BR112021011887A2 - Sensor bioquímico biodegradável para determinar a presença e/ou o nível de pesticidas ou desreguladores endócrinos: método e composição - Google Patents

Sensor bioquímico biodegradável para determinar a presença e/ou o nível de pesticidas ou desreguladores endócrinos: método e composição Download PDF

Info

Publication number
BR112021011887A2
BR112021011887A2 BR112021011887-0A BR112021011887A BR112021011887A2 BR 112021011887 A2 BR112021011887 A2 BR 112021011887A2 BR 112021011887 A BR112021011887 A BR 112021011887A BR 112021011887 A2 BR112021011887 A2 BR 112021011887A2
Authority
BR
Brazil
Prior art keywords
biochemical
bligo
glyphosate
target analyte
enzyme
Prior art date
Application number
BR112021011887-0A
Other languages
English (en)
Inventor
Julien Espeut
Franck Molina
Original Assignee
Skillcell
Centre National De La Recherche Scientifique
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Skillcell, Centre National De La Recherche Scientifique filed Critical Skillcell
Publication of BR112021011887A2 publication Critical patent/BR112021011887A2/pt

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/26—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/26—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase
    • C12Q1/28—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase involving peroxidase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
    • C12Q1/42—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving phosphatase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
    • C12Q1/44—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving esterase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
    • C12Q1/44—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving esterase
    • C12Q1/46—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving esterase involving cholinesterase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/48—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving transferase

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)

Abstract

sensor bioquímico biodegradável para determinar a presença e/ou o nível de pesticidas ou desreguladores endócrinos: método e composição. a presente invenção se refere ao método sensor bioquímico biodegradável para realizar em uma amostra a detecção e/ou quantificação multiplex de pesticidas e/ou desreguladores endócrinos e para fornecer uma resposta lógica integrada ao usuário. esse sensor bioquímico é uma vesícula que encapsula redes bioquímicas usando enzimas capazes de gerar, inibir ou ativar um sinal mensurável específico na presença dos ditos analitos-alvo. a rede bioquímica é capaz de fornecer uma resposta final lógica integrada ao usuário. a presente invenção também se refere a uma composição ou kit compreendendo a dita vesícula de sensor bioquímico.

Description

“SENSOR BIOQUÍMICO BIODEGRADÁVEL PARA DETERMINAR A PRESENÇA E/OU O NÍVEL DE PESTICIDAS OU DESREGULADORES ENDÓCRINOS: MÉTODO E COMPOSIÇÃO”
[0001] A presente invenção refere-se a um método para detectar e/ou quantificar pesticidas ou desreguladores endócrinos em uma amostra usando reagentes bioquímicos encapsulados em vesículas incluindo 1 ou mais enzimas capazes de gerar ou inibir sinal mensurável específico na presença do dito analito-alvo. A presente invenção também se refere a uma composição ou kit compreendendo a dita vesícula.
[0002] Os pesticidas são usados para controlar e/ou eliminar pragas e doenças vegetais ou animais. Os agrotóxicos podem ser classificados como herbicidas, inseticidas, fungicidas ou outros tipos de acordo com sua finalidade e envolvem diferentes compostos químicos.
[0003] Os pesticidas podem ser classificados por alvo biológico, estrutura química ou perfil de segurança. Por causa da alta toxicidade dos pesticidas, as agências ambientais estabeleceram valores máximos para seus níveis de contaminação em águas potáveis e superficiais. Dependendo de sua solubilidade aquosa, os pesticidas permanecem no solo ou entram em águas superficiais e subterrâneas.
[0004] Os métodos convencionais de análise de resíduos de pesticidas, especialmente para resíduos de pesticidas em vegetais e frutas, incluem espectrofotometria, espectroscopia de ressonância magnética nuclear, cromatografia de camada fina, espectroscopia de absorção atômica, cromatografia de gás, cromatografia líquida, espectrometria de massa, fluorimetria e assim por diante, entre os quais a cromatografia gasosa e a cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massa são mais comumente usadas devido às vantagens de repetibilidade favorável, sensibilidade e capacidade de determinar o tipo e a concentração de pesticidas. Tais métodos devem ser executados seguindo as etapas de detecção padrão, bem como por técnicos de laboratório equipados com experiência em pré-tratamento de amostras e análise por meio de operação instrumental. Eles oferecem análise de traços poderosa com alta reprodutibilidade, mas essas técnicas envolvem extração de grandes volumes de água, requerem purificação extensiva e exigem pessoal qualificado e equipamentos caros.
[0005] Nos últimos anos, vários métodos para detectar pesticidas inibidores de enzimas por meio de reação bioquímica e técnica eletroquímica foram desenvolvidos, particularmente usando tecnologia de enzima imobilizada (ver Patente US 6.406.876 (Gordon et al.; Patente CN101082599 (Lin et al.)). O método para imobilizar a enzima no eletrodo para determinar a concentração de pesticida em solução aquosa através do grau de inibição da enzima causada por pesticidas também foi divulgado (ver patente TW 1301541 (Wu et al.)). No entanto, os métodos de imobilização da enzima são complicados e as desvantagens da enzima imobilizada incluem alto custo, processo de fabricação complicado e condições de preservação rigorosas (ver patente US20150300976A1 (Wang et al.) para revisão).
[0006] Grande progresso foi feito recentemente na aplicação de nanomateriais ao desenvolvimento de sensores e biossensores. Devido às propriedades proporcionadas pelo pequeno tamanho dos nanomateriais, suas grandes proporções de superfície para volume; suas propriedades físico-químicas, composição e forma; e suas características incomuns de ligação ao alvo, esses sensores podem melhorar significativamente a sensibilidade e a especificidade da detecção do analito. Essas propriedades, juntamente com a robustez estrutural geral dos nanomateriais, tornam esses materiais altamente adequados para uso em vários esquemas de detecção com base em diversos modos de transdução (Nanomateriais para Detecção e Destruição de Pesticidas. Gemma Aragay et al., Chemical Reviews, 2012, 112, 5317-5338).
[0007] O documento de patente US20150355154A1 (Tae Jung Park et al.) pode ser citado, o qual divulga um sistema sensor capaz de detectar resíduos de pesticidas organofosforados induzindo a agregação de nanopartículas de ouro.
[0008] O documento de patente CN102553497A também pode ser citado, o qual divulga um método de preparação de nanoesferas de carimbo de composto multifuncional com fluorescência e magnetismo, e sua aplicação para a detecção no resíduo de pesticida por modificação da intensidade de fluorescência das nanoesferas de carimbo de composto multifuncional antes e após a adsorção seletiva a moléculas de pesticidas de um modelo.
[0009] Finalmente, o documento de pedido de patente internacional WO 2017/178896A2 (Molina et al.) também pode ser citado, o qual divulga dispositivos biossintéticos para seu uso no método de diagnóstico de doenças, implementando enzima encapsulada capaz de reagir com o composto- alvo que se deseja testar em uma amostra.
[0010] Os desreguladores endócrinos também são conhecidos por causar efeitos prejudiciais aos humanos por meio de várias vias de exposição. Esses produtos químicos parecem interferir principalmente nos sistemas endócrino ou hormonal. Tão importante quanto, vários estudos demonstraram que o acúmulo de desreguladores endócrinos pode induzir doenças fatais, incluindo obesidade e câncer. (Yang O. et al., J Cancer Prev. março de 2015; 20(1): 12 a 24).
[0011] Os desreguladores endócrinos podem afetar todos os níveis do sistema endócrino. Primeiro, eles podem interromper a ação de enzimas envolvidas na esteroidogênese. Essas enzimas podem ser inibidas, assim como as enzimas envolvidas no metabolismo dos estrogênios. Por exemplo, alguns metabólitos de bifenil policlorado (PCB) inibem a sulfotransferase, resultando em um aumento do estradiol circulante (Kester MH et al., Endocrinology. 2000; 141: 1897-1900). Outros desreguladores endócrinos são conhecidos por promover a adipogênese. Esses incluem pesticidas bisfenol A (BPA), organofosforados, glutamato monossódico e éteres difenil polibromados (PBDEs).
[0012] A presente invenção fornece um método para detectar e/ou quantificar a presença de um analito-alvo selecionado a partir do grupo de pesticidas e resíduos de desreguladores endócrinos, presentes em uma amostra, em uma solução ou na superfície de um produto sólido, particularmente presente em ambientes ou alimentos, em que o dito pesticida ou desregulador endócrino-alvo que se deseja testar é conhecido por ser um substrato ou um inibidor de uma atividade enzimática específica.
[0013] Em uma modalidade preferencial, a presente invenção se refere a tal método para a sua utilização no campo da alimentação agrícola, ambiente ou diagnóstico de saúde, sendo a alimentação agrícola e o campo ambiental os mais preferenciais.
[0014] Por exemplo, o glifosato é um herbicida que inibe a 5-enolpiruvilchiquimato-3-fosfato (EPSP) sintase, uma enzima chave na via do ácido chiquímico, que está envolvida na síntese dos aminoácidos aromáticos. A inibição de EPSP leva à depleção dos aminoácidos aromáticos triptofano, tirosina e fenilalanina que são necessários para a síntese de proteínas. Culturas resistentes ao glifosato com uma enzima EPSP alternativa foram desenvolvidas que permitem o uso de glifosato nessas culturas sem danos à cultura (http://herbicidesymptoms.ipm.ucanr.edu/MOA/EPSP_synthase_inhibitors/).
[0015] Em um primeiro aspecto, a presente invenção é direcionada a um método para detectar a presença ou para detectar uma quantidade relevante ou a ausência e/ou para quantificar a quantidade de pelo menos um analito-alvo em uma amostra, em que o método compreende as etapas de:
[0016] a) colocar a amostra em contato com uma composição em que:
[0017] - a dita composição compreende elementos bioquímicos formando uma rede bioquímica encapsulada em uma ou em um conjunto de micro ou nanovesículas (doravante denominadas vesículas)
permeáveis ou não ao analito-alvo, em que a dita rede bioquímica compreende como elemento bioquímico pelo menos uma enzima tendo como substrato ou como inibidor ou como ativador do dito analito-alvo que se deseja detectar e/ou quantificar, e em que:
[0018] i) o analito-alvo é selecionado a partir do grupo que consiste em pesticidas e/ou desreguladores endócrinos,
[0019] ii) a rede bioquímica é capaz de:
[0020] - gerar pelo menos um sinal de saída específico legível/mensurável apenas na presença, de preferência dado um limite escolhido, do analito-alvo quando o dito analito-alvo é um substrato da enzima da dita rede bioquímica; ou
[0021] - inibir o sinal de saída específico legível/mensurável gerado pela dita rede bioquímica apenas na presença do analito-alvo quando o dito analito-alvo é um inibidor da enzima da dita rede bioquímica, e,
[0022] b) determinar a taxa e/ou nível do sinal de saída legível/mensurável específico produzido pela rede bioquímica, a taxa e/ou nível obtido sendo correlacionado com a presença ou ausência e/ou a quantidade do analito-alvo na amostra.
[0023] Na presente descrição, o uso da palavra “um” ou “uma” quando usado em conjunto com o termo “compreendendo” nas reivindicações e/ou no relatório descritivo pode significar “um”, mas também é consistente com o significado de “um ou mais”, “pelo menos um” e “um ou mais de um”.
[0024] Além disso, o uso de “compreender”, “conter” e “incluir” ou modificações dessas palavras raiz, por exemplo, mas sem limitação a “compreende”, “contido” e “incluindo”, não se destina a ser limitante. O termo “e/ou” significa que os termos antes e depois podem ser considerados em conjunto ou separadamente. Para fins de ilustração, mas não como uma limitação, “X e/ou Y” podem significar “X” ou “Y” ou “X e Y”.
[0025] Ao longo de todo o relatório descritivo, incluindo as reivindicações, a palavra “compreende” e variações da palavra, tais como “compreendendo” e “compreende”, bem como “ter”, “tendo”, “inclui” e “incluindo” e variações dos mesmos, significa que as etapas, elementos ou materiais nomeados aos quais se refere são essenciais, mas outras etapas, elementos ou materiais podem ser adicionados e ainda formar uma construção dentro do escopo da reivindicação ou divulgação. Quando recitado na descrição da invenção e em uma reivindicação, significa que a invenção e o que é reivindicado são considerados o que se segue e potencialmente mais. Esses termos, particularmente quando aplicados a reivindicações, são inclusivos ou em aberto e não excluem elementos adicionais não solicitados ou etapas do método.
[0026] Pelo termo inibidor de enzima, pretende-se designar um composto que reduz a taxa de uma reação catalisada por enzima interferindo de alguma forma na enzima. Um inibidor de enzima, por exemplo, uma molécula que se liga a uma enzima e diminui sua atividade. A ligação de um inibidor pode impedir que um substrato entre no sítio ativo da enzima e/ou impedir que a enzima catalise sua reação.
[0027] Pelo termo ativador de enzima, pretende-se designar um composto que aumenta a taxa, atividade ou velocidade de uma enzima. Geralmente, são moléculas que se ligam às enzimas. Suas ações são opostas ao efeito das enzimas.
[0028] Pelo termo substrato de enzima, pretende-se designar um composto que reage com uma enzima para gerar um produto. É o material sobre o qual uma enzima atua.
[0029] Por elementos biomoleculares, pretende-se designar moléculas que estão presentes em organismos vivos, incluindo macromoléculas grandes, como proteínas, carboidratos, lipídios e ácidos nucléicos, bem como pequenas moléculas, como metabólitos primários, metabólitos secundários e produtos naturais.
[0030] Por vesícula ou micro ou nanovesícula,
pretende-se designar vesícula com um tamanho (diâmetro) entre 5 nm e 500 µm, preferencialmente entre 10 nm e 200 µm, mais preferencialmente entre 25 nm e 50 µm. Também se pretende designar vesícula unilamelar ou multilamelar tendo membrana lipídica (lipossoma) ou polímero ou copolímero sintético.
[0031] Por elemento bioquímico encapsulado ou internalizado ou incluído ou contido em uma vesícula, pretende-se designar o elemento bioquímico que pode ser encapsulado no compartimento interno da vesícula, mas também encapsulado na membrana (membrana bi ou multilamelar) ou anexado à membrana da vesícula (membrana externa ou interna).
[0032] Em uma modalidade preferencial do método da presente invenção, os ditos elementos biomoleculares são selecionados a partir de elementos biomoleculares semissintéticos, sintéticos ou isolados de sistemas biológicos de ocorrência natural.
[0033] Em uma modalidade mais preferencial, o dito pelo menos um elemento(s) biomolecular(es) é selecionado a partir do grupo que consiste em proteínas, ácidos nucleicos, de preferência ácidos nucleicos não codificantes e metabólitos. Enzimas e metabólitos são elementos biomoleculares particularmente mais preferenciais.
[0034] Estas proteínas, particularmente as enzimas, quando encapsuladas nesses sistemas de partículas apresentam uma estabilidade muito boa e cinética melhorada, mesmo à temperatura ambiente e a sua atividade pode então ser preservada durante muito tempo à temperatura ambiente.
[0035] Pelo termo analito-alvo, também se pretende designar uma classe ou um grupo de pesticidas ou desreguladores endócrinos que se deseja detectar ou quantificar na amostra, quando todos os membros da dita classe ou grupo estão agindo como um substrato, como um inibidor ou como um ativador da dita enzima que é encapsulada na vesícula ou conjunto de vesículas.
[0036] O termo “analito-alvo” geralmente se refere aqui a qualquer molécula de pesticida ou desregulador endócrino que é detectável com o método e o kit como aqui descrito. Exemplos não limitativos de alvos de pesticida ou desregulador endócrino que são detectáveis com o método e o kit, conforme descrito neste documento, incluem, mas sem limitação a compostos químicos ou bioquímicos.
[0037] A título de exemplo não limitativo, os pesticidas são selecionados do grupo que consiste em inseticidas, herbicidas, fungicidas. São preferenciais os pesticidas que podem atuar como substrato ou como inibidor da atividade enzimática.
[0038] A título de exemplo não limitativo, desreguladores endócrinos (EDs) são selecionados a partir do grupo que consiste em:
[0039] A) Ligação de EDs a receptores de estrogênio, efeito agonista ou antagonista
[0040] i) Agonistas (efeito estrogênico)
[0041] Bisfenol A; Ftalatos
[0042] Polifenóis incluindo isoflavonas e genisteína
[0043] Algumas telas UV (benzofenona 2; cinamato; derivados de cânfora)
[0044] ii) Antagonistas (efeito antiandrogênico)
[0045] Pesticidas, fungicidas, herbicidas (linurona, procimidona, vinclocolina) dioxina
[0046] B) EDs tendo efeitos sobre enzimas
[0047] Fungicidas (azóis): Inibidores de síntese: etapa de síntese afetada pela inibição (esterol desmetilase e cromatase)
[0048] Isoflavonas: inibição da peroxidase tireoidiana
[0049] Polifenóis (isoflavonas, genisteína): A sulfatase aumentou a diminuição da sulfotransferase (de W. Wuttke et al., Hormones 2010, 9 (1): 9 a 15).
[0050] Em uma modalidade preferencial, a presente invenção é direcionada a um método para detectar a presença ou ausência e/ou para quantificar a quantidade de pelo menos um analito-alvo em uma amostra, em que o método compreende as etapas de:
[0051] a partir de uma amostra contendo ou suscetível a conter o analito-alvo;
[0052] a) colocar a amostra em contato com uma composição que compreende elementos bioquímicos formando uma rede bioquímica, em que a dita rede bioquímica compreende como elemento bioquímico pelo menos uma enzima tendo como substrato ou como inibidor ou como ativador o dito analito-alvo que se deseja detectar e/ou quantificar, e em que:
[0053] - pelo menos um dos ditos elementos bioquímicos que formam uma rede bioquímica é encapsulado em uma micro ou nanovesícula (denominada vesícula) permeável ou não ao analito-alvo; ou
[0054] - pelo menos dois dos ditos elementos bioquímicos que formam uma rede bioquímica são encapsulados em duas vesículas distintas permeáveis ou não ao analito-alvo,
[0055] em que:
[0056] i) o dito pelo menos um analito-alvo que se deseja detectar ou quantificar na amostra é selecionado do grupo de pesticidas ou desreguladores endócrinos, mais preferencialmente selecionado do grupo de pesticidas. São preferenciais os pesticidas que podem atuar como substrato ou como inibidor da atividade enzimática. O grupo que consiste em inseticidas, herbicidas, fungicidas é o mais preferencial.
[0057] ii) a rede bioquímica é capaz de:
[0058] - gerar pelo menos um sinal de saída específico legível/mensurável apenas na presença do analito-alvo quando o dito analito-alvo é um substrato da enzima da dita rede bioquímica; ou
[0059] - inibir o sinal de saída específico legível/mensurável gerado pela dita rede bioquímica apenas na presença do analito-alvo quando o dito analito-alvo é um inibidor da enzima da dita rede bioquímica, e,
[0060] b) determinar a taxa e/ou nível do sinal de saída legível/mensurável específico produzido pela rede bioquímica, a taxa e/ou nível obtido sendo correlacionado com a presença ou ausência e/ou a quantidade do analito-alvo na amostra.
[0061] Em uma modalidade preferencial, quando se deseja encapsular a enzima em uma vesícula ou para facilitar a entrada da enzima na vesícula, tensoativo, hemolisinas ou porinas podem ser usados:
[0062] - Os tensoativos podem ser usados para facilitar a transferência do glifosato através da membrana da vesícula, uma vez que o glifosato não passa facilmente pelas membranas lipídicas. Pode ser usada polioxietileno amina como a amida de sebo hidrogenada POE, POE (3) N-sebo trimetilenodiamina, POE (15) amina de sebo, POE (5) amina de sebo, POE (2) amina de sebo.
[0063] - As hemolisinas ou proteínas porinas também podem ser inseridas na membrana para facilitar a transferência de enzimas, substratos ou moléculas a serem detectadas (como o glifosato) através da membrana da vesícula (Deshpande et al. 2015, NATURE COMMUNICATIONS | DOI: 10.1038/ncomms10447; Vamvakaki et al. 2007, Biosens Bioelectron. 15 de junho de 2007; 22(12): 2848-53. Epub, 16 de janeiro de 2007; Karamdad et al. 2015, Lab Chip, 2015, 15, 557).
[0064] Em uma modalidade preferencial, o analito- alvo, pesticida e/ou desregulador endócrino, é um substrato de pelo menos uma enzima encapsulada na dita vesícula ou é um substrato de pelo menos uma enzima que está contida na composição, mas não encapsulada na dita vesícula.
[0065] Em uma modalidade também preferencial, o analito-alvo, pesticida e/ou desregulador endócrino é um inibidor da atividade de pelo menos uma das ditas enzimas encapsuladas ou não na dita vesícula.
[0066] Em uma modalidade preferencial, a amostra suscetível a conter o analito-alvo é selecionada a partir do grupo que consiste em amostra de fluido ou material sólido, de preferência amostra de material ambiental, material vegetal, água (como água potável, bebida, água residual, pluvial ou água do mar), produtos alimentícios, extratos de solo, material industrial, produção de alimentos, extrato vegetal, fluido fisiológico (urina, sangue, suor, seiva vegetal, etc,...) ou tecido de organismo vivo (mamífero, planta, aves, etc, ...).
[0067] Exemplos não limitativos de tecido de organismos vivos incluem tecido mole, tecido duro, pele, tecido de superfície, tecido externo, tecido interno, uma membrana, tecido fetal e tecido endotelial.
[0068] Quando a amostra é de uma fonte alimentar, exemplos não limitativos de fontes alimentares podem ser grãos/sementes vegetais (de preferência vegetais comestíveis), bebidas, leite e produtos lácteos, peixes, crustáceos, ovos, alimentos preparados comercialmente e/ou perecíveis para consumo animal ou humano.
[0069] Como mencionado acima, a amostra pode estar em um ambiente externo, como solo, cursos de água, lama, efluente comercial e semelhantes.
[0070] Por amostra, pretende-se designar particularmente uma amostra de um material suspeito de conter o(s) analito(s) de interesse, cujo material pode ser um fluido ou ter fluidez suficiente para fluir ou estar em contato com a vesícula da composição implementada no método da presente invenção. A amostra de fluido pode ser usada conforme obtida diretamente da fonte ou após um pré-tratamento, de modo a modificar seu caráter. Essas amostras podem incluir amostras humanas, animais, vegetais ou feitas pelo homem, conforme listado acima, mas sem limitação a esses. A amostra pode ser preparada em qualquer meio conveniente que não interfira no ensaio. Normalmente, a amostra é uma solução aquosa ou fluido biológico, ou a superfície de um material sólido.
[0071] Assim, a dita amostra também pode designar a superfície de um material sólido suspeito de conter o(s) analito(s) de interesse, cujo material sólido pode ser poroso ou não poroso e pode ser selecionado de material feito pelo homem, produtos alimentícios, plantas, sementes, frutas e semelhantes. Nesse caso, a composição implementada no método da presente invenção e compreendendo uma vesícula pode ser aplicada diretamente na superfície desse material sólido, por exemplo, com a composição da presente invenção na forma de gel poroso, como esferas poliméricas porosas (por exemplo, agarose, alginato, álcool polivinílico, dextrano, pérolas de derivados de polímero de acrilamida) em que as vesículas da composição são retidas.
[0072] Em uma modalidade preferencial, o método da presente invenção é caracterizado pelo fato de que a presença ou quantidade e/ou quantidade relevante do analito-alvo é detectada por um sinal associado a um agente selecionado a partir do grupo que consiste em um agente colorimétrico, uma transferência de elétrons agente, uma enzima, um agente fluorescente, agente que fornece o dito sinal detectável ou quantificável correlacionado com a presença e/ou a quantidade do analito-alvo.
[0073] A presente invenção também se refere a um método para detectar a presença ou ausência e/ou quantificar a quantidade de pelo menos dois analitos-alvo diferentes em uma amostra em que os ditos analitos diferentes são substratos ou inibidores ou ativadores do mesmo, pelo menos uma enzima da rede bioquímica encapsulada ou não encapsulada na vesícula.
[0074] De fato, a presença de dois analitos distintos atuando na mesma enzima vesícula encapsulada ou não encapsulada ou na mesma rede bioquímica de enzima (como substrato ou como inibidor) pode amplificar o sinal emitido.
[0075] Por exemplo, (ver Exemplo 6, Figuras 6, 7 e 12), a detecção de um primeiro analito-alvo (ou seja, glifosato) e um segundo alvo (ou seja, glicina) podem ser detectados ou quantificados separativamente pela mesma rede bioquímica usada no método da presente invenção. Além disso, usando a mesma rede bioquímica de acordo com a presente invenção, os dois analitos-alvo podem ser detectados e/ou quantificados ao mesmo tempo (ver Figura 12).
[0076] Uma das vantagens do método da presente invenção é reduzir ou remover o ruído de fundo normalmente presente e que causa dificuldades quando diferentes elementos bioquímicos ou rede bioquímica são usados em um método de detecção ou quantificação de um composto.
[0077] A utilização, no mesmo dispositivo ou composição, de elementos bioquímicos em solução, encapsulados em vesículas ou presos em uma matriz de gel ou em uma superfície sólida permitem importante redução desses ruídos de fundo.
[0078] Quando necessário, por exemplo, quando o sinal específico não pode ser diretamente legível por leitura visual, o sinal pode ser detectado ou quantificado por medição colorimétrica, fluorescência, espectroscopia (ou seja, infravermelho, Raman), composto químico ou produção de partículas (elétrons).
[0079] Em uma modalidade preferencial do método da presente invenção, o dito sinal de saída que é capaz de gerar pela dita rede bioquímica é selecionado a partir de um sinal biológico, químico, eletrônico ou fotônico, de preferência um sinal de saída físico-químico legível e, opcionalmente, mensurável.
[0080] Entre os sinais que podem ser utilizados como sinal de saída, podemos citar em particular e, por exemplo, o sinal colorimétrico, fluorescente, luminescente ou eletroquímico. Esses exemplos não se destinam a limitar o sinal de saída que pode ser usado na presente invenção. A sua escolha depende principalmente das especificações do ensaio, em termos de sensibilidades ou recursos técnicos. É importante ressaltar que as saídas colorimétricas são legíveis por humanos, uma propriedade de interesse para integração em dispositivos de ponto de atendimento fáceis de usar e de baixo custo, enquanto, por exemplo, os sinais luminescentes oferecem sensibilidades ultra-altas e ampla faixa dinâmica de detecções. No entanto, em vez de medir os sinais de ponto final tradicionais, outras estruturas de biossensor existem e podem ser alcançadas graças às propriedades inerentes aos sistemas biológicos. Assim, é possível definir diferentes modos de leitura, como linear, frequência ou limite, ou modos de detecção de vários valores.
[0081] Em outro aspecto, o método da presente invenção pode ser usado para detectar e/ou quantificar a presença de dois analitos-alvo diferentes em uma mesma amostra, e em que a composição implementada no método compreende dois conjuntos diferentes de elementos bioquímicos formando duas redes bioquímicas distintas encapsuladas na mesma ou em pelo menos duas vesículas distintas ou conjunto de vesículas permeáveis ou não a ambos os analitos-alvo, em que cada um dos ditos elementos bioquímicos compreende pelo menos uma enzima diferente tendo como substrato ou como inibidor ou como ativador apenas um dos analitos-alvo que se deseja detectar e/ou quantificar. Nesse caso, a composição implementada no método da presente invenção contém pelo menos dois conjuntos diferentes de elementos bioquímicos, cada um deles formando uma rede bioquímica diferente, gerando um sinal de saída legível/mensurável diferente, sendo os ditos dois conjuntos diferentes de elementos bioquímicos encapsulados na mesma vesícula ou em um conjunto diferente de vesículas, ou pelo menos um dos elementos bioquímicos que formam a rede bioquímica e para cada uma das duas redes bioquímicas distintas é encapsulado na mesma vesícula ou em um conjunto diferente de vesículas.
[0082] Assim, a presente invenção também se refere a um método para detectar a presença ou ausência e/ou quantificar a quantidade de pelo menos dois analitos-alvo diferentes em uma amostra, em que:
[0083] - os ditos analitos diferentes são substratos ou inibidores de duas enzimas de rede bioquímica distintas e em que:
[0084] - pelo menos e para cada uma das ditas duas redes bioquímicas distintas, um dos elementos bioquímicos que formam a dita rede bioquímica é encapsulado em uma vesícula permeável ou não ao analito- alvo; ou
[0085] - pelo menos dois dos ditos elementos bioquímicos que formam uma rede bioquímica são encapsulados em duas vesículas distintas permeáveis ou não ao analito-alvo; e
[0086] - as ditas redes bioquímicas diferentes (interconectadas ou não) geram um sinal de saída legível/mensurável diferente.
[0087] Por “redes bioquímicas interconectadas” pretende-se designar aqui que as duas redes bioquímicas diferentes podem ter elementos bioquímicos comuns ou uma mesma etapa ou parte comum da rede.
[0088] Em uma modalidade preferencial, o método da presente invenção é caracterizado por o pesticida ou desregulador endócrino que se deseja detectar e/ou quantificar ser um elemento bioquímico da rede bioquímica que pode produzir em uma ou mais etapas, um sinal de saída legível/mensurável específico, sendo que o dito elemento bioquímico é preferencialmente selecionado do grupo que consiste em macromolécula, peptídeo, proteína, metabólito, enzima, ácido nucleico, íon metálico.
[0089] Mais preferencialmente, o pesticida ou desregulador endócrino que se deseja detectar e/ou quantificar é selecionado do grupo que consiste em:
[0090] a) pesticida ou uma molécula desreguladora endócrina que é um substrato específico de uma atividade enzimática, atividade que pode produzir em uma ou mais etapas, um sinal de saída específico legível/mensurável; ou
[0091] b) pesticida ou uma molécula desreguladora endócrina que é um inibidor específico de uma atividade enzimática, atividade que pode produzir em uma ou mais etapas, um sinal de saída específico legível/mensurável; ou
[0092] c) pesticida ou uma molécula desreguladora endócrina que é um ativador específico de uma atividade enzimática, atividade que pode produzir em uma ou mais etapas, um sinal de saída específico legível/mensurável.
[0093] Em uma modalidade mais preferencial, o pesticida ou molécula desreguladora endócrina que é um substrato específico de uma atividade enzimática, atividade que pode produzir em uma ou mais etapas, um sinal de saída legível/mensurável específico associado ao presente e/ou à quantidade desse o analito-alvo na amostra, é selecionado a partir do grupo que consiste em glifosato (que é um substrato para a enzima glicina/glifosato oxidase) e clordecona (substrato de clordecona redutase).
[0094] Em uma modalidade também mais preferencial, o pesticida ou uma molécula desreguladora endócrina que é um inibidor específico de uma atividade enzimática, atividade que pode produzir em uma ou mais etapas, um sinal de saída legível/mensurável específico associado ao presente e/ou à quantidade desse analito-alvo na amostra, é selecionado a partir do grupo que consiste em: glifosato (inibidor de EPSPS), clordecona (agente de interferência dos receptores de estrogênio), carbamatos (inibidor da acetil colinesterase), fungicidas inibidores de succinato desidrogenase (fungicidas SDHI). São preferenciais os fungicidas SDHI selecionados do grupo de Oxatiin-carboxamida, Fenil-Benzamidas, Tiazol-carboxiamida, Furan-carboxamida, Piridina-carboxamida, Pirazol-carboxamida e Piridinil-etil-benzamida. Neonicotinoides (inibidores da atividade dos receptores de acetilcolina) são preferencialmente selecionados do grupo de cloropiridinila, trifluoropiridinila, clorotiazolila, tetra-hidrofuranila, fenilpirazol.
[0095] Outros fungicidas como Fungicidas AnilinoPirimidinas (AP), Fungicidas Amidas de Ácido Carboxílico (CAA) e Inibidores de Biossíntese de Esterol (SBI) podem ser citados, os quais também são inibidores específicos de uma atividade enzimática (consulte o site http://www.frac.info/working-group/ para obter informações completas sobre esses compostos).
[0096] O pesticida ou uma molécula desreguladora endócrina selecionada do grupo que consiste em Neonicotinoide, Organocloretos, dioxina (PCDD), bifenila policlorada (PCB), 17-beta estradiol, 17-alfa etileno estradiol, bisfenol (PBDE), ftalatos, metal pesado (Cr, Mn, Pb, Li, Hg, etc.) também são preferenciais.
[0097] Em uma modalidade também mais preferencial, os elementos que formam a rede bioquímica compreendem, pelo menos encapsulado em uma vesícula, pelo menos uma enzima selecionada do grupo que consiste em Glicina/Glifosato oxidase (EC 1.4.3.19), acetilcolinesterase (EC3.1.1.7), 5-enolpiruvilchiquimato-3-fosfato (EPSP) sintase (EC 2.5.1.19) e succinato desidrogenase (EC 1.3.5.1).
[0098] Em outra modalidade mais preferencial, o pelo menos pesticida ou um analito-alvo desregulador endócrino que se deseja detectar e/ou quantificar na amostra é o glifosato.
[0099] Em uma modalidade mais preferencial, a presente invenção é direcionada a um método de acordo com a presente invenção, para a detecção da presença ou ausência e/ou para quantificar a quantidade de pelo menos o glifosato como analito-alvo em uma amostra, em que o dito método compreende as etapas de:
[0100] a partir de uma amostra contendo ou suscetível a conter glifosato;
[0101] a) colocar a amostra em contato com uma composição que compreende elementos bioquímicos formando uma rede bioquímica, em que a dita rede bioquímica compreende como elemento bioquímico pelo menos uma enzima tendo como substrato ou como inibidor ou como ativador o dito analito-alvo que se deseja detectar e/ou quantificar, e em que:
[0102] - pelo menos um dos ditos elementos bioquímicos que formam uma rede bioquímica é encapsulado em uma vesícula permeável ou não ao analito-alvo; ou
[0103] - pelo menos dois dos ditos elementos bioquímicos que formam uma rede bioquímica são encapsulados em duas vesículas distintas permeáveis ou não ao analito-alvo,
[0104] em que:
[0105] i) a rede bioquímica é capaz de:
[0106] - gerar pelo menos um sinal de saída específico legível/mensurável apenas na presença do analito-alvo quando o dito analito-alvo é um substrato da enzima da dita rede bioquímica; ou
[0107] - inibir o sinal de saída específico legível/mensurável gerado pela dita rede bioquímica apenas na presença do analito-alvo quando o dito analito-alvo é um inibidor da enzima da dita rede bioquímica, e,
[0108] b) determinar a taxa e/ou nível do sinal de saída legível/mensurável específico produzido pela rede bioquímica, a taxa e/ou nível obtido sendo correlacionado com a presença ou ausência e/ou a quantidade de glifosato na amostra.
[0109] Em uma modalidade preferencial, os elementos bioquímicos que formam a rede bioquímica compreendem, pelo menos encapsulada ou não em uma vesícula, a enzima glicina/glifosato oxidase (EC 1.4.3.19).
[0110] Em uma modalidade preferencial, a dita enzima glicina/glifosato oxidase é a glicina/glifosato oxidase nativa (ou de tipo selvagem/WT) que pode ser obtida como proteína recombinante.
[0111] Em uma modalidade mais preferencial, a dita enzima glicina/glifosato oxidase compreende uma etiqueta que é fundida à enzima glicina/glifosato oxidase, particularmente a fim de aumentar a expressão recombinante e sua solubilidade em comparação com as sequências nativas (Jeffrey G. Marblestone et al. (Protein Sci. janeiro de 2006; 15(1): 182 a 189)).
[0112] Entre as etiquetas que podem ser usadas, mas sem limitação à proteína de ligação à maltose (MBP), proteína de ligação à quitina (CBP), glutationa S-transferase (GST), tioredoxina (TRX), NUS A, ubiquitina (Ub) e etiquetas SUMO (pequeno modificador relacionado à ubiquitina) podem ser citadas.
[0113] As etiquetas que compreendem SUMO e GST são etiquetas particularmente preferenciais.
[0114] Em uma modalidade também mais preferencial, a dita enzima glicina/glifosato oxidase é a glicina oxidase (GO) da bactéria marinha Bacillus licheniformis ((BliGO) que foi clonada e que mostra 62% de similaridade com a GO padrão de Bacillus subtilis (ver Characterization and directed evolution of BliGO, a novel glycine oxidase from Bacillus licheniformis. Zhang K et al. (Enzyme Microb Technol. Abril de 2016; 85: 12-8). A sequência homóloga com pelo menos 60%, 70%, de preferência 75%, 80%, 85%, 90% ou 95% de identidade (usando, por exemplo, o software BLAST-P ou BLAST-N padrão para alinhamento) com a sequência de proteína BliGO WT e preferencialmente exibindo pelo menos atividade GO, preferencialmente pelo menos 50% da atividade BliGO WT GO nas mesmas condições do teste de atividade, também é preferencial.
[0115] São preferenciais a GST-BliGO (nativa/WT) com a sequência de DNA SEQ ID NO: 5 ou a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 6 (ver Figuras 16) e a SUMO-BliGO (nativa/WT) com a sequência de DNA SEQ ID NO: 9 ou a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 10 (ver Figuras 18), ou suas sequências de BliGO etiquetadas homólogas, conforme definido acima, em que a sequência de BliGO exibe pelo menos 70%, de preferência 75%, 80%, 85%, 90% ou 95% de identidade com a WT BliGO.
[0116] Em uma modalidade mais preferencial, a dita enzima glicina/glifosato oxidase é a glicina oxidase mutada (GO) da bactéria marinha Bacillus licheniformis ((BliGO)-SCF4 geneticamente modificada e contendo 6 mutações únicas de aminoácidos em comparação com a versão de tipo selvagem BliGO-WT clonada e mostra 62% de similaridade com a GO padrão de Bacillus subtilis (ver Characterization and directed evolution of BliGO,
a novel glycine oxidase from Bacillus licheniformis. Zhang K et al. (Enzyme Microb Technol. Abril de 2016; 85: 12-8).
[0117] Também são preferenciais a GST-BliGO_Mut tendo a sequência de DNA SEQ ID NO: 7 ou a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 8 (ver Figuras 17) e a SUMO-BliGO_Mut tendo a sequência de DNA SEQ ID NO: 11 ou a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 12 (ver Figuras 19).
[0118] Em uma modalidade preferencial, os elementos bioquímicos que formam a rede bioquímica compreendem ainda, além de glicina/glifosato oxidase (EC 1.4.3.19), pelo menos encapsulada na mesma partícula ou em outra vesícula, uma peroxidase, de preferência a enzima peroxidase de rábano (HRP) (EC.1.11.17) e um substrato de uma peroxidase que pode ser oxidado, de preferência O-dianisidina, pirogalol ou vermelho de amplex, ácido 2,2’-azino-bis (3-etilbenzotiazolina-6-sulfônico) (ABTS), o-fenilenodiamina (OPD), 3,3’-Diaminobenzidina (DAB), 3-Amino-9-etilcarbazol (AEC), 3,3’,5,5’-Tetrametilbenzidina (TMB), ácido homovanílico, tiramina ou luminol.
[0119] Em outra modalidade mais preferencial, o pesticida ou um analito-alvo desregulador endócrino que se deseja detectar e/ou quantificar na amostra é o glifosato, e em que os elementos bioquímicos que formam a rede bioquímica compreendem, pelo menos encapsulada em uma vesícula, a enzima 5-Enolpiruvilchiquimato-3-fosfato (EPSP) sintase (EPSPS) (EC 2.5.1.19), 3-fosfo-chiquimato e fosfoenolpiruvato (PEP).
[0120] Em uma modalidade preferencial, os elementos bioquímicos que formam a rede bioquímica compreendem, além da enzima 5-enolpiruvilchiquimato-3-fosfato (EPSP) sintetase (EPSPS) (EC 2.5.1.19), 3-fosfo-chiquimato e fosfoenolpiruvato (PEP), pelo menos encapsulada na mesma partícula ou em outra uma ou mais partículas, a enzima corismato sintase (EC.4.2.3.5), a enzima corismato liase (EC.4.1.3.40), enzima lactato desidrogenase (EC 1.1.1.27) e seu substrato NADH.
[0121] Em outra modalidade mais preferencial, o pesticida ou um analito-alvo desregulador endócrino que se deseja detectar e/ou quantificar na amostra é o glifosato, e em que os elementos bioquímicos que formam a rede bioquímica compreendem, pelo menos encapsulada em uma vesícula, a enzima 5-Enolpiruvilchiquimato-3-fosfato (EPSP) sintase (EPSPS) (EC 2.5.1.19), 3-fosfo-chiquimato e fosfoenolpiruvato (PEP), e na mesma partícula ou em outra uma ou mais partículas, a enzima purina-nucleosídeo fosforilase (EC.2.4.2.1.) e seu substrato de inosina, a enzima xantina oxidase (EC. 1.17.3.2), uma peroxidase, de preferência a enzima peroxidase de rábano (HRP) (EC.1.11.17), e um substrato de uma peroxidase que pode ser oxidado, de preferência O-dianisidina, pirogalol ou vermelho de amplex, ácido 2,2’-azino-bis (3-etilbenzotiazolina-6-sulfônico) (ABTS), o-fenilenodiamina (OPD), 3,3’-diaminobenzidina (DAB), 3-amino-9-etilcarbazol (AEC), 3,3’,5,5’-tetrametilbenzidina (TMB), ácido homovanílico, tiramina ou luminol.
[0122] Em uma modalidade preferencial, as vesículas são selecionadas a partir do grupo que consiste em vesículas unilamelares ou multilamelares, sendo preferenciais as vesículas lipídicas, lipossomas ou fosfolipídios automontados, ou vesículas formadas de polímeros sintéticos ou copolímeros, em que as ditas vesículas têm preferencialmente um diâmetro médio entre 0,01 µm a 500 µm, preferencialmente entre 0,01 µm a 100 µm, mais preferencialmente entre 0,05 µm a 50 µm ou entre 0,05 µm a 10 µm.
[0123] Por exemplo, mas sem limitação, os elementos bioquímicos da composição implementados no método da presente invenção podem ser compartimentados/confinados ou encapsulados em um compartimento, por exemplo, em um sistema vesicular ou em qualquer outro tipo de compartimento, tendo uma natureza vesicular ou não, mas não limitada a um gel poroso, uma esfera polimérica porosa, fosfolipídios montados, como lipossomas, copolímeros sintéticos.
[0124] Na presente descrição, também é utilizada a expressão “confinado” ou “compartimentado” para “encapsulado”, que têm o mesmo significado.
[0125] Em uma modalidade preferencial, as vesículas da composição implementada no método da presente invenção são aprisionadas em um gel polimérico poroso, de preferência selecionado do grupo de gel polimérico poroso que consiste em alginato, quitosano, PVP (polivinilpirrolidona), PVA (álcool polivinílico), agarose, sefadex, sefarose, sefacril e suas misturas.
[0126] Por exemplo, o método para detectar a presença ou ausência e/ou quantificar a quantidade de pelo menos um analito- alvo em uma amostra, de acordo com a presente invenção, compreende as etapas de:
[0127] a) colocar em contato a composição implementada no método da presente invenção com uma amostra suscetível a conter o dito composto analito-alvo, para gerar uma mistura,
[0128] b) incubar a dita mistura em condições adaptadas para o desempenho de pelo menos uma reação bioquímica, para gerar pelo menos o dito sinal de saída, de preferência sinal de saída físico- químico legível/mensurável, em que o dito sinal de saída é indicativo da presença ou de uma quantidade relevante de e/ou do nível do composto que se deseja analisar na dita amostra.
[0129] c) detectar ou medir o sinal de saída gerado na etapa b), e
[0130] d) determinar, a partir do sinal gerado/medido na etapa c), a presença e/ou o nível do dito composto.
[0131] Também deve ser entendido que, em certas modalidades do método da presente invenção, o método pode detectar analito (s)-alvo ao longo do tempo de duração desejado. A duração pode ser um primeiro intervalo de tempo pré-determinado e pelo menos um segundo intervalo de tempo pré-determinado que são calculados. Em certas modalidades, um valor de correlação do analito é calculado durante o intervalo de tempo de teste.
[0132] Em um segundo aspecto, a presente invenção é direcionada a uma composição para detectar a presença ou ausência e/ou quantificar a quantidade de pelo menos um analito-alvo em uma amostra, em que a dita composição compreende elementos bioquímicos que formam uma rede bioquímica encapsulada em uma ou em um conjunto de vesículas permeáveis ou não permeáveis ao analito-alvo, em que a dita rede bioquímica compreende como elemento bioquímico pelo menos uma enzima tendo como substrato ou como inibidor o dito analito-alvo que se deseja detectar e/ou quantificar, e em que:
[0133] i) o analito-alvo é selecionado do grupo que consiste em pesticidas e/ou desreguladores endócrinos,
[0134] ii) a rede bioquímica é capaz de:
[0135] a) gerar pelo menos um sinal de saída específico legível/mensurável apenas na presença do analito-alvo quando o dito analito-alvo é um substrato da enzima da dita rede bioquímica; ou
[0136] b) inibir o sinal de saída específico legível/mensurável gerado pela dita rede bioquímica apenas na presença do analito-alvo quando o dito analito-alvo é um inibidor da enzima da dita rede bioquímica.
[0137] Em uma modalidade preferencial, a vesícula é permeável ao analito-alvo.
[0138] Em uma modalidade preferencial, a composição de acordo com a presente invenção compreende uma vesícula ou um conjunto de vesículas com as características definidas acima na composição implementada para o método da presente invenção.
[0139] Em uma modalidade mais preferencial, a dita composição da presente invenção compreende elementos bioquímicos que formam uma rede bioquímica encapsulada em uma ou em um conjunto de vesículas permeáveis ou não permeáveis ao analito-alvo, em que a dita rede bioquímica compreende:
[0140] A) como elementos bioquímicos, um dos elementos bioquímicos selecionados do grupo de:
[0141] - glicina/glifosato oxidase (EC 1.4.3.19), acetilcolinesterase (EC3.1.1.7), 5-enolpiruvilchiquimato-3-fosfato (EPSP) sintase (EC 2.5.1.19) e succinato desidrogenase (EC 1.3.5.1), e, opcionalmente,
[0142] - i) além de glicina/glifosato oxidase (EC 1.4.3.19), pelo menos uma peroxidase, de preferência a enzima peroxidase de rábano (HRP) (EC.1.11.17) e, opcionalmente, um substrato de uma peroxidase que pode ser oxidado, de preferência O-dianisidina, pirogalol ou vermelho de amplex, ácido 2,2’-azino-bis (3-etilbenzotiazolina-6-sulfônico) (ABTS), o-fenilenodiamina (OPD), 3,3’-diaminobenzidina (DAB), 3-amino-9-etilcarbazol (AEC), 3,3’,5,5’-tetrametilbenzidina (TMB), ácido homovanílico, tiramina ou luminol e, opcionalmente,
[0143] - ii) além da enzima 5-enolpiruvilchiquimato-3-fosfato (EPSP) sintase (EPSPS) (EC 2.5.1.19), pelo menos 3-fosfo-chiquimato e fosfoenolpiruvato (PEP) e, opcionalmente, além de:
[0144] ii) a) enzima corismato sintase (EC.4.2.3.5), enzima corismato liase (EC.4.1.3.40), enzima lactato desidrogenase (EC 1.1.1.27) e seu substrato NADH, ou
[0145] ii) b) a enzima purina-nucleosídeo fosforilase (EC.2.4.2.1.) e seu substrato de inosina, a enzima xantina oxidase (EC. 1.17.3.2), uma peroxidase, de preferência a enzima peroxidase de rábano (HRP) (EC.1.11.17), e um substrato de uma peroxidase que pode ser oxidado, de preferência O-dianisidina, pirogalol ou vermelho de amplex, ácido 2,2’-azino-bis (3-etilbenzotiazolina-6-sulfônico) (ABTS), o-fenilenodiamina (OPD), 3,3’-diaminobenzidina (DAB), 3-amino-9-etilcarbazol (AEC), 3,3’,5,5’-tetrametilbenzidina (TMB), ácido homovanílico, tiramina ou luminol;
[0146] e
[0147] B) como vesículas, as vesículas selecionadas do grupo que consiste em:
[0148] - vesículas unilamelares ou multilamelares, sendo preferenciais vesículas lipídicas, lipossomas ou fosfolipídios automontados, ou vesículas formadas de polímeros ou copolímeros sintéticos, em que as ditas vesículas têm preferencialmente um diâmetro médio entre 0,01 μm e 500 μm, de preferência entre 0,01 μm e 100 μm, mais preferencialmente entre 0,05 μm e 50 μm ou entre 0,05 μm e 10 μm; e/ou
[0149] - vesícula de natureza vesicular ou não, tal como, mas sem limitação a um gel poroso, uma esfera polimérica porosa, fosfolípidos montados, tais como lipossomas, copolímeros sintéticos.
[0150] Em uma modalidade mais preferencial, as vesículas da composição da presente invenção são aprisionadas em um gel polimérico poroso, de preferência selecionado do grupo de gel polimérico poroso que consiste em alginato, quitosana, PVP (polivinilpirrolidona), PVA (álcool polivinílico), agarose, sefadex, sefarose, sefacril e suas misturas.
[0151] Em uma modalidade mais preferencial, a composição da presente invenção é direcionada a uma composição compreendendo elementos bioquímicos que formam uma rede bioquímica encapsulada ou não em uma ou em um conjunto de vesículas permeáveis ou não ao analito-alvo, em que a dita rede bioquímica compreende como elemento bioquímico pelo menos uma enzima selecionada do grupo de:
[0152] - glicina/glifosato oxidase (EC 1.4.3.19), de preferência a glicina/glifosato oxidase nativa (tipo selvagem/WT) que pode ser obtida como proteína recombinante, ou sequência homóloga da mesma com pelo menos 70% de identidade com a sequência de proteína WT e exibindo atividade de glicina/glifosato oxidase;
[0153] - 5-enolpiruvilchiquimato-3-fosfato (EPSP) sintase (EC 2.5.1.19);
[0154] - a glicina oxidase (GO) da bactéria marinha Bacillus licheniformis ((BliGO) que foi clonada e que mostra pelo menos 62% de similaridade com a GO padrão de Bacillus subtilis, ou sequência de BliGO homóloga da mesma com pelo menos 70% de identidade com a sequência de proteínas BliGO WT e exibindo atividade de GO;
[0155] - a glicina oxidase (GO) mutada da bactéria marinha Bacillus licheniformis ((BliGO)_SCF4 (também chamada de BliGO-Mut) geneticamente modificada e contendo 6 mutações únicas de aminoácidos em comparação com a versão de tipo selvagem BliGO-WT;
[0156] - uma enzima glifosato oxidase etiquetada, de preferência com uma etiqueta selecionada a partir do grupo que consiste em proteína de ligação à maltose (MBP), proteína de ligação à quitina (CBP), glutationa S-transferase (GST), tioredoxina (TRX), NUS A, ubiquitina (Ub), e etiquetas SUMO (pequeno modificador relacionado à ubiquitina), de preferência etiquetas SUMO e GST; e
[0157] - a GST-BliGO (nativa/WT) com a sequência de DNA SEQ ID NO: 5 ou a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 6;
[0158] - a SUMO-BliGO (nativa/WT) com a sequência de DNA SEQ ID NO: 9 ou a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 10;
[0159] a GST-BliGO-Mut com a sequência de DNA SEQ ID NO: 7 ou a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 8 e a SUMO-BliGO- Mut com a sequência de DNA SEQ ID NO: 11 ou a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 12 e
[0160] - sequências de BliGO etiquetadas homólogas, conforme definido acima, em que a sequência de BliGO exibe pelo menos 70% e, opcionalmente, uma vesícula, conforme definido acima, e em que pelo menos um elemento bioquímico que forma uma rede bioquímica é encapsulado em uma vesícula e/ou preso em uma matriz de gel.
[0161] Em um terceiro aspecto, a presente invenção é direcionada a um kit ou dispositivo para detectar a presença ou a presença de uma quantidade relevante ou a ausência, e/ou para quantificar a quantidade de pelo menos um analito-alvo em uma amostra, em que o dito kit compreende um recipiente contendo a composição, de acordo com a presente invenção ou conforme definido acima, na composição implementada para o método da presente invenção, em que as vesículas da dita composição são aprisionadas em um gel polimérico poroso, preferencialmente selecionado do grupo que consiste em gel polimérico poroso, de preferência selecionado do grupo que consiste em alginato, quitosano, PVP (polivinilpirrolidona), PVA (álcool polivinílico), agarose, sefadex, sefarose, sefacril e suas misturas.
[0162] Deve ser entendido que tanto a descrição geral anterior quanto a descrição detalhada a seguir são exemplificativas e explicativas apenas e não se destinam a limitar o escopo dos ensinamentos atuais. Neste pedido, o uso do singular inclui o plural, a menos que seja especificamente indicado de outra forma.
[0163] Aqueles versados na técnica perceberão que a seguinte descrição detalhada das modalidades é apenas ilustrativa e não se destina a ser de qualquer forma limitante. Outras modalidades irão sugerir-se prontamente para tais pessoas versadas na técnica tendo o benefício desta divulgação. A referência a uma “modalidade”, “aspecto” ou “exemplo” neste documento indica que as modalidades da invenção assim descritas podem incluir um recurso, estrutura ou característica particular, mas nem toda modalidade inclui necessariamente o recurso, estrutura ou característica particular. Além disso, o uso repetido da frase “em uma modalidade” não se refere necessariamente à mesma modalidade, embora possa.
[0164] Os exemplos a seguir, as figuras e as legendas a seguir foram escolhidos para fornecer aos versados na técnica uma descrição completa a fim de serem capazes de implementar e usar a presente invenção. Estes exemplos não se destinam a limitar o escopo do que o inventor considera ser a sua invenção, nem pretendem mostrar que apenas as experiências a seguir foram realizadas.
[0165] Outras características e vantagens da invenção surgirão no restante da descrição com os Exemplos e Figuras, cujas legendas são fornecidas a seguir. LEGENDAS DAS FIGURAS:
[0166] Figura 1: Representação esquemática da rede bioquímica de glicina/glifosato nº 1. A rede compreende a enzima GST-BliGO Mut nº1, a enzima HRP e o vermelho de Amplex ou dianisidina para a leitura colorimétrica ou fluorescente.
[0167] Figuras 2A-2B: Representação esquemática da rede bioquímica de EPSP sintase nº 2A e nº 2B para detecção de glifosato.
[0168] A rede nº 2A (Figura 2A) compreende a enzima EPSP sintetase, a enzima corismato sintase, a enzima corimato-liase, a enzima lactato desidrogenase e o NADH para a detecção de absorvância ou fluorescência.
[0169] A rede nº 2B compreende a enzima EPSP sintase, a enzima Purina-nucleosídeo fosforilase, a enzima Xantina oxidase, a enzima HRP e o vermelho de Amplex ou O-dianisidina para a leitura colorimétrica ou fluorescente.
[0170] Figura 3: Processo microfluídico para formação de vesículas (de Courbet et al. Mol. Sys. Biol. 2018, 14 (4): e7845. Figura 4A))
[0171] Figuras 4A-4B:
[0172] Figura 4A: Detecção de absorbância de glifosato pela rede nº 1 de Glicina/Glifosato oxidase. Detecção de glifosato variando de 0 a 10 mM.
[0173] Figura 4B: Análise da atividade catalítica da enzima glicina/glifosato oxidase.
[0174] Figuras 5A-5B:
[0175] Figura 5A: Detecção de fluorescência de fosfoenol piruvato (PEP) pela rede nº 2B de glicina/glifosato oxidase. Detecção de PEP variando de 0 a 100 μΜ. Figura 5B: Análise da atividade catalítica da enzima EPSP sintase.
[0176] Figura 6: Representação esquemática da rede bioquímica nº 3 de glicina para detecção de glicina. A rede compreende a enzima Glicine oxidase H244K de Bacillus Subtilis, a enzima HRP e o vermelho de
Amplex ou O-dianisidina para a leitura colorimétrica ou fluorescente.
[0177] Figura 7: Representação esquemática da rede bioquímica nº 4 de Glifosato OU Glicina para detecção de glifosato e glicina. A rede compreende a enzima GST-BliGO Mut nº1, a enzima Glicina oxidase H244K de Bacillus Subtilis, a enzima HRP e o vermelho de Amplex ou O- dianisidina para a leitura colorimétrica ou fluorescente.
[0178] Figuras 8A-8B: Detecção de fluorescência (parte superior) e colorimétrica (parte inferior) de glifosato pela rede nº 1 de glicina/glifosato oxidase. (A- à esquerda) Detecção de Glifosato variando de 0 a 2 mM em tampão Tris 50 mM pH 7,5. (B-à direita) Detecção de Glifosato variando de 0 a 2 mM em sementes de cevada extraídas em tampão Tris 50 mM pH 7,5.
[0179] Figuras 9A-9B: Detecção de glifosato por fluorescência (parte superior) e colorimétrica (parte inferior) pela rede nº 1 de glicina/glifosato oxidase integrada em vesículas. (A- à esquerda) Detecção de Glifosato variando de 0 a 2 mM em tampão Tris 50 mM pH 7,5. (B-à direita) Detecção de Glifosato variando de 0 a 2 mM em sementes de cevada extraídas em tampão Tris 50 mM pH 7,5.
[0180] Figura 10: Detecção colorimétrica de glifosato pela rede nº 1 de Glicina/Glifosato oxidase integrada em esferas de alginato. (Parte superior) Detecção de glifosato variando de 0 a 4 mM em tampão Tris 50mM pH 7,5. (Parte inferior) Detecção de glifosato variando de 0 a 4 mM em sementes de cevada extraídas em tampão Tris 50 mM pH 7,5.
[0181] Figura 11: Detecção por fluorescência (parte superior) e colorimétrica (parte inferior) de glicina pela rede nº 3 de glicina/glifosato oxidase. (Esquerda) Detecção de glicina variando de 0 a 1 mM em tampão Tris 50 mM pH 7,5. Observe a ausência de detecção do glifosato em 100 μΜ.
[0182] Figura 12: Detecção por fluorescência de glifosato e glicina pela rede nº 4 de Glicina/Glifosato oxidase. (Parte superior) Cinética da degradação do glifosato E/OU da glicina pela rede. O glifosato e a glicina estavam presentes na concentração de 1 mM. (Parte inferior) Resposta da porta lógica (OR) da rede nº 4 de glicina/glifosato oxidase à presença de glicina E/OU glifosato.
[0183] Figura 13: Detecção por fluorescência de glifosato pela rede nº 2B de EPSP sintase. Cinética da degradação do glifosato pela rede. Detecção de glifosato variando de 0 a 1 mM.
[0184] Figura 14: Proteína BliGO_WT (nativa): sequência de DNA (SEQ ID NO: 1) e de aminoácidos (SEQ ID NO: 2)
[0185] Figura 15: Proteína BliGO_Mut: sequência de DNA (SEQ ID NO: 3) e de aminoácidos (SEQ ID NO: 4)
[0186] Figura 16: Proteína GST-BliGO_WT (nativa): sequência de DNA (SEQ ID NO: 5) e de aminoácidos (SEQ ID NO: 6)
[0187] Figura 17: Proteína GST-BliGO_Mut: sequência de DNA (SEQ ID NO: 7) e de aminoácidos (SEQ ID NO: 8)
[0188] Figura 18: Proteína SUMO-BliGO_WT: sequência de DNA (SEQ ID NO: 9) e de aminoácidos (SEQ ID NO: 10)
[0189] Figura 19: Proteína SUMO-BliGO_Mut: sequência de DNA (SEQ ID NO: 11) e de aminoácidos (SEQ ID NO: 12). EXEMPLO 1: PROJETO DO ESTUDO - CONFIGURAÇÃO
DAS REDES BIOQUÍMICAS
[0190] Diferentes redes bioquímicas foram projetadas para detectar a presença de diferentes pesticidas e/ou desreguladores endócrinos. Uma originalidade da nossa invenção reside no fato de que diferentes redes bioquímicas podem ser conectadas entre si para permitir a detecção de diferentes analitos e levar à entrega de um único sinal de saída, se necessário.
[0191] Para a detecção específica do pesticida glifosato, projetamos dois sistemas de detecção que podem ser combinados para melhorar a especificidade do sinal de saída:
[0192] 1. A primeira rede usa a capacidade da enzima
Glicina/Glifosato oxidase de metabolizar o Glifosato (Figura 1).
[0193] Em um primeiro exemplo, essa primeira rede compreende:
[0194] a) a enzima Glicina/Glifosato oxidase, a enzima Peroxidase de Rábano e o dicloridrato de O-Dianisidina. Na presença de Glifosato, fosfonato de 2-amino e H2O2 são produzidos pela Glicina/Glifosato oxidase. Posteriormente, o H2O2 é coprocessado com a O-dianisidina pela peroxidase de rábano para dar uma leitura colorimétrica da reação com uma mudança na absorbância no comprimento de onda visível de 450 nm.
[0195] Primeiro, a rede foi testada em tampão líquido sem vesícula ou gel. O sistema de reação de 100 μl compreendia pirofosfato dissódico 30 mM (pH 8,5), 0,46 μΜ (0,0024 unidade) Glicina/Glifosato oxidase H244K de Bacillus Subtilis (Biovision nº 7845), 0,5 mM de dicloridrato de O-Dianisidina, 0,25 unidade de peroxidase de rábano e Glifosato de 0 a 600 mM. A reação foi seguida por 1 hora a 25 °C registrando a absorbância a 450 nm em um espectrofotômetro.
[0196] Em um segundo exemplo, essa primeira rede pode compreender:
[0197] b) a enzima GST-Bacillus licheniformis Mut nº 1 ou SCF-4 Glicina/Glifosato oxidase, a enzima de Peroxidase de rábano e o vermelho de Amplex. Na presença de Glifosato, fosfonato de 2-amino e H2O2 são produzidos pela Glicina/Glifosato oxidase. Posteriormente, o H 2O2 é coprocessado com o vermelho de Amplex pela peroxidase de rábano para dar uma leitura colorimétrica (vermelho) e fluorescente à reação.
[0198] Primeiro, a rede foi testada em tampão líquido sem vesícula ou gel (Figuras 8A-8B). O sistema de reação de 100 μl compreendeu Tris 50 mM (pH 7,5), 0,46 μΜ (0,0024 unidade) Glicina/Glifosato oxidase GST-BliGO Mut nº1 de Bacillus Licheniformis geneticamente modificada e derivada da BliGO-SCF-4 contendo 6 mutações únicas de aminoácidos em comparação com a versão de tipo selvagem, vermelho de Amplex 0,2 mM,
0,25 unidade de peroxidase de rábano e glifosato em concentrações que variam de 0 a 2 mM. A rede também foi testada na presença de extratos de cevada (Figura 8B). A reação foi seguida por 1 hora a 25 °C registrando a fluorescência (Excitação a 530 nm/Emissão a 590 nm) em um espectrofotômetro.
[0199] A rede também foi testada em vesícula (Figuras 9A-9B). As vesículas compreendiam Tris 50 mM (pH 7,5), vermelho de Amplex 0,2 mM e 0,25 unidade de peroxidase de rábano. 0,46 μΜ (0,0024 unidade) de Glicina/Glifosato oxidase GST-BliGO Mut nº1 de Bacillus licheniformis e Glifosato em concentrações que variam de 0 a 2 mM foram adicionados na reação fora das vesículas. A reação foi seguida por 1 hora a 25 °C registrando a fluorescência (Excitação a 530 nm/Emissão a 590 nm) em um espectrofotômetro.
[0200] A rede também foi testada em esferas de alginato (Figura 10). As esferas de alginato compreendiam Tris 50 mM (pH 7,5), vermelho de Amplex 0,2 mM, 0,25 unidade de peroxidase de rábano. 0,46 μΜ (0,0024 unidade), Glicina/Glifosato oxidase GST-BliGO de Bacillus Licheniformis. As esferas foram mergulhadas em tampão Tris 50 mM pH 7,5 ou extratos de cevada contendo glifosato em concentrações que variam de 0 a 4 mM. A reação (colorimetria das esferas) foi seguida durante 1 hora a 25 °C.
[0201] 2. A segunda rede combina a atividade de 4 enzimas com a primeira enzima sendo a 5-enolpiruvilchiquimato 3-fosfato-Sintase (EPSP Sintase) (Figuras 2A-2B).
[0202] Essa rede explora a capacidade do Glifosato de inibir a atividade da EPSP sintase. Com essa rede, o nível de inibição depende da concentração de glifosato. A entrada da rede é composta por: a EPSP sintase que utiliza o fosfoenol piruvato (PEP) e o 3-fosfochiquimato para produzir 5-O-(1-caroxivinil)-3-fosfoschiquimato e fosfato inorgânico.
[0203] Em seguida, 2 redes diferentes foram testadas:
[0204] - Uma que converte o fosfato inorgânico (Pi): o Pi é combinado com a Inosina na presença da purina nucleosídeo fosforilase para dar hipoxantina. A hipoxantina leva à Xantina e H 2O2 na presença de Xantina Oxidase. A peroxidase de rábano usa o H 2O2 para converter a O-dianisidina ou o vermelho de Amplex e fornecer um sinal colorimétrico ou fluorimétrico detectável.
[0205] Primeiro, a rede foi testada em tampão líquido sem vesícula ou gel. O sistema de reação de 100 μl compreendia 50 mM de Hepes (pH 7), 50 mM de KC1, 0,5 mM de Chiquimato-3-fosfato, 0,1 unidade de Xantina Oxidase, 0,12 μg de E. coli EPSP Sintase, 0,2 unidade de Purina Nucleosídeo Fosforilase, 2,25 mM de Inosina, 0,5 mM de Dicloridrato de O-dianisidina, 0,25 unidade de Peroxidase de Rábano, Fosfoenol Piruvato entre 0 e 600 μM e Glifosato em concentrações que variam de 0 a 2 mM. A reação foi seguida por 1 hora a 25 °C registrando a absorbância a 450 nm em um espectrofotômetro.
[0206] - Uma que converte o 5-O- (1-caroxivinil) -3-fosfoschiquimato produzido pela EPSP sintase: 5-O- (1-caroxivinil)-3-fosfosiquimato é metabolizado pela Corismato Sintase para dar corismato. Esse corismato é então transformado em piruvato pela corismato liase. Finalmente, o piruvato é usado pela lactato desidrogenase na presença de NADH para dar lactato e NAD+. O consumo de NADH é seguido pela alteração da emissão de fluorescência a 445 nm (Excitação a 340 nm) - ou alteração da absorbância a 340 nm em um espectrofotômetro.
[0207] 3. A terceira rede (nº 3) usa a capacidade da enzima Glicina/Glifosato oxidase do Bacillus subtilis H244K (enzima criativa) para metabolizar a glicina (Figura 6).
[0208] A rede compreende: a enzima Glicina/Glifosato oxidase de Bacillus subtilis H244K, a enzima de peroxidase de rábano e o vermelho de Amplex. Na presença de Glicina, mas não de Glifosato, glioxilato e H2O2 são produzidos pela Glicina/Glifosato oxidase. Posteriormente, o H 2O2 é coprocessado com o vermelho de Amplex pela peroxidase de rábano para dar uma leitura colorimétrica (vermelho) e fluorescente à reação.
[0209] Primeiro, a rede foi testada em tampão líquido sem vesícula ou gel (Figura 11). O sistema de reação de 100 μl compreendia Tris 50 mM (pH 7,5), 0,46 μM (0,0024 unidade) de H244K Glicina/Glifosato oxidase de Bacillus subtilis geneticamente modificada contendo 1 única mutação de aminoácidos H244K (ver Número de Acesso 031616 Biovision) em comparação com a versão de tipo selvagem (Enzima criativa NATE-1674), vermelho de Amplex 0,2 mM, 0,25 unidade de peroxidase de rábano e glicina em concentrações que variam de 0 a 1 mM. A reação foi seguida por 1 hora a 25 °C registrando a fluorescência (Excitação a 530 nm/Emissão a 590 nm) em um espectrofotômetro.
[0210] 4. A quarta rede (nº 4) combina a primeira e a terceira redes para detectar glicina e glifosato (Figura 7).
[0211] A rede compreende: a enzima GST-Bacillus licheniformis Mut nº1 Glicina/Glifosato oxidase, a Glicina/Glifosato oxidase de Bacillus subtilis H244K, a enzima peroxidase de rábano e o vermelho de Amplex. Na presença de Glicina OU Glifosato, fosfonato de 2-amino, glioxilato e H2O2 são produzidos pela rede nº 4 de Glicina/Glifosato oxidase. Posteriormente, o H 2O2 é coprocessado com o vermelho de Amplex pela peroxidase de rábano para dar uma leitura colorimétrica (vermelho) e fluorescente à reação.
[0212] A rede foi testada em vesículas (Figura 12). As vesículas compreendiam Tris 50 mM (pH 7,5), vermelho de Amplex 0,2 mM e 0,25 unidade de peroxidase de rábano. 0,46 μΜ (0,0024 unidade) de Glicina/Glifosato oxidase GST-BliGO Mut nº1 de Bacillus Licheniformis, 0,46 μΜ (0,0024 unidade) H244K Glicina/Glifosato oxidase de Bacillus subtilis geneticamente modificada contendo uma mutação de aminoácidos de tipo único H244K em comparação com a mutação H244K de tipo selvagem (Enzima criativa NATE-1674) e glifosato em concentrações variando de 0 a 2 mM foram adicionados na reação fora das vesículas. A reação foi seguida por 1 hora a 25 °C registrando a fluorescência (Excitação a 530 nm/Emissão a 590 nm) em um espectrofotômetro.
EXEMPLO 2: CONFIGURAÇÃO DAS VESÍCULAS PARA ENCAPSULAR AS REDES BIOQUÍMICAS (CONSULTE COURBET ET AL. MOL. SYS. BIOL. 2018)
[0213] Identificamos uma arquitetura macromolecular universal e robusta, capaz de suportar a implementação modular de processos de biossensor/biocomputação in vitro. Essa arquitetura é capaz de (i) encapsular e proteger de forma estável os circuitos bioquímicos arbitrários irrelevantes de sua composição biomolecular, (ii) discretizar o espaço através da definição de um interior isolado contendo o circuito sintético e um exterior consistindo do meio para operar (por exemplo, uma amostra clínica), (iii) permitir a transdução de sinal por meio da transferência seletiva de massa de sinais moleculares (ou seja, entradas de biomarcadores) e (iv) apoiar a construção precisa por meio de mecanismos de automontagem termodinamicamente favoráveis. A arquitetura das vesículas que propomos nesse estudo é feita de membranas de bicamada fosfolipídica.
[0214] Contamos com o desenvolvimento de um método que suportaria simultaneamente (i) unilamelaridade da membrana, (ii) eficiência de encapsulação e estequiometria, (iii) monodispersidade e (iv) maior estabilidade/resistência ao estresse osmótico. Para esse propósito, desenvolvemos uma plataforma microfluídica customizada e chips microfluídicos baseados em PDMS para alcançar a automontagem dirigida de um fosfolipídio sintético (DPPC) em bicamadas de membrana calibradas de tamanho customizado encapsulando um baixo número de cópias de espécies bioquímicas. Resumidamente, essa estratégia se baseou em geometrias de canal de geração de gotícula com foco em fluxo que geram modelos de emulsão dupla água-em-óleo-em-água (WOW: circuito bioquímico em PBS-DPPC em ácido oleico-tampão de armazenamento aquoso com uma baixa concentração de metanol). Após a formação dos modelos de emulsão dupla, as membranas fosfolipídicas DPPC são precisamente direcionadas para se automontar durante um processo de extração de solvente controlado da fase oleosa por metanol presente no tampão (Figura 3). Esse projeto microfluídico também integra um dispositivo conhecido como misturador espinha de peixe escalonado (SHM) (Williams et al, 2008) para permitir a mistura passiva e caótica eficiente de vários canais a montante sob o regime de fluxo de Stokes. Raciocinamos que os gradientes de concentração laminar podem impedir a mistura crítica de partes bioquímicas, estequiometria precisa e encapsulamento eficiente. Nossa hipótese é que os circuitos bioquímicos sintéticos homogeneizados imediatamente antes da montagem poderiam padronizar o mecanismo de encapsulamento e reduzir sua dependência da natureza dos materiais isolados. Além disso, esse projeto permitiu o ajuste fino da estequiometria por meio do controle das taxas de fluxo de entrada, o que se mostrou prático para testar diferentes parâmetros para a prototipagem direta de protosensores.
[0215] Usamos uma câmera ultrarrápida para realizar o monitoramento em tempo real e inspecionar visualmente o processo de fabricação, o que permitiu estimar em torno de ~1500 Hz a frequência média de geração de vesículas nessas taxas de fluxo. Foi encontrada uma forte dependência dos rendimentos de geração de vesículas nas taxas de fluxo, que mantivemos em 1/0,4/0,4 μl/min (tampão de armazenamento/DPPC em óleo/circuito bioquímico em PBS, respectivamente) para alcançar a melhor eficiência de montagem. Em seguida, analisamos a dispersão do tamanho das vesículas usando transmissão de luz, microscopia eletrônica de varredura confocal e ambiental. Foram observadas vesículas monodispersas com parâmetro de tamanho médio de 10 µm e uma distribuição gaussiana inversa aparente. Curiosamente, o isolamento do circuito bioquímico não pareceu influenciar a distribuição do tamanho das vesículas, o que apoia a dissociação do processo de isolamento da complexidade do conteúdo bioquímico. Além disso, nenhuma evolução dos tamanhos foi registrada após 3 meses, o que demonstrou a ausência de eventos de fusão entre as vesículas. A fim de avaliar a capacidade das vesículas de encapsular espécies de proteínas sem vazamento, que é um pré-requisito para alcançar um projeto racional de processamento de informações bioquímicas, testamos a estabilidade do encapsulamento usando microscopia confocal. Para este fim, uma proteína irrelevante com um marcador fluorescente foi encapsulada dentro de vesículas, e a evolução da fluorescência interna foi monitorada ao longo de 3 meses. A fluorescência interna permaneceu estável, o que não demonstrou vazamento mensurável de proteína através da membrana da vesícula em nossas condições de armazenamento. Além disso, usando corante específico de bicamada fosfolipídica, DiIC18, que sofre aumento drástico no rendimento quântico de fluorescência quando especificamente incorporado em bicamadas (Gullapalli et al, 2008, Phys Chem Chem Phys; 10(24): 3548-3560), a extração completa do ácido oleico da emulsão dupla e um arranjo bem estruturado da bicamada podem ser visualizados. Em seguida, procuramos avaliar o encapsulamento de partes enzimáticas biológicas dentro das vesículas. Constatou-se que poderíamos recuperar as assinaturas moleculares das enzimas no interior das vesículas. Juntas, essas constatações mostram que essa configuração provou ser capaz de gerar vesículas modulares estáveis com alta eficiência e conteúdo definido pelo usuário com ajuste fino. EXEMPLO 3: INCORPORAÇÃO DAS VESÍCULAS CONTENDO A REDE BIOQUÍMICA DE INTERESSE EM UMA MATRIZ DE GEL.
[0216] Uma vez que as vesículas contendo a rede bioquímica de interesse estão prontas, elas são incorporadas ao formato final que é um conjunto de esferas à base de matriz de gel. O tamanho das esferas de gel pode ser ajustado dependendo das necessidades do usuário final (ou seja, 5 mm de diâmetro). O gel é composto por 10% de álcool polivinílico (PVA) e 1% de alginato de sódio. A mistura contendo todos os componentes da rede bioquímica em vesículas é incorporada em uma solução líquida de 10% de álcool polivinílico (PVA), 1% de alginato de sódio. A rede bioquímica/PVA/Alginato mistura é então vertida uma solução de 0,8 M de ácido bórico/0,2 M CaCl 2, sob agitação com uma barra de agitação. Após 30 minutos, as contas são enxaguadas 2 vezes em água e colocadas em tampão de sulfato de sódio 0,5 M durante 90 minutos. As contas são enxaguadas 2 vezes em PBS frio e conservadas em PBS a 4 °C. EXEMPLO 4: DETECÇÃO DO GLIFOSATO/RESULTADOS DE QUANTIFICAÇÃO.
[0217] 1. Detecção de Glifosato pela rede de Glicina/Glifosato oxidase
[0218] 1.1 Usando o dicloridrato de O-Dianisidina, seguimos a oxidação do Glifosato pela Glicina/Glifosato Oxidase que é dependente da concentração de Glifosato (Figuras 1, 4A, 4B). A mudança de cor das contas foi seguida pela mudança de absorbância a 450 nm em um espectrofotômetro. Isso nos permitiu determinar uma afinidade (Km) da Glicina/Glifosato Oxidase para o glifosato que é 2,5 mM e uma Vmax de 6x10-9 mol/l/s.
[0219] 1.2 Detecção de Glifosato em tampão Tris e extratos de cevada pela rede de Glicina/Glifosato Oxidase (nº 1) em líquido, vesícula ou gel)
[0220] 1.2.1 Preparação de extratos de cevada para subsequente detecção de glifosato
[0221] Primeiro, os grãos de cevada foram moídos e peneirados. O pó foi ressuspenso com Tris 100 mM pH 7,5 e incubado por 30 minutos em roda à temperatura ambiente. O extrato foi centrifugado por 10 minutos a 4000 g. O sobrenadante foi filtrado com filtro de seringa de corte de 0,2 micrômetro e conservado a 4 °C antes da análise.
[0222] 1.2.2 Usando o vermelho de Amplex, seguimos a oxidação do Glifosato pela Glicina/Glifosato Oxidase que é dependente da concentração de Glifosato (Figuras 8A-8B). A reação foi acompanhada pela alteração da fluorescência em um fluorímetro (Excitação a 530 nm/Emissão a 590 nm). Paralelamente, acompanhamos a mudança de cor da reação que depende da concentração de glifosato. Isso nos permitiu detectar o glifosato não apenas em meio tamponado simples (Figura 8A), mas também em extratos complexos de cevada (Figura 8B).
[0223] 1.2.3 Detecção de Glifosato pela rede Glicina/Glifosato Oxidase (nº 1) em vesículas
[0224] Após incorporar uma parte da rede nas vesículas (HRP, vermelho de Amplex, tampão Tris 50 mM pH 7,5) e fora das vesículas (Glicina/Glifosato oxidase), seguimos a oxidação do Glifosato que é dependente da concentração de Glifosato (Figuras 9A -9B)). A reação foi acompanhada pela alteração da fluorescência em um fluorímetro (Excitação a 530 nm/Emissão a 590 nm). Paralelamente, acompanhamos a mudança de cor da reação que depende da concentração de glifosato. Isso nos permitiu detectar o glifosato não apenas em meio tamponado simples (Figura 9A), mas também em extratos complexos de cevada (Figura 9B).
[0225] 1.2.4 Detecção de Glifosato pela rede Glicina/Glifosato Oxidase (nº 1) em esferas de gel
[0226] A rede completa de glicina/glifosato oxidase foi incorporada em esferas de gel de alginato. Seguimos a oxidação do Glifosato que é dependente da concentração do Glifosato (Figura 10). A reação foi seguida pela mudança da cor das esferas (vermelho). Mais uma vez, permitiu-nos detectar o glifosato não apenas em meio tamponado simples (Figura 10 (primeira linha)), mas também em extratos complexos de cevada (Figura 10, segunda linha).
[0227] 2. Detecção de glifosato pela rede de EPSP Sintase conectada à detecção de fosfato
[0228] Usando o dicloridrato de O-Dianisidina ou o vermelho de Amplex, seguimos a inibição do Glifosato da EPSP Sintase que é dependente da concentração de Glifosato (Figuras 2B, 5A, 5B, 7). A reação foi acompanhada pela alteração da fluorescência em um fluorímetro (Excitação a 530 nm/Emissão a 590 nm) ou pela alteração da absorbância a 450 nm em um espectrofotômetro. Isso nos permitiu determinar a atividade da EPSP sintase em relação ao Piruvato de Fosfoenol (PEP). A afinidade de EPSP para PEP é de
14 μΜ e Vmax é de 10,26x10-9 mol/l/s. Além disso, ele nos permitiu detectar o glifosato por seu efeito inibitório na EPSP sintase (Figura 7).
[0229] 3. Detecção de glifosato pela rede de EPSP Sintase conectada à detecção de 5-O-(1-caroxivinil)-3-fosfochiquimato
[0230] Ao monitorar o consumo de NADH, seguimos a inibição do Glifosato da EPSP Sintase que é dependente da concentração de Glifosato (Figura 2A). O consumo de NADH foi dado pela alteração da emissão de fluorescência a 445 nm (Excitação a 340 nm) - ou alteração da absorbância a 340 nm em um espectrofotômetro. EXEMPLO 5: DETECÇÃO DA GLICINA/RESULTADOS DE QUANTIFICAÇÃO.
[0231] 1. Detecção de glicina em tampão Tris pela rede de glicina/glifosato oxidase (nº 3) em líquido (sem vesícula/sem gel)
[0232] Ao usar o vermelho de Amplex, seguimos a oxidação da Glicina pela Glicina/Glifosato Oxidase (Glicina/Glifosato oxidase H244K Glicina/Glifosato oxidase de Bacillus subtilis geneticamente modificado contendo 1 única mutação de aminoácidos H244K em comparação com a versão de tipo selvagem (Creativa -1674)) que é dependente da concentração de glicina (Figura 11). A reação foi acompanhada pela alteração da fluorescência em um fluorímetro (Excitação a 530 nm/Emissão a 590 nm). Isso nos permitiu detectar a glicina. EXEMPLO 6: DETECÇÃO DE GLIFOSATO E GLICINA/RESULTADOS DE QUANTIFICAÇÃO.
[0233] 1. Detecção de glifosato e glicina em tampão Tris pela rede de Glicina/Glifosato Oxidase (nº 4) em vesículas
[0234] Nesse exemplo, tiramos vantagem da especificidade d GST-BliGO Mut nº1 para o glifosato em comparação com a glicina e da especificidade da Glicina/Glifosato oxidase H244K de Bacillus subtilis para a glicina em comparação com o glifosato. De fato, a GST-BliGO Mut nº1 é derivada do mutante BliGO SCF4 desenvolvido por Zhang et al. (2016).
Esse mutante tem um aumento de 8 vezes na afinidade (1,58 mM) para o glifosato e sua atividade para a glicina diminuiu 113 vezes em comparação com a de WT. Esse mutante foi desenvolvido para aumentar a resistência das plantas ao glifosato e o usamos como base para o biossensor do glifosato.
[0235] Depois de incorporar uma parte da rede nas vesículas (HRP, vermelho de Amplex, tampão Tris 50mM pH7,5) e fora das vesículas (Glicina/Glifosato oxidase H244K Glicina/Glifosato oxidase de Bacillus subtilis geneticamente modificado contendo 1 única mutação de aminoácidos H244K em comparação com a versão de tipo selvagem (enzima Creativa NATE-1674) e GST-BliGO Mut nº1 de Bacillus Licheniformis derivada de BliGO –SCF-4 geneticamente modificada e contendo 6 mutações únicas de aminoácidos em comparação com a versão de tipo selvagem, seguimos a oxidação de Glifosato e/ou glicina que é dependente da concentração de Glifosato e Glicina (Figura 12)). A reação foi seguida pela alteração da fluorescência em um fluorímetro (Excitação a 530 nm/Emissão a 590 nm). Isso nos permitiu detectar o glifosato sozinho, a glicina sozinha e a combinação de glifosato e glicina. (Figura 12).
CONCLUSÃO E DISCUSSÃO
[0236] Esse estudo demonstrou que o método e a composição de acordo com a presente invenção são ferramentas altamente promissoras para realizar a detecção e quantificação de pesticidas ou desreguladores endócrinos, potencialmente multiplexados. Mostramos que essa tecnologia pode ser aplicada com sucesso para resolver problemas ambientais reais e demonstramos que o método e a composição da presente invenção podem superar vários obstáculos enfrentados pelas ferramentas de diagnóstico clássicas neste campo.

Claims (19)

REIVINDICAÇÕES
1. Método para detectar a presença ou a ausência e/ou quantificar a quantidade de pelo menos um analito-alvo em uma amostra, em que o método é caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: a partir de uma amostra contendo ou suscetível a conter o analito-alvo; a) colocar a amostra em contato com uma composição que compreende elementos bioquímicos formando uma rede bioquímica, em que a dita rede bioquímica compreende como elemento bioquímico pelo menos uma enzima tendo como substrato ou como inibidor ou como ativador o dito analito- alvo que é desejado ser detectado e/ou quantificado, e em que: - pelo menos um dos ditos elementos bioquímicos que formam uma rede bioquímica é encapsulado em uma micro ou nanovesícula (denominada vesícula) permeável ou não ao analito-alvo; ou - pelo menos dois dos ditos elementos bioquímicos que formam uma rede bioquímica são encapsulados em duas vesículas distintas permeáveis ou não ao analito-alvo, em que: i) o dito pelo menos um analito-alvo que se deseja detectar ou quantificar na amostra é o glifosato; ii) a rede bioquímica é capaz de: - gerar pelo menos um sinal de saída específico legível/mensurável apenas na presença do analito-alvo quando o dito analito- alvo é um substrato da enzima da dita rede bioquímica; ou - inibir o sinal de saída específico legível/mensurável gerado pela dita rede bioquímica apenas na presença do analito-alvo quando o dito analito-alvo é um inibidor da enzima da dita rede bioquímica, e, b) determinar a taxa e/ou nível do sinal de saída legível/mensurável específico produzido pela rede bioquímica, a taxa e/ou nível obtido sendo correlacionado com a presença ou ausência e/ou a quantidade do analito-alvo na amostra.
2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a amostra suscetível a conter o analito-alvo é selecionada a partir do grupo que consiste em amostra de fluido ou material sólido, de preferência amostra de material ambiental, material vegetal, água, bebida, produtos alimentícios, extratos de solo, material industrial, alimentos produção, extrato de planta, fluido fisiológico ou tecido de organismo vivo.
3. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 e 2, caracterizado pelo fato de que a presença e/ou ausência e/ou a quantidade do analito-alvo é detectada e/ou quantificada pela medida de um sinal selecionado a partir do grupo que consiste em: medição colorimétrica visível, fluorescência, luminescência, espectroscopia (ou seja, infravermelho, Raman), composto químico ou produção de partículas (elétrons).
4. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que detecta a presença ou ausência e/ou quantifica a quantidade de pelo menos um segundo analito-alvo em uma amostra, em que o dito segundo analito é um substrato, inibidor ou ativador do mesmo pelo menos uma enzima de rede bioquímica, em que pelo menos um dos ditos elementos bioquímicos formando uma rede bioquímica é encapsulado na dita vesícula.
5. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que detecta a presença ou ausência e/ou quantifica a quantidade de pelo menos um segundo analito-alvo em uma amostra, em que: - o dito segundo analito é um inibidor ou ativador de substrato de uma segunda rede bioquímica distinta de enzimas, e um dos ditos elementos bioquímicos formando a dita segunda rede bioquímica é encapsulado na mesma ou em outra vesícula distinta, ou conjunto de vesículas; e - as ditas duas redes bioquímicas distintas (interconectadas ou não) geram um sinal de saída legível/mensurável diferente.
6. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações
1 a 5, caracterizado pelo fato de que o segundo analito-alvo que se deseja detectar e/ou quantificar é um pesticida ou um desregulador endócrino selecionado a partir do grupo que consiste em: a) pesticida e/ou uma molécula desreguladora endócrina que é um substrato específico de uma atividade enzimática, atividade que pode produzir em uma ou mais etapas, um sinal de saída específico legível/mensurável; b) pesticida e/ou uma molécula desreguladora endócrina que é um inibidor específico de uma atividade enzimática, atividade que pode produzir em uma ou mais etapas, um sinal de saída específico legível/mensurável; e c) pesticida ou uma molécula desreguladora endócrina que é um ativador específico de uma atividade enzimática, atividade que pode produzir em uma ou mais etapas, um sinal de saída específico legível/mensurável.
7. Método, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o segundo analito-alvo que se deseja detectar e/ou quantificar é um pesticida ou um desregulador endócrino selecionado a partir do grupo que consiste em: Clordecona, Neonicotinoide, Organocloretos, Inibidor de Succinato desidrogenase (SDHI), carbamatos, dioxina (PCDD), policlorobifenilo (PCB), 17-beta estradiol, 17-alfa etileno estradiol, bisfenol (PBDE), ftalatos e metais pesados.
8. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que a pelo menos uma enzima de rede bioquímica que está compreendida na composição na etapa a), encapsulada na dita vesícula ou não encapsulada, é selecionada a partir do grupo que consiste em: - glicina/glifosato oxidase (EC 1.4.3.19), de preferência a glicina/glifosato oxidase nativa (tipo selvagem/WT) de Bacillus subtilis que pode ser obtida como proteína recombinante, ou sequência homóloga desta tendo pelo menos 70% de identidade com a sequência de proteína WT e exibindo atividade de glicina/glifosato oxidase; e - 5-enolpiruvilshiquimato-3-fosfato (EPSP) sintase (EC 2.5.1.19).
9. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que a pelo menos uma enzima de rede bioquímica que está compreendida na composição na etapa a), encapsulada na dita vesícula ou não encapsulada, é a glicina oxidase (GO) da bactéria marinha Bacillus licheniformis ((BliGO) que foi clonada e que mostra pelo menos 62% de similaridade com o GO padrão de Bacillus subtilis, ou sequência de BliGO homóloga deste tendo pelo menos 70% de identidade com a sequência da proteína BliGO WT SEQ ID NO: 2 e exibindo atividade GO.
10. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que a pelo menos uma enzima de rede bioquímica que está compreendida na composição na etapa a), encapsulada na dita vesícula ou não encapsulada, é a glicina oxidase mutada (GO) da bactéria marinha Bacillus licheniformis geneticamente modificada e contendo 6 mutações únicas de aminoácidos em comparação com a versão de tipo selvagem BliGO-WT, denominada BliGO-SCF-4 ou BliGO-Mut tendo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 4.
11. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 10, caracterizado pelo fato de que a dita glicina/glifosato oxidase compreende uma etiqueta que é fundida à enzima glicina/glifosato oxidase, de preferência uma etiqueta selecionada a partir do grupo que consiste em proteína de ligação à maltose (MBP), proteína de ligação à quitina (CBP), glutationa S-transferase (GST), tioredoxina (TRX), NUS A, ubiquitina (Ub) e etiquetas SUMO (pequeno modificador relacionado à ubiquitina), de preferência etiquetas SUMO e GST.
12. Método, de acordo com a reivindicação 11,
caracterizado pelo fato de que a dita é uma etiqueta SUMO ou GST.
13. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 12, caracterizado pelo fato de que a dita glicina/glifosato oxidase compreendendo uma etiqueta é selecionada a partir do grupo de: - a GST-BliGO (nativa/WT) com a sequência de DNA SEQ ID NO: 5 ou a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 6; - a SUMO-BliGO (nativa/WT) com a sequência de DNA SEQ ID NO: 9 ou a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 10; - a GST-BliGO-Mut com a sequência de DNA SEQ ID NO: 7 ou a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 8 e a SUMO-BliGO-Mut com a sequência de DNA SEQ ID NO: 11 ou a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 12 e - sequências de BliGO etiquetadas homólogas, conforme definido acima, em que a sequência de BliGO exibe pelo menos 70%.
14. Método, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o analito-alvo que se deseja detectar e/ou quantificar é o glifosato ou seus derivados que podem ser detectados ou quantificados com a mesma rede de enzima bioquímica do glifosato, e em que a pelo menos uma enzia da rede bioquímica encapsulada ou não em uma vesícula é a enzima 5-enolpiruvilchiquimato-3-fosfato (EPSP) sintase (EPSPS) (EC 2.5.1.19), a composição compreendendo ainda 3-fosfo-chiquimato e fosfoenolpiruvato (PEP).
15. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizado pelo fato de que a vesícula é selecionada a partir do grupo que consiste em vesículas unilamelares ou multilamelares, vesículas lipídicas são preferenciais, lipossomas ou fosfolipídios automontados ou vesículas formadas de polímeros ou copolímeros sintéticos, em que as ditas vesículas têm preferencialmente um diâmetro médio entre 0,05 µm a 500 µm, mais preferencialmente entre 0,1 µm a 100 µm.
16. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, caracterizado pelo fato de que as vesículas são aprisionadas em um gel polimérico poroso, de preferência selecionado a partir do grupo que consiste em gel polimérico poroso, de preferência selecionado a partir do grupo que consiste em alginato, quitosana, PVP (polivinilpirrolidona), PVA (álcool polivinílico), agarose, sefadex, sefarose, gel de sefacril e suas misturas.
17. Composição caracterizada pelo fato de que detecta a presença ou ausência e/ou quantifica a quantidade de pelo menos um analito- alvo em uma amostra, em que a dita composição compreende elementos bioquímicos formando uma rede bioquímica encapsulada ou não em uma ou em um conjunto de vesículas permeáveis ou não ao analito-alvo, em que a dita rede bioquímica compreende como elemento bioquímico pelo menos uma enzima selecionada a partir do grupo de: - glicina/glifosato oxidase (EC 1.4.3.19), de preferência a glicina/glifosato oxidase nativa (tipo selvagem/WT) que pode ser obtida como proteína recombinante, ou sequência homóloga da mesma com pelo menos 70% de identidade em relação à sequência de proteínas WT e que exibe atividade de glicina/glifosato oxidase; - 5-enolpiruvilchiquimato-3-fosfato (EPSP) sintase (EC 2.5.1.19); - a glicina oxidase (GO) da bactéria marinha Bacillus licheniformis ((BliGO) que foi clonada e que mostra pelo menos 62% de similaridade com a GO padrão de Bacillus subtilis, ou sequência de BliGO homóloga da mesma com pelo menos 70% de identidade em relação à sequência de proteínas BliGO WT e que exibe atividade de GO; - a glicina oxidase mutada (GO) da bactéria marinha Bacillus licheniformis ((BliGO) _SCF4 geneticamente modificada e contendo 6 mutações únicas de aminoácidos em comparação com a versão de tipo selvagem BliGO-WT ou BliGO-Mut; - uma enzima glifosato oxidase etiquetada, de preferência com uma etiqueta selecionada a partir do grupo que consiste em proteína de ligação à maltose (MBP), proteína de ligação à quitina (CBP), glutationa S- transferase (GST), tioredoxina (TRX), NUS A, ubiquitina (Ubiquitina), e etiquetas SUMO (pequeno modificador relacionado à ubiquitina), de preferência etiquetas SUMO e GST; e - a GST-BliGO (nativa/WT) com a sequência de DNA SEQ ID NO: 5 ou a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 6; - a SUMO-BliGO (nativa/WT) com a sequência de DNA SEQ ID NO: 9 ou a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 10; - a GST-BliGO-Mut com a sequência de DNA SEQ ID NO: 7 ou a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 8 e a SUMO-BliGO-Mut com a sequência de DNA SEQ ID NO: 11 ou a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 12 e - sequências de BliGO etiquetadas homólogas, conforme definido acima, em que a sequência de BliGO exibe pelo menos 70%.
18. Composição, de acordo com a reivindicação 17, caracterizada pelo fato de que o analito-alvo, os elementos bioquímicos, a rede bioquímica e as vesículas têm as características, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 16.
19. Kit ou dispositivo caracterizado pelo fato de que detecta a presença ou ausência e/ou quantifica a quantidade do pelo menos um analito- alvo em uma amostra, em que o dito kit compreende um recipiente contendo a composição, conforme definido na reivindicação 17, ou conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 16, aprisionada em um gel polimérico poroso, preferencialmente selecionada a partir do grupo que consiste em alginato, quitosana, PVP, PVA, agarose, sefadex, sefarose, gel de sefacril e suas misturas.
BR112021011887-0A 2018-12-20 2019-12-20 Sensor bioquímico biodegradável para determinar a presença e/ou o nível de pesticidas ou desreguladores endócrinos: método e composição BR112021011887A2 (pt)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP18214973.2 2018-12-20
EP18214973 2018-12-20
PCT/EP2019/086838 WO2020128069A1 (en) 2018-12-20 2019-12-20 Biodegradable biochemical sensor for determining the presence and/or the level of pesticides or endocrine disruptors: method and composition

Publications (1)

Publication Number Publication Date
BR112021011887A2 true BR112021011887A2 (pt) 2021-08-31

Family

ID=65033298

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
BR112021011887-0A BR112021011887A2 (pt) 2018-12-20 2019-12-20 Sensor bioquímico biodegradável para determinar a presença e/ou o nível de pesticidas ou desreguladores endócrinos: método e composição

Country Status (10)

Country Link
US (1) US20230242964A1 (pt)
EP (1) EP3899012A1 (pt)
JP (1) JP2022514594A (pt)
CN (1) CN113348251A (pt)
AU (1) AU2019408552A1 (pt)
BR (1) BR112021011887A2 (pt)
CA (1) CA3123764A1 (pt)
IL (1) IL284127A (pt)
WO (1) WO2020128069A1 (pt)
ZA (1) ZA202103890B (pt)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112630337A (zh) * 2020-12-17 2021-04-09 生态环境部华南环境科学研究所 一种土壤中多氯联苯和多溴联苯醚的协同检测方法
CN112964706A (zh) * 2021-02-09 2021-06-15 贵阳海关综合技术中心(贵州国际旅行卫生保健中心、贵阳海关口岸门诊部) 多孔Co3O4过氧化物酶应用于草甘膦快速比色检测方法
CN115746381A (zh) * 2022-12-12 2023-03-07 郑州轻工业大学 一种基于微气泡模板的多孔水凝胶制备方法

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5413915A (en) * 1988-07-12 1995-05-09 Resource Technologies Group, Inc. Method and sensor for detecting toxic chemical exposure effects and metabolic activation of carcinogenic chemical agents
US6406876B1 (en) 2000-04-26 2002-06-18 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Army Immobilized enzymes biosensors for chemical toxins
DE10111392A1 (de) * 2001-03-09 2002-09-12 Chromeon Gmbh Bioanalytisches Messverfahren unter Verwendung von Oxidasen
TWI301541B (en) 2005-11-01 2008-10-01 Dev Center Biotechnology Method for detecting pesticides ,bio-microsensor,and metood for reducing current noise
CN101082599B (zh) 2006-06-01 2010-10-13 五鼎生物技术股份有限公司 酶抑制剂的分析装置与方法
JP5212996B2 (ja) * 2011-03-04 2013-06-19 富山県 生体試料中のｌ−トリプトファン分析方法およびそれに用いるキット
GB201108259D0 (en) * 2011-05-17 2011-06-29 Cambridge Entpr Ltd Gel beads in microfluidic droplets
CN102553497B (zh) 2011-12-28 2014-04-02 北京化工大学 一种多功能复合印迹纳米球及其在农药残留检测中的应用
TWM479417U (zh) 2013-12-23 2014-06-01 Brilliant Sensing Technology 一種農藥殘留濃度檢測裝置
US9518974B2 (en) 2014-06-10 2016-12-13 Chung Ang University Industry Academic Cooperation Sensor system for detecting organophosphorus residues by inducing coagulation of gold nanoparticles
CN109074422B (zh) * 2016-04-13 2022-05-13 技能细胞公司 制备生物合成装置的方法及其在诊断中的用途

Also Published As

Publication number Publication date
IL284127A (en) 2021-08-31
CN113348251A (zh) 2021-09-03
US20230242964A1 (en) 2023-08-03
EP3899012A1 (en) 2021-10-27
AU2019408552A1 (en) 2021-07-01
WO2020128069A1 (en) 2020-06-25
ZA202103890B (en) 2022-05-25
JP2022514594A (ja) 2022-02-14
CA3123764A1 (en) 2020-06-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
BR112021011887A2 (pt) Sensor bioquímico biodegradável para determinar a presença e/ou o nível de pesticidas ou desreguladores endócrinos: método e composição
Zhang et al. Portable glucose meter: trends in techniques and its potential application in analysis
JP5124751B2 (ja) 生物学的又は化学的試料の評価
Khiyami et al. Plant pathogen nanodiagnostic techniques: forthcoming changes?
Dzyadevych et al. Early-warning electrochemical biosensor system for environmental monitoring based on enzyme inhibition
Tu et al. Combined effects of deltamethrin, temperature and salinity on oxidative stress biomarkers and acetylcholinesterase activity in the black tiger shrimp (Penaeus monodon)
Trivedi et al. Potentiometric biosensor for urea determination in milk
Zhang et al. Dual-mode supramolecular fluorescent probe for rapid and on-site detection of chlorpyrifos in the environment
Otles et al. Review on the application of nanobiosensors in food analysis
Ho et al. Procedures for preparing escherichia c oli o157: H7 immunoliposome and its application in liposome immunoassay
Esimbekova et al. Design of bioluminescent biosensors for assessing contamination of complex matrices
Nguyen-Ngoc et al. Synchronous-scan fluorescence of algal cells for toxicity assessment of heavy metals and herbicides
AU742846B2 (en) Particles
Chen et al. Nanozyme based on ZIF-8 for the colorimetric detection of sulfonamides in cow milk
Su et al. Bioluminescent detection of the total amount of viable Gram-positive bacteria isolated by vancomycin-functionalized magnetic particles
Verma et al. Advancement towards microfluidic approach to develop economical disposable optical biosensor for lead detection
Botsford A comparison of ecotoxicological tests
EP1563296B1 (en) Biosensors, and method and kits for using same
JP2009136205A (ja) 細胞内ａｔｐ測定方法
Drake et al. Single cell glutamate analysis in Aplysia sensory neurons
Łukaszewicz et al. Unicellular cyanobacteria degrade sulfoxaflor to its amide metabolite of potentially higher aquatic toxicity
Guan Colorimetric screening device for pesticide analysis based on the liposome
Tuantranont et al. Nanomaterials in agricultural and food applications
US20230091126A1 (en) Receptor-based biosensors
RU2175352C1 (ru) Способ определения концентрации инсектицида метафоса и продукта гидролиза фосфорорганических нитроароматических инсектицидов пара-нитрофенола в водной среде