BR112021013791A2

BR112021013791A2 - Parâmetros para concentração e lavagem de partículas com acústica

Info

Publication number: BR112021013791A2
Application number: BR112021013791-2A
Authority: BR
Inventors: Benjamin Ross-Johnsrud; Bart Lipkens
Original assignee: Flodesign Sonics, Inc.
Priority date: 2019-01-21
Filing date: 2020-01-21
Publication date: 2021-09-21
Also published as: WO2020154334A9; JP2022518009A; US20210355479A1; CN113518820A; EP3914695A4; AU2020211945A1; SG11202107453WA; CA3126826A1; WO2020154334A1; EP3914695A1; KR20210105443A; IL284606A

Abstract

parâmetros para concentração e lavagem de partículas com acústica. a presente invenção refere-se a dispositivos multiestágios de acustoforese para separar continuamente um fluido secundário e particulado de um fluido hospedeiro. métodos para operação dos dispositivos multiestágios de acustoforese são também descritos. os sistemas podem incluir múltiplos dispositivos de acustoforese conectados fluidicamente um ao outro em série, cada dispositivo acustoforético compreendendo uma câmara de fluxo, um transdutor ultrassônico capaz de criar uma onda estacionária acústica multidimensional e um refletor. os sistemas podem incluir adicionalmente bombas e fluxômetros.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "PARÂME-

TROS PARA CONCENTRAÇÃO E LAVAGEM DE PARTÍCULAS COM ACÚSTICA". Antecedentes da Invenção

[0001] Concentrar células terapêuticas e transferi-las de uma solu- ção para outra (geralmente referido como lavagem) são dois processos envolvidos em múltiplos estágios de produção e uso das células. A la- vagem e separação de materiais em processamento celular é uma parte importante da eficácia global da terapia celular de escolha. Especifica- mente, as células terapêuticas podem originalmente ser suspensas em um soro de crescimento ou em materiais conservantes como dimetilsul- fóxido (DMSO). Separar as células desses fluidos para que as células possam ser processadas mais é importante no processo terapêutico glo- bal para o uso de tais materiais celulares. Em um exemplo, as células são tipicamente recuperadas de um biorreator, concentradas e transfe- ridas do meio de cultura para um tampão de eletroporação antes da transdução, tal como na produção de células CAR-T. Depois de sua ex- pansão na etapa final de produção, as células são concentradas e trans- feridas para um solvente adequado dependendo da aplicação desejada.

[0002] As células terapêuticas são armazenadas em meios especi- alizados para prolongar a viabilidade dessas células quer através de processos de refrigeração e/ou congelamento. Tal meio especializado pode não ser compatível quando as células terapêuticas são introduzi- das em um paciente. Pode ser, portanto, de ajuda lavar e concentrar as células terapêuticas em um tampão ou meio de lavagem que seja bio- compatível com ambos, as células terapêuticas e o paciente. Esses pro- cessos de lavagem e concentração convencionalmente envolvem o uso de centrifugação e filtração física. A etapa de lavagem pode ser repetida várias vezes. Por exemplo, o meio especializado (que pode ser pirogê- nico ou do contrário nocivo) pode ser totalmente removido com múltiplas etapas de lavagem, e as células podem ser suspensas em um novo tampão ou solução de lavagem. Durante esse processo de lavagem, muitas das células são degradadas ou destruídas através dos proces- sos de centrifugação e filtração física. Além do mais, o processo de fil- tração pode ser bastante ineficiente e implicar em intrusão não estéril no ambiente para o processamento de lotes, pelo qual a cultura celular é exposta a possíveis patógenos ou influências celulares externas que seriam prejudiciais para a cultura celular alvo. Ainda mais, com esses processos de filtração física, são gerados resíduos biológicos através do uso de múltiplos filtros físicos, o que incorrer em etapas adicionais para o descarte apropriado. O custo e a periodicidade desse processo não conduzem também para um processo rápido e de custo baixo de preparação das células para introdução no paciente. Breve sumário da invenção

[0003] A presente invenção provê métodos e sistemas para substi- tuir ou aumentar os processos convencionais de centrifugação e filtra- ção física juntamente com as múltiplas etapas de lavagem por um pro- cesso mais simples, de custo menor e mais amigável para partículas como células terapêuticas. Os métodos / processos podem ser realiza- dos em um ambiente estéril e de forma contínua.

[0004] São aqui descritos métodos para lavagem de partículas, as quais podem ser células. Em alguns métodos de exemplo, uma mistura inicial de um primeiro meio e as partículas é alimentada a uma câmara de fluxo de um dispositivo acustoforético. O primeiro meio pode conter conservantes, como dimetilsulfóxido (DMSO), que são indesejáveis para aplicações / usos futuros das partículas. O dispositivo acustoforé- tico possui pelo menos um transdutor ultrassônico que inclui um material piezoelétrico e é configurado para ser direcionado e criar uma onda es- tacionária acústica multidimensional na câmara de fluxo. Pelo menos uma porção das partículas é capturada na onda estacionária acústica multidimensional. Um segundo meio é circulado através da câmara de fluxo para lavar o primeiro meio enquanto as partículas ficam retidas na onda estacionária acústica multidimensional. As partículas podem, as- sim, experimentar uma troca do meio, em que o primeiro meio é trocado pelo segundo meio.

[0005] Em alguns exemplos, o volume do segundo meio usado para realizar o processo de lavagem pode ser equivalente a um volume da câmara de fluxo. Em alguns exemplos, o volume do segundo meio usado para o processo de lavagem pode ser múltiplos de ou porções do volume da câmara de fluxo. O segundo meio pode ser uma solução bi- ocompatível de lavagem ou tampão.

[0006] As partículas podem ser células. As células podem ser célu- las do ovário de hamster chinês (CHO), células de hibridoma NSO, cé- lulas renais de filhotes de hamster (BHK), células humanas, células T reguladoras, células T Jurkat, células CAR-T, células B ou células NK, células mononucleares do sangue periférico (PBMCs), células de algas, plantas, bactérias ou vírus. As células podem ser aderidas a microtrans- portadores.

[0007] Às vezes, o material piezoelétrico de pelo menos um trans- dutor ultrassônico está na forma de um arranjo piezoelétrico formado por uma pluralidade de elementos piezoelétricos. Cada elemento piezo- elétrico pode estar fisicamente separado dos elementos piezoelétricos em volta por um material de envasamento (potting). O arranjo piezoelé- trico pode estar presente em um único cristal, com um ou mais canais separando os elementos piezoelétricos uns dos outros. Cada elemento piezoelétrico pode ser conectado individualmente a seu próprio par de eletrodos. Os elementos piezoelétricos podem ser operados em fase um com outro, ou operado fora de fase um com outro. O dispositivo acusto- forético pode compreender adicionalmente uma unidade de resfria- mento para resfriar ao menos um transdutor ultrassônico.

[0008] Em várias modalidades, a mistura inicial pode ter uma den- sidade entre aproximadamente 0,5 milhão de partículas/mL e 5 milhões de partículas/mL. O volume do concentrado pode ser 25 a aproximada- mente 50 vezes menor do que um volume da mistura inicial. O volume do concentrado pode ter uma densidade de partículas de 25 a aproxi- madamente 50 vezes maior do que uma densidade de partículas da mistura inicial.

[0009] Além disso, são descritos, em várias modalidades, métodos para recuperar maios de 90% das células de uma cultura celular. Uma mistura inicial de um primeiro meio e a cultura celular é alimentada atra- vés da câmara de fluxo de um dispositivo acustoforético, em que o dis- positivo acustoforético compreende pelo menos um transdutor ultrassô- nico incluindo um material piezoelétrico que é configurado para ser di- recionado e criar uma onda estacionária acústica multidimensional na câmara de fluxo. Pelo menos um transdutor ultrassônico é direcionado para criar uma onda estacionária acústica multidimensional na câmara de fluxo e, assim, concentrar a cultura celular dentro da onda estacio- nária acústica. A mistura inicial tem uma densidade celular inicial entre aproximadamente 0,5 milhão de células/mL e 5 milhões de células/mL, e a cultura celular concentrada tem uma densidade celular pelo menos vezes maior do que a densidade celular inicial.

[0010] Em algumas modalidades, a cultura celular concentrada tem uma densidade celular de 25 a aproximadamente 50 vezes maior do que a densidade celular inicial. Em outras modalidades, um volume da cultura celular concentrada é 25 a aproximadamente 50 vezes inferior a um volume da mistura inicial. A cultura celular concentrada pode ser obtida em aproximadamente 35 minutos ou menos.

[0011] Além disso, são descritos dispositivo acustoforético que compreendem: uma câmara de fluxo que tem uma entrada para fluido, uma primeira saída e uma segunda saída; pelo menos um transdutor ultrassônico próximo de uma primeira parede da câmara de fluxo, pelo menos um transdutor ultrassônico incluindo um material piezoelétrico que é adaptado para ser direcionado e criar uma onda estacionária acústica multidimensional; um refletor em uma segunda parede da câ- mara de fluxo, do lado oposto a pelo menos um transdutor ultrassônico; e um gerador termoelétrico localizado entre pelo menos um transdutor ultrassônico e a primeira parede da câmara de fluxo.

[0012] O dispositivo acustoforético pode ter um volume do concen- trado entre aproximadamente 25 mL e 75 mL. O dispositivo acustoforé- tico pode ter uma capacidade para células entre aproximadamente 4 bilhões e 40 bilhões de células. Várias linhas podem conectar o dispo- sitivo acustoforético a recipientes que fornecem ou recebem vários ma- teriais para / do dispositivo acustoforético.

[0013] Essas e outras características não limitantes são mais parti- cularmente descritas abaixo. Breve descrição dos desenhos

[0014] A seguir, é apresentada uma breve descrição dos desenhos, os quais são apresentados para fins de ilustrar as modalidades de exemplo aqui descritos e não para fins de limitar as mesmas.

[0015] A Figura 1 ilustra um processo de acustoforese de exemplo usando um transdutor e um refletor para criar uma onda estacionária acústica e capturar partículas e separá-las de um fluido por deposição gravitacional aumentada.

[0016] A Figura 2 ilustra um exemplo de processo de concentração e lavagem de células ("diafiltração") de acordo com a presente invenção usando acustoforese.

[0017] A Figura 3 ilustra outro exemplo de processo de concentra- ção e lavagem de células (empuxo) de acordo com a presente invenção usando acustoforese.

[0018] A Figura 4 mostra seis fotografias que, da esquerda para di- reita e de cima para baixo, mostram a progressão das células sendo capturadas em um dispositivo acustoforético antes que uma mistura do segundo meio (corado de azul) seja circulada no dispositivo e gradual- mente substitua o primeiro meio (corado de vermelho).

[0019] A Figura 5[7] é um gráfico mostrando o desempenho de um dispositivo acustoforético. O eixo x é o tempo decorrido (minutos) e vai de O a 40 em incrementos de 5. O eixo y do lado esquerdo é redução na densidade do permeado (%) e vai de O a 100 em incrementos de 10. O eixo y do lado direito é a densidade celular do permeado (x106 célu- las/mL) e vai de 0,00 a 2,00 em incrementos de 0,20. A linha contínua superior representa a redução da densidade do permeado (%). A linha contínua inferior representa a densidade celular do permeado. A linha do meio, traçada substancialmente no sentido horizontal da página, re- presenta a densidade celular da alimentação para fins de referência.

[0020] A Figura 6[14] é um gráfico mostrando o desempenho na concentração de células T de um processo acustoforético de acordo com a presente invenção com uma cultura de baixa densidade celular. O eixo x é o tempo decorrido (minutos) e vai de O a 25 em incrementos de 5. O eixo y do lado esquerdo é o percentual de redução (%) e vai de O a 100 em incrementos de 10. O eixo y do lado direito é a densidade celular (x10º células/mL) e vai de 0,00 a 1,60 em incrementos de 0,20. A linha contínua superior representa a redução no permeado (%). A li- nha contínua inferior representa a densidade celular do permeado. À linha tracejada representa a densidade celular da alimentação para fins de referência.

[0021] A Figura 7[15] é um gráfico mostrando a dependência do per- centual de redução da densidade (PDR) na concentração e vazão de um processo acustoforético de acordo com a presente invenção. O eixo x é o tempo (minutos) e vai de O a 40 em incrementos de 5. O eixo y é a redução na densidade do permeado (%) e vai de O a 100 em incre- mentos de 10. A linha com pontos de dados em forma de círculo repre- senta uma mistura com uma concentração celular inicial de 5x106 célu- las/mL. A linha com pontos de dados em forma de x representa uma mistura com uma concentração celular inicial de 3x106 células/mL. À linha com pontos de dados em forma de triângulo representa uma mis- tura com uma concentração celular inicial de 1x106 células/mL em uma vazão de 20 mL/minuto. A linha com pontos de dados em forma de lo- sango representa uma mistura com uma concentração celular inicial de 1x106 células/mlL em uma vazão de 10 mL/minuto.

[0022] A Figura 8[16] é um gráfico mostrando o desempenho de cé- lulas T para um processo acustoforético de acordo com a presente in- venção com uma cultura de alta densidade celular. O eixo x é o tempo decorrido (minutos) e vai de O a 25 em incrementos de 5. O eixo y do lado esquerdo é o percentual de redução (%) e vai de 0 a 100 em incre- mentos de 10. O eixo y do lado direito é a densidade celular (x10º célu- las/mL) e vai de 0,00 a 3,00 em incrementos de 0,50. A linha contínua superior representa a redução na densidade do permeado (%). A linha contínua inferior representa a densidade celular do permeado. A linha tracejada representa a densidade celular da alimentação para fins de referência.

[0023] A Figura 9[17]A é uma vista em perspectiva de um exemplo de dispositivo acustoforético de acordo com a presente invenção inclu- indo uma unidade de resfriamento para resfriar o transdutor. A Figura 9[17]B é uma vista explodida do dispositivo da Figura 9[17]A.

[0024] A Figura 10[18] é um gráfico mostrando o perfil de tempera- tura de um dispositivo acustoforético sem resfriamento ativo. O eixo x é o tempo decorrido (minutos) e vai de 0,00 a 20,00 em incrementos de 2,00. O eixo y é a temperatura (ºC) e vai de 17,00 a 33,00 em incremen- tos de 2,00. A linha inferior ao longo do lado direito do gráfico representa a temperatura da alimentação (ºC). A linha superior ao longo do lado direito do gráfico representa a temperatura do núcleo (ºC). A linha do meio ao longo do lado direito do gráfico representa a temperatura do permeado (ºC).

[0025] A Figura 11[19] é um gráfico mostrando o perfil de tempera- tura de um dispositivo acustoforético com resfriamento ativo do transdu- tor. O eixo x é o tempo decorrido (minutos) e vai de 0,00 a 20,00 em incrementos de 2,00. O eixo y é a temperatura (ºC) e vai de 17,00 a 33,00 em incrementos de 2,00. A linha inferior ao longo do lado direito do gráfico representa a temperatura da alimentação (ºC). A linha supe- rior ao longo do lado direito do gráfico representa a temperatura do nú- cleo (ºC). A linha do meio ao longo do lado direito do gráfico representa a temperatura do permeado (ºC).

[0026] A Figura 12/20] ilustra um processo para concentrar, lavar e/ou separar microtransportadores e células de acordo com a presente invenção. A parte mais à esquerda representa uma primeira etapa de recebimento dos complexos de microtransportadores e células envolvi- dos por um soro do biorreator desde um biorreator e concentração dos complexos microtransportador/célula em um dispositivo acustoforético de acordo com a presente invenção. A parte do meio representa uma segunda etapa de lavagem dos microtransportadores concentrados com células aderidas para remover o soro do biorreator. A parte mais à direita representa uma terceira etapa de tripsinização, ou dissociação, dos microtransportadores e células e uma quarta etapa de separação dos microtransportadores das células. A porção inferior representa uma etapa final de lavagem e concentração que pode ser empregada se de- sejado.

[0027] A Figura 13[24] mostra a concentração de microtransporta- dores com células T aderidas na alimentação para o dispositivo acusto-

forético (linha superior das fotografias) e a concentração de microtrans- portadores e células T separados no permeado extraído do dispositivo acustoforético (linha inferior das fotografias). Os itens circulares escuros indicam microtransportadores, e a área mais clara indica células T.

[0028] A Figura 14[25] mostra imagens microscópicas da concen- tração de microtransportadores com células T aderidas na alimentação e a concentração de microtransportadores e células T separados no permeado.

[0029] A Figura 15/26] é uma representação esquemática de um exemplo de sistema acustoforético de acordo com a presente invenção mostrando o caminho do fluxo do material de alimentação através do sistema.

[0030] A Figura 16[27] é uma representação esquemática do exem- plo de sistema acustoforético da Figura 28 mostrando o caminho do fluxo do material de lavagem através do sistema.

[0031] A Figura 17[28] é uma representação esquemática do exem- plo de sistema acustoforético da Figura 28 mostrando o escoamento do sistema.

[0032] A Figura 18[29] é um gráfico de dois eixos mostrando os re- sultados do ensaio A. O eixo y do lado esquerdo é o percentual de re- dução de células no permeado, e vai de 0 a 100% em intervalos de 20%. O eixo y do lado direito é a densidade celular do permeado em unidades de milhão de células/mL, e vai de O a 1,00 em intervalos de 0.20. O eixo xé o tempo decorrido em minutos, e vai de O a 33 minutos em intervalos de 3. A linha pontilhada indica a densidade celular inicial, que era 0,98 milhão de células/mL.

[0033] A Figura 19[30] é um gráfico de dois eixos mostrando os re- sultados do ensaio B. O eixo y do lado esquerdo é o percentual de re- dução de células no permeado, e vai de 0 a 100% em intervalos de 20%. O eixo y do lado direito é a densidade celular do permeado em unidades de milhão de células/mL, e vai de O a 1,00 em intervalos de 0,20. O eixo xé o tempo decorrido em minutos, e vai de O a 33 minutos em intervalos de 3. A linha pontilhada indica a densidade celular inicial, que era 0,85 milhão de células/mL.

[0034] A Figura 20[31] é um gráfico de dois eixos mostrando os re- sultados do ensaio C. O eixo y do lado esquerdo é o percentual de re- dução de células, e vai de O a 100% em intervalos de 20%. O eixo y do lado direito é a densidade celular em unidades de milhão de células/mL, e vai de O a 4,00 em intervalos de 1,00. O eixo x é o tempo decorrido em minutos, e vai de O a 30 minutos em intervalos de 3. A linha ponti- lhada indica a densidade celular inicial, que era 4,08 milhões de célu- las/mL.

[0035] A Figura 21[33] é um gráfico mostrando a viabilidade de cé- lulas no processo de lavagem de concentrado.

[0036] A Figura 22[34] é um gráfico mostrando a densidade celular versus potência.

[0037] A Figura 23[35] é um diagrama em corte lateral de um dispo- sitivo de concentração e lavagem para aplicações de baixa densidade celular com um refletor facetado e a dispositivo de concentração e lava- gem para aplicações de alta densidade celular com um refletor plano.

[0038] A Figura 24/36] é um diagrama em corte lateral dos disposi- tivos na Figura 35 mostrando a operação dos dispositivos com aplica- ções de baixa e alta densidade celular.

[0039] A Figura 25[37] é uma série de fotografias mostrando o pro- cessamento de células T com o dispositivo de concentração e lavagem.

[0040] A Figura 26[38] é um gráfico mostrando a densidade de cé- lulas residuais viáveis ao longo do tempo. Descrição detalhada da invenção

[0041] A presente invenção pode ser compreendida mais pronta- mente por referência à descrição detalhada seguinte de modalidades desejadas e dos exemplos incluídos na mesma. No relatório descritivo a seguir e nas reivindicações que se seguem, será feita referência a vários termos que serão definidos para que tenham os seguintes signi- ficados.

[0042] Embora termos específicos sejam usados na descrição a se- guir por uma questão de clareza, a intenção é que esses termos se re- firam somente à estrutura em particular das modalidades selecionadas para ilustração nos desenhos, e não se destinam a definir ou limitar o âmbito da descrição. Nos desenhos e na descrição abaixo a seguir, de- verá ser entendido que designações numéricas semelhantes se referem a componentes de função semelhante. Além disso, deve-se entender que os desenhos não estão em escala.

[0043] As formas no singular "um", "uma", "o" e "a" incluem referen- tes no plural a menos que o contexto indique claramente o contrário.

[0044] Neste relatório descritivo e nas reivindicações, o termo "com- preender" pode incluir as modalidades "consistir em" e "consistir essen- cialmente em". Os termos "compreende(m)", "inclui(em)", "tendo", "tem", "pode", "contém(êm)" e variantes dos mesmos, neste relatório descri- tivo, destinam-se a ser expressões transicionais, termos ou palavras abertas que requerem a presença dos componentes/etapas nomeados e permitem a presença de outros componentes/etapas. No entanto, tal descrição deve ser interpretada no sentido de descrever também com- posições ou processos como "que consistem em" e "que consistem es- sencialmente em" os componentes/etapas enumerados, que permite a presença de somente os componentes/etapas nomeados, juntamente com quaisquer impurezas que poderiam resultar dos mesmos, e exclui outros componentes/etapas.

[0045] Deve-se entender que os valores numéricos incluem valores numéricos que são iguais quando reduzidos pelo mesmo número de nú- meros significativos e valores numéricos que diferem do valor declarado por menos do que o erro experimental da técnica de medição convenci- onal do tipo descrito no presente pedido de patente para determinar o valor.

[0046] Todas as faixas aqui descritas incluem as extremidades re- citadas e independentemente combináveis (por exemplo, a faixa de "en- tre 2 gramas e 10 gramas" inclui as extremidades, 2 gramas e 10 gra- mas, e todos os valores intermediários).

[0047] Um valor modificado por um termo ou termos, como "aproxi- madamente" e "substancialmente", pode não ser limitado ao valor pre- ciso especificado. A linguagem de aproximação pode corresponder à precisão de um instrumento para medir o valor. Deve-se também consi- derar que o modificador "aproximadamente" descreve a faixa definida pelos valores absolutos das duas extremidades. Por exemplo, a expres- são "entre aproximadamente 2 e 4" também descreve a faixa "de 2 a 4".

[0048] Deve-se notar que muitos dos termos aqui usados são ter- mos relativos. Por exemplo, os termos "superior" e "inferior" são relati- vos um ao outro em termos de localização, por exemplo, um compo- nente superior está localizado em uma elevação mais alta do que um componente inferior em uma dada orientação, mas esses termos podem mudar se o dispositivo for invertido. Os termos "entrada" e "saída" são relativos a um fluido passa através delas com respeito a uma dada es- trutura, por exemplo, um fluido passa através da entrada para dentro da estrutura e passa através da saída para fora da estrutura. Os termos "a montante" e "a jusante" são relativos à direção na qual um flui passa através de vários componentes, por exemplo, o fluxo flui através de um componente a montante antes de fluir através do componente a jusante. Deve-se notar que, em uma alça, um primeiro componente pode ser descrito como estando tanto a montante como a jusante de um segundo componente.

[0049] Os termos "horizontal" e "vertical" são usados para indicar a direção em relação a uma referência absoluta, por exemplo, nível do solo. Os termos "para cima" e "para baixo" são também relativos contra uma referência absoluta, um fluxo para cima está sempre contra a gra- vidade da terra.

[0050] O presente pedido de patente refere-se "à mesma ordem de magnitude". Dois números são da mesma ordem de magnitude se o quociente do número maior dividido pelo número menor for um valor igual a pelo menos 1 e inferior a 10.

[0051] A tecnologia de acustoforese da presente invenção emprega ondas estacionárias acústicas para concentrar, lavar e/ou separar ma- teriais (tais como partículas ou um fluido secundário) em um fluido pri- mário ou hospedeiro. Especificamente, como mostrado na imagem su- perior esquerda (A) da Figura 1, um transdutor ultrassônico T cria uma onda acústica no fluido, que interage com um refletor R posicionado em frente do transdutor ultrassônico para criar uma onda estacionária acús- tica. Embora um refletor R esteja ilustrado na Figura 1, outro transdutor pode ser usado para refletir e/ou gerar energia acústica para formar a onda estacionária acústica.

[0052] Como mostrado na imagem superior direita (B) da Figura 1, enquanto o fluido hospedeiro e o material arrastado no fluido hospedeiro movem-se para cima através da onda estacionária acústica, a(s) onda(s) estacionária(s) acústica(s) captura(m) (retém ou detém) o material (por exemplo, materiais de fase secundária, incluindo fluidos e/ou partícu- las). A dispersão do campo acústico para fora do material resulta em uma força de radiação acústica tridimensional, que atua como um campo de captura tridimensional.

[0053] A força de radiação acústica tridimensional gerada em con- junto com uma onda estacionária ultrassônica é referida na presente invenção como uma onda estacionária tridimensional ou multidimensio- nal. A força de radiação acústica é proporcional ao volume da partícula (por exemplo, o cubo do raio) do material quando a partícula for pe- quena em relação ao comprimento de onda. A força de radiação acús- tica é proporcional à frequência e ao fator de contraste acústico. A força de radiação acústica ascende com a potência acústica (por exemplo, o quadrado da amplitude da pressão acústica). Para excitação harmônica, a variação espacial sinusoidal da força impulsiona as partículas para as posições estáveis dentro das ondas estacionárias. Quando a força de radiação acústica exercida sobre as partículas for mais forte do que o efeito combinado de força de arrasto e flutuabilidade do fluido e força gravitacional, a partícula pode ser capturada dentro do campo da onda estacionária acústica, como mostrado na imagem superior à direita (B) da Figura 1.

[0054] Como pode ser visto na imagem inferior esquerda (C) da Fi- gura 1, essa captura resulta em coalescência, aglutinação, agregação, aglomeração e/ou agrupamento das partículas capturadas. Além disso, forças secundárias entre as partículas, como forças de Bjerkness, aju- dam na aglomeração das partículas.

[0055] À medida que as partículas continuam a coalescer, aglutinar, agregar, aglomerar e/ou agrupar, as partículas podem crescer até certo tamanho no qual as forças gravitacionais sobre o agrupamento das par- tículas superam a força de radiação acústica. Em tal tamanho, o agru- pamento das partículas pode cair da onda estacionária acústica, como mostrado na imagem inferior direita (D) da Figura 1.

[0056] Desejavelmente, o(s) transdutor(es) ultrassônico(s) gera(m) uma onda estacionária acústica tridimensional ou multidimensional no fluido que exerce uma força lateral sobre as partículas suspensas para acompanhar a força axial force de modo a aumentar as capacidades de captura de partículas da onda estacionária. Uma onda estacionária acústica plana ou unidimensional pode fornecer forças acústicas na di- reção axial ou na direção de propagação da onda. A força lateral na geração de onda acústica plana ou unidimensional pode ser de duas ordens de magnitude menor do que a força axial. A onda estacionária acústica multidimensional pode fornecer uma força lateral que é signifi- cativamente maior doe que aquela da onda estacionária acústica plana. Por exemplo, a força lateral pode ser da mesma ordem de magnitude que a força axial na onda estacionária acústica multidimensional.

[0057] As ondas estacionárias acústicas da presente invenção po- dem ser usadas para capturar partículas (por exemplo, células terapêu- ticas como células T, células B, células NK) suspensas em um primeiro meio na onda estacionária. O primeiro meio pode então ser substituído por um segundo meio (por exemplo, uma solução biocompatível de la- vagem ou tampão). Colocado de outra maneira, o fluido hospedeiro das partículas pode ser substituído. Antes de substituir o primeiro meio pelo segundo meio, pode-se usar acustoforese para realizar um processo de diafiltração, como mostrado na Figura 2.

[0058] Na Figura 2, a partir de uma mistura inicial que tem uma baixa densidade celular, por exemplo, inferior a 1x10º células/mL, pode- se usar acustoforese para reduzir o volume da mistura inicial, por exem- plo, em pelo menos 10x, incluindo 20x e até 100x ou mais. A concentra- ção de células pode ser aumentada em pelo menos 10x, incluindo 20x e até 100x ou mais. Esse processo de redução inicial é a primeira etapa de redução do volume (A). Em seguida, o segundo meio (por exemplo, uma solução biocompatível de lavagem ou tampão) pode ser introdu- zido para pelo menos deslocar parcialmente o primeiro meio, como in- dicado na etapa (B). Em seguida, a nova mistura das células e segundo meio pode ser submetida a uma etapa de redução de volume por acus- toforese (C). Essa série de operações é referida como um processo de "diafiltração".

[0059] A Figura 3 ilustra um processo de etapa única de empuxo, no qual partículas / células são capturadas na onda estacionária acús- tica e detidas no dispositivo acustoforético. O segundo meio (por exem- plo, uma solução biocompatível de lavagem ou tampão) é então circu- lado no dispositivo acustoforético para efetivamente "lavar" o primeiro meio. Com o processo de empuxo, mais de 90%, incluindo até 99% ou mais do primeiro meio pode ser removido das partículas / células. O processo de empuxo pode ser empregado como um processo contínuo de uso único que usa menos solução tampão e menos tempo do que o processo de diafiltração da Figura 2. Os volumes alimentados para o processo podem ser de 500 mL a 3 litros, o tempo de processamento pode ser inferior a 60 minutos, a densidade da alimentação de entrada pode ser entre menos de aproximadamente um milhão de células por mL (1M/mL) a quarenta milhões de células por mL (40M/mL). O pro- cesso não tem efeito sobre a viabilidade das células, e o volume do concentrado final é inferior a 7 mL com 1M/mL e inferior a 50 mL com 40M/mL. O fator de concentração, partindo de uma concentração inicial de 1 M/mL é 15 vezes, por exemplo, 105 mL a 7 mL, e de uma concen- tração inicial de 40 M/mL é 140 vezes, por exemplo, 7 L a 50 mL.

[0060] A Figura 4 mostra seis fotografias que, da esquerda para a direita e de cima para baixo, mostram a progressão das células sendo capturadas em um dispositivo acustoforético antes que uma mistura do segundo meio (corada de azul) seja circulada no dispositivo e substitua gradualmente o primeiro meio (corado de vermelho). Na Figura 4, usou- se um volume de alimentação de 150 mL com 80 mL de lavagem do meio de eletroporação para o segundo meio. O concentrado foi extraído com uma vazão de 10 mL/minuto. Como pode ser visto nessas figuras, com o passar do tempo, o primeiro meio é substituído pelo segundo meio.

[0061] A Figura 5[7] é um gráfico mostrando o desempenho de um dispositivo acustoforético operado em uma frequência fixa de 2,234 MHz para uma mistura com uma densidade celular na alimentação de aproximadamente 1,5x106 células/mL. Como pode ser visto, o disposi- tivo alcançou uma redução na densidade do permeado (PDR) superior a 95% durante aproximadamente 35 minutos e uma densidade celular do permeado inferior a 0,10x106 células/mL ao longo do mesmo perí- odo.

[0062] O(s) transdutor(es) piezoelétrico(s) dos dispositivos acusto- foréticos e sistemas da presente invenção pode(m) ser materiais piezo- elétricos monolíticos únicos ou pode(m) ser produzido(s) a partir de um arranjo de materiais piezoelétricos. O material piezoelétrico pode ser um material cerâmico, um cristal ou um policristal, como PZT-8 (titanato zir- conato de chumbo).

[0063] A eficiência da concentração do dispositivo acustoforético foi testada. Primeiramente, foi usada uma suspensão de células T tendo uma densidade celular de 1x108º células/mL. Um volume de alimentação entre aproximadamente 500 e 1000 mL foi usado com uma vazão de 10-15 mL/minuto. Os resultados estão representados graficamente na Figura 6[14]. O dispositivo exibiu um fator de concentração entre 10x e 20x, uma recuperação celular de 90% e uma eficiência de lavagem de 77% (ou seja, a quantidade do primeiro meio que foi deslocada pelo segundo meio) durante dez minutos de testagem. Foi observado um au- mento na temperatura de 10 ºC.

[0064] Uma mistura de levedura foi então usada para testar a de- pendência do percentual de redução da densidade (PDR) na concentra- ção e vazão. Os resultados estão representados graficamente na Fi- gura 7[15]. Como visto aqui, as concentrações celulares iniciais mais altas resultaram geralmente em maior PDR. Além disso, a variação na vazão (de 20 mL/minuto para 10 mL/minuto) não teve um efeito obser- vado sobre o PDR.

A eficiência da concentração do dispositivo acustoforético foi nova- mente testada com uma densidade celular maior. Uma suspensão de células T com uma densidade celular de 5x106 células/mL foi usada. Usou-se um volume de alimentação de 1000 mL com uma vazão de 10- mL/minuto. Os resultados estão representados graficamente na Fi- gura 8[16]. O dispositivo exibiu um fator de concentração melhor do que 10x, uma recuperação celular de 90% e uma eficiência de lavagem de 77% durante uma hora de testagem. Um aumento na temperatura de 10 ºC foi novamente observado.

[0100] Durante a testagem, foi também verificado que o resfíria- mento ativo do transdutor ultrassônico levou a maior rendimento e efici- ência e a mais potência. Assim, uma unidade de resfriamento foi desen- volvida para resfriar ativamente o transdutor. A Figura 9[17]A ilustra um dispositivo acustoforético 7000 contendo uma unidade de resfriamento, em uma condição de totalmente montado. A Figura 9[17]B ilustra o dis- positivo 7000, com os vários componentes em uma vista parcialmente explodida. Com referência agora à Figura 9[17]B, o dispositivo inclui um transdutor ultrassônico 7020 e um refletor 7050 em paredes opostas de uma câmara de fluxo 7010. Note-se que o refletor 7050 pode ser feito de um material transparente, de tal modo que o interior da câmara de fluxo 7010 possa ser visto. O transdutor ultrassônico está próximo de uma primeira parede da câmara de fluxo. O refletor está próximo de uma segunda parede da câmara de fluxo ou pode formar a segunda parede da câmara de fluxo. Uma unidade de resfriamento 7060 está localizada entre o transdutor ultrassônico 7020 e a câmara de fluxo 7010. A uni- dade de resfriamento 7060 é acoplada termicamente ao transdutor ul- trassônico 7020. Nessa figura, a unidade de resfriamento está na forma de um gerador termoelétrico, que converte o fluxo de calor (ou seja, as diferenças de temperatura) em energia elétrica usando o efeito de See- beck, removendo, assim, o calor da câmara de fluxo. Colocado de outra maneira, pode-se gerar eletricidade a partir do calor residual não dese- jado durante a operação do dispositivo acustoforético.

[0101] Note-se que as várias entradas e saídas (por exemplo, en- trada para fluido, saída para concentrado, saída para permeado, saída para recirculação, saída de escape / coleta) da câmara de fluxo não são mostradas aqui. A unidade de resfriamento pode ser usada para resfriar o transdutor ultrassônico, o que pode ser especialmente vantajoso quando o dispositivo tiver que operar continuamente com processa- mento e recirculação repetidos por um período prolongado de tempo (por exemplo, perfusão).

[0102] Alternativamente, a unidade de resfriamento pode também ser usada para resfriar o fluido que atravessa a câmara de fluxo 7010. Para aplicações desejadas, a cultura celular deve ser mantida em torno da temperatura ambiente (-20 ºC) e, no máximo, em torno de 28 ºC. Isso por que, quando as células experimentam temperaturas mais ele- vadas, as suas taxas metabólicas aumentam. Sem uma unidade de res- friamento, no entanto, a temperatura da cultura celular pode se elevar até 34 ºC.

[0103] Esses componentes são modulares e podem ser mudados ou trocados separadamente um do outro. Portanto, quando novas revi- sões ou modificações são feitas a um dado componente, o componente pode ser substituído enquanto o resto do sistema permanece o mesmo.

[0104] O objetivo é começar com uma bolsa de cultura que tenha um volume entre aproximadamente 1 litro (L) e 2 litros e uma densidade de aproximadamente 1 milhão de células/mL, concentrar essa bolsa até um volume entre aproximadamente 25 mL e 30 mL e, então, lavar o meio de crescimento ou trocar o meio em um período de aproximada- mente 1 hora (ou menos). Desejavelmente, o sistema pode ser feito de materiais que são estáveis quando irradiados com radiação gama.

[0105] As vantagens de prover uma unidade de resfriamento para o Figura 10[18] mostra graficamente o perfil de temperatura do dispositivo acustoforético sem qualquer resfriamento ativo (por exemplo, sem uma unidade de resfriamento para o transdutor). Como visto na Figura 10[18], a diferença de temperatura entre a alimentação e o núcleo (por exemplo, o transdutor) era 8,6 ºC. A Figura 11[19] mostra graficamente o perfil de temperatura do dispositivo acustoforético com resfriamento ativo (por exemplo, com uma unidade de resfriamento para o transdutor). Como visto na Figura 11[19], com o uso do resfriamento ativo, a diferença de tempe- ratura entre a alimentação e o núcleo foi reduzida para 6,1 ºC.

[0106] A Figura 12[20] ilustra um processo em quatro etapas (com uma quinta etapa opcional) para concentrar, lavar e separar microtrans- portadores de células. A primeira etapa no processo envolve concentrar os microtransportadores com células aderidas em um dispositivo acus- toforético, tal como aqueles aqui descritos. Os microtransportadores e células aderidas podem ser introduzidos no dispositivo acustoforético pelo recebimento dos microtransportadores com células aderidas desde um biorreator. No biorreator, os microtransportadores e células são sus- pensos em um primeiro meio (por exemplo, soro de crescimento ou ma- terial conservante usado para manter as células viáveis no biorreator). Os microtransportadores com células aderidas envolvidos pelo primeiro meio são concentrados pela(s) onda(s) estacionária(s) acústica(s) ge- rada(s) no dispositivo acustoforético. Em uma segunda etapa, os micro- transportadores com células aderidas concentrados são então lavados com um segundo meio para remover o primeiro meio (por exemplo, soro de crescimento ou material conservante do biorreator). A terceira etapa é então introduzir um terceiro meio contendo uma enzima no dispositivo acustoforético para desprender as células dos microtransportadores através de ação enzimática do segundo meio. Em modalidades especí- ficas, tripsina é a enzima usada para desprender enzimaticamente as células dos microtransportadores. A onda estacionária acústica multidi- mensional pode então ser utilizada para separar as é realizada por cap- tura dos microtransportadores na onda estacionária acústica multidi- mensional, enquanto as células desprendidas atravessam com o ter- ceiro meio. No entanto, as células podem ser capturadas, em vez disso, se desejado. Finalmente, as células separadas podem ser opcional- mente concentradas e lavadas novamente, se desejado.

[0107] Depois de serem concentrados e capturados / detidos na onda estacionária acústica multidimensional, os microtransportadores podem coalescer, aglutinar, agregar, aglomerar e/ou agrupar até um ta- manho crítico, em cujo ponto os microtransportadores caem da onda estacionária acústica devido à deposição gravitacional aumentada. Os microtransportadores podem cair em um coletor do dispositivo acusto- forético localizado embaixo da onda estacionária acústica, para serem removidos da câmara de fluxo.

[0108] A Figura 13[24] mostra a presença de microtransportadores SoloHill e células T no dispositivo acustoforético em 4x de ampliação. À linha superior de imagens mostra os microtransportadores e células na alimentação antes da acustoforese. A linha de baixo de imagens mostra os microtransportadores e células no permeado depois que as células foram separadas por acustoforese. A diferença no número de micro- transportadores com a aplicação de acustoforese evidencia a viabili- dade de usar o dispositivo para capturar os microtransportadores no dis- positivo e separar as células dos mesmos. A viabilidade dessa técnica e os resultados são evidenciados adicionalmente pelas imagens na Fi- gura 14[25], que mostram imagens microscópicas dos microtransporta-

dores e células na alimentação (linha superior de imagens) e no perme- ado (linha inferior de imagens) depois da concentração e da primeira, segunda e terceira lavagem, da esquerda para a direita.

[0109] A testagem do processo acustoforético de concentração, la- vagem, e separação mostrou que o processo é adequado para aplica- ções de terapia celular e microtransportador. As etapas de concentra- ção e lavagem foram realizadas com uma eficiência resultante superior a 99%, e a etapa de separação, por exemplo, separar as células dos microtransportadores, foi realizada com eficiência superior a 98%.

[0110] As Figuras 15-17[26-28] ilustram outra modalidade de exemplo de um sistema / processo acustoforético 2800 que inclui um dispositivo acustoforético descartável 2810 com válvulas solenoides de estrangulamento que controlam a travessia do fluxo do fluido. Iniciando do lado esquerdo da Figura 15[26], o sistema inclui um tanque de ali- mentação 2820, um tanque de lavagem 2830 e uma admissão de ar

2805. A admissão de ar 2805 passa através de uma válvula de admis- são de ar 2804. A linha de alimentação 2821 corre desde o tanque de alimentação 2820. A admissão de ar e a linha de alimentação 2821 são unidas por um conector em Y em uma linha de alimentação comum 2811, que corre para a válvula seletora de alimentação 2801. Uma linha de lavagem 2831 corre desde o tanque de lavagem 2830 e também corre para a válvula seletora de alimentação 2801. A válvula seletora de alimentação 2801 permite que somente uma linha seja aberta em um dado momento (as válvulas 2802, 2803 também operam dessa ma- neira). A linha de lavagem 2831 e a linha de alimentação 2811 são uni- das por um conector em Y a jusante da válvula seletora de alimentação 2801 na linha de entradas 2812. A linha de entradas 2812 passa através da bomba 2806 para válvula seletora de entrada de fluxo 2802, que está a jusante da válvula seletora de alimentação 2801 e a montante do dis- positivo acustoforético 2810. The válvula seletora de entrada de fluxo

2802 controla seletivamente a entrada de fluxo de alimentação ou lava- gem no dispositivo acustoforético 2810 através da porta de alimentação 2602 ou da porta de lavagem/escoamento 2604. Uma linha de alimen- tação 2813 vai da válvula seletora de entrada de fluxo 2802 até a porta de alimentação 2602. Uma linha de lavagem 2814 vai da válvula sele- tora de entrada de fluxo 2802 até a linha comum 2815 e para a porta de lavagem/escoamento 2604.

[0111] No lado direito da Figura 15[26], uma válvula seletora de sa- ída de fluxo 2803 está localizada a jusante do dispositivo acustoforético 2810 e controla a saída de fluxo do fluido desde a mesma. Uma linha de resíduos 2816 vai da porta de resíduos 2608 através da válvula se- letora de saída de fluxo 2803 e subsequentemente para o tanque de resíduos 2850. A linha comum 2815 vai para a linha de escoamento 2817, a qual, então, passa através da válvula seletora de saída de fluxo 2803 e subsequentemente para o tanque do concentrado 2840. Esses tanques 2840, 2850 podem ser, por exemplo, bolsas de coleta. O seletor de saída do fluxo 2803 controla, assim, seletivamente o fluxo de fluido para o tanque do concentrado e tanque de resíduos.

[0112] O uso de bolsas de coleta no final das linhas do concentrado e de resíduo cria vantajosamente um ambiente primário fechado dentro do qual podem ocorrer a concentração, lavagem, e/ou separação de cé- lulas e materiais celulares, o que ajuda a impedir que as células / cultura celular / material celular sejam expostos a possíveis intrusões, patóge- nos ou influências celulares externas que poderiam ser prejudiciais.

[0113] A Figura 15[26] também ilustra o caminho do fluxo do mate- rial de alimentação através do sistema. Nessa modalidade de exemplo, a válvula seletora de alimentação 2801 é operada com a parte inferior aberta (e a parte superior aberta), para que a alimentação proveniente do tanque de alimentação 2820 passe através dela. A válvula seletora de entrada de fluxo 2802 é operada com a parte superior aberta (e a parte inferior fechada), de modo que o material de alimentação entre no dispositivo acustoforético 2810 pela porta de alimentação 2602. A vál- vula seletora de saída de fluxo 2803 é também operada com a parte su- perior aberta (e a parte inferior fechada) para que o fluido / primeiro meio do material de alimentação passe através dela até o tanque de resíduos

2850. As partículas alvo no material de alimentação (por exemplo, micro- transportadores ou células) são capturadas no dispositivo acustoforético 2810 pela ação de onda(s) estacionária(s) acústica(s) multidimensio- nal(is), como explicado detalhadamente neste documento.

[0114] O sistema ilustrado na Figura 15[26] possui um elemento acústico composto por policarbonato e aço inoxidável. A tubulação é um tubo com parede fina 1/8" de PVC que permite o uso de bolsas de ali- mentação soldadas estéreis para o processamento das células. É usada uma altura da bomba NaoStedi de uso único não pulsado de 2x2,5 mL. O tubo, o elemento acústico e a bomba são duplo-ensacados e são es- terilizadas com irradiação gama. O sistema permite processos incluindo preparação, recirculação, concentração, troca de meio, lavagem e/ou coleta. O sistema de exemplo pode operar com alimentações de até 3 litros, com capacidade celular total de aproximadamente 4 bilhões de células e volume final do concentrado entre aproximadamente 6 mL e 50 mL, embora o sistema possa ter parâmetros com faixas menores ou menores em outras implementações de exemplo.

[0115] A Figura 16[27] ilustra o caminho do fluxo do material de lavagem através do sistema. A válvula seletora de alimentação 2801 é operada com a parte superior aberta (e a parte inferior fechada), de modo que o material de lavagem proveniente do tanque de lavagem 2830 passe através dela. A válvula seletora de entrada de fluxo 2802 é operada com a parte inferior aberta (e a parte inferior fechada) e a vál- vula seletora de saída de fluxo 2803 é operada com a parte superior aberta (e a parte inferior fechada). Como resultado, o material de lava- gem entra no dispositivo acustoforético 2810 pela porta de lavagem/es- coamento 2604, que opera como uma entrada para lavagem. Note que, quando a válvula seletora de saída de fluxo 2803 está fechada, é impedida a entrada do material de lavagem no tanque do concentrado 2840. O ma- terial de lavagem pode então passar através do dispositivo acustoforético 2810 e remover o primeiro meio (por exemplo, soro do biorreator ou mate- rial conservante). O material de lavagem sai então pela porta de resíduos 2608 e escoa para o tanque de resíduos 2850. As partículas alvo perma- necem capturadas no dispositivo acustoforético 2810.

[0116] A Figura 17[28] ilustra o escoamento do sistema (por exem- plo, a coleta das partículas alvo). A válvula de admissão de ar 2804 é aberta. A válvula seletora de alimentação 2801 é operada com a parte inferior aberta (e a parte inferior fechada), e a válvula seletora de en- trada de fluxo 2802 é operada com a parte superior aberta (e a parte inferior fechada), de modo que o ar entra no dispositivo acustoforético 2810 pela porta de alimentação 2602. O ar geralmente ajuda a desalojar os agrupamentos de partículas alvo do dispositivo acustoforético 2810. A válvula seletora de saída de fluxo 2803 é operada com a parte inferior aberta (e a parte inferior fechada). As partículas alvo escoam para fora da porta de lavagem/escoamento 2604 através da linha comum 2815, através da linha de escoamento 2817 e, subsequentemente, para o tan- que do concentrado 2840.

[0117] A concentração e lavagem da cultura celular é útil para gerar produtos biológicos de uso industrial. Os sistemas da presente invenção podem ser continuamente melhorados e escalonados verticalmente para o manuseio de volumes maiores.

[0118] Em alguns exemplos, os dispositivos acustoforéticos da pre- sente invenção podem ter um volume do concentrado que varia entre aproximadamente 25 mL e 75 mL. Os dispositivos podem ter uma ca- pacidade celular total entre aproximadamente 4 bilhões e 40 bilhões de células, entre aproximadamente 4 bilhões e 8 bilhões de células, entre aproximadamente 20 bilhões e 40 bilhões de células ou entre aproxima- damente 16 bilhões e 35 bilhões de células. Os fluidos que entram e saem dos dispositivos acustoforéticos podem ter densidades celulares entre aproximadamente 160 milhões de células/mL e 670 milhões de células/mL, entre aproximadamente 160 milhões de células/mL e 320 milhões de células/mL, entre aproximadamente 260 milhões de célu- las/mL e 535 milhões de células/mL, entre aproximadamente 305 mi- lhões de células/mL e 670 milhões de células/mL ou entre aproximada- mente 0,5 milhão de células/mL e 5 milhões de células/mL.

[0119] Os exemplos seguintes são fornecidos para ilustrar os dispo- sitivos e processos da presente invenção. Os exemplos são simples- mente ilustrativos e não se destinam a limitar a descrição dos materiais, condições ou parâmetros do processo apresentados nos mesmos. Exemplos

[0120] A capacidade de um sistema acustoforético da presente in- venção para concentrar células T Jurkat foi testada. As células T Jurkat têm um diâmetro de 11 micrômetros (um) a 14 um. Usou-se um dispo- sitivo acustoforético, e um Beckman Coulter Vi-CELL X foi usado em várias condições de teste para medir a redução na densidade celular.

[0121] No primeiro ensaio A, as células T foram concentradas, e a densidade celular do permeado foi medida. A linha pontilhada indica a densidade celular da alimentação. Desejavelmente, a densidade celular no permeado é a mais baixa possível, indicando que as células ficam retidas no concentrado. O gráfico na Figura 18[29] mostra os resultados do ensaio A ao longo do tempo. Os resultados mostram densidades ce- lulares muito baixas no permeado, entre 0,0 e 0,2 milhão de células/mL,

mostrando que a maior parte das células está no concentrado. Os re- sultados também mostram uma porcentagem alta de redução, entre 80% e 99%.

[0122] No segundo ensaio B, as células T foram concentradas, e a densidade celular do permeado foi medida. A linha pontilhada indica a densidade celular da alimentação. A Figura 19[30] mostra os resultados ao longo do tempo. Os resultados mostram bom desempenho, sendo a densidade celular do permeado abaixo de 0,1 milhão de células/mL de- pois do 1º minuto, e uma redução no permeado superior a 95% depois de dois minutos.

[0123] No terceiro ensaio C, as células T foram concentradas e la- vadas. A concentração ocorreu durante os primeiros 18 minutos, e a lavagem foi realizada subsequentemente. A Figura 20[31] mostra os resultados ao longo do tempo. A linha pontilhada indica a densidade celular da alimentação. As linhas contínuas verticais indicam quando os volumes de concentrados pelo sistema foram processados (no total, fo- ram processados três volumes). Note que esse gráfico inclui dados so- bre o concentrado e o permeado (não só do permeado). Todas as célu- las obtidas desde a concentração foram mantidas até a lavagem, por exemplo, células concentradas não foram perdidas devido à adição do processo de lavagem. A Tabela 1 abaixo fornece informações adicionais sobre esses três ensaios. Taxas de retenção e recuperação superiores a 90% puderam ser obtidas para as células T Jurkat. Tabela 1 Volume de Densidade da Volume Recupe- | Fator de | Duração do alimenta- alimentação do con- ração de | concen- processo E mm em e ee FL ss e e 6

[0124] Foram rastreados os volumes usados do líquido para lavar completamente as células concentradas. O rastreamento dos volumes do líquido pode ser útil em aplicações como, por exemplo, remover o tampão de eletroporação de uma cultura celular antes da transdução ou transfecção da cultura celular.

[0125] A Tabela 2 abaixo mostra os valores de entradas, saídas e desempenho experimental para a redução no volume do lavado-con- centrado acústico (ACW) com baixa densidade de células viáveis ("1LE", 1-5 E6 mL-1). A Figura 21[33] representa a densidade de célu- las viáveis (VCD) e viabilidade de culturas primárias de células T após o processamento 1LE. As células de cada experimento 1LE voltaram a ser semeadas a 1E6 mL-1, 37 ºC, CO2 5% em duplicata e contadas 24 horas mais tarde. Tabela 2 1LE ACW baixa densidade celular

[0126] Todos os testes foram realizados de acordo com as especi- ficações, produzindo um volume do concentrado entre 5 e 7 mL abaixo de uma hora. Os volumes processados foram aproximadamente 1100 mL com densidades celulares entre 1,8 e 2,5 E6 mL-1. O número total de células processadas variou de 1,9 a 2,8 B de células com a viabili- dade celular acima de 99%. Depois da concentração, o volume da con- centração de células coletadas variou de 5,8 a 6,9 mL com as densida- des celulares entre 243 e 357 E6 mL-1. Isso representa uma recupera- ção de células de 1,4 a 2,1 B de células sem queda perceptível na via- bilidade celular. A recuperação de células viáveis foi, portanto, entre 73 e 84%, o que constitui um fator de redução do volume entre 160 e 187 e um fator de concentração da densidade celular variando de 135 a 143. A duração do processo foi aproximadamente 50 minutos.

[0127] A Tabela 3 exibe os valores de entradas, saídas e desempe- nho experimental para a redução no volume de ACW com alta densi- dade de células viáveis ("1LH", 10-40 E6 mL-1). A Figura 22[34] mostra o efeito da potência sobre a Recuperação de Células Viáveis (VCR) usando o elemento 1LH de alta densidade celular com uma vazão de mL/minuto. Tabela 3 Entradas do processo 1LH-1(5W) | 1LH-2 (8W) | 1LH-3 (8W) | 1LH-4 (10W) 976,2 mL 949,9mL |9319mL 9086mL Densidade de células viáveis 39,0 m/mL 35,38 MmL |32,3M/mML |31,4 M/mL Viabilidade celular 97,9% 98,8% 98,8% 98,2% Saídas do processo 1LH-1(5W) | 1LH-2(8W) | 1LH-3 (8W) | 1LH-4 (10W) Densidade de células viáveis 470 M/mL 587 M/mL 483 M/mL 483 M/mL Viabilidade celular 99,0% 97,6% 97,7% 97,5% Desempenho do processo 1LH-1 (SW) | 1LH-2 (8W) | 1LH-3 (8W) | 1LH-4 (10W)

1LH ACW alta densidade celular

[0128] Os volumes processados foram aproximadamente 950 mL com densidades de células viáveis de 31 a 39 E6 mL-1, correspondendo a uma faixa de números de células entre 29 e 38 B de células com as viabilidades celulares acima de 98%. Os volumes de concentrados ce- lulares variou em média 49 mL. As durações do processo foram entre 31 e 36 minutos.

[0129] O teste 5W produziu uma taxa de reocupação celular baixa de 62%. O aumento para 8W levou o desempenho para a faixa desejada (recuperação celular de 78 para 86%), enquanto um aumento da potên- cia para 10W não pareceu melhorar a recuperação celular (83%). Em- bora réplicas adicionais sejam necessárias em cada nível de potência para fornecer conclusões definitivas, esses resultados sugerem que po- tências acima de 8W são necessárias para uma VCR próxima e acima de 80%. Os fatores de redução de volume foram aproximadamente 19 e os fatores de concentrações celulares variaram de 12 (5W) para 17 (8W). As concentrações celulares finais obtidas durante os experimen- tos 1LH, 470-590 E6 mL-1, são comparáveis às concentrações de pel- lets nos processos finais de centrifugação para linhagens de células em suspensão (200-600 e6 mL-1.

[0130] A FIG. 23[35] mostra dois campos típicos de onda estacio- nária acústica e o fluxograma do processo para uma aplicação de con- centrado/lavado com baixa concentração celular (1LE) e uma aplicação de concentrado/lavado alta densidade celular (1LH). Em cada cenário, o transdutor piezoelétrico está à direita e é excitado em um de seus padrões de deslocamento multimodal. Para 1LH, é usado um refletor plano, enquanto que, para o 1LE, é usado um refletor facetado. O refle- tor plano combinado com o multimodo do transdutor estabelece uma onda estacionária multidimensional resultando em três ondas estacio- nárias paralelas com fortes gradientes laterais de amplitude. A força de radiação acústica é proporcional ao gradiente da amplitude da pressão acústica. Essa configuração, portanto, possui potencial de captura sufi- ciente para capturar células, mas também gera grupamentos de células de tamanho suficiente resultando em uma deposição gravitacional con- tínua desses grupamentos de células. Isso é mostrado esquematica- mente na Figura24[36] à direita. Essa separação contínua de células é útil quando se realizada uma operação na unidade de concentração/la- vagem de uma cultura celular com alta densidade celular, por exemplo, as células sendo removidas do campo da onda estacionária acústica. Por outro lado, para culturas celulares de densidade celular pequena, o número total de células a serem processadas é tal que todas as células podem ser capturadas e detidas na onda estacionária acústica. Por- tanto, o objetivo é maximizar o potencial de captura do campo da onda estacionária. Esse objetivo pode ser alcançado pelo uso de um refletor facetado. Essas facetas refletem e dispersam a onda acústica, gerando um número maior de poços e com potencial de radiação acústica mais forte onde as células serão capturadas, ver a FIG. 23[35], esquerda, 1LE, e formam agrupamentos menores que não depositam enquanto o campo acústico está ativo, ou até que o campo acústico seja desligado.

[0131] O Concentrado-Lavado Acústico (ACW) multidimensional para baixa concentração celular é mostrado nas Figuras 23, 24[35, 36] (dispositivo no lado esquerdo, 1LE, 1-5E6 células mL-1) e para alta con- centração celular (dispositivo no lado direito, 1LH, >10E6 células mL-1). As vistas em corte transversal do desenho representam o campo de pressão acústica estabelecidos nos dispositivos 1LE e 1LH e o perfil de deslocamento do transdutor e o princípio de captura e formação de agrupamentos para alcançar a separação de células. Os dispositivos incluem um dreno coletor no fundo (não mostrado).

[0132] Durante a parte de arranque das operações de concentra- ção/lavagem, uma recirculação é usada para gerar os agrupamentos iniciais na onda estacionária, por exemplo, realizar uma semeadura de agrupamentos. Uma vez formados os agrupamentos iniciais, a eficiên- cia da captura aumenta devido às forças de radiação acústica, pelo qual os agrupamentos maiores exercem uma força de atrações sobre as cé- lulas recebidas.

[0133] A FIG. 25[37] mostra fotografias de vários estágios do pro- cesso de concentração de células T no dispositivo ACW: (a) captura de células T no campo acústico e separação e depósito de células T no coletor, (b) deposição de agrupamentos de células T depois que o campo acústico é desligado, (c) escoamento inicial das células T desde o coletor e (d) estágio final do escoamento de células T desde o coletor. A Recuperação de Células Viáveis (VCR (%)) é calculada de acordo com o saldo de células viáveis presentes no concentrado em relação à alimentação (ver a derivação abaixo). Resíduos da lavagem não foram calculados para esses ensaios, pois o foco desses experimentos era demonstrar a eficiência da concentração.

Células viáveis concentradas VCR (%) E ———— X 100 Células viáveis processados Volume do concentrado x VCDrconcentrado — Volume processado da alimentação x VCDaumentação x 100

[0134] A aplicação 1LE foi realizada em triplicata (experimentos de- signados como 1LE-1, -2, e -3) usando culturas primárias de células T e parâmetros fixos do processo. Os elementos acústicos foram monta- dos, duplo-ensacados e submetidos à irradiação gama para realizar a concentração em ambiente asséptico. Os parâmetros do processo eram uma vazão nominal de 30 mL/minuto (-2L/hora) e condições de direci- onamento acústico de 2,24 MHz/40W por canal. O período de recircula- ção é necessário antes da etapa de concentração etapa por que a efici- ência do sistema 1LE é intensificada pelo número de células que povo- aram a onda estacionária acústica. A recirculação do resíduo de volta para a alimentação permite que as células entrem no sistema e sejam retidas pela acústica, gradualmente montando a eficiência, sem perder as células iniciais não retidas para a corrente de resíduos. Com base nos testes anteriores com células T Jurkat, a duração selecionada para o modo de recirculação foi 15 minutos, pois o sistema está com aproxi- madamente 80% de eficiência nesse ponto para alimentações nessa faixa de densidade celular. A Figura 26[38] retrata a VCD do resíduo (E6 mL-1) versus tempo (minutos) para os três experimentos 1LE (30 mL/minuto) com densidades celulares iniciais na ordem de 2E6 mL-1 e demonstra a utilidade de um período de recirculação de 15 minutos para povoar a onda estacionária acústica 3D (em densidades celulares mai- ores, como 1LE-3, e com a mesma vazão, a onda estacionária acústica será povoada mais rápido).

[0135] O 1LH ACW/ foi operado em diferentes potências para avaliar o efeito sobre a recuperação de células viáveis. Realizaram-se quatro testes na especificação para alimentação de entradas, usando uma va- zão fixa de 30 mL/minuto (-2 L/h). O primeiro teste foi realizado com nível de potência de 5W. O segundo e o terceiro teste foram realizados com 8W e, para o quarto teste, a potência foi aumentada para 10 W. O resíduo desse quarto teste foi reprocessado através do mesmo ele- mento para simular a operação de um ACW em dois estágios (ou seja, dois elementos acústicos em série). Em densidades celulares maiores da alimentação, uma redução significativa na potência do transdutor é alcançada, ou seja, 5-10W para 1LH versus 40W para 1LE, o que eli- mina a necessidade de qualquer resfriamento do sistema.

[0136] A FIG. 27 mostra um fluxograma do processo para opera- ções em um sistema de concentração e lavagem de células T 500. Uma duração típica do processo para a operação de concentração e lavagem varia de 60 a 90 minutos. O dispositivo de concentração e lavagem acústica (ACW) 510 possui entradas de um produto celular 530 e um tampão de lavagem 520. O tampão de lavagem 520 pode ter um volume em uma faixa entre aproximadamente 300 mL e 600 mL. O produto ce- lular 530 pode consistir em 40 bilhões de células em um volume de 2 L. O dispositivo ACW 510 possui saídas de um produto 540 e resíduo 550. O produto 540 pode ter uma faixa de volume entre aproximadamente 5 e 100 mL. O resíduo 550 pode consistir em células dispersas, resíduos celulares e solução tampão.

[0137] A operação do dispositivo ACW 510 é implementada com o protocolo como ilustrado na Figura 27. A operação inicia com o dispo- sitivo ACW 510 sendo preparado, tal como pelo fluxo do produto celular 530 para uma câmara acústica interna do dispositivo ACW 510. O ma- terial celular no produto celular 530 tende a se acumular dentro da câ- mara acústica durante o estágio de preparação para permitir que o dis- positivo ACW 510 opere com eficiência maior. A saída do dispositivo ACW 510 pode voltar a ser circulada para a entrada (não mostrado). Dessa forma, à medida que as células estão sendo capturadas na onda acústica na câmara acústica, e a eficiência da captura aumenta, as cé- lulas que passam através da câmara acústica podem ser devolvidas para a entrada de modo a não se perder conteúdo celular enquanto o dispositivo ACW 510 está sendo preparado.

[0138] Uma vez preparado o dispositivo ACW 510, o caminho da recirculação é fechado, e o fluxo do produto celular adicional 530 é di- recionado para a câmara acústica. À medida que o fluxo do produto ce- lular 530 escoa para a câmara acústica preparada, células adicionais são capturadas na onda acústica, enquanto o meio escoa da câmara acústica para o resíduo 550.

[0139] Uma vez coletadas todas as células na onda acústica na câ- mara acústica, o tampão de lavagem 520 é circulado para a câmara acústica, o que faz com que o meio anterior na câmara acústica seja lavado para fora e direcionado para o resíduo 550. Nesse ponto, as cé- lulas são lavadas e concentradas, e podem ser removidas da câmara acústica e fornecidas ao produto 540.

[0140] A Figura 28 é um gráfico de bolhas mostrando recuperação de células viáveis versus bilhões de células processadas. O total de cé- lulas viáveis processadas é inserido no eixo x e a recuperação corres- pondente de células viáveis é inserida no eixo y. O tamanho das bolhas no gráfico de bolhas representa o volume processado em uma faixa en- tre aproximadamente 0,75 e 2 L. Os resultados do gráfico de bolhas são para uma operação de concentrado-lavado com células T Jurkat com um tempo de processamento entre 60 e 90 minutos. 1 bilhão de células em 1 L de meio foi processado, produzindo em uma recuperação de células viáveis de 92 +/- 3% e um volume de saída de 5-6 mL.

[0141] A FIG. 29 é um mapa do processo para operações de con- centração-lavagem acústicas tais como aquelas ilustradas nas Figuras 27, 28. O mapa do processo traça parâmetros operacionais de potência acústica, vazão, número de ciclos de coleta de células, número de cé- lulas e concentração de células. A Figura 30 é um gráfico mostrando a redução total da concentração proteica no permeado, em função de vo- lumes da câmara do tampão de lavagem. Depois de cinco volumes da câmara terem sido passados através das células, o teor final de proteí- nas totais é reduzido em 99%.

[0142] A Figura 31 mostra uma aplicação do dispositivo ACW 500 para remoção de células isolados de agregados celulares em um bior- reator 610. Células-tronco pluripotentes humanas (hPSCs) podem se agregar dentro do biorreator 610, cujo processo pode ser um pouco ine- ficiente. Tal processo pode levar à geração de uma população de célu- las isoladas que pode afetar o crescimento e diferenciação de agrega- dos de hPSC bem como a qualidade do produto final. O dispositivo ACW 500 pode ser utilizado para remover tais células isoladas enquanto re- tendo os agregados celulares no biorreator. Nessa aplicação, os agre- gados e células isoladas são supridos ao dispositivo ACW 500, onde os agregados maiores são capturados na onda estacionária acústica na câmara acústica do dispositivo ACW 500. As células isoladas menores passam através da onda acústica e saem da câmara acústica para o resíduo 620. Os agregados maiores podem ser coletados na onda acús- tica e devolvidos para o biorreator 610. Com o passar do tempo, as cé- lulas isoladas são removidas do biorreator 610 enquanto os agregados são mantidos, concentrando, assim os agregados e esvaziando as cé- lulas isoladas dos biorreatores 610.

[0143] A Figura 32 é um gráfico mostrando a retenção de hPSC versus potência acústica. No gráfico, a potência acústica foi modulada de aproximadamente 5 W para aproximadamente 30 W. Como mos- trado no gráfico, as maiores retenções de agregados ocorreram em 30 W. A inspeção dos agregados retidos mostrou que a sua morfologia não se alterou durante o processamento no dispositivo ACW 500.

[0144] A FIG. 33 é um gráfico de barras mostrando a remoção de células isoladas de uma população de agregados em um biorreator. Um biorreator de 2 L foi conectado ao dispositivo ACW 500 e operado em 60 mL por minuto a 30 W com agregados devolvidos para o biorreator a cada cinco minutos. O gráfico de barras ilustra a fração crescente de agregados detidos no biorreator à medida que o conteúdo do biorreator foi processado através do dispositivo ACW 500. A inspeção dos agre-

gados retidos indicou que a morfologia inicial permanecia a mesma de- pois do processamento acústico. A recuperação de agregados totais foi 85%.

[0145] A Figura 34 mostra dois gráficos para o processamento acústico de concentração e lavagem, um retratando expansão celular versus duração do processo (lado esquerdo) e outro retratando altera- ções na população de células T depois do processamento acústico de concentração-lavagem. Uma cultura primária de células CAR-T huma- nas processadas com o dispositivo acústico de concentração e lavagem cresceu na sua taxa de crescimento típico (tempo dobrado de 30h). À viabilidade celular é mantida em alto nível e uma expansão de 30 vezes pode ser realizada em uma cultura perfundida em biorreator Xuri (gráfico esquerdo). O gráfico direito ilustra uma comparação de n=2 doadores da viabilidade celular e fenótipo antes e depois do processamento com o dispositivo acústico de lavagem e concentração. Não são observadas alterações significativas na expressão de marcadores da superfície ce- lular depois do processamento pelo dispositivo acústico de concentra- ção e lavagem.

[0146] A FIG. 35 ilustra um gráfico representativo de citometria de fluxo, representando marcadores típicos da superfície de células T, cuja expressão permanece inalterada depois do processamento acústico de concentração e lavagem. O processamento fornece uma recuperação celular média de 90% e lavagem de proteínas de 99% com um volume de entrada de 1-2 L e um volume de saída de 5-120 mL. Uma VCD de saída de 100-500 M/mL é obtida com uma VCD de entrada de 1-40 M/mL. Não foi observada perda na viabilidade, a porcentagem de célu- las T ficou inalterada e a razão CD8/CD4 permaneceu inalterada.

[0147] A Figura 36 ilustra um processo completo de produção de terapia celular usando o dispositivo de concentração e lavagem da pre-

sente invenção em vários pontos no processo. O dispositivo de concen- tração e lavagem pode ser usado para reduzir granulócitos, hemácias e plaquetas em um hemoderivado original. Após seleção de células por afinidade, o dispositivo de concentração e lavagem pode ser usado para coletar e lavar as células T resultantes. Após ativação de células T, as células T podem ser novamente concentradas e lavadas antes de uma etapa de transdução/transfecção. O dispositivo de concentração e lava- gem pode ser empregado depois da etapa de transdução/transfecção, antes da expansão celular. Após a expansão celular, o dispositivo de concentração e lavagem pode ser usado para coletar e lavar as células CAR-T expandidas. Após uma etapa dois de seleção de células por afi- nidade para remover células contaminantes ou selecionar células dese- jadas, outro processo de concentração e lavagem pode ser empregado.

[0148] Os métodos, sistemas e dispositivos discutidos acima são exemplos. Várias configurações podem omitir, substituir ou adicionar vários procedimentos ou componentes, conforme adequado. Por exem- plo, em configurações alternativas, os métodos podem ser realizados em uma ordem diferente daquela descrita, e várias etapas podem ser adicionadas, omitidas ou combinadas. Além disso, características des- critas com relação a certas configurações podem ser combinadas em várias outras configurações. Aspectos e elementos diferentes das con- figurações podem ser combinados de maneira semelhante. Além disso, a tecnologia evolui e, assim, muitos dos elementos são exemplos e não limitam o âmbito da descrição ou das reivindicações.

[0149] Detalhes específicos são fornecidos na descrição para pro- porcionar um entendimento completo de configurações de exemplo (in- cluindo implementações). No entanto, as configurações podem ser co- locadas em prática sem esses detalhes específicos. Por exemplo, pro- cessos, estruturas e técnicas bem conhecidos foram mostrados sem de-

talhes desnecessários para evitar encobrir as configurações. Essa des- crição fornece configurações de exemplo somente, e não limita o âàm- bito, a aplicabilidade ou as configurações das reivindicações. Em vez disso, a descrição anterior das configurações fornece uma descrição para implementar as técnicas descritas. Várias mudanças podem ser feitas na função e arranjo dos elementos sem que se desviem do espí- rito ou âmbito da invenção.

[0150] Além disso, as configurações podem ser descritas como um processo que é representado em um fluxograma ou diagrama de blocos. Embora cada um possa descrever as operações como um processo se- quencial, muitas das operações podem ser realizadas em paralelo ou simultaneamente. Além disso, a ordem das operações pode ser rear- ranjada. Um processo pode ter estágios ou funções adicionais não in- cluídos na figura.

[0151] Tendo sido descritas diversas configurações de exemplo, po- dem ser usadas várias modificações, construções alternativas e equiva- lentes sem que se desviem do espírito da invenção. Por exemplo, os elementos acima podem ser componentes de um sistema maior, em que outras estruturas ou processos podem tomar precedência sobre ou do contrário modificar a aplicação da invenção. Além disso, várias opera- ções podem ser empreendidas antes, durante ou depois que os elemen- tos acima forem considerados. Dessa forma, a descrição acima não vin- cula o âmbito das reivindicações.

[0152] Uma afirmação de que um valor excede (ou é mais do que) um primeiro valor limiar é equivalente a uma afirmação de que o valor atende ou excede um segundo valor limiar que é ligeiramente maior do que o primeiro valor limiar, por exemplo, o segundo valor limiar sendo um valor maior do que o primeiro valor limiar na resolução de um sis- tema relevante. Uma afirmação de que um valor é inferior a (ou situa-se em) um primeiro valor limiar é equivalente a uma afirmação de que o valor é inferior ou igual a um segundo valor limiar que é ligeiramente menor do que o primeiro valor limiar, por exemplo, o segundo valor limiar sendo um valor menor do que o primeiro valor limiar na resolução do sistema relevante.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Método de lavagem de partículas, caracterizado pelo fato de que o método compreende: obter uma densidade inicial de partículas e volume de uma mistura inicial de um primeiro meio e partículas; definir os parâmetros de um processo acústico de concen- tração e lavagem usando um dispositivo acustoforético com base na densidade inicial de partículas e no volume da mistura inicial; fornecer a mistura inicial a uma câmara do dispositivo acus- toforético, o dispositivo acustoforético incluindo pelo menos um transdu- tor ultrassônico que inclui um material piezoelétrico; direcionar pelo menos um transdutor ultrassônico para criar uma onda acústica na câmara, de modo que pelo menos uma porção das partículas seja retida em um campo acústico gerado pelo menos em parte pela onda acústica; e operar o dispositivo acustoforético de acordo com os parâ- metros.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende ainda fornecer um segundo meio à câ- mara, o qual é uma solução biocompatível de lavagem ou tampão.

3. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as partículas são células.

4. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as partículas constituem complexos de microtranspor- tador/célula.

5. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a mistura inicial possui uma densidade entre aproxima- damente 0,5 milhão de partículas/mL e 5 milhões de partículas/mL.

6. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende ainda concentrar as partículas na mistura inicial.

7. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende ainda concentrar as partículas até um vo- lume do concentrado que é entre aproximadamente 25 e 50 vezes me- nor do que um volume da mistura inicial.

8. Método de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que compreende ainda concentrar as partículas na mistura inicial até uma densidade de partículas concentradas entre aproximada- mente 25 e 50 vezes maior do que uma densidade de partículas da mis- tura inicial.

9. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que uma densidade celular de uma saída de lavagem da câmara de fluxo é entre aproximadamente 0,0 e 0,5 milhão de célu- las/mL.

10. Método de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que a saída da lavagem é de um processo de concentração e um processo de lavagem.

11. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende ainda conduzir um processo de espectro- fotometria na câmara para determinar a eficácia da lavagem.

12. Método para recuperação de células de uma cultura ce- lular, caracterizado pelo fato de que compreende: obter uma densidade inicial de partículas e volume para uma mistura inicial de um primeiro meio e partículas; definir os parâmetros de um processo acústico de concen- tração e lavagem usando um dispositivo acustoforético com base na densidade inicial de partículas e no volume da mistura inicial;

alimentar a mistura inicial da cultura celular a uma câmara de fluxo do dispositivo acustoforético, o dispositivo acustoforético inclu- indo pelo menos um transdutor ultrassônico que inclui um material pie- zoelétrico que é configurado para ser direcionado e gerar uma onda acústica multidimensional na câmara de fluxo; e direcionar pelo menos um transdutor ultrassônico para gerar uma onda acústica multidimensional na câmara de fluxo; reter as células da mistura inicial em um campo acústico ge- rado pelo menos em parte pela onda acústica multidimensional para concentrar as células; operar o dispositivo acustoforético de acordo com os parâ- metros.

13. Método de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que a densidade celular das células concentradas é entre aproximadamente 25 e 50 vezes maior do que a densidade celular da mistura inicial.

14. Método de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que um volume das células concentradas é entre 25 e apro- ximadamente 50 vezes menor do que um volume a mistura inicial.

15. Método de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que as células concentradas são obtidas em aproximada- mente 35 minutos ou menos.

16. Método de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que compreende ainda lavar as células concentradas, em que uma densidade celular de uma saída de lavagem da câmara de fluxo é entre aproximadamente 0,0 e 0,5 milhão de células/mL.

17. Sistema de concentração e lavagem, caracterizado pelo fato de que compreende: uma bomba; uma pluralidade de válvulas;

uma câmara de fluxo; pelo menos um transdutor ultrassônico acoplado à câmara de fluxo e incluindo um material piezoelétrico que é adaptado para ser direcionado e gerar uma onda acústica multidimensional; e um controlador para controlar a bomba, a pluralidade de vál- vulas e pelo menos um transdutor ultrassônico, sendo que o controlador pode ser configurado com parâmetros que incluem um ou mais dentre potência acústica, vazão, número de ciclos de coleta de células, número de células ou concentração de células.

18. Sistema de concentração e lavagem de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que a câmara de fluxo com- preende ainda um volume entre aproximadamente 25 mL e 75 mL.

19. Sistema de concentração e lavagem de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que a câmara de fluxo pode conter uma capacidade celular entre aproximadamente 4 bilhões e 40 bilhões de células.