KR20210105443A

KR20210105443A - 음향을 사용한 입자 농축 및 세척 파라미터

Info

Publication number: KR20210105443A
Application number: KR1020217025882A
Authority: KR
Inventors: 벤자민 로스-존스러드; 바트 립켄스
Original assignee: 프로디자인 소닉스, 인크.
Priority date: 2019-01-21
Filing date: 2020-01-21
Publication date: 2021-08-26
Also published as: CA3126826A1; CN113518820A; EP3914695A4; IL284606A; WO2020154334A1; AU2020211945A1; SG11202107453WA; WO2020154334A9; US20210355479A1; BR112021013791A2; JP2022518009A; EP3914695A1

Abstract

호스트 유체로부터 제2 유체 또는 미립자를 연속적으로 분리하기 위한 다단계 음향영동 디바이스들이 개시된다. 다단계 음향영동 디바이스들을 동작하는 방법들도 개시된다. 시스템들은 직렬로 서로 유체 연결된 다수의 음향영동 디바이스들을 포함할 수 있고, 각 음향영동 디바이스는 유동 챔버, 다차원 음향 정재파를 생성할 수 있는 초음파 트랜스듀서, 및 반사기를 포함한다. 시스템들은 펌프들 및 유량계들을 더욱 포함할 수 있다.

Description

음향을 사용한 입자 농축 및 세척 파라미터

치료 세포들을 농축하고 이들을 한 용액에서 또 다른 용액으로 옮기는 것(일반적으로 세척으로 지칭됨)은 세포들의 생산 및 사용의 다수의 스테이지들에서 수반된 2 가지 공정들이다. 세포 처리에서 물질들의 세척 및 분리는 세포 선택 요법의 전반적인 효능의 중요한 부분이다. 특히, 치료 세포들은 원래 성장 혈청 또는 디메틸 설폭사이드(DMSO)와 같은 보존 물질들에 부유될 수 있다. 세포들이 추가 처리될 수 있도록 이들 유체들로부터 세포들을 분리하는 것은 그러한 세포 물질들을 사용하는 전체 치료 처리에서 중요하다. 한 예에서, 세포들은 통상적으로 바이오리액터로부터 회수되고, 농축되고, CAR-T 세포들의 제조에서와 같이, 형질도입(transduction) 전에 배양 배지(culture media)로부터 전기천공 완충제로 옮겨진다. 최종 제조 단계에서 세포들을 확장한 후, 이들은 농축되고 원하는 용도에 따라 적절한 용매로 옮겨진다.

치료 세포들은 냉장 및/또는 냉동 공정들을 통해 이들 세포들의 생존력을 연장하기 위해 특수 배지에 저장된다. 그러한 특수 배지는 치료 세포들이 환자에게 도입될 때 호환되지 않을 수 있다. 따라서 치료 세포들 및 환자 둘다와 생체적합성인 완충제 또는 세척 배지에서 치료 세포들을 세척하고 농축하는 것이 도움이 될 수 있다. 이들 세척 및 농축 공정들은 일반적으로 원심분리 및 물리적 여과의 사용을 수반한다. 세척 단계는 다수 번 반복될 수 있다. 예를 들어, 특수 배지(발열성 또는 그렇지 않으면 유해할 수 있음)는 다수의 세척 단계들로 완전히 제거될 수 있으며, 그리고 세포들은 새 완충제 또는 세척 용액에 부유될 수 있다. 이러한 세척 공정 동안, 많은 세포들이 원심분리 및 물리적 여과 공정들을 통해 분해되거나 파괴된다. 게다가, 여과 공정은 다소 비효율적일 수 있고, 뱃치(batch) 공정을 위한 환경으로의 비-무균 침입을 수반할 수 있으며, 이로써 세포 배양은 표적 세포 배양에 해로울 수 있는 가능한 병원체 또는 세포 외부 영향에 노출된다. 또한, 이들 물리적 여과 공정들에서 생물학적 폐기물은 적절한 폐기를 위한 추가 단계들을 초래할 수 있는 다수의 물리적 필터들의 사용을 통해 발생된다. 이러한 공정의 비용 및 적시성 또한 환자에게 도입하기 위해 세포들을 준비하는, 빠르고 저렴한 공정에 도움이 되지 않는다.

본 개시 내용은 치료 세포들과 같은 입자들에 대해 보다 간단하고, 보다 저렴하며, 보다 친숙한 공정으로 다수의 세척 단계들과 함께 종래의 원심분리 및 물리적 여과 공정들을 대체하거나 증대하는 방법들 및 시스템들을 제공한다. 방법들/공정들은 무균 환경에서 연속 형태로 수행될 수 있다.

세포들일 수 있는 입자들을 세척하는 방법들이 여기에 개시된다. 일부 예시적인 방법들에서, 제1 배지 및 입자들의 초기 혼합물은 음향영동 디바이스(acoustophoretic device)의 유동 챔버로 공급된다. 상기 제1 배지는 입자들의 향후 적용/사용에 바람직하지 않은 디메틸 설폭사이드(dimethyl sulfoxide, DMSO)와 같은 보존료를 포함할 수 있다. 음향영동 디바이스는 압전 물질를 포함하고 유동 챔버에서 다차원 음향 정재파(acoustic standing wave)를 생성하기 위해 구동되도록 구성된 적어도 하나의 초음파 트랜스듀서를 가진다. 입자들의 적어도 일 부분은 다차원 음향 정재파에 포획된다. 입자들이 다차원 음향 정재파에 유지되는 동안 제2 배지가 유동 챔버를 통해 흘러 제1 배지를 씻어낸다. 이로써, 입자들은 제1 배지가 제2 배지로 교환되는 배지 교환을 경험할 수 있다.

일부 예들에서, 세척 공정을 수행하는데 사용되는 제2 배지의 볼륨은 유동 챔버의 볼륨과 동일할 수 있다. 일부 예들에서, 세척 공정을 수행하는데 사용되는 제2 배지의 볼륨은 유동 챔버 볼륨의 배수 또는 일부일 수 있다. 제2 배지는 생체적합성 세척 또는 완충 용액일 수 있다.

입자들은 세포들일 수 있다. 세포들은 CHO(Chinese hamster ovary) 세포들, NS0 하이브리도마(hybridoma) 세포들, BHK(baby hamster kidney) 세포들, 인간 세포들, 조절(regulatory) T-세포들, Jurkat T-세포들, CAR-T 세포들, B 세포들, 또는 NK 세포들, PBMC들(peripheral blood mononuclear cells), 조류, 식물 세포들, 박테리아 또는 바이러스들일 수 있다. 세포들은 마이크로캐리어들에 부착될 수 있다.

때때로, 적어도 하나의 초음파 트랜스듀서의 압전 물질는 복수의 압전 요소들로 형성된 압전 어레이의 형태로 이루어진다. 각각의 압전 요소는 포팅(potting) 물질에 의해 주변 압전 요소들로부터 물리적으로 분리될 수 있다. 압전 어레이는 압전 요소들을 서로 분리하는 하나 이상의 채널이 있는 단결정(single crystal)에 존재할 수 있다. 각 압전 요소는 그 자체 전극들 쌍에 개별적으로 연결될 수 있다. 압전 요소들은 서로 동위상으로 동작되거나 서로 위상차로 동작될 수 있다. 음향영동 디바이스는 적어도 하나의 초음파 트랜스듀서를 냉각시키기 위한 냉각 유닛을 더 포함할 수 있다.

다양한 실시예들에서, 초기 혼합물은 약 0.5 백만 particles/mL 내지 약 5 백만 particles/mL의 밀도를 가질 수 있다. 농축된 볼륨은 초기 혼합물의 볼륨보다 25 내지 약 50 배 작을 수 있다. 농축된 볼륨은 초기 혼합물의 입자 밀도보다 25 내지 약 50 배보다 큰 입자 밀도를 가질 수 있다.

또한, 다양한 실시예들에서 세포 배양으로부터 90% 초과의 세포들을 회수하는 방법들이 개시된다. 제1 배지 및 세포 배양의 초기 혼합물은 음향영동 디바이스의 유동 챔버를 통해 공급되고, 음향영동 디바이스는 유동 챔버에서 다차원 음향 정재파를 생성하기 위해 구동되도록 구성된 압전 물질을 포함하는 적어도 하나의 초음파 트랜스듀서를 포함한다. 적어도 하나의 초음파 트랜스듀서는 유동 챔버에서 다차원 음향 정재파를 생성하고, 이로써 음향 정재파 내에서 세포 배양을 농축하도록 구동된다. 초기 혼합물은 약 0.5 백만 cells/mL 내지 약 5 백만 cells/mL의 초기 세포 밀도를 가지며, 그리고 농축된 세포 배양은 초기 세포 밀도보다 적어도 25 배 큰 세포 밀도를 가진다.

일부 실시예들에서, 농축된 세포 배양은 초기 세포 밀도보다 25 내지 약 50 배 큰 세포 밀도를 가진다. 다른 실시예들에서, 농축된 세포 배양의 볼륨은 초기 혼합물의 볼륨보다 25 내지 약 50배 작다. 농축된 세포 배양은 약 35 분 이하에서 얻어질 수 있다.

또한 음향영동 디바이스들이 개시되고, 상기 디바이스들은: 유체 유입구, 제1 유출구, 및 제2 유출구를 가진 유동 챔버; 유동 챔버의 제1 벽에 근접한 적어도 하나의 초음파 트랜스듀서 - 적어도 하나의 초음파 트랜스듀서는 다차원 음향 정재파를 생성하기 위해 구동되도록 구성된 압전 물질을 포함함; 적어도 하나의 초음파 트랜스듀서에 대향한 유동 챔버의 제2 벽 상의 반사기; 및 적어도 하나의 초음파 트랜스듀서 및 유동 챔버의 제1 벽 사이에 위치된 열전 발전기를 포함한다.

음향영동 디바이스는 약 25 mL 내지 약 75 mL의 농축된 볼륨을 가질 수 있다. 음향영동 디바이스는 약 40억 내지 약 400 억의 세포들의 세포 용량을 가질 수 있다. 다양한 라인들은, 다양한 물질들을, 음향영동 디바이스로 제공하거나 음향영동 디바이스로부터 수용하는 컨테이너들에 음향영동 디바이스를 연결할 수 있다.

이들 및 다른 비-제한적인 특성들은 아래에서 보다 구체적으로 기술된다.

다음은 여기에 개시된 예시적인 실시예들을 제한하기 위한 목적이 아니라, 예시할 목적으로 제시되는 도면들에 대한 간략한 설명이다.
도 1은 입자들을 포획하고 강화된 중력 침강에 의해 유체로부터 입자들을 분리하는 음향 정재파를 생성하기 위해 트랜스듀서 및 반사기를 사용하는 예시적인 음향영동 공정을 도시한다.
도 2는 음향영동을 사용한 본 개시 내용에 따른 예시적인 세포 농축 및 세척 공정("정용여과(diafiltration)")을 도시한다.
도 3은 음향영동을 사용한 본 개시 내용에 따른 또 다른 예시적인 세포 농축 및 세척 공정(푸시 스루, push through)을 도시한다.
도 4는 좌측에서 우측으로, 위에서 아래로, 제2 배지 혼합물(청색으로 염색됨)이 디바이스로 흘러 들어가 점차적으로 제1 배지(적색으로 염색됨)를 교체하기 전에, 음향영동 디바이스에 포획된 세포들의 진행을 보여주는 6개의 사진을 나타낸다.
도 5[7]은 음향영동 디바이스의 성능을 나타내는 그래프이다. x축은 경과 시간(분)이며 0에서 40까지 5씩 증가한다. 좌측 y축은 투과물 밀도 감소(%)이며 0에서 100까지 10씩 증가한다. 우측 y축은 투과물 세포 밀도(×10⁶ cells/mL)이며, 0.00에서 2.00까지 0.20씩 증가한다. 상단 실선은 투과 감소 밀도(%)를 나타낸다. 하단 실선은 투과물 세포 밀도를 나타낸다. 페이지를 가로질러 실질적으로 수평으로 이어지는 중간 선은 참조 목적용으로 공급물 세포 밀도를 나타낸다.
도 6[14]은 낮은 세포 밀도 배양으로 본 개시 내용에 따른 음향영동 공정의 T-세포 농축 성능을 나타내는 그래프이다. x축은 경과 시간(분)이고 0에서 25까지 5씩 증가한다. 좌측 y축은 감소율(%)이고 0에서 100까지 10씩 증가한다. 우측 y축은 세포 밀도(×10⁶ cells/mL)이고 0.00에서 1.60까지 0.20씩 증가한다. 상부 실선은 투과 감소(%)를 나타낸다. 하부 실선은 투과물 세포 밀도를 나타낸다. 점선은 참조 목적용으로 공급물 세포 밀도를 나타낸다.
도 7[15]은 본 개시 내용에 따른 음향영동 공정에 대한 농도 및 유량(flow rate)에 관한 PDR(백분율 밀도 감소, Percent Density Reduction) 의존성을 나타내는 그래프이다. x축은 시간(분)이고 0에서 40까지 5씩 증가한다. y축은 투과물 밀도 감소(%)이고 0에서 100까지 10씩 증가한다. 원 형상의 데이터 포인트들을 가진 선은 5×10⁶ cells/mL의 초기 세포 농도를 가진 혼합물을 나타낸다. x 형상의 데이터 포인트들을 가진 선은 3×10⁶ cells/mL의 초기 세포 농도를 가진 혼합물을 나타낸다. 삼각형 형상의 데이터 포인트들을 가진 선은 20mL/minute의 유량에서 1×10⁶ cells/mL의 초기 세포 농도를 가진 혼합물을 나타낸다. 다이아몬드 형상의 데이터 포인트들을 가진 선은 10 mL/minute의 유량에서 1×10⁶ cells/mL의 초기 세포 농도를 가진 혼합물을 나타낸다.
도 8[16]은 높은 세포 밀도 배양으로 본 개시 내용에 따른 음향영동 공정에 대한 T-세포 성능을 나타내는 그래프이다. x축은 경과 시간(분)이며 0에서 25까지 5씩 증가한다. 좌측 y축은 감소율(%)이고 0에서 100까지 10씩 증가한다. 우측 y축은 세포 밀도(×10⁶ cells/mL)이며 0.00에서 3.00까지 0.50씩 증가한다. 상부 실선은 투과물 밀도 감소(%)를 나타낸다. 하부 실선은 투과물 세포 밀도를 나타낸다. 점선은 참조 목적용으로 공급물 세포 밀도를 나타낸다.
도 9[17]a는 트랜스듀서를 냉각하는 냉각 유닛을 포함하는 본 개시 내용에 따른 예시적인 음향영동 디바이스의 사시도이다. 도 9[17]b는 도 9[17]a의 디바이스의 분해도이다.
도 10[18]은 능동 냉각이 없는 음향영동 디바이스의 온도 프로파일을 나타내는 그래프이다. x축은 경과 시간(분)이며 0.00에서 20.00까지 2.00씩 증가한다. y축은 온도(℃)이며 17.00에서 33.00까지 2.00씩 증가한다. 그래프 우측을 따른 하단 선은 공급 온도(℃)를 나타낸다. 그래프 우측을 따른 상단 선은 코어 온도(℃)를 나타낸다. 그래프의 우측을 따른 중간 선은 투과 온도(℃)를 나타낸다.
도 11[19]은 트랜스듀서의 능동 냉각을 갖는 음향영동 디바이스의 온도 프로파일을 나타내는 그래프이다. x축은 경과 시간(분)이며 0.00에서 20.00까지 2.00씩 증가한다. y축은 온도(℃)이며 17.00에서 33.00까지 2.00씩 증가한다. 그래프 우측을 따른 하단 선은 공급 온도(℃)를 나타낸다. 그래프 우측을 따른 상단 선은 코어 온도(℃)를 나타낸다. 그래프 우측을 따른 중간 선은 투과 온도(℃)를 나타낸다.
도 12[20]는 본 개시 내용에 따른 마이크로캐리어들 및 세포들을 농축, 세척 및/또는 분리하는 공정을 도시한다. 좌측단 부분은 본 개시 내용에 따른 음향영동 디바이스에서 바이오리액터로부터 바이오리액터 혈청으로 둘러싸인 마이크로캐리어들 및 세포들의 복합체들를 수용하고 마이크로캐리어/세포 복합체들을 농축하는 제1 단계를 나타낸다. 중간 부분은 바이오리액터 혈청을 제거하기 위해 부착된 세포들로 농축된 마이크로캐리어들을 세척하는 제2 단계를 나타낸다. 우측단 부분은 마이크로캐리어들 및 세포들을 트립신화(trypsinizing) 또는 분리하는 제3 단계, 및 세포들로부터 마이크로캐리어들을 분리하는 제4 단계를 나타낸다. 하부 부분은 원하는 대로 사용될 수 있는 최종 세척 및 농축 단계를 나타낸다.
도 13[24]은 음향영동 디바이스로 공급되는 공급물에서 T 세포들이 부착된 마이크로캐리어들의 농축물(사진의 상부 행) 및 음향영동 디바이스에서 인출된 투과물에서 분리된 마이크로캐리어들 및 T 세포들의 농축물(사진의 하부 행)를 나타낸다. 어두운 원형 아이템들은 마이크로캐리어들을 나타내며, 더 밝은 영역은 T 세포들을 나타낸다.
도 14[25]는 공급물에서 T 세포들이 부착된 마이크로캐리어들의 농축물 및 투과물들에서 분리된 마이크로캐리어들 및 T 세포들의 농축물의 현미경 이미지들을 나타낸다.
도 15[26]은 시스템을 통한 공급 물질의 유동 경로를 보여주는 본 개시 내용에 따른 예시적인 음향영동 시스템의 개략도이다.
도 16[27]은 시스템을 통한 세척 물질의 유동 경로를 보여주는 도 28의 예시적인 음향영동 시스템의 개략도이다.
도 17[28]은 시스템의 유출을 보여주는 도 28의 예시적인 음향영동 시스템의 개략도이다.
도 18[29]은 시험 A의 결과들을 나타내는 2축 그래프이다. 좌측 y축은 투과물에서 세포들의 감소율이며, 0에서 100%까지 20% 간격으로 진행된다. 우측 y축은 투과물의 세포 밀도(백만 cells/mL 단위)이며, 0에서 1.00까지 0.20 간격으로 진행된다. x축은 경과 시간(분)이며, 0에서 33분까지 3 간격으로 진행된다. 점선은 0.98 백만 cells/mL이였던 초기 세포 밀도를 나타낸다.
도 19[30]은 시험 B의 결과들을 나타내는 2축 그래프이다. 좌측 y축은 투과물에서 세포들의 감소율이며, 0에서 100%까지 20% 간격으로 진행된다. 우측 y축은 투과물의 세포 밀도(백만 cells/mL 단위)이며, 0에서 1.00까지 0.20 간격으로 진행된다. x축은 경과 시간(분)이며, 0에서 33분까지 3 간격으로 진행된다. 점선은 0.85 백만 cells/mL이였던 초기 세포 밀도를 나타낸다.
도 20[31]은 시험 C의 결과들을 나타내는 2축 그래프이다. 좌측 y축은 세포들의 감소율이고, 0에서 100%까지 20% 간격으로 진행된다. 우측 y축은 백만 cells/mL 단위의 세포 밀도이며, 0에서 4.00까지 1.00 간격으로 진행된다. x축은 경과 시간(분)이고 0에서 30분까지 3 간격으로 진행된다. 점선은 4.08 백만 cells/mL이였던 초기 세포 밀도를 나타낸다.
도 21[33]은 농축물 세척 공정에서 세포들의 생존력을 나타내는 그래프이다.
도 22[34]는 세포 밀도 대 전력을 나타내는 그래프이다.
도 23[35]은 면처리된(faceted) 반사기를 갖는 낮은 세포 밀도 적용들을 위한 농축물 세척 디바이스 및 평면 반사기를 갖는 높은 세포 밀도 적용들을 위한 농축물 세척 디바이스의 측단면도이다.
도 24[36]은 낮은 및 높은 세포 밀도 적용들을 갖는 디바이스들의 동작을 보여주는 도 35의 디바이스들의 측단면도이다.
도 25[37]은 농축물 세척 디바이스로 T-세포들의 처리를 보여주는 일련의 사진들이다.
도 26[38]은 시간 경과에 따른 폐기 생존 세포 밀도를 나타내는 그래프이다.

본 개시 내용은 원하는 실시예들에 대한 다음의 상세한 설명 및 이에 포함된 예들을 참조함으로써 보다 용이하게 이해될 수 있다. 다음 명세서 및 하기의 청구범위에서, 다음 의미를 가지는 것으로 정의될 다수의 용어들에 대한 참조가 이루어질 것이다.

다음의 상세한 설명에서 특정 용어들이 명확성을 위해 사용되지만, 이들 용어는 도면에서 예시를 위해 선택된 실시예들의 특정 구조만을 지칭하는 것으로 의도되며, 본 개시 내용의 권리 범위를 한정하거나 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 이하, 도면 및 하기 상세한 설명에서, 유사한 숫자 표시는, 유사한 기능의 구성요소를 지칭하는 것으로 이해되어야 한다. 추가로, 도면은 축척되지 아니한 것으로 이해되여야 한다.

단어의 단수 형태는, 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다.

명세서 및 청구항에서 사용되는 바와 같이, 용어 "포함하는"는 "이루어지는" 및 "본질적으로 이루어지는" 실시예들을 포함할 수 있다. 용어들 "포함하다", "포함한다", "가진", "가지다", "일 수 있다", "포함하고" 및 이들의 변형은 여기에 사용되는 바와 같이, 명명된 구성요소들/단계들의 존재를 필요로 하고 다른 구성요소들/단계들의 존재를 허용하는 개방형 전이 어구들, 용어들, 또는 단어들로 의도된다. 그러나, 그러한 설명은 또한, 단지 명명된 구성요소들/단계들의 존재를, 그로부터 발생될 수 있는 임의의 파생물들과 함께, 허용하고 다른 구성요소들/단계들을 배제하는, "이루어지는" 및 "본질적으로 이루어지는" 열거된 구성요소들/단계들로서, 구성들 및 공정들을 기술하는 것으로 해석되어야 한다.

수치 값은 동일한 수의 유효 숫자로 감소되는 경우 동일한 수치 값 및 값을 결정하기 위해 본 출원에서 기재된 타입의 종래의 측정 기술의 실험 오차 미만 만큼 명시된 값과는 상이한 수치 값을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.

여기에 개시된 모든 범위는, 인용된 말단점을 포함하고, 독립적으로 조합 가능하다(예를 들어, "2 grams 내지 10 grams"의 범위는, 말단점인, 2 grams 및 10 grams, 및 모든 중간 값을 포함한다).

"약" 및 "실질적으로"와 같은 용어 또는 용어들에 의해 수정된 값은 특정된 정확한 값으로 제한되지 않을 수 있다. 근사 언어는 값을 측정하는 기구의 정밀도에 대응할 수 있다. 한정어 "약"은 또한 두 말단점의 절대 값에 의해 정의된 범위를 개시하는 것으로 간주되어야 한다. 예를 들어, "약 2 내지 약 4"의 표현은 또한 "2 내지 4"의 범위를 개시한다.

여기에 사용된 많은 용어는 상대적인 용어임을 유의하여야 한다. 예를 들어, 용어 "상단" 및 "하단"은 위치에서 서로에 대해 상대적인데, 예를 들어, 상단 구성요소는, 지정된 방향에서 하단 구성요소보다 더 높은 고도에 위치하지만, 이들 용어는, 디바이스가 뒤집히면, 변경될 수 있다. 용어 "유입구" 및 "유출구"는, 주어진 구조물에 대하여 그들을 통해 흐르는 유체와 관련이 있는데, 예를 들어, 유체는 유입구를 통해 구조물로 흐르고, 유출구를 통해 구조물 밖으로 흐른다. 용어 "상류" 및 "하류"는, 유체가 다양한 구성요소들을 통해 유동하는 방향과 관계가 있는데, 예를 들어, 유체는 하류 구성요소를 통해 흐르기 전에 상류 구성요소를 통해 흐른다. 루프(loop)에서, 제1 구성요소는 제2 구성요소의 상류 및 하류 둘다인 것으로 기재될 수 있음에 유의해야 한다.

용어 "수평" 및 "수직"은, 절대 기준, 예를 들어, 지상(ground level)에 대한 방향을 나타내는데 사용된다. 용어 "상향" 및 "하향"은, 또한 절대 기준과 관련이 있다; 상향 흐름은 항상 지구의 중력에 대항한다.

본 출원은 "동일한 자릿수(the same order of magnitude)"를 지칭한다. 더 작은 숫자로 나눈 더 큰 숫자의 몫이 적어도 1이고 10보다 작은 값인 경우, 두 숫자는 동일한 자릿수이다.

본 개시 내용의 음향영동 기술은 1차 또는 호스트 유체에서 물질들(그 예로 입자들 또는 2차 유체)을 농축, 세척 및/또는 분리하기 위해 음향 정재파들을 사용한다. 특히, 도 1의 좌측 상부 이미지(A)에 도시된 바와 같이, 초음파 트랜스듀서(T)는 유체에 음향파(acoustic wave)를 생성하고, 상기 음향파는 초음파 트랜스듀서의 바로 맞은편에 위치한 반사기(R)와 상호작용하여 음향 정재파를 생성한다. 반사기(R)가 도 1에 도시되지만, 음향 정재파를 형성하기 위해 음향 에너지를 반사 및/또는 생성하는데 또 다른 트랜스듀서가 사용될 수 있다.

도 1의 우측 상부 이미지(B)에 도시된 바와 같이, 호스트 유체 및 상기 호스트 유체에 수반된 물질이 음향 정재파를 통해 위쪽으로 유동함에 따라, 음향 정재파(들)는 물질(예를 들어, 유체들 및/또는 입자들을 포함한 2차 상(phase) 물질들)을 포획한다(유지하거나 붙잡는다). 물질에서 음향장(acoustic field)의 산란은 3차원 포획장으로 작용하는 3차원 음향 방사력을 초래한다.

초음파 정재파와 함께 발생되는 3차원 음향 방사력은 본 개시 내용에서 3차원 또는 다차원 정재파로 지칭된다. 음향 방사력은 입자가 파장에 비해 작을 때 물질의 입자 볼륨(예를 들어 반경의 세제곱)에 비례하다. 음향 방사력은 주파수 및 음향 콘트라스트 팩터에 비례하다. 음향 방사력은 음향 에너지에 따라 조정된다(scales)(예를 들어, 음향 압력 진폭의 제곱). 조화 여기(harmonic excitation)의 경우, 힘의 사인파 공간적 변화는 입자들을 정재파들 내의 안정된 위치들로 구동시킨다. 입자들 상에 가해지는 음향 방사력이 유체 항력(fluid drag force)과 부력 및 중력의 결합된 효과보다 강할 때, 입자들은 도 1의 우측 상부 이미지(B)에 도시된 바와 같이 음향 정재파 장 내에 포획될 수 있다.

도 1의 좌측 하부 이미지(C)에서 볼 수 있는 바와 같이, 이러한 포획은 포획된 입자들의 합침(coalescing), 뭉침(clumping), 결집(aggregating), 응집(agglomerating), 및/또는 클러스터링(clustering)을 초래한다. 추가적으로, 2차 입자 간 힘들, 그 예로 Bjerkness 힘들은 입자 응집에 도움을 준다.

입자들이 계속해서, 합쳐지고, 뭉쳐지고, 결집되고, 응집되고 그리고/또는 클러스터링되기 때문에, 입자들은 입자 클러스터 상의 중력이 음향 방사력을 극복하는 소정의 크기로 성장될 수 있다. 그러한 크기에서, 입자 클러스터는 도 1의 우측 하부 이미지(D)에 도시된 바와 같이 음향 정재파에서 떨어질 수 있다.

바람직하게는, 초음파 트랜스듀서(들)는 유체에서 3차원 또는 다차원 음향 정재파를 생성하고, 상기 음향 정재파는 횡력을 부유 입자들 상에 가하여 축력(axial force)을 동반함으로써, 정재파의 입자 포획 능력을 증가시킨다. 평면 또는 1차원 음향 정재파는 축 방향 또는 파동 전파 방향으로 음향력을 제공할 수 있다. 평면 또는 1차원 음향파 발생에서 횡력은 축력보다 2 자릿수(two orders of magnitude) 작을 수 있다. 다차원 음향 정재파는 평면 음향 정재파의 것보다 상당하게 큰 횡력을 제공할 수 있다. 예를 들어, 횡력은 다차원 음향 정재파에서 축력과 동일한 자릿수를 가질 수 있다.

본 개시 내용의 음향 정재파들은 정재파의 제1 배지에 부유된 입자들(예를 들어, 치료 세포들 그 예로 T 세포들, B 세포들, NK 세포들)을 포획하는데 사용될 수 있다. 그 후 제1 배지는 제2 배지(예를 들어, 생체적합성 세척 또는 완충 용액)로 교체될 수 있다. 달리 말하면, 입자들의 호스트 유체는 교체될 수 있다. 제1 배지를 제2 배지로 교체하기 전에, 음향영동은 도 2에 도시된 바와 같이, 정용여과 공정을 수행하는데 사용될 수 있다.

도 2에서, 예를 들어 1×10⁶ cells/mL 미만의 낮은 세포 밀도를 가진 초기 혼합물로 시작하여, 음향영동은 초기 혼합물의 볼륨을, 예를 들어 적어도 10×, 20×, 그리고 최대 100× 이상만큼으로 감소시키는데 사용될 수 있다. 세포 농도는 적어도 10×, 20× 및 최대 100× 이상만큼 증가될 수 있다. 초기 감소 공정은 제1 볼륨 감소 단계(A)이다. 다음으로, 제2 배지(예를 들어, 생체적합성 세척 또는 완충 용액)는 단계(B)에 나타난 바와 같이, 제1 배지를 적어도 부분적으로 대체하기 위해 도입될 수 있다. 그 다음으로, 세포들 및 제2 배지의 새로운 혼합은 음향영동 볼륨 감소 단계(C)를 거칠 수 있다. 이러한 일련의 동작들은 "정용여과" 공정으로 지칭된다.

도 3은, 입자들/세포들이 음향 정재파에 포획되고 음향영동 디바이스에 유지되는 단일 단계의 푸시-시루 공정을 도시한다. 제2 배지(예를 들어, 생체적합성 세척 또는 완충 용액)는 그 후에, 제1 배지를 효과적으로 "세척"하기 위해, 음향영동 디바이스로 흐른다. 푸시-시루 공정을 사용하면, 90% 초과, 최대 99% 이상의 제1 배지는 입자들/세포들로부터 제거될 수 있다. 푸시-시루 공정은 도 2의 정용여과 공정보다 적은 완충 용액과 적은 시간을 사용하는 연속적인 단일-사용 공정으로서 사용될 수 있다. 상기 공정용 공급물 볼륨들은 500 mL 내지 3L일 수 있고, 공정 시간은 60 분 미만일 수 있으며, 유입되는 공급 밀도는 mL당 약 100만 세포들(1M/mL) 미만으로부터 mL당 약 4000만 세포들(40M/mL) 까지일 수 있다. 상기 공정은 세포들의 생존력에 영향을 미치지 않으며, 최종 농축물 볼륨은 1M/mL의 경우 7 mL 미만이고, 40M/mL의 경우 50 mL 미만이다. 1M/mL로의 시작 농도로부터 농도 팩터는 15 배, 예를 들어, 105 mL 내지 7 mL이며, 그리고 40M/mL로의 시작 농도로부터 농도 팩터는 140 배, 예를 들어, 7 L 내지 50 mL이다.

도 4는 좌측에서 우측으로, 위에서 아래로, 제2 배지 혼합물(청색으로 염색됨)이 디바이스로 흘러 들어가 점차적으로 제1 배지(적색으로 염색됨)를 교체하기 전에, 음향영동 디바이스에 포획된 세포들의 진행을 보여주는 6개의 사진을 나타낸다. 도 4에서, 150 mL 공급물 볼륨은 제2 배지에 대해 80 mL의 전기천공 배지 세척과 함께 사용되었다. 농축물은 10 mL/minute 유량으로 인출되었다. 이들 사진에서 볼 수 있는 바와 같이, 시간이 지남에 따라 제1 배지는 제2 배지로 교체된다.

도 5[7]는 약 1.5×10⁶ cells/mL의 공급물 세포 밀도를 가진 혼합물에 대해 2.234 MHz의 고정 주파수에서 동작되는 음향영동 디바이스의 성능을 보여주는 그래프이다. 볼 수 있는 바와 같이, 디바이스는 약 35 분에 걸쳐 95% 초과의 투과물 밀도 감소(PDR)와, 그리고 동일한 기간에 걸쳐 0.10×10⁶ cells/mL 미만의 투과물 세포 밀도를 달성했다.

본 개시 내용의 음향영동 디바이스들 및 시스템들의 압전 트랜스듀서(들)는 단일 모놀리식 압전 물질들일 수 있거나, 압전 물질들 어레이로 제조될 수 있다. 압전 물질은 세라믹 물질, 결정 또는 다결정, 그 예로 PZT-8(lead zirconate titanate)일 수 있다.

음향영동 디바이스의 농축 효율은 테스트되었다. 먼저, 1×10⁶ cells/mL의 세포 밀도를 가진 T-세포 부유액이 사용되었다. 약 500 내지 1000 mL의 공급물 볼륨은 10-15 mL/minute의 유량으로 사용되었다. 결과들은 도 6[14]에 그래프로 표시된다. 디바이스는 10 분의 테스트에 걸쳐, 10× 내지 20×의 농도 팩터, 90% 세포 회수율 및 77% 세척 효율(즉, 제2 배지에 의해 대체된 제1 배지의 양)을 나타내었다. 10 ℃의 온도 증가가 관찰되었다.

그 후, 효모 혼합물은 사용되어 농도 및 유량에 대한 밀도 감소 백분율(PDR)의 의존성을 시험하였다. 결과들은 도 7[15]에 그래프로 표시되어 있다. 여기에서 보이는 바와 같이, 초기 세포 농도들이 높을수록 일반적으로 PDR이 커진다. 추가적으로, 변화하는 유량(20 mL/min 내지 10mL/min)은 PDR에 대해 관찰된 효과를 나타내지 않았다.

음향영동 디바이스의 농축 효율은 더 높은 세포 밀도로 다시 테스트되었다. 5×106 cells/mL의 세포 밀도를 가진 T-세포 부유액이 사용되었다. 1000 mL의 공급물 볼륨은 10-15 mL/minute의 유량으로 사용되었다. 결과들은 도 8[16]에 그래프로 표시된다. 디바이스는 1 시간의 테스트에 걸쳐, 10× 이상의 농도 팩터, 90% 세포 회수율 및 77% 세척 효율을 나타내었다. 10 ℃의 온도 증가가 다시 관찰되었다.

테스트 동안, 초음파 트랜스듀서의 능동 냉각이 더 큰 처리량 및 효율성 및 더 많은 전력을 가져온다는 것도 발견되었다. 이와 같이, 트랜스듀서를 능동적으로 냉각하기 위한 냉각 유닛이 개발되었다. 도 9[17]a는 완전히 조립된 상태에서 냉각 유닛을 포함하는 음향영동 디바이스(7000)를 도시한다. 도 9[17]b는 부분 분해도에서 다양한 구성요소들이 있는 디바이스(7000)를 도시한다. 이제, 도 9[17]b를 참조하면, 디바이스는 유동 챔버(7010)의 대향 벽들 상의 반사기(7050) 및 초음파 트랜스듀서(7020)를 포함한다. 반사기(7050)는 유동 챔버(7010)의 내부가 보일 수 있도록 투명한 물질로 만들어질 수 있음에 유의한다. 초음파 트랜스듀서는 유동 챔버의 제1 벽에 근접하게 위치된다. 반사기는 유동 챔버의 제2 벽에 근접하게 위치되거나, 유동 챔버의 제2 벽을 구성할 수 있다. 냉각 유닛(7060)은 초음파 트랜스듀서(7020)과 유동 챔버(7010) 사이에 위치된다. 냉각 유닛(7060)은 초음파 트랜스듀서(7020)에 열적으로 결합된다. 이러한 도면에서, 냉각 유닛은, Seebeck 효과를 사용하여 열 플럭스(즉, 온도 차이들)를 전기 에너지로 변환하여, 유동 챔버로부터 열을 제거하는 열전 발전기의 형태로 이루어질 수 있다. 달리 말하면, 음향영동 디바이스를 동작하는 동안 원하지 않는 폐열로부터 전기가 발생될 수 있다.

유동 챔버의 다양한 유입구들 및 유출구들(예를 들어 유체 유입구, 농축물 유출구, 투과물 유출구, 재순환 유출구, 배출/수확 유출구)이 여기에 도시되지 않음을 유의한다. 냉각 유닛은 초음파 트랜스듀서를 냉각하는데 사용될 수 있으며, 이는 디바이스가 장기간(예를 들어, 관류) 동안, 반복되는 공정 및 재순환과 함께 연속적으로 진행되어야 할 때 특히 유리할 수 있다.

대안적으로, 냉각 유닛은 또한 유동 챔버(7010)를 통해 흐르는 유체를 냉각시키는데 사용될 수 있다. 원하는 적용들을 위해, 세포 배양은 실온(~20℃) 부근에서, 최대 28℃ 부근에서 유지되어야 한다. 이는, 세포들이 더 높은 온도를 경험할 때 그들의 신진 대사율이 증가하기 때문이다. 그러나, 냉각 유닛이 없으면, 세포 배양의 온도는 34℃만큼 높게 올라갈 수 있다.

이들 구성요소들은 모듈식이며 서로 별도로 변경되거나 전환될 수 있다. 이로써, 주어진 구성요소에 새로운 변경들 또는 수정들이 있을 때, 구성요소는 시스템의 나머지를 동일하게 유지하면서 교체될 수 있다.

목표는 약 100만 cells/mL의 밀도와 함께 약 1 리터(L) 내지 약 2L의 볼륨을 가진 배양 백(culture bag)으로 시작되고, 이 백이 약 25 mL 내지 약 30 mL의 볼륨으로 농축하고, 그 후에 약 1 시간(또는 그 미만) 내에 성장 배지를 세척하거나 배지를 교환하는 것이다. 바람직하게는, 시스템은 감마 방사선로 조사될 때 안정된 물질들로 만들어질 수 있다.

트랜스듀서에 냉각 유닛을 제공하는 이점들은 도 10[18] 및 도 11[19]에서 볼 수 있다. 도 10[18]은 임의의 능동 냉각 없이(예를 들어, 트랜스듀서용 냉각 유닛 없이) 음향영동 디바이스의 온도 프로파일을 그래프로 보여준다. 도 10[18]에서 보는 바와 같이, 공급과 코어(예를 들어, 트랜스듀서) 사이의 온도 차이는 8.6 ℃였다. 도 11[19]은 능동 냉각을 갖는(예를 들어, 트랜스듀서용 냉각 유닛을 갖는) 음향영동 디바이스의 온도 프로파일을 그래프로 도시한다. 도 11[19]에서 보는 바와 같이, 능동 냉각의 사용을 통해, 공급과 코어 사이의 온도 차이는 6.1 ℃로 감소되었다.

도 12[20]는 세포들로부터 마이크로캐리어들을 농축, 세척 및 분리하기 위해 4 단계 공정(옵션으로 제5 단계를 갖음)을 도시한다. 공정에서 제1 단계는 여기에 기술된 것과 같이, 음향영동 디바이스에서 세포들이 부착된 마이크로캐리어들을 농축시키는 것을 수반한다. 마이크로캐리어들 및 부착된 세포들은 바이오리액터로부터, 부착된 세포들을 갖는 마이크로캐리어들을 수용함으로써, 음향영동 디바이스에 도입될 수 있다. 바이오리액터에서, 마이크로캐리어들 및 세포들은 제1 배지(예를 들어, 바이오리액터에서 세포들을 생존 가능하게 유지하는데 사용된 성장 혈청 또는 보존 물질)에 부유된다. 제1 배지에 의해 둘러싸인 부착된 세포들을 갖는 마이크로캐리어들은 음향영동 디바이스에서 발생된 음향 정재파(들)에 의해 농축된다. 제2 단계에서, 부착된 세포들을 갖는 농축된 마이크로캐리어들은 그 후에 제1 배지(예를 들어, 바이오리액터 성장 혈청 또는 보존 물질)를 제거하기 위해 제2 배치로 세척된다. 그 후 제3 단계는 효소를 포함하는 제3 배지를 음향영동 디바이스에 도입하여 제2 배지의 효소 작용을 통해 마이크로캐리어들로부터 세포들을 분리하는 것이다. 특정 실시예들에서, 트립신은 마이크로캐리어들로부터 세포들을 효소같이 분리하는데 사용된 효소이다. 다차원 음향 정재파는 그 후 마이크로캐리어들로부터 세포들을 분리하는데 사용될 수 있다. 일반적으로, 이러한 분리는 다차원 음향 정재파에서 마이크로캐리어들을 포획하여 실행되면서, 분리된 세포들은 제3 배지로 통과된다. 그러나, 원하는 경우 세포들이 대신에 포획될 수 있다. 마지막으로, 분리된 세포들은 원하는 대로 옵션으로 다시 농축되고 세척될 수 있다.

다차원 음향 정재파에서 농축 및 포획/유지된 후에, 마이크로캐리어들은 임계 크기로 합쳐지고, 뭉쳐지고, 결집되고, 응집되고, 그리고/또는 클러스터링될 수 있고 그 시점에서 마이크로캐리어들은 강화된 중력 침강으로 인해 음향 정재파에서 떨어진다. 마이크로캐리어들은 음향 정재파 아래에 위치된 음향영동 디바이스의 수집기로 떨어져 유동 챔버로부터 제거될 수 있다.

도 13[24]은 4× 배율 하에 음향영동 디바이스에서 SoloHill 마이크로캐리어들 및 T-세포들의 존재를 나타낸다. 상부 행의 이미지들은 음향영동 이전에 공급물에서의 마이크로캐리들 및 세포들을 보여준다. 하부 행의 이미지들은 세포들이 음향영동에 의해 분리된 이후 투과물에서의 마이크로캐리어들 및 세포들을 보여준다. 음향영동의 적용에 따른 마이크로캐리어들의 수의 차이는 마이크로캐리어들을 디바이스에 포획하고 세포들을 그로부터 분리하는 디바이스를 사용하는 가능성을 입증한다. 이 기술의 가능성 및 결과들은 도 14[25]의 이미지들에 의해 추가로 입증되고, 이는 좌측에서 우측으로, 농축 및 제1, 제2 및 제3 세척 후에, 공급물(상부 행의 이미지들)에서 그리고 투과물(하부 행의 이미지들)에서 마이크로캐리어들 및 세포들의 현미경 이미지들을 보여준다.

음향영동 농축, 세척 및 분리 공정의 테스트는 상기 공정이 세포 요법 및 마이크로캐리어 적용들에 적절함을 보여주었다. 농축 및 세척 단계들은 99% 초과의 결과적인 효율로 수행되었으며, 분리 단계, 예를 들어, 마이크로캐리어들로부터 세포들을 분리하는 단계는 98% 초과의 효율로 수행되었다.

도 15-17[26-28]은 유체의 흐름을 제어하는 솔레노이드 핀치 밸브들(solenoid pinch valves)을 갖는 일회용 음향영동 디바이스(2810)를 포함하는 음향영동 시스템/공정(2800)의 또 다른 예시적인 실시예를 도시한다. 도 15[26]의 좌측부터 시작하여, 시스템은 공급 탱크(2820), 세척 탱크(2830) 및 공기 흡입구(2805)를 포함한다. 공기 흡입구(2805)는 공기 흡입구 밸브(2804)를 통해 이어진다. 공급 라인(2821)은 공급 탱크(2820)로부터 이어진다. 공기 흡입구 및 공급 라인(2821)은 Y-커넥터에 의해 공통 공급 라인(2811)으로 함께 연결되고, 상기 공통 공급 라인은 공급 선택기 밸브(2801)로 이어진다. 세척 라인(2831)은 세척 탱크(2830)로부터 이어지고, 또한 공급 선택기 밸브(2801)로 이어진다. 공급 선택기 밸브(2801)는 주어진 시간에 하나의 라인만 열리도록 한다(밸브들(2802, 2803)도 이러한 방식으로 동작함). 세척 라인(2831) 및 공급 라인(2811)은 공급 선택기 밸브(2801) 하류에 있는 Y-커넥터에 의해 입력 라인(2812)으로 함께 연결된다. 입력 라인(2812)은 펌프(2806)를 통과하고, 공급 선택기 밸브(2801) 하류 및 음향영동 디바이스(2810) 상류에 위치된 유입용 선택기 밸브(2802)로 나아간다. 유입용 선택기 밸브(2802)는 공급 포트(2602) 또는 세척/유출 포트(2604)를 통해 음향영동 디바이스(2810)로 공급 또는 세척의 유입을 선택적으로 제어한다. 공급 라인(2813)은 유입용 선택기 밸브(2802)로부터 공급 포트(2602)로 이어진다. 세척 라인(2814)은 유입용 선택기 밸브(2802)로부터 공통 라인(2815)으로 그리고 세척/유출 포트(2604)로 이어진다.

도 15[26]의 우측 상에서, 유출용 선택기 밸브(2803)는 음향영동 디바이스(2810) 하류에 위치되고 그로부터 유체의 유출을 제어한다. 폐기물 라인(2816)은 폐기물 포트(2608)로부터 유출용 선택기 밸브(2803)를 통해, 차후에 폐기 탱크(2850)로 이어진다. 공통 라인(2815)은 유출 라인(2817)으로 이어지고, 상기 유출 라인은 그 후에 유출용 선택기 밸브(2803)을 통과하고, 차후에 농축 탱크(2840)로 나아간다. 이들 탱크들(2840, 2850)은, 예를 들어, 수집 백들일 수 있다. 이에 따라 유출용 선택기(2803)는 농축 탱크 및 폐기 탱크로의 유체 흐름을 선택적으로 제어한다.

농축물 라인 및 폐기물 라인의 말단부들에서 수집 백들의 사용은, 세포들 및 세포 물질들의 농축, 세척, 및/또는 분리가 일어날 수 있는, 둘러싸인 1차 환경을 유리하게 생성하여, 세포들/세포 배양/세포 물질이 가능한 침입, 병원체, 또는 유해할 수 있는 외부 세포 영향에 노출되지 않도록 도움을 준다.

도 15[26]는 또한 시스템을 통해 공급 물질의 유동 경로를 도시한다. 이 예시적인 실시예에서, 공급 선택기 밸브(2801)는 하부 개방(및 상부 폐쇄)으로 동작되어, 공급 탱크(2820)로부터의 공급물은 상기 공급 선택기 밸브를 통해 흐른다. 유입용 선택기 밸브(2802)는 상부 개방(및 하부 폐쇄)으로 동작되어, 공급 물질은 공급 포트(2602)를 통해 음향영동 디바이스(2810)에 들어간다. 유출용 선택기 밸브(2803)는 또한 상부 개방(및 하부 폐쇄)으로 동작되어, 공급 물질의 유체/제1 배지는 폐기 탱크(2850)로 흘러 들어간다. 공급 물질(예를 들어, 마이크로캐리어들 또는 세포들)에서 표적 입자들은 여기에서 상세하게 설명된 바와 같이, 다차원 음향 정재파(들)의 작용에 의해 음향영동 디바이스(2810)에 포획된다.

도 15[26]에 도시된 시스템은 폴리카보네이트 및 스테인리스 스틸로 구성된 음향 요소를 가진다. 관은, 무균 용접 공급 백들이 세포 처리에 사용되도록 하는 1/8" PVC의 얇은 벽 관이다. 일회용 펄스리스(pulseless) 펌프 헤드 NaoStedi 2x2.5mL이 사용된다. 관, 음향 요소 및 펌프는 이중 포장되며(double-bagged), 감마선이 조사된다. 시스템은 준비(priming), 재순환, 농축, 배지 교환, 세척 및/또는 수집을 포함하는 공정들을 허용한다. 예시적인 시스템은 총 세포 용량이 약 40 억 세포들이고, 최종 농축물 볼륨이 약 6 mL 내지 약 50 mL인 최대 3L의 공급으로 작동될 수 있지만, 상기 시스템은 다른 예시적인 구현들로 보다 크거나 보다 작은 파라미터 범위들을 가질 수 있다.

도 16[27]은 시스템을 통한 세척 물질의 유동 경로를 도시한다. 공급 선택기 밸브(2801)는 상부 개방(및 하부 폐쇄)으로 동작되어, 세척 탱크(2830)로부터의 세척 물질은 상기 공급 선택기 밸브를 통해 흐른다. 유입용 선택기 밸브(2802)는 하부 개방(및 상부 폐쇄)로 동작되고, 유출용 선택기 밸브(2803)는 상부 개방(및 하부 폐쇄)로 동작된다. 그 결과, 세척 물질은 세척 유입구로서 동작하는 세척/유출 포트(2604)를 통해 음향영동 디바이스(2810)로 들어간다. 폐쇄된 유출용 선택기 밸브(2803)는 세척 물질이 농축 탱크(2840)에 들어가지 않도록 한다는 점에 유의한다. 그 후, 세척 물질은 음향영동 디바이스(2810)을 통과하고 제1 배지(예를 들어, 바이오리액터 혈청 또는 보존 물질)를 제거할 수 있다. 그 후, 세척 물질은 폐기물 포트(2608)을 통해 배출되고 폐기 탱크(2850)로 흐른다. 표적 입자들은 음향영동 디바이스(2810)에서 포획된 채로 남게 된다.

도 17[28]은 시스템의 유출(예를 들어, 표적 입자들의 수집)을 도시한다. 공기 흡입구 밸브(2804)는 개방된다. 공급 선택기 밸브(2801)는 하부 개방(및 상부 폐쇄)으로 동작되며, 그리고 유입용 선택기 밸브(2802)는 상부 개방(및 하부 폐쇄)으로 동작되어, 공기는 공급 포트(2602)를 통해 음향영동 디바이스(2810)에 들어간다. 공기는 일반적으로 음향영동 디바이스(2810)로부터 표적 입자들의 클러스터들을 제거하는데 도움을 준다. 유출용 선택기 밸브(2803)는 하부 개방(및 상부 폐쇄)로 동작된다. 표적 입자들은 세척/유출 포트(2604)를 나와, 공통 라인(2815), 유출 라인(2817)를 통해 차후에 농축 탱크(2840)로 흐른다.

농축 및 세척 세포 배양은 산업용 생물학적 제품들을 생산하는데 유용하다. 본 개시 내용의 시스템들은 보다 큰 볼륨들의 취급을 위해 지속적으로 개선되고 확장될 수 있다.

일부 예들에서, 본 개시 내용의 음향영동 디바이스들은 약 25 mL 내지 약 75 mL의 범위의 농축물 볼륨을 가질 수 있다. 디바이스들은 약 40 억 내지 약 400 억의 세포들, 또는 약 40 억 내지 약 80 억의 세포들, 또는 약 200 억 내지 약 400 억의 세포들, 또는 약 160 억 내지 약 350 억 세포들의 총 세포 용량을 가질 수 있다. 음향영동 디바이스들에 들어가고 나가는 유체는 약 16000만 cells/mL 내지 약 67000만 cells/mL, 또는 약 16000만 cells/mL 내지 약 32000만 cells/mL, 또는 약 26000만 cells/mL 내지 약 53500만 cells/mL, 또는 약 30500만 cells/mL 내지 약 67000만 cells/mL, 또는 약 50만 cells/mL 내지 약 500만 cells/mL의 세포 밀도를 가질 수 있다.

다음 예들은 본 개시 내용의 디바이스들 및 공정들을 예시하기 위해 제공된다. 예들은 단지 예시일뿐이며, 개시 내용을 여기에 기재된 물질들, 조건들, 또는 공정 파라미터들에 제한하도록 의도되지 않는다.

예들

Jurkat T-세포들을 농축시키는 본 개시 내용의 음향영동 시스템의 능력이 테스트되었다. Jurkat T-세포들은 11 마이크로미터(㎛) 내지 14 ㎛의 직경을 가진다. 음향영동 디바이스는 사용되었고, Beckman Coulter Vi-세포 X가 세포 밀도 감소를 측정하기 위해 다양한 테스트 조건들에서 사용되었다.

제1 시험 A에서, T-세포들은 농축되었고, 투과물의 세포 밀도는 측정되었다. 점선은 공급물 세포 밀도를 나타낸다. 바람직하게는, 투과물에서의 세포 밀도는 가능한 한 낮으며, 이는 세포들이 농축되어 유지됨을 나타낸다. 도 18[29]에서의 그래프는 시간 경과에 따른 시험 A의 결과들을 도시한다. 상기 결과들은 0.0 내지 0.2 백만 cells/mL의 투과물에서의 매우 낮은 세포 밀도를 보여주며, 이는 대부분의 세포들이 농축되어 있음을 나타낸다. 결과들은 또한 80% 내지 99%의 높은 투과 감소율을 보여준다.

제2 시험 B에서, T-세포들은 농축되었고, 투과물의 세포 밀도는 측정되었다. 점선은 공급물 세포 밀도를 나타낸다. 도 19[30]는 시간 경과에 따른 결과들을 보여준다. 상기 결과들은 우수한 성능을 보여주었고, 이때 투과물 세포 밀도는 1 분 후에 0.1 백만 cells/mL 이하이고, 2 분 후에는 투과물 감소가 95% 이상이다.

제3 시험 C에서, T-세포들은 농축되었고, 세척되었다. 농축은 먼저 18 분 동안 일어났고, 세척은 차후에 수행되었다. 도 20[31]은 시간 경과에 따른 결과들을 보여준다. 점선은 공급물 세포 밀도를 나타낸다. 실선 수직선들은 농축 시스템 볼륨들이 처리될 때를 나타낸다(총 3개의 볼륨들이 처리됨). 이 그래프는 농축물 및 투과물(투과물뿐만 있는 것이 아님)에 관한 데이터를 포함함을 유의한다. 농축물로부터 얻어진 모든 세포들은 예를 들어 세척을 통해 유지되었고, 농축된 세포들은 세척 공정의 추가로 인한 손실은 있지 않았다. 아래 표 1은 이들 3 개의 시험들에 관한 추가 정보를 제공한다. Jurkat T-세포들에 대해 90% 초과의 보유율 및 회수율이 얻어졌다.

농축된 세포들을 완전하게 세척하는데 사용된 액체 볼륨들은 추적되었다. 액체 볼륨들 추적은 예를 들어, 세포 배양의 형질도입 또는 형질주입(transfection) 전에 세포 배양으로부터 전기천공 완충제를 제거하는 것과 같은 적용들에서 유용할 수 있다.

아래 표 2는 낮은 생존 세포 밀도("1LE", 1-5 E6mL-1) 음향 농축물 세척(ACW) 볼륨 감소에 대한 입력, 출력 및 성능 실험 값들을 보여준다. 도 21[33]은 1LE 처리 후에 T-세포들의 1차 배양물들의 생존 세포 밀도(VCD) 및 생존력을 도시한다. 각 1LE 실험으로부터의 세포들은 1E6mL-1, 37℃, 5% CO2에서 이중으로 다시 시딩되었고(re-seeded), 24 시간 후에 카운팅되었다.

모든 테스트들은 사양들에 따라 수행되었고, 1 시간 이내에 5 내지 7 mL의 농축물 볼륨을 얻었다. 처리된 볼륨들은 약 1100 ml이였고, 이때 세포 밀도들은 1.8 내지 2.5 E6 ml-1이였다. 처리된 세포들의 총 수는 1.9 내지 2.8 B 세포들의 범위에 있고, 이때 세포 생존력은 99%를 초과하였다. 농축 후에, 수집된 세포 농축물 볼륨은 5.8부터 6.9 ml까지 다양했으며, 이때 세포 밀도들은 243 내지 357 E6 ml-1이였다. 이는, 세포 생존력의 현저한 저하 없이 1.4 내지 2.1 B 세포들의 세포 회수율을 나타낸다. 생존 세포 회수율은 그러므로 73 내지 84%로, 160 내지 187의 볼륨 감소 팩터 및 135 내지 143의 세포 밀도 농도 팩터 범위를 구성한다. 공정 시간은 약 50 분였다.

표 3은 높은 생존 세포 밀도("1LH", 10-40 E6mL-1) ACW 볼륨 감소에 대한 입력, 출력 및 성능 실험 값들을 표시한다. 도 22[34]는 30mL/min의 유량으로 높은 세포 밀도 1LH 요소를 사용하여 생존 세포 회수율(VCR)에 대한 전력의 효과를 보여준다.

처리된 볼륨들은 약 950 ml이였고, 이때 생존 세포 밀도들은 98%를 초과하는 세포 생존율에서 29 내지 38 B 세포들의 세포 수 범위에 대응하는 31 내지 39 E6 ml-1이다. 세포 농축물의 평균 볼륨들은 49 ml이였다. 공정 시간은 31 내지 36 분이였다.

5W 테스트는 62%의 낮은 세포 회수율을 산출했다. 8W로의 증가는 원하는 범위(78 내지 86%의 세포 회수율)로 성능을 증가시킨 반면, 10W로의 전력 증가는 세포 회수율(83%)을 개선시키는 것으로 보이지 않았다. 확실한 결론을 제공하기 위해 각 전력 레벨에서 추가 복제들이 필요하지만, 이들 결과들은 8W 이상의 전력이 80%에 가깝거나 80% 이상의 VCR을 갖는데 필요함을 시사했다. 볼륨 감소 팩터들은 약 19였고, 세포 농도 팩터들의 범위는 12(5W) 내지 17(8W)이였다. 1LH 실험들 동안 얻어진 최종 세포 농도들(470-590 E6mL-1)은 부유액 세포 라인들(200-600 e6mL-1)에 대한 데드-엔드(dead-end) 원심분리 공정들에서 펠렛(pellet) 농도들과 비슷하다.

도 23[35]은 낮은 세포 농도 농축물/세척 적용(1LE) 및 높은 세포 밀도 농축물/세척 적용(1LH)에 대한 2 개의 통상적인 음향 정재파 장들 및 공정 흐름도를 도시한다. 각 시나리오에서, 압전 트랜스듀서는 우측에 있으며 그의 다중 모드 변위 패턴들 중 하나에 여기된다. 1LH의 경우 평탄한 평면 반사기가 사용되는 반면, 1LE의 경우 면처리된 반사기가 사용된다. 트랜스듀서의 다중모드와 결합된 평탄한 평면 반사기는 다차원 정재파를 설정하여 강한 횡방향(lateral) 진폭 기울기들 갖는 3개의 평행 정재파들을 초래한다. 음향 방사력은 음압 진폭의 기울기에 비례한다. 그러므로, 이러한 설정은 세포들을 포획할 수 있을 뿐만 아니라, 충분한 크기의 세포 클러스터들을 생성하여 이들 세포 클러스터들의 연속적인 중력 침강을 초래하는 충분한 포획 잠재력을 가진다. 이는 도 24[36]의 우측 상에 개략적으로 도시된다. 이러한 연속적인 세포들의 분리는 높은 세포 밀도 세포 배양, 예를 들어 음향 정재파 장으로부터 제거되는 세포들의 농축/세척 유닛 동작을 수행할 때 유용하다. 다른 한편으로, 작은 세포 밀도 세포 배양들의 경우, 처리될 세포들의 총 수는 모든 세포들이 음향 정재파에 포획 및 유지될 수 있는 정도이다. 그러므로, 정재파 장의 포획 잠재력을 최대화시키는 것이 목표이다. 이 목표는 면처리된 반사기를 사용하여 달성할 수 있다. 이러한 면처리는 음향파를 반사 및 산란시켜, 세포들이 포획될 보다 강한 음향 방사 잠재력 우물들을 생성하고(도 23[35], 좌측, 1LE 참조), 음향장이 활동하는 동안, 또는 음향장이 턴 오프될 때까지 정착되지 않는 보다 작은 클러스터들을 형성한다.

낮은 세포 농도(좌측 디바이스, 1LE, 1-5E6 세포들 mL-1) 및 높은 세포 농도(우측 디바이스, 1LH, >10E6 세포들 mL-1)에 대한 ACW(Multidimensional Acoustic Concentrate-Wash)가 도 23, 24[35, 36]에 도시된다. 설계의 단면도들은 1LE 및 1LH 디바이스들에서 확립된 음압 장 및 트랜스듀서 변위 프로파일, 그리고 세포 분리를 달성하기 위한 포획 및 클러스터 형성 원리를 나타낸다. 디바이스들은 바닥에서 수집기 유출부를 포함한다(도시되지 않음).

농축/세척 유닛 동작의 가동 부분 동안, 재순환은 정재파에서 초기 클러스터들을 발생하기 위해 사용되며, 예를 들어 클러스터들의 시딩을 수행한다. 초기 클러스터들이 형성되면, 2차 음향 방사력들로 인해 포획 효율이 증가하여 보다 큰 클러스터들이 들어오는 세포들 상에 인력을 가한다.

도 25[37]은 ACW 디바이스에서 T-세포 농축 공정의 다양한 스테이들의 사진들을 보여준다: (a) 음향장에서 T-세포들의 포획 및 수집기에서 T-세포들 안정, (b) 음향장이 턴 오프된 후 T-세포 클러스터들의 정착, (c) 수집기로부터 T-세포들의 초기 유출, 및 (d) 수집기로부터 T-세포들 유출의 최종 스테이지. 생존 세포 회수율(VCR(%))은 공급물에 대하여 농축물에 존재하는 생존 세포들의 밸런스에 따라 계산된다(아래 유도식 참조). 이들 실험들의 초점은 농축 효율을 입증하는 것이였기 때문에, 세척 잔류물들은 이들 시험들에 대해 계산되지 않았다.

1LE 적용은 T 세포들의 1차 배양들 및 고정 공정 파라미터들을 사용하여 삼중으로 수행되었다(1LE-1, -2 및 -3으로 지정된 실험들). 음향 요소들이 조립되고 이중 포장되고 감마선이 조사되어 무균 환경에서 농축을 수행하였다. 공정 파라미터들은 30 mL/min(~2L/hr)의 공칭 유량 및 채널당 2.24MHz/40W의 음향 구동 조건들이였다. 재순환 주기는, 1LE 시스템의 효율이 음향 정재파에 있는 세포들의 수에 의해 향상되기 때문에 농축 단계 전에 필요하다. 폐기물을 다시 공급물로 재순환하면 세포들이 시스템에 들어가고 음향들에 의해 유지되어, 초기에 유지되지 않는 세포들이 폐기물 스트림으로 손실됨 없이, 점차적으로 효율성이 높아진다. Jurkat T-세포들에 대한 이전 테스트를 기반으로 하여, 재순환 모드 지속 시간은 15분으로 선택되었는데, 이는 시스템이 이 세포 밀도 범위의 공급물들에 대해 그 시점에서 대략 80% 효율적이기 때문이다. 도 26[38]은 2E6 ml-1 정도의 초기 세포 밀도들을 갖는 3개의 1LE 실험들(30mL/min)에 대한 폐기물 VCD(E6 ml-1) 대 시간(분)을 도시하고, 3D 음향 정재파를 채우기 위한 15 분 재순환 주기의 유용성을 입증한다(1LE-3과 같은 더 높은 셀 밀도들에서 그리고 동일한 유량으로, 음향 정재파가 더 빨리 채워질 것이다).

1LH ACW는 생존 세포 회수율에 대한 효과를 평가하기 위해 서로 다른 전력들에서 동작되었다. 4 개의 테스트들은 30mL/min(~2L/hr)의 고정 유량을 사용하여 입력 공급 사양에서 수행되었다. 제1 테스트는 5W의 전력 레벨에서 수행되었다. 제2 및 제3 테스트들은 8W에서 수행되었으며, 그리고 제4 테스트 경우 전력은 10W로 증가되었다. 이러한 제4 테스트의 폐기물은 2 개의 스테이지 ACW(즉, 직렬인 2 개의 음향 요소들)의 동작을 시뮬레이션하기 위해 동일한 요소를 통해 재처리되었다. 공급 세포 밀도들이 높을수록 트랜스듀서 전력의 상당한 감소가 달성되었고, 즉, 1LH 경우 5-10W인 반면, 1LE 경우 40W이고, 이렇게 하면 시스템을 냉각할 필요가 없다.

도 27은 T-세포 농축 및 세척 시스템(500)에서의 동작들에 대한 공정 흐름도를 도시한다. 농축 및 세척 동작의 통상적인 공정 시간은 60 내지 90분 범위에 있다. 음향 농축물 세척(ACW) 디바이스(510)는 세포 생성물(530) 및 세척 완충제(520)의 입력을 가진다. 세척 완충제(520)는 약 300 mL 내지 약 600 mL의 범위에 잇는 볼륨을 가질 수 있다. 세포 생성물(530)은 2 L 볼륨에서 400억 세포들로 구성될 수 있다. ACW 디바이스(510)는 생성물(540) 및 폐기물(550)의 출력을 가진다. 생성물(540)은 약 5 내지 약 100 mL의 볼륨 범위를 가질 수 있다. 폐기물(550)은 표류 세포들, 세포 잔해 및 완충 용액으로 구성될 수 있다.

ACW 디바이스(510)의 동작은 도 27에 도시된 바와 같은 프로토콜로 구현된다. 동작은 ACW 디바이스(510)의 내부 음향 챔버 내로 세포 생성물(530)을 흘림으로써와 같이 ACW 디바이스(510)가 준비되는 것으로 시작한다. 세포 생성물(530) 내의 세포 물질은, ACW 디바이스(510)가 더 큰 효율로 동작할 수 있도록 준비 스테이지 동안에 음향 챔버 내에서 축적되는 경향이 있다. ACW 디바이스(510)의 출력은 입력(도시되지 않음)으로 재순환될 수 있다. 이에 따라, 세포들이 음향 챔버에서 음향파에 포획되고 포획 효율이 증가함에 따라, 음향 챔버를 통과한 세포들은 ACW 디바이스(510)가 준비되는 동안 세포 내용물을 잃지 않도록 입력으로 복귀될 수 있다.

ACW 디바이스(510)가 준비되면, 재순환 경로는 폐쇄되고, 추가 세포 생성물(530)이 음향 챔버로 흐른다. 세포 생성물(530)이 준비된 음향 챔버로 흐르기 때문에, 추가 세포들은 음향파에 포착되는 반면, 배지는 음향 챔버에서 폐기물(550)로 흐른다.

모든 세포들이 음향 챔버에서 음향파에 수집되면, 세척 완충제(520)가 음향 챔버로 흘러 들어가고, 이는 음향 챔버에서의 이전 배지가 씻겨 나가게 하여 폐기물(550)로 향하게 한다. 그 시점에서, 세포들이 세척 및 농축되고 음향 챔버로부터 제거되고 생성물(540)에 제공될 수 있다.

도 28은 처리된 수십억 개의 세포에 대한 생존 세포 회수율을 나타내는 버블 그래프이다. 처리된 총 생존 세포들은 x축에 표시되고 해당하는 생존 세포 회수율은 y축에 표시된다. 버블 그래프의 버블들 크기는 약 0.75 내지 약 2L 범위에서 처리된 볼륨을 나타낸다. 버블 그래프 결과들은 Jurkat T-세포들을 사용한 농축물 세척 동작에 관한 것이고, 이때 공정 시간은 60분 내지 90분이다. 1 L의 배지에서 10 억 세포들이 처리되었고, 92 +/- 3% 생존 세포 회수율 및 5-6 mL의 출력 볼륨을 산출했다.

도 29는 도 27, 28에 도시된 것과 같은 음향 농축물 세척 동작들을 위한 공정 맵이다. 공정 맵은 음향 전력, 유량, 세포 수집 사이클 수, 세포 수 및 세포 농도의 동작 파라미터들을 차트로 표시한다. 도 30은 세척 완충제의 챔버 볼륨들의 함수로서, 투과물에서 총 단백질 농도 감소를 나타내는 그래프이다. 5개의 챔버 볼륨들이 세포들을 통과한 후, 최종 총 단백질 함량이 99%로 감소된다.

도 31은 바이오리액터(610)에서 세포 결집체로부터 단일 세포들을 제거하기 위한 ACW 디바이스(500)의 적용을 도시한다. 인간 만능 줄기 세포들(Human pluripotent stem cells, hPSC들)은 바이오리액터(610) 내에서 결집될 수 있으며, 이 공정은 다소 비효율적일 수 있다. 그러한 공정은 hPSC 결집체들의 성장 및 분화뿐만 아니라 최종 생성물 품질에 영향을 미칠 수 있는 단일 세포들 집단의 발생으로 이어질 수 있다. ACW 디바이스(500)는 바이오리액터에서 세포 결집체를 유지하면서 그러한 단일 세포들을 제거하는데 사용될 수 있다. 이러한 적용에서, 결집체들 및 단일 세포들은 ACW 디바이스(500)에 제공되고, 여기서 보다 큰 결집체들은 ACW 디바이스(500)의 음향 챔버에서 음향 정재파에 포획된다. 보다 작은 단일 세포들은 음향파를 통과하고 음향 챔버를 빠져나가 폐기물(620)로 나아간다. 보다 큰 결집체들은 음향파에 수집되고 바이오리액터(610)로 되돌아갈 수 있다. 시간이 경과함에 따라, 단일 세포들은 바이오리액터(610)로부터 제거되는 반면, 결집체들은 유지되어, 바이오리액터들(610)에서 결집체들을 농축하고 단일 세포들을 고갈시킨다.

도 32는 hPSC 보유 대 음향 전력을 나타내는 그래프이다. 그래프에서 음향 전력은 약 5 W 내지 약 30 W에서 조절되었다. 그래프에서 볼 수 있는 바와 같이, 가장 큰 결집체 보유량은 30 W에서 발생했다. 보유된 결집체들의 검사는 ACW 디바이스(500)에서 처리되는 동안 그들의 형태가 변경되지 않았음을 보여준다.

도 33은 바이오리액터에서 결집체 집단으로부터 단일 세포 제거를 보여주는 막대 그래프이다. 2L 바이오리액터는 ACW 디바이스(500)에 연결되었고 30 W에서 분당 60 mL로 작동시키고, 이때 결집체들은 5분마다 바이오리액터로 되돌아간다. 막대 그래프는 바이오리액터 내용물들이 ACW 디바이스(500)를 통해 처리됨에 따라 바이오리액터에 보유된 결집체들의 증가하는 부분을 예시하다. 보유된 결집체들의 검사는 초기 형태가 음향 공정 후에 동일하게 유지되었음을 나타내었다. 총 결집체 회수율은 85%이였다.

도 34는 음향 농축물 세척 공정에 대한 2 개의 그래프들을 도시하고, 하나는 공정 시간에 대한 세포 확장 차트(좌측)이고, 하나는 음향 농축물 세척 공정 이후 T-세포 집단에서의 변경 차트이다. 음향 농축물 세척 디바이스로 처리된 인간 CAR-T 세포들의 1차 배양은 그들의 통상적인 성장률(30시간 배가 시간)로 성장한다. 세포 생존력은 높은 레벨로 유지되며, 관류된 Xuri 바이오리액터 배양에서 30배(30-fold) 확장이 실현될 수 있다(좌측 그래프). 우측 그래프는 음향 농축물 세척 디바이스로 처리되기 전 및 후의 T 세포 생존력 및 표현형(phenotype)의 n=2 기증자들 비교를 보여준다. 음향 농축물 세척 디바이스로 처리된 후 세포 표면 마커 발현에 큰 변화가 관찰되지 않는다.

도 35는 음향 농축물 세척 공정 후에 발현이 변하지 않은 채로 유지되는, 통상적인 T-세포 표면 마커들을 도시한 대표적인 유동 세포 분석 플롯(flow cytometry plot)을 예시한다. 공정은 1-2 L의 입력 볼륨 및 5-120 mL의 출력 볼륨으로 90% 평균 세포 회수율 및 99% 단백질 세척을 제공한다. 100-500M/mL의 출력 VCD는 1-40M/mL의 입력 VCD로 얻어진다. 생존력의 손실은 관찰되지 않았고, T-세포들의 백분율은 변하지 않았으며, CD8/CD4의 비율은 변하지 않았다.

도 36은 공정의 다수의 시점들에서 본 개시 내용의 농축물 세척 디바이스를 사용하여 엔드 투 엔드(end to end) 세포 요법 생산 공정을 도시한다. 농축물 세척 디바이스는 원래 혈액 제품의 과립구들, RBC들 및 혈소판들을 줄이는데 사용될 수 있다. 친화성 세포 선택 후 농축물 세척 디바이스가 사용되어 결과적인 T-세포들이 수집 및 세척될 수 있다. T-세포 활성화 후, T-세포들은 형질도입/형질주입 단계 이전에 다시 농축되고 세척될 수 있다. 농축물 세척 디바이스는 세포 확장 전에 형질도입/형질주입 단계 후에 사용할 수 있다. 세포 확장 후, 농축물 세척 디바이스가 사용되어 확장된 CAR-T 세포들이 수집되고 세척될 수 있다. 친화성 세포 선택 단계 2에서 오염 세포들을 제거하거나, 원하는 세포들을 선택한 후에, 또 다른 농축물 세척 공정이 사용될 수 있다.

상기에서 논의된 방법들, 시스템들, 및 디바이스들은 예들이다. 적절한 경우 다양한 구성들이 생략, 대체될 수 있거나, 다양한 절차들 또는 구성요소들이 추가될 수 있다. 예를 들어, 대안적인 구성들에서, 방법들은 기술된 것과는 상이한 순서로 수행될 수 있고, 다양한 단계들이 추가, 생략 또는 결합될 수 있다. 또한, 소정의 구성들과 관련하여 기술된 특징들은 다양한 다른 구성들로 결합될 수 있다. 구성들의 상이한 관점들 및 요소들은 유사한 방식으로 결합될 수 있다. 또한, 기술이 발전하고 따라서 많은 요소들이 예들이고, 본 개시 또는 청구항의 권리 범위를 제한하지 않는다.

예시적인 구성들(구현들 포함)의 완전한 이해를 제공하기 위해 특정 세부 사항이 발명의 상세한 설명에 제공된다. 그러나, 이들 특정 세부 사항들 없이 구성들이 실행될 수 있다. 예를 들어, 잘 알려진 공정들, 구조들 및 기술들은 구성들을 모호하게 하는 것을 피하기 위해 불필요한 세부 사항 없이 나타내었다. 이러한 기술은 예시적인 구성들만을 제공하며, 청구항들의 권리 범위, 적용 가능성 또는 구성을 제한하지 않는다. 오히려, 구성들에 대한 이전 설명은 설명된 기술들을 구현하기 위한 설명을 제공한다. 본 개시 내용의 기술 사상 또는 권리 범위를 벗어나지 않고 요소들의 기능 및 배치에 다양한 변경이 이루어질 수 있다.

또한, 구성들은 흐름도 또는 블록도로 도시된 프로세스로 기술될 수 있다. 동작들 각각은 순차적인 공정으로 기술될 수 있지만, 많은 동작들이 병렬로 또는 동시에 수행될 수도 있다. 추가적으로 동작 순서들이 재배열될 수 있다. 공정은 도면에 포함되지 않은 추가 스테이지들이나 기능을 가질 수 있다.

여러 예시적인 구성들을 기술했지만, 본 개시 내용의 기술 사상을 벗어남 없이, 다양한 수정들, 대안적 구성들 및 균등물들이 사용될 수 있다. 예를 들어, 상기의 요소들은 보다 큰 시스템의 구성요소들일 수 있고, 다른 구조들 또는 공정들이 본 발명의 적용을 우선시하거나 이와 달리 수정할 수 있다. 또한, 상기의 요소들이 고려되기 전, 도중, 또는 후에 다수의 동작들이 수행될 수 있다. 이에 따라서, 상기의 설명은 청구항의 권리 범위를 제한하지 않는다.

한 값이 제1 임계값을 초과(또는 보다 큼)한다는 진술은 상기 값이 제1 임계값보다 다소 큰 제2 임계값을 충족하거나 초과한다는 진술, 예를 들어, 제2 임계값이 관련 시스템의 분해능에서 제1 임계값보다 하나 높은 값이라는 진술과 동등하다. 한 값이 제1 임계값 미만(또는 내에 있음)인 진술은 상기 값이 제1 임계값보다 다소 작은 제2 임계값 이하인 진술, 예를 들어, 제2 임계값이 관련 시스템의 분해능에서 제1 임계값보다 하나 낮은 값이라는 진술과 동등하다.

Claims

입자들을 세척하는 방법에 있어서,
제1 배지(media) 및 입자들의 초기 혼합물에 대한 초기 입자 밀도 및 볼륨을 얻는 단계;
상기 초기 혼합물의 초기 입자 밀도 및 볼륨을 기반으로 하여, 음향영동 디바이스를 사용함으로써 음향 농축물 세척 공정의 파라미터들을 설정하는 단계;
상기 음향영동 디바이스의 챔버에 상기 초기 혼합물을 제공하는 단계 - 상기 음향영동 디바이스는, 압전 물질을 포함한 적어도 하나의 초음파 트랜스듀서를 포함함;
상기 챔버에서 음향 정재파를 생성하기 위해 상기 적어도 하나의 초음파 트랜스듀서를 구동하되, 상기 입자들의 적어도 일 부분이 상기 음향 정재파에 유지되도록 구동하는 단계; 및
상기 파라미터들에 따라서 상기 음향영동 디바이스를 동작시키는 단계;를 포함하는, 입자 세척 방법.
청구항 1에 있어서,
상기 챔버에, 생체적합성 세척 또는 완충 용액인 제2 배지를 제공하는 단계를 더욱 포함하는, 입자 세척 방법.
청구항 1에 있어서,
상기 입자들은 세포들인, 입자 세척 방법.
청구항 1에 있어서,
상기 입자들은 마이크로캐리어/세포 복합체들인, 입자 세척 방법.
청구항 1에 있어서,
상기 초기 혼합물은 약 0.5 백만 particles/mL 내지 약 5 백만 particles/mL의 밀도를 가진, 입자 세척 방법.
청구항 1에 있어서,
상기 초기 혼합물에서 상기 입자들을 농축하는 단계를 더욱 포함하는, 입자 세척 방법.
청구항 7에 있어서,
상기 초기 혼합물의 볼륨보다 약 25 내지 약 50 배 작은 농축물 볼륨으로 상기 입자들을 농축하는 단계를 더욱 포함하는, 입자 세척 방법.
청구항 7에 있어서,
상기 초기 혼합물의 입자 밀도보다 약 25 내지 약 50 배 큰 농축물 입자 밀도로 상기 초기 혼합물 내의 입자들을 농축하는 단계를 더욱 포함하는, 입자 세척 방법.
청구항 1에 있어서,
상기 유동 챔버의 세척 출력의 세포 밀도는 약 0.0 내지 약 0.5 백만 cells/mL인, 입자 세척 방법.
청구항 10에 있어서,
상기 세척 출력은 농축 공정 및 세척 공정으로부터 발생되는, 입자 세척 방법.
청구항 1에 있어서,
세척 효능을 결정하기 위해, 상기 유동 챔버에 대해 분광 광도계 공정(spectrophotometer process)을 수행하는 단계를 더욱 포함하는, 입자 세척 방법.
세포 배양으로부터 세포들을 회수하는 방법에 있어서,
제1 배지 및 입자들의 초기 혼합물에 대한 초기 입자 밀도 및 볼륨을 얻는 단계;
상기 초기 혼합물의 초기 입자 밀도 및 볼륨을 기반으로 하여, 음향영동 디바이스를 사용함으로써 음향 농축물 세척 공정의 파라미터들을 설정하는 단계;
상기 음향영동 디바이스의 유동 챔버에 상기 세포 배양의 초기 혼합물을 제공하는 단계 - 상기 음향영동 디바이스는, 상기 유동 챔버에서 다차원 음향 정재파를 발생시키기 위해 구동되도록 구성된, 압전 물질을 포함한 적어도 하나의 초음파 트랜스듀서를 포함함; 및
상기 유동 챔버에서 다차원 음향 정재파를 발생시키기 위해 상기 적어도 하나의 초음파 트랜스듀서를 구동하는 단계;
상기 세포들을 농축시키기 위해, 상기 다차원 음향 정재파에서, 상기 초기 혼합물로부터의 세포들을 유지하는 단계;
상기 파라미터들에 따라서 상기 음향영동 디바이스를 동작시키는 단계;를 포함하는, 세포 회수 방법.
청구항 12에 있어서,
상기 농축된 세포들의 세포 밀도는 상기 초기 혼합물의 세포 밀도보다 약 25 내지 약 50 배가 큰, 세포 회수 방법.
청구항 12에 있어서,
상기 농축된 세포들의 볼륨은 상기 초기 혼합물의 볼륨보다 25 내지 약 50배 작은, 세포 회수 방법.
청구항 12에 있어서,
상기 농축된 세포들은 약 35 분 이하에서 얻어지는, 세포 회수 방법.
청구항 12에 있어서,
상기 농축된 세포들을 세척하는 단계를 더욱 포함하고,
상기 유동 챔버의 세척 출력의 세포 밀도는 약 0.0 내지 약 0.5 백만 cells/mL인, 세포 회수 방법.
농축물 세척 시스템에 있어서,
펌프;
복수의 밸브들;
유동 챔버;
상기 유동 챔버에 결합되고, 다차원 음향 정재파를 발생시키기 위해 구동되도록 구성된 압전 물질을 포함하는 적어도 하나의 초음파 트랜스듀서; 및
상기 펌프, 복수의 밸브들 및 적어도 하나의 초음파 트랜스듀서를 제어하는 제어기 - 상기 제어기는 음향 전력, 유량, 세포 수집 사이클 수, 세포 수 또는 세포 농도 중 하나 이상을 포함하는 파라미터들로 구성 가능함;를 포함하는, 농축물 세척 시스템.
청구항 17에 있어서,
상기 유동 챔버는 약 25 mL 내지 약 75 mL의 볼륨을 더욱 포함하는, 농축물 세척 시스템.
청구항 18에 있어서,
상기 유동 챔버는 약 40 억 내지 약 400 억 세포들의 세포 용량을 포함할 수 있는, 농축물 세척 시스템.