACGGTCTTAATTCAATCAAGGACTTGAAAGTTCCAAGTGATT CTTCAGGTCCTGTGGGAGTTTGTACTTATGATGACCATAGAGTGG CAATGTCATTCAGTTTGTTAGCTGGTATGGTTAATTCTCAAAACGA GAGGGATGAAGTGGCTAACCCAGTTAGAATTTTGGAAAGGCACTG CACTGGAAAGACATGGCCTGGTTGGTGGGACGTTTTGCATAGTGA ATTAGGAGCTAAACTTGATGGTGCAGAGCCTTTAGAATGTACTTCT AAGAAAAATTCCAAGAAATCTGTGGTTATTATCGGAATGAGAGCTG CAGGTAAAACCACTATTTCCAAATGGTGCGCTTCTGCATTGGGATA CAAATTGGTTGATTTAGACGAGCTTTTTGAACAACAGCATAATAAC CAATCAGTTAAGCAGTTCGTGGTTGAGAACGGTTGGGAAAAATTT AGAGAAGAGGAAACTAGGATCTTCAAGGAAGTTATCCAAAACTAC GGTGATGACGGATACGTTTTCTCTACAGGAGGTGGAATTGTGGAG TCAGCTGAAAGTAGAAAGGCACTTAAAGATTTCGCTAGTTCCGGT GGATATGTGTTGCATTTACACAGGGACATTGAGGAAACTATCGTTT TCTTGCAATCTGATCCATCAAGACCAGCTTATGTTGAGGAAATTAG AGAAGTGTGGAACAGAAGGGAGGGTTGGTACAAGGAATGTTCAAA CTTCTCTTTCTTTGCTCCACACTGCTCTGCTGAGGCAGAATTTCAA GCTCTTAGAAGGTCCTTCTCTAAATACATCGCAACTATAACAGGAG TTAGAGAGATCGAAATACCATCCGGTAGGTCTGCTTTTGTTTGTTT GACCTTCGATGACTTAACCGAGCAGACTGAAAACTTAACTCCTATT TGTTATGGTTGCGAGGCAGTGGAAGTTAGAGTGGACCATCTTGCT AATTACTCAGCAGATTTCGTTTCCAAGCAATTGTCTATCCTTAGAA AGGCTACTGATAGTATCCCAATAATTTTCACAGTTAGGACCATGAA ACAGGGTGGAAACTTTCCTGACGAGGAATTTAAGACACTTAGAGA ATTGTACGATATAGCTCTTAAGAATGGTGTTGAGTTTCTTGACTTG GAATTAACTCTTCCTACAGATATCCAATACGAAGTTATCAACAAGA GAGGAAACACTAAGATCATAGGTTCCCATCACGATTTTCAAGGATT ATACTCTTGGGATGACGCTGAGTGGGAAAATAGATTCAACCAGGC ATTGACCTTAGATGTTGACGTGGTTAAGTTTGTGGGTACTGCTGTT AATTTCGAGGACAACCTTAGATTGGAACATTTTAGGGATACACACA AGAACAAGCCACTTATCGCAGTTAACATGACCTCAAAAGGATCAAT CAGTAGAGTGTTGAATAACGTTTTAACCCCTGTGACTTCCGATCTT TTGCCAAACTCTGCTGCACCTGGTCAACTTACCGTTGCTCAGATC AACAAGATGTACACTTCTATGGGTGGAATTGAGCCAAAAGAACTTT TCGTGGTTGGAAAGCCAATCGGACATTCAAGATCACCTATCTTGC ATAACACTGGATACGAAATTTTAGGTCTTCCTCATAAGTTCGATAA ATTCGAGACAGAATCTGCTCAATTGGTTAAGGAAAAATTACTTGAT GGTAACAAGAACTTTGGTGGAGCTGCAGTTACTATCCCATTGAAAT TGGATATCATGCAGTACATGGATGAATTGACAGACGCTGCAAAGG TTATTGGTGCTGTGAATACCGTTATCCCACTTGGAAACAAGAAGTT CAAGGGTGATAACACAGACTGGCTTGGAATAAGAAATGCTCTTAT CAACAACGGTGTTCCTGAATATGTGGGTCACACTGCAGGATTGGT TATTGGTGCTGGTGGAACATCAAGAGCTGCATTATACGCTCTTCAT AGTTTGGGTTGTAAGAAAATCTTTATCATCAACAGGACAACCTCTA AGTTAAAACCACTTATCGAGTCACTTCCTAGTGAATTTAACATCAT CGGAATAGAGTCCACTAAGTCTATTGAGGAAATCAAAGAACACGT TGGTGTGGCAGTTTCCTGCGTTCCAGCTGATAAACCTTTGGATGA CGAGTTGCTTTCAAAACTTGAAAGATTTTTGGTTAAGGGTGCTCAT GCTGCATTCGTGCCAACACTTTTGGAAGCTGCATATAAGCCATCC GTGACCCCTGTTATGACTATCTCTCAGGATAAGTACCAGTGGCAC GTGGTTCCTGGATCTCAAATGTTGGTTCATCAGGGTGTGGCTCAG TTTGAGAAGTGGACAGGATTCAAAGGACCATTTAAGGCTATTTTCG ACGCAGTTACCAAGGAG SEQ ID NO:4 - sequência de aminoácidos de ScAro1 (proteína penta- funcional arom de Saccharomyces cerevisiae; CAA88208) MVQLAKVPILGNDIIHVGYNIHDHLVETIIKHCPSSTYVICNDTNLSKVP YYQQLVLEFKASLPEGSRLLTYVVKPGETSKSRETKAQLEDYLLVEG CTRDTVMVAIGGGVIGDMIGFVASTFMRGVRVVQVPTSLLAMVDSSI GGKTAIDTPLGKNFIGAFWQPKFVLVDIKWLETLAKREFINGMAEVIKT ACIWNADEFTRLESNASLFLNVVNGAKNVKVTNQLTNEIDEISNTDIEA MLDHTYKLVLESIKVKAEVVSSDERESSLRNLLNFGHSIGHAYEAILTP QALHGECVSIGMVKEAELSRYFGILSPTQVARLSKILVAYGLPVSPDE KWFKELTLHKKTPLDILLKKMSIDKKNEGSKKKVVILESIGKCYGDSAQ FVSDEDLRFILTDETLVYPFKDIPADQQKVVIPPGSKSISNRALILAALG EGQCKIKNLLHSDDTKHMLTAVHELKGATISWEDNGETVVVEGHGG STLSACADPLYLGNAGTASRFLTSLAALVNSTSSQKYIVLTGNARMQ QRPIAPLVDSLRANGTKIEYLNNEGSLPIKVYTDSVFKGGRIELAATVS SQYVSSILMCAPYAEEPVTLALVGGKPISKLYVDMTIKMMEKFGINVE TSTTEPYTYYIPKGHYINPSEYVIESDASSATYPLAFAAMTGTTVTVPN IGFESLQGDARFARDVLKPMGCKITQTATSTTVSGPPVGTLKPLKHV DMEPMTDAFLTACVVAAISHDSDPNSANTTTIEGIANQRVKECNRILA MATELAKFGVKTTELPDGIQVHGLNSIKDLKVPSDSSGPVGVCTYDD HRVAMSFSLLAGMVNSQNERDEVANPVRILERHCTGKTWPGWWDV LHSELGAKLDGAEPLECTSKKNSKKSVVIIGMRAAGKTTISKWCASAL GYKLVDLDELFEQQHNNQSVKQFVVENGWEKFREEETRIFKEVIQNY GDDGYVFSTGGGIVESAESRKALKDFASSGGYVLHLHRDIEETIVFLQ SDPSRPAYVEEIREVWNRREGWYKECSNFSFFAPHCSAEAEFQALR RSFSKYIATITGVREIEIPSGRSAFVCLTFDDLTEQTENLTPICYGCEAV EVRVDHLANYSADFVSKQLSILRKATDSIPIIFTVRTMKQGGNFPDEEF KTLRELYDIALKNGVEFLDLELTLPTDIQYEVINKRGNTKIIGSHHDFQG LYSWDDAEWENRFNQALTLDVDVVKFVGTAVNFEDNLRLEHFRDTH KNKPLIAVNMTSKGSISRVLNNVLTPVTSDLLPNSAAPGQLTVAQINK MYTSMGGIEPKELFVVGKPIGHSRSPILHNTGYEILGLPHKFDKFETE SAQLVKEKLLDGNKNFGGAAVTIPLKLDIMQYMDELTDAAKVIGAVNT VIPLGNKKFKGDNTDWLGIRNALINNGVPEYVGHTAGLVIGAGGTSRA ALYALHSLGCKKIFIINRTTSKLKPLIESLPSEFNIIGIESTKSIEEIKEHVG VAVSCVPADKPLDDELLSKLERFLVKGAHAAFVPTLLEAAYKPSVTPV MTISQDKYQWHVVPGSQMLVHQGVAQFEKWTGFKGPFKAIFDAVTK E SEQ ID NO:5 - sequência de polinucleotídeos de CgQsuB ATGAGAACAAGTATTGCAACCGTTTGTTTATCCGGAACTCTTGCTG AAAAATTGAGAGCAGCTGCAGACGCAGGATTCGATGGTGTTGAGA TTTTTGAACAAGATTTGGTTGTGTCTCCACATTCAGCTGAACAAAT CAGACAGAGGGCACAAGATTTAGGTCTTACATTGGACTTATTTCAG CCTTTCAGAGATTTTGAAGGAGTTGAAGAGGAACAATTCTTAAAGA ATCTTCACAGGTTGGAGGAAAAATTTAAGTTAATGAACAGACTTGG TATCGAAATGATCTTGCTTTGTTCTAACGTTGGAACAGCTACCATC AACGATGACGATCTTTTTGTGGAACAATTGCATAGAGCTGCAGATT TGGCTGAGAAGTACAACGTTAAGATCGCTTATGAAGCTCTTGCTT GGGGTAAATTCGTTAATGATTTTGAGCATGCTCACGCATTGGTTGA AAAAGTGAACCATAAGGCTTTGGGTACTTGCTTAGATACATTCCAC ATATTAAGTAGAGGATGGGAGACTGATGAGGTTGAAAACATCCCA GCTGAAAAAATATTTTTCGTGCAATTGGCTGATGCACCTAAGTTAT CTATGGATATCCTTTCTTGGTCAAGGCATCACAGAGTTTTTCCAGG AGAGGGTGACTTCGATTTGGTTAAGTTCATGGTGCATCTTGCTAA GACAGGATACGATGGTCCTATATCTTTGGAGATTTTCAACGACTCA TTTAGGAAAGCTGAAGTTGGAAGAACTGCAATTGATGGTTTAAGGT CTCTTAGATGGTTGGAGGACCAAACATGGCATGCACTTAACGCTG AAGATAGGCCATCAGCACTTGAGTTGAGAGCTTTGCCAGAAGTTG CAGAGCCTGAGGGTGTGGATTTCATTGAGATCGCTACAGGAAGGT TAGGTGAAACCATCAGAGTTTTACACCAGCTTGGTTTTAGACTTGG TGGACATCACTGTTCTAAGCAGGATTATCAAGTTTGGACTCAAGGA GATGTGAGGATCGTTGTGTGCGACAGAGGAGCAACAGGTGCTCC TACCACTATATCAGCTATGGGTTTCGACACCCCAGATCCTGAGGC TGCACATGCTAGGGCAGAACTTTTGAGAGCACAAACAATTGATAG ACCACACATCGAGGGAGAAGTTGATCTTAAGGGTGTGTACGCTCC TGACGGAGTTGAATTGTTTTTCGCAGGACCATCTCCTGATGGTAT GCCAGAGTGGTTACCTGAATTTGGTGTTGAGAAGCAAGAAGCTGG ACTTATCGAAGCAATCGATCATGTTAACTTTGCTCAGCCTTGGCAA CACTTCGATGAGGCAGTTTTGTTTTATACCGCATTGATGGCTTTAG AAACTGTGAGAGAGGATGAATTTCCATCACCTATTGGTTTAGTTAG GAATCAGGTGATGAGATCACCAAACGATGCTGTTAGATTACTTTTG TCAGTGGCACCTGAGGACGGAGAACAGGGTGATTTCTTAAATGCT GCATACCCAGAACATATAGCTCTTGCAACTGCTGATATTGTTGCAG TGGCTGAAAGAGCTAGGAAAAGAGGTTTGGATTTCTTGCCAGTTC CTGAAAACTATTACGACGATGTGCAGGCTAGATTCGATTTGCCTCA AGAGTTTTTAGACACACTTAAGGAAAACCATCTTCTTTATGACTGC GATGAGAACGGTGAATTTTTGCACTTCTACACTAGAACATTGGGAA CATTATTTTTCGAGGTTGTGGAAAGAAGGGGTGGATTTGCTGGAT GGGGTGAAACCAATGCACCTGTTAGGCTTGCTGCTCAATATAGAG AAGTTAGAGATTTAGAGAGAGGTATCCCAAAC SEQ ID NO:6 - sequência de aminoácidos de CgQsuB (desidrochiqui- mato desidratase de Corynebacterium glutamicum; BAF53460) MRTSIATVCLSGTLAEKLRAAADAGFDGVEIFEQDLVVSPHSAEQIRQ RAQDLGLTLDLFQPFRDFEGVEEEQFLKNLHRLEEKFKLMNRLGIEMI LLCSNVGTATINDDDLFVEQLHRAADLAEKYNVKIAYEALAWGKFVND FEHAHALVEKVNHKALGTCLDTFHILSRGWETDEVENIPAEKIFFVQL ADAPKLSMDILSWSRHHRVFPGEGDFDLVKFMVHLAKTGYDGPISLE IFNDSFRKAEVGRTAIDGLRSLRWLEDQTWHALNAEDRPSALELRAL PEVAEPEGVDFIEIATGRLGETIRVLHQLGFRLGGHHCSKQDYQVWT QGDVRIVVCDRGATGAPTTISAMGFDTPDPEAAHARAELLRAQTIDR PHIEGEVDLKGVYAPDGVELFFAGPSPDGMPEWLPEFGVEKQEAGLI EAIDHVNFAQPWQHFDEAVLFYTALMALETVREDEFPSPIGLVRNQV MRSPNDAVRLLLSVAPEDGEQGDFLNAAYPEHIALATADIVAVAERA RKRGLDFLPVPENYYDDVQARFDLPQEFLDTLKENHLLYDCDENGEF LHFYTRTLGTLFFEVVERRGGFAGWGETNAPVRLAAQYREVRDLER GIPN SEQ ID NO:7 - sequência de polinucleotídeos de PaDsDH ATGCCTTCAAAACTTGCTATCACCTCAATGTCTCTTGGTAGATGCT ATGCTGGTCACTCCTTCACTACTAAATTGGATATGGCTAGGAAATA TGGTTACCAAGGACTTGAATTGTTCCATGAGGATTTGGCTGACGTT GCATATAGACTTAGTGGTGAAACACCATCCCCTTGTGGACCATCT CCTGCTGCACAGTTGAGTGCTGCAAGACAAATACTTAGGATGTGT CAGGTTAGAAACATAGAAATTGTGTGCTTACAGCCATTTTCTCAAT ACGATGGTTTGTTAGACAGAGAAGAGCATGAAAGAAGGCTTGAAC AATTGGAGTTCTGGATAGAATTAGCTCACGAGCTTGATACAGACAT TATCCAGATTCCAGCAAATTTTCTTCCTGCTGAAGAGGTTACCGAA GATATTTCTTTGATCGTTTCAGATTTGCAAGAGGTGGCTGACATGG GTTTGCAGGCAAACCCACCTATTAGATTCGTTTATGAAGCTCTTTG TTGGTCAACTAGAGTGGATACATGGGAAAGGAGTTGGGAGGTTGT GCAAAGAGTTAATAGGCCTAACTTTGGTGTGTGCCTTGATACATTC AATATCGCAGGAAGAGTTTACGCTGACCCAACCGTGGCATCAGGT AGAACTCCTAACGCTGAAGAGGCAATTAGGAAGTCAATCGCTAGA TTGGTTGAAAGGGTTGATGTTAGTAAAGTTTTCTATGTGCAAGTTG TGGACGCAGAGAAGTTGAAAAAGCCATTAGTTCCTGGACACAGAT TCTACGATCCAGAACAACCTGCTAGGATGTCTTGGTCAAGAAACT GCAGGTTGTTTTATGGTGAAAAAGATAGAGGAGCTTACTTGCCAG TTAAGGAGATTGCTTGGGCATTTTTCAATGGTTTGGGATTTGAAGG TTGGGTTTCCTTAGAGCTTTTCAACAGAAGGATGTCTGATACTGGT TTTGGAGTGCCTGAAGAGTTAGCTAGAAGGGGAGCAGTTTCCTGG GCTAAACTTGTGAGAGATATGAAGATCACCGTTGACTCACCAACT CAACAGCAAGCTACACAGCAACCTATAAGAATGTTGAGTTTATCCG CTGCATTA SEQ ID NO:8 - sequência de aminoácidos de PaDsDH (desidrochi- quimato desidratase de Podospora anserina; CAD60599) MPSKLAITSMSLGRCYAGHSFTTKLDMARKYGYQGLELFHEDLADVA YRLSGETPSPCGPSPAAQLSAARQILRMCQVRNIEIVCLQPFSQYDG LLDREEHERRLEQLEFWIELAHELDTDIIQIPANFLPAEEVTEDISLIVS DLQEVADMGLQANPPIRFVYEALCWSTRVDTWERSWEVVQRVNRP NFGVCLDTFNIAGRVYADPTVASGRTPNAEEAIRKSIARLVERVDVSK VFYVQVVDAEKLKKPLVPGHRFYDPEQPARMSWSRNCRLFYGEKD RGAYLPVKEIAWAFFNGLGFEGWVSLELFNRRMSDTGFGVPEELAR RGAVSWAKLVRDMKITVDSPTQQQATQQPIRMLSLSAAL SEQ ID NO:9 - sequência de polinucleotídeos de PhPAAS ATGGACACTATCAAGATCAACCCAGAGTTCGACGGACAGTTCTGC AAGACTACATCATTATTAGACCCAGAGGAGTTCAGGAGGAATGGA CATATGATGGTTGATTTTCTTGCTGACTACTTCCACAACATCGAAA AGTACCCAGTTAGATCCCAAGTGGAACCTGGTTATTTGGAGAGGT TGTTACCAGATTCAGCTCCTATACAGCCAGAACCTATCGAGAAAAT TTTGAAGGATGTTAGATCAGACATATTTCCAGGTTTAACACATTGG CAAAGTCCAAATTTCTTTGCTTACTTCCCTTGCTCTTCAAGTACCG CAGGAATTTTAGGTGAAATGCTTTCAGCTGGATTGAACGTTGTGG GTTTTTCATGGATCGCTAGTCCAGCTGCAACTGAATTAGAGAGTAT TGTTATGGATTGGCTTGGAAAATTGATTAATTTGCCTAAGACATAT CTTTTCTCTGGTGGAGGTGGAGGTGTGATGCAGGGTACTACATGC GAAGTTATGCTTTGTACTATCGTGGCTGCAAGAGATAAAATGTTGG AAAAGTTTGGAAGGGAGAACATTGATAAGTTAGTTGTGTACGCATC AGACCAAACCCACTTTAGTTTCCAGAAAGCTGTTAAGATCTCAGGT ATAAAACCAGAAAACTTCAGAGCTATACCTACCACTAAGGCAACAG AATTCTCCCTTAACCCAGAGTCTTTGAGAAGGGCTATCCAAGAGG ATAAAAAGGCAGGACTTATCCCTTTGTTTTTATGCACATCAATAGG TACAACCAGTACTACAGCAGTTGACCCACTTAAACCTTTGTGTGAA ATAGCTGAAGAGTATGGAATTTGGGTTCATGTGGATGCTGCATAC GCTGGTTCTGCATGCATTTGTCCTGAATTTCAGCATTTCTTGGACG GTGTTGAGCACGCTAATTCCTTTTCTTTCAACGCACACAAGTGGTT GTTTACTACTCTTGATTGTTGCTGTCTTTGGTTGAAAGACCCATCC TCTTTGACTAAGGCACTTTCAACAAACCCTGAAGTTTTGAGAAACG ATGCTACCGACAGTGAGCAAGTTGTGGATTATAAAGACTGGCAGA TTACTTTATCCAGAAGGTTTAGGTCTCTTAAGCTTTGGTTGGTTCTT AAGTCCTACGGAGTGGCTAATCTTAGAAACTTCATAAGGTCTCATA TCGAAATGGCTAAGCACTTTGAAGAGTTGGTTGCAATGGATGAAA GATTCGAGATCATGGCACCAAGGAATTTTTCCTTAGTTTGTTTCAG AGTGTCTCTTTTGGCTCTTGAAAAGAAGTTTAATTTCGTTGATGAA ACTCAAGTGAACGAGTTTAACGCTAAGCTTCTTGAATCTATCATCT CAAGTGGTAACGTTTACATGACACATACCGTTGTGGAGGGAGTTT ACATGATTAGATTCGCTGTGGGTGCACCTTTGACAGATTATCCTCA CATTGATATGGCTTGGAATGTTGTTAGGAACCACGCTACTATGATG TTGAACGCA SEQ ID NO:10 - sequência de aminoácidos de PhPAAS (Fenilacetal- deído sintase de Petúnia hybrida; ABB72475) MDTIKINPEFDGQFCKTTSLLDPEEFRRNGHMMVDFLADYFHNIEKYP VRSQVEPGYLERLLPDSAPIQPEPIEKILKDVRSDIFPGLTHWQSPNF FAYFPCSSSTAGILGEMLSAGLNVVGFSWIASPAATELESIVMDWLGK LINLPKTYLFSGGGGGVMQGTTCEVMLCTIVAARDKMLEKFGRENID KLVVYASDQTHFSFQKAVKISGIKPENFRAIPTTKATEFSLNPESLRRA IQEDKKAGLIPLFLCTSIGTTSTTAVDPLKPLCEIAEEYGIWVHVDAAYA GSACICPEFQHFLDGVEHANSFSFNAHKWLFTTLDCCCLWLKDPSSL TKALSTNPEVLRNDATDSEQVVDYKDWQITLSRRFRSLKLWLVLKSY GVANLRNFIRSHIEMAKHFEELVAMDERFEIMAPRNFSLVCFRVSLLA LEKKFNFVDETQVNEFNAKLLESIISSGNVYMTHTVVEGVYMIRFAVG APLTDYPHIDMAWNVVRNHATMMLNA SEQ ID NO:11 - sequência de polinucleotídeos de ObCCMT1 ATGGCGAGAAAAGAGAACTATGTTGTTTCTAACATGAATGTTGAAA GTGTGTTGTGCATGAAAGGTGGAAAAGGAGAAGATAGCTATGATA ACAACTCTAAGATGCAGGAGCAACATGCTCGATCAGTGCTCCACC TTCTGATGGAAGCTCTCGACGGCGTGGGGCTGAGCTCGGTGGCG GCCGGCGCTTTCGTGGTGGCGGATCTCGGCTGCTCCAGCGGAAG AAACGCCATAAACACGATGGAATTTATGATCAATCACCTGACTGAG CACTACACGGTGGCGGCGGAAGAGCCGCCGGAATTCTCAGCCTT CTTCTGCGACCTCCCCTCCAACGACTTCAACACCCTCTTTCAGCT CCTTCCGCCGTCTGACGGCAGCAGCGGTTCTTACTTCACTGCCG GCGTGGCCGGTTCGTTTTACCGGAGGCTTTTCCCGGCGAAGTCT GTTGATTTCTTTTACTCGGCATTTAGTTTGCACTGGCTATCTCAGA TACCAAAGGAGGTGATGGAGAAGGGATCGGCGGCTTACAACGAG GGGAGAGTGACCATCAACGGTGCAAAAGAGAGCACCGTAAATGC ATACAAGAAACAATTTCAAAGTGATTTGGGTGTCTTCTTGAGATCC AGATCCAAAGAATTGAAACCGGGAGGATCCATGTTCCTCATGCTC TTGGGTCGGACCAGCCCCGACCCGGCAGATCAGGGCGCATGGAT TCTCACTTTCAGCACACGTTATCAAGATGCTTGGAATGATCTTGTG CAAGAGGGCTTAATTTCGAGCGAAAAACGGGATACGTTCAACATC CCGATATATACGCCCAGCCTAGAGGAGTTCAAAGAGGTGGTAGAA AGAGATGGTGCATTCATAATCAACAAGCTCCAACTTTTCCACGGTG GCAGCGCTCTCATCATCGATGATCCCAACGATGCGGTTGAGATTA GCCGTGCCTATGTCAGCCTCTGTCGCAGCCTCACCGGAGGCTTA GTTGATGCCCACATAGGCGATCAGCTCGGCCATGAGCTCTTCTCG CGCTTATTAAGCCAAGCCGTGGATCAGGCTAAGGAGCTAATGGAC CAGTTTCAGCTCGTCCATATAGTTGCATCCCTTACTTTAGCT SEQ ID NO:12 - sequência de aminoácidos de ObCCMT1 (cinamato/p- cumarato carboxila metiltransferase de Ocimum basilicum; ABV91100) MARKENYVVSNMNVESVLCMKGGKGEDSYDNNSKMQEQHARSVL HLLMEALDGVGLSSVAAGAFVVADLGCSSGRNAINTMEFMINHLTEH YTVAAEEPPEFSAFFCDLPSNDFNTLFQLLPPSDGSSGSYFTAGVAG SFYRRLFPAKSVDFFYSAFSLHWLSQIPKEVMEKGSAAYNEGRVTIN GAKESTVNAYKKQFQSDLGVFLRSRSKELKPGGSMFLMLLGRTSPD PADQGAWILTFSTRYQDAWNDLVQEGLISSEKRDTFNIPIYTPSLEEF KEVVERDGAFIINKLQLFHGGSALIIDDPNDAVEISRAYVSLCRSLTGG LVDAHIGDQLGHELFSRLLSQAVDQAKELMDQFQLVHIVASLTLA SEQ ID NO:13 - sequência de polinucleotídeos de RgC2’H ATGGCACCAACCAAAGATTCAGTTATTCACATGGGAGCAGAGTCC TGGGATGAGATTTCCGAGTTCGTTACTAAAAAGGGACACGGTGTT AAGGGTCTTTCTGAACTTGGTATTAAAACTCTTCCAAAGCAATTCC ATCAGCCTCTTGAAGAGAGGTTCAGTGAGAAAAAGATTTTGGAAA GAGCTTCAATCCCACTTATCGATATGAGTAAGTGGGACTCCCCTG AGGTTGTGAAGTCTATCTGTGATGCTGCAGAACATTGGGGTTTCTT TCAAATAGTTAATCACGGAGTGCCATTGGAGACTTTACAGAGAGTT AAAGAAGCTACACATAGGTTTTTCGCTTTGCCTGCAGAAGAGAAAA ATAAGTACTCTAAGGAAAACTCACCAATTAATAACGTTAGATTCGG TTCTTCATTCGTTCCTCATGTTGAGAAAGCACTTGAATGGAAGGAT TTTCTTAGTATGTTCTATGTTTCCGAAGAGGAAACTAACACATACT GGCCACCTATTTGTAGAGACGAGATGTTAGAATACATGAGGAGTT CCGAGGTTCTTATCAAAAGATTGATGGAAGTGTTAGTTGTGAAGG GTCTTAAAGTTAAGCAAATCGATGAGATAAGAGAACCAATGTTGGT GGGATCAAGAAGAATTAATTTGAACTACTACCCTAAATGCCCAAAT CCTGAACTTACATTGGGTGTTGGAAGGCATAGTGATATTTCCACCT TTACTATCTTGTTACAAGACGAAATCGGTGGACTTCATGTTAGAAA GTTGGATGACACTGGTAACACCTGGGTTCATGTTACCCCAATATCT GGTTCACTTATTATCAATATCGGAGATGCTTTGCAGATAATGTCTA ACGGAAGGTACAAGTCAATAGAACACATGGTTGTGGCAAATGGAA CACAAGACAGAATCTCTGTTCCTTTATTTGTGAACCCAAAGCCTCA GGCTATACTTTGTCCATTCCCTGAGGTTTTGGCAAATGGAGAAAAA CCAGTTTATAAGCCTGTGTTGTGCTCTGATTACTCAAGGCATTTCT ACACAAAACCTCACGATGGTAAAAAGACAGTGGATTTCGCATTGAT GAAC SEQ ID NO:14 - sequência de aminoácidos de RgC2’H (dioxigenase dependente de 2-oxoglutarato de Ruta graveolens; Vialart et al., Plant. J 2012, 70:460-470) MAPTKDSVIHMGAESWDEISEFVTKKGHGVKGLSELGIKTLPKQFHQ PLEERFSEKKILERASIPLIDMSKWDSPEVVKSICDAAEHWGFFQIVN HGVPLETLQRVKEATHRFFALPAEEKNKYSKENSPINNVRFGSSFVP HVEKALEWKDFLSMFYVSEEETNTYWPPICRDEMLEYMRSSEVLIKR LMEVLVVKGLKVKQIDEIREPMLVGSRRINLNYYPKCPNPELTLGVGR HSDISTFTILLQDEIGGLHVRKLDDTGNTWVHVTPISGSLIINIGDALQI MSNGRYKSIEHMVVANGTQDRISVPLFVNPKPQAILCPFPEVLANGE KPVYKPVLCSDYSRHFYTKPHDGKKTVDFALMN SEQ ID NO:15 - Plastídeo que visa a sequência de polinucleotídeos sinal ATGGCTTCGATCTCCTCCTCAGTCGCGACCGTTAGCCGGACCGC CCCTGCTCAGGCCAACATGGTGGCTCCGTTCACCGGCCTTAAGTC CAACGCCGCCTTCCCCACCACCAAGAAGGCTAACGACTTCTCCAC CCTTCCCAGCAACGGTGGAAGAGTTCAATGCATGCAGGTGTGGC CGGCCTACGGCAACAAGAAGTTCGAGACGCTGTCGTACCTGCCG CCGCTGTCGACGATGGCGCCCACCGTGATGATGGCCTCGTCGGC CACCGCCGTCGCTCCGTTCCAGGGGCTCAAGTCCACCGCCAGCC TCCCCGTCGCCCGCCGCTCCTCCAGAAGCCTCGGCAACGTCAGC AACGGCGGAAGGATCCGGTGCATGCAG SEQ ID NO:16 - Plastídeo que visa a sequência de aminoácidos sinal MASISSSVATVSRTAPAQANMVAPFTGLKSNAAFPTTKKANDFSTLP SNGGRVQCMQVWPAYGNKKFETLSYLPPLSTMAPTVMMASSATAV APFQGLKSTASLPVARRSSRSLGNVSNGGRIRCMQ SEQ ID NO:17 - sequência de polinucleotídeos do promotor IRX5 ATGAAGCCATCCTCTACCTCGGAAAAACTTGTTGCGAGAAGAAGA CATGCGATGGCATGGATGCTTGGATCTTTGACATTGATGACACTC TTCTCTCAACCATTCCTTACCACAAGAGCAACGGTTGTTTCGGGTA AATAAACTAAACTTAACCATATACATTAGCCTTGATTCGGTTTTTGG TTTGATTTATGGATATTAAAGATCCGAATTATATTTGAACAAAAAAA AATGATTATGTCACATAAAAAAAAATTGGCTTGAATTTTGGTTTAGA TGGGTTTAAATGTCTACCTCTAATCATTTCATTTGTTTTCTGGTTAG CTTTAATTCGGTTTAGAATGAAACCGGGATTGACATGTTACATTGA TTTGAAACAGTGGTGAGCAACTGAACACGACCAAGTTCGAGGAAT GGCAAAATTCGGGCAAGGCACCAGCGGTTCCACACATGGTGAAG TTGTACCATGAGATCAGAGAGAGAGGTTTCAAGATCTTTTTGATCT CTTCTCGTAAAGAGTATCTCAGATCTGCCACCGTCGAAAATCTTAT TGAAGCCGGTTACCACAGCTGGTCTAACCTCCTTCTGAGGTTCGA ATCATATTTAATAACCGCATTAAACCGAAATTTAAATTCTAATTTCA CCAAATCAAAAAGTAAAACTAGAACACTTCAGATAAATTTTGTCGTT CTGTTGACTTCATTTATTCTCTAAACACAAAGAACTATAGACCATAA TCGAAATAAAAACCCTAAAAACCAAATTTATCTATTTAAAACAAACA TTAGCTATTTGAGTTTCTTTTAGGTAAGTTATTTAAGGTTTTGGAGA CTTTAAGATGTTTTCAGCATTTATGGTTGTGTCATTAATTTGTTTAG TTTAGTAAAGAAAGAAAAGATAGTAATTAAAGAGTTGGTTGTGAAA TCATATTTAAAACATTAATAGGTATTTATGTCTAATTTGGGGACAAA ATAGTGGAATTCTTTATCATATCTAGCTAGTTCTTATCGAGTTTGAA CTCGGGTTATGATTATGTTACATGCATTGGTCCATATAAATCTATG AGCAATCAATATAATTCGAGCATTTTGGTATAACATAATGAGCCAA GTATAACAAAAGTATCAAACCTATGCAGGGGAGAAGATGATGAAA AGAAGAGTGTGAGCCAATACAAAGCAGATTTGAGGACATGGCTTA CAAGTCTTGGGTACAGAGTTTGGGGAGTGATGGGTGCACAATGG AACAGCTTCTCTGGTTGTCCAGTTCCCAAGAGAACCTTCAAGCTC CCTAACTCCATCTACTATGTCGCCTGATTAAATCTTATTTACTAACA AAACAATAAGATCAGAGTTTCATTCTGATTCTTGAGTCTTTTTTTTC TCTCTCCCTCTTTTCATTTCTGGTTTATATAACCAATTCAAATGCTT ATGATCCATGCATGAACCATGATCATCTTTGTGTTTTTTTTTCCTTC TGTATTACCATTTTGGGCCTTTGTGAAATTGATTTTGGGCTTTTGTT ATATAATCTCCTCTTTCTCTTTCTCTACCTGATTGGATTCAAGAACA TAGCCAGATTTGGTAAAGTTTATAAGATACAAAATATTAAGTAAGA CTAAAGTAGAAATACATAATAACTTGAAAGCTACTCTAAGTTATACA AATTCTAAAGAACTCAAAAGAATAACAAACAGTAGAAGTTGGAAGC TCAAGCAATTAAATTATATAAAAACACTAACTACACTGAGCTGTCTC CTTCTTCCACCAAATCTTGTTGCTGTCTCTTGAAGCTTTCTTATGAC ACAAACCTTAGACCCAATTTCACTCACAGTTTGGTACAACCTCAGT TTTCTTCACAACAAATTCAAACATCTTACCCTTATATTACCTCTTTAT CTCTTCAATCATCAAAACACATAGTCACATACATTTCTCTACCCCA CCTTCTGCTCTGCTTCCGAGAGCTCAGTGTACCTCGCC SEQ ID NO:18 - sequência de polinucleotídeos do promotor AtC4H CGGAATGAGAGACGAGAGCAATGTGCTAAGAGAAGAGATTGGGA AGAGAGAAGAGAAGATAAAGGAAACGGAAAAGCATATGGAGGAG CTTCACATGGAGCAAGTGAGGCTGAGAAGACGGTCAAGTGAGCTT ACGGAAGAAGTGGAAAGGACGAGAGTGTCTGCATCGGAAATGGC TGAGCAGAAAAGAGAAGCTATAAGACAGCTTTGTATGTCTCTTGAC CATTACAGAGATGGGTACGACAGACTTTGGAGAGTTGTTGCAGGA CATAAGAGTAAGAGAGTAGTGGTCTTATCAACTTGAAGTGTAAGAA CAATGAGTCAATGACTACGTGCAGGACATTGGACATACCGTGTGT TCTTTTGGATTGAAATGTTGTTTCGAAGGGCTGTTAGTTGATGTTG AAAATAGGTTGAAGTTGAATAATGCATGTTGATATAGTAAATATCAA TGGTAATATTTTCTCATTTCCCAAAACTCAAATGATATCATTTAACT ATAAACTAACGTAAACTGTTGACAATACACTTATGGTTAAAAATTTG GAGTCTTGTTTTAGTATACGTATCACCACCGCACGGTTTCAAAACC ACATAATTGTAAATGTTATTGGAAAATAGAACTCGCAATACGTATT GTATTTTGGTAAACATAGCTCTAAGCCTCTAATATATAAGCTCTCAA CAATTCTGGCTAATGGTCCCAAGTAAGAAAAGCCCATGTATTGTAA GGTCATGATCTCAAAAACGAGGGTGAGGTGGAATACTAACATGAG GAGAAAGTAAGGTGACAAATTTTTGGGGCAATAGTGGTGGATATG GTGGGGAGGTAGGTAGCATCATTTCTCCAAGTCGCTGTCTTTCGT GGTAATGGTAGGTGTGTCTCTCTTTATATTATTTATTACTACTCATT GTAAATTTCTTTTTTCTACAATTTGTTTCTGACTCCAAAATACGTCA CAAATATAATACTAGGCAAATAATTATTTTATTATAAGTCAATAGAG TGGTTGTTGTAAAATTGATTTTTTGATATTGAAAGAGTTCATGGAC GGATGTGTATGCGCCAAATGGTAAGCCCTTGTACTGTGCCGCGC GTATATTTTAACCACCACTAGTTGTTTCTCTTTTTCAAAAAACACAA AAAAAAAATAATTTGTTTTCTTAACGGCGTCAAATCTGACGGCGTC TCAATACGTTCAATTTTTTTCTTTCTTTCACATGGTTTCTCATAGCTT TGCATTGACCATAGGTAAAGGGATAAGGATAATGGTTTTTTCTCTT GTTTGTTTTATCCTTATTATTCAAAAAGGATAAAAAAACAGTGATAT TTAGATTTCTTTGATTAAAAAAGTCATTGAAATTCATATTTGATTTTT TGCTAAATGTCAACACAGAGACACAAACGTAATGCACTGTCGCCA ATATTCATGGATCATGACAATAAATATCACTAGAATAATTAAAAATC AGTAGAATGCAAACAAAGCATTTTCTAAGTAAAACAGTCTTTTATAT TCACGTAATTGGAATTTCCTTTTTTTTTTTTTGTCGTAATTGGAATTT CCTTTATCAAACCCAAAGTCCAAAACAATCGGCAATGTTTTGCAAA ATGTTCAAAACTATTGGCGGGTTGGTCTATCCGAATTGAAGATCTT TTCTCCATATGATAGACCAACGAAATTCGGCATACGTGTTTTTTTTT TTGTTTTGAAAACCCTTTAAACAACCTTAATTCAAAATACTAATGTA ACTTTATTGAACGTGCATCTAAAAATTTTGAACTTTGCTTTTGAGAA ATAATCAATGTACCAATAAAGAAGATGTAGTACATACATTATAATTA AATACAAAAAAGGAATCACCATATAGTACATGGTAGACAATGAAAA ACTTTAAAACATATACAATCAATAATACTCTTTGTGCATAACTTTTTT TGTCGTCTCGAGTTTATATTTGAGTACTTATACAAACTATTAGATTA CAAACTGTGCTCAGATACATTAAGTTAATCTTATATACAAGAGCAC TCGAGTGTTGTCCTTAAGTTAATCTTAAGATATCTTGAGGTAAATA GAAATAGTTGACTCGTTTTTATCTTCTTCTTTTTTTACCATGAGCAA AAAAGATGAAATAAGTTCAAAACGTGACGAATCTATATGTTACTAC TTAGTATGTGTCAATCATTAAATCGGGAAAACTTCATCATTTCAGG AGTATTACAAAACTCCTAAGAGTGAGAACGACTACATAGTACATAT TTTGATAAAAGACTTGAAAACTTGCTAAAACGAATTTGCGAAAATAT AATCATACAAGTGCCAGTGATTTTGATCGAATTATTCATAGCTTTGT AGGATGAACTTAATTAAATAATATCTCACAAAAGTATTGACAGTAAC CTAGTACTATACTATCTATGTTAGAATATGATTATGATATAATTTAT CCCCTCACTTATTCATATGATTTTTGAAGCAACTACTTTCGTTTTTT TAACATTTTCTTTTGTTGGTTATTGTTAATGAGCATATTTAGTCGTT TCTTAATTCCACTGAAATAGAAAATACAAAGAGAACTTTAGTTAATA GATATGAACATAATCTCACATCCTCCTCCTACCTTCACCAAACACT TTTACATACACTTTGTGGTCTTTCTTTACCTACCACCATCAACAACA ACACCAAGCCCCACTCACACACACGCAATCACGTTAAATTTAACG CCGTTTATTATCTCATCATTCACCAACTCCCACGTACCTAACGCCG TTTACCTTTTGCCGTTGGTCCTCATTTCTCAAACCAACCAAACCTC TCCCTCTTATAAAATCCTCTCTCCCTTCTTTATTTCTTCCTCAGCAG CTTCTTCTGCTTTCAATTACTCTCGCC SEQ ID NO:19 - sequência de polinucleotídeos do promotor AtC3H ATCGTAAGTTTTTTTGTGTGTGTGTTAACAATGTACTCACTACTCAC TGTTCCATATTTTTGATGTACGTATATCGAAAACATTCTGCCAACAA ATGCAAACATAACAAAAGTCAAAAACAATAACATAACCGGGAATTA AACCAAAATGTAATTGCTTTTTATTAGTGTCAGGCCTTCTGCTTAAA AATATTCTCGGCCCAGAGCCCATTAACACCTATCTCAATTCATATT GAAGAAAATGACTATATTACTTGACAAAAACTTTAGTCAGAAAAATA TGGAATCTCTTTCGGTACTGCTAAGTGCTAACCTTAAATAGTATAG AATTCTTAGTTCATTCTCAAAAACATAGCTATATGTAGATTATAAAA GTTCGATATTATTTCCTGCAAAAGATGTTATAATGTTACAACTTACA AGAAAATGATGTATATGTAGATTTTATAAACTGGTACCGTAATTCAT AAAAGATGGTGGTGGGTATGTATCAGTAACGGAACTTACATATGC GTGTGTATTACTATGTCTATATGGTGTATTCCTTTGTGTGGAACAA TGCACGTCAGAGTTGTTTATTTTCTTATAGAATTTAAGGAATCAATT ATTGGATTTCTCAAGGTGAAAGTGGACTTCTTTGCACGCAAGGTCT AGTTGCCGACTTGCCGTTGCATGTAACATGATTGTTGAAATAAAGT GAATTGAGAGAAGTTTGGCCAGACATTTTAAATTTAACCCAAAAAA AGTAGGGCCTAACACAAAATATAACCTCTCTTTGTTCAAAGGAAAT AACACCTACGTCTTATAATTGAACCAAACATTGAATCATTGAACTC ACCTATAATAATTATAATAACACGAATTCACAAGACACCTAAAAGAA AAAGTTCACAAAAACAAATAAAAATTTACCTCTCACCAAACACACT CACCTACCCGTCTGGTCCCACTGACCCCAACATACAACACCGACT CTCTCCCACACCAATTTTTTTTTTTGGCGTTTTAAAACAAATAAACT ATCTATTTTTTTTTCTTACCAACTGATTAATTCGTGAATAATCTATTA TCTTCTTCTTTTTTTTGTGACGGATGATTAGTGCGTGGGGAAATCA AAATTTACAAAATTTGGGATGATTCCGATTTTTGCCATTCGATTAAT TTTGGTTAAAAGATATACTATTCATTCACCAAGTTTTCAGATGAGTC TAAAAGATAATATCATTTCACTAGTCACTTAAAAAAAGGGTTAAAAG AACATCAATAATATCACTGGTTTCCTTAGGTGACCCAAAAAAAGAA GAAAAAGTCACTAGTTTCTTTTTGGAAATTTTACTGGGCATATAGA CGAAGTTGTAATGAGTGAGTTTAAATTTATCTATGGCACGCAGCTA CGTCTGGTCGGACTATACCAAGTTACCAACTCTCTCTACTTCATGT GATTGCCAATAAAAGGTGACGTCTCTCTCTCTCTCACCAACCCCAA ACCACTTTCCCCACTCGCTCTCAAAACGCTTGCCACCCAAATCTAT GGCTTACGGGGACATGTATTAACATATATCACTGAGTGAAAAGAA GGGTTTATTACCGTTGGACCAGTGATCAAACGTGTTTTATAAAAAT TTGGAATTGAAAACATGATTTGACATTTTTAATGATGGCAGCAGAC GAAACCAACAACACTAAGTTTAACGTTCGTGGAGTATACTTTTCTA TTTTCGAAGAAGACATATAACTAAGCTGATTGTTATTCTTCATAGAT TTCTTTTCACTGCGAATAAAAGTTTGTGAACATGTCACCGTTTGAA CACTCAACAATCATAAGCGTTTTACCTTTGTGGGGTGGAGAAGAT GACAATGAGAAAGTCGTCGTACATATAATTTAAGAAAATACTATTC TGACTCTGGAACGTGTAAATAATTATCTAAACAGATTGCGAATGTT CTCTACTTTTTTTTTGTTTACATTAAAAATGCAAATTTTATAACATTT TACATCGCGTAAATATTCCTGTTTTATCTATAATTAATGAAAGCTAC TGAAAAAAAACATCCAGGTCAGGTACATGTATTTCACCTCAACTTA GTAAATAACCAGTAAAATCCAAAGTAATTACCTTTTCTCTGGAAATT TTCCTCAGTAGTTTATACCAGTCAAATTAAAACCTCAAATCTGAATG TTGAAAATTTGATATCCAAGAAATTTTCTCATTGGAATAAAAGTTCA ATCTGAAAATAGATATTTCTCTACCTCTGTTTTTTTTTTTCTCCACC AACTTTCCCCTACTTATCACTATCAATAATCGACATTATCCATCTTT TTTATTGTCTTGAACTTTGCAATTTAATTGCATACTAGTTTCTTGTTT TACATAAAAGAAGTTTGGTGGTAGCAAATATATATGTCTGAAATTG ATTATTTAAAAACAAAAAAAGATAAATCGGTTCACCAACCCCCTCC CTAATATAAATCAAAGTCTCCACCACATATATCTAGAAGAATTCTAC AAGTGAATTCGATTTACACTTTTTTTTGTCCTTTTTTATTAATAAATC ACTGACCCGAAAATAAAAATAGAAGCAAAACTTC SEQ ID NO:20 - sequência de polinucleotídeos do promotor AtHCT TTCTCTAGGTTTTGAAGCTTTCCTAGTTCTTTTGGAAGCGTGCCGG ACAAGTCATTGTCGTATAGAAACAGATTGATAAGTTCAGAGCAGTT TCCAAGCTCTTTAGGGATCTCACCTGAGAGCATTGTAGAATAGAC AGATAAAGACTGGAGCTTGCTTAGTTGACCCAACGAAACAGGTAA AGAACCGGATATTTTCGTTGCTGCTAACCCTAAGACCTTGAGATTC CTACAGTTTCCGATCTCCTCCGGGATCTTCCCTGAAAGCTCTGAG TTTCCTCCGGCTCTTATGCTCTCAAGAGTCGAGATCTTTCCGAGCT CCAACGGGAGATTCTCGGATAAGTAGTTATCGAAAATCTCAAGATT CTTGAGGCTAACGCAGTCGCCGAGTTCCGGTGGGATCTTTCCTGT GAGGCCATTGGAGTTTAAACAAAGTTCTTGAAGATTCTTGAGCTTC CCTAGACTCGAAGGTATTTCACCAACAAGACTATTTGAGCTTAAAT CGATAACTATAAGCTCCGAACAATCTCCGATCTCAGAAGATATAGC TCCGGTGAGATTAGTGTTGGAGATAACGAGTTTCTGAAGTGAAGT AAACGAAGAAATGTTAGGAGGGAAAGGTAAAGCTAACTGAACAGA GACGACATTGATCTCTGTAACGAGTTTGTTGTCTGAGGAGGAACA AGTAATGTAAGGCCATTGACATGGGTCAGAATCAGAAGGATTCCA GCCGGAGAAGACTGACGGTGGCGGCGAGTTCGAGCTGTGAAGC CAAGAAATCAAAGCTGAGACTTCATTGGTTGATGCAGAGGTCGAG GAGATGAAGAAAGCTAAAAACAGAGACAATGTAATGGAAAAATGA GAAACAGTTAAGGCTTTTTTTCTTGGAATCGGCATTTGCAAAGACA TAAGAGTTTTTTTCTTTGCATTTGGCTCTCAAATCCAAAACAAGCCT TCTTGGTTCTGCATCGATCTGAGTCCTTTGGCTTAGGGTTTAGGG AAGTTTTTGCTTTAGAGATAAGCAATAAGAAAGAATGATATATTAAA TATATAAAAGTACTAAACTTCATGTGCTCTGTCTTTTTCTTTTACCT CGGGGTTCTGTTTCTAGCTTCAGATTAATTAATTACAGTCATTAACT TTTCTTTGAAATATGTTTGCCAAGAGCCCGAGACACTATCCATAGA TGACAAAAGTCAATAGTTATATATACATAAAATATCACAAAACAAAA GGCATTGGTTATATATATACAGAATCATTTCACTTAGTAGTGTTTTT TCTTATAAGATTATGATAGAAATATGGAAGCATGCATGTGGTTTTG CATTGTTTTCCTCAATTAAGTCAGGATTGTGAGTTGGTTTGTTTTC GAGACCTGAACCGAGCGTTTAAGATTCTTCCTCGTTTGAAGTAAAC TCCATAATTGTCCACACCTAAGCTAAAAGAAAGTAATAACAAGTTT AAATATTCATGACAAGGAAAATATTGCATTCAGAAAATTGTTAACAA CGAAGTAAACATTTTTTTCAATCCGATGCCAATAGTCTCTAGCGGC ATCAAAAGTCCACAAACTCGATACCTCTGGGTAAATGAGCGAATG GGCCGGTCCGTTGTAGCCCAGAAGAGAAATTGTCCTCTAAATTCC ATACTTCCATGAATTTTCTCTGTATATCCTCGTTTGATGTATGGTAT ATTTGTTCCGCTCTAAATCATGACCAACCCAAGGTACTAAATTGTC ATTTAAGCTTTGATTGGTATTTGGTAGCATGGGTTACCATTGACCA ACCCACGGTACTAGTTGCTTTTCTTTTAGTTTTGCTTTTGCTTTATT TTCTTAGAGAGTGGGAGGACAAAAGGTTTGGATCATTAAGCCAAT GAATGCTTCAAAGAAATTGAATTTTTATTAGATCCTCAAACCAAGTT GGATCATCAAATAATGGCTAAGAAATAATTTTAGAACAGAAAGCAA AGAAAAGCTATCCGCAACAACAACCATTAGTTAATAAATTAAAATG AAATGTGAAATTTATGACTAATTGAGGTATGTTTTCATATAATATAG TATAGTTCGGATATAAATTCAACATAATTTATTTGTGGTGTACTGAA AAAAAGACTTTCTTGGATTCTGACGTAATTCTCTTAACACGTGAGT TTACGCCGTTAGATGTTATTGGTGGTTGTTGTTATGCTCTGCTACG TGGTAATGAGTTAAGTTAAGCCAAACTTTGGCATTCGATTGACTAA CTTGTACGGTAGCTATAACAATCAACTTGTCAATTTTTTTTCCTTCT TCTTCATTCGAACTTTATACTATTTAAGCCCATTAGTATTATTTGGG CCTTAGGACAGAGGGAACGGGTTTACCAACCCCGGATAGAAAAGT AGGACCGAGTGATGAGATGGACCAATGATAAACCTTCTGAGAGAG TTGGTCGACAGATGGAGTAGGCGGGGTCGTGGGGCGGTAGGTG AAGGATTACGACCTTTCCTTTTTTGTTCACACCCACTTATATCTACC CCTCCTCGCTTCTCACACAATTTCTCAGATCAAACTCAAAACAAAA TTTGTTTGTTCGTTTGATCTTTCTTAAAAAT SEQ ID NO:21 - sequência de polinucleotídeos do promotor AtCCR1 TTGCTTTCTCTGTCCATGATATGAGGCATTGACTTCTCACCTGTAT TCATATGGTATAGATTCCTCTTTTCAGGAGTCCAATACAAACGAGC TTGGTGAAGAACTCGTTGGTAAGAGAGTTAATGTCTGGTGGCCAC TCGACAAGAAGTAAGTTTATTGTTAAACTTACTAACTTCATTTTTGA TACTATATGATGAATGATAGCAATCTTACGATTTGTATTTGCACAG GTTTTATGAAGGTGTCATAAAATCTTATTGTAGAGTTAAGAAGATG CATCAAGTGAGTTAACTTCTCTATTTGGTATTTTAAAATTCTCTATT TATTGCATAACTGGTTTATATAGAATTTTCCCACTGATGGTCTCGC AGGTAACATATTCTGATGGCGATGTTGAAGAGCTTAATCTGAAAAA AGAACGTTTTAAGATAATCGAGGATAAATCTTCAGCCAGTGAGGT GAAAATTTCTTACATTCTATCATTCACCATTCTTTATATTTACCAAAA TTTCAATGTATCTGGTTTCCCTAATAAAATCTAAGCAGGATAAGGA AGATGATCTGCTTGAGTCTACTCCTTTATCTGCCTTGTAAGTGAAA CTTCCATAGTTCTATGATAACCCACAATTTATAATTTTAATTTAGCT TTAGTCTTGAGTTTTTTGCTGTTATGTGCAGTATACAAAGGGAGAA ATCCAAGAAGAGGAAAATTGTGTCTAAGAATGTGGAACCGAGTAG TTCTCCAGAAGTCAGGTATGAAAGTATATAAGAATTCTAGTTTTAG TTGTTTGAAAGTTTGATCCGTGAGTGAATTAGTTCACAATTATGGA TGTAGATCCTCTATGCAAACAATGAAGAAGAAAGACTCTGTAACAG ACTCCATTAAGCAAACAAAAAGAACCAAAGGTGCACTGAAGGCTG TAAGCAATGAACCAGAAAGCACTACAGGGAAAAATCTTAAATCCTT GAAAAAGCTGAATGGTGAACCTGATAAAACAAGAGGCAGAACTGG CAAAAAGCAGAAGGTGACTCAAGCTATGCACCGGAAAATCGAAAA AGATTGTGATGAGCAGGAAGACCTCGAAACCAAAGATGAAGAAGA CAGTCTGAAATTGGGGAAAGAATCAGATGCAGAGCCTGATCGTAT GGAAGATCACCAAGAATTGCCTGAAAATCACAATGTAGAAACCAA AACTGATGGAGAAGAGCAGGAGGCAGCGAAAGAGCCAACGGCAG AGTCTAAAACTAATGGAGAGGAGCCAAATGCAGAACCCGAAACTG ATGGAAAAGAGCATAAATCATTGAAGGAGCCAAATGCAGAGCCCA AATCTGATGGAGAAGAGCAGGAGGCAGCAAAAGAGCCAAATGCT GAGCTCAAAACTGATGGAGAAAATCAGGAGGCAGCAAAAGAGCTA ACTGCAGAACGCAAAACTGATGAGGAAGAGCACAAGGTAGCTGAT GAGGTAGAGCAAAAGTCACAGAAAGAGACAAATGTAGAACCGGAA GCTGAGGGAGAAGAGCAAAAGTCAGTGGAAGAGCCAAATGCAGA ACCCAAGACCAAGGTAGAAGAGAAAGAGTCAGCAAAAGAGCAAAC TGCAGACACAAAATTGATTGAGAAGGAGGATATGTCTAAGACAAA GGGAGAAGAGATTGATAAAGAAACATATTCAAGCATCCCTGAGAC TGGTAAAGTAGGAAACGAAGCTGAAGAAGATGATCAGAGAGTGAT TAAGGAACTGGAAGAAGAGTCTGACAAGGCAGAAGTCAGTACTAC GGTGCTTGAGGTTGATCCATGAATGAAGGATTGTTAGGTAAATGTT AATCCAGGAAAAAAAGATTGGTTCTTGTGGTTTAGGTAACTTATGT ATTAAGTGAAGCTGCTTGTTTAGAGACTAATGGTGTGTTTTATGAG TAGATTCTTCTGACCTATGTCTCGTTATGGAACTAGTTTGATCTTAT GTCACCTTGCTAGCAGCAGATATTGATATTTATATATTTAAGAGAC ATGCGCATGAGAATGAGGGTATGGAAAAGTCCATATCAGATGACA CAAACAATGATCGTATGTGTAGTCACTTGTGCATTTCCAGTTTTGG ACATAAAATTCTGATATTGCATAGAAATGTTTTTAAATAACACTAAT CCAAACCTAAATAAAATATCTCTATACATCATCTAGAAATGTATGGC TTGATCAAGAATTGTAGATAATAATACCCTGAGTTAAATGATTGTA GGTATTATTTCAGTTTTCAAAATTGTCCAAATTTATGAGCTATATTA AAGATAATATTTTCAATAAGGTGTGTAGTTCTAAATGTTTCTTCTTC TTCCACCAACCCCTCTTTCTATATGTATGTTCTTTTTTCTAAAATAA TTGTTTGTTCTTTTTTAGATATATCAAATTAAATATAAAAAATATTGA CAAAACTTATTTACCATTGTTAGGTGAACTTGGCAAGTGTGTAAAT ATAAAGATAACATTCCTTTTCGTTCTTTATATATACGAAACGTACCA CAAATTTCTAACTAAAGCATTCATAGTCTCTCGAAAGCCTCTTTTCA GAACCGAAGCTCTTTACTTTCGTCCACCGGGAAAT SEQ ID NO:22 - sequência de polinucleotídeos do promotor AtCAD4 CAGAAAGGTCTTCACACTCTGTTTTAGCTAGAGAGTTTTATCCATC TGAGTTTTTAGTCTATTTTGTTTTATCTAGGAGTTGCTTTGTTTGTT CGAATTCGGTCATTGCTTTTGCTGCTTTACTGGAGTCAAATTTGAA GGTAAAATATATGTTAAATATCTGGGTAGGTGGTTGTGGATGATGG AAAATCTGAACGTATCACTGTTAATGACAATGGAGAACTCGTTTCT ACTCAGCATGCTATCACCGAATACCGAGTGATTGAATCTTCACCAC ATGGTTAGTGAGACTGACTTCCATTTCTATTCAGTTAAACTTAAAG CAAATGATTTTGCCTTGAGTTTTTAGCACATTGTTGAATTGCAGGA TACACATGGCTTGAGCTTCGCCCTTTAACCGGGAGAAAACATCAG GTCTCTATAGATATTCAGTTTTTGTTTCAACTTTCTCTCTTTTTTATG TTCTCTTAATACTAATCTGTTTTCAACTGTTCTTCGATTGCCACAGC TTCGTGTACACTGCGCTGAAGTGCTAGGAACACCGATAGTCGGG GACTACAAATACGGTTGGCAAGCTCATAAAGCCCGGGAACCTTTT GTCTCTTCTGAAAACAACCCAACCAAGCAATCATCATCTCCTTTTG GATTGGATCTGGATGGTGGAGATGTCTCTTCGAAACAGCCACACC TTCATCTCCATTCAAAGCAAATCGATCTGCCAAACATATCACAGCT CTTGGAGAAAATGCAGGTCTCTTCAGACTCTGATATTTCGGATCTC GATAGCCTTAAATTCGATGCTCCATTGCCTAGTCATATGCAACTAA GCTTTAATTTGTTGAAATCTAGAGTCGAAACTTGTGACAAAAATTA GATTTTTTTTCTTACCGAGCTTTCTTCTTTGTGTTCATTGAGGCCCA AGTATTTGTGTATTTGGACCTGAATATTCTCATACAAAGATAAATAA TTATAATTAAATGATTTTTCGCATATAATCATTATTGTGGTATGATTA ACACAGTTGGTGTGATGACTGATTGACACAATAATCACCGTTTGGA TTCGATTCCTTTAATACTTGTCACTAGAGTTGTTTGACTAAACAGCT AACTTGTCACTAGAGTTATTGTGTTTGTATTTTGATCTGTTATTAAT CTGATTGGGTATAATTACAGATAGAGAGACATCTATATTGTAATTA AGACAATCTTAAAGTGTAAACTAAAAAGATCTCTCTGACCTCTGGA AAACGAAAGGTGGGTGACACATCACTCTAGCTATGAATATGATGA ATATTCAGTACCTAACCGAACAAAGACTGGTTTGGTATTTTTATTG GAAAAAAGAGATAAATAATTGTGAATGTGAATTATCCTGTCTGAAA GGTAAGCTGATGACATGGCGTTATATGATTGGACGAGCTTCAGAA CAAAAGAGTAGCGTCGAATCGAATCTTTACCTACTACACTTTGAAC TTTGAAGTACATTACCTACTTCCTCCTTGATCGAACGTCTTTTCTCA AAACTATTTTATTTCCCCAATTAAAGTAGTGGTGATAAATTCACAAA AATACAAACACTTTTATTTTTGACGTCAAAAACAAATACTTCTTTGA ACAGGCTATTACAATATTTTTAAGAAAAAAGTAAGCAAAATAGTCC ACAAACCAAAATCTGTAACATATTAAACGATTTATGTTTTTTTTTTTT TTTCTTAACTAGAGAACAATTCGGGCTTTTACTAAGGATGATGAGT GTAGTTACCGAATAGTGTATTCATATAATCTTTTAATGAGCTTAAGA TATGATATTATTTCGACTAATCAGATAAGAGTAGTTAGATAATTTCG TAATAGAGCAACTCTTTCGCAAATAAAACCATTGTAAACATTACCA ATTAGTTTTTCTTTTTTTTTGGTCACAACCAATTAGTTTGTTTGTTCT ATTTTATGAAGTGCGTATTAAAGCTAACGTGTTTACAGTAACGCCA CACAAATAAAAATAAAAATAATTATGTACTTTATGGATTTATAGAAA AAACAAGAATAGTCACCAAAAATTGATTGTGTCATATATCTTTTGTC AACTATTTTATCTTATTTTTCTATGGATATGTATGTCCAAAATGTTA GACAAAAAACCAAAAAATCATGTCCAAAATTTCGTTAGGCTGCCGA TATCTCTGTTTCCCTTTCAACGACTATCTATTTAATTACCGTCGTCC ACATTGTTTTTAATATCTTTATTCGAGGTTGGTTTAGTTTTTTTTACC AAACTCACTTTGCTACGTTTTTGCCTTTTTGGTATGGTTGTATTTGT ACCACCGGGAAAAAAAAGATAAGAGGTTTGGTTGGTCGAGCTTAC TGATTAAAAAATATACACGTCCACCAAATATTAAAACAATATATCCC ATTTTTCCTCCTCTCTTTTGGTATTACATTAATATTTTATTATTTCCC CATTTGCTCTGTATATATAAACATATGTCAATAGAGTGCCTCTACA GTCATGTTTCCATAGACATAATCTCTCACCATTGTTTTTCTCTGCAA AACTAAAGAAACAAAAAAAGAAAAATCGGAGAAACCAAGAAAAAA GAA SEQ ID NO:23 - sequência de polinucleotídeos do promotor AtCAD5 CCTCGATAACTCTGATTGTTGTATTGTCCAAGTATTCACTAAACAA CTTTGCTAAAAGAGAAGATGCTGCTGGAGCAATTTCAGAAGGTTTT AGCACAACCGCATTACCAGCTGCAATAGCTCCAATGACTGGCTCG ACAGACAATACTAAGGAAAAAAACAAAGCACCATGAAGACATATAA ACTTTAATAGTTTAGAAATTGAGACAAAATTGTCAATAAATAAAATT GAGCTTACAGAAAGGGAAATTCCAGGCTGAAATAACCAAAACAAC TCCAAGCGGTTCTGAGACTATTTGTGCAGACGAGGGAAATGTTGT CACAGAAGTTTTGACCTGAAAGGTCCAAGCATAGAAAAAGCAAGT GGTTTTAGAAAGGACACATATCAATGAAGCAGCAAAGCTTGAACG GTCTAGTTACCGTTTCTGGAGCCATCCAGTTCTTTAACTCTTTGAT TGCAAGCATACAGGATGATTTTGTATTCGAAATCTAAAAAACGAGA AAAATACCAAAGAGATTCAACAGTGGATAAGTGGAATGCAGTGAA GAAACGGGACATTGAAATTATATAAAAAACCTCAGCTAGAAAAGCT TCAAGCTCAGGCTTAGAAAGATCTTGATACAAAGCTTCGGTGATG CATTTCTCCTTCTCATCAATCATCCTAGCAATGTTTTGAAGCTGAG AAATTCTCCACTCGTAGCTCTTCGTTCTGCCAGAGTTGAAGTTGCT TCTGAGCTCATCTACAAGCAAAGCTGCTTCTTTTCCACTAAAGTCT GATGCTTGCTCCTTTACCACAGCAGATAGTGTTGCATAACAAGTAC TGATTCAAGACACCAAAACCGCAATGTGAGAGACTTTAAGACTAAA AATCATGGATAAGACTAAAAAAACATGGATAAGTATCAACTGTTCT CACGATTATTTATTCATACCACTGTACTTAAACTTAAAACCCACTAT ACTAAATAGAAAGGTAATCATCAAAAAATCAGTATGTAAAAACCAC TTTTGTGAATAAAATATGTAAAATGGGTGAATAAAGAAATGTGCTTA CAATTTCAACCGATAAGGGATACAAGCATTGCTGCAATATCCACCA CCACCACGACGAGATATCCGAAAAGGTGAAGTTGCAACATTTAAT CTGCAACAAAAGAGGCCATTCATTAAAATGGTACTAATTAGATCTA ATCATATCATATTGAATGACCAAATCATTCACAGAAGCATCCATTG CTCCAATTAACATTCTAGACCAAATTCAACTTAAAGGTAACTCTTTT ATACAGGAAACCGAGAAACCGAAAACGCAATTCACATAAAAAGGA AGGCTTGTTTGGAGAAGCAGAATCGAACAAGTCAATCTCAAACCC TGATGAGCAGGTTTTTCAAGTTACCTGGCAGGAGAAAAACCCTTG GCAAAACAAAGGGTTTGAATATGATTAATCTCTAGAAGCTTCGTCA TGACTTGGGTTCAGTTAAAAATCTCAAATTGGAGACATTATTGGTG TTTATATATTTGAGAGAGAGAGCCAGAGAGGAGACGTTGAATTGA ATGAAGGGTGTGGTCGGAAGAGAAGACGTGTAGAAGAGACGAGA CAAGTAAATTTAAGCATTGGCCCCATTTACAGCCACAAGTCCGCTA CAACAAATTATTTCCAAGAAACTCTGAGATAACGTCGTGATGAAAC GGCTCATGCTGCTGTTGTGATTCGTGAATTAGAGGTTTATCTTTTG GGTTTTTGAATGTTACTTAATTGGACGGTCGATTTTTCAAACTGGG TGTGAAATGTGAATGGGTCATTCATAATGGGCTTTTGTTTTAATGT GAAGCCATTCACACACTCTTTGTCCTTCTTTTCTATTATTCATAACT GTCACTCTTTGTTCTTCGAAATAGTAAAGAGCAAATCGATTCTTTG TTGATCTGGGCCGTAAAATTTCCATGGTTGTGGGAAGTATTCTCG CAGCTGATCTGGGCCGTCAATGCTACAGTTTCATGTCAGAGAGAG GTCAAGAATCAACACGTGGCCAACCATGATTTTAAACCAAAGCAAA CACACGATTAGACCCCACATTGTTTGTTCACCAACCCCCGTGGAC CCTCCTTTAGCCGACGTGTCCACGTCAATAGTGGTTTTTCTTCCTT TCAAAGTACACAAATTCCATTCTTTCTCATTTTACTTTTTGGATTAC GTTGTTGTTATAAACTGGTAAAATGAATTATGAATGCAAATAAATTT CATTTAAGTTTTGTTGGCTTCTAATATTTTTTTCACCTAAAATTCTAA TAAACTACACAGCCATGAGCCATCGTATGAAAAGAAGAAGAAAAA AAATGTCTTTTTCTAGAAGGATCTTTCAACGACTAAAAAAGATTTTA AGCTTTTGACTAATTTTGTCAATAATATACACAAATTTACACTCAAT TATAGCCATCAAATGTGTGCTATGCAGAAACACCAATTATTTCATC ACACATACGCATACGTTACGTTTCCAACTTTCTCTATATATATATAT AGTAATACACACACATAAACAGCAAAAGCGTGAAAGCAGCAGATC AAGATAAGAAAGAAGAAAGAATCATCAAAAA SEQ ID NO:24 - sequência de polinucleotídeos do promotor AtF5H TGTGTGTCTTTTTGCGAGTAGTTGTTGGCTTCAGACAGTTCATAGC GGAGTTACTCTATACGCGAAGTACTTGTCTCATACTGATAATTTTG ATGGCAATTAAGGCTTTAAAAGCTTATGTATTTTCTTATAACCATTT TATTCTGTATATAGGGGGACAGAAACATAATAAGTAACAAATAGTG GTTTTATTTTTTTAAATATACAAAAACTGTTTAACCATTTTATTTCTT GGTTAGCAAAATTTTGATATATTCTTAAGAAACTAATATTTTAGGTT GATATATTGCAGTCACTAAATAGTTTTAAAAGACACGAAGTTGGTA AGAACAGGCATATATTATTCGATTTAATTAGGAATGCTTATGTTAAT CTGATTCGACTAATTAGAAACGACGATACTATGAGCTCATAGATGG TCCCACGACCCACTCTCCCATTTGATCAATATTCAACTGAGCAATG AAACTAATTAAAAACGTGGTTAGATTAAAAAAATAAATTGTGCAGG TAGCGGATATATAATACTAGTAGGGGTTAAAAATAAAATAAAACAC CACAGTATTAAATTTTTGTTTCAAAAGTATTATCAATAGTTTTTTTGC TTCAAAAATATCACAAATTTTTGTATGAAATATTTCTTTAACGAAAAT AAATTAAATAAAATTTAAAATTTATATTTGGAGTTCTATTTTTAATTT AGAGTTTTTATTGTTACCACATTTTTTGAATTATTCTAATATTAATTT GTGATATTATTACAAAAAGTAAAAATATGATATTTTAGAATACTATT ATCGATATTTGATATTATTGACCTTAGCTTTGTTTGGGTGGAGACA TGTGATTATCTTATTACCTTTTTATTCCATGAAACTACAGAGTTCGC CAGGTACCATACATGCACACACCCTCGTGAAACGAGCGTGACTTA ATATGATCTAGAACTTAAATAGTACTACTAATTGTGTCATTTGAACT TTCTCCTATGTCGGTTTCACTTCATGTATCGCAGAACAGGTGGAAT ACAGTGTCCTTGAGTTTCACCCAAATCGGTCCAATTTTGTGATATA TATTGCGATACAGACATACAGCCTACAGAGTTTTGTCTTAGCCCAC TGGTTGGCAAACGAAATTGTCTTTATTTTTTTATGTTTTGTTGTCAA TGTGTCTTTGTTTTTAACTAGATTGAGGTTTAATTTTAATACATTTGT TAGTTTACAGATTATGCAGTGTAATCTGATAATGTAAGTTGAACTG CGTTGGTCAAAGTCTTGTGTAACGCACTGTATCTAAATTGTGAGTA ACGACAAAATAATTAAAATTAAAGGGACCTTCAAGTATTATTAGTAT CTCTGTCTAAGATGCACAGGTATTCAGTAATAGTAATAAATAATTA CTTGTATAATTAATATCTAATTAGTAAACCTTGTGTCTAAACCTAAA TGAGCATAAATCCAAAAGCAAAAATCTAAACCTAACTGAAAAAGTC ATTACGAAAAAAAGAAAAAAAAAAGAGAAAAAACTACCTGAAAAGT CATGCACAACGTTCATCTTGGCTAAATTTATTTAGTTTATTAAATAC AAAAATGGCGAGTTTCTGGAGTTTGTTGAAAATATATTTGTTTAGC CACTTTAGAATTTCTTGTTTTAATTTGTTATTAAGATATATCGAGATA ATGCGTTTATATCACCAATATTTTTGCCAAACTAGTCCTATACAGTC ATTTTTCAACAGCTATGTTCACTAATTTAAAACCCACTGAAAGTCAA TCATGATTCGTCATATTTATATGCTCGAATTCAGTAAAATCCGTTTG GTATACTATTTATTTCGTATAAGTATGTAATTCCACTAGATTTCCTT AAACTAAATTATATATTTACATAATTGTTTTCTTTAAAAGTCTACAAC AGTTATTAAGTTATAGGAAATTATTTCTTTTATTTTTTTTTTTTTTTAG GAAATTATTTCTTTTGCAACACATTTGTCGTTTGCAAACTTTTAAAA GAAAATAAATGATTGTTATAATTGATTACATTTCAGTTTATGACAGA TTTTTTTTATCTAACCTTTAATGTTTGTTTCCTGTTTTTAGGAAAATC ATACCAAAATATATTTGTGATCACAGTAAATCACGGAATAGTTATG ACCAAGATTTTCAAAGTAATACTTAGAATCCTATTAAATAAACGAAA TTTTAGGAAGAAATAATCAAGATTTTAGGAAACGATTTGAGCAAGG ATTTAGAAGATTTGAATCTTTAATTAAATATTTTCATTCCTAAATAAT TAATGCTAGTGGCATAATATTGTAAATAAGTTCAAGTACATGATTAA TTTGTTAAAATGGTTGAAAAATATATATATGTAGATTTTTTCAAAAG GTATACTAATTATTTTCATATTTTCAAGAAAATATAAGAAATGGTGT GTACATATATGGATGAAGAAATTTAAGTAGATAATACAAAAATGTC AAAAAAAGGGACCACACAATTTGATTATAAAACCTACCTCTCTAAT CACATCCCAAAATGGAGAACTTTGCCTCCTGACAACATTTCAGAAA ATAATCGAATCCAAAAAAAACACTCAAT SEQ ID NO:25 - sequência de polinucleotídeos do promotor AtPAL1 CAAATAGTACGATGTATTTAGTGATTTTATTTATGTACTTTGTTCAT TAAATTAGTCATAATTGTTCTGATTTTTAGGGGTTTTGATCGAACCC TTAGATCAAAAGTTACCTTAATTGTTTTTTTAGCTAAGTACTTTATTA AAAATTTAATGTTTAGTTCTGATTGAGTAGTACTATAAAGGAGACAT GTGTCAATCTTGTCAATTGGTTTTGAGTTCAACAATATGCAATATTG CACATGCATTAACGACCAAAAGAAGATGCAATGCACTTAAATCATT GAAACTGATTTTGTTTTTGTAGTGTATAAAATATCTATTTAATTACC AACGAAAGAAGTGAGCTTTTAAAAACAAAGAGTCAGAAGATATATA TAACTACAAAACCTACAGAAGATAAGCTGGATTTCAAAAGAAGAGA AAGAGTAAACCAATAAATTGACCAAAGCAAAATCGGATATTTGACA TAAGTTTCCATTCACATTGACCCAAATCCACCAGCATTTCAAATAA AGTTACTTAATATAATTTTTGTGTTTATAATATATTCCGCCCACTCTT GCCTTCATTTGGACCTTATCCTAAAAGTCAAAACAGGTGAAAAAAA TGAGAATACAATTAACACGAAAAATGCAAAAGACTGTTAAACCGAA ATCGAATTCTAGTGTAATCAATCCTTTTCCCAATGATACAACTATAA ATCAAAAAGAAAAAATGTACTGATAAACGAAACTAAACGTATAAATT AATATATTTCTTGACATAAATAGGAGGCTTTTGCCTGCTAGTCTGC TACGATGGAAGGAAAAATGCATGCACACATGACACATGCAAAATG TTTCAATGAAGACGCATTGCCCAATTAACCAACACACCACTTCTTC CATTCCACCCATATTATTTATTTCTACCATTTTCTTTAATTTATTGTT TTTTCTTTGATTCATACACTGTTTATGACTATTACATTTTCCCTTTCG ACTAATATTAACGCGTTTAAACCAAAGAATGGATTTGATAATGAAAT TTTATTTTATTAGCATATAGATAATGGATGGCTTCATGCTTGGTTTC CATGACAAGGAATGACACAAGATAATTATTTTGAATAAAATCATAAA TATGATAATACTAGTTGTAAAAAAACTTGAGTGTTTCGTGTGTTATT TTTCGGTTTCTTGACTTTTTATATTTCTCGTTTTTGTAATTTTAGGAT GGATTATTTAGCTTGCTTTTCTCTTTTATTACTTTCTAAAATTTTATT TATAAACTCATTTTTAATATATTGACAATCAATAAATGAGTTATCTTT TAATTAATAAAAAATTTGTAAACTCTTGTAAACAGATCATAGTCACT AAAAGCTATTATAAGTTATTTGTAGCTATATTTTTTTATTTCATGAAC TTAGGATAAGATACGAAAATGGAGGTTATATTTACATAAATGTCAC CACATTGCCTTTGTCATGCAAACGGCGTGTTGCGTCACTCGCCTC CTATTGGGAATCTTATAATCGCGTGAATATTATTAGAGTTTGCGAT ATTTCCACGTAATAGTTATCTTTCACAAATTTTATACTCAATTACAA AATCAACGAAAATGTACATTTGTATCTTTAACTATTTACGTTTTTTTT ACGTATCAACTTTCAGTTATATGTTTTGGATAATATATTTTTTTACTT TTGACTTTTCAGTTTTCACCTAATGATTGGGATATACATATGCATGC ATAGTTCCCATTATTTAAATGTAAGCTAAGTGCATATGAACTGTTAG TCAAAATTACGAAGTTTATTTGTACATATATATAGTTATAACAAAAT GGTACAGTAAATTAAACAGAACATCAAGAAAGTACAAAAGACTGAA CACAATAATTTACATGAAAACAAAACACTTAAAAAATCATCCGATAA AATCGAAATGATATCCCAAATGACAAAAATAACAATATAGAAAATA CAAAAACAAAAACAAAATATGAAAGAGTGTTATGGTGGGGACGTTA ATTGACTCAATTACGTTCATACATTATACACACCTACTCCCATCACA ATGAAACGCTTTACTCCAAAAAAAAAAAAAAAACCACTCTTCAAAA AATCTCGTAGTCTCACCAACCGCGAAATGCAACTATCGTCAGCCA CCAGCCACGACCACTTTTACCACCGTGACGTTGACGAAAACCAAA GAAATTCACCACCGTGTTAAAATCAAATTAAAAATAACTCTCTTTTT GCGACTTAAACCAAATCCACGAATTATAATCTCCACCACTAAAATC CATCACTCACTCTCCATCTAACGGTCATCATTAATTCTCAACCAAC TCCTTCTTTCTCACTAATTTTCATTTTTTCTATAATCTTTATATGGAA GAAAAAAAGAAACTAGCTATCTCTATACGCTTACCTACCAACAAAC ACTACCACCTTATTTAAACCACCCTTCATTCATCTAATTTTCCTCAG GAACAAATACAATTCCTTAACCAACAATATTACAAATAAGCTCCTAT CTTCTTTCTTTCTTTTAGAGATCTTGTAATCTCCTCTTAGTTAATCTT CTATTGTAAAACTAAGATCAAAAGTCTAA SEQ ID NO:26 - sequência de polinucleotídeos do promotor AtPAL2 GATTGATGGTTTAATAATCTGCCTCGTGATACATGGTGTTATCTTA AAATGGTCTCTCAATTAGTCTTTGTATTTGTATAAAATAAGGCCTAA AAATATCATCAATGGGGTCCTGTTAAAAACAAAAACAGATACACCT TTCACTAATAAAAAAAAACTGTTACCGACAAGTCAAACAATATCTG CGGACAAAAAAATGAAGAATGTTTAGTAAGAAATAGAAGATGTGGT AAAGAGCCATACACACATGCAAGTGTTTTTCAATGAACCCATCTTA CCAACCCACTACTTCTTTGAGCCATAATTGTTTGGTTCGGAGACCC TTTACATTTCCGTCTCAGCTTTATTTGTTTACGCATTGATTTGTCTT AAATTATGTTAGATATTGTTTTTTGGCTATTTATTAGCAGCAATCAA GTTAAAAGAGTGGTTCGATATCACCATCGAACTCTCCTTTAGATAT TTTCTATATAAAACCAAACAAAAACAAAAAAATTGGTCCGATCATCT AATATACAAGTTAGACGATTTCACGTTATGTTATTACAACCTACAAC AAAATAGACTATGATCGAAATCATATTGAATCTTTTACCTTTCAACG TAATACAAATCTGGCTTTACAAAGCAATAATTCATGTTTGTTTGTCT AATTTAAATTTCCCTGTTTTTTTTCCCCTCTTTCTGTTTCCCATTTGA AAGTAAAAGATCATTTAAGCACCTAACTCAATTTTATTTTATTTTAAA CACCTAATGTCATGCTCCTTGGCTCCTTGTAATTAGTTGATCGTTT CAATTTAGACCAGCAAAACATTTTAGTATGTTCGTAAATATTGCGTA CATGCCATTTCGTTTGTCATGCAAACGGTGTGTGTTTCTTTACTTA GCTTCTAGTTGGTGTATATTGCGTCGCATTAATATCGGTTTACCTT CCTCCTGTCTACGTAATGATATATTCTCCACCACAAATTTAAATTCT TATTGAAATTTCCTAATTTTTTAGGTAGCTCAAGGTCTCAAGTATAC TACGTACCCTATTTTTTTGAATATCTATCTATATTATAACAAGAGTTT TTCTGAGCTAGTTAATGAGATGACAATATTCTACATAAATAAATGAC CCTCGAAAGTTTCAAGTACTTTAGGATCTGACCAAATCGGGGTAAA ACATTTTGAAACTAATTACGTTCACATCTACCATCGATGATTGACAA GCTTATTGTCACCTTTTATGTTAAAGTGACATGGTCTTGACGTTAAT TTGCATGTTATTCTACATCTATAGTCCAAAGATAGCAAACCAAAGA AAAAAATTGTCACAGAGGGTTCAATGTTACTTAGATAGAAATGGTT CTTTACAATAATAAATTTATGTTCCATTCTTCATGGACCGATGGTAT ATATATGACTATATATATGTTACAAGAAAAACAAAAACTTATATTTT CTAAATATGTCTTCATCCATGTCACTAGCTCATTGTGTATACATTTA CTTGCTTCTTTTTGTTCTATTTCATTTCCTCTAACAAATTATTCCTTA TATTTTGTGATGTACTGAATTATTATGAAAAAAAACCTTTACACTTG ATAGAGAAGCATATTTGGAAACGTATATAATTTGTTTAATTGGAGT CACCAAAATTATACAAATCTTGTAATATCATTAACATAATAGCAAAC TAATTAAATATATGTTTTGAGGTCAAATGTTCGGTTTAGTGTTGAAA CTGAAAAAAATTATTGGTTAATAAAATTTCAAATAAAAGGACAGGTC TTTCTCACCAAAACAAATTTCAAGTATAGATAAGAAAAATATAATAA GATAAACAATTCATGCTGGTTTGGTTCGACTTCAACTAGTTAGTTG TATAAGAATATATTTTTTTAATACATTTTTTTAGCAACTTTTGTTTTT GATACATATAAACAAATATTCACAATAAAACCAAACTACAAATAGCA ACTAAAATAATTTTTTGAAAACGAAATTAGTGGGGACGACCTTGAA TTGACTGAACTACATTCCTACGTTCCACAACTACTCCCATTTCATT CCCAAACCATAATCAATCACTCGTATAAACATTTTTGTCTCCAAAAA GTCTCACCAACCGCAAAACGCTTATTAGTTATTACCTTCTCAATTC CTCAGCCACCAGCCACGACTACCTTTTCGATGCTTGAGGTTGATA TTTGACGGAACACACAAATTTAACCAAACCAAACCAAAACCAAACG CGTTTTAAATCTAAAAACTAATTGACAAACTCTTTTTGCGACTCAAA CCAAATTCACGTTTTCCATTATCCACCATTAGATCACCAATCTTCAT CCAACGGTCATCATTAAACTCTCACCCACCCCTCATACTTCACTTT TTTTCTCCAAAAAATCAAAACTTGTGTTCTCTCTTCTCTCTTCTCTT GTCCTTACCTAACAACAACACTAACATTGTCCTTCTTATTTAAACGT CTCTTCTCTCTTCTTCCTCCTCAGAAAACCAAAAACCACCAACAAT TCAAACTCTCTCTTTCTCCTTTCACCAAACAATACAAGAGATCTGAT CTCATTCACCTAAACACAACTTCTTGAAAACCA SEQ ID NO:27 - sequência de polinucleotídeos do promotor At4Cl1 ACATAAGATTTGGATTATGAGAGGAGTTGAGAAGTTATATGATGGA AACTGAAAAGTAAATCTTTTTGCAGAGCTGTAGAATCAATCAACAT TTGATGACTTGGACTTCTTCACCATGTGTGTTGGTGTGGACCATTG AATTGACGGTTTTGCCATTCACCAACAACAGCATGAGTTTTTGAGT CTTCATGTTTGGTAAAGGTTAGGCTTATTAGGAGACACGGGTAAG AGACTAGAGAGAGACATTCTCCAAACCTTTCTTTTGCATGTTTTGT AAGAAACATTTCCGAAAATGAAAGAAATCTTACACAACATTCATATA ATTTGTTTGAAATATAACAAAATGATAATTTATACTCTCAAGTAAAA TGCCTAAACTTTTATCAATTGGAAAAGACATCACACACAAGCGTGA AGCGTATCTTATTACCAAACCCAACTAAGCATGGGTCTCGATACTT GCCATAATTACTTTAATCCATTCTCTTTTTGAGAAATGTATAAAACA TGACTTTGCATAAATAGTCTTTTACTAATTACTATGTAAATAATTCC TAAGACTGGTTTCATGGTACATATTATCGTTTTATCCTTGTTTTAAG AATATTCAGATGTTTGGTCTATGGAATATAGTCTATTCTTCATGTTT AAAACTATTATTTGATAAGAAAATATGTACTAATATGTTTTTGCATA CAAATGTTGATCAGTTCGTAGCATTTGAATTAATACATTCTCAATCA CTTTCAAGCATTATTATGTAATAAATGATTCATGTCGAAAAGTAATA GTATCACTGTCCATTACATTTGGCATATATATTTTTTTGTCAAAGCC TTACATTTGGCATATTGACGAAGCAGTTTTGTATTCACTTATATTTT GACATCGCTTTCACAAAAATAAATAGCTATATATGATTATTATCCAT TAATTGTCTCTTTTCTTTTGCTGACACAATTGGTTGTAAATGCAATG CCAATATCCATAGCATTTGTGTGGTGAATCTTTTTCTAAGCCTAATA GTAAATAAATCTCAATACAAGAACCCATTTACGAACAAATCAAACC AAGTTGTGATGGGTTAGTACTTAGTAGCCCGTTTGAAATGTAGAAT TTTTGATGAGATTTTACGTTTTATATAGATTTTTCTCAGAAAACAAA AAATTCTTGCATCTTGCATTTTGGTCATTTGTAAATATTTTTTTAGTC TTAAAAAAGACCCAAATTCTTATTAATTTCAAAATTTTCGGTCTCTA ATACCTCCGGTTTTAAAAAAAAACATATCAGTTGAAGGATGAGTTT GGTGAAGGCTATATTGTCCATTGATTTTGGAGATATATGTATTATG GTCATGATTATTACGATTTTTATATAAAAGAATATTAAAAATGGTGG GGTTGGTGAAGAAATGAAGATTTATCGTCAAATATTTCAATTTTTAC TTGGACTATTGCTTCGGTTATATCGTCAACATGGGCCCACTCTTCC ACCAAAGCCCAATCAATATATCTCTCGCTATCTTCACCAACCCACT CTTCTTCTCTTACCAAACCCATTTCCTTTATTTCCAACCCTACCCCT TTATTTCTCAAGCTTTACACTTTTAGCCCATAACTTTCTTTTTATCCA AATGGATTTGACTGGTCTCCAAAGTTGAATTAAATGGTTGTAGAAA TAAAATAAAATTATACGGGTTCAATTGTTCAATTGTTCATATACCGT TGACGTTCAATTGTTCATATACGGGTTCCGTGGTCGTTGGTAATAT ATATGTCTTTTATGGAACCAAAATAGACCAAATCAACAACAAATGA AGAAATTGTTAGAGTATGATACACTCATATATACCCAAATATAGCAT ATATTTATAATATAACTTTTGGCTATGTCATTTTACATGATTTTTTTG GCTTATCTATTAAAAGTATCATACAAACTGTTTTTACTTCTTTTTTTT CTTAGAATATATATGCCCAAAATGGAAAAGAACATATGCCAAGGTT GATTTTATCGCTTATATGGTAAAAATTGGAAAAACATACAAATCATT ACTTTATTTAATTAAATCATGTGAAGAAACATATTCAATTACGGTAA TACGTTATCAAAACATTTTTTTTTACATTAATTGTTACATTTTTTTTTT TTGCAAATATTCTTAAATAACCATTCTTTTTTTATTTACTATAATTAA CATAAAAATAAATAAAATATAACATTTCAACAAAGAAATTTGCTTAT GAAAAATACAAAATCCAGTTAATTTTTCAGAAAAATACAAATTTGCT TATAAATATATTACCACTAGTTTATGTGATTTTAAAAGAAAGAAATG CAGCTTACCAAACGCAACGTGAAAATTTGAGAAACCCATACTCAAA AAAGATTAAATGACAAAATCACCCTCAGCAAAATCATGAAACAACA ACACTAACATTTTCACCAACCCCACCGTCTACTCCGGTGAATTGTC TATATGAACTCCTCCGATACAACTCCTGTTTCCTTCAGGCCAAAGC CTAAAATTCACACAACCAAAAAAACCAACCTTTTTTTTCCACCTAAA TCTTTGAATATCACAATATTTACTATTTACA SEQ ID NO:28 - sequência de polinucleotídeos do promotor AtCcoA- OMT ACACATTAAAACAAAAACCATTTCCACATAAAAAAAAACGATCCAG TAAATGAAATAGATTCAAGACCGATCGTCGAGCGGTAGAGAAAGT AAACAAAACAAAGACAGAGAATTGAAGAAACTGTGTACCTGCAAAA ATACCAATCAGATGGGTCTCCGCCAAAGTAATCTGCTTAGAAGTTT TGTAAGAAAAAACAATTAAAGGCGTTTCATTTATTGAATTTTCCGGT TGTTTGATTCTCAGGATGAGATTGCCTATTTCCTTCAAAAAAGAAC TCTTTAATTTACACAGAAAAGCTCTGAAAATTTCCACAGAAAATGAA GAAAGAAAAGAGCGTAAAAGGGGAAAGAGATGAAATGGGTTATTA AAAAAAGAAGCAGTGGATGAGGGAAGAGAGGATTAAGAGGCGTA GAGATTACATGTGATGAATGATACTATCTTTTCTTACAAACACATTT TCGTGTAATTAAAATTTAATTTGGTTCCAAAGATTTTAATCAAAAGA AGTTTGGTAAATTGAAACAGGCAGACATAATTTATTGTAAAGAGTT TTTATTTATTTATTCATGACGTTGCTTGATGGTGCTTTACCAATTTT CTTCTCCTACGTTAGATTTTTTTCACTTTTTTTTTTGGTGTTTGTAAT AAATGTGAAAAATGGACCGTTTAAAAACTTAAAGACGTTTGATTAC TATATAAAGTAATTGTTTATAATAGAAAGTTAATTGAGACGTGAAAT GGTATAATATTATTGTGTAACAGTTGTGTACACGTAGCTCTCATGC AGTTTTAGTGGACCCATATGGCTTGACTTGTATTCTGTTTTTGGGC TATTAAAGTCCAAAACAGAGACCCCTCTCAAGCCCTTCCTATTAAT CCATCTAGCTAATAGAAACTATAAACGTGTCCTCTCTCTCAATTAA ATAAGCTAGAAACATACTCAACCATTCGCATTACGCACTTCATAGC GGTAGGTTTAGATTTGTCTAAAATACTTAAAAAAATTTTTGTCTAAG TTGTTGTCCGTTACAAAGTTTTTTTCTTTGTGACAACTTGACAACAT TGACAAATAGAAAAATAAATTTCGATGAAACCTATGAAATGGGCTA TGGCCCAACTAAAAAGAGTGGGAAATTAAAGATGGGATGGTTCAA GTGTATACTTCGAACTTCCGACATTAGGGTCAAAGGATTTTTAAAA GGCAACCATTTGTTCCACTTTCTCGAACAAAAACGAGCCATTTATT AATATATAGTACGGCTGAATTGGTTTTGTTCGTCATTGTGTAAACA CAAAGTCATTCGAATTATGTTAGGGTCCGTTGATAATATAGACGGC CCATCCCACGCACATATTAAGTGTTCAACTCCATAGAATATCATAT GGGACACTGTTTTTAATTTATAATCACCATTTAAAATGTTTAAATGT TTATGCAAATTGGATGGCTTCTTCACACAACATTTATTTATTGGCCT TTCATTCCATCAAAGTAAAATAGCTTTTCAAATACATTATACTCTAT ACTCCTATACATGTAAATAACCATATGCATATATATTTTTTTCAAATA TAGGTCAACGCCATTTAATATAATTTTAAAAAAATTTGTTCGGAAAA TATCACATTTCTTTCACTAGACAAGCCTTGTTACCACACAATGTATC AATATGATCTAAAGGGCAAACGAAAGATCCTGACATGAAACGTTTA ATTCTCATTTTCTCCAAATTTTATTTTTTATGTGAAGTAGATAAATTA GTATATATATATATATACCAAACTAGTGTGTTATGTTATGGCAAATG TTATATCAATTCGAAGGTTCCGCTATTGCAATATTCATTAATTTTTT CATACCAATACTATTTTTCTTTCTCTTTTATTTTGTTTTTTAATAAATA AAAGAAATTAAGGATGATTAGTAAGGAAGTCGCCTACCAAGAGATT CACCTACCACGGTACACTTCAACACCGAAGCAGAGTTGTTGAATC CACTTTTTATTCCCTTCTCTAATCTCTACTCACCAAGTCTCCACTTT TTTTTCTCTTTATTATATACATTTAAATTATTTAATATACGCCAACTA CATACATATCCAGTGTAATTTCTCGTTACGTCACACCCCTTTCGTA ATCGTCTAATTTCAGAAAAATATCCAGAGGTTTAAATACATATTCCC ATCATTAAATCTAGACATAAACACATCATACTCACAAAATTTGGCA GCAAACAGTTACTACAGACCCATAAATGAAAAAACGTATTCACTTG TTTTCAATTTTCACATAACCACTTCCCTGAGTTTGGTCTCAATTTGA TTGCCCCGCCGAGGCATTACTACGCCAAGTGCGATTAAGGTCCCA TACAGTGTAACGGGACCCACTATAAGACAGCGACCGACCAATTGC GTGTTAGGAGAGTTTCACCAACCCCGGACCGGTTTTTACCGGATA TAACAGAACCGGTACGAACCGGTCTCATTATCTTCCATCTTCTTTA TATAGACCTCATGCCATGTGTGTGACTCACCAAGAAAAACACAATC GTTTAATCTCACCCAAGAAGACAAAAACACAGAGAGAGAAAGAGA GAGAA SEQ ID NO:29 - sequência de aminoácidos de TcPAM (fenilalanina aminomutase de Taxus chinensis; AAT47186) MGFAVESRSHVKDILGLINTFNEVKKITVDGTTPITVAHVAALARRHDV KVALEAEQCRARVETCSSWVQRKAEDGADIYGVTTGFGACSSRRTN QLSELQESLIRCLLAGVFTKGCASSVDELPATATRSAMLLRLNSFTYG CSGIRWEVMEALEKLLNSNVSPKVPLRGSVSASGDLIPLAYIAGLLIGK PSVVARIGDDVEVPAPEALSRVGLRPFKLQAKEGLALVNGTSFATAL ASTVMYDANVLLLLVETLCGMFCEVIFGREEFAHPLIHKVKPHPGQIE SAELLEWLLRSSPFQDLSREYYSIDKLKKPKQDRYALRSSPQWLAPL VQTIRDATTTVETEVNSANDNPIIDHANDRALHGANFQGSAVGFYMD YVRIAVAGLGKLLFAQFTELMIEYYSNGLPGNLSLGPDLSVDYGLKGL DIAMAAYSSELQYLANPVTTHVHSAEQHNQDINSLALISARKTEEALDI LKLMIASHLTAMCQAVDLRQLEEALVKVVENVVSTLADECGLPNDTK ARLLYVAKAVPVYTYLESPCDPTLPLLLGLEQSCFGSILALHKKDGIET DTLVDRLAEFEKRLSDRLENEMTAVRVLYEKKGHKTADNNDALVRIQ GSRFLPFYRFVREELDTGVMSARREQTPQEDVQKVFDAIADGRITVP LLHCLQGFLGQPNGCANGVESFQSVWNKSA SEQ ID NO:30 - sequência de aminoácidos de PDC (fenilacrílico des- carboxilase de Pediococcus pentosaceus; CAC16794) MEKTFKTLDDFLGTHFIYTYDNGWEYEWYAKNDHTVDYRIHGGMVA GRWVKDQEAHIAMLTEGIYKVAWTEPTGTDVALDFVPNEKKLNGTIF FPKWVEEHPEITVTFQNEHIDLMEESREKYETYPKLVVPEFATITYMG DAGQDNDEVIAEAPYEGMTDDIRAGKYFDENYKRINK SEQ ID NO:31 - sequência de aminoácidos de CHS (chalcona sintase de Physcomitrella patens; ABB84527) MASAGDVTRAALPRAQPRAEGPACVLGIGTAVPPAEFLQSEYPDFFF NITNCGEKEALKAKFKRICDKSGIRKRHMFLTEEVLKANPGICTYMEP SLNVRHDIVVVQVPKLAAEAAQKAIKEWGGRKSDITHIVFATTSGVNM PGADHALAKLLGLKPTVKRVMMYQTGCFGGASVLRVAKDLAENNKG ARVLAVASEVTAVTYRAPSENHLDGLVGSALFGDGAGVYVVGSDPK PEVEKPLFEVHWAGETILPESDGAIDGHLTEAGLIFHLMKDVPGLISK NIEKFLNEARKPVGSPAWNEMFWAVHPGGPAILDQVEAKLKLTKDK MQGSRDILSEFGNMSSASVLFVLDQIRHRSVKMGASTLGEGSEFGFF IGFGPGLTLEVLVLRAAPNSA SEQ ID NO:32 - sequência de aminoácidos de CHS (chalcona sintase de Arabidopsis thaliana; AAA32771) MVMAGASSLDEIRQAQRADGPAGILAIGTANPENHVLQAEYPDYYFRI TNSEHMTDLKEKFKRMCDKSTIRKRHMHLTEEFLKENPHMCAYMAP SLDTRQDIVVVEVPKLGKEAAVKAIKEWGQPKSKITHVVFCTTSGVD MPGADYQLTKLLGLRPSVKRLMMYQQGCFAGGTVLRIAKDLAENNR GARVLVVCSEITAVTFRGPSDTHLDSLVGQALFSDGAAALIVGSDPDT SVGEKPIFEMVSAAQTILPDSDGAIDGHLREVGLTFHLLKDVPGLISKN IVKSLDEAFKPLGISDWNSLFWIAHPGGPAILDQVEIKLGLKEEKMRAT RHVLSEYGNMSSACVLFILDEMRRKSAKDGVATTGEGLEWGVLFGF GPGLTVETVVLHSVPL SEQ ID NO:33 - sequência de aminoácidos de SPS (estilbeno sintase de Vitis vinifera; ABE68894) MASVEEFRNAQRAKGPATILAIGTATPDHCVYQSDYADFYFRVTKSE HMTALKKKFNRICDKSMIKKRYIHLTEEMLEEHPNIGAYMAPSLNIRQE IITAEVPKLGKEAALKALKEWGQPKSKITHLVFCTTSGVEMPGADYKL ANLLGLEPSVRRVMLYHQGCYAGGTVLRTAKDLAENNAGARVLVVC SEITVVTFRGPSEDALDSLVGQALFGDGSAAVIVGSDPDISIERPLFQL VSAAQTFIPNSAGAIAGNLREVGLTFHLWPNVPTLISENIEKCLTQAFD PLGISDWNSLFWIAHPGGPAILDAVEAKLNLDKKKLEATRHVLSEYGN MSSACVLFILDEMRKKSLKGERATTGEGLDWGVLFGFGPGLTIETVV LHSIPMVTN SEQ ID NO:34 - sequência de aminoácidos de CUS (curcuminoide sin- tase de Oryza sativa versão curta; 3OIT_A) MRRSQRADGLAAVLAIGTANPPNCVTQEEIPDFYFRVTNSDHLTALK DKFKRICQEMGVQRRYLHHTEEMLSAHPEFVDRDAPSLDARLDIAAD AVPELAAEAAKKAIAEWGRPAADITHLVVTTNSGAHVPGVDFRLVPLL GLRPSVRRTMLHLNGCFAGCAALRLAKDLAENSRGARVLVVAAELTL MYFTGPDEGCFRTLLVQGLFGDGAAAVIVGADADDVERPLFEIVSAA QTIIPESDHALNMRFTERRLDGVLGRQVPGLIGDNVERCLLDMFGPLL GGDGGGGWNDLFWAVHPGSSTIMDQVDAALGLEPGKLAASRRVLS DYGNMSGATVIFALDELRRQRKEAAAAGEWPELGVMMAFGPGMTV DAMLLHATSHVN SEQ ID NO:35 - sequência de aminoácidos de CUS (curcuminoide sin- tase de Oryza sativa versão longa; 3ALE_A) MAPTTTMGSALYPLGEMRRSQRADGLAAVLAIGTANPPNCVTQEEIP DFYFRVTNSDHLTALKDKFKRICQEMGVQRRYLHHTEEMLSAHPEFV DRDAPSLDARLDIAADAVPELAAEAAKKAIAEWGRPAADITHLVVTTN SGAHVPGVDFRLVPLLGLRPSVRRTMLHLNGCFAGCAALRLAKDLAE NSRGARVLVVAAELTLMYFTGPDEGCFRTLLVQGLFGDGAAAVIVGA DADDVERPLFEIVSAAQTIIPESDHALNMRFTERRLDGVLGRQVPGLI GDNVERCLLDMFGPLLGGDGGGGWNDLFWAVHPGSSTIMDQVDAA LGLEPGKLAASRRVLSDYGNMSGATVIFALDELRRQRKEAAAAGEW PELGVMMAFGPGMTVDAMLLHATSHVN SEQ ID NO:36 - sequência de aminoácidos de BAS (benzalacetona sintase de Rheum palmatum; AAK82824) MATEEMKKLATVMAIGTANPPNCYYQADFPDFYFRVTNSDHLINLKQ KFKRLCENSRIEKRYLHVTEEILKENPNIAAYEATSLNVRHKMQVKGV AELGKEAALKAIKEWGQPKSKITHLIVCCLAGVDMPGADYQLTKLLDL DPSVKRFMFYHLGCYAGGTVLRLAKDIAENNKGARVLIVCSEMTTTC FRGPSETHLDSMIGQAILGDGAAAVIVGADPDLTVERPIFELVSTAQTI VPESHGAIEGHLLESGLSFHLYKTVPTLISNNIKTCLSDAFTPLNISDW NSLFWIAHPGGPAILDQVTAKVGLEKEKLKVTRQVLKDYGNMSSATV FFIMDEMRKKSLENGQATTGEGLEWGVLFGFGPGITVETVVLRSVPV IS SEQ ID NO:37 - sequência de aminoácidos de AtPAP1 (fator de transcrição de R2R3 Myb de Arabidopsis thaliana, AtMyb75; AAG42001) MEGSSKGLRKGAWTTEEDSLLRQCINKYGEGKWHQVPVRAGLNRC RKSCRLRWLNYLKPSIKRGKLSSDEVDLLLRLHRLLGNRWSLIAGRLP GRTANDVKNYWNTHLSKKHEPCCKIKMKKRDITPIPTTPALKNNVYKP RPRSFTVNNDCNHLNAPPKVDVNPPCLGLNINNVCDNSIIYNKDKKK DQLVNNLIDGDNMWLEKFLEESQEVDILVPEATTTEKGDTLAFDVDQ LWSLFDGETVKFD SEQ ID NO:38 - sequência de aminoácidos de AtPAP2 (fator de transcrição de R2R3 Myb de Arabidopsis thaliana, AtMyb90; AAG42002) MEGSSKGLRKGAWTAEEDSLLRLCIDKYGEGKWHQVPLRAGLNRC RKSCRLRWLNYLKPSIKRGRLSNDEVDLLLRLHKLLGNRWSLIAGRL PGRTANDVKNYWNTHLSKKHESSCCKSKMKKKNIISPPTTPVQKIGV FKPRPRSFSVNNGCSHLNGLPEVDLIPSCLGLKKNNVCENSITCNKD DEKDDFVNNLMNGDNMWLENLLGENQEADAIVPEATTAEHGATLAF DVEQLWSLFDGETVELD SEQ ID NO:39 - sequência de aminoácidos de AtTT2 (Arabidopsis tha- liana fator de transcrição de R2R3 Myb, AtMyb123; AED93980) MGKRATTSVRREELNRGAWTDHEDKILRDYITTHGEGKWSTLPNQA GLKRCGKSCRLRWKNYLRPGIKRGNISSDEEELIIRLHNLLGNRWSLI AGRLPGRTDNEIKNHWNSNLRKRLPKTQTKQPKRIKHSTNNENNVC VIRTKAIRCSKTLLFSDLSLQKKSSTSPLPLKEQEMDQGGSSLMGDLE FDFDRIHSEFHFPDLMDFDGLDCGNVTSLVSSNEILGELVPAQGNLDL NRPFTSCHHRGDDEDWLRDFTC SEQ ID NO:40 - sequência de aminoácidos de NtAn2 (fator de transcrição de R2R3 Myb de Nicotiana tabacum; ACO52470) MNICTNKSSSGVKKGAWTEEEDVLLKKCIEKYGEGKWHQVPLRAGL NRCRKSCRLRWLNYLRPHIKRGDFSFDEVDLILRLHKLLGNRWSLIAG RLPGRTANDVKNYWNSHLRKKLIAPHDQKESKQKAKKITIFRPRPRTF SKTNTCVKSNTNTVDKDIEGSSEIIRFNDNLKPTTEELTDDGIQWWAD LLANNYNNNGIEEADNSSPTLLHEEMPLLS SEQ ID NO:41 - sequência de aminoácidos de MtLAP1 (fator de transcrição de R2R3 Myb de Medicago truncatula; ACN79541) MENTGGVRKGAWTYKEDELLKACINTYGEGKWNLVPQRSGLNRCR KSCRLRWLNYLSPNINRGRFSEDEEDLILRLHKLLGNRWSLIAGRLPG RTANDVKNYWHTNLAKKVVSEKEEEKENDKPKETMKAHEVIKPRPIT LSSHSNWLKGKNSIPRDLDYSENMASNQIGRECASTSKPDLGNAPIP CEMWCDSLWNLGEHVDSEKIGSCSSLQEENLMEFPNVDDDSFWDF NLCDLNSLWDLP SEQ ID NO:42 - sequência de aminoácidos de ZmMYB-C (fator de transcrição de R2R3 Myb de Zea mays; AAK09326) MGRRACCAKEGVKRGAWTSKEDDALAAYVKAHGEGKWREVPQKA GLRRCGKSCRLRWLNYLRPNIRRGNISYDEEDLIIRLHRLLGNRWSLI AGRLPGRTDNEIKNYWNSTLGRRAGAGAGAGGSWVVVAPDTGSHA TPAATSGACETGQNSAAHRADPDSAGTTTTSAAAVWAPKAVRCTGG LFFFHRDTTPAHAGETATPMAGGGGGGGGEAGSSDDCSSAASVSL RVGSHDEPCFSGDGDGDWMDDVRALASFLESDEDWLRCQTAGQL A SEQ ID NO:43 - sequência de aminoácidos de ZmMYC-Lc (fator de transcrição de BHLH de Zea mays; ABD72707) MALSASRVQQAEELLQRPAERQLMRSQLAAAARSINWSYALFWSIS DTQPGVLTWTDGFYNGEVKTRKISNSVELTSDQLVMQRSDQLRELY EALLSGEGDRRAAPARPAGSLSPEDLGDTEWYYVVSMTYAFRPGQ GLPGRSFASDEHVWLCNAHLAGSKAFPRALLAKSASIQSILCIPVMG GVLELGTTDTVPEAPDLVSRATAAFWEPQCPSSSPSGRANETGEAA ADDGTFAFEELDHNNGMDDIEAMTAAGGHGQEEELRLREAEALSDD ASLEHITKEIEEFYSLCDEMDLQALPLPLEDGWTVDASNFEVPCSSPQ PAPPPVDRATANVAADASRAPVYGSRATSFMAWTRSSQQSSCSDD AAPAAVVPAIEEPQRLLKKVVAGGGAWESCGGATGAAQEMSGTGTK NHVMSERKRREKLNEMFLVLKSLLPSIHRVNKASILAETIAYLKELQRR VQELESSREPASRPSETTTRLITRPSRGNNESVRKEVCAGSKRKSPE LGRDDVERPPVLTMDAGTSNVTVTVSDKDVLLEVQCRWEELLMTRV FDAIKSLHLDVLSVQASAPDGFMGLKIRAQFAGSGAVVPWMISEALR KAIGKR SEQ ID NO:44 - sequência de aminoácidos de AtTT8 (fator de trans- crição de BHLH de Arabidopsis thaliana; AEE82802) MDESSIIPAEKVAGAEKKELQGLLKTAVQSVDWTYSVFWQFCPQQR VLVWGNGYYNGAIKTRKTTQPAEVTAEEAALERSQQLRELYETLLAG ESTSEARACTALSPEDLTETEWFYLMCVSFSFPPPSGMPGKAYARR KHVWLSGANEVDSKTFSRAILAKSAKIQTVVCIPMLDGVVELGTTKKV REDVEFVELTKSFFYDHCKTNPKPALSEHSTYEVHEEAEDEEEVEEE MTMSEEMRLGSPDDEDVSNQNLHSDLHIESTHTLDTHMDMMNLME EGGNYSQTVTTLLMSHPTSLLSDSVSTSSYIQSSFATWRVENGKEHQ QVKTAPSSQWVLKQMIFRVPFLHDNTKDKRLPREDLSHVVAERRRR EKLNEKFITLRSMVPFVTKMDKVSILGDTIAYVNHLRKRVHELENTHH EQQHKRTRTCKRKTSEEVEVSIIENDVLLEMRCEYRDGLLLDILQVLH ELGIETTAVHTSVNDHDFEAEIRAKVRGKKASIAEVKRAIHQVIIHDTNL SEQ ID NO:45 - sequência de aminoácidos de VvMyc1 (fator de transcrição de BHLH de Vitis vinifera; ACC68685) MAAPPNSRLQSMLQSAVQSVRWTYSLFWQICPQQGILVWGDGYYN GAIKTRKTVQPMEVSAEEASLQRSQQLRELYESLSAGETNQPARRP CAALSPEDLTESEWFYLMCVSFSFPPGVGLPGKAYAKRHHIWLAGA NEVDSKVFSRAILAKSARVQTVVCIPLMDGVVEFGTTEKVQEDLGFV QHVKSFFTDHHLHNHPPKPALSEHSTSNPATSSDHSRFHSPPIQAAY AAADPPASNNQEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEAESDSEAETGR NNRRVRTQNTGTEGVAGSHTAAEPSELIQLEMSEGIRLGSPDDGSN NLDSDFHMLAVSQPGSSVDHQRRADSYRAESARRWPMLQDPLCSS GLQQPPPQPPTGPPPLDELSQEDTHYSQTVSTILQHQPNRWSESSS SGCIAPYSSQSAFAKWTTRCDHHHHPMAVEGTSQWLLKYILFSVPFL HTKYRDENSPKSRDGDSAGRFRKGTPQDELSANHVLAERRRREKLN ERFIILRSLVPFVTKMDKASILGDTIEYVKQLRKKIQDLEARTRQMEVE QRSRGSDSVRSKEHRIGSGSVDRNRAVVAGSDKRKLRIVEGSTGAK PKVVDSPPAAVEGGTTTVEVSIIESDALLEMQCPYREGLLLDVMQML RELRLETTTVQSSLTNGVFVAELRAKVKENASGKKASIMEVKRAINQII PQC

[000184] Entende-se que os exemplos e as modalidades descritas neste pedido somente são para propósitos ilustrativos e que várias modificações ou alterações à luz destas serão sugeridas a especialistas na técnica e devem estar incluídos dentro do espírito e do alcance deste pedido de patente e do escopo das reivindicações acrescentadas. Todas as publicações, patentes e pedidos de patentes citados neste pedido são por meio deste incorporados por referência em sua totalidade para todos os propósitos.

Claims

1. Método de engenharia de uma planta tendo conteúdo reduzido de lignina, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) introdução na planta de um cassete de expressão com-preendendo um polinucleotídeo que codifica uma proteína que desvia um precursor de monolignol de uma via de biossíntese de lignina na planta, em que o polinucleotídeo compreende uma sequência de nu- cleotídeos de SEQ ID NO:1 que codifica o polipeptídeo chiquimato quinase (AroK) compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:2, ou uma sequência de nucleotídeos degenerada da mesma que codifica a SEQ ID NO:2; e em que o polinucleotídeo é operacionalmente ligado a um promotor heterólogo; e (b) cultura da planta sob condições nas quais a proteína que desvia o precursor de monolignol da via de biossíntese de lignina é expressa.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo compreende uma sequência degenerada de SEQ ID NO: 1 que codifica SEQ ID NO: 2.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo compreende a sequência de nucleo- tídeos de SEQ ID NO:1.

4. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o promotor é um promotor específico de parede celular secundária ou um promotor específico de célula de fibra.

5. Método, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o promotor é um promotor de uma cinnamato 4- hidroxilase (C4H), coumarato 3-hidroxilase (C3H), hidroxicinamoil- coenzima A, chinquimato/quinato hidroxicinamoililtransferase (HCT), cinnamoil-CoA redutase (CCR1), álcool cinamílico desidrogenase 4 (CAD4), álcool cinamílico desidrogenase 5 (CAD5), ferulado 5- hidroxilase (F5H), fenilalanina amônia-liase 1 (PAL1), fenilalanina amônia-liase 2 (PAL2), 4-cumarato CoA ligase 1 (4CL1) ou cafe- oil/CoA-3-O-metiltransferase (CCoAMT).

6. Método, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o promotor compreende uma sequência de ácido nu- cleico de qualquer uma de SEQ ID NOs: 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27 ou 28.

7. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que a proteína é direcionada a um plastídeo na planta.

8. Método, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo compreende um sinal de direcionamento de plastídeo que compreende a sequência de polinucleotídeos da SEQ ID NO: 15.

9. Método de obtenção de uma quantidade aumentada de açúcares solúveis de uma planta em uma reação de sacarificação, o método caracterizado pelo fato de que compreende: submissão da planta engenheirada pelo método como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 8 a uma reação de sacarificação, por meio disso aumentando a quantidade de açúcares solúveis que podem ser obtidos da planta quando comparada com uma planta selvagem.