BR112021011174A2 - Folha de nitrocelulose compreendendo imunoglobulinas imobilizadas e antígenos baseados em de lipídeos e uso dos mesmos - Google Patents

Abstract

FOLHA DE NITROCELULOSE COMPREENDENDO IMUNOGLOBULINAS IMOBILIZADAS E ANTÍGENOS BASEADOS EM DE LIPÍDEOS E USO DOS MESMOS. A presente invenção se refere a uma folha de nitrocelulose que compreende anticorpos imobilizados e antígenos baseados em lipídeos. A presente invenção também se refere a um kit, compreendendo a referida folha de nitrocelulose. A invenção também se refere ao uso da referida folha, em particular em um método para a detecção de anticorpos indicativos de uma infecção.

Description

“FOLHA DE NITROCELULOSE COMPREENDENDO IMUNOGLOBULI- NAS IMOBILIZADAS E ANTÍGENOS BASEADOS EM DE LIPÍDEOS E USO DOS MESMOS”

[0001] A presente invenção se refere a uma folha de nitrocelulose que compreende anticorpos imobilizados e antígenos baseados em lipídeos. A presente invenção também se refere a um kit, compreendendo a referida folha de nitrocelulose. A invenção também se refere ao uso da referida folha, em particular em um método para a detecção de anticorpos indicativos de uma infecção.

Introdução

[0002] Muitos agentes infecciosos, como bactérias, vírus e fungos, produzem antígenos que invocam uma resposta imune do indivíduo infectado. Essa resposta imune é acompanhada pela produção de anticorpos específicos contra esses antígenos. Esses anticorpos são, portanto, indicativos de uma infecção por um agente infeccioso.

[0003] Muitos antígenos são expostos ou excretados a partir da super- fície externa do agente infeccioso. Uma classe particular importante de antígenos são os antígenos baseados em de lipídeos, porque muitos deles são capazes de invocar uma resposta imune potente.

Sumário da invenção

[0004] A presente invenção faz uso da resposta imune potente invo- cada por antígenos de lipídeos, usando-os para fins de diagnóstico. Em particular, os antígenos de lipídeos imobilizados são usados na invenção para detectar anticorpos em amostras derivadas a partir de indivíduos suspeitos de estarem infectados com um agente infeccioso. Dessa forma, torna-se possível diagnosticar o indivíduo com uma determinada infecção.

[0005] O diagnóstico de doenças infecciosas frequentemente envolve testes complicados, caros e demorados e muitas vezes requer laboratórios especiali- zados.

[0006] Além disso, os testes de laboratórios convencionais, como o ELISA, requerem grandes quantidades de antígenos, que muitas vezes são difíceis de purificar ou sintetizar nessas quantidades. É, portanto, desejável fornecer um teste que requeira menos antígenos.

[0007] Além disso, os testes convencionais apenas diagnosticam se um indivíduo está infectado com um agente infeccioso específico ou não, mas não podem dar uma indicação do estágio da infecção.

[0008] A presente invenção visa superar esses problemas.

[0009] Em um primeiro aspecto, a invenção refere-se a uma folha de nitrocelulose que compreende, imobilizada na mesma em posições separadas: imuno- globulina G; imunoglobulina M; e pelo menos um antígeno baseado em lipídeos capaz de se ligar a anticorpos produzidos em resposta à infecção por um agente infeccioso em um indivíduo.

[0010] Em um segundo aspecto, a invenção refere-se a um kit, com- preendendo a folha de nitrocelulose, definida de acordo com o primeiro aspecto da invenção, e ainda compreendendo: um recipiente contendo um anticorpo secundário anti-IgG com um marcador de detecção conjugado; e um recipiente contendo um anti- corpo secundário anti-IgM com um marcador de detecção conjugado.

[0011] Em um terceiro aspecto, a invenção refere-se a um método pa- ra detecção de anticorpos indicativos de uma infecção que compreende: expor pelo menos uma folha definida de acordo com o primeiro aspecto da invenção a uma amos- tra derivada de um indivíduo suspeito de ter uma infecção; determinar a presença de anticorpos primários a partir da referida amostra ligada aos antígenos imobilizados na folha por uma incubação com um anticorpo secundário com um marcador de detecção conjugado selecionado a partir do grupo que compreende anticorpo secundário anti- IgM e anticorpo secundário anti-IgG; e detectar a ligação do anticorpo secundário aos referidos anticorpos primários ligados aos antígenos imobilizados na folha, em que a ligação dos referidos anticorpos primários ao anticorpo secundário leva a um sinal po- sitivo, em que um sinal positivo no caso de uma incubação com um anti-IgM secundá- rio o anticorpo é indicativo de uma infecção em estágio inicial e um sinal positivo no caso de uma incubação com um anticorpo secundário anti-IgG é indicativo de uma infecção em estágio posterior.

[0012] Em um quarto aspecto, a invenção também se refere ao uso da folha definida de acordo com o primeiro aspecto para discernir entre uma infecção em estágio inicial e uma infecção em estágio posterior e/ou para discernir entre uma infec- ção ativa e uma inativa.

[0013] O inventor descobriu que é possível imobilizar antígenos deri- vados de lipídeos e imunoglobulinas na mesma folha de nitrocelulose. A resposta imu- ne potente aos antígenos de lipídeos possibilita a obtenção de fortes sinais de detec- ção e a obtenção de resultados confiáveis. É importante ressaltar que a imobilização dos antígenos de lipídeos na nitrocelulose requer apenas uma quantidade limitada de antígenos, o que é importante porque a purificação e a síntese de antígenos costu- mam ser demoradas e caras. Por exemplo, apenas 0,2 ng de antígenos imobilizados é mais do que suficiente para obter um bom sinal, enquanto uma técnica convencional como ELISA requer 250 µg por placa de 96 cavidades. A presente invenção, portanto, fornece uma redução importante da quantidade necessária de antígenos.

[0014] As folhas são fáceis de usar em um método de detecção de an- ticorpos indicativos de uma infecção, sem a necessidade de testes complicados, caros e demorados e de laboratórios especializados. A este respeito, o kit da invenção com- preende partes para realizar o método de definido de acordo com a invenção sem a necessidade de equipamento caro e especializado e o médico, tal como o pesquisa- dor, precisaria apenas de equipamento de laboratório padrão. Isso torna a invenção aplicável para diagnóstico, mas também adequada para ser usada para fins de pes- quisa não direcionados ao diagnóstico de uma infecção.

[0015] É importante ressaltar que a presente invenção também torna possível determinar o estado da infecção. IgM é o primeiro anticorpo a aparecer em resposta à exposição de um indivíduo infectado a um antígeno a partir de um agente infeccioso. A presença de anticorpos IgM contra antígenos de agentes infecciosos indica, portanto, um estágio inicial de infecção com esses agentes infecciosos. Por outro lado, os anticorpos IgG são gerados após a maturação da resposta do anticorpo e participam predominantemente na resposta imune secundária posterior. A presença de anticorpos IgG contra antígenos de agentes infecciosos indica, portanto, um estágio posterior de infecção com esses agentes infecciosos. A presente invenção torna assim possível determinar se há uma infecção de estágio inicial ou uma infecção de estágio posterior em um ensaio elegante usando apenas um tipo de substrato de teste, a sa- ber, uma folha de nitrocelulose. Isso torna possível determinar a imunoglobulina G (IgG) e/ou imunoglobulina M (IgM) produzida contra infecções causadas por agentes infecciosos e determinar o estado da infecção em um único ensaio e usando equipa- mento de laboratório padrão.

Descrição detalhada da invenção

[0016] A presente invenção é baseada no fornecimento de um teste fácil de usar para a presença de anticorpos indicativos de uma infecção usando uma folha de nitrocelulose que compreende, imobilizada na mesma em posições separa- das: imunoglobulina G; imunoglobulina M; e pelo menos um antígeno baseado em lipídeos capaz de se ligar a anticorpos produzidos em resposta à infecção por um agente infeccioso em um indivíduo.

[0017] A exposição da folha a uma amostra derivada a partir de um indivíduo suspeito de ter uma infecção por um agente infeccioso específico leva à liga- ção aos antígenos imobilizados se esses antígenos forem derivados a partir de ou baseados em antígenos desse agente infeccioso específico. A ligação destes anticor- pos pode ser detectada usando um anticorpo secundário com um marcador de detec- ção conjugado com o mesmo, tal como um conjugado de enzima repórter anti-Ig. Tal conjugado compreende uma porção de marcador de detecção e uma porção capaz de reconhecer imunoglobulinas (anticorpos) ligadas aos antígenos imobilizados no subs- trato. Em outras palavras, esses conjugados são capazes de reconhecer imunoglobu- linas e são capazes de gerar um sinal detectável. No caso de, de fato, anticorpos pri- mários contra o antígeno imobilizado estarem presentes na amostra, um sinal será fornecido pelo marcador de detecção, como por exemplo por uma enzima repórter se o marcador for uma enzima repórter. Um sinal positivo no caso de uma incubação com conjugado de anticorpo secundário anti-IgM é indicativo de uma infecção em estágio inicial, enquanto, por outro lado, um sinal positivo no caso de uma incubação com um anti-IgG é indicativo de uma infecção em estágio posterior. O IgG e o IgM imobilizado na folha servem como controles positivo/negativo.

[0018] No contexto da invenção, os anticorpos (IgG, IgM, IgA produzi- dos em resposta à infecção por um agente infeccioso em um indivíduo podem ser considerados anticorpos primários, enquanto, por outro lado, o anti-Ig (anti- imunoglobulina) com detecção conjugada o marcador funciona como uma porção de anticorpo secundário que pode se ligar ao anticorpo primário. No estado da técnica da imunologia, anticorpos primários e secundários são expressões comuns para dois gru- pos de anticorpos que são classificados com base em se eles se ligam a antígenos ou proteínas diretamente (estes são anticorpos primários) ou têm como alvo outro anti- corpo (primário) que por sua vez está ligado a um antígeno ou proteína (estes últimos anticorpos são anticorpos secundários).

[0019] Enquanto os anticorpos produzidos em resposta a uma infec- ção em um indivíduo podem se ligar aos antígenos imobilizados na folha de nitrocelu- lose da invenção e, como tal, podem ser considerados como anticorpos primários, os conjugados anti-Ig se ligam aos anticorpos primários por meio de suas porções de anticorpos secundários e fornecem detecção e amplificação de sinal por meio de seu marcador de detecção, como uma porção de enzima repórter. No contexto da inven- ção, os anticorpos secundários podem se ligar aos anticorpos primários, que estão diretamente ligados ao (s) antígeno (s) imobilizado (s) no substrato de nitrocelulose. A este respeito, um anticorpo secundário anti-IgM é um anticorpo que reconhece e se liga especificamente a IgM, um anticorpo secundário anti-IgG é um anticorpo que re- conhece e se liga especificamente a IgG e um anticorpo secundário anti-IgA é um an- ticorpo que reconhece e se liga especificamente IgA.

[0020] A título de explicação, em um procedimento de imuno marca- ção, o domínio Fab do anticorpo primário se liga ao antígeno imobilizado e expõe seu domínio Fc ao anticorpo secundário com a marcação de detecção. Como resultado, o domínio Fab do anticorpo secundário pode se ligar ao domínio Fc do anticorpo primá- rio. Como o domínio Fc é constante na mesma classe de animais (como, por exemplo, na classe de humanos), apenas um tipo de anticorpo secundário será necessário para se ligar a muitos tipos de anticorpos primários em uma classe de animais. Isso permite o uso de apenas um tipo de anticorpo secundário para detectar vários tipos de anticor- pos primários. Os anticorpos secundários estão, portanto, comumente disponíveis co- mercialmente. Além disso, vários anticorpos secundários podem se ligar a um único anticorpo primário, o que aumenta a sensibilidade e a amplificação do sinal.

[0021] O marcador de detecção conjugado ao anticorpo secundário, por sua vez, permite a detecção de ligação. Os anticorpos secundários podem ser conjugados com enzimas repórter, tais como peroxidase de rábano (HRP) ou fosfatase alcalina (AP); ou corantes fluorescentes, tais como isotiocianato de fluoresceína (FITC), derivados de rodamina, corantes Alexa Fluor, etc; ou outros marcadores de detecção a serem usados em várias aplicações, incluindo biotina. A este respeito, o marcador de detecção pode ser uma enzima repórter, como peroxidase de rábano (HRP) ou fosfatase alcalina (AP); ou corantes fluorescentes, tais como isotiocianato de fluoresceína (FITC), derivados de rodamina, corantes Alexa Fluor; ou outras moléculas adequadas para fornecer um sinal em um ensaio imunológico, como disponível na técnica.

[0022] Em uma modalidade preferencial, o anticorpo secundário é um conjugado de enzima repórter anti-Ig. Neste caso, o marcador de detecção é uma en- zima repórter.

[0023] Se uma incubação com um conjugado anti-IgM como anticorpo secundário for realizada, o IgM imobilizado na folha serve como um controle positivo: um sinal positivo para a ligação do conjugado anti-IgM ao IgM imobilizado mostra que o teste funciona, enquanto um sinal menor ou ausente para a ligação do conjugado anti-IgM ao IgG imobilizado mostra que o sinal é específico para a ligação a IgM.

[0024] Por outro lado, se uma incubação com um conjugado anti-IgG for realizada, o IgG imobilizado na folha serve como um controle positivo: um sinal positivo para a ligação do conjugado anti-IgG ao IgG imobilizado mostra que o teste funciona, enquanto um sinal menor ou ausente para a ligação do conjugado anti-IgG ao IgM imobilizado mostra que o sinal é específico para a ligação a IgG.

[0025] No caso de uma incubação com um conjugado de enzima re- pórter anti-IgM ser realizada, o IgM imobilizado na folha serve como um controle posi-

tivo: um sinal positivo para a ligação do conjugado anti-IgM ao IgM imobilizado mostra que o teste funciona, enquanto um sinal menor ou ausente para a ligação do conjuga- do anti-IgM ao IgG imobilizado mostra que o sinal é específico para a ligação a IgM.

[0026] Por outro lado, se uma incubação com um conjugado de enzi- ma repórter anti-IgG for realizada, o IgG imobilizado na folha serve como um controle positivo: um sinal positivo para a ligação do conjugado anti-IgG ao IgG imobilizado mostra que o teste funciona, enquanto um sinal menor ou ausente para a ligação do conjugado anti-IgG ao IgM imobilizado mostra que o sinal é específico para a ligação a IgG.

[0027] Em uma modalidade, a folha de nitrocelulose pode ainda com- preender imunoglobulina A imobilizada na mesma. Isso torna possível realizar um tes- te que determina a presença de anticorpos a partir da amostra ligada aos antígenos imobilizados na folha por uma incubação com um anticorpo secundário selecionado a partir do grupo que compreende o conjugado anti-IgM, um conjugado anti-IgG e um conjugado anti-IgA. Em particular, estes podem ser selecionados a partir do grupo que compreende conjugado de enzima repórter anti-IgM, um conjugado de enzima repórter anti-IgG e um conjugado de enzima repórter anti-IgA. IgA é a principal imunoglobulina encontrada nas secreções de mucosas, incluindo secreções a partir do trato genituri- nário, trato gastrointestinal, próstata e epitélio respiratório, como escarro. Portanto, esta modalidade pode ser particularmente adequada para fornecer uma possibilidade adicional para testar infecções que afetam as membranas mucosas. Por exemplo, isto seria em particular vantajoso para testar indivíduos suspeitos de infecção por tubercu- lose, porque as infecções por tuberculose levam a altas concentrações de anticorpos na expectoração. Se nesta modalidade uma incubação com um conjugado anti-IgA é realizada, neste caso o IgA imobilizado na folha serve como um controle positivo: um sinal positivo para a ligação do conjugado anti-IgA ao IgA imobilizado mostra que o teste funciona, enquanto um sinal menor ou ausente para a ligação do conjugado anti- IgA ao IgM e IgA imobilizado mostra que o sinal é específico para a ligação a IgA. Além da vantagem particular para amostras baseadas em secreções de mucosas, o teste de anticorpos IgA na amostra também pode fornecer uma melhoria adicional, confirmando os resultados obtidos a partir do teste em outras folhas para anticorpos

IgM e/ou IgG. No caso de se considerar o teste de anticorpos de IgA, o kit de acordo com a invenção pode ainda compreender um recipiente contendo um conjugado anti- IgA como anticorpo secundário, preferencialmente um conjugado de enzima repórter anti-IgA.

[0028] A amostra usada para os propósitos da invenção pode ser qualquer amostra que possa conter anticorpos contra antígenos de um agente infecci- oso. Em uma modalidade, a amostra é uma amostra derivada de sangue. A amostra pode ser uma amostra de sangue integral, uma amostra de plasma ou uma amostra de soro. O soro do sangue é o plasma do sangue sem fatores de coagulação e é pre- ferencial como plasma. A palavra plasma neste pedido pode, portanto, também referir- se a soro (sangue). O soro é preferencial porque contém menos materiais diferentes do que o plasma do sangue, o que pode levar a interações inespecíficas ou atividade biológica indesejada. Além disso, o soro pode ter uma viscosidade mais baixa do que o plasma sanguíneo. O uso de soro, portanto, pode evitar a necessidade de diluir uma amostra, o que economiza tempo e materiais. Em outra modalidade, a amostra pode ser derivada de secreções de mucosas. No caso de a amostra ser uma amostra de sangue integral, a amostra pode ser pré-filtrada ou separada em plasma ou soro, se desejado. Um filtro adequado para essa etapa de pré-filtragem é um filtro de 0,2 mí- cron. Em princípio, tal etapa de filtração não seria necessária para os propósitos da invenção.

[0029] Pode ser desejável diluir a amostra antes de incubá-la com uma folha de acordo com a invenção. Se uma amostra de sangue integral não for filtrada suficientemente ou se a situação física do paciente exigir isso, pode ser desejável diluir a amostra de sangue integral ou plasma ou soro. As palavras plasma ou soro neste pedido podem, portanto, também referir-se a plasma ou soro diluído. Também pode ser desejável diluir amostras derivadas de secreções de mucosas. A diluição pode ser realizada com qualquer diluente adequado, por exemplo, um tampão baseados em PBS, como um tampão de bloqueio. Opcionalmente, um detergente pode ser adicionado em baixa concentração ao sangue/plasma/soro para evitar a aderência dos componentes.

[0030] A amostra pode ser opcionalmente deslipidada antes do uso, por exemplo, removendo ácidos graxos, tais como colesterol, se necessário. O colesterol pode levar a sinais incorretos devido à reatividade cruzada.

[0031] O indivíduo a partir do qual a amostra é derivada pode ser um humano ou outro animal. A este respeito, a invenção é adequada para propósitos médicos e veterinários e, como mencionado acima, também para propósitos de pesquisa que não visam o diagnóstico de uma infecção. Em uma modalidade adequada, a amostra é derivada a partir de um ser humano. Neste caso, os anticorpos secundários são conjugados de Ig anti-humana, tais como conjugados de enzima repórter anti-Ig humana. Neste caso, os anticorpos secundários reconhecem e se ligam à imunoglobulina humana (Ig), por exemplo IgG, IgM ou IgA humana.

[0032] Os referidos conjugados de enzima repórter anti-humano são preferencialmente selecionados a partir de conjugados de peroxidase de rábano (HRP) e fosfatase alcalina (AP). Neste caso, a etapa de detecção da ligação de anti- corpos na referida amostra aos antígenos imobilizados na folha envolve o uso de con- jugados de enzima repórter anti-Ig selecionados a partir de conjugados de peroxidase de rábano (HRP) e fosfatase alcalina (AP). Estes conjugados são bem conhecidos e conjugados padrão para visualizar a ligação de anticorpos. Esses conjugados são co- mumente usados como sondas de detecção devido à sua simplicidade, sensibilidade e aplicações de amplo espectro. A peroxidase de rábano (HRP) e a fosfatase alcalina (AP) podem ser usadas para detectar proteínas alvo por meio de saídas cromogêni- cas, quimioluminescentes ou fluorescentes. Essas leituras podem ser realizadas por qualquer meio conhecido pelo versado na técnica.

[0033] Os antígenos baseados em lipídeos imobilizados na folha de nitrocelulose podem ser antígenos nativos ou antígenos modificados que são purifica- dos a partir de um agente infeccioso ou sintetizados com base em antígenos de agen- tes infecciosos. A este respeito, deve ser entendido que o termo "antígeno" abrange qualquer molécula que é capaz de se ligar especificamente a um anticorpo, indepen- dentemente de ocorrer na natureza ou se for baseado em tal antígeno e sintetizado.

[0034] Os antígenos imobilizados na folha de nitrocelulose são ade- quadamente derivados a partir de agentes infecciosos, incluindo bactérias, micoplas- ma, fungos, parasitas, protozoários, vírus, etc. ou com base nesses antígenos, se sin- tetizados. Esses agentes infecciosos expõem antígenos baseados em lipídeos ao sis- tema imunológico do indivíduo e invocam a produção de imunoglobulinas.

[0035] Vírus bem conhecidos incluem vírus da hepatite A (HAV), vírus da hepatite B (HBV), vírus da hepatite C (HCV), vírus da hepatite D (HDV), vírus da hepatite G/vírus GB-C (HGV/GBV-C), Vírus da imunodeficiência tipos 1 e 2 humano (HIV-1/2), vírus linfotrópico de células T humanas tipos I e II (HTLV-I/II), citomegalovírus (CMV), vírus Epstein-Barr (EBV), vírus TT (TTV), Herpesvírus Humano tipo 6 (HHV-6), Vírus SEN (SEN-V) e Parvovírus Humano (HPV-B19).

[0036] As bactérias incluem, por exemplo, Treponema Pallidum (TP, o agente da sífilis), Yersinia Enterocolitica e espécies de Staphylococcus e Streptococcus (agentes comuns de contaminação bacteriana), Borrelia Burgdorferi (agente da doença de Lyme) Pseudomonas spp, Neisseria gonorrhea, Chlamydia, incluindo C. pneumoniae, C. trachomatis, C. psittaci e C. pecorum, Helicobacter, incluindo H. pylori e H. felis, bactérias periodontais incluindo P. gingivalis e P. sanguis. Micobactérias, como Mycobacterium tuberculosis, etc.

[0037] Os parasitas incluem, por exemplo, espécies de Plasmodium (malária), Trypanosoma Cruzi (doença de Chagas) e Babesia Microti (babesiose).

[0038] Os fungos incluem Candida, fungos similares a leveduras, como Cryptococcus, Trichophyton, etc.

[0039] É particularmente preferencial que os lipídeos sejam derivados a partir de ou baseados em antígenos baseados em lipídeos bacterianos porque as bactérias expõem muitos antígenos derivados de lipídeos na sua membrana celular, por exemplo a membrana externa. A este respeito, a infecção pode ser causada por um agente infeccioso bacteriano.

[0040] Em uma modalidade preferencial, a folha de nitrocelulose com- preende imobilizados na mesma uma pluralidade de diferentes antígenos baseados em lipídeos capazes de se ligar a anticorpos produzidos em resposta à infecção por um agente infeccioso em um indivíduo. Esta pluralidade de antígenos é preferencial- mente derivada ou baseada no mesmo agente infeccioso. Em outras palavras, é prefe- rencial que os antígenos baseados em lipídeos da pluralidade de diferentes antígenos baseados em lipídeos são, cada um, capaz de se ligar a anticorpos produzidos em resposta à infecção pelo mesmo agente infeccioso. Nesta modalidade, o uso de uma pluralidade de diferentes antígenos baseados em de lipídeos, em particular uma plura- lidade de diferentes tipos de antígenos baseados em de lipídeos, aumenta a confiabili- dade de um resultado de teste positivo, devido ao risco de identificação falso-positiva da presença de anticorpos invocados por a infecção é diminuída.

[0041] Alternativamente, a pluralidade de antígenos é derivada ou ba- seada nos diferentes agentes infecciosos. Isso permite o diagnóstico de infecção por diferentes agentes infecciosos usando apenas um único kit.

[0042] Além da diferença na ocorrência de vários tipos de imunoglobulinas durante vários estágios de anticorpos de infecção no indivíduo infectado, também o agente infeccioso pode exibir diferentes antígenos em diferentes estágios da infecção. É, portanto, preferencial que a referida pluralidade de diferentes antígenos baseados em de lipídeos, pelo menos um dos referidos antígenos baseados em de lipídeos é capaz de se ligar a anticorpos indicativos de uma infecção em estágio inicial e pelo menos um outro dos referidos antígenos baseados em de lipídeos é capaz de se ligar a anticorpos indicativos de uma infecção em estágio posterior. Aumenta a confiabilidade do resultado do teste em relação ao estado da infecção. Exemplos de tais antígenos serão discutidos em mais detalhes abaixo.

[0043] Em uma modalidade preferencial particular, o referido antígeno ou antígenos é/são derivados a partir de ou com base em antígeno(s) baseados em de lipídeos micobacterianos. A infecção a ser testada pode, portanto, ser causada por um Mycobacterium tuberculosis.

[0044] O Mycobacterium tuberculosis é uma espécie bacteriana patogênica da família Mycobacteriaceae e o agente causador da maioria dos casos de tuberculose (TB). A tuberculose ainda é uma das principais causas de morte em muitos países de baixa e média renda. Além disso, cada vez mais casos são relatados de TB resistente a multi fármacos. Uma forma confiável e rápida de diagnosticar a tuberculose, tal como fornecida pela presente invenção, é, portanto, de extrema importância.

[0045] Em uma modalidade preferencial, os referidos antígenos mico- bacterianos compreendem antígenos derivados do ácido micólico ou em que o referido antígeno é um antígeno derivado do ácido micólico, opcionalmente modificado com um grupo funcional para permitir a imobilização na folha de nitrocelulose.

[0046] Os antígenos derivados de ácido micólico, conforme referido no presente pedido, podem ser derivados a partir de micobactérias selecionadas a partir de micobactérias virulentas e patogênicas. O termo antígeno derivado de ácido micóli- co deve ser entendido como um composto que compreende um resíduo de ácido mi- cólico que é capaz de se ligar a anticorpos anti-ácido micólico. Preferencialmente, o antígeno de ácido micólico é derivado de Mycobacterium tuberculosis. O referido antí- geno derivado de ácido micólico pode ser pelo menos um selecionado a partir do gru- po de ácido micólico, fator de cordão, ácido micólico quimicamente modificado, fator de cordão quimicamente modificado, um derivado de ácido micólico sintético, um deri- vado de fator de cordão sintético.

[0047] O antígeno derivado de ácido micólico pode ser adequadamen- te selecionado a partir de um ou mais dentre os ácidos micólicos obtidos a partir de fontes naturais, ácidos micólicos preparados sinteticamente, ácidos micólicos conten- do enxofre, análogos estruturais de ácidos micólicos e ésteres de cera de ácido micóli- co. O antígeno derivado do ácido micólico também inclui sais e/ou ésteres desses de- rivados.

[0048] Fontes naturais de derivados de ácido micólico incluem as pa- redes celulares de micobactérias, como Mycobacterium tuberculosis, incluem misturas de diferentes classes de compostos e diferentes homólogos de ácido micólico, fre- quentemente como derivados nos quais estão ligados à parede celular.

[0049] Pode ser preferencial usar ácidos micólicos preparados sinteti- camente porque então pode ser determinado exatamente qual e qual quantidade de um determinado derivado é usado.

[0050] Portanto, a fim de ser capaz de fornecer uma detecção com al- ta confiabilidade e resultados reproduzíveis, é preferencial usar derivados de ácido micólico semi-sintéticos ou ainda mais preferenciais sintéticos que são idênticos ou estreitamente análogos a compostos únicos encontrados em misturas naturais.

[0051] Ésteres de derivados de ácido micólico também podem ser usados, como ésteres de álcoois (por exemplo, álcoois monohídricos e álcoois polihí- dricos) e ésteres de açúcar. Os ésteres de açúcar são particularmente preferenciais. Os ésteres de açúcar incluem ésteres com um monossacarídeo, dissacarídeo ou um oligossacarídeo. Os referidos sacarídeos podem incluir convenientemente unidades de açúcar com base em hexoses e/ou pentoses. Os ésteres de glicose são exemplos adequados desses ésteres. Outros ésteres de açúcar adequados são ésteres de trea- lose, incluindo monomicolatos de trealose e dimicolatos de trealose. Por exemplo, fato- res de cordão, que são monomicolatos de trealose ou dimicolatos de trealose, são exemplos bem conhecidos de ésteres de açúcar que são adequados. Esses compos- tos ocorrem na natureza como misturas complexas de diferentes classes de ácidos micólicos e de diferentes homólogos dentro de cada classe.

[0052] Porque é difícil estabelecer a identidade de fatores de cordão presentes em produtos naturais e separar espécies moleculares individuais, é prefe- rencial usar derivados de ácido micólico semi-sintéticos ou mais preferencialmente sintéticos para os propósitos da invenção. Além disso, sabe-se que a estrutura da uni- dade de ácido micólico afeta a atividade biológica do fator de cordão. Derivados semi- sintéticos adequados incluem fatores de cordão semi-sintéticos que podem ser prepa- rados ligando ácidos micólicos ao grupo de açúcar. No entanto, esses fatores semi- sintéticos ainda contêm misturas de homólogos diferentes. Portanto, derivados de áci- do micólico particularmente adequados para uso no contexto da presente invenção são fatores de cordão sintéticos, por exemplo, os fatores de cordão sintéticos descritos em WO 2010/08667, isto é, compostos de fórmula (M)x (S)y (M')z, em que x é a partir de 1 a 6, y é a partir de 1 a 12, z é a partir de 0 a 10, cada M e cada M’ é independen-

temente um resíduo de ácido micólico incluindo uma porção de β-hidroxiácido e cada S é uma unidade monossacarídica.

[0053] Sais de derivados de ácido micólico também podem ser usa- dos, por exemplo, sais de amônio, ou sais de metais alcalinos e alcalino-terrosos. Áci- dos micólicos contendo enxofre e/ou ésteres dos mesmos ou sais também podem ser usados. Estes compostos são análogos dos compostos naturais de ácido micólico con- tendo enxofre. Os ésteres de cera de ácido micólico compreendem um grupo ciclopro- pila ou um alqueno e um grupo éster interno e podem ser isolados a partir de fontes naturais ou preparados sinteticamente.

[0054] Compostos adequados para uso no método de detecção da in- venção são descritos inter alia em WO 2016/024116.

[0055] Exemplos adequados de ácidos micólicos sintéticos são mostrados na Fig. 1, Fig. 2 e Fig. 3, opcionalmente para modificados com um grupo funcional para imobilização na nitrocelulose. A este respeito, este pedido também deve ser entendido como descrevendo o uso de um ou mais dos antígenos da Fig. 1, Fig. 2 e Fig. 3 em combinação com qualquer substrato diferente de nitrocelulose para o diagnóstico de tuberculose.

[0056] Outro antígeno micobacteriano adequado pode ser um antígeno manosil fosfocetídeo. Tal antígeno de manosil fosfocetídeo pode ser um composto representado pela seguinte fórmula (I), (I) em que Y é um número inteiro entre 1 e 10, X + é um cátion ou ausente, e R é um grupo hidrocarboneto, em que o antígeno é opcionalmente modificado com um ou mais grupos funcionais que permitem a imobilização na referida folha de nitrocelulose e enantiômeros, diastereoisômeros, e as misturas dos mesmos.

No caso de X+ ser um cátion, é preferencial que seja um próton ou cátion metálico, como um cátion de Na ou K.

É preferencial que a cauda hidrofóbica do antígeno de manosil fosfocetídeo seja bastante curta.

Isso torna os antígenos mais solúveis em soluções aquosas e, portanto, mais fáceis de usar.

A hidrofilicidade aumentada que resulta a partir de cadeias de hidrocarbonetos relativamente curtas torna a superfície de nitrocelulose na qual os antígenos são imobilizados mais hidrofílica.

Devido a isso, as interações de anticorpos no antígeno ocorrem mais facilmente e a velocidade de detecção será aumentada.

Além disso, será mais fácil sintetizar os antígenos caso sejam usados antígenos sintéticos.

Na fórmula (I) Y é preferencialmente um número inteiro entre 3 e 9, preferencialmente entre 4 e 8, mais preferencialmente em que Y é 5. Na fórmula (I) R é preferencialmente um grupo alquila.

É preferencial que R seja um C1-C15 alquila, preferencialmente um C5 alquila ou um C7 alquila, preferencialmente em que R é um n-C5-alquila ou um n-C7- alquila.

É preferencial que R seja um n-C7-alquila.

Na fórmula (I), Y pode ser modificado com um ou mais grupos funcionais que permitem a imobilização na referida folha de nitrocelulose.

Alternativamente, ou em adição na fórmula (I), R pode ser modificado com um ou mais grupos funcionais que permitem a imobilização na referida folha de nitrocelulose.

Em relação a tais grupos funcionais, é preferencial que os referidos antígenos de manosil fosfocetídeo tenham uma modificação alceno ou alcino na extremidade da cauda hidrofóbica.

É preferencial que o referido antígeno de manosil fosfocetídeo seja um β-manosil fosfomicocetídeo, opcionalmente modificado com um ou mais grupos funcionais que permitem a imobilização na referida folha de nitrocelulose.

Um β-manosil fosfomicocetídeo altamente preferencial é

(II)

em que X+ é um cátion (tal como cátion metálico, por exemplo, K + ou Na+ ou próton) ou ausente e R é n-C7H15 ou n-C5H11, opcionalmente modificado com um ou mais grupos funcionais que permitem imobilização em uma folha de nitrocelulose e enantiômeros, diastereoisômeros e as misturas dos mesmos. É altamente preferencial que R seja n-C7H15 uma vez que esta é a forma que normalmente ocorre em Mycobacterium tuberculosis. Os antígenos de β- manosil fosfomicocetídeo levam a uma melhora significativa no que diz respeito à sensibilidade de detecção de marcadores para tuberculose. Uma ligação muito elevada de anticorpos específicos da tuberculose a estes antígenos é detectada no caso de amostras derivadas de pacientes cujo esfregaço foi testado positivo. Como as moléculas de β-manosil fosfomicocetídeo existem no Mycobacterium tuberculosis, elas podem ser isoladas a partir da bactéria. Neste caso, o antígeno natural é usado e modificado para propósitos de imobilização, se desejado. Os níveis de β-manosil fosfomicocetídeos em micobactérias são bastante baixos, muito mais baixos do que, por exemplo, os níveis de ácido micólico. Portanto, é mais vantajoso sintetizar moléculas de β- manosil fosfomicocetídeo, totalmente quimicamente ou com a ajuda de um organismo de produção por meio de expressão transgênica. Isso economiza custos consideráveis. É, portanto, preferencial que o β-manosil fosfomicocetido seja sintético. A síntese pode ser realizada, por exemplo, conforme descrito em Van Summeren et al., 2006. Os antígenos de manosil fosfocetídeo definidos acima têm um desempenho particularmente bom no caso de serem testadas amostras derivadas de pessoas com esfregaço positivo, que têm uma infecção por TB em estágio posterior. Antígenos de manosil fosfocetídeo são, portanto, exemplos de antígenos baseados em de lipídeos capazes de se ligar a anticorpos indicativos de uma infecção em estágio posterior.

[0057] Outro antígeno micobacteriano adequado pode ser um antígeno de diacil glicolipídeo. O termo "antígenos de diacil glicolipídeos" neste pedido se refere a estruturas de trealose diacilada, conforme definido nas seguintes estruturas (III) a (XI). Estes diacil glicolipídeos, que são na verdade antígenos de trealose diacilada e, portanto, também podem ser referidos como antígenos de trealose diacilada, ou derivados das mesmas podem ser definidos como um composto representado pela seguinte fórmula (III),

(III) em que: R2 e R3, idênticos ou diferentes, são independentemente escolhidos a partir de H, SO3H, SO3- ou SO3-/M+, em que M+ é um cátion, preferencialmente um cátion metálico, tal como Na+ ou K+; R2’ and R3’, idênticos ou diferentes, são grupos de acila, em que o antígeno é opcionalmente modificado com um ou mais grupos funcionais que permitem a imobilização em uma folha de nitrocelulose.

Os diacil glicolipídeos como descritos neste documento também incluem enantiômeros, diastereoisômeros e misturas dos compostos de fórmula (III). Na fórmula (III) R2’ e R3’, idênticos ou diferentes, podem ser em que X é independentemente escolhido a partir de uma cadeia de hidrocarboneto linear ou ramificada insaturada ou saturada, adequadamente um grupo alquila, opcionalmente substituído com um ou mais substituintes e/ou modificado com um ou mais grupos funcionais.

Em uma modalidade preferencial de fórmula (III) R2 é SO3-, SO3H ou SO3-/M+, em que M+ é um cátion e R3 é H.

É preferencial que no caso de R2 seja SO3-/M+ que o cátion é

Na+ ou K+. Em outra modalidade preferencial da fórmula (III), R2 e R3 são H.

É preferencial que em um dentre R2’ e R3’ da fórmula (III) X seja uma cadeia de hidrocarboneto linear saturada, opcionalmente substituída com um ou mais substituintes e/ou modificada com um ou mais grupos funcionais e em que no outro dentre R2’ e R3’ X é uma cadeia de hidrocarboneto ramificada saturada, opcionalmente substituída com um ou mais substituintes e/ou modificada com um ou mais grupos funcionais.

A este respeito, é ainda preferencial que na fórmula (III) um dentre R2’ e R3’ seja um grupo representado pela seguinte fórmula (IV):

(IV), em que R4 é uma cadeia de hidrocarboneto saturada linear com a fórmula CnHn+1, em que n é um número inteiro entre 1 e 20, opcionalmente modificado com um ou mais grupos funcionais, e em que Y é um número inteiro entre 1 e 10, e em que R5 é H ou OH, e o outro dentre R2' e R3' é uma cadeia de hidrocarboneto saturada linear com a fórmula CnHn+1, em que n é um número inteiro entre 1 e 20, opcionalmente modificado com um ou mais grupos funcionais.

É preferencial que as cadeias de acila representadas por R2’ e R3’ sejam relativamente curtas.

Isso torna os antígenos mais solúveis em soluções aquosas e, portanto, mais fáceis de usar.

A hidrofilicidade aumentada que resulta a partir de cadeias de acila relativamente curtas torna a nitrocelulose na qual os antígenos são imobilizados mais hidrofílica.

Devido a isso, as interações de anticorpos no antígeno ocorrem mais facilmente e a velocidade de detecção será aumentada.

Além disso, será mais fácil sintetizar os antígenos caso sejam usados antígenos sintéticos.

A este respeito, em antígenos de acordo com a fórmula (III) com cadeias acila R 2’ e R3’ curtas, R4 pode ser uma cadeia de hidrocarboneto saturada linear com a fórmula C nHn+1, em que n é um número inteiro entre 1 e 10, como entre 1 e 9, como entre 1 e 8, como entre 1 e 7, como entre 1 e 6, como entre 1 e 5, como entre 1 e 4, como entre 1 e 3, como 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ou 9, opcionalmente modificada com um ou mais grupos funcionais, e em que Y é um número inteiro entre 1 e 10, como entre 1 e 5, como entre 1 e 4, tal como entre 1 e 3, tal como 1, 2, 3, 4 ou 5, opcionalmente modificada com um ou mais grupos funcionais.

O outro dentre R2’ e R3’ em respeito pode ser uma cadeia de hidrocarboneto saturado linear com a fórmula CnHn+1, em que n é um número inteiro entre 1 e 15, tal como entre 1 e 14, tal como entre 1 e 13, tal como entre 1 e 12, tal como entre 1 e 11, como entre 1 e 10, como entre 1 e 9, como entre 1 e 8, como entre 1 e 7, como entre 1 e 6, como entre 1 e 5, como entre 1 e 4, tal como entre 1 e 3, tal como entre 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ou 15 opcionalmente modificadas com um ou mais grupos funcionais.

Caso o antígeno de diacil glicolipídeo esteja presente no Mycobacterium, tuberculose, ele pode ser isolado a partir de Mycobacterium tuberculosis.

Alternativamente, pode ser sintetizado, por exemplo, por um método adaptado do que é descrito em EP 1 950 218 A1. Se o antígeno não estiver presente no Mycobacterium tuberculosis, ele pode ser modificado a partir de um antígeno isolado a partir de Mycobacterium tuberculosis ou sintetizado.

O diacil glicolipídeo pode ser adequadamente sulfoglicolípideo diacilado (Ac2SGL) como encontrado em Mycobacterium tuberculosis, opcionalmente modificado com um ou mais grupos funcionais.

Em uma modalidade preferencial, o referido Ac 2SGL é 2- palmitoil-3-hidroxifthioceranoil-2'-sulfato-α-α'-D-trealose ou 2-estearoil-3- hidroxifthioceranoil-2'-sulfato-α-α'-D -trehalose, opcionalmente modificado com um ou mais grupos funcionais.

As moléculas de Ac2SGL apresentam um núcleo de 2'-sulfato de trealose e são diaciladas quer com um resíduo palmítico ou esteárico na posição 2 e ácido hidroxiftiocerânico, com comprimento variável e substituintes de metila, na posição 3, por exemplo, composto (VI):

(VI), em que R2 é SO3-, SO3H ou SO3-/M+, em que M+ é um cátion, preferencialmente um cátion de metal, preferencialmente Na + ou K+. Outros exemplos são representados pelas fórmulas VII, VIII e IX abaixo.

(VII), (VIII), (IX), em que nas fórmulas VII, VIII e IX a porção SO 3-/Na+ também pode ser SO3-, SO3H e Na+ também pode ser outro cátion, como K+. Em uma outra modalidade, os antígenos de diacil glicolipídeo, conforme definidos acima, podem ser representados pela fórmula (X): (X) R2'e R3' estão na fórmula (X) conforme definido para a fórmula (III) acima. É preferencial que uma ou ambas as cadeias de acila neste documento sejam modificadas para permitir a imobilização em uma folha de nitrocelulose. É em particular preferencial usar um composto representado pela fórmula (XI): (XI), em que uma ou ambas as cadeias de acila são modificadas para permitir a imobilização em uma folha de nitrocelulose. As cadeias de acila do composto de fórmula (XI) podem ser substituídas por qualquer cadeia conforme definido na fórmula (IV), e as cadeias podem ser opcionalmente modificadas para permitir a imobilização na nitrocelulose.

[0058] A modificação adequada inclui a incorporação de um grupo tio em uma das cadeias de acila ou a incorporação de uma ligação insaturada no final de uma das cadeias de acila, por exemplo, uma ligação dupla. Ainda em relação aos grupos funcionais para propósitos de imobilização,

é preferencial que os referidos antígenos de diacil glicolipídeos tenham um alceno ou modificação de alcino no final da cauda hidrofóbica.

[0059] Exemplos adequados de tais moléculas modificadas incluem compostos de acordo com a fórmula (XII), que tem um grupo alceno no final de uma das cadeias de acila ou (XIII) que possui um grupo tiol no final de uma das cadeias de acila.

(XII) (XIII).

[0060] As cadeias de alquila do composto de fórmulas (XII) e (XIII) pode ser substituída por qualquer cadeia possuindo a fórmula CnHn+1 ou fórmula (IV) modificada com o alceno mostrado acima ou grupo tiol. Os antígenos de diacil glicolipídeos fornecem um meio para obter alta sensibilidade de detecção de marcadores para tuberculose. A ligação muito elevada de anticorpos específicos da tuberculose a esses antígenos é detectada no caso de amostras derivadas a partir de pacientes cujo esfregaço foi negativo, ou seja, que estão em um estágio inicial de infecção. Os antígenos de diacil glicolipídeo descritos acima são, portanto, exemplos de antígenos baseados em lipídeos capazes de se ligar a anticorpos indicativos de uma infecção em estágio inicial.

[0061] Outros antígenos baseados em lipídeos que podem ser usados como antígenos imobilizados são antígenos de tuberculosinil adenosina.

Estes antígenos de tuberculosinil adenosina são compostos representados pela seguinte fórmula (XIV),

(XIV) em que na fórmula (XIV) R1 é H ou um grupo com a fórmula (XV)

(XV), R2 está ausente ou um grupo com a fórmula (XV), desde que um dentre R1 e R2 seja um grupo com a fórmula (XV), R3 e R4 são selecionados independentemente a partir de hidrogênio, OH, uma cadeia de acila, um grupo de ácido carboxílico que compreende uma cadeia acila, em qualquer combinação dos mesmos, em que os antígenos são opcionalmente modificados com um ou mais grupos funcionais que permitem a imobilização em uma folha de nitrocelulose e enantiômeros, diastereoisômeros dos antígenos e as misturas dos mesmos.

Nesta fórmula, é preferencial que R 4 seja OH, e ainda mais preferencial que R4 e R3 sejam OH.

Na fórmula (XIV), R1 pode ser um grupo de fórmula (XV) e R2 pode estar ausente.

Em outras modalidades, R1 pode ser H e R2 pode ser um grupo de fórmula (XV). No caso de R2 ser um grupo de fórmula (XV), o nitrogênio ao qual está ligado tem uma carga positiva.

Os grupos funcionais que permitem a imobilização em uma folha de nitrocelulose estão preferencialmente incluídos no grupo de fórmula (XV). No caso de R3 ou R4 serem ou compreendem um grupo acila, prefere-se que apenas um dentre R3 e R4 seja ou compreenda um grupo acila, ou, em particular, um grupo de ácido graxo. Os grupos acila têm, preferencialmente, um comprimento adequado e hidrofobicidade para permitir a imobilização em uma folha de nitrocelulose. A cadeia de acila pode ser modificada com um grupo funcional para permitir a imobilização em uma folha de nitrocelulose. Uma cadeia de acila pode ser uma cadeia de ácido micólico, conforme descrito em WO 2014/210327. É preferencial que, se o antígeno de fórmula (XIV) tiver uma cadeia de acila, a cadeia acila seja bastante curta. Isso torna os antígenos mais solúveis em soluções aquosas e, portanto, mais fáceis de usar. A hidrofilicidade aumentada que resulta a partir de cadeias de hidrocarbonetos relativamente curtas torna a superfície de detecção ou superfície de sensor na qual os antígenos são imobilizados mais hidrofílica. Devido a isso, as interações de anticorpos no antígeno ocorrem mais facilmente e a velocidade de detecção será aumentada. Além disso, será mais fácil sintetizar os antígenos caso sejam usados antígenos sintéticos. A este respeito, em antígenos com cadeias de acila curtas, a cadeia de acila pode ser uma cadeia C1-C20 linear ou ramificada, tal como uma cadeia de C5-C20. Em uma modalidade preferencial, o antígeno de fórmula (XIV) é representado por um composto de fórmula (XVI) ou (XVII), opcionalmente modificado com um ou mais grupos funcionais que permitem a imobilização em uma folha de nitrocelulose. Tal grupo funcional pode ser, por exemplo, um grupo azida, que por sua vez pode ser usado em uma reação de acoplamento para acoplar um grupo biotina.

(XVI) (XVII).

[0062] É preferencial que o antígeno, de acordo com a fórmula (XIV), seja selecionado a partir do grupo de 1-tuberculosinil adenosina (como na fórmula (XVI)), 1-tuberculosinil-2'-desoxiadenosina, 1-tuberculosinil-O- acetiladenosina ou uma combinação dos mesmos. Estes compostos ocorrem naturalmente em bactérias Mycobacterium tuberculosis e podem ser isolados a partir delas. Neste caso, o antígeno natural pode ser usado e modificado para propósitos de imobilização, se desejado. Os níveis desses compostos em micobactérias são bastante baixos, muito mais baixos do que, por exemplo, os níveis de ácido micólico. Portanto, é mais vantajoso sintetizar quimicamente essas moléculas, ou sintetizá-las em um microrganismo hospedeiro de produção seguido de isolamento e etapas opcionais de purificação adicionais. Isso economiza custos consideráveis. É, portanto, preferencial que estes compostos sejam sintéticos. Os antígenos sintéticos de acordo com a fórmula (XIV) podem, por exemplo, ser sintetizados de acordo com o método descrito em Buter et al., 2016.

[0063] O antígeno sintético derivado de tuberculosinil adenosina também pode ser representado pela seguinte fórmula (XVII): (XVIII)

em que na fórmula (I) R1 é H ou um grupo com a fórmula (XV)

(XV), R2 está ausente ou um grupo com a fórmula (XV), desde que um de R1 e R2 seja um grupo com a fórmula (XV), R3 e R4 são selecionados independentemente a partir de hidrogênio, OH ou um grupo acila, em qualquer combinação dos mesmos, e em que R5 é um grupo ligante e enantiômeros, diastereoisômeros do referido antígeno, em que o referido antígeno é imobilizado na referida folha de nitrocelulose por meio do referido grupo ligante.

Na fórmula (XVIII), R1 pode ser um grupo de fórmula (XV) e R2 pode estar ausente.

Em outras modalidades, R1 pode ser H e R2 pode ser um grupo de fórmula (XV). No caso de R2 ser um grupo de fórmula (XV), o nitrogênio ao qual está ligado tem uma carga positiva.

No caso de R3 ou R4 serem um grupo acila, é preferencial que apenas um dentre R3 e R4 seja um grupo acila.

Por exemplo, R3 ou R4 podem ser um grupo amida, éster, cetona ou aldeído ou ácido carboxílico.

É possível que R3 seja H e R4 seja OH.

Também é possível que R4 seja H e R3 seja OH.

Também é possível que R3 e R4 sejam H.

É preferencial que um dentre R3 e R4 seja OH, por exemplo, que R4 seja OH ou que R3 seja OH.

É preferencial que R4 seja OH e ainda mais preferencial que R4 e R3 sejam OH.

Tais moléculas podem ser efetivamente sintetizadas, por exemplo de acordo com o método descrito em Buter et al., 2016 e apresentam boa apresentação de antígenos.

O antígeno da fórmula (XVIII) pode ser representado adequadamente por um composto da fórmula (XIX) ou (XX), em que R5 é um grupo ligante:

(XIX) (XX)

[0064] Em relação ao grupo ligante de R5 dos antígenos de fórmulas XVIII, XIX e XX, qualquer grupo ligante adequado para imobilizar um antígeno em um substrato de nitrocelulose pode ser qualificado e muitos grupos ligantes adequados para imobilização de antígenos são conhecidos na técnica. Exemplos de tais ligantes serão discutidos abaixo. Para permitir a imobilização em nitrocelulose, o ligante contém, preferencialmente, um grupo funcional que permite a imobilização no substrato. O termo "grupo funcional" neste pedido deve, portanto, ser entendido como um grupo que permite a imobilização do antígeno na nitrocelulose. Para este propósito, o referido grupo ligante pode compreender um grupo funcional selecionado a partir de um grupo tio, um grupo amina, um grupo aldeído, um grupo azida, uma poli-histidina ou um grupo biotina. Um ligante adequado para os propósitos desta invenção é um polietilenoglicol (ligante PEG) apropriadamente funcionalizado para permitir a imobilização. Em uma modalidade preferencial, o referido grupo ligante é um PEG (polietilenoglicol) contendo um grupo funcional que permite a imobilização em um substrato de nitrocelulose. Muitos ligantes de PEG adequados estão disponíveis e muitas maneiras são adequadas para acoplar os antígenos a um substrato de nitrocelulose sólido. O grupo PEG pode, por exemplo, ser funcionalizado com um grupo que compreende um grupo funcional selecionado a partir de um grupo tio, um grupo amina, um grupo aldeído, um grupo azida, uma poli-histidina ou um grupo biotina. Em uma modalidade, o grupo ligante pode, portanto, ser um grupo PEG biotinilado. Em outra modalidade, o referido grupo ligante pode ser um grupo PEG que contém um grupo azida, por exemplo, como mostrado na fórmula (XXI) abaixo.

(XXI).

[0065] Antígenos de tuberculosinil adenosina, conforme definidos acima, são usados em um método para detectar um marcador para tuberculose, uma ligação muito alta específica de tuberculose de anticorpos a esses antígenos é detectada. O sinal derivado partir dos marcadores reais para tuberculose é significativamente menos obscurecido por um sinal de fundo do que quando antígenos micólicos imobilizados são usados, de modo que o sinal derivado a partir dos marcadores reais da tuberculose se torna mais pronunciado. Desta forma, a invenção fornece uma melhoria significativa no que diz respeito à sensibilidade de detecção de marcadores para tuberculose. O inventor descobriu ainda que se os antígenos de tuberculosinil adenosina, conforme definido acima, forem usados em um método para detectar um marcador para tuberculose em combinação com outros tipos de antígenos que são capazes de se ligar a um anticorpo que é indicativo da presença de material micobacteriano em um humano ou animal, uma indicação mais confiável é fornecida que o indivíduo do qual a amostra é derivada tem tuberculose ativa. O inventor descobriu agora que os anticorpos contra antígenos de tuberculosinil adenosina, conforme definidos acima, não são adequadamente detectáveis em amostras derivadas a partir de indivíduos vacinados com uma vacina BCG ou a partir de indivíduos curados de uma infecção de tuberculose. Em outras palavras, se uma amostra contém uma quantidade mensurável de anticorpos contra antígenos de tuberculosinil adenosina, conforme definido acima, isso é uma indicação de tuberculose ativa. Isso torna possível distinguir em um teste de tuberculose entre indivíduos com tuberculose ativa e indivíduos em que a infecção é inativa.

[0066] Em uma modalidade preferencial, a folha de nitrocelulose, de acordo com a invenção, compreende uma pluralidade de diferentes antígenos baseados em lipídeos, cuja pluralidade compreende dois ou mais dentre: a) pelo menos um antígeno derivado de ácido micólico, b) pelo menos um antígeno de tuberculosinil adenosina c) pelo menos um antígeno de diacil glicolipídeo d) pelo menos um antígeno de manosil fosfocetídeo. Exemplos des- ses antígenos são descritos acima. Ainda mais preferencialmente, a referida pluralidade de diferentes antígenos baseados em lipídeos compreende: a) pelo menos um antígeno derivado de ácido micólico b) pelo menos um antígeno de tuberculosinil adenosina c) pelo menos um antígeno de diacil glicolipídeo; e d) pelo menos um antígeno manosil fosfocetídeo, porque como ex- plicado acima, a presença de anticorpos contra cada um desses tipos de antí- genos pode fornecer informações específicas sobre o estado ou estágio da in- fecção micobacteriana do indivíduo do qual a amostra testada é derivada. Exemplos desses antígenos são descritos acima.

[0067] A folha de nitrocelulose pode compreender ainda um ou mais antígenos de proteína imobilizados na mesma, sendo os referidos antígenos baseados em proteínas capazes de se ligar a anticorpos produzidos em resposta à infecção por um agente infeccioso em um indivíduo. É preferencial que o(s) antígeno(s) baseados em lipídeos e o(s) antígeno(s) de proteína imobilizado(s) na nitrocelulose sejam, cada um, capazes de se ligar a anticorpos produzidos em resposta à infecção de pelo mesmo agente infeccioso. Isso melhora ainda mais a confiabilidade do teste realizado com a folha de nitrocelulose. No caso de uma infecção bacteriana, tais antígenos proteicos podem ser selecionados a partir de quaisquer antígenos de proteínas conhecidos de agentes infecciosos específicos. Por exemplo, no caso do agente infeccioso ser Mycobacterium tuberculosis, possíveis antígenos de proteína para este propósito podem incluir, mas não estão limitados a antígenos de proteína de micobactérias selecionados do grupo que compreende: M. Tuberculosis MPT51, MPT63, MPT64, MPT53, M. Tuberculosis 85-A Protein, M. Tuberculosis 85-B Protein, M. Tuberculosis 85-C Protein, M. Tuberculosis CFP-10 Protein, M. Tuberculosis CFP10/ESAT6 Quimera Protein, M. Tuberculosis ESAT-6, Rv3881c, Rv0934 (pstS1), Rv0932c (pstS2) e Rv3006 (LppZ), etc. Essas proteínas podem ser proteínas recombinantes.

[0068] Antígenos derivados de lipídeos e imunoglobulinas, e opcionalmente antígenos derivados de proteínas, podem ser imobilizados primeiro em uma folha de nitrocelulose, após o que a folha é cortada em folhas ou discos. Isso garante uma distribuição igual dos antígenos e imunoglobulinas. A este respeito, a folha de nitrocelulose pode estar em qualquer formato adequado, como uma tira ou uma folha.

[0069] A imobilização em nitrocelulose pode ocorrer por qualquer meio convencional conhecido na técnica. O inventor observou que antígenos derivados de lipídeos podem ser imobilizados por meio de interação hidrofóbica de uma ou ambas as cadeias de carbono hidrofóbicas, tais como cadeias de acila, do antígeno com nitrocelulose. Também é possível modificar o antígeno com um grupo funcional, como um alceno ou modificação de alcino no final da cauda hidrofóbica. Os mecanismos também incluem ligação covalente de antígeno tiolado a uma membrana de nitrocelulose funcionalizada com epóxido, ligação de um antígeno biotinilado por meio de uma proteína âncora de estreptavidina de ligação de nitrocelulose e fusão de um antígeno a uma nova proteína âncora de ligação de nitrocelulose para acoplamento direto e ligação covalente por meio de uma ligação epóxido tiol usando uma imobilização de membrana de nitrocelulose funcionalizada.

[0070] De acordo com a invenção, também é fornecido um kit, compreendendo a folha de nitrocelulose acima descrita e ainda compreendendo: um recipiente contendo um anticorpo secundário anti-IgG com um marcador de detecção conjugado; e um recipiente contendo um anticorpo secundário anti-IgM com um marcador de detecção conjugado. Opcionalmente, o kit compreende ainda um recipiente contendo um anticorpo secundário anti-IgA com um marcador de detecção conjugado.

[0071] Em uma modalidade preferencial, é fornecido um kit, compreendendo a folha de nitrocelulose acima descrita e compreendendo ainda: um recipiente contendo um conjugado de enzima repórter anti-IgG; e um recipiente contendo um conjugado de enzima repórter anti-IgM. Opcionalmente, também contém um conjugado de enzima repórter anti-IgA. As enzimas repórter são para determinar a presença de anticorpos a partir da referida amostra ligada aos antígenos imobilizados na folha ao realizar o método da invenção.

[0072] Embora outros reagentes, recipientes e equipamentos possam estar disponíveis em um laboratório de pesquisa, uma modalidade preferencial do kit pode compreender ainda uma bandeja de incubação, configurada para receber várias das referidas folhas, um recipiente com diluente de amostra; um recipiente com tampão de lavagem; um recipiente com diluente conjugado; e um recipiente com substrato de detecção de enzima repórter. A bandeja de incubação acima mencionada permite testar várias das referidas folhas simultaneamente. O kit pode ainda ser fornecido com instruções de uso.

[0073] Os exemplos seguintes pretendem ilustrar o princípio da invenção e não devem ser interpretados como limitando o escopo das reivindicações.

Exemplos Exemplo 1 - uma folha de nitrocelulose exemplar

[0074] Uma tira de nitrocelulose é fornecida com imobilizado na mesma: IgA, IgM e IgG, antígenos de lipídeos da tuberculose (TB), incluindo 4 antígenos derivados de ácido micólico diferentes, incluindo a variante natural, 1 antígeno tuberculosinil adenosina sintético; 2 antígenos diacil glicolipídeos diferentes; e 2 antígenos de manosil fosfocetídeo, incluindo a variante natural. Variantes naturais são imobilizadas na nitrocelulose pela interação hidrofóbica de sua cauda hidrofóbica. As variantes sintéticas são modificadas com biotina para melhor imobilização na nitrocelulose. Cada antígeno está contido em uma folha em uma quantidade de 0,2ng.

Exemplo 2: um kit exemplar

[0075] A Tabela 1 abaixo descreve um kit contendo a tira de nitrocelulose do exemplo 1.

Material Quantidade Detalhe Folhas com antíge- 16 peças Tira de nitrocelulose com controles e antígenos de nos de TB lipídeos de TB Diluente de amostra 20 mL Diluente de amostra livre de proteína e bloqueador de ligação não específica Conjugado 4000x 15 µl IgG ou IgM ou IgA anti-humano monoclonal conju- concentrado gado com fosfatase alcalina Diluente Conjugado 20 mL Diluente de conjugado livre de proteína Solução de substra- 18 mL NBT/BCIP pronto para usar substrato to Tampão de lavagem 160 mL Tampão de lavagem TBS com conservante Bandejas de incu- 2 peças bação de 8 cavida- des com tampa Instruções de uso 1 Tabela 1: conteúdo de um kit exemplar

[0076] Todos os reagentes devem, preferencialmente, estar em temperatura ambiente (20-25 °C) por 1 hora antes do uso. Anti-IgG e anti-IgA são usados na diluição de 1/2000 (10µL de conjugado em 20mL de diluente de conjugado). O anti-IgM é usado na diluição de 1/4000 (5µL de conjugado em 20mL de diluente de conjugado).

[0077] A Tabela 2 abaixo lista outros materiais necessários para usar o kit, mas que não estão incluídos no kit.

Material Número Detalhe Ângulo de inclinação recomendado Rocker de plataforma 1 8 graus com 10 rpm Pinça de ponta cega 1 Pipetas capazes de forne- Preferencialmente, uma pipeta 1 cer 1mL multicanal de 8 cavidades Pipeta capaz de fornecer Para pipetagem de amostra e con- 1 10µL e 20µL jugado Aspirador a vácuo com ar- madilha de líquido e filtro 1 Opcional, mas preferencial de 0,2um Pontas de pipeta descartá- Deve caber nos volumes de1 mL e como requerido veis 20µL Para cronometrar os ciclos de in- Cronômetro de laboratório 1 cubação Para manipulação de amostras Gabinete de biossegurança 1 potencialmente infecciosas Scanner Epson perfection 1 v600 ou equivalente Tabela 2: materiais não incluídos no kit. Exemplo 3: uso do kit

[0078] O kit pode ser usado de acordo com o seguinte protocolo:

1. Deixe todos os reagentes e amostras atingirem a temperatura ambiente por 1 hora a 20-25°C.

2. O kit contém um conjugado concentrado que é anti-IgG, anti- IgM ou anti-IgA. Diluir o conjugado adicionando 5 (IgM) ou 10µL (IgG/IgA) do conjugado ao frasco de 20mL do diluente do conjugado. Alternativamente, 2,5µL podem ser adicionados a 10 mL de diluente de conjugado ao analisar até 8 amostras. Armazene o conjugado não diluído imediatamente a 2-8°C após o uso. Marque o frasco para indicar que o conjugado foi adicionado. (também pode ser preparado após a etapa 9)

3. Remova o número de folhas necessárias a partir do tubo de armazenamento com uma pinça.

4. Coloque as folhas na bandeja de incubação de 8 cavidades de forma que a linha preta do marcador fique orientada para cima e à esquerda da folha.

5. Adicione 1mL de diluente de amostra de bloqueio a cada uma das cavidades da bandeja de incubação (O bloqueador pode ser, por exemplo, uma combinação de detergente e caseína: sem carboidratos, sem ácidos gra- xos; caseína de surmodics; bloqueador de leite de surmodics; Kem e Tec; Hi- drolisado de proteína de soja; BSA: sem ácido graxo, em que o detergente po- de ser ou por exemplo Tween 20, Tween 80, Triton X100; Pluronics 125; Chaps; NP-40)

1. Coloque a tampa na bandeja e bloqueie as manchas na bande- ja em uma plataforma oscilante a 20-25°C por 30 minutos.

2. Misture a amostra de soro ou plasma com ou sem delipidação: antes de pipetar por vórtex com a tampa colocada, não homogeneizar por pipe- tagem para evitar a formação de aerossol.

3. Pipete 2,5µL de amostra para o líquido em uma única cavidade de bandeja de incubação com o diluente de amostra (diluição 400 x).

4. Coloque a tampa na bandeja e incube a bandeja em uma plata- forma oscilante a 20-25°C por 30 minutos.

5. Remova o líquido a partir das bandejas preferencialmente com um aspirador a vácuo ou com uma pipeta.

6. Adicione 1mL de tampão de lavagem à bandeja e incube agi- tando por 30 segundos.

7. Repita as etapas 10 e 11 2 vezes.

8. Remova todo o líquido da bandeja preferencialmente com um aspirador a vácuo ou com uma pipeta.

9. Adicione 1mL de conjugado diluído às cavidades da bandeja.

10. Coloque a tampa na bandeja e incube a bandeja em uma plata- forma oscilante a 20-25°C por 30 minutos.

11. Remova o líquido a partir das bandejas preferencialmente com um aspirador a vácuo ou com uma pipeta.

12. Adicione 1mL de tampão de lavagem à bandeja e incube agi- tando por 30 segundos.

13. Repita as etapas 16 e 17 2 vezes.

14. Remova todo o líquido a partir da bandeja com uma pipeta.

15. Adicione 1mL de solução de substrato às cavidades da bande- ja.

16. Incubar por 10 minutos a 20-25°C em uma plataforma oscilan- te.

17. Remova a solução de substrato a partir das bandejas preferen- cialmente com um aspirador a vácuo ou com uma pipeta.

18. Adicione 1mL de tampão de lavagem às cavidades.

19. Incube por 2 minutos em uma plataforma oscilante.

20. Remova o líquido a partir das bandejas preferencialmente com um aspirador a vácuo ou com uma pipeta.

21. Retire as folhas e seque-as sobre uma superfície de vidro.

22. Após a secagem, aplicar as folhas no formulário de análise im- presso. (fornecer instruções sobre como preparar formulários de análise).

23. Digitalizar as folhas usando um scanner Epson V600 de 600 dpi.

24. Analisar a varredura com o software de análise. (fornecer ins- truções de análise de dados).

Claims (29)

REIVINDICAÇÕES

1. Folha de nitrocelulose caracterizada pelo fato de que compreende imobilizado na mesma em posições separadas: - imunoglobulina G; - imunoglobulina M; e - pelo menos um antígeno baseado em lipídeos capaz de se ligar a anticorpos produzidos em resposta à infecção por um agente infeccioso em um indivíduo.

2. Folha de nitrocelulose de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que compreende, imobilizados na mesma, uma pluralidade de diferentes antígenos baseados em lipídeos capazes de se ligarem a anticorpos produzidos em resposta a infecção por um agente infeccioso em um indivíduo.

3. Folha de nitrocelulose de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que os antígenos baseados em lipídeos da pluralidade de diferentes antígenos baseados em lipídeos são, cada um, capaz de se ligar a anticorpos produzidos em resposta à infecção pelo mesmo agente infeccioso.

4. Folha de nitrocelulose, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizada pelo fato de que a referida pluralidade de diferentes antígenos baseados em de lipídeos, pelo menos um dos referidos antígenos baseados em de lipídeos é capaz de se ligar a anticorpos indicativos de uma infecção em estágio inicial e pelo menos um outro dos referidos antígenos baseados em de lipídeos é capaz de se ligar a anticorpos indicativos de uma infecção em estágio posterior.

5. Folha de nitrocelulose, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizada pelo fato de que o referido antígeno baseado em lipídeos é derivado a partir de ou baseado em um antígeno baseado em lipídeos bacterianos ou em que a referida pluralidade de diferentes antígenos baseados em lipídeos é derivada ou baseada em antígenos baseados em lipídeos bacterianos.

6. Folha de nitrocelulose, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizada pelo fato de que o referido antígeno ou antígenos é/são derivados a partir de ou com base em antígeno(s) baseados em de lipídeos micobacterianos.

7. Folha de nitrocelulose, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizada pelo fato de que a referida pluralidade de diferentes antígenos baseados em de lipídeos compreende antígenos derivados a partir de ácido micólico ou em que o referido antígeno é um antígeno derivado de ácido micólico.

8. Folha de nitrocelulose, de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de que a referida pluralidade de diferentes antígenos baseados em de lipídeos compreende dois ou mais dentre: a) pelo menos um antígeno derivado de ácido micólico; b) pelo menos um antígeno de tuberculosinil adenosina; c) pelo menos um antígeno de diacil glicolipídeo; d) pelo menos um antígeno de manosil fosfocetídeo.

9. Folha de nitrocelulose, de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelo fato de que a referida pluralidade de diferentes antígenos baseados em de lipídeos compreende: a) pelo menos um antígeno derivado de ácido micólico; b) pelo menos um antígeno de tuberculosinil adenosina; c) pelo menos um antígeno de diacil glicolipídeo; e d) pelo menos um antígeno de manosil fosfocetídeo.

10. Folha de nitrocelulose, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizada pelo fato de que compreende ainda um ou mais antígenos baseados em de proteína, imobilizados na mesma, sendo o (s) referido (s) antígeno (s) baseados em de proteína capaz de se ligar a anticorpos produzidos em resposta à infecção por um agente infeccioso em um indivíduo, preferencialmente em que o (s) antígeno (s) baseados em lipídeos e o (s) antígeno (s) baseados em proteína, imobilizados na folha de nitrocelulose são, cada um, capazes de se ligar a anticorpos produzidos em resposta à infecção pelo mesmo agente infeccioso.

11. Folha de nitrocelulose de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizada pelo fato de que compreende ainda imunoglobulina A imobilizada na mesma.

12. Kit, caracterizado pelo fato de que compreende a folha de nitrocelulose definida de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, e compreende ainda: um recipiente contendo um anticorpo secundário anti-IgG com um marcador de detecção conjugado; e um recipiente contendo um anticorpo secundário anti-IgM com um marcador de detecção conjugado.

13. Kit, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que compreende ainda: um recipiente contendo um anticorpo secundário anti-IgA com um marcador de detecção conjugado.

14. Kit, de acordo com a reivindicação 12 ou 13, caracterizado pelo fato de que o referido anticorpo secundário anti-IgG é um conjugado de enzima repórter anti-IgG; o referido anticorpo secundário anti-IgM é um conjugado de enzima repórter anti-IgM; e o referido anticorpo secundário anti-IgA é um conjugado de enzima repórter anti-IgA.

15. Kit, de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 14, caracterizado pelo fato de que os referidos anticorpos secundários são conjugados de Ig anti-humana.

16. Kit, de acordo com qualquer uma das reivindicações 14 a 15, caracterizado pelo fato de que compreende ainda: uma bandeja de incubação, configurada para receber uma série das referidas folhas,

um recipiente com diluente de amostra; um recipiente com tampão de lavagem; um recipiente com diluente conjugado; e um recipiente com substrato de detecção de enzima repórter.

17. Kit, de acordo com qualquer uma das reivindicações 14 a 16, caracterizado pelo fato de que os referidos conjugados de enzima anti-Ig humana repórter são selecionados a partir de conjugados de peroxidase de rábano (HRP) e fosfatase alcalina (AP).

18. Método para detecção de anticorpos indicativos de uma infecção, caracterizado pelo fato de que compreende: Método para detecção de anticorpos indicativos de uma infecção, caracterizado pelo fato de que compreende: determinar a presença de anticorpos primários a partir da referida amostra ligada aos antígenos imobilizados na folha por uma incubação com um anticorpo secundário com um marcador de detecção conjugado selecionado a partir do grupo que compreende anticorpo secundário anti-IgM e anticorpo secundário anti-IgG; e detectar a ligação do anticorpo secundário aos referidos anticorpos primários ligados aos antígenos imobilizados na folha, em que a ligação dos referidos anticorpos primários ao anticorpo secundário leva a um sinal positivo, em que um sinal positivo no caso de uma incubação com um anti- IgM secundário o anticorpo é indicativo de uma infecção em estágio inicial e um sinal positivo no caso de uma incubação com um anticorpo secundário anti-IgG é indicativo de uma infecção em estágio posterior.

19. Método, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que a folha é a folha definida de acordo com a reivindicação 11, e que compreende: expor pelo menos uma folha definida de acordo com a reivindicação 11 a uma amostra derivada a partir de um indivíduo suspeito de ter uma infecção; determinar a presença de anticorpos a partir da referida amostra ligada aos antígenos imobilizados na folha por uma incubação com anticorpo secundário com um marcador de detecção conjugado selecionado a partir do grupo que compreende anticorpo secundário anti-IgM, anticorpo secundário anti- IgG e anticorpo secundário anti-IgA.

20. Método, de acordo com a reivindicação 18 ou 19, caracterizado pelo fato de que o referido anticorpo secundário anti-IgG é um conjugado de enzima repórter anti-IgG; o referido anticorpo secundário anti-IgM é um conjugado de enzima repórter anti-IgM; e o referido anticorpo secundário anti-IgA é um conjugado de enzima repórter anti-IgA.

21. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 18 a 20, caracterizado pelo fato de que os referidos anticorpos secundários são conjugados de Ig anti-humana.

22. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 20 a 21, caracterizado pelo fato de que a etapa de detecção da ligação de anticorpos na referida amostra aos antígenos imobilizados na folha envolve o uso de conjugados de enzima repórter anti-Ig selecionados a partir de conjugados de peroxidase de rábano (HRP) e fosfatase alcalina (AP).

23. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 18 a 22, caracterizado pelo fato de que a referida infecção é causada por um agente infeccioso bacteriano.

24. Método, de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que a referida infecção é causada por um Mycobacterium tuberculosis.

25. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 18 a 24, caracterizado pelo fato de que compreende o uso do kit definido de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 17.

26. Uso da folha definida de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11 caracterizado por ser para discernir entre uma infecção em estágio inicial e uma infecção em estágio posterior e/ou para discernir entre uma infecção ativa e uma inativa.

27. Uso, de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de que a referida infecção é causada por um agente infeccioso fúngico, agente infeccioso viral ou agente infeccioso bacteriano.

28. Uso, de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de que a referida infecção é causada por um agente infeccioso bacteriano.

29. Uso, de acordo com a reivindicação 28, caracterizado pelo fato de que a referida infecção é causada por Mycobacterium tuberculosis.