BR112021016340A2

BR112021016340A2 - Métodos para produzir células t autólogas úteis para tratar câncer e composições das mesmas

Info

Publication number: BR112021016340A2
Application number: BR112021016340-9A
Authority: BR
Inventors: Timothy J. Langer; Jacob CECCARELLI
Original assignee: Myst Therapeutics, Llc
Priority date: 2019-02-19
Filing date: 2020-02-18
Publication date: 2021-10-26
Also published as: US20220135944A1; EP3927370A1; WO2020172202A1; IL285631A; CN113710270A; KR20210152464A; AU2020226498A1; MX2021009967A; EP3927370B1; CA3130578A1

Abstract

métodos para produzir células t autólogas úteis para tratar câncer e composições das mesmas. a presente invenção refere-se a métodos para a fabricação de células t. em certas modalidades, são fornecidos métodos para a fabricação de células t que expressam um novo grupo de receptores de superfície celular que reconhecem peptídeos na superfície de uma célula alvo. também são fornecidas aqui populações de células t produzidas por métodos aqui descritos e suas composições farmacêuticas.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para “MÉTO-

DOS PARA PRODUZIR CÉLULAS T AUTÓLOGAS ÚTEIS PARA TRATAR CÂNCER E COMPOSIÇÕES DAS MESMAS”. Referência Cruzada a Pedidos Relacionados

[001] Este pedido reivindica prioridade do pedido provisório Nor- te-americano nº 62/807.644, depositado em 19 de fevereiro de 2019, intitulado “METHODS FOR PRODUCING AUTOLOGOUS T CELLS USEFUL TO TREAT CANCERS AND COMPOSITIONS THEREOF,” Pedido provisório Norte-americano nº 62/826.974, depositado em 29 de março de 2019, intitulado “EX VIVO METHODS FOR PRODUCING

A T CELL THERAPEUTIC AND RELATED COMPOSITIONS AND METHODS,” Pedido provisório Norte-americano nº 62/941, 614, depo- sitado em 27 de novembro de 2019, intitulado “METHODS FOR PRO-

DUCING AUTOLOGOUS T CELLS USEFUL TO TREAT CANCERS AND COMPOSITIONS THEREOF,” e pedido provisório Norte- americano nº 62/941.610, depositado em 27 de novembro de 2019, intitulado “EX VIVO METHODS FOR PRODUCING A T CELL THERA- PEUTIC AND RELATED COMPOSITIONS AND METHODS,” os con- teúdos de cada um dos quais são incorporados por referência em sua totalidade. Campo

[002] A presente invenção refere-se a métodos para a fabricação de células T. Em certas modalidades, são fornecidos métodos para a fabricação de células T que expressam um novo grupo de receptores de superfície celular que reconhecem peptídeos na superfície de uma célula alvo. A presente invenção também fornece populações de célu- las T produzidas por métodos aqui descritos e composições farmacêu- ticas das mesmas. Antecedentes

[003] O processo de produção de terapias de linfócitos infiltrantes de tumor autólogo (TIL) para uso no câncer é demorado, envolve um baixo número de células reativas e não é adequado para aplicações comerciais. Portanto, seria desejável desenvolver melhorias no pro- cesso de fabricação de células T para superar essas limitações. São fornecidas aqui modalidades que atendem a essas necessidades. Sumário

[004] De acordo com certas modalidades aqui descritas, são for- necidos métodos para a fabricação de células T que expressam um novo grupo de receptores de superfície celular que reconhecem peptí- deos na superfície de uma célula alvo. São fornecidos aqui, em certas modalidades, métodos para a fabricação de células T que expressam um novo grupo de receptores de superfície celular que reconhecem peptídeos na superfície de uma célula alvo. Tais métodos incluem, mas não estão limitados às etapas de (1) enriquecer uma população de linfócitos obtida de um indivíduo doador; (2) estimular a população com um ou mais agentes estimuladores de células T de linfócitos para produzir uma população de células T ativadas em que a estimulação é realizada em um sistema fechado usando meio sem soro; (3) cocultura de uma população de células T na presença de células apresentado- ras de antígeno que apresentam um ou mais peptídeos não nativos associados a MHC; (4) separar as células apresentadoras de antígeno da população de células T em um sistema fechado; (5) selecionar uma nova população de células T contendo TCR endógeno que são reati- vos a peptídeos presentes nas APCs com base em marcadores de su- per-regulação em células T cultivadas na presença de células nuclea- das apresentando peptídeos em um sistema fechado usando meio sem soro; e (6) expandir a nova população de células selecionadas na presença de citocinas em um sistema fechado usando meio sem soro. Também são fornecidas aqui populações de células T produzidas por métodos aqui descritos e suas composições farmacêuticas.

[005] É aqui fornecido um método para a fabricação de células T para uso em uma composição de células terapêuticas, em que as célu- las T expressam um receptor de células T (TCR) que reconhece um antígeno na superfície de uma célula alvo, o referido método compre- endendo: (a) enriquecer uma população de linfócitos obtida de um in- divíduo doador para produzir uma primeira população de linfócitos T; (b) estimular a primeira população com um ou mais agentes estimula- dores de células T de linfócitos para produzir uma segunda população de células T ativadas em que a estimulação é realizada em um siste- ma fechado usando meio sem soro; (c) cocultura da segunda popula- ção de células T na presença de células apresentadoras de antígeno que apresentam um ou mais peptídeos não nativos em um complexo de histocompatibilidade principal (MHC) em um sistema fechado usan- do meio sem soro, sendo que um ou mais peptídeos não nativos são peptídeos correspondentes a mutações somáticas não sinônimas as- sociadas ao tumor de um indivíduo, para produzir uma terceira popula- ção contendo células T compreendendo receptores de células T endó- genos reativos a mutações que codificam peptídeos do tumor (células T reativas ao tumor); (d) separar células apresentadoras de antígeno da população de células T na terceira população de células em um sis- tema fechado; (e) após a separação, selecionar a população de célu- las T contendo TCR endógeno que são reativos a peptídeos presentes nas APCs com base em marcadores de super-regulação em células T cultivadas em um sistema fechado para produzir uma quarta popula- ção contendo as células T selecionadas; e (f) expandir a quarta popu- lação de células selecionadas na presença de um ou mais agentes estimuladores de células T de linfócitos em um sistema fechado usan- do meio sem soro para produzir uma composição de células T expan- didas para uso em uma composição de células terapêuticas.

[006] É fornecido aqui um método para a fabricação de células T para uso em uma composição de células terapêuticas, em que as célu- las T expressam um receptor de células T (TCR) que reconhece um antígeno na superfície de uma célula alvo, o referido método compre- endendo: (a) processar uma população de células de linfócitos T obti- da de um indivíduo doador que tem um tumor para produzir uma pri- meira população de células de linfócitos T; (b) estimular a primeira po- pulação com um ou mais primeiros agentes estimuladores de células T de linfócitos sob condições para expansão de células T na população para produzir uma segunda população de células T ativadas em que a estimulação é realizada em um sistema fechado usando soro livre mé- dio; (c) cocultura da segunda população de células T na presença de células apresentadoras de antígeno que apresentam um ou mais pep- tídeos não nativos em um complexo de histocompatibilidade principal (MHC) em um sistema fechado usando meio sem soro, sendo que um ou mais peptídeos não nativos são peptídeos correspondentes a mu- tações somáticas não sinônimas associadas ao tumor do indivíduo, para produzir uma terceira população contendo células T compreen- dendo receptores de células T endógenos reativos a mutações que codificam peptídeos do tumor (células T reativas ao tumor); (d) seleci- onar, a partir da terceira população de células, a população de células T contendo TCR endógeno que são reativos aos peptídeos presentes nas APCs com base em um ou mais marcadores de super-regulação expressos em células T reativas ou ativadas em um sistema fechado para produzir um quarta população contendo as células T seleciona- das; e (e) expandir a quarta população de células selecionadas na presença de um ou mais segundos agentes estimuladores de células T de linfócitos sob condições para expandir células T na população em um sistema fechado usando meio sem soro para produzir uma compo- sição de células T expandidas para uso como uma composição celular terapêutica.

[007] É aqui fornecido um método para a fabricação de células T para uso em uma composição de células terapêuticas, em que as célu- las T expressam um receptor de células T (TCR) que reconheceu um antígeno na superfície de uma célula alvo, o referido método compre- endendo (a) o enriquecimento de uma população de linfócitos obtidos de um indivíduo doador para produzir uma primeira população de lin- fócitos T; (b) estimular a primeira população com um ou mais agentes estimuladores de células T de linfócitos para produzir uma segunda população de células T ativadas em que a estimulação é realizada em um sistema fechado usando meio sem soro; (c) cocultura da segunda população de células T na presença de células apresentadoras de an- tígeno que apresentam um ou mais peptídeos não nativos em um complexo de histocompatibilidade principal (MHC) em um sistema fe- chado usando meio sem soro, sendo que um ou mais peptídeos não nativos são peptídeos correspondentes a mutações somáticas não si- nônimas associadas no tumor de um indivíduo, para produzir uma ter- ceira população de células contendo células T compreendendo recep- tores de células T endógenos reativos à mutação que codificam peptí- deos do tumor (células T reativas ao tumor); (d) selecionar, a partir da terceira população de células, a população de células T contendo TCR endógeno que são reativos a peptídeos presentes nas APCs com base em marcadores de super-regulação em células T cultivadas em um sistema fechado para produzir uma quarta população contendo as cé- lulas T selecionadas; e (e) expandir a quarta população de células se- lecionadas na presença de um ou mais agentes estimuladores de célu- las T de linfócitos em um sistema fechado usando meio sem soro para produzir uma composição de células T expandidas para uso em uma composição de células terapêuticas.

[008] É aqui fornecido um método para a fabricação de células T para uso em uma composição de células terapêuticas, em que as célu-

las T expressam um receptor de células T (TCR) que reconheceu um antígeno na superfície de uma célula alvo, o referido método compre- endendo (a) o processamento de uma população de linfócitos obtidos de um indivíduo doador que tem um tumor para produzir uma primeira população de células de linfócitos T; (b) estimular a primeira população com um ou mais primeiros agentes estimuladores de células T de lin- fócitos sob condições para expansão de células T na população para produzir uma segunda população de células T em que a estimulação é realizada em um sistema fechado usando meio sem soro; (c) cocultura da segunda população de células T na presença de células apresen- tadoras de antígeno que apresentam um ou mais peptídeos não nati- vos em um complexo de histocompatibilidade principal (MHC) em um sistema fechado usando meio sem soro, sendo que um ou mais peptí- deos não nativos são peptídeos correspondentes a mutações somáti- cas não sinônimas associadas no tumor de um indivíduo, para produzir uma terceira população contendo células T compreendendo recepto- res de células T endógenos reativos a mutações que codificam peptí- deos do tumor; (d) separar células apresentadoras de antígeno da po- pulação de células T na terceira população de células em um sistema fechado; (e) após a separação, selecionar a população de células T contendo TCR endógeno que são reativos aos peptídeos presentes nas APCs com base em um ou mais marcadores de super-regulação expressos em células T reativas ou ativadas em um sistema fechado para produzir uma quarta população contendo o células T seleciona- das; e (f) expandir a quarta população de células selecionadas na pre- sença de um ou mais segundos agentes estimuladores de células T de linfócitos sob condições para expandir células T na população em um sistema fechado usando meio sem soro para produzir uma composi- ção de células T expandidas para uso como uma composição celular terapêutica.

[009] Em alguns dos métodos fornecidos, o método compreende ainda a expansão de células T in vitro. Em algumas das modalidades, as células apresentadoras de antígeno são células nucleadas, como células dendríticas, fagócitos mononucleares, linfócitos B, células en- doteliais ou timicepitélio. Em algumas das modalidades, as células apresentadoras de antígeno são células dendríticas. Em algumas das modalidades, as células T são autólogas do indivíduo. Em algumas das modalidades, as células T são autólogas a um indivíduo com tu- mor. Em algumas de tais modalidades, as células T são autólogas pa- ra o paciente. Em algumas das modalidades, as células T são obtidas de um doador saudável. Em algumas das modalidades, a molécula de MHC é uma molécula de classe I. Em algumas das modalidades, a molécula de MHC é uma molécula de classe II. Em algumas das mo- dalidades, a molécula de MHC é de classe I e II. Em algumas das mo- dalidades, as células T são células CD4+. Em algumas das modalida- des, as células T são células CD8+. Em algumas das modalidades, as células T são células CD4+ e células CD8+.

[0010] Em algumas das modalidades, os agentes estimuladores de células T são selecionados a partir de um ou mais de um anticorpo anti-CD3; um anticorpo anti-CD28; ou uma citocina recombinante sele- cionada entre IL-2, IL-7, IL-15 e IL-21.

[0011] Em algumas das modalidades, os primeiros agentes esti- muladores de células T são selecionados a partir de um ou mais de um anticorpo anti-CD3; um anticorpo anti-CD28; ou uma citocina re- combinante selecionada entre IL-2, IL-7, IL-15 e IL-21. Em algumas das modalidades, os primeiros agentes estimuladores de células T são ou compreendem IL-2 recombinante. Em algumas das modalidades, a concentração de IL-2 recombinante é de 100 IU/mL a 6000 IU/mL. Em algumas das modalidades, a concentração de IL-2 recombinante é de 300 IU/mL a 1000 IU/mL. Em algumas modalidades, a concentração de IL-2 recombinante é de ou cerca de 300 IU/mL.

[0012] Em algumas das modalidades, o agente estimulador de cé- lulas T compreende ainda um anticorpo anti-CD3, como OKT3. Em algumas modalidades, a concentração do anticorpo anti-CD3 é de ou cerca de 50 ng/mL. Em algumas das modalidades fornecidas, os se- gundos agentes estimuladores de células T são selecionados a partir de um ou mais de um anticorpo anti-CD3; um anticorpo anti-CD28; ou uma citocina recombinante selecionada entre IL-2, IL-7, IL-15 e IL-21. Em algumas das modalidades, os segundos agentes estimuladores de células T são ou compreendem IL-2 recombinante. Em algumas das modalidades fornecidas, a concentração de IL-2 recombinante é de 100 IU/mL a 6000 IU/mL. Em algumas das modalidades, a concentra- ção de IL-2 recombinante é de 300 IU/mL a 1000 IU/mL. Em algumas modalidades, a concentração de IL-2 recombinante é de ou cerca de 300 IU/mL. Em algumas das modalidades, o agente estimulador de células T compreende ainda um anticorpo anti-CD3, como OKT3. Em algumas modalidades, a concentração do anticorpo anti-CD3 é de ou cerca de 50 ng/mL.

[0013] Em algumas das modalidades, os um ou mais peptídeos não nativos compreendem um peptídeo individual ou um pool de pep- tídeos. Em algumas das modalidades, os peptídeos não nativos são peptídeos correspondentes às mutações somáticas não sinônimas as- sociadas ao tumor do paciente. Em algumas das modalidades forneci- das, um ou mais peptídeos não nativos são carregados em células apresentadoras de antígeno por transfecção de construtos de minige- ne sintetizados transcritos in vitro que codificam para aminoácidos so- máticos mutados não sinonômicos. Em algumas modalidades, os ami- noácidos mutados são flanqueados em cada lado por 12 aminoácidos de proteínas endógenas, em tandem, em que os construtos de mini- gene transcritos geram peptídeos individuais. Em algumas das moda-

lidades, os peptídeos não nativos são expressos em células nucleadas por eletroporação de pools de peptídeos associados a mutações so- máticas não sinônimas nas células apresentadoras de antígeno. Em algumas modalidades, os aminoácidos mutados são flanqueados em cada lado por 12 aminoácidos de proteínas endógenas, em tandem, em que os construtos de minigene transcritos geram peptídeos indivi- duais. Em algumas das modalidades, os peptídeos não nativos são expressos em células apresentadoras de antígeno por meio da síntese de construtos de minigene que codificam para aminoácidos mutados somáticos não sinônimos, flanqueados em cada lado por 12 aminoáci- dos de proteínas endógenas em tandem, então transcritos usando in vitro Transcrição de RNA para gerar peptídeos individuais e, em se- guida, transfectados nas células apresentadoras de antígeno.

[0014] Em algumas das modalidades, os peptídeos não nativos são expressos em células nucleadas por pulsação de peptídeo, tal como por eletroporação, de pools de peptídeos que consistem em 12 peptídeos longos associados a mutações somáticas não sinônimas nas células apresentadoras de antígeno. Em algumas das modalida- des, um ou mais peptídeos não nativos são carregados em células apresentadoras de antígeno por pulso de peptídeo. Em algumas mo- dalidades, o pulso de peptídeo é realizado por eletroporação. Em al- gumas das modalidades, os peptídeos não nativos são expressos em células nucleadas por pulsação de peptídeo, tal como por eletropora- ção, de pools de peptídeos associados a mutações somáticas não si- nônimas nas células apresentadoras de antígeno. Em alguns casos, cada peptídeo do pool de peptídeos tem 9 a 15 aminoácidos no com- primento, como cerca de 9 aminoácidos, 10 aminoácidos, 11 aminoá- cidos, 12 aminoácidos, 13 aminoácidos, 14 aminoácidos ou 15 amino- ácidos ácidos em comprimento. Em alguns casos, cada peptídeo dos pools de peptídeos é um peptídeo de 12 aminoácidos no comprimento.

Em algumas das modalidades, os um ou mais peptídeos não nativos tem 5-30 aminoácidos. Em algumas das modalidades, os um ou mais peptídeos não nativos tem 12-25 aminoácidos. Em algumas das moda- lidades, um ou mais peptídeos não nativos têm cerca de 25 aminoáci- dos ou cerca de 12 aminoácidos.

[0015] Em algumas das modalidades, a proporção de pools de peptídeos para células apresentadoras de antígenos durante a pulsa- ção de peptídeo (por exemplo, eletroporação) está entre 0,001 e 100 µg por 1 milhão de células, entre 0,01 e 100 µg por 1 milhão de célu- las, entre 0,1 e 100 µg por 1 milhão de células, entre 1 e 100 µg por 1 milhão de células, entre 10 e 100 µg por 1 milhão de células.

[0016] Em algumas das modalidades, a concentração de pools de peptídeos para a pulsação (por exemplo, eletroporação) está entre a ou cerca de 0,001 µg/mL e a ou cerca de 40 µg/mL, 0,01 µg/mL e a ou cerca de 40 µg/mL, a ou cerca de 0,1 µg/mL e a ou cerca de 40 µg/mL, a ou cerca de 1 µg/mL e a ou cerca de 40 µg/mL, a ou cerca de 0,01 µg/mL e a ou cerca de 10 µg/mL ou a ou cerca de 1 µg/mL e ou cerca de 10 µg/mL.

[0017] Em algumas modalidades, a concentração de peptídeos individuais para o pulso de peptídeo está entre a ou cerca de 0,00001 µg/mL e a ou cerca de 1 µg/mL, em ou cerca de 0,00001 µg/mL e a ou cerca de 0,1 µg/mL, em ou cerca de 0,00001 µg/mL e a ou cerca de 0,01 µg/mL, em ou cerca de 0,0001 µg/mL e a ou cerca de 1 µg/mL, em ou cerca de 0,0001 µg/mL e a ou cerca de 0,1 µg/mL, em ou cerca de 0,0001 µg/mL e a ou cerca de 0,1 µg/mL ou a ou cerca de 0,0001 µg/mL e a ou cerca de 0,01 µg/mL. Em algumas das modalidades, a proporção de peptídeos individuais para células apresentadoras de antígeno durante a pulsação de peptídeo (por exemplo, eletroporação) está entre 0,001 e 100 µg por 1 milhão de células, entre 0,01 e 100 µg por 1 milhão de células, entre 0,1 e 100 µg por 1 milhão de células,

entre 1 e 100 µg por 1 milhão de células, entre 10 e 100 µg por 1 mi- lhão de células. Em algumas modalidades, a concentração de peptí- deos individuais para o pulso de peptídeo está entre a ou cerca de 0,0001 µg/mL e a ou cerca de 40 µg/mL ou a ou cerca de 0,001 µg/mL e a ou cerca de 40 µg/mL. Em algumas modalidades, a concentração de peptídeos individuais para a pulsação de peptídeo (por exemplo, eletroporação) está entre a ou cerca de 0,01 µg/mL e a ou cerca de 40 µg/mL, a ou cerca de 0,1 µg/mL e a ou cerca de 40 µg/mL, a ou cerca de 1 µg/mL e a ou cerca de 40 µg/mL, a ou cerca de 0,01 µg/mL e a ou cerca de 10 µg/mL ou a ou cerca de 1 µg/mL e a ou cerca de 10 µg/mL. Em algumas modalidades, a concentração de peptídeos indivi- duais para o pulso de peptídeo está entre a ou cerca de 0,0001 µg/mL e a ou cerca de 10 µg/mL, em ou cerca de 0,0001 µg/mL e a ou cerca de 1 µg/mL, em ou cerca de 0,0001 µg/mL e a ou cerca de 0,1 µg/mL, a ou cerca de 0,0001 µg/mL e a ou cerca de 0,01 µg/mL, ou a ou cerca de 0,0001 µg/mL e a ou cerca de 0,001 µg/mL.

[0018] Em algumas das modalidades, os peptídeos não nativos são derivados de proteínas endossômicas ou lisossomais. Em algu- mas das modalidades, os peptídeos não nativos são derivados de pro- teínas citosólicas.

[0019] Em algumas das modalidades, a relação de cocultura de células apresentadoras de antígeno para células T está entre 20:1 e 1:1, entre 15: 1 e 1:1, entre 10:1 e 1:1, entre 5:1 e 1:1, entre 2,5:1 e 1:1.

[0020] Em algumas das modalidades, a relação de cocultura de células apresentadoras de antígeno para células T está entre 20:1 e 1:1, entre 15:1 e 1:1, entre 10:1 e 1:1, entre 5:1 e 1:1 ou entre 2,5:1 e 1:1. Em algumas das modalidades, a relação de cocultura de células apresentadoras de antígeno para células T é ou é de cerca de 1:1.

[0021] Em algumas das modalidades, a separação de células apresentadoras de antígeno está usando separação magnética, sepa- ração gravimétrica, ligação seletiva ou classificação de células usando citometria de fluxo.

[0022] É fornecido aqui um método de fabricação de células T pa- ra uso em uma composição de células terapêuticas, em que as células T expressam um receptor de células T (TCR) que reconhece um antí- geno na superfície de uma célula alvo: (a) processamento de uma po- pulação de linfócitos células T obtidas de um indivíduo doador que tem um tumor para produzir uma primeira população de células de linfóci- tos T; (b) estimular a primeira população com um ou mais primeiros agentes estimuladores de células T de linfócitos sob condições para expansão de células T na população para produzir uma segunda po- pulação de células T ativadas, em que um ou mais agentes estimula- dores de células T são ou inclui IL-2 recombinante em uma concentra- ção de 300 IU/mL a 1000 IU/mL e em que a estimulação é realizada em um sistema fechado usando meio sem soro; (c) cocultura da se- gunda população de células T na presença de células dendríticas au- tólogas carregadas com um ou mais peptídeos não nativos para apre- sentar um ou mais peptídeos não nativos em um complexo de histo- compatibilidade principal (MHC), em que a cocultura é em um sistema fechado usando meio sem soro e em que um ou mais peptídeos não nativos são peptídeos correspondentes a mutações somáticas não si- nônimas associadas ao tumor do indivíduo e são carregados com as células dendríticas a uma concentração de menos de 0,02 µg/mL por peptídeo individual, para produzir uma terceira população de células contendo células T compreendendo receptores de células T endóge- nos reativos a peptídeos que codificam mutações do tumor; (d) seleci- onar, a partir da terceira população de células, a população de células T contendo TCR endógeno que são reativos aos peptídeos presentes nas APCs com base em um ou mais marcadores de super-regulação expressos em células T reativas ou ativadas em um sistema fechado para produzir um quarta população contendo as células T seleciona- das; e (e) expandir a quarta população de células selecionadas na presença de um ou mais segundos agentes estimuladores de células T de linfócitos sob condições para expandir células T na população, em que um ou mais segundos agentes estimuladores de células T são ou incluem IL-2 recombinante a uma concentração de 300 IU/mL a 1000 IU/mL e em que a expansão é em um sistema fechado usando meio sem soro para produzir uma composição de células T expandidas para uso como uma composição de células terapêuticas.

[0023] Em algumas das modalidades, a concentração de cada peptídeo individual de um ou mais peptídeos não nativos é 0,00001 µg/mL e igual ou cerca de 0,01 µg/mL. Em algumas das modalidades, a concentração de cada peptídeo individual de um ou mais peptídeos não nativos é de 0,0001 µg/mL e 0,001 µg/mL. Em algumas das moda- lidades, os um ou mais peptídeos não nativos compreendem um pep- tídeo individual ou um pool de peptídeos individuais. Em algumas das modalidades, cada um dos um ou mais peptídeos não nativos tem 12 a 25 aminoácidos no comprimento. Em algumas modalidades, os um ou mais peptídeos não nativos tem cerca de 25 aminoácidos no com- primento. Em algumas das modalidades fornecidas, a relação de co- cultura de células dendríticas para células T está entre 5:1 e 1:5 ou está entre 3: 1 e 1:3. Em algumas modalidades, a relação de cocultura é ou é de cerca de 1:1. Em algumas das modalidades fornecidas, a relação de cocultura de células dendríticas para células T é ou é de cerca de 1:1. Em algumas das modalidades fornecidas, a cocultura é de 2 horas a 24 horas. Em algumas das modalidades fornecidas, a co- cultura é por cerca de 6 horas.

[0024] Em algumas das modalidades, a seleção é realizada usan- do um classificador de células à base de fluorescência. Em algumas das modalidades, a seleção é realizada usando um classificador de células à base de fluorescência em um sistema fechado usando meio sem soro. Em algumas das modalidades, a seleção é por 1 ciclo, 2 ci- clos, 3 ciclos ou 4 ciclos pelo classificador de células à base de fluo- rescência. Em algumas das modalidades, a seleção é realizada a uma taxa entre 10.000 e 100.000 células/segundo usando um coletor de fluidos descartável com base fluorescente. Em algumas das modalida- des, o sistema fechado é um sistema de saco.

[0025] Em algumas das modalidades, os marcadores de super- regulação são proteínas expressas na superfície da célula T que são expressas apenas quando o TCR endógeno das células T reconhece um peptídeo expresso pelas APCs.

[0026] Em algumas das modalidades, um ou mais marcadores de super-regulação são selecionados a partir do grupo que consiste em CD107, CD107a, CD39, CD103, CD137 (4-1BB), CD59, CD69, CD90, CD38, CD30, CD154, CD252, CD134 (OX40), CD258, CD256, PD-1, TIM-3 e LAG-3. Em algumas das modalidades, os um ou mais marca- dores de super-regulação são selecionados a partir do grupo que con- siste em CD38, CD39, CD6, CD90, CD134 e CD137. Em algumas das modalidades, os um ou mais criadores de super-regulação são CD134 e/ou CD137. Em algumas das modalidades, um ou mais marcadores de super-regulação são selecionados a partir do grupo que consiste em CD107, CD107a, CD39, CD103, CD59, CD90, CD38, CD30, CD154, CD252, CD134, CD258 e CD256. Em algumas das modalida- des, os um ou mais marcadores de super-regulação de T são selecio- nados a partir do grupo que consiste em CD107a, CD39, CD103, CD59, CD90 e CD38. Em algumas das modalidades, os um ou mais marcadores de super-regulação de T compreende pelo menos dois marcadores selecionados dentre CD107a e CD39, CD107a e CD103, CD107a e CD59, CD107a e CD90, CD107a e CD38, CD39 e CD103,

CD39 e CD59, CD39 e CD90, CD39 e CD38, CD103 e CD59, CD103 e CD90, CD103 e CD38, CD59 e CD90, CD59 e CD38 e CD90 e CD38. Em algumas das modalidades, um ou mais marcadores de su- per-regulação de células T compreendem ainda CD137. Em algumas das modalidades, um ou mais marcadores de super-regulação de célu- las T compreendem pelo menos dois marcadores selecionados dentre CD107a e CD137, CD38 e CD137, CD103 e CD137, CD59 e CD137, CD90 e CD137 e CD38 e CD137. Em algumas das modalidades for- necidas, os um ou mais marcadores de super-regulação compreen- dem ainda pelo menos um marcador selecionado do grupo que consis- te em PD-1, TIM-3 e LAG-3.

[0027] Em algumas das modalidades, o estímulo da primeira popu- lação é de 7 a 21 dias. Em algumas modalidades, estimular a primeira população é de 7 a 14 dias. Em algumas das modalidades fornecidas, a expansão da quarta população é de 7 a 21 dias. Em algumas moda- lidades, a expansão da quarta população é de 7 a 14 dias.

[0028] Em algumas das modalidades, o tempo de processamento da população de linfócitos para a produção das células T expandidas é inferior a 30 dias. Em algumas das modalidades, o tempo de enrique- cimento da população de linfócitos para a produção das células T ex- pandidas é inferior a 30 dias. Em algumas das modalidades, a popula- ção de linfócitos é de linfócitos infiltrantes de tumor, linfócitos linfáticos ou células mononucleares de sangue periférico. Em algumas das mo- dalidades, a população de linfócitos é derivada de linfócitos infiltrantes de tumor, linfócitos linfáticos ou células mononucleares de sangue pe- riférico.

[0029] Em algumas das modalidades, o tumor é um tumor de um câncer epitelial. Em algumas das modalidades, o tumor é um tumor de um melanoma, pulmão escamoso, adenocarcinoma de pulmão, câncer de bexiga, câncer de células pequenas do pulmão, câncer de esôfago,

câncer colorretal (CRC), câncer cervical, câncer de cabeça e pescoço, câncer de estômago ou câncer uterino. Em algumas das modalidades fornecidas, o tumor é um tumor de um câncer de pulmão de células não pequenas (NSCLC), CRC, câncer de ovário, câncer de mama, câncer de esôfago, câncer gástrico, câncer pancreático, câncer de co- langiocarcinoma, câncer endometrial, opcionalmente em que o câncer de mama é câncer de mama HR+/Her2-, câncer de mama triplo nega- tivo (TNBC) ou câncer de mama HER2+.

[0030] Em algumas das modalidades, a população de linfócitos é processada a partir de um tumor ressecado, como fragmentos de tu- mor do tumor ressecado. Em algumas das modalidades, o tumor é um melanoma.

[0031] Em algumas das modalidades fornecidas, a população de linfócitos é processada como uma suspensão de célula única obtida por homogeneização e/ou digestão enzimática de um ou mais frag- mentos de tumor de um tumor ressecado. Em algumas das modalida- des fornecidas, a população de linfócitos é processada como uma suspensão de célula única obtida por homogeneização e digestão en- zimática de um ou mais fragmentos de tumor de um tumor ressecado. Em algumas das modalidades, a digestão enzimática é por uma cola- genase. Em algumas modalidades, a colagenase é uma colagenase do tipo IV. Em algumas modalidades, a colagenase é uma colagenase do tipo I/II. Em algumas das modalidades, o tumor é um câncer color- retal (CRC).

[0032] Em algumas das modalidades, a composição de células expandidas é usada para tratar um paciente com câncer.

[0033] Em algumas das modalidades, o método compreende ainda a colheita de células produzidas pelo método. Em algumas das moda- lidades, o método compreende ainda formular as células colhidas com um crioprotetor.

[0034] Em algumas das modalidades, a população de células T da composição terapêutica produzida pelo método expressa maior ou igual a 1 receptor de superfície de célula T que reconhece maior ou igual a 1 antígeno específico em uma célula alvo que expressa muta- ções não sinônimas.

[0035] Em algumas das modalidades, a população de células T da composição terapêutica produzida pelo método é enriquecida para cé- lulas T reativas ao tumor ou células T que são positivas na superfície para um ou mais marcadores de super-regulação de células T expres- sos em células T reativas ou ativadas em comparação com a primeira população de células T, como enriquecidas 10 a 1000 vezes. Em al- gumas das modalidades, a população de células T da composição te- rapêutica produzida pelo método é enriquecida para células T reativas ao tumor ou células T que são positivas na superfície para um ou mais marcadores de super-regulação de células T expressos em células T reativas ou ativadas em comparação com a segunda população de células T, como enriquecidas 10 a 1000 vezes. Em algumas das mo- dalidades, a população de células T da composição terapêutica produ- zida pelo método é enriquecida para células T reativas ao tumor ou células T que são positivas na superfície para um ou mais marcadores de super-regulação de células T expressos em células T reativas ou ativadas em comparação com a terceira população de células T, como enriquecidas 1,5 a 50 vezes.

[0036] Em algumas das modalidades, a população de células T da composição terapêutica produzida pelo método é capaz de produzir IFNgama a uma concentração maior do que ou cerca de 30 pg/mL após a estimulação específica do antígeno. Em algumas modalidades, o IFNgama produzido após a estimulação específica do antígeno é maior que ou cerca de 40 pg/mL, maior que ou cerca de 50 pg/mL, maior que ou cerca de 60 pg/mL, maior que ou cerca de 70 pg/mL,

maior do que ou cerca de 80 pg/mL ou maior do que ou cerca de 90 pg/mL.

[0037] É aqui fornecida uma população de células T produzida por qualquer um dos métodos fornecidos, em que a população de células T expressa maior ou igual a 1 receptor de superfície de célula T que reconhece maior ou igual a 1 antígeno específico em uma célula alvo que expressa mutações não sinônimas.

[0038] Em algumas das modalidades, a população de células T produzidas pelos métodos fornecidos é enriquecida para células T rea- tivas ao tumor ou células T que são positivas na superfície para um ou mais marcadores de super-regulação de células T expressos em célu- las T reativas ou ativadas em comparação com a primeira população de células T, como enriquecido 10 a 1000 vezes. Em algumas das modalidades, a população de células T produzidas pelos métodos for- necidos é enriquecida para células T reativas ao tumor ou células T que são positivas na superfície para um ou mais marcadores de super- regulação de células T expressos em células T reativas ou ativadas em comparação com a segunda população de células T, como enri- quecida 10 vezes a 1000 vezes. Em algumas das modalidades, a po- pulação de células T produzidas pelos métodos fornecidos é enrique- cida para células T reativas ao tumor ou células T que são positivas na superfície para um ou mais marcadores de super-regulação de células T expressos em células T reativas ou ativadas em comparação com a terceira população de células T, como enriquecida 1,5 a 50 vezes.

[0039] Em algumas das modalidades fornecidas, a população de células T produzida pelos métodos fornecidos é capaz de produzir IFNgama a uma concentração maior que ou cerca de 30 pg/mL, tal como maior que ou cerca de 60 pg/mL, após estimulação específica do antígeno. Em algumas das modalidades, a população de células T produzida pelo método é capaz de produzir IFNgama em uma concen-

tração maior do que ou cerca de 30 pg/mL após a estimulação especí- fica do antígeno. Em algumas modalidades, o IFNgama produzido após a estimulação específica do antígeno é maior que ou cerca de 40 pg/mL, maior que ou cerca de 50 pg/mL, maior que ou cerca de 60 pg/mL, maior que ou cerca de 70 pg/mL, maior do que ou cerca de 80 pg/mL ou maior do que ou cerca de 90 pg/mL.

[0040] É aqui fornecida uma população de células T que expressa maior ou igual a 1 receptor de superfície de célula T que reconhece maior ou igual a 1 antígeno específico em uma célula alvo que expres- sa mutações não sinônimas; (a) enriquecer uma população de linfóci- tos obtida de um indivíduo doador para produzir uma primeira popula- ção de linfócitos T; (b) estimular a primeira população com um ou mais agentes estimuladores de células T de linfócitos para produzir uma se- gunda população de células T ativadas em que a estimulação é reali- zada em um sistema fechado usando meio sem soro; (c) cocultura da segunda população de células T na presença de células apresentado- ras de antígeno que apresentam um ou mais peptídeos não nativos em um complexo de histocompatibilidade principal (MHC) em um sis- tema fechado usando meio sem soro, sendos um ou mais peptídeos não nativos são peptídeos correspondentes a mutações somáticas não sinônimas associadas no tumor de um indivíduo, para produzir uma terceira população de células contendo células T compreendendo re- ceptores de células T endógenos reativos à mutação que codificam peptídeos do tumor (células T reativas ao tumor); (d) separar células apresentadoras de antígeno de células T na terceira população de cé- lulas em um sistema fechado; (e) após a separação, seleção de célu- las T contendo TCR endógeno que são reativos a peptídeos presentes no APC com base em marcadores de super-regulação em células T em um sistema fechado para produzir uma quarta população contendo as células selecionadas; e (f) expandir a quarta população de células selecionadas na presença de um ou mais agentes estimuladores de células T de linfócitos em um sistema fechado usando meio sem soro.

[0041] Em algumas das modalidades fornecidas, o marcador da superfície celular é um TCR. Em algumas das modalidades fornecidas, a célula alvo é uma célula cancerosa. Em algumas das modalidades fornecidas, a célula cancerosa é uma malignidade epitelial. Em algu- mas das modalidades fornecidas, o antígeno é um neoantígeno.

[0042] Em algumas das modalidades fornecidas, o tempo desde o enriquecimento da população de linfócitos até a produção das células T expandidas é inferior a 30 dias. Em algumas das modalidades forne- cidas, as células T são usadas para tratar um paciente com câncer.

[0043] É aqui fornecida uma composição farmacêutica que com- preende a composição terapêutica de células T produzidas por qual- quer um dos métodos aqui fornecidos. Em algumas das modalidades, a composição farmacêutica compreende uma dose terapêutica das células T.

[0044] É aqui fornecida uma composição que compreende células T reativas ao tumor, em que pelo menos pelo menos ou cerca de 40%, pelo menos pelo menos ou cerca de 50%, pelo menos pelo menos ou cerca de 60%, pelo menos pelo menos ou cerca de 70%, pelo menos pelo menos ou cerca de 80%, ou pelo menos pelo menos ou cerca de 90% das células totais ou células T totais na composição são células T reativas ao tumor ou são positivas na superfície para um ou mais mar- cadores de super-regulação de células T expressos em células T rea- tivas ou ativadas. Em algumas das modalidades, um ou mais marca- dores de super-regulação de células T são selecionados a partir do grupo que consiste em CD107, CD107a, CD39, CD103, CD137 (4- 1BB), CD59, CD90, CD38, CD30, CD154, CD252, CD134, CD258, CD256, PD-1, TIM-3 e LAG-3. Em algumas das modalidades, um ou mais marcadores de super-regulação de células T são CD137 e/ou

CD134. Em algumas das modalidades, um ou mais marcadores de super-regulação de células T são selecionados a partir do grupo que consiste em CD107, CD107a, CD39, CD103, CD59, CD90, CD38, CD30, CD154, CD252, CD134, CD258 e CD256. Em algumas das modalidades, um ou mais marcadores de super-regulação de células T são selecionados a partir do grupo que consiste em CD107a, CD39, CD103, CD59, CD90 e CD38. Em algumas das modalidades, um ou mais marcadores de super-regulação de células T compreendem pelo menos dois marcadores selecionados dentre CD107a e CD39, CD107a e CD103, CD107a e CD59, CD107a e CD90, CD107a e CD38, CD39 e CD103, CD39 e CD59, CD39 e CD90, CD39 e CD38, CD103 e CD59, CD103 e CD90, CD103 e CD38, CD59 e CD90, CD59 e CD38 e CD90 e CD38. Em algumas das modalidades, um ou mais marcadores de super-regulação de células T compreendem ainda CD137. Em algumas das modalidades, um ou mais marcadores de super-regulação de células T reativas compreendem pelo menos dois marcadores selecionados dentre CD107a e CD137, CD38 e CD137, CD103 e CD137, CD59 e CD137, CD90 e CD137 e CD38 e CD137. Em algumas das modalidades fornecidas, um ou mais marcadores de super-regulação de células T compreendem ainda pelo menos um marcador selecionado do grupo que consiste em PD-1, TIM-3 e LAG-

3.

[0045] Em algumas das modalidades, as células T são células T CD3+ ou compreendem células T CD4+ e/ou células T CD8+. Em al- gumas das modalidades, as células T compreendem células T CD4+ e células T CD8+, em que a relação de células T CD8+ para células T CD4+ está entre a ou cerca de 1:100 e a ou cerca de 100:1, entre a ou cerca de 1:50 e a ou cerca de 50:1, entre a ou cerca de 1:25 e a ou cerca de 25:1, entre a ou cerca de 1:10 e a ou cerca de 10:1, entre a ou cerca de 1:5 e a ou cerca de 5:1, ou entre a ou cerca de 1:2,5 e a ou cerca de 2,5:1. Em algumas das modalidades, o número de células T reativas ao tumor ou células T totais positivas na superfície para o marcador de ativação de células T, ou de células viáveis das mesmas, na composição está entre a ou cerca de 0,5 x 108 e a ou cerca de 50 x 109, entre a ou cerca de 0,5 x 108 e a ou cerca de 30 x 109, entre 0,5 x 108 e a ou cerca de 12 x 109, entre a ou cerca de 0,5 x 108 e a ou cer- ca de 60 x 108, entre a ou cerca de 0,5 x 108 e a ou cerca de 15 x 108, entre a ou cerca de 0,5 x 108 e a ou cerca de 8 x 108, entre a ou cerca de 0,5 x 108 e a ou cerca de 3,5x 108, entre a ou cerca de 0,5 x 108 e a ou cerca de 1 x 108, entre 1 x 108 e a ou cerca de 50 x 109, entre a ou cerca de 1 x 108 e a ou cerca de 30 x 109, entre 1 x 108 e a ou cerca de 12 x 109, entre a ou cerca de 1 x 108 e a ou cerca de 60 x 108, entre a ou cerca de 1 x 108 e a ou cerca de 15 x 108, entre a ou cerca de 1 x 108 e a ou cerca de 8 x 108, entre a ou cerca de 1 x 108 e a ou cerca de 3,5x 108, entre a ou cerca de 3,5 x 108 e a ou cerca de 50 x 109, entre a ou cerca de 3,5 x 108 e a ou cerca de 30 x 109, entre a ou cer- ca de 3,5 x 108 e a ou cerca de 12 x 109, entre a ou cerca de 3,5 x 108 e a ou cerca de 60 x 108, entre a ou cerca de 3,5 x 108 e a ou cerca de 15 x 108, entre a ou cerca de 3,5 x 108 e a ou cerca de 8 x 108, entre a ou cerca de 8 x 108 e a ou cerca de 50 x 109, entre a ou cerca de 8 x 108 e a ou cerca de 30 x 109, entre a ou cerca de 8 x 108 e a ou cerca de 12 x 109, entre a ou cerca de 8 x 108 e a ou cerca de 60 x 108, entre a ou cerca de 8 x 108 e a ou cerca de 15 x 108, entre a ou cerca de 15 x 108 e a ou cerca de 50 x 109, entre a ou cerca de 15 x 108 e a ou cerca de 30 x 109, entre a ou cerca de 15 x 108 e a ou cerca de 12 x 109, entre a ou cerca de 15 x 108 e a ou cerca de 60 x 108, entre a ou cerca de 60 x 108 e a ou cerca de 50 x 109, entre a ou cerca de 60 x 108 e a ou cerca de 30 x 109, entre a ou cerca de 60 x 108 e a ou cerca de 12 x 109, entre a ou cerca de 12 x 109 e a ou cerca de 50 x 109, en- tre a ou cerca de 12 x 109 e a ou cerca de 30 x 109, ou entre a ou cer-

ca de 30 x 109 e a ou cerca de 60 x 109, cada um inclusive. Em algu- mas das modalidades fornecidas, a composição compreende um exci- piente farmaceuticamente aceitável. Em algumas das modalidades, a composição compreende um crioprotetor. Em algumas das modalida- des, a composição é estéril.

[0046] É aqui fornecido um método de tratamento de um indivíduo com câncer, o método compreendendo a administração de uma dose terapêutica de qualquer uma das composições farmacêuticas aqui for- necidas. Em algumas das modalidades, a dose terapeuticamente efi- caz está entre 1 x 109 e 10 x 109 células T. Em algumas das modalida- des, a dose terapeuticamente eficaz é de mais de 1 milhão a menos de 100 milhões de células T por quilograma de peso corporal. Em al- gumas das modalidades, a dose terapeuticamente eficaz é de ou cer- ca de 10 milhões a ou cerca de 50 milhões de células T por quilogra- ma de peso corporal. Em algumas das modalidades, a dose terapeuti- camente eficaz é de mais de 1 milhão a menos de 10 milhões de célu- las T por quilograma de peso corporal. Em algumas das modalidades, a dose terapeuticamente eficaz é de cerca de 5 milhões de células T por quilograma de peso corporal. Em algumas das modalidades, a do- se terapeuticamente eficaz é de cerca de 10 milhões de células T por quilograma de peso corporal.

[0047] É aqui fornecido um método para a fabricação de células T, o método compreendendo: (a) obtenção de linfócitos; (b) estimular a população de linfócitos a produzir uma população de células T ativa- das em um sistema fechado usando meio sem soro; (c) cocultura de células T na presença de células apresentadoras de antígeno que apresentam um ou mais peptídeos não nativos associados a MHC apresentados; (d) separar as células apresentadoras de antígeno das células T em um sistema fechado; (e) selecionar células T contendo receptores de superfície celular que são reativos a peptídeos presen-

tes no APC com base em marcadores de super-regulação em células T cultivadas na presença de células nucleadas apresentando peptí- deos em um sistema fechado usando meio sem soro; e (f) expandir células selecionadas na presença de citocinas em um sistema fechado usando meio sem soro.

[0048] Em algumas dessas modalidades, o receptor da superfície celular é um TCR. Em algumas das modalidades fornecidas, o recep- tor de superfície celular é um novo grupo de receptores de células T endógenos reativos a peptídeos que codificam mutações. Em algumas das modalidades fornecidas, o receptor de superfície celular é um no- vo grupo de receptores de células T endógenos reativos a um grupo único de mutações somáticas associadas ao tumor do paciente. Breve Descrição dos Desenhos

[0049] As FIG. 1A e 1B representam fluxogramas de processo que refletem os métodos descritos neste documento. A FIG. 1A representa a administração em etapas das experiências de cocultura descritas no Exemplo 6, enquanto a FIG. 1B representa um fluxograma de proces- so completo para a geração de uma população de células T infiltrantes derivadas de tumor específicas do paciente.

[0050] A FIG. 2A representa cinética exemplar e reatividade de neoantígeno de células T em um processo de expansão de TIL típico envolvendo uma expansão em massa de células T com uma primeira expansão inicial e uma segunda expansão rápida em que a reatividade permanece baixa ao longo do processo, incluindo dentro do produto final. A FIG. 2B representa ainda a cinética exemplar de um processo de expansão de TIL envolvendo uma primeira expansão inicial, segui- da por um enriquecimento de células T reativas ao tumor por cocultura com células apresentadoras de antígeno apresentadoras de peptídeo neoantígeno, seleção de células reativas ao tumor para marcadores de ativação de células T (super-regulação) e uma segunda expansão de células reativas enriquecidas.

[0051] A FIG. 3A representa a geração de células da População 1 viáveis totais a partir de tecido tumoral de CRC derivado de paciente usando cultura de fragmentos, homogeneização com enzima e homo- geneização sem enzima. A digestão com e sem enzima produziu mais células totais do que a cultura de fragmentos. A porcentagem de viabi- lidade dessas células é mostrada na FIG. 3B. Viabilidades de culturas geradas a partir de fragmentos e digeridas com enzima foram maiores do que aquelas derivadas usando homogeneização sem enzima.

[0052] A FIG. 4A representa a geração de células da População 1 a partir de tecido tumoral de melanoma derivado de paciente usando cultura de fragmentos ou homogeneização com ou sem enzima. A cul- tura de fragmentos rendeu mais células totais do que as culturas inici- adas a partir de suspensões de células individuais. A porcentagem de viabilidade dessas células é mostrada na FIG. 4B. A população gerada a partir de fragmentos apresentou maior viabilidade do que células de suspensões de células únicas.

[0053] A FIG. 5 representa curvas de crescimento (FIG. 5A), bem como expansão de duplicação (FIG. 5B) de células da População 2 derivadas de tumores de CRC primários em uma placa de cultura de 6 cavidades convencional ou em uma placa de cultura permeável a gás de 24 cavidades. A FIG. 5 também representa o número de células totais (FIG. 5C), bem como a expansão de duplicação (FIG. 5D) de células da População 2 derivadas de tumores de CRC primários con- trastados por método de extração celular, seja por fragmento ou cultu- ra em suspensão de célula única.

[0054] A FIG. 6 representa curvas de crescimento (FIG. 6A), bem como expansão de duplicação (FIG. 6B) de células da População 2 derivadas de tumores de melanoma primário em uma placa de cultura de 6 cavidades ou em uma placa de cultura permeável a gás de 24 cavidades.

[0055] A FIG. 7 representa o número de células totais (FIG. 7A), bem como a expansão de duplicação (FIG. 7B) de células da Popula- ção 2 derivadas de tumores de CRC primários usando OpTmizer sem soro ou meio RPMI suplementado com 5% de soro humano. Da mes- ma forma, a FIG. 8 representa o número de células totais (FIG. 8A), bem como a expansão de duplicação (FIG. 8B) de células da Popula- ção 2 derivadas de tumores de melanoma primário usando OpTmizer sem soro ou meio RPMI suplementado com 5% de soro humano.

[0056] A FIG. 9 representa o número de células totais (FIG. 9A), bem como a expansão de duplicação (FIG. 9B) de células da Popula- ção 2 derivadas de tumores de CRC e cultivadas em meio suplemen- tado com uma concentração baixa (300 IU/mL) ou uma concentração alta (600 IU/mL) de IL-2 humana recombinante. Estes dados são re- presentados de forma semelhante para células derivadas de tumor de melanoma nas FIG. 10A e 10B. Uma alta concentração de IL-2 não foi observada como sendo necessária para a expansão celular.

[0057] A FIG. 11A representa o número de células totais da Popu- lação 2 e a FIG. 11B representa a expansão de duplicação de culturas de células derivadas de melanoma que não foram estimuladas ou es- timuladas com OKT3, um anticorpo monoclonal anti-CD3, foram ob- servadas como sendo amplamente semelhantes.

[0058] As FIG. 12A-C representam a super-regulação percentual de marcadores de ativação em células T CD8+, CD38 e CD39 (FIG. 12A), CD134 e CD137 (FIG. 12B) e CD69 e CD90 (FIG. 12C), entre 0 e 48 horas após a ativação com OKT3.

[0059] As FIG. 13A-C representam a super-regulação percentual de marcadores de ativação em células T CD4+, CD38 e CD39 (FIG. 13A), CD134 e CD137 (FIG. 13B) e CD69 e CD90 (FIG. 13C), entre 0 e 48 horas após a ativação com OKT3.

[0060] A FIG. 14 representa a expressão de marcadores exempla- res selecionados em uma cultura de suspensão de célula única gerada a partir de um tumor de CRC no Dia 0.

[0061] As FIG. 15A-E representam a pureza das células CD3+ como uma porcentagem das células da População 1. A FIG. 15A re- presenta a pureza das células do SCS do dia 0 de um tumor de CRC após homogeneização sem enzima, com enzima 1 mg/ml (baixa) e en- zima 5 mg/ml (alta). Estes dados são mostrados de forma semelhante para uma cultura derivada de melanoma na FIG. 15B. A FIG. 15C re- presenta a pureza das células CD3+ da População 1 do Dia 0 (SCS da linha de base) e do Dia 6 de fragmentos cultivados na presença ou au- sência de estimulação de OKT3. A FIG. 15D mostra a pureza relativa de células CD3+ de um doador de CRC no Dia 11 usando fragmentos cultivados em meio suplementado com 6000 IU/mL (alto) ou 300 IU/mL (baixo) de IL-2 recombinante. A FIG. 15E representa células da Popu- lação 1 (Dia 9) de fragmentos cultivados em meio OpTmizer sem soro ou RPMI com estimulação de OKT3 e/ou IL-2 em concentrações altas ou baixas. Estas observações suportam que as SCSs de biópsias de tumor de pacientes com CRC podem ser mais capazes de fornecer um maior número de células T para expansão do que as células obtidas a partir de cultura de fragmentos de tumor.

[0062] A FIG. 16 representa a pureza das células CD3+ da Popu- lação 1 derivadas de um paciente com melanoma como culturas de fragmentos do Dia 9 em altas e baixas concentrações de IL-2 e com soro contendo meio RPMI ou OpTmizer sem soro.

[0063] A FIG. 17A representa a geração de células da População 3 após cocultura com células dendríticas carregadas com peptídeo em concentrações de 0,1 ng/mL a 20 ng/mL. A FIG. 17B representa o au- mento de duplicação no mesmo experimento de células T que foram cocultivadas com células dendríticas não carregadas (FIG. 17B).

[0064] A FIG. 18A compara a estimulação com um peptídeo ou dois peptídeos relatados como % de expressão de 41BB/OX40. A FIG. 18B representa a estimulação com um peptídeo ou dois peptídeos re- portados como aumento de duplicação a partir de células T que não estavam ativadas.

[0065] A FIG. 19A compara duas relações de células T para célu- las dendríticas, 1:1 e 1:2, relatadas como % de expressão de 41BB/OX40. A FIG. 19B compara duas relações de células T para cé- lulas dendríticas, 1:1 e 1:2, relatadas como aumento de duplicação de células T que não foram ativadas.

[0066] A FIG. 20A representa a porcentagem de TCR neoantígeno reativo antes e depois da cocultura com peptídeos neoantígenos autó- logos e classificação de células T provenientes do sangue periférico de três doadores saudáveis. A FIG. 20B representa reatividade classe I média pré e pós-cocultura e classificação de células CD8+.

[0067] As FIG. 21A e FIG. 21B descrevem a recuperação da clas- sificação de células usando o Sony FX500 como entrada e saída de células totais para dois ciclos independentes (FIG. 21A) e recuperação percentual (FIG. 21B). A FIG. 22 representa a pureza e a passagem de uma população CD4+ a partir da classificação de células usando Sony FX500. Os resultados demonstram uma alta recuperação de cé- lulas após a seleção e classificação de células positivas para marcado- res de super-regulação.

[0068] As FIG. 23A-FIG. 23C representam a expansão de linfóci- tos T que se infiltram no tumor após a classificação. A FIG. 23A repre- senta o número de células totais e a FIG. 23B representa a expansão de duplicação de células da População 5 derivadas das células da Po- pulação 4 após cocultura com ou sem células dendríticas carregadas com o peptídeo tipo selvagem, peptídeo associado a tumor ou nenhum peptídeo. Os números de células projetados após a expansão das cé-

lulas da População 4 em células da População 5 em vários números de recuperação de células após a classificação são mostrados na FIG. 23C.

[0069] A FIG. 24A representa a secreção medida de IFN-gama dentro de uma cocultura em massa, população classificada como posi- tiva (selecionada) pela expressão de CD137 e/ou CD134 a partir de células de cocultura em massa (enriquecida) ou população classificada como negativa (não selecionada) a partir de células de cocultura em massa, após estimulação com peptídeo mutante (mut) ou peptídeo normal tipo selvagem (WT) de um paciente com câncer de ovário. A FIG. 24B representa o enriquecimento da população específica de ne- oantígeno das células específicas reativas ao tumor na classificação positiva e na classificação negativa em comparação com as células T não classificadas em massa. A FIG. 24C representa o número de clo- notipos de TCR presentes nas populações não selecionadas e seleci- onadas e demonstra que a diversidade de TCRs recebidos é alta na população de células T não classificadas e que há enriquecimento de clones de TCR únicos na população selecionada. A FIG. 24D repre- senta as populações de células pré e pós-classificação da Amostra A que foram observadas como contendo células CD4+ e CD8+, indican- do que células reativas de classe I e classe II estão presentes na po- pulação enriquecida.

[0070] A FIG. 25A representa a secreção medida de IFN-gama dentro de uma cocultura em massa, população classificada como posi- tiva (selecionada) por expressão de CD137 e/ou CD134 a partir de cé- lulas de cocultura em massa (enriquecidas) ou população classificada de forma negativa (não selecionada) de células de cocultura em mas- sa, após estimulação com anti-CD3 (OKT3) de paciente com câncer colorretal. A FIG. 25B representa o enriquecimento da população es- pecífica de neoantígeno das células específicas reativas ao tumor na classificação positiva e na classificação negativa em comparação com as células T não classificadas em massa. A FIG. 25C representa o perfil de clonalidade de TCR presente nas populações não seleciona- das e selecionadas. A FIG. 25D representa as populações de células pré e pós-classificação que foram observadas como contendo células CD4+ e CD8+, indicando que as células reativas de classe I e classe II estão presentes na população enriquecida.

[0071] A FIG. 26A representa o enriquecimento da população es- pecífica de neoantígeno de células específicas reativas ao tumor em uma população de cocultura em massa, classificada como positiva (se- lecionada) por expressão de CD137 e/ou CD134 a partir de células de cocultura em massa (enriquecidas) ou população classificada de forma negativa (não selecionada) de células de cocultura em massa. A FIG. 26B representa o perfil de clonalidade de TCR presente nas popula- ções não selecionadas e selecionadas. A FIG. 26C representa popula- ções de células Pré- (em massa) e pós-classificação, que foram ob- servadas conter células CD4+ classe I reativas e CD8+ classe II reati- vas. Descrição Detalhada

[0072] São fornecidos aqui métodos para a fabricação de células T. Tais métodos incluem, mas não estão limitados às etapas de (1) Enriquecimento de uma população de linfócitos obtida de um indivíduo doador; (2) Estimular a população com um ou mais agentes estimuladores de células T de linfócitos para produzir uma população de células T ativadas em que a estimulação é realizada em um sistema fechado usando meio sem soro; (3) Cocultura de uma população de células T na presença de células apresentadoras de antígeno que apresentam um ou mais peptídeos não nativos associados a MHC; (4) Separar as células apresentadoras de antígeno da população de células T em um sistema fechado; (5) Seleção de uma nova população de células T contendo TCR endógeno que são reativos a peptídeos presentes nas APCs com base em marcadores de super-regulação em células T cultivadas na presença de células nucleadas apresentando peptídeos em um sistema fechado usando meio sem soro; (6) Expandir a nova população de células selecionadas na presença de citocinas em um sistema fechado usando meio sem soro.

[0073] De acordo com as modalidades aqui, métodos ou processos para a fabricação de preparações de células T são fornecidos, os quais podem ser úteis para o tratamento de pacientes com uma doença ou condição patológica. Em contraste com os métodos de produção conhecidos, os métodos e processos descritos neste documento podem ser concluídos em um tempo significativamente mais curto e recuperar um maior número de células T que expressam TCR endógenas, oferecendo assim uma vantagem significativa para trazer as células para a clínica em doses terapêuticas. Também são fornecidas aqui populações de células T produzidas por métodos aqui descritos e suas composições farmacêuticas.

[0074] Os métodos fornecidos referem-se à produção de uma terapia de células T reativa a antígenos associados a tumores, como neoantígenos. As células cancerosas acumulam muitas mutações de DNA diferentes como parte do processo tumorigênico. Essas mutações podem causar alterações de aminoácidos nas regiões codificadoras de proteínas. Para que uma mutação seja reconhecida pelo sistema imunológico, a proteína precisa ser processada intracelularmente e apresentada na superfície com o Complexo Principal de Histocompatibilidade (MHC). Neoantígenos peptídicos (também referidos aqui como neoepítopos ou neoepítopos peptídicos) são os peptídeos mutantes apresentados pelo complexo MHC que podem ser reconhecidos por uma célula T via ligação de TCR. Para que o sistema imunológico reconheça a mutação, ela deve ser expressa na superfície da célula cancerosa por meio do complexo MHC e a célula T deve ter um TCR que reconheça o peptídeo mutado. Esses neoantígenos podem ser apresentados por MHC classe I e MHC classe II, e são reconhecidos pelas células T CD8+ e CD4+, respectivamente.

[0075] Em algumas modalidades, o método descrito pode ser usado para fabricar células T que expressam receptores de superfície celular. O receptor da superfície celular pode ser um receptor de células T (TCR) ou um novo grupo de TCRs. Em modalidades particulares dos métodos fornecidos, a população de células T é ou inclui células T reativas que expressam receptores de superfície celular, como um receptor de células T (TCR), capaz de reconhecer antígenos peptídicos na superfície de células alvo. Especificamente, para um antígeno ser reconhecido pelo sistema imunológico, a proteína precisa ser processada intracelularmente em fragmentos de peptídeos que são então apresentados na superfície com o Complexo Principal de Histocompatibilidade (MHC). Um TCR tem duas cadeias de proteínas, que são projetadas para se ligar a peptídeos específicos apresentados por uma proteína do complexo principal de histocompatibilidade (MHC) na superfície de certas células. Uma vez que os TCRs reconhecem peptídeos no contexto de moléculas MHC expressas na superfície de uma célula alvo, os TCRs têm o potencial de reconhecer antígenos não apenas apresentados diretamente na superfície das células alvo, por exemplo, células cancerosas, mas também apresentadas por células apresentadoras de antígenos, como as presentes em microambientes tumorais, inflamatórios e infectados, e em órgãos linfoides secundários. As células T reativas que expressam tais receptores de superfície celular podem ser usadas para direcionar e matar qualquer célula alvo, incluindo, mas não se limitando a, células infectadas, células danificadas ou células disfuncionais. Assim, de acordo com as modalidades aqui descritas, as células T fabricadas que expressam o receptor de superfície celular podem ser usadas para direcionar e matar qualquer célula alvo, incluindo, mas não se limitando a, células infectadas, células danificadas ou células disfuncionais. Exemplos de tais células alvo podem incluir células cancerosas, células infectadas por vírus, células infectadas por bactérias, células inflamatórias ativadas de forma disfuncional (por exemplo, células endoteliais inflamatórias) e células envolvidas em reações imunes disfuncionais (por exemplo, células envolvidas em doenças autoimunes).

[0076] Em algumas modalidades, um “receptor de células T” ou “TCR” é uma molécula que contém cadeias α e β variáveis (também conhecidas como TCRα e TCRβ, respectivamente) ou cadeias γ e δ variáveis (também conhecidas como TCR e TCRδ, respectivamente), ou suas porções de ligação ao antígeno, e que é capaz de se ligar es- pecificamente a um peptídeo ligado a uma molécula de MHC. Em al- gumas modalidades, o TCR está na forma αβ. Normalmente, os TCRs que existem nas formas αβ e γδ são geralmente estruturalmente se- melhantes, mas as células T que os expressam podem ter funções ou localizações anatômicas distintas. Um TCR pode ser encontrado na superfície de células T (ou linfócitos T), onde geralmente é responsá- vel pelo reconhecimento de antígenos ligados às moléculas do com- plexo principal de histocompatibilidade (MHC).

[0077] Em alguns aspectos, as células T reativas são células T reativas ao tumor que reconhecem um neoantígeno de câncer. A mai- oria dos neoantígenos surge de mutações passenger, o que significa que eles não inferem nenhuma vantagem de crescimento para a célula cancerosa. Um número menor de mutações promove ativamente o crescimento do tumor, essas são conhecidas como mutações driver. É provável que as mutações passenger dêem origem a neoantígenos que são exclusivos de cada paciente e podem estar presentes em um subconjunto de todas as células cancerosas. Mutações driver dão ori- gem a neoantígenos que provavelmente estão presentes em todas as células tumorais de um indivíduo e potencialmente compartilhados. Em algumas modalidades do método fornecido, a população de células T contém células T reativas ao tumor que podem reconhecer neoantíge- nos contendo mutações passenger e/ou driver.

[0078] Em aspectos particulares, os métodos fornecidos podem ser usados para a produção ex vivo de uma terapia de células T, inclu- indo para a expansão ex vivo de células T reativas ao tumor autólogas. Em alguns aspectos, os neoantígenos são alvos ideais para imunote- rapias porque representam alvos específicos da doença. Por exemplo, tais antígenos geralmente não estão presentes no corpo antes do cân- cer se desenvolver e são verdadeiramente específicos do câncer, não são expressos em células normais e não estão sujeitos a toxicidade imunológica fora do alvo. Assim, o repertório único de neoantígenos específicos para o paciente pode desencadear uma forte resposta imunológica específica para as células cancerosas, evitando as células normais. Esta é uma vantagem sobre outros alvos de terapia celular que podem não ser alvos específicos da doença, uma vez que mesmo níveis baixos de antígeno alvo em células normais podem levar a toxi- cidade autoimune fatal grave no contexto de terapias projetadas que têm como alvo antígenos comuns. Por exemplo, um programa anti MAGE-A3-TCR em pacientes com melanoma foi interrompido devido a mortes relacionadas ao estudo atribuídas à reatividade cruzada com um alvo semelhante MAGE-A12, que é expresso em um nível baixo no cérebro. Um desafio significativo na imunoterapia contra o câncer tem sido a identificação de alvos do câncer.

[0079] Estudos clínicos recentes demonstraram que as células T isoladas de tumores ressecados cirurgicamente possuem TCRs que reconhecem neoantígenos, e expandir essas populações TIL reativas a neoantígenos e infundi-las novamente no paciente pode, em alguns casos, resultar em um benefício clínico dramático. Esta terapia perso- nalizada gerou respostas clínicas notáveis em certos pacientes com tumores epiteliais comuns.

[0080] Os métodos existentes para obter e gerar células T reativas ao tumor não são inteiramente satisfatórios. Por exemplo, o isolamento direto de células T reativas ao tumor de um indivíduo sem expansão não é viável porque quantidades terapeuticamente eficazes de tais cé- lulas não podem ser obtidas. Como alternativa, foram feitas tentativas para identificar TCRs específicos para um neoantígeno desejado para modificação recombinante do TCR em células T para uso em métodos de terapia celular adotiva. Tais abordagens, no entanto, produzem apenas um único TCR contra um neoantígeno específico e, portanto, carecem de diversidade para reconhecer um repertório mais amplo de múltiplas mutações específicas de tumor. Outros métodos envolvem a expansão em massa de células T a partir de uma fonte tumoral, que tem o risco de expandir células T que não são reativas a um antígeno tumoral e/ou que podem incluir uma série de células espectadoras que podem exibir atividade inibidora. Por exemplo, as células T regulado- ras de tumor (Tregs) são uma subpopulação de células T CD4+, que se especializam na supressão de respostas imunes e podem limitar a reatividade de um produto de células T. Estas abordagens adicionais que buscaram expandir as células T reativas ao tumor ex vivo não são seletivas, de modo que as células T não reativas na cultura podem se expandir preferencialmente sobre as células T reativas, resultando em um produto final que carece de reatividade satisfatória e/ou em que o número de células T reativas ao tumor permanece insuficiente. Méto-

dos para produzir células T reativas ao tumor para terapia são neces- sários.

[0081] As modalidades fornecidas referem-se a métodos melhora- dos para identificar e expandir células T ex vivo, incluindo células T reativas ao tumor, para uso em terapia de células T. Em algumas mo- dalidades, os métodos fornecidos melhoram ou aumentam o cresci- mento e a sobrevivência de células T, como células T reativas ao tu- mor, fora do corpo. Em modalidades particulares, os métodos enrique- cem para expansão de células T reativas em comparação com células T não reativas e promovem sua sobrevivência e crescimento em cultu- ra ex vivo. Em algumas modalidades, os métodos resultantes podem ser realizados em um sistema fechado. Os métodos em algumas mo- dalidades são realizados de forma automatizada ou parcialmente au- tomatizada.

[0082] Os métodos fornecidos resultam em uma população enri- quecida de células T reativas a mutações específicas do paciente, co- mo com base na seleção de marcadores de super-regulação após a apresentação de antígenos mutantes e/ou com base na expansão de células T enriquecidas para células T reativas ao tumor após cocultura com células apresentadoras de antígenos apresentando neoepítopos peptídicos. Por exemplo, os métodos de cultura das células incluem métodos para proliferar e expandir células, particularmente envolvendo etapas para enriquecer para proliferação e expansão de células T rea- tivas ao tumor, como por seleção de tais células, ou com base na su- per-regulação de uma molécula de superfície celular em células T ati- vadas (marcador de ativação de células T) que estão associadas ou indicativas de células T reativas ao tumor. Os métodos fornecidos re- sultam em um produto contendo células T reativas ao tumor que po- dem ter como alvo muitas mutações e/ou que contém centenas de TCRs que são reativos a diferentes antígenos tumorais. Assim, tais células T reativas ao tumor oferecem vantagens em comparação com os métodos existentes nos quais as células são transduzidas para ex- pressar um único TCR reativo a neoepítopo.

[0083] Em algumas modalidades dos métodos fornecidos, uma fonte de peptídeos tumorais potenciais é usada para identificar TCRs que são reativos a neoantígenos em um processo que inclui a expan- são das células T reativas aos peptídeos neoantigênicos tumorais. Os métodos fornecidos incluem métodos de cocultura ex vivo em que uma população de células T que foram expandidas a partir de células T presentes em ou a partir de uma amostra biológica (por exemplo, fra- gmentos de tumor ou sangue periférico ou outra fonte de células T) é incubada na presença de células apresentadoras de antígeno que fo- ram colocadas em contato com, ou feitas para apresentar, os peptí- deos neoantigênicos. Em aspectos particulares, as células T e as célu- las apresentadoras de antígeno são autólogas para o indivíduo com tumor a partir do qual os peptídeos foram identificados. Os métodos fornecidos incluem ainda etapas para separar, enriquecer e/ou seleci- onar células T reativas ao tumor da cocultura antes ou em conexão com sua expansão ex vivo adicional.

[0084] A FIG. 1A representa um esquema de um processo exem- plar para a fabricação de uma composição terapêutica de células T de acordo com os métodos fornecidos. No processo exemplar, uma amostra de tumor é obtida de um paciente para identificação e gera- ção de peptídeos para uso em métodos de cocultura com células apresentadoras de antígeno (APCs) apresentando os peptídeos e cé- lulas T de antígeno autólogo obtidas do mesmo indivíduo. Em alguns casos, uma população de células T do paciente, por exemplo, conten- do linfócitos infiltrantes de tumor (TIL) ou linfócitos de sangue periféri- co (PBL), é estimulado sob condições para expandir as células, antes da cocultura com células apresentadoras de antígeno que foram con-

tatadas ou expostas a neoepítopos de peptídeo para apresentação em um complexo de histocompabilidade principal. Após a cocultura sob condições em que as células apresentadoras de antígeno apresentam peptídeos no contexto de um complexo de histocompatibilidade princi- pal, as células T reativas ao tumor ou células T superficiais positivas para um ou mais marcadores de ativação de células T (também cha- mado de marcador de super-regulação ou Marcador de células T reati- vo, por exemplo, CD70a) associados a células T reativas ao tumor po- dem ser selecionadas e cultivadas sob condições para expansão de acordo com os métodos fornecidos, tais como incubação com um (s) agente (s) estimulador (es) de células T (por exemplo, IL-2 recombi- nante, anti-CD3 e/ou anti-CD28). A cultura pode ser realizada na pre- sença de uma ou mais citocinas recombinantes (por exemplo, IL-2) para suportar a proliferação e expansão de células. O processo pode ser realizado na presença de meio sem soro contendo nutrientes. Uma ou mais ou todas as etapas podem ser realizadas em um sistema fe- chado, por exemplo, sem exposição das células ao ambiente. Ao atin- gir uma dose terapêutica ou um número limite de células, as células podem ser colhidas e formuladas, em alguns casos concentradas ou criopreservadas, e usadas para administração a um indivíduo, como por infusão. A FIG. 1B representa um processo exemplar no qual uma etapa de criopreservação pode ser realizada após uma ou mais das etapas.

[0085] Os métodos fornecidos oferecem vantagens em compara- ção com os métodos existentes para a produção e expansão de TILs porque os métodos fornecidos envolvem etapas para enriquecer para células reativas de tumor, tal como pela etapa de cocultura com APCs apresentadoras de peptídeo seguido pela seleção de clones de células T reativas que têm super-regulado um ou mais marcadores de ativa- ção de células T. Em virtude deste processo, a pequena população inicial de células T reativas ao tumor expandida da amostra biológica (por exemplo, tumor) é enriquecida por células que são ou provavel- mente são células reativas ao tumor antes de uma segunda etapa de expansão subsequente, promovendo assim a preservação e expansão de células de interesse e que limitam a expansão de células T obser- vadoras que não são reativas a um antígeno tumoral e/ou que podem incluir células que exibem atividade inibidora (FIG. 2A). Isto está em contraste com os métodos existentes que envolvem a expansão passi- va de células T em massa, nas quais todas as células T de um tumor são submetidas a uma primeira expansão inicial, por exemplo, com altas concentrações de IL-2, seguido por uma segunda expansão rápi- da de células T presentes após a expansão inicial. Em tais outros mé- todos, embora as células viáveis totais (TVC) possam ser grandemen- te expandidas por esses processos alternativos, não há nenhuma eta- pa para garantir ativamente que as células T reativas ao tumor sejam predominantemente propagadas (FIG. 2B). Além disso, os métodos fornecidos são realizados para maximizar o número de células tumo- rais reativas que podem ser coletadas, por exemplo, por cocultura de todas as células propagadas após a primeira expansão com APCs apresentadoras de peptídeo e, em seguida, selecionando entre todas as células em massa após a cocultura para células positivas para um ou mais marcadores de ativação antes da segunda expansão subse- quente. Em aspectos dos métodos fornecidos, todas as etapas do mé- todo são realizadas em um sistema fechado.

[0086] Os métodos fornecidos incluem uma ou mais característi- cas que fornecem ou se relacionam a um processo melhorado, mais eficiente e/ou mais robusto para a produção de uma composição tera- pêutica de células T reativas ao tumor ex vivo. Em particular, a descri- ção se refere a métodos que fornecem vantagens sobre os métodos disponíveis para a produção de uma composição de células terapêuti-

cas TIL. Tais vantagens incluem, por exemplo, custo reduzido, simplifi- cação, enriquecimento melhorado de células T reativas ao tumor na composição terapêutica e maior eficácia da composição terapêutica, incluindo entre diferentes indivíduos e condições tumorais.

[0087] Entre as descobertas aqui descritas está a observação de que concentrações mais baixas de IL-2 recombinante podem ser em- pregadas durante uma ou ambas as etapas de expansão com suces- so. Muitos métodos existentes usam altas concentrações de IL-2 de 6000 IU/mL para a expansão de células T de TIL. No entanto, altas concentrações de IL-2 podem aumentar o custo do processo e podem ser limitantes. Em alguns casos, altas concentrações de IL-2 podem levar a impactos negativos na diferenciação de células T ao direcionar a diferenciação de células T efetoras sobre células T de memória inici- al que podem ser mais desejáveis em uma composição de células T terapêuticas. Os métodos fornecidos podem ser realizados com con- centrações que são várias vezes menores do que 6000 IU/mL, tais como concentrações menores que ou cerca de 1000 IU/mL, por exem- plo, de ou cerca de 300 IU/mL até ou cerca de 1000 UI/mL. Em moda- lidades particulares, a concentração de IL-2 é de cerca de 300 IU/mL.

[0088] Em modalidades dos métodos fornecidos, a população de células T é obtida a partir de uma amostra biológica conhecida por conter células T. Em algumas modalidades, a população de células T é enriquecida a partir de uma amostra biológica de um indivíduo, em particular um indivíduo humano. A amostra biológica pode ser qual- quer amostra contendo uma população em massa de células T. Em algumas modalidades, a amostra biológica é ou inclui células mononu- cleares de sangue periférico. Em algumas modalidades, a amostra bio- lógica é uma amostra de sangue periférico ou soro. Em algumas mo- dalidades, a amostra biológica é uma amostra de linfonodo. Em algu- mas modalidades, a amostra biológica é uma amostra de tumor. Em alguns aspectos, as células T em massa podem incluir células T que se infiltram no tumor (TILs). Em algumas modalidades, o indivíduo é um indivíduo humano. Em algumas modalidades, o indivíduo é um in- divíduo com câncer, infecção viral, infecção bacteriana ou é um indiví- duo com uma condição inflamatória. Em modalidades particulares, o indivíduo tem um câncer.

[0089] Em aspectos dos métodos fornecidos, a fonte inicial de cé- lulas no método pode ser fragmentos de tumor (por exemplo, fragmen- tos de 1 a 8 mm de diâmetro) ou pode ser uma preparação de suspen- são de célula única a partir da digestão enzimática de fragmentos de tumor. Verificou-se aqui que, embora certas fontes possam ser superi- ores para alguns tipos de tumor, ambos os fragmentos e suspensões de células individuais podem suportar a expansão de células T e o en- riquecimento de células T reativas ao tumor. Em alguns casos, a fonte de células tumorais pode ser escolhida dependendo do tipo de tumor ou câncer, de modo a otimizar ou aumentar a expansão e o enrique- cimento de células T reativas ao tumor a partir do tumor. Em um exemplo, o câncer é um melanoma e a população inicial de linfócitos são fragmentos de tumor, como de um tumor ressecado. Em outro exemplo, o câncer é um câncer colorretal e a população inicial de lin- fócitos é uma suspensão de célula única obtida por digestão enzimáti- ca, por exemplo, colagenase, de fragmentos de tumor.

[0090] Em algumas modalidades, os métodos incluem uma etapa de cocultura de células T inicialmente expandidas com células apre- sentadoras de antígeno autólogo que foram carregadas com o peptí- deo. As descobertas aqui demonstram que concentrações relativa- mente baixas de peptídeo ou um pool de peptídeos (contendo uma pluralidade de peptídeos, por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 ou 100 mais, ou qualquer valor entre qualquer um dos anteriores), de modo que cada peptídeo individual seja inferior a 20 ng/mL, e mesmo tão baixo quanto 0,1 ng/mL, pode levar a um aumento na ativação de T célula durante a cultura. Em algumas moda- lidades, isso pode levar a um enriquecimento melhorado de células T reativas ao tumor na cocultura antes da seleção de células positivas para um ou mais marcadores de ativação de células T (ou seja, mar- cador de super-regulação ou marcador de célula T reativa). Em algu- mas modalidades, a etapa de cocultura nos métodos fornecidos inclui uma proporção de células derivadas de tumor contendo células T para APCs autólogas (por exemplo, células dendríticas) de ou cerca de 1:5 para ou cerca de 5:1, tal como 1:3 a ou cerca de 3:1, por exemplo, como em ou cerca de 1:1, e envolve o carregamento das APCs com um peptídeo individual ou um pool de peptídeos. Em algumas modali- dades, os APCs são carregados com uma concentração de peptídeo ou pool de peptídeos em que o peptídeo individual, ou peptídeos indi- viduais do pool de peptídeos em média, é inferior a ou cerca de 20 ng/mL, tal como de em ou cerca de 0,1 ng/mL a ou cerca de 1 ng/mL, por exemplo, a ou cerca de 0,1 ng/mL.

[0091] Em algumas modalidades, os métodos fornecidos incluem células T de enriquecimento, como células T CD3+ ou um subconjunto CD4 e/ou CD8 das mesmas, ainda com base em um ou mais marca- dores cuja expressão é regulada positivamente em (por exemplo, em comparação com células T em repouso ou não ativadas) ou específico para células T reativas ou ativadas (doravante “marcador de células T reativas” ou marcador de ativação de células T). As células T reativas expressarão certos marcadores reativos quando seu TCR endógeno reconhecer um antígeno em uma célula ou tecido alvo, como quando um TCR reconhece um neoantígeno no tumor. Marcadores de células T reativas exemplares incluem um ou mais, tais como dois, três, quatro ou mais de, CD107, CD107a, CD39, CD103, CD137 (4-1BB), CD59, CD90, CD38, CD30, CD154, CD252, CD134 (OX40), CD258, CD256,

PD-1, TIM-3 ou LAG-3. O enriquecimento ou seleção de células positi- vas para um ou mais desses marcadores de super-regulação em célu- las T reativas ou ativadas pode ser realizado antes ou durante uma ou mais etapas do método de expansão. Em modalidades particulares, os métodos fornecidos incluem enriquecimento ou seleção para células positivas para um ou mais marcadores de super-regulação em células T reativas ou ativadas após a ativação de uma população de células T pela incubação de cocultura com APCs apresentadoras de peptídeo (por exemplo, DCs). Em algumas modalidades, a etapa de seleção de células positivas para um ou mais marcadores de super-regulação em células T reativas ou ativadas da cocultura pode resultar em enrique- cimento de 2 vezes ou maior de células T reativas ao tumor específi- cas ao antígeno e/ou uma diminuição na clonalidade de TCR evidenci- ando o enriquecimento de clonotipos de TCR consistente com o enri- quecimento de células T reativas ao tumor. Além disso, tais células T enriquecidas podem exibir uma capacidade melhorada de produzir IFN-gama após estimulação específica do antígeno em comparação com células T não selecionadas ou células T em massa da cocultura.

[0092] Em algumas modalidades, os métodos produzem ou ex- pandem células T para uso em terapia de células adotivas para o tra- tamento de uma doença ou condição na qual as células ou tecido as- sociado à doença ou condição são conhecidos ou suspeitos de ex- pressar um antígeno alvo reconhecido pelas células T. Em algumas modalidades, a terapia com células T é autóloga para o indivíduo. Em algumas modalidades, a terapia com células T é alogênica para o indi- víduo.

[0093] A menos que definido de outra forma, todos os termos da técnica, notações e outros termos técnicos e científicos ou terminolo- gia usados neste documento se destinam a ter o mesmo significado como é comumente entendido por alguém versado na técnica à qual o assunto reivindicado se refere. Em alguns casos, os termos com mé- dias comumente compreendidas são definidos neste documento para maior clareza e/ou para pronta referência, e a inclusão de tais defini- ções neste documento não deve necessariamente ser interpretada como representando uma diferença substancial sobre o que é geral- mente entendido na técnica.

[0094] Todas as publicações, incluindo documentos de patentes, artigos científicos e bancos de dados, referidos neste pedido são in- corporados por referência em sua totalidade para todos os fins, na mesma medida como se cada publicação individual fosse incorporada individualmente por referência. Se uma definição estabelecida neste documento for contrária ou de outra forma inconsistente com uma de- finição estabelecida nas patentes, pedidos, pedidos publicados e ou- tras publicações que são incorporadas neste documento por referên- cia, a definição estabelecida neste documento prevalece sobre a defi- nição que é incorporada neste documento por referência.

[0095] Os títulos das seções usados neste documento são apenas para fins organizacionais e não devem ser interpretados como limitan- do o assunto descrito. I. EXPANSÃO EX VIVO DE CÉLULAS T REATIVAS AO

TUMOR

[0096] Os métodos fornecidos envolvem a expansão ex vivo e a produção de uma composição terapêutica de células T, particularmen- te para uso em conexão com o tratamento de câncer. Em algumas modalidades, o método de fabricação envolve o crescimento e a mani- pulação de células do paciente fora do corpo. Em modalidades particu- lares, os métodos se referem a métodos para expandir células T con- tendo um TCR endógeno específico para um antígeno associado a tumor (doravante “células T reativas ao tumor”). Para os fins desta descrição, a referência a células T reativas ao tumor inclui células T que exibem reatividade a um antígeno tumoral ou que são prováveis ou suspeitas de serem células T reativas ao tumor devido à super- regulação ou expressão de superfície positiva de uma proteína ex- pressa na célula T que são apenas expresso quando o TCR endógeno das células T reconhece um peptídeo expresso pelas APCs, por exemplo, marcador de ativação de células T. Em alguns aspectos, a frequência dessas células pode ser baixa e, para expandir essas célu- las a uma dose terapêutica ex vivo, métodos para enriquecimento e expansão são necessários.

[0097] Em modalidades de métodos fornecidos, uma população contendo células T (doravante também chamada de primeira popula- ção de células T) é uma população de células T que é obtida, selecio- nada ou isolada de uma amostra biológica de um indivíduo, como um indivíduo humano, em que a amostra contém células T. Em algumas modalidades, a população contendo células T pode ser de qualquer amostra fonte que é conhecida ou suspeita de conter células T que são ou que podem incluir ou potencialmente podem incluir células T reativas ao tumor. A amostra pode incluir uma amostra de tumor con- tendo linfócitos infiltrantes de tumor (TILs), uma amostra de sangue (por exemplo, aférese ou amostra de leucaferese) contendo células mononucleares de sangue periférico (PBMCs) ou uma amostra de lin- fonodo. Em algumas modalidades, a amostra é uma amostra de tumor ou um fragmento de tumor contendo linfócitos infiltrantes de tumor ou TILs. A população contendo células T pode ser obtida diretamente de um indivíduo (por exemplo, indivíduo saudável ou com câncer), tal co- mo por seleção de células T ou um subconjunto das mesmas a partir da amostra biológica do indivíduo. Em modalidades particulares, a amostra biológica é de um indivíduo que tem um tumor e que contém células T reativas ao tumor ou que tem o potencial para ou que podem conter células T reativas ao tumor que podem ser enriquecidas pelos métodos fornecidos.

[0098] Em algumas modalidades, os métodos fornecidos incluem (1) Enriquecer uma população de linfócitos obtidos de um indivíduo doador para produzir uma primeira população de células T; (2) Estimu- lar a primeira população com um ou mais agentes estimuladores de células T de linfócitos para produzir uma segunda população de célu- las T ativadas; (3) Cocultura de células da segunda população de célu- las T na presença de células apresentadoras de antígeno que apre- sentam um ou mais peptídeos (por exemplo, neoepítopos de peptídeo) em um MHC (peptídeo não nativo associado ao MHC), em que o a cul- tura produz uma terceira população de células contendo ou enriqueci- da em células T que são reativas a peptídeos apresentados no MHC de uma APC (por exemplo, células T reativas ao tumor); (4) a partir da terceira população, separar as APCs para produzir uma quarta popu- lação de células T contendo TCR endógeno que são reativos aos pep- tídeos presentes nas APCs; e (5) expansão da quarta população de células T contendo células T reativas ao tumor por incubação na pre- sença de agentes estimuladores de células T. Em algumas modalida- des, a separação das células T em (4) pode envolver a depleção ou a remoção das APCs e/ou pode incluir a seleção de células T com base em marcadores de super-regulação em células T reativas ou ativadas. Em algumas modalidades, uma ou mais das etapas podem ser reali- zadas em um sistema fechado usando meio sem soro.

[0099] Em algumas modalidades, os métodos fornecidos incluem (1) Enriquecer uma população de linfócitos obtidos de um indivíduo doador para produzir uma primeira população de células T; (2) Estimu- lar a primeira população com um ou mais agentes estimuladores de células T de linfócitos para produzir uma população de células T ativa- das em que a estimulação é realizada em um sistema fechado usando meio sem soro; (3) Cocultivo de células da segunda população de cé-

lulas T na presença de células apresentadoras de antígeno que apre- sentam um ou mais (por exemplo, neoepítopos de peptídeo) em um MHC (peptídeo não nativo associado ao MHC), em que o cocultivo produz uma terceira população de células contendo ou enriquecida em células T reativas a peptídeos apresentados no MHC do APC (por exemplo, células T reativas ao tumor); (4) a partir da terceira popula- ção, separar as células apresentadoras de antígeno da população de células T em um sistema fechado; (5) após a separação das células apresentadoras de antígeno, selecionar células T contendo TCR en- dógeno que são reativos a peptídeos presentes nas APCs com base em marcadores de super-regulação em células T reativas ou ativadas para produzir uma quarta população de células T, em que a seleção está em um sistema fechado usando meio sem soro; e (6) Expandir a quarta população de células selecionadas na presença de citocinas em um sistema fechado usando meio sem soro.

[00100] Em algumas modalidades, os métodos fornecidos incluem (1) Enriquecer uma população de linfócitos obtidos de um indivíduo doador para produzir uma primeira população de células T; (2) Estimu- lar a primeira população com um ou mais agentes estimuladores de células T de linfócitos para produzir uma população de células T ativa- das em que a estimulação é realizada em um sistema fechado usando meio sem soro; (3) Cocultivo de células da segunda população de cé- lulas T na presença de células apresentadoras de antígeno que apre- sentam um ou mais (por exemplo, neoepítopos de peptídeo) em um MHC (peptídeo não nativo associado ao MHC), em que o cocultivo produz uma terceira população de células contendo ou enriquecida em células T reativas a peptídeos apresentados no MHC do APC (por exemplo, células T reativas ao tumor); (4) a partir da terceira popula- ção, selecionar células T contendo TCR endógeno que são reativos a peptídeos presentes nas APCs com base em marcadores de super-

regulação em células T reativas ou ativadas para produzir uma quarta população de células T, em que a seleção é em um sistema usando meio sem soro; e (5) Expandir a quarta população de células selecio- nadas na presença de citocinas em um sistema fechado usando meio sem soro.

[00101] Em algumas modalidades, os agentes estimuladores de células T incluem anti-CD3 (por exemplo, anticorpo anti-CD3, como OKT3), reagentes anti-CD28 (por exemplo, anticorpo anti-CD28), co- mo um anticorpo anti-CD3 (por exemplo, OKT3) e um anticorpo anti- CD28 e/ou uma ou mais citocinas recombinantes (por exemplo, IL-2, IL-7, IL-21 e/ou IL-15). Em modalidades particulares, a incubação ou cultura de células T também é realizada com meio contendo nutrientes para que as células possam sobreviver fora do corpo.

[00102] Em alguns casos, os métodos incluem incubação com IL-2 recombinante sozinha ou em combinação com uma ou mais outras citocinas recombinantes (por exemplo, IL-7, IL-21 e/ou IL-15) e, em alguns casos, uma ou mais outros agentes estimuladores de células T para fornecer um sinal primário e secundário (coestimulador) às célu- las. Os métodos padrão para a cultura de células T para fornecer um sinal primário e secundário (coestimulador) para as células, envolvem incubação com agentes estimuladores de células T fornecidos por re- agentes anti-CD3 (por exemplo, OKT3) e anti-CD28. Em algumas mo- dalidades, os agentes estimuladores de células T incluem um anticor- po anti-CD3 (por exemplo, OKT3) e um anticorpo anti-CD28. Normal- mente, tais estimulações também incluem uma ou mais citocinas re- combinantes adicionais (por exemplo, IL-2, IL-7, IL-21 e/ou IL-15) e meios contendo nutrientes para que as células possam sobreviver fora do corpo.

[00103] Os métodos fornecidos para a expansão de células T reati- vas ao tumor envolvem uma primeira expansão envolvendo a cultura da população selecionada ou isolada contendo células T (ou seja, a primeira população de células T) com uma citocina recombinante de um ou mais de (por exemplo, IL-2, IL- 7, IL-21 e/ou IL-15), tipicamente geralmente incluindo IL-2 recombinante. Em alguns casos, os agentes estimuladores de células T fornecem ainda um sinal primário e secun- dário (coestimulador) para as células, tal como fornecido por reagentes anti-CD3 (por exemplo, OKT3) e anti-CD28, como um anticorpo anti- CD3 (por exemplo, OKT3) e um anticorpo anti-CD28. A expansão ini- cial ou primeira resulta em uma segunda população de células T que é enriquecida para células T como resultado da expansão ou prolifera- ção de células T presentes na primeira população.

[00104] Nos métodos fornecidos, as células T reativas ao tumor são identificadas ou enriquecidas a partir das células T estimuladas ex- pandidas na primeira etapa por uma ou mais etapas adicionais que incluem cocultura ex vivo das células T estimuladas (segunda popula- ção de células T) com células apresentadoras de antígeno (APCs) e um ou uma pluralidade de peptídeos que incluem neoepítopos de um antígeno tumoral (APCs/neoepítopos peptídicos). Em algumas modali- dades, os métodos fornecidos incluem cocultura ex vivo em que a se- gunda população de células T é incubada com APCs, tais como APCs autólogas ou células apresentadoras de antígenos artificiais (aAPCs), que foram expostas ou contatadas com uma ou mais peptídeos, por exemplo, peptídeos sintéticos, sob condições em que as APCs foram induzidas a apresentar um ou mais peptídeos de um antígeno associ- ado a tumor. Em algumas modalidades, a população de células T são células T autólogas de um indivíduo com um tumor e a fonte de peptí- deos sintéticos são peptídeos antigênicos tumorais de um antígeno tumoral do mesmo indivíduo. Em algumas modalidades, as células da cocultura ex vivo são uma população de células (terceira população) que inclui células T reativas ao tumor que reconhecem ou são ativadas por um peptídeo apresentado em um MHC de uma APC na cultura. Em algumas modalidades, as células da cocultura ex vivo representam uma fonte de células que são enriquecidas em células T reativas ao tumor.

[00105] Em alguns casos, as células T reativas ao tumor podem ser ainda mais enriquecidas por separação ou seleção de células que ex- pressam um ou mais marcadores de super-regulação, como um mar- cador de ativação, associado a células T reativas ao tumor (a separa- ção ou seleção adicional produzindo uma quarta população de células T das células T reativas ao tumor enriquecidas). Os marcadores de ativação de células T podem incluir marcadores de superfície celular cuja expressão é regulada positivamente ou específica para células T que foram expostas ao antígeno e ativadas. Exemplos de tais marca- dores são descritos abaixo.

[00106] Em modalidades particulares, os métodos fornecidos inclu- em o enriquecimento de uma amostra biológica (proveniente direta- mente de uma amostra in vivo ou de uma cocultura ex vivo com célu- las apresentadoras de antígeno (APCs)) de células T que têm um TCR endógeno que reconhece antígenos associados a tumores, por exem- plo, neoantígenos, como por meio da seleção de células T que são positivas na superfície para um ou mais marcadores de ativação de células T (por exemplo, CD107, CD107a, CD039, CD134, CD137, CD59, CD69, CD90, CD38 ou CD103).

[00107] Em modalidades particulares, uma segunda expansão é realizada em células T enriquecidas ou isoladas da cocultura, tal como após a separação ou seleção de células T reativas ao tumor ou células T que são positivas na superfície para um ou mais marcadores de ati- vação de células T associados ao tumor células T reativas. A segunda expansão envolve a incubação para estimular ainda mais as células T com um (s) agente (s) estimulador (es) de células T, como anticorpo anti-CD3 (por exemplo, OKT3), anticorpo anti-CD28 e citocina (s) re- combinante (s) (por exemplo, IL-2, IL- 7, IL-21 e/ou IL-15). As células T, tais como células T reativas ao tumor ou células T que são positivas na superfície para um ou mais marcadores de ativação de células T associados a células T reativas ao tumor, podem se expandir por um certo número de dias conforme desejado e/ou até um período terapêu- tico a dose ou a dose da colheita for atendida. A composição de célu- las T expandidas pode então ser colhida e formulada para administra- ção a um indivíduo para tratamento de um câncer no indivíduo.

[00108] Em modalidades particulares, os métodos fornecidos inclu- em, mas não estão limitados às etapas de (1) identificar, obter ou ge- rar uma pluralidade de peptídeos que contêm neoepítopos específicos para o tumor de um indivíduo (2) obter uma população de células T obtidas de um indivíduo doador, como a partir de um tumor ressecado ou selecionando diretamente células T de uma amostra biológica, por exemplo, um tumor, sangue, medula óssea, nódulo linfático, timo ou outro tecido ou fluidos (primeira população de células T); (3) realizar uma primeira expansão estimulando ou ativando a primeira população de células T com um (s) agente (s) estimulador (es) de células T, como uma ou mais citocinas recombinantes de IL-2, IL-7, IL-21 e/ou IL -15 (por exemplo, incluindo pelo menos IL-2 recombinante) para produzir uma segunda população de células T contendo células T expandidas ou estimuladas, (3) cocultura da segunda população contendo células T estimuladas na presença de células apresentadoras de antígeno (APCs) que foram contatados ou expostos a um ou mais da pluralida- de de peptídeos sob condições em que as APCs apresentam um ou mais peptídeos não nativos associados a MHC para produzir uma ter- ceira população de células T; e (5) enriquecimento, a partir da terceira população de células T, células T contendo um TCR endógeno que são reativos a peptídeos presentes em células apresentadoras de an-

tígeno (APCs) para produzir uma quarta população de células T. Em alguns aspectos, as células T contendo um TCR endógeno são enri- quecidas separando as células apresentadoras de antígeno da popu- lação de células T. Alternativamente ou adicionalmente, tais células são enriquecidas selecionando células T que são positivas na superfí- cie para um ou mais marcadores de ativação associados a células T reativas ao tumor. Em modalidades particulares, uma segunda expan- são é realizada em células T enriquecidas ou isoladas da cocultura, tal como após a separação ou seleção de células T reativas ao tumor ou células T que são positivas na superfície para um ou mais marcadores de ativação de células T associados ao tumor células T reativas. A se- gunda expansão envolve a incubação para estimular ainda mais as células T com um (s) agente (s) estimulador (es) de células T, como anticorpo anti-CD3 (por exemplo, OKT3), anticorpo anti-CD28 e citoci- na (s) recombinante (s) (por exemplo, IL-2, IL-7, IL-21 e/ou IL-15).

[00109] Em modalidades dos métodos fornecidos, uma ou mais das etapas podem ser realizadas em meio sem soro. Em uma modalidade, o meio sem soro é OpTmizer CTS (LifeTech), Immunocult XF (tecnolo- gias Stemcell), CellGro (CellGenix), TexMacs (Miltenyi), Stemline (Sigma), Xvivo15 (Lonza), PrimeXV (Irvine Scientific) ou Stem XVivo (sistemas RandD). O meio sem soro pode ser suplementado com um substituto de soro, como ICSR (substituição de soro de célula imune) da LifeTech. O nível de substituto do soro (por exemplo, ICSR) pode ser, por exemplo, até 5%, por exemplo, cerca de 1%, 2%, 3%, 4% ou 5%. Em algumas modalidades, o meio sem soro contém 0,5 mM a 5 mM de uma forma dipeptídica de L-glutamina, como L-alanil-L- glutamina (Glutamax™). Em algumas modalidades, a concentração da forma dipeptídica de L-glutamina, tal como L-alanil-L-glutamina, é de ou cerca de 0,5 mM a 5 mM, 0,5 mM a 4 mM, 0,5 mM a 3 mM, 0,5 mM a 2 mM, 0,5 mM a 1 mM, 1 mM a 5 mM, 1 mM a 4 mM, 1 mM a 3 mM,

1 mM a 2 mM, 2 mM a 5 mM, 2 mM a 4 mM, 2 mM a 3 mM, 3 mM a 5 mM, 3 mM a 4 mM or 4 mM a 5 mM, cada um inclusive. Em algumas modalidades, a concentração da forma dipeptídica de L-glutamina, tal como L-alanil-L-glutamina, é ou é cerca de 2 mM.

[00110] Em conexão com os métodos fornecidos, os métodos resul- tam no enriquecimento de células T contendo um TCR endógeno es- pecífico para um antígeno associado a tumor para maximizar a expan- são de células terapêuticas desejadas. As células T, como células T reativas ao tumor ou células T que são de superfície positivo para um ou mais marcadores de super-regulação de células T ou marcadores de ativação associados a células T reativas ao tumor, podem se ex- pandir por um certo número de dias conforme desejado e/ou até que uma dose terapêutica ou dose de colheita seja alcançada. A composi- ção de células T expandidas pode então ser colhida e formulada para administração a um indivíduo para tratamento de um câncer no indiví- duo. A. Identificação de neoepítopos e geração de peptídeos

[00111] Os métodos fornecidos incluem uma etapa de geração ou identificação in silico de uma pluralidade de peptídeos (também referi- dos como “P” ou “n-mers”) que contêm pelo menos um neoepítopo de câncer específico do câncer e uma etapa adicional de filtragem in silico dos peptídeos para obter um subconjunto de sequências de neoepíto- pos. Em algumas modalidades, pelo menos um peptídeo sintético é preparado usando informações de sequência do subconjunto de se- quências de neoepítopos e o peptídeo sintético é então empregado em métodos para enriquecer células T reativas ao tumor de acordo com os métodos fornecidos.

[00112] Em algumas modalidades, o neoepítopo do câncer especí- fico do câncer é determinado pela identificação ou isolamento de um antígeno associado ao tumor ou sequência peptídica do mesmo a par-

tir de uma célula cancerosa de um indivíduo. A célula cancerosa pode ser obtida a partir de qualquer amostra corporal derivada de um paci- ente que contém ou se espera que contenha células tumorais ou can- cerosas. A amostra corporal pode ser qualquer amostra de tecido, tal como sangue, uma amostra de tecido obtida do tumor primário ou de metástases tumorais, uma amostra de nódulo linfático ou qualquer ou- tra amostra contendo células cancerosas ou de tumor.

[00113] Em algumas modalidades, o tumor é um tumor hematológi- co. Exemplos não limitantes de tumores hematológicos incluem leu- cemias, incluindo leucemias agudas (tais como leucemia aguda positi- va lq23, leucemia linfocítica aguda, leucemia mielocítica aguda, leu- cemia mieloide aguda e mieloblástica, promielocítica, mielomonocítica, monocítica e eritroleucemia crônica (tais como leucemia crônica), co- mo leucemia mielocítica crônica (granulocítica), leucemia mieloide crô- nica e leucemia linfocítica crônica), policitemia vera, linfoma, doença de Hodgkin, linfoma não-Hodgkin (formas indolentes e de alto grau), mieloma múltiplo, síndrome macroglobulínica de cadeia pesada de Waldenstrom, leucemia de células cabeludas e mielodisplasia.

[00114] Em algumas modalidades, o tumor é um tumor sólido. Exemplos não limitantes de tumores sólidos, como sarcomas e carci- nomas, incluem fibrossarcoma, mixossarcoma, lipossarcoma, condros- sarcoma, sarcoma osteogênico e outros sarcomas, sinovioma, meso- telioma, tumor de Ewing, leiomiossarcoma, rabdomiossarcoma, carci- noma de cólon, malignidade linfoide, câncer pancreático, câncer de mama (incluindo carcinoma basal de mama, carcinoma ductal e carci- noma lobular de mama), cânceres de pulmão, câncer de ovário, cân- cer de próstata, carcinoma hepatocelular, carcinoma de células esca- mosas, carcinoma de células basais, adenocarcinoma, carcinoma de glândula sudorípara, carcinoma medular da tireoide, carcinoma papilar da tireoide, carcinoma de glândula sebácea de feocromocitomas, car-

cinoma papilar, adenocarcinomas papilares, carcinoma medular, carci- noma broncogênico, carcinoma de células renais, hepatoma, carcino- ma de ducto biliar, coriocarcinoma, tumor de Wilms, câncer cervical, tumor testicular, seminoma, carcinoma de bexiga, tumores do CNS (tal como um glioma, astrocitoma, meduloblastoma, craniofaringioma, ependimoma, pinealoma, hemangioblastoma, neuroma acústico, oli- godendroglioma, meningioma, melanoma, neuroblastoma e retinoblas- toma). Em vários exemplos, um tumor é melanoma, câncer de pulmão, câncer de mama linfoma ou câncer de cólon.

[00115] Em algumas modalidades, o câncer é um câncer gastroin- testinal envolvendo um câncer do trato gastrointestinal (trato GI), inclu- indo cânceres ou do trato digestivo superior ou inferior, ou um órgão acessório da digestão, como esôfago, estômago, sistema biliar, pân- creas, intestino delgado, intestino grosso, reto ou ânus. Em algumas modalidades, o câncer é um câncer espfágico, câncer de estômago (gástrico), câncer de pâncreas, câncer de fígado (carcinoma hepatoce- lular), câncer de vesícula biliar, câncer do tecido linfoide associado à mucosa (linfoma MALT), câncer da árvore biliar, câncer colorretal (in- cluindo câncer de cólon, câncer de reto ou ambos), câncer anal ou um tumor carcinoide gastrointestinal. Em modalidades particulares, o cân- cer é um câncer colorretal.

[00116] Em algumas modalidades, o tumor é de um câncer de ma- ma, como um carcinoma ductal ou um carcinoma lobular. Em algumas modalidades, o tumor é de um câncer de próstata. Em algumas moda- lidades, o tumor é de um câncer de pele, como um carcinoma de célu- las basais, um carcinoma de células escamosas, um sarcoma de Ka- posi ou um melanoma. Em algumas modalidades, o tumor é de um câncer de pulmão, como um adenocarcinoma, um carcinoma bron- quiolaveolar, um carcinoma de células grandes ou um carcinoma de células pequenas. Em algumas modalidades, o tumor é de um câncer cerebral, como um glioblastoma ou meningioma. Em algumas modali- dades, o tumor é de um câncer gastrointestinal, como qualquer um descrito acima. Em algumas modalidades, o tumor é de um câncer de cólon. Em algumas modalidades, o tumor é de um câncer de fígado, como um carcinoma hepatocelular. Em algumas modalidades, o tumor é de um câncer pancreático. Em algumas modalidades, o tumor é de um câncer renal, como um carcinoma de células renais. Em algumas modalidades, o tumor é de um câncer testicular.

[00117] Em algumas modalidades, o câncer não é um melanoma. O melanoma é um câncer que geralmente apresenta uma alta taxa de mutação. A alta carga de mutação tumoral foi considerada um marca- dor de prognóstico particularmente desejado para o sucesso relacio- nado ao tratamento com uma imunoterapia direcionada a neoantíge- nos tumorais (Simpson et al., Journal of Clinical Oncology 2017, 35:15_suppl, 9567-9567; McGranahan et al. Science 2016, 351:1463- 1469). Em algumas modalidades, os métodos fornecidos podem ser usados em cânceres que têm uma carga de mutação tumoral mais baixa, uma vez que os métodos são realizados para enriquecer ativa- mente (em oposição a passivamente) para células T reativas ao tumor.

[00118] Em algumas modalidades, o indivíduo é um indivíduo com uma carga mutacional tumoral (TMB) de menos de 8 mutações. O TMB inclui o número de mutações não sinônimas por tumor. Em algu- mas modalidades, TMB pode ser calculado contando o número de mu- tações sinônimas e não sinônimas em uma região de 0,8 a 1,2 mega- base (Mb) e relatando o resultado como mutações/Mb. Em algumas modalidades, TMB pode ser determinado por sequenciamento de pró- xima geração (NGS) em amostras de tecido tumoral. Em alguns casos, o sequenciamento completo do exoma pode ser usado ou a filtragem computacional do status da linha germinativa pode ser usada (Chal- mers et al. Genome Med 2017 9:34). Em algumas modalidades, o indi-

víduo tem uma TMB de menos que ou cerca de 60 mutações/Mb, tal como menos que ou cerca de 55 mutações/Mb, menos que ou cerca de 50 mutações/Mb, menos que ou cerca de 45 mutações/Mb, menos do que ou cerca de 40 mutações/Mb, menos do que ou cerca de 30 mutações/Mb, menos do que ou cerca de 25 mutações por Mb, ou menos do que ou cerca de 20 mutações/Mb, ou qualquer valor entre qualquer um dos acima expostos. Em algumas modalidades, o indiví- duo tem uma TMB de menos do que ou cerca de 41 mutações/Mb, menos do que ou cerca de 40 mutações/Mb, menos do que ou cerca de 39 mutações/Mb, menos do que ou cerca de 38 mutações/Mb, me- nos do que ou cerca de 37 mutações/Mb ou menos.

[00119] Em algumas modalidades, o peptídeo (P) é um antígeno associado a tumor derivado de condições pré-malignas, como varian- tes de carcinoma in situ ou neoplasia intraepitelial vulvar, neoplasia intraepitelial cervical ou neoplasia intraepitelial vaginal.

[00120] Em alguns aspectos, o ácido nucleico de tais células do tu- mor ou câncer é obtido e sequenciado. Em modalidades, a região de codificação de proteína de genes em um genoma é obtida, tal como por análise ômica, tal como por análise de dados de sequenciamento genômico completo, dados de sequenciamento de exoma e/ou dados de transcriptoma. Para identificar sequências específicas de tumor, os dados de sequenciamento podem ser comparados a dados de se- quenciamento de referência, como dados obtidos de uma célula nor- mal ou célula não cancerosa do mesmo indivíduo. Em algumas moda- lidades, métodos de sequenciamento de próxima geração (NGS) são usados.

[00121] Em algumas modalidades, os métodos incluem uma etapa de uso de dados ômicos normais correspondentes de um tumor. Em tais métodos, a análise in silico envolve uma análise ômica para identi- ficar mutações no tumor em relação ao tecido normal do mesmo paci-

ente, como tecido não doente do mesmo paciente. É geralmente con- siderado que os dados ômicos normais correspondentes são dados de sequenciamento genômico completo, dados de sequenciamento de exoma e/ou dados de transcriptoma, e que os dados ômicos normais correspondentes são comparados com o normal antes do tratamento do paciente. Em uma modalidade particular, sequenciamento de exoma completo é realizado em tecido saudável e doente para identifi- car mutações somáticas associadas ao tumor.

[00122] Em algumas modalidades, os dados ômicos são obtidos de uma ou mais amostras de biópsia de paciente seguindo o protocolo de processamento de tecido padrão e protocolos de sequenciamento. Em modalidades particulares, os dados são dados de tumor combinados com o paciente (por exemplo, tumor versus o mesmo paciente nor- mal). Em alguns casos, não combinados ou combinados contra outra referência (por exemplo, mesmo paciente normal anterior ou tumor an- terior do mesmo paciente, ou homo statisticus) também são conside- rados adequados para uso neste documento. Os dados ômicos podem ser dados ômicos novos ou dados ômicos que foram obtidos de um procedimento anterior (ou mesmo de um paciente diferente). Por exemplo, os neoepítopos podem ser identificados a partir de um tumor de paciente em uma primeira etapa por análise de genoma completo e/ou exoma de uma biópsia tumoral (ou biópsia linfática ou biópsia de um sítio metastático) e tecido normal correspondente (ou seja, tecido não doente de o mesmo paciente, como sangue periférico). Em algu- mas modalidades, a análise genômica pode ser processada por meio de comparação síncrona guiada por localização das informações ômi- cas assim obtidas.

[00123] A análise genômica pode ser realizada por qualquer núme- ro de métodos analíticos. Em modalidades particulares, os métodos incluem WGS (sequenciamento do genoma completo) e sequencia-

mento de exoma de ambos tumor e amostra normal combinada usan- do sequenciamento de próxima geração, como métodos de sequenci- amento massivamente paralelos, sequenciamento de torrente de íons, pirossequenciamento. A análise computacional dos dados de sequên- cia pode ser realizada de várias maneiras. Em algumas modalidades, o formato de dados está no formato SAM, BAM, GAR ou VCF. Como um exemplo, a análise pode ser realizada in silico por alinhamento síncrono guiado por localização de amostras de tumor e normais co- mo, por exemplo, descrito em US 2012/0059670A1 e US 2012/0066001 Al usando arquivos BAM e servidores BAM. Formatos de arquivo alternativos para análise de sequência (por exemplo, SAM, GAR, FASTA, etc.) também são considerados.

[00124] Em algumas das modalidades, os peptídeos (P) que com- preendem neoantígenos decorrentes de uma mutação de sentido in- correto abrangem a mudança de aminoácido codificada por 1 ou mais polimorfismos de nucleotídeo. Os peptídeos (P) compreendendo neo- antígenos que surgem de mutações por mudança da matriz de leitura, variantes de sítio de splice, inserções, inversões e deleções devem abranger as novas sequências de peptídeos e junções de novas se- quências de peptídeos. Os peptídeos (P) que compreendem neoantí- genos com novas modificações pós-translacionais devem abranger os aminoácidos que suportam a (s) modificação (ões) pós-translacional (is), tais como um fosfato ou glicano.

[00125] Uma vez que essas mutações são identificadas, os neoepí- topos são então identificados. Neoepítopos são peptídeos mutantes que são reconhecidos pelas células T de um paciente. Esses neoepí- topos devem ser apresentados por um tumor ou célula apresentadora de antígeno pelo complexo MHC e, então, ser reconhecidos por um TCR na célula T. Em algumas modalidades, os métodos fornecidos incluem uma etapa de cálculo de um ou mais neoepítopos para definir neoepítopos que são específicos para o tumor e o paciente. Conse- quentemente, deve-se reconhecer que neoepítopos específicos do pa- ciente e do câncer podem ser identificados a partir de informações ômicas em um ambiente exclusivamente in silico que, em última análi- se, prevê epítopos potenciais que são únicos para o paciente e o tipo de tumor. Em aspectos particulares, os neoepítopos de câncer assim identificados são únicos para o paciente e o câncer específico no paci- ente (por exemplo, tendo uma frequência de menos de 0,1% de todos os neoepítopos e, mais tipicamente, menos de 0,01% em uma popula- ção de pacientes com câncer diagnosticados com o mesmo câncer), mas que os neoepítopos de câncer assim identificados têm uma alta probabilidade de se apresentarem em um tumor.

[00126] Em algumas das modalidades, o comprimento do peptídeo (P) depende da aplicação específica e está tipicamente entre cerca de 5 a cerca de 50 aminoácidos. Em modalidades preferidas, o peptídeo (P) está entre cerca de 7 a 35 aminoácidos, por exemplo, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34 ou 35 aminoácidos. Em alguns aspectos, os méto- dos podem ser realizados com um peptídeo individual que inclui uma (s) alteração (ões) (por exemplo, mutações) nas sequências de ami- noácidos. Em alguns aspectos, os métodos podem ser realizados com um pool de peptídeos, onde os peptídeos do pool contêm uma (s) alte- ração (ões) (por exemplo, mutações) nas sequências de aminoácidos. O pool de peptídeos pode incluir dezenas a centenas de peptídeos in- dividuais. Em alguns casos, o pool de peptídeos inclui 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 ou mais peptídeos individuais, ou qualquer valor entre qual- quer um dos anteriores. O pool de peptídeos pode representar um neo-antígeno ou pode representar vários neo-antígenos. Em alguns casos, um pool de peptídeos pode incluir vários peptídeos sobrepostos do mesmo neoantígeno. Assim, para um antígeno associado a tumor, o antígeno pode ser dividido em 7 a 35 aminoácidos, por exemplo, 25 aminoácidos, peptídeos (P) em que cada peptídeo (P) contém uma composição única de aminoácidos; ou, os peptídeos (P) podem ser conjuntos de peptídeos sobrepostos em que um antígeno é dividido em um número conjunto de 7 a 35 aminoácidos, por exemplo, 25 ami- noácidos, peptídeos (P) que têm sequências sobrepostas. Em alguns casos, cada um dos peptídeos do pool de sobreposição de um antíge- no pode ser compensado por um número definido de resíduos de ami- noácidos, como 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 15 ou 15 aminoácidos. Em algumas modalidades, cada um dos peptídeos do pool de sobreposi- ção de um antígeno é compensado por 10 aminoácidos. Em algumas modalidades, cada um dos peptídeos do pool de sobreposição de um antígeno é compensado por 12 aminoácidos. Por exemplo, um conjun- to de peptídeos sobrepostos compreendendo um antígeno de 100 aminoácidos pode ser dividido em oito peptídeos de 25 aminoácidos (P) que são cada um deslocado por 12 aminoácidos (ou seja, cada peptídeo de 25 aminoácidos subsequente compreendendo uma se- quência de peptídeo de 100 aminoácidos começa na posição do 13º aminoácido do peptídeo anterior). Os versados na técnica entendem que existem muitas permutações para gerar um pool de peptídeos a partir de um antígeno.

[00127] As sequências de neoepítopos, conforme consideradas neste documento, podem ser definidas como trechos de sequência com comprimento relativamente curto (por exemplo, 5-30 meros, mais tipicamente 7-11 meros ou 12-25 meros), em que tais trechos incluem a (s) mudança (s) (por exemplo, mutações) nas sequências de amino- ácidos. Mais tipicamente, a (s) alteração (ões) está/estão localizadas centralmente ou perto do centro (por exemplo, menos do que 4, ou menos do que 5, ou menos do que 6 aminoácidos da posição central).

Em aspectos particulares, as sequências de neoepítopo consideradas neste documento incluirão especialmente aquelas em que um único aminoácido é trocado em relação à sequência normal combinada e em que a posição do aminoácido alterado está localizada centralmente, ou perto do centro da sequência de neoepítopo (por exemplo, em um 9- mer, o aminoácido alterado está na posição 2, 3, 4 ou 5, e mais tipi- camente na posição 3, 4 ou 5, e mais tipicamente na posição 4 ou 5). Deve ser apreciado que uma única alteração de aminoácido pode ser apresentada em numerosas sequências de neoepítopos que incluem o aminoácido alterado, dependendo da posição do aminoácido alterado.

[00128] Em modalidades particulares, os neoepítopos serão calcu- lados para ter um comprimento entre 2-50 aminoácidos, mais tipica- mente entre 5-30 aminoácidos e mais tipicamente entre 9-15 aminoá- cidos. Por exemplo, onde o epítopo deve ser apresentado pelo com- plexo MHC-I, um comprimento de epítopo típico será de cerca de 8-11 aminoácidos, enquanto o epítopo típico para apresentação via com- plexo MHC-II terá um comprimento de cerca de 13-17 aminoácidos. Como será prontamente apreciado, uma vez que a posição do amino- ácido alterado no neoepítopo pode ser diferente de central, a sequên- cia peptídica real e com isso a topologia real do neoepítopo podem variar consideravelmente. Além disso, quando o neoepítopo é apre- sentado a uma célula imunocompetente (ou outra) como um peptídeo sintético, deve ser apreciado que o peptídeo sintético pode ser signifi- cativamente mais longo do que a porção do peptídeo que é finalmente ligada pelo sistema MHC-I ou MHC-II para permitir o processamento proteolítico na célula. Por exemplo, os peptídeos sintéticos considera- dos podem, portanto, ter entre 8 e 15 aminoácidos a montante e a ju- sante do aminoácido alterado.

[00129] Vários algoritmos foram desenvolvidos e podem ser usados para mapear epítopos de células T (tanto MHC Classe I quanto restri-

tos a Classe II) dentro de moléculas de proteínas de várias origens. Em algumas modalidades, muitos programas utilizam a disponibilidade da matriz de afinidade de ligação de peptídeo-MHC em grande escala de medições experimentais para treinar classificadores baseados em aprendizado de máquina (ML) para distinguir ligantes de MHC de não ligantes (veja, por exemplo, Zhao et al. (2018) PLoS Comput Biol 14 (11): e1006457). Métodos preditivos exemplares para MHC classe I (por exemplo, 9-mer) incluem smm, smmpmbec, ann (NetMHC3.4), NetMHC4, PickPocket, consenso, NetMHCpan2.8, NetMHCpan3, NetMHCpan4, NetMHCcons, mhcflurry, mhcflurry_pan, ou Mix- MHCpred. Métodos preditores exemplares para MHC classe II (por exemplo, 15-mer) incluem NetMHCIIpan, NetMHCII2.3, nn_align, smm_align, consensus, comblib, tepitope, ou mhcflurry. Qualquer um desses métodos pode ser usado.

[00130] Em modalidades em que o peptídeo sintético é usado para ligação direta ao MHC-I, o comprimento total será entre 8 e 10 amino- ácidos. Em modalidades, onde o peptídeo sintético é usado para liga- ção direta ao MHC-II, o comprimento total será entre 12 e 25 aminoá- cidos, tal como entre 14 e 20 aminoácidos. Em alguns casos, onde o peptídeo sintético é processado na célula (normalmente via processa- mento de proteassoma) antes da apresentação de MHC, o compri- mento total será tipicamente entre 10 e 40 aminoácidos, com o amino- ácido alterado em ou próximo a uma posição central no peptídeo sinté- tico. Em algumas modalidades, um peptídeo para ligação a MHC-I é um 9-mer. Em algumas modalidades, um peptídeo para ligação a MHC-II é um 23-mer. Em algumas modalidades, um peptídeo para li- gação ao MHC-II é um 25-mer.

[00131] Como exemplo, um peptídeo (P) pode incluir 0-25 aminoá- cidos em ambos os lados que flanqueiam a mudança de aminoácido ou nova junção que surge devido a uma mutação. Em uma modalida-

de, o peptídeo (P) é uma sequência de neoantígeno que compreende os 12 aminoácidos de cada lado que flanqueiam a alteração de ami- noácidos que surge de um único polimorfismo de nucleotídeo, por exemplo, um peptídeo de 25 aminoácidos, em que o 13º aminoácido é o resíduo de aminoácido resultante do polimorfismo de nucleotídeo único. Em algumas modalidades, o peptídeo (P) é uma sequência de neoantígeno que compreende os 12 aminoácidos de cada lado que flanqueiam um aminoácido com uma nova modificação pós- translacionais, por exemplo, um peptídeo de 25 aminoácidos, em que o 13º aminoácido é o resíduo de aminoácido resultante do novo local de modificação pós-translacionais. Em outras modalidades, o peptídeo (P) é uma sequência de neoantígeno que compreende 0-12 aminoáci- dos em ambos os lados que flanqueiam uma nova junção criada por uma inserção, deleção ou inversão. Em alguns casos, o peptídeo (P) que compreende neoantígenos resultantes de novas sequências pode abranger toda a nova sequência, incluindo 0-25 aminoácidos em am- bos os lados de novas junções que também podem surgir.

[00132] Em algumas modalidades, uma análise posterior a jusante pode ser realizada nas diferenças de sequência assim identificadas para identificar aquelas que levam a uma nova sequência de peptídeo com base no câncer e na mutação específica do paciente. Neoepíto- pos podem, portanto, ser identificados considerando o tipo (por exem- plo, deleção, inserção, transversão, transição, translocação) e o im- pacto da mutação (por exemplo, sem sentido, de sentido incorreto, mudança da matriz de leitura, etc.), e podem, como tal, servir como um filtro de conteúdo através de quais mutações silenciosas e outras não relevantes (por exemplo, não expressas) são eliminadas.

[00133] Em algumas modalidades, os neoepítopos identificados po- dem ser filtrados in silico contra um tipo HLA de paciente identificado. Acredita-se que tal correspondência de HLA assegure a forte ligação dos neoepítopos ao complexo MHC-I de células nucleadas e ao com- plexo MHC-II de células apresentadoras de antígenos específicos. Pensa-se, em particular, que ter como alvo ambos os sistemas de apresentação de antígeno produzem uma resposta imune terapeuti- camente eficaz e durável envolvendo as ramificações celular e humo- ral do sistema imune. Também deve ser apreciado que os neoepítopos compatíveis com HLA assim identificados podem ser validados bio- quimicamente in vitro.

[00134] A determinação de HLA para MHC-I e MHC-II pode ser feita usando vários métodos. Em algumas modalidades, o tipo HLA pode ser previsto a partir de dados ômicos in silico usando uma sequência de referência contendo a maioria ou todos os tipos de HLA conhecidos e/ou comuns. Por exemplo, o tipo HLA de um paciente é verificado (usando química úmida ou determinação in silico), e uma solução es- trutural para o tipo HLA é calculada ou obtida de um banco de dados, que é então usado como um modelo de docking in silico para determi- nar a afinidade de ligação do neoepítopo à solução estrutural de HLA. Os sistemas adequados para a determinação de afinidades de ligação incluem a plataforma NetMHC (veja, por exemplo, Nucleic Acids Res. 1 de Julho de 2008; 36 (Web Server issue): W509-W512.), HLAMatch- maker (http: // www.epitopes.net/downloads. html) e IEDB Analysis Resource (http://tools.immuneepitope.org/ mhcii /). Neoepítopos com alta afinidade (por exemplo, menos de 100 nM, menos de 75 nM, me- nos de 50 nM para MHC-I; menos de 500 nM, menos de 300 nM, me- nos de 100 nM para MHC-II) contra o tipo HLA previamente determi- nado são então selecionados. Ao calcular a afinidade mais elevada, as modificações aos neoepítopos podem ser implementadas adicionando modificações N- e/ou C-terminais ao epítopo para aumentar ainda mais a ligação de um neoepítopo sintético ao tipo HLA do paciente. Assim, os neoepítopos podem ser nativos conforme identificados ou ainda modificados para melhor combinar um determinado tipo HLA. Em algumas modalidades, os neoepítopos podem ser pontua- dos/classificados com base na frequência de alelo multiplicada pelos transcritos por milhão de número para obter uma pontuação de proba- bilidade. Essa pontuação pode então ser aumentada usando informa- ções de HLA e afinidade de ligação calculada ou real para o tipo HLA do paciente.

[00135] Entre as modalidades fornecidas estão modalidades nas quais os neoepítopos são comparados com um banco de dados que contém sequências humanas conhecidas para evitar o uso de uma se- quência idêntica a humanos.

[00136] Após a identificação in silico de sequências de neoepítopos adequadas, os peptídeos sintéticos correspondentes são então prepa- rados in vitro (por exemplo, usando síntese em fase sólida). Em moda- lidades particulares, uma biblioteca de peptídeos sintéticos é prepara- da representando uma pluralidade de neoepítopos diferentes do indi- víduo. A biblioteca pode incluir 100, 1000, 10000 ou mais peptídeos diferentes. Para obter um anticorpo sintético contra o (s) neoepítopo (s) identificado (s), é considerado que o epítopo identificado é prepa- rado in vitro para produzir um peptídeo sintético.

[00137] Vários métodos podem ser usados para preparar peptí- deos sintéticos. Por exemplo, os peptídeos com sequências de neo- epítopos de câncer podem ser preparados em uma fase sólida (por exemplo, usando síntese de Merrified), via síntese em fase líquida ou a partir de fragmentos de peptídeos menores. Os epítopos de peptí- deos podem ser obtidos por síntese química utilizando um sintetizador de peptídeos automatizado disponível comercialmente. Em algumas modalidades, os peptídeos podem ser sintetizados, por exemplo, usando o modo Fmoc-poliamida de síntese de peptídeos em fase sóli- da que é descrito por Lu et al (1981) .J. Org. Chem. 46,3433 e as refe-

rências aí contidas. Em alguns aspectos, os peptídeos podem ser pro- duzidos pela expressão de um ácido nucleico recombinante em um hospedeiro adequado e com um sistema de expressão adequado. Em alguns aspectos, os métodos recombinantes podem ser usados onde múltiplos neoepítopos estão em uma única cadeia de peptídeo, tal co- mo com espaçadores entre neoepítopos ou sítios de clivagem).

[00138] Os peptídeos podem ser purificados por qualquer um, ou uma combinação de técnicas, tais como recristalização, cromatografia de exclusão por tamanho, cromatografia de permuta iônica, cromato- grafia de interação hidrofóbica e cromatografia líquida de alto desem- penho de fase reversa usando, por exemplo, separação por gradiente de acetonitrila/água. Em algumas modalidades, os peptídeos podem ser precipitados e posteriormente purificados, por exemplo, por croma- tografia líquida de alto desempenho (HPLC). A análise de peptídeos pode ser realizada usando cromatografia em camada fina, eletrofore- se, em particular eletroforese capilar, extração de fase sólida (CSPE), cromatografia líquida de alto desempenho de fase reversa, análise de aminoácidos após hidrólise ácida e por bombardeamento de átomo rápido (FAB) de massa análise espectrométrica, bem como análise espectrométrica de massa MALDI e ESI-Q-TOF. B. Seleção e Estimulação de uma População de Células T

[00139] Os métodos fornecidos incluem a obtenção e enriquecimen- to ou seleção de uma população de células T de uma amostra biológi- ca para uso como uma primeira população ou população de entrada de células T. Em alguns casos, a primeira população de células T é aquela que é conhecida ou provavelmente contém células T reativas a um antígeno tumoral ou que são capazes de ser reativas a um antíge- no tumoral, tal como após uma cocultura ex vivo com uma fonte autó- loga de antígeno tumoral. Por exemplo, normalmente a primeira popu- lação de células T é de uma amostra biológica de um tumor ou de um indivíduo conhecido ou com probabilidade de ter um tumor. Em moda- lidades particulares, a primeira população de células T é ainda estimu- lada com um ou mais agentes estimuladores de células T (por exem- plo, uma ou mais citocinas recombinantes, como IL-2) para produzir uma segunda população ou população estimulada de células T con- tendo células T que se expandiram após a estimulação.

[00140] Em algumas modalidades, a incubação com o (s) agente (s) estimulador (es) de células T é realizada diretamente em uma entrada ou primeira população de células T selecionadas a partir de uma amostra biológica de um indivíduo, em que a população de células T selecionada a partir da amostra biológica (por exemplo, células T autó- logas do indivíduo) é incubado com o (s) agente (s) estimulador (es) de células T. Em outras modalidades, a população de entrada de célu- las T inclui células T que provavelmente são ou são suspeitas de se- rem células T reativas ao tumor, em que tais células são primeiro sele- cionadas a partir de uma população de células T selecionadas a partir de uma amostra biológica de um indivíduo por selecionar células posi- tivas para um marcador de superfície que é regulado positivamente em células T ativadas (por exemplo, 4-1BB ou OX40). Em tais modalida- des, a incubação com o (s) agente (s) estimulador (es) de células T é realizada após o enriquecimento para a população de células T com- preendendo células T reativas ao tumor. Nas modalidades fornecidas, a incubação com o (s) agente (s) estimulador (es) de células T é reali- zada antes da cocultura de tais células T (células T estimuladas) com os APCs/neoepítopos peptídicos.

[00141] Em alguns casos, as condições para estimular as células T por cultura com um ou mais agentes estimuladores de células T resul- tam na ativação das células e expansão ou crescimento de células T presentes na primeira população de células T ou na população de en- trada. Em algumas modalidades, as condições para estimular as célu-

las T com um ou mais agentes estimuladores de células T podem in- cluir a cultura das células T sob condições que resultam na expansão em massa das células T.

[00142] Nos métodos fornecidos, a composição estimulada de célu- las T é então empregada em etapas subsequentes a jusante para en- riquecimento e expansão de células T reativas ao tumor, incluindo eta- pas que incluem a cocultura das células T estimuladas com células apresentadoras de antígeno (APCs) na presença de antígenos peptí- dicos de neopítopos de células T (mutados) para produzir, produzir ou retirar células T que são células T reativas ao tumor. Em modalidades particulares, os métodos fornecidos também podem incluir uma etapa para selecionar ou enriquecer células T reativas a um antígeno tumoral (células T reativas ao tumor), após a cocultura de células T com APCs/neoepítopos peptídicos. As populações de células T reativas ao tumor podem ser cultivadas em condições de expansão, como para produzir uma composição de células T terapêutica.

[00143] Em aspectos de qualquer um dos métodos fornecidos, a entrada ou primeira população de células T é incubada na presença de um (s) agente (s) estimulador (es) de células T. Em modalidades parti- culares, a incubação é realizada sob condições em que o (s) agente (s) estimulador (es) de células T ativam ou estimulam as células ou promovem a expansão das células T presentes na entrada ou na pri- meira população de células T.

[00144] Em algumas modalidades, o (s) agente (s) estimulador (es) de células T incluem uma citocina estimuladora de células T recombi- nantes, como IL-2, IL-7, IL-15 e/ou IL-21. Em algumas modalidades, a citocina estimuladora de células T inclui IL-2, sozinha ou em combina- ção com outra citocina de entre IL-7, IL-15 e/ou IL-21. Em algumas modalidades, as citocinas estimuladoras de células T são IL-7 e IL-15.

[00145] Em algumas modalidades, o (s) estimulador (es) de células

T pode (m) incluir um agente ou agentes que envolvem CD3 e/ou uma molécula coestimuladora, como CD28. O (s) agente (s) estimulador (es) de células T podem incluir um anticorpo anti-CD3, tal como OKT3 e/ou um agente anti-CD28 (apresentado por APCs ou como um anti- corpo solúvel). Nas modalidades, antes e/ou durante pelo menos uma porção da cocultura de células T com APCs, as células T selecionadas da amostra biológica (ou seja, entrada ou primeira população) são in- cubados na presença de um (s) agente (s) estimulador (es) de células T, como um anticorpo anti-CD3 (por exemplo, OKT3)/anti-CD28. As- sim, antes da cocultura na presença de APCs ou após a seleção de células reativas, as células T são incubadas com um ou mais agentes estimuladores de células T de linfócitos, tais como, mas não se limi- tando a, anticorpo anti-CD3 (por exemplo, OKT3) e anti-CD28 (apre- sentado por APC's ou como anticorpos solúveis), para produzir uma segunda população de células T que incluem células T ativadas ou estimuladas. Nas modalidades, uma ou mais citocinas recombinantes também estão presentes como agentes estimuladores de células T adicionais durante a incubação.

[00146] Em algumas modalidades, a incubação com um ou mais agentes estimuladores de células T, como um anticorpo anti-CD3/anti- CD28, pode ser continuada por um período de tempo suficiente para ativar ou estimular as células. Em algumas modalidades, a incubação com o (s) agente (s) estimulador (es) de células T, como um anticorpo anti-CD3/anti-CD28, é realizada por ou cerca de 1 dia, tal como geral- mente em ou cerca de 2 dias, 3 dias, 4 dias, 5 dias, 6 dias, 7 dias, 8 dias, 9 dias, 10 dias, 11 dias, 12 dias ou qualquer intervalo de tempo entre qualquer um dos anteriores. Em algumas modalidades, a incu- bação é realizada por 7 a 10 dias. Em algumas modalidades, a incu- bação é de ou cerca de 7 dias. Em algumas modalidades, a incubação é de ou cerca de 8 dias. Em algumas modalidades, a incubação é de ou cerca de 9 dias. Em algumas modalidades, a incubação é de ou cerca de 10 dias. Em algumas modalidades, a incubação com o (s) agente (s) estimulador (es) de células T, como o anticorpo anti- CD3/anti-CD28 e, em alguns casos, uma ou mais citocinas recombi- nantes, é de 12 horas a 96 horas, tal como 24 horas para 48 horas, e geralmente em ou cerca de 48 horas.

[00147] Em algumas modalidades, as células são lavadas uma ou mais vezes durante a cultura para remover os agentes presentes du- rante a incubação ou cultura e/ou para reabastecer o meio de cultura com um ou mais agentes adicionais. Em algumas modalidades, as cé- lulas são lavadas durante a incubação ou cultura para reduzir ou re- mover o (s) agente (s) estimulador (es) de células T antes da conclu- são da cultura.

[00148] Em algumas modalidades, os métodos de estimulação de células T aqui fornecidos incluem incubação com um (s) agente (s) es- timulador (es) de células T a uma temperatura adequada para o cres- cimento de linfócitos T humanos, por exemplo, pelo menos cerca de 25 graus Celsius, geralmente pelo menos cerca de 30 graus, e geral- mente em ou cerca de 37 graus Celsius. Em algumas modalidades, os métodos de cultura ou incubação são realizados em meios sem soro.

1. Seleção de uma População de Células T

[00149] Os métodos fornecidos incluem a seleção ou obtenção de uma população de células T a partir de uma amostra biológica, que pode ser usada como fonte ou entrada de células T para estimulação com um ou mais agentes estimuladores de células T (por exemplo, IL- 2 recombinante ou outras citocinas estimuladoras de células T e/ou anti-CD3/anti-CD28). Em algumas modalidades, as células T são de uma amostra biológica de um indivíduo que é conhecido ou provavel- mente contém células T reativas ao tumor. A amostra biológica coleta- da contém ou é suspeita de conter linfócitos que possuem TCRs en-

dógenos que são reativos a mutações presentes em um tumor.

[00150] Em aspectos de qualquer uma das modalidades fornecidas, é obtida uma amostra biológica adequada de um indivíduo, tal como de um paciente de interesse, ou seja, um paciente com suspeita de ter ou que tem câncer. Em algumas modalidades, a amostra é aquela que é conhecida ou suspeita de conter células T, como células T que po- dem ser ou podem provavelmente expressar um receptor de células T endógeno (TCR) que é específico para, se liga ou reconhece um antí- geno associado a tumor. A amostra pode ser derivada de qualquer fonte inicial que contenha ou seja suspeita de conter tais células T. Em alguns aspectos, as fontes de amostra biológica de interesse incluem, mas não estão limitadas a, muitas fontes fisiológicas diferentes, por exemplo, amostras derivadas de tecido, por exemplo, homogenatos e sangue ou seus derivados.

[00151] Qualquer uma de uma variedade de amostras pode ser usada como uma fonte de células T potencialmente reativas. Embora o tumor e os linfonodos a jusante possam ter a maior frequência de célu- las T reativas (Powell et al., Clin. Cancer. Res., 2014), outras fontes de amostra também podem ser usadas. Em alguns casos, a amostra é uma amostra de tumor, um sítio linfoide terciário, um linfonodo de dre- nagem, sangue periférico ou medula óssea. Em algumas modalidades, a amostra é uma amostra de tumor. Em algumas modalidades, a amostra é uma amostra de linfa. Em algumas modalidades, a amostra é uma amostra de sangue periférico.

[00152] As amostras incluem tecido, fluido e outras amostras retira- das diretamente do indivíduo, bem como amostras resultantes de uma ou mais etapas de processamento, como separação, por exemplo, se- leção ou enriquecimento, centrifugação, lavagem e/ou incubação. A amostra biológica pode ser uma amostra obtida diretamente de uma fonte biológica ou uma amostra que é processada. As amostras bioló-

gicas incluem, mas não estão limitadas a, fluidos corporais, tais como sangue, plasma, soro, fluido cerebrospinal, fluido sinovial, urina e suor, amostras de tecido e órgãos, incluindo amostras processadas deriva- das dos mesmos.

[00153] Em alguns aspectos, a amostra é sangue ou uma amostra derivada de sangue, ou é ou é derivada de um produto de aférese ou leucaferese. Amostras exemplares incluem sangue total, células mo- nonucleares de sangue periférico (PBMCs), leucócitos, medula óssea, timo, biópsia de tecido, tumor, leucemia, linfoma, nódulo linfático, teci- do linfoide associado ao intestino, tecido linfoide associado à mucosa, baço, outros tecidos linfoides, fígado, pulmão, estômago, intestino, có- lon, rim, pâncreas, mama, osso, próstata, colo do útero, testículos, ovários, amígdalas ou outro órgão e/ou células derivadas deles. As amostras incluem, no contexto da terapia celular, por exemplo, terapia celular adotiva, amostras de fontes autólogas e alogênicas.

[00154] Em muitas modalidades, a amostra pode ser derivada de fluidos nos quais as células T de interesse são pelo menos suspeitas de estarem presentes. Em muitas modalidades, uma fonte inicial ade- quada para a amostra é o sangue. Em algumas modalidades, a amos- tra biológica é uma amostra derivada do sangue. A amostra derivada de sangue pode ser derivada de sangue total ou uma fração deste, por exemplo, soro, plasma, etc., onde em muitas modalidades a amostra é derivada de células sanguíneas colhidas de sangue total. Em alguns aspectos, a fonte de amostra contém células mononucleares. Por exemplo, uma amostra biológica é ou contém células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) ou é derivada de PBMCs.

[00155] Em algumas modalidades em que a amostra é uma amos- tra derivada de PBMC, a amostra é geralmente uma amostra derivada de PBMC de fluido. Qualquer metodologia conveniente para a produ- ção de uma amostra de PBMC de fluido pode ser empregada. Em mui-

tas modalidades, a amostra derivada de PBMC de fluido é preparada separando PBMC do sangue total, ou seja, coletando PBMC, por exemplo, por centrifugação (tal como por centrifugação de gradiente de densidade Ficoll-Hypaque, onde protocolos representativos para tais procedimentos de separação são descritos em WO 98/15646 e Patente Norte-americana Nº 5.985.565).

[00156] Em algumas modalidades, a amostra é uma amostra de tumor e, assim, fornece uma fonte de linfócitos infiltrantes de tumor (TILs). Em alguns aspectos, os TILs são células T que deixaram a cor- rente sanguínea de um indivíduo e migraram para ou se infiltraram em um tumor. Em aspectos particulares, os TILs são reativos a um antí- geno tumoral.

[00157] Uma amostra de tumor de paciente pode ser obtida por qualquer um de uma variedade de métodos em que o método obtém uma amostra que contém uma mistura de tumor e células TIL. Em al- gumas modalidades, a amostra do tumor é obtida por ressecção cirúr- gica. Em algumas modalidades, a amostra do tumor é obtida por bióp- sia por agulha. Em geral, a amostra de tumor pode ser de qualquer tumor sólido, incluindo tumores primários, tumores invasivos ou tumo- res metastáticos. A amostra de tumor também pode ser um tumor lí- quido, como um tumor obtido de uma malignidade hematológica. O tumor sólido pode ser de qualquer tipo de câncer, incluindo, mas não se limitando a, mama, pâncreas, próstata, colorretal, pulmão, cérebro, renal, estômago (gastrointestinal) e pele (incluindo, mas não se limi- tando a carcinoma de células escamosas, células basais carcinoma e melanoma). Em modalidades particulares, o tumor é qualquer um con- forme descrito na Seção III. Em algumas modalidades, a amostra de tumor é da mesma fonte de tumor que foi usada para identificar um neoantígeno para a preparação de neoepítopos peptídicos.

[00158] Em modalidades fornecidas, a amostra de tumor obtida é fragmentada em pequenos pedaços de entre a ou cerca de 1 mm3 e a ou cerca de 8 mm3 em tamanho, tal como entre a ou cerca de 1 mm3 e a ou cerca de 6 mm3, entre a ou cerca de 1 mm3 e a ou cerca de 4 mm3, entre a ou cerca de 1 mm3 e a ou cerca de 2 mm3. Em algumas modalidades, o fragmento de tumor é de cerca de 2-3 mm3. Em algu- mas modalidades, o fragmento de tumor é de cerca de 1-2 mm3. Em algumas modalidades, o fragmento do tumor é obtido por fragmenta- ção física, como por dissecção. Em algumas modalidades, o fragmen- to do tumor é obtido por dissecção afiada.

[00159] Em algumas das modalidades fornecidas, a amostra de tu- mor obtida é fragmentada em pequenos pedaços de entre a ou cerca de 1 mm e a ou cerca de 8 mm de diâmetro, tal como entre a ou cerca de 1 mm e a ou cerca de 6 mmin de diâmetro, entre a ou cerca de 1 mm e a ou cerca de 4 mmin de diâmetro, entre a ou cerca de 1 mm e a ou cerca de 2 mm de diâmetro. Em algumas modalidades, o fragmento de tumor tem cerca de 2-3 mm de diâmetro. Em algumas modalidades, o fragmento de tumor tem cerca de 1-2 mm de diâmetro. Em algumas modalidades, o fragmento do tumor é obtido por fragmentação física, como por dissecção. Em algumas modalidades, o fragmento do tumor é obtido por dissecção afiada.

[00160] Em algumas modalidades, a amostra de tumor é criopre- servada antes da fragmentação. Em algumas modalidades, os frag- mentos de tumor são criopreservados.

[00161] Em algumas modalidades, os fragmentos de tumor obtidos são colocados em meios de cultura sob condições e com nutrientes apropriados para mediar a ativação das células T e/ou sustentar a ex- pansão das células T, como qualquer uma das condições descritas na Subseção I.B.2 abaixo para estimulação de células T. Em algumas modalidades, 1 a 500 fragmentos de tumor (por exemplo, cada um de 1 a 8 mm de tamanho) são colocados em um recipiente de cultura apropriado sob condições para expansão.

Em algumas modalidades, 10, 20, 30, 40, 50 ou mais fragmentos são cultivados sob condições de expansão.

O recipiente de cultura pode ser uma microcavidade, fras- co, tubo, saco ou outro dispositivo de sistema fechado.

Em algumas modalidades, o recipiente de cultura é um recipiente fechado que for- nece uma área de superfície permeável a gás, como um frasco per- meável a gás.

Um recipiente de cultura exemplar que fornece uma área de superfície permeável a gás inclui placas ou frascos G-Rex.

Em algumas modalidades, 1 fragmento de tumor (cerca de 1 a 8 mm de diâmetro) é colocado para cada área de cerca de 2 cm2 de um recipi- ente de cultura.

O recipiente de cultura particular pode ser escolhido com base no número de fragmentos de tumor disponíveis e/ou o ren- dimento desejado de células.

A escolha do recipiente de cultura (por exemplo, G-Rex) pode ser escolhida escalando linearmente o número de fragmentos semeados para a área de superfície do recipiente de cultura.

Em algumas modalidades, as áreas de superfície do recipiente de cultura são de cerca de 2 cm2 (por exemplo, placa de 24 cavidades G-Rex) e cerca de 1 fragmento de tumor (cerca de 1 a 8 mm de diâ- metro) é colocado no recipiente de cultura.

Em algumas modalidades, a área de superfície de um recipiente de cultura é de cerca de 10 cm2 (por exemplo, G-Rex 10 ou G-Rex 10M) e cerca de 5 fragmentos de tumor (cada um com cerca de 1 a 8 mm de diâmetro) são colocados no recipiente de cultura.

Em algumas modalidades, a área de superfí- cie de um recipiente de cultura é de cerca de 100 cm2 (por exemplo, G-Rex 100 M/100M-CS) e cerca de 50 fragmentos de tumor (cada um com cerca de 1 a 8 mm de diâmetro) são colocados no recipiente de cultura.

Em algumas modalidades, a área de superfície de um recipi- ente de cultura é de cerca de 500 cm2 (por exemplo, G-Rex 500 M/500M-CS) e cerca de 250 fragmentos de tumor (cada um com cerca de 1 a 8 mm de diâmetro) são colocados no recipiente de cultura.

Em aspectos dos métodos fornecidos, aumentar o tamanho do recipiente de cultura e, portanto, o número de fragmentos de tumor por recipien- te, pode diminuir a variabilidade em comparação com métodos que envolvem recipientes de cultura menores e/ou menos fragmentos por recipiente, por meio de agrupamento de maiores números de fragmen- tos para minimizar a variabilidade intertumoral entre os fragmentos.

[00162] Em algumas modalidades, os fragmentos de tumor são co- locados em meios de cultura para estimulação das células usando qualquer uma das condições descritas na Subseção I.B.2 abaixo. Em algumas modalidades, o meio de cultura é um meio sem soro conten- do citocinas recombinantes de IL-2, IL-7, IL-15 e/ou IL-21, como IL-12 recombinante ou IL-7 recombinante e IL-15 recombinante. A concen- tração de citocina recombinante pode incluir qualquer uma conforme descrito. Em modalidades particulares, o meio de cultura é um meio sem soro contendo IL-2 recombinante, tal como de ou cerca de 300 IU/mL a ou cerca de 1000 IU/mL, por exemplo, ou cerca de 300 IU/mL. Em algumas modalidades, o meio de cultura é um meio sem soro con- tendo um anticorpo anti-CD3 e/ou agente de direcionamento de CD28 (por exemplo, anticorpo anti-CD28) e uma ou mais citocinas recombi- nantes (por exemplo, IL-2).

[00163] Em algumas modalidades, os métodos fornecidos envolvem a obtenção de células dos fragmentos de tumor, como por digestão enzimática de fragmentos de tumor para obter TILs. A digestão enzi- mática pode ser realizada usando uma colagenase, como uma cola- genase do tipo IV ou uma colagenase do tipo I/II. A enzima, tal como uma colagenase, pode estar presente no meio para a digestão enzi- mática a uma concentração de ou cerca de 1 mg/mL a ou cerca de 5 mg/mL, tal como em ou cerca de 1 mg/mL, em ou cerca de 2 mg/mL, a ou cerca de 3 mg/mL, a ou cerca de 4 mg/mL ou a ou cerca de 5 mg/mL, ou qualquer valor entre qualquer um dos anteriores. Em algu-

mas modalidades, a digestão enzimática é com um meio que inclui co- lagenase do tipo IV, tal como de ou cerca de 1 mg/mL a ou cerca de 5 mg/mL. Em algumas modalidades, a digestão enzimática é com um meio que inclui colagenase tipo I/II, tal como de ou cerca de 1 mg/mL a ou cerca de 5 mg/mL. Em outras modalidades, as enzimas do kit de dissociação de tumor humano Miltenyi podem ser usadas (por exem- plo, Cat. O. 130-095-929; Miltenyi Biotec). O meio enzimático contendo a enzima pode ser um meio sem soro, tal como qualquer um conforme descrito. Em modalidades particulares, o meio enzimático inclui cola- genase, por exemplo, tampão Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640, glutamato 2 mM (por exemplo, GlutaMAX), 10 mg/mL de genta- micina, 30 unidades/mL de DNase e 1,0 mg/mL de colagenase). Em algumas modalidades, o meio enzimático inclui um meio sem soro (por exemplo, OpTmizer) contendo 2 mM de glutamato (por exemplo, Glu- taMAX), 10 µg/mL de gentamicina, uma substituição de soro de células imunes (por exemplo, CTS Immune Cell Soro Replacement) e 1,0 mg/mL a 5,0 mg/mL de colagenase). Em algumas modalidades, a co- lagenase é uma colagenase do tipo IV. Em algumas modalidades, a colagenase é uma colagenase do tipo I/II.

[00164] O fragmento de tumor é então dissecado mecanicamente para dissociar os TILs, por exemplo, usando um dissociador de tecido. Um exemplo de um dissociador de tecido é GentleMACs™ (Miltenyi Biotec) para homogeneizar o tecido. A digestão do tumor pode ser produzida colocando o tumor em meio enzimático e dissociando me- canicamente o tumor por aproximadamente 1 minuto, seguido por in- cubação por 30 minutos a 37 °C em 5% de CO2, seguido por ciclos repetidos de dissociação mecânica e incubação nas condições anterio- res até que apenas pequenos pedaços de tecido estejam presentes. No final deste processo, se a suspensão de células contiver um gran- de número de glóbulos vermelhos ou células mortas, uma separação por gradiente de densidade usando FICOLL pode ser realizada para remover essas células. Em alguns casos, a separação pode ser con- seguida por centrifugação, caso em que o pélete celular pode ser res- suspenso e coado através de um, por exemplo, Peneira de 70 µm para remover resíduos. Métodos alternativos conhecidos na técnica podem ser usados, tais como aqueles descritos na Publicação do Pedido de Patente Norte-americana Nº 2012/0244133 Al, cuja descrição é aqui incorporada por referência. Qualquer um dos métodos anteriores pode ser usado em qualquer uma das modalidades aqui descritas para mé- todos de obtenção de TILs para uso nos métodos fornecidos.

[00165] Em algumas modalidades, as células digeridas dos frag- mentos de tumor são colocadas em meio de cultura sob condições e com nutrientes apropriados para mediar a ativação de células T e/ou sustentar a expansão de células T, como qualquer uma das condições descritas na Subseção IB2 abaixo para estimulação de células T. As células são semeadas em uma densidade particular adequada para o recipiente de cultura particular. O recipiente de cultura pode ser um microcavidade, frasco, tubo, saco ou outro dispositivo de sistema fe- chado. Em algumas modalidades, o recipiente de cultura é um recipi- ente fechado que fornece uma área de superfície permeável a gás, como um frasco permeável a gás. Um recipiente de cultura exemplar que fornece uma área de superfície permeável a gás inclui placas ou frascos G-Rex. Em algumas modalidades, aproximadamente 5 x 105 a 2 x 106 células de uma suspensão de célula única digerida enzimati- camente são semeadas para cada área de cerca de 2 cm2 de um reci- piente de cultura. O recipiente de cultura particular pode ser escolhido com base no número de células disponíveis e/ou o rendimento deseja- do de células. A escolha do recipiente de cultura (por exemplo, G-Rex) pode ser escolhida escalando linearmente o número de células seme- adas para a área de superfície do recipiente de cultura. Em algumas modalidades, as áreas de superfície do recipiente de cultura são de cerca de 2 cm2 (por exemplo, placa de 24 cavidades G-Rex) e cerca de 5 x 105 a 2 x 106 células de uma suspensão de célula única digerida enzimaticamente são colocadas no recipiente de cultura. Em algumas modalidades, a área de superfície de um recipiente de cultura é de cerca de 10 cm2 (por exemplo, G-Rex 10 ou G-Rex 10M) e cerca de 2,5 x 106 a 1 x 107 células de uma suspensão de célula única digerida enzimaticamente são colocadas no recipiente de cultura . Em algumas modalidades, a área de superfície de um recipiente de cultura é de cerca de 100 cm2 (por exemplo, G-Rex 100 M/100M-CS) e cerca de 2,5 x 107 a 1 x 108 células de uma suspensão de célula única digerida enzimaticamente são colocadas no recipiente de cultura. Em algumas modalidades, a área de superfície de um recipiente de cultura é de cerca de 500 cm2 (por exemplo, G-Rex 500 M/500M-CS) e cerca de 1,25 x 108 a 5 x 108 células de uma suspensão de célula única digerida enzimaticamente são colocadas no recipiente de cultura.

[00166] Em algumas modalidades, o meio de cultura é um meio sem soro contendo IL-2 recombinante. Em algumas modalidades, um ou mais agentes estimuladores de células T adicionais também podem ser incluídos. Em algumas modalidades, o meio de cultura é um meio sem soro contendo um anticorpo anti-CD3 e/ou um agente de direcio- namento de CD28 (por exemplo, anticorpo anti-CD28) e uma ou mais citocinas recombinantes (por exemplo, IL-2, IL-7, IL -15 e/ou IL-21).

[00167] A amostra pode ser obtida de uma variedade de diferentes indivíduos/pacientes/hospedeiros. Geralmente, tais hospedeiros são “mamíferos” ou “mamífero”, onde esses termos são usados amplamente para descrever organismos que estão dentro da classe mamíferos, incluindo as ordens carnívoros (por exemplo, cães e ga- tos), roedores (por exemplo, camundongos, porquinhos-da-índia e ra- tos) e primatas (por exemplo, humanos, chimpanzés e macacos). Em muitas modalidades, os hospedeiros serão humanos.

[00168] Em alguns aspectos, o indivíduo é um humano. Conse- quentemente, as células em algumas modalidades são células primá- rias, por exemplo, células humanas primárias. Em algumas modalida- des, a amostra é autóloga para um indivíduo a ser tratado, como um indivíduo que é um paciente com necessidade de uma intervenção te- rapêutica particular, como a terapia celular adotiva para a qual as célu- las estão sendo isoladas, processadas e/ou expandidas de acordo com os métodos fornecidos. Em algumas modalidades, a amostra é alogênica a um indivíduo a ser tratado.

[00169] Em algumas modalidades, as células T para uso em cone- xão com os métodos fornecidos podem ser enriquecidas ou classifica- das de uma variedade de maneiras, incluindo, mas não se limitando a, separação magnética de esferas, classificação de células fluorescen- tes e classificadores de células com base em cartucho fechado des- cartável. Em aspectos particulares, um ou mais reagentes específicos para células T ou um subconjunto dos mesmos, tais como reagentes específicos para marcadores de ativação de células T para selecionar células reativas, podem ser usados incluindo, mas não se limitando a, anticorpos fluorescentes, nanopartículas ou contas na seleção de célu- las equipamento, mas não limitado a, o CliniMACS, Sony FX500 ou os sistemas de classificação de células Tyto (Miltenyi).

[00170] Em alguns aspectos, as células T podem ser selecionadas a partir de uma amostra biológica, como com base em marcadores de células T CD3, CD4 ou CD8. Em algumas modalidades, a seleção de uma célula T que é positiva de superfície para um ou mais marcadores de superfície celular inclui qualquer método para separação com base em tais marcadores.

[00171] Em algumas modalidades, a separação é uma separação baseada em afinidade ou imunoafinidade. Por exemplo, o isolamento em alguns aspectos inclui a separação de células e populações de cé- lulas com base na expressão das células ou nível de expressão de um ou mais marcadores, normalmente marcadores de superfície celular, por exemplo, por incubação com um anticorpo ou parceiro de ligação que se liga especificamente a tais marcadores, seguidos geralmente por etapas de lavagem e separação de células que se ligaram ao anti- corpo ou parceiro de ligação, daquelas células que não se ligaram ao anticorpo ou parceiro de ligação. Em algumas modalidades, as sele- ções baseadas em imunoafinidade incluem o contato de uma amostra contendo células, como uma amostra contendo uma população em massa de células T, por exemplo, células T humanas primárias, con- tendo células T CD3+ ou células CD4+ e CD8+, com um anticorpo ou parceiro de ligação que se liga especificamente ao marcador ou mar- cadores da superfície celular. Em algumas modalidades, o anticorpo ou parceiro de ligação está ligado a um suporte sólido ou matriz, como uma esfera ou conta, por exemplo, uma nanopartícula, microcontas, nanocontas, incluindo agarose, conta magnético ou contas paramag- néticas, para permitir a separação de células para seleção positiva e/ou negativa. Em algumas modalidades, as esferas ou contas podem ser empacotadas em uma coluna para efetuar a cromatografia de imu- noafinidade, na qual uma amostra contendo células, como células T humanas primárias contendo células T CD3+ ou células CD4+ e CD8+, é contatada com a matriz da coluna e subsequentemente eluído ou liberado a partir dele. Em outras modalidades, o anticorpo ou par- ceiro de ligação é marcado de forma detectável.

[00172] Em alguns aspectos, a amostra ou composição de células a serem separadas é incubada com material pequeno, magnetizável ou magneticamente responsivo, como partículas magneticamente res- ponsivas ou micropartículas, como nanopartículas ou contas para- magnéticas. O material magneticamente responsivo, por exemplo, par-

tícula, geralmente é direta ou indiretamente ligado a um parceiro de ligação, por exemplo, um anticorpo, que se liga especificamente a uma molécula, por exemplo, marcador de superfície, presente na célula, células ou população de células que ele é desejado separar, por exemplo, que é desejado selecionar negativamente ou positivamente. Tais contas são conhecidas e estão disponíveis comercialmente a par- tir de uma variedade de fontes, incluindo, em alguns aspectos, Dyna- beads® (Life Technologies, Carlsbad, CA), contas MACS® (Miltenyi Biotec, San Diego, CA) ou reagentes de contas Streptamer® (IBA, Alemanha). Em alguns aspectos, a amostra é colocada em um campo magnético e as células com partículas magneticamente responsivas ou magnetizáveis ligadas a ela serão atraídas para o ímã e separadas das células não marcadas. Para a seleção positiva, as células que são atraídas pelo ímã são retidas; para a seleção negativa, as células que não são atraídas (células não marcadas) são retidas.

[00173] Em certas modalidades, a amostra é posta em contato com um agente de ligação, por exemplo, um agente de ligação marcado de forma detectável, que se liga especificamente a um marcador de su- perfície celular. Em certas modalidades, o (s) agente (s) de ligação marcado (s) de maneira detectável são marcados por fluorescência. Em certas modalidades, as células T marcadas com agentes de liga- ção específicos para um marcador de superfície celular são identifica- das por citometria de fluxo. Em certas modalidades, o método inclui ainda a separação de quaisquer células T resultantes marcadas com o (s) agente (s) de ligação de outros componentes da amostra para pro- duzir uma composição enriquecida para células T positivas na superfí- cie para um ou mais marcadores de superfície celular. Pode ser usado um equipamento de classificação de seleção de células que tenha um rendimento suficientemente alto para lidar com grandes volumes e números de células. O equipamento de classificação de células não limitativo inclui, por exemplo, Sony FX500 ou os sistemas de classifi- cação de células Tyto (Miltenyi).

[00174] A incubação geralmente é realizada sob condições em que os anticorpos ou parceiros de ligação, ou moléculas, tais como anti- corpos secundários ou outros reagentes, que se ligam especificamente a tais anticorpos ou parceiros de ligação, que estão ligados à partícula magnética ou conta e/ou são detectáveis marcados, se ligam especifi- camente às moléculas da superfície celular, se presentes nas células da amostra. Em alguns aspectos, as células ligadas aos anticorpos podem ser recuperadas ou separadas das células não ligadas na amostra.

[00175] Em alguns aspectos, uma combinação de seleção positiva e negativa é realizada durante a mesma etapa de seleção, onde as frações positivas e negativas são retidas e posteriormente processa- das ou sujeitas a outras etapas de separação. Essas etapas de sepa- ração podem ser baseadas na seleção positiva, em que as células que se ligaram aos reagentes são retidas para uso posterior, e/ou seleção negativa, em que as células que não se ligaram ao anticorpo ou par- ceiro de ligação são retidas. Em alguns exemplos, ambas as frações são retidas para uso posterior. Em alguns aspectos, a seleção negati- va pode ser particularmente útil onde nenhum anticorpo está disponí- vel que identifique especificamente um tipo de célula em uma popula- ção heterogênea, de modo que a separação seja melhor realizada com base em marcadores expressos por células diferentes da popula- ção desejada.

[00176] A separação não precisa resultar em 100% de enriqueci- mento ou remoção de uma determinada população de células ou célu- las que expressam um determinado marcador. Por exemplo, seleção positiva ou enriquecimento para células de um tipo particular, como aquelas que expressam um marcador, refere-se ao aumento do núme-

ro ou porcentagem de tais células, mas não precisa resultar em uma ausência completa de células que não expressam o marcador. Da mesma forma, a seleção negativa, remoção ou esgotamento de célu- las de um tipo particular, como aquelas que expressam um marcador, refere-se à diminuição do número ou porcentagem de tais células, mas não precisa resultar na remoção completa de todas essas células. Por exemplo, em alguns aspectos, uma seleção de uma das populações CD4+ ou CD8+ enriquece para a referida população, seja a população CD4+ ou CD8+, mas também pode conter alguma porcentagem resi- dual ou pequena de outras células não selecionadas, que podem, em alguns casos, incluem o outro da população CD4 ou CD8 ainda pre- sente na população enriquecida.

[00177] Em algumas modalidades, o isolamento é realizado por en- riquecimento para uma determinada população de células por seleção positiva ou depleção de uma determinada população de células por seleção negativa. Em algumas modalidades, a seleção positiva ou ne- gativa é realizada incubando células com um ou mais anticorpos ou outro agente de ligação que se ligam especificamente a um ou mais marcadores de superfície expressos ou expressos (marcador+) em um nível relativamente mais alto (marcadoralto) nas células positiva ou ne- gativamente selecionadas, respectivamente.

[00178] Em modalidades particulares, uma população de células T é aquela que inclui células T CD4+ e CD8+. Muitos cânceres, incluindo tumores sólidos, tais como muitas indicações epiteliais comuns (por exemplo, GI), expressam mutações restritas de classe I e classe II. Para que um produto de células T almeje tais indicações, por exemplo, indicações epiteliais comuns, é considerado que ambas as células T CD8+ para reconhecer moléculas restritas ao MHC de classe I e célu- las T CD4+ para reconhecer moléculas restritas ao MHC de Classe II são necessárias.

[00179] Em algumas modalidades, os métodos incluem isolamento, seleção e/ou enriquecimento de células CD3+. Em algumas modalida- des, os métodos incluem isolamento, seleção e/ou enriquecimento de células CD4+ e CD8+. Em alguns aspectos, uma etapa de seleção CD4+ ou CD8+, como seleção positiva para CD4 e seleção positiva para CD8, é usada para separar células T auxiliares CD4+ e CD8+ ci- totóxicas. Essas seleções em alguns aspectos são realizadas simulta- neamente e em outros aspectos são realizadas sequencialmente, em qualquer ordem. Em algumas modalidades, os métodos incluem enri- quecimento para células T CD4+ e CD8+ selecionando células T posi- tivas na superfície para CD3 ou por seleção sequencial ou simultânea para células T positivas na superfície para CD4 e células T positivas na superfície para CD8. Essas células T CD3+, ou populações CD4+ e/ou CD8+, podem ser ainda classificadas em subpopulações por se- leção positiva ou negativa para marcadores expressos ou expressos em um grau relativamente mais alto em células T reativas ao tumor ou em células T com expressão de T marcadores de ativação celular as- sociados a células T reativas ao tumor, por exemplo, conforme des- crito na Seção I.D.

[00180] Em algumas modalidades, as células T selecionadas po- dem ser ainda mais enriquecidas para células T reativas ao tumor com base na expressão de um marcador associado a células T ativadas. Marcadores particulares para uso na seleção ou enriquecimento de tais células T reativas ao tumor são descritos na Seção I.D. abaixo. Em outros casos, a seleção ou enriquecimento de células T reativas ao tumor é realizada em uma ou mais etapas subsequentes do pro- cesso, tal como após a cocultura com um ou mais peptídeos mutados (neoepítopo de peptídeo).

[00181] Em algumas modalidades, a seleção das células T da amostra biológica inclui ainda o enriquecimento ou a seleção de célu-

las T reativas ao tumor ou células T que expressam um ou mais mar- cadores de ativação associados às células T reativas ao tumor. Os marcadores de ativação de células T incluem marcadores de superfí- cie celular cuja expressão é regulada positivamente ou específica para células T que foram expostas ao antígeno e ativadas. Marcadores ex- emplares são descritos na Seção I.D abaixo.

[00182] Em algumas das modalidades fornecidas, a amostra bioló- gica é uma amostra proveniente de linfa ou uma amostra proveniente de tumor, e em que: o número de células no início da cultura está en- tre cerca de 10 x 106 e 100 x 106 células viáveis totais, 20 x 106 e 100 x 106 células viáveis totais, ou 12 x 106 e 43 x 106 células viáveis totais; ou é em ou cerca de 10 x 106 células viáveis totais, em ou cerca de 12 x 106 células viáveis totais, 20 x 106 células viáveis totais, 40 x 106 células viáveis totais, 60 x 106 células viáveis totais, ou 100 x 106 células viáveis totais, ou qualquer valor entre qualquer um dos anterio- res. Em algumas modalidades, a porcentagem de células T reativas ao tumor no início da cultura está entre a ou cerca de 1% e a ou cerca de 90%, a ou cerca de 1% e a ou cerca de 75%, a ou cerca de 1% e a ou cerca de 50%, em ou cerca de 1% e a ou cerca de 25% ou em ou cer- ca de 1% e a ou cerca de 14%.

[00183] Em algumas das modalidades fornecidas, a amostra bioló- gica é uma amostra proveniente de linfa ou uma amostra proveniente de tumor, e em que o número de células T positivas na superfície para o marcador de ativação de células T no início da cultura está entre a ou cerca de 0,7 x 106 e a ou cerca de 15 x 106 células T, 1 x 106 e a ou cerca de 15 x 106 células T, ou em ou cerca de 0,7 x 106 e a ou cerca de 5,4 x 106 células T; ou está em ou cerca de 0,7 x 106 células T, 1 x 106 células T, 5,4 x 106 células T ou 15 x 106 células T, ou qualquer valor entre qualquer um dos anteriores.

1. Estimulação de células T para Expansão Inicial

[00184] Em aspectos dos métodos fornecidos, as células T da amostra biológica (entrada ou primeira população de células T, tais como presentes em um fragmento de tumor ressecado) são incubadas ou cultivadas na presença de um ou mais agentes estimulatórios de células T sob condições para estimular as células T, tal como para ex- pandir as células T. Em algumas modalidades, a incubação ou cultura com um ou mais agentes estimulatórios de células T resulta na expan- são ou crescimento de células T selecionadas, ou um subconjunto ou subtipo desejado das mesmas ou para células viáveis das mesmas, para uso em etapas subsequentes dos métodos fornecidos. Exemplos não limitantes de agentes estimulatórios de células T e condições para incubação ou cultura são descritos aqui.

[00185] Em algumas modalidades, os agentes estimulatórios de cé- lulas T incluem uma citocina estimulatória de célula T recombinante, tal como IL-2, IL-7, IL-15 e/ou IL-21. Em algumas modalidades, a cito- cina estimulatória de células T inclui IL-2, sozinha ou em combinação com outra citocina dentre IL-7, IL-15 e/ou IL-21. Em algumas modali- dades, a citocina estimulatória de células T inclui IL-7 e IL-15.

[00186] Em algumas das modalidades fornecidas, os agentes esti- mulatórios de células T são selecionados a partir de um agente que inicia a sinalização intracelular de TCR/CD3 e um agente que inicia a sinalização por meio de um receptor coestimulatório. Em algumas das modalidades fornecidas, o agente que inicia a sinalização intracelular de TCR/CD3 é um anticorpo anti-CD3, tal como OKT3. Em algumas das modalidades fornecidas, o agente que inicia a sinalização por meio de um receptor coestimulatório compreende células mononuclea- res de sangue periférico (PBMCs), opcionalmente PBMCs sem divisão ou irradiadas. Em algumas das modalidades fornecidas, o agente que inicia a sinalização por meio de um receptor coestimulatório é um anti- corpo anti-CD28. Em algumas das modalidades fornecidas, os agentes estimulatórios de células T são um anticorpo anti-CD3 e um anticorpo anti-CD28 em que cada um é solúvel.

[00187] Assim, entre os métodos fornecidos estão métodos de cul- tura de células T para a fabricação de células T reativas de tumor em que as células T são cultivadas ou incubadas na presença de um agente estimulatório de células T sob condições para expandir células T, tais como presentes no cocultura. Em algumas modalidades, o agente estimulatório de células T é ou inclui um anticorpo anti-CD3 e um anticorpo anti-CD28.

[00188] Em modalidades dos métodos fornecidos, as condições de estimulação incluem um ou mais agentes, por exemplo, ligante, que liga ou inicia a cascata de sinalização intracelular de TCR/CD3 em uma célula T e/ou um sinal coestimulatório em uma célula T. Tais agentes podem incluir anticorpos, tais como aqueles específicos para um componente de TCR, por exemplo, anti-CD3 e/ou receptor coesti- mulatório, por exemplo, anti-CD28 ou anti-4-1BB. Em algumas modali- dades, tais agentes são adicionados ao meio de cultura como anticor- pos solúveis. Em outras modalidades, tais agentes são ligados a um suporte sólido, tal como uma conta. Em algumas modalidades, os agentes estimulatórios de células T incluem contas magnéticas conju- gadas com anti-CD3/CD28 (por exemplo, Expansor de Célula T CD3/CD28 DYNABEADS® M-450).

[00189] Um anticorpo anti-CD3 pode incluir qualquer anticorpo dire- cionado contra ou que pode se ligar especificamente ao receptor CD3 na superfície das células T, tipicamente CD3 humano em células T humanas. Os anticorpos anti-CD3 incluem OKT3, também conhecido como muromonabe. Os anticorpos anti-CD3 também incluem o dclone UHCTI, também conhecido como T3 e CD3E. Outros anticorpos anti- CD3 incluem, por exemplo, otelixizumabe, teplizumabe e visilizumabe. O anticorpo anti-CD3 pode ser adicionado como um reagente solúvel ou ligado a uma conta. Em modalidades particulares, o anticorpo anti- CD3 é solúvel.

[00190] Em modalidades particulares, os agentes estimulatórios de células T incluem um anticorpo anti-CD3, que é adicionado ao meio de cultura de células durante a incubação. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-CD3 é adicionado em uma concentração variando entre ou cerca de 0,1 ng/mL e 50 ng/mL, tal como entre ou cerca de 0,5 ng/mL e em ou cerca de 50 ng/mL, entre ou cerca de 0,5 ng/mL e em ou cerca de 30 ng/mL, entre ou cerca de 0,5 ng/mL e em ou cerca de 15 ng/mL, entre ou cerca de 0,5 ng/mL e em ou cerca de 5 ng/mL, en- tre ou cerca de 0,5 ng/mL e em ou cerca de 1 ng/mL, entre ou cerca de 1 ng/mL e em ou cerca de 50 ng/mL, entre ou cerca de 1 ng/mL e em ou cerca de 30 ng/mL, entre ou cerca de 1 ng/mL e em ou cerca de 15 ng/mL, entre ou cerca de 1 ng/mL e em ou cerca de 5 ng/mL, entre ou cerca de 5 ng/mL e em ou cerca de 50 ng/mL, entre ou cerca de 5 ng/mL e em ou cerca de 30 ng/mL, entre ou cerca de 5 ng/mL e em ou cerca de 15 ng/mL, entre ou cerca de 15 ng/mL e em ou 50 ng/mL, en- tre ou cerca de 15 ng/mL e em ou cerca de 30 ng/mL ou entre ou cer- ca de 30 ng/mL e em ou cerca de 50 ng/mL, cada um inclusive.

[00191] Em modalidades particulares, o anticorpo anti-CD3 é OKT3. Em uma modalidade, o meio de cultura celular compreende cerca de 0,1 ng/mL, cerca de 0,5 ng/mL, cerca de 1 ng/mL, cerca de 2,5 ng/mL, cerca de 5 ng/mL, cerca de 7,5 ng/mL, cerca de 10 ng/mL, cerca de 15 ng/mL, cerca de 20 ng/mL, cerca de 25 ng/mL, cerca de 30 ng/mL, cerca de 35 ng/mL, cerca de 40 ng/mL, cerca de 50 ng/mL, cerca de 60 ng/mL, cerca de 70 ng/mL, cerca de 80 ng/mL, cerca de 90 ng/mL, cerca de 100 ng/mL, cerca de 200 ng/mL, cerca de 500 ng/mL, e cerca de 1 μg/mL de anticorpo OKT3. Em uma modalidade, o meio de cultu- ra celular compreende entre 0,1 ng/mL e 1 ng/mL, entre 1 ng/mL e 5 ng/mL, entre 5 ng/mL e 10 ng/mL, entre 10 ng/mL e 20 ng/mL, entre 20 ng/mL e 30 ng/mL, entre 30 ng/mL e 40 ng/mL, entre 40 ng/mL e 50 ng/mL, e entre 50 ng/mL e 100 ng/mL de anticorpo OKT3.

[00192] Em algumas modalidades, os agentes estimulatórios de cé- lulas T incluem a incubação com um anticorpo anti-CD3 e a incubação com um outro agente que se liga especificamente a CD28 ou estimula ou induz um sinal mediado por CD28 nas células. Em algumas moda- lidades, o sinal mediado por CD28 pode ser iniciado ou fornecido pelo anticorpo anti-CD28 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo. Em algumas modalidades, o sinal mediado por CD28 pode ser forne- cido por células alimentadoras apresentadoras de antígeno (APCs), tais como células mononucleares de sangue periférico (PBMC).

[00193] Em algumas modalidades, os agentes estimulatórios de cé- lulas T podem incluir adicionar à população de células alimentadoras de células T, tais como células mononucleares de sangue periférico sem divisão (PBMC). Em alguns aspectos, as células alimentadoras sem divisão podem compreender células alimentadoras de PBMC com radiação gama. Em algumas modalidades, as PBMC são irradiadas com raios gama na faixa de cerca de 3000 a 3600 rads para evitar a divisão celular. Em alguns aspectos, as células alimentadoras são adi- cionadas ao meio de cultura antes da adição das populações de célu- las T. Em algumas modalidades, a população de células resultante contém pelo menos cerca de 5, 10, 20 ou 40 ou mais células alimenta- doras PBMC para cada linfócito T na população inicial a ser expandi- da. Em algumas modalidades, a razão de células T para PBMCs e/ou células apresentadoras de antígeno é de cerca de 1 a 25, cerca de 1 a 50, cerca de 1 a 100, cerca de 1 a 125, cerca de 1 a 150, cerca de 1 a 175, cerca de 1 a 200, cerca de 1 a 225, cerca de 1 a 250, cerca de 1 a 275, cerca de 1 a 300, cerca de 1 a 325, cerca de 1 a 350, cerca de 1 a 375, cerca de 1 a 400 ou cerca de 1 a 500.

[00194] Em algumas modalidades, os agentes estimulatórios de cé-

lulas T podem incluir adicionar à população de células um anticorpo anti-CD28 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo. Um anti- corpo anti-CD28 pode incluir qualquer anticorpo dirigido contra ou que pode se ligar especificamente ao receptor CD28 na superfície das cé- lulas T. Exemplos não limitantes de anticorpos anti-CD28 incluem NA/LE (por exemplo, BD Pharmingen), IM1376 (por exemplo, Beck- man Coulter) ou 15E8 (por exemplo, Miltenyi Biotec). O anticorpo anti- CD28 pode ser adicionado como um reagente solúvel ou ligado a uma conta. Em modalidades particulares, o anticorpo anti-CD3 é solúvel. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-CD28 é adicionado em uma concentração variando entre ou cerca de 1 ng/mL e 1000 ng/mL, entre ou cerca de 1 ng/mL e 500 ng/mL, entre ou cerca de 1 ng/mL e em ou cerca de 100 ng/mL, entre ou cerca de 1 ng/mL e em ou cerca de 10 ng/mL, entre ou cerca de 10 ng/mL e em ou cerca de 1000 ng/mL, entre ou cerca de 10 ng/mL e em ou cerca de 500 ng/mL, entre ou cerca de 10 ng/mL e em ou cerca de 100 ng/mL, entre ou cerca de 100 ng/mL e em ou cerca de 1000 ng/mL, entre ou cerca de 100 ng/mL e em ou cerca de 500 ng/mL ou entre ou cerca de 500 ng/mL e em ou cerca de 1000 ng/mL.

[00195] Em algumas modalidades, os agentes estimulatórios de cé- lulas T incluem uma ou mais citocinas recombinantes. Em algumas modalidades, a citocina é adicionada ou é exógena ao meio de cultura. Assim, em algumas modalidades, uma ou mais citocinas recombinan- tes adicionais também são incluídas durante a cultura. Em algumas modalidades, a citocina recombinante pode incluir um ou mais de IL-2, IL-7, IL-15 ou IL-21. Em algumas modalidades, a cultura e a incubação são realizadas na presença de IL-2, IL-15 e IL-7 recombinantes. Em algumas modalidades, a cultura é realizada na presença de uma IL-2. Em algumas modalidades, a cultura é realizada na presença de IL-15 e IL-17, que, em alguns aspectos, não inclui adicionalmente IL-2. Em modalidades particulares, as citocinas recombinantes são humanas.

[00196] A citocina recombinante geralmente é uma proteína huma- na recombinante. Em modalidades particulares, a citocina recombinan- te está presente no meio de cultura de células durante a incubação a uma concentração de pelo menos ou pelo menos cerca de 0,5 IU/mL, pelo menos ou pelo menos cerca de 1,0 IU/mL, pelo menos ou pelo menos cerca de 5 IU/mL, pelo menos em ou cerca de ou em cerca de 10 IU/mL, pelo menos em ou cerca de ou em ou cerca de 100 IU/mL, pelo menos em ou cerca de ou em ou cerca de 1000 IU/mL, pelo me- nos ou cerca de ou cerca de 1,500 IU/mL, pelo menos ou cerca de ou cerca de 2,000 IU/mL, pelo menos ou cerca de ou cerca de 2,500 IU/mL, pelo menos ou cerca de ou cerca de 3000 IU/mL, pelo menos em ou cerca de ou cerca de 3500 IU/mL, pelo menos em ou cerca de ou cerca de 4000 IU/mL, pelo menos em ou cerca de ou cerca de 4500 IU/mL, pelo menos em ou cerca de ou em cerca de 5000 IU/mL, pelo menos pelo menos ou cerca de ou cerca de 5,500 IU/mL, pelo menos por ou cerca de ou cerca de 6,000 IU/mL, pelo menos por ou cerca de ou cerca de 6500 IU/mL, pelo menos por ou cerca de ou por ou cerca de 7000 IU/mL, pelo menos a ou cerca de ou cerca de 7500 IU/mL, ou pelo menos ou cerca de ou cerca de 8000 IU/mL. Em uma modalida- de, o meio de cultura celular compreende entre ou cerca de 10 IU/mL e em ou cerca de 100 IU/mL, em ou cerca de 100 IU/mL e em ou cerca de 1000 IU/mL, em ou cerca de 1000 e em ou cerca de 2000 IU/mL, entre ou cerca de 2000 e em ou cerca de 3000 IU/mL, entre ou cerca de 3000 e 4000 em ou cerca de IU/mL, entre ou cerca de 4000 e em ou cerca de 5000 IU/mL, entre ou cerca de 5000 e em ou cerca de 6000 IU/mL, entre ou cerca de 6000 e em ou cerca de 7000 IU/mL, entre ou cerca de 7000 e em ou cerca de 8000 IU/mL, cada um inclu- so.

[00197] Em algumas modalidades, a IL-2 recombinante está pre-

sente no meio de cultura celular. IL-2 é uma citocina que suporta a re- cuperação e proliferação de células T. IL-2 também suporta a homeos- tase das células T, apoiando assim o seu fenótipo, estado de diferen- ciação e memória imunológica. Em alguns casos, a indução de células T regulatórias no microambiente tumoral pode levar a uma baixa bio- disponibilidade de IL-2. A IL-2 recombinante tem sido usada regular- mente na ampla expansão de células T em vários contextos. A IL-2 recombinante está disponível comercialmente. Em modalidades parti- culares, a IL-2 recombinante é de grau GMP (por exemplo, MACS GMP Recombinant Human IL-2, Miltenyi Biotec).

[00198] A IL-2 recombinante pode ser incluída no meio de cultura de células durante vários estágios do processo fornecido. Em alguns casos, a IL-2 recombinante pode ser incluída na expansão inicial das células T (primeira expansão), de modo a promover o crescimento de TIL e permitir sua proliferação a partir de tumor sólido. IL-2 também pode ser incluída na cocultura de células apresentadoras de antígeno, como descrito na Seção I.C, de modo a permitir a ativação de pico de T reativo com neoantígeno antes de sua separação ou seleção. Em alguns casos, a IL-2 recombinante também pode ser incluída em cultu- ras para expandir as células T reativas ao tumor durante a segunda fase de expansão, tal como descrito na Seção I.D.

[00199] Em algumas modalidades, a IL-2 recombinante é adiciona- da ao meio de cultura em uma concentração entre ou cerca de 10 IU/mL e em ou cerca de 1000 IU/mL, tal como entre ou cerca de 10 IU/mL e em ou cerca de 600 IU/mL, entre ou cerca de 10 IU/mL e em ou cerca de 400 IU/mL, entre ou cerca de 10 IU/mL e em ou cerca de 200 IU/mL, entre ou cerca de 10 IU/mL e em ou cerca de 100 IU/mL, entre ou cerca de 10 IU/mL e em ou cerca de 50 IU/mL, entre ou cerca de 50 IU/mL e em ou cerca de 1000 IU/mL, entre ou cerca de 50 IU/mL e em ou cerca de 600 IU/mL, entre ou cerca de 50 IU/mL e em ou cer-

ca de 400 IU/mL, entre ou cerca de 50 IU/mL e em ou cerca de 200 IU/mL, entre ou cerca de 50 IU/mL e em ou cerca de 100 IU/mL, entre ou cerca de 100 IU/mL e em ou cerca de 1000 IU/mL, entre ou cerca de 100 IU/mL e em ou cerca de 600 IU/mL, entre ou cerca de 100 IU/mL e em ou cerca de 400 IU/mL, entre ou cerca de 100 IU/mL e em ou cerca de 200 IU/mL, entre ou cerca de 200 IU/mL e em ou cerca de 1000 IU/mL, entre ou cerca de 200 IU/mL e em ou cerca de 600 IU/mL, entre ou cerca de 200 IU/mL e em ou cerca de 400 IU/mL, entre ou cerca de 400 IU/mL e em ou cerca de 1000 IU/mL, entre ou cerca de 400 IU/mL e em ou cerca de 600 IU/mL ou entre ou cerca de 600 IU/mL e em ou cerca de 1000 IU/mL. Em algumas modalidades, a IL-2 recombinante está presente em uma quantidade que está entre 50 e 400 IU/mL.

[00200] Em algumas modalidades, a incubação é realizada com uma dose mais elevada de IL-2. Em alguns aspectos, IL-2 é a única citocina recombinante adicionada à cultura. Em algumas modalidades, a IL-2 recombinante é adicionada ao meio de cultura em uma concen- tração entre ou cerca de 1000 IU/mL em ou cerca de 8000 IU/mL, tal como entre ou cerca de 1000 IU/mL e em ou cerca de 7000 IU/mL, en- tre ou cerca de 1000 IU/mL e em ou cerca de 6000 IU/mL, entre ou cerca de 1000 IU/mL e em ou cerca de 5000 IU/mL, entre ou cerca de 1000 IU/mL e em ou cerca de 4000 IU/mL, entre ou cerca de 1000 IU/mL e em ou cerca de 2000 IU/mL, 2000 IU/mL em ou cerca de 8000 IU/mL, entre ou cerca de 2000 IU/mL e em ou cerca de 7000 IU/mL, entre ou cerca de 2000 IU/mL e em ou cerca de 6000 IU/mL, entre ou cerca de 2000 IU/mL e em ou cerca de 5000 IU/mL, entre ou cerca de 2000 IU/mL e em ou cerca de 4000 IU/mL, 4000 IU/mL em ou cerca de 8000 IU/mL, entre ou cerca de 4000 IU/mL e em ou cerca de 7000 IU/mL, entre ou cerca de 4000 IU/mL e em ou cerca de 6000 IU/mL, entre ou cerca de 4000 IU/mL e em ou cerca de 5000 IU/mL, entre ou cerca de 5000 IU/mL em ou cerca de 8000 IU/mL, entre ou cerca de 5000 IU/mL e em ou cerca de 7000 IU/mL, entre ou cerca de 5000 IU/mL e em ou cerca de 6000 IU/mL, entre ou cerca de 6000 IU/mL em ou cerca de 8000 IU/mL, entre ou cerca de 6000 IU/mL e em ou cerca de 7000 IU/mL ou entre ou cerca de 7000 IU/mL e em ou cerca de 8000 IU/mL. Em algumas modalidades, a IL-2 recombinante está pre- sente em uma quantidade que é ou é de cerca de 6,000 IU/mL.

[00201] Em algumas modalidades, a IL-15 recombinante está pre- sente no meio de cultura celular. A IL-15 é uma citocina que está en- volvida na homeostase e na ativação das células T de memória. Em alguns casos, a IL-15 pode promover funções efetoras de células T com experiência em antígeno na ausência de antígeno e prevenir sua diferenciação em um fenótipo exaurido. IL-15 também desempenha um papel na proliferação de células T. A IL-15 recombinante está dis- ponível comercialmente. Em modalidades particulares, a IL-15 recom- binante é de grau GMP (por exemplo, MACS GMP Recombinant Hu- man IL-15, Miltenyi Biotec).

[00202] A IL-15 recombinante pode ser incluída em meios de cultu- ra de células durante vários estágios do processo fornecido. Em al- guns casos, a IL-15 recombinante pode ser incluída na expansão inici- al de células T (primeira expansão), de modo a promover a expansão de TIL para promover seu crescimento e permitir sua proliferação e/ou estabilizar o fenótipo de tumor sólido. A IL-15 recombinante também pode ser incluída na cocultura de células apresentadoras de antígeno, como descrito na Seção I.C, de modo a permitir a ativação de pico de T reativo com neoantígeno antes de sua separação ou seleção. Em alguns casos, a IL-15 recombinante também pode ser incluída em cul- turas para expandir as células T reativas ao tumor durante a segunda fase de expansão, tal como descrito na Seção I.D. Em alguns casos, a IL-15 recombinante pode ser combinada com a IL-7 recombinante para fornecer ativação, sobrevivência e/ou expansão de células T reativas ao tumor nos métodos fornecidos. Em algumas de tais modalidades, a combinação de IL-7 e IL-15 recombinante é uma alternativa ao uso de IL-2 recombinante na cultura, e o meio de cultura não contém adicio- nalmente IL-2 recombinante.

[00203] Em algumas modalidades, a IL-15 recombinante é adicio- nada ao meio de cultura em uma concentração entre ou cerca de 10 IU/mL e 500 IU/mL, tal como entre ou cerca de 10 IU/mL e em ou cer- ca de 400 IU/mL, entre ou cerca de 10 IU/mL e em ou cerca de 300 IU/mL, entre ou cerca de 10 IU/mL e em ou cerca de 200 IU/mL, entre ou cerca de 10 IU/mL e em ou cerca de 100 IU/mL, entre ou cerca de 10 IU/mL e em ou cerca de 70 IU/mL, entre ou cerca de 10 IU/mL e em ou cerca de 50 IU/mL, entre ou cerca de 10 IU/mL e em ou cerca de 30 IU /mL, entre ou cerca de 30 IU/mL e 500 IU/mL, entre ou cerca de 30 IU/mL e em ou cerca de 400 IU/mL, entre ou cerca de 30 IU/mL e em ou cerca de 300 IU/mL, entre ou cerca de 30 IU/mL e em ou cerca de 200 IU/mL, entre ou cerca de 30 IU/mL e em ou cerca de 100 IU/mL, entre ou cerca de 30 IU/mL e em ou cerca de 70 IU/mL, entre ou cerca de 30 IU/mL e em ou cerca de 50 IU/mL, entre ou cerca de 50 IU/mL e em ou cerca de 400 IU/mL, entre ou cerca de 50 IU/mL e em ou cerca de 500 IU/mL, entre ou cerca de 50 IU/mL e em ou cerca de 300 IU/mL, entre ou cerca de 50 IU/mL e em ou cerca de 200 IU/mL, entre ou cerca de 50 IU/mL e em ou cerca de 100 IU/mL, entre ou cerca de 50 IU/mL e em ou cerca de 70 IU/mL, entre ou cerca de 70 IU/mL e em ou cerca de 500 IU/mL, entre ou cerca de 70 IU/mL e em ou cerca de 400 IU/mL, entre ou cerca de 70 IU/mL e em ou cerca de 300 IU/mL, entre ou cerca de 70 IU/mL e em ou cerca de 200 IU/mL, entre ou cerca de 70 IU/mL e em ou cerca de 100 IU/mL, entre ou cerca de 100 IU/mL e em ou cerca de 500 IU/mL, entre ou cerca de 100 IU/mL e em ou cerca de 400 IU/mL, entre ou cerca de 100 IU/mL e em ou cerca de 300 IU/mL, entre ou cerca de 100 IU/mL e em ou cer- ca de 200 IU/mL, entre ou cerca de 200 IU/mL e em ou cerca de 500 IU/mL, entre ou cerca de 200 IU/mL e em ou cerca de 400 IU/mL, en- tre ou cerca de 200 IU/mL e em ou cerca de 300 IU/mL, entre ou cerca de 300 IU/mL e em ou cerca de 500 IU/mL, entre ou cerca de 200 IU/mL e em ou cerca de 400 IU/mL, ou entre ou cerca de 400 IU/mL e em ou cerca de 500 IU/mL. Em algumas modalidades, a IL-15 é adici- onada ao meio de cultura em uma quantidade entre ou cerca de 100 IU/mL e em ou cerca de 200 IU/mL. Em algumas modalidades, a IL-15 é adicionada ao meio de cultura em ou cerca de 180 IU/mL.

[00204] Em algumas modalidades, IL-7 recombinante é adicionado ao meio de cultura. A IL-7 é uma citocina que está envolvida na pro- moção da manutenção e homeostase das células T. Em alguns casos, a IL-7 pode aumentar a sobrevivência e proliferação de células T de memória, particularmente o compartimento de memória central. A IL-7 recombinante está disponível comercialmente. Em modalidades parti- culares, a IL-7 recombinante é de grau GMP (por exemplo, MACS GMP Recombinant Human IL-7, Miltenyi Biotec).

[00205] A IL-7 recombinante pode ser incluída em meios de cultura de células durante vários estágios do processo fornecido. Em alguns casos, a IL-7 recombinante pode ser incluída na expansão inicial de células T (primeira expansão), de modo a promover a expansão de TIL para promover seu crescimento e permitir sua proliferação e/ou estabi- lizar o fenótipo de tumor sólido. IL-7 também pode ser incluída na co- cultura de células apresentadoras de antígeno, como descrito na Se- ção I.C, de modo a permitir a ativação de pico de T reativo com neoan- tígeno antes de sua separação ou seleção. Em alguns casos, a IL-7 recombinante também pode ser incluída em culturas para expandir as células T reativas ao tumor durante a segunda fase de expansão, tal como descrito na Seção I.D. A inclusão de IL-7 recombinante no pro-

cesso pode manter ou apoiar a expansão de subconjuntos de células T de memória no processo. Em alguns casos, a IL-7 recombinante po- de ser combinada com a IL-15 recombinante para fornecer ativação, sobrevivência e/ou expansão de células T reativas ao tumor nos méto- dos fornecidos. Em algumas de tais modalidades, a combinação de IL- 7 e IL-15 recombinante é uma alternativa ao uso de IL-2 recombinante na cultura, e o meio de cultura não contém adicionalmente IL-2 recom- binante.

[00206] Em algumas modalidades, a IL-7 recombinante é adiciona- da ao meio de cultura em uma concentração entre ou cerca de 100 IU/mL e em ou cerca de 2000 IU/mL, entre ou cerca de 100 IU/mL e em ou cerca de 1500 IU/mL, entre ou cerca de 100 IU/mL e em ou cerca de 1000 IU/mL, entre ou cerca de 100 IU/mL e em ou cerca de 800 IU/mL, entre ou cerca de 100 IU/mL e em ou cerca de 600 IU/mL, entre ou cerca de 100 IU/mL e em ou cerca de 400 IU/mL, entre ou cerca de 100 IU/mL e em ou cerca de 200 IU/mL, entre ou cerca de 200 IU/mL e em ou cerca de 2000 IU/mL, entre ou cerca de 200 IU/mL e em ou cerca de 1500 IU/mL, entre ou cerca de 200 IU/mL e em ou cerca de 1000 IU/mL, entre ou cerca de 200 IU/mL e em ou cerca de 800 IU/mL, entre ou cerca de 200 IU/mL e em ou cerca de 600 IU/mL, entre ou cerca de 200 IU/mL e em ou cerca de 400 IU/mL, entre ou cerca de 400 IU/mL e em ou cerca de 2000 IU/mL, entre ou cerca de 400 IU/mL e em ou cerca de 1500 IU/mL, entre ou cerca de 400 IU/mL e em ou cerca de 1000 IU/mL, entre ou cerca de 400 IU/mL e em ou cerca de 800 IU/mL, entre ou cerca de 400 IU/mL e em ou cerca de 600 IU/mL, entre ou cerca de 600 IU/mL e em ou cerca de 2000 IU/mL, entre ou cerca de 600 IU/mL e em ou cerca de 1500 IU/mL, entre ou cerca de 600 IU/mL e em ou cerca de 1000 IU/mL, entre ou cerca de 600 IU/mL e em ou cerca de 800 IU/mL, entre ou cerca de 800 IU/mL e em ou cerca de 2000 IU/mL, entre ou cerca de 800 IU/mL e em ou cerca de 1500 IU/mL, entre ou cerca de 800 IU/mL e em ou cerca de 1000 IU/mL, entre ou cerca de 1000 IU/mL e em ou cerca de 2000 IU/mL, entre ou cerca de 1000 IU/mL e em ou cerca de 1500 IU/mL, entre ou cerca de 1500 IU/mL e em ou cerca de 2000 IU/mL. Em al- gumas modalidades, a IL-7 é adicionada ao meio de cultura em uma quantidade entre ou cerca de 1000 IU/mL e em ou cerca de 2000 IU/mL. Em algumas modalidades, a IL-7 é adicionada ao meio de cul- tura em ou cerca de 600 IU/mL.

[00207] Em algumas modalidades, a IL-21 recombinante é adicio- nada ao meio de cultura. IL-21 é uma citocina que suporta uma ampla gama de ativação de células T sem aumentar a sinalização de células T regulatórias. Em alguns casos, a IL-21 pode suportar a estabilização das células de memória, a função efetora e a proliferação de células T com experiência no antígeno. A IL-21 pode induzir a regulação positiva de moléculas efetoras em células T CD4 e CD8. A IL-21 recombinante está disponível comercialmente. Em modalidades particulares, a IL-21 recombinante é de grau GMP (por exemplo, MACS GMP Recombinant Human IL-21, Miltenyi Biotec).

[00208] IL-21 recombinante pode ser incluída em meios de cultura de células durante vários estágios do processo fornecido. Em alguns casos, a IL-21 recombinante pode ser incluída na expansão inicial das células T (primeira expansão), de modo a promover o crescimento de TIL de tumor sólido, incluindo a estabilização da ativação, função e/ou proliferação de células T de memória. Em alguns aspectos, a presença de IL-21 permite uma recuperação melhorada de TIL. A IL-21 recom- binante também pode ser incluída na cocultura de células apresenta- doras de antígeno, como descrito na Seção I.C, como devido à capa- cidade de estimular a expressão de marcadores de ativação de células T, incluindo a expressão de marcadores de ativação em TIL reativo a neoantígeno. Em alguns casos, a IL-21 recombinante também pode ser incluída em culturas para expandir as células T reativas ao tumor durante a segunda fase de expansão, conforme descrito na Seção I.D, tal como para suportar a proliferação e estabilização do fenótipo de memória.

[00209] Em algumas modalidades, a IL-21 recombinante é adicio- nada ao meio de cultura em uma concentração entre ou cerca de 0,5 IU/mL e em ou cerca de 20 IU/mL, entre ou cerca de 0,5 IU/mL e em ou cerca de 15 IU/mL, entre ou cerca de 0,5 IU/mL e em ou cerca de 10 IU/mL, entre ou cerca de 0,5 IU/mL e em ou cerca de 5 IU/mL, en- tre ou cerca de 0,5 IU/mL e em ou cerca de 2,5 IU/mL, entre ou cerca de 0,5 IU/mL e em ou cerca de 1 IU/mL, entre ou cerca de 1 IU/mL e em ou cerca de 20 IU/mL, entre ou cerca de 1 IU/mL e em ou cerca de 15 IU/mL, entre ou cerca de 1 IU/mL e em ou cerca de 10 IU/mL, entre ou cerca de 1 IU/mL e em ou cerca de 5 IU/mL, entre ou cerca de 1 IU/mL e em ou cerca de 2,5 IU/mL, entre ou cerca de 2,5 IU/mL e em ou cerca de 20 IU/mL, entre ou cerca de 2,5 IU/mL e em ou cerca de 15 IU/mL, entre ou cerca de 2,5 IU/mL e em ou cerca de 10 IU/mL, en- tre ou cerca de 2,5 IU/mL e em ou cerca de 5 IU/mL, entre ou cerca de 5 IU/mL e em ou cerca de 20 IU/mL, entre ou cerca de 5 IU/mL e em ou cerca de 15 IU/mL, entre ou cerca de 5 IU/mL e em ou cerca de 10 IU/mL, entre ou cerca de 10 IU/mL e em ou cerca de 20 IU/mL, entre ou cerca de 10 IU/mL e em ou cerca de 15 IU/mL, ou entre ou cerca de 15 IU/mL e em ou cerca de 20 IU/mL. Em algumas modalidades, a IL-21 é adicionada ao meio de cultura em uma quantidade entre ou cerca de 0,5 IU/mL e em ou cerca de 2,5 IU/mL. Em algumas modali- dades, a IL-21 é adicionada ao meio de cultura em ou cerca de 1 IU/mL.

[00210] Em modalidades particulares, os agentes estimulatórios de células T presentes durante a incubação, tal como para a expansão de células, contém IL-2 recombinante. Em algumas modalidades, um ou mais outros agentes estimulatórios podem ser incluídos, como uma ou mais outras citocinas recombinantes de IL-7, IL-15, IL-21 ou um anti- corpo anti-CD3 (por exemplo, OKT-3). Em alguns casos em que um anticorpo anti-CD3 (por exemplo, OKT-3), os agentes estimulatórios de células T também podem incluir um agente coestimulatório, tal como fornecido por células alimentadoras apresentadoras de antígeno, tais como PBMCs, ou um anticorpo anti-CD28 solúvel.

[00211] Em modalidades particulares, os agentes estimulatórios de células T presentes durante a incubação, tal como para a expansão de células, contém IL-2 recombinante, um anticorpo anti-CD3, por exem- plo, OKT-3 e células alimentadoras apresentadoras de antígeno, tais como PBMCs.

[00212] Em modalidades particulares, os agentes estimulatórios de células T presentes durante a incubação, tal como para a expansão de células, contém IL-2 recombinante, um anticorpo anti-CD3, por exem- plo, OKT-3 e um anticorpo anti-CD28. Em algumas modalidades, o an- ticorpo anti-CD3 e/ou o anticorpo anti-CD28 são solúveis. Em algumas modalidades, um ou ambos os anticorpos anti-CD3 e anti-CD28 estão ligados a uma superfície sólida, como uma conta (por exemplo, Ex- pansou de Célula T CD3/CD28 DYNABEADS® M-450).

[00213] Em modalidades particulares, os agentes estimulatórios de células T presentes durante a incubação, tal como para a expansão de células, contém IL-2 recombinante, IL-15 recombinante, IL-7 recombi- nante, um anticorpo anti-CD3, por exemplo, OKT-3 e células alimenta- doras apresentadoras de antígeno, tais como PBMCs.

[00214] Em modalidades particulares, os agentes estimulatórios de células T presentes durante a incubação, tal como para a expansão de células, contém IL-2 recombinante, IL-15 recombinante, IL-7 recombi- nante, um anticorpo anti-CD3, por exemplo, OKT-3 e um anticorpo an- ti-CD28. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-CD3 e/ou o anti-

corpo anti-CD28 são solúveis. Em algumas modalidades, um ou am- bos os anticorpos anti-CD3 e anti-CD28 estão ligados a uma superfície sólida, tal como ums conta (por exemplo, Expansor de Célula T CD3/CD28 DYNABEADS® M-450).

[00215] Em modalidades particulares, os agentes estimulatórios de células T presentes durante a incubação, tal como para a expansão de células, contém IL-15 recombinante e IL-7 recombinante, um anticorpo anti-CD3, por exemplo, OKT-3 e células alimentadoras apresentadoras de antígeno, tais como PBMCs.

[00216] Em modalidades particulares, os agentes estimulatórios de células T presentes durante a incubação, tal como para a expansão de células, contém IL-15 recombinante e IL-7 recombinante, um anticorpo anti-CD3, por exemplo, OKT-3 e um anticorpo anti-CD28. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-CD3 e/ou o anticorpo anti-CD28 são so- lúveis. Em algumas modalidades, um ou ambos os anticorpos anti- CD3 e anti-CD28 estão ligados a uma superfície sólida, tal como uma conta (por exemplo, Expansor de Célula T CD3/CD28 DYNABEADS® M-450).

[00217] Em algumas modalidades, a incubação com os agentes es- timulatórios de células T é realizada sob condições para a expansão inicial de células T da amostra biológica. Em algumas modalidades, as células são cultivadas a cerca de 37 °C com cerca de 5% de CO2.

[00218] Em algumas modalidades, a incubação com os agentes es- timulatórios de células T é realizada por ou cerca de 1 dia, tal como geralmente em ou cerca de 2 dias, 3 dias, 4 dias, 5 dias, 6 dias, 7 dias, 8 dias, 9 dias, 10 dias, 11 dias, 12 dias ou qualquer intervalo de tempo entre qualquer um dos anteriores. Em algumas modalidades, a incu- bação com os agentes estimulatórios de células T é realizada por 7 a 21 dias, tal como 7 dias, 8 dias, 9 dias, 10 dias, 11 dias, 12 dias, 13 dias, 14 dias, 15 dias, 16 dias, 17 dias, 18 dias, 19 dias, 20 dias ou 21 dias, ou qualquer valor entre qualquer um dos anteriores. Em algumas modalidades, a incubação é realizada por 7 a 14 dias. Em algumas modalidades, a incubação é realizada por 7 a 10 dias. Em algumas modalidades, a incubação é de ou cerca de 7 dias. Em algumas moda- lidades, a incubação é de ou cerca de 8 dias. Em algumas modalida- des, a incubação é de ou cerca de 9 dias. Em algumas modalidades, a incubação é de ou cerca de 10 dias.

[00219] A incubação, tal como para a expansão inicial de células T na amostra biológica, pode ser realizada em condições de GMP. Em algumas modalidades, a incubação é em um sistema fechado, que em alguns aspectos pode ser um sistema automatizado fechado. Em al- gumas modalidades, o meio de cultura contendo os agentes estimula- tórios de células T podem ser um meio sem soro. Em algumas modali- dades, a incubação é realizada em um sistema automatizado fechado e com meio sem soro.

[00220] Em algumas modalidades, a expansão inicial de células sob uma ou mais condições estimulatórias é em um recipiente de cultura adequado para a expansão celular. Em algumas modalidades, o reci- piente de cultura é um recipiente de cultura permeável a gases, tal como um sistema G-Rex (por exemplo, G-Rex 10, G-Rex 10M, G-Rex 100 M/100M-CS ou G-Rex 500 M/500M-CS). Em algumas modalida- des, o recipiente de cultura é uma microplaca, frasco, barra ou outro recipiente de cultura adequado para a expansão de células em um sis- tema fechado. Em algumas modalidades, a expansão pode ser reali- zada em um biorreator. Em algumas modalidades, a expansão inicial pode ser realizada usando um sistema de expansão celular por trans- ferência das células para sacos permeáveis a gases, tal como em co- nexão com um biorreator (por exemplo, Xuri Cell Expansion System W25 (GE Healthcare)). Em uma modalidade, o sistema de expansão celular inclui um recipiente de cultura, tal como um saco, por exemplo,

saco de células permeável a gás, com um volume que é cerca de 50 mL, cerca de 100 mL, cerca de 200 mL, cerca de 300 mL, cerca de 400 mL, cerca de 500 mL, cerca de 600 mL, cerca de 700 mL, cerca de 800 mL, cerca de 900 mL, cerca de 1 L, cerca de 2 L, cerca de 3 L, cerca de 4 L, cerca de 5 L, cerca de 6 L, cerca de 7 L, cerca de 8 L, cerca de 9 L e cerca de 10 L, ou qualquer valor entre qualquer um dos anteriores. Em algumas modalidades, o processo é automatizado ou semiautomatizado. Exemplos de biorreatores adequados para a ex- pansão de perfusão automatizada incluem, mas não são limitados a, GE Xuri W25, GE Xuri W5, Sartorius BioSTAT RM 20 | 50, Finesse SmartRocker Bioreactor Systems e Pall XRS Bioreactor Systems ou Miltenyi Prodigy. Em alguns aspectos, a cultura de expansão é reali- zada em condições estáticas. Em algumas modalidades, a cultura de expansão é realizada sob condições de balanço. O meio pode ser adi- cionado em bolus ou pode ser adicionado em um cronograma de per- fusão. Em algumas modalidades, o biorreator mantém a temperatura em ou próxima a 37 °C e os níveis de CO2 em ou próximos a 5% com um fluxo de ar estável em, em cerca de ou pelo menos 0,01 L/min, 0,05 L/min, 0,1 L/min, 0,2 L/min, 0,3 L/min, 0,4 L/min, 0,5 L/min, 1,0 L/min, 1,5 L/min ou 2,0 L/min ou superior a 2,0 L/min. Em certas moda- lidades, pelo menos uma parte da cultura é realizada com perfusão, tal como com uma taxa de 290 ml/dia, 580 ml/dia e/ou 1160 ml/dia.

[00221] Em algumas modalidades, as células são semeadas em um recipiente de cultura apropriado (por exemplo, saco permeável a gás) a uma densidade de 0,5 x 106 células/mL a 1,5 x 106 células/mL. Em algumas modalidades, a densidade é de ou cerca de 0,5 x 106 célu- las/mL, 0,75 x 106 células/mL, 1 x 106 células/mL, 1,25 x 106 célu- las/mL ou 1,5 x 106 células/mL, ou qualquer valor entre qualquer um dos anteriores.

[00222] Em alguns aspectos, as células são expandidas em um sis-

tema de expansão fechado automatizado que é habilitado para perfu- são. As perfusões podem adicionar continuamente meio às células pa- ra garantir que uma taxa de crescimento ideal seja alcançada.

[00223] Os métodos de expansão podem ser realizados sob condi- ções de GMP, incluindo em um sistema automatizado fechado e usan- do meio sem soro. Em algumas modalidades, qualquer uma ou mais das etapas do método podem ser realizadas em um sistema fechado ou sob condições de GMP. Em certas modalidades, todas as opera- ções do processo são realizadas em um pacote GMP. Em algumas modalidades, um sistema fechado é usado para realizar uma ou mais das outras etapas de processamento de um método para a fabricação, geração ou produção de uma terapia celular. Em algumas modalida- des, uma ou mais ou todas as etapas de processamento, por exemplo, etapas de isolamento, seleção e/ou enriquecimento, processamento, cultura, incluindo incubação em conexão com a expansão das células e as etapas de formulação são realizadas usando um sistema, disposi- tivo, ou aparelho em um sistema integrado ou autônomo e/ou de forma automatizada ou programável. Em alguns aspectos, o sistema ou apa- relho inclui um computador e/ou programa de computador em comuni- cação com o sistema ou aparelho, o que permite que um usuário pro- grame, controle, avalie o resultado e/ou ajuste vários aspectos das etapas de processamento, isolamento, engenharia e formulação.

[00224] Em algumas modalidades, imediatamente após a incuba- ção, as células estimuladas podem ser coletadas para cocultura sub- sequente com APCs, tal como de acordo com os métodos descritos na Seção I.C abaixo.

[00225] Em algumas modalidades, as células estimuladas são cole- tadas e crio-congeladas. O fornecimento de uma etapa de retenção intermediária por criopreservação após a fase de expansão inicial po- de ser usado para coordenar o tempo com a identificação do neoepí-

topo e geração de peptídeo, tal como descrito na Seção I.A e/ou a ge- ração de APCs como descrito na Seção I.C. Em algumas modalida- des, para a criopreservação, as células estimuladas são formuladas como uma composição com um crioprotetor. Em algumas modalida- des, o crioprotetor é ou compreende DMSO e/ou glicerol s. Em algu- mas modalidades, as composições formuladas para criopreservação podem ser armazenadas em temperaturas baixas, tal como temperatu- ras ultrabaixas, por exemplo, armazenamento com faixas de tempera- tura de -40ºC a -150ºC, tal como ou cerca de 80ºC ± 6,0ºC.

[00226] Em algumas modalidades, as células criopreservadas são preparadas para as etapas subsequentes de descongelamento. Em alguns casos, as células podem estar prontas para cultura subsequen- te com APCs e peptídeos imediatamente após o descongelamento após uma ou mais etapas de lavagem. C. Cocultura de células T com APCs

[00227] Em modalidades dos métodos fornecidos, uma vez que os neopítopos que codificam para proteínas são sintetizados, uma plurali- dade de peptídeos sintéticos são colocados em contato com células apresentadoras de antígeno sob condições para apresentar peptídeos no contexto de uma molécula de MHC e incubados com células T de uma população de T células para reconhecimento dos peptídeos apre- sentados nas APCs. Em algumas modalidades, os peptídeos sintéticos são pulsados em APCs autólogas ou alogênicas que são então co- cultivadas com células T do paciente. Células apresentadoras de antí- genos são usadas para apresentar esses peptídeos. As células T que reconhecem esses peptídeos na superfície da APC podem então ser isoladas, tal como pelos métodos descritos abaixo. As células incuba- das podem ser cultivadas em condições que enriquecem e expandem células T reativas ao tumor, isto é, células T contendo TCR endógeno que são reativos a peptídeos presentes nas APCs, na cultura. Em al-

gumas modalidades, os métodos incluem a cultura das células T sob condições de expansão até que uma quantidade limite de células T seja obtida e/ou até 20 dias após o início da incubação. Em algumas modalidades, dos métodos fornecidos, o método pode incluir a cocultu- ra das células T com as APCs ao longo de várias horas a dias e, em seguida, separar as células apresentadoras de antígeno da população de células T para a expansão das células T sob condições para enri- quecer ou expandir as células T reativas ao tumor. Em algumas moda- lidades, dos métodos fornecidos, o método pode incluir a cocultura das células T com as APCs ao longo de 1 a 7 dias e, em seguida, separar as células apresentadoras de antígeno da população de células T para a expansão das células T sob condições para enriquecer ou expandir células T reativas ao tumor. Em algumas modalidades, a separação pode incluir isolar ou selecionar células T reativas da cultura com base em um ou mais marcadores de ativação de células T em células T.

[00228] Vários métodos podem ser usados para cultivar células pa- ra especificidade de antígeno, ver, por exemplo, Pedido publicado US No. US2017/0224800.

[00229] Em algumas modalidades, as células T reativas ao tumor são co-cultivadas com APCs que foram colocadas em contato ou ex- postas para apresentar um peptídeo, por exemplo, contendo uma se- quência de aminoácidos mutada, tal como peptídeos de neoepítopos como descrito acima. O método pode compreender a indução de célu- las apresentadoras de antígeno autólogo (APCs) do paciente para apresentar a sequência de aminoácidos mutada. As APCs podem in- cluir quaisquer células que apresentem fragmentos de peptídeos de proteínas em associação com moléculas de complexo de histocompa- tibilidade principal (MHC) em sua superfície celular. A molécula de MHC pode ser qualquer molécula de MHC expressa pelo paciente, in- cluindo, mas não limitadas a, MHC de classe I, MHC de classe II, HLA-

A, HLA-B, HLA-C, HLA-DM, HLA-DO, HLA-DP, HLA-DQ e moléculas HLA-DR. As APCs podem incluir, por exemplo, qualquer um ou mais macrófagos, DCs, células de Langerhans, linfócitos B e células T. Em modalidades particulares, as APCs são DCs. Em algumas modalida- des particulares, as APCs são células B. Em algumas modalidades, as APCs são APCs artificiais.

[00230] Em modalidades particulares, as APCs incluem células que são capazes de apresentar moléculas restritas de Classe I e Classe II. Por exemplo, células B e DCs têm a capacidade de apresentar molé- culas restritas a MHC de classe I e MHC de classe II. Em algumas modalidades, a amostra de células APC inclui células B e DCs. Em algumas modalidades, a amostra de células APC é enriquecida para células B, tal como por seleção ou isolamento de uma amostra de cé- lulas primárias. Em algumas modalidades, a amostra de células APC é enriquecida para DCs, tal como por seleção ou isolamento de uma amostra de células primárias.

[00231] Em algumas modalidades, as APCs expressam moléculas de MHC de classe I e/ou MHC de classe II com um HLA correspon- dente a partir do qual a fonte de células T foi obtida. Em modalidades particulares, tanto as APCs quanto as células T foram isoladas do mesmo indivíduo, ou seja, são autólogas para o paciente com câncer. Em algumas modalidades, o método pode compreender induzir células apresentadoras de antígeno autólogo (APCs) do paciente a apresentar a sequência de aminoácidos mutada. Ao usar APCs autólogas do pa- ciente, os métodos podem identificar células T que têm especificidade antigênica para uma sequência de aminoácidos mutada codificada por uma mutação específica do câncer que é apresentada no contexto de uma molécula de MHC expressa pelo paciente.

[00232] Em algumas modalidades, as APCs são células de uma amostra de sangue ou aférese de um indivíduo, tal como o paciente.

Em algumas modalidades, as APCs incluem células presentes em uma amostra de células mononucleares de sangue periférico (PBMC). Normalmente, a função de APCs em uma cultura de PBMC envolve principalmente monócitos e células B. Em algumas modalidades, uma população de PBMCs isolados pode ser usada como APCs nos méto- dos fornecidos. PBMCs podem ser obtidos usando métodos padrão, tais como separação de gradiente Ficoll-Paque. Em alguns casos, as APCs são ou incluem células B que são isoladas do sangue ou amos- tra de aférese ou de uma amostra de PBMC. Em outros casos, as APCs são ou incluem monócitos isolados do sangue ou amostra de aférese ou de uma amostra de PBMC. Em alguns aspectos, os monó- citos podem ser usados como uma fonte para a preparação de DCs derivadas de monócitos para uso como APCs. Em algumas modalida- des, uma fonte de DCs derivadas de monócitos (por exemplo, células CD11chighMHCIIhighCD14low) pode ser gerada ex vivo a partir de monó- citos isolados, por cultura com GM-CSF e IL-4 por 4 a 6 dias para pro- duzir células dendríticas derivadas de monócitos. Em modalidades particulares, os monócitos são isolados de PBMCs, tal como por sele- ção de CD14 e, em seguida, são cultivados com GM-CSF e IL-4 por 4 a 6 dias.

[00233] Em algumas modalidades, as APCs são células primárias (por exemplo, células B ou DCs derivadas de monócitos) que são competentes para replicação, por exemplo, as células não são subme- tidas a irradiação, tratamento térmico ou outro método que resultaria em sua inativação. Em modalidades particulares, os métodos forneci- dos não usam APCs irradiadas. Em algumas modalidades, as APCs são células primárias recém-isoladas obtidas do indivíduo ou são deri- vadas de células primárias obtidas do indivíduo. Em algumas modali- dades, as APCs foram criopreservadas e subsequentemente descon- geladas antes da cocultura com as células T estimuladas de acordo com os métodos fornecidos.

[00234] Em algumas modalidades particulares, as células B são usadas como uma fonte de APCs e são geradas a partir de uma afére- se do paciente, como uma aférese autóloga para o indivíduo a partir do qual os fragmentos de tumor e/ou células T foram obtidos. Em ou- tras modalidades particulares, células dendríticas derivadas de monó- citos são usadas como uma fonte de APCs e são geradas a partir de monócitos de uma aférese de paciente, tal como uma aférese autóloga para o indivíduo a partir do qual o fragmento de tumor e/ou células T são obtidos.

[00235] Em algumas modalidades, as APCs isoladas ou geradas são coletadas e crio-congeladas. O fornecimento de uma etapa de re- tenção intermediária por criopreservação após o isolamento ou gera- ção de APCs pode ser usado para coordenar o tempo com a identifi- cação de neoepítopo e geração de peptídeo, tal como descrito na Se- ção I.A e/ou expansão inicial de células T, como descrito na Seção I.B. Em algumas modalidades, para a criopreservação, as APCs isoladas ou geradas são formuladas como uma composição com um crioprote- tor. Em algumas modalidades, o crioprotetor é ou compreende DMSO e/ou glicerol s. Em algumas modalidades, as composições formuladas para criopreservação podem ser armazenadas em temperaturas bai- xas, tal como temperaturas ultrabaixas, por exemplo, armazenamento com faixas de temperatura de -40 ºC a -150 ºC, tal como ou cerca de 80 ºC ± 6,0 ºC.

[00236] Em algumas modalidades, as células criopreservadas são preparadas para as etapas subsequentes de descongelamento. Em alguns casos, as células podem estar prontas para cultura subsequen- te com células T e peptídeos imediatamente após o descongelamento após uma ou mais etapas de lavagem.

[00237] Em modalidades particulares, os métodos para enriqueci-

mento ou seleção de células reativas ao tumor são iniciados pelo con- tato de PBMCs com a sequência de aminoácidos mutada, tal como um ou mais, tal como uma pluralidade de, peptídeos de neoepítopos. Os PBMCs/peptídeos podem então ser cultivados com células T estimula- das. Os PBMCs e células T podem ser obtidos do mesmo indivíduo.

[00238] Em modalidades particulares, os métodos para enriqueci- mento ou seleção de células tumorais reativas são iniciados pelo con- tato de células B com a sequência de aminoácidos mutada, tal como um ou mais, tal como uma pluralidade de, peptídeos de neoepítopos. As células B/peptídeos podem então ser cultivadas com células T es- timuladas. As células B e células T podem ser obtidas do mesmo indi- víduo.

[00239] Em modalidades particulares, os métodos para enriqueci- mento ou seleção de células tumorais reativas são iniciados pelo con- tato de DCs derivadas de monócitos com a sequência de aminoácidos mutada, tal como um ou mais, tal como uma pluralidade de peptídeos de neoepítopos. As DCs/peptídeos derivados de monócitos podem en- tão ser cultivadas com células T estimuladas. As DCs e células T deri- vadas de monócitos podem ser obtidas ou derivadas do mesmo indiví- duo.

[00240] Em algumas modalidades, a APC é uma célula apresenta- dora de antígeno artificial (aAPC). Normalmente, aAPCs incluem ca- racterísticas de APCs naturais, incluindo a expressão de uma molécula de MHC, moléculas estimulatória e coestimulatória, receptor Fc, molé- culas de adesão e/ou a capacidade de produzir ou secretar citocinas (por exemplo, IL-2). Normalmente, uma aAPC é uma linhagem celular que carece de expressão de um ou mais dos acima, e é gerado pela introdução (por exemplo, por transfecção ou transdução) de um ou mais dos elementos ausentes de uma molécula de MHC, um receptor Fc de baixa afinidade (CD32), um receptor Fc de alta afinidade

(CD64), um ou mais de um sinal coestimulatório (por exemplo, CD7, B7-1 (CD80), B7-2 (CD86), PD-L1, PD-L2, 4-1BBL, OX40L, ICOS-L, ICAM, CD30L, CD40, CD70, CD83, HLA-G, MICA, MICB, HVEM, re- ceptor beta de linfotoxina, ILT3, ILT4, 3/TR6 ou um ligante de B7-H3; ou um anticorpo que se liga especificamente a CD27, CD28, 4-1BB, OX40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, LFA-1, CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, Receptor de ligante de Toll ou um ligante de CD83), uma mo- lécula de adesão celular (por exemplo, ICAM-1 ou LFA-3) e/ou uma citocina (por exemplo, IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-10, IL-12, IL-15, IL-21, interferon-alpha (IFNα), interferon-beta (IFNβ), interferon-gamma (IFNγ), fator de necrose tumoral alfa (TNFα), fator de necrose tumoral beta (TNFβ), fator estimulatório de colônias de macrófagos de granu- lócitos (GM-CSF) e fator estimulatório de colônias de granulócitos (GCSF)). Em alguns casos, uma aAPC normalmente não expressa uma molécula de MHC, mas pode ser projetado para expressar uma molécula de MHC ou, em alguns casos, é ou pode ser induzido a ex- pressar uma molécula de MHC, tal como por estimulação com citoci- nas.

Em alguns casos, aAPCs também podem ser carregadas com um ligante estimulatório ou coestimulatório, que pode incluir, por exemplo, um anticorpo anti-CD3, um anticorpo anti-CD28 ou um anticorpo anti- CD2. Um exemplo de uma linhagem de células que pode ser usada como estrutura para gerar uma aAPC é uma linhagem de células K562 ou linhagem de células de fibroblastos.

Várias aAPCs são conhecidas na técnica, ver por exemplo, Patente U.S.

No. 8.722.400, pedido publi- cado No.

US2014/0212446; Butler and Hirano (2014) Immunol Rev., 257(1):10. 1111/imr.12129; Suhoshki et al. (2007) Mol.

Ther., 15:981- 988). Em modalidades particulares, os métodos para enriquecimento ou seleção de células reativas de tumor são iniciados pelo contato de aAPCs com a sequência de aminoácidos mutada, tal como um ou mais, tal como uma pluralidade de peptídeos de neoepítopos.

Os aAPC/peptídeos podem então ser cultivados com células T estimula- das.

[00241] A indução de APCs (por exemplo, células B ou DCs deriva- das de monócitos) para apresentar a sequência de aminoácidos muta- da pode ser realizada usando vários métodos adequados. Em uma modalidade, induzir APCs a apresentar a sequência de aminoácidos mutada (por exemplo, neoepítopo de peptídeo) compreende pulsar as APCs com peptídeos sintéticos compreendendo a sequência de ami- noácidos mutada ou um pool de peptídeos, cada peptídeo no pool compreendendo uma sequência de aminoácidos mutada diferente. Em alguns casos, as APCs são pulsadas com os peptídeos usando eletro- poração em uma célula apresentadora de antígeno. Os peptídeos sin- téticos podem então ser apresentados pelas células apresentadoras de antígeno para serem reconhecidos por células CD8 (MHC classe I) ou células CD4 (MHC classe II). Em certas modalidades particulares, os peptídeos sintéticos são gerados para serem adequados para ex- pressão por moléculas restritas de MHC de classe I para reconheci- mento por células CD8. Em outras modalidades particulares, os peptí- deos sintéticos são gerados para serem adequados para expressão por moléculas restritas de MHC de classe II para reconhecimento por células CD4.

[00242] Em algumas modalidades, as APCs (por exemplo, PBMCs, células B ou DCs derivadas de monócitos) são colocadas em contato com um único peptídeo ou um pool de peptídeos. O pool de peptídeos pode representar muitas sequências de aminoácidos mutadas diferen- tes, tais como 5, 10, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 ou 100 peptídeos, ou qualquer valor entre qualquer um dos anteriores.

[00243] Os peptídeos ou pool de peptídeos são carregados em cé- lulas apresentadoras de antígeno (por exemplo, células dendríticas),

tal como por pulsação de peptídeo, em concentrações adequadas para sua apresentação na superfície de um complexo principal de histo- compatibilidade (MHC).

[00244] Em algumas modalidades, a concentração de peptídeo que representa um peptídeo individual ou único pode variar entre ou cerca de 0,00000 1 µg/mL e em ou cerca de 10 µg/mL. Em algumas modali- dades, a concentração de peptídeo representando um peptídeo indivi- dual ou único pode variar entre ou cerca de 0,00001 µg/mL e em ou cerca de 10 µg/mL, em ou cerca de 0,00001 µg/mL e em ou cerca de 1 µg/mL, em ou cerca de 0,00001 µg/mL e em ou cerca de 0,1 µg/mL, em ou cerca de 0,00001 µg/mL e em ou cerca de 0,01 µg/mL, em ou cerca de 0,00001 µg/mL e em ou cerca de 0,001 µg/mL, em ou cerca de 0,00001 µg/mL e em ou cerca de 0,0001 µg/mL, em ou cerca de 0,0001 µg/mL e 10 µg/mL, em ou cerca de 0,0001 µg/mL e em ou cer- ca de 1 µg/mL, em ou cerca de 0,0001 µg/mL e em ou cerca de 0,1 µg/mL, em ou cerca de 0,0001 µg/mL e em ou cerca de 0,01 µg/mL, em ou cerca de 0,0001 µg/mL e em ou cerca de 0,001 µg/mL, em ou cerca de 0,001 µg/mL e em ou cerca de 10 µg/mL, em ou cerca de 0,001 µg/mL e em ou cerca de 1 µg/mL, em ou cerca de 0,001 µg/mL e em ou cerca de 0,1 µg/mL, em ou cerca de 0,001 µg/mL e em ou cerca de 0,01 µg/mL, em ou cerca de 0,01 µg/mL e em ou cerca de 10 µg/mL, em ou cerca de 0,01 µg/mL e em ou cerca de 1 µg/mL, em ou cerca de 0,01 µg/mL e em ou cerca de 0,1 µg/mL, em ou cerca de 0,1 µg/mL e em ou cerca de 10 µg/mL, em ou cerca de 0,1 µg/mL e em ou cerca de 1 µg/mL, ou em ou cerca de 1 µg/mL e em ou cerca de 10 µg/mL. Em algumas modalidades, a concentração representando um peptídeo individual ou único pode ser em ou cerca de 0,00000 1 µg/mL, em ou cerca de 0,00001 µg/mL, em ou cerca de 0,0001 µg/mL, em ou cerca de 0,001 µg/mL, em ou cerca de 0,01 µg/mL, em ou cerca de 0,1 µg/mL, em ou cerca de 1 µg/mL, ou qualquer valor entre qual-

quer um dos anteriores.

[00245] Em algumas modalidades, os peptídeos são um pool de peptídeos que representam muitas sequências de aminoácidos muta- das diferentes e a concentração em média de peptídeos individuais ou únicos no pool pode variar entre ou cerca de 0,00000 1 µg/mL e em ou cerca de 10 µg/mL. Em algumas modalidades, os peptídeos são um pool de peptídeos que representam muitas sequências de aminoáci- dos mutadas diferentes e a concentração em média de peptídeos indi- viduais ou únicos no pool pode variar entre ou cerca de 0,00001 µg/mL e em ou cerca de 10 µg/mL, em ou cerca de 0,00001 µg/mL e em ou cerca de 1 µg/mL, em ou cerca de 0,00001 µg/mL e em ou cerca de 0,1 µg/mL, em ou cerca de 0,00001 µg/mL e em ou cerca de 0,01 µg/mL, em ou cerca de 0,00001 µg/mL e em ou cerca de 0,001 µg/mL, em ou cerca de 0,00001 µg/mL e em ou cerca de 0,0001 µg/mL, em ou cerca de 0,0001 µg/mL e 10 µg/mL, em ou cerca de 0,0001 µg/mL e em ou cerca de 1 µg/mL, em ou cerca de 0,0001 µg/mL e em ou cerca de 0,1 µg/mL, em ou cerca de 0,0001 µg/mL e em ou cerca de 0,01 µg/mL, em ou cerca de 0,0001 µg/mL e em ou cerca de 0,001 µg/mL, em ou cerca de 0,001 µg/mL e em ou cerca de 10 µg/mL, em ou cerca de 0,001 µg/mL e em ou cerca de 1 µg/mL, em ou cerca de 0,001 µg/mL e em ou cerca de 0,1 µg/mL, em ou cerca de 0,001 µg/mL e em ou cerca de 0,01 µg/mL, em ou cerca de 0,01 µg/mL e em ou cerca de 10 µg/mL, em ou cerca de 0,01 µg/mL e em ou cerca de 1 µg/mL, em ou cerca de 0,01 µg/mL e em ou cerca de 0,1 µg/mL, em ou cerca de 0,1 µg/mL e em ou cerca de 10 µg/mL, em ou cerca de 0,1 µg/mL e em ou cerca de 1 µg/mL, ou em ou cerca de 1 µg/mL e em ou cerca de 10 µg/mL. Em algumas modalidades, a concentração em média de peptídeos individuais ou únicos no pool pode ser em ou cerca de 0,00000 1 µg/mL, em ou cerca de 0,00001 µg/mL, em ou cerca de 0,0001 µg/mL, em ou cerca de 0,001 µg/mL, em ou cerca de 0,01 µg/mL, em ou cerca de 0,1 µg/mL, em ou cerca de 1 µg/mL, ou qual- quer valor entre qualquer um dos anteriores.

[00246] Em algumas modalidades, a concentração de peptídeos individuais de um ou mais peptídeos não nativos é, em média, inferior a 0,02 µg/mL. Em algumas modalidades, a concentração de peptídeos individuais de um ou mais peptídeos não nativos é, em média, de ou cerca de 0,00001 µg/mL a ou cerca de 0,01 µg/mL, tal como a ou cer- ca de 0,00001 µg/mL a ou cerca de 0,005 µg/mL, a ou cerca de 0,00001 µg/mL a ou cerca de 0,002 µg/mL, a ou cerca de 0,00001 µg/mL a ou cerca de 0,001 µg/mL, em ou cerca de 0,00001 µg/mL to em ou cerca de 0,0005 µg/mL, em ou cerca de 0,00001 µg/mL to em ou cerca de 0,0002 µg/mL, em ou cerca de 0,00001 µg/mL a em ou cerca de 0,0001 µg/mL, em ou cerca de 0,00001 µg/mL a em ou cerca de 0,00005 µg/mL, em ou cerca de 0,00001 µg/mL a em ou cerca de 0,00002 µg/mL, em ou cerca de 0,00002 µg/mL a em ou cerca de 0,005 µg/mL, em ou cerca de 0,00002 µg/mL a em ou cerca de 0,002 µg/mL, em ou cerca de 0,00002 µg/mL a em ou cerca de 0,001 µg/mL, em ou cerca de 0,00002 µg/mL a em ou cerca de 0,0005 µg/mL, em ou cerca de 0,00002 µg/mL a em ou cerca de 0,0002 µg/mL, em ou cerca de 0,00002 µg/mL a em ou cerca de 0,0001 µg/mL, em ou cerca de 0,00002 µg/mL a em ou cerca de 0,00005 µg/mL, em ou cerca de 0,00005 µg/mL a em ou cerca de 0,005 µg/mL, em ou cerca de 0,00005 µg/mL a em ou cerca de 0,002 µg/mL, em ou cerca de 0,00005 µg/mL a em ou cerca de 0,001 µg/mL, em ou cerca de 0,00005 µg/mL a em ou cerca de 0,0005 µg/mL, em ou cerca de 0,00005 µg/mL a em ou cerca de 0,0002 µg/mL, em ou cerca de 0,00005 µg/mL a em ou cerca de 0,0001 µg/mL, em ou cerca de 0,0001 µg/mL a em ou cerca de 0,005 µg/mL, em ou cerca de 0,0001 µg/mL a em ou cerca de 0,002 µg/mL, em ou cerca de 0,0001 µg/mL a em ou cerca de 0,001 µg/mL, em ou cerca de 0,0001 µg/mL a em ou cerca de 0,0005 µg/mL, em ou cerca de 0,0001 µg/mL a em ou cerca de 0,0002 µg/mL, em ou cerca de 0,0005 µg/mL a em ou cerca de 0,005 µg/mL, em ou cerca de 0,0005 µg/mL a em ou cerca de 0,002 µg/mL, em ou cerca de 0,0005 µg/mL a em ou cerca de 0,001 µg/mL, em ou cerca de 0,001 µg/mL a em ou cerca de 0,005 µg/mL, em ou cerca de 0,001 µg/mL a em ou cerca de 0,002 µg/mL, ou em ou cerca de 0,002 µg/mL a em ou cerca de 0,005 µg/mL.

[00247] Em algumas modalidades, a concentração de peptídeo, re- presentando o peptídeo único ou pool de peptídeos, pode variar entre ou cerca de 0,0001 µg/mL e em ou cerca de 40 µg/mL. A concentração de peptídeo, representando o peptídeo único ou pool de peptídeos, pode variar entre em ou cerca de 0,001 µg/mL e em ou cerca de 40 µg/mL, em ou cerca de 0,001 µg/mL e em ou cerca de 25 µg/mL, 0,001 µg/mL e em ou cerca de 10 µg/mL, 0,001 µg/mL e em ou cerca de 5 µg/mL, 0,001 µg/mL e em ou cerca de 1 µg/mL , 0,001 µg/mL e em ou cerca de 0,5 µg/mL, 0,001 µg/mL e em ou cerca de 0,1 µg/mL, 0,001 µg/mL e em ou cerca de 0,01 µg/mL, 0,01 µg/mL e em ou cerca de 40 µg/mL, tal como em ou cerca de 0,01 µg/mL e em ou cerca de 25 µg/mL, em ou cerca de 0,01 µg/mL e em ou cerca de 10 µg/mL, em ou cerca de 0,01 µg/mL e em ou cerca de 5 µg/mL, em ou cerca de 0,01 µg/mL e em ou cerca de 1 µg/mL, em ou cerca de 0,01 µg/mL e em ou cerca de 0,5 µg/mL, em ou cerca de 0,01 µg/mL e em ou cerca de 0,1 µg/mL, em ou cerca de 0,01 µg/mL e em ou cerca de 0,05 µg/mL, 0,05 µg/mL e em ou cerca de 40 µg/mL, em ou cerca de 0,05 µg/mL e em ou cerca de 25 µg/mL, em ou cerca de 0,05 µg/mL e em ou cerca de 10 µg/mL, em ou cerca de 0,05 µg/mL e em ou cerca de 5 µg/mL, em ou cerca de 0,05 µg/mL e em ou cerca de 1 µg/mL, em ou cerca de 0,05 µg/mL e em ou cerca de 0,5 µg/mL, em ou cerca de 0,05 µg/mL e em ou cerca de 0,1 µg/mL, 0,1 µg/mL e em ou cerca de 40 µg/mL, tal como em ou cerca de 0,1 µg/mL e em ou cerca de 25 µg/mL, em ou cerca de 0,1 µg/mL e em ou cerca de 10 µg/mL, em ou cerca de 0,1 µg/mL e em ou cerca de 5 µg/mL, em ou cerca de 0,1 µg/mL e em ou cerca de 1 µg/mL, em ou cerca de 0,1 µg/mL e em ou cerca de 0,5 µg/mL, 0,5 µg/mL e em ou cerca de 40 µg/mL, em ou cer- ca de 0,5 µg/mL e em ou cerca de 25 µg/mL, em ou cerca de 0,5 µg/mL e em ou cerca de 10 µg/mL, em ou cerca de 0,5 µg/mL e em ou cerca de 5 µg/mL, em ou cerca de 0,5 µg/mL e em ou cerca de 1 µg/mL, 1 µg/mL e em ou cerca de 40 µg/mL, em ou cerca de 1 µg/mL e em ou cerca de 25 µg/mL, em ou cerca de 1 µg/mL e em ou cerca de 10 µg/mL, em ou cerca de 1 µg/mL e em ou cerca de 5 µg/mL, 5 µg/mL e em ou cerca de 40 µg/mL, em ou cerca de 5 µg/mL e em ou cerca de 25 µg/mL, em ou cerca de 5 µg/mL e em ou cerca de 10 µg/mL, 10 µg/mL e em ou cerca de 40 µg/mL, em ou cerca de 10 µg/mL e em ou cerca de 25 µg/mL, ou em ou cerca de 25 µg/mL e em ou cerca de 40 µg/mL. Em algumas modalidades, a concentração de peptídeo, representando o peptídeo único ou pool de peptídeos pode ser em ou cerca de 0,0001 µg/mL, em ou cerca de 0,001 µg/mL, em ou cerca de 0,01 µg/mL, em ou cerca de 0,1 µg/mL, em ou cerca de 1 µg/mL, em ou cerca de 10 µg/mL, em ou cerca de 20 µg/mL, em ou cerca de 30 µg/mL ou em ou cerca de 40 µg/mL ou qualquer valor en- tre qualquer um dos anteriores. Em algumas modalidades, as concen- trações de peptídeos são a concentração de um pool de peptídeos. Em algumas modalidades, a concentração de peptídeo é uma concen- tração de um peptídeo único ou individual.

[00248] Em uma modalidade, induzir APCs (por exemplo, células B ou DCs derivadas de monócitos) para apresentar a sequência de ami- noácidos mutada compreende a introdução de uma sequência de nu- cleotídeos que codifica a sequência de aminoácidos mutada nas APCs. A sequência de nucleotídeos é introduzida nas APCs de modo que as APCs expressem e exibam a sequência de aminoácidos muta-

da, ligada a uma molécula de MHC, na membrana celular.

A sequên- cia de nucleotídeos que codifica o aminoácido mutado pode ser RNA ou DNA.

A introdução de uma sequência de nucleotídeos em APCs pode ser realizada de uma variedade de maneiras diferentes.

Exem- plos não limitantes de técnicas que são úteis para a introdução de uma sequência de nucleotídeos em APCs incluem transformação, transdu- ção, transfecção e eletroporação.

Em alguns casos, os peptídeos para a ligação de moléculas restritas de MHC de classe II são apresentados como um gene que codifica o DNA da mutação e eletroporados na cé- lula apresentadoras de antígeno.

Este DNA será então transcrito in vitro em RNA que codifica peptídeos na superfície para reconhecimen- to por células CD4+. Em alguns casos, os métodos Tandem Mini Gene podem ser empregados para fazer isso para moléculas restritas de MHC de classe II, ver, por exemplo, Pedido de Patente PCT publicado Número WO2016/053338 and Parkhurst et al. (2016) Clin Cancer Res., 23:2491-505. Em uma modalidade em que mais de um gene é identificado, o método pode compreender a preparação de mais de uma sequência de nucleotídeos, cada uma codificando uma sequência de aminoácidos mutada codificada por um gene diferente e introduzin- do cada sequência de nucleotídeos em uma população diferente de APCs.

A este respeito, podem ser obtidas múltiplas populações de APCs, cada população expressando e exibindo uma sequência de aminoácidos mutada diferente.

Por exemplo, no caso em que minige- nes em tandem são usados, APCs (por exemplo, células B ou DCs derivadas de monócitos) são eletroporadas com uma mistura de DNA (pluralidade de DNA) que codifica sequências de aminoácidos muta- das diferentes, que serão então transcrito in vitro em RNA que codifica peptídeos para reconhecimento de superfície por células T CD4+. Em algumas modalidades, as APCs (por exemplo, células B ou DCs deri- vados de monócitos) são eletroporados usando o sistema de eletropo-

ração contínua do Nucleofector Lonza 4D.

[00249] Os métodos incluem a adição de células T (por exemplo, de um paciente com tumor) com a cultura de APCs apresentando os pep- tídeos e a cocultura de APCs e células T por um período de tempo pa- ra permitir a apresentação e o reconhecimento do peptídeo na superfí- cie de APCs por uma ou mais células T na população. Em modalida- des fornecidas, as células T incluem uma população de células T esti- muladas.

[00250] Em algumas modalidades, para APCs de pulsação de pep- tídeo (por exemplo, células B ou DCs derivadas de monócitos) são in- cubadas com peptídeos durante entre ou cerca de 2 horas e em ou cerca de 48 horas, tal como entre ou cerca de 2 horas e em ou cerca de 36 horas, entre ou cerca de 2 horas e em ou cerca de 24 horas, en- tre ou cerca de 2 horas e em ou cerca de 24 horas, entre ou cerca de 2 horas e em ou cerca de 18 horas, entre ou cerca de 2 horas e em ou cerca de 12 horas, entre ou cerca de 2 horas e em ou cerca de 6 ho- ras, entre ou cerca de 6 horas e em ou cerca de 48 horas, entre ou cerca de 6 horas e em ou cerca de 36 horas, entre ou cerca de 6 horas e em ou cerca de 24 horas, entre ou cerca de 6 horas e em ou cerca de 24 horas, entre ou cerca de 6 horas e em ou cerca de 18 horas, en- tre ou cerca de 6 horas e em ou cerca de 12 horas, entre ou cerca de 12 horas e em ou cerca de 48 horas, entre ou cerca de 12 horas e em ou cerca de 36 horas, entre ou cerca de 12 horas e em ou cerca de 24 horas, entre ou cerca de 12 horas e em ou cerca de 18 horas, entre ou cerca de 18 horas e em ou cerca de 48 horas, entre ou cerca de 18 horas e em ou cerca de 36 horas, entre ou cerca de 18 horas e em ou cerca de 24 horas, entre ou cerca de 24 horas e em ou cerca de 48 horas, entre ou cerca de 24 horas e em ou cerca de 36 horas, ou entre ou cerca de 36 horas e em ou cerca de 48 horas. Em algumas modali- dades, as APCs (por exemplo, células B ou DCs derivadas de monóci-

tos) são incubadas com peptídeos por ou cerca de 4 horas, em ou cer- ca de 6 horas, em ou cerca de 7 horas, em ou cerca de 8 horas, em ou cerca de 9 horas, em ou cerca de 10 horas, em ou cerca de 12 horas, em ou cerca de 14 horas, em ou cerca de 16 horas, em ou cerca de 18 horas, em ou cerca de 20 horas, em ou cerca de 22 horas, em ou cer- ca de 24 horas, ou qualquer valor entre qualquer um dos anteriores. Em modalidades particulares, as APCs (por exemplo, PBMCs, células B ou DCs derivadas de monócitos) são incubadas com peptídeos du- rante a noite, tal como por entre ou cerca de 8 a 12 horas. Em algu- mas modalidades, a incubação de cocultura é para em ou cerca de 6 horas.

[00251] As células T (por exemplo, células T estimuladas) e APCs (por exemplo, células B ou DCs derivadas de monócitos) podem estar presentes em uma cultura em uma proporção de células T para APC de 1:100 a 100:1, como 1:50 a 50:1, 1:25 a 25:1, 1:10 a 10:1 ou 1:5 a 5:1. Em algumas modalidades, a proporção de células T (por exemplo, células T estimuladas) para APC é em ou cerca de 1:100, em ou cerca de 1:50, em ou cerca de 1:25, em ou cerca de 1:10, em ou cerca de 1:5, em ou cerca de 1:2,5, em ou cerca de 1:1, em ou cerca de 2:5:1, em ou cerca de 5:1, em ou cerca de 10:1, em ou cerca de 25:1, em ou cerca de 50:1 ou em ou cerca de 100:1, ou qualquer valor entre qual- quer um dos anteriores. Em algumas modalidades, a proporção de cé- lulas T (por exemplo, células T estimuladas) para APC está entre 20:1 e 1:1, entre 15:1 e 1:1, entre 10:1 e 1:1, entre 5:1 e 1:1 ou entre 2,5:1 e 1:1. Em algumas modalidades, a razão de células T (por exemplo, células T estimuladas) para APC está entre 1:20 e 1:1, entre 1:15 e 1:1, entre 1:10 e 1:1, entre 1:5 e 1:1 ou entre 1:2,5 e 1:1. Em modali- dades particulares, a cocultura será realizada misturando as células T, e. população de células T estimuladas e APC (por exemplo, células B ou DC derivadas de monócitos) em aproximadamente uma razão de

3:1. Em algumas modalidades, a cocultura será realizada misturando as células T, por exemplo, população de células T estimuladas e APC (por exemplo, células B ou DC derivadas de monócitos) em aproxima- damente uma razão de 1:1.

[00252] Em algumas modalidades, uma ou mais citocinas recombi- nantes para sustentar células T são adicionadas à cocultura. Em al- gumas modalidades, a citocina recombinante pode incluir um ou mais de IL-2, IL-7, IL-15 ou IL-21. Em algumas modalidades, a cocultura é realizada na presença de IL-2, IL-15 e IL-7 recombinantes. Em algu- mas modalidades, a cocultura é realizada na presença de uma IL-2. Em algumas modalidades, a cocultura é realizada na presença de IL- 15 e IL-17, que, em alguns aspectos, não inclui adicionalmente IL-2.

[00253] A citocina recombinante geralmente é uma proteína huma- na recombinante. Em modalidades particulares, a citocina recombinan- te está presente no meio de cultura de células durante a cocultura em uma concentração de pelo menos ou cerca de ou em ou cerca de 10 IU/mL, pelo menos em ou cerca de ou em ou cerca de 100 IU/mL, pelo menos em ou cerca de ou em ou cerca de 1000 IU/mL, pelo menos em ou cerca de ou em ou cerca de 1500 IU/mL, pelo menos em ou cerca de ou em ou cerca de 2000 IU/mL, pelo menos em ou cerca de ou em ou cerca de 2500 IU/mL, pelo menos em ou cerca de ou em ou cerca de 3000 IU/mL, pelo menos em ou cerca de ou em ou cerca de 3500 IU/mL, pelo menos em ou cerca de ou em ou cerca de 4000 IU/mL, pelo menos em ou cerca de ou em ou cerca de 4500 IU/mL, pelo me- nos em ou cerca de ou em ou cerca de 5000 IU/mL, pelo menos em ou cerca de ou em ou cerca de 5500 IU/mL, pelo menos em ou cerca de ou em ou cerca de 6000 IU/mL, pelo menos em ou cerca de ou em ou cerca de 6500 IU/mL, pelo menos em ou cerca de ou em ou cerca de 7000 IU/mL, pelo menos em ou cerca de ou em ou cerca de 7500 IU/mL, ou pelo menos em ou cerca de ou em ou cerca de 8000 IU/mL.

Em uma modalidade, o meio de cultura celular compreende entre ou cerca de 10 IU/mL e em ou cerca de 100 IU/mL, em ou cerca de 100 IU/mL e em ou cerca de 1000 IU/mL, em ou cerca de 1000 e em ou cerca de 2000 IU/mL, entre ou cerca de 2000 e em ou cerca de 3000 IU/mL, entre ou cerca de 3000 e 4000 em ou cerca de IU/mL, entre ou cerca de 4000 e em ou cerca de 5000 IU/mL, entre ou cerca de 5000 e em ou cerca de 6000 IU/mL, entre ou cerca de 6000 e em ou cerca de 7000 IU/mL, entre ou cerca de 7000 e em ou cerca de 8000 IU/mL, cada um incluso.

[00254] Em algumas modalidades, IL-2 recombinante está presente no meio de cultura celular. Em algumas modalidades, IL-2 recombi- nante é adicionada ao meio de cultura em uma concentração entre ou cerca de 10 IU/mL e em ou cerca de 1000 IU/mL, tal como entre ou cerca de 10 IU/mL e em ou cerca de 600 IU/mL, entre ou cerca de 10 IU/mL e em ou cerca de 400 IU/mL, entre ou cerca de 10 IU/mL e em ou cerca de 200 IU/mL, entre ou cerca de 10 IU/mL e em ou cerca de 100 IU/mL, entre ou cerca de 10 IU/mL e em ou cerca de 50 IU/mL, entre ou cerca de 50 IU/mL e em ou cerca de 1000 IU/mL, entre ou cerca de 50 IU/mL e em ou cerca de 600 IU/mL, entre ou cerca de 50 IU/mL e em ou cerca de 400 IU/mL, entre ou cerca de 50 IU/mL e em ou cerca de 200 IU/mL, entre ou cerca de 50 IU/mL e em ou cerca de 100 IU/mL, entre ou cerca de 100 IU/mL e em ou cerca de 1000 IU/mL, entre ou cerca de 100 IU/mL e em ou cerca de 600 IU/mL, entre ou cerca de 100 IU/mL e em ou cerca de 400 IU/mL, entre ou cerca de 100 IU/mL e em ou cerca de 200 IU/mL, entre ou cerca de 200 IU/mL e em ou cerca de 1000 IU/mL, entre ou cerca de 200 IU/mL e em ou cerca de 600 IU/mL, entre ou cerca de 200 IU/mL e em ou cerca de 400 IU/mL, entre ou cerca de 400 IU/mL e em ou cerca de 1000 IU/mL, entre ou cerca de 400 IU/mL e em ou cerca de 600 IU/mL ou entre ou cerca de 600 IU/mL e em ou cerca de 1000 IU/mL. Em algumas moda-

lidades, a IL-2 recombinante está presente em uma quantidade que está entre 50 e 400 IU/mL.

[00255] Em algumas modalidades, a incubação é realizada com uma dose mais elevada de IL-2. Em alguns aspectos, IL-2 é a única citocina recombinante adicionada à cultura. Em algumas modalidades, a IL-2 recombinante é adicionada ao meio de cultura em uma concen- tração entre ou cerca de 1000 IU/mL em ou cerca de 8000 IU/mL, tal como entre ou cerca de 1000 IU/mL e em ou cerca de 7000 IU/mL, en- tre ou cerca de 1000 IU/mL e em ou cerca de 6000 IU/mL, entre ou cerca de 1000 IU/mL e em ou cerca de 5000 IU/mL, entre ou cerca de 1000 IU/mL e em ou cerca de 4000 IU/mL, entre ou cerca de 1000 IU/mL e em ou cerca de 2000 IU/mL, 2000 IU/mL em ou cerca de 8000 IU/mL, entre ou cerca de 2000 IU/mL e em ou cerca de 7000 IU/mL, entre ou cerca de 2000 IU/mL e em ou cerca de 6000 IU/mL, entre ou cerca de 2000 IU/mL e em ou cerca de 5000 IU/mL, entre ou cerca de 2000 IU/mL e em ou cerca de 4000 IU/mL, 4000 IU/mL em ou cerca de 8000 IU/mL, entre ou cerca de 4000 IU/mL e em ou cerca de 7000 IU/mL, entre ou cerca de 4000 IU/mL e em ou cerca de 6000 IU/mL, entre ou cerca de 4000 IU/mL e em ou cerca de 5000 IU/mL, entre ou cerca de 5000 IU/mL em ou cerca de 8000 IU/mL, entre ou cerca de 5000 IU/mL e em ou cerca de 7000 IU/mL, entre ou cerca de 5000 IU/mL e em ou cerca de 6000 IU/mL, entre ou cerca de 6000 IU/mL em ou cerca de 8000 IU/mL, entre ou cerca de 6000 IU/mL e em ou cerca de 7000 IU/mL ou entre ou cerca de 7000 IU/mL e em ou cerca de 8000 IU/mL. Em algumas modalidades, A IL-2 recombinante está pre- sente em uma quantidade que é ou é de cerca de 6000 IU/mL.

[00256] Em algumas modalidades, a IL-15 recombinante está pre- sente no meio de cultura celular. Em algumas modalidades, a IL-15 recombinante é adicionada ao meio de cultura em uma concentração entre ou cerca de 10 IU/mL e 500 IU/mL, tal como entre ou cerca de

10 IU/mL e em ou cerca de 400 IU/mL, entre ou cerca de 10 IU/mL e em ou cerca de 300 IU/mL, entre ou cerca de 10 IU/mL e em ou cerca de 200 IU/mL, entre ou cerca de 10 IU/mL e em ou cerca de 100 IU/mL, entre ou cerca de 10 IU/mL e em ou cerca de 70 IU/mL, entre ou cerca de 10 IU/mL e em ou cerca de 50 IU/mL, entre ou cerca de 10 IU/mL e em ou cerca de 30 IU /mL, entre ou cerca de 30 IU/mL e 500 IU/mL, entre ou cerca de 30 IU/mL e em ou cerca de 400 IU/mL, entre ou cerca de 30 IU/mL e em ou cerca de 300 IU/mL, entre ou cer- ca de 30 IU/mL e em ou cerca de 200 IU/mL, entre ou cerca de 30 IU/mL e em ou cerca de 100 IU/mL, entre ou cerca de 30 IU/mL e em ou cerca de 70 IU/mL, entre ou cerca de 30 IU/mL e em ou cerca de 50 IU/mL, entre ou cerca de 50 IU/mL e em ou cerca de 400 IU/mL, entre ou cerca de 50 IU/mL e em ou cerca de 500 IU/mL, entre ou cer- ca de 50 IU/mL e em ou cerca de 300 IU/mL, entre ou cerca de 50 IU/mL e em ou cerca de 200 IU/mL, entre ou cerca de 50 IU/mL e em ou cerca de 100 IU/mL, entre ou cerca de 50 IU/mL e em ou cerca de 70 IU/mL, entre ou cerca de 70 IU/mL e em ou cerca de 500 IU/mL, entre ou cerca de 70 IU/mL e em ou cerca de 400 IU/mL, entre ou cer- ca de 70 IU/mL e em ou cerca de 300 IU/mL, entre ou cerca de 70 IU/mL e em ou cerca de 200 IU/mL, entre ou cerca de 70 IU/mL e em ou cerca de 100 IU/mL, entre ou cerca de 100 IU/mL e em ou cerca de 500 IU/mL, entre ou cerca de 100 IU/mL e em ou cerca de 400 IU/mL, entre ou cerca de 100 IU/mL e em ou cerca de 300 IU/mL, entre ou cerca de 100 IU/mL e em ou cerca de 200 IU/mL, entre ou cerca de 200 IU/mL e em ou cerca de 500 IU/mL, entre ou cerca de 200 IU/mL e em ou cerca de 400 IU/mL, entre ou cerca de 200 IU/mL e em ou cer- ca de 300 IU/mL, entre ou cerca de 300 IU/mL e em ou cerca de 500 IU/mL, entre ou cerca de 200 IU/mL e em ou cerca de 400 IU/mL, ou entre ou cerca de 400 IU/mL e em ou cerca de 500 IU/mL.

Em algu- mas modalidades, a IL-15 é adicionada ao meio de cultura em uma quantidade entre ou cerca de 100 IU/mL e em ou cerca de 200 IU/mL. Em algumas modalidades, a IL-15 é adicionada ao meio de cultura em ou cerca de 180 IU/mL.

[00257] Em algumas modalidades, IL-7 recombinante é adicionado ao meio de cultura. Em algumas modalidades, a IL-7 recombinante é adicionada ao meio de cultura em uma concentração entre ou cerca de 100 IU/mL e em ou cerca de 2000 IU/mL, entre ou cerca de 100 IU/mL e em ou cerca de 1500 IU/mL, entre ou cerca de 100 IU/mL e em ou cerca de 1000 IU/mL, entre ou cerca de 100 IU/mL e em ou cerca de 800 IU/mL, entre ou cerca de 100 IU/mL e em ou cerca de 600 IU/mL, entre ou cerca de 100 IU/mL e em ou cerca de 400 IU/mL, entre ou cerca de 100 IU/mL e em ou cerca de 200 IU/mL, entre ou cerca de 200 IU/mL e em ou cerca de 2000 IU/mL, entre ou cerca de 200 IU/mL e em ou cerca de 1500 IU/mL, entre ou cerca de 200 IU/mL e em ou cerca de 1000 IU/mL, entre ou cerca de 200 IU/mL e em ou cerca de 800 IU/mL, entre ou cerca de 200 IU/mL e em ou cerca de 600 IU/mL, entre ou cerca de 200 IU/mL e em ou cerca de 400 IU/mL, entre ou cerca de 400 IU/mL e em ou cerca de 2000 IU/mL, entre ou cerca de 400 IU/mL e em ou cerca de 1500 IU/mL, entre ou cerca de 400 IU/mL e em ou cerca de 1000 IU/mL, entre ou cerca de 400 IU/mL e em ou cerca de 800 IU/mL, entre ou cerca de 400 IU/mL e em ou cerca de 600 IU/mL, entre ou cerca de 600 IU/mL e em ou cerca de 2000 IU/mL, entre ou cerca de 600 IU/mL e em ou cerca de 1500 IU/mL, entre ou cerca de 600 IU/mL e em ou cerca de 1000 IU/mL, entre ou cerca de 600 IU/mL e em ou cerca de 800 IU/mL, entre ou cerca de 800 IU/mL e em ou cerca de 2000 IU/mL, entre ou cerca de 800 IU/mL e em ou cerca de 1500 IU/mL, entre ou cerca de 800 IU/mL e em ou cerca de 1000 IU/mL, entre ou cerca de 1000 IU/mL e em ou cerca de 2000 IU/mL, entre ou cerca de 1000 IU/mL e em ou cerca de 1500 IU/mL, entre ou cerca de 1500 IU/mL e em ou cerca de 2000 IU/mL. Em al-

gumas modalidades, a IL-7 é adicionada ao meio de cultura em uma quantidade entre ou cerca de 1000 IU/mL e em ou cerca de 2000 IU/mL. Em algumas modalidades, a IL-7 é adicionada ao meio de cul- tura em ou cerca de 600 IU/mL.

[00258] Em algumas modalidades, a IL-21 recombinante é adicio- nada ao meio de cultura. Em algumas modalidades, a IL-21 recombi- nante é adicionada ao meio de cultura em uma concentração entre ou cerca de 0,5 IU/mL e em ou cerca de 20 IU/mL, entre ou cerca de 0,5 IU/mL e em ou cerca de 15 IU/mL, entre ou cerca de 0,5 IU/mL e em ou cerca de 10 IU/mL, entre ou cerca de 0,5 IU/mL e em ou cerca de 5 IU/mL, entre ou cerca de 0,5 IU/mL e em ou cerca de 2,5 IU/mL, entre ou cerca de 0,5 IU/mL e em ou cerca de 1 IU/mL, entre ou cerca de 1 IU/mL e em ou cerca de 20 IU/mL, entre ou cerca de 1 IU/mL e em ou cerca de 15 IU/mL, entre ou cerca de 1 IU/mL e em ou cerca de 10 IU/mL, entre ou cerca de 1 IU/mL e em ou cerca de 5 IU/mL, entre ou cerca de 1 IU/mL e em ou cerca de 2,5 IU/mL, entre ou cerca de 2,5 IU/mL e em ou cerca de 20 IU/mL, entre ou cerca de 2,5 IU/mL e em ou cerca de 15 IU/mL, entre ou cerca de 2,5 IU/mL e em ou cerca de 10 IU/mL, entre ou cerca de 2,5 IU/mL e em ou cerca de 5 IU/mL, en- tre ou cerca de 5 IU/mL e em ou cerca de 20 IU/mL, entre ou cerca de 5 IU/mL e em ou cerca de 15 IU/mL, entre ou cerca de 5 IU/mL e em ou cerca de 10 IU/mL, entre ou cerca de 10 IU/mL e em ou cerca de 20 IU/mL, entre ou cerca de 10 IU/mL e em ou cerca de 15 IU/mL, ou entre ou cerca de 15 IU/mL e em ou cerca de 20 IU/mL. Em algumas modalidades, a IL-21 é adicionada ao meio de cultura em uma quanti- dade entre ou cerca de 0,5 IU/mL e em ou cerca de 2,5 IU/mL. Em al- gumas modalidades, a IL-21 é adicionada ao meio de cultura em ou cerca de 1 IU/mL.

[00259] A cocultura de APCs e células T pode ser incubada a uma temperatura adequada para a apresentação de peptídeos em MHC e a ativação de células T na cultura, por exemplo, pelo menos cerca de 25 graus Celsius, geralmente pelo menos cerca de 30 graus, e geralmen- te a ou cerca de 37 graus Celsius. Em algumas modalidades, a incu- bação é realizada por até 96 horas. A incubação pode ser realizada por 24 horas a 96 horas, tal como em ou cerca de 24 horas, em ou cerca de 36 horas, em ou cerca de 48 horas, em ou cerca de 60 horas, em ou cerca de 72 horas, em ou cerca de 84 horas ou em ou cerca de 96 horas, ou por um tempo entre qualquer um dos anteriores. Em mo- dalidades particulares, a cocultura é incubada por 24 a 48 horas.

[00260] Em algumas modalidades, no final da cocultura, as células T reativas ao tumor são separadas das APCs presentes na cocultura. Em algumas modalidades, a separação pode incluir métodos que se- lecionam ou removem as APCs. Em algumas modalidades, a separa- ção pode incluir métodos que selecionam ou retêm positivamente as células T presentes na cocultura. Em algumas modalidades, o total de células T na cocultura pode ser selecionado. Em modalidades particu- lares, células T reativas a tumor ou células T que expressam um ou mais marcadores de regulação positiva, por exemplo, marcadores de ativação, associados a células T reativas ao tumor, podem ser seleci- onados. D. Seleção de células T reativas ao tumor

[00261] Em modalidades dos métodos fornecidos, os métodos en- volvem enriquecimento ou seleção de células T reativas ao tumor ou células T que são prováveis ou suspeitas de serem células T reativas ao tumor, selecionando ou isolando células T que são positivas de su- perfície para um ou mais marcadores de ativação de células T associ- ado a células T reativas ao tumor. Em algumas modalidades, as célu- las T que são positivas para a superfície para um ou mais marcadores de ativação são ainda selecionadas ou enriquecidas a partir de uma população de células T que foram isoladas ou selecionadas de uma amostra biológica, tal como descrito na Seção I.B.1. Em algumas mo- dalidades, as células T que são positivas de superfície para um ou mais marcadores de ativação são ainda selecionadas ou enriquecidas a partir da população de células T estimuladas, tal como descrito na Seção I. B.2. Em algumas modalidades, as células T que são positivas para a superfície para um ou mais marcadores de ativação são ainda selecionadas ou enriquecidas a partir de uma população de células T após sua cocultura com APCs, tal como descrito na Seção I.C. Em al- gumas modalidades, os métodos podem incluir uma combinação de qualquer uma das seleções acima para obter ou enriquecer em células T reativas a tumor ou células T que são prováveis ou suspeitas de se- rem células T reativas a tumor. Em algumas modalidades, a população enriquecida de células é usada em etapas de processamento subse- quentes, tais como etapas de processamento subsequentes envolven- do incubação, estimulação ou ativação e/ou expansão de acordo com uma ou mais etapas de qualquer um dos métodos fornecidos.

[00262] Em aspectos de qualquer uma das modalidades fornecidas, as células T reativas ao tumor e/ou células T que expressam pelo me- nos um marcador de ativação de células T associado às células T rea- tivas ao tumor são enriquecidas a partir de uma amostra biológica de acordo com qualquer um dos métodos fornecidos. Em alguns aspec- tos, antes ou simultaneamente com o enriquecimento, as células T po- dem ser enriquecidas ou selecionadas a partir de uma amostra bioló- gica, tal como com base em marcadores de células T CD3, CD4 ou CD8. Em algumas modalidades, o enriquecimento para uma célula T que é positiva de superfície para um ou mais marcadores de superfície celular inclui qualquer método para separação com base em tais mar- cadores. Em algumas modalidades, a separação é uma separação ba- seada em afinidade ou imunoafinidade. Por exemplo, o isolamento em alguns aspectos inclui a separação de células e populações de células com base na expressão das células ou nível de expressão de um ou mais marcadores, normalmente marcadores de superfície celular, por exemplo, por incubação com um anticorpo ou parceiro de ligação que se liga especificamente a tais marcadores, seguidos geralmente por etapas de lavagem e separação de células que se ligaram ao anticor- po ou parceiro de ligação, daquelas células que não se ligaram ao an- ticorpo ou parceiro de ligação.

[00263] Em algumas modalidades, antes da expansão adicional de células T da cocultura, os métodos fornecidos envolvem ainda o enri- quecimento ou seleção de células T reativas ao tumor ou células T que são prováveis ou suspeitas de serem células T reativas ao tumor. Em algumas modalidades, tal enriquecimento inclui selecionar ou isolar células T da cocultura que são positivas de superfície para um ou mais marcadores de ativação de células T associados a células T reativas ao tumor. Em algumas modalidades, as células T selecionadas a partir da cocultura resultam em uma população de células T enriquecida pa- ra células T CD3+ ou células CD4+ e células CD8+, que são ainda po- sitivas para um ou mais de tal marcador de ativação de células T. Em algumas modalidades, tais células incluem ou são enriquecidas em células T reativas a tumor ou células T associadas a células T reativas a tumor. Por exemplo, tais células T CD3+, ou populações de CD4+ e/ou CD8+, podem ser ainda classificadas em subpopulações por se- leção positiva ou negativa para marcadores expressos ou expressos em um grau relativamente mais alto em células T reativas ao tumor ou em células T possuindo expressão de marcadores de ativação de célu- las T associados a células T reativas a tumor. Em modalidades parti- culares, a população enriquecida de células é cultivada sob condições para expansão, tal como descrito na Seção I.E.

[00264] Em alguns aspectos, a seleção positiva é realizada para um ou mais marcadores de ativação de células T. Quando uma célula T é ativada por um alvo ou peptídeo mutante, ela começa a expressar marcadores de regulação positiva, tais como, mas não limitado a, CD107, CD107a, CD39, CD103, CD137 (4-1BB), CD59, CD90, CD38, CD30, CD154, CD252, CD134 (OX40), CD258, CD256, PD-1, TIM-3 e/ou LAG-3. Em modalidades particulares, o marcador de regulação positiva é CD107, CD107a, CD39, CD137, CD59, CD90, CD38, ou CD103. Esses marcadores podem então ser usados para selecionar células reativas. Em particular, entre os marcadores de ativação de células T estão aqueles que são regulados positivamente e/ou cuja expressão é especificamente detectada após a estimulação de antíge- no de células T, de modo que efetores específicos de antígeno podem ser identificados como um substituto de um antígeno que está ativando ou estimulando as células. Por exemplo, após a estimulação induzida por antígeno, as células T humanas sofrem alterações funcionais e fenotípicas dinâmicas, incluindo expressão de superfície regulada po- sitivamente de múltiplas moléculas associadas à ativação, tais como CD25, CD69, CD38 e outros. A regulação positiva de moléculas de superfície fornece a oportunidade de identificar e isolar células T espe- cíficas do antígeno, como células T reativas ao tumor, através da liga- ção do anticorpo do determinante regulado positivamente e subse- quente enriquecimento por citometria de fluxo, incluindo por métodos que envolvem separação magnética e classificação de células ativa- das por fluorescência (FACS).

[00265] Em algumas modalidades, o marcador de ativação de célu- las T é selecionado para qualquer um ou mais de CD107, CD107a, CD39, CD103, CD137 (4-1BB), CD59, CD90, CD38, CD30, CD154, CD252, CD134, CD258, CD256, PD-1, TIM-3 e/ou LAG-3. Em algu- mas modalidades, o marcador de ativação de células T é selecionado a partir de qualquer um ou mais de CD107, CD107a, CD39, CD103, CD59, CD90, CD38, CD30, CD154, CD252, CD134, CD258 e/ou

CD256. Em algumas modalidades, o marcador de ativação de células T é selecionado a partir de qualquer um ou mais de CD107a, CD39, CD103, CD59, CD90 e/ou CD38.

[00266] Em algumas modalidades, o marcador de ativação de célu- las T é ou inclui CD107a. CD107a é uma proteína associada ao lisos- soma normalmente encontrada na superfície das células T. Após o de- sencadeamento do TCR, a desgranulação das células T CD8 pode ocorrer rapidamente, e o CD107 e outras proteínas lisossomais podem ser transportados para a membrana celular para facilitar a liberação de perforina e granzima. Por exemplo, em alguns casos, a expressão de CD107 pode ser detectada em células T CD8 específicas do antígeno, tal como 30 minutos após a estimulação. (Betts et al. (2003) J. Immu- nol. Methods 281:6578).

[00267] Em algumas modalidades, o marcador de ativação de célu- las T é ou inclui CD39. Em algumas modalidades, o marcador de ati- vação de células T é ou inclui CD103. Em algumas modalidades, o marcador de ativação de células T é ou inclui CD59. Em algumas mo- dalidades, o marcador de ativação de células T é ou inclui CD90. Em algumas modalidades, o marcador de ativação de células T é ou inclui CD38.

[00268] Em algumas modalidades, o marcador de ativação de célu- las T é ou inclui CD137 (41BB). Em algumas modalidades, o marcador de ativação de células T é ou inclui CD134 (OX40).

[00269] Em algumas modalidades, as células T reativas ao tumor ou células T associadas às células T reativas ao tumor são seleciona- das, enriquecidas ou isoladas com base na expressão de superfície positiva de pelo menos dois ou mais marcadores de ativação de célu- las T, tal como pelo menos 3, 4, 5 ou 6 marcadores de ativação de cé- lulas T. Em algumas modalidades, as células T reativas ao tumor ou células T associadas às células T reativas ao tumor são selecionadas,

enriquecidas ou isoladas com base na expressão de superfície positiva de dois ou mais de PD-1, TIM-3, LAG-3, CD137, CD107, CD107a, CD39, CD103, CD59, CD90, CD38, CD30, CD154, CD252, CD134, CD258 e/ou CD256.

[00270] Em algumas modalidades, pelo menos dois marcadores de ativação de células T são selecionados a partir de CD107a e CD39, CD107a e CD103, CD107a e CD59, CD107a e CD90, CD107a e CD38, CD39 e CD103, CD39 e CD59, CD39 e CD90, CD39 e CD38, CD103 e CD59, CD103 e CD90, CD103 e CD38, CD59 e CD90, CD59 e CD38 e CD90 e CD38.

[00271] Em algumas modalidades, as células T reativas ao tumor ou células T associadas às células T reativas ao tumor são seleciona- das, enriquecidas ou isoladas com base na expressão de superfície positiva de PD-1, TIM-2, LAG-3 e/ou CD137 e pelo menos um outro marcador de ativação de células T. Em algumas modalidades, as célu- las T reativas ao tumor ou células T associadas às células T reativas ao tumor são selecionadas, enriquecidas ou isoladas com base na ex- pressão de superfície positiva de CD137 e pelo menos um outro mar- cador de ativação de células T. Em algumas modalidades, pelo menos um outro marcador de ativação de células T é selecionado a partir de um ou mais de PD-1, TIM-3, LAG-3, CD107, CD107a, CD137, CD39, CD103, CD59, CD90, CD38, CD30, CD154, CD252, CD134, CD258 e CD256. Em algumas modalidades, pelo menos um outro marcador de ativação de células T é selecionado a partir de um ou mais de CD107, CD107a, CD39, CD103, CD59, CD90, CD38, CD30, CD154, CD252, CD134, CD258 e CD256. Em algumas modalidades, pelo menos um outro marcador de ativação de células T é selecionado a partir de um ou mais de CD107a, CD39, CD103, CD59, CD90 e CD38. Em algu- mas modalidades, as células T reativas ao tumor ou células T associ- adas às células T reativas ao tumor são selecionadas, enriquecidas ou isoladas com base na expressão de superfície positiva de CD107a e CD137, CD38 e CD137, CD103 e CD137, CD59 e CD137, CD90 e CD137 e CD38 e CD137.

[00272] Em algumas modalidades, o marcador de ativação de célu- las T inclui CD137 (41BB) e CD134 (OX40).

[00273] Em algumas modalidades, as células T reativas ao tumor são selecionadas usando um tetrâmero MHC ligado a um peptídeo as- sociado à mutação ou associado ao tumor. Em algumas modalidades, os tetrâmeros são preparados usando algoritmos MHC classe I ou MHC classe II. Em algumas modalidades, o tetrâmero é marcado de forma detectável, tal como marcado com fluorescência. Em algumas modalidades, o tetrâmero é HLA correspondente ao indivíduo a partir do qual a fonte de células biológicas é obtida. Em algumas modalida- des, a seleção de células usando um tetrâmero MHC é diretamente de uma fonte de células, por exemplo, sangue periférico, para uma amos- tra de um indivíduo. Em algumas modalidades, a seleção de células usando um tetrâmero de MHC é após a seleção ou enriquecimento de células T que são positivas de superfície para um marcador de ativa- ção de células T.

[00274] Os métodos de isolamento, seleção e/ou enriquecimento de células podem ser por qualquer um de uma variedade de métodos, tal como por seleção positiva ou negativa baseada, tal como pelo uso de quaisquer métodos como descrito na Seção I.B acima. Em algumas modalidades, os métodos podem incluir seleções baseadas em imu- noafinidade. Em algumas modalidades, as células T podem ser enri- quecidas ou classificadas de uma variedade de maneiras, incluindo, mas não limitadas a, separação magnética de esferas, classificação de células fluorescentes e classificadores de células com base em cartu- cho fechado descartável. Em aspectos particulares, um ou mais mar- cadores de ativação de células T podem ser usados para selecionar células reativas usando, mas não limitados a, anticorpos fluorescentes, nanopartículas ou contas no equipamento de seleção de células, mas não limitados ao CliniMACS, Sony FX500 ou os sistemas de classifi- cação celular Tyto (Miltenyi).

[00275] Em algumas modalidades, as seleções produzem uma po- pulação enriquecida de células, tal como uma população de células enriquecida para células T CD3+ ou células CD4+ e células CD8+, que são ainda positivas para um ou mais desses marcadores de ativação de células T. Em algumas modalidades, tais células incluem ou são enriquecidas em células T reativas a tumor ou células T associadas a células T reativas a tumor. Em algumas modalidades, a população en- riquecida de células é usada em etapas de processamento subse- quentes, tais como etapas de processamento subsequentes envolven- do incubação, estimulação ou ativação e/ou expansão de acordo com uma ou mais etapas de qualquer um dos métodos fornecidos.

[00276] Em algumas modalidades, a população enriquecida de cé- lulas são células enriquecidas de uma amostra inicial, como descrito acima, em que a porcentagem de células de um fenótipo particular, por exemplo, células T CD3+ reativas a tumor ou células T CD3+ positivas de superfície para um ou mais marcadores de ativação de células T, na população enriquecida de células aumentadas em pelo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 500%, 1000%, 5000% ou mais do que a porcentagem de tais células na amostra inicial. Em algumas modalidades, a pureza das células T CD3+ reativas ao tumor ou células T CD3+ superficiais positivas para um ou mais marcadores de ativação de células T na composição enri- quecida, ou seja, a porcentagem de células positivas para o marcador de superfície celular selecionado versus o total de células na popula- ção de células enriquecidas é pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94% e é geralmente pelo menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais.

E. Expansão e Colheita adicionais

[00277] Em algumas modalidades, as células T da cocultura, ou cé- lulas T selecionadas das mesmas, são ainda incubadas sob condições para expandir as células ex vivo após a cocultura. A incubação é reali- zada na presença de um ou mais agentes estimulatórios de células T sob condições para estimular as células T, como para expandir as cé- lulas T. Os agentes estimulatórios de células T podem incluir qualquer um como descrito na Seção B.2 acima.

[00278] Em algumas das modalidades fornecidas, os agentes esti- mulatórios de células T são selecionados a partir de um agente que inicia a sinalização intracelular de TCR/CD3 e/ou um agente que inicia a sinalização por meio de um receptor coestimulatório. Em algumas das modalidades fornecidas, o agente que inicia a sinalização intrace- lular de TCR/CD3 é um anticorpo anti-CD3, tal como OKT3. Em algu- mas das modalidades fornecidas, o agente que inicia a sinalização por meio de um receptor coestimulatório compreende células mononuclea- res de sangue periférico (PBMCs), opcionalmente PBMCs sem divisão ou irradiadas. Em algumas das modalidades fornecidas, o agente que inicia a sinalização por meio de um receptor coestimulatório é um anti- corpo anti-CD28. Em algumas das modalidades fornecidas, os agentes estimulatórios de células T são um anticorpo anti-CD3 e um anticorpo anti-CD28 em que cada um é solúvel.

[00279] Em modalidades dos métodos fornecidos, as condições de estimulação incluem um ou mais agentes, por exemplo, ligante, que liga ou inicia a cascata de sinalização intracelular de TCR/CD3 em uma célula T e/ou um sinal coestimulatório em uma célula T. Tais agentes podem incluir anticorpos, tais como aqueles específicos para um componente de TCR, por exemplo, anti-CD3 e/ou receptor coesti- mulatório, por exemplo, anti-CD28 ou anti-4-1BB. Em algumas modali- dades, esses agentes são adicionados ao meio de cultura como anti-

corpos solúveis. Em outras modalidades, tais agentes são ligados a um suporte sólido, como uma conta. Em algumas modalidades, os agentes estimulatórios de células T incluem contas magnéticas conju- gadas com anti-CD3/CD28 (por exemplo, Expansor de Célula T CD3/CD28 DYNABEADS® M-450).

[00280] Um anticorpo anti-CD3 pode incluir qualquer anticorpo dire- cionado contra ou que pode se ligar especificamente ao receptor CD3 na superfície das células T, tipicamente CD3 humano em células T humanas. Os anticorpos anti-CD3 incluem OKT3, também conhecido como muromonabe. Os anticorpos anti-CD3 também incluem o clone UHCTI, também conhecido como T3 e CD3E. Outros anticorpos anti- CD3 incluem, por exemplo, otelixizumabe, teplizumabe e visilizumabe. O anticorpo anti-CD3 pode ser adicionado como um reagente solúvel ou ligado a uma conta. Em modalidades particulares, o anticorpo anti- CD3 é solúvel.

[00281] Em modalidades particulares, os agentes estimulatórios de células T incluem um anticorpo anti-CD3, que é adicionado ao meio de cultura de células durante a incubação. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-CD3 é adicionado em uma concentração variando entre ou cerca de 0,1 ng/mL e 50 ng/mL, tal como entre ou cerca de 0,5 ng/mL e em ou cerca de 50 ng/mL, entre ou cerca de 0,5 ng/mL e em ou cerca de 30 ng/mL, entre ou cerca de 0,5 ng/mL e em ou cerca de 15 ng/mL, entre ou cerca de 0,5 ng/mL e em ou cerca de 5 ng/mL, en- tre ou cerca de 0,5 ng/mL e em ou cerca de 1 ng/mL, entre ou cerca de 1 ng/mL e em ou cerca de 50 ng/mL, entre ou cerca de 1 ng/mL e em ou cerca de 30 ng/mL, entre ou cerca de 1 ng/mL e em ou cerca de 15 ng/mL, entre ou cerca de 1 ng/mL e em ou cerca de 5 ng/mL, entre ou cerca de 5 ng/mL e em ou cerca de 50 ng/mL, entre ou cerca de 5 ng/mL e em ou cerca de 30 ng/mL, entre ou cerca de 5 ng/mL e em ou cerca de 15 ng/mL, entre ou cerca de 15 ng/mL e em ou 50 ng/mL, en-

tre ou cerca de 15 ng/mL e em ou cerca de 30 ng/mL ou entre ou cer- ca de 30 ng/mL e em ou cerca de 50 ng/mL, cada um inclusive.

[00282] Em modalidades particulares, o anticorpo anti-CD3 é OKT3. Em uma modalidade, o meio de cultura celular compreende cerca de 0,1 ng/mL, cerca de 0,5 ng/mL, cerca de 1 ng/mL, cerca de 2,5 ng/mL, cerca de 5 ng/mL, cerca de 7,5 ng/mL, cerca de 10 ng/mL , cerca de 15 ng/mL, cerca de 20 ng/mL, cerca de 25 ng/mL, cerca de 30 ng/mL, cerca de 35 ng/mL, cerca de 40 ng/mL, cerca de 50 ng/mL, cerca de 60 ng/mL, cerca de 70 ng/mL, cerca de 80 ng/mL, cerca de 90 ng/mL, cerca de 100 ng/mL, cerca de 200 ng/mL, cerca de 500 ng/mL e cerca de 1 μg/mL de anticorpo OKT3. Em uma modalidade, o meio de cultu- ra celular compreende entre 0,1 ng/mL e 1 ng/mL, entre 1 ng/mL e 5 ng/mL, entre 5 ng/mL e 10 ng/mL, entre 10 ng/mL e 20 ng/mL, entre 20 ng/mL e 30 ng/mL, entre 30 ng/mL e 40 ng/mL, entre 40 ng/mL e 50 ng/mL, e entre 50 ng/mL e 100 ng/mL de anticorpo OKT3.

[00283] Em algumas modalidades, os agentes estimulatórios de cé- lulas T incluem a incubação com um anticorpo anti-CD3 e a incubação com um outro agente que se liga especificamente a CD28 ou estimula ou induz um sinal mediado por CD28 nas células. Em algumas moda- lidades, o sinal mediado por CD28 pode ser iniciado ou fornecido pelo anticorpo anti-CD28 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo. Em algumas modalidades, o sinal mediado por CD28 pode ser forne- cido por células alimentadoras apresentadoras de antígeno (APCs), tais como células mononucleares de sangue periférico (PBMC).

[00284] Em algumas modalidades, os agentes estimulatórios de cé- lulas T podem incluir adicionar à população de células alimentadoras de células T, como células mononucleares de sangue periférico sem divisão (PBMC). Em alguns aspectos, as células alimentadoras sem divisão podem compreender células alimentadoras de PBMC com ra- diação gama. Em algumas modalidades, as PBMC são irradiadas com raios gama na faixa de cerca de 3000 a 3600 rads para evitar a divisão celular. Em alguns aspectos, as células alimentadoras são adicionadas ao meio de cultura antes da adição das populações de células T. Em algumas modalidades, a população de células resultante contém pelo menos cerca de 5, 10, 20 ou 40 ou mais células alimentadoras de PBMC para cada linfócito T na população inicial a ser expandida. Em algumas modalidades, a razão de células T para PBMCs e/ou células apresentadoras de antígeno é de cerca de 1 a 25, cerca de 1 a 50, cerca de 1 a 100, cerca de 1 a 125, cerca de 1 a 150, cerca de 1 a 175, cerca de 1 a 200, cerca de 1 a 225, cerca de 1 a 250, cerca de 1 a 275, cerca de 1 a 300, cerca de 1 a 325, cerca de 1 a 350, cerca de 1 a 375, cerca de 1 a 400 ou cerca de 1 a 500.

[00285] Em algumas modalidades, os agentes estimulatórios de cé- lulas T podem incluir adicionar à população de células um anticorpo anti-CD28 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo. Um anti- corpo anti-CD28 pode incluir qualquer anticorpo direcionado contra ou que pode se ligar especificamente ao receptor CD28 na superfície das células T. Exemplos não limitantes de anticorpos anti-CD28 incluem NA/LE (por exemplo, BD Pharmingen), IM1376 (por exemplo, Beck- man Coulter) ou 15E8 (por exemplo, Miltenyi Biotec). O anticorpo anti- CD28 pode ser adicionado como um reagente solúvel ou ligado a uma conta. Em modalidades particulares, o anticorpo anti-CD3 é solúvel. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-CD28 é adicionado em uma concentração variando entre ou cerca de 1 ng/mL e 1000 ng/mL, entre ou cerca de 1 ng/mL e 500 ng/mL, entre ou cerca de 1 ng/mL e em ou cerca de 100 ng/mL, entre ou cerca de 1 ng/mL e em ou cerca de 10 ng/mL, entre ou cerca de 10 ng/mL e em ou cerca de 1000 ng/mL, entre ou cerca de 10 ng/mL e em ou cerca de 500 ng/mL, entre ou cerca de 10 ng/mL e em ou cerca de 100 ng/mL, entre ou cerca de 100 ng/mL e em ou cerca de 1000 ng/mL, entre ou cerca de 100 ng/mL e em ou cerca de 500 ng/mL ou entre ou cerca de 500 ng/mL e em ou cerca de 1000 ng/mL.

[00286] Em geral, a cultura e as incubações podem ocorrer na pre- sença de citocinas recombinantes. Em algumas modalidades, a citoci- na é adicionada ou é exógena ao meio de cultura. Em algumas das modalidades fornecidas, a cultura é realizada na presença de uma ci- tocina recombinante selecionada do grupo que consiste em IL-2, IL-15, IL-7 e IL-21. Em algumas modalidades, a cultura e a incubação são realizadas na presença de IL-2, IL-15 e IL-7 recombinantes. Em algu- mas modalidades, a cultura é realizada na presença de uma IL-2. Em algumas modalidades, a cultura é realizada na presença de IL-15 e IL- 17, que, em alguns aspectos, não inclui adicionalmente IL-2.

[00287] A citocina recombinante geralmente é uma proteína huma- na recombinante. Em modalidades particulares, a citocina recombinan- te está presente no meio de cultura de células durante a incubação a uma concentração de pelo menos ou pelo menos cerca de 0,5 IU/mL, pelo menos ou pelo menos cerca de 1,0 IU/mL, pelo menos ou pelo menos cerca de 5 IU/mL, pelo menos a ou cerca de ou cerca de 10 IU/mL, pelo menos em ou cerca de ou cerca de 100 IU/mL, pelo me- nos em ou cerca de ou cerca de 1000 IU/mL, pelo menos em ou cerca de ou cerca de 1500 IU/mL, pelo menos em ou cerca de ou em ou cer- ca de 2.000 IU/mL, pelo menos em ou cerca de ou cerca de 2,500 IU/mL, pelo menos em ou cerca de ou cerca de 3.000 IU/mL, pelo me- nos em ou cerca de ou em ou cerca de 3.500 IU/mL, pelo menos em ou cerca de ou em cerca de 4000 IU/mL, pelo menos pelo ou cerca de ou cerca de 4500 IU/mL, pelo menos pelo ou cerca de ou cerca de 5000 IU/mL, pelo menos pelo ou cerca de ou cerca de 5.500 IU/mL, pelo menos por ou cerca de ou por ou cerca de 6000 IU/mL, pelo me- nos em ou cerca de ou cerca de 6500 IU/mL, pelo menos em ou cerca de ou cerca de 7000 IU/mL, pelo menos em ou cerca de ou cerca de

7500 IU/mL, ou em pelo menos a ou cerca de ou cerca de 8.000 IU/mL. Em uma modalidade, o meio de cultura celular compreende en- tre ou cerca de 10 IU/mL e em ou cerca de 100 IU/mL, em ou cerca de 100 IU/mL e em ou cerca de 1000 IU/mL, em ou cerca de 1000 e em ou cerca de 2000 IU/mL, entre ou cerca de 2000 e em ou cerca de 3000 IU/mL, entre ou cerca de 3000 e 4000 em ou cerca de IU/mL, entre ou cerca de 4000 e em ou cerca de 5000 IU/mL, entre ou cerca de 5000 e em ou cerca de 6000 IU/mL, entre ou cerca de 6000 e em ou cerca de 7000 IU/mL, entre ou cerca de 7000 e em ou cerca de 8000 IU/mL, cada um inclusive.

[00288] Em algumas modalidades, IL-2 recombinante está presente no meio de cultura celular. Em algumas modalidades, IL-2 recombinan- te é adicionada ao meio de cultura em uma concentração entre ou cer- ca de 10 IU/mL e em ou cerca de 1000 IU/mL, tal como entre ou cerca de 10 IU/mL e em ou cerca de 600 IU/mL, entre ou cerca de 10 IU/mL e em ou cerca de 400 IU/mL, entre ou cerca de 10 IU/mL e em ou cer- ca de 200 IU/mL, entre ou cerca de 10 IU/mL e em ou cerca de 100 IU/mL, entre ou cerca de 10 IU/mL e em ou cerca de 50 IU/mL, entre ou cerca de 50 IU/mL e em ou cerca de 1000 IU/mL, entre ou cerca de 50 IU/mL e em ou cerca de 600 IU/mL, entre ou cerca de 50 IU/mL e em ou cerca de 400 IU/mL, entre ou cerca de 50 IU/mL e em ou cerca de 200 IU/mL, entre ou cerca de 50 IU/mL e em ou cerca de 100 IU/mL, entre ou cerca de 100 IU/mL e em ou cerca de 1000 IU/mL, en- tre ou cerca de 100 IU/mL e em ou cerca de 600 IU/mL, entre ou cerca de 100 IU/mL e em ou cerca de 400 IU/mL, entre ou cerca de 100 IU/mL e em ou cerca de 200 IU/mL, entre ou cerca de 200 IU/mL e em ou cerca de 1000 IU/mL, entre ou cerca de 200 IU/mL e em ou cerca de 600 IU/mL, entre ou cerca de 200 IU/mL e em ou cerca de 400 IU/mL, entre ou cerca de 400 IU/mL e em ou cerca de 1000 IU/mL, en- tre ou cerca de 400 IU/mL e em ou cerca de 600 IU/mL ou entre ou cerca de 600 IU/mL e em ou cerca de 1000 IU/mL. Em algumas moda- lidades, a IL-2 recombinante está presente em uma quantidade que está entre 50 e 400 IU/mL.

[00289] Em algumas modalidades, a incubação é realizada com uma dose mais elevada de IL-2. Em alguns aspectos, IL-2 é a única citocina recombinante adicionada à cultura. Em algumas modalidades, a IL-2 recombinante é adicionada ao meio de cultura em uma concen- tração entre ou cerca de 1000 IU/mL em ou cerca de 8000 IU/mL, tal como entre ou cerca de 1000 IU/mL e em ou cerca de 7000 IU/mL, en- tre ou cerca de 1000 IU/mL e em ou cerca de 6000 IU/mL, entre ou cerca de 1000 IU/mL e em ou cerca de 5000 IU/mL, entre ou cerca de 1000 IU/mL e em ou cerca de 4000 IU/mL, entre ou cerca de 1000 IU/mL e em ou cerca de 2000 IU/mL, 2000 IU/mL em ou cerca de 8000 IU/mL, entre ou cerca de 2000 IU/mL e em ou cerca de 7000 IU/mL, entre ou cerca de 2000 IU/mL e em ou cerca de 6000 IU/mL, entre ou cerca de 2000 IU/mL e em ou cerca de 5000 IU/mL, entre ou cerca de 2000 IU/mL e em ou cerca de 4000 IU/mL, 4000 IU/mL em ou cerca de 8000 IU/mL, entre ou cerca de 4000 IU/mL e em ou cerca de 7000 IU/mL, entre ou cerca de 4000 IU/mL e em ou cerca de 6000 IU/mL, entre ou cerca de 4000 IU/mL e em ou cerca de 5000 IU/mL, entre ou cerca de 5000 IU/mL em ou cerca de 8000 IU/mL, entre ou cerca de 5000 IU/mL e em ou cerca de 7000 IU/mL, entre ou cerca de 5000 IU/mL e em ou cerca de 6000 IU/mL, entre ou cerca de 6000 IU/mL em ou cerca de 8000 IU/mL, entre ou cerca de 6000 IU/mL e em ou cerca de 7000 IU/mL ou entre ou cerca de 7000 IU/mL e em ou cerca de 8000 IU/mL. Em algumas modalidades, A IL-2 recombinante está pre- sente em uma quantidade que é ou é de cerca de 6000 IU/mL.

[00290] Em algumas modalidades, IL-15 recombinante está presen- te no meio de cultura de células. Em algumas modalidades, a IL-15 recombinante é adicionada ao meio de cultura em uma concentração entre ou cerca de 10 IU/mL e 500 IU/mL, tal como entre ou cerca de 10 IU/mL e em ou cerca de 400 IU/mL, entre ou cerca de 10 IU/mL e em ou cerca de 300 IU/mL, entre ou cerca de 10 IU/mL e em ou cerca de 200 IU/mL, entre ou cerca de 10 IU/mL e em ou cerca de 100 IU/mL, entre ou cerca de 10 IU/mL e em ou cerca de 70 IU/mL, entre ou cerca de 10 IU/mL e em ou cerca de 50 IU/mL, entre ou cerca de 10 IU/mL e em ou cerca de 30 IU /mL, entre ou cerca de 30 IU/mL e 500 IU/mL, entre ou cerca de 30 IU/mL e em ou cerca de 400 IU/mL, entre ou cerca de 30 IU/mL e em ou cerca de 300 IU/mL, entre ou cer- ca de 30 IU/mL e em ou cerca de 200 IU/mL, entre ou cerca de 30 IU/mL e em ou cerca de 100 IU/mL, entre ou cerca de 30 IU/mL e em ou cerca de 70 IU/mL, entre ou cerca de 30 IU/mL e em ou cerca de 50 IU/mL, entre ou cerca de 50 IU/mL e em ou cerca de 400 IU/mL, entre ou cerca de 50 IU/mL e em ou cerca de 500 IU/mL, entre ou cer- ca de 50 IU/mL e em ou cerca de 300 IU/mL, entre ou cerca de 50 IU/mL e em ou cerca de 200 IU/mL, entre ou cerca de 50 IU/mL e em ou cerca de 100 IU/mL, entre ou cerca de 50 IU/mL e em ou cerca de 70 IU/mL, entre ou cerca de 70 IU/mL e em ou cerca de 500 IU/mL, entre ou cerca de 70 IU/mL e em ou cerca de 400 IU/mL, entre ou cer- ca de 70 IU/mL e em ou cerca de 300 IU/mL, entre ou cerca de 70 IU/mL e em ou cerca de 200 IU/mL, entre ou cerca de 70 IU/mL e em ou cerca de 100 IU/mL, entre ou cerca de 100 IU/mL e em ou cerca de 500 IU/mL, entre ou cerca de 100 IU/mL e em ou cerca de 400 IU/mL, entre ou cerca de 100 IU/mL e em ou cerca de 300 IU/mL, entre ou cerca de 100 IU/mL e em ou cerca de 200 IU/mL, entre ou cerca de 200 IU/mL e em ou cerca de 500 IU/mL, entre ou cerca de 200 IU/mL e em ou cerca de 400 IU/mL, entre ou cerca de 200 IU/mL e em ou cer- ca de 300 IU/mL, entre ou cerca de 300 IU/mL e em ou cerca de 500 IU/mL, entre ou cerca de 200 IU/mL e em ou cerca de 400 IU/mL, ou entre ou cerca de 400 IU/mL e em ou cerca de 500 IU/mL.

Em algu-

mas modalidades, a IL-15 é adicionada ao meio de cultura em uma quantidade entre ou cerca de 100 IU/mL e em ou cerca de 200 IU/mL. Em algumas modalidades, a IL-15 é adicionada ao meio de cultura em ou cerca de 180 IU/mL.

[00291] Em algumas modalidades, IL-7 recombinante é adicionada ao meio de cultura. Em algumas modalidades, a IL-7 recombinante é adicionada ao meio de cultura em uma concentração entre ou cerca de 100 IU/mL e em ou cerca de 2000 IU/mL, entre ou cerca de 100 IU/mL e em ou cerca de 1500 IU/mL, entre ou cerca de 100 IU/mL e em ou cerca de 1000 IU/mL, entre ou cerca de 100 IU/mL e em ou cerca de 800 IU/mL, entre ou cerca de 100 IU/mL e em ou cerca de 600 IU/mL, entre ou cerca de 100 IU/mL e em ou cerca de 400 IU/mL, entre ou cerca de 100 IU/mL e em ou cerca de 200 IU/mL, entre ou cerca de 200 IU/mL e em ou cerca de 2000 IU/mL, entre ou cerca de 200 IU/mL e em ou cerca de 1500 IU/mL, entre ou cerca de 200 IU/mL e em ou cerca de 1000 IU/mL, entre ou cerca de 200 IU/mL e em ou cerca de 800 IU/mL, entre ou cerca de 200 IU/mL e em ou cerca de 600 IU/mL, entre ou cerca de 200 IU/mL e em ou cerca de 400 IU/mL, entre ou cerca de 400 IU/mL e em ou cerca de 2000 IU/mL, entre ou cerca de 400 IU/mL e em ou cerca de 1500 IU/mL, entre ou cerca de 400 IU/mL e em ou cerca de 1000 IU/mL, entre ou cerca de 400 IU/mL e em ou cerca de 800 IU/mL, entre ou cerca de 400 IU/mL e em ou cerca de 600 IU/mL, entre ou cerca de 600 IU/mL e em ou cerca de 2000 IU/mL, entre ou cerca de 600 IU/mL e em ou cerca de 1500 IU/mL, entre ou cerca de 600 IU/mL e em ou cerca de 1000 IU/mL, entre ou cerca de 600 IU/mL e em ou cerca de 800 IU/mL, entre ou cerca de 800 IU/mL e em ou cerca de 2000 IU/mL, entre ou cerca de 800 IU/mL e em ou cerca de 1500 IU/mL, entre ou cerca de 800 IU/mL e em ou cerca de 1000 IU/mL, entre ou cerca de 1000 IU/mL e em ou cerca de 2000 IU/mL, entre ou cerca de 1000 IU/mL e em ou cerca de 1500 IU/mL,

entre ou cerca de 1500 IU/mL e em ou cerca de 2000 IU/mL. Em al- gumas modalidades, a IL-7 é adicionada ao meio de cultura em uma quantidade entre ou cerca de 1000 IU/mL e em ou cerca de 2000 IU/mL. Em algumas modalidades, a IL-7 é adicionada ao meio de cul- tura em ou cerca de 600 IU/mL.

[00292] Em algumas modalidades, IL-21 recombinante é adicionada ao meio de cultura. Em algumas modalidades, a IL-21 recombinante é adicionada ao meio de cultura em uma concentração entre ou cerca de 0,5 IU/mL e em ou cerca de 20 IU/mL, entre ou cerca de 0,5 IU/mL e em ou cerca de 15 IU/mL, entre ou cerca de 0,5 IU/mL e em ou cerca de 10 IU/mL, entre ou cerca de 0,5 IU/mL e em ou cerca de 5 IU/mL, entre ou cerca de 0,5 IU/mL e em ou cerca de 2,5 IU/mL, entre ou cer- ca de 0,5 IU/mL e em ou cerca de 1 IU/mL, entre ou cerca de 1 IU/mL e em ou cerca de 20 IU/mL, entre ou cerca de 1 IU/mL e em ou cerca de 15 IU/mL, entre ou cerca de 1 IU/mL e em ou cerca de 10 IU/mL, entre ou cerca de 1 IU/mL e em ou cerca de 5 IU/mL, entre ou cerca de 1 IU/mL e em ou cerca de 2,5 IU/mL, entre ou cerca de 2,5 IU/mL e em ou cerca de 20 IU/mL, entre ou cerca de 2,5 IU/mL e em ou cerca de 15 IU/mL, entre ou cerca de 2,5 IU/mL e em ou cerca de 10 IU/mL, entre ou cerca de 2,5 IU/mL e em ou cerca de 5 IU/mL, entre ou cerca de 5 IU/mL e em ou cerca de 20 IU/mL, entre ou cerca de 5 IU/mL e em ou cerca de 15 IU/mL, entre ou cerca de 5 IU/mL e em ou cerca de 10 IU/mL, entre ou cerca de 10 IU/mL e em ou cerca de 20 IU/mL, en- tre ou cerca de 10 IU/mL e em ou cerca de 15 IU/mL, ou entre ou cer- ca de 15 IU/mL e em ou cerca de 20 IU/mL. Em algumas modalidades, a IL-21 é adicionada ao meio de cultura em uma quantidade entre ou cerca de 0,5 IU/mL e em ou cerca de 2,5 IU/mL. Em algumas modali- dades, a IL-21 é adicionada ao meio de cultura em ou cerca de 1 IU/mL.

[00293] As células T classificadas ou selecionadas podem ser ex-

pandidas sob uma ou mais condições estimulatórias em um recipiente de cultura adequado para a expansão celular.

Em algumas modalida- des, o recipiente de cultura é um recipiente de cultura permeável a gás, tal como um sistema G-Rex (por exemplo, G-Rex 10, G-Rex 10M, G-Rex 100 M/100M-CS ou G-Rex 500 M/500M-CS). Em algumas mo- dalidades, o recipiente de cultura é uma microplaca, frasco, barra ou outro recipiente de cultura adequado para a expansão de células em um sistema fechado.

Em algumas modalidades, a expansão pode ser realizada em um biorreator.

Em algumas modalidades, a composição de células T expandidas é removida de um sistema fechado e coloca- da e/ou conectada a um biorreator para expansão.

As células T classi- ficadas ou selecionadas podem ser expandidas usando um sistema de expansão de células por transferência para a célula para sacos per- meáveis a gases, tal como em conexão com um biorreator (por exem- plo, Xuri Cell Expansion System W25 (GE Healthcare)). Em uma mo- dalidade, o sistema de expansão celular inclui um recipiente de cultu- ra, tal como um saco, por exemplo, saco de células permeáveis a gás, com um volume que é cerca de 50 mL, cerca de 100 mL, cerca de 200 mL, cerca de 300 mL, cerca de 400 mL, cerca de 500 mL, cerca de 600 mL, cerca de 700 mL, cerca de 800 mL, cerca de 900 mL, cerca de 1 L, cerca de 2 L, cerca de 3 L, cerca de 4 L, cerca de 5 L, cerca de 6 L, cerca de 7 L, cerca de 8 L, cerca de 9 L e cerca de 10 L, ou qual- quer valor entre qualquer um dos anteriores.

Em algumas modalida- des, o processo é automatizado ou semiautomático.

Exemplos de bior- reatores adequados para a expansão de perfusão automatizada inclu- em, mas não são limitados a, GE Xuri W25, GE Xuri W5, Sartorius Bi- oSTAT RM 20 | 50, Finesse SmartRocker Bioreactor Systems, e Pall XRS Bioreactor Systems, ou Miltenyi Prodigy.

Em alguns aspectos, a cultura de expansão é realizada em condições státicas.

Em algumas modalidades, a cultura de expansão é realizada sob condições de ba-

lanço. O meio pode ser adicionado em bolus ou pode ser adicionado em um cronograma de perfusão. Em algumas modalidades, o biorrea- tor mantém a temperatura em ou próximo a 37 °C e os níveis de CO 2 em ou próximo de 5% com um fluxo de ar estável em, em cerca de, ou pelo menos 0,01 L/min, 0,05 L/min, 0,1 L/min, 0.2 L/min, 0,3 L/min, 0,4 L/min, 0,5 L/min, 1,0 L/min, 1,5 L/min, ou 2,0 L/min ou mais do que cerca de 2,0 L/min. Em certas modalidades, pelo menos uma parte da cultura é realizada com perfusão, tal como com uma taxa de 290 ml/dia, 580 ml/dia e/ou 1160 ml/dia.

[00294] Em algumas modalidades, as células são semeadas em um recipiente de cultura apropriado (por exemplo, saco permeável a gás) a uma densidade de 0,5 x 106 células/mL a 1,5 x 106 células/mL. Em algumas modalidades, a densidade é de ou cerca de 0,5 x 106 célu- las/mL, 0,75 x 106 células/mL, 1 x 106 células/mL, 1,25 x 106 célu- las/mL ou 1,5 x 106 células/mL, ou qualquer valor entre qualquer do anterior.

[00295] Em alguns aspectos, as células são expandidas em um sis- tema de expansão fechado automatizado que é habilitado para perfu- são. As perfusões podem adicionar continuamente mídia às células para garantir que uma taxa de crescimento ideal seja alcançada.

[00296] Em algumas modalidades, a expansão é realizada usando um biorreator de sistema de expansão de células Xuri. As células po- dem ser semeadas em 0,5 a 1,5 milhões de células por mL. As células podem ser cultivadas em condições estáticas ou oscilantes. O meio pode ser adicionado em bolus ou em um cronograma de perfusão. Em modalidades, o biorreator mantém a temperatura em ou próximo a 37 °C e os níveis de CO2 em ou próximo a 5%. O volume da cultura pode ser mantido em aproximadamente 0,5 L a 1,0 L. Em algumas modali- dades, a expansão é realizada por 7 a 14 dias, como 7 a 10 dias. Em alguns aspectos, a expansão resulta em 100 milhões a 50 bilhões de células após a expansão e/ou em uma expansão de 10 a 1000 vezes.

[00297] Em algumas modalidades, a expansão é realizada usando um biorreator Miltenyi Prodigy. As células podem ser semeadas em 0,5-1,5 milhões de células por mL. As células podem ser cultivadas em condições estáticas ou de agitação. O meio pode ser adicionado em bolus ou em um cronograma de perfusão. Em modalidades, o biorrea- tor mantém a temperatura em ou próximo a 37 °C e os níveis de CO2 em ou próximo a 5%. O volume da cultura pode ser mantido em apro- ximadamente 70 mL a 400 mL. Em algumas modalidades, a expansão é realizada por 7 a 14 dias, como 7 a 10 dias. Em alguns aspectos, a expansão resulta em 100 milhões a 3 bilhões de células após a ex- pansão e/ou em uma expansão de 10 a 1000 vezes.

[00298] Em algumas modalidades, a expansão é realizada usando um saco permeável a gás. As células podem ser semeadas em 0,5 a 1,5 milhões de células por mL. As células podem ser cultivadas em condições estáticas. Em modalidades, o biorreator mantém a tempera- tura em ou próximo a 37 °C e os níveis de CO 2 em ou próximo a 5%. Em tais aspectos, quando a concentração de células excede 2,0 mi- lhões de células por mL, o meio pode ser adicionado para trazer a concentração de células para entre 0,5 e 1,0 milhão de células por mL. Se o volume atingir o volume máximo do saco, as células seriam adi- cionadas a um saco maior ou a vários sacos para cultura nas mesmas condições. Em algumas modalidades, a expansão é realizada por 7 a 14 dias, como 7 a 10 dias.

[00299] Os métodos de expansão podem ser realizados em condi- ções de GMP, incluindo em um sistema automatizado fechado e usan- do meio sem soro. Em algumas modalidades, qualquer uma ou mais das etapas do método podem ser realizadas em um sistema fechado ou sob condições de GMP. Em certas modalidades, todas as opera- ções do processo são realizadas em um pacote GMP. Em algumas modalidades, um sistema fechado é usado para realizar uma ou mais das outras etapas de processamento de um método para a fabricação, geração ou produção de uma terapia celular. Em algumas modalida- des, uma ou mais ou todas as etapas de processamento, por exemplo, isolamento, seleção e/ou enriquecimento, processamento, etapas de cultura, incluindo incubação em conexão com a expansão das células e as etapas de formulação são realizadas usando um sistema, disposi- tivo, ou aparelho em um sistema integrado ou autônomo e/ou de forma automatizada ou programável. Em alguns aspectos, o sistema ou apa- relho inclui um computador e/ou programa de computador em comuni- cação com o sistema ou aparelho, o que permite que um usuário pro- grame, controle, avalie o resultado e/ou ajuste vários aspectos do pro- cessamento, isolamento, engenharia e etapas de formulação.

[00300] Em algumas modalidades, a incubação com o(s) agente(s) estimulador(es) de células T para a expansão de células reativas ao tumor é realizada por ou cerca de 1 dia, tal como geralmententre de ou cerca de 2 dias, 3 dias, 4 dias, 5 dias, 6 dias, 7 dias, 8 dias, 9 dias, 10 dias, 11 dias, 12 dias ou qualquer intervalo de tempo entre qualquer um dos anteriores. Em algumas modalidades, a incubação com o(s) agente(s) estimulador(es) de células T para expansão de células reativas ao tumor é realizada por 7 a 21 dias, tal como 7 dias, 8 dias, 9 dias, 10 dias, 11 dias, 12 dias , 13 dias, 14, dias, 15 dias, 16 dias, 17 dias, 18 dias, 19 dias, 20 dias ou 21 dias, ou qualquer valor entre qualquer um dos anteriores. Em algumas modalidades, a incubação é realizada por 7 a 14 dias. Em algumas modalidades, a incubação é realizada por 7 a 10 dias. Em algumas modalidades, a incubação é de ou cerca de 7 dias. Em algumas modalidades, a incubação é de ou cerca de 8 dias. Em algumas modalidades, a incubação é de ou cerca de 9 dias. Em algumas modalidades, a incubação é de ou cerca de 10 dias. Em alguns casos, o meio pode ser trocado diariamente, a cada segundo dia, a cada terceiro dia, a cada 5° dia ou uma vez por semana durante o período de cultura ou incubação. Em algumas modalidades, os agentes estimulantes (por exemplo, citocinas, anti- CD3) são reabastecidos em cada troca de meio.

[00301] Em algumas modalidades, os métodos de cultura para expandir células de acordo com qualquer um dos métodos fornecidos são realizados até uma quantidade limite de células, tal como células reativas ao tumor ou células positivas para um ou mais marcadores de ativação de células T, é obtido. Em algumas modalidades, o método de cultura para expandir células de acordo com qualquer um dos métodos fornecidos é realizado até 30 dias a partir do momento de enriquecimento dos linfócitos. Em algumas modalidades, o método de cultura para expandir células de acordo com qualquer um dos métodos fornecidos é realizado em até 20 dias após o início da primeira expansão. Em algumas modalidades, o método de cultura para expandir células de acordo com qualquer um dos métodos fornecidos é realizado em até 20 dias após o início da cocultura. Em algumas das modalidades fornecidas, a colheita é realizada dentro de 20 dias após o início da cultura e/ou o enriquecimento de células T compreendendo células reativas ao tumor. Em algumas das modalidades fornecidas, as células são colhidas 7 a 20 dias, 7 a 14 dias, 7 a 10 dias, 10 a 20 dias, 10 a 14 dias ou 14 a 20 dias após o início da cultura. Entende-se que a referência ao número de dias é com referência aos dias em que as células estão presentes em uma cultura e não incluem o tempo em que as células de qualquer uma ou mais das etapas podem ser armazenadas sob condições de criopreservação.

[00302] Em algumas das modalidades fornecidas, a cultura é realizada até que uma quantidade limite de células seja alcançada que está entre de ou cerca de 0,5 x 108 entre de ou cerca de 50 x 109 células totais ou células viáveis totais, entre de ou cerca de 0,5 x 108 entre de ou cerca de 30 x 109 células totais ou células viáveis totais, entre 0,5 x 108 entre de ou cerca de 12 x 109 células totais ou células viáveis totais, entre de ou cerca de 0,5 x 108 entre de ou cerca de 60 x 108 células totais ou células viáveis totais, entre de ou cerca de 0,5 x 108 entre de ou cerca de 15 x 108 células totais ou células viáveis totais, entre de ou cerca de 0,5 x 108 entre de ou cerca de 8 x 108 células totais ou células viáveis totais, entre de ou cerca de 0,5 x 108 entre de ou cerca de 3,5x 108 células totais ou células viáveis totais, entre de ou cerca de 0,5 x 108 entre de ou cerca de 1 x 108 células totais ou células viáveis totais, entre 1 x 108 entre de ou cerca de 50 x 109 células totais ou células viáveis totais, entre de ou cerca de 1 x 108 entre de ou cerca de 30 x 109 células totais ou células viáveis totais, entre 1 x 108 entre de ou cerca de 12 x 109 células totais ou células viáveis totais, entre de ou cerca de 1 x 108 entre de ou cerca de 60 x 108 células totais ou células viáveis totais, entre de ou cerca de 1 x 108 entre de ou cerca de 15 x 108 células totais ou células viáveis totais, entre de ou cerca de 1 x 108 entre de ou cerca de 8 x 108 células totais ou células viáveis totais, entre de ou cerca de 1 x 108 entre de ou cerca de 3,5 x 108 células totais ou células viáveis totais, entre de ou cerca de 3,5 x 108 entre de ou cerca de 50 x 109 células totais ou células viáveis totais, entre de ou cerca de 3,5 x 108 entre de ou cerca de 30 x 109 células totais ou células viáveis totais, entre de ou cerca de 3,5 x 108 entre de ou cerca de 12 x 109 células totais ou células viáveis totais, entre de ou cerca de 3,5 x 108 entre de ou cerca de 60 x 108 células totais ou células viáveis totais, entre de ou cerca de 3,5 x 108 entre de ou cerca de 15 x 108 células totais ou células viáveis totais, entre de ou cerca de 3,5 x 108 entre de ou cerca de 8 x 108 células totais ou células viáveis totais, entre de ou cerca de 8 x 108 entre de ou cerca de 50 x 109 células totais ou células viáveis totais, entre de ou cerca de 8 x 108 entre de ou cerca de 30 x 109 células totais ou células viáveis totais, entre de ou cerca de 8 x 108 entre de ou cerca de 12 x 109 células totais ou células viáveis totais, entre de ou cerca de 8 x 108 entre de ou cerca de 60 x 108 células totais ou células viáveis totais, entre de ou cerca de 8 x 108 entre de ou cerca de 15 x 108 células totais ou células viáveis totais, entre de ou cerca de 15 x 108 entre de ou cerca de 50 x 109 células totais ou células viáveis totais, entre de ou cerca de 15 x 108 entre de ou cerca de 30 x 109 células totais ou células viáveis totais, entre de ou cerca de 15 x 108 entre de ou cerca de 12 x 109 células totais ou células viáveis totais, entre de ou cerca de 15 x 108 entre de ou cerca de 60 x 108 células totais ou células viáveis totais, entre de ou cerca de 60 x 108 entre de ou cerca de 50 x 109 células totais ou células viáveis totais, entre de ou cerca de 60 x 108 entre de ou cerca de 30 x 109 células totais ou células viáveis totais, entre de ou cerca de 60 x 108 entre de ou cerca de 12 x 109 células totais ou células viáveis totais, entre de ou cerca de 12 x 109 entre de ou cerca de 50 x 109 células totais ou células viáveis totais, entre de ou cerca de 12 x 109 entre de ou cerca de 30 x 109 células totais ou células viáveis totais, ou entre de ou cerca de 30 x 109 entre de ou cerca de 60 x 109 células totais ou células viáveis totais, cada inclusive.

[00303] Em algumas das modalidades fornecidas, o método resulta em uma expansão de vezes de células T ou em uma expansão de vezes de células T reativas ao tumor que é de pelo menos, ou de cerca de 2 vezes, pelo menos em ou cerca de 5 vezes, pelo menos por ou cerca de 10 vezes, pelo menos por ou cerca de 25 vezes, pelo menos por ou cerca de 50 vezes, pelo menos por ou cerca de 100 vezes, pelo menos por ou cerca de 250 vezes, em pelo menos pelo menos ou cerca de 500 vezes, pelo menos pelo menos ou cerca de 1000 vezes, ou mais.

[00304] Ao atingir a dose terapêutica após a expansão, o produto pode ser concentrado e congelado em meio de criopreservação. Também são fornecidas aqui populações de células T produzidas por métodos aqui descritos e composições farmacêuticas das mesmas. II. COMPOSIÇÕES E FORMULAÇÕES FARMACÊUTICAS

[00305] São fornecidas aqui composições contendo células T expandidas, tais como produzidas por qualquer um dos métodos fornecidos. Em algumas modalidades, as composições contêm células T reativas ao tumor ou células T contendo um TCR endógeno específico para um antígeno associado ao tumor, por exemplo, neoantígeno. Em particular, entre as composições fornecidas estão composições de células que são enriquecidas para células T reativas ao tumor ou células T contendo um TCR endógeno específico para um antígeno associado a tumor, por exemplo, neoantígeno.

[00306] Em algumas modalidades, a composição compreende cerca de 5 a 99% de células T reativas ao tumor ou células T positivas de superfície para um ou mais marcadores de ativação de células T, ou qualquer porcentagem de tais células entre 5 e 99% inclusive. Em algumas modalidades, a composição pode incluir percentagens aumentadas ou maiores de células T CD3+ reativas ao tumor ou de células T CD3+ positivas de superfície para um ou mais marcadores de ativação de células T em relação às células T CD3+ totais ou células totais na composição em comparação com a porcentagem de tais células T CD3+ reativas ao tumor ou de células T CD3+ positivas de superfície para um ou mais marcadores de ativação de células T em relação ao total de células T CD3+ ou células totais naturalmente presentes no indivíduo ou amostra biológica a partir da qual as células foram isoladas. Em algumas modalidades, a porcentagem é aumentada pelo menos ou pelo menos cerca de 2 vezes, 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, 10 vezes, 20 vezes, 30 vezes, 40 vezes, 50 vezes, 60 vezes, 70 vezes, 80 vezes, 90 vezes, 100 vezes, 150 vezes, 200 vezes ou mais. Em tais modalidades, o um ou mais marcadores de ativação de células T podem ser qualquer um conforme descrito, tal como qualquer um ou mais de CD107a, CD39, CD103, CD59, CD90 e/ou CD38.

[00307] Em algumas modalidades, a composição pode incluir pelo menos ou cerca de 20%, pelo menos ou cerca de 30%, pelo menos ou cerca de 40%, pelo menos ou cerca de 50%, pelo menos ou cerca de 60%, pelo menos ou cerca de 65%, pelo menos ou cerca de 70%, pelo menos ou cerca de 75%, pelo menos ou cerca de 80%, pelo menos ou cerca de 81%, pelo menos ou cerca de 82%, pelo menos ou cerca de 83%, pelo menos ou cerca de 84%, pelo menos ou cerca de 85%, pelo menos ou cerca de 86%, pelo menos ou cerca de 87%, pelo menos ou cerca de 88%, pelo menos ou cerca de 89%, pelo menos ou cerca de 90%, pelo menos ou cerca de 91%, pelo menos ou cerca de 92%, pelo menos ou cerca de 93%, pelo menos ou cerca de 94%, pelo menos ou cerca de 95%, pelo menos ou cerca de 96%, pelo menos ou cerca de 97%, pelo menos ou cerca de 98%, pelo menos ou cerca de 99%, ou substancialmente células T CD3+ reativas ao tumor ou células T CD3+ positivas de superfície para um ou mais marcadores de ativação. Em algumas modalidades, a composição compreende mais de 30% de células T CD3+ reativas ao tumor ou células T CD3+ positivas de superfície para um ou mais marcadores de ativação. Em algumas modalidades, a composição compreende mais de 40% de células T CD3+ reativas ao tumor ou células T CD3 + positivas de superfície para um ou mais marcadores de ativação. Em algumas modalidades, a composição compreende mais de 50% de células T CD3+ reativas ao tumor ou células T CD3+ positivas de superfície para um ou mais marcadores de ativação. Em algumas modalidades, a composição compreende mais de 60% de células T CD3+ reativas ao tumor ou células T CD3+ positivas de superfície para um ou mais marcadores de ativação. Em algumas modalidades, a composição compreende mais de 70% de células T CD3+ reativas ao tumor ou células T CD3+ positivas de superfície para um ou mais marcadores de ativação. Em algumas modalidades, a composição compreende mais de 80% de células T CD3+ reativas ao tumor ou células T CD3+ positivas de superfície para um ou mais marcadores de ativação. Em algumas modalidades, a composição compreende mais de 90% de células T CD3+ reativas ao tumor ou células T CD3+ positivas de superfície para um ou mais marcadores de ativação. Em tais modalidades, o um ou mais marcadores de ativação de células T podem ser qualquer um conforme descrito, tal como qualquer um ou mais de CD107a, CD39, CD103, CD59, CD90 e/ou CD38. Em tais modalidades, o um ou mais marcadores de ativação de células T podem ser CD134 e/ou CD137.

[00308] Em algumas modalidades, as células T CD3+ reativas ao tumor ou células T CD3+ positivas de superfície para um ou mais marcadores de ativação podem estar presentes na composição em uma quantidade terapeuticamente eficaz. Uma quantidade eficaz de células pode variar dependendo do paciente, bem como do tipo, gravidade e extensão da doença. Assim, um médico pode determinar o que é uma quantidade eficaz após considerar a saúde do indivíduo, a extensão e gravidade da doença e outras variáveis.

[00309] Em certas modalidades, o número de tais células na composição é uma quantidade terapeuticamente eficaz. Em algumas modalidades, a quantidade é uma quantidade que reduz a gravidade, a duração e/ou os sintomas associados ao câncer, infecção viral, infecção microbiana ou choque séptico em um animal. Em algumas modalidades, uma quantidade terapeuticamente eficaz é uma dose de células que resulta em uma redução do crescimento ou disseminação do câncer em pelo menos 2,5%, pelo menos 5%, pelo menos 10%, pelo menos 15%, pelo menos 25%, pelo menos 35%, pelo menos

45%, pelo menos 50%, pelo menos 75%, pelo menos 85%, por pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 99% em um paciente ou animal administrado a composição aqui descrita em relação ao crescimento ou disseminação do câncer em um paciente (ou um animal) ou um grupo de pacientes (ou animais) não administrados com a composição. Em algumas modalidades, uma quantidade terapeuticamente eficaz é uma quantidade que resulta em atividade citotóxica, resultando em atividade para inibir ou reduzir o crescimento de células cancerosas, virais e microbianas.

[00310] Em algumas modalidades, a composição compreende uma quantidade de células T CD3+ reativas ao tumor ou células T CD3+ positivas de superfície para um ou mais marcadores de ativação que são de ou cerca de 105 entre de ou cerca de 1012 células T CD3+ reativas ao tumor ou células T CD3+ positivas de superfície para um ou mais marcadores de ativação, ou de ou cerca de 105 a ou cerca de 108 células T CD3+ reativas ao tumor ou células T CD3+ positivas de superfície para um ou mais marcadores de ativação, ou de ou cerca de 106 entre de ou cerca de 1012 células T CD3+ reativas ao tumor ou células T CD3+ positivas de superfície para um ou mais marcadores de ativação, ou de ou cerca de 108 entre de ou cerca de 1011 células T CD3+ reativas ao tumor ou células T CD3+ positivas de superfície para um ou mais marcadores de ativação, ou de ou cerca de 109 entre de ou cerca de 1010 células T CD3+ reativas ao tumor ou células T CD3+ positivas de superfície para um ou mais marcadores de ativação. Em algumas modalidades, a composição compreende mais ou mais do que de ou cerca de 105 células T CD3+ reativas ao tumor ou células T CD3+ positivas de superfície para um ou mais marcadores de ativação, de ou cerca de 106 células T CD3+ reativas ao tumor ou células T CD3+ positivas de superfície para um ou mais marcadores de ativação, de ou cerca de 107 células T CD3+ reativas ao tumor ou células T CD3+ positivas de superfície para um ou mais marcadores de ativação, de ou cerca de 108 células T CD3+ reativas ao tumor ou células T CD3+ positivas de superfície para um ou mais marcadores de ativação, de ou cerca de 109 células T CD3+ reativas ao tumor ou células T CD3+ positivas de superfície para um ou mais marcadores de ativação, de ou cerca de 1010 células T CD3+ reativas ao tumor ou células T CD3+ positivas de superfície para um ou mais marcadores de ativação, de ou cerca de 1011 células T CD3+ reativas ao tumor ou células T CD3+ positivas de superfície para um ou mais marcadores de ativação, ou de ou cerca de 1012 células T CD3+ reativas ao tumor ou células T CD3+ positivas de superfície para um ou mais marcadores de ativação. Em algumas modalidades, tal quantidade pode ser administrada a um indivíduo com uma doença ou condição, tal como a um paciente com câncer. Em tais modalidades, o um ou mais marcadores de ativação de células T podem ser qualquer um conforme descrito, tal como qualquer um ou mais de CD107a, CD39, CD103, CD59, CD90 e/ou CD38. Em algumas modalidades, o um ou mais marcadores de ativação de células T são CD134 e/ou CD137.

[00311] Em algumas modalidades, a composição compreende células T CD3+ como uma porcentagem do total de células na população que é maior do que ou maior do que cerca de 60%, maior do que ou maior do que cerca de 70%, maior do que ou maior do que cerca de 80%, maior do que ou maior do que cerca de 90% ou maior do que ou maior do que cerca de 95%. Em algumas modalidades, a composição contém células T CD4+ e células T CD8+ como uma porcentagem do total de células na população que é maior do que ou maior do que cerca de 60%, maior do que ou maior do que cerca de 70%, maior do que ou maior do que cerca de 80 %, maior do que ou maior do que cerca de 90% ou maior do que ou maior do que cerca de 95%. Em modalidades particulares, a composição contém uma relação de células T CD8+ para células T CD4+ que é entre de ou cerca de 1:100 entre de ou cerca de 100:1, entre de ou cerca de 1:50 entre de ou cerca de 50:1, entre de ou cerca de 1:25 entre de ou cerca de 25:1, entre de ou cerca de 1:10 entre de ou cerca de 10:1, entre de ou cerca de 1:5 entre de ou cerca de 5:1, ou entre de ou cerca de 1:2.5 entre de ou cerca de 2.5:1.

[00312] Em algumas modalidades, o volume da composição é de pelo menos ou pelo menos cerca de 10 mL, 50 mL, 100 mL, 200 mL, 300 mL, 400 mL ou 500 mL, tal como é de ou de cerca de 10 mL a 500 mL, 10 mL a 200 mL, 10 mL a 100 mL, 10 mL a 50 mL, 50 mL a 500 mL, 50 mL a 200 mL, 50 mL a 100 mL, 100 mL a 500 mL, 100 mL a 200 mL ou 200 mL a 500 mL, cada um inclusive. Em algumas modalidades, a composição tem uma densidade celular de pelo menos ou pelo menos cerca de 1 x 105 células/mL, 5 x 105 células/mL, 1 x 106 células/mL, 5 x 106 células/mL, 1 x 107 células/mL, 5 x 107 células/mL ou 1 x 108 células/mL. Em algumas modalidades, a densidade celular da composição está entre ou entre cerca de 1 x 105 células/mL a 1 x 108 células/mL, 1 x 105 células/mL a 1 x 107 células/mL, 1 x 105 células/mL a 1 x 106 células/mL, 1 x 106 células/mL a 1 x 107 células/mL, 1 x 106 células/mL a 1 x 108 células/mL, 1 x 106 células/mL a 1 x 107 células/mL ou 1 x 107 células/mL a 1 x 108 células/mL, cada inclusive.

[00313] Entre as composições estão composições farmacêuticas e formulações para administração, tal como para terapia celular adotiva. Em algumas modalidades, as células projetadas são formuladas com um transportador farmaceuticamente aceitável.

[00314] Um transportador farmaceuticamente aceitável pode incluir todos os solventes, meios de dispersão, revestimentos, agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes isotônicos e retardadores de absorção e semelhantes, compatíveis com a administração farmacêutica (Gennaro, 2000, Remington: The science and practice of pharmacy, Lippincott, Williams & Wilkins, Philadelphia, PA). Exemplos de tais veículos ou diluentes incluem, mas não estão limitados a, água, solução salina, soluções de Ringer, solução de dextrose e albumina de soro humano a 5%. Lipossomas e veículos não aquosos, como óleos fixos, também podem ser usados. Compostos ativos suplementares também podem ser incorporados nas composições. O transportador farmacêutico deve ser um que seja adequado para células NK, tal como uma solução salina, uma solução de dextrose ou uma solução compreendendo albumina de soro humano.

[00315] Em algumas modalidades, o transportador ou veículo farmaceuticamente aceitável para tais composições é qualquer solução aquosa não tóxica na qual as células NK podem ser mantidas, ou permanecer viáveis, por um tempo suficiente para permitir a administração de células NK vivas. Por exemplo, o transportador ou veículo farmaceuticamente aceitável pode ser uma solução salina ou solução salina tamponada. O transportador ou veículo farmaceuticamente aceitável também pode incluir vários biomateriais que podem aumentar a eficiência das células NK. Os veículos e transportadores celulares podem, por exemplo, incluir polissacarídeos, como metilcelulose (M. C. Tate, D. A. Shear, S. W. Hoffman, D. G. Stein, M. C. LaPlaca, Biomaterials 22, 1113, 2001, que é incorporado neste documento por referência em sua totalidade), quitosana (Suh J K F, Matthew H W T. Biomaterials, 21, 2589, 2000; Lahiji A, Sohrabi A, Hungerford D S, et al., J Biomed Mater Res, 51, 586, 2000, cada um dos quais é incorporado aqui por referência na sua totalidade), copolímero P de N-isopropilacrilamida (NIPAM-co-AA) (Y. H. Bae, B. Vernon, C. K. Han, S. W. Kim, J. Control. Release 53, 249, 1998; H. Gappa, M. Baudys, J. J. Koh, S. W. Kim, Y. H. Bae, Tissue Eng. 7, 35, 2001, cada um dos quais é incorporado aqui por referência em sua totalidade), bem como poli(oxietileno)/ácido poli(D,L-lático -ácido co- glicólico) (B. Jeong, K. M. Lee, A. Gutowska, Y. H. An, Biomacromolecules 3, 865, 2002, que é incorporado aqui por referência em sua totalidade), P(PF-co-EG) (Suggs L J, Mikos A G. Cell Trans, 8, 345, 1999, que é incorporado aqui por referência em sua totalidade), PEO/PEG (Mann B K, Gobin A S, Tsai A T, Schmedlen R H, West J L., Biomaterials, 22, 3045, 2001; Bryant S J, Anseth K S. Biomaterials, 22, 619, 2001, cada um dos quais é incorporado aqui por referência em sua totalidade), PVA (Chih-Ta Lee, Po-Han Kung e Yu-Der Lee, Carbohydrate Polymers, 61, 348, 2005, que é incorporado aqui por referência em sua totalidade), colágeno (Lee C R, Grodzinsky A J, Spector M., Biomaterials 22, 3145, 2001, que é incorporado aqui por referência em sua totalidade), alginato (Bouhadir K H, Lee K Y, Alsberg E, Damm K L, Anderson K W, Mooney D J. Biotech Prog 17, 945, 2001; Smidsrd O, Skjak-Braek G., Trends Biotech, 8, 71, 1990, cada um dos quais é incorporado aqui por referência em sua totalidade).

[00316] Em algumas modalidades, a composição, incluindo a composição farmacêutica, é estéril. Em algumas modalidades, o isolamento ou enriquecimento das células é realizado em um ambiente fechado ou estéril, por exemplo, para minimizar o erro, manuseio do usuário e/ou contaminação. Em algumas modalidades, a esterilidade pode ser facilmente realizada, por exemplo, por filtração através de membranas de filtração estéreis.

[00317] Também são fornecidas aqui composições que são adequadas para criopreservar as células T fornecidas, incluindo células T reativas a tumor ou células T positivas de superfície para um ou mais marcadores de ativação. Em algumas modalidades, a composição compreende um crioprotetor. Em algumas modalidades, o crioprotetor é ou compreende DMSO e/ou glicerol. Em algumas modalidades, as composições formuladas para criopreservação podem ser armazenadas em temperaturas baixas, como temperaturas ultrabaixas, por exemplo, armazenamento com faixas de temperatura de -40 ºC a -150 ºC, tal como ou cerca de 80 ºC ± 6,0 º C.

[00318] Em algumas modalidades, as células criopreservadas são preparadas para administração por descongelamento. Em alguns casos, as células podem ser administradas a um indivíduo imediatamente após o descongelamento. Em tal modalidade, a composição está pronta para uso sem qualquer processamento adicional. Em outros casos, as células são posteriormente processadas após o descongelamento, tal como por ressuspensão com um transportador farmaceuticamente aceitável, incubação com um agente ativador ou estimulador, ou são ativadas lavadas e ressuspensas em um tampão farmaceuticamente aceitável antes da administração a um indivíduo. III. MÉTODOS DE TRATAMENTO E APLICAÇÕES TERAPÊUTICAS

[00319] São fornecidos aqui composições e métodos relacionados às composições de células terapêuticas fornecidas aqui descritas para uso no tratamento de doenças ou condições em um indivíduo, tal como um câncer. Tais métodos e usos incluem métodos e usos terapêuticos, por exemplo, envolvendo a administração das células terapêuticas, ou composições contendo as mesmas, a um indivíduo com uma doença, condição ou distúrbio. Em alguns casos, a doença ou distúrbio é um tumor ou câncer. Em algumas modalidades, as células ou sua composição farmacêutica são administradas em uma quantidade eficaz para efetuar o tratamento da doença ou distúrbio. Os usos incluem o uso das células ou composições farmacêuticas das mesmas em tais métodos e tratamentos, e na preparação de um fármaco para realizar tais métodos terapêuticos. Em algumas modalidades, os métodos tratam assim a doença ou condição ou distúrbio no indivíduo.

[00320] Em algumas modalidades, os métodos de tratamento compreendem a administração de uma quantidade eficaz de uma composição contendo células T CD3+ reativas a tumor ou superfície de células T CD3+, que podem incluir células T positivas de superfície para um ou mais marcadores de ativação. Essas composições podem incluir qualquer um aqui descrito, incluindo composições produzidas pelos métodos fornecidos.

[00321] Em algumas modalidades, um indivíduo (por exemplo, autólogo) é administrado a partir de ou cerca de 105 a de ou cerca de 1012 Células T CD3+ produzidas por qualquer um dos métodos fornecidos, ou a partir de ou cerca de 105 a de ou cerca de 108 Células T CD3+ produzidas por qualquer um dos métodos fornecidos, ou a partir de ou cerca de 106 entre de ou cerca de 1012 Células T CD3+ produzidas por qualquer um dos métodos fornecidos, ou a partir de ou cerca de 108 entre de ou cerca de 1011 Células T CD3+ produzidas por qualquer um dos métodos fornecidos, ou a partir de ou cerca de 10 9 entre de ou cerca de 1010 Células T CD3+ produzidas por qualquer um dos métodos fornecidos. Em algumas modalidades, a quantidade terapeuticamente eficaz para administração compreende mais do que ou mais do que de ou cerca de 105 Células T CD3+ produzidas por qualquer um dos métodos, de ou cerca de 106 Células T CD3+ produzidas por qualquer um dos métodos, de ou cerca de 107 Células T CD3+ produzidas por qualquer um dos métodos, de ou cerca de 108 Células T CD3+ produzidas por qualquer um dos métodos, de ou cerca de 109 Células T CD3+ produzidas por qualquer um dos métodos, de ou de cerca de 1010 Células T CD3+ produzidas por qualquer um dos métodos, de ou cerca de 1011 Células T CD3+ produzidas por qualquer um dos métodos, ou de ou cerca de 1012 Células T CD3+ produzidas por qualquer um dos métodos. Em algumas modalidades, tal quantidade pode ser administrada a um indivíduo com uma doença ou condição, tal como a um paciente com câncer. Em algumas modalidades, o número de células T administradas são células T viáveis.

[00322] Em algumas modalidades, os métodos de tratamento compreendem a administração de uma quantidade eficaz de uma composição contendo células T CD3+ reativas ao tumor ou células T CD3+ positivas de superfície para um ou mais marcadores de ativação. Essas composições podem incluir qualquer um aqui descrito, incluindo composições produzidas pelos métodos fornecidos. Em alguma modalidade, a partir de ou cerca de 105 a de ou cerca de 1012 células T CD3+ reativas ao tumor ou células T CD3+ positivas de superfície para um ou mais marcadores de ativação, tal como qualquer um conforme descrito, ou a partir de ou cerca de 105 a de ou cerca de 108 células T CD3+ reativas ao tumor ou células T CD3+ positivas de superfície para um ou mais marcadores de ativação, ou de ou cerca de 106 entre de ou cerca de 1012 células T CD3+ reativas ao tumor ou células T CD3+ positivas de superfície para um ou mais marcadores de ativação, ou de ou cerca de 108 entre de ou cerca de 1011 células T CD3+ reativas ao tumor ou células T CD3+ positivas de superfície para um ou mais marcadores de ativação, ou de ou cerca de 109 entre de ou cerca de 1010 células T CD3+ reativas ao tumor ou células T CD3+ positivas de superfície para um ou mais marcadores de ativação são administrados ao indivíduo. Em algumas modalidades, a quantidade terapeuticamente eficaz para administração compreende maior do que ou maior do que de ou cerca de 105 células T CD3+ reativas ao tumor ou células T CD3+ positivas de superfície para um ou mais marcadores de ativação, de ou cerca de 106 células T CD3+ reativas ao tumor ou células T CD3+ positivas de superfície para um ou mais marcadores de ativação, de ou cerca de 107 células T CD3+ reativas ao tumor ou células T CD3+ positivas de superfície para um ou mais marcadores de ativação, de ou cerca de 108 células T CD3+ reativas ao tumor ou células T CD3+ positivas de superfície para um ou mais marcadores de ativação, de ou cerca de 109 células T CD3+ reativas ao tumor ou células T CD3+ positivas de superfície para um ou mais marcadores de ativação, de ou cerca de 1010 células T CD3+ reativas ao tumor ou células T CD3+ positivas de superfície para um ou mais marcadores de ativação, de ou cerca de 1011 células T CD3+ reativas ao tumor ou células T CD3+ positivas de superfície para um ou mais marcadores de ativação, ou de ou cerca de 1012 células T CD3+ reativas ao tumor ou células T CD3+ positivas de superfície para um ou mais marcadores de ativação. Em algumas modalidades, tal quantidade pode ser administrada a um indivíduo com uma doença ou condição, tal como a um paciente com câncer. Em algumas modalidades, o número de células T administradas são células T viáveis.

[00323] Em algumas modalidades, a quantidade é administrada como uma dose fixa. Em outras modalidades, a quantidade é administrada por quilograma de peso corporal do indivíduo.

[00324] Em algumas modalidades, a composição, tal como produzida por qualquer um dos métodos fornecidos ou contendo células T reativas ao tumor ou células T positivas de superfície para um marcador de ativação de células T, é administrada a um indivíduo logo após a expansão de acordo com os métodos fornecidos. Em outras modalidades, as células T expandidas, tais como células T reativas ao tumor expandido ou células T positivas de superfície para um marcador de ativação de células T, são criopreservadas antes da administração, tal como pelos métodos descritos acima. Por exemplo, as células T, tais como células T reativas a tumor ou células T positivas de superfície para um marcador de ativação de células T,

podem ser armazenadas por mais de 6, 12, 18 ou 24 meses antes da administração ao indivíduo. Essas células criopreservadas podem ser descongeladas antes da administração.

[00325] Em algumas modalidades, as composições fornecidas, tais como as fornecidas por qualquer um dos métodos fornecidos ou contendo células T reativas ao tumor ou células T positivas de superfície para um marcador de ativação de células T, podem ser administradas a um indivíduo por qualquer via conveniente, incluindo vias parenterais, tal como as vias de administração subcutânea, intramuscular, intravenosa e/ou epidural.

[00326] Em algumas modalidades, as composições, tal como fornecidas por qualquer um dos métodos fornecidos ou contendo células T reativas ao tumor ou células T positivas de superfície para um marcador de ativação de células T, podem ser administradas em uma dose única. Tal administração pode ser por injeção, por exemplo, injeção intravenosa. Em algumas modalidades, células T reativas ao tumor ou células T positivas de superfície para um marcador de ativação de células T podem ser administradas em doses múltiplas. A dosagem pode ser uma, duas, três vezes, quatro vezes, cinco vezes, seis vezes ou mais de seis vezes por ano. A dosagem pode ser uma vez por mês, uma vez a cada duas semanas, uma vez por semana ou uma vez em dias alternados. A administração de tais composições e células pode continuar enquanto for necessário.

[00327] Em algumas modalidades, o indivíduo recebe uma terapia de linfodepleção antes da administração da dose de células de uma composição fornecida, tal como produzida por qualquer um dos métodos fornecidos ou contendo células T reativas ao tumor ou células T positivas de superfície para um marcador de ativação de células T. A terapia de linfodepleção pode incluir a administração de fludarabina e/ou ciclofosfamida (a forma ativa sendo referida como mafosfamida) e suas combinações. Tais métodos são descritos em Gassner et al. (Cancer Immunol Immunother . 201 1 , 60(l):75-85, Muranski, et al, Nat Clin Pract Oncol, 2006 3(12):668-681, Dudley, et al., J Clin Oncol 2008, 26:5233-5239, e Dudley, et al., J Clin Oncol. 2005, 23(10):2346- 2357, todos os quais são incorporados por referência neste documento em sua totalidade. Em algumas modalidades, a fludarabina é administrada em uma dosagem de 10 mg/kg/dia, 15 mg/kg/dia, 20 mg/kg/dia, 25 mg/kg/dia, 30 mg/kg/dia, 35 mg/kg/dia, 40 mg/kg/dia, ou 45 mg/kg/dia, ou uma quantidade de dosagem entre uma gama de qualquer uma das anteriores. Em algumas modalidades, a fludarabina é por 2 a 7 dias, tal como por 3 a 5 dias, tal como em ou cerca de 3 dias, em ou cerca de 4 dias ou em ou cerca de 5 dias. Em algumas modalidades, a ciclofosfamida é administrada em uma dosagem de 100 mg/m2/dia, 150 mg/m2/dia, 175 mg/m2/dia, 200 mg/m2/dia, 225 mg/m2/dia, 250 mg/m2/dia, 275 mg/m2/dia, ou 300 mg/m2/dia. Em algumas modalidades, a ciclofosfamida é administrada por via intravenosa (isto é, i.v.). Em algumas modalidades, o tratamento com ciclofosfamida é de 2 a 7 dias, como 3 a 5 dias, em ou cerca de 3 dias, em ou cerca de 4 dias ou em ou cerca de 5 dias. A terapia de linfodepleção é administrada antes das composições celulares fornecidas. Em algumas modalidades, a terapia de linfodepleção é realizada dentro de uma semana da administração das composições celulares fornecidas, tal como 5 a 7 dias antes da administração da dose de células.

[00328] As composições aqui descritas podem ser usadas em um método para o tratamento de distúrbios hiperproliferativos. Em uma modalidade preferida, eles são para uso no tratamento de câncer. Em alguns aspectos, o câncer pode ser um melanoma, câncer de ovário, câncer cervical, câncer de pulmão, câncer de bexiga, câncer de mama, câncer de cabeça e pescoço, carcinoma de células renais,

leucemia mieloide aguda, câncer colorretal e sarcoma. Em algumas modalidades, o câncer é um câncer com uma alta carga mutacional. Em algumas modalidades, o câncer é melanoma, pulmão escamoso, adenocarcinoma de pulmão, câncer de bexiga, câncer de células pequenas do pulmão, câncer de esôfago, câncer colorretal, câncer cervical, câncer de cabeça e pescoço, câncer de estômago ou câncer uterino.

[00329] Em algumas modalidades, o câncer é um câncer epitelial. Em algumas modalidades, o câncer é selecionado de câncer de pulmão de células não pequenas (NSCLC), CRC, câncer de ovário, câncer de mama, câncer de esôfago, câncer gástrico, câncer pancreático, câncer de colangiocarcinoma, câncer endometrial. Em algumas modalidades, o câncer de mama é câncer de mama HR+/Her2-. Em algumas modalidades, o câncer de mama é um câncer de mama triplo negativo (TNBC). Em algumas modalidades, o câncer de mama é um câncer de mama HER2+.

[00330] Em algumas modalidades, o indivíduo tem um câncer que é um tumor hematológico. Exemplos não limitativos de tumores hematológicos incluem leucemias, incluindo leucemias agudas (tal como leucemia aguda positiva lq23, leucemia linfocítica aguda, leucemia mielocítica aguda, leucemia mielóide aguda e mieloblástica, promielocítica, mielomonocítica, monocítica e eritroleucemia), leucemias crônicas (tal como leucemia mielocítica crônica (granulocítica), leucemia mielóide crônica e leucemia linfocítica crônica), policitemia vera, linfoma, doença de Hodgkin, linfoma não- Hodgkin (formas indolente e de alto grau), mieloma múltiplo, macroglobulina de Waldenstrom, doença da cadeia pesada, síndrome mielodisplásica, leucemia de células pilosas e mielodisplasia.

[00331] Em algumas modalidades, o indivíduo tem um câncer de tumor sólido. Exemplos não limitativos de tumores sólidos, tal como sarcomas e carcinomas, incluem fibrossarcoma, mixossarcoma, lipossarcoma, condrossarcoma, sarcoma osteogênico e outros sarcomas, sinovioma, mesotelioma, tumor de Ewing, leiomiossarcoma, rabdomiossarcoma, carcinoma de cólon, malignidade linfoide, câncer de pâncreas, câncer de mama (incluindo carcinoma de mama basal, carcinoma ductal e carcinoma de mama lobular), câncer de pulmão, câncer de ovário, câncer de próstata, carcinoma hepatocelular, carcinoma de células escamosas, carcinoma basocelular, adenocarcinoma, carcinoma das glândulas sudoríparas, carcinoma medular da tireoide, carcinoma papilífero da tireoide, feocromocitomas carcinoma das glândulas sebáceas, carcinoma papilar, adenocarcinomas papilares, carcinoma medular, carcinoma broncogênico, carcinoma das células renais, hepatoma, carcinoma do ducto biliar, coriocarcinoma, tumor de Wilms, câncer cervical, tumor testicular, seminoma, carcinoma da bexiga e tumores do CNS (tais como um glioma, astrocitoma, meduloblastoma, craniofaringioma, ependimoma, pinealoma, hemangioblastoma, neuroma acústico, oligodendroglioma, meningioma, melanoma, neuroblastoma e retinoblastoma). Em vários exemplos, um tumor é melanoma, câncer de pulmão, câncer de mama linfoma ou câncer de cólon.

[00332] Em algumas modalidades, o câncer é um câncer de pele. Em modalidades particulares, o câncer é um melanoma, como um melanoma cutâneo. Em algumas modalidades, o câncer é uma célula de Merkel ou carcinoma de células escamosas cutâneo metastático (CSCC).

[00333] Em algumas modalidades, o tumor é um carcinoma, que é um câncer que se desenvolve a partir de células epiteliais ou é um câncer de origem epitelial. Em algumas modalidades, o câncer surge de células epiteliais que incluem, mas não estão limitadas a, câncer de mama, carcinoma basocelular, adenocarcinoma, câncer gastrointestinal, câncer de lábio, câncer de boca, câncer de esôfago, câncer de intestino delgado e câncer de estômago, câncer de cólon, câncer de fígado, câncer de bexiga, câncer de pâncreas, câncer de ovário, câncer cervical, câncer de pulmão, câncer de mama e câncer de pele, tal como câncer de células escamosas e de células basais, câncer de próstata, carcinoma de células renais e outros cânceres conhecidos que afetam células epiteliais em todo o corpo.

[00334] Em algumas modalidades, o indivíduo tem um câncer que é um câncer gastrointestinal envolvendo um câncer do trato gastrointestinal (trato GI), incluindo cânceres ou do trato digestivo superior ou inferior, ou um órgão acessório da digestão, tal como esôfago, estômago, sistema biliar, pâncreas, intestino delgado, intestino grosso, reto ou ânus. Em algumas modalidades, o câncer é um câncer esofágico, câncer de estômago (gástrico), câncer de pâncreas, câncer de fígado (carcinoma hepatocelular), câncer de vesícula biliar, câncer do tecido linfoide associado à mucosa (linfoma MALT), câncer da árvore biliar, câncer colorretal (incluindo câncer de cólon, câncer de reto ou ambos), câncer anal ou um tumor carcinoide gastrointestinal. Em modalidades particulares, o câncer é um câncer colorretal.

[00335] Em algumas modalidades, o câncer é um câncer colorretal. O câncer colorretal (CCR) é um tumor comum de incidência crescente, que, em muitos casos, não responde à inibição do ponto de verificação ou outra imunoterapia. Este é o caso mesmo que tais cânceres tenham propriedades que estão associadas com resposta, por exemplo, uma taxa de mutação razoavelmente alta e associação bem estabelecida de prognóstico com o nível de infiltração de células T.

[00336] Em algumas modalidades, o câncer é um câncer de ovário. Em algumas modalidades, o câncer é um câncer de mama triplo- negativo (TNBC).

[00337] Em algumas modalidades, o câncer é câncer de pulmão. Em algumas modalidades, o câncer é um câncer de mama. Em algumas modalidades, o câncer é um câncer colorretal. Em algumas modalidades, o câncer é câncer pancreático. Em algumas modalidades, o câncer é um câncer de células de Merkel. Em algumas modalidades, o câncer é um carcinoma de células escamosas cutâneo metastático (CSCC). Em algumas modalidades, o câncer é um melanoma.

[00338] Em algumas modalidades, o indivíduo é aquele cujo câncer é refratário a, e/ou que recidivou após o tratamento com, um bloqueio de ponto de verificação, tal como uma terapia anti-PD1 ou anti-PD-L1.

[00339] Em algumas modalidades, o indivíduo é o mesmo indivíduo com a amostra biológica obtida para a produção da composição celular terapêutica. Em algumas de tais modalidades, os métodos de tratamento fornecidos são uma terapia celular adotiva com uma composição terapêutica contendo células T autólogas para o indivíduo.

[00340] Em algumas modalidades, as composições de células fornecidas neste documento são autólogas para o indivíduo a ser tratado. Em tais modalidades, as células iniciais para expansão são isoladas diretamente de uma amostra biológica do indivíduo como aqui descrito, em alguns casos incluindo enriquecimento para células T positivas de superfície para um ou mais marcadores de ativação de células T, conforme descrito, e cultivadas sob condições para expansão conforme fornecido aqui. Em alguns aspectos, a amostra biológica do indivíduo é ou inclui uma amostra de tumor ou nódulo linfático e essa amostra de tumor e uma quantidade de tal tecido é obtida, tal como por ressecção ou biópsia (por exemplo, biópsia por agulha central ou aspiração por agulha fina). Em algumas modalidades, após a cultura sob condições para expansão de acordo com os métodos fornecidos, as células são formuladas e opcionalmente criopreservadas para administração subsequente ao mesmo indivíduo para o tratamento do câncer.

[00341] Em algumas modalidades, as composições celulares aqui fornecidas são alogênicas ao indivíduo a ser tratado. Em alguns aspectos, o indivíduo do qual as células são derivadas ou isoladas é um indivíduo saudável ou não é conhecido por ter uma doença ou condições, tal como um câncer. Em tais modalidades, as células iniciais para expansão são isoladas diretamente de uma amostra biológica de tal indivíduo como aqui descrito, em alguns casos incluindo enriquecimento para células T positivas de superfície para um ou mais marcadores de ativação de células T, conforme descrito, e cultivadas sob condições para expansão conforme fornecido aqui. Em alguns aspectos, a amostra biológica do indivíduo é ou inclui uma amostra de tumor ou nódulo linfático e essa amostra de tumor e uma quantidade de tal tecido é obtida, tal como por ressecção ou biospsia (por exemplo, biópsia por agulha central ou aspiração por agulha fina). Em algumas modalidades, após a cultura sob condições de expansão, as células são formuladas e opcionalmente criopreservadas para administração subsequente a um indivíduo diferente para o tratamento de um câncer em tal indivíduo diferente.

[00342] Em algumas modalidades, os métodos fornecidos podem ser realizados com uma ou mais outras imunoterapias. Em algumas modalidades, a imunoterapia é um agente imunomodulador que é um inibidor do ponto de verificação imunológico. Em algumas modalidades, o inibidor do ponto de verificação imunológico se liga especificamente a uma molécula selecionada entre CD25, PD-1, PD- L1, PD-L2, CTLA-4, LAG-3, TIM-3, 4-1BB, GITR, CD40, CD40L, OX40, OX40L, CXCR2, B7-H3, B7-H4, BTLA, HVEM, CD28, TIGIT e VISTA. Em algumas modalidades, o inibidor do ponto de verificação imunológico é um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, uma pequena molécula ou um polipeptídeo. Em algumas modalidades, o inibidor do ponto de verificação imunológico é selecionado dentre nivolumabe, pembrolizumabe, pidilizumabe, MK-3475, BMS-936559, MPDL3280A, ipilimumabe, tremelimumabe, IMP31, BMS-986016, urelumabe, TRX518, dacetuzumabe, lucatumumabe, SEQ-CD40, CP- 870, CP-893, MED16469, MEDI4736, MOXR0916, AMP-224, e MSB001078C, ou é um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo.

[00343] Em algumas modalidades, os métodos fornecidos incluem terapia de combinação de uma terapia celular conforme descrito e inibidores de PD-1 ou PD-L1. Um inibidor de PD-1 ou PD-L1 pode incluir anticorpos de ligação, antagonistas ou inibidores (isto é, bloqueadores).

[00344] Em uma modalidade, o inibidor de PD-I é nivolumabe (comercialmente disponível como OPDIVO da Bristol-Myers Squibb Co.), ou biossimilares, fragmentos de ligação ao antígeno, conjugados ou variantes dos mesmos. O nivolumabe é um anticorpo IgG4 totalmente humano que bloqueia o receptor PD-I. Em uma modalidade, o anticorpo anti-PD-I é uma imunoglobulina G4 kappa, anticorpo anti(CD274 humano). O nivolumabe foi atribuído ao Chemical Abstracts Service (CAS) número de registro 946414-94-4 e também é conhecido como 5C4, BMS-936558, l\tIDX-1106 e ONO-

4538. A preparação e as propriedades do nivolumabe são descritas na Patente Norte Americana n.º 8.008.449 e na Publicação de Patente Internacional n.º WO 2006/121168.

[00345] Em outra modalidade, o inibidor de PD-1 compreende pembrolizumabe (comercialmente disponível como KEYTRUDA da Merck & Co., Inc., Kenilworth, NJ, EUA) ou fragmentos de ligação ao antígeno, conjugados ou variantes dos mesmos. O pembrolizumabe recebeu o número de registro CAS 1374853-91-4 e também é conhecido como lambrolizumabe, MK-3475 e SCH-900475. As propriedades, usos e preparação de pembrolizumabe são descritos na Publicação de Patente Internacional No. WO 2008/156712 Al, Patente Norte Americana No. 8.354.509 e Publicação de Pedido de Patente Norte Americana Nos. US 2010/0266617 Al, US 2013/0108651 Al e US 2013/0109843 A2.

[00346] Em uma modalidade, o inibidor de PD-LI é durvalumabe, também conhecido como MEDI4736 (que está comercialmente disponível na Medimmune, LLC, Gaithersburg, JVIaryland, uma subsidiária da AstraZeneca plc.), ou fragmentos de ligação ao antígeno, conjugados ou suas variantes. Em uma modalidade, o inibidor de PD-LI é um anticorpo descrito na Patente Norte Americana Nº 8.779.108 ou Publicação do Pedido de Patente Norte Americana Nº 2013/0034559.

[00347] Em uma modalidade, o inibidor de PD-LI é avelumabe, também conhecido como MSB0010718C (comercialmente disponível na Merck KGaA/EMD Serono), ou fragmentos de ligação ao antígeno, conjugados ou variantes dos mesmos. A preparação e as propriedades do avelumabe são descritas na Publicação do Pedido de Patente Norte Americana Nº US 2014/0341917 Al.

[00348] Em uma modalidade, o inibidor de PD-LI é o atezolizumabe, também conhecido como MPDL3280A ou RG7446 (comercialmente disponível como TECENTRIQ da Genentech, Inc., uma subsidiária da Roche Holding AG, Basel, Suíça), ou fragmentos de ligação ao antígeno, conjugados ou variantes dos mesmos. Em uma modalidade, o inibidor de PD-LI é um anticorpo descrito na Patente Norte Americana nº 8.217.149, cuja descrição é especificamente incorporada neste documento por referência. Em uma modalidade, o inibidor de PD-LI é um anticorpo descrito na Publicação do Pedido de Patente Norte Americana Nos. 2010/0203056 Al, 2013/0045200 Al, 2013/0045201 Al, 2013/0045202 Al ou 2014/0065135 Al. A preparação e as propriedades do atezolizumabe são descritas na Patente Norte Americana No. 8.217.149. IV. KITS E ARTIGOS DE FABRICAÇÃO

[00349] São fornecidos aqui artigos de fabricação e kits que compreendem as composições fornecidas, tais como composições contendo células T produzidas por qualquer um dos métodos fornecidos ou contendo ou enriquecido para células T reativas ao tumor ou células T positivas de superfície para um marcador de ativação de células T. Em algumas modalidades, as composições são produzidas por qualquer um dos métodos fornecidos.

[00350] Os kits podem incluir opcionalmente um ou mais componentes, tal como instruções de uso, dispositivos e reagentes adicionais (por exemplo, água esterilizada ou soluções salinas para diluição das composições e/ou reconstituição da proteína liofilizada) e componentes, como tubos, recipientes e seringas para a prática dos métodos. Em algumas modalidades, os kits podem conter ainda reagentes para coleta de amostras, preparação e processamento de amostras e/ou reagentes para quantificar a quantidade de um ou mais marcadores de superfície em uma amostra, tais como, mas não se limitando a, reagentes de detecção, tais como anticorpos, tampões, substratos para manchamento enzimática, cromagens ou outros materiais, tais como lâminas, recipientes, placas de microtitulação e, opcionalmente, instruções para realizar os métodos. Os versados na técnica reconhecerão muitos outros recipientes, placas e reagentes possíveis que podem ser usados de acordo com os métodos fornecidos.

[00351] Em algumas modalidades, os kits podem ser fornecidos como artigos de fabricação que incluem materiais de embalagem para o empacotamento das células, anticorpos ou reagentes, ou composições dos mesmos, ou um ou mais outros componentes. Por exemplo, os kits podem conter recipientes, garrafas, tubos, frascos e qualquer material de embalagem adequado para separar ou organizar os componentes do kit. O um ou mais recipientes podem ser formados de uma variedade de materiais, como vidro ou plástico. Em algumas modalidades, um ou mais recipientes contêm uma composição que compreende células ou um anticorpo ou outros reagentes para uso nos métodos. O artigo de fabricação ou kit aqui pode compreender as células, anticorpos ou reagentes em recipientes separados ou no mesmo recipiente.

[00352] Em algumas modalidades, o um ou mais recipientes contendo a composição podem ser um frasco de uso único ou um frasco de multiuso, o que, em alguns casos, pode permitir o uso repetido da composição. Em algumas modalidades, o artigo de fabricação ou kit pode compreender ainda um segundo recipiente que compreende um diluente adequado. O artigo de fabricação ou kit pode incluir ainda outros materiais desejáveis do ponto de vista comercial, terapêutico e do usuário, incluindo outros tampões, diluentes, filtros, agulhas, seringas, agentes terapêuticos e/ou bulas com instruções de uso.

[00353] Em algumas modalidades, o kit pode, opcionalmente, incluir instruções. As instruções normalmente incluem uma expressão tangível que descreve a composição celular, opcionalmente, outros componentes incluídos no kit e métodos para usá-los. Em algumas modalidades, as instruções indicam métodos para usar as composições de células para administração a um indivíduo para o tratamento de uma doença ou condição, tal como de acordo com qualquer uma das modalidades fornecidas. Em algumas modalidades, as instruções são fornecidas como um rótulo ou uma bula, que está no recipiente ou associada a ele. Em algumas modalidades, as instruções podem indicar direções para reconstituição e/ou uso da composição.

V. DEFINIÇÕES

[00354] A menos que definido de outra forma, todos os termos da técnica, notações e outros termos técnicos e científicos ou terminologia usados neste documento se destinam a ter o mesmo significado que é comumente entendido por alguém versado na técnica ao qual o assunto reivindicado pertence. Em alguns casos, os termos com médias comumente compreendidas são definidos neste documento para clareza e/ou para referência pronta, e a inclusão de tais definições neste documento não deve necessariamente ser interpretada como representando uma diferença substancial sobre o que é geralmente entendido na técnica.

[00355] Conforme usado aqui, as formas singulares "um", "uma" e "o/a" incluem referentes plurais, a menos que o contexto dite claramente o contrário. Por exemplo, “a” ou “uma” significa “pelo menos um” ou “um ou mais”. Entende-se que os aspectos e variações aqui descritos incluem "consistindo" e/ou "consistindo essencialmente de" aspectos e variações.

[00356] Ao longo desta descrição, vários aspectos do objeto reivindicado são apresentados em um formato de intervalo. Deve ser entendido que a descrição em formato de intervalo é meramente por conveniência e brevidade e não deve ser interpretada como uma limitação inflexível no escopo do objeto reivindicado. Por conseguinte, a descrição de uma faixa deve ser considerada como tendo descrito especificamente todas as subfaixas possíveis, bem como valores numéricos individuais dentro dessa faixa. Por exemplo, onde uma faixa de valores é fornecida, entende-se que cada valor intermediário, entre o limite superior e inferior dessa faixa e qualquer outro valor declarado ou intermediário nessa faixa declarada, está englobado no objeto reivindicado. Os limites superior e inferior dessas faixas menores podem ser independentemente incluídos nas faixas menores e também são abrangidos dentro do assunto reivindicado, sujeito a qualquer limite especificamente excluído na faixa declarada. Quando o intervalo declarado inclui um ou ambos os limites, os intervalos excluindo um ou ambos os limites incluídos também estão incluídos no assunto reivindicado. Isso se aplica independentemente da amplitude do intervalo.

[00357] O termo "cerca de", conforme usado neste documento, refere-se à faixa de erro usual para o respectivo valor prontamente conhecido pelo especialista neste campo técnico. A referência a "cerca de" um valor ou parâmetro neste documento inclui (e descreve) modalidades que são direcionadas a esse valor ou parâmetro per se. Por exemplo, a descrição referente à “cerca de X” inclui a descrição de “X”.

[00358] O termo "epítopo" significa um peptídeo curto derivado de um antígeno de proteína, em que o peptídeo se liga a uma molécula de complexo de histo compatibilidade principal (MHC) e é reconhecido no contexto ligado a MHC por uma célula T. O epítopo pode se ligar a uma molécula de MHC de classe I (por exemplo, HLA-A1 HLA-A2 ou HLA-A3) ou uma molécula de MHC de classe II.

[00359] O termo "alogênico" conforme usado neste documento significa uma célula ou tecido que é removido de um organismo e, em seguida, infundido ou transferido de forma adotiva para um organismo geneticamente diferente da mesma espécie.

[00360] O termo "autólogo", conforme usado aqui, significa uma célula ou tecido que é removido do mesmo organismo para o qual é posteriormente infundido ou transferido de forma adotiva.

[00361] O termo "anticorpo" aqui é usado no sentido mais amplo e inclui anticorpos policlonais e monoclonais, incluindo anticorpos intactos e fragmentos de anticorpos funcionais (ligação ao antígeno), incluindo fragmentos de ligação ao antígeno do fragmento (Fab),

fragmentos F(ab')2, fragmentos Fab', fragmentos Fv, fragmentos de IgG recombinante (rIgG), fragmentos de anticorpos de cadeia única, incluindo fragmentos variáveis de cadeia única (scFv) e fragmentos de anticorpos de domínio único (por exemplo, sdAb, sdFv, nanocorpo). O termo abrange formas geneticamente modificadas e/ou modificadas de imunoglobulinas, tal como intracorpos, pepticorpos, anticorpos quiméricos, anticorpos totalmente humanos, anticorpos humanizados e anticorpos heteroconjugados, multiespecíficos, por exemplo, biespecíficos, anticorpos, diacorpos, triacorpos e tetracorpos, di-scFv tandem, tri-scFv tandem. A menos que indicado de outra forma, o termo "anticorpo" deve ser entendido como abrangendo fragmentos de anticorpo funcionais do mesmo. O termo também abrange anticorpos intactos ou de comprimento total, incluindo anticorpos de qualquer classe ou subclasse, incluindo IgG e suas subclasses, IgM, IgE, IgA e IgD. Entre os anticorpos fornecidos estão fragmentos de anticorpos.

[00362] Um "fragmento de anticorpo" ou "fragmento de ligação ao antígeno" refere-se a uma molécula diferente de um anticorpo convencional ou intacto que compreende uma porção de um anticorpo convencional ou intacto contendo pelo menos uma região variável que se liga a um antígeno. Exemplos de fragmentos de anticorpo incluem, mas não estão limitados a Fv, Fvs de cadeia única (sdFvs), Fab, Fab’, Fab’-SH, F(ab’)2; diacorpos; anticorpos lineares; anticorpos de domínio único compreendendo apenas a região VH (VHH).

[00363] Tal como aqui utilizado, "ligar", "ligação" ou variações gramaticais das mesmas referem-se à participação de uma molécula em qualquer interação atrativa com outra molécula, resultando em uma associação estável em que as duas moléculas estão em estreita proximidade uma da outra. A ligação inclui, mas não está limitada a, ligações não covalentes, ligações covalentes (tal como ligações covalentes reversíveis e irreversíveis) e inclui interações entre moléculas, tais como, mas não se limitando a, proteínas, ácidos nucleicos, carboidratos, lipídios e pequenas moléculas, tal como compostos químicos, incluindo fármacos.

[00364] O termo “amostra biológica” significa uma quantidade de uma substância de uma coisa viva ou anteriormente viva. Essas substâncias incluem, mas não estão limitadas a, sangue, (por exemplo, sangue total), plasma, soro, urina, líquido amniótico, líquido sinovial, células endoteliais, leucócitos, monócitos, outras células, órgãos, tecidos, medula óssea, nódulos linfáticos e baço.

[00365] Conforme usado neste documento, "enriquecimento" quando se refere a um ou mais tipos de células ou população de células em particular, refere-se a aumentar o número ou porcentagem do tipo de célula ou população, por exemplo, em comparação com o número total de células ou volume da composição, ou em relação a outros tipos de células, tal como por seleção positiva com base em marcadores expressos pela população ou célula, ou por seleção negativa com base em um marcador não presente na população de células ou célula a ser esgotada. O termo não requer a remoção completa de outras células, tipo de célula ou populações da composição e não requer que as células assim enriquecidas estejam presentes ou mesmo perto de 100% na composição enriquecida.

[00366] O termo "simultaneamente" é usado neste documento para se referir a um procedimento, tal como uma incubação, seleção, enriquecimento ou administração, envolvendo dois ou mais agentes, onde pelo menos parte do procedimento específico com um agente se sobrepõe no tempo com pelo menos um segundo agente.

[00367] O termo "intermitentemente" é usado neste documento para se referir a um procedimento, tal como uma incubação, seleção, enriquecimento ou administração, envolvendo dois ou mais agentes, onde o procedimento específico envolvendo cada agente não ocorre em intervalos regulares ou não são contínuos ou param e iniciam repetidamente com períodos entre eles.

[00368] O termo "sequencialmente" é usado neste documento para se referir a um procedimento, tal como uma incubação, seleção, enriquecimento ou administração, envolvendo dois ou mais agentes, onde o procedimento específico envolvendo cada agente não se sobrepõe no tempo.

[00369] Tal como aqui utilizado, "isolado" ou "purificado" com referência a um peptídeo, proteína ou polipeptídeo refere-se a uma molécula que está substancialmente livre de todos os outros polipeptídeos, contaminantes, reagentes de partida ou outros materiais, ou substancialmente livre de precursores químicos ou outros produtos químicos quando sintetizados quimicamente. As preparações podem ser determinadas como substancialmente livres se parecerem livres de impurezas facilmente detectáveis, conforme determinado por métodos padrão de análise, tais como cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC), cromatografia de camada fina (TLC) ou eletroforese capilar (CE), usados por aqueles versados na técnica para avaliar tal pureza, ou suficientemente puro de modo que a purificação adicional não altere de forma detectável as propriedades físicas e químicas da substância.

[00370] Tal como aqui utilizado, o termo "recombinante" refere-se a uma célula, microrganismo, molécula de ácido nucleico ou vetor que foi modificado pela introdução de um exógeno, tal como heterólogo, molécula de ácido nucleico, ou se refere a uma célula ou microrganismo que foi alterado de modo que a expressão de uma molécula de ácido nucleico endógeno ou gene seja controlada, desregulada ou constitutiva, onde tais alterações ou modificações podem ser introduzidas por engenharia genética. As alterações genéticas podem incluir, por exemplo, modificações que introduzem moléculas de ácido nucleico (que podem incluir um elemento de controle de expressão, como um promotor) que codifica uma ou mais proteínas ou enzimas, ou outras adições, deleções, substituições de moléculas de ácido nucleico ou outra interrupção funcional ou adição ao material genético de uma célula. Modificações exemplares incluem aquelas em regiões de codificação ou fragmentos funcionais das mesmas de polipeptídeos heterólogos ou homólogos de uma referência ou molécula parental. O termo "recombinante" também pode se referir a um produto de proteína expresso a partir de tal molécula de ácido nucleico ou vetor ou de tal célula ou microrganismo ao qual é introduzido ou modificado com um ácido nucleico exógeno.

[00371] Tal como aqui utilizado, uma composição refere-se a qualquer mistura de dois ou mais produtos, substâncias ou compostos, incluindo células. Pode ser uma solução, uma suspensão, um líquido, um pó, uma pasta, aquoso, não aquoso ou qualquer combinação dos mesmos.

[00372] Conforme usado neste documento, "opcional" ou "opcionalmente" significa que o evento ou circunstância subsequentemente descrita ocorre ou não ocorre, e que a descrição inclui casos em que tal evento ou circunstância ocorre e casos em que não ocorre. Por exemplo, um grupo opcionalmente substituído significa que o grupo não está substituído ou é substituído.

[00373] O termo "composição farmacêutica" refere-se a uma composição adequada para uso farmacêutico em um indivíduo mamífero, muitas vezes um humano. Uma composição farmacêutica compreende tipicamente uma quantidade eficaz de um agente ativo (por exemplo, células, tais como expandidas de acordo com os métodos fornecidos) e um transportador, excipiente ou diluente. O transportador, excipiente ou diluente é tipicamente um transportador, excipiente ou diluente farmaceuticamente aceitável, respectivamente.

[00374] Um "transportador farmaceuticamente aceitável" refere-se a um enchimento não tóxico sólido, semissólido ou líquido, diluente, material de encapsulamento, formulação auxiliar ou transportador convencional na técnica para uso com um agente terapêutico que, juntos, compreendem uma "composição farmacêutica” para administração a um indivíduo. Um transportador farmaceuticamente aceitável não é tóxico para os destinatários nas dosagens e concentrações utilizadas e são compatíveis com outros ingredientes da formulação. O transportador farmaceuticamente aceitável é apropriado para a formulação empregada.

[00375] A referência a "população de células" aqui significa referir- se a uma série de células que compartilham uma característica comum. Uma população de células geralmente contém uma pluralidade de células, tal como mais de ou cerca de 100 células, de ou cerca de 1000 células e, normalmente, variam de 1 x 104 a 1 x 1010 em número.

[00376] O termo "solúvel", tal como aqui utilizado em referência a proteínas, indica que a proteína não está ligada, imobilizada ou ligada a uma partícula, tal como uma célula ou suporte sólido, por exemplo, uma pérola. Por exemplo, uma proteína solúvel inclui uma proteína que não está ligada como uma proteína transmembrana à membrana celular de uma célula. Em alguns casos, a solubilidade de uma proteína pode ser melhorada por ligação ou fixação, direta ou indiretamente por meio de um ligante, a outra molécula, tal como um domínio Fc, que, em alguns casos, também pode melhorar a estabilidade e/ou meia-vida da proteína. Em alguns aspectos, uma proteína solúvel é uma proteína de fusão Fc.

[00377] O termo "liga-se especificamente", tal como aqui utilizado, significa a capacidade de uma proteína, sob condições de ligação específicas, de se ligar a uma proteína alvo de modo que sua afinidade ou avidez seja pelo menos 10 vezes maior, mas opcionalmente 50, 100, 250 ou 500 vezes maior, ou mesmo pelo menos 1000 vezes maior que a afinidade ou avidez média da mesma proteína para uma coleção de peptídeos aleatórios ou polipeptídeos de tamanho estatístico suficiente. Uma proteína de ligação específica não precisa se ligar exclusivamente a uma única molécula alvo, mas pode se ligar especificamente a mais de uma molécula alvo. Em alguns casos, uma proteína de ligação específica pode se ligar a uma proteína que tem semelhança na conformação estrutural com a proteína alvo (por exemplo, parálogos ou ortólogos). Os versados na técnica reconhecerão que a ligação específica a uma molécula com a mesma função em uma espécie diferente de animal (isto é, ortólogo) ou a uma molécula com um epítopo substancialmente semelhante à molécula alvo (por exemplo, parálogo) é possível e não prejudica a especificidade de ligação que é determinada em relação a uma coleção estatisticamente válida de não alvos únicos (por exemplo, polipeptídeos aleatórios). Os imunoensaios ELISA de fase sólida, medições ForteBio Octet ou Biacore podem ser usados para determinar a ligação específica entre duas proteínas. Geralmente, as interações entre duas proteínas de ligação têm constantes de dissociação (Kd) menores que cerca de 1x10-5 M, e frequentemente tão baixo como cerca de 1 x 10-12 M. Em certos aspectos da presente descrição, as interações entre duas proteínas de ligação têm constantes de dissociação inferiores a cerca de 1x10-6 M, 1x10-7 M, 1x10-8 M, 1x10-9 M, 1x10-10 M, ou 1x10-11 M ou inferior.

[00378] Tal como aqui utilizado, uma declaração de que uma célula ou população de células é "positiva" para um marcador específico refere-se à presença detectável na ou na célula de um marcador específico, normalmente um marcador de superfície. Quando se refere a um marcador de superfície, o termo se refere à presença de expressão de superfície detectada por citometria de fluxo, por exemplo, por manchamento com um anticorpo que se liga especificamente ao marcador e detecção do referido anticorpo, em que o manchamento é detectável por citometria de fluxo em um nível substancialmente acima do manchamento detectado realizando o mesmo procedimento com um controle compatível com isotipo sob outras condições idênticas e/ou em um nível substancialmente semelhante ao da célula conhecida por ser positiva para o marcador e/ou em um nível substancialmente mais alto do que para uma célula conhecida por ser negativa para o marcador.

[00379] Tal como aqui utilizado, uma declaração de que uma célula ou população de células é "negativa" para um marcador particular refere-se à ausência de presença detectável substancial na ou na célula de um marcador particular, tipicamente um marcador de superfície. Quando se refere a um marcador de superfície, o termo se refere à ausência de expressão de superfície detectada por citometria de fluxo, por exemplo, por manchamento com um anticorpo que se liga especificamente ao marcador e detecção do referido anticorpo, em que o manchamento não é detectado por citometria de fluxo em um nível substancialmente acima do manchamento detectado realizando o mesmo procedimento com um controle compatível com isotipo sob outras condições idênticas e/ou em um nível substancialmente inferior ao da célula conhecida ser positiva para o marcador e/ou em um nível substancialmente semelhante em comparação com uma célula conhecida ser negativa para o marcador.

[00380] Conforme usado aqui, um "indivíduo" é um mamífero, tal como um ser humano ou outro animal, e normalmente é humano. O indivíduo pode ser homem ou mulher e pode ter qualquer idade adequada, incluindo crianças, jovens, adolescentes, adultos e indivíduos geriátricos.

[00381] Os termos "quantidade eficaz" ou "quantidade terapeuticamente eficaz" referem-se a uma quantidade e/ou concentração de uma composição terapêutica, tal como células contendo, por exemplo, expandido de acordo com os métodos fornecidos, que quando administrado a um paciente produz qualquer maneira na qual os sintomas de uma condição, distúrbio ou doença ou outra indicação, são melhorados ou de outra forma alterados de forma benéfica. Uma quantidade eficaz para o tratamento de uma doença ou distúrbio pode ser uma quantidade que alivia, diminui ou alivia pelo menos um sintoma ou resposta biológica ou efeito associado à doença ou distúrbio, evita a progressão da doença ou distúrbio ou melhora o funcionamento físico do paciente. Em aspectos particulares, existe uma inibição estatisticamente significativa da progressão da doença como, por exemplo, melhorando ou eliminando sintomas e/ou a causa da doença. No caso de terapia celular, a quantidade eficaz é uma dose eficaz ou número de células administradas a um paciente. Em algumas modalidades, o paciente é um paciente humano.

[00382] Tal como aqui utilizado, "doença", "distúrbio" ou "condição" refere-se a uma condição patológica em um organismo resultante de uma causa ou condição incluindo, mas não se limitando a, infecções, condições adquiridas, condições genéticas e caracterizadas por sintomas identificáveis. Em particular, é uma condição em que o tratamento é necessário e/ou desejado.

[00383] Os termos "tratando", "tratamento" ou "terapia" de uma doença ou distúrbio, conforme usados neste documento, significam retardar, interromper ou reverter a progressão da doença ou distúrbios, conforme evidenciado pela diminuição, cessação ou eliminação de quaisquer sintomas clínicos ou diagnóstico, por administração de uma proteína imunomoduladora ou células modificadas da presente invenção, quer sozinhas ou em combinação com outro composto como aqui descrito. "Tratar", "tratamento" ou "terapia" também significa uma diminuição na gravidade dos sintomas em uma doença ou distúrbio agudo ou crônico ou uma diminuição na taxa de recaída como, por exemplo, no caso de um curso de doença autoimune recorrente ou remitente ou uma diminuição da inflamação no caso de um aspecto inflamatório de uma doença autoimune. "Prevenindo", "profilaxia" ou "prevenção" de uma doença ou distúrbio, conforme usado no contexto desta invenção, refere-se à administração de uma proteína imunomoduladora ou células modificadas que expressam uma proteína imunomoduladora da presente invenção, sozinha ou em combinação com outro composto, para prevenir a ocorrência ou início de uma doença ou distúrbio ou alguns ou todos os sintomas de uma doença ou distúrbio ou para diminuir a probabilidade de início de uma doença ou distúrbio. Por exemplo, no contexto do câncer, os termos "tratamento" ou "inibir", "inibindo" ou "inibição" do câncer referem-se a pelo menos um de: uma diminuição estatisticamente significativa na taxa de crescimento do tumor, uma cessação de crescimento do tumor, ou uma redução no tamanho, massa, atividade metabólica ou volume do tumor, conforme medido por critérios padrão, tais como, mas não se limitando a, os Critérios de Avaliação de Resposta para Tumores Sólidos (RECIST), ou um aumento estatisticamente significativo na sobrevida livre de progressão (PFS) ou sobrevida global (OS).

[00384] O termo "antígeno" se refere a uma molécula que pode induzir uma resposta imune. Normalmente, um antígeno é uma molécula que é capaz de ser ligada por um sítio de reconhecimento em uma molécula imune, tal como um anticorpo ou receptor de células T, se apresentado por moléculas do complexo principal de histocompatibilidade (MHC). Um antígeno pode ter um ou mais epítopos em que cada epítopo que faz parte do antígeno pode ser ligado por um sítio de reconhecimento de um anticorpo ou complexo TCR/MHC. Em algumas modalidades, um antígeno é capaz de induzir uma resposta imune humoral ou uma resposta imune celular levando à ativação de linfócitos B e/ou linfócitos T.

[00385] Conforme usado neste documento, um "antígeno associado a tumor" ou "antígeno específico de tumor" refere-se a uma proteína ou outra molécula que é encontrada apenas em células cancerosas e não em células normais.

[00386] Conforme usado neste documento, "neoantígeno" refere-se a um antígeno ao qual o sistema imunológico não foi exposto anteriormente, tal como aquele que surge por alteração de antígenos do hospedeiro por infecção viral, transformação neoplásica, metabolismo de fármacos ou outra maneira. Em aspectos particulares, um neoantígeno é um antígeno codificado por genes mutados específicos de tumor ou que é um novo antígeno que se desenvolve em uma célula tumoral.

[00387] O termo "in vivo" se refere a um evento que ocorre no corpo de um indivíduo mamífero.

[00388] O termo "ex vivo" se refere a um evento que ocorre em ou em um tecido ou células de um indivíduo mamífero, mas fora do corpo do indivíduo mamífero. Normalmente, o evento é realizado em um ambiente externo. Em aspectos específicos, um procedimento ex vivo inclui qualquer um em que um órgão, célula ou tecido é retirado de um indivíduo, normalmente um corpo vivo, para um tratamento ou procedimento e, em seguida, devolvido ao indivíduo.

[00389] O termo "in vitro" se refere a um evento que ocorre em um sistema de teste, tal como em um laboratório.

[00390] Conforme usado neste documento, um kit é uma combinação embalada que inclui opcionalmente outros elementos, tais como reagentes adicionais e instruções para o uso da combinação ou elementos dos mesmos.

[00391] O termo "bula" é usado para se referir às instruções habitualmente incluídas em embalagens comerciais de produtos terapêuticos, que contêm informações sobre as indicações, uso, dosagem, administração, terapia combinada, contraindicações e/ou advertências relativas ao uso de tais produtos terapêuticos.

[00392] Conforme usado neste documento, um "artigo de fabricação" é um produto que é feito e, em alguns casos, que pode ser vendido. Em algumas modalidades, o termo pode se referir a composições contidas em artigos de embalagem, como em um recipiente.

[00393] Entende-se que aspectos e modalidades da invenção aqui descrita incluem "compreendendo", "consistindo" e "consistindo essencialmente em" aspectos e modalidades. VI. MODALIDADES EXEMPLARES

[00394] Entre as modalidades fornecidas estão:

1. Um método para a fabricação de células T para uso em uma composição de células terapêuticas, em que as células T ex- pressam um receptor de células T (TCR) que reconhece um antígeno na superfície de uma célula alvo, o método caracterizado pelo fato de que compreende: (a) enriquecimento de uma população de linfócitos obtido de um indivíduo doador para produzir uma primeira população de linfócitos T; (b) estimular a primeira população com um ou mais agentes estimuladores de células T de linfócitos para produzir uma se- gunda população de células T ativadas em que a estimulação é reali- zada em um sistema fechado usando meio livre de soro; (c) cocultura da segunda população de células T na presença de células apresen- tadoras de antígeno que apresentam um ou mais peptídeos não nati- vos em um complexo principal de histocompatibilidade (MHC) em um sistema fechado usando meio livre de soro, dito um ou mais peptídeos não nativos são peptídeos correspondentes a mutações somáticas não sinônimas associadas ao tumor de um indivíduo, para produzir uma terceira população contendo células T compreendendo receptores de células T endógenos reativos à mutação que codificam peptídeos do tumor (células T reativas ao tumor); (d) separar células apresentadoras de antígeno da população de células T na terceira população de célu- las em um sistema fechado; (e) após a separação, selecionar a popu- lação de células T contendo TCR endógeno que são reativos a peptí- deos presentes nas APCs com base em marcadores de regulação po- sitiva em células T cultivadas em um sistema fechado para produzir uma quarta população contendo as células T selecionadas; e (expan- dir a quarta população de células selecionadas na presença de um ou mais agentes estimuladores de células T de linfócitos em um sistema fechado usando meio livre de soro para produzir uma composição de células T expandidas para uso em uma composição de células tera- pêuticas.

2. Um método para a fabricação de células T para uso em uma composição de células terapêuticas, em que as células T ex- pressam um receptor de células T (TCR) que reconhece um antígeno na superfície de uma célula alvo, o método caracterizado pelo fato de que compreende: (a) enriquecimento de uma população de linfócitos obtidos de um indivíduo doador para produzir uma primeira população de linfócitos T; (b) estimular a primeira população com um ou mais agentes estimuladores de células T de linfócitos para produzir uma se- gunda população de células T ativadas em que a estimulação é reali- zada em um sistema fechado usando meio livre de soro; (c) cocultura da segunda população de células T na presença de células apresen- tadoras de antígeno que apresentam um ou mais peptídeos não nati- vos em um complexo principal de histocompatibilidade (MHC) em um sistema fechado usando meio livre de soro, dito um ou mais peptídeos não nativos são peptídeos correspondentes a mutações somáticas não sinônimas associadas ao tumor de um indivíduo, para produzir uma terceira população de células contendo células T compreendendo re- ceptores de células T endógenos reativos à mutação que codificam peptídeos do tumor (células T reativas ao tumor); (d) selecionar, a par- tir da terceira população de células, a população de células T contendo TCR endógeno que são reativos a peptídeos presentes nas APCs com base em marcadores de regulação positiva em células T cultivadas em um sistema fechado para produzir uma quarta população contendo as células T selecionadas; e (e) expandir a quarta população de células selecionadas na presença de um ou mais agentes estimuladores de células T de linfócitos em um sistema fechado usando meio livre de soro para produzir uma composição de células T expandidas para uso em uma composição de células terapêuticas.

3. O método da modalidade 1 ou 2, em que as células apresentadoras de antígeno são células nucleadas, tais como células dendríticas, fagócitos mononucleares, linfócitos B, células endoteliais ou timicepitélio.

4. O método de qualquer uma das modalidades 1 a 3, em que as células T são autólogas a um indivíduo com um tumor.

5. O método da modalidade 1, em que as células T são autólogas para o paciente.

6. O método de qualquer uma das modalidades 1 a 3, em que as células T são obtidas de um doador saudável.

7. O método das modalidades 1, compreendendo ainda a expansão de células T in vitro.

8. O método de qualquer uma das modalidades 1 a 5, em que a molécula de MHC é uma molécula de classe I.

9. O método de qualquer uma das modalidades 1 a 5, em que a molécula de MHC é uma molécula de Classe II.

10. O método de qualquer uma das modalidades 1 a 5, em que a molécula de MHC é MHC de classe I e II.

11. O método de qualquer uma das modalidades 1 a 8, em que as células T são células CD4+.

12. O método de qualquer uma das modalidades 1 a 8, em que as células T são células CD8+.

13. O método de qualquer uma das modalidades 1 a 8, em que as células T são células CD4+ e células CD8+.

14. Método, de acordo com qualquer uma das modalida- des 1 a 11, em que os agentes estimuladores de células T são seleci- onados a partir de um ou mais de um anticorpo anti-CD3; um anticorpo anti-CD28; ou uma citocina recombinante selecionada dentre IL-2, IL- 7, IL-15 e IL-2114.

15. O método da modalidade 1, em que os peptídeos não nativos são peptídeos correspondentes às mutações somáticas não sinônimas associadas ao tumor do paciente.

16. O método na modalidade 1, em que os peptídeos não nativos são expressos em células apresentadoras de antígeno por meio da síntese de construção de minigene que codificam para ami- noácidos mutados somáticos não sinônimos, flanqueados em cada lado por 12 aminoácidos de proteínas endógenas em tandem, então transcritos usando a transcrição de RNA in vitro para gerar peptídeos individuais e, em seguida, transfectados nas células apresentadoras de antígeno.

17. O método, de acordo com qualquer uma das modali- dades 1 a 12, em que os peptídeos não nativos são expressos em cé- lulas apresentadoras de antígeno por transfecção de construções de minigene sintetizadas transcritas in vitro que codificam para aminoáci- dos somáticos mutados não sinônimos, opcionalmente em que os aminoácidos mutados são flanqueados em cada lado por 12 aminoáci-

dos de proteínas endógenas, em tandem, em que as construções de minigene transcritas geram peptídeos individuais.

18. O método de qualquer uma das modalidades 1 a 12, em que peptídeos não nativos são expressos em células nucleadas por pulso de peptídeo, opcionalmente por eletroporação, de lagos de peptídeos associados a mutações somáticas não sinônimas nas célu- las apresentadoras de antígeno. Opcionalmente, em que cada peptí- deo dos lagos de peptídeos é um peptídeo de 12 aminoácidos de comprimento.

19. O método na modalidade 1, em que os peptídeos não nativos são expressos em células nucleadas por eletroporação de la- gos de peptídeos que consistem em 12 peptídeos longos associados a mutações somáticas não sinônimas nas células apresentadoras de antígeno.

20. O método da modalidade 14, em que a relação de la- gos de peptídeos para células apresentadoras de antígeno durante o pulso de peptídeo está entre 0,001 e 100 ug por 1 milhão de células, entre 0,01 e 100 ug por 1 milhão de células, entre 0,1 e 100 ug por 1 milhão de células , entre 1 e 100 µg por 1 milhão de células, entre 10 e 100 µg por 1 milhão de células; ou a relação de peptídeos individuais para células apresentadoras de antígeno durante o pulso de peptídeo está entre 0,001 e 100 ug por 1 milhão de células, entre 0,01 e 100 ug por 1 milhão de células, entre 0,1 e 100 ug por 1 milhão de células, entre 1 e 100 ug por 1 milhão de células, entre 10 e 100 ug por 1 mi- lhão de células.

21. O método da modalidade 14, em que a concentração de lagos de peptídeos para o pulso de peptídeos é entre de ou cerca de 0,01 µg/mL entre de ou cerca de 40 µg/mL, de ou cerca de 0,1 µg/mL entre de ou cerca de 40 µg/mL, de ou cerca de 1 µg/mL entre de ou cerca de 40 µg/mL, de ou cerca de 0,01 µg/mL entre de ou cerca de 10 µg/mL ou de ou cerca de 1 µg/mL entre de ou cerca de 10 µg/mL; ou a concentração de peptídeos individuais para o pulso de peptídeo é entre de ou cerca de 0,0001 µg/mL entre de ou cerca de 40 µg/mL, de ou cerca de 0,001 µg/mL entre de ou cerca de 40 µg/mL, de ou cerca de 0,01 µg/mL entre de ou cerca de 40 µg/mL, de ou cerca de 0,1 µg/mL entre de ou cerca de 40 µg/mL, de ou cerca de 1 µg/mL en- tre de ou cerca de 40 µg/mL, de ou cerca de 0,01 µg/mL entre de ou cerca de 10 µg/mL ou de ou cerca de 1 µg/mL entre de ou cerca de 10 µg/mL.

22. O método de qualquer uma das modalidades 1 a 16, em que os peptídeos não nativos são derivados de proteínas endos- sômicas orlisossômicas.

23. O método de qualquer uma das modalidades 1 a 16, em que os peptídeos não nativos são derivados de proteínas citosóli- cas.

24. Método, de acordo com qualquer uma das modalida- des 1 a 19, em que a relação de cocultura de células apresentadoras de antígeno para células T está entre 20:1 e 1:1, entre 15:1 e 1:1, en- tre 10:1 e 1:1 , entre 5:1 e 1:1, entre 2,5:1 e 1:1, entre 1:20 e 1:1, entre 1:15 e 1:1, entre 1:10 e 1:1, entre 1: 5 e 1:1, ou entre 1:2,5 e 1:1.

25. O método de qualquer uma das modalidades 1 a 19, em que a separação de células apresentadoras de antígeno está usando separação magnética, separação gravimétrica, ligação seletiva ou classificação de células usando citometria de fluxo.

26. Método, de acordo com qualquer uma das modalida- des 1 a 20, em que a seleção é realizada usando um classificador de células com base em fluorescência em um sistema fechado usando meio sem soro.

27. O método da modalidade 21, em que a seleção é rea- lizada a uma taxa entre 10.000 e 100.000 células/segundo usando um classificador de células fluídicas descartáveis com base fluorescente.

28. O método de qualquer uma das modalidades 1 a 22, em que os marcadores de regulação positiva são proteínas expressas na superfície da célula T que são expressas apenas quando o TCR endógeno das células T reconhece um peptídeo expresso pelas APCs.

29. Método, de acordo com qualquer uma das modalida- des 1 a 23, em que o tempo de enriquecimento da população de linfó- citos para a produção das células T expandidas é inferior a 30 dias.

30. O método de qualquer uma das modalidades 1 a 24, em que a composição de células expandidas é usada para tratar um paciente com câncer.

31. O método de qualquer uma das modalidades 1 a 25, em que o sistema fechado em um sistema de bolsa.

32. O método em qualquer uma das modalidades 1 a 26, em que na população de linfócitos são de linfócitos infiltrantes de tu- mor, linfócitos linfáticos ou células mononucleares de sangue periféri- co.

33. Método, de acordo com qualquer uma das modalida- des 1 a 27, em que a população de linfócitos é de um tumor resseca- do, opcionalmente, fragmentos de tumor de um tumor ressecado.

34. Uma população de células T produzida pelo método de qualquer uma das modalidades 1 a 28, em que a população de células T expressa maior ou igual a 1 receptor de superfície de célula T que reconhece maior ou igual a 1 antígeno específico em uma célula alvo expressando mutações não sinônimas.

35. Uma população de células T que expressa maior ou igual a 1 receptor de superfície de célula T que reconhece maior ou igual a 1 antígeno específico em uma célula alvo que expressa muta- ções não sinônimas; (a) enriquecimento de uma população de linfóci- tos obtidos de um indivíduo doador a produzir uma primeira população de linfócitos T; (b) estimular a primeira população com um ou mais agentes estimuladores de células T de linfócitos para produzir uma se- gunda população de células T ativadas, em que a estimulação é reali- zada em um sistema fechado usando meio livre de soro; (c) cocultura da segunda população de células T na presença de células apresen- tadoras de antígeno que apresentam um ou mais peptídeos não nati- vos em um complexo de histocompatibilidade principal (MHC) em um sistema fechado usando meio livre de soro, sendo que um ou mais não-peptídeos nativos são peptídeos correspondentes a mutações somáticas não sinônimas associadas no tumor de um indivíduo, para produzir uma terceira população de células contendo células T com- preendendo receptores de células T endógenos reativos a mutações que codificam peptídeos do tumor (células T reativas ao tumor); (d) separar as células apresentadoras de antígeno das células T na tercei- ra população de células em um sistema fechado; (e) após a separa- ção, selecionar células T contendo TCR endógeno que são reativos a peptídeos presentes no APC com base em marcadores de regulação positiva em células T em um sistema fechado para produzir uma quar- ta população contendo as células selecionadas; e (f) expandir a quarta população de células selecionadas na presença de um ou mais agen- tes estimuladores de células T de linfócitos em um sistema fechado usando meio livre de soro.

36. A população da modalidade 30, em que o marcador de superfície celular é um TCR.

37. A população da modalidade 30, em que a célula alvo é uma célula cancerosa.

38. A população da modalidade 31, em que a célula can- cerosa é uma malignidade epitelial.

39. A população de qualquer uma das modalidades 30 a 32, em que o antígeno é um neoantígeno.

40. A população de qualquer uma das modalidades 30 a 33, em que o tempo desde o enriquecimento da população de linfóci- tos até a produção das células T expandidas é inferior a 30 dias.

41. A população de qualquer uma das modalidades 30 a 34, em que as células T são usadas para tratar um paciente com cân- cer.

42. Uma composição farmacêutica que compreende a composição terapêutica de células T produzidas pelo método de qual- quer uma das modalidades 1 a 29.

43. A composição farmacêutica da modalidade 36, que compreende uma dose terapêutica das células T.

44. Método de tratamento de um indivíduo com câncer, o método caracterizado pelo fato de que compreende a administração de uma dose terapêutica da composição farmacêutica da modalidade 36 ou modalidade 37.

45. O método da modalidade 38, em que a dose terapeuti- camente eficaz está entre 1 x 109 e 10 x 109 células T.

46. O método da modalidade 38, em que a dose terapeuti- camente eficaz é de mais de 1 milhão a menos de 100 milhões de cé- lulas T por quilograma de peso corporal.

47. O método da modalidade 38, em que a dose terapeuti- camente eficaz é de mais de 1 milhão a menos de 10 milhões de célu- las T por quilograma de peso corporal.

48. O método da modalidade 38, em que a dose terapeuti- camente eficaz é de cerca de 10 milhões a cerca de 50 milhões de cé- lulas T por quilograma de peso corporal.

49. Um método para fabricar células T compreendendo: (a) obtenção de linfócitos; (b) estimulação da população de linfócitos para produzir uma população de células t ativadas em um sistema fe- chado usando meio livre de soro; (c) cocultura de células T na presen-

ça de células apresentadoras de antígeno que apresentam um ou mais peptídeos não nativos associados a MHC apresentados; (d) separar as células apresentadoras de antígeno das células T em um sistema fe- chado; (e) selecionar células T contendo receptores de superfície celu- lar que são reativos a peptídeos presentes no APC com base em mar- cadores de regulação positiva em células T cultivadas na presença de células nucleadas apresentando peptídeos em um sistema fechado usando meio livre de soro; e (f) expandir células selecionadas na pre- sença de citocinas em um sistema fechado usando meio livre de soro.

50. Método, de acordo com a modalidade 43, em que o receptor de superfície celular é um novo grupo de receptores de célu- las T endógenos reativos a peptídeos que codificam mutações.

51. A composição farmacêutica da modalidade 36, onde o receptor da superfície celular é um receptor de células T (TCR).

52. A composição farmacêutica da modalidade 36, onde nos TCRs está um novo grupo de TCRs endógenos reativos a um úni- co grupo de mutações somáticas associadas ao tumor do paciente. VII. EXEMPLOS

[00395] Os exemplos a seguir são incluídos apenas para fins ilustrativos e não se destinam a limitar o escopo da invenção. Exemplo 1 Avaliação de Metodologias de Processamento de Tumor na Ob- tenção de Uma População de Células T Derivadas de Tumor

[00396] Os tumores de pacientes com câncer colorretal (CRC) ou melanoma foram processados conforme descrito abaixo e as populações de células T infiltrantes resultantes foram analisadas quanto à viabilidade da contagem de células. A. Câncer Colorretal

[00397] Os tumores foram originados de tumores primários em pacientes com câncer colorretal e enviados durante a noite em

HypoThermosol a 4°C. Os tumores foram processados como culturas de fragmento ou suspensão de célula única (SCS).

[00398] Para culturas de fragmentos, os tumores foram picados em fragmentos de 1 a 8 mm de diâmetro, e cada fragmento de 1 a 8 mm foi colocado em um orifício de recipiente de cultura, uma placa de cultura de 24 orifícios permeável a gás ou placa de 6 orifícios convencionais, na presença de Roswell Park Memorial Institute (RPMI) contendo 5% de soro humano ou meio OpTmizer sem soro (ThermoFisher). O meio foi suplementado com 300 ou 6000 IU/mL de IL-2 recombinante e também continha gentamicina a 10 µg/mL, Reposição de Soro de Célula Imune (ThermoFisher) entre 2 e 5% de acordo com as recomendações do fabricante e uma concentração final de 2,0 mM de uma forma dipeptídica de L-alanil-L-glutamina de glutamina (suplemento GlutaMAX; Termofisher). Culturas de fragmentos foram mantidas e monitoradas visualmente até que uma contagem de células foi realizada entre aproximadamente os dias 5 e 11 de cultura.

[00399] Para culturas de SCS, os tumores também foram picados em fragmentos de 1 a 8 mm de diâmetro. Os fragmentos foram então homogeneizados em um sistema fechado usando o Miltenyi GentleMACS na presença ou ausência de uma enzima para digerir o tumor, seja um coquetel de enzimas do Miltenyi Tumor Dissociation Kit, humano (parte 130-095-929) usado de acordo com a recomendação do fabricante, mistura de Colagenase I/II (Nordmark, grau comprovado de colagenase NB 4G, parte: S1746503) ou Colagenase IV (parte biomédica de Worthington: LS004130) a 1 mg/ml ou 5 mg/ml. Os fragmentos designados para SCS com homogeneização e digestão enzimática foram incubados com o coquetel de enzimas ou colagenase por um total de 60 minutos. Imediatamente após a geração de SCS, contagens de células e avaliações de viabilidade foram realizadas no contador de células automatizado NC-200 (ChemoMetec).

[00400] Como mostrado na FIG. 3A, as culturas de SCS com ou sem digestão enzimática produziram mais células viáveis totais (TVC) do que as obtidas após a cultura de fragmentos de tumor de CRC. Representado na FIG. 3B a porcentagem de células viáveis foi semelhante em culturas geradas a partir de fragmentos ou SCS gerado por homogeneização na presença de enzimas. B. Melanoma

[00401] Os tumores foram originados de tumores primários em pacientes com melanoma e enviados durante a noite em HypoThermosol a 4°C. As células foram cultivadas de forma semelhante à descrita acima.

[00402] Resumidamente, para culturas de fragmentos, os tumores foram picados em fragmentos de 1 a 8 mm de diâmetro, e cada fragmento de 1 a 8 mm foi cultivado em um orifício de uma placa de cultura de 24 orifícios permeável a gás ou placa de 6 orifícios convencional no presença de RPMI contendo 5% de soro humano ou meio OpTmizer sem soro suplementado com IL-2 recombinante a uma concentração de 300 UI/ml ou 6000 UI/ml. O meio também continha gentamicina a 10 µg/ml e uma concentração final de 2,0 mM de uma forma de dipeptídeo L-alanil-L-glutamina de glutamina (suplemento GlutaMAX; Thermofisher). As culturas de fragmentos foram mantidas e monitoradas visualmente até que uma contagem de células foi realizada entre os dias 5 e 9 da cultura.

[00403] Para gerar culturas de SCS, fragmentos de tumor foram homogeneizados usando Miltenyi GentleMACS na presença ou ausência de uma enzima, que incluía Colagenase IV a uma concentração de 1 mg/mL ou 5 mg/mL ou mistura de Colagenase I/II a 1 mg/mL ou 5 mg/mL (Nordmark, Colagenase NB 4G Grau comprovado, parte: S1746503). Como acima, a contagem de células e avaliações de viabilidade foram realizadas imediatamente após a geração de SCS usando o contador de células automatizado NC-200 (Chemometec) .

[00404] Representado na FIG. 4A, as culturas geradas a partir de fragmentos de tumor de melanoma produziram mais células viáveis totais do que SCS gerado por homogeneização e dissociação com enzimas. Como mostrado na FIG. 4B, as culturas de fragmentos também tiveram uma porcentagem maior de células viáveis do que as células em culturas de SCS, independentemente da homogeneização enzimática. Exemplo 2 Avaliação da cinética de expansão de células T de células deriva- das de tumor

[00405] Os tumores foram processados conforme descrito no Exemplo 1 para gerar fragmentos de 1 a 8 mm de diâmetro ou culturas de SCS, que foram então incubados em condições para expandir as populações de células T presentes no tumor. As culturas foram cultivadas sob várias condições testadas na presença de IL-2 recombinante, conforme descrito abaixo, a fim de avaliar a expansão celular. Entre as condições testadas estavam o efeito do tipo de placa de cultura, meio de cultura e concentração de IL-2 na expansão celular. A. Condições de Cultura

[00406] Suspensões de células únicas (SCSs) obtidas por homogeneização e digestão enzimática de tumores primários de pacientes doadores com CRC ou melanoma, conforme descrito no Exemplo 1, foram cultivadas em uma placa de 6 orifícios convencional ou uma placa de cultura de 24 orifícios permeável a gás. Sempre que possível, várias condições de cada doador foram iniciadas e calculadas (as barras de erro representam ± desvio padrão). Para placas de 6 orifícios, as células foram semeadas entre 250.000 e

1.000.000 células/mL e para placas de 24 orifícios permeáveis a gás as células foram semeadas entre 5.000 e 750.000 células/mL. Em ambos os casos, as células foram semeadas em RPMI contendo 5% de soro humano ou meio OpTmizer sem soro com IL-2 recombinante suplementado a uma concentração de IL-2 de 300 IU/mL ou 6000 IU/mL. O meio também continha gentamicina a 10 µg/ml e uma concentração final de 2,0 mM de uma forma de dipeptídeo L-alanil-L- glutamina de glutamina (suplemento GlutaMAX; Thermofisher). As células foram incubadas por até 31 dias, normalmente 14 a 21 dias, em que 50% do meio celular foi trocado a cada dois dias começando no 5º dia de cultura.

[00407] Para a expansão de fragmentos de tumor, um fragmento de tumor individual de 1 a 8 mm, obtido conforme descrito no Exemplo 1 de tumores primários de pacientes doadores com CRC ou melanoma, foi colocado em um orifício de uma placa de cultura de 24 orifícios permeável a gás ou uma placa de 6 orifícios, e cultivadas em RPMI contendo 5% de soro humano ou meio OpTmizer sem soro com IL-2 recombinante suplementado a uma concentração de 300 IU/mL ou 6000 IU/mL. O meio também continha gentamicina a 10 µg/ml e uma concentração final de 2,0 mM de uma forma de dipeptídeo L-alanil-L- glutamina de glutamina (suplemento GlutaMAX; Thermofisher). As células foram incubadas por até 31 dias, tal como normalmente 14 a 21 dias, em que 50% do meio celular foi trocado a cada dois dias começando no 5º dia de cultura.

[00408] Para todas as condições, as contagens de células foram realizadas aproximadamente a cada dois dias usando o NC-200 Automated Cell Counter (Chemometec) e as amostras foram coletadas para classificação de células ativadas por fluorescência (FACS). Após a conclusão da fase de expansão (por exemplo, dias 14 a 31), as células foram lavadas em PBS e então criopreservadas na presença de um crioprotetor. A criopreservação foi realizada usando dispositivos CoolCell (Corning) ou o VIA Freeze (GE Healthcare). B. Resultados

1. Curvas de Crescimento

[00409] As curvas de crescimento de expansão de SCS obtidas a partir de fragmentos de tumor de pacientes doadores de CRC após cultura de expansão em diferentes frascos de cultura são mostradas nas FIGS. 5A e 5B. Os resultados apresentados são de culturas incubadas com IL-2 recombinante em ambas as concentrações de 300 IU/mL ou 6000 IU/mL, e em qualquer tipo de meio, mas são separados com base na fonte de células de partida. Como mostrado, foi possível expandir células derivadas de tumor de SCS de tumores de doadores de CRC sob essas condições. Em alguns doadores, foi observada expansão superior a 2 vezes e até mesmo 10 vezes ou mais nesta fase inicial de expansão de células obtidas diretamente de tumores CRC.

[00410] A expansão alcançada a partir de SCS em comparação com fragmentos de tumor de produtos de biópsia tumoral CRC foi avaliada. Como mostrado nas FIGS. 5C e 5D, foi possível expandir células de tumores CRC sob essas condições, sejam extraídas e cultivadas como fragmentos ou como SCS. No entanto, em geral, uma maior expansão foi alcançada em culturas de CRC extraídas como SCS, conforme evidenciado por maiores números de células totais (FIG. 5C) e expansão de vezes (FIG. 5D) em comparação com a cultura de células extraídas por meio de fragmentos.

[00411] As curvas de crescimento de expansão de células cultivadas como fragmentos de tumor extraídos, ou como SCSs de fragmentos de tumor, de diferentes doadores de melanoma após cultura de expansão em diferentes vasos de cultura são mostradas em FIGS. 6A e 6B. Os resultados apresentados são de culturas incubadas com IL-2 recombinante em ambas as concentrações de 300 IU/mL ou 6000 IU/mL, e em qualquer tipo de meio, mas são separados com base na fonte de células de partida. Como mostrado, uma expansão substancial foi observada em culturas de melanoma extraídas como fragmentos de tumor em qualquer recipiente de cultura, enquanto menos expansão foi observada para células de melanoma cultivadas como SCS.

[00412] Consistente com observações anteriores, as células tumorais de certos doadores não eram passíveis de expansão, independentemente do tipo de tumor, indicativo de variabilidade inerente no potencial de expansão entre doadores e, além disso, entre fragmentos de tumor do mesmo tumor de doador. Os métodos em escala maior em que fragmentos de tumor de um paciente doador são agrupados durante a cultura seriam esperados para mitigar a variabilidade intratumoral combinando fragmentos de tumor do mesmo tumor de doador.

2. Avaliação de Crescimento pelo Meio Celular

[00413] Culturas expandidas geradas conforme descrito acima em meio RPMI contendo 5% de soro humano ou uma formulação de substituição de soro (meio OpTmizer) foram comparadas após expansão por entre 14 e 21 dias. Os resultados mostrados são de culturas incubadas com IL-2 recombinante em ambas as concentrações de 300 IU/mL ou 6000 IU/mL, e em qualquer tipo de recipiente de cultura, mas são separados com base no tipo de meio. Os resultados para tumores CRC são da cultura de SCS obtidos a partir de fragmentos de tumor (FIG. 7A e 7B), enquanto os resultados de tumores de melanoma são da cultura de fragmentos de tumor (FIG. 8A e 8B).

[00414] Para ambos os tipos de tumor, um aumento no número total de células (FIG. 7A e FIG. 8A) e expansão de vezes (FIG. 7B e FIG. 8B) foram observados por cultura em soro humano a 5% ou meio de reposição de soro para ambos os tipos de tumor. Nas amostras testadas, houve uma tendência de expansão melhorada usando meio OpTmizer, como evidenciado pelo maior número geral de células no final da fase inicial de expansão (FIG. 7A e FIG. 8A).

3. Concentração IL-2

[00415] O efeito de diferentes concentrações de IL-2 durante as expansões dos diferentes tipos de tumor foi comparado. As culturas foram expandidas conforme descrito acima em meio RPMI contendo 5% de soro humano ou uma formulação de substituição de soro (meio OpTmizer) por entre 14 e 21 dias, em 300 IU/mL ou 6000 IU/mL de IL- 2 recombinante. Os resultados apresentados são de culturas incubadas na presença de qualquer tipo de meio e em qualquer tipo de recipiente de cultura, mas são separados com base na concentração de IL-2. Os resultados para tumores CRC são da cultura de SCS obtidos a partir de fragmentos de tumor (FIG. 9A e 9B), enquanto os resultados de tumores de melanoma são da cultura de fragmentos de tumor (FIG. 10A and 10B).

[00416] Para ambos os tipos de tumor, os resultados mostraram expansão semelhante de células cultivadas em uma concentração alta ou baixa de IL-2, como evidenciado por números totais de células semelhantes após a expansão (FIG. 9A e FIG. 10A), bem como expansão de vezes (FIG. 9B e FIG. 10B). Esses dados suportam a observação de que doses de IL-2 de cerca de 300 IU/mL suportam a expansão e que uma dose alta de IL-2, como 6000 IU/mL, não é necessária para a expansão celular para culturas de CRC ou melanoma.

[00417] Juntos, os resultados mostram que, embora a expansão possa ser doadora e, além disso, dependente da amostra de tumor, células T infiltrantes de tumor CRC foram cultivadas com sucesso a partir de culturas de SCS e células T infiltradas de melanoma de culturas de fragmentos em vários doadores. Foi observado de forma semelhante que para ambas as culturas de células T derivadas de melanoma e CRC, a adição de altas concentrações de IL-2 não resultou em uma resposta de expansão apreciavelmente distinta quando comparada com uma dose mais baixa. Exemplo 3 Avaliação da Estimulação Anti-CD3 na Expansão de Células Deri- vadas de Tumor

[00418] As células processadas a partir de fragmentos de tumor de melanoma, conforme descrito nos Exemplos 1 e 2, foram cultivadas na presença ou ausência de 50 ng/mL de OKT3, um anticorpo monoclonal anti-CD3 humano. As culturas de células foram realizadas entre 14 e 31 dias em uma placa de 6 orifícios convencional ou uma placa de cultura permeável a gás com RPMI ou meio OpTmizer. As culturas também foram suplementadas com 300 ou 6000 IU/mL de IL- 2 recombinante, 10 µg/mL de gentamicina e uma concentração final de 2,0 mM de uma forma de dipeptídeo L-alanil-L-glutamina de glutamina (suplemento GlutaMAX; Thermofisher). Cerca de 50% dos meios celulares foram trocados em dias alternados, começando no 5º dia de cultura, conforme descrito anteriormente. As células foram então contadas usando o NC-200 Automated Cell Counter (Chemometec).

[00419] Os resultados mostrados são de culturas incubadas com IL- 2 recombinante em ambas as concentrações de 300 IU/mL ou 6000 IU/mL, diferentes meios de comunicação e em qualquer tipo de recipiente de cultura, mas são separados com base na presença ou ausência de estimulação anti-CD3. As células do doador 6 foram testadas na presença ou ausência de estimulação anti-CD3 e demonstraram expansão de 2 a 4 vezes em todas as condições, com uma expansão de 13 vezes observada em meio OpTmizer suplementado com 300 IU/mL IL-2 com incubação na ausência de estimulação anti-CD3 (-OKT3). Os resultados mostrados nas FIGS. 11A a 11B demonstram que a estimulação de CD3 por meio de OKT3 suportou a expansão de células T, mas não impactou substancialmente o número total de células (FIG. 11A) ou expansão de vezes (FIG. 11B). Estes dados são consistentes com a descoberta de que a estimulação anti-CD3 (por exemplo, por meio de OKT3) pode não ser necessária para a expansão de células de culturas de tumor. Exemplo 4 Avaliação dos Marcadores de Ativação CD4+ e CD8+ Pós- estimulação

[00420] Células T de três doadores saudáveis foram descongeladas, repousadas durante a noite em meio OpTmizer suplementado com 300 IU/mL de IL-2 recombinante e, em seguida, ativadas usando 50 ng/mL OKT3, um anticorpo monoclonal anti-CD3 humano. Marcadores específicos de ativação nas populações de células CD4+ e CD8+ foram medidos usando citometria de fluxo ao longo de um curso de tempo de 3 a 48 horas. Especificamente, os seguintes marcadores foram avaliados: CD38 e CD39 (FIG. 12A e FIG. 13A), CD134 e CD137 (FIG. 12B e FIG. 13B), e CD69 e CD90 (FIG. 12C e FIG. 13C).

[00421] Os resultados para a expressão de marcadores de ativação na superfície das células CD8 são mostrados nas FIGS. 12A a 12C, que demonstra a cinética da regulação positiva de marcadores em células T CD8+ nas 48 horas após a estimulação com OKT3 em comparação com a cultura na ausência de OKT3. Em alguns casos, algum nível basal dos marcadores pode ser visto no dia 0 antes da estimulação. Como mostrado, todos os marcadores avaliados foram regulados positivamente até certo ponto durante este curso de tempo, com a maior porcentagem de células sendo regulada positivamente para os marcadores CD38 (FIG. 12A), CD134 (FIG. 12B) e CD69 (FIG. 12C) durante este estudo.

[00422] Os resultados para a expressão de marcadores de ativação na superfície das células CD4 são mostrados nas FIGS. 13A a 13C, que demonstra a cinética da regulação positiva de marcadores em células T CD4+ nas primeiras 48 horas após a estimulação com OKT3 em comparação com a cultura na ausência de OKT3. Como mostrado, todos os marcadores avaliados foram regulados positivamente até certo ponto durante este curso de tempo, com a maior porcentagem de células sendo regulada positivamente para os marcadores CD38 (FIG. 13A), CD137 (FIG. 13B) e CD69 (FIG. 13C) durante este estudo.

[00423] Tomados em conjunto, estes dados suportam que a expressão dos marcadores acima podem ser usados como marcadores de regulação positiva para selecionar células T que foram ativadas, incluindo sob condições de ativação que seriam esperadas para estimular a sinalização através do complexo TCR-CD3 como ocorreria após a cocultura com células apresentadoras de antígeno apresentando peptídeos neoantigênicos. Exemplo 5 Determinação do fenótipo da célula doadora e da viabilidade celu- lar

[00424] As células T foram obtidas a partir de tumores primários em pacientes com melanoma ou CRC, conforme descrito no Exemplo 1. As células dos tumores foram extraídas como fragmentos de tumor ou como um SCS como descrito no Exemplo 1 e, em seguida, foram avaliadas quanto ao fenótipo de células T por citometria de fluxo.

[00425] Para fragmentos de tumor, cada fragmento de 1 a 8 mm foi colocado em um orifício do vaso de cultura, ou uma placa de cultura de 24 orifícios permeável a gás ou placa de 6 orifícios convencional, e incubado por entre 5 e 11 dias na presença de RPMI contendo 5% de soro humano ou meio OpTmizer sem soro (ThermoFisher). O meio foi suplementado com 300 ou 6000 IU/mL de IL-2 recombinante e também continha gentamicina a 10 µg/mL e uma concentração final de 2,0 mM de uma forma dipeptídica de L-alanil-L-glutamina de glutamina (suplemento GlutaMAX; Termofisher). A incubação também foi realizada com ou sem 50 ng/mL de anticorpo anti-CD3 OKT3. As culturas de fragmentos foram monitoradas visualmente até que foi determinado que uma contagem de células poderia ser realizada (normalmente entre os dias 5 e 9 de cultura) e, em seguida, as células foram manchadas e analisadas por citometria de fluxo para marcadores de células T.

[00426] Alternativamente, para culturas de SCS, os tumores foram picados em fragmentos de 1 a 8 mm de diâmetro, depois homogeneizados na presença ou ausência de Colagenase IV (Worthington Biomedical part: LS004130) a 1 mg/ml ou 5 mg/ml ou Colagenase Grau comprovado NB4G (Nordmark Biomedicals; No. de Catálogo S1746503) a 1 mg/mL. Após a incubação com a enzima por cerca de 90 minutos, as células foram imediatamente manchadas e analisadas por citometria de fluxo para marcadores de células T.

[00427] As hierarquias de barreira foram projetadas da seguinte forma: primeiro, a porcentagem de células CD3+ de uma população parental do total de eventos celulares foi registrada, seguida pela porcentagem de células CD4+ viáveis das populações parentais CD3+ e, em seguida, a porcentagem de células CD3+ viáveis da mesma população CD3+ parental. As populações de células T de memória (Tem) foram então calculadas com base em suas respectivas populações parentais CD4+ e CD8+. Assim, CD4/Tem foi determinado a partir da população parental de células CD4+ viáveis, enquanto

CD8/Tem foi determinado a partir da população parental de células CD8+ viáveis. Assim, os resultados, conforme representado na FIG. 12, são a porcentagem de células CD3+ de uma população pai do total de eventos celulares registrados, que foram classificados em uma hierarquia em subpopulações como uma porcentagem da respectiva população parental na hierarquia. A FIG. 14 representa a porcentagem de células viáveis positivas para marcadores de células T selecionados em suspensões de células únicas imediatamente após a extração de fragmentos de tumor por homogeneização e digestão enzimática de um doador CRC exemplar (doador 1).

[00428] A porcentagem de células CD3+ foi comparada em amostras de SCS que foram extraídas apenas por homogeneização (sem colagenase) ou por homogeneização após digestão com uma baixa concentração de colagenase (1 mg/mL) ou uma alta concentração de colagenase (5 mg/mL). Os resultados de um segundo CRC e de um paciente com melanoma são mostrados na FIG. 15A e FIG. 15B, respectivamente. Como mostrado na FIG. 15A, os resultados demonstram uma recuperação aumentada de células T CD3+ em SCSs de um doador de CRC após homogeneização e digestão com uma baixa concentração de colagenase. Embora a porcentagem de células CD3+ em SCSs de uma porta de melanoma fosse menor, os resultados também demonstram que a homogeneização e digestão com uma baixa concentração de colagenase produziram a maior porcentagem de células T CD3+ (FIG. 15B). Tomadas em conjunto, essas observações demonstram pureza relativamente elevada de células de SCS de tumores de melanoma podem ser alcançadas e podem apoiar que SCS é uma fonte viável de células CD3+ derivadas de melanoma.

[00429] A porcentagem de células CD3+ em SCSs extraídas de tumores de um doador CRC exemplar adicional também foi avaliada.

Além disso, neste mesmo doador, a porcentagem de células T CD3+ nos SCSs imediatamente após a homogeneização e digestão foi comparada a (1) a porcentagem de células CD3+ após a cultura de SCSs com 300 UI/mL IL-2 (baixo) ou 6000 IU/mL IL-2 (alto) por 6 dias, ou (2) a porcentagem de células CD3 + após a cultura de fragmentos tumorais individuais por até 6 dias com 300 IU/mL IL-2 (baixo) ou 6000 IU/mL (alto) na presença de ausência de estimulação de CD3 (OKT3). Como mostrado na FIG. 15C, a porcentagem de células CD3 na linha de base (dia 0) SCS foi substancialmente maior do que a porcentagem de células CD3+ em culturas obtidas após a cultura de fragmentos de tumor com IL-2 ou OKT3 por 6 dias. Resultados semelhantes de cultura de fragmentos de tumor de dois doadores adicionais foram observados, nos quais a porcentagem de células CD3+ em culturas obtidas após a cultura de fragmentos de tumor derivados de CRC com IL-2 e/ou OKT3 por 11 dias (FIG. 15D) ou 9 dias (FIG. 15E) também geralmente mostraram um baixo rendimento ao extrair células tumorais de fragmentos de tumor CRC sob várias condições avaliadas. Estes resultados são consistentes com a descoberta de que SCSs de biópsias de tumor de pacientes com CRC podem ser mais capazes de fornecer um número maior de células T para expansão do que células obtidas a partir de cultura de fragmentos de tumor.

[00430] Em contraste com os resultados da cultura de fragmentos de tumor para pacientes com CRC, a FIG. 16 mostra que uma alta porcentagem de células T CD3+ pode ser obtida a partir da cultura de fragmentos de tumor de melanoma sob várias condições, tal como a presença de concentrações baixas (300 IU/mL) ou altas (6000 IU/mL) de IL-2, presença de ausência de estimulação de CD3 (OKT3) ou meios diferentes. Os resultados representados na FIG. 16 são de uma cultura do dia 0. Estes resultados são consistentes com a descoberta de que a cultura de fragmentos de tumor de pacientes com melanoma pode ser mais capaz de fornecer um número maior de células T para expansão do que células obtidas de SCSs de biópsias de tumor. Exemplo 6 Quantificação da Ativação de Células T Derivadas de Tumor Após Cocultura com Células que Apresentam Antígeno

[00431] As células T foram obtidas de tumores primários em pacientes com melanoma ou CRC como fragmentos de tumor, conforme descrito no Exemplo 1. Após 5 dias de cultura em meio OpTmizer sem soro (ThermoFisher) suplementado com 300 IU/mL de IL-2 recombinante, gentamicina a 10 µg/ml, reposição de soro de células imunológicas (ThermoFisher) entre 2 e 5% de acordo com as recomendações do fabricante, e uma concentração final de 2,0 mM de uma forma de dipeptídeo L-alanil-L-glutamina de glutamina (suplemento GlutaMAX; Thermofisher), as células derivadas de tumor foram lavadas com meio OpTmizer antes de serem centrifugadas a 300 xg por 5 minutos e suspensas a 2 x 106 células/mL. As células foram então semeadas em uma placa de cultura de 6 orifícios convencionais a 10.000.000 células/orifícios.

[00432] Em uma cultura paralela, Células Dendríticas (DCs) que apresentam antígeno foram diferenciadas de PBMCs obtidas do mesmo paciente (autólogas) como células T fontes. Criofrasconetes de PGMC congelada isolada de doadores aferesados foram descongelados de armazenagem de nitrogênio líquido. As células foram descongeladas em um volume dez vezes maior de 1X DPBS (Gibco) e contadas (NucleoCounter NC200). Após a lavagem, as células foram imediatamente utilizadas para seleção positiva de microesferas CD14 (MACS Miltenyi) de acordo com as instruções do kit do fabricante. As células CD14 purificadas (monócitos) foram contadas, as células foram ressuspensas em DendriMACs (MACS Miltenyi) e semeadas a uma densidade de 0,5 a 2 x 10 6 células por mL no frasco de cultura apropriado. GM-CSF (100 ng/mL) e IL-4 (20 ng/mL) foram adicionados às culturas para promover a diferenciação em células dendríticas imaturas. Os monócitos foram cultivados e diferenciados por um total de 5 dias, com uma adição de 50% do meio igual a 50% da quantidade inicial de meio no dia 2.

[00433] Transcritos de codificação de peptídeos específicos de tumor foram identificados autologamente para cada paciente a partir de sequenciamento de exoma completo e sequenciamento de RNA, conforme descrito em Parkhurst, Maria R., et al. "Unique neoantigens arise from somatic mutations in patients with gastrointestinal cancers." Cancer discovery 9.8 (2019): 1022-1035. O sequenciamento completo do exoma (WES) de amostras de pacientes foi realizado em tecido tumoral não fixado, congelado rapidamente e em células sanguíneas periféricas normais (fonte normal). Alinhamentos de sequências de tumor vs. amostras normais foram realizados usando MPI novoalign de novocraft (http://www.novocraft.com/) para construção de genoma humano hg19. As duplicatas foram marcadas usando a ferramenta MarkDuplicates de Picard. O realinhamento da exclusão da inserção e a recalibração da base foram realizados de acordo com o fluxo de trabalho das melhores práticas do GATK (https://www.broadinstitute.org/gatk/). Pós-limpeza de dados, os arquivos pileup foram criados usando samtools mpileup (http://samtools.sourceforge.net) e Varscan2, (http://varscan.sourceforge.net), SomaticSniper (http://gmt.genome.wustl.edu/packages/somatic-sniper/), Strelka (https://sites.google.com/site/strelkasomaticvariantcaller/), e Mutect (https://www.broadinstitute.org/gatk/). Os arquivos VCF foram mesclados usando as ferramentas GATK CombineVariants e anotados usando Annovar (http://annovar.openbioinformatics.org). Variantes (mutações) presentes em tumores de pacientes foram então anotadas usando Annovar (http://annovar.openbioinformatics.org).

[00434] Os seguintes filtros foram usados para gerar uma lista inicial de mutações putativas para avaliação: (1) um tumor e cobertura normal maior que 10, (2) uma frequência de alelo variante (VAF) de 7% ou superior, (3 ) contagens de leitura variante de 4 ou acima, (4) e dois dos quatro chamadores identificando mutações. Para inserções e exclusões, os mesmos pontos de corte foram usados, exceto que apenas um único chamador identificando a mutação foi necessário para passar os filtros, já que estes foram chamados apenas por varscan e strelka. Tabelas de sequências de aminoácidos correspondentes ao resíduo mutante unido aos 12 aminoácidos codificados por regiões a montante e a jusante de variantes de nucleotídeo único (SNVs) (Nmers) foram geradas para aquelas variantes que passaram os quatro filtros. Para transcritos com deslocamento de quadro, as sequências foram transladadas até que um códon de parada foi gerado na região de codificação normal ou na região 3' não transladada. O Integrative Genomics Viewer (IGV, Broad Institute), que permite a visualização dos alinhamentos mapeados, foi então utilizado para realizar a curadoria manual das chamadas variantes. Mudanças foram feitas nas sequências dos Nmers quando a curadoria manual revelou mudanças não sinônimas resultantes de variantes somáticas adicionais ou variantes da linha germinativa presentes nas transcrições que codificam os Nmers. Variantes inferidas de leituras contendo vários nucleotídeos incompatíveis, mapeamento de inserção/deleções para diferentes locais em diferentes leituras e variantes correspondentes a SNPs frequentes foram sinalizadas para remoção.

[00435] As variantes detectadas em mais de um tumor de pacientes, mas em menos de 2,5% do total de tumores, foram sinalizadas, mas incluídas na lista de variantes aprovadas. As transcrições de variantes anotadas apenas no banco de dados ENSEMBL geralmente representam regiões de codificação não verificadas e também foram removidas. As variantes sinalizadas como polimorfismos de nucleotídeo único conhecidos ou presentes em vários tumores não foram removidas automaticamente, mas foram avaliadas posteriormente usando IGV, pois a remoção de potenciais falsos positivos, que provavelmente não codificam produtos reconhecidos por células T, era menos crítica do que a remoção de candidatos que poderiam representar falsos negativos.

[00436] Esses dados de sequenciamento foram então usados para gerar um pool de peptídeos representando peptídeos mutados associados ao tumor e peptídeos de tipo selvagem associados a células sanguíneas periféricas não doentes.

[00437] Peptídeos sintéticos foram sintetizados via química Fmoc. Para indels, peptídeos de 25 aminoácidos foram sintetizados sobrepondo-se por 10 aminoácidos com base na translação da sequência com deslocamento de quadro até o próximo códon de parada. Em alguns casos, os peptídeos de epítopos mínimos foram sintetizados. Os peptídeos foram dissolvidos em DMSO e misturados em volumes iguais.

[00438] DCs diferenciadas foram carregadas com um número variável e concentração de peptídeos de um pool de peptídeos identificados como descrito acima antes de serem adicionados à cultura derivada de tumor em várias proporções de células tumorais: DC. DCs e células derivadas de tumor foram então cocultivadas a 37°C por 6 horas a 5% de CO2 antes de a cultura ser agitada suavemente e as células em suspensão recuperadas. As células recuperadas foram então classificadas por citometria de fluxo para células T ativadas usando marcadores de ativação de células T 4-1BB e OX40.

[00439] FIG. 17A e 17B mostram ativação de células T derivadas de tumor em uma faixa de peptídeo de 20 a 0,1 ng/mL. Como mostrado na FIG. 17A, cocultura de células T com DCs carregadas com cada uma das três concentrações de peptídeo testadas resultou em níveis prontamente detectáveis de células T 4-1BB/OX40+, incluindo até aproximadamente 80% a 1 ng/mL de peptídeo. O aumento na expressão do marcador de ativação de células T em comparação com as células cultivadas com DCs não carregadas é mostrado na FIG.17B, onde 0,1 ng/mL resultou no maior delta, mas todas as três concentrações de peptídeo resultaram em uma mudança positiva. Estes dados demonstram que as concentrações de peptídeo mais baixas inferiores a 20 ng/mL podem resultar em aumento da regulação dos marcadores de ativação de células T (marcadores de regulação positiva) após a cocultura.

[00440] FIG. 16 descreve de forma semelhante a ativação de células T derivadas de tumor em função da expressão de 41BB/OX40 em estudos em que as DCs foram pulsadas com um ou dois peptídeos para apresentação de superfície durante a cocultura. Mostrado na FIG. 18A e novamente na FIG. 18B como mudança de vezes, as DCs que foram carregadas com apenas um peptídeo foram mais marcadamente mais eficientes na ativação de células T em cocultura.

[00441] Conforme mostrado na FIG. 19, os marcadores de ativação de células T 41BB e OX40 foram substancialmente regulados positivamente quando células T derivadas de tumor foram cocultivadas com DCs em uma relação de 1:2 (células T: DC) em comparação com 1:1. Exemplo 7 Enriquecimento e Recuperação de Células T Ativadas Por Meio de Classificação de Células

[00442] Células T de um doador saudável foram isoladas por seleção baseada em imunoafinidade e, em seguida, criopreservadas. As células T foram descongeladas e repousadas durante a noite e, em seguida, foram ativadas com 50 ng/mL OKT3 por 24 a 48 horas antes do manchamento com anti-CD4 FITC (BD), anti-CD8 PerCPCy.5.5 (BD), anti-CD134 (Beckman Couleter) e anti-CD137 (MACs Miltenyi). As células foram trazidas a uma concentração de aproximadamente 20 x 106 células/mL e classificados usando o BD FACSAriaIIa uma taxa de classificação de aproximadamente 15.000 eventos por segundo. Um portão foi desenhado em torno das células que expressam CD134, CD137 ou ambos CD134 e CD137 e classificado em uma única população. Esta foi a população classificada positiva. As células sem expressão de CD134 e CD137 foram classificadas em uma população separada. Esta foi a população classificada de forma negativa. Após a classificação, as células das populações classificadas positivas e negativas e da população não classificada foram analisadas em um citômetro de fluxo alternativo para verificar a pureza e avaliar as taxas de recuperação.

[00443] Conforme mostrado na FIG. 20, a população de células T derivadas de tumor não classificado (pré-classificação) foi comparada com a população classificada positiva que foi coletada após cocultura com células dendríticas autólogas carregadas com peptídeo mutante, conforme descrito anteriormente no Exemplo 6 e classificadas em populações positivas de 41BB/OX40. Foi observado que esta estratégia de bloqueio resultou em um enriquecimento aumentado para a porcentagem de TCR reativo para três doadores (FIG. 20A) e reatividade média de Classe I (FIG. 20B).

[00444] A recuperação total de células a partir da classificação de células é mostrada em relação à entrada total de células na FIG. 21A. Visto de forma semelhante na FIG. 21B, a recuperação percentual de duas execuções independentes foi de aproximadamente 80%. Os resultados demonstram que é possível obter uma alta recuperação de células após a seleção e triagem de células positivas para marcadores de regulação positiva.

[00445] FIG. 22 representa a pureza da população CD4+ por meio de citometria de fluxo de células T de doadores saudáveis ativadas com OKT3 e manchadas como descrito acima. As células foram primeiro bloqueadas em CD4+, então a população que expressa a maior intensidade de CD134+ foi em seguida bloqueada e os resultados exibidos mostrando CD4+ vs. CD8+ e CD137+ vs. CD134+. Esses dados suportam o uso desses marcadores para controlar uma população de alta pureza de células T que se infiltram por tumor. Exemplo 8 Expansão pós-classificação de células T derivadas de tumor ati- vadas

[00446] Células T provenientes de um tumor CRC primário foram processadas como descrito no Exemplo 1 e, em seguida, foram cocultivadas com células dendríticas que apresentam peptídeo, usando métodos como descrito no Exemplo 6. Resumidamente, linfócitos infiltrantes de tumor isolados foram cultivados com DCs autólogas que foram carregados para expressar peptídeo associado a tecido saudável (Tipo-selvagem, WT), peptídeo associado a tecido tumoral (Mutante) ou não foram carregados com peptídeo totalmente (Sem peptídeo). Uma subpopulação de controle de células T foi cultivada sem DCs (não ativadas). Após a cocultura, as células foram classificadas por meio do Sony FX500 habilitado para fluorescência com base na expressão de superfície dos marcadores de ativação 4- 1BB e OX40.

[00447] As células foram então semeadas em uma placa de cultura de 24 orifícios permeável a gás a 250.000 a 1.000.000 células/cm2 em meio OpTmizer sem soro suplementado com IL-2 recombinante a uma concentração de 300 IU/mL, gentamicina a 10 µg/mL, e 2,0 mM de uma forma de dipeptídeo L-alanil-L-glutamina de glutamina (suplemento GlutaMAX; termofisher). As células foram incubadas por um total de 7 dias com 50% da meio trocado a cada dois dias, começando no dia 5 de cultura. As contagens de células foram realizadas usando NC-200 Automated Cell Counter (Chemometec) em cada dia de cultura.

[00448] Conforme mostrado na FIG. 23A e novamente na FIG. 23B como expansão de vezes, cada população de células T de linfócitos infiltrantes de tumor (TIL) testada sofreu expansão mensurável entre os dias de cultura 3 e 5 e continuou a tendência ascendente na conclusão de 7 dias do período de cultura. Células T de infiltração tumoral cultivadas com DCs carregadas com o peptídeo associado ao tumor mutante atingiu o maior número total de células ao longo do experimento.

[00449] Usando os dados acima, um modelo matemático teórico mostrado na FIG. 23C foi criado para prever a relação entre o número de células recuperadas após a classificação e o número esperado de células presentes na cultura após a fase de expansão. Exemplo 9 Modelagem Monte Carlo Expansão Ex Vivo de Células T Deriva- das de Tumor

[00450] Em complemento à análise de ponto determinístico no Exemplo 8, uma primeira simulação de Monte Carlo probabilística foi projetada para prever o número de linfócitos infiltrantes de tumor resultante de uma primeira expansão, conforme descrito no Exemplo

2. Simulações de Monte Carlo dos números prováveis de células T viáveis e reativas totais pós-extração e uma primeira expansão foram executadas substituindo-se uma distribuição de probabilidade por dois fatores de incerteza inerente, eficiência de recuperação e capacidade de expansão de vezes. Os resultados foram calculados iterativamente dezenas de milhares de vezes como uma distribuição normal em que um valor médio de células recuperadas foi definido para recuperação baixa e média, e um valor médio para mudança de vezes na expansão foi definido para potenciais de expansão baixo, médio e alto. As distribuições foram então calculadas para o número total de células T viáveis, bem como para o total de células T reativas.

[00451] Para as simulações de Monte Carlo iniciais, em que as saídas prováveis de células T são calculadas para uma primeira expansão, os casos de teste foram executados para modelar recuperação baixa/expansão baixa, recuperação média/expansão baixa, recuperação média/expansão média e recuperação média/condições de alta expansão. Os valores da média e do desvio padrão para as variáveis de recuperação e expansão foram atribuídos da seguinte forma: (1) a recuperação baixa foi definida como a cultura de um total de 20 milhões de células viáveis do tumor processado a um desvio padrão de 6 milhões, (2) a recuperação intermediária foi definida como 50 ou 60 milhões de células com um desvio padrão de 15 milhões, (3) uma expansão de vezes de primeira baixa foi definida como 50 vezes com um desvio padrão de 11, (4) a expansão média foi definida como 75 vezes com um desvio padrão de 15 e (5) a expansão alta foi definida como 500 vezes com um desvio padrão de 160.

[00452] Os dados para cada caso de teste das primeiras simulações de Monte Carlo A são exibidos na Tabela E1 abaixo. Tabela E1: Simulações de Monte Carlo para uma primeira expansão Células T totais infil- Tumor Viável Total trantes de tumor Infiltrando células T reativas Valores de Condições de Teste Hipóteses Estatísticas Valores de previsão previsão Baixa recuperação/Baixa Média = 20 Média 1,99 x107 1,59 x106 Expansão Desvio Padrão = 6 7 Mediana 1,99 x10 1,51 x106 Média = 50 Desvio Padrão = 11 Distribuição de probabilidade (10 a 1,22 x107 – 7,48 x105 – 90º percentil) 2,76 x107 2,53 x106

Recuperação média/Baixa Média = 50 Média 4,99 x107 3,99 x106 7 expansão Desvio Padrão = 15 Mediana 5,00 x10 3,81 x106 Média = 50 Distribuição de probabilidade (10 a 3,05 x107 – 1,85 x106 – Desvio Padrão = 11 90º percentil) 6,93 x107 6,34 x106 7 Recuperação mé- Média = 60 Média 6,00 x10 4,81 x106 7 dia/Expansão média Desvio Padrão = 15 Mediana 5,99 x10 4,63 x106 Média = 75 Distribuição de probabilidade (10 a 4,07 x107 – 4,07 x107 – Desvio Padrão = 15 90º percentil) 7,91 x107 7,91 x107 7 Recuperação média/Alta Média = 60 Média 4,78 x10 5,99 x107 7 expansão Desvio Padrão = 15 Mediana 4,60 x10 6,00 x107 Média = 500 Distribuição de probabilidade (10 a 4,07 x107 – 2,43 x106 – Desvio Padrão = 160 90º percentil) 7,94 x107 7,40 x106

[00453] Usando esses dados, um segundo conjunto de simulações de Monte Carlo foi projetado para prever o número final de linfócitos infiltrantes tumorais reativos após a cocultura com APCs, classificação por citometria de fluxo e uma segunda expansão, conforme descrito no Exemplo 8. Um valor fixo para a porcentagem de células T reativas presentes na população de células T totais cultivadas a partir de fragmentos de tumor ou SCS foi atribuído a uma média de 8% e uma variação padrão de 2,50. Após dezenas de milhares de cálculos iterativos, os dados para cada caso de teste das segundas simulações de Monte Carlo são representados na Tabela E2 abaixo. Tabela E2: Simulações de Monte Carlo para uma segunda e última expansão Células T totais infiltrantes de tumor reativas Condições de Teste Hipóteses Estatísticas Valores de previsão Baixa recuperação / Baixa expansão Média = 20 Média 7,96 x107 Desvio Padrão = 6 Mediana 7,34 x107 Média = 50 Desvio Padrão = 11 Distribuição de probabilidade (10 a 90º 3,41 x107 – percentil) 1,34 x108 Recuperação média/baixa expansão Média = 50 Média 2,00 x108 Desvio Padrão = 15 Mediana 1,85 x108 Média = 50 Distribuição de probabilidade (10 a 90º 8,44 x107 – Desvio Padrão = 11 percentil) 3,33 x108 Recuperação média/Expansão média Média = 60 Média 3,61 x108 Desvio Padrão = 15 Mediana 3,39 x108 Média = 75 Distribuição de probabilidade (10 a 90º 1,68 x108 – Desvio Padrão = 15 percentil) 5,80 x108 Recuperação média/Alta expansão Média = 60 Média 2,39 x109 Desvio Padrão = 15 Mediana 2,19 x109 Média = 500 Distribuição de probabilidade (10 a 90º 9,57 x108 – Desvio Padrão = 160 percentil) 4,06 x109

[00454] O potencial de recuperação e expansão de células T reativas de infiltração de tumor de uma primeira expansão após o processamento do tumor ou uma segunda expansão após a cocultura a jusante com APCs são fatores que são inerentemente variáveis entre doadores e dentro de uma população de células tumorais. A faixa esperada de números de células T gerados pelo processo descrito aqui está contida no 10º e 90º percentis. É improvável que os números de células abaixo do 10º percentil sejam gerados e provavelmente não resultarão em um fármaco utilizável. Portanto, as observações das simulações de Monte Carlo nas Tabelas E1 e E2 suportam que em todos os cenários entre os percentis 10º e 90º, dada uma gama de níveis de variabilidade para potenciais de expansão, o método aqui descrito provavelmente fornecerá uma saída robusta de células T que é aproximado ao número de células que seriam necessárias para a dosagem terapêutica. Exemplo 10 Exemplo 10: Avaliação do Enriquecimento de TCR Reativo ao Tumor por Produção de IFN-Gama e Clonalidade de TCR

[00455] Células T provenientes de tumor primário de pacientes com câncer de ovário (Amostra A), CRC (Amostra B) ou melanoma (Amostra C) foram processadas a partir de fragmentos de tumor conforme descrito no Exemplo 1. Após a expansão inicial, as células T foram então cocultivadas com células dendríticas autólogas apresentando peptídeo por 6 horas usando métodos substancialmente como descrito no Exemplo 6. Para a cocultura, as DCs autólogas foram carregadas com um único peptídeo longo mutante (por exemplo, 25 mer) exclusivo para o tumor do paciente ou um único peptídeo longo de tipo selvagem que não foi mutado em comparação com a amostra normal do paciente. Após a cocultura, as células T reativas ao tumor foram enriquecidas por manchamento das células para expressão de 4-1BB (CD137) e/ou OX40 (CD134) e classificação das células por classificação de células ativadas por fluorescência (FACS). As células que foram positivas para um ou ambos de 41BB e OX40 foram coletadas como a população "positiva" (também chamada de população "enriquecida por mutantes") e as células que eram duplamente negativas para 41BB e OX40 foram coletadas como a população "negativa" (também chamada de população “não enriquecida de tipo selvagem”).

[00456] As populações de células T mutantes e de tipo selvagem foram então cultivadas por 16 horas em meio sozinho ou sob condições para estimular a secreção de IFN-gama. Células T não classificadas e não enriquecidas (células T em massa) da cocultura que não foram classificadas com base na expressão de 41BB e OX40 foram incluídas como um controle de pré-seleção e foram estimuladas de forma semelhante. O sobrenadante da cultura foi coletado e os níveis de secreção de IFN-gama foram determinados por ELISA.

[00457] A porcentagem de células T na população classificada que expressa um TCR reativo ao neo-epítopo peptídico foi determinada por sequenciamento de TCR de célula única. A clonalidade de TCR nas populações de células T também foi determinada por sequenciamento de RNA de célula única para as cadeias TCR-beta e TCR-alfa.

1. Amostra A (Câncer do ovário)

[00458] As populações de células T enriquecidas mutantes e de tipo selvagem, ou células T em massa de controle, produzidas a partir de células tumorais da Amostra A foram cultivadas por 16 horas em meio sozinho ou foram estimuladas por cultura com anticorpos anti-CD28 e anti-CD49d juntamente com o mínimo epítopo de peptídeo (8mer) correspondente ao peptídeo mutante (neo-epítopo) ou o peptídeo de tipo selvagem do respectivo tumor do paciente. Como mostrado na FIG. 24A, as células T em massa exibiram reatividade melhorada, tal como evidenciado pela secreção aumentada de IFN-gama, após a cultura com o neo-epítopo em comparação com o meio de cultura sozinho. A capacidade de produzir IFN-gama foi ainda aumentada na população de células T enriquecidas com mutantes que foi estimulada com o neo-epítopo, mas nenhuma diferença foi observada na população de células T enriquecidas de tipo selvagem após estimulação em meio sozinho versus estimulação com as condições de neo-epítopo. Além disso, a população de células T não enriquecidas de tipo selvagem ainda incluía algum grau de células T reativas a neoantígenos, conforme evidenciado por sua regulação positiva da secreção de IFN-gama em comparação com o meio sozinho. Estes dados indicam que a massa de células T após a c- cultura contém uma população reativa de neoantígeno, que é enriquecida por classificação com base na expressão de 41BB e OX40. Além disso, os resultados também demonstram a especificidade do enriquecimento de neoantígeno.

[00459] A análise de TCRs específicos para neoepítopos por sequenciamento de RNA e citometria de fluxo mostrou um enriquecimento de TCRs específicos para neoantígenos TCR "A" nas populações de células T enriquecidas mutantes com 17% de TCRs específicos para neoantígenos em comparação com 2% na população inicial de células T em massa ou 0,1% na população de células T enriquecidas de tipo selvagem (FIG. 24B). A clonalidade de TCR de células T na população não selecionada (população de células T enriquecidas de tipo selvagem) em comparação com a população selecionada (população de células T enriquecida com mutantes) é mostrada na FIG. 24C, que mostra que a diversidade de TCR de entrada é alta na população de células T não classificadas e que o enriquecimento de clones de TCR únicos é alcançado na população selecionada. FIG. 24D demonstra que as populações de células pré- (volume) e pós classificação contêm células CD4 e CD8, indicando que células reativas de classe I e classe II estão presentes na população enriquecida,

2. Amostra B (paciente CRC)

[00460] As populações de células T enriquecidas mutantes e de tipo selvagem, ou células T em massa de controle, produzidas a partir de células tumorais da Amostra B foram cultivadas por 16 horas em meio sozinho ou foram estimuladas em resposta a uma estimulação TCR geral usando um anticorpo anti-CD3 (OKT3). Como mostrado na FIG. 25A, todas as populações de células T exibiram funcionalidade (isto é, produção de IFNg) após a cocultura e classificação em resposta à estimulação geral de TCR.

[00461] A análise de TCRs específicos do neoepítopo mostrou um enriquecimento de TCRs específicos do neoantígeno "B" nas populações de células T enriquecidas mutantes com 71% de TCRs específicos do neoantígeno em comparação com 42% na população inicial de células T ou 17% no população de células T enriquecidas de tipo selvagem (FIG. 25B). Em comparação com as células T em massa após a cocultura, isso representa um enriquecimento de aproximadamente 1,7 vezes nas células T reativas ao tumor na população de células T classificadas e uma redução de aproximadamente 2,5 vezes nas células T reativas ao tumor na população de células T classificadas. A clonalidade TCR de células T na população não selecionada (população de células T enriquecidas de tipo selvagem) em comparação com a população selecionada (população de células T enriquecida com mutantes) é mostrada em FIG. 25C, que mostra que a diversidade de TCR de entrada é alta na população de células T não classificadas (807 clones de TCR únicos) e que o enriquecimento de clones de TCR únicos é alcançado na população selecionada (64 clones de TCR únicos). FIG. 25D demonstra que as populações de células pré-(volume) e pós classificação contêm células CD4 e CD8, indicando que células reativas de classe I e classe II estão presentes na população enriquecida.

3. Amostra C (Paciente com melanoma)

[00462] Células T nas populações de células T enriquecidas mutantes e de tipo selvagem, ou células T em massa de controle, produzidas a partir de células tumorais da Amostra C, foram avaliadas quanto a TCRs específicos para neoepítopos por sequenciamento de RNA e citometria de fluxo e clonalidade de TCR. Os resultados mostraram um enriquecimento de TCRs específicos do neoantígeno "C" nas populações de células T enriquecidas por mutantes com 33% de TCRs específicos do neoantígeno em comparação com 5% na população inicial de células T em massa ou 4% na população de células T enriquecidas de tipo selvagem (FIG. 26A). Em comparação com as células T em massa após a cocultura, isso representa um enriquecimento de aproximadamente 7 vezes nas células T reativas ao tumor na população de células T classificadas e nenhum enriquecimento em células T reativas ao tumor na população de células T não classificadas. A clonalidade TCR de células T na população não selecionada (população de células T enriquecidas de tipo selvagem) em comparação com a população selecionada (população de células T enriquecida com mutantes) é mostrada em FIG. 26B, que mostra que a diversidade de TCR de entrada é alta na população de células T não classificadas (182 clones de TCR únicos) e que o enriquecimento de clones de TCR únicos é alcançado na população selecionada (15 clones de TCR únicos). FIG. 26C demonstra que as populações de células pré-(volume) e pós classificação contêm células CD4 e CD8, indicando que células reativas de classe I e classe II estão presentes na população enriquecida.

4. Conclusão

[00463] Juntos, os resultados mostram que a diversidade de TCR de entrada é alta na população de células T não classificadas (por exemplo, 100 a 900 TCRs). Esta população não classificada produz um baixo nível de IFNgamma (por exemplo, 5 a 25 pg/mL). Após a classificação da população de TCR com base em marcadores de ativação, por exemplo, OX40/41BB, a população de TCR é enriquecida em uma população reativa de TCRs (por exemplo, 15 a 64 TCRs) que produzem IFNgamma mais alto (por exemplo, 65,3 a 98,6 pg/mL) do que a população não classificada e classificada negativa (5 pg/mL) de TCRs. Os resultados indicam que esta é uma ativação específica consistente com o enriquecimento de células T reativas ao tumor, uma vez que não é visto nas coculturas não classificadas de tipo selvagem.

[00464] A presente invenção não se destina a ser limitada em escopo às modalidades particulares descritas que são fornecidas, por exemplo, para ilustrar vários aspectos da invenção. Várias modificações nas composições e métodos descritos irão se tornar evidentes a partir da descrição e dos ensinamentos deste documento. Tais variações podem ser praticadas sem se afastar do verdadeiro escopo e espírito da invenção e se destinam a incluir-se no escopo da presente invenção.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Método para a fabricação de células T para uso em uma composição de células terapêuticas, em que as células T expressam um receptor de células T (TCR) que reconhece um antígeno na super- fície de uma célula alvo, caracterizado pelo fato de que o método compreende: a. processar uma amostra biológica contendo uma população de célu- las de linfócitos T obtida de um indivíduo doador que tem um tumor para produzir uma primeira população de células de linfócitos T; b. estimular a primeira população com um ou mais primeiros agentes estimuladores de células T de linfócitos sob condições para expansão de células T na população para produzir uma segunda população de células T ativadas em que a estimulação é realizada em um sistema fechado usando meio sem soro; c. cocultura da segunda população de células T na presença de célu- las apresentadoras de antígeno que apresentam um ou mais peptí- deos não nativos em um complexo de histocompatibilidade principal (MHC) em um sistema fechado usando meio sem soro, referido um ou mais peptídeos não nativos são peptídeos que correspondem a muta- ções somáticas não sinonímicas associadas ao tumor do indivíduo, para produzir uma terceira população de células contendo células T compreendendo recetores de células T endógenos reativos a peptí- deos que codificam mutação do tumor; d. selecionar, a partir da terceira população de células, a população de células T contendo TCR endógeno que são reativos a peptídeos pre- sentes nas APCs com base em um ou mais marcadores de super- regulação expressos em células T reativas ou ativadas em um sistema fechado para produzir uma quarta população contendo as células T selecionadas; e e. expandir a quarta população de células selecionadas na presença de um ou mais segundos agentes estimuladores de células T de linfó- citos sob condições para expandir células T na população em um sis- tema fechado usando meio sem soro para produzir uma composição de células T expandidas para uso como uma composição celular tera- pêutica.

2. Método para a fabricação de células T para uso em uma composição de células terapêuticas, em que as células T expressam um receptor de células T (TCR) que reconhece um antígeno na super- fície de uma célula alvo, caracterizado pelo fato de que o método compreende: a. processar uma amostra biológica contendo uma popu- lação de células de linfócitos T obtida de um indivíduo doador que tem um tumor para produzir uma primeira população de células de linfóci- tos T; b. estimular a primeira população de linfócitos com um ou mais primeiros agentes estimuladores de células T de linfócitos sob condições para expansão de células T na população para produzir uma segunda população de células T em que a estimulação é realiza- da em um sistema fechado usando meio sem soro; c. cocultura da segunda população de células T na pre- sença de células apresentadoras de antígeno que apresentam um ou mais peptídeos não nativos em um complexo de histocompatibilidade principal (MHC) em um sistema fechado usando meio sem soro, referi- do um ou mais os peptídeos não nativos são peptídeos corresponden- tes a mutações somáticas não sinonímicas associadas no tumor de um indivíduo, para produzir uma terceira população contendo células T compreendendo receptores de células T endógenos reativos a muta- ções que codificam peptídeos do tumor; d. separar as células apresentadoras de antígeno da po- pulação de células T na terceira população de células em um sistema fechado; e. após a separação, selecionar a população de células T contendo TCRs endógenos que são reativos aos peptídeos presentes nas APCs com base em um ou mais marcadores de super-regulação expressos em células T reativas ou ativadas em um sistema fechado para produzir uma quarta população contendo as células T seleciona- das; e f. expandir a quarta população de células selecionadas na presença de um ou mais segundos agentes estimuladores de célu- las T de linfócitos sob condições para expandir células T na população em um sistema fechado usando meio sem soro para produzir uma composição de células T expandidas para uso como uma composição celular terapêutica.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracteri- zado pelo fato de que as células apresentadoras de antígeno são célu- las nucleadas, tais como células dendríticas, fagócitos mononucleares, linfócitos B, células endoteliais ou timicepitélio.

4. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que as células apresentadoras de an- tígeno são células dendríticas.

5. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que as células apresentadoras de an- tígeno

6. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que as células T são autólogas ao indivíduo.

7. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que a molécula de MHC é uma molé- cula de classe I.

8. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações

1 a 6, caracterizado pelo fato de que a molécula de MHC é uma molé- cula de Classe II.

9. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que na molécula de MHC está MHC de classe I e II.

10. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 9, caracterizado pelo fato de que as células T são células CD4+.

11. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 9, caracterizado pelo fato de que as células T são células CD8+.

12. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 9, caracterizado pelo fato de que as células T são células CD4+ e células CD8+.

13. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 12, caracterizado pelo fato de que os um ou mais primeiros agentes estimuladores de células T são selecionados a partir de um ou mais de um anticorpo anti-CD3; um anticorpo anti-CD28; ou uma cito- cina recombinante selecionada entre IL-2, IL-7, IL-15 e IL-21.

14. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 13, caracterizado pelo fato de que os um ou mais primeiros agentes estimuladores de células T é ou compreende IL-2 recombi- nante.

15. Método, de acordo com a reivindicação 14, caracteriza- do pelo fato de que a concentração de IL-2 recombinante é de 100 IU/mL a 6000 IU/mL.

16. Método, de acordo com a reivindicação 14 ou 15, carac- terizado pelo fato de que a concentração de IL-2 recombinante é de 300 IU/mL a 1000 IU/mL, opcionalmente em que a concentração de IL- 2 recombinante é igual ou cerca de 300 IU/mL.

17. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 14 a 16, caracterizado pelo fato de que os um ou mais agentes estimuladores de células T compreende ainda um anticorpo anti-CD3, opcionalmente OKT3, opcionalmente, em que a concentração do anti- corpo anti-CD3 é de ou cerca de 50 ng/mL.

18. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 17, caracterizado pelo fato de que os um ou mais segundos agentes estimuladores de células T são selecionados a partir de um ou mais de um anticorpo anti-CD3; um anticorpo anti-CD28; ou uma cito- cina recombinante selecionada entre IL-2, IL-7, IL-15 e IL-21.

19. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 18, caracterizado pelo fato de que os um ou mais segundos agentes estimuladores de células T é ou compreende IL-2 recombi- nante.

20. Método, de acordo com a reivindicação 19, caracteriza- do pelo fato de que a concentração de IL-2 recombinante é de 100 IU/mL a 6000 IU/mL.

21. Método, de acordo com a reivindicação 19 ou 20, carac- terizado pelo fato de que a concentração de IL-2 recombinante é de 300 IU/mL a 1000 IU/mL, opcionalmente em que a concentração de IL- 2 recombinante é igual ou cerca de 300 IU/mL.

22. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 19 a 21, caracterizado pelo fato de que os um ou mais segundos agentes estimuladores de células T compreende ainda um anticorpo anti-CD3, opcionalmente OKT3, opcionalmente, em que a concentra- ção do anticorpo anti-CD3 é de ou cerca de 50 ng/mL.

23. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 22, caracterizado pelo fato de que um ou mais peptídeos não nativos compreendem um peptídeo individual ou um pool de peptí- deos.

24. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 23, caracterizado pelo fato de que um ou mais peptídeos não nativos são carregados em células apresentadoras de antígeno por transfecção de construtos de minigene sintetizados transcritos in vitro que codificam um ou mais peptídeos não nativos, opcionalmente em que um ou mais os peptídeos não nativos são flanqueados em cada lado por 12 aminoácidos de proteínas endógenas, em tandem, em que os construtos de minigene transcritos geram peptídeos individuais.

25. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 23, caracterizado pelo fato de que um ou mais peptídeos não nativos são carregados em células apresentadoras de antígeno por pulso de peptídeo, opcionalmente por eletroporação.

26. Método, de acordo com a reivindicação 25, caracteriza- do pelo fato de que um ou mais peptídeos não nativos tem 5-30 ami- noácidos, opcionalmente 12-25 aminoácidos, opcionalmente ou cerca de 25 aminoácidos no comprimento.

27. Método, de acordo com a reivindicação 25 ou 26, carac- terizado pelo fato de que: os um ou mais peptídeos não nativos são um pool de pep- tídeos e a concentração de peptídeos no pool de peptídeos para o pul- so de peptídeo está entre a ou cerca de 0,001 µg/mL e a ou cerca de 40 µg/mL, 0,01 µg/mL e a ou cerca de 40 µg/mL, a ou cerca de 0,1 µg/mL e a ou cerca de 40 µg/mL, a ou cerca de 1 µg/mL e a ou cerca de 40 µg/mL, a ou cerca de 0,01 µg/mL e a ou cerca de 10 µg/mL ou a ou cerca de 1 µg/mL e a ou cerca de 10 µg/mL; ou os um ou mais peptídeos não nativos é um peptídeo individual e a concentração de peptídeos individuais para o pulso de peptídeo está entre a ou cerca de 0,00001 µg/mL e a ou cerca de 1 µg/mL, em ou cerca de 0,00001 µg/mL e a ou cerca de 0,1 µg/mL, a ou cerca de 0,00001 µg/mL e a ou cerca de 0,01 µg/mL, a ou cerca de 0,0001 µg/mL e a ou cerca de 1 µg/mL, a ou cerca de 0,0001 µg/mL e a ou cerca de 0,1 µg/mL, a ou cerca de 0,0001 µg/mL e a ou cerca de 0,1 µg/mL ou a ou cerca de 0,0001 µg/mL e a ou cerca de 0,01 µg/mL.

28. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 27, caracterizado pelo fato de que a relação de cocultura de células apresentadoras de antígeno para células T está entre 20:1 e 1:1, entre 15:1 e 1:1, entre 10:1 e 1:1, entre 5:1 e 1:1, entre 2,5:1 e 1:1, entre 1:20 e 1:1, entre 1:15 e 1:1, entre 1:10 e 1:1, entre 1:5 e 1:1 ou entre 1:2,5 e 1:1.

29. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 28, caracterizado pelo fato de que a relação de cocultura de células apresentadoras de antígeno para células T é ou é de cerca de 1:1.

30. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 29, caracterizado pelo fato de que a separação de células apresentadoras de antígeno está usando separação magnética, sepa- ração gravimétrica, ligação seletiva ou classificação de células usando citometria de fluxo.

31. Método para a fabricação de células T para uso em uma composição de células terapêuticas, em que as células T expres- sam um receptor de células T (TCR) que reconhece um antígeno na superfície de uma célula alvo, caracterizado pelo fato de que o método compreende: a. processar uma amostra biológica contendo uma popula- ção de células de linfócitos T obtida de um indivíduo doador que tem um tumor para produzir uma primeira população de células de linfóci- tos T; b. estimular a primeira população com um ou mais primei- ros agentes estimuladores de células T de linfócitos sob condições pa- ra expansão de células T na população para produzir uma segunda população de células T ativadas, em que um ou mais agentes estimu- ladores de células T são ou incluem recombinantes IL-2 em uma con- centração de 300 IU/mL a 1000 IU/mL e em que a estimulação é reali- zada em um sistema fechado usando meio sem soro; c. cocultivo da segunda população de células T na presen- ça de células dendríticas autólogas carregadas com um ou mais peptí- deos não nativos para apresentar um ou mais peptídeos não nativos em um complexo de histocompatibilidade principal (MHC), em que o cocultivo é em um sistema fechado usando meio sem soro e em que um ou mais peptídeos não nativos são peptídeos correspondentes a mutações somáticas não sinônimas associadas ao tumor do indivíduo e são carregados com as células dendríticas a uma concentração de menos de 0,02 µg/mL em média por peptídeo individual de um ou mais peptídeos não nativos, para produzir uma terceira população de célu- las contendo células T compreendendo receptores de células T endó- genos reativos à mutação que codificam peptídeos do tumor; d. selecionar, a partir da terceira população de células, a população de células T contendo TCR endógeno que são reativos a peptídeos presentes nas APCs com base em um ou mais marcadores de super-regulação expressos em células T reativas ou ativadas em um sistema fechado para produzir uma quarta população contendo as células T selecionadas; e e. expandir a quarta população de células selecionadas na presença de um ou mais segundos agentes estimuladores de células T de linfócitos sob condições para expandir células T na população, em que um ou mais segundos agentes estimuladores de células T são ou incluem IL-2 recombinante a uma concentração de 300 IU/mL a 1000 IU/mL e em que a expansão é em um sistema fechado usando meio sem soro para produzir uma composição de células T expandidas para uso como uma composição de células terapêuticas.

32. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 31, caracterizado pelo fato de que os um ou mais primeiros agentes estimuladores de células T não compreendem células alimen- tadoras irradiadas, células mononucleares de sangue periférico opcio- nalmente irradiadas (PBMCs) ou células apresentadoras de antígeno irradiadas.

33. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 32, caracterizado pelo fato de que os um ou mais segundos agentes estimuladores de células T não compreendem células alimen- tadoras irradiadas, células mononucleares de sangue periférico opcio- nalmente irradiadas (PBMCs) ou células apresentadoras de antígeno irradiadas.

34. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 25 a 33, caracterizado pelo fato de que a concentração de peptí- deos individuais de um ou mais peptídeos não nativos, em média, é de ou cerca de 0,00001 µg/mL a ou cerca de 0,01 µg/mL.

35. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 25 a 33, caracterizado pelo fato de que a concentração de peptí- deo individual de um ou mais peptídeos não nativos, em média, é de ou cerca de 0,0001 µg/mL e a ou cerca de 0,001 µg/mL.

36. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 31 a 35, caracterizado pelo fato de que um ou mais peptídeos não nativos compreendem um peptídeo individual ou um pool de pep- tídeos individuais.

37. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 25 a 36, caracterizado pelo fato de que cada um dos um ou mais peptídeos não nativos tem 12 a 25 aminoácidos no comprimento, op- cionalmente a ou cerca de 25 aminoácidos no comprimento.

38. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 31 a 37, caracterizado pelo fato de que a relação de cocultura de células dendríticas para células T está entre 5:1 e 1:5 ou está entre 3:1 e 1:3, opcionalmente é ou é de cerca de 1:1.

39. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 31 a 38, caracterizado pelo fato de que a relação de cocultura de células dendríticas para células T é ou é de cerca de 1:1.

40. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 39, caracterizado pelo fato de que a cocultura é de 2 horas a 24 horas.

41. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 40, caracterizado pelo fato de que a cocultura está para a ou cerca de 6 horas.

42. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 41, caracterizado pelo fato de que a seleção é realizada usando um classificador de células à base de fluorescência.

43. Método, de acordo com a reivindicação 42, caracteriza- do pelo fato de que o classificador de células à base de fluorescência é um classificador de citometria de fluxo de alto rendimento automati- zado, opcionalmente classificador de células FX500 ou classificador de células Miltenyi Tyto.

44. Método, de acordo com a reivindicação 42 ou 43, carac- terizado pelo fato de que a seleção é por 1 ciclo, 2 ciclos, 3 ciclos ou 4 ciclos pelo classificador de células à base de fluorescência.

45. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 42 a 44, caracterizado pelo fato de que a seleção é realizada a uma taxa entre 10.000 e 100.000 células/segundo usando um coletor de fluidos descartável com base fluorescente.

46. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 45, caracterizado pelo fato de que um ou mais marcadores de super-regulação são proteínas expressas na superfície da célula T que são expressas apenas quando o TCR endógeno das células T reco-

nhece um peptídeo expresso pelas APCs.

47. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 46, caracterizado pelo fato de que um ou mais marcadores de super-regulação são selecionados a partir do grupo que consiste em CD107, CD107a, CD39, CD103, CD137 (4-1BB), CD59, CD69, CD90, CD38, CD30, CD154, CD252, CD134 (OX40), CD258, CD256, PD-1, TIM-3 e LAG-3.

48. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 47, caracterizado pelo fato de que um ou mais marcadores de super-regulação são selecionados a partir do grupo que consiste em CD38, CD39, CD6, CD90, CD134 e CD137.

49. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 48, caracterizado pelo fato de que os um ou mais criadores de super-regulação são CD134 e/ou CD137.

50. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 48, caracterizado pelo fato de que um ou mais marcadores de super-regulação são selecionados a partir do grupo que consiste em CD107, CD107a, CD39, CD103, CD59, CD90, CD38, CD30, CD154, CD252, CD134, CD258 e CD256.

51. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 48 e 50, caracterizado pelo fato de que um ou mais marcado- res de super-regulação são selecionados a partir do grupo que consis- te em CD107a, CD39, CD103, CD59, CD90 e CD38.

52. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 48, 50 e 51, caracterizado pelo fato de que os um ou mais marcadores de super-regulação de T compreendem pelo menos dois marcadores selecionados a partir de CD107a e CD39, CD107a e CD103, CD107a e CD59, CD107a e CD90, CD107a e CD38, CD39 e CD103, CD39 e CD59, CD39 e CD90, CD39 e CD38, CD103 e CD59, CD103 e CD90, CD103 e CD38, CD59 e CD90, CD59 e CD38 e CD90 e CD38.

53. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 50 a 52, caracterizado pelo fato de que um ou mais marcadores de super-regulação de células T compreendem ainda CD137.

54. Método, de acordo com a reivindicação 53, caracteriza- do pelo fato de que um ou mais marcadores de super-regulação de células T compreendem pelo menos dois marcadores selecionados dentre CD107a e CD137, CD38 e CD137, CD103 e CD137, CD59 e CD137, CD90 e CD137 e CD38 e CD137.

55. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 48 a 54, caracterizado pelo fato de que os um ou mais marcado- res de super-regulação compreendem ainda pelo menos um marcador selecionado a partir do grupo que consiste em PD-1, TIM-3 e LAG-3.

56. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 55, caracterizado pelo fato de que a estimulação da primeira população é de 7 a 21 dias, opcionalmente de 7 a 14 dias.

57. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 56, caracterizado pelo fato de que a estimulação da primeira população em um sistema fechado é o uso de um recipiente de cultura permeável a gás.

58. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 56, caracterizado pelo fato de que a estimulação da primeira população em um sistema fechado é realizada usando um biorreator.

59. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 58, caracterizado pelo fato de que a expansão da quarta po- pulação é de 7 a 21 dias, opcionalmente de 7 a 14 dias.

60. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 59, caracterizado pelo fato de que a expansão da quarta po- pulação é realizada em um recipiente de cultura permeável a gás.

61. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica-

ções 1 a 59, caracterizado pelo fato de que a expansão da quarta po- pulação é realizada usando um biorreator.

62. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 61, caracterizado pelo fato de que o tempo de processamento das amostras biológicas contendo a população de linfócitos para a produção das células T expandidas é inferior a 30 dias.

63. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 62, caracterizado pelo fato de que a composição de células expandidas é usada para tratar um paciente com câncer.

64. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 63, caracterizado pelo fato de que o tumor é um tumor de um câncer epitelial.

65. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 64, caracterizado pelo fato de que o tumor é um tumor de um melanoma, pulmão escamoso, adenocarcinoma de pulmão, câncer de bexiga, câncer de células pequenas do pulmão, câncer de esôfago, câncer colorretal (CRC), câncer cervical, câncer de cabeça e pescoço, câncer de estômago ou câncer de útero.

66. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 65, caracterizado pelo fato de que o tumor é um tumor de um câncer de pulmão de células não pequenas (NSCLC), CRC, câncer de ovário, câncer de mama, câncer de esôfago, câncer gástrico, câncer de pâncreas, câncer de colangiocarcinoma, câncer endometrial, opci- onalmente em que o câncer de mama é câncer de mama HR+/Her2-, câncer de mama triplo negativo (TNBC) ou câncer de mama HER2+.

67. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 66, caracterizado pelo fato de que a população de linfócitos da amostra biológica é de linfócitos infiltrantes de tumor, linfócitos linfá- ticos ou células mononucleares de sangue periférico.

68. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica-

ções 1 a 67, caracterizado pelo fato de que a amostra biológica é um tumor e a população de linfócitos da amostra biológica é de linfócitos infiltrantes de tumor.

69. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 68, caracterizado pelo fato de que a primeira população de linfócitos é processada como fragmentos de tumor de um tumor resse- cado, opcionalmente, em que a primeira população de linfócitos é um ou mais fragmentos de tumor do tumor ressecado.

70. Método, de acordo com a reivindicação 69, caracteriza- do pelo fato de que a primeira população de linfócitos é semeada para estimulação no sistema fechado em cerca de 1 fragmento de tumor por 2 cm2.

71. Método, de acordo com a reivindicação 69 ou 70, carac- terizado pelo fato de que o tumor é um melanoma.

72. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 68, caracterizado pelo fato de que a primeira população de linfócitos é processada como uma suspensão de célula única por ho- mogeneização e/ou digestão enzimática de um ou mais fragmentos de tumor de um tumor ressecado.

73. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 68, caracterizado pelo fato de que a primeira população de linfócitos é processada como uma suspensão de célula única por ho- mogeneização e digestão enzimática de um ou mais fragmentos de tumor de um tumor ressecado.

74. Método, de acordo com a reivindicação 72 ou 73, carac- terizado pelo fato de que a digestão enzimática é por incubação com uma colagenase, opcionalmente colagenase IV ou colagenase I/II.

75. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 72 a 74, caracterizado pelo fato de que a primeira população de linfócitos é semeada para estimulação no sistema fechado de cerca de

5 x 105 a ou cerca de 2 x 106 células totais por 2 cm2.

76. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 72 a 75, caracterizado pelo fato de que o tumor é um câncer co- lorretal (CRC).

77. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 76, caracterizado pelo fato de que compreende ainda a coleta de células produzidas pelo método.

78. Método, de acordo com a reivindicação 77, caracteriza- do pelo fato de que compreende a formulação das células colhidas com um crioprotetor.

79. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 78, caracterizado pelo fato de que a população de células T da composição terapêutica expressa maior ou igual a 1 receptor de superfície de célula T que reconhece maior ou igual a 1 antígeno es- pecífico em uma célula alvo que expressa mutações não sinônimas.

80. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 79, caracterizado pelo fato de que a população de células T da composição terapêutica é enriquecida para células T reativas ao tumor ou células T que são positivas na superfície para um ou mais marcadores de super-regulação de células T expressos em células T reativas ou ativadas em comparação com a primeira população de cé- lulas T, opcionalmente em que as células T reativas ao tumor são en- riquecidas de 10 a 1000 vezes.

81. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 79, caracterizado pelo fato de que a população de células T da composição terapêutica é enriquecida para células T reativas ao tumor ou células T que são positivas na superfície para um ou mais marcadores de super-regulação de células T expressos em células T reativas ou ativadas em comparação com a segunda população de células T, opcionalmente em que as células T reativas ao tumor são enriquecidas de 10 a 1000 vezes.

82. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 79, caracterizado pelo fato de que a população de células T da composição terapêutica é enriquecida para células T reativas ao tumor ou células T que são positivas na superfície para um ou mais marcadores de super-regulação de células T expressos em células T reativas ou ativadas em comparação com a terceira população de cé- lulas T, opcionalmente em que as células T reativas ao tumor são en- riquecidas 1,5 a 50 vezes.

83. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 82, caracterizado pelo fato de que a população de células T da composição terapêutica é capaz de produzir IFNgama a uma con- centração maior do que ou cerca de 30 pg/mL, opcionalmente maior do que ou cerca de 60 pg/mL, após estimulação específica do antíge- no.

84. População de células T produzida pelo método como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 83, caracterizada pe- lo fato de que expressa maior ou igual a 1 receptor de superfície de célula T que reconhece maior ou igual a 1 antígeno específico em uma célula alvo que expressa mutações não sinônimas.

85. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende a composição terapêutica de células T produzidas pelo método como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a

83.

86. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindica- ção 85, caracterizada pelo fato de que a população de células T da composição terapêutica expressa maior ou igual a 1 receptor de super- fície de célula T que reconhece maior ou igual a 1 antígeno específico em uma célula alvo que expressa mutações não sinônimas.

87. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindica-

ção 85 ou 86, caracterizada pelo fato de que a população de células T da composição terapêutica é enriquecida para células T reativas ao tumor ou células T que são positivas na superfície para um ou mais marcadores de super-regulação de células T expressos em células T reativas ou ativadas em comparação com a primeira população de cé- lulas T, opcionalmente em que as células T reativas ao tumor são en- riquecidas de 10 a 1000 vezes.

88. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindica- ção 85 ou 86, caracterizada pelo fato de que a população de células T da composição terapêutica é enriquecida para células T reativas ao tumor ou células T que são positivas na superfície para um ou mais marcadores de super-regulação de células T expressos em células T reativas ou ativadas em comparação com a segunda população de células T, opcionalmente em que as células T reativas ao tumor são enriquecidas de 10 a 1000 vezes.

89. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindica- ção 85 ou 86, caracterizada pelo fato de que a população de células T da composição terapêutica é enriquecida para células T reativas ao tumor ou células T que são positivas na superfície para um ou mais marcadores de super-regulação de células T expressos em células T reativas ou ativadas em comparação com a terceira população de cé- lulas T, opcionalmente em que as células T reativas ao tumor são en- riquecidas de 1,5 a 50 vezes.

90. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 85 a 89, caracterizada pelo fato de que a po- pulação de células T da composição terapêutica é capaz de produzir IFNgama em uma concentração maior do que ou cerca de 30 pg/mL, opcionalmente maior do que ou cerca de 60 pg/mL, após estimulação específica do antígeno.

91. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 85 a 90, caracterizada pelo fato de que com- preende uma dose terapêutica das células T.

92. Composição que compreende células T reativas ao tu- mor, caracterizada pelo fato de que pelo menos ou cerca de 40%, pelo menos ou cerca de 50%, pelo menos ou cerca de 60%, pelo menos ou cerca de 70%, pelo menos ou cerca de 80%, ou pelo menos ou cerca de 90% das células totais ou células T totais na composição são célu- las T reativas ao tumor ou são positivas na superfície para um ou mais marcadores de super-regulação de células T expressos em células T reativas ou ativadas.

93. Composição, de acordo com a reivindicação 92, carac- terizada pelo fato de que um ou mais marcadores de super-regulação de células T são selecionados a partir do grupo que consiste em CD107, CD107a, CD39, CD103, CD137 (4-1BB), CD59, CD90, CD38, CD30, CD154, CD252, CD134, CD258, CD256, PD-1, TIM-3 e LAG-3.

94. Composição, de acordo com a reivindicação 92 ou 93, caracterizada pelo fato de que os um ou mais marcadores de super- regulação de células T são CD137 e/ou CD134.

95. Composição, de acordo com a reivindicação 92 ou 93, caracterizada pelo fato de que um ou mais marcadores de super- regulação de células T são selecionados a partir do grupo que consiste em CD107, CD107a, CD39, CD103, CD59, CD90, CD38, CD30, CD154, CD252, CD134, CD258 e CD256.

96. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 92 a 95, caracterizada pelo fato de que um ou mais marcado- res de super-regulação de células T são selecionados a partir do grupo que consiste em CD107a, CD39, CD103, CD59, CD90 e CD38.

97. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 92 a 96, caracterizada pelo fato de que um ou mais marcado- res de super-regulação de células T compreendem pelo menos dois marcadores selecionados a partir de CD107a e CD39, CD107a e CD103, CD107a e CD59, CD107a e CD90, CD107a e CD38, CD39 e CD103, CD39 e CD59, CD39 e CD90, CD39 e CD38, CD103 e CD59, CD103 e CD90, CD103 e CD38, CD59 e CD90, CD59 e CD38 e CD90 e CD38.

98. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 92 a 97, caracterizada pelo fato de que um ou mais marcado- res de super-regulação de células T compreendem ainda CD137.

99. Composição, de acordo com a reivindicação 98, carac- terizada pelo fato de que um ou mais marcadores de super-regulação de células T reativas compreendem pelo menos dois marcadores sele- cionados dentre CD107a e CD137, CD38 e CD137, CD103 e CD137, CD59 e CD137, CD90 e CD137 e CD38 e CD137.

100. Composição, de acordo com qualquer uma das reivin- dicações 92 a 99, caracterizada pelo fato de que um ou mais marcado- res de super-regulação de células T compreendem ainda pelo menos um marcador selecionado a partir do grupo que consiste em PD-1, TIM-3 e LAG-3.

101. Composição, de acordo com qualquer uma das reivin- dicações 92 a 100, caracterizada pelo fato de que as células T são cé- lulas T CD3+ ou compreendem células T CD4+ e/ou células T CD8+.

102. Composição, de acordo com qualquer uma das reivin- dicações 92 a 101, caracterizada pelo fato de que as células T com- preendem células T CD4+ e células T CD8+, em que a relação de cé- lulas T CD8+ para células T CD4+ está entre a ou cerca de 1:100 e a ou cerca de 100:1, entre a ou cerca de 1:50 e a ou cerca de 50:1, en- tre a ou cerca de 1:25 e a ou cerca de 25:1, entre a ou cerca de 1:10 e a ou cerca de 10:1, entre a ou cerca de 1:5 e a ou cerca de 5:1, ou en- tre a ou cerca de 1:2,5 e a ou cerca de 2,5:1.

103. Composição, de acordo com qualquer uma das reivin- dicações 92 a 102, caracterizada pelo fato de que o número de células

T reativas ao tumor ou células T totais positivas na superfície para o marcador de ativação de células T, ou de células viáveis das mesmas, na composição está entre a ou cerca de 0,5 x 108 e a ou cerca de 50 x 109, entre a ou cerca de 0,5 x 108 e a ou cerca de 30 x 109, entre 0,5 x 108 e a ou cerca de 12 x 109, entre a ou cerca de 0,5 x 108 e a ou cer- ca de 60 x 108, entre a ou cerca de 0,5 x 108 e a ou cerca de 15 x 108, entre a ou cerca de 0,5 x 108 e a ou cerca de 8 x 108, entre a ou cerca de 0,5 x 108 e a ou cerca de 3,5x 108, entre a ou cerca de 0,5 x 108 e a ou cerca de 1 x 108, entre 1 x 108 e a ou cerca de 50 x 109, entre a ou cerca de 1 x 108 e a ou cerca de 30 x 109, entre 1 x 108 e a ou cerca de 12 x 109, entre a ou cerca de 1 x 108 e a ou cerca de 60 x 108, entre a ou cerca de 1 x 108 e a ou cerca de 15 x 108, entre a ou cerca de 1 x 108 e a ou cerca de 8 x 108, entre a ou cerca de 1 x 108 e a ou cerca de 3,5x 108, entre a ou cerca de 3,5 x 108 e a ou cerca de 50 x 109, entre a ou cerca de 3,5 x 108 e a ou cerca de 30 x 109, entre a ou cer- ca de 3,5 x 108 e a ou cerca de 12 x 109, entre a ou cerca de 3,5 x 108 e a ou cerca de 60 x 108, entre a ou cerca de 3,5 x 108 e a ou cerca de 15 x 108, entre a ou cerca de 3,5 x 108 e a ou cerca de 8 x 108, entre a ou cerca de 8 x 108 e a ou cerca de 50 x 109, entre a ou cerca de 8 x 108 e a ou cerca de 30 x 109, entre a ou cerca de 8 x 108 e a ou cerca de 12 x 109, entre a ou cerca de 8 x 108 e a ou cerca de 60 x 108, entre a ou cerca de 8 x 108 e a ou cerca de 15 x 108, entre a ou cerca de 15 x 108 e a ou cerca de 50 x 109, entre a ou cerca de 15 x 108 e a ou cerca de 30 x 109, entre a ou cerca de 15 x 108 e a ou cerca de 12 x 109, entre a ou cerca de 15 x 108 e a ou cerca de 60 x 108, entre a ou cerca de 60 x 108 e a ou cerca de 50 x 109, entre a ou cerca de 60 x 108 e a ou cerca de 30 x 109, entre a ou cerca de 60 x 108 e a ou cerca de 12 x 109, entre a ou cerca de 12 x 109 e a ou cerca de 50 x 109, en- tre a ou cerca de 12 x 109 e a ou cerca de 30 x 109, ou entre a ou cer- ca de 30 x 109 e a ou cerca de 60 x 109, cada um inclusive.

104. Composição, de acordo com qualquer uma das reivin- dicações 92 a 103, caracterizada pelo fato de que compreende um ex- cipiente farmaceuticamente aceitável.

105. Composição, de acordo com qualquer uma das reivin- dicações 92 a 104, caracterizada pelo fato de que compreende um cri- oprotetor.

106. Composição, de acordo com qualquer uma das reivin- dicações 92 a 105, caracterizada pelo fato de que é estéril.

107. Método de tratamento de um indivíduo com câncer, caracterizado pelo fato de que compreende a administração a um indi- víduo tendo um tumor de uma dose terapêutica da composição como definida em qualquer uma das reivindicações 85 a 106.

108. Método, de acordo com a reivindicação 107, caracteri- zado pelo fato de que a dose terapeuticamente eficaz está entre 1 x 109 e 10 x 109 células T.

109. Método, de acordo com a reivindicação 107, caracteri- zado pelo fato de que a dose terapeuticamente eficaz é de mais de 1 milhão a menos de 100 milhões de células T por quilograma de peso corporal.

110. Método, de acordo com a reivindicação 107, caracteri- zado pelo fato de que a dose terapeuticamente eficaz é de mais de 1 milhão a menos de 10 milhões de células T por quilograma de peso corporal.

111. Método, de acordo com a reivindicação 107, caracteri- zado pelo fato de que a dose terapeuticamente eficaz é de ou cerca de 10 milhões a ou cerca de 50 milhões de células T por quilograma de peso corporal.

112. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 107 a 111, caracterizado pelo fato de que as células da composi- ção terapêutica são autólogas ao indivíduo.

Etapa do Processo

Processamento de tumor

Petição 870210075771, de 18/08/2021, pág. 298/338 Expansão

Lavagem 1 Sequenciamento Peptídeos individuais Amostra de Tumor do Genoma Completo Lagos de peptídeo Criopreservação

Paciente Cocultura Seleção Expansão Infusão Descongelamento e Lavagem 2 1/35

TIL ou PBL

Cocultura

Lavagem 3

Classificar

Expansão

Lavagem 4

Criopreservação