BR112021011956A2 - Composição liofilizada de pegaspargase - Google Patents

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Sanjay Singh
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Abstract

composição liofilizada de pegaspargase. a presente invenção refere-se a uma composição liofilizada de pegaspargase inovadora, economicamente viável e estável em armazenamento. a composição compreende pegaspargase, um crioprotetor, um agente de volume, um tampão e pode conter opcionalmente outros excipientes farmaceuticamente aceitáveis que incluem, mas não são limitados a um sal. a composição da presente invenção é estável por períodos prolongados ao longo de uma faixa significativa de temperaturas, sem a presença de nenhuma quantidade significativa de impurezas. a presente invenção também se refere a um processo de liofilização economicamente viável e escalonável para a produção da composição de pegaspargase estável em armazenamento.

Description

“COMPOSIÇÃO LIOFILIZADA DE PEGASPARGASE” Campo da Invenção
[0001] A presente invenção refere-se ao campo da ciência biofarmacêutica. Em particular, se refere a uma composição liofilizada de pegaspargase e processo para a preparação da mesma. Antecedentes da Invenção
[0002] A entrega de proteínas de fármacos continua sendo um grande desafio para a indústria biofarmacêutica devido à instabilidade inerente das proteínas exibidas in vivo. Embora as proteínas administradas por via oral sejam suscetíveis à sua digestão no trato digestivo, as proteínas injetadas por via parenteral são geralmente consideradas propensas à depuração renal e proteólise. Outros problemas que são tipicamente associados a fármacos proteicos são a baixa solubilidade, meia-vida curta de circulação, imunogenicidade, agregação, etc. Como resultado, a sustentabilidade da proteína no corpo é comprometida. Várias abordagens para alcançar a sustentabilidade das proteínas in vivo foram experimentadas, como alteração da sequência de aminoácidos para diminuir a imunogenicidade e eliminar locais de clivagem proteolítica, conjugação de proteínas com proteínas séricas, fusão com anticorpos, incorporação em lipossomas para liberação lenta, conjugação com natural ou polímeros sintéticos, etc.
[0003] A conjugação de proteínas terapêuticas com polímeros, como polietileno glicol (PEG) tem sido usada com sucesso nas indústrias biofarmacêuticas por um longo tempo e é aceita como uma modificação segura de proteínas para aumentar a meia-vida de circulação, reduzindo a imunogenicidade, e uma divulgação a esse respeito pode ser encontrada no documento US 4.179.337. Esse processo de conjugação é denominado peguilação. O PEG foi classificado pelos órgãos reguladores, como USFDA e OMS, sob os compostos “Geralmente Reconhecidos como Seguros” (GRAS).
[0004] O PEG é um polímero linear ou ramificado e é solúvel em água (a solubilidade aumenta com o aumento do peso molecular), lipofílico e não tóxico. A propriedade lipofílica do PEG torna-o passível de funcionalização de grupo final para pronta conjugação com proteínas terapêuticas. Cada molécula de PEG normalmente se a liga 2 a 3 moléculas de água por unidade de óxido de etileno. A peguilação, portanto, mascara a superfície da proteína e aumenta o tamanho molecular do polipeptídeo, evitando assim o acesso de anticorpos ou células de processamento de antígeno e também reduz a degradação por enzimas proteolíticas, o que resulta em aumento da meia-vida circulatória. Além disso, o aumento no tamanho (devido ao aumento dos raios hidrodinâmicos) prolonga seu tempo circulatório, reduzindo a depuração renal.
[0005] Em muitos tipos de células cancerígenas como aquelas envolvidas em leucemia linfoblástica aguda (LLA), as células cancerígenas não são capazes de realizar a síntese de novo do aminoácido L-asparagina (porque possuem baixos níveis ou nenhum da enzima asparagina sintetase, que catalisa a transformação enzimática do aminoácido L- aspartato em L-asparagina) e o retira do sangue pra crescimento celular. A L-asparaginase é uma enzima que catalisa a hidrólise de L-asparagina em L-aspartato com a liberação de amônia. A L-asparaginase esgota os níveis de L-asparagina do sangue, evitando assim sua absorção pelas células cancerígenas/tumorais, levando finalmente à morte das células. A L-asparaginase pode ser obtida de várias fontes incluindo bactérias, leveduras, fungos, actinomicetos e plantas. É útil no tratamento de tumores ou cânceres que são dependentes da L-asparagina para a síntese de proteínas. Ela é particularmente usada para o tratamento de leucemias, como leucemia linfoblástica aguda, e é tipicamente usada em combinação com outras terapias antitumorais ou anticancerígenas, embora possa ser empregada sozinha em determinadas situações clínicas.
[0006] Entretanto, a própria L-asparaginase sofre das desvantagens usuais de ser uma proteína, como alta taxa de depuração, meia-vida curta, degradação proteolítica e potencial para induzir uma resposta imune devido à origem não humana em pacientes tratados com essa enzima. Essas deficiências limitam o uso dessa enzima para tratamentos mais longos ou dosagem repetida. Conforme discutido anteriormente, esses problemas podem ser superados por peguilação. A L-asparaginase (de
E. coli) é modificada por sua conjugação covalente com monometoxipolietileno glicol de 5 kDa (mPEG). A pegaspargase resultante tem as vantagens de ser substancialmente não antigênica e exibe uma taxa reduzida de eliminação da circulação.
[0007] A pegaspargase, geralmente apresentada em composição líquida em embalagens de 5 ml com concentração de 750 UI/ml, foi inicialmente aprovada para a indicação de leucemia linfoblástica aguda em pacientes que desenvolveram hipersensibilidade às formas nativas da L- asparaginase, pela US-FDA em 1994 e foi comercializado com a marca Oncaspar®. Posteriormente, em 2006, o Oncaspar® obteve a aprovação para o tratamento de primeira linha de doentes com leucemia linfoblástica aguda (LLA) como componente de um regime de quimioterapia multiagente. Oncaspar® foi fabricado por peguilação de um monometoxipolietileno glicol (mPEG) Succinimidil Succinato PEG de 5 kDa (também conhecido como SS-PEG). A asparaginase peguilada é divulgada nos pedidos US 5.122.614; 5.324.844; 5.612.460; US20120100121A1; CN105802946A.
[0008] Apesar de ter todas as vantagens, foi relatado que a composição líquida da pegaspargase tem problemas como estabilidade térmica, exigência estrita para manutenção da cadeia de frio, vida útil mais curta, etc. Foi relatado que proteínas peguiladas, especialmente aquelas que estão associadas com o ligante de succinato tendem a degradar em sua composição líquida para resultar em PEG livre e proteína succinilada como resultado da hidrólise da ligação éster entre o PEG e o ligante de succinato na composição aquosa. O acesso a tais fármacos críticos na prática clínica requer composições que podem ser armazenadas por um período prolongado que também podem sustentar as variações de temperatura durante a fabricação e durante a distribuição às clínicas.
[0009] Na maioria das vezes, os problemas de estabilidade associados às proteínas na composição líquida podem ser superados apresentando-as na composição sólida. A remoção da água é frequentemente comprovada como eficaz, uma vez que todas as principais reações de degradação (desamidação, hidrólise, proteólise, etc.) ocorrem na solução aquosa. O método mais comum usado para a transformação de líquido em sólido é a secagem por congelamento ou liofilização. A liofilização é um processo que pode ajudar a estabilizar a pegaspargase e superar os desafios. Mais da metade dos produtos terapêuticos de origem biológica comercializados são apresentados como composição liofilizada.
[0010] O ciclo de liofilização consiste principalmente em três etapas: congelamento, secagem primária e secagem secundária com uma etapa de recozimento opcional entre congelamento e secagem primária. O processo de liofilização não é isento de estresse e nem sempre garante uma vida útil prolongada do produto biofarmacêutico. O estresse associado às etapas de liofilização pode causar tanto degradações físicas (desnaturação, agregação, precipitação, etc.) quanto químicas (oxidação, reação de Maillard, agregação covalente, etc.) da proteína. Essas vias degradativas que eventualmente levam à perda de sua bioatividade e não são mutuamente exclusivas, pois muitas vezes uma leva à outra e ambas as vias degradativas estão um tanto ligadas.
[0011] O projeto de um ciclo de liofilização depende da concentração da proteína, da natureza e da quantidade de agentes de volume, estabilizantes e outros excipientes presentes na composição. Parâmetros térmicos importantes, como temperatura de transição vítrea aparente (Tg'), temperatura de cristalização do agente de volume, etc., são normalmente determinados para as composições antes do projeto do processo, pois servem de ponto de orientação para definir os parâmetros de temperatura e pressão para cada etapa incluindo a rampa e tempo de espera em cada etapa do ciclo de liofilização.
[0012] As proteínas peguiladas apresentam outras complexidades que precisam ser abordadas para a determinação do processo de liofilização final, como o estado do PEG, sendo amorfo ou cristalino, quantidade de água livre disponível para interação, temperatura de armazenamento, parâmetros de liofilização, razão proteína/PEG, tudo o que influencia a atividade da proteína liofilizada pós-liofilização, e não existe uma solução universal para todos os produtos peguilados.
[0013] Portanto, é importante criar um processo e uma composição exclusivos para cada proteína, pois o processo e a composição adequados para uma proteína podem não ser eficazes para outra.
[0014] Os documentos US 6.180.096 e US 7.632.491 B2 divulgam a composição de interferon peguilado 2b com ciclo de liofilização mais longo e alto teor de umidade. O documento US 8.367.054 B2 divulga uma composição para Peg-interferon 2b com um ciclo de liofilização mais curto. Esses documentos revelam a importância do processo de liofilização e sugerem que existe uma alteração na qualidade do produto com base no ciclo de liofilização.
[0015] O documento CN105796507A divulga uma composição estável de pegaspargase contendo sorbitol, um agente protetor, um agente tamponante e um tensoativo. Entretanto, a composição aborda a estabilidade na forma líquida e proteção durante o congelamento. O dito pedido não foi bem-sucedido ao fornecer uma composição seca por congelamento estável.
[0016] O documento WO2018017190, divulga uma composição estável de armazenamento liofilizada, sendo que a composição compreende um óxido de polialquileno-asparaginase compreendendo um grupo de óxido de polialquileno covalentemente ligado por um ligante a L-asparaginase; um tampão; um sal; e um açúcar.
[0017] Entretanto, o processo conforme divulgado no documento WO’ 190 é longo (~5 dias) e não econômico. Além disso, utiliza grandes quantidades de excipientes, o que não é preferencial, uma vez que pode aumentar o custo do excipiente em ~ 50% e, portanto, o custo do produto final.
[0018] A pegaspargase é classificada como um medicamento órfão e tem um preço alto. Esse processo de preparação do produto de armazenamento estável aumenta o custo da liofilização, bem como os excipientes adicionais que tornarão o produto mais caro.
[0019] Portanto, há uma necessidade de uma composição liofilizada de pegaspargase estável em armazenamento ideal que mantenha a propriedade física e a atividade biológica durante sua vida de prateleira e um processo de liofilização para tal composição.
Objetivo da Invenção
[0020] Um objetivo da presente invenção é fornecer uma composição liofilizada estável de armazenamento ideal compreendendo pegaspargase que exibe estabilidade físico-química e atividade biológica durante sua vida de prateleira e um processo de liofilização para tal composição. Sumário da Invenção
[0021] A presente invenção fornece uma composição liofilizada estável de armazenamento ideal compreendendo pegaspargase que exibe estabilidade psicoquímica e atividade biológica durante sua vida útil e um processo de liofilização para tal composição.
[0022] A composição da presente invenção é estável por longos períodos em uma faixa significativa de temperaturas, sem a presença de qualquer quantidade significativa de impurezas/degradantes. A presente invenção também se refere a um processo de liofilização economicamente viável e escalonável para a produção da composição estável de armazenamento de pegaspargase. Breve Descrição das Figuras
[0023] A Figura 1 retrata a estrutura de bolo para as composições dentro do escopo da presente invenção.
[0024] A Figura 2 retrata os dados analíticos que demonstram a integridade e pureza de pegaspargase, pré e pós-liofilização (Figura 2(B)) conforme avaliado por eletroforese em gel de dodecil sulfato de sódio- poliacrilamida (SDS-PAGE) e cromatografia líquida de alto desempenho de exclusão de tamanho (SE-HPLC), respectivamente.
[0025] A Figura 3 retrata os dados analíticos avaliados por dodecil sulfato de sódio - eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) comparando a estabilidade da composição líquida da técnica anterior de pegaspargase (Figura 3 (A)) com a composição liofilizada da presente invenção (Figura 3 (B)).
[0026] A Figura 4 retrata os dados analíticos conforme avaliado por dodecil sulfato de sódio - eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) demonstrando a presença de impurezas de alto peso molecular presentes na composição liofilizada de pegaspargase da técnica anterior com composição liofilizada da presente invenção por coloração de
Coomassie (Figura 4 (A)), coloração com iodo (Figura 4 (B)). A Figura 4 (C) e a Figura 4 (D) mostram a análise Western Blot das amostras contra o anticorpo antiasparagianse e o anticorpo anti-PEG, respectivamente. Descrição Detalhada da Invenção Composição
[0027] A presente invenção fornece uma composição liofilizada estável de armazenamento ideal compreendendo pegaspargase que exibe estabilidade psicoquímica e atividade biológica durante sua vida útil e um processo de liofilização para tal composição.
[0028] A composição liofilizada da presente invenção compreende como ingrediente ativo a pegaspargase. A composição liofilizada da presente invenção compreende pegaspargase, um crioprotetor, um agente de volume, um tampão e pode conter opcionalmente outros excipientes farmaceuticamente aceitáveis incluindo, mas não se limitando a um sal.
[0029] A composição liofilizada da presente invenção compreende uma asparaginase peguilada compreendendo um grupo óxido de polialquileno covalentemente ligado por um ligante à asparaginase.
[0030] A composição da presente invenção é derivada da asparaginase peguilada. A asparaginase peguilada também conhecida como pegaspargase compreende um monometóxi polietileno glicol (mPEG) de peso molecular preferencialmente entre 4 a 6 kDa, mais preferencialmente entre 4,5 a 5,5 kDa e mais preferencialmente 4,8 a 5,2 kDa que está covalentemente ligado por um ligante succinato através de uma ligação amida a um ou mais grupos de amina primária (amina terminal e e-aminoácido da cadeia lateral de lisina) da L- asparaginase.
[0031] A L-asparaginase pode ser obtida naturalmente a partir de E. coli ou outras fontes bacterianas como Erwinia chrysanthemi ou por engenharia genética em E. coli por meio de tecnologia recombinante.
[0032] A reação da conjugação de mPEG e L-asparaginase resulta na ligação covalente de 1 a 12 mPEGs por monômero de L-asparaginase, de preferência entre 5 a 10 mPEGs por monômero de L-asparaginase, mais preferencialmente entre 7 a 10 mPEGs por monômero de L-
asparaginase e mais preferencialmente entre 7 a 9 mPEGs por monômero de L-asparaginase.
[0033] A quantidade de pegaspargase da invenção pode estar presente em uma concentração (porcentagem em peso total) de 2 a 32% da composição; mais preferencialmente 5 a 20% e mais preferencialmente entre 6 a 14%.
[0034] O processo de liofilização aqui estabelecido é novo e inventivo em termos da quantidade ótima de excipientes utilizados no processo. Os excipientes da presente invenção, tornam a composição da presente invenção a ser fisico-quimicamente estável e biologicamente ativa durante o prazo de validade. Os excipientes também possibilitam o projeto de um ciclo de liofilização curto e econômico de forma a se obter o produto da presente invenção. A composição da presente invenção contendo pegaspargase e excipientes, conforme estabelecido neste documento, é sinérgica.
[0035] A composição da presente invenção inclui um crioprotetor. O crioprotetor pode ser selecionado a partir de açúcar, poliol, polímero e aminoácido. Mais preferencialmente, o crioprotetor da presente invenção é açúcar. Mais preferencialmente, o crioprotetor é sacarose. O crioprotetor pode estar presente em uma faixa de 9 a 91% da composição; mais preferencialmente 20 a 60% e mais preferencialmente entre 32 a 41% da composição da presente invenção. Sem estar limitado pela teoria, a composição da presente invenção prevê um crioprotetor que pode servir como crio e lioprotetor para reduzir a carga dos excipientes durante o ciclo. Também pode servir como um estabilizador.
[0036] A composição da presente invenção compreende um agente de volume. O agente de volume da presente invenção é selecionado a partir do grupo que compreende açúcar, poliol, polímero e aminoácido, de preferência o agente de volume é um aminoácido selecionado a partir do grupo que compreende glicina, histidina, arginina; preferencialmente o aminoácido é glicina. O agente de volume da invenção pode estar presente na faixa de 1 a 78% da composição; mais preferencialmente 20 a 60% e mais preferencialmente entre 38 a 50% da composição da presente invenção.
[0037] A composição da presente invenção compreende um tampão. O tampão pode ser selecionado a partir do grupo que compreende tampão de fosfato, tal como tampão de fosfato de sódio (diidrogenofosfato de sódio - hidrogenofosfato dissódico) ou tampão de fosfato de potássio (tampão de di-hidrogenofosfato de potássio - hidrogenofosfato dipotássico), TRIS, tampão de citrato; de preferência, a composição da presente invenção compreende tampão de fosfato. O pH do produto antes da liofilização e após a reconstituição do produto liofilizado pode ser 6 a 8. O tampão da presente invenção pode estar presente na faixa de 3 a 33% da composição; mais preferencialmente 3 a 15% e mais preferencialmente entre 4 a 6% da composição da presente invenção.
[0038] A composição da presente invenção pode opcionalmente compreender sal, selecionado do grupo que compreende cloreto de sódio, cloreto de potássio, preferencialmente cloreto de sódio. A quantidade do sal na composição pode estar na faixa de 0 a 40%, preferencialmente 0 a 10%, mais preferencialmente 0 a 0,5% da composição da presente invenção. Sem estar limitada pela teoria, a composição da presente invenção é caracterizada por conter pouco ou nenhum sal, isto é, a composição da presente invenção pode compreender um sal em uma quantidade muito baixa ao contrário das composições da técnica anterior e também pode conter de sal.
[0039] A composição da presente invenção tem osmolalidade preferencialmente na faixa de 250 a 600 mOsm/Kg, mais preferencialmente 250 a 500 mOsm/Kg e mais preferencialmente 250 a 450 mOsm/Kg. Processo de Liofilização
[0040] É afirmado que os processos de liofilização são exclusivos para os excipientes e o ingrediente ativo, e os processos devem ser desenvolvidos separadamente para cada composição. Além disso, os processos da técnica anterior são demorados, usam elevada proporção de excipientes e não são econômicos.
[0041] O processo liofilizado da presente invenção formula o material farmacêutico ativo de uma maneira que o produto liofilizado obtido possua as seguintes características a. Bolo elegante que não gruda nas laterais do frasco b. Teor de umidade consistente c. Vida útil estendida (em temperatura ambiente) d. Dissolve-se prontamente na reconstituição, produz uma solução límpida e. A atividade da proteína está intacta f. Sem alteração na estrutura da proteína g. pH é mantido h. A solução reconstituída está dentro da faixa de osmolalidade aceitável para administração parenteral
[0042] O ciclo de liofilização consiste principalmente em três etapas: congelamento, secagem primária e secagem secundária com uma etapa de recozimento opcional entre congelamento e secagem primária. Cada uma dessas etapas foi otimizada para a composição da presente invenção. Além disso, prevê-se que o processo aqui estabelecido também será aplicável às composições semelhantes compreendendo pegaspargase como ingrediente ativo.
[0043] O tempo total do processo de liofilização no presente invento é de preferência de 2.880 min (48 h) a 5.790 min (96,5 h), mais preferencialmente de 3.120 min (52 h) a 4.980 min (83 h), mais preferencialmente de 3.120 min (52 h) a 4.200 min (70 h). O processo liofilizado na presente invenção preferencialmente inclui variação de temperatura de -60 °C a 30 °C, mais preferencialmente de -50 °C a 30 °C, mais preferencialmente de -40 °C a 25 °C. A variação de pressão do processo de liofilização na presente invenção é preferencialmente de 0,037 Torr a 760 Torr. Pré-liofilização
[0044] A concentração de pegaspargase presente na composição antes da liofilização está preferencialmente na faixa de 4 a 25%, mais preferencialmente na faixa de 6 a 20%, mais preferencialmente na faixa de 8 a 16% da composição.
[0045] O volume de enchimento antes da liofilização está preferencialmente na faixa de 0,5 a 5 ml, mais preferencialmente na faixa de 0,5 a 4 ml, mais preferencialmente na faixa de 0,5 a 3 ml.
[0046] Com base no volume de preenchimento, bem como no volume pós- reconstituição, a concentração apropriada de aditivos (se houver) precisa ser adicionada de modo que a concentração desejada dos aditivos seja obtida após a reconstituição do produto liofilizado antes de sua administração. Ciclo de Liofilização Etapa - 1 Congelamento
[0047] O processo liofilizado na presente invenção inclui preferencialmente a temperatura mais baixa da etapa de congelamento de -10 °C a -60 °C, mais preferencialmente de -20 °C a -50 °C, mais preferencialmente de - 35 °C a -45 °C. O tempo total da etapa de congelamento do processo de liofilização na presente invenção é preferencialmente de 150 min a 500 min, mais preferencialmente de 200 min a 400 min, mais preferencialmente de 240 min a 350 min. O tempo necessário para atingir a temperatura de congelamento mais baixa da etapa de congelamento do processo de liofilização na presente invenção é preferencialmente de 20 min a 180 min, mais preferencialmente de 30 min a 120 min, mais preferencialmente de 45 min a 90 min. O tempo de espera na temperatura de congelamento mais baixa da etapa de congelamento do processo de liofilização na presente invenção é preferencialmente de 120 min a 480 min, mais preferencialmente de 250 min a 360 min, mais preferencialmente de 200 min a 300 min. Etapa -2 – Secagem Primária
[0048] O processo liofilizado na presente invenção inclui preferencialmente a temperatura inicial da etapa de secagem primária de 10 °C a -50 °C, mais preferencialmente de 0 °C a -45 °C, mais preferencialmente de -30 °C a -40 °C. O tempo total da etapa de secagem primária do processo de liofilização na presente invenção é preferencialmente de 35 a 80 h, mais preferencialmente de 40 a 75 h, mais preferencialmente de 50 a 60 h. O tempo necessário para atingir a temperatura inicial da etapa de secagem primária do processo de liofilização na presente invenção é preferencialmente de 100 min a 1000 min, mais preferencialmente de 250 min a 500 min, mais preferencialmente de 300 min a 400 min. A pressão no início da etapa de secagem primária do processo de liofilização na presente invenção é preferencialmente de 50 mTorr a 200 mTorr. A temperatura máxima no final da etapa de secagem primária do processo de liofilização na presente invenção é preferencialmente de 5 °C a 25 °C, mais preferencialmente de 8 °C a 22 °C, mais preferencialmente de 10 °C a 20 °C. O tempo de espera na temperatura máxima da etapa de secagem primária do processo de liofilização na presente invenção é preferencialmente de 5 a 72 h, mais preferencialmente de 8 a 24 h, mais preferencialmente de 10 a 14 h. A pressão no final da etapa de secagem primária do processo de liofilização na presente invenção é preferencialmente de 37 mTorr a 112 mTorr, mais preferencialmente de 50 mTorr a 90 mTorr, mais preferencialmente de 60 mTorr a 80 mTorr.
[0049] A etapa de secagem primária do processo de liofilização na presente invenção também poderia incluir uma ou mais etapas intermediárias de secagem. A temperatura da etapa de secagem intermediária do processo de liofilização na presente invenção é preferencialmente de -5 °C a 15 °C, mais preferencialmente de 0 °C a 10 °C, mais preferencialmente de 3 °C a 7 °C. O tempo de espera na etapa de secagem intermediária do processo de liofilização na presente invenção é preferencialmente de 2 a 24 h, mais preferencialmente de 5 a 12 h, mais preferencialmente de 8 a 10 h. A pressão na etapa de secagem intermediária do processo de liofilização na presente invenção é preferencialmente de 75 mTorr a 200 mTorr, mais preferencialmente de 100 mTorr a 120 mTorr. Etapa - 3 Secagem Secundária
[0050] No final do ciclo de secagem primária, o pó seco normalmente retém 10% da umidade que precisa ser removida pela incorporação de um ciclo secundário. Esse é o último ciclo do processo de liofilização e remove a água descongelada, isto é, a água associada ao estado amorfo para secar ainda mais o produto e reduzir o teor de umidade residual.
[0051] O processo liofilizado na presente invenção inclui preferencialmente a temperatura da etapa de secagem secundária de 10 °C a 37 °C, mais preferencialmente de 15 °C a 35 °C, mais preferencialmente de 20 °C a
30 °C. O tempo total da etapa de secagem secundária do processo de liofilização na presente invenção é preferencialmente de 3 a 24 h, mais preferencialmente de 4 a 16 h, mais preferencialmente de 4 a 7 h. O tempo de espera da etapa de secagem secundária do processo de liofilização na presente invenção é preferencialmente de 3 a 24 h, mais preferencialmente de 4 a 16 h, mais preferencialmente de 4 a 7 h. A pressão da secagem secundária do processo de liofilização na presente invenção é preferencialmente de 37 mTorr a 50 mTorr. Pós-Liofilização
[0052] O volume de reconstituição por frasco, pós-liofilização pode ser de 1 a 5,5 ml, dependendo da dose desejada pós-reconstituição e da concentração inicial da amostra de pré-liofilização. A concentração de pegaspargase após reconstituição do produto liofilizado no volume necessário está na faixa de 750 ± 20% UI/ml. Utilização
[0053] Em outro aspecto da invenção observa-se que a composição da presente invenção é estável por longos períodos, apesar das oscilações de temperatura que ocorrem durante o manuseio e transporte, pois o produto é estável à temperatura ambiente assim como 30 °C e 37 °C. °C por intervalo de tempo substancial. Sem estar limitado pela teoria, é proposto que o uso ótimo dos vários ingredientes na referida proporção mantém a estabilidade da composição durante e após a liofilização, tornando o produto mais estável. A presente invenção permite alcançar um produto liofilizado que mantém a integridade física, atividade biológica e estabilidade química.
[0054] Além disso, a composição da presente invenção contém pegaspargase que tem pureza superior a 95% após a liofilização. Com esta pureza de porcentagem mais alta, a composição é bem estabilizada e a deterioração é considerada mínima em ambas as condições aceleradas e em tempo real da estabilidade.
[0055] A composição da presente invenção também é sinérgica em que os ingredientes, quando constituídos em conjunto de acordo com os princípios aqui descritos, produzem uma composição com atividade e estabilidade adequadas durante seu prazo de validade.
Vantagens Da Composição Da Presente Invenção
[0056] 1. A composição da presente invenção é tal que fornece o suporte mecânico desejado à estrutura de bolo, conferindo estabilidade à composição da pegaspargase e aumentando sua capacidade de lidar com o estresse do processo de liofilização, resultando em um produto estável em armazenamento.
[0057] 2. O processo da presente invenção é tal que o tempo de liofilização é reduzido consideravelmente em relação a outros processos da técnica anterior, abrindo caminho para um processo economicamente viável com quase 2 dias menos de tempo de execução do liofilizador e utilização das instalações. O processo de liofilização otimizado para a nova composição de pegaspargase, conforme detalhado nesta invenção, é concluído em menos de 3 dias, o que é uma melhoria significativa em relação aos quase 5 dias (112,5 horas).
[0058] 3. A presente invenção permite o uso de nenhuma ou baixa concentração de sal na composição da pegaspargase liofilizada, apresentando vantagens em termos de temperatura eutética e de transição vítrea.
[0059] 4. A nova composição mencionada no presente invento produz um produto estável em armazenamento mesmo a temperaturas mais elevadas. A estabilidade da pegaspargase liofilizada a 30 °C por 18 meses e 37 °C por 3 meses demonstra claramente a melhora da estabilidade térmica em relação à formulação líquida. A deterioração física, química e biológica da composição em questão é minimizada em condições de armazenamento aceleradas e em tempo real. Isso é particularmente importante para os países em desenvolvimento, pois esta nova composição de pegaspargase liofilizada permite variações de temperatura durante o transporte e manuseio.
[0060] 5. A nova composição mencionada no presente inventário produz um produto estável em armazenamento mesmo a mais elevadas. A estabilidade da pegaspargase liofilizada a 30 °C por 18 meses e 37 °C por 3 meses demonstra claramente a estabilidade térmica em relação à líquida. A deterioração física, química e biológica da composição em questão é minimizada em condições de armazenamento aceleradas e em tempo real. Isso é particularmente importante para os países em desenvolvimento, pois esta nova composição de pegaspargase liofilizada permite variações de temperatura durante o transporte e manuseio.
[0061] 6. Com base na quantidade ideal de excipientes e no processo otimizado de liofilização, a presente invenção resulta em um produto liofilizado estável em armazenamento a um custo ideal.
[0062] A presente invenção é aqui ilustrada a título de exemplos. Os exemplos fornecem uma descrição de uma composição da presente invenção e proteção de pegaspargase durante a liofilização e armazenamento. Os exemplos são ilustração de uma modalidade da presente invenção e não podem, de forma alguma, ser interpretados como limitantes. Exemplos
[0063] Como foi reiterado anteriormente, o ciclo de liofilização e a composição precisam ser codesenvolvidos, uma vez que o processo de liofilização que produz um produto estável em armazenamento depende da composição da formulação que, por sua vez, determina o destino do produto pós-liofilização. Os exemplos 1 e 2 detalham a interdependência do processo de liofilização e da composição. Exemplo 1: Efeito do Excipiente
1.1 Crioprotetor
[0064] O volume da pegaspargase foi trocado por tampão em solução salina tampão de fosfato de sódio 50 mM, pH 7,4. O volume (substância medicamentosa) foi formulado com várias percentagens em peso (da composição) de crioprotetor, ou seja, sacarose e trealose. 1 ml do volume formulado de pegaspargase foi colocado em frascos de vidro de 2 ml de USP tipo I pré-esterilizados despirogenados (recomendado para parenteral) e semi-rolhados com rolha de borracha cinza de 13 mm revestida com bromobutila. Os frascos foram fechados pela metade e submetidos ao processo de liofilização.
[0065] Para a etapa de congelamento do processo de liofilização, o congelamento inicial foi realizado a -40 °C por 1 hora a qual foi atingida uma taxa de congelamento de 1,08 °C/min, onde os frascos foram mantidos por 3 horas.
[0066] Na etapa de secagem primária, a temperatura foi levada a -5 °C a uma taxa de 0,028 °C/min abaixo de 112 mTorr e foi mantida nessa temperatura por 6 h. A temperatura foi posteriormente aumentada para 0 °C a uma taxa de 0,006 °C/min e foi mantida a 0 °C durante 6 h sob pressão de 112 mTorr. Por último, a temperatura foi posteriormente aumentada para 20 °C a uma taxa de 0,03 °C/min e foi mantida a 20 °C durante 5 h sob pressão de 112 mTorr. Na etapa de secagem secundária, a pressão foi reduzida ainda mais para 37 mTorr e a temperatura elevada para 25 °C a uma taxa de 0,17 °C/min e mantida por 5 h. O tempo total para o processo de liofilização é de 76,5 h.
[0067] Após a conclusão do processo de liofilização, os frascos foram tapados com o movimento da prateleira para cima. Em seguida, a pressão foi liberada pela introdução do gás nitrogênio estéril na câmara de liofilização. Os frascos liofilizados foram então selados com selos flip-off de 13 mm e submetidos à caracterização analítica. A estrutura de bolo, o tempo de reconstituição, a clareza pós-reconstituição e a atividade relativa (em relação à amostra pré-liofilizada) foram medidos para o produto liofilizado. O resultado do processo de liofilização nas várias composições de pegaspargase com crio-protetores variados está tabelado na Tabela 1. Tabela 1: Efeito De Diferentes Crioprotetores Com Porcentagens Variáveis Na Composição Da Formulação Liofilizada De Pegaspargase Nº Crioprote % da Aparên Tempo de Transparên % de Sr tor Composiç cia do Reconstitui cia após Ativida . ão bolo ção Reconstitui de ção Relativ a 1 Sacarose 35,14% Fraca 30 s clara 89% 2 69,80% Fraca 30 s Clear 82% 3 90,24% Fraca 35 s Clear 86% 4 Trealose 31,62% Fraca 27 s Clear 93% 5 90,24% Fraca 1:45 min Clear 80% 6 Sacarose 55,84% Fraca 32 s Clear 95% Trealose 13,96%
[0068] A estrutura de bolo de todas as pegaspargases formuladas, na presença de diferentes crioprotetores com diferentes percentagens de composição do produto liofilizado, foram insatisfatórias. A adição de agente de volume foi, portanto, necessária para obter um resultado satisfatório.
1.2 Agente de Volume
[0069] O volume da pegaspargase foi trocado por tampão em tampão salino de fosfato de sódio 50 mM, pH 7,4. O volume (substância medicamentosa) formulado com várias percentagens em peso (da composição) de agentes de volume, ou seja, manitol e glicina. 1 ml do volume formulado de pegaspargase foi colocado em frascos de vidro de 2 ml de USP tipo I pré-esterilizados despirogenados (recomendado para parenteral) e semi- rolhados com rolha de borracha cinza de 13 mm revestida com bromobutila. Os frascos foram tampados pela metade e submetidos ao processo de liofilização.
[0070] Para a etapa de congelamento do processo de liofilização, o congelamento inicial foi realizado a -40 °C por 1 h que atingiu uma taxa de congelamento de 1,08 °C/min, onde os frascos foram mantidos por 3 h. Na etapa de secagem primária, a temperatura foi levada a -35 °C a uma taxa de 0,028 °C/min abaixo de 112 mTorr e foi mantida a essa temperatura por 10 h. A temperatura foi posteriormente aumentada para 5 °C a uma taxa de 0,11 °C/min e foi mantida a 5 °C durante 9 h sob pressão de 112 mTorr. Por último, a temperatura foi posteriormente aumentada para 15 °C a uma taxa de 0,13 °C/min e foi mantida a 15 °C durante 12 h sob uma pressão reduzida de 75 mTorr. Na etapa de secagem secundária, a pressão foi reduzida ainda mais para 37 mTorr e a temperatura elevada para 25 °C a uma taxa de 0,33 °C/min e mantida por 5 h. O tempo total para o processo de liofilização é de 53 h.
[0071] Após a conclusão do processo de liofilização, os frascos foram tapados com o movimento da prateleira para cima. Em seguida, a pressão foi liberada pela introdução do gás nitrogênio estéril na câmara de liofilização. Os frascos liofilizados foram então selados com selos flip-off de 13 mm e submetidos à caracterização analítica. A estrutura de bolo, tempo de reconstituição, clareza pós-reconstituição e atividade relativa e pureza (em relação à amostra pré-liofilizada) foram medidos para o produto liofilizado. O resultado do processo de liofilização nas várias composições de pegaspargase com agente de volume variável está tabelado na Tabela 2. Tabela 2: Efeito De Diferentes Agentes De Volume Com Porcentagens Variáveis Na Composição Da Formulação Liofilizada De Pegaspargase Nº Agent % da Aparên Tempo de Clareza % de % de Sr e de Composiç cia do Reconstitui após Ativida Purez . Volum ão bolo ção Reconstitui de a e ção Relativ Relati a va 1 Nenhu NA Boa 28 s Límpida 69% 67% m 2 Glicina 51,54% Boa 26 s Límpida 83% 98% 3 Glicina 51,36% Boa 52 s Límpida 100% 96% 4 Manito 35,96% Fraca 37 s Límpida 89% 97% l 5 Manito 27,44% Fraca 37 s Límpida 83% 99% l Glicina 24,01%
[0072] A estrutura do bolo é mostrada na Figura 1. É claro a partir do conjunto de dados que o agente de volume glicina contribui substancialmente para a estrutura de bolo e também retém a atividade dentro dos limites permitidos (600 UI/ml a 900 UI/ml). A estrutura de bolo na ausência de agente de volume para este processo de liofilização é farmaceuticamente aceitável, mas a atividade e a pureza da pegaspargase são muito pobres. O uso do manitol como agente de volume, embora retenha atividade e pureza, não apresenta uma boa estrutura de bolo para esse processo de liofilização.
1.3 Efeito do Sal
[0073] O volume da pegaspargase foi trocado por tampão em tampão de fosfato de sódio 50 mM, pH 7,4 e formulado com sacarose (crio/lioprotetor), diferentes quantidades de agente de volume - glicina com quantidade variável (% em peso da composição) de sal. 2 ml do volume formulado foram enchidos em frascos de vidro de 5 ml de USP despirogenados pré-esterilizados (recomendado para parenteral) e meio rolhados com rolha de borracha revestida com bromobutila cinza de 20 mm. Os frascos foram rolhados pela metade e submetidos ao processo de liofilização otimizado.
[0074] A etapa de congelamento do processo de liofilização foi realizada a -40 °C por 4 h. A temperatura de congelamento foi atingida a uma taxa de congelamento de 1 °C/min. Na etapa de secagem primária, a temperatura foi elevada a -35 °C a uma taxa de 0,014 °C/min abaixo de 112 mTorr e foi mantida a essa temperatura por 10 h. A temperatura foi posteriormente aumentada para 5 °C a uma taxa de 0,06 °C/min e foi mantida a 5 °C durante 9 h sob pressão de 112 mTorr. A pressão foi reduzida para 75 mTorr e a temperatura elevada para 15 °C a uma taxa de 0,02 °C/min e mantida durante 12 h. Durante o ciclo de secagem secundária, a pressão foi reduzida ainda mais para 37 mTorr e a temperatura elevada para 25 °C a uma taxa de 0,33 °C/min e mantida por 5 h.
[0075] Após a conclusão do processo de liofilização, os frascos foram tapados com o movimento da prateleira para cima. Em seguida, a pressão foi liberada pela introdução do gás nitrogênio estéril na câmara de liofilização. Os frascos liofilizados foram então selados com selos destacáveis de 20 mm. O produto liofilizado foi reconstituído em 5 ml de água para injetáveis e submetido à caracterização analítica. A estrutura de bolo, tempo de reconstituição, clareza pós-reconstituição, atividade relativa (em relação ao volume de pré-liofilização), pureza absoluta (expressa como porcentagem determinada por cromatografia líquida de alta eficiência de exclusão de tamanho (SE-HPLC)) e osmolalidade foram medidos para o produto liofilizado. O resultado do processo de liofilização nas várias composições de pegaspargase está tabelado na Tabela 3. Tabela 3: O Efeito Do NaCl E Da Glicina Na Liofilização Da Pegaspargase N % da Aparên Tempo de Clareza % de % de Osmolalid º Composiçã cia do Reconstitu após Ativida Pure ade S o bolo ição (s) Reconstitu de za (mOsm/K r. NaC Glici ição g) l na 1 0,00 48,44 Boa 40 Límpida 90,0% 98,0 427 % % % 2 0,00 46,45 Boa 39 Límpida 90,7% 97,7 393 % % % 3 0,00 44,29 Boa 42 Límpida 80,8% n.d. 370 % % 4 0,44 48,23 Boa 44 Límpida 92,6% 97,6 427
% % % 5 0,45 46,24 Boa 35 Límpida 96,8% 98,2 395 % % % 6 0,47 44,08 Boa 30 Límpida 93,9% 97,9 385 % % % 7 1,08 47,92 Boa 35 Límpida 85,3% 97,6 433 % % % 8 1,12 45,93 Boa 33 Límpida 87,8% 97,6 403 % % % 9 1,16 43,78 Boa 32 Límpida 61,9% n.d. 384 % %
[0076] É evidente que o processo de liofilização otimizado pode ser utilizado para a composição com baixa e nenhuma concentração de sal sem alterar os atributos críticos do produto. Exemplo 2: Efeito De Ciclo De Liofilização Diferente Na Mesma Composição
[0077] O volume da pegaspargase foi trocado por tampão em tampão salino de fosfato de sódio 50 mM, pH 7,4. O grosso (fármaco) foi formulado com sacarose (cromo/lio-protetor a 34,3% da composição) e glicina (agente de volume a 51,5% da composição). 1 ml do volume formulado foi enchido em frascos de vidro de 2 ml de USP despirogenado pré- esterilizado (recomendado para parenteral) e meia rolha com rolha de borracha revestida com bromobutila cinza de 13 mm. Os frascos foram rolhados pela metade e submetidos a vários processos de liofilização.
[0078] A etapa de congelamento dos vários processos de liofilização foi realizada por várias durações e temperaturas. Em alguns casos, foi realizado um congelamento em uma única etapa, enquanto em outros foi realizado o congelamento em várias etapas. Em um ciclo, o congelamento inicial foi realizado a -15 °C por 2 h, o qual foi atingido a uma taxa de congelamento de 1,16 °C/min. Seguiu-se uma nova diminuição da temperatura para -25 °C, alcançada à taxa de congelamento de 0,33 °C/min, onde os frascos foram mantidos por 3 h. Por fim, a temperatura foi baixada para -40 °C, atingindo a taxa de congelamento de 0,5 °C/min onde os frascos foram mantidos por 2 h. A duração total da etapa de congelamento foi de 8,5 h. Em outro ciclo a etapa de congelamento do processo de liofilização foi realizada a -40 °C por 3 h. A temperatura de congelamento foi atingida a uma taxa de congelamento de 1 °C/min. A duração total da etapa de congelamento foi de 4 h. Em outro ciclo a etapa de congelamento do processo de liofilização foi realizada a -40 °C por 6 h. A temperatura de congelamento foi atingida a uma taxa de congelamento de 0,5 °C/min. A duração total da etapa de congelamento foi de 8 h. Já em outro ciclo a etapa de congelamento do processo de liofilização foi realizada a -40 °C por 4 h. A temperatura de congelamento foi atingida a uma taxa de congelamento de 1 °C/min. A duração total da etapa de congelamento foi de 5 h.
[0079] A etapa de secagem primária do ciclo de liofilização também variou em relação à temperatura, pressão e tempo. Em um ciclo, para a etapa de secagem primária, a temperatura foi colocada a -5 °C a uma taxa de 0,028 °C/min sob 112 mTorr e foi mantida nessa temperatura por 6 h. A temperatura foi ainda elevada a 0 °C a uma taxa de 0.006 °C/min e foi mantida a 0 °C por 6 h sob pressão de 112 mTorr. Por fim, a temperatura foi adicionalmente elevada a 20 °C a uma taxa de 0,03 °C/min e foi mantida a 20 °C por 5 h sob pressão de 112 mTorr. A duração total da etapa de secagem primária foi de 61,5 h. Em outro ciclo para a etapa de secagem primária, a temperatura foi colocada a -5 °C a uma taxa de 0,15 °C/min sob 112 mTorr e foi mantida nessa temperatura por 14 h. A temperatura foi adicionalmente aumentada a 5 °C a uma taxa de 0,06 °C/min e foi mantida a 5 °C por 9 h sob pressão de 112 mTorr. Por fim, a pressão foi reduzida a 75 mTorr e a temperatura foi colocada a 15 °C a uma taxa de 0,067 °C/min e mantida por 6 h. A duração total da etapa de secagem primária foi de 38,5 h. Em outro ciclo para a etapa de secagem primária, a temperatura foi colocada a -35 °C a uma taxa de 0.027 °C/min sob 112 mTorr e foi mantida nessa temperatura por 10 h. A temperatura foi adicionalmente elevada para 5 °C a uma taxa de 0,11 °C/min e foi mantida a 5 °C por 9 h sob pressão de 112 mTorr. Por fim, a pressão foi reduzida para 75 mTorr e a temperatura foi colocada a 15 °C a uma taxa de 0,067 °C/min e mantida por 12 h. A duração total da etapa de secagem primária foi de 42,5 h. Em outro ciclo para a etapa de secagem primária, a temperatura foi colocada a -35 °C a uma taxa de 0,027 °C/min sob 112 mTorr e foi mantida nessa temperatura por 10 h. A temperatura foi adicionalmente elevada para 5 °C a uma taxa de 0,11 °C/min e foi mantida a 5 °C por 9 h sob pressão de 112 mTorr. A temperatura foi adicionalmente elevada para 10 °C a uma taxa de 0,014 °C/min e foi mantida a 10°C for 24 h sob pressão de 112 mTorr. Por fim, a pressão foi reduzida para 75 mTorr e a temperatura foi colocada a 15 °C a uma taxa de 0,033 °C/min e mantida por 12 h. A duração total da etapa de secagem primária foi de 72,5 h. Ainda, em outro ciclo pra a etapa de secagem primária, a temperatura foi colocada a -35°C a uma taxa de 0,027 °C/min sob 112 mTorr e foi mantida nessa temperatura por 6 h. A temperatura foi adicionalmente elevada para 15°C a uma taxa de 0,138 °C/min e foi mantida a 15°C for 9 h sob pressão de 112 mTorr. Por fim, a pressão foi reduzida para 75 mTorr ao longo de 5 h a 15 °C e mantida por 12 h. A duração total da etapa de secagem primária foi de 38,5 h.
[0080] A etapa de secagem secundária do ciclo de liofilização também variou em relação à temperatura, pressão e tempo. Em um ciclo, para a etapa de secagem secundária, a pressão foi adicionalmente reduzida para 37 mTorr e a temperatura foi elevada para 25 °C a uma taxa de 0,16 °C/min e mantida para 5 h. A duração total da etapa de secagem secundária foi de 5,5 h. Em um ciclo, para a etapa de secagem secundária, a pressão foi adicionalmente reduzida para 37 mTorr e a temperatura foi elevada para 25 °C a uma taxa de 0,33 °C/min e mantida para 5 h. A duração total da etapa de secagem secundária foi de 5,5 h. Ainda, em um ciclo, para a etapa de secagem secundária, a pressão foi adicionalmente reduzida pra 37 mTorr e a temperatura foi elevada para 25 °C a uma taxa de 0,33 °C/min e mantida para 9 h. A duração total da etapa de secagem secundária foi de 9,5 h.
[0081] O tempo de conclusão do processo de liofilização variou de 48 h a 83,5 h.
[0082] Após a conclusão do processo de liofilização, os frascos foram tapados com o movimento da prateleira para cima. Em seguida, a pressão foi liberada pela introdução do gás nitrogênio estéril na câmara de liofilização. Os frascos liofilizados foram então selados com selos flip-off de 13 mm e submetidos à caracterização analítica. A estrutura de bolo, tempo de reconstituição, clareza pós-reconstituição, atividade relativa
(em relação ao volume de pré-liofilização), pureza relativa (em relação ao volume de pré-liofilização, conforme determinado por cromatografia líquida de alto desempenho de exclusão de tamanho (SE-HPLC)) e osmolalidade foram medidos para o produto liofilizado. O produto liofilizado apresentou formação de bolo de boa a satisfatória, tempo de reconstituição aceitável (menos de 2 minutos) e a amostra reconstituída era límpida e incolor. Entretanto, a atividade relativa e a pureza variaram consideravelmente conforme mostrado na Tabela 4. Esse resultado é esperado devido às diferentes condições de estresse conferidas na mesma composição devido à mudança no processo de liofilização. Tabela 4: Pureza Relativa e Atividade Da Mesma Formulação Com Condições De Liofilização Variadas Ciclos de Tempo (h) % de % de Liofilizaçã Congelament Secage Secagem Tota Atividad Pureza o o m Secundári l e Relativ Primária a Relativa a 1 8,5 61,5 5,5 75,5 84% 83% 2 4,0 61,5 5,5 71,0 98% 91% 3 4,0 38,5 5,5 48,0 91% 93% 4 8,0 38,5 5,5 52,0 87% 91% 5 5,0 42,5 5,5 53,0 83% 98% 6 5,0 61,5 5,5 72,0 87% 101% 7 5,0 38,5 9,5 53,0 85% 95% Exemplo 3: Um Exemplo Ilustrativo Da Composição Da Presente Invenção – Baixo Teor De Sal
[0083] O volume da pegaspargase foi trocado por tampão em tampão salino de fosfato de sódio 50 mM, pH 7,4. O volume necessário foi formulado com sacarose como crio/lioprotetor e glicina como agente de volume e finalmente diluído para atingir 1875 IU/ml. A formulação final compreendia pegaspargase, sacarose, glicina, fosfato de sódio monobásico, fosfato de sódio dibásico e cloreto de sódio a 13,67% a 7,04%, 39,60% a 36,78%, 47,52% a 44,13%, 0,95% a 0,88%, 4,42% a 4,10 % e 0,47% a 0,43% da composição, respectivamente. 2 ml do volume formulado foram enchidos em frascos de vidro de 5 ml de USP despirogenados pré-esterilizados (recomendado para parenteral) e meio rolhados com rolha de borracha revestida com bromobutila cinza de 20 mm. Os frascos foram tampados pela metade e submetidos ao processo de liofilização otimizado.
[0084] A etapa de congelamento do processo de liofilização foi realizada a -40 °C por 4 h. A temperatura de congelamento foi atingida a uma taxa de congelamento de 1 °C/min. No ciclo de secagem primária, a temperatura foi colocada a -35 °C a uma taxa de 0,014 °C/min sob 112 mTorr e foi mantida nessa temperatura por 10 h. A temperatura foi adicionalmente elevada para 5 °C a uma taxa de 0,06 °C/min e foi mantida a 5 °C por 9 horas sob pressão de 112 mTorr. A pressão foi reduzida para 75 mTorr e a temperatura foi colocada a 15 °C a uma taxa de 0,02 °C/min e mantida por 12 h. Durante o ciclo de secagem secundária, a pressão foi reduzida para 37 mTorr e a temperatura foi elevada para 25 °C a uma taxa de 0,33 °C/min e mantida por 5 h. O tempo total para o processo de liofilização é de 66,5 h.
[0085] Após a conclusão do processo de liofilização, os frascos foram tapados com o movimento da prateleira para cima. Em seguida, a pressão foi liberada pela introdução do gás nitrogênio estéril na câmara de liofilização. Os frascos liofilizados foram então selados com selos destacáveis de 20 mm. O produto liofilizado foi reconstituído em 5 ml de água para injeção e submetido à caracterização analítica (Tabela 5). Tabela 5. Caracterização Analítica De Pegaspargase Liofilizada Teste Critérios de Aceitação Produto Liofilizado Aparência Pré-reconstituição – Bolo branco a Em conformidade esbranquiçado Pós-reconstituição – Solução incolor Tempo de NMT 180 s 68 reconstituição (s) Clareza Límpida, sem partículas visíveis Em conformidade Volume de Carga Para entrega 5,0 ml (USP) 5,0 ml pH 7,0 – 7,4 7,08 Potência (Atividade) 600 a 900 IU/ml 680 Atividade específica ≥ 85 IU/mg proteína 128 Pureza por SEC ≥ 85% de componentes ativos, ≤8% de 94,94% Pureza Relativa agregados 99,11% Concentração de 4,8 a 8,5 mg/ml 5,33 Proteína Teor de Umidade NMT 5% 3,5% Osmolalidade 270 a 600 mOsm/kg 409 (mOsm/kg)
[0086] A Figura 2 demonstra a integridade e pureza da pegaspargase pré e pós-liofilizada conforme determinado por dodecil sulfato de sódio - eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) e cromatografia líquida de alto desempenho de exclusão de tamanho (SE-HPLC), respectivamente.
[0087] A robustez do processo de ciclo de liofilização assim como a composição foram verificadas em múltiplos lotes. A estrutura de bolo, tempo de reconstituição, clareza pós-reconstituição, atividade absoluta, atividade relativa (em relação ao volume de pré-liofilização), pureza absoluta (expressa como porcentagem determinada por cromatografia líquida de alto desempenho de exclusão de tamanho (SE-HPLC)), relativa pureza (em relação ao volume de pré-liofilização), osmolalidade e teor de umidade foram medidos para o produto liofilizado. As características do produto estão em conformidade com os critérios de aceitação, conforme mostrado na Tabela 6 para três lotes representativos. Tabela 6. Caracterização Analítica De Três Lotes De Pegaspargase Liofilizada Teste Critérios de Aceitação Lote 1 Lote 2 Lote 3 Aparência Pré-reconstituição – Bolo Em conformidade branco a esbranquiçado Pós-reconstituição – Solução incolor Tempo de NMT 180 s 59 59 66 reconstituição (s) Clareza Límpida, sem partículas Em conformidade visíveis Potência 600 a 900 IU/ml 815 869 727 (Atividade) Atividade Relativa NLT 85% 103,70% 101,60% 97,60% Pureza por SEC ≥ 85% de componentes 97,55% 99,73% 99,78% Pureza Relativa ativos, ≤8% de agregados 100,40% 100,00% 100,00% Teor de Umidade NMT 5% 2,28% 2,78% 2,35% Osmolalidade 270 a 600 mOsm/kg 390 398 401 (mOsm/kg)
[0088] O produto liofilizado foi submetido a estudo de estabilidade de longo prazo a 5 °C ± 3 °C por 24 meses e estudo de estabilidade acelerado a 25 °C ± 2 °C/60% ± 5% de umidade relativa por 6 meses de acordo com ICH diretrizes de qualidade (Q1A). O resultado do processo de liofilização na pegaspargase do produto em vários pontos de tempo à temperatura ambiente (5 °C ± 3 °C) e a 25 °C ± 2 °C/60% ± 5% de umidade relativa é tabulado na Tabela 7 e tabela 8, respectivamente.
Tabela 7. Estudo De Estabilidade De Longo Prazo De Pegaspargase Liofilizada A 5 °C ± 3 °C Por 24 Meses Teste Critérios de 0 dia 15 dias 1 Mês 3 6 9 12 18 24 Aceitação Meses Mese Mese Meses Mese Mese s s s s Aparência Pré- Em conformidade reconstituiçã o – Bolo branco a esbranquiça do Pós- reconstituiçã o – Solução incolor Tempo de NMT 180 s 68 58 58 52 58 59 59 57 54 Reconstituiç ão (s) Clareza Límpida, Em conformidade sem partículas visíveis Volume de Para 5,0 ml 5,0 ml 5,0 ml 5,0 ml 5,0 ml 5,0 ml 5,0 ml 5,0 ml 5,0 ml carga entrega 5,0 ml (USP) pH 7,0 a 7,4 7,08 7,09 7,11 7,07 7,08 7,2 7,19 7,17 7,2 Potência 600 a 900 680 687 679 673 661 650 656 675 642 (Atividade) IU/ml Atividade ≥ 85 IU/mg 128 128 126 130 127 115 120 121 123 Específica proteína Pureza por ≥ 85% de 94,94 95,96% 95,86% 95,82% 95,77 95,70 95,79% 95,40 93,05 SEC componente % % % % % Pureza s ativos, 99,11 100,18 100,07 100,03 99,98 99,91 100,00 99,59 97,14 Relativa ≤8% de % % % % % % % % % agregados Concentraçã 4,8 a 8,5 5,33 5,35 5,39 5,18 5,2 5,66 5,48 5,58 5,24 o de mg/ml Proteína Osmolalidad 270 a 600 409 419 412 411 413 406 411 408 413 e mOsm/kg (mOsm/kg)
Tabela 8. Estudo De Estabilidade Acelerada De Pegaspargase Liofilizada A 25 °C ± 3 °C/60% ± 5% De Umidade Relativa Por 6 Meses.
Teste Critérios de 0 dia 15 dias 1 Mês 3 Meses 6 Meses Aceitação Aparência Pré-reconstituição – Em conformidade Bolo branco a esbranquiçado Pós-reconstituição – Solução incolor Tempo de NMT 180 s 68 64 63 56 62 Reconstituição (s) Clareza Límpida, sem Em conformidade partículas visíveis Volume de carga Para entrega 5,0 ml 5,0 ml 5,0 ml 5,0 ml 5,0 ml 5,0 ml (USP)
pH 7,0 a 7,4 7,08 7,1 7,1 7,06 7,05 Potência (Atividade) 600 a 900 IU/ml 680 679 681 657 622 Atividade Específica ≥ 85 IU/mg proteína 128 129 132 123 119 Pureza por SEC ≥ 85% de 94,94% 95,53% 95,00% 95,09% 94,06% Pureza Relativa componentes ativos, 99,11% 99,73% 99,18% 99,27% 98,19% ≤8% de agregados Concentração de 4,8 a 8,5 mg/ml 5,33 5,28 5,14 5,33 5,24 Proteína Osmolalidade 270 a 600 mOsm/kg 409 412 414 411 410 (mOsm/kg)
[0089] As características do produto estão em conformidade com os critérios de aceitação para toda a duração, mostrando que o produto é estável a 5 °C ± 3 °C por 24 meses e a 25 °C ± 2 °C/60% ± 5% de umidade relativa para 6 meses. Além disso, a estabilidade do produto liofilizado foi avaliada em temperatura elevada para a qual o produto foi submetido a estudo de estabilidade de longo prazo a 30 °C ± 2 °C/65% ± 5% de umidade relativa por 18 meses e estudo de estabilidade acelerado a 37 °C ± 2 °C/75% ± 5% de umidade relativa por 3 meses. O resultado do processo de liofilização na pegaspargase do produto em vários pontos de tempo a 30 °C ± 2 °C/65% ± 5% umidade relativa e a 37 °C ± 2 °C/75% ± 5% umidade relativa é tabulado na Tabela 9 e Tabela 10, respectivamente. As características do produto estão de acordo com os critérios de aceitação para toda a duração, mostrando que o produto é estável a 30 °C ± 2 °C/65% ± 5% de umidade relativa por 18 meses e a 37 °C ± 2 °C/75% ± 5% de umidade relativa - umidade relativa do ar por 3 meses. Tabela 9. Estudo De Estabilidade De Longo Prazo De Pegaspargase Liofilizada A 30 °C ± 2 °C/65% ± 5% De Umidade Relativa Por 18 Meses Teste Critérios de 0 dia 15 dias 1 Mês 3 6 9 12 18 Aceitação Meses Meses Meses Meses Meses Aparência Pré- Em conformidade reconstituição – Bolo branco a esbranquiçado Pós- reconstituição – Solução incolor
Tempo de NMT 180 s 68 57 59 58 61 58 62 61 Reconstituição (s) Clareza Límpida, sem Em conformidade partículas visíveis Volume de Para entrega 5,0 ml 5,0 ml 5,0 ml 5,0 ml 5,0 ml 5,0 ml 5,0 ml 5,0 ml carga 5,0 ml (USP) pH 7,0 a 7,4 7,08 7,08 7,09 7,07 7,05 7,27 7,18 7,24 Potência 600 a 900 680 668 687 652 611 617 629 601 (Atividade) IU/ml Atividade ≥ 85 IU/mg 128 131 138 128 119 116 112 113 Específica proteína Pureza por ≥ 85% de 94,94% 95,31% 95,00% 94,11% 91,11% 90,10% 91,00% 87,06% SEC componentes Pureza ativos, ≤8% de 99,11% 99,50% 99,18% 98,25% 95,11% 94,06% 95,00% 90,89% Relativa agregados Concentração 4,8 a 8,5 5,33 5,11 4,98 5,08 5,15 5,33 5,61 5,3 de Proteína mg/ml Osmolalidade 270 a 600 409 411 415 406 409 396 409 412 (mOsm/kg) mOsm/kg
Tabela 10: Estudo De Estabilidade Acelerado De Pegaspargase Liofilizada A 37 °C ± 2 °C/75% ± 5% De Umidade Relativa Por 3 Meses Teste Critérios de 0 dia 15 dias 1 Mês 3 Meses Aceitação Aparência Pré- Em conformidade reconstituição – Bolo branco a esbranquiçado Pós- reconstituição – Solução incolor Tempo de NMT 180 s 68 56 54 59 Reconstituição (s) Clareza Límpida, sem Em conformidade partículas visíveis Volume de carga Para entrega 5,0 5,0 ml 5,0 ml 5,0 ml 5,0 ml ml (USP) pH 7,0 a 7,4 7,08 7,09 7,09 7,1 Potência 600 a 900 IU/ml 680 656 699 631 (Atividade) Atividade ≥ 85 IU/mg 128 125 130 125 Específica proteína Pureza por SEC ≥ 85% de 94,94% 91,16% 91,15% 90,26% componentes ativos, ≤8% de agregados Pureza Relativa 99,11% 95,17% 95,16% 94,23% Concentração de 4,8 a 8,5 mg/ml 5,33 5,24 5,37 5,05 Proteína Osmolalidade 270 a 600 409 411 419 410 (mOsm/kg) mOsm/kg Exemplo 4: Um Exemplo Ilustrativo Da Composição Da Presente Invenção - Sem Sal
[0090] O volume da pegaspargase foi trocado por tampão em tampão de fosfato de sódio 50 mM, pH 7,4. O volume concentrado necessário foi formulado com sacarose como crio/lio-protetor e glicina como agente de volume e finalmente diluído para atingir 1875 IU/ml. A formulação final compreendia pegaspargase, sacarose, glicina, fosfato de sódio monobásico e fosfato de sódio dibásico a 12,57% a 9,60%, 38,71% a 37,43%, 46,45% a 44,92%, 0,93% a 0,90% e 4,32% a 4,18% da composição respectivamente. 2 ml do volume formulado foram enchidos em frascos de vidro de 5 ml de USP tipo I pré-esterilizados despirogenados (recomendado para parenteral) e meio rolhados com rolha de borracha revestida de bromobutila cinza de 20 mm. Os frascos foram tampados pela metade e submetidos ao processo de liofilização otimizado.
[0091] A etapa de congelamento do processo de liofilização foi realizada a -40 °C por 4 h. A temperatura de congelamento foi atingida a uma taxa de congelamento de 1 °C/min. No ciclo de secagem primária, a temperatura foi colocada a -35 °C a uma taxa de 0,014 °C/min sob 112 mTorr e foi mantida nessa temperatura por 10 h. A temperatura foi adicionalmente elevada para 5 °C a uma taxa de 0,06 °C/min e foi mantida a 5 °C por 9 horas sob pressão de 112 mTorr. A pressão foi reduzida para 75 mTorr e a temperatura foi colocada a 15 °C a uma taxa de 0,02 °C/min e mantida por 12 h. Durante o ciclo de secagem secundária, a pressão foi reduzida para 37 mTorr e a temperatura foi elevada para 25 °C a uma taxa de 0,33 °C/min e mantida por 5 h. O tempo total para o processo de liofilização é de 66,5 h.
[0092] Após a conclusão do processo de liofilização, os frascos foram tapados com o movimento da prateleira para cima. Em seguida, a pressão foi liberada pela introdução do gás nitrogênio estéril na câmara de liofilização. Os frascos liofilizados foram então selados com selos destacáveis de 20 mm. O produto liofilizado foi reconstituído em 5 ml de água para injeção e submetido à caracterização analítica (Tabela 11). Tabela 11. Caracterização Analítica De Pegaspargase Liofilizada Como Composição Sem Sal Teste Critérios de Aceitação Produto Liofilizado Aparência Pré-reconstituição – Bolo branco a Em conformidade esbranquiçado Pós-reconstituição – Solução incolor Tempo de NMT 180 s 49 reconstituição (s) Clareza Límpida, sem partículas visíveis Em conformidade Volume de Carga Para entrega 5,0 ml (USP) 5,0 ml Potência (Atividade) 600 a 900 IU/ml 803 Atividade específica ≥ 85 IU/mg proteína 144 Pureza por SEC ≥ 85% de componentes ativos, ≤8% de 99,40% Pureza Relativa agregados 100% Concentração de 4,8 a 8,5 mg/ml 5,56 Proteína Teor de Umidade NMT 5% 2,47% Osmolalidade 270 a 600 mOsm/kg 434 (mOsm/kg)
[0093] A robustez do processo de ciclo de liofilização assim como a composição foram verificadas em múltiplos lotes. A estrutura de bolo, tempo de reconstituição, clareza pós-reconstituição, atividade absoluta, atividade relativa (em relação ao volume de pré-liofilização), pureza absoluta (expressa como porcentagem determinada por cromatografia líquida de alto desempenho de exclusão de tamanho (SE-HPLC)), pureza relativa (em relação ao volume de pré-liofilização), osmolalidade e teor de umidade foram medidos para o produto liofilizado. As características do produto estão em conformidade com os critérios de aceitação, conforme mostrado na Tabela 12 para três lotes representativos. Tabela 12. Caracterização Analítica De Três Lotes De Pegaspargase Liofilizada Como Composição Sem Sal
Teste Critérios de Aceitação Lote 1 Lote 2 Lote 3 Aparência Pré-reconstituição – Bolo Em conformidade branco a esbranquiçado Pós-reconstituição – Solução incolor Tempo de NMT 180 s 49 83 49 reconstituição (s) Clareza Límpida, sem partículas Em conformidade visíveis Potência 600 a 900 IU/ml 831 849 803 (Atividade) Atividade Relativa NLT 85% 89% 107% 101% Pureza por SEC ≥ 85% de componentes 99% 99% 99% Pureza Relativa ativos, ≤8% de agregados 99% 100% 100% Teor de Umidade NMT 5% 2,20% 2,37% 2,47% Osmolalidade 270 a 600 mOsm/kg 420 444 434 (mOsm/kg)
[0094] O produto liofilizado sem sal foi submetido a estudo de estabilidade de longo prazo a 5 °C ± 3 °C, a 25 °C ± 2 °C/60% ± 5%, a 30 °C ± 2 °C/65% ± 5% de umidade relativa e a 37 °C ± 2 °C/75% ± 5% de umidade relativa e os dados são apresentados na Tabela 13 para um mês e na TABELA 14 para três meses. Tabela 13: Estabilidade De Uma Modalidade Da Composição Da Presente Invenção Em 1 Mês Testes Critérios de 0 dia 1 Mês (Temperatura de Aceitação Armazenamento) 5 ºC 25 ºC 30 ºC 37 ºC Aparência Bolo intacto branco Bolo intacto branco Bolo intacto branco a esbranquiçado, a esbranquiçado, a esbranquiçado, firmemente fixado ao frasco firmemente fixado firmemente fixado ao frasco ao frasco Tempo de ≤ 180 s 128 107 93 108 87 Reconstituição (s) Clareza após Solução límpida, Solução límpida, Solução límpida, nenhuma partícula reconstituição nenhuma partícula nenhuma partícula visível deve ser observada visível deve ser visível deve ser observada observada pH 7,1 a 7,5 7,3 7,23 7,24 7,23 7,24 Teor de proteína NLT 5 mg/ml 5,53 5,8 6,22 6,06 5,91 (mg/ml) Ensaio (IU/ml) 600 a 900 IU/ml 753 722 753 729 748 Atividade NLT 85 IU/mg 136 124 121 120 127 específica (IU/mg)
Osmolalidade NMT 460 mOsm/kg 430 434 436 439 445 (mOsm/kg) Pureza por SC (%) NLT 95% 99,63 99,95 99,99 97,76 96,83 PMT/Nº Total de NMT 6000 ≥ 10 µm tamanho: - 45 30 30 40 partículas por 232 recipiente NMT 600 ≥ 25 µm tamanho: - 05 03 05 03 020 SDS-PAGE Aceitável Tabela 14: Estabilidade De Uma Modalidade Da Composição Da Presente Invenção Em 3 Meses Testes Critérios de 0 dia 3 Meses (Temperatura de Aceitação Armazenamento) 5 ºC 25 ºC 30 ºC 37 ºC Aparência Bolo intacto branco Bolo intacto branco Bolo intacto branco a esbranquiçado, a esbranquiçado, a esbranquiçado, firmemente fixado ao frasco firmemente fixado firmemente fixado ao frasco ao frasco Tempo de ≤ 180 s 128 65 80 50 90 Reconstituição (s) Clareza após Solução límpida, Solução límpida, Solução límpida, nenhuma partícula reconstituição nenhuma partícula nenhuma partícula visível deve ser observada visível deve ser visível deve ser observada observada pH 7,1 a 7,5 7,3 7,29 7,29 7,29 7,28 Teor de proteína NLT 5 mg/ml 5,53 6,21 6,12 5,56 5,66 (mg/ml) Ensaio (IU/ml) 600 a 900 IU/ml 753 748 719 708 763 Atividade NLT 85 IU/mg 136 120 116 127 135 específica (IU/mg) Osmolalidade NMT 460 mOsm/kg 430 439 434 432 440 (mOsm/kg) Pureza por SC (%) NLT 95% 99,63 99,39 99,31 97,67 95,87 PMT/Nº Total de NMT 6000 ≥ 10 µm tamanho: - 23 23 30 73 partículas por 232 recipiente NMT 600 ≥ 25 µm tamanho: - 05 03 05 03 020 SDS-PAGE Aceitável Exemplo 5: Comparação Da Composição Da Presente Invenção Com A Técnica Anterior
5.1 Composição Líquida da Técnica Anterior Versus Composição Sólida da Presente Invenção
[0095] A pegaspargase relatada na técnica anterior é geralmente apresentada como uma composição líquida e não é estável em armazenamento em períodos mais longos e em temperaturas mais altas. A presente invenção divulga uma composição liofilizada estável em armazenamento a várias temperaturas. É mencionado na técnica anterior que a pegaspargase não é estável em períodos mais longos. A presente invenção supera esta limitação e fornece uma composição estável em armazenamento. O produto da técnica anterior se degrada substancialmente em 3 meses a 25 °C ± 2 °C/60% ± 5% de umidade relativa. Conforme mostrado na Figura 3, a degradação da formulação líquida é evidente pela presença de várias bandas a 25 °C ± 2 °C/60% ± 5% de umidade relativa para a composição líquida conforme analisado por SDS-PAGE (Figura 3 (A)). Esta invenção produz uma formulação estável em armazenamento que é estável a 25 °C ± 2 °C/60% ± 5% de umidade relativa, 30 °C ± 2 °C/65% ± 5% de umidade relativa e a 37 °C ± 2 °C/75% ± 5% de umidade relativa. A estabilidade da presente composição é evidente a partir da presença de uma única banda difusa com peso molecular apropriado, como mostrado na Figura 3 (B).
5.2 Composição Sólida Da Técnica Anterior Versus Composição Sólida Da Presente Invenção
[0096] A técnica anterior divulga uma composição estável em armazenamento, mas tem limitação em termos de agregados de alto peso molecular no produto liofilizado. A divulgação atual usa um processo inventivo e uma composição melhorada e não tem nenhuma agregação adicional/impurezas de alto peso molecular (ver Figura 4). A Figura 4 mostra a análise SDS-PAGE da composição liofilizada da técnica anterior com a presente invenção. Os géis SDS-PAGE confirmam a presença de impurezas de alto peso molecular, como evidente a partir da coloração de Coomassie para proteína (Figura 4 (A)) e coloração de iodo (Figura 4 (B)) para PEG. Além disso, a análise de Western Blot com anticorpo antiasparaginase (Figura 4 (C)) e anticorpo anti-PEG (Figura 4 (B)) confirma a presença de impurezas relacionadas ao produto. Isso destaca ainda mais a relação sinérgica do processo de liofilização com a composição da formulação. Deve-se notar que a composição líquida do produto da técnica anterior não mostrou a presença de espécies de alto peso molecular.

Claims (17)

REIVINDICAÇÕES
1. Composição liofilizada estável de armazenamento ideal caracterizada pelo fato de que compreende pegaspargase, um crioprotetor, um agente de volume, um tampão, opcionalmente com excipientes farmaceuticamente aceitáveis.
2. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a pegaspargase é uma asparaginase peguilada compreendendo um grupo óxido de polialquileno covalentemente ligado por um ligante à asparaginase; em que o óxido de polialquileno é monometóxi polietileno glicol (mPEG) de peso molecular preferencialmente entre 4 a 6 kDa, mais preferencialmente entre 4,5 a 5,5 kDa e mais preferencialmente 4,8 a 5,2 kDa e está covalentemente ligado por um ligante succinato através de uma ligação amida um ou mais grupos de amina primária de L-asparaginase por conjugação; em que a reação de conjugação de mPEG e L-asparaginase resulta na ligação covalente de 1 a 12 mPEGs por monômero de L-asparaginase, de preferência entre 5 a 10 mPEGs por monômero de L-asparaginase, mais preferencialmente entre 7 a 10 mPEGs por monômero de L-asparaginase e mais preferencialmente entre 7 a 9 mPEGs por monômero de L-asparaginase.
3. Composição, de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que a L-asparaginase é de uma fonte bacteriana selecionada a partir do grupo que consiste em E. coli ou Erwinia chrysanthemi ou obtida por meio de E. coli geneticamente modificada por meio de tecnologia recombinante.
4. Composição, de acordo com a personalidade 1, caracterizada pelo fato de que a quantidade de pegaspargase na composição é 2 a 32%; mais preferencialmente 5 a 20% e mais preferencialmente entre 6 a 14% da composição.
5. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o crioprotetor é selecionado a partir do grupo que compreende açúcar, poliol, polímero e aminoácido, preferencialmente um açúcar; e o açúcar é sacarose; em que o crioprotetor está presente em uma faixa de 9 a 91%; preferencialmente 20 a 60%, mais preferencialmente entre 32 a 41% da composição.
6. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o agente de volume é selecionado a partir do grupo que compreende açúcar, poliol, polímero e aminoácido, preferencialmente um aminoácido; e o aminoácido selecionado do grupo que compreende glicina, histidina, arginina; preferencialmente o aminoácido é glicina; em que o volume do agente está presente na faixa de 1 a 78%; mais preferencialmente 20 a 60% e mais preferencialmente entre 38 a 50% da composição.
7. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o tampão é selecionado a partir do grupo que compreende tampão de fosfato, tampão de fosfato de sódio (diidrogenofosfato sódico - hidrogenofosfato dissódico), tampão de fosfato de potássio (tampão de potássio diidrogenofosfato - hidrogenofosfato dipotássico), TRIS, tampão de citrato; preferencialmente, tampão de fosfato; em que o tampão está no intervalo de 3 a 33%; mais preferencialmente 3 a 15% e mais preferencialmente entre 4 a 6% da composição.
8. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o excipiente farmaceuticamente aceitável é um sal.
9. Composição, de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelo fato de que o sal é selecionado a partir do grupo que compreende cloreto de sódio, cloreto de potássio, preferencialmente cloreto de sódio; em que a quantidade do sal na composição está na faixa de 0 a 40%, de preferência 0 a 10%, mais preferencialmente 0 a 0,5% da composição.
10. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o pH do produto antes da liofilização e após a reconstituição do produto liofilizado é 6 a 8; a osmolalidade está preferencialmente na faixa de 250 a 600 mOsm/Kg, mais preferencialmente 250 a 500 mOsm/Kg e mais preferencialmente 250 a 450 mOsm/Kg.
11. Processo para a preparação da composição, conforme reivindicado na reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que consiste em: a. congelamento, b. anelamento opcional; c. secagem primária e d. secagem secundária.
12. Processo de preparação da composição, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o tempo total do processo de liofilização é preferencialmente de 2.880 min (48 h) a 5.790 min (96,5 h), mais preferencialmente de 3.120 min (52 h) a 4.980 min (83 h), mais preferencialmente de 3.120 min (52 h) a 4.200 min (70 h); a variação de temperatura é de -60 °C a 30 °C, mais preferencialmente de -50 °C a 30 °C, mais preferencialmente de -40 °C a 25 °C e a variação de pressão é preferencialmente de 0,037 Torr a 760 Torr.
13. Processo, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o congelamento é conduzido na temperatura mais baixa da etapa de congelamento de -10 °C a -60 °C, mais preferencialmente de -20 °C a -50 °C, mais preferencialmente de -35 °C a -45 °C; o tempo total é preferencialmente de 150 min a 500 min, mais preferencialmente de 200 min a 400 min, mais preferencialmente de 240 min a 350 min; a temperatura de congelamento mais baixa é preferencialmente de 20 min a 180 min, mais preferencialmente de 30 min a 120 min, mais preferencialmente de 45 min a 90 min; o tempo de espera na temperatura de congelamento mais baixa é preferencialmente de 120 min a 480 min, mais preferencialmente de 250 min a 360 min, mais preferencialmente de 200 min a 300 min.
14. Processo, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que a secagem primária é de 10 °C a -50 °C, mais preferencialmente de 0 °C a -45 °C, mais preferencialmente de -30 °C a -40 °C; o tempo total é preferencialmente de 35 a 80 h, mais preferencialmente de 40 a 75 h, mais preferencialmente de 50 a 60 h; o tempo necessário para atingir a temperatura inicial é preferencialmente de 100 min a 1.000 min, mais preferencialmente de 250 min a 500 min, mais preferencialmente de 300 min a 400 min; pressão no início é preferencialmente de 50 mTorr a 200 mTorr; a temperatura máxima no final da etapa de secagem primária é preferencialmente de 5 °C a 25 °C, mais preferencialmente de 8 °C a 22 °C, mais preferencialmente de 10 °C a 20 °C; o tempo de espera na temperatura máxima da etapa de secagem primária do processo de liofilização no presente invenção é preferencialmente de 5 a 72 h, mais preferencialmente de 8 a 24 h, mais preferencialmente de 10 a 14 h; a pressão no final da etapa de secagem primária do processo de liofilização no presente invenção é preferencialmente de 37 mTorr a 112 mTorr, mais preferencialmente de 50 mTorr a 90 mTorr, mais preferencialmente de 60 mTorr a 80 mTorr.
15. Processo, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que a etapa de secagem secundária está a uma temperatura de 10 °C a 37 °C,
mais preferencialmente de 15 °C a 35 °C, mais preferencialmente de 20 °C a 30 °C; tempo total é preferencialmente de 3 a 24 h, mais preferencialmente de 4 a 16 h, mais preferencialmente de 4 a 7 h; tempo de retenção da etapa de secagem secundária da liofilização é preferencialmente de 3 a 24 h, mais preferencialmente de 4 a 16 h, ais preferencialmente de 4 a 7 h; e a pressão é preferencialmente de 37 mTorr a 50 mTorr.
16. Composição liofilizada caracterizada pelo fato de que é obtida a partir do processo, conforme definido na reivindicação 11.
17. Composição, de acordo com a reivindicação 1 ou 16, caracterizada pelo fato de que o volume de reconstituição por frasco, pós-liofilização é 1 a 5,5 ml, e antes da liofilização está preferencialmente na faixa de 4 a 25%, mais preferencialmente na faixa de 6 a 20%, com mais preferência na faixa de 8 a 16% da composição e a concentração final de pegaspargase está na faixa de 750 ± 20% IU/ml.
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